KR20230002817A - 방법 및 조성물 - Google Patents

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KR20230002817A
KR20230002817A KR1020227040166A KR20227040166A KR20230002817A KR 20230002817 A KR20230002817 A KR 20230002817A KR 1020227040166 A KR1020227040166 A KR 1020227040166A KR 20227040166 A KR20227040166 A KR 20227040166A KR 20230002817 A KR20230002817 A KR 20230002817A
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interactor
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다누쉬카 라트나야크
피터 커리
미카엘 마르티노
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모나쉬 유니버시티
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Abstract

CCR5 상호작용제 또는 인코딩 분자를 근육에 전달하는 단계를 포함하는, 근육 재생을 자극하는 방법. CCR5 상호작용제는 근육 줄기 세포에 결합하고, 근아세포 증식 및 근육 재생을 자극한다. CCR5 상호작용제의 일례는 사이토카인 핑거 모티프(cytokine finger motif)를 포함하는 NAMPT 또는 이의 유도체이다. 방법 및 조성물은 위성 또는 대식세포 집단 또는 그들의 전구체/자손을 포함하는 CCR5 상호작용제를 발현하는 세포 조성물; 및 줄기 세포 요법 또는 근육 결핍, 장애 또는 손상을 치료하는 데 사용하기 위한 그들의 적용을 포함한다. 예는 최소한의 섬유증으로 근육 조직 재생을 보여준다. 또한, 사이토카인 핑거를 포함하는 NAMPT의 C-말단 부분을 포함하는 NAMPT 폴리펩티드 단편이 가능해진다. 조성물은 NAMPT 폴리펩티드 단편과 조직 줄기 세포 또는 대식세포 또는 전구체/자손, 스캐폴드 또는 보유 물질, 조직 전달 향상 또는 세포 보유 모이어티 중 하나 이상을 추가로 포함한다.

Description

방법 및 조성물
본 개시내용은 생산적인 조직 복구 및 재생의 기술 분야 및 이를 필요로 하는 대상체의 치료에 관한 것이다.
본 명세서에서 임의의 선행 간행물 또는 공지된 임의의 문제에 대한 언급은 그 선행 간행물 또는 공지된 문제가 이 명세서와 관련된 노력 분야에서 공통의 일반 지식의 일부를 형성한다는 인정 또는 승인 또는 어떤 형태의 제안이 아니며, 그렇게 간주되어서는 안된다.
참조된 문서의 서지 세부 사항은 명세서의 끝에 나열되어 있다.
골격근은 전형적으로 인간 체질량의 약 40%를 형성한다. 그것은 근육형성에 의해 발달 중에 형성되고, 여기서 체세포로서 공지된 근축 중배엽의 쌍을 이루는 블록이 통합되고 복잡한 근육계를 형성하기 위해 확장되는 근절을 생성한다. 평생 동안, 근육 조직의 성장, 재생 및 복구는 중배엽 유래 골격근 상주 줄기 세포에 의해 구동된다.
골격근은 전형적으로 성인 인간의 체질량의 약 40%를 형성한다. 그것은 근육형성에 의해 발달하는 동안 형성되며, 여기서 체세포로 공지된 근축 중배엽의 쌍을 이루는 블록이 근육 줄기 세포를 형성하고 근관 표면에 근아세포의 융합을 통해 통합되고 복잡한 근육계를 형성하기 위해 확장되는 일시적인 근절을 생성한다. 근육 형성의 추가 단계에서, 근육 줄기 세포(위성 세포(satellite cell)라고 함)는 이동하여 개별 근섬유의 근초와 기저층 사이의 틈새를 차지한다. 양막은 근육 섬유의 완전한 세트를 가지고 태어나며, 성인의 경우 근육 복구는 일반적으로 기존 섬유 크기의 증가를 통해 이루어진다. 평생 동안, 근육 조직의 항상성, 성장, 재생 및 복구는 중배엽 유래 골격근 상주 줄기 세포에 의해 구동된다. 분자 수준에서, 정지(quiescent) 위성 세포는 전사 인자 PAX7을 필요로 하고 발현하며, PAX3도 발현한다. 골격근 손상 후, 일부 위성 세포가 활성화되고 증식하여 분화하고 융합하여 새로운 근섬유를 형성하거나 손상된 근육 섬유와 병합 및 복구하는 근아세포를 형성한다. 이 근원성 프로그램은 근원성 조절 인자, MYF5, MYOD, MYOG 및 MRF4에 의해 지배된다. 근육 틈새와 관련된 풍부한 다른 인자와 세포는 항상성 및 재생 맥락에서 복잡한 세포 과정과 기능 조직의 최종 생산에 관여하는 것으로 생각된다. 따라서, 위성 세포의 활성화 및 증식을 자극하는 신호의 공급원 및 특성을 식별하는 것은 현재까지 어려웠다.
위성 세포는 분화된 조직 내의 특정 해부학적 틈새를 차지하는 단능성 조직 상주 줄기 세포의 원형이다. 수십 년간의 연구는 다양한 손상에 반응하여 근육 복구를 효과적으로 조정하는 이 시스템의 특별한 능력을 밝혀냈다. 이 입증된 재생 능력에도 불구하고, 단리된 근육 줄기 세포의 이식은 아직 치료 효과를 제공하지 않았으며 근육 줄기 세포를 자극하는 재생 촉진 치료는 이 시점에서 완전히 부족하다.
특히 중요하고 다양한 미충족 임상적 요구를 해결하기 위해 근아세포 기반 요법에 사용하기 위한 조성물이 제공된다.
용어 "및/또는", 예를 들어, "X 및/또는 Y"는 "X 및 Y" 또는 "X 또는 Y" 중 어느 하나를 의미하는 것으로 이해되어야 하며, 두 의미 또는 두 의미 중 어느 하나의 의미에 대한 명시적 지원을 제공하는 것으로 간주되어야 한다.
본원에서 사용되는 용어 "약"은 반대로 명시되지 않는 한, 지정된 값의 +/- 10% 또는 +/- 5%를 지칭한다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 단어 "포함하다" 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 포함하고 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 배제하는 것은 아님을 암시하는 것으로 이해될 것이다.
본원에서 사용되는 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 달리 나타내지 않는 한, 단수 및 복수의 지시대상을 포함한다.
본 개시내용은 부분적으로 근육 재생을 위한 시간적 및 세포적 프레임워크를 단일 세포 수준에서 기재하기 위해 저속도(time-lapse) 사진을 사용하는 실험의 결과에 기초한다. 이것은 이러한 상호작용과 경로가 척추동물 시스템에서 전부 시각화된 처음이며, 본원에 기재된 새롭게 관찰된 세포 거동 및 방법 및 조성물이 다른 조직 유형에서 재현될 수 있다는 것이 본원에서 제안되고 가능하게 되었다.
특정 대식세포(macrophage) 서브세트의 놀랍게 직접적이고 필수적인 역할은 생체내 조직 재생을 조절하는 데에서 확인되었으며, 이는 상처 유인 대식세포의 일부가 상주 조직 줄기 세포와 함께 일시적 줄기 세포 틈새를 형성하고 그들의 활성화를 유도한다는 것을 입증한다. 이 틈새 특이적 대식세포 서브세트의 절제는 손상 부위 내에 존재하는 증식성 전구 세포의 수의 심각한 감소를 초래하고, 결과적으로 재생 결핍을 초래한다. 본원에서 용어 손상은 조직 재생이 질환 과정, 감염 또는 외상의 결과, 수명, 불량한 식이 및 운동 부족 등과 같은 임의의 과정을 통해 손실된 조직을 교체하거나 손실된 기능적 조직을 재건하거나 재생하는데 필요한 임의의 외부적으로 또는 내부적으로 추가되거나 존재하는 상처와 광범위하게 관련된다.
필수 위성 세포-대식세포 틈새가 실시간으로 그리고 상처 내에서 확인되어 효율적인 골격근 재생 및 손상 복구를 유발한다. 이것은 상처 유인 대식세포의 일부가 일시적 줄기 세포 틈새를 형성하고 친근원성임을 입증한다. 더 큰 잎이 있는 대식세포 세포가 분열을 겪는 것으로 보이는 더 작은 위성 세포와 장기간 밀접하게 접촉하는 것으로 보이는 도 2m을 참조한다. 이 틈새 특이적 대식세포 서브세트의 절제는 손상 부위 내에 존재하는 근원성 전구 세포 수의 심각한 감소를 초래하고, 결과적으로 근육 재생 결핍을 초래한다.
하나의 구현예에서, 줄기 세포는 조직 줄기 세포, 예를 들어, 근육 줄기 세포이다. 하나의 구현예에서, 줄기 세포는 골격근 줄기 세포(위성 세포)이다. 다른 근육 줄기 세포는 심장 조직 줄기 세포 또는 줄무늬가 없는 근육 세포를 포함한다. 본원에서 결정되는 바와 같이, 하나의 구현예에서, 조직 줄기 세포는 CCR5 수용체를 발현한다.
따라서, 전염증성 및 항염증 이벤트를 조절하는 충분히 설명된 능력과 함께, 특이적 대식세포 집단은 또한 일시적 줄기 세포 활성화 틈새를 제공한다(세포는 공간적으로 함께 구속되고, 근육 조직에서 직접 상호작용한다). 따라서, 본원에서 상세화된 대식세포 또는 대식세포 유래 인자는 줄기 세포 활성을 조절하고, 정지 조직 줄기 세포를 직접 활성화하고, 조직 재생에 사용하기 위해 제안된다.
본원에 기재된 하나의 대식세포 유래 인자는 니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라제(NAMPT, 비스파틴 및 PBEF(프리-B 세포 증강 인자)로도 공지됨)이다. NAMPT는 본원에서 손상 거주 대식세포에 의해 상향조절되고 생산되는 것으로 나타났다. 근육 줄기 세포 수용체와 상호작용하는 NAMPT의 특정 유도체가 개발되었다. 이를 포함하는 조성물은 근육 줄기 세포 증식 및 근육 재생을 유도하는 것으로 결정되었다(도면 및 실시예 참조). 하나의 구현예에서, 활성화는 케모카인 수용체 결합을 통해 이루어진다. 이 수용체를 통해 특이적으로 작용하는 다른 제제는 또한 근육 재생을 자극한다(예: CCR5, CCL8 및 CCL4의 경우). 중요하게는, NAMPT에 의한 근육 치료는 임상적으로 관련된 용적 상처 모델에서 거의 또는 최소한의 섬유증과 관련되어 있었다. 따라서, NAMPT 및 이의 기능적 유도체는 조직 기능의 완전한 회복, 즉 생산적인 조직 복구 및 재생을 촉진하기 위해 상처 치유를 자극하고 치유의 품질을 향상시키는 데 사용하기 위해 제안된다. 본원에서 NAMPT에 대한 언급은 정지 조직 줄기 세포, 및 당업계에 공지된 생산, 및 임상적 또는 상업적 용도에 적합한 적응, 예를 들어, 향상된 조직 전달 또는 향상된 신호전달 기능을 포함하는 그들의 유도체를 활성화하는 전장 분자(예: 서열번호 4), 기능적 활성 부분 또는 단편(기능적이도록 배열되거나 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 단편 포함)을 포함한다. 상기 용어는 본원에 기재된 위성 세포를 활성화하는 NAMPT 전부 또는 일부를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체를 포함한다. NAMPT는 오르토로그 및 이소폼을 포함한다.
NAMPT 또는 NAMPTcif의 "기능적 유도체"에 대한 언급은 전장 분자 및 부분, 전장 NAMPT 또는 NAMPTcif의 단편(오르토그 및 동족체 포함), 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체 또는 다량체 형태의 펩티드, 및 본원에 추가로 기재된 바와 같은 변이체 및 이의 다른 변형된 형태를 포함하고, 여기서 기능적 유도체는 적어도 정지 조직 줄기 세포에 결합하고 이의 신호전달, 활성화 및 증식을 유도한다. 본 출원은 새로운 용도를 위한 NAMPT와 같은 공지된 분자의 용도를 제공하고, 또한 본 개시된 조성물, 방법 또는 용도에 사용하기 위한 공지된 분자의 기능적 유도체를 포함하는 신규한 분자를 제공한다.
한 측면에서, 본 출원은 근육 재생을 자극하는 데 사용하기 위한 케모카인 수용체 상호작용 또는 결합 활성 또는 근육 조직 줄기 세포 상호작용 활성을 제공하는 조성물을 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 출원은 섬유증 없이 또는 실질적으로 섬유증 없이 근육 재생을 자극하는 데 사용하기 위한 케모카인 수용체 상호작용 또는 결합 활성, 또는 위성 세포 결합 또는 상호작용 활성을 제공하는 조성물을 제공한다.
하나의 구현예에서, 케모카인 수용체는 CCR5 케모카인 수용체 또는 NAMPTcif에 결합하는 조직 줄기 세포 수용체를 포함하는 NAMPT에 결합하는 조직 줄기 세포 수용체이다. 하나의 구현예에서, CCR5 상호작용 활성을 제공하는 세포 또는 다른 제제를 포함하는 조성물은 조직 줄기 세포, 특히 근육 줄기 세포에 결합한다. 세포 또는 제제는 본원에서 요구되고 기재된 바와 같이 변형시켜 특정 조직 줄기 세포에 대한 결합의 선택성을 향상시킬 수 있다. 세포 또는 제제는 본원에서 요구되고 기재된 바와 같이 변형시켜 사이토카인 수용체 신호전달을 향상시킬 수 있다.
근육과 관련된 "재생"에 대한 언급은 본원에서 광범위한 맥락으로 사용되며, 근육 세포(또한 위성 세포로 칭명됨) 활성화의 직접적인 결과로서 근육 및 근육 관련 조직에 대한 효과에 대한 흐름을 포함한다. 따라서, 재생은 근육 상처 복구 및 근육 유지, 성장, 복구, 생산적으로 증식하고 기능적 조직을 형성하는 근육 세포의 능력의 증강을 포함한다. 상기 용어는 근육 조직의 생성 및 손상된 근육의 복구를 포함하며, 근육 줄기 세포의 활성화 및 증식, 근아세포의 증식, 근세포로의 조기 분화 및 근섬유로의 말단 분화로 개시하는 근육 재생(근육 형성) 과정과 관련이 있다. 하나의 구현예에서, 재생은 섬유성 조직 또는 약화된 조직이 아닌 정상적 또는 거의 정상적인 생물학적 특성을 갖는 천연 구조 또는 재생 조직의 확립을 가능하게 하는 최소한의 섬유증과 관련된다. 근육 기능 특성은 근력(예: 편심근 수축), 힘 및 지구력, 및 물리적 길이 및 용적에 대한 시험을 포함하는 수축근 기능의 표준 시험에 의해 결정될 수 있다. 상기 용어는 또한 상업적 배양에서 근육 조직의 성장을 포함한다.
하나의 비제한적인 구현예에서, 근육 줄기 세포 케모카인 수용체 신호전달을 촉진하는 것은 용적 근육 손실 손상 또는 근육 변성/위축을 포함하는 근육 손상, 또는 근육 또는 신경근 장애, 근육 또는 신경근 퇴행성 상태, 근병증 또는 그에 따른 성향을 갖는 대상체를 치료하는 데 특히 유용하다. 하나의 구현예에서, 케모카인 수용체 결합 활성은 케모카인 수용체 상호작용/결합 인자를 발현하는 대식세포 또는 줄기 세포와 같은 세포, 및 폴리펩티드 또는 펩티드와 같은 분자, 핵산 분자, 항체 또는 이의 수용체 상호작용 부분, 소분자 또는 케모카인 수용체 결합 활성을 갖거나 인코딩(encoding)하는 다른 제제의 형태로 제공된다.
하나의 구현예에서, 본 출원은 줄기 세포의 증식, 예를 들어, 위성 세포 증식을 자극하는 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 상기 방법은 케모카인 수용체 작용제(agonist) 활성을 갖는 대식세포를 포함하는 세포 조성물의 유효량을 세포 또는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, 하나 이상의 근육 줄기 세포 내의 케모카인 수용체 작용제 활성은 근육 줄기 세포의 증식을 자극하거나 향상시키고 근육 생성을 유도한다.
하나의 구현예에서, 케모카인 수용체는 CCR5 수용체이다.
하나의 구현예에서, CCR5 수용체는 조직 줄기 세포 또는 조직 줄기 세포 자손(progeny) CCR5 수용체이다. 하나의 구현예에서, CCR5 수용체는 위성 세포 또는 위성 세포 자손 CCR5 수용체이다.
하나의 구현예에서, 시험관내, 생체내 및 생체외 적용이 고려된다.
하나의 특정 구현예에서, 본 출원은 근육 조직 재생(muscle tissue regeneration)을 자극하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 CCR5 상호작용제(interacting agent)를 포함하거나 인코딩하는 유효량의 조성물을 근육에 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 CCR5 상호작용제는 근육 줄기 세포(위성 세포)에 결합하고, 근아세포 증식 및 근육 재생을 자극한다.
하나의 구현예에서, CCR5 상호작용제는 CCR5 작용제이다. 즉, 그것은 위성 세포의 활성화 및 증식과 같은 수용체 신호전달 또는 다운스트림 이벤트를 자극한다. 하나의 구현예에서, CCR5 상호작용제는 조직 줄기 세포를 특이적으로 활성화한다. 하나의 구현예에서, CCR5 상호작용제는 위성 세포를 특이적으로 활성화한다.
본원에 기재된 바와 같이, 하나의 구현예에서, 상기 방법에 의해 자극된 조직 재생은 최소 섬유증과 관련된다. 따라서, 다른 측면에서, 본 출원은 재생 치료를 받는 환자 또는 생물학적 조직 대상체에서 섬유증 발달을 감소시키는 제제 및 방법을 제공한다.
하나의 구현예에서, 본 출원은 시험관내, 생체내, 또는 생체외에서 근육 조직을 재생하기에 적합한 방법을 제공한다. 따라서, 본원에 기재된 CCR5 상호작용제는 줄기 세포 기반 요법 및 조직 공학에 사용하기 위해 제안된다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 CCR5 상호작용제는 시험관내에서 인공 육류 생산에 사용하기 위한 것이다.
하나의 구현예에서, CCR5 상호작용제는 근육 줄기 세포와의 상호작용을 위해 니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라제(NAMPT)와 경쟁한다. NAMPT는 세포내로 국소화될 때 세포 대사 및 NAD 재생에서 잘 특성화된 효소 역할을 수행하는 다기능 단백질이다. 또한, 이의 분비된 형태(분비된 NAMPT(secNAMPT))는 다수의 조직에서 재생적, 생리학적 및 병리학적 기능의 상반되는 보고와 함께 사이토카인으로서 기능하는 것으로 문서화되었다.
하나의 구현예에서, 줄기 세포 활성화를 촉진할 수 있는 CCR5 상호작용제는 secNAMPT, 또는 사이토카인 핑거(cif) 모티프(cytokine finger (cif) motif)를 포함하는 이의 일부, 또는 사이토카인 핑거(cif) 모티프를 포함하는 이의 유도체이다. 본원에서 NAMPT에 대한 언급은 또한 본원에 기재된 CCR5 상호작용 분자인 부분 또는 단편을 포함하는 secNAMPT 및 유도체에 대한 언급을 포함한다.
따라서, 하나의 구현예에서, 본 출원은 조직 재생을 자극하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 secNAMPT 또는 사이토카인 핑거(cif) 모티프를 포함하는 이의 일부, 또는 사이토카인 핑거(cif) 모티프를 포함하는 이의 유도체, 및 임의로 조직 특이적 전달 모이어티를 포함하거나 인코딩하는 조성물의 유효량을 조직에 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 secNAMPT, 부분 또는 유도체는 조직 내의 성체 줄기 세포에 결합하고, 줄기 세포 활성화, 증식 및 조직 재생을 자극한다.
추가의 구현예에서, 본 출원은 근육 조직 재생을 자극하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 secNAMPT 또는 사이토카인 핑거(cif) 모티프를 포함하는 이의 일부 또는 사이토카인 핑거(cif) 모티프를 포함하는 이의 유도체를 포함하거나 인코딩하는 조성물의 유효량을 근육에 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 secNAMPT, 부분 또는 유도체는 위성 세포에 결합하고, 위성 세포 활성화, 근아세포 증식 및 근육 재생을 자극한다.
하나의 구현예에서, 본 출원은 근육 조직 재생을 자극하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 secNAMPT 또는 사이토카인 핑거(cif) 모티프를 포함하는 이의 일부 또는 사이토카인 핑거(cif) 모티프를 포함하는 이의 유도체를 포함하거나 인코딩하는 조성물의 유효량을 근육에 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 secNAMPT, 부분 또는 유도체는 위성 세포에 결합하고, 위성 세포 활성화, 및 근아세포 증식 및 근육 재생을 자극한다.
더욱 추가의 구현예에서, 본 출원은 근육 조직 재생을 자극하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 secNAMPT 또는 사이토카인 핑거(cif) 모티프를 포함하는 이의 일부 또는 사이토카인 핑거(cif) 모티프를 포함하는 이의 유도체, 및 조직 특이적 전달 모이어티를 포함하거나 인코딩하는 조성물의 유효량을 근육에 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 secNAMPT, 부분 또는 유도체는 위성 세포에 결합하고, 위성 세포 활성화, 근아세포 증식 및 근육 재생 및 실질적인 섬유증(흉터 형성)의 부재를 자극한다.
NAMPT 및 CCR5에 대한 언급은 포유동물, 비포유류 척추동물, 어류 및 조류를 포함하는 임의의 동물로부터의 동족체 및 이의 오르토로그를 포함한다.
하나의 구현예에서, NAMPT 또는 사이토카인 핑거(cif) 모티프를 포함하는 이의 일부 또는 사이토카인 핑거(cif) 모티프를 포함하는 이의 유도체는 서열번호 1 내지 4 중 하나에 제시된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, NAMPT 또는 사이토카인 핑거(cif) 모티프를 포함하는 이의 일부 또는 사이토카인 핑거(cif) 모티프를 포함하는 이의 유도체는 서열번호 1 또는 2 중 하나에 제시된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, 전장 NAMPT 또는 이의 기능적 부분을 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호 8 또는 9 중 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성(identity)을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, NAMPT 부분 또는 사이토카인 핑거(cif) 모티프를 포함하는 이의 일부 또는 사이토카인 핑거(cif) 모티프를 포함하는 이의 유도체를 포함하는 이의 단편을 인코딩하는 핵산 분자는 서열번호 6 또는 7 중 하나에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, cif 모티프를 보유하면서 소수의 치환된 또는 결실된 잔기를 갖는 NAMPT 또는 사이토카인 핑거(cif) 모티프를 포함하는 이의 일부 또는 사이토카인 핑거(cif) 모티프를 포함하는 이의 유도체는 줄기 세포 또는 그들의 보다 분화된 자손, 예를 들어, 위성 세포와 상호작용하는 능력을 매개했다. 하나의 구현예에서, NAMPT 또는 사이토카인 핑거(cif) 모티프를 포함하는 이의 일부 또는 사이토카인 핑거(cif) 모티프를 포함하는 이의 유도체는 상기 서열에 대한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하고, CCR5 또는 조직 줄기 세포 상호작용 활성을 보유한다. 특히, 1 내지 5개의 연속 아미노산의 부분은 NAMPTcif(서열번호 1, 2, 5)로부터 결실될 수 있고, Mapk/Erk 신호전달 캐스케이드(signalling cascade)를 통해 CCR5 신호전달을 유도할 수 있는 기능적 유도체를 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, NAMPT 부분 또는 단편은 CCR5에 결합하는 전장 secNAMPT의 C-말단 부분을 포함하고, 효소 활성이 가능한 부분을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, NAMPT 부분 또는 단편은 CCR5에 결합하는, 케모카인-유사 α-나선 및 β-시트를 갖는 전장 secNAMPT의 C-말단 부분을 포함한다.
하나의 구현예에서, cif 모티프를 포함하지 않는 NAMPT 펩티드는 세포내로 투여되어 정지 근육 세포의 활성화를 개시할 수 있다.
하나의 구현예에서, NAMPT 펩티드는 니코틴아미드 리보뉴클레오티드 결합 부위(아미노산 219, 384, 392, 311-313, 353-354) 또는 디포스페이트 결합 부위 196, 247 및 311)를 포함한다.
하나의 구현예에서, CCR5 작용제 및 NAMPT 또는 이의 부분 또는 단편은 하나 이상의 ECM 및/또는 다른 조직 특이적 결합 부분과 같은 조직 전달 또는 보유 강화 모이어티를 포함한다. 특정 작용 방식에 결부되지 않고, NAMPT 및 NAMPT 유도체는 그들의 수용체를 보유하는 표적 조직 줄기 세포에 대한 결합에 특히 선택적일 수 있으며, 수용체를 보유하는 다른 세포에 대한 결합에서는 그렇지 않아 상기 방법의 선택성을 향상시킬 수 있다.
하나의 구현예에서, CCR5 작용제 및 NAMPT 또는 이의 부분 또는 단편은 신데칸(syndecan) 결합 모이어티와 같은 하나 이상의 신호전달 향상 모이어티를 포함한다.
하나의 구현예에서, 당업계에 공지된 세포외 매트릭스(ECM) 결합 모이어티가 포함된다. 예시적인 ECM 결합 펩티드는 미국 공개 제2014/0011978호 및 미국 공보 제20140010832호에 기재되어 있다. 표준 방법은 링커(linker)를 포함하거나 포함하지 않는 ECM 결합 모이어티와 같은 모이어티에 제제 또는 펩티드를 접합시키는 데 사용된다.
또 다른 구현예에서, 신데칸 결합 모이어티가 신데칸을 통해 강장제 또는 향상된 CCR5 신호전달을 제공하기 위해 포함된다.
하나의 구현예에서, NAMPT 부분 또는 단편은 단량체, 이량체 또는 다량체 형태로 투여된다. 하나의 구현예에서, 이량체는 단량체 형태와 비교하여 증가된 수용체 또는 조직 줄기 세포 결합을 나타낸다.
하나의 구현예에서, 조성물은 CCR5 상호작용제, 특히 본원에 기재되거나 예시된 NAMPT 또는 기능적 유도체를 발현하는 세포를 포함하는 세포 조성물이다.
하나의 구현예에서, 본 출원은 근육 조직 재생을 자극하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 CCR5 상호작용제를 포함하거나 인코딩하는 세포, 및 임의로 근육에의 전달 또는 근육에서의 보유를 향상시키는 성분을 포함하는 조성물의 유효량을 근육에 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 CCR5 상호작용제는 위성 세포에 결합하고, 근아세포 증식 및 근육 재생을 자극한다.
하나의 구현예에서, 세포는 내인성 NAMPT 및/또는 도입된 NAMPT 또는 이의 기능적 유도체를 발현한다.
하나의 구현예에서, 세포는 대식세포이다. 하나의 구현예에서, 대식세포는 조직으로부터 단리된다. 하나의 구현예에서, 대식세포는 줄기 세포, 예를 들어, 골수 전구체(precursor) 또는 iPSC로부터 유도된다. 하나의 구현예에서, 대식세포 또는 대식세포 전구체(단핵구)는 혈액, 림프, 골수와 같은 공급 조직으로부터 단리된 후, 시험관내 세포 또는 조직 배양에 제공되어 목적하는 조직 틈새 지시된 표현형을 유도한다. 하나의 구현예에서, 세포 조성물은 동결보존되고/되거나 전달 제제를 함유한다.
당업계에 공지된 바와 같이, 대식세포는 다양한 수단에 의해 줄기 세포로부터 시험관내에서 생성될 수 있다. IFNg 또는 LPS의 존재하에서 BMSC와 같은 줄기 세포로부터 생성된 대식세포는 일반적으로 "M1 대식세포"로 지칭되는 "염증성" 대식세포로 간주된다. IL-4 또는 IL-10의 존재하에 생성된 것들은 소위 "분해 촉진" 활성을 가지며, "M2" 대식세포로서 지칭된다.
하나의 구현예에서, 대상체 대식세포는 M2 대식세포 마커를 발현한다.
하나의 구현예에서, 대식세포 세포는 mmp9 , arg2 , mmp13a , L- 플라스틴 및 cd163 중 1개 또는 2개 또는 3개 또는 4개 또는 5개를 발현한다.
하나의 다른 구현예에서, 대식세포 서브세트는 prox1a 및 pou2f3을 발현한다.
하나의 구현예에서, 대식세포는 본원에 기재되고 정의된 클러스터 대식세포, 예를 들어, 클러스터 1, 클러스터 2, 클러스터 3, 클러스터 4, 클러스터 5, 클러스터 6, 클러스터 7, 또는 클러스터 8 세포 유형이다. 하나의 구현예에서, 클러스터 대식세포는 본원에 기재된 특징을 가지며, 배양 확장 전에 분화 특징을 정의한다. 하나의 구현예에서, 세포는 주치의에 의해 결정된 양, 예를 들어, 약 1 × 107개 또는 약 1 × 107 내지 2 × 108개의 세포로 투여된다. 투여되는 세포는 주로 본원에서 정의된 바와 같은 하나 이상의 클러스터 유형의 세포이다. 실시예 및 보충 표는 우세한 대식세포/세포 클러스터 유형 사이에서 선택, 검출, 정량화, 기능적으로 특성화 및 식별하는 데 사용될 수 있는 차등적으로 발현된 유전자/마커를 제시한다. 마커는 당업계에 공지된 바와 같이 표면 마커 또는 내부 마커 또는 둘 다일 수 있다. 따라서, 마커는 차등 발현의 수준/정도에 기초하여 선택되어 어느 유전자가 선호도를 취하여 가장 상향조절되거나 하향조절되는지의 선택/검출을 용이하게 할 수 있다. 대안적으로, 마커 및 따라서 세포는 클러스터 세포 유형의 기능적 활성 또는 표현형에 기초하여 선택될 수 있고, 여기서 마커의 검출은 세포의 바람직한/바람직하지 않은 기능적 특징을 나타낸다. 하나, 다수 또는 다수의 마커는 선택에 대한 이론적 근거, 즉 세포 농축, 투여를 위한 세포 선택, 세포 추적, 세포 표적화 등에 따라 사용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 조성물은 줄기 세포 및/또는 대식세포를 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서, 줄기 세포는 위성 세포이다. 또 다른 구현예에서, 줄기 세포는 단능성 또는 다능성 줄기 세포이다.
상기 방법의 하나의 구현예에서, 조성물 중의 CCR5 상호작용제는 NAMPT, 또는 사이토카인 핑거(cif) 모티프를 포함하는 이의 일부 또는 이의 기능적 유도체 또는 약제학적으로 허용되는 염, 수화물, 동족체, 오르토로그, 호변이성체, 입체이성체, 이의 프로드럭이다.
프로드럭은 화학적 또는 생리학적 공정(예: 효소 공정 및 대사 가수분해)을 통해 CCR5 작용제로 전환될 수 있는 제제를 지칭한다. 따라서, 용어 "프로드럭"은 또한 약제학적으로 허용되는 생물학적 활성 화합물의 전구체를 지칭한다. 프로드럭은 대상체에게 투여될 때 불활성일 수 있지만, 생체내에서 활성 화합물로 전환된다. 프로드럭 화합물은 종종 유기체에서 용해도, 조직 적합성 또는 지연 방출의 이점을 제공한다. 용어 "프로드럭"은 또한 이러한 프로드럭이 대상체에게 투여될 때 생체내에서 활성 화합물을 방출하는 임의의 공유 결합된 담체를 포함하는 것을 의미한다. 활성 화합물의 프로드럭은 활성 화합물에 존재하는 작용기를 변형이 통상적인 조작 또는 생체내에서 모 활성 화합물로 절단되는 방식으로 변형시킴으로써 제조될 수 있다. 프로드럭은 하이드록시, 아미노 또는 머캅토 그룹이 활성 화합물의 프로드럭이 대상체에게 투여될 때 절단되어 각각 유리 하이드록시, 유리 아미노 또는 유리 머캅토 그룹을 형성하는 임의의 그룹에 결합되는 화합물을 포함한다.
하나의 구현예에서, CCR5 상호작용제 또는 NAMPT 또는 사이토카인 핑거(cif) 모티프를 포함하는 이의 일부 또는 이의 유도체는 하나 이상의 모이어티, 예를 들어, 링커, 안정성 향상, 신호전달 향상, 전달 향상 또는 표지 모이어티(label moiety)를 포함한다.
하나의 구현예에서, CCR5 상호작용제는 단량체, 이량체 또는 다량체 형태이다.
하나의 구현예에서, CCR5 상호작용제 또는 근육 줄기 세포 상호작용제는 단량체, 이량체 또는 다량체 형태의 NAMPTcif이며, 조직 지시된 또는 ECM 결합 도메인 및/또는 신호전달 향상(예: 신데칸 결합) 도메인도 또한 포함한다.
하나의 구현예에서, CCR5 상호작용제를 인코딩하는 조성물은 CCR5 상호작용제를 발현하는 핵산 분자를 포함한다. 핵산 분자는 RNA 또는 DNA 또는 RNA:DNA 또는 이들의 화학적으로 변형된 형태일 수 있다. 예를 들어, 핵산은 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터의 형태일 수 있다.
또 다른 구현예에서, CCR5 상호작용제는 소분자이다. 본 출원은 조직 줄기 세포 활성화를 유도할 수 있는 소분자 CCR5 작용제를 스크리닝하기 위한 스크리닝 검정을 제공한다. "소분자"는 본원에서 약 1000 달톤 이하, 바람직하게는 약 500 달톤 이하의 분자량을 갖는 것으로 정의된다.
또 다른 구현예에서, CCR5 상호작용제는 항체이거나 이의 CCR5 결합 부분을 포함한다.
또 다른 구현예에서, CCR5 상호작용제는 제제를 대식세포와 같은 골수 세포로 표적화하거나, 제제를 위성 세포와 같은 줄기 세포로 표적화하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다.
본 출원은 본원에 정의된 CCR5 상호작용제를 포함하거나 인코딩하는 조성물을 제공한다. 약제학적 및 생리학적 활성 조성물이 제공된다. 세포 조성물이 명확하게 제공된다.
하나의 구현예에서, 세포는 대식세포이다. 하나의 구현예에서, 대식세포는 조직으로부터 단리된다. 하나의 구현예에서, 대식세포는 줄기 세포, 예를 들어, 골수 전구체 또는 iPSC로부터 유도된다. 하나의 구현예에서, 대식세포 또는 대식세포 전구체(단핵구)는 공급 조직, 예를 들어, 이에 제한되지 않고, 혈액, 림프, 골수로부터 단리된 후, 시험관내 세포 또는 조직 배양에 제공되어 목적하는 조직 틈새 지시된 표현형을 유도한다. 하나의 구현예에서, 세포 조성물은 동결보존되고/되거나 전달제를 함유한다.
당업계에 공지된 바와 같이, 대식세포는 다양한 수단에 의해 줄기 세포로부터 시험관내에서 생성될 수 있다. IFNg 또는 LPS의 존재하에서 줄기 세포, 예를 들어, BMSC로부터 생성된 대식세포는 일반적으로 "M1 대식세포"로 지칭되는 "염증성" 대식세포로 간주된다. IL-4 또는 IL-10의 존재하에 생성된 것들은 소위 "분해 촉진" 활성을 가지며, "M2" 대식세포라고 지칭된다.
하나의 구현예에서, 대상체 대식세포는 M2 대식세포 마커를 발현한다.
하나의 구현예에서, 대식세포 세포는 mmp9 , arg2 , mmp13a , L- 플라스틴 및 cd163 중 1개 또는 2개 또는 3개 또는 4개 또는 5개를 발현한다.
하나의 다른 구현예에서, 대식세포 서브세트는 prox1a 및 pou2f3을 발현한다.
하나의 구현예에서, 대식세포는 본원에 기재되고 정의된 바와 같은 클러스터 대식세포, 예를 들어, 클러스터 1, 클러스터 2, 클러스터 3, 클러스터 4, 클러스터 5, 클러스터 6, 클러스터 7, 또는 클러스터 8 세포 유형이다. 하나의 구현예에서, 클러스터 대식세포는 본원에 기재된 특징을 가지며, 배양 확장 전 분화 특징을 정의한다. 하나의 구현예에서, 세포는 주치의에 의해 결정된 양, 예를 들어, 약 1 × 107개 또는 약 1 × 107 내지 2 × 108개의 세포로 투여된다. 투여된 세포는 주로 본원에 정의된 하나 이상의 클러스터 유형의 세포이다. 실시예 및 보충 표는 우세한 대식세포/세포 클러스터 유형 사이에서 선택, 검출, 정량화, 기능적 특성화 및 식별에 사용될 수 있는 차등적으로 발현된 유전자/마커를 나타낸다. 마커는 당업계에 공지된 바와 같이 표면 마커 또는 내부 마커 또는 둘 다일 수 있다. 따라서, 마커는 어느 유전자가 선호도를 취하여 가장 상향조절되거나 하향조절되는지의 선택/검출을 용이하게 하기 위해, 차등 발현의 수준/정도에 기초하여 선택될 수 있다. 대안적으로, 마커 및 따라서 세포는 클러스터 세포 유형의 기능적 활성 또는 표현형에 기초하여 선택될 수 있고, 여기서 마커의 검출은 세포의 바람직한/바람직하지 않은 기능적 특징을 나타낸다. 선택의 이론적 근거, 즉 세포 농축, 투여를 위한 세포 선택, 세포 추적, 세포 표적화 등에 따라, 하나, 여러 개 또는 다수의 마커가 사용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 조성물은 지지 물질, 예를 들어, 하이드로겔, 접착제, 발포체 또는 보유 물질(retentive material), 스캐폴드(scaffold) 등을 포함하거나 이들과 함께 투여된다. 섬세한 구조는 일반적으로 보다 섬세한 조직 재생을 가능하게 하기에 적합하다. 예로서, 매우 빠르게 흡수되는 물질, 예를 들어, 특정 피브린, 콜라겐, 하이드로겔 및 알기네이트 제형이 사용될 수 있다. 대안적으로, 천천히 흡수 가능한 합성물질, 예를 들어, 폴리-4-하이드록시부타레이트가 사용될 수 있다. 실크 섬유, 또는 심지어 포유류 기원으로부터 유래된 실질적으로 매끄러운 제품, 예를 들어, 근육 세포외 매트릭스도 또한 고려된다. 비흡수성 합성물질, 예를 들어, 폴리프로필렌 및 폴리에틸렌은 지지 및 신뢰성을 제공한다. 하나의 구현예에서, 조성물은 피브린 하이드로겔을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 표적 부위에 대한 CCR5 상호작용제의 조직 재생 및 생체 이용률을 향상시키기 위해, RAFT-아크릴아미드 기반 지지 표면이 제공된다.
하나의 구현예에서, 본 출원은 사이토카인 핑거(cif) 모티프를 포함하는 NAMPT의 C-말단 부분을 포함하는 NAMPT 폴리펩티드 단편, 또는 이의 변형된 형태 또는 기능적 유도체를 제공한다.
하나의 구현예에서, NAMP 폴리펩티드 단편은 서열번호 1 또는 2 또는 5에 제시된 펩티드 서열(단량체 NAMPTcif), 또는 서열번호 1 또는 2 또는 5에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, 서열번호 1 또는 2 또는 5에 제시된 펩티드 서열(단량체 NAMPTcif) 또는 서열번호 1 또는 2 또는 5에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 NAMPT 폴리펩티드 단편을 인코딩하는 핵산 분자가 제공된다. 예시적인 핵산 서열은 서열번호 6 내지 9 및 표 4에 제시되어 있다. 하나의 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 6 또는 7(각각 마우스 및 인간 NAMPTcif)에 대해 적어도 80% 동일성을 포함한다.
본원에서 적어도 80% 서열 동일성에 대한 언급은 이와 적어도 81%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 분자를 명시적으로 포함한다.
하나의 구현예에서, NAMPT의 단편 또는 부분은 서열번호 3에 제시된 전장 NAMPT의 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 미만인 다수의 NAMPT 아미노산을 포함한다.
하나의 구현예에서, NAMPT 폴리펩티드 단편은 링커, 안정성 또는 신호전달 향상 모이어티, 전달 또는 보유 향상 모이어티 또는 표지 모이어티를 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서, NAMPT 단편은 단량체, 이량체 또는 다량체 형태이다. 단백질의 재접힘 프로토콜은 당업계에 공지되어 있다.
하나의 구현예에서, 본원에 기재된 NAMPT 폴리펩티드 부분 또는 단편 및 (i) 위성 세포 또는 그에 따른 전구체 또는 이의 자손, (ii) 대식세포 또는 그에 따른 전구체, 또는 이의 자손, (iii) 스캐폴드(반고체 또는 고체 지지체) 또는 보유 물질 및 (iv) 조직 전달 향상 또는 세포 보유 모이어티 중 임의의 1개 또는 2개 또는 3개 또는 4개를 포함하는 조성물이 제공된다.
하나의 구현예에서, 스캐폴드 또는 보유 물질은 하이드로겔, 예를 들어, 피브린 또는 아크릴아미드 하이드로겔이다. 하나의 구현예에서, 조직 전달 향상 또는 세포 보유 모이어티는 ECM 결합 모이어티이다.
하나의 구현예에서, 본 출원은 다음 중 1개 또는 2개 또는 3개 또는 4개 또는 5개를 포함하는 약제학적 또는 생리학적 활성 재생 조성물을 가능하게 한다:
(i) 본원에 정의된 바와 같은 CCR5 상호작용제를 포함하거나 인코딩하는 단계,
(ii) 위성 세포 또는 그에 따른 전구체 또는 이의 자손
(iii) 대식세포 또는 그에 따른 전구체 또는 이의 자손
(iv) 스캐폴드 또는 보유 물질
(v) 조직 전달 향상 성분.
특정 구현예에서, 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 전장 NAMPT 형태의 CCR5 상호작용제 또는 단량체 또는 이량체 형태의 이의 사이토카인 상호작용 단편(cif)은 제제가 생물학적 담체 또는 세포외 매트릭스에 부착하기에 적합하도록 변형된다. 또한, 제제는 헤파린 설페이트 프로테오글리칸(예: 신데칸)과 같은 공동 수용체에 결합하는 모이어티의 첨가에 의해 CCR5 수용체를 통한 신호전달을 향상시키도록 변형되었다.
제안된 변형을 포함하는 CCR5 상호작용제는 NAMPT를 사용하는 실시예에서 예시되었지만, 본원에 기재된 실험은 CCR5 작용제 CCL4 및 CCL8이 또한 골격근 위성 세포에서 작용하여 근육 근아세포 증식을 자극한다는 것을 보여준다. 따라서, CCL4 및 CCL8은 추가의 예시적인 CCR5 제제이며, 전장, 부분 및 단편(cif 모티프 포함), 및 이들의 유도체는 본 방법에서 사용하고 본원에 기재된 바와 같은 재생 조성물의 제조에 사용하기 위해 제안된다. 특정 구현예에서, 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 전장 CCL4 또는 CCL8 형태의 CCR5 상호작용제, 또는 단량체 또는 이량체 형태의 이의 사이토카인 상호작용 단편(cif)은 제제가 생물학적 담체 또는 세포외 매트릭스에 부착하기에 적합하도록 변형된다. 또한, 제제는 헤파린 설페이트 프로테오글리칸(예: 신데칸)과 같은 공동 수용체에 결합하는 모이어티의 첨가에 의해 CCR5 수용체를 통한 신호전달을 향상시키도록 변형된다.
하나의 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 시험관내, 생체외 또는 시험관내에서 근육 재생을 자극하는 데 사용하거나 또는 자극하는 데 사용되는 조성물을 제조하는 데 사용하기 위한 것이다.
하나의 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 인공 근육 생산(직접 또는 간접 소비를 위한 어류, 조류 또는 다른 비인간 동물 근육)에 사용하기 위한 것이거나 사용하는 경우이다. 예를 들어, 성장 배지에 대한 NAMPT의 보충은 확장성과 보다 효율적인 근육 증식을 가능하게 한다.
하나의 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 줄기 세포 치료에 사용하기 위한 것 또는 사용하는 경우의 것이다. 따라서, 조성물은 시험관내 확장을 지지하고/하거나 이식편에 (또는 전처리로서) 포함되어 생체내 확장 및 조직 통합을 촉진한다.
하나의 구현예에서, 본 출원은 조직 재생을 자극하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 단리된 또는 조직 상주 조직 줄기 세포(tissue-resident tissue stem cell) 또는 이의 전구체에 CCR5 상호작용제, 및 임의로 조직으로의 전달을 향상시키는 성분을 포함하거나 인코딩하는 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 CCR5 상호작용제는 조직 줄기 세포 또는 그들의 전구체에 결합하고 정지 조직 줄기 세포 증식 및 조직 재생을 자극한다(활성화한다). 하나의 구현예에서, CCR5 상호작용제는 표적 조직으로의 전달을 향상시키는 성분 또는 모이어티를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 근육, 신경근, 또는 근골격의 결핍, 장애, 또는 손상의 치료에 사용하기 위한, 또는 치료하는 데 사용하기 위한 조성물을 제조하는 데 사용되거나 사용하기 위한 것이다. 근육, 신경근, 또는 근골격의 결함, 장애, 또는 손상은 당업계에 공지되어 있다. 결핍 및 장애는, 예를 들어, 제한 없이, 근육 감소증(sarcopenia), 악액질(cachexia) 및 근이영양증(muscular dystrophies), 근위축증(muscle atrophy), 근육 의사 비대(muscle pseudo hypertrophy) 또는 근이영양증 상태(muscle dystrophy conditions) 및 근병증(myopathy)에서 발견된다. 모든 적절한 형식, 예를 들어, 스위스 스타일 사용, 처리 방법 및/또는 EPC 2000 스타일 청구범위가 포함된다.
특허 또는 출원 파일에는 컬러로 작성된 적어도 하나의 도면이 포함되어 있다. 컬러 도면(들)을 포함한 이 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 요청 및 필요한 수수료 지불시 특허청에서 제공할 것이다.
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도 1. 손상 반응성 대식세포의 서브세트는 복구 중에 상처 부위에 거주한다. a-c, 무손상 근육(Tg(actc1b:GFP), 자홍색) 4dpf(a)에서 대식세포(MΦ)(Tg(mpeg1:GAL4FF/UAS:NfsB-mCherry), 황색)에 의해 순찰된다. 손상시, MΦ가 활성화되고, 상처 부위로 빠르게 이동한다(b-b", 화살촉)(n = 3). (c) 손상 반응성 MΦ의 이동 경로가 그래프로 표시되고, 여기서 (0,0)은 상처의 중심으로 설정된다. d-f, 모든 이미징은 뚜렷한 시간적 위상(f)에서 상처를 점유하는 2개의 MΦ 서브세트, 초기 손상 반응 일시적(d) 및 후기 손상 위치 거주 서브세트(e)(화살촉)(n = 8)를 식별한다. g-i, 이들 두 서브세트의 형태학적 특성화는 일시적 MΦ가 낮은 구형도(i)를 갖는 성상(g)인 반면, 거주 MΦ는 높은 구형도(i)를 갖는 보다 원형(h)(그룹당 n = 69 MΦ)임을 나타냈다. 평균±S.D. 쌍을 이루지 않은 t-테스트에서의 유의성(****P<0.0001). j-m, 상처 위치된 MΦ의 추적은 거주 MΦ가 일시적 MΦ에서 유래된다는 것을 나타낸다. (j) 광 변환 전략의 개략도. 1dpi에서 Tg(mpeg1:Gal4FF/UAS:Kaede) 유충의 손상 위치된 MΦ를 광 변환시키고(k-k", 변환 전, 자홍색(화살촉), 변환 후; 황색), 2dpi(l-l")에서 재평가하고, 정량화하였다(m, n = 20). 쌍을 이루지 않은 t-테스트에서는 유의하지 않다(ns). n-n', 24hpi에서 손상이 있는 거주 MΦ의 후향적 추적은 손상 근접 기원을 식별하였다. (n) 이미징 동안 거주 MΦ 트랙 투영은 전체 유충에 겹쳐진다. (n') 이미징 후 상이한 시점에서 거주 MΦ(황색)의 위치는 그들의 기원과 손상 부위(청색)(n = 4)로 순차적 이동을 입증한다.
도 2. 거주 대식세포는 생체내에서 근육 줄기 세포 증식을 유도한다. a, 모든 MΦ 또는 특히 Tg(mpeg1:GAL4FF/UAS:NfsB-mCherry) 유충 중 거주 MΦ를 절제하기 위해 프로드럭 메트로니다졸(Mtz)을 추가하기 위한 투여 전략 개략도. b-h, 이러한 두 절제 전략은 복굴절 이미징(b-g') 및 정량화(h, n = 24)에 의해 관찰된 바와 같이, 상당한 재생 결핍을 초래한다. i-l, 레이저 절제 손상(점선) 후, 일시적 MΦ가 상처 부위로 이동한다((Tg(mpeg1:GAL4FF/UAS:NfsB-mCherry), 황색)(i-k). 동시에, 활성화된 pax3a + 근원성 줄기 세포(TgBAC(pax3a:GFP), 청록색)는 손상되고 인접한 근절로부터 손상 부위의 가장자리를 따라 이동한다(i-k, 화살촉). MΦ가 거주 아형으로 전환되면, 그들은 상처 가장자리 라이닝 pax3a+ 세포(l, 직교도)(n=5)와의 상호작용을 시작한다. m. 정량화된 일시적 및 거주 MΦ에 대한 중단되지 않은 대식세포-줄기 세포 상호작용의 길이(n = 5 손상으로부터 추출됨). 평균 ± S.D. 쌍을 이루지 않은 t-테스트. n, 이러한 상호작용의 고해상도 AiryScan 현미경 검사는 거주 MΦ가 pax3a+ 근육 줄기 세포(화살촉)와 장기간 밀접한 연관성을 유지한 다음, 관련된 줄기 세포가 세포 분열을 겪는다(n = 10)는 것을 나타낸다. o-q, 거주 MΦ 절제 후 줄기 세포 증식의 EdU 통합 평가, o)는 상처 부위에서 근육 줄기 세포 분열을 유지하기 위해 이 MΦ 서브세트에 대한 요구 사항을 나타낸다. 손상 영역의 모든 EdU+ 증식 세포는 pax3a로 공동 표지되었으며, 이와 같이, 근원성 줄기/전구 세포는 복구 과정의 이 시점에서 재생물에 존재하는 유일한 증식 세포이다. 손상 영역 외부의 근절 세포 증식의 항상성 수준은 이러한 분석에 대한 내부 특이성 조절을 제공하며, 상처 외부에서 관찰되는 거주 MΦ의 존재 또는 부재하에 세포 증식에서 유의한 차이는 없다. 정량화(q). 평균±S.D. Tukey의 다중 비교 테스트에 의한 이원 ANOVA에서의 유의성(****P <0.0001).
도 3. 단일 세포 RNA-seq는 독특한 mmp9 양성 거주 대식세포 서브세트를 식별한다. a, 손상 반응성 대식세포 scRNA-seq 워크플로우의 개략도. b, 자발적인 세포 클러스터를 나타내는 UMAP 산점도. 적절한 필터링 후, 1309개의 세포가 분석되었다. c, 이 그래프에서, 단리된 MΦ의 손상 시점은 UMAP 산점도에 중첩되고, 무감독 클러스터링과 기재된 일시적 및 거주 MΦ 아형 사이의 상응성을 예시한다. d, 무손상 MΦ는 함께 클러스터화한다(클러스터 3). "일시적" 시점(1dpi)에서 단리된 대식세포는 또한 주로 함께 클러스터화한다(클러스터 1). 나머지 6개의 클러스터(0, 2, 4, 5, 6, 7)는 주로 '거주' 시점(2-3dpi)으로부터 단리된 대식세포로 구성된다. e, 분류된 세포의 대식세포 동일성은 pan-백혈구 마커 lcp1(L-플라스틴) 및 pan-대식세포 마커 cd163(cd63)의 집단적 발현에 의해 검증되었다. 공지된 재생 촉진 MΦ 마커 arg2, mmp9 및 mmp13a는 MΦ를 제공하는 클러스터 2에 집중된다. 이러한 마커를 발현하는 클러스터 2 중 세포의 백분율이 표시된다. 또한, 이 클러스터는 또한 nampta를 차등적으로 발현한다. 특징 플롯에서 시각화된 유전자 발현 수준은 스케일링 팩터(scaling factor) 10,000을 사용하는 로그 정규화된 유전자 판독 계수이다. f, 바이올린 플롯은 클러스터 동일성과 단리 시점을 기반으로 하는 mmp9 및 nampta의 발현 패턴을 보여준다. 2dpi에서 마커를 발현하는 세포의 백분율이 문서화된다. g -k. 계통 분석은 분할 기반 그래프 추상화(PAGA)를 사용하여 수행되었다. PAGA 연결성의 볼-및-막대 표현; 파이 차트는 단리 시간을 기반으로 하는 대식세포 조성을 나타내는 클러스터(클러스터 세포 크기를 반영하는 크기)를 나타내고; 가장자리 두께는 클러스터 간 연결성의 통계적 측정값을 나타낸다(g). 세포는 PAGA-초기화된 힘 지시된 레이아웃(FDL)을 사용하여 재매립되었고, 여기서 세포는 그들의 단리 시점 아이덴티티(h), Seurat 클러스터 아이덴티티(i) 및 의사 시간 추론(j)에 따라 그룹화되었다. (k) PAGA 경로 그래프는 PAGA 클러스터의 경로 3-0-4-2에 따른 mmp9+-거주 대식세포 서브세트 및 PAGA 클러스터의 경로 3-5-1-6에 따른 prox1a+/pou2f3+-거주 대식세포 서브세트의 정의로 이어지는 유전자 발현 변화를 시각화한다. 수치 스케일(오른쪽)은 Seurat로부터 정규화된 유전자 발현을 나타내는 반면, 클러스터(아래)는 PAGA 경로를 따라 서브세트를 나타내며, 길이는 각 클러스터 중 세포 수에 비례한다. l. mmp9 RNA의 시공간적 발현은 바늘 찔림 손상 후 원위치 하이브리드화에 의해 검정되었다. mmp9 발현은 2dpi 이후부터(n>15) 상처 부위에서 특이적으로 상향조절된다. m -n, 상처 부위에서 mmp9 발현(TgBAC(mmp9:EGFP), 자홍색)은 공간적으로 분해되고, 거주 MΦ(Tg(mpeg1:GAL4FF/UAS:NfsB-mCherry), 황색)의 서브세트(흰색 화살촉)에 존재하는 것으로 식별되었다. 정량화(n). 평균 ± S.D. 쌍을 이루지 않은 t-테스트. (o) 이러한 mmp9 발현 MΦ(자홍색)는 상처 존재 pax3a+ 줄기 세포와 관련되었다(청록색, 상처 부위: 흰색 점선, n = 15). p -r, TgBAC(mmp9:EGFP-NTR) 유충에서 mmp9 발현 거주 MΦ의 일시적으로 제어된 메트로니다졸(Mtz) 기반 절제는 중요한 골격근 재생 결핍으로 이어진다(p). 정량화(q). mmp9+ MΦ 절제된 유충에서 EdU 통합을 검정하면 상체 부위 위치된 근육 줄기 세포 증식의 상당한 감소를 나타냈다(r). 대표적인 이미지는 도 10g에 제시되어 있다. 평균±S.D. Tukey의 다중 비교 테스트에 의한 이원 ANOVA(q,r).
도 4. Ccr5에 결합하는 대식세포 분비 Nampt는 줄기 세포 증식을 유도한다. a, 손상 부위(흰색 점선) 내에서, Nampt(자홍색)는 근육 줄기 세포(청록색)와 관련된 대식세포(황색, 빨간색 화살촉은 Nampt+/mpeg1+ MΦ를 강조한다)에 의해 발현될 뿐만 아니라 세포외 공간에 존재한다(n = 15). b -i, 새로운 조직 특이적 기능 상실 돌연변이유발 전략을 이용하여 손상 반응성 대식세포에서 Nampta의 특정 역할(개략도, b) 및 근육 줄기/전구 세포에서 Ccr5의 특정 역할(개략도, c)을 독립적으로 평가했다. Mpeg+ 세포 특이적 Nampta 및 Pax7b+ 세포 특이적 Ccr5 녹아웃 유충은 모두 현저한 재생 결핍을 나타냈다(이미지화됨(d) 및 정량화됨(e)). 두 경우에, 이는 상처 상주 근육 줄기 세포에서 필요한 증식 반응을 유지할 수 없는 불능으로 인해서였다(이미지화됨(f,h) 및 정량화됨(g,i)). j, NAMPT 보충은 유충 제브라피시 바늘 찔림 근육 손상 후 상처 상주 근육 줄기 세포 증식을 특이적으로 향상시켰다. NAMPT 보충은 대식세포를 절제함으로써 생성된 증식 결핍을 구제한다(4dpf/0dpi에서 첨가된 5mM Mtz). 그러나, NAMPT는 Ccr5/Ccr2 이중 길항제 세니크리비록(CVC)을 투여함으로써 생성된 증식 결핍을 구제하지 못했다. 표준 Ccr5 리간드 CCL4는 증식을 향상시키는 기능을 했지만, 손상 영역과 손상 외부 부위 사이의 차별을 입증하지 못했다. 실험 조건 대 미처리 대조군의 확률 값과 유의성은 각 바이올린 플롯의 상부에 기록했다. 대표적인 이미지가 제시된다(도 14d. k, 마우스 1차 근아세포 단일 배양물에서 PAX7+ 위성 세포는 외인성 NAMPT 또는 CCL4 보충에 의해 매개되는 CCR5 수용체 신호전달시 향상된 증식을 나타낸다. 근아세포를 대식세포와 공동 배양하면 위성 세포 증식이 자극되었다. 이 증식 촉진 반응은 CCR5 특이적 억제제 마라비록(MVC)의 투여에 의해 제거되는 반면, CCR2 특이적 억제제 PF-4136309(PF4)는 부정적인 효과를 갖지 않으며, 줄기 세포에 대한 대식세포의 증식 촉진 기능은 CCR5 신호전달에 의해 매개된다는 것을 재확인한다. 또한, NAMPT를 분비하지 않는 3T3 세포와 근아세포를 공동 배양하는 것은 위성 세포 증식을 자극하지 않고, NAMPT를 줄기 세포 증식을 구동하는 증식 촉진 신호를 구동하는 대식세포로서 제안한다. e , g, i, j, k, 평균±S.D. Tukey 다중 비교 테스트에 의한 이원 ANOVA. l -o, NAMPT의 국소 전달은 성체 마우스의 근육 손상 모델에서 근육 재생을 촉진한다(개략도, l). (m) 용적 근육 결함이 생성되고 피브린 하이드로겔을 통해 전달되는 NAMPT로 직접 처리되었다. 결함의 중앙을 통해 뮤린 직근 대퇴골(RF) 근육(치료 후 10일)의 마슨의 트리크롬 염색된 대표적인 조직 절편은 NAMPT 전달이 재생된 근육 영역(어두운 적색, 정량화, n)을 상당히 증가시키는 동시에, 섬유성 조직의 상당한 감소를 나타낸다(보라색/청색, 흰색 점선은 섬유성 근육 섬유와 건강한 근육 섬유 사이의 분리를 구분하는 반면, 근육을 둘러싸는 근막은 청색으로 염색된다(정량화, o))는 것을 입증한다. n,o, 평균±SEM. 다중 비교를 위한 Dunnett 사후 테스트에 의한 일원 ANOVA(그룹당 n = 5 마우스). p-t, 위성 세포는 외인성 NAMPT 보충시 향상된 증식을 입증했다. 마우스 근육 손상은 피브린 또는 피브린 단독 대조군에 전달된 NAMPT(0.5㎍)로 치료되었다. (p-q) 위성 세포의 총 수(PAX7+)(p) 및 증식 단계의 위성 세포 수(PAX7+/Ki67+)(q)는 치료 후 4일째에 채취된 조직에서 유세포 계측법에 의해 정량화되었다. 그래프는 채취된 조직에서 10,000개 세포당 위성 세포의 분획을 보여준다(피브린 그룹의 경우 n = 6 마우스, NAMPT 치료 그룹의 경우 n = 5 마우스). 게이팅 전략은 도 10e에 제시되어 있다. (r) 치료 후 6일째 채취된 조직에 대해 PAX7(위성 세포, 황색), 밀 배아 응집소(WGA, 자홍색) 및 핵(DAPI, 청색)에 대해 염색된 대표적인 근육 재생 동결 절편. (s-t) 중앙 유핵화 근육 섬유는 치료 후 6일째에 정량화되었다(그룹당 n = 6 마우스)(s). 헤마톡실린과 에오신을 포함한 대표적인 조직학 조직 절편(t). p,q,s, 평균±S.E.M. 양측 스튜던트 t-테스트.
도 5.
거주 대식세포는 재생 과정에 필수적인 근육 손상 후 일시적인 틈새를 확립한다. a-c'", 바늘 찔림 근육 손상 후 Tg(actc1:BFP) 표지 분화된 근육 섬유(자홍색, a', b', c'), TgBAC(pax3a:GFP) 표지 pax3a+ 근아세포(청록색, a", b", c") 및 Tg(mpeg1:GAL4FF/UAS:NfsB-mCherry) 표지 대식세포(황색, a'", b'", c'")에 대해 유전자 도입된 동일 개별 어류의 최대 강도 투영 이미지. d, 2dpi까지, 원래 손상 반응성 MΦ의 51.6%가 상처 부위에 남아 있고, 이들 거주 MΦ는 친근원성(n=20)인 일시적 손상 틈새를 계속 확립한다. e -i, 니트로리덕타제 매개 대식세포 절제 파라미터의 확립. (e-i) 유전자 도입 라인인 Tg(mpeg1:GAL4FF/UAS:NfsB-mCherry)는 대식세포 내에서 특이적으로 효소 니트로리덕타제를 발현하여 프로드럭 메트로니다졸(Mtz)의 첨가에 의해 대식세포의 시간적으로 제어된 유전자 절제를 가능하게 한다. 최적의 Mtz 농도는 유충을 5 및 10mM Mtz로 24시간 처리하고(4dpf에서 시작), 트렁크 존재 MΦ를 시각화(e) 및 정량화함(f)으로써 확립되었다. 5mM Mtz 처리(f, n = 10)에 의해 5dpf에서 77% MΦ 절제가 달성되었다. 무손상 유충은 10mM Mtz를 견딜 수 있었지만, 이 농도에서 수행된 바늘 찔림 손상은 심각한 치사율을 초래했다. 따라서, 모든 추가 실험은 MΦ 절제에 5mM Mtz를 사용했다. (g-g') 관심 있는 MΦ 서브세트를 특이적으로 절제하기 위한 Mtz 투여 시간 적정. (g) 5mM Mtz에 대한 시간 반응은 Mtz 첨가(4dpf) 직후의 유충 제브라피시의 머리와 꼬리 영역을 저속도 이미징에 의해 시각화되었다. MΦ 절제는 Mtz 처리 3시간 후에 시작된다. 프레임은 보충 비디오 5(n=8)에서 추출된다. (g') 손상 지점에 Mtz를 추가하면 모든 MΦ(황색, 제브라피시 트렁크의 명시야 이미지에 겹쳐져 표시됨)가 절제되는 반면, 1.75dpi(5dpf)에서 Mtz를 추가하면 거주 MΦ가 선택적으로 절제되었다(n = 10). (h-i) 대식세포의 절제는 2dpi에서 손상에 대한 호중구의 반응을 변경하지 않았다(이미지화(h) 및 정량화(i), n = 12). j, 골격근 손상에 반응한 호중구 이동의 시간적 서열을 검정하고 정량화하였다(k, 5-6hpi에서 n=14, 1dpi에서 n=13, 2dpi에서 n=12). l -o, 니트로리덕타제 매개 세포 절제의 대조군 실험으로서, 호중구를 유전자삽입(transgenic) 라인 Tg(mpx:KALTA4/UAS:NfsB-mCherry)를 사용하여 선택적으로 절제하였다. 4dpf에서 시작하는 5mM Mtz 처리 24시간 후 절제 효율을 시각화하고(l), 5dpf에서 정량화하였다(m, n = 10). (n) 바늘 찔림 손상 후, 유충을 5mM 및 10mM Mtz(4dpf/0dpi)에 침지시켜 모든 호중구를 절제하고, 5dpf(1.75dpi)에서 5mM Mtz에 침치시켜 후기 손상 존재 호중구를 특이적으로 절제하고(Mtz 처리는 매일 Mtz 약물 리프레쉬와 함께 7dpf/3dpi에서 실험 종점까지 유지되었다), 재생을 복굴절(n)에 대해 이미징하여 모니터링하고, 정량화하였다(o, n = 12). 호중구 절제된 유충은 Mtz 투여량 또는 타이밍에서 재생 결함을 나타내지 않았으며, 재생을 자극하는 데 있어 대식세포의 특정 요구 사항을 강조하고 임의의 재생 결함이 메트로니다졸 관련될 가능성을 배제했다. d , f, k, m, 평균±S.D. 다중 비교를 위한 Dunnett 사후 테스트에 의한 일원 ANOVA. i, 평균±S.D. 쌍을 이루지 않은 t-테스트. o, 평균±S.D. Tukey의 다중 비교 테스트에 의한 이원 ANOVA.
도 6. 대식세포 절제는 근육 손상 후 조직 파편 클리어런스를 방해하지 않는다. a-f, Tg(mpeg1:GAL4FF/UAS:NfsB-mCherry)(니트로리덕타제를 발현하는 대식세포) 내의 3dpf 대식세포에서 유전자삽입 라인은 5mM 메트로니다졸(Mtz)의 첨가에 의해 유충 제브라피시에서 제거하였다. 이어서, 대식세포 절제된 유충을 4dpf에서 바늘 찔림 골격근 손상을 겪었고, 상처 부위는 다수의 기준에 의해 손상된 근육 섬유의 클리어런스에 대해 검정되었다. (a) 팔로이딘 염색, 잔류 근육 섬유 마킹. 대조군과 대식세포 절제 유충 사이에는 차이가 없다. 제시된 시점당 n = 3의 독립적 손상, 이미징된 시점당 n = 12의 손상. (b-c) 아폽토시스/식세포 신호전달 과정을 표시하는 아넥신 V는 유전자삽입 라인 Tg(ubi:secAnnexinV-mVenus)(자홍색, 제시된 시점당 n = 3의 독립적인 손상)을 사용하여 생체내에서 시각화하고(b), 정량화되었다(c). (d-e) LysoTracker(자홍색)로 마킹된 산성 세포기관을 이미징하고(d) 정량화하였다(e). (c, e) 평균±S.D. Tukey의 다중 비교 테스트(c) 또는 쌍을 이루지 않은 t-테스트(e)에 의한 이원 ANOVA. 대조군과 대식세포 절제 유충 사이에 차이는 분명하지 않다. (f) 바늘 찔림 손상 근절을 통한 헤마톡실린 및 에오신 염색 단면은 대식세포 절제 유충(그룹당 n = 3 유충)의 상처 후 3일째에 상처 부위(검은색 화살촉)가 제거되었음을 입증한다.
도 7. 거주 대식세포-근육 줄기 세포 결합은 근육 줄기 세포 증식을 선행한다. a-c, 거주 대식세포가 상호작용하는 pax3a+-근원성 세포는 또한 근육 줄기 세포 마커 met(a-b) 및 pax7b(c)를 발현한다. (a) TgBAC(pax3a:GFP)(청록색) 및 Tg(met:mCherry-2A-KALTA4/UAS:NfsB-mCherry)(자홍색)에 대한 유전자 도입 유충에서 바늘 찔림 골격근 손상(흰색 점선) 후, 상처 존재 근육 줄기 세포는 pax3a+/met+이다. 이들 세포는 대칭성 확장(흰색 개방 화살촉)과 비대칭성 분열(닫힌 황색 화살촉)을 모두 겪고, 각각 2개의 pax3a+/met+ 딸 세포 또는 pax3a+/met+ 및 pax3a+/met- 딸 세포를 생성한다. 광범위한 근원성 마커 pax3a+는 이러한 이벤트 각각을 시각화한다(n=20). (b) 저속도 이미징을 사용하여 레이저 절제 골격근 손상(흰색 점선) 후 근육 줄기 세포(TgBAC(pax3a:GFP)/Tg(met:mCherry-2A-KALTA4/UAS:NfsB-mCherry), 청록색/황색 이중 양성 세포) 및 거주 대식세포(Tg(mpeg1:GAL4FF/UAS:NfsB-mCherry), 황색) 상호작용을 시각화하였다. 거주 대식세포(흰색 닫힌 화살촉)는 pax3a+/met+ 근육 줄기 세포(자홍색 개방 화살촉)와 상호작용한 다음, 근육 줄기 세포는 대칭성 분열을 겪어 2개의 pax3a+/met+ 전구세포를 생성한다. 프레임은 보충 비디오 9(n=6)에서 추출됨. (c) 상처 부위(흰색 점선) 존재 거주 대식세포(Tg(mpeg1:GFP), 황색)는 마커 pax7b(청록색, Tg(pax7b:GAL4FF/UAS:NfsB- mCherry))를 또한 발현하는 근육 줄기 세포와 상호작용한다. d -f, 근육 줄기 세포는 대식세포 유래 신호와 독립적으로 손상 부위로 이동한다. 대식세포(Tg(mpeg1:GAL4FF/UAS:NfsB-mCherry), 황색) 및 근육 줄기 세포(TgBAC(pax3a:GFP), 청록색)가 동시에 이동하여 손상 부위를 채우기 때문에, 서로의 의존성을 평가하였다. 대조군 유충 및 대식세포 절제 유충(모든 대식세포를 절제하기 위해 손상 지점(4dpf)에 첨가된 5mM Mtz)이 모두 바늘 찔림 골격근 손상 후 2dpi(흰색 화살촉)에서 손상 부위(흰색 점선)에서 pax3a+ 줄기 세포(d) 및 14 hpi에서 레이저 절제 근육 손상 후 손상 부위(황색 별표)의 가장자리를 라이닝하는 근육 줄기 세포(e)를 나타냈다. 레이저 손상 반응성 대식세포의 정량화(f). 평균±S.D. 쌍을 이루지 않은 t-테스트에서는 유의하지 않다. 대조군 설정(상부 패널 d, e)에서, 이러한 세포는 대식세포와 관련되었다. 바늘 찔림 손상 후 3dpi에서, 대조군 유충은 치유 근육 손상의 특징인 상처(d)에 존재하는 pax3a+ 근육 줄기 세포에서 생성된 재생된 청록색 형광 지속성 근육 섬유(적색 화살촉)를 나타냈다. 대조적으로, 상처 부위는 여전히 대식세포 절제된 유충에서 3dpi에서 pax3a+ 줄기 세포에 의해 점유되었지만, 초기 pax3a+ 줄기 세포 유래 근육 섬유는 존재하지 않았고(d), 상처 부위에서 대식세포의 존재가 pax3a+ 근원성 세포 이동에 전제 조건은 아니지만, 그러한 이동된 세포가 근원성 보충 프로그램에 들어가는 것이 필요하다(n = 12)는 것을 강조한다. g, 거주 대식세포는 상처 반응성 근육 줄기 세포와 상호작용한다. 3개의 독립적인 레이저 절제 근육 손상 부위의 예는 거주 대식세포-줄기 세포 연관성에 이어 줄기 세포 분열(화살촉)을 보여준다. 이미징은 유전자삽입 제브라피시 유충, Tg(mpeg1:GAL4FF/UAS:NfsB-mCherry) 표지 대식세포(황색) 및 TgBAC(pax3a:GFP) 표지 pax3a+ 세포(청록색)에서 수행되었다. 프레임은 보충 비디오 7로부터 추출되었다. h, 근육 줄기 세포 분열 후, 관련된 거주 대식세포, 및 생성된 딸 세포가 서로 멀리 이동한다. 거주 대식세포는 손상 영역(흰색 점선) 내에 위치된 근육 줄기 세포와 상호작용한다. 근육 줄기 세포 분열에 이어(닫힌 흰색, 자홍색, 황색, 회색 화살촉은 4개의 독립적인 줄기 세포를 강조한다), 상처 부위 내의 딸 세포(개방 흰색, 자홍색, 황색, 회색 화살촉은 동일한 색상의 닫힌 화살촉에 의해 나타낸 줄기 세포로부터 생성된 딸 세포를 강조한다) 움직임은 거주 대식세포와의 관계가 시각화될 수 있도록 강조된다. 세포의 움직임은 거주 대식세포가 수직 근중격에 국소화될 때까지 추적된다. 프레임은 보충 비디오 10으로부터 추출된다. n = 5의 장시간 시간 경과에서 검정된 n = 9 줄기 세포 분열의 대표.
도 8. 일시적인 대식세포 줄기 세포 틈새의 상관 광 및 전자 현미경( CLEM ) 분석은 대식세포와 줄기 세포가 xyz 평면에서 직접적인 이종 세포 표면 동격을 유지한다는 것을 보여준다. a, 화합물 유전자삽입 제브라피시 라인, Tg(mpeg1:GAL4FF/UAS:NfsB-mCherry); TgBAC(pax3a:GFP) 표지 대식세포(황색) 및 pax3a+ 근육 줄기/전구 세포(청록색)에서 레이저 절제 근육 손상 후 25시간에 상처 부위의 공초점 현미경 검사. b, (a)에 예시된 동일한 유충의 동일한 트렁크 영역의 큰 STEM 타일 세트는 에폰 매립 및 섹션화 후 생성되었다. 이 데이터 세트를 사용하여 관심 있는 강조된 대식세포-줄기 세포 상호작용을 상관시키고 식별하였다(흰색 별표(a,b)). 점선의 사각형은 투과 전자 현미경으로 추가로 조사된 영역을 표시한다(c,d). c, 긴밀한 상호작용을 유지하는 대식세포와 줄기 세포를 포함하는 관심 영역은 z-깊이를 통해 조사되었다. 관심있는 세포와 상호작용 영역이 분할 된다(대식세포 세포질: 황색, 대식세포 핵: 오렌지색, 줄기 세포 세포질: 청록색, 줄기 세포 핵: 청색, 세포-세포 상호작용 표면: 자홍색). d, z-깊이를 통한 두 평면의 고해상도 이미지(분할 이미지에 적색 점선으로 상관된 평면)는 두 세포 사이의 밀접한 관련성을 추가로 입증한다(검은색 스케일 바: 5μm).
도 9. scRNA - seq로 식별되는 Prox1a + / Pou2f3 + 대식세포(클러스터 6)는 mmp9 + 대식세포(클러스터 2)와 독립적인 거주 대식세포 서브세트이다. a, scRNA-seq에 의해 검정된 세포는 항원 처리 및 제시 유전자를 발현하고 그들의 대식세포 특성을 확인한다. 대부분의 세포(cd83, cd81a 및 cd40)에 의해 발현될 뿐만 아니라 개별 서브세트에 의해 차별적으로 발현되는 항원 제시 유전자를 강조하는 특징 플롯이 제시된다. 관심 있는 유전자를 발현하는 세포의 백분율도 기록된다(적갈색, 보충 표 1,3에서 추출된 정보). b -g, 바이올린 플롯(백분율로 기록된 클러스터 6 발현 마커 내의 세포 비율(b, e) 및 바늘 찔림 근육 손상 후 서브세트 6 특이적 마커 Pou2f3(c) 및 Prox1a(f)의 항체 염색(흰색 점선)은 특이적 후기 손상 거주 대식세포 집단을 식별했다(보충 표 3, 워크시트 7). mCherry에 대한 항체 염색을 사용하여 Tg(mpeg1:GAL4FF/UAS:Nfsb-mCherry)(황색) 라인에서 모든 mpeg1+ 대식세포를 식별하였다. 손상 후, 1dpi에서, Pou2f3+/mpeg+(c) 또는 Prox1a+/mpeg+(f) 대식세포는 상처 부위에 거의 존재하지 않으며, 그들의 수는 2dpi에서 약간 증가하기 시작하고 최고 백분율은 3dpi에서 존재하고, 이 서브세트를 후기 손상 거주 대식세포 서브세트로서 강조한다. 정량화(d, g). 평균±S.D. 쌍을 이루지 않은 t-테스트. (d) 다중 비교 테스트를 위한 Dunnett의 사후 테스트에 의한 일원 ANOVA. (g). h-i, 클러스터 2 대식세포는 유전자 발현 수준에서 당분해를 향한 대사 이동을 나타낸다. 클러스터 2 차등 발현 유전자의 KEGG 경로 분석(보충 표 3)은 당분해(용어: dre00010) 및 산화적 인산화(용어: dre00190) 경로와 관련된 유전자를 식별하였다. 당분해와 관련된 유전자는 상향조절된(h) 반면, 산화적 인산화와 관련된 대부분의 유전자는 하향조절되었으며(i), 클러스터 2/mmp9+-거주 대식세포에서 당분해를 향한 대사 이동을 강조하였다.
도 9. a. NAMPT는 다른 사이토카인에 보존된 "사이토카인 핑거"(cif)를 함유한다. b. NAMPTcif는 CCR5에 대한 NAMPT의 결합을 억제한다. c. NAMPTcif에 의한 위성 세포 자극은 무자극 대조군 기준선(No. stim)과 비교하여 투여량 의존 방식으로 증식을 촉진한다. d. ECM 및 신데칸 결합 태그를 포함하거나 포함하지 않는 NAMPT의 유도체는 생체내 및 시험관내에서 테스트된다.
도 10. NAMPT의 세포내 효소 기능은 골격근 재생에서 증식 촉진 기능을 지배하지 않는다. a -b, mmp9는 상처 거주 대식세포의 서브세트를 표지한다. (a) 레이저 절제 골격근 손상(흰색 점선) 후, 대식세포의 서브세트(Tg(mpeg1:GAL4FF/UAS:NfsB-mCherry), 황색)가 거주시(황색/자홍색 이중 표지된 세포) mmp9(TgBAC(mmp9:EGFP), 자홍색)를 발현하기 시작한다. 손상 후, mpeg+ 대식세포는 손상에 반응한다. 동시에, 호중구 발현 mmp9도 또한 손상에 존재하는 것으로 보인다(자홍색만, 녹색 열린 화살촉, 대식세포와 구별되는 세포 표현형 및 상처 부위의 역학을 나타낸다. 이러한 세포는 호중구 특이적 마커 mpx를 공동 발현한다(데이터는 표시되지 않음, n = 16). 이들 mmp9 발현 호중구는 5.21 ± 1.27 hpi까지 상처 부위를 떠난다(n = 6)). 대식세포가 거주하기 시작하면, mpeg 발현 대식세포의 서브세트는 또한 mmp9를 발현하기 시작한다(흰색 닫힌 화살촉). 프레임은 보충 비디오 10(n = 6)에서 추출됨, (b) 메트로니다졸(Mtz) 투여량을 적정하면 TgBAC(mmp9:EGF-NTR)(자홍색) 유전자삽입 라인에서 mmp9 발현 면역 세포의 특이적 절제를 가능하게 한다. 6시간 동안(1.75dpi(5dpf) 내지 2dpi(6dpf)) 5mM Mtz 처리시, 무손상 유충은 mmp9 발현 면역 세포(표현형적으로 구별되는 성상 형태, mmp9 고발현 세포)의 절제를 나타내는 반면, 유의하게 낮은 수준에서 mmp9를 발현하는 피부 세포(표현형적으로 구별되는 육각형 형태)는 절제에 내성이 있다. 바늘 찔림 골격근 손상(4dpf/0dpi) 후, 5dpf/1.75dpi에서 Mtz로 처리된 유충은 특히 상처 부위(점선의 흰색 선)에서 mmp9 고발현 세포의 부재를 입증한다(n = 12). c -d, 사용된 Mtz 처리의 투여량 및 지속 기간은 mmp9+/mpeg+ 대식세포의 77.94%를 특이적으로 절제한다(mmp9-/mpeg+ 대식세포: Mtz 처리에서 6.65±1.50 대 대조군에서 5.47±2.75, mmp9+/mpeg+ 대식세포: Mtz 처리에서 2.18±1.19 대 대조군에서 9.87±2.72). (c) 바늘 찔림 골격근 손상 영역(흰색 점선) 내의 mmp9 + /mpeg + (각각 자홍색 및 황색) 대식세포를 식별하는 흰색 화살촉을 갖는 대표적인 이미지. (d) 정량화. e -g, mmp9+ 대식세포의 절제는 근육 줄기/전구 세포에 존재하는 상처 부위의 현저한 감소를 유도한다. Mtz 처리 후, Pax7+ 근육 줄기 세포에 위치하는 상처 부위(흰색 점선)의 상당히 감소가 있다(e). (f) 정량화. 이 감소는 근육 줄기 세포 이동 후 Mtz 처리가 수행되기 때문에(Mtz 처리 유충의 근육 줄기 세포를 라이닝하는 상처 가장자리는 시각화될 수 있다, e) 줄기 세포 이동 결핍으로 인한 것이 아니라, 오히려 EdU 통합을 검정함으로써 관찰된 바와 같이 상처 부위(황색 점선) 내의 근육 줄기 세포 증식 결핍으로 인한 것이다(g, 대조군 및 Mtz 처리 유충 모두에 대한 유충 손상의 세 가지 독립적인 예가 제시된다. 이미지는 도 3r에 제시된 정량화를 대표한다). d, f, 평균±S.D. 쌍을 이루지 않은 t-테스트. h , nampta mRNA 발현은 유충 제브라피시에서 2dpi 이후(검은색 화살촉, n> 15)로부터 손상 부위에서 특이적으로 상향조절된다. i -j, 증가된 NAMPT 활성은 세포내 NADH 수준의 증가로 이어진다. (i) NADH 자가 형광(자홍색)은 거주 대식세포(황색)에서 국소화된 상향조절을 표시하여 이러한 세포가 상처 존재 Nampt(n = 15)의 주요 공급원임을 나타낸다. (j) 이것은 일시적 MΦ와 비교할 때 더 낮은 NAD+/NADH 비율을 갖는 상처 위치된 거주 MΦ를 입증한 생물 발광 기반 검정에 의해 추가로 정량적으로 확인되었다. 평균±S.D. 쌍을 이루지 않은 t-테스트. k -o, 유충 제브라피시에서 Nampt 발현의 평가. 발달 시리즈(1, 3 및 4dpf)에서 수행된 Nampt 항체 염색은 단백질의 분포 패턴과 이전에 공개된 RNA 전사체32 사이의 일치를 확인했으며, 1-4dpf에서 체절 경계(백색 닫힌 화살촉)에서 농축 및 3dpf 이후(n = 10)로부터 장(흰색 개방 화살촉)에서 추가의 농축과 함께 초기 발달 동안 유비쿼터스 발현을 입증했다(k). (l-m) 바늘 찔림 골격근 손상 후, 상처 부위 Nampt 단백질 발현은 6dpf/2dpi에서 시작하여 상향조절된다. 정량화(m). 평균±S.D. 쌍을 이루지 않은 t-테스트. (n-o) 상처 부위(흰색 점선)에서 Nampt 상향조절은 대식세포 기원이며, 선택적으로 절제하는 대식세포(손상 지점(4dpf/0dpi)에서 Tg(mpeg1:GAL4FF/UAS:NfsB-mCherry) 유충에 첨가되어 모든 대식세포를 절제하는 5mM Mtz)는 상처 부위 Nampt 발현의 상당한 감소로 이어진다. 이것은 Nampt 수준이 호중구(호중구 절제에 사용된 Tg(mpx:KALTA4/UAS:NfsB-mCherry) 유충)의 선택적 절제시 방해받지 않는 Nampt 수준에 의해 추가로 확인된다. 정량화(o). 평균±S.D. Tukey의 다중 비교 테스트에 의한 이원 ANOVA. p -q, Nampt의 효소 기능을 억제하면 근육 줄기 세포 증식에는 영향을 미치지 않는다. 바늘 찔림 골격근 손상(흰색 점선) 후, TgBAC(pax3a:GFP)(청록색) 유충은 5dpf/1.75dpi로부터 실험 종점(6dpf/2.5-2.75dpi)까지 소분자 경쟁 억제제인 GMX1778로 처리되었다. GMX1778은 NAD+ 생합성에서 Nampt의 속도 제한 효소 기능을 선택적으로 억제하고, 투여된 농도에서 유충 NAD+/NADH 수준의 심각한 감소를 초래한다(도 10c 참조). Nampt의 효소 기능을 억제하는 것은 손상 영역에서의 근육 줄기 세포의 증식에는 영향을 미치지 않고(p), 줄기 세포 증식 동안 Nampt의 기능은 에너지 대사에서 세포내 역할과 구별된다는 것을 강조한다. 정량화(q). 평균±S.D. Tukey의 다중 비교 테스트에 의한 이원 ANOVA.
도 11. NAMPT는 근육 줄기 세포에 존재하는 CCR5 수용체에 결합하고 증식을 유도한다. a-b, NAMPT는 CCR5에 선택적으로 결합한다. (a) ELISA 플레이트를 인간 재조합 CCR5(hrCCR5) 또는 BSA로 코팅하고, 증가하는 농도(0nM 내지 800nM)에서 인간 재조합 NAMPT(1)(hrNAMPT(1))와 추가로 배양하였다. CCR5에 결합된 NAMPT 분자는 비오티닐화 항체를 통해 검출되었다. NAMPT는 172±18nM의 KD로 CCR5에 결합한다(n=2의 독립적 실험, 삼중). 그래프는 BSA에 대한 비특이적 결합이 차감된 대표적인 결합 곡선을 보여준다. 평균±S.E.M. (b) ELISA 플레이트를 마우스 재조합 CCR5(mrCCR5) 또는 BSA로 코팅하고, 100nM hrNAMPT(1)와 함께 증가하는 농도(0nM 내지 400nM)에서 마우스 재조합 CCL4(mrCCL4)과 배양한다. CCR5에 결합된 hrNAMPT(1) 분자는 비오티닐화 항체를 통해 검출되었다. mrCCL4는 34.4±2.2nM의 IC50을 나타낸다(n = 2의 독립적 실험, 삼중). 그래프는 BSA에 대한 비특이적 결합이 차감된 결합된 결합 곡선을 보여준다. 데이터는 평균±SEM이다. c, 배양된 Maf/DKO 대식세포는 활발하게 NAMPT를 분비한다. 16시간 배양된 Maf/DKO 및 Raw 264.7 대식세포(n = 1 실험, 삼중, 10ng/ml M-CSF로 자극됨)의 상청액 중 ELISA 정량화된 NAMPT 농도. 평균±S.D. 쌍을 이루지 않은 t-테스트. d-e, 배양된 Maf/DKO 대식세포는 CCR5의 동족체 리간드인 CCL3, CCL4, 및 CCL5를 활발히 분비하지 않는다. (d) M-CSF(10ng/ml)로 16시간 자극 후 Maf/DKO 대식세포에 의해 발현된 CCR5 리간드를 검출하는 대표적인 어레이 스폿. (e) 정량화. 평균±S.E.M. (이중으로 그룹당 n = 1). f, 외인성 NAMPT의 보충은 근아세포 증식을 향상시킨다. C2C12 근아세포 증식에 대한 외인성 도입 인자의 효과를 평가하는 시험관내 검정. 증식은 EdU 통합에 의해 확인된다. NAMPT의 투여(시험된 2개의 시판하는 NAMPT 공급원, hrNAMPT(1) 및 hrNAMPT(2)) 근아세포 증식에서 투여량 의존적 증가를 유도한다. 이 효과는 CCR5 수용체를 통해 특이적으로 매개된다. NAMPT와 CCR2/CCR5 이중 억제제 세니크리비록(CVC) 및 CCR5 특이적 억제제 마라비록(MVC)의 공동 투여는 NAMPT의 증식 촉진 반응을 제거하는 반면, CCR2 억제제 PF-4136309(PF)와의 공동 투여는 근아세포 증식에 대한 NAMPT의 자극 효과를 방해하지 않는다. 이 발견과 일치하여, CCR5의 내인성 리간드 mrCCL8 및 mrCCL4는 C2C12 증식을 향상시키는 기능을 하였지만, CCR2 특이적 리간드 mrCCL2는 대조군의 증식 속도를 넘어 증식 속도를 증가시키지 못했다. NAMPT의 증식 촉진 기능은 NAMPT와 NAMPT 효소 억제제 GMX1778의 공동 투여가 근아세포 증식에 대한 이의 효과에 영향을 미치지 않기 때문에 에너지 대사에서의 세포내 역할과는 별개이다. 평균±S.D. Tukey의 다중 비교 테스트에 의한 이원 ANOVA. g, NAMPT는 마우스 1차 근아세포 단일배양물에서 PAX7+ 위성 세포의 증식을 자극한다. 이 증식 촉진 반응은 CVC의 투여시 제거된다. 근아세포를 대식세포와 공동 배양하면 CVC 투여시 억제되는 반응인 위성 세포 증식을 자극한다. NAMPT를 분비하지 않는 3T3 세포와 근아세포를 공동 배양하면 위성 세포 증식을 자극하지 않는다. 평균±S.D. Tukey의 다중 비교 테스트에 의한 이원 ANOVA. h-p, 제브라피시 중 Ccr5 유전자의 수용체의 활성화를 억제하는 것은 유충 제브라피시의 손상 반응성 면역 세포 역학에 영향을 미치지 않는다. (h-i) 제브라피시 중 예측된 이종상동성 Ccr5 유전자는 BLAST를 사용하여 제브라피시 게놈 중 인간 CCR5 아미노산 서열에 대한 적절한 최적 적중을 결정함으로써 식별되었다. Ccr5의 단백질 서열을 사용하여 작제된 최대 가능성 계통수는 추정적 제브라피시 Ccr5-유사(Ccr5L) 서열을 강력한 부트스트랩 지지를 갖는 포유류 CCR5의 동족체로서 배치하였다. 500개 복제에 의한 부트스트랩 값은 분기 아래에 문서화되어 있다. CCR7은 외부 그룹으로 사용되었다. 본 분석에 포함된 유전자의 수탁 번호는 표(i)에 제공되어 있다. (j) pax3a+ 근육 줄기 세포는 RT-PCR에 의해 검출된 바와 같이 2dpi에서 zfCcr5 수용체를 발현한다. (k-l) 수용체 길항제 CVC에 의한 Ccr5 억제는 손상 부위(Tg(actc1b:BFP)로 표지된 골격근, 자홍색)로의 대식세포(Tg(mpeg1:GAL4FF/UAS:NfsB-mCherry), 황색) 이동 또는 거주 MΦ 아형으로의 성공적인 전환에 영향을 미치지 않는다. 정량화(l). (m-n) CVC 처리된 대식세포는 형태학적으로 대조군과 구별할 수 없는 것으로 보이며, 일시적 MΦ는 그들의 거주 대응물보다 낮은 구형도 값을 보유한다. 정량화(n). (l, n) 평균±S.D. Tukey의 다중 비교 테스트에 의한 이원 ANOVA. (o-p) CVC 처리는 바늘 찔림 근육 손상(흰색 점선)에 대한 호중구(Tg(mpx:eGFP), 자홍색) 반응을 변경하지 않는다(o). 정량화(p). 평균±S.D. 쌍을 이루지 않은 t-테스트. q, CVC 처리(2시간 동안 전처리 및 레이저 절제 골격근 손상(흰색 점선)에 이어 실험의 종점까지 유지됨)는 상처 부위에서 거주 대식세포(흰색 화살표) 근육 줄기 세포(흰색 화살촉) 연관성의 개시 및 유지를 방해하지 않는다. 프레임은 보충 비디오 13으로부터 추출됨. r-s, CVC 또는 MVC에 침지된 유충은 복굴절 이미징(r) 및 정량화(s)에 의해 밝혀진 현저한 재생 결핍을 나타냈다. t-u, pax3a+ 근원성 줄기 세포(TgBAC(pax3a:GFP), 청록색) 증식은 손상 후(t) 및 정량화된(u) 손상 부위(흰색 점선)에서 이들 세포의 감소된 EdU 통합(자홍색)에 의해 입증된 바와 같이 CVC 첨가에 의해 억제된다. s, u, 평균±S.D. Tukey의 다중 비교 테스트에 의한 이원 ANOVA.
도 12. 제브라피시 생식 계열 nampta 및 ccr5 돌연변이체는 급성 근육 손상에 대한 반응으로 심각한 골격근 재생 결핍을 제공한다. a-j, CRISPR/Cas9를 사용하여 nampta의 엑손 2를 표적으로 하고, 이는 변경된 아미노산 서열 및 후속 조기 정지 코돈(별표)(nampt p.Try61Profs*4, nampta pc41 로서 지칭됨)을 생성한 생식 계열 결실 삽입 돌연변이를 초래했다. (a) 표적 nampta 유전자좌에서 DNA 및 아미노산 서열(AA) 수준에서 Cas9/gRNA 유도 돌연변이의 효과를 입증하는 유전자형 PCR 앰플리콘의 생거(Sanger) 추적. (b) 역전사효소(RT) PCR을 위한 엑손, 돌연변이 부위, 전사체 및 프라이머 결합 부위를 강조하는 nampta 유전자의 개략도. (c) nampt cDNA에 대한 RT-PCR은 절단된 단백질을 인코딩하는 돌연변이체 전사체의 수준의 감소를 입증하며, 넌센스 매개 붕괴에 의한 분해를 표적으로 한다는 점을 강조한다. actc1b 전사체 수준은 로딩 대조군 역할을 한다. (d-f) 대식세포 및 줄기 세포 역학은 nampta 돌연변이에서 영향을 받지 않는다. (d) nampta 이형접합성 및 동형접합성 돌연변이체는 모두 2dpi에서 거주 상태로의 대식세포 이동과 함께 야생형 동기에 필적하는 상처 부위(흰색 점선) 대식세포(황색) 역학을 제공한다. (e) 정량화. (f) 또한, 이형접합성 및 동형접합성 nampta 돌연변이체 중 거주 대식세포는 상처 부위 존재 Pax7+ 근육 줄기 세포와 상호작용한다. n=20 관측치의 대표. 동형 접합성 돌연변이체는 복굴절 이미징(g)에 의해 관찰되고 (h)에서 정량화된 바와 같이 바늘 찔림 근육 손상 후 심각한 재생 결핍을 제공한다. 이 복구 결핍은 바늘 찔림 골격근 손상(골격근을 시각화하기 위한 미오신 중쇄(MyHC), 자홍색) 후 손상 부위 내에서 관찰된 유의한 증식 결핍(EdU, 흰색)과 상관될 수 있다(i). 돌연변이체 유충의 손상 영역 내에서의 증식은 상처 부위 외부에서 관찰된 항상성 수준으로 감소되고 돌연변이체가 복구를 유지하는 데 필요한 추가 증식 반응을 유도하지 못했다는 것을 강조한다. 또한, 이러한 관찰은 거주 및 mmp9 발현 대식세포의 절제 후 관찰된 것을 요약한다. 정량화(j). k-t, CRISPR/Cas9는 또한 ccr5의 엑손 2를 표적으로 하는 데 사용되며(2개의 gRNA를 사용) 프레임 이동 및 후속 조기 정지 코돈(ccr5 p.Pro24Leufs*28, ccr5 pc42 로서 지칭됨)을 유발하는 결실-삽입 돌연변이를 초래한다(k). (l) 돌연변이 부위(513 bp 결실 및 90 bp 삽입) 및 mRNA 전사체와 함께 ccr5의 두 엑손의 개략도. RT-PCR의 프라이머 결합 부위도 문서화되어 있다. (m) ccr5 cDNA의 RT-PCR 분석은 돌연변이체 전사체(적색 화살촉)에 상응하는 234 bp 생성물을 입증한다. 657 bp 생성물(적색 화살표)에 상응하는 야생형 전사체는 돌연변이체에 존재하지 않는다. 두 PCR 단편 서열 검증되었다. 돌연변이체 전사체는 ccr5의 엑손 2에 의해 코딩된 케모카인 도메인의 대부분이 결여되고, 따라서 돌연변이체 단백질은 번역될 경우 리간드 결합 부위가 결여되기 때문에 비기능적일 것이다. actc1b 전사체 수준은 로딩 대조군 역할을 한다. 상기 기재된 nampta 변이체와 관련하여, ccr5 변이체는 야생형 동기에 필적하는 대식세포 역학(대표적 이미지, n 및 정량화, o) 및 대식세포-줄기 세포 상호작용(p, n = 20 관측치의 대표)이 제공되었다. 또한, 이 돌연변이체는 nampta 돌연변이체에 대해 상기 기재된 표현형 결함을 반영하고, 손상 부위 근육 줄기 세포 증식 결함(s, 팔로이딘에 의해 표지된 근육, 정량화(t))으로 인한 손상(q), 정량화(r)시 유의한 골격근 복구 결핍을 제공했다. e, h, j, o, r, t, Tukey의 다중 비교 테스트에 의한 이원 ANOVA.
도 13. 유충 제브라피시에서 nampta 및 namptb의 면역 세포 특이적 유전자 편집. a-d, 대식세포 특이적 nampta 유전자 편집 전략의 검증. (a) 대식세포는 nampta gRNA 주사된 mpeg1-Cas9 유충으로부터 3dpf에서 FACS에 의해 단리시켰다. 이들 세포로부터 단리된 DNA를 사용하여 gRNA 표적 부위를 포함하는 영역의 PCR 앰플리콘을 생성하였다. 앰플리콘의 생거 서열분석은 PAM 부위의 상류에 있는 몇 개의 염기 쌍에서 시작하여 서열 중단의 존재를 확인했다. (b) 상처 부위에서 Nampt 단백질 발현은 바늘 찔림 근육 손상(흰색 점선) 후 nampta gRNA 주사된 mpeg1-Cas9 유충에서 평가되었다. 유전자 편집된 유충은 손상 영역(n = 12) 내에서 관찰 가능하게 감소된 Nampt 발현(자홍색)을 제공하였다. c, 유전자 편집된 유충으로부터 FACS 단리된 대식세포는 발광-기반 검정을 사용하여 NAD+/NADH 수준을 측정함으로써 Nampt 기능에 대해 검정하였다. 대조군 주사되지 않은 유충으로부터 단리된 대식세포를 사용하여 유충 제브라피시 대식세포의 기준선 NAD+/NADH 수준을 측정했다. Nampt 효소 억제제 GMX1778로 처리된 유충의 대식세포를 사용하여 Nampt 기능의 부재하에 대식세포에 존재하는 NAD+/NADH 수준을 식별하였다. 또한, Nampt의 속도 제한 효소 반응의 주요 생성물인 NMN으로 처리된 유충의 대식세포를 사용하여 검정 감도의 최대 임계값을 확립했다. nampta gRNA 주사된 mpeg1-Cas9 유충으로부터 단리된 대식세포는 이러한 유충에 존재하는 대식세포 내에서 Nampt 활성의 기능 상실을 반영하여 NAD+/NADH 수준의 감소를 제시했다. 이 검정은 Namptb의 잔류 효소 활성도 또한 검출할 것이며, 이는 이 유전자 특이적 표적화 접근법에 의해 영향을 받지 않을 것이다. 평균±S.D. 다중 비교 테스트를 위한 Dunnett의 사후 테스트에 의한 일원 ANOVA. d-f. nampta 유전자 편집된 유충의 대식세포(황색) 역학은 상처 후 검정되었고 대조군 유충에서 관찰 가능한 편차를 나타내지 않았다(d, n = 10). 손상 영역(흰색 점선) 내에 위치된 nampta 유전자 편집된 유충 대식세포는 2dpi에서 거주 상태로 전환되었다(e, 정량화, f). 이러한 거주 대식세포는 상처 존재 pax3a+ 근육 줄기 세포와 계속 상호작용한다(g, n = 20 관측치의 대표). h-j, 근육 줄기 세포 특이적 ccr5 유전자 편집은 손상 반응성(흰색 점선이 상처 부위의 경계를 구분한다) 대식세포 역학과 2dpi에서 거주 표현형으로의 전환에 영향을 미치지 않는다(h, 정량화, i). 또한, 이러한 ccr5 유전자 편집된 Pax7b+ 근육 줄기 세포(청록색)는 손상 영역에 위치된 거주 대식세포(황색)와 표현형적으로 야생형 상호작용을 나타낸다(j, n = 20 관측치의 대표). k-n, 제브라피시에서, Namptb가 아닌 Nampta는 근육 재생에서 Nampt의 재생 역할을 지배한다. (k) 상처 부위에서의 원위치 혼성화에 의한 namptb 발현의 측면도는 손상 부위에서 1-3dpi로부터의 구성적 발현을 입증한다. namptb를 표적으로 하는 2개의 gRNA를 주사한 mpeg1-Cas9 유충(개략도, l)은 바늘 찔림 근육 손상 후 복굴절 이미징(m)에 의해 적당한 골격근 재생 능력을 입증하였다. 정량화(n). o-q, 호중구가 아닌 대식세포는 근육 재생에서 Nampta의 주요 및 기능적 공급원이다. nampta는 재생물에 존재하는 다른 중요한 선천적 면역 세포 유형인 호중구에서 특이적으로 녹다운되었다(mpx-Cas9 라인 사용, 개략도, o). 이 접근법을 사용하면 복굴절 이미징(p)에 의해 관찰된 바와 같이, 바늘 찔림 근육 손상 후 재생 결핍이 관찰되지 않았다. 정량화(q). f, i, n, q, 평균±S.D. Tukey의 다중 비교 테스트에 의한 이원 ANOVA.
도 14. 유충 제브라피시에서 급성 골격근 손상 후 NAMPT 보충은 특히 손상 영역에서의 증식을 향상시킨다. a-c, NAMPT 보충은 손상에 대한 면역 세포 반응을 변경하지 않는다. 바늘 찔림 근육 손상 유충(흰색 점선)은 즉시 인간 재조합 NAMPT(1)(hrNAMPT(1))(4dpf/0dpi)를 보충하고, 그들의 면역 세포 역학은 2dpi에서 검정하였다. 대식세포(Tg(mpeg1:GAL4FF/UAS:NfsB-mCherry), 황색) 및 호중구(Tg(mpx:eGFP), 청록색)의 수는 미처리 대조군에 필적할 만했다(a). 정량화(b). 평균±S.D. Tukey의 다중 비교 테스트에 의한 이원 ANOVA. 또한, 손상 영역 내의 자가포식 과정은 LysoTracker(자홍색)에 의해 비교되었고, 대조군 및 hrNAMPT(1) 보충된 유충(a)에서 유사한 것으로 밝혀졌다. 정량화(c). 평균±S.D. 쌍을 이루지 않은 t-테스트. d, 상처 부위(흰색 점선, 팔로이딘 염색에 의해 시각화된 골격근, 자홍색) 증식(EdU, 백색)에 대한 효과는 Tg(mpeg1:GAL4FF/UAS:NfsB-mCherry) 라인에서 NAMPT 및 병용 약물 보충 후 검정되었다. 각 그룹에 대해 4개의 개별 예가 제공되었으며, 이들 이미지는 도 4m에 제시된 정량화를 나타낸다. NAMPT 보충은 대조군 설정에서 상처 부위의 증식을 증가시킬뿐만 아니라 대식세포 절제시 발생하는 증식성 결핍을 구제한다. 그러나, NAMPT가 Ccr5 수용체에 작용하여 증식 반응을 유도하기 때문에, CVC 처리에 의해 이 수용체를 억제하면 NAMPT 매개 구제에 내성이 있는 증식 결핍을 초래했다. 또한, Ccr5 리간드 CCL8은 상처 부위에서 증식을 증가시키는 기능을 한 반면, NAMPT가 발휘할 수 있는 특이성의 부족을 강조하는 손상 영역 외부의 증식도 증가시켰다. e, NAMPT가 보충된 마우스 근육 손상에서 증식하는 위성 세포. 증식성 위성 세포 집단을 단리하기 위한 게이팅 전략이 제시되어 있다. CD45-, CD11b-, Ly6G-, CD31-, VCAM-1+, 및 PAX7+인 세포는 위성 세포로서 간주된다. 증식성 위성 세포는 추가로 Ki67+이다. 처리 후 4일째 정량화는 도 4 q-r에 문서화된다. f-g, NAMPT로 처리된 마우스 VML 손상 후 혈관신생. (f) 근육 손상을 피브린 또는 피브린 단독 대조군에 전달된 NAMPT(0.5μg)로 처리하고, 처리 후 6일째에 조직을 채취했다. CD31(내피 세포, 황색) 및 라미닌(자홍색)으로 염색된 대표적인 재생 근육 냉동 절편. (g) CD31 양성 영역의 정량화(n = 6마리 마우스/그룹). h-i, NAMPT가 보충된 마우스 근육 손상 후 면역 세포 프로파일. (h) 근육 손상에서 상처 면역 세포 서브세트를 분석하기 위한 게이팅 전략. 호중구, 대식세포 및 T 세포 서브세트 패널에 대한 게이팅 전략이 제시된다. (i) 백분율은 채취된 조직에서 총 생존 세포에 대해 계산되었다(6일째 n = 5 마우스, 8일째 n = 6 마우스). 평균±±S.E.M. 쌍별 비교를 위한 본페로니(Bonferroni) 사후 테스트에 의한 이원 ANOVA. j, 근육 줄기 세포 증식을 조절하는 데 있어서 손상 반응성 MΦ 역할의 요약 개략도. 급성 근육 외상 후(1), 대식세포 및 근육 줄기 세포는 손상 영역으로 이동한다(2). 이러한 손상 반응성 대식세포의 약 절반은 복구하는 동안 상처 부위에 거주한다(3). mmp9+/mpeg1+-거주 대식세포의 서브세트는 상처 존재 pax3a+ 근육 줄기 세포와 활발하게 상호작용하기 시작한다(4). 이러한 대식세포는 근육 줄기 세포 상의 Ccr5에 결합하는 Nampta를 활발하게 분비하고(4'), 근육 줄기 세포의 증식을 초래하는 신호전달 캐스케이드를 활성화한다(5).
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에서 사용되는 용어 "단리된 세포"는 그것이 원래 발견되었던 유기체로부터 제거된 세포 또는 그러한 세포의 자손을 지칭한다. 세포는, 예를 들어, 다른 세포의 존재하에 시험관내에서 배양될 수 있었다. 또한, 세포는 나중에 제2 유기체에 도입되거나 그것 (또는 그것이 유래되는 세포)이 단리된 유기체에 재도입될 운명일 수 있다.
용어 "단리된 세포 집단" 등은 혼합된 또는 불균질한 세포 집단으로부터 제거되고 분리된 세포 집단을 지칭한다. 일부 구현예에서, 단리된 집단은 세포가 단리되거나 농축된 불균질한 집단과 비교하여 실질적으로 순수한 세포 집단이다.
하나의 구현예에서, 본 출원은 다음 중 1개 또는 2개 또는 3개 또는 4개 또는 5개를 포함하는 약제학적 또는 생리학적 활성 재생 조성물을 가능하게 한다:
(i) 본원에 정의된 바와 같은 CCR5 상호작용제를 포함하거나 인코딩하는 단계,
(ii) 조직 줄기 세포(예: 위성 세포) 또는 그에 따른 전구체 또는 이의 자손
(iii) 대식세포 또는 그에 따른 전구체 또는 이의 자손
(iv) 스캐폴드 또는 보유 물질
(v) 조직 전달 향상 성분.
하나의 구현예에서, 본 출원은 본원에 기재된 하나 이상의 줄기 세포, 기질 세포, 전위성 세포 또는 위성 세포, 전대식세포 또는 대식세포 또는 대식세포 유래 인자 중 하나 이상을 포함하는 세포 조성물을 제공한다. 하나의 구현예에서, 다능성 "조직 줄기 세포"는 전근육 세포 또는 이들 세포가 본질적으로 천연 형태로 생산될 수 있거나 이종 또는 자기 인자를 발현하도록 변형될 수 있는 임의의 전대식세포 세포를 포함한다. 유사하게, 용어 다능성 "조직 줄기 세포"는 조직 줄기 세포의 활성화된 자손을 포함할 수 있다.
근육 줄기 세포를 포함하는 조직 줄기 세포는 단리되거나(생체외 또는 시험관내 또는 생체내 절차용) 유도될 수 있다.
줄기 세포는 CCR5 작용제를 포함하는 배지 또는 조성물과 임의의 양의 시간 동안 접촉될 수 있다. 예를 들어, 줄기 세포를 CCR5 작용제와 12시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주 또는 그 이상 동안 접촉될 수 있다. 줄기 세포는 중배엽, 내배엽, 외배엽, 뉴런, 중간엽 및 조혈 계통으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포 계통으로 분화하도록 유도되거나 자극될 수 있다.
일부 구현예에서, 줄기 세포는 인간 줄기 세포, 다능성 성체 줄기 세포, 만능성 성체 줄기 세포 또는 배아 줄기 세포이다.
인간 성체 줄기 세포는 유사분열성이며, 일반적으로 하나의 딸 세포는 줄기 세포로 잔류한다. 성인 조직은 조직에서 특정 틈새를 차지하고 국소 환경을 적극적으로 감지하고 반응하는 하나 이상의 상주 수임 전구 세포 또는 줄기 세포를 포함한다. 각 조직은 전형적으로 특정 범위의 세포 유형으로 분화하는 자손을 생성하는데 전념하는 자체 상주 수임 줄기 세포를 갖는다. 근육 조직은 근아세포의 생산에 전념하는 위성 세포를 포함한다. 이 유형의 다른 잘 연구된 줄기 세포는 많은 상이한 세포 유형, 특히 근육, 연골, 뼈, 지방 및 모든 혈액 세포와 조혈계를 생산하는 조혈 줄기 세포(HSC) 및 중성 줄기 세포(NSC)를 생산하는 중간엽 줄기 세포(MSC)이다. 모든 조직은 심장, 장 및 간을 포함하는 상주 줄기 세포 집단을 함유한다. 성체 줄기 세포는 전형적으로 3개의 배아 층 모두에서 유래된 세포의 전부는 아니지만 일부로 분화할 수 있는 세포를 지칭하는 다능성 세포이다. 따라서, 다능성 세포는 부분적으로 분화된 세포이다. 예를 들어, MSC는 당업계에 익히 공지된 다수의 방법에 의해 수득될 수 있다. USPN 5,486,358; 6,387,367; USPN 7,592,174 및 USPN 2003/0211602를 참조한다. MSC는 그들이 상주하는 뼈, 지방 및 기타 조직으로부터 유래될 수 있다. "유래된"은 직접 파생을 지칭하지 않고 그들이 원래 유래되는 인덱스일 뿐이다.
하나의 구현예에서, 줄기 세포는 비배아성 또는 성체 다능성 줄기 세포이다.
하나의 구현예에서, 줄기 세포는 HSC 또는 MSC이다.
CCR5를 발현하는 성체 줄기 세포는 본원에 기재된 CCR5 상호작용제에 대한 노출에 의해 분화를 겪도록 자극될 수 있다. 세포는, 예를 들어, 당업계에 공지된 근원성 조절 인자의 발현 변화에 대해 모니터링된다.
세포는 표준 배지 또는 구체적으로 정의된 배지에서 배양될 수 있다.
세포 발현은 당업계에 공지된 기술에 의해 변경될 수 있다.
유도된 또는 부분적으로 유도된 만능성 줄기 세포는 편리한 줄기 세포 공급원이다. 이들은 인간 포피 세포와 같은 분화된 성체 세포에서 유래될 수 있다.
인간 iPS 세포는, 예를 들어, Oct3/4, Sox 패밀리 전사 인자(예: Sox1, Sox2, Sox3, Sox15), Myc 패밀리 전사 인자(예: c-Myc, 1-Myc, n-Myc), 크루펠 유사 패밀리(KLF) 전사 인자(예: KLF1, KLF2, KLF4, KLF5) 및/또는 관련 전사 인자, 예를 들어, NANOG, LIN28 및/또는 Glis1을 포함할 수 있는 비만능성 세포에 특정 세트의 재프로그래밍 인자를 도입함으로써 생성될 수 있다. 예를 들어, 재프로그래밍 인자는 하나 이상의 플라스미드, 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터를 사용하여 세포에 도입될 수 있다. 일부 경우에, 벡터를 게놈에 통합하고, 재프로그래밍이 완료된 후 제거될 수 있다. 일부 경우에, 벡터는 통합되지 않는다(예: 비감염성 (비패키징) 자가 복제 베네수엘라 말 뇌염(VEE) 바이러스, 심플리콘 RNA 재프로그래밍 키트, 밀리포어, SCR549 및 SCR550으로부터 유래된 영성-가닥, 단일 가닥 RNA 종에 기초한 것들). 심플리콘 RNA 레플리콘은 제한된 수의 세포 분열에 대해 자가 복제할 수 있는 폴리시스트론 전사체에서 4개의 재프로그래밍 인자(OKG-iG; Oct4, Klf4, Sox2 및 Glis1) 모두를 발현하는 합성 시험관내 전사 RNA이다. 심플리콘 키트를 사용하여 생성된 인간 유도 만능성 줄기 세포는 "무통합" 및 "풋프린트 부재"로서 지칭된다. 인간 iPS 세포는 또한, 예를 들어, miRNA, 전사 인자의 작용을 모방하는 소분자 또는 계통 지정자를 사용하여 생성될 수 있다. 인간 iPS 세포는 3개의 척추동물 배엽, 예를 들어, 내배엽, 외배엽 또는 중배엽의 임의의 세포로 분화하는 능력을 특징으로 한다. 인간 iPS 세포는 또한 적절한 시험관내 배양 조건하에서 무기한으로 증식하는 능력을 특징으로 한다. 인간 iPS 세포는 알칼리성 포스파타제, SOX-2, OCT-4, Nanog 및 Tra-1-60 마커를 발현한다.
용어 "나이브" 및 "프라이밍된"은 인간 iPS 세포의 상이한 만능성 상태를 식별한다. 나이브 및 프라이밍된 iPS 세포의 특징은 당업계에 기재되어 있다. 나이브 인간 iPS 세포는 이식 전 배아의 내부 세포 덩어리의 ES 세포와 유사한 만능성 상태를 나타낸다. 이러한 나이브 세포는 계통 사양과 헌신을 위해 프라이밍되지 않는다. 암컷 나이브 iPS 세포는 2개의 활성 X 염색체로 특성화된다. 배양에서, 나이브 인간 iPS 세포의 자가 재생은 백혈병 억제 인자(LIF) 및 기타 억제제에 의존한다. 배양된 나이브 인간 iPS 세포는 둥근 돔형 콜로니와 정점 기저 극성(apico-basal polarity)의 부족을 특징으로 하는 클론 형태를 나타낸다. 배양된 나이브 세포는 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이 하나 이상의 만능성 마커를 추가로 나타낼 수 있다. 적절한 조건하에서, 배양 중 나이브 인간 iPS 세포의 배가 시간은 16 내지 24시간일 수 있다.
프라이밍된 인간 iPSC는 이식 후 외체 세포와 유사한 만능성 상태를 발현한다. 이러한 세포는 계통 사양 및 헌신을 위해 프라이밍된다. 암컷 프라이밍 iPSC는 하나의 활성 X 염색체와 하나의 비활성 X 염색체로 특성화된다. 배양에서, 프라이밍된 인간 iPSC의 자가 재생은 섬유아세포 성장 인자(FGF) 및 액티빈과 같은 인자에 의존한다. 배양된 프라이밍 인간 iPSC는 상피 단층을 특징으로 하는 클론 형태를 나타내며 정점 기저 극성을 나타낸다. 적절한 조건하에서, 배양 중 프라이밍된 인간 iPSC의 배가 시간은 그들이 유래되는 성체 세포의 수준에 따라 24시간 이상일 수 있다.
배아 줄기 세포(ESC)는 특징적으로 만능성이다, 즉 그들은 상이한 조건하에서 세 가지 생식 세포 층(내배엽, 중배엽 및 외배엽)의 특징적인 세포 유형으로 분화하는 능력을 갖는다. 만능성 세포는 주로 세 가지 배엽 모두로 분화하는 능력을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 만능성 세포는 미분화 세포이다. 만능성 세포는 1년 이상 또는 30회 이상의 계대 동안 시험관내에서 분열할 가능성을 갖는다.
ESC는 전형적으로 배아 배반포의 내부 세포 덩어리의 만능성 줄기 세포이다(미국 특허 제5,843,780호, 제6,200,806호 참조). 이러한 세포는 체세포 핵 전달로부터 유래된 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 유사하게 수득될 수 있다(미국 특허 제5,945,577호, 제5,994,619호, 제6,235,970호 참조). 예시적인 구별가능한 배아 줄기 세포의 특징은, 제한 없이, 유전자 발현 프로파일, 증식 능력, 분화 능력, 핵형, 특정 배양 조건에 대한 반응성을 포함한다.
하나의 구현예에서, 줄기 세포는 성체이다.
하나의 구현예에서, 줄기 세포는 대상체에게 자가 또는 이종성이다.
하나의 구현예에서, 줄기 세포는 포유류 또는 인간이다.
위성 세포를 포함하는 대식세포 및 줄기 세포는 당업계에서 인정된 방법을 사용하여 본원에 기재된 바와 같이 제조될 수 있으며, iPSC 및 임의로 유전자 편집 절차의 사용을 포함한다.
하나의 구현예에서, 단리된 대식세포 또는 줄기 세포 유래 대식세포는 본원에 기재된 절단된 NAMPT 펩티드를 발현하도록 변형된다. 일반적으로, M2형 대식세포가 선택되거나 제공된다.
하나의 구현예에서, 줄기 세포는 활성화 및 증식을 유도하기 위해 본원에 기재된 바와 같이 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 CCR5 상호작용제와 접촉된다. 시험관내 또는 생체외 처리된 줄기 세포는 상처 부위에 도입되어 복구를 수행하거나, 전신 투여되어 본원에 기재된 바와 같이 손상된 조직의 재생을 수행하거나, 근육 관련 상태를 치료하거나 개선시킬 수 있다.
CCR5 작용제 또는 이를 발현하는 세포는 단독으로 또는 이식을 위한 세포와 함께 작용화된 하이드로겔의 형태로 투여될 수 있다. 이러한 하이드로겔 또는 유사한 생체 적합 재료 또는 스캐폴드는 상처 부위에서의 이식 효율을 증가시킨다.
하이드로겔은 피브린 기반과 같은 ECM 기반일 수 있다. 대안적으로, 하이드로겔은 RAFT 기술을 사용하는 아크릴아미드-기반과 같은 비-ECM-기반일 수 있다(참조: Chiefari et al Macromol . 31:5559-5526, 1998 and Fairbanks et al Advanced Drug Delivery Reviews 91: 141-152, 2015). 적합한 재료는 방출 동역학을 조절하고, 당업계에 공지된 바와 같이 조직 재생을 위한 목적하는 기계적 및 물리적 특성을 갖는다.
하나의 구현예에서, 위성 세포는 CCR5 작용화된 하이드로겔 또는 다른 생체 적합 재료에 캡슐화된다.
본원에 기재된 세포 조성물 및/또는 제제를 포함하는 키트도 또한 제공된다. 근육 복구 또는 재생에 적합한 키트가 특히 고려된다. CCR5 작용제는 투여를 위해 미리 제형화될 수 있거나, 또는 제형화용 성분이 키트와 함께 제공될 수 있다. CCR5 작용제는, 예를 들어, 국소 적용을 위해 하이드로겔 또는 다른 지지성 비히클에 제형화된다. CCR5 작용제는, 예를 들어, 동결건조되거나 액체일 수 있다.
본원에서 상호교환 가능하게 사용되는 용어 "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 코딩 및 비-코딩된 아미노산, 및 화학적으로 또는 생화학적으로 변형되거나 유도체화된 아미노산을 포함하는 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 변형된 중합체, 예를 들어, 변형된 펩티드 백본을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
단백질은 "N-말단(N-terminus)"이 "N-말단(N-terminal)"이고, "C-말단(C-terminus)"이 "C-말단(C-terminal)"이라고 한다. 용어 "N-말단"은 유리 아민 그룹(--NH2)을 갖는 아미노산에 의해 종결되는 단백질 또는 폴리펩티드의 개시에 관한 것이다. 용어 "C-말단"은 아미노산 쇄(단백질 또는 폴리펩티드)의 말단과 관련되며, 이는 본질적으로 유리 카르복실 그룹(-COOH)에 의해 종결된다. 본 출원에서, C-말단 및 N-말단 단편에 대한 언급은 선택된 부분이 유래되는 전장 분자의 영역을 광범위하게 기재하며, 그것은 전장 또는 천연 분자를 배제한다. C-말단 단편은 반드시 모든 C-말단 아미노산을 포함할 필요는 없지만 포함할 수 있고, N-말단 단편은 반드시 모든 N-말단 아미노산을 포함할 필요는 없지만 포함할 수 있다.
본 출원은 실시예에 기재된 초기 발견에 기초하여 다양한 CCR5 상호작용제를 개시하고 이의 사용을 가능하게 한다. 특히, 펩티드 CCR5 상호작용제는 NAMPT 및 이의 기능적 C-말단 단편의 형태로 제공된다.
혈청 프로테아제에 대해 펩티드를 안정화시키거나 세포내 배치를 촉진하기 위한 다수의 펩티드 변형이 당업계에 공지되어 있으며, 이들은 포함된다. 일부 이러한 변형된 펩티드는 세포 내의 핵산으로부터 발현될 수 있고, 다른 것들은 합성적으로 제조된다. 유사하게, CCR5 상호작용제를 하나 이상의 특정 세포 유형으로 표적화하는 것이 바람직한 경우, 이는 표적 세포의 생체외 조작, 또는 당업계에 공지된 바와 같이, 표적 세포 또는 조직에 특이적으로 결합할 수 있는 표적화 모이어티, 예를 들어, ECM 결합 모이어티의 통합에 의해 달성될 수 있다.
"보존적 아미노산 치환"은 천연 또는 비천연 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 천연 또는 비천연 아미노산 잔기로 치환되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 정의되어 있다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄(예: Lys, Arg, His), 산성 측쇄(예: Asp, Glu), 하전되지 않은 극성 측쇄(예: Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr, Cys), 비극성 측쇄(예: Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, Trp), 베타-분지 측쇄(예: Thr, Val, Ile) 및 방향족 측쇄(예: Phe, Trp, His)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, CCR5 내의 예측된 비필수 아미노산 잔기는, 예를 들어, 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 허용되는 치환의 다른 예는 등전자 고려 사항(예: 메티오닌에 대한 노르류신) 또는 다른 특성(예: 페닐알라닌에 대한 2-티에닐알라닌)에 기초하는 치환이다. 완전한 아미노산 하위 분류는 표 2에 제시되어 있고, 예시적인 치환은 표 3에 제시되어 있다.
CCR5 상호작용 펩티드는 생체내 프로테아제 내성을 증가시키는 것과 같이 펩티드의 약동학적 특징을 변형시키는 것으로 공지된 변형을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 펩티드는 하나 이상의 링커 또는 스페이서, 예를 들어, GGS 또는 GGS의 반복체 및 당업계에 공지된 변이체), 변형된 또는 비천연 또는 비단백질생성 아미노산, 변형된 측쇄, 변형된 백본, 말단 변형된 그룹을 포함하거나, 변형된 공간적 제약을 포함하거나, 또는 D-레트로-인버소 펩티드이다. 하나의 구현예에서, 펩티드는 슈도펩티드, 펩토이드, 아자펩티드, 사이클릭화, 스테이플화, 에테르 또는 락탐 펩티드이거나 공간적 제약을 포함한다.
하나의 구현예에서, CCR5 상호작용제 또는 펩티드는 지질, 탄수화물, 중합체, 단백질, 나노입자, 펩티드, 프로테오글리칸, 항체 또는 이의 단편 또는 항원 결합 형태, 앱타머, 또는 핵산에 적절하게 접합되거나 달리 부착/결합/발현된다.
하나의 구현예에서, CCR5 결합제는 근육 세포 또는 근육 세포 조직 또는 관련 구조, 예를 들어, ECM에 특이적으로 결합한다.
하나의 구현예에서, CCR5 상호작용제는 생리학적으로 또는 약제학적으로 허용되는 염, 수화물, 입체이성체 및 프로드럭을 포함한다.
하나의 구현예에서, 비필수 아미노산이 변경될 수 있다. "비필수" 아미노산 잔기에 대한 언급은 내인성 또는 이종성 CCR5에 결합하는 이의 능력을 제거하거나 실질적으로 변경하지 않고 폴리펩티드(예: secNAMPT)의 야생형 서열로부터 변경될 수 있는 잔기를 의미한다.
하나의 구현예에서, CCR5 상호작용제는 서열번호 1 내지 4 중 하나에 제시된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 임의로 하나 이상의 조직 전달 향상 또는 신호전달 향상 모이어티와 함께 포함하거나 이들로 이루어지거나 본질적으로 이들로 이루어지는 펩티드를 포함하거나 인코딩한다. 하나의 구현예에서, 소수의 치환, 부가 또는 결실 잔기를 갖는 CCR5 상호작용제는 위성 세포와 상호작용하고 활성화하는 능력을 보유하는 본원에서 식별된 cif 모티프를 보유한다(예: CCR5 결합을 매개하는 NAMPT의 C-말단 부분 내의 40 내지 약 100개 잔기)를 보유한다.
하나의 구현예에서, CCR5 상호작용제는 CCR5 상호작용 활성을 보유하는 상기 서열에 대해 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 인코딩한다.
하나의 구현예에서, CCR5 상호작용제는 CCR5 상호작용 펩티드가 발현 가능한 핵산 분자를 포함한다.
적합한 폴리뉴클레오티드 서열의 예는 서열번호 6 내지 9에 제시된 펩티드/폴리펩티드 서열을 인코딩하는 것들이다. 특정 구현예에서, 본 개시내용은 인코딩 가능한 CCR5 펩티드 또는 인코딩 가능한 CCR5 상호작용제의 코딩 서열을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 개시내용의 핵산은 서열번호 6 내지 10 중 어느 하나와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어진다.
하나의 구현예에서, 핵산 분자는 RNA 또는 DNA 또는 RNA:DNA 또는 이의 화학적으로 변형된 형태이다.
하나의 구현예에서, 적어도 하나의 유형의 뉴클레오티드(예: 시스테인 및/또는 우라실)의 일부는 화학적으로 변형되어 생체내 안정성을 증가시킨다.
하나의 구현예에서, 핵산은 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터의 형태이다.
하나의 구현예에서, CCR5 상호작용제는 생체외로 세포에 투여된다. 본 발명은 유전자 변형 세포 데포(예: CAR T 세포, TCR, 유전자 변형 대식세포 등)의 사용을 포함한다.
하나의 구현예에서, CCR5 상호작용제는 표적 세포, 예를 들어, 근육 줄기 세포에 특이적으로 제제를 표적화하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 출원은 상기 본원에서 정의된 CCR5 상호작용제를 포함하는 약제학적 또는 생리학적 조성물을 제공한다.
본 출원은 근육 줄기 세포 증식 및 근육 재생을 자극하기에 충분한 CCR5 상호작용제를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하여, 근육 손상 또는 근육을 복구 또는 재생하는 능력이 감소되거나 차선책인 사람을 치료하는 방법을 가능하게 한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 CCR5 상호작용제를 포함하는 제제 또는 조성물에 관한 것이다.
조성물은 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 생리학적 또는 약리학적 또는 약제학적으로 허용되는 비히클을 포함한다. 본원에 기재된 화합물의 약리학적으로 허용되는 염, 에스테르, 프로드럭 또는 유도체는 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 염, 에스테르, 프로드럭 또는 유도체이다.
일부 구현예에서, 제제는 변형된다. 펩티드 및 제제 활성은 정의된 경계 내의 추가의 모이어티, 인접 잔기 및 교체에 내성이 있다. 유사하게, 백본 변형 및 교체, 측쇄 변형 및 N-말단 및 C-말단 변형은 당업계에서 통상적이다. 일반적으로, 변형은 안정성 또는 약리학적 프로파일, 표적화/전달을 향상시키기 위한 것이다. 예를 들어, 펩티드 사이클릭화 또는 스테이플링은 펩티드 안정성을 향상시키기 위해 통상적이다. 또 다른 구현예에서, 펩티드 또는 제제는 표적 조직에 대한 안정성, 전달 또는 특이성에 적합한 모이어티를 포함하는 마이크로 또는 나노입자 또는 거품, 겔, 리포좀, 접합체 또는 융합 단백질의 형태이다.
하나의 구현예에서, 제제 또는 그들의 인코딩 핵산은 적절한 경우 리포좀, 하이드로겔, 에멀젼, 바이러스 벡터, 바이러스-유사 입자 또는 비로좀으로 조립된다.
하나의 구현예에서, 특이적 결합 모이어티, 예를 들어, 항체 또는 항체 단편 또는 모방체를 사용하여 제제를 근육 환경으로 표적화한다.
하나의 구현예에서, 펩티드 제제는 생체내 생물학적 합성을 통해, 예를 들어, mRNA의 전달, 유전자 편집, 예를 들어, CRISPR 성분, 또는 박테리아 또는 세포를 통해 전달된다.
조성물은 일반적으로 CCR5 상호작용 펩티드, 펩티드모방체, 또는 필요에 따라 인코딩 핵산, 및 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함한다. 하나의 구현예에서, 담체는 나노담체일 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 개시내용의 CCR5 상호작용제는 천연 분자가 아니고, 대신 천연 전장 분자의 특정 특징 또는 기능을 포함하지 않는 천연 분자의 변형된 형태이다. 예를 들어, NAMPT 효소 활성이 부재할 수 있다.
또 다른 구현예에서, CCR5 상호작용 펩티드는 펩티드 내의 적어도 2개의 아미노산에 공유 결합된 링커에 의해 구속된다. 안정성 및 세포 투과성을 증가시키기 위한 다양한 사이클릭화 전략이 당업계에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, CCR5 상호작용제는 이를 인코딩하는 핵산 분자 또는 이의 프로드럭 또는 이를 인코딩하는 핵산 분자 또는 이의 프로드럭을 포함하는 벡터 형태로 전달된다. 하나의 구현예에서, 핵산은 mRNA이다. CCR5 상호작용제는 근육 줄기 세포의 표면에 결합하거나 내부적으로 기능하여 신호전달 및 증식을 자극할 수 있다.
또 다른 구현예에서, CCR5 상호작용제는 다른 약제학적으로 허용되는 담체 이외에 수용액에서 미셀, 불용성 단층, 액정 또는 라멜라 층과 같은 응집체로서 존재하는 지질과 같은 양친매성 제제와 조합된다.
하나의 구현예에서, 본 개시내용은 약제로서 사용하거나 요법에 사용하기 위한 내인성 CCR5 단백질과 상호작용하는, 본원에 기재된 바와 같은 CCR5 상호작용제를 포함하는 조성물을 허용한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 CCR5 상호작용 펩티드 또는 펩티드가 발현 가능한 핵산 분자를 포함하는 근육 줄기 세포 증식을 자극하기 위한 조성물을 허용한다.
하나의 구현예에서, 대상체 조성물은 제2 생리학적 활성 치료제 또는 예방제 또는 재생제와 함께 공동 투여된다. 예시적인 사이토카인은, 제한 없이, IGF-1, TGF-b, GDF-5, bFGF, PDGF-b3, IL-4 중 하나 이상을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 근육 재생을 자극하기 위한 약제의 제조 또는 줄기 세포 요법에서 CCR5 상호작용제의 사용을 제공한다.
하나의 구현예에서, 본 출원은 근육 줄기 세포 증식 및 근육 생성 또는 이의 지표를 유도하는 제제의 능력을 평가하는 단계를 포함하는, 본원에 기재된 CCR5 상호작용 제제의 스크리닝 검정을 제공한다.
펩티드 기반 치료제는 달리 소분자로 조작하기 어려운 생물학적 표적에 대해 강력하고 선택적인 것으로 공지되었기 때문에 유용한 분자를 제공한다. 선형 펩티드의 약동학적 특성을 개선하기 위해, 변형된 펩티드가 성공적으로 개발되었다.
본 개시내용의 펩티드는 아미노산을 포함한다. "아미노산"에 대한 언급은 천연 아미노산 또는 비천연 아미노산을 포함한다.
펩티드 화합물은 일반적으로 및 통상적으로 모이어티의 첨가, 인접 펩티드 잔기 및 이해된 파라미터 내에서의 치환에 의해 변형 가능하다. 펩티드는 또한 표준 펩티드 화학을 사용하는 통상적인 변형된 백본, 측쇄, 펩티드 결합 대체, 및 말단 변형을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 아미노산 서열에 혼입된 아미노산은 L-아미노산, D-아미노산, L-β-호모 아미노산, D-β-호모 아미노산 또는 N-메틸화 아미노산, 당 아미노산 및/또는 이들의 혼합물일 수 있다. 비천연 아미노산은 프로테아제에 의해 인식되지 않을 수 있고, 따라서 반감기를 변경할 수 있다. 하나의 구현예에서, D-레트로 반전 서열이 사용된다.
비천연 아미노산은 상응하는 천연 아미노산의 화학적 유사체를 포함한다. 비천연 아미노산 및 유도체의 예는 4-아미노 부티르산, 6-아미노헥산산, 4-아미노-3-하이드록시-5-페닐펜탄산, 4-아미노-3-하이드록시-6-메틸헵탄산, t-부틸글리신, 노르류신, 노르발린, 페닐글리신, 오르니틴, 사르코신, 2-티에닐 알라닌 및/또는 아미노산의 D-이성체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
하나의 구현예에서, 펩티드는 당업계에서 인정된 변형을 사용하여 그들의 약역학적 특성을 향상시키기 위해 변형된다. 펩티드는 치환될 수 있고, 예를 들어, 알라닌 치환될 수 있거나 가교 결합 가능한 부분으로 치환 및/또는 결합될 수 있다. 적합한 잔기는 헤테로-저급 알킬, 헤테로-메틸, 에틸, 프로필 및 부틸로부터 선택되는 추가의 알파-탄소 치환을 포함할 수 있다. 트리플루오로에틸아민과 같은 펩티드 결합 교체는 보다 안정하고 활성인 펩티드모방체를 생성하는데 사용된다.
따라서, 사이클릭 또는 스테이플링된 펩티드, 펩토이드, 펩토머 및 펩티드의 펩티드모방체 형태가 포함된다.
백본 구속 펩티드모방체 및 사이클릭 펩티드는 엑소펩티다제로부터 보호된다. 펩티드는 절단 후 N-말단을 C-말단에 결합시켜 사이클릭화할 수 있다. 이것은 직접 결합에 의해 또는 이중직교 반응에 의해 정의된 사이클릭화를 허용하는 특정 작용기의 도입에 의해 달성될 수 있다. 예시적인 변형 Cys-Cys 디설파이드 브릿지, 거대 락탐 펩티드, 티오 에테르 펩티드 또는 스테이플 펩티드 등을 형성하는 링커를 포함하는 측쇄 변형의 포함. 클릭 변이체는 펩티드 사이클릭화에 특히 유용하다. 또 다른 접근법은 Asn을 리포아민으로 대체하고 N-말단에 대한 2-아미노-d,1-도데칸산(Laa)을 결합을 사용한다.
보다 정의된 구조는 헤테로사이클, N-메틸화된 아민 결합, 또는 메틸화된 α-탄소 원자를 포함하는 보다 강성 백본을 사용함으로써 수득될 수 있다.
펩티드 스테이플링에 사용되는 기술 중, 2성분 이중 Cu 촉매 아지드-알킨 사이클로첨가(CuAAC) 전략은 펩티드를 생물활성 형태로 구속하는 동시에 약동학적 특성을 향상시킨다. 또한, 이 전략은 쉽게 합성될 수 있는 비천연 아지도 아미노산을 사용하고, 스테이플, 형광 표지 태그 및 광 전환 가능한 링커의 작용화를 용이하게 한다. 스테이플의 독립적인 작용화는 복잡한 작용기가 펩티드의 N-말단 또는 C-말단이 아닌 스테이플에 첨가되기 때문에 특히 유용할 수 있다. 또한, 이 접근법은 다양한 작용화된 스테이플 펩티드를 생성하기 위해 하나의 선형 펩티드만을 필요로 하며, 링커의 다양한 작용성 및 따라서 전체 펩티드의 특성의 탐색을 용이하게 한다.
아자펩티드는 하나 이상의 아미노 잔기가 세미카르바지드로 대체된 펩티드 유사체이다. α-탄소 중심에 대한 이러한 질소의 치환은 구조적 제한을 초래하고, 이는 선형 기하학으로부터 멀리 아자-아미노산 잔기 주위에서 펩티드를 구부린다. 생성되는 아자펩티드 회전 형태는 x-선 결정학 및 분광학에 의해 관찰될 뿐만 아니라 계산 모델을 기반으로 하여 예측되었다. 생물학적 활성 펩티드 유사체에서, 아자 치환은 향상된 활성 및 선택성뿐만 아니라 향상된 특성, 예를 들어, 연장된 작용 지속 시간 및 대사 안정성을 초래하였다.
반감기는 또한 말단을 아실화 또는 아미드화함으로써 증가될 수 있다. 펩토이드는 N-알킬화 올리고글리신 측쇄로 생성된다. 일부 구현예에서, 펩티드는 아세틸화, 아실화(예: 리포펩티드), 포르밀화, 아미드화, 인산화(Ser, Thr 및/또는 Tyr 상에서), 황산화 또는 글리코실화될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "마크로사이클릭화" 또는 "마크로사이클 형성 시약"은 2개의 반응성 그룹 사이의 반응을 매개함으로써 펩티드모방성 마크로사이클을 제조하는데 사용될 수 있는 임의의 시약을 지칭한다. 반응성 그룹은, 예를 들어, 아지드 및 알킨일 수 있으며, 이 경우 마크로사이클릭화 시약은, 제한 없이, Cu 시약, 예를 들어, 반응성 Cu(I) 종, 예를 들어, CuBr, CuI 또는 CuOTf를 제공하는 시약뿐만 아니라 환원제, 예를 들어, 아스코르브산 또는 나트륨 아스코르베이트의 첨가에 의해 원위치에서 활성 Cu(I) 시약으로 전환될 수 있는 Cu(II) 염, 예를 들어, Cu(CO.sub.2CH.sub.3).sub.2, CuSO.sub.4, 및 CuCl.sub.2를 포함한다. 마크로사이클릭화 시약은 추가로, 예를 들어, 당업계에 공지된 Ru 시약, 예를 들어, Cp*RuCl(PPh.sub.3).sub.2, [Cp*RuCl].sub.4 또는 반응성 Ru(II) 종을 제공할 수 있는 다른 Ru 시약을 포함할 수 있다. 다른 경우에, 반응성 그룹은 말단 올레핀이다. 이러한 구현예에서, 마크로사이클릭화 시약 또는 마크로사이클 형성 시약은 안정화된 후기 전이 금속 카빈 착물 촉매, 예를 들어, VIII족 전이 금속 카벤 촉매를 포함하지만 이에 제한되지 않는 복분해 촉매이다. 예를 들어, 이러한 촉매는 +2 산화 상태, 16개의 전자 수 및 5배위를 갖는 Ru 및 Os 금속 중심이다. 추가의 촉매는 문헌(참조: Grubbs et al., "Ring Closing Metathesis and Related Processes in Organic Synthesis" Acc . Chem . Res. 1995, 28, 446-452, 및 U.S. Pat. No. 5,811,515)에 개시되어 있다. 또 다른 경우에, 반응성 그룹은 티올 그룹이다. 이러한 구현예에서, 마크로사이클릭화 시약은, 예를 들어, 2개의 티올 반응성 그룹, 예를 들어, 할로겐 그룹으로 작용화된 링커이다.
하나의 구현예에서, 펩티드모방성 마크로사이클은 상응하는 비마크로사이클릭 폴리펩티드와 비교할 때 향상된 생물학적 특성, 예를 들어, 증가된 구조적 안정성, 표적에 대한 증가된 친화도, 단백질 분해에 대한 증가된 내성을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 펩티드모방성 마크로사이클은 수용액 중 하나 이상의 α-나선을 포함하고/하거나 상응하는 비마크로사이클릭 폴리펩티드와 비교하여 증가된 정도의 α-헬리시티(helicity)를 나타낸다.
예를 들어, 펩티드의 서열이 분석될 수 있고, 본 발명의 아지드 함유 및 알킨 함유 아미노산 유사체는 적절한 위치에서 치환될 수 있다. 적합한 위치는 2차 구조의 어느 분자 표면(들)이 생물학적 활성에 필요한지, 따라서 본 발명의 마크로사이클 형성 링커가 생물학적 활성에 필요한 표면(들)을 입체적으로 차단하지 않고 마크로사이클을 형성할 수 있는 다른 표면(들)을 가로질러 확인함으로써 결정된다. 이러한 결정은 활성에 중요한 잔기 (및 표면)을 시각화하기 위해 2차 구조와 천연 결합 파트너 사이의 복합체의 X-선 결정학과 같은 방법을 사용하여; 활성에 중요한 잔기 (및 표면)을 기능적으로 식별하기 위해 2차 구조에서 잔기의 순차적 돌연변이유발에 의해; 또는 다른 방법에 의해 이루어진다. 이러한 결정에 의해, 적절한 아미노산은 본 발명의 아미노산 유사체 및 마크로사이클 형성 링커로 치환된다. 예를 들어, 나선형 2차 구조의 경우, 나선의 한 표면(예: 나선의 축을 따라 세로 방향으로, 나선의 축 주위에 방사상으로 45 내지 135°연장되는 분자 표면)은 생물학적 활성을 위해 생체내 또는 시험관내에서 또 다른 생체분자와 접촉하도록 하는데 필요할 수 있다. 이러한 경우, 마크로사이클 형성 링커는 활성에 직접 필요하지 않은 표면의 일부에서 나선의 표면을 따라 세로로 연장하면서 나선의 2개의 탄소를 연결하도록 설계된다.
펩티드모방성 마크로사이클은 수용액 중의 나선을 포함할 수 있다. 예를 들어, 펩티드모방성 마크로사이클은 상응하는 비마크로사이클릭 폴리펩티드와 비교하여 수용액에서 증가된 나선 구조를 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드모방성 마크로사이클은 상응하는 비마크로사이클릭 폴리펩티드와 비교하여 증가된 열 안정성을 나타낸다. 다른 구현예에서, 펩티드모방성 마크로사이클은 상응하는 비마크로사이클릭 폴리펩티드와 비교하여 증가된 생물학적 활성을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 펩티드모방성 마크로사이클은 상응하는 비마크로사이클릭 폴리펩티드와 비교하여 단백질 분해에 대한 증가된 내성을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 펩티드모방성 마크로사이클은 상응하는 비마크로사이클릭 폴리펩티드와 비교하여 살아있는 세포에 침투하는 증가된 능력을 나타낸다.
용어 "아미노산 유사체"는 천연 아미노산과 구조적으로 유사하며, 펩티드모방성 마크로사이클의 형성에서 아미노산을 치환할 수 있는 분자를 지칭한다. 아미노산 유사체는, 제한 없이, 아미노 그룹과 카르복실 그룹 사이에 하나 이상의 추가의 메틸렌 그룹의 포함 또는 유사한 반응성 그룹에 의한 아미노 또는 카르복시 그룹의 치환(예: 2차 또는 3차 아민에 의한 1차 아민의 치환 또는 에스테르에 의한 카르복시 그룹의 치환)의 포함을 제외하고, 본원에서 정의된 바와 같이 아미노산과 구조적으로 동일한 화합물을 포함한다.
펩티드는 N-말단 아세틸, 포르밀, 미리스토일, 팔미토일, 카르복실, 2-푸로실, 및/또는 C-말단 하이드록실, 아미드, 에스테르 또는 티오에스테르 그룹을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 펩티드는 N-말단에서 아세틸화되고 C-말단에서 아미드화된다. 하나의 구현예에서, 킬레이트제, 예를 들어, DOTA, DPTA가 도입된다. 펩티드는, 예를 들어, 페길화, 지질화, 크테닐화, 파실화, 및 생체내 또는 시험관내에서 펩티드의 반감기를 연장시키는 다른 접근법에 의해 변형될 수 있다. 하나의 구현예에서, 펩티드의 용해도 및 생체이용률을 증가시키기 위해 페길화가 사용된다. 다양한 형태의 peg가 당업계에 공지되어 있으며, HiPeg, 분지형 및 포크형 Peg, 방출 가능한 Peg, 말단 그룹 NHS 에스테르를 갖는 이종이작용성 Peg, 말라이메이드, 비닐설폰, 피리딜 디설파이드, 아민 및 카르복실산을 포함한다. 치료적 페길화 펩티드의 예는 Amgen에서 제조한 페그필라글라스틴(Neulasta)을 포함한다.
링커 또는 스페이서는 아미노산 또는 핵산 또는 당업계에 공지된 다른 원자 구조일 수 있고, 전형적으로 2 내지 10개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이이다. 스페이서는 나노입자, 항체 단편, 리포좀, 세포 투과성 및/또는 세포내 전달 모이어티를 포함하는 것들과 같이, 본원에 기재된 CCR5 상호작용 작제물의 정확한 배향을 가능하게 하기에 충분히 유연해야 한다. 스페이서의 한 형태는 작제물이 세포 표적화를 위한 항원 결합 모이어티를 포함하는 경우에 사용하기에 적합한 IgG로부터의 힌지 영역이다.
항원 결합 분자는, 예를 들어, 세포외 수용체, 항체 또는 항체 단편(ScFv와 같은 분자 포함)을 포함한다. 신호 펩티드는 N-말단 말단에 존재할 수 있다. 2개 이상의 에피토프에 선택적으로 결합할 수 있는 이중특이적 항체는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 근육 환경 또는 다른 기질에 결합하기 위해 본 CCR5 상호작용제에 사용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 펩티드는 전달제와 접합되거나 달리 결합된다(공유 또는 비공유 부착). 하나의 구현예에서, 전달제는 펩티드를 조직, 표적 세포 또는 세포 집단에 전달한다.
CCR5 상호작용제의 유도체는 기재된 구조 또는 오르토로그를 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 이의 생물학적 활성 단편을 포함한다. 보존된 모티프 주위의 체계적인 단축 또는 알라닌 스캐닝 또는 모델링을 통상적으로 수행하여 CCR5 작용제 효과를 갖는 최소 펩티드를 식별할 수 있다.
유도체는 또한 최적의 정렬 후 비교창에 걸쳐 퍼센트 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 분자를 포함한다. 하나의 구현예에서, 동일성 백분율은 80 내지 99 사이의 임의의 수를 포함하여 적어도 80% 내지 99%이다.
펩티드 또는 제제의 생물학적 활성에 대한 적절한 검정은 당업자에게 공지되어 있으며, 본 명세서에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 펩티드 활성의 마커는 위성 세포 신호전달(예: MAPK), 줄기 세포 및 근아세포의 증식 및 분화의 상향조절을 포함한다.
하나의 구현예에서, CCR5 상호작용제는 천연 아미노산 잔기가 아닌 모이어티로 변형된다. 모이어티는 검출 가능한 표지, 본원에 기재된 비천연 아미노산, 반응성 그룹, 지방산, 콜레스테롤, 지질, 생물활성 탄수화물, 나노입자, 소분자 약물, 및 폴리뉴클레오티드로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 하나의 특정 구현예에서, 모이어티는 검출 가능한 태그 표지이다. 하나의 예에서, 검출 가능한 표지는 형광단, 형광발생 기질, 발광 기질 및 비오틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 당해 분야에서 인식된 태그 또는 표지는 친화성 제제를 포함하고, 검출용 모이어티는 형광 및 발광 화합물, 금속, 염료를 포함한다. 다른 유용한 모이어티는 친화성 태그, 비오틴, 렉틴, 킬레이트제, 란타나이드, 형광 염료, FRET 수용체/공여체를 포함한다.
하나의 구현예에서, 검출 가능한 표지를 포함할 수 있는 CCR5 상호작용제는 CCR5 제제의 보존된 잔기가, 예를 들어, 알라닌으로 치환된 제제의 변형된 대조군 버전을 포함하는 키트에 수반된다. 제제를 포함하는 키트는 판매용으로 제안되고, 스크리닝 목적 또는 치료 목적으로 사용될 수 있다.
이러한 유형의 펩티드는, 예를 들어, 문헌[참조: Sambrook et al. MOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbour Press, 1989), in particular Sections 16 and 17; Ausubel et al CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (John Wiley & Sons, Inc. 1994-1998), in particular Chapters 10 and 16; and Coligan et al. CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE (John Wiley & Sons, Inc. 1995-1997), in particular Chapters 1, 5 and 6]에 기재되어 있는 재조합 핵산 기술의 적용을 통해 수득될 수 있다.
대안적으로, 이러한 유형의 펩티드는 통상적인 액체 또는 점점 더 고상 합성 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 예를 들어, 초기 참조는, 예를 들어, 문헌[참조: Atherton and Sheppard in SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS : A PRACTICAL APPROACH (IRL Press at Oxford University, Oxford, England, 1989), see particularly Chapter 9, or by Roberge et al. (1995 Science 269: 202)]에 기재된 바와 같은 용액 합성 또는 고상 합성에 대해 이루어질 수 있다.
아자펩티드 합성은 이전에 선택적 하이드라진 작용화를 위한 지루한 용액-상 합성 경로에 의해 방해받았다. 최근에, 아자펩티드 합성을 위한 서브모노머 절차는 일반적인 세미카르바존 중간체에 다양한 측쇄의 추가를 가능하게 하여 용액 및 고상 화학에 의해 아자펩티드 라이브러리를 작제하는 수단을 제공한다. 간단히 말해, 아자 잔기는 세미카르바존 통합, 탈양성자화, N-알킬화 및 직교 탈보호에 의한 서브모노머 전략을 사용하여 펩티드 쇄에 도입된다. 생성되는 세미카르바지드의 아미노 아실화 및 연장은 목적하는 아자펩티드를 제공한다. 또한, 다수의 화학적 변형은 세미카르바존 잔기의 직교 화학(예: 마이클 첨가(Michael additions) 및 N-아릴화)을 이용한다. 또한, 아자-글리신 잔기의 산화는 주변사이클릭 반응(예: 딜스-앨더(Diels-Alder) 및 앨더-엔(Alder-ene) 화학)으로 반응하는 아조펩티드를 제공했다. 아자-글리신 잔기의 이러한 변형의 대부분은 루벨(Lubell) 연구소에 의해 개발되었고, 이는 암 또는 노화 관련 황반 변성과 같은 질환을 치료하기 위한 유망한 생물학적 활성을 갖는 리간드의 합성에 이러한 화학을 적용하였다. 성장 호르몬 방출 펩티드-6(His-d-Trp-Ala-Trp-d-Phe-Lys-NH2, GHRP-6)의 아자펩티드 유사체는, 예를 들어, 분화 36 수용체의 클러스터(CD36)의 리간드로서 추구되어 왔으며, 혈관신생 관련 질환, 예를 들어, 노화 관련 황반 변성뿐만 아니라 아테롬성 동맥경화증에 대한 치료법의 개발에 유망한 활성을 나타낸다. 아자펩티드는 또한 암 세포에서 유망한 아폽토시스 유도 활성을 나타내는 일련의 구조적으로 제한된 제2 미토콘드리아 유래 카스파제(Smac) 모방체를 제조하기 위해 사용되었다. 사이클릭 아자펩티드 유도체의 합성은 인간 종양 전이 및 종양 유발 혈관신생에 대한 효능을 나타내는 항암제 실렌지타이드, 사이클로(RGDf-N(Me)V) 및 이의 모 대응물 사이클로(RGDfV)의 형태-활성 관계를 연구하기 위해 아자 스캔을 제조하는데 사용되었다. 아자펩티드의 합성 및 적용에서의 혁신은 문헌(참조: Acc Chem Res. 2017 Jul 18;50(7):1541-1556)에 기재되어 있다.
대안적으로, 펩티드는 엔도Lys-C, 엔도Arg-C, 엔도Glu-C 및 스타필로코쿠스 V8-프로테아제와 같은 프로테이나제에 의한 어댑터 폴리펩티드의 소화에 의해 생성될 수 있다. 소화된 단편은, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 기술에 의해 정제될 수 있다. 펩티드 및 펩티드 유사체의 약력학 파라미터를 최적화하기 위해 취해질 수 있는 조치가 문헌(참조: Werle M. et al (2006) Strategies to improve plasma half-life time of peptide and protein drugs amino Acids 30(4):351-367; and Di L (2014) Strategic approaches to optimising peptide ADME properties AAPS J 1-10)에 의해 기재되어 있다.
CCR5 상호작용 펩티드는, 예를 들어, 나노입자, 리포좀, 미셀, 또는, 예를 들어, 당업계에 공지된 PEG를 통해 안정화될 수 있다. 리포좀을 형성하는 방법은 문헌(참조: Prescott, Ed. Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), p. 33 et seq., 이의 내용은 본원에 참고로 포함된다)에 기재되어 있다. 중합체 나노입자는 이상적으로 나노입자에 독성이 없거나 물리적으로 흡착되지 않은 계면활성제를 사용한다. 한 측면에서, 생분해성 서프머가 사용된다. 예를 들어, 생분해성 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)화 N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드(HPMA) 기반 서프머가 합성되고 친유성 NP를 안정화하는데 사용된다. 특히, NP 코어는 HPMA 이중 결합으로 작용화된 폴리(락트산)(PLA) 쇄를 포함하는 마크로단량체로 제조된다. 이어서, 중합체 쇄를 형성하는 나노입자는 생체적합성이고 수용성 및 가수분해 가능한 PEG 및 PLA 펜던트인 균일한 폴리(HPMA) 백본으로 구성되어 중합체의 완전한 분해성을 보장한다. 합성된 서프머에 의해 제공된 안정성은 에멀젼 자유 라디칼 중합 및 용액 자유 라디칼 중합 모두에 이어 수득된 양친매성 공중합체의 플래시 나노침전이 이어지는 경우에 연구된다.
다른 안정화 또는 이종 모이어티는 NMEG, ECM 결합, 신데칸 결합 알부민, 알부민 결합 단백질, 면역글로불린 Fc 도메인을 포함한다.
전통적인 Fc 융합 단백질 및 항체는 유도되지 않은 상호작용 쌍의 예인 반면, 다양한 조작된 Fc 도메인은 문헌(참조: Spiess et al. (2015) Molecular Immunology 67(2A): 95-106)에 기재된 바와 같은 비대칭 상호작용 쌍으로서 설계되었다. Fc 접합체는 IgG(IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4), IgA(IgA1 또는 IgA2), IgE, 또는 IgM 면역글로불린의 Fc 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 면역글로불린 도메인은 숙주 세포 내에서 이종 또는 동종이량체 또는 다량체성 아밀로이드 형성을 촉진하는 하나 이상의 아미노산 변형(예: 결실, 부가 및/또는 치환)을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, CCR5 상호작용제를 포함하는 나노입자는 당업계에 공지된 조직 유형 특이적 결합제, 항체 또는 이의 단편의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다.
다른 적합한 결합제는 당업계에 공지되어 있고, 항원 결합 작제물, 예를 들어, 아피머, 앱타머, 또는 적절한 리간드(수용체) 또는 이의 일부를 포함한다.
항체, 예를 들어, 모노클로날 항체, 또는 이의 유도체 또는 유사체는, 제한 없이, Fv 단편; 단일 쇄 Fv(scFv) 단편; Fab' 단편; F(ab')2 단편; 인간화 항체 및 항체 단편; 낙타화 항체 및 항체 단편, 및 상기의 다가 버전을 포함한다. 필요한 경우, 제한 없이, 단일특이적 또는 이중특이적 항체; 예를 들어, 디설파이드 안정화 Fv 단편, scFv 탠덤 (scFv) 단편, 디아바디, 트리바디 또는 테트라바디를 포함하는 다가 결합 시약이 또한 사용될 수 있고, 이는 전형적으로 공유적으로 연결되거나 그렇지 않으면 안정화된(즉, 류신 지퍼 또는 나선 안정화된) scFv 단편이다.
본원에 사용된 용어 "항체 단편"은 전장 항체에 의해 인식되는 에피토프에 결합하는 능력을 보유하는 항체의 임의의 부분을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 단일 쇄 Fv(scFv), 디설파이드 결합 Fv(dsFv), 및 VL 또는 VH를 포함하는 단편을 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다. 항체의 항원 결합 단편은 가변 영역(들)을 단독으로 또는 힌지 영역, CH1, CH2, CH3, 또는 이들의 조합의 일부와 조합하여 포함할 수 있다. 바람직하게는, 항체 단편은 전체 항체의 6개 CDR 모두를 함유하지만, 6개의 CDR 모두보다 적게 함유하는 단편이 또한 기능적일 수 있다.
"단일 쇄 FV"("scFv")는 단일 폴리펩티드 내에 항체의 경쇄 가변 영역(VL)에 연결된 항체의 중쇄 가변 영역(VH)을 함유하지만, 항체의 불변 도메인 중 일부 또는 전부가 결여된 항원 결합 단편이다. VH와 VL 사이의 연결은 scFv가 유래된 전체 항체의 표적 분자 결합 특이성을 유지하기 위해 VL 및 VH 영역의 적절한 3차원 폴딩이 발생한다는 것을 보장하도록 선택된 짧고 유연한 펩티드를 통해 달성될 수 있다. scFv는 항체의 불변 도메인의 일부 또는 전부가 결여된다.
일반적으로, 특히 천연 리간드에 기초하지만, 항체 및 그들의 유도체 및 유사체 및 앱타머를 포함하는 수용체 특이적 결합제를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 폴리클로날 항체는 동물의 면역화에 의해 생성될 수 있다. 모노클로날 항체는 표준(하이브리도마) 방법론에 따라 제조될 수 있다. 인간화 항체를 포함하는 항체 유도체 및 유사체는 표준 방법에 따라 모노클로날 항체를 인코딩하는 DNA로부터 DNA 단편을 단리시키고 적절한 V 영역을 적절한 발현 벡터에 서브클로닝함으로써 재조합적으로 제조될 수 있다. 파지 디스플레이 및 앱타머 기술은 문헌에 기재되어 있으며, 매우 친화성이 낮은 교차 반응성을 갖는 표적 특이적 결합 시약의 시험관내 클론 증폭을 가능하게 한다. 파지 디스플레이 시약 및 시스템은 시판되고 있으며, 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 Amersham Pharmacia Biotech, Inc.으로부터 시판되는 재조합 파지 항체 시스템(RPAS) 및 플로리다주 마르코 아일랜드의 MoBiTec, LLC로부터 시판되는 pSKAN 파지미드 디스플레이 시스템을 포함한다. 앱타머 기술은, 예를 들어, 제한 없이, 미국 특허 제5,270,163호; 제5,475,096호; 제5,840,867호 및 제6,544,776호에 기재되어 있다.
임의로, 하나 이상의 변형된 아미노산은 글리코실화 아미노산, 페길화 아미노산, 파르네실화 아미노산, 아세틸화 아미노산, 비오티닐화 아미노산 및 지질 모이어티에 접합된 아미노산 및 유기 유도체화제에 접합된 아미노산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. CCR5 상호작용 펩티드는 적어도 하나의 N-결합 당을 포함할 수 있고, 2개, 3개 또는 그 이상의 N-결합 당을 포함할 수 있다. 펩티드는 또한 O-결합 당을 포함할 수 있다. CCR5 상호작용 펩티드 또는 제제는 유전자 조작된 곤충 또는 효모 세포, 및 포유류 세포, 예를 들어, COS 세포, CHO 세포, HEK 세포 및 NSO 세포를 포함하여 환자의 사용에 적합한 방식으로 단백질을 글리코실화하는 다양한 세포주에서 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, CCR5 펩티드는 글리코실화되고, 중국 햄스터 난소 세포주로부터 수득 가능한 글리코실화 패턴을 갖는다. 대부분의 구현예에서, CCR5 상호작용제가 합성되고, 성분 부분은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 첨가된다.
일부 구현예에서, 대상체 CCR5 상호작용제는 포유동물(예: 마우스 또는 인간)에서 약 0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 12, 24, 36, 48 또는 72시간의 반감기를 갖는다. 대안적으로, 그들은 접합체 및 담체 특징 및 투여 방식에 따라 포유동물(예: 마우스 또는 인간)에서 약 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 20, 25, 또는 30일의 반감기를 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드는 근육 조직에서의 보유를 최대화하고 전신 순환을 회피하거나 최소화하도록 변형된다. 제제는 겔, 발포체, 접착제, 하이드로겔, 패치, 및 필름 등과 같은 당업계에 공지된 일련의 보유 향상 조성물로 투여될 수 있다.
펩티드의 크기를 변형하여 유체역학적 라듐 및 신장 클리어런스를 변경할 수 있다. 종종 링커에 의한 PEG화 및 지질화는 프로테아제로부터의 클리어런스 및 보호를 감소시킴으로써 제제의 혈청 반감기를 증가시키는 확립된 변형이다. 2세대 PEG화 과정은 PEG 부착을 위한 대체 화학뿐만 아니라 분지 구조의 사용을 도입했다. 특히, 말레이미드 및 요오도아세트아미드와 같은 시스테인 반응성 그룹을 갖는 PEG는 최종 생성물의 불균일성을 감소시키는 펩티드 내의 단일 잔기로 PEG화의 표적화를 가능하게 한다. 또한, 균질하고 쉽게 생성되는 XTEN(참조: US 20190083577) 및 PAS를 포함하는 PEG의 기능적 유사체인 생분해성 친수성 아미노산 중합체가 개발되었다. ConX에 의해 개발된 펩티드에 대한 항체의 화학적 결합은 이전 방법의 단점을 극복할 것을 약속하는 다양한 하이브리드 펩티드 반감기 연장 방법을 예시한다.
경구 및 주사용 용액 가용화 부형제는 수용성 유기 용매(폴리에틸렌 글리콜 300, 폴리에틸렌 글리콜 400, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 글리세린, N-메틸-2-피롤리돈, 디메틸아세트아미드 및 디메틸설폭사이드), 비이온성 계면활성제(크레모포어 EL, 크레모포어 RH 40, 크레모포어 RH 60, d-α-토코페롤 폴리에틸렌 글리콜 1000 석시네이트, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 솔루톨 HS 15, 소르비탄 모노올레에이트, 폴록사머 407, 라브라필 M-1944CS, 라브라필 M-2125CS, 라브라솔, 겔루시레 44/14, 소프티겐 767, 및 PEG 300, 400 또는 1750의 모노- 및 디-지방산 에스테르), 수불용성 지질(피마자유, 옥수수유, 면실유, 올리브유, 땅콩유, 페퍼민트유, 잇꽃유, 참기름, 대두유, 수소화 식물성 오일, 수소화 대두유, 및 코코넛유 및 야자씨유의 중쇄 트리글리세라이드), 유기 액체/반고체(밀랍, d-α-토코페롤, 올레산, 중쇄 모노- 및 디글리세라이드), 다양한 사이클로덱스트린(α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린, 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린 및 설포부틸에테르-β-사이클로덱스트린) 및 인지질(수소화 대두 포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜글리세롤, l-α-디미리스토일포스파티딜콜린, l-α-디미리스토일포스파티딜글리세롤)을 포함한다. 경구 및 주사 투여용 제제를 가용화하기 위한 화학 기술은 pH 조절, 공용매, 복합체화, 마이크로에멀젼, 자가-유화 약물 전달 시스템, 미셀, 리포솜 및 에멀젼을 포함한다.
작제물 /벡터
수령인 세포로부터 CCR5 결합제를 발현하기 위한 작제물 또는 벡터는 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 하나 이상의 DNA 영역을 포함할 수 있다. 프로모터는 유도성 또는 구성적일 수 있다. 적합한 구성적 프로모터의 예는, 예를 들어, 즉각적 초기 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 신장 성장 인자-1a(EF-1a) 유전자 프로모터, 심미안 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 긴 말단 반복(LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인-바 바이러스 즉각적 초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터 뿐만 아니라 인간 유전자 프로모터, 예를 들어, 이에 제한되지 않고, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터 및 크레아틴 키나제 프로모터를 포함한다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터 및 테트라사이클린 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
발현 작제물은 특히, 플라스미드, 박테리오파지, 바큘로바이러스, 포유류 바이러스, 인공 염색체와 같은 당업계에 공지되어 이용 가능한 다양한 벡터를 이용하는, 재조합 또는 합성 기술을 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 생성될 수 있다. 발현 작제물은 원형 또는 선형일 수 있고, 진핵생물로의 복제 및 통합에 적합해야 한다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 렌티바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 포유류 세포로의 유전자 전달을 위해 다수의 바이러스 기반 시스템이 개발되었다. 예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 선택된 유전자를 벡터에 삽입하고 당업계에 공지된 기술을 사용하여 레트로바이러스 입자에 패키징할 수 있다. 이어서, 재조합 바이러스를 단리시키고 대상체 줄기 세포에 전달할 수 있다. 다수의 레트로바이러스 시스템이 당업계에 공지되어 있다.
펩티드가 펩티드를 인코딩하는 핵산으로서 제공되는 본 발명의 특정 구현예에서, 핵산은 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로서 그것을 작제하고 그것을 투여하여 세포내가 되도록 함으로써(예를 들어, 레트로바이러스 벡터의 사용, 직접 주사, 미립자 충격의 사용, 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 형질감염제로 코팅함으로써 또는 그것을 연계하여 호메오박스 유사 펩티드 또는 다른 세포내 표적화 모이어티에 투여함으로써 이의 인코딩된 단백질의 발현을 촉진하기 위해 생체내 투여될 수 있다. 대안적으로, 핵산은 세포내로 도입되고, 발현을 위해 숙주 세포 DNA에 혼입될 수 있다.
본원에서 상호교환 가능하게 사용되는 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 이들의 유사체 또는 변형된 버전을 포함하는 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 포함한다. 그들은 단일 가닥, 이중 가닥 및 다중 가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드 및 퓨린 염기, 피리미딘 염기 또는 다른 천연, 화학적으로 변형된, 생화학적으로 변형된, 비천연 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 포함한다.
핵산은 모노뉴클레오티드가 반응하여 하나의 모노뉴클레오티드 펜토스 환의 5' 포스페이트가 포스포디에스테르 결합을 통해 한 방향으로 이웃의 3' 산소에 부착되는 방식으로 올리고뉴클레오티드를 제조하기 때문에 "5' 말단" 및 "3' 말단"을 갖는다고 한다. 올리고뉴클레오티드의 말단은 이의 5' 포스페이트가 모노뉴클레오티드 펜토스 환의 3' 산소에 결합되지 않는 경우 "5' 말단"으로 지칭된다. 올리고뉴클레오티드의 말단은 이의 3' 산소가 다른 모노뉴클레오티드 펜토스 환의 5' 포스페이트에 결합되지 않는 경우 "3' 말단"으로 지칭된다. 핵산 서열은, 더 큰 올리고뉴클레오티드 내부에 있는 경우에도, 또한 5' 말단 및 3' 말단을 갖는다고 할 수 있다. 선형 또는 원형 DNA 분자에서, 개별 요소는 "하류" 또는 3' 요소의 "상류" 또는 5'로 지칭된다.
"코돈 최적화"가 사용될 수 있으며, 일반적으로 천연 아미노산 서열을 유지하면서 천연 서열의 적어도 하나의 코돈을 숙주 세포의 유전자에서 보다 자주 또는 가장 자주 사용되는 코돈으로 대체함으로써 특정 숙주 세포에서 향상된 발현을 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 포함한다. 예를 들어, Cas 단백질을 인코딩하는 핵산은 천연 핵산 서열과 비교하여 박테리아 세포, 효모 세포, 인간 세포, 비인간 세포, 포유류 세포, 설치류 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 햄스터 세포, 또는 임의의 다른 숙주 세포를 포함하는 주어진 원핵 세포 또는 진핵 세포에서 더 높은 사용 빈도를 갖는 코돈을 대체하도록 변형될 수 있다. 코돈 사용 표는, 예를 들어, "코돈 사용 데이터베이스"에서 쉽게 이용 가능하다. 이들 표는 다양한 방법으로 조정할 수 있다. 본원에서 그 전문이 모든 목적을 위해 참고로 포함된 문헌(참조: Nakamura et al. (2000) Nucleic Acids Research 28:292)을 참조한다. 특정 숙주에서 발현을 위한 특정 서열의 코돈 최적화를 위한 컴퓨터 알고리즘도 이용 가능하다(참조: 예를 들어, Gene Forge).
본원에 기재된 핵산 분자는 시험관내 전사된 RNA 또는 합성 RNA를 포함하는 DNA 또는 RNA와 같은 임의의 형태일 수 있다. 핵산은 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 재조합적으로 생성되고 화학적으로 합성된 분자, 및 이들의 변형된 형태를 포함한다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, 선형이거나 원을 형성하기 위해 공유적으로 폐쇄될 수 있다. RNA는 서열의 안정화, 캡핑 및 폴리아데닐화에 의해 변형될 수 있다. RNA 또는 DNA는 펩티드를 발현하는 플라스미드로서 전달될 수 있다. RNA 기반 접근법은 통상적으로 이용 가능하다.
용어 "RNA"는 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하고, 바람직하게는 전적으로 또는 실질적으로 리보뉴클레오티드 잔기로 구성되는 분자에 관한 것이다. "리보뉴클레오티드"는 β-D-리보푸라노실 그룹의 2' 위치에 하이드록실 그룹을 갖는 뉴클레오티드에 관한 것이다. 상기 용어는 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 단리된 RNA, 예를 들어, 부분적으로 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합적으로 생성된 RNA뿐만 아니라 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 천연 RNA와 상이한 변형된 RNA를 포함한다. 이러한 변경은, 예를 들어, RNA의 말단(들)에 또는 내부적으로, 예를 들어, RNA의 하나 이상의 뉴클레오티드에 비-뉴클레오티드 물질의 부가를 포함할 수 있다. RNA 분자 내의 뉴클레오티드는 또한 비표준 뉴클레오티드, 예를 들어, 비천연 뉴클레오티드 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 변경된 RNA는 유사체 또는 천연 RNA의 유사체로서 지칭될 수 있다.
최적화된 mRNA 기반 조성물은 당업계에 공지된 바와 같이 번역 효율 및 세포내 안정성을 최적화하는 5' 및 3' 비번역 영역(5'-UTR, 3'-UTR)을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 캡핑되지 않은 5'-트리포스페이트의 제거는 RNA를 포스파타제로 처리함으로써 달성될 수 있다. RNA는 안정성을 높이고 세포 독성을 감소시키기 위해 변형된 리보뉴클레오티드를 가질 수 있다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, RNA에서, 5-메틸시티딘은 시티딘을 부분적으로 또는 완전히 치환한다. 하나의 구현예에서, 용어 "변형"은 RNA에 5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 제공하는 것에 관한 것이다. 용어 "5'-캡"은 mRNA 분자의 5'-말단에서 발견되는 캡 구조를 지칭하며, 일반적으로 특이한 5' 내지 5' 트리포스페이트 결합을 통해 mRNA에 결합된 구아노신 뉴클레오티드로 구성된다. 하나의 구현예에서, 이 구아노신은 7-위치에서 메틸화된다. 용어 "통상적인 5'-캡"은 천연 RNA 5'-캡, 바람직하게는 7-메틸구아노신 캡을 지칭한다. 용어 "5'-캡"은 RNA 캡 구조와 유사하고 RNA를 안정화시키고/시키거나 RNA의 번역을 향상시키는 능력을 갖도록 변형된 5'-캡 유사체를 포함한다. RNA에 5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 제공하는 것은 상기 5'-캡 또는 5'-캡 유사체의 존재하에 DNA 주형의 시험관내 전사에 의해 달성될 수 있으며, 여기서 상기 5'-캡은 생성된 RNA 가닥에 공동전사적으로 혼입되거나, RNA는, 예를 들어, 시험관내 전사에 의해 생성될 수 있거나, 5'-캡은 캡핑 효소, 예를 들어, 백시니아 바이러스의 캡핑 효소를 사용하여 전사 후 RNA에 부착될 수 있다.
RNA의 추가 변형은 천연 폴리(A) 꼬리의 연장 또는 절단 또는 5'- 또는 3'-비번역 영역(UTR)의 변경, 예를 들어, 상기 RNA의 코딩 영역과 관련이 없는 UTR의 도입, 예를 들어, 기존의 3'-UTR과 글로빈 유전자, 예를 들어, 알파2-글로빈, 알파1-글로빈, 베타-글로빈으로부터 유래된 3'-UTR 중 하나 이상, 바람직하게는 2개의 카피와의 교환 또는 이의 삽입일 수 있다. 마스킹되지 않은 폴리-A 서열을 갖는 RNA는 마스킹된 폴리-A 서열을 갖는 RNA보다 더 효율적으로 번역된다. RNA의 안정성 및/또는 발현을 증가시키기 위해, 바람직하게는 10 내지 500, 보다 바람직하게는 30 내지 300, 더욱 더 바람직하게는 65 내지 200, 특히 100 내지 150 아데노신 잔기의 길이를 갖는 폴리-A 서열과 함께 존재하도록 변형될 수 있다. RNA의 발현을 증가시키기 위해, 코딩 영역 내에서 변형되어 GC-함량을 증가시키고, mRNA의 안정성을 향상시키고, 코돈 최적화를 수행하고, 따라서 세포내 번역을 향상시킬 수 있다. 변형된 mRNA는 효소적으로 합성되고, 지질 나노입자와 같은 나노입자에 패키징될 수 있고, 예를 들어, 근육내로 투여될 수 있다.
핵산 분자는, 예를 들어, 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예: 리포좀, 미소구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐), 또는 마크로에멀젼에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 문헌(참조: Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Remington, J., ed. (2000))에 개시되어 있다. 제제의 특별 세포 서브세트로의 표적화 전달은 치료 지수를 향상시킬 수 있다. 항체는 항체 또는 이의 결합 단편에 의해 인식되는 항원을 포함하는 세포에 결합하는 제제를 표적화한다. 이는, 예를 들어, 말레이미드 작용화된 PEG-PLGA 중합체성 나노입자, 또는 전달 모이어티 또는 셔틀제를 포함하는 조성물에 CCR5 상호작용 펩티드를 단순히 조합하는 것을 포함한다.
생체외 접근법은 본원에 기재된 바와 같은 CCR5 상호작용제를 함유하거나 발현하도록 세포를 변형시키기 위한 CRISPR 성분과 같은 유전자 편집의 투여를 고려한다.
소분자 작용제
SMA는 본원에 기재된 기술을 사용하거나 당업계에 공지된 바와 같이 개발된다. 소분자는 1000nM 미만, 500nM 미만, 250nM 미만, 200nM 미만, 100nM 미만, 50nM 미만, 25nM 미만, 20nM 미만, 10nM 미만, 1nM 미만, 0.1nM 미만, 0.01nM 미만, 또는 0.001nM 미만의 ED50으로 CCR5 수용체를 활성화시킬 수 있는 것으로 추가로 선택된다. 하나의 구현예에서, CCR5 상호작용 작용제는 CCR5 또는 위성 세포 CCR5에 대해 선택적이다.
투여
본 개시내용에 따라, 본원에 개시된 CCR5 결합제를 포함하거나 인코딩하는 조성물 또는 제제는 근육 손실 또는 기능적으로 재생하는 능력의 감소와 관련된 다양한 상태에서 상처를 치유하거나 근육을 지연, 유지 또는 재생하기 위해 환자에게 투여할 수 있다.
조성물은 주사, 국소 또는 점막 적용, 흡입 또는 변형된 방출 모드를 포함하는 경구 경로에 의해 대상체의 근육 재생 수준을 자극하는데 효과적인 기간 및 양으로 전달될 수 있다. 투여는 국소적 또는 전신적(예: 예를 들어, 정맥내, 복강내, 피내, 피하 또는 근육내 경로에 의한 비경구)이거나 표적화될 수 있다. 하나의 구현예에서, CCR5 상호작용제의 투여는 전신적이거나 상처에 직접적이다. 피하 또는 근육내 경로는 영향을 받은 근육 조직에 직접적일 수 있다.
CCR5 상호작용제는 연고, 크림, 패치, 분말 또는 국소 제형에 적합한 다른 제형의 형태로 제형화될 수 있다. 소분자량 CCR5 작용제 제형은 제제를 피부에서 더 깊은 근육 조직으로 전달할 수 있다. 따라서, 이러한 제형은 활성 성분의 피부로의 침투를 향상시키는 하나 이상의 제제를 포함할 수 있다. 국소 적용의 경우, CCR5 제제는 상처 드레싱 및/또는 피부 코팅 조성물에 포함될 수 있다.
투여되는 제제의 양은 당업자에 의해 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 또한, 시험관내 검정을 임의로 사용하여 최적의 투여량 범위의 식별을 도울 수 있다. 사용되는 정확한 투여량은 또한 제제의 성질 및 기타 임상적 인자(예: 대상체의 상태, 그들의 체중, 연령, 다른 조건, 투여 경로 및 조성물의 유형(세포, 스캐폴드화, 하이드로겔 기재 또는 경구 제형))에 의존할 것이다. 치료적 또는 예방적으로 효과적이고 유해하지 않은 정확한 용량은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 약제학적 조성물은 통상적인 약제학적 배합 기술에 따라 편리하게 제조된다. 예를 들어, 문헌(Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Remington, J., ed. (2000) 및 이후 판)을 참조한다.
유효량에 대한 언급은 치료적 또는 생리학적 또는 재생적 유효량을 포함한다. 본원에서 사용된 "치료적 유효량"은 임의의 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 이익/위험 비율로 동물 내의 세포의 적어도 하위 집단에서 일부 목적하는 치료 효과를 생성하는 데 효과적인 케모카인 수용체 작용제 활성을 포함하는 조성물의 양을 의미한다. 예를 들어, 통계적으로 유의하고 측정 가능한 근육 복구 또는 재생을 생성하기에 충분한 CCR5 작용제의 양이 대상체에게 투여된다. 치료적 유효량의 결정은 충분히 당업자의 능력의 범위 내에 있다. 일반적으로, 치료적 유효량은 대상체의 이력(history), 연령, 상태, 성별, 및 대상체의 의학적 상태의 중증도 및 유형, 및 다른 약제학적 활성제의 투여에 따라 달라질 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "투여하다"는 목적하는 효과가 생성되도록 목적하는 부위에서 조성물의 적어도 부분적인 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 조성물의 대상체에의 배치를 지칭한다. 본 조성물에 적합한 투여 경로는 그 포맷에 따라 달라지며, 국소 및 전신 투여를 모두 포함한다. 일반적으로, 국소 투여는 대상체의 전신과 비교하여 더 많은 CCR5 작용제 또는 CCR5 작용제 활성으로 처리된 세포를 특정 위치에 전달하는 결과를 초래하는 반면, 전신 투여는 본질적으로 대상체의 전신에 전달을 초래한다. 국소 투여의 한 방법은 근육내 주사에 의한 것이다.
본 발명에 따르면, 용어 "투여하는"은 또한 대상체로의 세포의 이식을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "이식"은 적어도 하나의 세포를 대상체에게 이식 또는 전달하는 과정을 지칭한다. 용어 "이식"은, 예를 들어, 자가 이식(환자의 한 위치에서 동일한 환자의 동일한 위치 또는 다른 위치로 세포(들)의 제거 및 전달), 동종 이식(동일한 종의 구성원 간 이식) 및 이종 이식(상이한 종의 구성원 간 이식)을 포함한다. 당업자는 근육의 복원 및 재생을 위해 줄기 세포를 이식 또는 이식하는 방법을 잘 알고 있으며, 이들은 본 발명에 적합하다. 예를 들어, 미국 특허 제7,592,174호 및 미국 특허 공보 제2005/0249731호를 참조하고, 이들 둘의 내용은 본원에 참고로 포함된다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 방법에 따른 근육 조직의 재생은 최소한의 섬유증과 관련된다. 구체적으로, 본원에 기재된 방법 및 제제는 손상되거나 비재생되거나 위축된 근육 조직에서 흉터-유사 조직의 형성을 감소 및/또는 억제한다. 따라서, 일부 구현예에서, 손상된 근육 조직에서 흉터-유사 조직 형성의 형성은 본 제제가 없는 대조군에 비해 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 감소된다. 지방 침착(adipose deposition)도 유사하게 감소될 수 있다.
그러나, 본 발명의 펩티드의 정맥내 투여에 적합한 용량 범위는 일반적으로 체중 1킬로그램(Kg)당 약 1.25 내지 5마이크로그램의 활성 화합물이다. 비내 투여에 적합한 용량 범위는 일반적으로 약 0.01pg/kg 체중 내지 1mg/kg 체중이다. 유효 투여량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유도된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다. 좌제는 일반적으로 활성 성분을 0.5중량% 내지 10중량%의 범위로 함유하고; 경구 조성물은 바람직하게는 10% 내지 95%의 활성 성분을 함유한다.
"유도체"는 NAMPT의 기본 서열로부터 유래되거나 아미노산 서열의 변형, 또는, 예를 들어, 다른 화학적 모이어티와의 접합 또는 복합체화 또는 발현(예: 융합 단백질로서)에 의해, 또는 당업계에서 이해되는 바와 같은 번역 후 변형 기술에 의해 cif 모티프를 포함하는 제제 또는 활성 물질을 의미한다. 용어 "유도체"는 또한 기능적으로 동등하거나 기능적으로 향상된 분자를 제공하는 부가 또는 결실을 포함하는 부모 서열에 이루어진 변경을 그 범위 내에 포함한다.
"단리된"은 본래의 상태에서 통상적으로 수반되는 성분을 실질적으로 또는 본질적으로 함유하지 않는 물질을 의미한다.
용어 "대상체"는 환자를 포함하고, 의학적 또는 수의학적 관심이 있는 임의의 대상체를 지칭한다. 대상체는 척추동물 대상체, 예를 들어, 포유류 대상체(예: 소, 돼지, 개, 고양이, 말, 라마, 낙타 등), 비포유동물, 파충류, 조류, 어류일 수 있다. 대상체는 예방 또는 치료가 요구되는 인간을 포함한다. 대상체는 암, 상처 치료, 근육 감소증(sarcopenia) 또는 조직 변성과 관련된 다른 병리, 질환, 장애, 또는 상태의 예방 또는 치료를 필요로 할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 mRNA, RNA, cRNA, cDNA 또는 DNA를 지칭한다. 상기 용어는 전형적으로 길이가 30개 초과의 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 서열 "동일성"은 서열이 비교창에 걸쳐 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 기준 또는 아미노산 대 아미노산 기준으로 동일한 정도를 지칭한다. 따라서 "서열 동일성의 백분율"은 비교창에 걸쳐 2개의 최적 정렬된 서열을 비교하고, 동일한 핵산 염기(예: A, T, C, G, U) 또는 동일한 아미노산 잔기(예: Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys 및 Met)가 두 서열에서 발생하여 일치하는 위치의 수를 산출하는 위치의 수를 결정하고, 일치된 위치의 수를 비교창 중 총 위치의 수(즉, 창 크기)로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다. 본 발명의 목적을 위해, "서열 동일성"은 소프트웨어와 함께 수반되는 참조 매뉴얼에 사용된 표준 디폴트를 사용하여 DNSIS 컴퓨터 프로그램(Windows용 버전 2.5; 미국 캘리포니아 사우스 샌프란시스코 소재 Hitachi Software Engineering Co., Ltd.로부터 입수 가능)에 의해 계산된 "일치 백분율"을 의미하는 것으로 이해될 수 있다. 아미노산 서열 동일성은 또한 유럽 분자 생물학 실험실(European Molecular Biology Laboratory)의 일부인 The European Bioinformatics Institute(EMBL-EBI)로부터 입수 가능한 EMBOSS 쌍별 정렬 알고리즘 도구를 사용하여 결정될 수 있다. 이 도구는 www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/align/에 위치된 웹 사이트에서 액세스할 수 있다. 이 도구는 Needleman-Wunsch 글로벌 정렬 알고리즘을 사용한다(Needleman and Wunsch, 1970). 갭 개방: 10.0 및 갭 확장 0.5를 포함하는 디폴트 설정이 사용된다. 디폴트 매트릭스 "Blosum62"는 아미노산 서열과 디폴트 매트릭스에 사용된다.
용어 서열 "유사성"은 하기 표 1에 정의된 바와 같이 동일하거나 보존적 아미노산 치환을 구성하는 아미노산의 백분율 수를 지칭한다. 유사성은 서열 비교 프로그램, 예를 들어, GAP를 사용하여 결정될 수 있다(참조: Deverax et al., 1984 Nucleic Acids Research 12:387-395). 이러한 방식으로, 본원에 인용된 것들과 유사하거나 실질적으로 상이한 길이의 서열은 갭을 정렬에 삽입함으로써 비교될 수 있으며, 이러한 갭은, 예를 들어, GAP에 의해 사용되는 비교 알고리즘에 의해 결정된다. 종래의 분자 생물학 기술을 포함하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 이러한 기술은 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 다음과 같은 방법론 논문에 상세히 기재되어 있다: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (2001); and Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, (1992) (with periodic updates). 면역학 기술은 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 다음과 같은 방법론 논문에 상세히 기재되어 있다: Current Protocols in Immunology, ed. Coligan et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, (1992) (with periodic updates); Advances in Immunology, volume 93, ed. Frederick W. Alt, Academic Press, Burlington, Mass., (2007); Making and Using Antibodies: A Practical Handbook, eds. Gary C. Howard and Matthew R. Kaser, CRC Press, Boca Raton, Fl, (2006); Medical Immunology, 6th ed., edited by Gabriel Virella, Informa Healthcare Press, London, England, (2007); and Harlow and Lane ANTIBODIES: A Laboratory Manual, Second edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (2014). 유전자 전달 및 유전자 요법의 통상적인 방법은 또한 본 발명에서 사용하기 위해 개조될 수 있다. 예를 들어, 문헌(Gene Therapy: Principles and Applications, ed. T. Blankenstein, Springer Verlag, 1999; Gene Therapy Protocols (Methods in Molecular Medicine), ed. P. D. Robbins, Humana Press, 1997; Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, ed. Otto-Wilhelm Merten and Mohammed Al-Rubeai, Humana Press, 2011; and Nonviral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, ed. Mark A. Findeis, Humana Press, 2010. Amino Acids. 2018 Jan; 50(1):39-68. doi: 10.1007/s00726-017-2516-0. Epub 2017 Nov 28)을 참조한다.
본원에서 사용되는 방법의 추가 세부사항을 제공하는 참고문헌은 하기에 기재된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
본 출원은 제한 없이 기재된 주제를 실시하는데 유용한 하기 방법을 개시한다.
제브라피시 균쥬 및 유지
사용된 기존의 유전자삽입 라인은 TgBAC(pax3a:GFP)i150(TgBAC(pax3a:GFP)로서 지칭됨)40, Tg(mpeg1:mCherry)gl23(Tg(mpeg1:mCherry)로서 지칭됨)41, Tg(mpeg1:GAL4FF)gl25(Tg(mpeg1:GAL4FF)로서 지칭됨)41, Tg(UAS- E1b:Kaede)s1999t(Tg(UAS:Kaede)로서 지칭됨)42, Tg(UAS - E1b:Eco.NfsB-mCherry)c264(Tg(UAS:NfsB-mcherry)로서 지칭됨)43, Tg(-8mpx:KALTA4)gl28(Tg(mpx:KALTA4)로서 지칭됨)44,45, Tg(actc1b:EBFP2)pc5(Tg(actc1:BFP)로서 지칭됨)46, Tg(ubi:secAnnexinV-mVenus)mq8Tg(Tg(ubi:secAnnexinV-mVenus)로서 지칭됨)47, Tg(actc1b:GFP)zf10(Tg(actc1b:GFP)로서 지칭됨)48이었다. 모든 실험은 모나시 대학(Monash University)의 지침에 따라 수행되었으며, 지역 윤리위원회에 의해 승인되었다. 후브레흐트 연구소(Hubrecht Institute)의 동물과 관련된 모든 절차는 지역 동물 실험위원회에 의해 승인되었으며, 국가 및 유럽 법률에 따라 동물 복지법, 지침 및 정책에 따라 수행되었다. 준비와 축산은 이전에 기재된 바와 같이 수행되었다(참조: Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). (University of Oregon press, 2007))51. 모든 배아는 28.5℃의 링거 용액에서 유지되고, 8hpf로부터 0.003% 1-페닐-2-티오우레아(PTU)(Sigma-Aldrich)로 처리되었다.
제브라피시 돌연변이체 라인의 생성 및 유전형 분석
nampta 및 ccr5의 돌연변이는 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 생성되었다. 관심 유전자를 표적으로 하는 합성 가이드 RNA(gRNA)는 crRNA:tracrRNA 듀플렉스(Alt-R® CRISPR-Cas9 시스템, IDT)로 생성되었다. 유전자 특이적 crRNA 서열은 Alt-R® CRISPR-Cas9 사용자 지정 가이드 RNA 디자인 도구(IDT)를 사용하여 선택되었다(nampta crRNA: 5'-acgacaagacggtcttctatGGG-3', ccr5 crRNA_1: 5'-gtagcacccccatgcaacaaTGG-3', ccr5 crRNA_2: 5'-attttcctgataatacatccTGG-3'). 유전자 특이적 crRNA는 이분법 gRNA를 생성하기 위한 제조업체 권장 사항에 따라 범용 tracrRNA로 이종 이중화하였다. 돌연변이는 gRNA(단일 gRNA를 사용하여 생성된 nampta 돌연변이체, 이중 gRNA(ccr5 crRNA_1 + cr5 crRNA_2)를 사용하여 생성된 ccr5 돌연변이체) 및 재조합 Cas9 단백질(Alt-R® S.p Cas9 뉴클레아제, IDT)를 1-세포 단계 야생형 배아의 분열구에 주입함으로써 생성되었다. 주입된 배아는 성체가 될 때까지 성장하고, 야생형 제브라피시로 교배되고, 생식세포 돌연변이를 함유하는 창시자를 식별하기 위해 스크리닝되었다. 식별된 관심 돌연변이체; nampta c.180_182delinsTCCGTCTTGCTGACCTTTCCCCAGCAG (p.Try61Profs*4)(nampta pc41 로서 지칭됨) 및 ccr5 c.66_578delins ACCCCTATGCAACATCATTTTTACCAATGAGCAAATGGATTTAAACAAGAGAAAATCCTGCCAACTTGATTTTCCTGATAATACATAATA (p.Pro24Leufs*28)(ccr5 pc42 로서 지칭됨). nampta 돌연변이체의 유전형 분석을 위해, DNA를 잘린 지느러미(성체) 또는 전체 배아로부터 단리하고, 올리고뉴클레오티드 Nampta_F (5'-tgccgtgagaagaagacaga-3') 및 Nampta_R (5'-gcaatcaattgccttacctttt-3')(PCR 생성물 크기, nampta 117 bp 및 nampta pc41 141 bp)와의 PCR 반응에 사용하였다. ccr5 돌연변이체의 유전형 분석을 위해, 올리고뉴클레오티드 Ccr5_F (5'-aacgaaactgggcatgtagc-3') 및 Ccr5_R (5'-ccgggaataacaaaagctca-3')(PCR 생성물 크기, ccr5 618 bp 및 ccr5 pc42 173 bp)을 사용하여 PCR을 수행하였다.
유충 제브라피시 근육 손상
4dpf 유충은 링거 용액 중 0.01% 트리카인(MS-222)(Sigma-Aldrich)으로 마취시켰다. 기계적 손상은 유충이 왼쪽 앞쪽의 상부에 등쪽이 배향될 때 배설강 위의 등쪽 또는 복부 근절을 표적화했다. 바늘 찔림 손상은 이전에 기재된 바와 같이 수행되었다(참조: Gurevich, D. B. et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells co-ordinate muscle regeneration in vivo. Science 353 6295 aad9969 (2016)). 간단히 말해서, 근절은 많은 손상된 근섬유로 광범위한 손상을 생성하는 단일 30 게이지 바늘 천공을 받았다. 레이저 유도 손상의 경우, 마취된 유충을 링거 용액 중 1% 저융점 아가로스의 얇은 층에 장착하였다. 손상은 Zeiss Axioplan 현미경(MicroPoint Laser System, Andor Technology)에 결합된 쿠마린 440nm 염료 셀을 통해 펄싱된 UV-질소 레이저를 사용하여 수행되었다. 평균적으로, 레이저 손상은 40X 침수 대물렌즈를 통해 초점을 맞춘 레이저 빔에서 5 내지 10초 동안 펄스가 필요했다. 손상에 대한 즉각적인 반응의 시간 경과 분석을 위해, 25X/1.05 침수 대물렌즈가 장착된 올림푸스 FVMPE-RS 직립 다광자 현미경에서 790nm에서 SIM 스캐너(올림푸스)를 사용하고 100% 레이저 출력에서 200msec의 체류 시간을 사용하여 근육 섬유 절제를 달성했다. 손상 반응성 대식세포는 피지(Fiji)의 수동 추적 플러그인을 사용하여 추적되었다.
마우스 용적 근육 손실 손상 및 복구 평가
손상: 10-12주령의 수컷 C57BL/6J 마우스를 마취시키고, 왼쪽 뒷다리를 면도했다. 약 1cm의 일측 절개를 실시하여 기저 근막을 노출시켰다. 왼쪽 뒷다리를 확장시키고, 주변 조직을 수축시켜 절개 부위를 통해 외관화하였다. 대퇴직근의 3 x 4mm의 전체 두께 세그먼트가 제거되었다. 직후, 손상 부위는 결함에서 중합된 200ng 또는 500ng의 hrNAMPT(1)(하이드로겔 성분; 40μl, 8mg/ml 인간 피브리노겐(FIB3, Enzyme Research Laboratories), 4U/ml 소 트롬빈(T4648, Sigma), 5mM CaCl2, 17μg/ml의 아프로티닌(ab146286, Abcam))를 포함하거나 포함지 않는 피브린 하이드로겔로 충전되었다. 이어서, 연조직을 바늘로 봉합하였다.
조직학: 치료 10일 후, 동물을 희생시키고 조직학적 분석을 위해 상처를 수확하였다. 대퇴사두근(대퇴직근, 내측 광근 및 외측 광근 포함)의 결함 부위 및 관련 근위 및 원위 세그먼트를 절제하고 매립시켰다. 조직학적 분석은 일련의 파라핀 섹션(상처의 중앙 부분을 통해 수집된 4μm 섹션)에서 수행되었다. 복수의 절편을 마슨의 트리크롬으로 염색하고(콜라겐 침착을 검출하기 위해), 섬유증의 정도(청색 염색으로 표시됨)를 ImageJ 소프트웨어(버전 1.51h, 미국 국립위생연구소)를 사용하여 조직형태측정 분석으로 측정했다. 샘플 사이의 균일성을 유지하기 위해, 1.0mm 내지 3.0mm 범위의 다수의 깊이로 촬영된 내부 광근의 길이는 절편의 깊이를 결정하기 위한 조직 절편 사이의 기준 역할을 한다. 섬유증 정량화를 위해, 각 깊이에서 평균 근육 섬유증 면적을 채점하고 대퇴직근의 면적으로 정규화하였다. 근육의 총 면적은 각 깊이에서 대퇴직근의 평균 면적을 계산함으로써 결정된다.
유세포 계측에 의한 면역 세포 프로파일링 및 PAX7 + 세포 정량화: 피브린 하이드로겔에 의해 전달된 0.5μg의 hrNAMPT(1) 또는 대조군 피브린 하이드로겔만으로 치료 4일, 6일 또는 8일 후에, 마우스는 CO2 질식을 통해 안락사시켰다. 대퇴사두근의 결함 부위 및 관련 근위 및 원위 세그먼트를 단리시키고, 890μl의 완전한 RPMI(10% FBS 및 2mM 글루타멕스, Life Technologies)에 위치시켰다. 조직을 수술용 가위 및 100μl의 10mg/ml 콜라게나제 II(Sigma-Aldrich)와 10μl의 10mg/ml DNAse I(Biolabs)로 다졌고, 100μl의 디스파제 II(10mg/ml)를 PAX7 취득을 위해 소화에 첨가했다. 혼합물을 와동시키고, 37℃에서 45분 동안 배양하였다. 그런 다음, 콜라게나아제를 500μl의 빙냉 PBS, 5% FBS, 5mM EDTA로 불활성화시켰다. 그 후, 혼합물을 70㎛ 및 40㎛ 필터를 통해 변형시켰다. 세포 현탁액을 1ml의 완전 RPMI로 추가 희석하고, 300×g에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 펠렛을 250μL의 완전한 RPMI에 재현탁시키고 항체 염색을 위해 96-웰 U 바닥 플레이트의 웰에 분액화하였다. 세포 용액을 원심분리하고, 상청액을 버리고 PBS로 세척하였다. 사용된 세포 생존력 염색은 PBS(1:400 희석)로 희석된 100μl의 Zombie Aqua(Biolegend) 생-사 염료였고, 4℃에서 30분 동안 배양했다. 이어서, 세포를 FcX(항-CD16/32 항체, Biolegend, 1㎍/ml) 유세포 계측 완충액(PBS, 5% FBS)으로 차단하였다. 세포를 4℃에서 20분 동안 유지하고, 유세포 계측 완충액으로 세척하고, 원심분리하였다. 1차 표면 항체 염색은 유세포 계측 완충액으로 희석된 100μl의 항-마우스 항체 칵테일(Biolegend)을 사용하여 2개의 별도 염색으로 수행하였다: 2μg/ml의 항-CD4(클론 RM4.5, #100516), 항-CD8(클론 53-6.7, #100738), 및 항-CD3(클론 17A2, #100220)에 의한 T 세포 염색. 2μg/ml의 항-CD11b(클론 M1/70, #101208), 1μg/ml 항-Ly6G(클론 1A8, #127628), 4μg/ml 항-F4/80(클론 BM8, #123147), 10μg/ml 항-CD80(클론 16-10A1, #104714), 및 2.6μg/ml 항-CD206(클론 C068C2, #141720)에 의한 호중구 및 대식세포 염색. 세포를 30분 동안 얼음 위에서 염색하고, 상기 기재된 바와 같이 세척하였다. T 세포 패널에서 내부 Foxp3 염색을 위해, 세포를 100 μl 고정/투과 용액(42080, Biolegend)으로 35분 동안 고정시켰다. 이어서, 세포를 세척하고 0.5% 사포닌 및 5μg/ml 항-Foxp3(클론 3G3, #35-5773-U100)를 갖는 100μl의 유세포 계측 완충액에서 45분 동안 재현탁시켰다. 이어서, 세포를 유세포 계측 완충액(100μl)에 재현탁시키고, Fortessa x20(Becman Coulter) 상에서 획득하였다. 위성 세포 유세포 계측 염색은 유세포 계측 완충액: 5μg/ml의 항-VCAM/CD106 비오틴(클론 429(MVCAM.A), #105703), 2.5μg/ml의 항-스트렙타비딘(#405250), 2μg/ml의 CD45(클론 30-F11, #103114), 항-CD11b(클론 M1/70, #101208), 항-Ly6G(클론 1A8, #127607), 1μg/ml 항-CD31(클론 MEC1 3, #102507)에서 희석된 200μl의 항체 칵테일(Biolegend)로 수행하였다. 세포를 얼음 위에서 45분 동안 염색하고, 상기 기재된 바와 같이 세척하였다. 세포를 또한 얼음 위에서 1시간 동안 세포내 항체 칵테일: Biolegend 1μg/ml 항-Ki67 (클론 16A8, #652411), NovusBiologics 10μg/ml 항-Pax7 (클론 Pax7/497, #NBP2-34706AF488)과 함께 0.5% 사포닌을 갖는 200μl 유세포 계측 완충액으로 염색하였다. 그런 다음, 세포를 25μl의 Invitrogen Count Bright Absolute Counting Beads(25,000 비드, #C36950)와 함께 유세포 계측 완충액(275μl)에 재현탁시키고, Fortessa x20(Beckman Coulter)에서 획득했다. 모든 이벤트를 획득하고, 10,000개의 상처 세포당 PAX7+ 세포의 수를 다음 공식을 사용하여 계산하였다: 상처 중 PAX7+ 수 = 10,000 x PAX7+ 세포 계수/[(1/25,000) x 비드 계수 x (살아있는 세포 백분율/100) x 소화 후 총 세포 수 계수]. PAX7 및 Ki67에 대한 이중 양성의 세포 계수를 활용하여 증식성 PAX7+ 세포의 수를 정량화하기 위해 동일한 계산이 수행되었다.
동결 절편에 대한 면역형광: 면역염색은 항원 검색과 함께 표준 프로토콜(10mM 나트륨 시트레이트, 0.05% Tween 20, pH 6.0)을 사용하여 10μm 동결 절편에서 수행되었다. 절편은 마우스 조직에 마우스 항체의 비특이적 결합을 최소화하기 위해, 0.3% 트리톤-X 및 AffiniPure Fab 단편 염소 항-마우스 IgG(H + L)(Jackson Immuno Research Laboratories)를 갖는 PBS의 2% BSA, 5% 정상 염소 혈청으로 차단되었다. 항체:마우스 항-마우스 Pax7(2μg/ml, Developmental Studies Hybridoma Bank) 및 2차 Alexa Fluor 결합 항체(Thermo Fisher). 근육 근섬유초는 로다민 표지된 밀 배아 응집소(WGA)(Vector Laboratories)에 의해 시각화되었고, 핵은 DAPI(Sigma-Aldrich)로 염색함으로써 시각화되었다.
중앙 유핵화 근육 섬유의 정량화: 헤마톡실린 및 에오신(H & E) 염색은 4μm 파라핀 매립 절편에서 수행되었다. 근육 섬유 내의 핵 집중화의 수는 ImageJ 소프트웨어(버전 1.51h, National Institutes of Health, USA)를 사용한 조직형태측정 분석에 의해 샘플당 5개의 연속 절편으로부터 계수하였다. 샘플 사이의 균일성을 유지하기 위해, 1 내지 3mm 범위의 다수의 깊이에서 촬영된 내부 광근의 길이는 절편의 깊이를 결정하기 위한 조직 절편 사이의 기준으로서 기능한다. 중심 유핵화 세포 정량화의 평균 수의 경우, 각 깊이에서의 총 핵 수를 대퇴직근의 면적으로 정규화하였다.
현미경 및 이미지 분석
손상 반응성 대식세포를 추적하기 위한 전체 유충 저속도 이미징은 5X/0.16 공기 대물렌즈 및 환경 제어(28.5℃)가 장착된 Zeiss Lightsheet Z.1 현미경을 사용하여 수행되었다. XY 해상도는 1.14μm였고, Z 해상도는 5.5μm였고, 라이트 시트 두께는 11.68μm였다. 유충당 총 이미징 시간은 25시간이었고(1.5분 간격으로 획득된 1000개의 3D 스택)이며, 심박수를 평가하여 이미징 세션의 끝에서 유충 생존율을 확인했다. 추적을 위해, 대식세포 이미지는 먼저 3D 중간 필터로 필터링한 다음 3D ImageJ Suite53의 알고리즘을 사용하여 히스테리시스 임계값으로 분할되었다. 히스테리시스의 낮은 및 높은 임계값은 시각적으로 선택되었다. 이어서, 데이터세트는 손상 부위를 떠나는 세포를 추적하기 위해 시간 역전시켰다. 상처의 가장자리는 ImageJ 내에서 수동으로 표지되었다. 추적 절차는 연속 프레임 사이의 셀의 중복 세그먼트화에 기초했다. 두 셀이 너무 가깝고 하나의 개체를 형성하는 경우는 세그먼트화 알고리즘이 그들을 분리할 수 없기 때문에 "병합"으로 지정되었다. 추적된 대식세포 이미지는 결과의 시각화를 위해 반전되었다.
20X/1.0 침수 대물렌즈가 장착된 Zeiss LSM 710 직립 공초점을 사용하여 장기간 저속도 이미징 및 단일 Z-스택 획득을 위한 라인 스캐닝 공초점 현미경 검서를 수행하였다. 광 변환은 405nm 다이오드 레이저와 함께 표백 도구를 사용하여 수행되었다.
높은 시간적 및 공간적 해상도로 저속도 이미징은 40X/1.3 오일 침지 대물렌즈와 피에조 Z-스테이지가 장착된 역전된 LSM 880 고속 AiryScan 공초점에서 수행되었다. 복셀 크기는 0.2 x 0.2 x 1μm에서 일정하게 유지되었으며 시야에 따라 초당 3 내지 18 프레임의 프레임 속도가 달성되었다. 광퇴색은 이미징 후 검정되었고, 최대 1시간의 이미징 지속 기간 동안 최소인 것으로 결정되었다.
고정된 및 면역염색된 세포 배양 샘플은 10X 대물렌즈가 장착된 Leica DMi8 도립 광시야 현미경으로 이미징되었다. 복굴절 이미징은 5X 대물렌즈를 사용하여 Abrio 소프트웨어(CRI Hinds Instruments)와 통합된 라이카 DM IRB 직립 현미경을 사용하여 이전에 기재된 바와 같이 수행되었다(참조: Berger, J., Sztal, T. & Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochemical and biophysical research communications 423, 785-788 (2012)). 이미지는 소프트웨어 Fiji52를 사용하여 분석되었고, 이에 따라 손상 부위 복굴절의 평균 회색 값을 상처 분위의 상대적 복굴절을 계산하기 전후 영역으로 정규화된다.
현미경 이미지는 Adobe Creative Cloud 2018, Fiji52 및 Imaris 9.2(Bitplane)에서 처리되었다. 대식세포 수의 계수 및 추가 3D 분석은 Imaris를 사용하여 용적을 표면 렌더링하여 수행되었다. 구형도 분석은 임의의 값 1이 할당된 완전한 구체로부터 세포 형상 편차를 평가하였다. 구형도 값은 표면 렌더링의 요약 통계로 생성되었다. 증식성 줄기 세포 계수는 Fiji에서 수행되었다. PAX7 및 EdU 획득 채널은 임계값 명령을 사용하여 분할되었다. 이미지 계산기 기능을 사용하여 EDU 양성 PAX7 세포만의 마스킹된 채널을 생성했다. 세포 수는 분석 입자 명령을 사용하여 계수하였다.
화학적 처리
세포 절제는 약간 변형시켜 이전에 기재된 바와 같이 수행되었다(참조: Pisharath, H. & Parsons, M. J. in Zebrafish 133-143 (Springer, 2009)). 적절한 단계의 유충을 링거 용액 중 5-10mM 메트로니다졸(Mtz)(Sigma-Aldrich)에서 배양하고, 실험 종점까지 매일 신선하게 했다. 약물 처리는 손상 직후 링거 용액 중 5 및 10μM 세니크리비록(CVC)(Med Chem Express) 및 5 및 10μM 마라비록(MVC)(Med Chem Express)에서 4dpf 바늘 찔림 손상된 유충을 배양하여 수행하고, 매일 신선하게 하였다.
레이저 절제 근육 손상에 대한 약물 처리의 효과는 손상 2시간 전에 5μM CVC로 유충을 처리하여 검정되었고, 유충은 실험 종점까지 약물에 유지되었다. NAMPT 효소 억제 실험을 위해, 5dpf/1.75dpi에서 바늘 찔림 손상된 유충을 10μM GMX1778(Sigma-Aldrich)을 함유하는 링거 용액으로 옮기고, 그 자체로 실험 종점까지 그대로 유지하였다. 케모카인 보충 실험은 단백질 흡착을 최소화하기 위해 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)으로 코팅된 플라스틱 제품에서 밤새(사용 전에 링거 용액으로 세정됨) 수행되었다. 유충은 57nM 재조합 인간 비스파틴(hrNAMPT(1))(PeproTech), 57nM 재조합 뮤린 CCL8/MCP-2(mrCCL8)(PeproTech) 및 Mtz와 CVC의 조합으로 처리되었다.
세포 배양 약물 보충은 6시간 동안 C2C12 세포의 성장 배지에 다음을 첨가함으로써 수행하였다: 1.9, 9.5 및 19nM hrNAMPT(1)(PeproTech), 1.9 및 9.5nM 재조합 인간 비스파틴(hrNAMPT(2))(Enzo Life Sciences), 100nM CVC(Med Chem Express), 100nM MVC(Med Chem Express), 100nM PF-4136309(PF4)(Med Chem Express), 9.5nM mrCCL8, 9.5nM 재조합 마우스 CCL4/MIP-1β(mrCCL4)(PeproTech), 9.5nM 재조합 마우스 CCL2/MCP-1((PeproTech), 500nM GMX1778(Sigma-Aldrich) 및 hrNAMPT(1)와의 조합. 다음을 24시간 동안 1차 마우스 근아세포 공동배양의 증식 배지에 첨가하였다: 9.5nM hrNAMPT(2) (Enzo Life Sciences), 100nM CVC (Med Chem Express), 100nM MVC (Med Chem Express), 100nM PF4 (Med Chem Express) 및 9.5nM mrCCL4 (PeproTech).
LysoTracker 검정: 유충을 어둠 속에서 1시간 동안 링거 용액 중 10μM LysoTracker™ Deep Red(Thermo Fisher)에서 배양하고, 이미징 전에 신선한 링거 용액으로 5회 세정하였다.
5'- 에티닐 -2'- 데옥시우리딘 ( EdU ) 표지화
유충: 표지화 및 검출은 약간 변경하여 이전에 기재된 바와 같이 수행되었다(참조: Nguyen, P. D. et al. Muscle stem cells undergo extensive clonal drift during tissue growth via Meox1-mediated induction of G2 cell-cycle arrest. Cell Stem Cell 21, 107-119. e106 (2017))55. 6dpf/2dpi 유충을 2.5nM EdU(Thermo Fisher)로 1시간 동안 펄싱하고, 고정 전에 추가 1.5시간 동안 추적하였다. 세포 배양: 세포를 10μM EdU가 보충된 배지에서 1시간 동안 배양하였다. Edu 펄스 후, C2C12 세포를 즉시 고정하고, 1차 마우스 근아세포 공동배양물을 PBS로 세정하고, 배지로 교체하고 추가 2시간 동안 배양한 후 세포를 고정시켰다. 세포를 제조업체의 프로토콜에 따라 Click-iTTM EdU Alexa Fluro™ 647 이미징 키트(Thermo Fisher)를 사용하여 처리했다.
면역조직화학 및 원위치 하이브리드화
전체 마운트 유충에 대한 항체 염색은 이전에 기재된 바와 같이 수행되었고(참조: Inoue, D. & Wittbrodt, J. One for all―a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos. PloS one 6, e19713 (2011)), 배양된 근아세포에 대해 이전에 기재된 바와 같이 수행되었다(참조: Figeac, N., Serralbo, O., Marcelle, C. & Zammit, P. S. ErbB3 binding protein-1 (Ebp1) controls proliferation and myogenic differentiation of muscle stem cells. Developmental biology 386, 135-151 (2014)). 원위치 하이브리드화 후, 항체 염색은 표준 절차를 사용하여 수행하였다. 항체: 마우스 항-Pax7(1:10, DSHB), 닭 항-GFP 항체(1:500, Thermo Fisher), 마우스 항-mCherry 항체(1:500, Abcam), 래트 항-mCherry 항체(1:500), Kerafast)(면역조직화학), 토끼 항-PBEF1(항-NAMPT) 항체(1:50, Sigma-Aldrich) 및 2차 Alexa Fluro 결합 항체(Thermo Fisher). 핵은 DAPI(Sigma-Aldrich)로 염색함으로써 시각화되었다. 원위치 하이브리드화 및 프로브 생성은 이전에 기술된 바와 같이 수행되었다(참조: Thisse, C. & Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature protocols 3, 59 (2008)). 사용된 안티센스 프로브: mmp9(참조: de Vrieze, E., Sharif, F., Metz, J. R., Flik, G. & Richardson, M. K. Matrix metalloproteinases in osteoclasts of ontogenetic and regenerating zebrafish scales. Bone 48, 704-712 (2011). 안티센스 프로브의 경우 3'에 T7 RNA 중합효소 프로모터를, 센스 프로브의 경우 5'에 SP6 RNA 중합효소 프로모터를 함유하는 nampt(ENSDARG000000030598) PCR 프로브는 프라이머 5'-GAGtatttaggtgacactatagGGTTTCATCGCAAGAGACGG-3' 및 5'-GAGtaatacgactcactatagggGCGGAAGCACCTTATAGCCT-3'를 사용하여 생성되었다. 헤마톡실린 및 에오신 염색은 표준 방법에 따라 5 및 7dpf 유충의 10μm 저온 유지 단면에 대해 수행하였다.
CCR5에 대한 NAMPT 결합(ELISA)
hrCCR5에 대한 hrNAMPT 결합: ELISA 플레이트(중간 결합, Greiner Bio-One)를 PBS 중 1% BSA 또는 20nM의 GST 융합 재조합 인간 CCR5(hrCCR5, Abcam)로 4℃에서 밤새 코팅시켰다. 0.05% Tween-20(PBS-T)을 함유하는 PBS 중의 1% BSA로 웰을 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 웰을 PBS-T로 3회 세척하고, 0.1% BSA를 포함하는 PBS-T에서 증가하는 농도(0nM 내지 800nM)로 1시간 동안 hrNAMPT(1)(Peprotech)와 추가로 배양하였다. 결합된 NAMPT 분자는 NAMPT 및 HRP-스트렙타비딘(인간 PBEF/비스파틴 DuoSet ELISA, R&D Systems)에 대한 비오티닐화 항체를 사용하여 검출하였다. BSA-코팅 웰에서 수득된 신호를 사용하여 각 NAMPT 농도의 비특이적 결합을 제거하여 특이적 결합 값을 수득하였다. 특이적 결합 데이터는 A450nm = Bmax*[NAMPT]/(KD + [NAMPT])를 사용하여 해리 상수(KD)를 수득하기 위해 Prism 7을 사용한 비선형 회귀에 의해 적합화되었다.
mrCCR5에 대한 hrNAMPT 경쟁 결합: ELISA 플레이트(중간 결합, Greiner Bio-One)를 4℃에서 밤새 PBS 중의 1% BSA 또는 20nM 재조합 마우스 CCR5(MyBioSource)로 코팅하였다. 그런 다음, 웰을 0.05% Tween-20(PBS-T)을 함유하는 PBS 중 1% BSA로 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 웰을 PBS-T로 3회 세척하고, 100nM hrNAMPT(1)(Peprotech)를 함유하는 0.1% BSA로 PBS-T에서 증가하는 농도(0nM 내지 400nM)로 뮤린 CCL4(Peprotech)와 함께 1시간 동안 추가로 배양하였다. 결합된 hrNAMPT(1) 분자는 NAMPT 및 HRP-스트렙타비딘(인간 PBEF/비스파틴 DuoSet ELISA, R&D Systems)에 대한 비오티닐화 항체를 사용하여 검출되었다. BSA-코팅 웰에서 수득된 신호를 사용하여 각 hrNAMPT 농도에 대한 비특이적 결합을 제거하여 특이적인 결합 값을 수득하였다. 특이적 결합 데이터는 A450nm = A450nmMin +(A450nmMax - A450nmMin)/(1 + 10^(X-LogIC50))을 사용하여 CCL4의 최대 억제 농도의 절반(IC50)을 수득하기 위해 Prism 7을 사용하여 비선형 회귀에 의해 적합화되었다.
대식세포 상청액 중 NAMPT: Maf/DKO 세포 및 마우스 대식세포 세포주 Raw 264.7(ATCC)를 성장 배지(DMEM + 10% FBS + 10ng/ml M-CSF)에서 16시간 동안 배양했다. 수집된 상청액 중 단백질을 10kDa의 공칭 분자량 한계(Merck)를 갖는 Amicon® Ultra-15 원심 필터를 사용하여 농축시켰다. 제조업체의 지침에 따라 인간 PBEF/비스파틴 DuoSet ELISA(R & D Systems)를 사용하여 상청액 중 NAMPT를 정량화했다. 세포 표면 CCR5 수용체 농도: 마우스 근육 세포주 C2C12를 상기 기재된 바와 같이 배양하였다. 세포는 세포 스크레이퍼를 사용하여 70-80% 합류에서 제거되었고, 막 단백질은 추출 키트(원형질막 단백질 추출 키트, Abcam)를 사용하여 단리시켰다. 이어서, 막 추출물 중의 CCR5 농도를 ELISA(마우스 Ccr5 ELISA 키트, Biorbyt)로 측정하였고, 세포당 CCR5의 양을 [CCR5](분자/세포)=[CCR5](ng/세포)/CCR5mw * 10^-9 * N0를 사용하여 계산하였고, 여기서 N0 = 아보가드로 상수이다.
마우스 사이토카인 검정
상청액을 성장 배지(DMEM + 10% FBS + 10ng/ml M-CSF)에서 16시간 배양된 Maf/DKO 세포로부터 수집하였다. 사이토카인 검정(프로테옴 프로파일러 어레이, R & D systems, ARY006)은 제조업체의 지침에 따라 수행되었다. 간단히 말해서, 니트로셀룰로스 막을 로킹 플랫폼 셰이커에서 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 차단 단계 동안, 0.7ml의 샘플을 검정 완충액으로 1.5ml까지 토핑하고, 실온에서 1시간 동안 마우스 사이토카인 검정 패널 A 항체 칵테일과 함께 배양하였다. 이어서, 샘플을 락킹 플랫폼 쉐이커 상에서 4℃에서 밤새 멤브레인 상에서 배양하였다. 막을 실온에서 30분 동안 스트렙타비딘-HRP와 함께 배양 전에 세척하였다. 최종적으로, Chemi Reagent Mix을 첨가하여 막을 개발한 다음, Biorad Chemidoc MP 시스템에서 이미지화하고, (Image Lab 소프트웨어, Bio Rad)을 사용하여 분석하였다.
세포 배양
마우스 근육 세포주 C2C12(Yaffe, D. & Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature 270, 725 (1977))를 성장 배지(둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(4.5g/l D-글루코스, L 글루타민 없음, 나트륨 피루베이트(Gibco) 없음) + 20% 태아 소 용액-원 샷(Gibco)+1% Glut Max 100x (Gibco))에서 배양하였다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 유지했다. 70% 컨플루언스, 계대 8에서 세포를 0.025% 트립신 EDTA(Gibco)를 포함하는 T75 플라스크로부터 추출하고, 성장 배지에서 중화시키고, 180 X g에서 5분 동안 회전시켜 세포를 펠렛화하였다. 이어서, 세포를 10ml의 신선한 성장 배지에 재현탁시켰다. 500μL의 세포를 커버 유리 II(Sarstedt) 챔버 슬라이드 상의 8-웰에 1x103 세포/ml의 밀도로 플레이팅하였다. 세포를 37℃에서 4시간 방치하여 재부착시켰다. 약물 처리를 위해, 배지를 적절한 투여량으로 보충하고, 6시간 동안 배양하였다.
1차 마우스 근아세포의 단리를 위해, E17.5 C57/BL6J 마우스로부터 사지 골격근을 다지고, 0.125% 트립신에서 37℃에서 20분 동안 소화시켰다. 섬유아세포는 증식 배지(DMEM + 20% FBS)에서 10cm2 조직 배양 접시(접시당 2개의 배아)에 세포를 1시간 동안 플레이팅함으로써 고갈시켰다. 비부착 세포를 포함하는 배지를 증식 배지 중 젤라틴 코팅된 10cm2 조직 배양 접시에 24시간 동안 재플레이팅하였다. 근아세포는 DMEM + 20% FBS + 10% L929 조건화 배지에서 젤라틴 코팅된 48 웰 플레이트에서 공동 배양하기 전에 섬유아세포에 대해 다시 고갈시켰다. 100,000개의 근아세포를 7,500개의 MafB/c-Maf 결핍(Maf-DKO) 대식세포(Aziz, A., Soucie, E., Sarrazin, S. & Sieweke, M. H. MafB/c-Maf deficiency enables self-renewal of differentiated functional macrophages. Science 326, 867-871 (2009)) 또는 1,000 3T3 세포/웰로 플레이팅하였다. 약물 처리를 위해, 배지는 적절한 투여량으로 보충하고, 24시간 동안 배양하였다.
세포 표면 CCR5 수용체 농도
마우스 근육 세포주 C2C12를 앞서 기재된 바와 같이 배양하였다(상기 참조). 마우스 대식세포 세포주 Raw 264.7(ATCC)을 성장 배지(둘베코 변형 이글 배지 + 10% FBS)에서 배양하였다. 세포는 세포 스크레이퍼를 사용하여 70-80% 합류에서 제거되었고, 막 단백질은 추출 키트(원형질막 단백질 추출 키트, Abcam)를 사용하여 단리시켰다. 이어서, 막 추출물 중의 CCR5 농도를 ELISA(마우스 Ccr5 ELISA 키트, Biorbyt)로 측정한 다음, 세포당 CCR5의 양을 [CCR5](분자/세포)=[CCR5](ng/세포)/CCR5mw * 10^-9 * N0를 사용하여 계산하였고, 여기서 N0 = 아보가드로 상수이다.
형광 활성화 세포 분류( FACS ), 단일 세포 RNA 서열분석 및 분석
손상 반응성 대식세포는 다음과 같은 변형과 함께 이전에 기재된 바와 같이 FACS에 의해 단리시켰다(참조: Ratnayake, D. & Currie, P. D. in Myogenesis 245-254 (Springer, 2019)). 4dpf Tg(mpeg1:mCherry) 유충은 바늘 찔림 손상을 겪었고, 손상된 영역은 1, 2 및 3dpi에서 해부되었고, 조직은 단일 세포 현탁액으로 해리되었다. 무손상 유충 트렁크 조직도 또한 분석에 포함되었다. 세포는 FACS Aria II(BD biosciences)를 사용하여 분류하였다. 살아있는 개별 대식세포(mCherry 형광, DAPI 배제, 전방 및 측방 산란 특성에 기초함)를 100-200nl의 CEL-seq 프라이머, dNTP 및 5μL의 Vapor-Lock (Qiagen)에 함유된 합성 mRNA Spike-In을 함유하는 사전 제조된 384 웰 플레이트로 분류되었다. 분류 직후, 플레이트를 스핀다운하고 서열분석까지 -80℃에서 동결시켰다.
단일 세포 RNA 서열분석 라이브러리는 이전에 기재된 바와 같이(참조: Muraro, M. J. et al. A single-celltranscriptome atlas of the human pancreas. Cell systems 3, 385-394. e383(2016)) SORT-seq 플랫폼을 사용하여 제조하였다. 이 플랫폼에서, Cel-Seq2 프로토콜(Hashimshony, T. et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome biology 17, 77 (2016))은 로봇 액체 처리기의 도움으로 이어진다. 이 프로토콜은 각 세포가 바코딩화되고, 모든 단리된 대식세포의 단일 세포 전사체를 생성하도록 한다. 각 시점은 독립적으로 복제되고, 시점 약 768개의 대식세포(총 3072 대식세포)가 개별적으로 서열이도록 한다. 차세대 서열분석은 Illumina NextSeq 플랫폼을 사용하여 수행되었다. 쌍을 이룬 판독치는 제브라피시 참조 어셈블리 버전 10(GRC10)에 대해 매핑되었다. FASTQ 파일은 이전에 기재된 바와 같이 처리하였다(참조: Muraro, M. J. et al. (2016); Grun, D. et al. De novo prediction of stem cell identity using single-cell transcriptome data. Cell Stem Cell 19, 266-277 (2016).). 쌍을 이룬 말단 판독치는 전사체(Junker, J. P. et al. Genome-wide RNA tomography in the zebrafish embryo. Cell 159, 662-675 (2014))의 매핑 가능성을 증가시키기 위해 향상된 3' UTR 주석을 갖는 전사체 데이터세트와 함께 bwa(Li, H. & Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics 26, 589-595 (2010))를 사용하여 제브라피시 전사체에 정렬시켰다. 판독치 1은 올바른 세포 및 라이브러리에 판독치를 할당하는데 사용된 반면, 판독치 2는 유전자 모델에 매핑되었다. 판독 계수는 먼저 동일한 유전자에 매핑된 라이브러리, 세포 및 분자 바코드의 동일한 조합을 가진 중복 판독치를 제거하여 UMI 바코드에 대해 수정했다. 이어서, 전사체 계수를 계수, 256개의 가능한 UMI 및 포와송(poissonian) 계수 통계를 기반으로 하는 예상되는 분자 수로 조정되었다. 계수 파일을 생성하는 스크립트는 여기 https://github.com/vertesy/TheCorvinas/tree/master/Python/MapAndGo2 :https://github.com/vertesy/TheCorvinas/blob/master/Python/MapAndGo/Readme_MapAndGo.md에서 발견될 수 있다. 스파이크-인 RNA는 폐기되었으며, 추가 분석에는 포함되지 않았다. 검정된 모든 플레이트(손상 유형의 기술적 복제물)의 전사체 계수는 다운스트림 분석을 위한 하나의 매트릭스에 결합하였다. Seurat(v2.3.4)을 사용하여 조합된 샘플 전사체 판독 계수의 다운스트림 분석을 수행했다. 전사체 계수 매트릭스는 CreateSeuratObject 함수(min.cells = 25, min.genes = 250)를 사용하여 가져왔고, 저품질 세포는 다음 임계값을 갖는 FilterCells로 폐기하였다: 최소 500개 및 최대 3500개 유전자, 최대 10%의 미토콘드리아 유전자 및 최소 1000개 및 최대 15000개의 UMI). 필터링된 데이터세트는 스케일 팩터 10000을 사용하여 로그 정규화하였으며, 약 2800개의 유전자 세트를 선형 치수 감소((FindVariableGenes, x.low.cutoff = 0.05, x.high.cutoff = 3, y.cutoff = 0.5))에 사용하였다. 원치 않는 변이의 공급원은 세포당 UMI 수, 세포당 미토콘드리아 판독치의 백분율을 회귀함으로써 제거되었다. 클러스터링 분석은 Seurat의 FindClusters 함수(reduction.type = "pca", dims. Use = 1:50, resolution = 0.5, save.SNN = TRUE) 및 RunTSNE를 사용하는 비선형 치수 감소(reduction.use = "pca", dims.use = 1:50, perplexity = 30, tsne.method = "Rtsne")를 사용하여 수행되었다. 7개의 세포 클러스터가 식별되었다. 클러스터 바이오 마커를 식별하기 위해, FindAllMarkers(logfc.threshold = 0.25, test.use = "wilcox") 또는 FindMarkers(min.pct = 0.20) 함수를 사용하여 모든 클러스터를 서로 비교하거나 클러스터 특이적 비교를 수행하였다. tSNE, 특성 플롯 및 히트맵은 Seurat의 TSNEPlot, FeaturePlot 및 DoHeatmap 함수를 사용하여 생성되었다. 궤적 분석은 scanpy 패키지(v 1.4.5.2.dev6 + gfa408dc)87의 일부인 파티션 기반 그래프 추상화(PAGA)86를 사용하여 수행되었다. 요약하면, 데이터 포인트(세포)의 이웃 그래프는 scanpy.pp.neighbors 함수88(PCA 및 UMAP 및 35의 이웃 수와 같이 상위 50개 주요 구성 요소에서 시작)를 사용하여 이전에 식별된 클러스터를 그룹으로 사용하는 scanpy의 scanpy.tl.paga 함수를 사용하여 PAGA를 실행한다. 마지막으로, PAGA 세포 매립은 scanpy의 scanpy.tl.draw_graph 함수(Force Atlas 2 레이아웃)를 사용하여 PAGA 좌표로 초기화된 강제 지시된 레이아웃(FDL)을 사용하여 표현하였다.
의사 시간 분석은 확산 의사 시간(DPT)89을 사용하여 수행되었다. Scanpy의 scanpy.tl.dpt 함수는 이전에 정의된 클러스터 3(무손상 시점의 세포로 구성됨)을 루트로서 사용하여 실행되었다. PAGA 및 FDL 플롯은 scanpy의 sc.pl.paga sc.pl.paga_path(n_avg=25) 및 scanpy.pl.draw_graph 함수를 사용하여 생성되었다. Metascape(http://metascape.org)를 사용하여 각 클러스터의 차별적으로 발현되는 유전자를 사용하여 생물학적 과정 농축 분석을 수행했다.
조직 특이적 기능 상실 제브라피시 돌연변이
Tol2 인접 도입 유전자 Tg(4xUAS:NLS-Cas9, cryaa:EGFP)gl36Tg(Tg(4XUAS:NLS-Cas9, cryaa:EGFP)로서 지칭됨) 및 Tg(4xUAS:NLS-Cas9, cmlc2:RFP)gl37Tg(Tg(4XUAS:NLS-Cas9, cmlc2:RFP)로서 지칭됨)는 게이트웨이 클로닝에 의해 조립되었다. 이러한 작제물은 필요한 배경에 Tol2 mRNA로 미세주입되었다. Tg(4XUAS:NLS-Cas9, cryaa:EGFP)는 Tg(mpeg1:GAL4FF/UAS:NfsB-mCherry) 배경에 도입된 반면, Tg(4XUAS:NLS-Cas9, cmlc2:RFP)는 두 Tg(mpx:KALTA4/UAS:NfsB-mCherry)와 Tg(pax7b:Gal4;UAS:GFP) 배경에 도입되었다. 이 배경에 F0 및 F1 역교배를 통한 3개의 도입유전자의 공동 분리는 적절한 형광을 갖는 배아를 선택함으로써 달성되었다(Tg(mpeg1:GAL4FF/UAS:NfsB-mCherry/4XUAS:NLS-Cas9,cryaa:EGFP): mpeg1:GAL4FF 도입유전자의 존재를 확인하는 적색 대식세포 및 4xUAS:NLS-Cas9에 연결된 cryaa:EGFP 마커 유전자의 존재를 확인하는 녹색 눈에 대해 분류됨(이 라인은 mpeg1-Cas9로서 지칭된다). Tg(mpx:KALTA4/UAS:NfsB-mCherry/4XUAS:NLS-Cas9,cmlc2:RFP): 적색 호중구 및 적색 심장에 대해 분류됨(이 라인은 mpx-Cas9로서 지칭된다). Tg(pax7b:Gal4;UAS:GFP/4XUAS:NLS-Cas9,cmlc2:RFP): 녹색 근육 줄기/전구 세포 및 적색 심장에 대해 분류됨(이 라인은 pax7b-Cas9로서 지칭된다)). 유전자 편집 실험을 위해, F2 또는 F3 세대 성인으로부터 동종 교배된 배아를 사용했다. nampta 및 ccr5 표적화를 위해, 돌연변이체를 생성하는데 사용된 gRNA 또는 이중 gRNA 조합(상기 참조)이 사용되었다. namptb 표적화를 위해, 이중 gRNA 조합을 사용하였다. 이러한 gRNA는 namtb crRNA_1, 5'-tttctctgaccaaacacgcaAGG-3' 및 namptb crRNA_2, 5'-gttgacctgtgaacgtgataGGG-3'를 사용하여 생성되었다. nampta 개별 gRNA 및 ccr5 및 namptb 이중 gRNA 효율은 전체 배아 유전자 편집에서 테스트되었으며, 89-100%의 돌연변이 효율을 갖는 것으로 나타났다. 조직 특이적 유전자 편집을 유도하기 위해, 3nL의 gRNA 혼합물(3μL의 3μM gRNA(이중 gRNA가 사용된 경우, 1.5μL의 각 gRNA) + 0.5μL의 2% 페놀 레드 + 1.5μL 0.1M KCl 혼합물)을 1-세포 스테이지 배아의 세포에 주입하였다.
NAD / NADH의 시각화 및 정량화
유충 제브라피시 NADH의 생체내 이광자 여기 형광은 25X/1.05 침수 대물렌즈를 사용하여 올림푸스 FVMPE-RS 직립 다광자 현미경으로 측정되었다. 810nM 파장과 450/70 대역통과 필터가 사용되었다. 동일한 파장과 610/70 대역통과 필터를 사용하여 mCherry 형광을 검출했다. 갈보 스캐너를 사용하여 고해상도 데이터 세트를 생성하는 반면, 8kHz 공진 스캐너를 저속도 이미징에 사용하여 광독성 효과를 최소화했다.
시험관내 총 NAD+ 및 NADH 수준 및 그들의 개별 수준(그들의 비율을 결정하기 위해)은 공급자의 지시에 따라 NAD/NADH-GloTM 검정(Promega)을 사용하여 측정하였다. 총 NAD/NADH 측정: 검정은 대식세포 특이적 nampt 녹아웃 유충(mpeg1-Cas9 + nampt gRNA 주사됨) 및 대조군(mpeg1-Cas9) 유충으로부터 분류된 대식세포에 대해 수행하였다. 2dpf에서, 대조군 유충을 NAMPT 효소 억제제 GMX1778(10μM)(Sigma-Aldrich) 또는 NAMPT의 효소 제한 효소 촉매 생성물인 니코틴아미드 모노뉴클레오티드(NMN)(100μM)(Sigma-Aldrich)에 침지시켰다. 이들은 검정의 검출 범위를 식별하는 추가 대조군으로 사용되었다. 3dpf에서, 각 그룹으로부터의 mpeg1+ 대식세포를 2000 세포/웰 밀도에서 50μL의 PBS를 함유하는 백색의 평저 96 웰 플레이트(Costar)로 분류하였다. 세포를 50μL의 NAD/NADH Glo™ 검출 시약에서 배양하였다. 1시간 배양 후, 발광은 마이크로플레이트 판독기(BMG PHERAstar; 게인 3600, 1초 통합 시간)에서 결정하였다. 측정의 각 지점은 상대 발광 단위(RLU)로 측정된 평균 발광 반응을 나타낸다. 개별적으로 NAD+와 NADH의 측정: 검정은 Tg(mpeg:GAL4FF/UAS:NfsB-mCherry) 4dpf 무손상 유충 트렁크 및 1dpi(5dpf) 및 2dpi(6dpf)에서 해부된 근절 바늘 찔림 손상된 유충 상처 부위로부터 단리된 FACS 분류 mCherry+ 대식세포에서 수행하였다. 세포를 5000 세포/웰의 밀도로 50μL의 PBS를 함유하는 백색의 평저 96 웰 플레이트(Costar)로 분류하였다. 제조업체의 지침에 따라 2개의 별도 반응을 수행하여 NAD+ 또는 NADH 중 하나를 제거하였고 나머지 대사산물을 100μL의 NAD/NADH Glo™ 검출 시약을 사용하여 검출하였다. 2시간 배양 후, 발광은 이전과 마찬가지로 결정하였고, NAD+ 및 NADH의 수준에 기초하여 NAD+/NADH 비율을 계산하였다.
RT- PCR
FACS 분류된 pax3a+ 세포로부터의 총 RNA는 TRIzol™ 시약(Thermo Fisher)을 사용하여 추출하였다. cDNA는 제조업체의 지침에 따라 iScriptTM 고급 cDNA 합성 키트(Bio-Rad)를 사용하여 합성했다. RT-PCR의 경우, 10μl 반응은 GoTaq® Green Master Mix(Promega)를 사용하여 설정했다. 프라이머는 zfccr5, 5'-TTATAACCAAGAGACATGTCGGCG-3' 및 5'-ACCCAGACGACCAGACCATT-3'를 증폭하는 데 사용된다. 프라이머 쌍은 cDNA 및 게놈 DNA(gDNA) 주형이 각각 191bp 및 579bp의 밴드를 초래하도록 388bp 인트론을 교차하도록 설계된다. 사이클링 프로토콜은 다음과 같이 수행되었다: 95℃에서 2분 동안 초기 변성 후, 95℃에서 30초 동안 변성, 58℃에서 1분 동안 어닐링 및 72℃에서 45초 동안 확장의 25 사이클 후 72℃에서 5분의 최종 확장. 사이클링 프로토콜은 게놈 DNA 오염물의 식별을 허용하는 cDNA와 gDNA 주형을 모두 증폭하는 허용을 제공했다.
총 RNA를 추출하고, 상이한 유전자형의 4dpf 제브라피시 유충 꼬리로부터 cDNA를 합성했다(돌연변이체, 이형접합성 및 동형접합성 동기는 nampta+/ pc41 ccr5+/pc42의 이형접합성 동종 교배로부터 유충 머리를 유전형 분석하여 식별되었다). RT-PCR은 다음 프라이머 쌍을 사용하여 수행되었고, 이들 모두는 인트론을 교배하도록 설계되었다: zfnampta_mutant_RT, 5'-CCGACTCCTACAAGGTCACAC-3' 및 5'- TTGACTTTTCGGGGCTTGGT-3'(야생형 앰플리콘 115bp); zfccr5_mutant_RT, 5'-TTGAGCTGTTATAACCAAGAGACA-3' 및 5'-GAGGGAAAATTAAGCTCAGAAGG-3'(야생형 앰플리콘 657bp); zfactc1b_housekeeping_RT, 5'-TTGACAACGGCTCCGGTATG-3' 및 5'-GCCAACCATCACTCCCTGAT-3'(앰플리콘 110bp).
최대 가능성 계통수 분석
제브라피시의 추정 Ccr5 오르토로그는 BLAST에 의해 식별되었고, 오르톨로지는 계통발생학적 분석에 의해 평가되었다. 아미노산 서열은 MUSCLE에 의해 정렬되었고, GBLOCKS를 사용하여 트리밍하였다. PHYML을 사용하여 단백질 진화에 대한 JTT 모델을 사용하여 최대 가능성 트리를 생성했다(ProTest v3.4.2를 사용하여 추론됨). 트리는 iTOL(v4.3)(70-76)을 사용하여 시각화되었다.
통계 분석
각 실험 처리 그룹의 배아는 무작위로 할당되었고, 그룹은 분석 전에 실험자에게 맹검되었다. 모든 실험은 최소 3개의 독립적인 생물학적 복제물로 수행되었고; 정확한 숫자는 숫자로 표시되었다. 통계 분석은 Prism 버전 7.0c(GraphPad Software, Inc.)를 사용하여 수행되었다. 데이터는 두 조건을 비교하는 경우는 스튜던트의 쌍을 이루지 않은 양측 t-테스트를 사용하고, 여러 조건을 비교하는 경우는 Tukey의 사후 분석을 사용하는 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 분석했다.
NAMPT402 -491 생산 및 정제
최종 단백질 농도: 280μg/ml
예상 크기: 11kDa
겔에서 관찰된 크기: 14-15kDa(데이터는 표시되지 않음)
12%SDS-PAGE:
레인 1: NAMPT402-491
레인 2: MW 마커(kDa)
아미노산 서열:
MSYVVTNGLG VNVFKDPVAD PNKRSKKGRL SLHRTPAGNF VTLEEGKGDL EEYGHDLLHT VFKNGKVTKS YSFDEVRKNA QLNIEQDVAP HHHHHHH
아미노산 수: 97(이 예는 septaHis C-말단 모이어티를 포함한다)
분자량: 10977.26
흡광 계수(계산에 사용됨:
이 단백질은 임의의 Trp 잔기를 함유하지 않는다. 경험에 따르면, 이것이 계산된 흡광 계수에 10% 이상의 오류를 초래할 수 있음을 나타낸다.
흡광 계수는 물에서 측정된 280nm에서 M-1cm-1 단위이다.
Ext. 계수 4470
Abs 0.1%(=1g/l) 0.407(나노드롭 판독값을 조정하는 데 사용되는 값)
제조 프로토콜
플라스미드 제조 및 박테리아 형질전환:
- NAMPT402-491 DNA 서열을 pET22b(+) 벡터(여기서, 플라스미드 맵)에 서브클로닝했다
- 42℃에서 30초 동안 열 충격으로 적격의 이.콜리(E.Coli)(BL21DE3 균주)로 형질전환된 벡터
- 형질전환된 박테리아를 암피실린/한천 플레이트에 확산시키고, 단일 콜로니를 선택하였다.
단백질 생산:
- 밤새 배양된 LB + 100μg/ml 암피실린 중 5mL 스타터 배양물
- 배양 후, 스타터 배양물을 LB + 100μg/ml 암피실린으로 1:100 희석하고, OD600이 0.7에 도달할 때까지(약 4시간) 확장시켰다
- 1mM IPTG로 4시간 동안 유도
- 박테리아 배양물을 4000g에서 20분 동안 회전시키고, 펠렛을 용해 완충액(PBS + 50mg 리소자임 + 1% 트리톤 X-100 + 2.5 U 벤조나제 + 10mM MgCl2 + 1 정제 완전 EDTA 비함유 프로테아제 억제제)에 재현탁시켰다.
- 4 x 30초 동안 초음파 처리 및 부드럽게 진탕시키면서 4℃에서 30분 동안 배양
- 용해물을 14,000g으로 30분 동안 회전시키고, 상청액을 단백질 정제 전에 여과하였다.
단백질 정제:
- 용해물을 HisTap HP(GE healthcare)에 로딩했다
- LPS를 트리톤 X-114 0.1% 세척액으로 제거했다
- 박테리아 샤페론을 2mM ATP + 10mM MgCl2 세척액으로 제거했다
- 다른 오염물질을 20mM 이미다졸 세척액으로 제거했다
- 단백질을 20mM에서 500mM까지 이미다졸 구배로 용출시켰다
- 순수한 단백질을 함유하는 분획을 풀링하고 PBS에서 밤새 투석했다
- 단백질을 3kDa 아미콘 필터를 사용하여 농축시켰다.
본 설명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되지만, 이는 어떠한 식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
조직 손상에 대한 집단 세포 반응의 라이브 이미징은 재생 의학 분야의 장기 목표로 남아 있다. 이 목표를 달성하려는 시도에서, 이전에 개발된 조직 손상의 제브라피시 모델이 사용되었고, 여기서 유충의 광학적 접근성은 실시간으로 복구를 분석하기 위한 비침습적 기술의 적용을 가능하게 한다(참조: Gurevich D. B. et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells co-ordinate muscle regeneration in vivo. Science (2016))(3).
이 접근법은 본원에서 생체내 재생을 정의하는 세포 및 분자 이벤트를 결정하기 위해 골격근을 재생하는 데 적용되었다. 상처 존재 세포 성분을 형광 태깅하는 유전자삽입 제브라피시 리포터 라인은 급성 손상을 겪어 개별 상처 점유 세포의 위치와 반응 역학이 근육 복구 중에 줄기 세포 구획에 상관되도록 할 수 있었다.
두 가지 손상 패러다임이 사용되었다: 손상당 2 내지 6개의 섬유를 절단하는 초점 레이저 절제 모델과 2개의 인접한 근절을 일관되게 손상시키는 바늘 찔림 모델. 두 모델에서 재생 틈새 내의 상이한 세포 거동의 체계적인 특성화는 재생 동안 특정 대식세포 집단과 근육 줄기 세포 사이의 지시된 절대적인 연관성을 강조하였다. 생체내 세포 추적과 결합된 고해상도 이미징의 별개의 모드는 이러한 상호작용을 높은 시간적 및 공간적 해상도로 정의하였다.
특정 대식세포 서브세트는 외상에 반응하도록 프라이밍된다 .
처음에, 다광자 이미징을 사용하여 레이저 절제 근육 손상 전 및 직후의 반응을 포착하였다. 분화된 근육이 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하고 대식세포는 mCherry 형광으로 표지되는 화합물 유전자삽입 라인 Tg(actc1b:GFP); Tg(mpeg1:GAL4FF/UAS:NfsB-mCherry)는 손상 반응성 대식세포의 역학을 관찰하는 동안 상처 영역이 정의되도록 할 수 있었다(도 1a-c, 보충 비디오 1(제공되지 않음)). 근육 섬유 레이저 절제 손상 후, 상처 부근의 대식세포(MΦ)의 34±2%(레이저 절제 중심에서 반경 260μm 이내의 MΦ, 손상 중 어느 한 측면 상의 2개의 근절을 포함하는 영역, n = 4 손상)는 상처 부위를 향한 신속하고 활성이며 지시된 이동(평균 이동 거리: 128.31±68.03μm, 평균 속도: 0.149±0.040μmsec-1, n=4 유충에서 검정된 n=30 MΦ, 도 1c, 보충 비디오 1(제공되지 않음))을 나타냈다. 모든 손상 근접 대식세포가 병변에 반응한 것은 아니라는 것은 외상에 반응하도록 프라이밍된 특정 대식세포 서브세트의 잠재적인 존재를 시사했다.
다음으로, 상처 부위의 경계 내의 손상 이동 대식세포 역학을 근육 섬유 레이저 절제 후 세포 해상도에서 조사하였다. 고해상도 연속 공초점 이미징으로 상처 부위 내의 피크 대식세포 수는 손상 후 2.50±0.42시간(hpi)(n = 8 손상)에 도달하고, 이후 추가 대식세포는 상처로 이동하지 않았다(도 1d-f, 보충 비디오 2(제공되지 않음))는 것이 입증되었다.
총 손상 반응성 대식세포 중, 51.11±1.83%(n=8 손상)가 24hpi까지 상처 부위 내에 남아 있었다(도 1e-f). 이러한 장기 손상 위치된 대식세포는 "거주"로서 지칭된다. 대조적으로, 상처 부위를 떠나는 대식세포는 10.48±1.19hpi 이전에 그렇게 하고, 결과적으로 "일시적"으로 지정되었다(도 1d, f).
고해상도 공초점 이미징은 이들 두 대식세포 집단이 형태학적 차이를 나타내며 일시적인 세포가 명백한 성상 외관을 나타내는 반면, 거주 세포는 더 구형 형태를 채택한다는 것을 나타내었다(일시적 MΦ와 비교할 때, 거주 MΦ는 0.248±0.022 높은 구형도 값을 나타냄, 도 1g-i, 보충 비디오 3(제공되지 않음)). 이 일시적 대 거주 대식세포 전이가 손상의 크기에 관계없이 발생했지만 상처 크기에 따라 일시적으로 확장되었다(바늘 찔림 손상 반응성 MΦ의 51.6%는 손상 후 2일(dpi)까지 거주로 진행함, n = 20, 도 5a-d).
상처 활성 대식세포의 별개의 서브세트 사이의 계통 관계는 이 분야에서 상당한 논쟁의 문제로 남아 있다. 거주 대식세포가 손상 반응성 대식세포의 원래 풀의 서브세트인지 또는 대안적인 대식세포 이동파의 결과인지를 확립하기 위해, 대식세포가 광 활성화 가능한 형광 단백질 Kaede로 표지된 Tg(mpeg1:Gal4FF/UAS:Kaede) 유전자삽입 라인이 활용되었다. 바늘 찔림 근육 손상 1일 후, 상처 부위에 존재하는 일시적 대식세포를 광변환하여 손상 외부 대식세포와 구별하였다(n = 20, 도 1j-k"). 1일 후에 손상 부위 재이미징시, 손상 부위 내의 모든 거주 대식세포는 Kaede의 광변환된 형태를 나타냈다(도 1l-m). 이는 거주 대식세포가 초기 일시적 손상 반응성 대식세포 집단에서 유래된 서브세트이며, 또 다른 시간적으로 별개의 다른 이동의 결과가 아님을 나타낸다.
근육 복구 동안 조직 상주 대식세포와 동원된 대식세포의 각각의 기여는 적극적인 조사의 추가 영역이다. 광학 시트 기술을 유충 제브라피시 모델과 결합하면 복구 과정 동안 유리한 전체 유기체에서 개별 대식세포 이동 이벤트의 포착을 가능하게 하기 때문에 이 영역을 검사할 독특한 기회를 제공한다. 이와 같이 개별 대식세포는 광 시트 현미경 검사에 의해 Tg(actc1b:GFP) 및 Tg(mpeg1:GAL4FF/UAS:NfsB-mCherry) 유전자삽입 라인에서 레이저 절제 근육 섬유 손상 후 10분에서 25hpi까지 전체 제브라피시 유생 전반에 걸쳐 추적되었다(보충 비디오 4(제공되지 않음)). 상처 위치된 대식세포의 후향적 추적은 거주 표현형을 가정하기 위해 진행된 모든 대식세포가 상처 부위 근처에서 이동했으며, 그와 같이 사실상 이동성이 아닌 상주하는 조직이다는 것을 밝혀냈다(n=4 손상, 도 1n-n'). 이러한 관찰은 제브라피시 유충에서 상처 반응성 대식세포의 활성화에 대한 국소화된 해부학적 제약이 있음을 시사한다. 이 국소화된 반응은 조직 상주 대식세포의 이전에 기재된 친항상성 "클로킹" 기능을 연상시키며, 이로 인해 그들은 근육을 포함한 다양한 조직의 미세 병변을 분리하여 여분의 호중구 이동을 방지한다. 그러나, 근육 손상의 맥락에서, 일부 상처 근접 대식세포가 손상 부위로의 이동을 자제하는 이유는 미해결 문제로 남아 있다.
대식세포는 효율적인 골격근 재생에 필수 불가결하지만, 손상 복구를 위한 거주 대식세포 하위집단에 대한 명시적 요구 사항도 있다. 거주 대식세포의 상주는 줄기 세포 매개 근육 복구와 동일한 시간 창에서 발생했기 때문에, 그들이 일시적 및 거주 대식세포 집단의 존재 및 부재하에 근육 재생을 비교함으로써 이 과정에 필요하였는지 여부를 다음에 조사하였다. Tg(mpeg1:GAL4FF/UAS:NfsB-mCherry) 유전자삽입 라인은 근육 재생 중 개별적 시점에 메트로니다졸(Mtz)을 첨가하여 적시에 대식세포의 시간적으로 제어된 니트로리덕타제 매개 유전자 절제를 가능하게 한다(도 2a. 5e-f, 보충 비디오 5(데이터는 제공 되지 않음)). 이 유전자삽입 라인에 Mtz 첨가는 효율적인 세포사로 이어지며, 치료 3시간 후에 대식세포 절제가 시각화된다. 10 내지 13시간 후, 대부분의 트렁크 존재 대식세포는 절제되었고, 그들의 세포 시체는 유충으로부터 제거되었다(도 5g, 보충 비디오 5). 또한, 이 절제 전략은 2dpi에서 근육 손상에 대한 다른 선천적 면역 세포 반응을 변경하지 않았다(도 5h-i). 바늘 찔림 근육 손상 후 재생은 복구 과정의 과정에서 주요 이정표에서 상처 부위의 복굴절 이미징에 의해 평가되었다(그룹당 n = 24, 도 2b-h). 근육 육종의 의사 결정성 어레이는 고유한 복굴절을 부여하여 편광을 사용하여 관찰할 때 무손상 근육이 검은색 배경에 대해 밝게 보이게 하여 근육 무결성의 비침습적 시각화를 가능하게 하였다(Berger, et al.(2012)). 손상시 Mtz 첨가(모든 손상 반응성 대식세포를 절제하기 위해) 및 1.75dpi에서 Mtz 처리(거주 대식세포를 우선적으로 절제하기 위해)는 모두 상당한 재생 결핍을 초래했다(도 2b-h, 도 5g'). 관찰된 복구 결핍이 대식세포로 제한되며 Mtz 유도 독성 또는 일반적인 선천적 면역 결핍에 대한 반응의 결과가 아니라 대식세포에만 국한된 것임을 확립하기 위해, 대식세포를 절제하는데 사용되는 동일한 전략을 통해 호중구의 니트로리덕타제 매개 유전자 절제를 가능하게 하는 이전에 특성화된 Tg(mpx:KALTA4/UAS:NfsB-mCherry) 유전자삽입 라인이 사용되었다. 호중구는 손상시 유충 제브라피시가 손상시 상처 및 Mtz 처리에 장착되는 선천적 면역 반응의 다른 중요한 세포 성분이며, 모든 손상 반응성 호중구를 절제하는 것을 표적으로 하면 근육 재생을 방해하지 못했다(도 5j-o). 따라서, 대식세포는 효율적인 골격근 재생에 필수 불가결할 뿐만 아니라 손상 복구를 위한 거주 대식세포 하위집단에 대한 명시적 요구 사항도 있다.
대식세포 결핍 환경에서 명백한 복구 실패는 비효과적인 파편 클리어런스로 인한 것이 아니라 오히려 아직 특성화되지 않는 친근원성 기능의 부족으로 인해 발생한다. 상처 파편 클리어런스는 다수의 세포 유형에 의해 매개되지만, 주로 식세포 대식세포에 기인한다. 부재 또는 비효율적인 클리어런스는 대식세포 집단이 재생 과정 초기에 절제되었을 때 관찰되는 재생의 부족에 대한 한 가지 설명일 수 있다. 모든 손상 반응성 대식세포가 절제되었을 때 상처 파편 클리어런스를 검정하기 위해 4개의 개별적 접근법이 수행되었다. 첫째, 유충을 형광적으로 접합된 팔로이딘으로 염색하여 손상 부위에서 잔여 괴사성 골격근 섬유의 액틴 세포골격을 검출하였다(도 6a). 둘째, Tg(ubi:secAnnexinV-mVenus) 유전자삽입 라인을 이용하여 손상 영역 내의 아폽토시스 세포를 식별하였다(도 6b-c). 셋째, LysoTracker 형광 바이탈 염료를 사용하여 산성 막 세포 소기관과 자가포식 과정을 시각화했으며(도 6d-e), 마지막으로 헤마톡실린 및 에오신 염색을 수행하여 상처 부위의 죽은 섬유와 죽어가는 섬유의 제거를 모니터링했다(도 6f). 절제되지 않은 대조군과 비교하여 대식세포 절제된 유충의 손상 부위에 세포 파편의 축적은 이러한 독립적인 접근법 중 어느 것에서도 관찰되지 않았다(도 6a-f). 이러한 데이터는 대식세포 결핍 환경에서 명백한 복구 실패가 비효율적인 파편 클리어런스로 인한 것이 아니라, 오히려 아직 특성화되지 않은 친근원성 기능의 부족으로 인한 것임을 시사한다.
대식세포는 줄기 세포와의 매우 역동적인 막 접촉을 유지하여 연속적이고 반복적인 막 확장으로 그들을 감싸고 있다 - 대식세포- 줄기 세포 결합은 줄기 세포 증식에 필수적일 수 있다. 거주 대식세포가 복구 틈새 내에서 차지하는 위치가 분열하는 근육 줄기 및 전구 세포를 함유하는 것으로 확인된 것과 지형적으로 유사하다는 점을 감안할 때(도 1e), 다음으로, 이러한 두 세포 집단 간의 공간적 및 시간적 관계를 근육 재생 중에 조사했다. 레이저 절제 근육 손상 후 장기 공초점 저속도 이미징은 대식세포 및 pax3a 발현 근육 줄기/전구 세포 둘 다를 표지하는 화합물 Tg(mpeg1:GAL4FF/UAS:NfsB-mCherry);TgBAC(pax3a:GFP) 유전자삽입 라인에서 수행되었다(도 2i-l, 보충 비디오 6(데이터는 제공되지 않음)). pax3a:GFP 리포터는 근육 줄기 세포 구획과 분할 전구 세포 집단 모두에서 발현되므로 이 맥락에서 특히 유용하다. 손상 후, 일시적인 대식세포와 pax3a+ 세포가 모두 반응하고 동시에 상처로 이동했다. 그러나, pax3a+ 세포는 일시적인 대식세포와 독립적으로 이동하여 명확한 이동 역학을 나타내며 10.25±1.99hpi까지 상처의 가장자리에 있는 틈새에 거주한다(n = 5 손상, 도 2i-l, 도 7d-f, 보충 비디오 6, 제공되지 않음). 일시적 대식세포 표현형에서 거주 대식세포 표현형으로의 전이 후, 거주 대식세포는 11.17±1.13hpi에서 상처 가장자리를 라이닝하는 pax3a+ 세포와 관련되고, 5.38±1.79시간에 걸쳐 인접한 줄기 세포와의 연속적인 상호작용을 나타냈다(도 2l-m, 보충 비디오 6(데이터는 제공되지 않음)). 이러한 상호작용은 평균적으로 12.86±11.95분 동안 유지되는 일시적 대식세포와 pax3a+ 세포 간의 짧은 수명 상호작용과 비교할 때 그 성질과 지속 시간이 다르다(n=37 상호작용, 도 2i-k, m). 이러한 세트의 상호작용은 Tg(met:mCherry-2A-KALTA4/UAS:NfsB-mCherry) 근육 줄기 세포 마킹 라인3 및 GAL4FF가 pax7b 유전자(Tg(pax7b:GAL4FF)로서 지칭됨)11 통합되고 Tg(UAS:NfsB-mCherry)를 구동하는데 사용되는 근원성 줄기/전구 세포 마커 유전자 트랩 라인을 사용하는 분석에서 또한 요약되었다(도 7a-c, 보충 비디오 9).
근육 재생을 제어하는 데에서 특정 대식세포 서브세트의 직접적인 역할.
이러한 세포 상호작용을 더 잘 시각화하기 위해, AiryScan 공초점 현미경을 사용한 고해상도 라이브 이미징을 공존하는 거주 대식세포와 pax3a+ 근육 줄기/전구 세포에 대해 수행했다(도 2n, 보충 비디오 7(데이터는 제공되지 않음)). 공존하는 대식세포와 줄기 세포 사이에서 지속적인 연관성이 관찰되었다. 대식세포는 줄기 세포와의 매우 역동적인 막 접촉을 유지하고 연속적이고 반복적인 막 신장으로 그들을 감쌌다(n = 10 손상, 도 2n, 도 7g, 보충 비디오 7, 8(데이터는 제공되지 않음)). 이러한 장기간의 물리적 상호작용 후, 관련된 pax3a+ 근육 줄기 세포는 항상 세포 분열을 겪었다(도 2n, 보충 비디오 7, 8(데이터는 제공되지 않음)). 이들 대식세포-줄기 세포 상호작용은 상관 광 및 전자 현미경(CLEM)에 의해 추가로 검증되었고, 이는 두 세포 유형이 3차원 XYZ 평면에서 밀접한 막 접합을 나타내는 것으로 확인되었다(도 8a-d). 이러한 장기간의 물리적 상호작용 후, 관련 pax3a+ 근육 줄기 세포는 항상 세포 분열을 겪었다(도 2n, 도 7g, 보충 비디오 7, 8). 평균적으로, 거주 대식세포는 관련 줄기 세포가 분열하기 전에 특정 줄기 세포/전구 세포와 5.42±1.72시간 동안(n = 10 상호작용) 상호작용했다. 이는 거주 대식세포의 서브세트가 상처 반응성 근육 줄기 세포와 중단 없는 상호작용을 유지하는 시간(5.38±1.79시간, 도 2l-m)에 필적하고, 거주 대식세포가 줄기 세포 상호작용을 개시할 때 줄기 세포 분열시 정지하는 것을 강조한다. 결정적으로, 공존하는 거주 대식세포와의 장기간 상호작용의 부재하에 근육 줄기 세포 분열은 관찰되지 않았다(n=26 상처 관련 줄기 세포 분열은 n=10 독립적 유충에서 이미징됨). 증식 유도 대식세포의 71%는 단일 근육 줄기 세포와의 장기적인 연관성을 유지하고, 29%는 두 줄기 세포와 동시에 결합하며, 세포 분열 전에 둘 이상의 동시 장기 줄기 세포 상호작용을 유지하는 대식세포는 식별되지 않았다(n = 9 줄기 세포 분열). 줄기 세포 증식 후, 대식세포와 딸 근아세포는 서로 멀리 이동하고, 대식세포는 줄기 세포 분열 후 1.94±0.94시간에 근중격 국소화에서 취한다. 이러한 재배치 동안, 대식세포의 44%는 1.45±0.69시간 동안 하나 또는 두 개의 딸 근아세포와의 연관성을 나타내고, 나머지는 그러한 연관성을 회피한다(n=9 줄기 세포 분열, 도 7h, 보충 비디오 10). 흥미롭게도, 근육 줄기 세포와 상처-거주 대식세포 사이의 이러한 상호작용의 특성은 T 세포 활성화 및 증식을 유도하는 림프절 내의 수지상 세포-T 세포 면역학적 시냅스를 표현형적으로 연상시킨다. 종합적으로, 이러한 데이터는 대식세포-줄기 세포 연관성은 줄기 세포 증식에 필수적일 수 있음을 시사한다.
줄기 세포 증식을 자극하기 위한 거주 대식세포의 요구 사항을 검정하기 위해, 근절 바늘 찔림 손상된 유충에서 EdU 표지화가 수행되었고, 여기서 거주 대식세포가 절제되었다(도 2o-q). 2dpi에서 대조군 유충 상처 부위에서, 모든 EdU+ 증식 세포는 pax3a+ 근원성 줄기/전구 세포에 상응했다. 거주 대식세포의 절제는 손상 부위 내에서 증식하는 pax3a+ 근육 줄기 세포의 수를 심각하게 상당히 감소시켰고, EdU 양성 세포의 수를 무손상 영역 내에 존재하는 항상성 수준으로 감소시켰다(증식하는 pax3a+ 근육 줄기 세포의 51% 감소, n = 13, 도 2p-q). 종합적으로, 이러한 결과는 근육 재생을 제어하는 데 특정 대식세포 서브세트에 대한 놀랍게도 직접적인 역할을 나타내며, 상처 유인된 대식세포의 비율이 일시적인 줄기 세포 틈새를 형성한다는 것을 입증한다. 이 틈새 특이적 대식세포 서브세트의 절제는 손상 부위 내에 존재하는 근원성 전구 세포 수의 심각한 감소를 일으키고, 결과적으로 근육 재생 결핍을 일으킨다(도 2f-h).
무감독 클러스터링은 무손상 조직으로부터 균질한 집단(클러스터 3), 일시적인 대식세포의 클러스터 2 및 손상 특이적 거주 대식세포 아형의 많은 개별 클러 스터를 식별했다. 손상 반응성 대식세포 집단의 성질을 확립하기 위해, 재생 과정의 개별 단계로부터 단리된 손상 위치 대식세포에 대해 단일 세포 RNA 서열분석(scRNA-seq)을 수행하였다. Tg(mpeg1:mCherry) 유충의 바늘 찔림 골격근 손상 후, 상처 영역을 1, 2 및 3dpi에서 해부하고, mCherry 발현 대식세포를 FACS 분류하였다(도 3a). 무손상 유충으로부터 분류된 대식세포도 또한 분석에 포함되었다. 무감독 클러스터링은 대식세포 아형의 7개의 개별 클러스터를 식별했다(도 3b). 참고로, 모든 클러스터의 세포는 pan-백혈구 마커 L-플라스틴(림프구 세포질 단백질 1, Icp1)과 pan-대식세포 마커 cd163을 발현하여 그들 대식세포 동일성을 검증했다(도 3e, 도 9a, p 표 1). 무감독 클러스터링은 대식세포 아형의 8개의 개별 클러스터(클러스터 0-7)를 식별했다(도 3b). 이 분석은 근육 중 또는 임의의 다른 재생 시나리오14 -19에서 이전에 기재된 것보다 큰 대식세포 이질성을 나타냈다(도 3b). 본 발명자들은 이어서 손상 반응성 대식세포가 단리된 시점과 UMAP 산점도에 중첩된 식별된 클러스터를 비교하여 손상 시간이 특정 개별 클러스터에 상응하는지를 조사했다(도 3c). 무손상 유충으로부터의 대식세포는 일시적으로 균일한 클러스터를 형성하였다(클러스터 3, 도 3d, 보충 표 2). 게다가, 특히 무손상 유충으로부터의 대식세포의 무감독 클러스터링은 추가의 복잡성을 나타내지 않았고, 그들의 균질한 성질을 재확인했다. 무손상 대식세포 집단에서의 이러한 사전결정의 부족은 근육에 상주하는 대식세포의 일부만이 손상으로 이동함으로써 반응한다는 것을 고려하면 흥미로운 것이다. 상처 유래 단서에 반응하는 능력은 적어도 유전자 발현 수준에서 획득된 상태임을 시사한다. 일시적인 대식세포의 대부분(1dpi)은 함께 클러스터링하여(클러스터 1, 도 3d, 보충 표 2) 손상으로 이동하는 대식세포의 체계적인 초기 활성화를 시사한다. 나머지 6개의 클러스터는 거주 대식세포(2-3dpi)로 구성되며, 그들의 불균일한 특성을 강조한다(클러스터 0, 2, 4, 5, 6 및 7, 도 3d, 보충 표 2). 본 발명자들은 다음으로, 식별된 거주 대식세포 클러스터 사이의 잠재적인 계통 관계를 더 잘 이해하기 위해 전사체 궤적 및 의사 시간 분석을 수행하였다. 이러한 분석은 클러스터 2와 6으로 나타나는 2개의 '성숙한-거주' 대식세포 아형이 있음을 밝혀냈다. 다른 모든 클러스터는 이러한 성숙한 서브세트가 발생하는 일시적 아형임을 시사하는 궤적을 갖는다(도 3g-k).
포유동물에서, 활성화된 대식세포는 시험관내 연구를 통해 전염증성, 또는 M1 대식세포와 대안적으로 활성화된 항염증성 또는 M220 대식세포 풀 사이의 간단한 이분법으로 고전적으로 정의되었다. 최근의 분석은 대식세포 표현형의 이 간단한 이분법은 생체내 대식세포 다양성을 나타내지 않는다는 것을 명확하게 예시하지만, 특정 마커를 사용하여 전염증성 및 항염증성 아형을 식별할 수 있다. 각 클러스터 사이에서 차별적으로 발현되는 유전자의 분석은 클러스터 2 대식세포가 아르기나제 2(arg2), 매트릭스 메탈로프로테이나제 9(mmp9) 및 매트릭스 메탈로프로테이나제 13(mmp13)21-23을 포함하는 포유류의 항염증성 아형 마커에 대해 특이적으로 풍부했음을 나타냈다(클러스터 2의 53.4%, 100% 및 98.6%는 각각 arg2, mmp9 및 mmp13을 발현하는 세포를 제공한다, 도 3e, 보충 표 3).
모든 클러스터 2 세포가 mmp9를 발현했기 때문에(도 3e, k), 본 발명자들은 내인성 mRNA에 대한 원위치 하이브리드화(도 3l, o)와 mmp9 프로모터의 제어하에 EGFP를 발현하는 유전자삽입 라인의 사용의 통해 손상 후 이의 시공간적 발현을 평가했다(TgBAC(mmp9:EGFP)24, 도 3m-n, 도 10a 및 보충 비디오 11). 이러한 분석은 상처 부위에 존재하는 근육 줄기 세포 관련 거주 대식세포 집단에서 mmp9 발현이 2dpi 이후로 상향조절되었다는 것을 밝혀냈다(도 3l-m, o). 정량 분석은 2dpi에서 상처 부위의 mpeg+-거주 대식세포의 71.09±12.05%(n=11)가 mmp9+임을 확인하였으며(도 3m-o), 모든 2dpi 대식세포의 59%가 mmp9를 발현한다는 것을 확인한 scRNA-seq 분석과 일치하는 값 범위이다(도 3f). mmp9+ 대식세포의 수는 근육 줄기 세포와 활발하게 상호작용하는 상처 부위 존재 거주 대식세포의 수와도 일치한다(72.92±20.83%). 또한, 2dpi에서 상처 부위 중 잔류하는 거주 대식세포의 대부분은 클러스터 6에 특이적인 마커를 발현했다(세포의 15.10±12.13%는 Pou2f3+/mpeg+이고, 세포의 23.36±12.85%는 Prox1a+/mpeg+이다, 도 9b-g). 이 관찰은 상기 기재된 scRNA-seq 궤적 및 의사 시간 분석과 강하게 상관관계가 있으며(도 3g-k), 이는 클러스터 2 및 6은 후기 상처 재생 중에 존재하는 2개의 '성숙한-거주' 대식세포 아형으로 정의한다. 또한, 클러스터 2 세포와 대조적으로, 클러스터 6 세포의 대다수는 pax3a+ 근육 줄기/전구 세포에 인접하여 위치하지 않았고(2dpi에서 Pou2f3+/mpeg+ 세포의 12±10%(n=8) 및 Prox1a+/mpeg+ 세포(n = 10)의 9±7%는 상처 부위 존재 pax3a+ 세포에 인접하여 위치한다), 이 서브세트는 상처 복구의 증식 단계 동안 근육 줄기 세포와 활발하게 상호작용하지 않는다는 점을 강조한다.
재생 근육 줄기 세포 증식의 조절에 클러스터 2 대식세포를 보다 직접적으로 연루시키기 위해, 본 발명자들은 EGFP에 융합된 니트로리덕타제 효소(TgBAC(mmp9:EGFP-NTR)24)를 발현한 대안적인 mmp9 프로모터 구동된 유전자삽입 라인을 사용하여 복구 과정 동안 이러한 세포를 특이적으로 절제했다. 이들 유충은 4dpf(0dpi)에서 바늘 찔림 근육 손상을 겪었다. 1.75dpi에서 유충을 손상 영역에 존재하는 mmp9+/mpeg+-대식세포의 77.94%를 특이적으로 절제한 투여량인 5mM Mtz로 처리했다(도 10b-d). 이러한 세포의 특이적 절제는 상당한 골격근 복구 결핍(도 3p-q)과 상기 문서화된 mpeg+-거주 대식세포 절제시 명백한 수준과 유사한 수준으로 근육 줄기 세포 증식의 심각성 감소를 가져왔다(도 2f-h, 도 3r, 도 10e-g). 종합적으로, 이러한 분석은 클러스터 2가 근육 재생 중 근육 줄기 세포 증식에 필요한 특이적 mmp9+ 근육 줄기 세포 관련 거주 대식세포 서브세트를 함유함을 나타낸다.
클러스터 4(클러스터 2로 재분류됨) 대식세포는 arg2, mmp9 및 mmp13 를 발현하고 특정 근육 줄기 세포 관련 거주 대식세포이다. 클러스터 4(클러스터 2로 재분류됨)의 세포는 아르기나제 2(arg2), 매트릭스 메탈로프로테이나제 9(mmp9) 및 매트릭스 메탈로프로테이나제 13(mmp13)를 포함하는 포유류 M2 마커에 대해 농축되었다)는 거주 대식세포 특이적 항염증성 아형을 시사한다(클러스터 4 존재 세포의 53.5%, 100% 및 98.6%는 각각 arg2, mmp9 및 mmp13을 발현한다). 모든 클러스터 4(클러스터 2로 재분류됨) 세포가 mmp9를 발현했기 때문에, 이의 시공간적 발현은 손상 후 결정되었고, 공간적 제한은 상처 부위에서 관찰되고, 근육 줄기 세포 관련 거주 대식세포 집단에서 2dpi 이후 상승조절이 관찰되었다(도 3f-h). 이러한 분석은 클러스터 4(클러스터 2로 재분류됨)는 특정 근육 줄기 세포 관련 거주 대식세포 서브세트를 함유한다는 것을 나타낸다.
식별된 대식세포 클러스터의 클러스터 번호는 다음과 같이 이름이 변경되었다: 이전 버전의 클러스터 3(무손상) --> 현재 버전의 클러스터 3; 이전 버전의 클러스터 4(mmp9+) --> 현재 버전의 클러스터 2; 이전 버전의 클러스터 6(pou2f3+/prox1a+)--> 현재 버전의 클러스터 6. 보충 표에 예시된 바와 같이 이들 대식세포 클러스터(클러스터 1-8)의 특성화는 그들의 차등적 유전자 마커 발현 프로파일/s에 기초한 대식세포 클러스터의 선택 및/또는 농축, 예를 들어, 그들의 차등적 유전자 발현 프로파일, 및 시험관내 및 생체내 거동, 예를 들어, 항염증성 분화 촉진 활성에 기초한 기능적 특성화를 가능하게 한다.
NAMPT - CCR5 신호전달 축은 생체내에서 근육 줄기 세포 증식을 유도한다. 다른 모든 식별된 클러스터(확장 데이터 표 1(데이터는 포함되지 않음))와 비교하여 클러스터 4(클러스터 2로 재분류됨) 내에서 특이적으로 상향조절된 분비된 친유사분열성 분자를 인코딩하는 유전자의 목록을 평가하였다. 이는 근육 줄기/전구 세포 상에서 발현되는 것으로 공지된 수용체를 포함하는 데이터 세트와 일치했고(참조: Yahiaoui, L., Gvozdic, D., Danialou, G., Mack, M. & Petrof, B. J. CC family chemokines directly regulate myoblast responses to skeletal muscle injury. The Journal of Physiology 586, 3991-4004 (2008))(21), 니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라제(NAMPT/Visfatin/PBEF) 및 케모카인 수용체 CCR5(도 3e) 사이의 쌍의 식별을 유도한다. NAMPT는 다작용성 단백질이고, 이는 세포내로 국소화될 때 세포 대사 및 NAD 재생에서 잘 특성화된 역할을 수행하고, 분비된 인자로서 매우 불량하게 특성화된 역할을 수행한다. 이의 분비된 형태(분비된 NAMPT (secNAMPT))는 생리학적 및 병리학적 기능 둘 다의 보고와 함께 사이토카인으로서 기능하는 것으로 문서화하였다(참조: Grolla, A. A., Travelli, C., Genazzani, A. A. & Sethi, J. K. Extracellular nicotinamide phosphoribosyltransferase, a new cancer metabokine. British journal of pharmacology 173, 2182-2194 (2016)(25)). 이의 세포내 기능과는 대조적으로, 분비된 단백질의 역할에 대한 정보는 모순되고, 그 분비 방식 및 작용 기전 모두와 관련하여 잘 이해되지 않는다. 이러한 기계론적 통찰력의 부족에도 불구하고, secNAMPT는 친유사분열성인 것으로 입증되었고 또한 별개의 조직에서 다양한 재생 능력의 조절자로서 문서화된다(참조: Grolla et al.(2016)). CCR5는 NAMPT의 추정 세포 표면 수용체로서 제안되었다(참조: Van den Bergh, R. et al. Monocytes contribute to differential immune pressure on R5 versus X4 HIV through the adipocytokine visfatin/NAMPT. PloS One, e35074 (2012)(26)). 또한, NAMPT는 시험관내 근아세포에서 근원성 조절 인자의 발현을 변경하는 것으로 입증되었다. 결과적으로, 본 발명자들은 NAMPT-CCR5 신호전달 축은 생체내 근육 줄기 세포 증식을 촉진한다는 가설을 세웠다.
NAMPT/CCR5 신호전달 축을 생체내에서 근육 줄기 세포 매개 복구를 조절할 수 있는지 조사하기 위해, 다수의 독립적 접근법을 사용하여 생체내 상처 거주 대식세포 내에서 제브라피시 게놈에서 인코딩된 두 개의 nampt 유전자, nampta (단일 포유류 Nampt-인코딩 유전자의 상동체 및 클러스터 2 내에서 특이적으로 상향조절된 오르토로그) 및 namptb(어류에만 존재하는 유전자, 포유류 Nampt와 훨씬 더 낮은 상동성 포함)32의 시공간적 발현이 결정되었다. 첫째, 본 발명자들은 유충의 근육 손상에 이어 원위치 하이브리드화 분석을 수행하고 nampta가 2 및 3dpi에서 상처 부위 내에서 특이적으로 상향조절되는 반면(도 10h), namptb는 1 내지 3dpi로부터 손상 영역 내에서 일정한 낮은 수준에서 발현되었다(도 13k)는 것을 관찰했다. 이러한 관찰은 클러스터 2에서 상향조절된 유전자로서 nampta만을 식별한 scRNA-seq 데이터와 일치한다(도 3e, 보충 표 3). 둘째로, 본 발명자들은 nampta 32 의 내인성 발달 발현 프로파일을 요약한 NAMPT 항체를 식별하고(도 10k), 항체 염색은 결과적으로 화합물 Tg(mpeg1:GAL4FF/UAS:NfsB-mCherry);TgBAC(pax3a:GFP) 유전자삽입 라인에서 수행했다. 이러한 분석은 손상 부위에서 Nampt 발현은 2dpi에서 시간적으로 상향조절되고(도 10l-o), 상처 부위에서 Nampt 발현이 줄기 세포 관련 거주 대식세포 및 손상 부위의 세포외 공간에 특이적으로 국소화된다(도 4a)는 것을 확인했다. 2dpi에서 손상 부위에 존재하는 거주 대식세포 중, 72±16%(n=8 손상)는 Nampt+/mpeg1+였다(nampta를 발현하는 2dpi 대식세포의 58%를 식별한 scRNA-seq 분석과 일치하는 값 범위, 도 3f). 이 정량화는 근육 줄기 세포(72.92±20.83%)와 상호작용하는 거주 대식세포의 백분율 및 2dpi에서 상처 부위에서 mmp9+를 또한 발현하는 mpeg+ 대식세포의 백분율(71.09±12.05%) 모두와 유사하다. 모든 Nampt+/mpeg1+ 이중 양성 세포는 pax3a+ 근육 줄기/전구 세포와 관련되었다(도 4a). 또한, 재생 유충에 대한 전체 마운트 면역조직화학 분석은 대식세포 후 Nampt 수준의 감소를 밝혀냈지만 호중구 특이적 절제가 아니라 근육 손상 내 분비된 Nampt의 공급원이 대식세포 유래된다는 것을 다시 강화했다(도 10n-o).
생체내에서 근육 재생 동안 증가된 NAMPT 활성의 수준과 공급원을 모니터링하기 위해, 본 발명자들은 NAD 구제 경로에서 속도 제한 공정을 촉매하는 데 있어서 세포내 NAMPT의 중요한 생리학적 역할을 사용했다. 증가된 NAMPT 활성은 세포내 NADH의 수준을 높이는 것으로 문서화되었다. NADH는 2-광자 여기 형광 현미경 검사에 의해 검사할 수 있는 365nm에서 여기 피크를 갖는 내인성 형광을 나타낸다. 따라서, 본 발명자들은 생체내 NADH 수준을 조사하는 분석을 개발하고, 이를 상처 환경 내에서 실시간으로 세포 Nampt 수준을 조사하기 위한 프록시로서 사용하였다(참조: Hong, S. M. et al. Increased nicotinamide adenine dinucleotide pool promotes colon cancer progression by suppressing reactive oxygen species level. Cancer science 110, 629-638 (2019)). 2dpi에서, 거주 대식세포 단독은 상처 부위 내에서 높은 수준의 NADH를 특이적으로 발현하고(도 10i, 보충 비디오 12), 발광 기반 검정을 사용하여 단리된 상처 위치 대식세포 내에서 NAD+ 및 NADH의 수준을 정량화하여 생체내 기반 관찰을 확인했다(거주 MΦ는 일시적 MΦ와 비교하여 0.6781±0.1650 더 낮은 NAD+/NADH 비율을 가짐, 도 10j). 이러한 발견은 재생 동안 상처 부위에서 관찰된 증가된 Nampt 생산은 거주 대식세포 내에서 특이적으로 발생하고, 상처 부위에서 Nampt의 주요 공급원으로의 역할을 강조한다는 것을 확인한다. 또한, 거주 대식세포 내의 높은 수준의 NADH와 그에 따른 감소된 NAD+/NADH 비율은, 특히 클러스터 2/mmp9+-거주 대식세포 아형에서 대사 이동에 기인할 수 있다. 대식세포의 대사 상태가 활성화와 관련이 있다는 증거가 증가하고 있고(참조: Watanabe, R. et al. Glucose metabolism controls disease-specific signatures of macrophage effector functions. JCI insight 3 (2018)), 본 scRNA-seq 데이터세트의 분석은 mmp9+ 서브세트에서 잠재적인 당분해 이동을 나타낸다(도 9h-i). 대안적으로, 높은 Nampta 발현 수준은 세포내 저장을 고갈시키기에 충분히 높은 수준에서 발생하는 Nampt 분비의 결과로서 발생할 수 있으며, 이는 차례로 거주 대식세포 내에서 높은 수준의 nampta 발현의 유도를 유발한다.
CCR5 수용체를 통한 NAMPT의 선택적 신호전달이 근아세포 증식을 유도하는 데 필요하다. 근육 줄기 세포에 대한 NAMPT 기능의 분자 기반을 더 잘 분석하기 위해, 시험관내 검정은 포유류 세포 배양에서 수행했다. 분자 시약과 재조합 단백질은 본 발명자들이 본 생체내 제브라피시 기반 생체 관찰로부터 생성한 줄기 세포 활성화 모델의 엄격한 평가를 허용하는 포유류 시스템에서 생성되었다. 본 발명자들은 먼저 secNAMPT가 그것의 추정 수용체인 CCR5를 통해 근육 줄기 세포 증식을 조절하는 역할을 하는지를 확립하려고 했다. 직접적인 NAMPT-CCR5 상호작용에 대한 단일 보고서만이 존재하기 때문에, 본 발명자들은 CCR5에 대한 NAMPT의 결합을 독립적으로 평가하기 시작했다. 인간 재조합 CCR5 수용체(hrCCR5)에 대한 인간 재조합 NAMPT(hrNAMPT 소스 1(hrNAMPT(1)))의 결합은 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA) 접근법을 통해 평가하였다. 본 발명자들은 hrNAMPT(1)가 172±18nM의 해리 상수(KD)로 hrCCR5에 결합한다는 것을 발견하였고(도 11a), 이전 발견을 확인하였다30. NAMPT는 고도로 진화적으로 보존된 단백질이며, 인간 NAMPT는 마우스 NAMPT 및 제브라피시 Nampta 단백질과 각각 96% 및 88.24% 동일성을 공유한다. 본 발명자들은 이하 기재된 본 마우스 세포주 검정에서 hrNAMPT를 이용하기 때문에, 본 발명자들은 또한 동족체 리간드 CCL4와의 경쟁적 리간드 결합 검정에 의해 마우스 재조합 CCR5(mrCCR5)에 대한 hrNAMPT의 친화도를 검정하였다. 여기서, 마우스 재조합 CCL4(mrCCL4)는 34.4±2.2nM의 절반 최대 억제 농도(IC50)를 입증하여 mrCCR5에 대한 hrNAMPT의 강한 친화도와 CCL4에 의해 이용되는 동일한 부위를 통한 수용체에 대한 결합을 모두 나타냈다(도 11b).
이어서, 시험관내 뮤린 세포 배양 모델을 사용하여 NAMPT가 근육 줄기 세포 상의 증식 촉진 신호전달 캐스케이드를 개시하는지 여부를 결정하고, NAMPT-CCR5 상호작용이 이 과정의 기능적 조절을 산출하는지 여부를 평가했다. 이를 위해, 본 발명자들은 마우스 C2C12 근아세포를 사용했다. 이들 근아세포는 C2C12 세크로톰 데이터가 이 단백질을 검출하지 못하거나 매우 낮게 검출하기 때문에, NAMPT를 적극적으로 분비하는 것으로 보이지 않는다. 그러나, 본 발명자들은 이들 세포가 이전에 문서화된 생리적으로 관련된 CCR5의 수준과 일치하는 밀도(2,470±441 분자/세포(n = 6))에서 CCR5 수용체를 발현하지 않는다고 결정하였다(참조: Gilliam, B. L., Riedel, D. J. & Redfield, R. R. Clinical use of CCR5 inhibitors in HIV and beyond. Journal of translational medicine 9, S9 (2011). 본 검정에 대한 C2Cl2 시스템의 적합성을 검증한 후, 2개의 인간 재조합 NAMPT 단백질 공급원(hrNAMPT(1) 및 hrNAMPT(2))을 C2C12 근아세포에 적용하고, 증식은 EdU 통합에 의해 검정했다. NAMPT의 두 공급원 모두 근아세포 증식에서 필적할 만하고 유의한 투여량 의존 증가를 초래했다(도 11f). 증식 동안 NAMPT의 세포내 및 세포외 역할을 분리하기 위해, 이들 근아세포는 NAMPT의 효소 기능의 매우 특이적이고 강력한 억제제인 GMX1778로 처리했다. 약물 처리는 배양에서 C2C12 증식의 기준 수준에 부정적인 영향을 미치지 않았고, 또한 외인성 NAMPT 보충 후 생성된 증가된 근아세포 증식에 영향을 미치지 않았으며(도 11f), NAMPT의 증식 촉진 역할은 이의 세포내 효소 기능에 의존하지 않는다는 것을 강조한다. NAMPT 보충 후 관찰된 향상된 증식 반응은 CCR2 리간드 CCL2/MCP-1에 의해서가 아니라 표준 CCR5 리간드인 CCL8/MCP-2 및 CCL4/MIP-1β를 첨가하여 C2C12 세포에서 요약될 수 있었다(도 11f). 또한, 이 증식 반응은 CCR2 선택적 길항제 PF-4136309(PF)의 존재하에서가 아니라 이중 CCR2/CCR5 길항제인 세니크리비록(CVC) 및 CCR5 선택적 길항제인 마라비록(MVC)의 존재하에 차단되었다(도 11f). 종합적으로, 이 데이터는 CCR5 수용체를 통한 NAMPT의 선택적 신호전달이 근아세포 증식을 유도하는 데 필요하다는 것을 강조한다. 이어서, 본 발명자들은 대식세포와 NAMPT 매개 증식 사이의 관계를 조사하기 위해 시험관내 다세포 공동 배양 시스템으로 전환했다. 본 발명자들은 3개의 배양 조건에서 단리된 배아 마우스 PAX7+ 근육 줄기 세포의 증식을 평가하였다: 배아 마우스 1차 근아세포 단독(MB) 및 마우스 근아세포와 마우스 대식세포(MB + MΦ) 또는 3T3 마우스 섬유아세포(MB+3T3)의 공동 배양물. 사용된 마우스 대식세포 세포주는 높은 수준의 NAMPT를 발현하는 것으로 공지되어 있는 반면, 3T3 섬유아세포는 배양 중에 자연적으로 NAMPT를 분비하지 않는다. 이러한 실험에서, 대식세포의 존재가 위성 세포 증식을 촉진하고, 대식세포가 공동 배양에서 3T3 세포로 대체되었을 때 반응이 유도되지 않았다. 또한, hrNAMPT의 첨가는 CVC의 존재하에서 폐지된 효과인 MB + MΦ 배양물에서 명백한 수준에 필적하는 수준으로 MB 및 MB + 3T3 배양에서 위성 세포의 증식을 증가시킬 수 있었다. CVC의 첨가는 또한 MB + MΦ 배양 조건에서 위성 세포 증식을 MB 단독 또는 MB + 3T3 배양에서 명백한 수준으로 감소시켰다. 이러한 결과는 위성 세포 증식에서 대식세포 구동 증가가 CCR5 수용체를 통해 작용하는 secNAMPT에 의해 주로 매개되었다는 것을 강조한다. 종합적으로, 이러한 관찰은 대식세포 분비 NAMPT가 위성 세포에 존재하는 CCR5 수용체를 활성화시켜 근육 재생을 자극하는 중요한 증식 촉진 신호임을 보여준다.
후속적으로, 이러한 발견은 생체내에서 검증되었다. 제브라피시 ccr5 오르토로그는 RT-PCR에 의해 2dpi FACS 분류된 pax3a+ 근원성 줄기/전구 세포에서 발현되는 것으로 밝혀졌으며, CVC 및 MVC를 유충 제브라피시에게 투여하여 바늘 찔림 근육 손상 후 Ccr5 신호 전파를 차단했다. 복굴절 이미징을 사용하여 약물 투여된 유충에서 매우 중요한 재생 결핍이 식별되었다. 이는 대식세포 이동 역학에 대한 영향 또는 일시적 상태에서 거주 상태로 이행하는 대식세포의 차단 때문이 아니며, 이들 둘 다 약물 투여시 표현형적으로 야생형이다. 오히려, 상처 부위에 존재하는 pax3a+ 근원성 줄기 세포의 증식 감소가 관찰되었으며, 이는 거주 대식세포의 절제 후에 관찰된 것과 크기가 유사한 것으로 관찰되었다.). 종합적으로, 이러한 데이터는 생체내에서 재생 동안 근육 줄기 세포 증식을 활성화하는 Ccr5 의존 방식으로 작용하는 대식세포 분비 nampt와 일치한다.
마우스의 무조건 NAMPT 유전자 녹아웃은 배아 치사율을 초래한다. 본 분석을 혼란스럽게 하는 이 사태를 우회하기 위해, 대식세포 특이적 기능 손실 돌연변이유발 시스템이 개발되었다. Tg(mpeg1:Gal4FF) 도입유전자에 결합된 Tg(UAS:NLS-Cas9) 도입유전자로부터 Cas9의 안정한 대식세포 특이적 발현이 생성되었다. 미세주입에 의해 nampt 가이드 RNA(gRNA)를 전달함으로써 내구성 있는 대식세포 특이적 nampt 유전자 편집이 달성된 다음, 근육 복구에서 대식세포 유래 Nampt의 역할을 검정하였다(도 4i, 도 8d). Nampt의 면역염색은 nampt gRNA 주사된 유충에서 바늘 찔림 근육 손상 후 상처 부위에 존재하는 Nampt 발현 세포에서 가시성 감소를 나타냈다. 또한, 단리된 대식세포에서 NAD+/NADH 수준의 정량화는 이 대식세포 특이적 유전자 편집 접근법을 사용하여 대식세포 특이적 nampt 기능 상실을 기능적으로 검증했다.
바늘 찔림 근육 손상 후, nampt gRNA 주사된 유충 대식세포는 손상 영역으로 이동하고 1-3dpi의 상처 경계 내에 위치시킴으로써 반응했다. 그러나, 이러한 nampt 결핍 대식세포는 손상 부위에서 적절한 세포 증식과 재생을 유도하지 못했고, 적절한 재생을 보장하기 위한 기능적 대식세포 유래 Nampt에 대한 특정 요건을 강조하였다. 종합적으로, 시험관내 세포 배양 분석은 본 생체내 화학적 억제 및 대식세포 특이적 nampt 기능 상실 연구와 함께 CCR5 의존 방식으로 근육 줄기 세포 증식을 자극할 대식세포 유래 NAMPT에 대한 요건을 입증한다.
이어서, 외인성으로 적용된 NAMPT의 첨가가 용적 근육 손실, 일반적으로 정상 줄기 세포 매개 복구 과정에서 불응성인 손상 패러다임 및 충족되지 않은 임상적 필요 영역의 마우스 모델에서 재생을 가속화할 수 있는 것으로 결정되었다(참조: (Quarta, M. et al. Bioengineered constructs combined with exercise enhance stem cell-mediated treatment of volumetric muscle loss. Nature Communications 8, 1-17 (2017)(39)). 이 분석은 외인성으로 적용된 NAMPT가 또한 성인 손상 모델의 맥락에서도 작용한다는 것을 확인하고, 생체내에서 포유류 세포 배양 기반 결과를 검증했다. 놀랍게도, 피브린 단독 대조군 하이드로겔이 아니라 피브린 하이드로겔에서 hrNAMPT의 전달은 상처 부위에 적용될 때 근육 구조를 완전히 회복시킬 수 있었고, 제브라피시 유충에 대해 상기 기재한 결과와 유사한 방식으로 성체 포유류 근육의 급성 손상 맥락에서 근육 손상을 자극한다는 것을 나타낸다. 또한, NAMPT의 분비된 형태가 이들 생체내 환경 모두에서 작용하고 있음을 강화한다.
이 가장 간단한 줄기 세포 시스템조차도 생체내에서 복구하는 동안 다양한 세포 맥락과의 복잡한 상호작용을 필요로 하며, 선천적 면역 시스템, 특히 대식세포는 재생 과정의 중요한 조절 인자임이 본원에서 제안된다. 특정의 정의된 대식세포 서브세트의 존재가 본원에서 입증되고, 유사분열성 자극, 특히 NAMPT/CCR5 축의 제공을 통해 근육 줄기 세포를 직접 조절하는 일시적 줄기 세포 틈새로서 작용하는 상처 복구 동안 존재하는 대식세포 표현형의 놀라운 복잡성이 본원에서 입증된다. 종합적으로, 본원에 기재된 결과는, 여기에서 식별된 것들과 같은 근육 줄기 세포 증식에 필요한 특정 대식세포 유래 신호를 제공하는 것이 더 나은 근아세포 및 조직 줄기 세포 기반 치료 결과를 달성하기 위한 수단을 제공한다는 것을 보여준다.
이러한 결과는 다음의 추가 실험 데이터로 뒷받침되었고, 도면에 예시되어 있다.
그런 다음, 다세포 유형의 시험관내 공동 배양 시스템을 사용하여 대식세포와 NAMPT 매개 증식 사이의 관계를 조사했다. 단리된 배아 마우스 PAX7+ 근육 줄기 세포의 증식은 세 가지 배양 조건에서 평가되었다: 배아 마우스 1차 근아세포 단독(MB) 및 마우스 근아세포와 마우스 대식세포(MB + MΦ) 또는 3T3 마우스 섬유아세포(MB+ 3T3)의 공동 배양물. 사용된 마우스 대식세포 세포주(Maf/DKO)는 높은 수준의 NAMPT를 발현하는 것으로 공지되어 있지만, 본 발명자들은 본 배양 조건하에서 특정 수준의 NAMPT 분비를 정량화하려고 했다. 16시간 배양 후, Maf/DKO 대식세포는 5.24±0.67ng/ml의 NAMPT를 상청액으로 분비하였다(도 11). 또한, 이들 세포는 CCR5의 동족체 리간드(CCL3, CCL4 및 CCL5)를 상청액으로 적극적으로 분비하지 않았다(도 11d-e). 대조적으로, 3T3 섬유아세포는 배양 동안 자연적으로 NAMPT를 분비하지 않는다. 이들 실험에서, 본 발명자들은 대식세포의 존재가 대식세포가 공동 배양에서 3T3 세포로 대체될 때 유도되지 않은 반응(도 4k, 도 11g)인 위성 세포의 증식을 촉진한다는 것을 관찰하였다(도 4k, 도 11g). 또한, hrNAMPT의 첨가는 MB 및 MB+3T3 배양 조건에서 위성 세포의 증식을 MB + MΦ 배양에서의 명백한 수준에 필적하는 수준으로 증가시킬 수 있었고(도 4k, 도 11g), 이 효과는 CVC 및 MVC의 존재하에 제거되고 PF4의 존재하에서 유지된다(도 4k, 도 11g). 이러한 결과는 위성 세포 증식에서 대식세포 유래 증가가 CCR5 수용체를 통해 작용하는 secNAMPT에 의해 주로 매개되었다는 것을 강조한다. 흥미롭게도, hrNAMPT는 대식세포의 존재하에서 위성 세포 증식을 증가시키지 않았고, 이는 증식의 최대 임계 속도가 있고, 이는 수용체 포화에 의해 조절될 수 있음을 시사한다. 또한, 공동 배양에서 CCL4의 보충은 NAMPT의 첨가 결과를 반영하고, NAMPT의 증식 효과가 CCR5에 의해 매개된다는 것을 재확인했다. 종합적으로, 이러한 관찰은 대식세포 분비NAMPT가 위성 세포에 존재하는 CCR5 수용체를 활성화하여 근육 재생을 자극하는 중요한 증식 촉진 신호라는 가설을 뒷받침한다.
이어서, 이러한 발견은 생체내에서 검증되었다. 제브라피시 ccr5 오르토로그는 RT-PCR에 의해 2dpi FACS 단리된 pax3a+ 근원성 줄기/전구 세포 상에서 발현되었으며(도 11h-j), CVC 및 MVC를 바늘 찔림 근육 손상(4dpf) 직후에 유충 제브라피시에 투여하여 Ccr5 신호 전파를 차단하였다. 복굴절 이미징을 사용하면, 약물 투여된 유충에서 매우 유의한 재생 결핍이 검출되었다(도 11r-s). 이것은 대식세포 또는 호중구 이동 역학에 대한 영향 또는 일시적 상태에서 거주 상태로 전이하는 대식세포의 차단에 기인하지 않고, 이들 모두는 약물 투여시 표현형적으로 야생형이다(도 11k-p). 오히려, 거주 대식세포의 절제 후 관찰된 것과 크기가 유사한 상처 부위에 존재하는 pax3a+ 근원성 줄기 세포의 증식 감소가 관찰되었다(도 2f-h, 도 11t-u). 또한, 이러한 결과는 투여된 CVC, 절제된 근육 레이저, 손상된 영역으로의 대식세포 및 줄기 세포의 이동 또는 대식세포의 거주 상태로의 전이에서 식별 가능한 결핍을 나타내지 않은 유충의 장기간 저속도 이미징에 의해 확인되었다(MΦ는 10.20±0.91 hpi에서 거주하기 시작, n=6 손상). 거주 대식세포는 11.80±0.57 hpi(n=6)까지 근육 줄기 세포와 연계되기 시작하고, 동일하게 상호작용하여 지속적이고 중단 없는 결합을 유지하는 대식세포를 조절했다. 그러나, 미처리된 유충과 대조적으로, 거주 대식세포는 실험 종점(18h, n = 6)까지 표적 줄기 세포와 연관되어 있었으며. 이러한 상호작용이 중단되고 두 가지 세포 유형이 줄기 세포 분열 후 멀리 이동하는 대조군 설정에서와 같이 종료되지 않았다(도 11q, 보충 비디오 13). 이러한 방식으로, 줄기 세포 분열은 대식세포와 이의 관련 줄기 세포의 분리를 유발하여 대식세포가 다음 표적 줄기 세포로 진행할 수 있도록 한다. 종합적으로, 이러한 데이터는 지속적으로 생체내 재생 동안 근육 줄기 세포 증식을 활성화하기 위해 Ccr5 매개 신호전달이 필요함을 입증한다.
재생 촉진 대식세포 유래 근육 줄기 세포 틈새를 조절하는 데 있어서 Nampta/Ccr5 신호전달 축의 역할에 대한 추가 증거를 제공하기 위해, namtpa 유전자와 ccr5 유전자 모두에서 CRISPR-Cas9 매개 유전자 편집에 의해 생식계열 돌연변이를 생성시키고, 동형접합성 돌연변이체에서 근육 재생을 검정하였다(도 12a-c, k-m). 무조건 NAMPT 유전자 녹아웃이 배아 치사율을 초래하는 마우스와 대조적으로50, 유충 제브라피시는 nampta 생식계열 녹아웃에서 살아남을 수 있다. 이는 namptb가 생존에 중요한 NAD+ 구제 경로32에서 단백질의 효소적 역할을 기능적으로 보상하고 적어도 부분적으로 충족시킬 수 있다는 사실에 기인할 수 있다. 두 돌연변이체 모두 야생형 또는 이형접합성 동기와 비교하여 손상 반응성 대식세포 또는 거주 대식세포의 수에서 필적하는 차이를 나타내지 않았다(도 12d-e, n-o). 또한, 두 돌연변이체로부터의 거주 대식세포는 상처 부위 위치된 근육 줄기 세포와 상호작용하기 시작하였다(도 12f, p). nampta와 ccr5 동형접합성 돌연변이체는 모두 바늘 찔림 근육 손상 후 복굴절 분석을 사용하여 유의한 재생 결핍을 문서화했다(도 12g-h, q-r). 또한, 두 경우에서, 이 결핍은 손상 영역 내에서 증식하는 근육 줄기 세포의 유의한 감소로 인한 것이었다(도 12i-j, s-t).
재생 촉진 활성에 필요한 특이적으로 대식세포 유래 Nampta인지 여부를 결정하기 위해, 본 발명자들은 새로운 대식세포 특이적 기능 상실 돌연변이유발 시스템을 개발했다(참조: A.I.I, Z. Zhang, V. Pazhakh, H.R. Manley, E.R. Thompson, L.C. Fox, S. Yerneni, P. Blombery, G.J.L, in preparation). Cas9 단백질의 안정한 대식세포 특이적 발현은 Tg(mpeg1:Gal4FF) 도입유전자에 결합된 Tg(4xUAS:NLS-Cas9) 도입유전자로부터 생성되었다. 미세주입에 의해 nampta 가이드 RNA(gRNA)를 전달함으로써, 내구성 있는 대식세포 특이적 nampta 유전자 편집이 유전자 편집된 대식세포의 nampta gRNA 표적 부위 내 및 그 주변에서 분명했다(도 13a). Nampta에 대한 면역염색은 nampta-gRNA 주입된 유충에서 바늘 찔림 근육 손상 후 상처 부위에 존재하는 Nampt 발현 세포의 가시성 감소를 나타냈다(도 13b). 또한, 단리된 대식세포에서 NAD+/NADH 수준의 정량화는 이 대식세포 특이적 유전자 편집 접근법을 사용하여 대식세포 특이적 nampta 기능 상실을 기능적으로 검증하였다(도 13c).
이 검증된 계통 특이적 유전자 편집 접근법을 사용하여 근육 복구에서 대식세포 유래 Nampta의 역할을 본 표준화된 근육 손상 패러다임을 사용하여 평가하였다(도 4b). 바늘 찔림 근육 손상에 이어, nampta-gRNA 주사된 유충 대식세포는 손상 영역으로 이동하고 거주 아형으로 이동하고 손상 영역에서 근육 줄기 세포와 활발하게 상호작용함으로써 반응했다(도 13d-g). 그러나, 이러한 nampta 결핍 대식세포는 손상 부위에서 적절한 세포 증식 및 재생을 유도하지 못했고(도 4d-g), 적합한 재생을 보장하기 위한 기능적 대식세포 유래 Nampta에 대한 특정 요구 사항을 강조한다. mpeg-Cas9 실험과 NAMPT의 효소 활성을 억제하고 근육 줄기 세포 증식에 악영향을 미치지 않음을 입증하는 새로운 실험을 위해 추가의 대조군 실험을 수행하였다. 대조적으로, 대식세포 특이적 namptb 녹다운 유충은 조절 손상된 유충에서 명백한 감소된 속도임에도 불구하고 상당한 근육 재생을 겪는다(확장 데이터 도 13l-n). 또한, Tg(mpx1:KALTA4);Tg(4xUAS:NLS-Cas9) 유전자삽입 조합을 사용하는 nampta의 호중구 특이적 결실은 근육 재생의 임의의 결핍을 초래하지 않았고(도 13o-q), 대식세포를 상처 부위 존재 Nampta의 공급원으로 재확인한다. 마지막으로, 본 발명자들이 본 시험관내 기반 검정에서 결정한 바와 같이, 본 발명자들은 Nampt의 재생 촉진 사이토카인 활성이 생체내 효소 기능과 무관하였는지 여부를 조사하였다. 대식세포가 거주하기 시작한 시점부터, 엄격하게 시간적으로 제어된 창에서 재생 중인 유충에 GMX1778을 첨가하여 Nampt의 세포내 효소 기능을 억제하면 근육 줄기 세포 증식을 변경하지 않았다(도 10p-q). 이것은 Nampt의 분비된 형태가 이의 증식 기능을 지배한다는 본 시험관내 발견을 확인하였다. 종합적으로, 본 시험관내 세포 배양 분석은, 본 생체내 화학적 억제 및 대식세포 특이적 nampta 기능 상실 연구와 함께, CCR5 의존 방식으로 근육 줄기 세포 증식을 자극하기 위한 대식세포 유래 NAMPT에 대한 요구 사항을 입증한다(도 14j).
그런 다음, 본 발명자들은 Ccr5 수용체가 재생 과정 중에 근육 줄기 세포의 증식을 자극하는 데 특히 필요한지 확인하기 위한 실험을 설계했다. 이 분석을 수행하기 위해, 상처 존재 근육 줄기 세포에서 발현되는 상기 기재된 pax7b:GAL4FF 라인을 사용하였다(도 7c). 이 pax7b 프로모터를 사용하여 4xUAS:NLS-Cas9 유전자삽입 라인의 발현을 구동하면 매우 효율적인 이중 gRNA 조합을 사용하여 근육 줄기 세포 특이적 ccr5 녹다운을 가능하게 할 수 있다. 이 ccr5의 근육 줄기 세포 계통 특이적 절제는 손상 영역에서 일시적 및 거주 대식세포의 수를 변경하지 않았고, 거주 대식세포-줄기 세포 결합에 영향을 미치지 않았다(도 13h-j). 이러한 유전자 편집된 유충은 바늘 찔림 근육 손상 후 유의한 재생 결핍(도 4c-e) 및 상처 부위에서 유의한 근육 줄기 세포 증식 결핍(도 4h-i)을 나타냈다. 두 결함 모두 생식계열 ccr5 돌연변이체(도 12k-t) 및 Ccr5 활성이 화학적으로 억제된 유충(도 11r-s)에서 명백한 것들과 크기가 유사했다. 종합적으로, 이러한 데이터는 줄기 세포 증식을 유도하기 위해 근육 재생 동안 근육 줄기 세포-Ccr5 활성이 필요하다는 것을 나타낸다.
다음으로, 바늘 찔림 근육 손상 후 유생 제브라피시에 대한 외인성-NAMPT 첨가 효과를 조사하였다. 이전 연구는 분비된 NAMPT가 호중구의 아폽토시스51를 억제하고 이에 의해 염증 역학을 변경할 가능성을 입증하였기 때문에, NAMPT 보충에 대한 선천적 면역 세포 반응을 조사했다. 본 급성 손상 설정에서, 외인성 NAMPT 처리시 면역 세포 역학의 변화 또는 변경된 상처 부위의 리소좀은 관찰되지 않았다(도 14a-c). 그러나, NAMPT 보충은 상처 부위 내에서 근육 줄기 세포 증식의 매우 유의한 30.70±4.26% 증가를 초래하였다(도 4j, 도 14d). 또한, NAMPT 보충은 또한 대식세포 절제 유충의 상처 부위 증식을 구제하는 역할을 하였고, 심지어 증식을 대조군 설정에서의 반응보다 10.96±3.55% 증가시키는 작용을 했다(도 4j, 도 14d). 그러나, NAMPT는 CVC와 함께 보충되었을 때 증식 결핍을 구제하지 못했다(도 4j, 도 14d). 흥미롭게도, 표준 Ccr5 리간드인 CCL8은 상처 부위 증식 반응을 NAMPT와 유사한 수준으로 증가시킬 수 있었지만(대조군보다 평균 28.34±4.48% 높음), 손상 부위 이외의 세포 증식을 또한 대조군에 비해 43.03±4.46%만큼 증가시켰다(도 4j, 도 14d). 이는 NAMPT가 Ccr5 활성화에 의해 유발되는 일반화된 증식 반응과는 다른 상처 부위 존재 근육 줄기 세포에 대해 특정 기능을 가짐을 강조한다.
그런 다음, 본 발명자들은 외인성으로 적용된 NAMPT의 추가가 용적 근육 손실 마우스 모델, 일반적으로 내인성 줄기 세포 매개 복구 과정에 불응성인 손상 패러다임 및 충족되지 않은 임상 요구 영역의 마우스 모델에서 재생을 가속화할 수 있었는지 여부를 조사했다52. 이 분석은 외인성으로 적용된 NAMPT가 성체 손상 모델의 맥락에서 또한 작용할 수 있음을 확인하였고 생체내 뮤린 세포 배양 기반 결과를 검증했다. 놀랍게도, 피브린 단독 대조군 하이드로겔이 아닌 피브린 하이드로겔을 통한 근육 결함으로의 hrNAMPT의 전달은 상처 부위에 적용될 때 근육 구조를 완전히 회복시킬 수 있었다(도 4l-o). 평균적으로, 손상 지점에서 hrNAMPT(0.5μg)의 단일 투여량으로의 처리는 평균 근육 면적의 3.276±0.4926mm2 증가 및 평균 섬유성 면적의 34.76±9.32% 감소를 유도했다. VML 손상 모델에 NAMPT를 추가하면 증식하는 PAX7+ 위성 세포의 총 수와 비율 모두에서 상당한 증가(도 4p-r, 도 14e) 및 중심 유핵화된 드 노보 근육 섬유의 수의 유의한 증가(도 4s-t)를 초래하지만, 재생물의 면역 세포 프로파일에 대한 임의의 유의한 변경을 유도하지 않고 그렇게한다(도 14h-i). 상처내의 혈관신생은 VML 손상에서 다른 재생 촉진 접근법에 대해 기재된 것과 유사한 수준에서 발생하였고52 ,53(확장 데이터 도 14f-g), 혈관신생은 단순히 NAMPT 치료 손상에서 명백한 재생 수준으로 확장된다는 것을 시사한다. 그러나, 혈관신생을 자극하는 데 있어서 NAMPT와 CCR5의 더 지시된 작용 방식은, 특히 이들 두 단백질이 이전에 다수의 상이한 맥락에서 내피 세포 증식을 유도하는 것으로 나타났다는 점을 감안할 때54 -56, 공식적으로 배제할 수 없다. 종합적으로, 이러한 발견은 외인성으로 공급된 NAMPT 단백질이 본 발명자들이 제브라피시 유충에 대해 상기 기재한 결과와 유사한 방식으로 성체 포유류 근육의 급성 손상의 맥락에서 근육 복구를 자극한다는 것을 나타낸다. 그것은 또한, 이러한 생체내 설정 모두에서 활성인 NAMPT의 분비 형태라는 발견을 강화한다.
NAMPT 단편 및 유도체
하나의 구현예에서, 이량체는 N-말단에 시스테인 잔기를 부가함으로써 형성된다(링커, 예를 들어, GGS 또는 GGS의 반복체 포함 또는 부재). 시스테인은 또한 NAMPT 서열에 자연적으로 존재하는 것일 수 있다:
CSYVVTNGLGINVFKDPVADPNKRSKKGRLSLHRTPAGNFVTLEEGKGDLEEYGQDLLHTVFKNGKVTKSYSFDEIRKNAQLNIELEAAHH
인간:
SYVVTNGLGINVFKDPVADPNKRSKKGRLSLHRTPAGNFVTLEEGKGDLEEYGQDLLHTVFKNGKVTKSYSFDEIRKNAQLNIELEAAHH
마우스:
SYVVTNGLGVNVFKDPVADPNKRSKKGRLSLHRTPAGNFVTLEEGKGDLEEYGHDLLHTVFKNGKVTKSYSFDEVRKNAQLNIEQDVAPH
NAMPT의 C-말단 단편은 근육 줄기 세포 증식을 자극한다. 상기 기재된 바와 같이, NAMPT는 세포외 환경에서 방출될 때 사이토카인으로 작용하는 큰 동종이량체 세포내 효소이다. 그러나, 사이토카인 활성을 담당하는 NAMPT 도메인은 공지되지 않는다. NAMPT의 결정 구조를 재조사하면, NAMPT C-말단의 말단 구조는 이의 크기와 구조(C-말단의 α-나선 및 β-시트)로 인해 고전적인 CCR-결합 케모카인(예: CCL2)과 매우 유사하다는 것을 결정하였다(도 9a). 또한, 도메인은 잠재적으로 수용체 결합을 촉진하는 코어 단백질 구조로부터 확장된다. 따라서, NAMPT의 C-말단은 재조합적으로 재현되었고, CCR5에 대한 NAMPT 결합과 경쟁하고 위성 세포 증식을 자극하는 이의 능력을 테스트했다. 놀랍게도, 본원에서 "사이토카인 핑거"(cif)로 지칭되는 이 단편은 CCR5에 대한 NAMPT 결합을 억제하고(IC50=21.5nM, 도 9b), 용량 의존 방식으로 위성 세포 증식을 자극하여 전장 NAMPT와 유사한 수준에서 성장을 유도한다(도 9c). 종합적으로, 이러한 데이터는 C-말단 cif 도메인이 NAMPT 근육 사이토카인 활성을 담당한다는 것을 입증한다.
임상 적용을 위한 NAMPT 사이토카인 유도체. NAMPT 유도체는 전달을 개선하고 수용체 매개 활성을 향상시키기 위해 다양한 변형으로 조작된다. 이러한 형태는 임상적으로 유용한 특성, 예를 들어, 증가된 또는 최적의 수용체 결합 친화도, 시험관내 세포 기반 증식 및 생체내 제브라피시 또는 포유류 근육 재생 검정에 대해 연속적으로 검정하였다. 조직 표적화는 다수의 투여 방식에서 명백히 큰 가치가 있으며, 표적 조직에서의 전달 및 적절한 보유를 향상시키기 위해 조직 지시된 모이어티를 포함하는 것으로 제안된다. NAMPT 또는 NAMPT 유도체는 그들의 조성 또는 작용화된 구조를 통해 조직 표적화를 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 나노담체와 같은 담체에 추가로 투여될 수 있다.
수용체 친화도를 증가시키기 위한 NAMPT 사이토카인 핑거의 이량체화 . NAMPT는 자연적으로 동종이량체이며, 공지된 CCR5 결합 케모카인은 이량체이며, 수용체 결합 친화도 및 신호전달을 조절하는 다량체(올리고머화에 의한 삼량체, 사량체 이상)를 형성할 수 있다. 하나의 구현예에서, NAMPTcif는 이량체화되어 CCR5에 대한 결합 친화도를 증가시킨다(도 9d). 하나의 접근법에서, NAMPTcif의 N-말단에 자연적으로 존재하는 단일 시스테인 잔기를 사용하여 이량체화를 강제한다. CCR5에 대한 이량체 NAMPTcif의 결합 친화도는 ELISA 및 표면 플라즈몬 공명(SPR) 검정을 사용하여 시험한다. 마우스 1차 위성 세포의 증식을 촉진하는 이량체 NAMPTcif의 활성을 시험한다. 정지 위성 세포는 생체내에서 가장 높은 자가 재생 특성을 갖는 것으로 밝혀진 위성 세포의 서브세트에 특이적인 음성 및 양성 세포 표면 마커(CD31-, CD11b-, CD45-, TER119-, Sca1-, CD34+, CD106+)에 의존하는 상기 사용된 신선한 근육으로부터 분류된다. 세포는 시험관내에서 배양되고, 이러한 1차 근육 줄기 세포의 증식을 자극하는 NAMPT 유도체의 효능이 결정된다. 이량체 및 다량체 NAMPTcif 및 기능적 유도체의 재생 능력은 기재된 제브라피시 재생 검정에서 시험된다.
ECM 및/또는 신데칸 결합 모티프의 추가는 전달을 최적화하고 CCR5의 강장성 신호전달을 증가시키는 하나의 바람직한 접근법으로 사용된다(참조: Mochizuki et al Nat. Biomed Engineering 2019)(도 14 참조). 일부 단백질은 라미닌과 같은 신데칸에 결합한다. 하나의 특정 신데칸 결합 모이어티는 서열 RKRLQVQLSIRT(SB)를 갖는 라미닌-α 쇄의 구형 도메인이다. 결합 분자의 첨가는 당업계에 공지된 바와 같이 합성 수단에 의해 또는 재조합 접근법을 사용하여 이루어질 수 있다. 예시적인 비제한적인 ECM 결합 모이어티는 RGD, 또는 YGISR, YIGSR, GFOGER, IKVAV, 및 GEFYFDLRLKGK를 포함한다.
기능 유도체를 시험하기 위한 하나의 적합한 모델은 심장독소 유도된 근육 손상의 확립된 모델이다. 심장독소는 근육의 ECM을 파괴하지 않고 근육 세포를 죽이는 근괴사제이며, NAMPT 변이체를 함유하는 ECM 결합 모티프를 시험하는 중요한 모델을 제공한다. 대부분의 줄기 세포를 온전하게 유지하기 때문에, 근육 줄기 세포 활성화를 검정하는 데 가장 일반적으로 사용되는 모델이다. 경골 전방(TA) 근육에 심장독소의 근육내 주사가 손실된 섬유의 회복에 대해 검정되는 표준 모델이 사용된다. 시험된 최종 모델은 mdx 마우스이고, 이는 또한 ARMI에서 확립되었다. mdx 모델은 만성적인 근육 섬유증과 근육 퇴행을 나타내기 때문에, mdx 모델은 NAMPT 유도체의 줄기 세포 활성화 잠재력과 그들의 항섬유화 능력을 모두 시험하는 데 사용된다. 근육 재생은 상기 기재된 표준 조직학적 검정을 사용하여 확립된 시점에서 시험된다.
위성 세포는 분화된 조직 내의 특정 해부학적 틈새를 차지하는 단능성 조직 상주 줄기 세포의 원형이다. 수십 년간의 연구는 다양한 손상에 반응하여 근육 복구를 효과적으로 조정하는 이 시스템의 뛰어난 능력을 밝혀냈다. 이 입증된 재생 능력에도 불구하고, 단리된 근육 줄기 세포의 이식은 아직 치료 효과를 제공하지 못했으며 근육 줄기 세포를 자극하는 재생 촉진 치료는 이 시점에서 완전히 결여되어 있다. 본원에 개시된 데이터는 이러한 가장 단순한 줄기 세포 시스템조차도 생체내 복구 동안 다양한 세포 맥락과 복잡한 상호작용을 필요로 하며, 선천적 면역계, 특히 대식세포가 재생 과정의 중요한 조절 인자임을 시사한다. 본원에서 입증된 것은 특정 대식세포 서브세트의 개념이며, 상처 복구 동안 존재하는 대식세포 표현형의 놀라운 복잡성 중 하나는 유사분열 자극, 특히 NAMPT/CCR5 축의 제공을 통해 근육 줄기 세포를 직접 조절하는 일시적 줄기 세포 틈새 역할을 한다(도 14j). 따라서, 여기서 식별된 신호와 같은 근육 줄기 세포 증식에 필요한 특정 대식세포 유래 신호를 제공하는 것은 더 나은 근아세포 기반 요법 결과를 달성하는 수단을 제공한다.
Figure pct00003
Figure pct00004
[표 2]
Figure pct00005
[표 3]
Figure pct00006
일부 구현예에서, Trp 잔기는 치환된다.
[표 4]
Figure pct00007
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Figure pct00009
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Figure pct00011
[보충 표 1]
Figure pct00012
[보충 표 2]
Figure pct00013
Figure pct00014
[보충 표 3a]
Figure pct00015
[보충 표 3b]
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[보충 표 3c]
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[보충 표 3d]
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[보충 표 3e]
Figure pct00019
[보충 표 3f]
Figure pct00020
[보충 표 3g]
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[보충 표 3h]
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본원에서 인용되거나 참조된 모든 문서 및 본원 인용된 문서에서 인용되거나 참조된 모든 문서는 본원 또는 본원에 참고로 포함된 임의의 문서에서 언급된 임의의 제품에 대한 임의의 제조자의 지침, 설명, 제품 사양 및 제품 시트와 함께 전체가 본원에 참고로 포함된다. 2020년 12월 17일에 출원된 호주 가출원 2020904717 및 2020년 4월 20일에 출원된 호주 가출원 2020901237의 전체 내용은 전체가 본원에 참고로 포함된다. 도면은 또한 발명자 간행물[Nature 2021 Mar;591(7849):281-287.　doi: 10.1038/s41586-021-03199-7.　Epub 2021 Feb 10]에 컬러로 명확하게 표시된다.
당업자는 본 개시내용에 비추어, 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 예시된 특정 구현예에서 다양한 변형 및 변화가 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 모든 변형 및 변화는 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함되도록 의도된다.
참고문헌
Figure pct00023
SEQUENCE LISTING <110> Monash University <120> Methods and Compositions <130> 531790PCT <150> AU 2020901237 <151> 2020-04-20 <150> AU 2020904717 <151> 2020-12-17 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 90 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Tyr Val Val Thr Asn Gly Leu Gly Ile Asn Val Phe Lys Asp Pro 1 5 10 15 Val Ala Asp Pro Asn Lys Arg Ser Lys Lys Gly Arg Leu Ser Leu His 20 25 30 Arg Thr Pro Ala Gly Asn Phe Val Thr Leu Glu Glu Gly Lys Gly Asp 35 40 45 Leu Glu Glu Tyr Gly Gln Asp Leu Leu His Thr Val Phe Lys Asn Gly 50 55 60 Lys Val Thr Lys Ser Tyr Ser Phe Asp Glu Ile Arg Lys Asn Ala Gln 65 70 75 80 Leu Asn Ile Glu Leu Glu Ala Ala His His 85 90 <210> 2 <211> 90 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Ser Tyr Val Val Thr Asn Gly Leu Gly Val Asn Val Phe Lys Asp Pro 1 5 10 15 Val Ala Asp Pro Asn Lys Arg Ser Lys Lys Gly Arg Leu Ser Leu His 20 25 30 Arg Thr Pro Ala Gly Asn Phe Val Thr Leu Glu Glu Gly Lys Gly Asp 35 40 45 Leu Glu Glu Tyr Gly His Asp Leu Leu His Thr Val Phe Lys Asn Gly 50 55 60 Lys Val Thr Lys Ser Tyr Ser Phe Asp Glu Val Arg Lys Asn Ala Gln 65 70 75 80 Leu Asn Ile Glu Gln Asp Val Ala Pro His 85 90 <210> 3 <211> 491 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Asn Pro Ala Ala Glu Ala Glu Phe Asn Ile Leu Leu Ala Thr Asp 1 5 10 15 Ser Tyr Lys Val Thr His Tyr Lys Gln Tyr Pro Pro Asn Thr Ser Lys 20 25 30 Val Tyr Ser Tyr Phe Glu Cys Arg Glu Lys Lys Thr Glu Asn Ser Lys 35 40 45 Leu Arg Lys Val Lys Tyr Glu Glu Thr Val Phe Tyr Gly Leu Gln Tyr 50 55 60 Ile Leu Asn Lys Tyr Leu Lys Gly Lys Val Val Thr Lys Glu Lys Ile 65 70 75 80 Gln Glu Ala Lys Asp Val Tyr Lys Glu His Phe Gln Asp Asp Val Phe 85 90 95 Asn Glu Lys Gly Trp Asn Tyr Ile Leu Glu Lys Tyr Asp Gly His Leu 100 105 110 Pro Ile Glu Ile Lys Ala Val Pro Glu Gly Phe Val Ile Pro Arg Gly 115 120 125 Asn Val Leu Phe Thr Val Glu Asn Thr Asp Pro Glu Cys Tyr Trp Leu 130 135 140 Thr Asn Trp Ile Glu Thr Ile Leu Val Gln Ser Trp Tyr Pro Ile Thr 145 150 155 160 Val Ala Thr Asn Ser Arg Glu Gln Lys Lys Ile Leu Ala Lys Tyr Leu 165 170 175 Leu Glu Thr Ser Gly Asn Leu Asp Gly Leu Glu Tyr Lys Leu His Asp 180 185 190 Phe Gly Tyr Arg Gly Val Ser Ser Gln Glu Thr Ala Gly Ile Gly Ala 195 200 205 Ser Ala His Leu Val Asn Phe Lys Gly Thr Asp Thr Val Ala Gly Leu 210 215 220 Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Tyr Gly Thr Lys Asp Pro Val Pro Gly Tyr 225 230 235 240 Ser Val Pro Ala Ala Glu His Ser Thr Ile Thr Ala Trp Gly Lys Asp 245 250 255 His Glu Lys Asp Ala Phe Glu His Ile Val Thr Gln Phe Ser Ser Val 260 265 270 Pro Val Ser Val Val Ser Asp Ser Tyr Asp Ile Tyr Asn Ala Cys Glu 275 280 285 Lys Ile Trp Gly Glu Asp Leu Arg His Leu Ile Val Ser Arg Ser Thr 290 295 300 Gln Ala Pro Leu Ile Ile Arg Pro Asp Ser Gly Asn Pro Leu Asp Thr 305 310 315 320 Val Leu Lys Val Leu Glu Ile Leu Gly Lys Lys Phe Pro Val Thr Glu 325 330 335 Asn Ser Lys Gly Tyr Lys Leu Leu Pro Pro Tyr Leu Arg Val Ile Gln 340 345 350 Gly Asp Gly Val Asp Ile Asn Thr Leu Gln Glu Ile Val Glu Gly Met 355 360 365 Lys Gln Lys Met Trp Ser Ile Glu Asn Ile Ala Phe Gly Ser Gly Gly 370 375 380 Gly Leu Leu Gln Lys Leu Thr Arg Asp Leu Leu Asn Cys Ser Phe Lys 385 390 395 400 Cys Ser Tyr Val Val Thr Asn Gly Leu Gly Ile Asn Val Phe Lys Asp 405 410 415 Pro Val Ala Asp Pro Asn Lys Arg Ser Lys Lys Gly Arg Leu Ser Leu 420 425 430 His Arg Thr Pro Ala Gly Asn Phe Val Thr Leu Glu Glu Gly Lys Gly 435 440 445 Asp Leu Glu Glu Tyr Gly Gln Asp Leu Leu His Thr Val Phe Lys Asn 450 455 460 Gly Lys Val Thr Lys Ser Tyr Ser Phe Asp Glu Ile Arg Lys Asn Ala 465 470 475 480 Gln Leu Asn Ile Glu Leu Glu Ala Ala His His 485 490 <210> 4 <211> 491 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Asn Ala Ala Ala Glu Ala Glu Phe Asn Ile Leu Leu Ala Thr Asp 1 5 10 15 Ser Tyr Lys Val Thr His Tyr Lys Gln Tyr Pro Pro Asn Thr Ser Lys 20 25 30 Val Tyr Ser Tyr Phe Glu Cys Arg Glu Lys Lys Thr Glu Asn Ser Lys 35 40 45 Val Arg Lys Val Lys Tyr Glu Glu Thr Val Phe Tyr Gly Leu Gln Tyr 50 55 60 Ile Leu Asn Lys Tyr Leu Lys Gly Lys Val Val Thr Lys Glu Lys Ile 65 70 75 80 Gln Glu Ala Lys Glu Val Tyr Arg Glu His Phe Gln Asp Asp Val Phe 85 90 95 Asn Glu Arg Gly Trp Asn Tyr Ile Leu Glu Lys Tyr Asp Gly His Leu 100 105 110 Pro Ile Glu Val Lys Ala Val Pro Glu Gly Ser Val Ile Pro Arg Gly 115 120 125 Asn Val Leu Phe Thr Val Glu Asn Thr Asp Pro Glu Cys Tyr Trp Leu 130 135 140 Thr Asn Trp Ile Glu Thr Ile Leu Val Gln Ser Trp Tyr Pro Ile Thr 145 150 155 160 Val Ala Thr Asn Ser Arg Glu Gln Lys Lys Ile Leu Ala Lys Tyr Leu 165 170 175 Leu Glu Thr Ser Gly Asn Leu Asp Gly Leu Glu Tyr Lys Leu His Asp 180 185 190 Phe Gly Tyr Arg Gly Val Ser Ser Gln Glu Thr Ala Gly Ile Gly Ala 195 200 205 Ser Ala His Leu Val Asn Phe Lys Gly Thr Asp Thr Val Ala Gly Ile 210 215 220 Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Tyr Gly Thr Lys Asp Pro Val Pro Gly Tyr 225 230 235 240 Ser Val Pro Ala Ala Glu His Ser Thr Ile Thr Ala Trp Gly Lys Asp 245 250 255 His Glu Lys Asp Ala Phe Glu His Ile Val Thr Gln Phe Ser Ser Val 260 265 270 Pro Val Ser Val Val Ser Asp Ser Tyr Asp Ile Tyr Asn Ala Cys Glu 275 280 285 Lys Ile Trp Gly Glu Asp Leu Arg His Leu Ile Val Ser Arg Ser Thr 290 295 300 Glu Ala Pro Leu Ile Ile Arg Pro Asp Ser Gly Asn Pro Leu Asp Thr 305 310 315 320 Val Leu Lys Val Leu Asp Ile Leu Gly Lys Lys Phe Pro Val Thr Glu 325 330 335 Asn Ser Lys Gly Tyr Lys Leu Leu Pro Pro Tyr Leu Arg Val Ile Gln 340 345 350 Gly Asp Gly Val Asp Ile Asn Thr Leu Gln Glu Ile Val Glu Gly Met 355 360 365 Lys Gln Lys Lys Trp Ser Ile Glu Asn Val Ser Phe Gly Ser Gly Gly 370 375 380 Ala Leu Leu Gln Lys Leu Thr Arg Asp Leu Leu Asn Cys Ser Phe Lys 385 390 395 400 Cys Ser Tyr Val Val Thr Asn Gly Leu Gly Val Asn Val Phe Lys Asp 405 410 415 Pro Val Ala Asp Pro Asn Lys Arg Ser Lys Lys Gly Arg Leu Ser Leu 420 425 430 His Arg Thr Pro Ala Gly Asn Phe Val Thr Leu Glu Glu Gly Lys Gly 435 440 445 Asp Leu Glu Glu Tyr Gly His Asp Leu Leu His Thr Val Phe Lys Asn 450 455 460 Gly Lys Val Thr Lys Ser Tyr Ser Phe Asp Glu Val Arg Lys Asn Ala 465 470 475 480 Gln Leu Asn Ile Glu Gln Asp Val Ala Pro His 485 490 <210> 5 <211> 91 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Cys Ser Tyr Val Val Thr Asn Gly Leu Gly Ile Asn Val Phe Lys Asp 1 5 10 15 Pro Val Ala Asp Pro Asn Lys Arg Ser Lys Lys Gly Arg Leu Ser Leu 20 25 30 His Arg Thr Pro Ala Gly Asn Phe Val Thr Leu Glu Glu Gly Lys Gly 35 40 45 Asp Leu Glu Glu Tyr Gly Gln Asp Leu Leu His Thr Val Phe Lys Asn 50 55 60 Gly Lys Val Thr Lys Ser Tyr Ser Phe Asp Glu Ile Arg Lys Asn Ala 65 70 75 80 Gln Leu Asn Ile Glu Leu Glu Ala Ala His His 85 90 <210> 6 <211> 272 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 agctatgttg taactaatgg ccttgggatt aacgtcttca aggacccagt tgctgatccc 60 aacaaaaggt ccaaaaaggg ccgattatct ttacatagga cgccagcagg gaattttgtt 120 acactggagg aaggaaaagg agaccttgag gaatatggtc aggatcttct ccatactgtc 180 ttcaagaatg gcaaggtgac aaaaagctat tcatttgatg aaataagaaa aaatgcacag 240 ctgaatattg aactggaagc agcacatcat ta 272 <210> 7 <211> 271 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 7 agctatgttg taaccaatgg ccttggggtt aatgtgttta aggacccagt tgctgatccc 60 aacaaaaggt caaaaaaggg ccggttatct ttacatagga caccagcggg gaactttgtt 120 acacttgaag aaggaaaagg agaccttgag 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taaaaaatat tatggaacga aagatcctgt tccaggctat 720 tctgttccag cagcagaaca cagtaccata acagcttggg ggaaagacca tgaaaaagat 780 gcttttgaac atattgtaac acagttttca tcagtgcctg tatctgtggt cagcgatagc 840 tatgacattt ataatgcgtg tgagaaaata tggggtgaag atctaagaca tttaatagta 900 tcgagaagta cacaggcacc actaataatc agacctgatt ctggaaaccc tcttgacact 960 gtgttaaagg ttttggagat tttaggtaag aagtttcctg ttactgagaa ctcaaagggt 1020 tacaagttgc tgccacctta tcttagagtt attcaagggg atggagtaga tattaatacc 1080 ttacaagaga ttgtagaagg catgaaacaa aaaatgtgga gtattgaaaa tattgccttc 1140 ggttctggtg gaggtttgct acagaagttg acaagagatc tcttgaattg ttccttcaag 1200 tgtagctatg ttgtaactaa tggccttggg attaacgtct tcaaggaccc agttgctgat 1260 cccaacaaaa ggtccaaaaa gggccgatta tctttacata ggacgccagc agggaatttt 1320 gttacactgg aggaaggaaa aggagacctt gaggaatatg gtcaggatct tctccatact 1380 gtcttcaaga atggcaaggt gacaaaaagc tattcatttg atgaaataag aaaaaatgca 1440 cagctgaata ttgaactgga agcagcacat catta 1475 <210> 9 <211> 1474 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 9 atgaatgctg cggcagaagc cgagttcaac atcctgctgg ccaccgactc gtacaaggtt 60 actcactata aacaataccc acccaacaca agcaaagttt attcctactt tgaatgccgt 120 gaaaagaaga cagaaaactc caaagtaagg aaggtgaaat acgaggaaac agtattttat 180 gggttgcagt acattcttaa taagtactta aaaggtaaag tagtgaccaa agagaaaatc 240 caggaggcca aagaagtgta cagagaacat ttccaagatg atgtctttaa cgaaagagga 300 tggaactaca tccttgagaa atacgatggt catctcccga ttgaagtaaa ggctgttccc 360 gagggctctg tcatccccag agggaacgtg ctgttcacag tggaaaacac agacccagag 420 tgctactggc ttaccaattg gattgagact attcttgttc agtcctggta tccaattaca 480 gtggccacaa attccagaga acagaagaga atactggcca aatatttgtt agaaacctct 540 ggtaacttag atggtctgga atacaagtta catgactctg gttacagagg agtctcttcg 600 caagagactg ctggcatagg ggcatctgct catttggtta acttaaaagg aacagatact 660 gtggcgggaa ttgctctaat taaaaaatac tatgggacaa aagatcctgt tccaggctat 720 tctgttccag cagcagagca cagtaccata acggcttggg ggaaagacca tgagaaagat 780 gcttttgaac acatagtaac acagttctca tcagtgcctg tgtctgtggt cagcgatagc 840 tatgacattt ataatgcgtg tgagaaaata tggggtgaag acctgagaca tctgatagta 900 tcgagaagta cagaggcacc actaatcatc agacctgact ctggaaatcc tcttgacact 960 gtattgaagg tcttagatat tttaggcaag aagtttcctg ttactgagaa ctcaaaaggc 1020 tacaagttgc tgccacctta tcttagagtc attcaaggag atggcgtgga tatcaatact 1080 ttacaagaga ttgtagaggg aatgaaacaa aagaagtgga gtatcgagaa tgtctccttc 1140 ggttctggtg gcgctttgct acagaagtta acccgagacc tcttgaattg ctccttcaag 1200 tgcagctatg ttgtaaccaa tggccttggg gttaatgtgt ttaaggaccc agttgctgat 1260 cccaacaaaa ggtcaaaaaa gggccggtta tctttacata ggacaccagc ggggaacttt 1320 gttacacttg aagaaggaaa aggagacctt gaggaatatg gccatgatct tctccatacg 1380 gttttcaaga atgggaaggt gacaaaaagc tactcatttg atgaagtcag aaaaaatgca 1440 cagctgaaca tcgagcagga cgtggcacct catt 1474 <210> 10 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 10 gagtatttag gtgacactat agggtttcat cgcaagagac gg 42 <210> 11 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 11 gagtaatacg actcactata ggggcggaag caccttatag cct 43 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 12 ttataaccaa gagacatgtc ggcg 24 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 13 acccagacga ccagaccatt 20

Claims (49)

  1. 근육 조직 재생(muscle tissue regeneration)을 자극하는 방법으로서, 상기 방법이 CCR5 상호작용제(interacting agent), 및 임의로 근육으로의 전달을 향상시키는 성분을 포함하거나 인코딩(encoding)하는 조성물의 유효량을 근육에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 CCR5 상호작용제가 근육 줄기 세포에 결합하고, 근아세포 증식 및 근육 재생을 자극하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CCR5 상호작용제가 CCR5 작용제(agonist)인, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 CCR5 작용제가 Mapk/Erk 신호전달 캐스케이드(signalling cascade)를 활성화하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CCR5 상호작용제가 줄기 세포를 특이적으로 활성화하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 근육 재생이 섬유증(fibrosis)이 없거나 최소 섬유증과 관련되는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 근육 조직이 시험관내, 생체내 또는 생체외인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CCR5 상호작용제가 근육 줄기 세포와의 상호작용을 위해 니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라제(NAMPT)와 경쟁하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, CCR5 상호작용제가 NAMPT 또는 사이토카인 핑거(cif) 모티프(cytokine finger (cif) motif)를 포함하는 이의 일부 또는 이의 유도체인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 CCR5 상호작용제를 발현하는 세포를 포함하는 세포 조성물인, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 세포가 대식세포(macrophage)인, 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 조성물이 줄기 세포를 추가로 포함하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중의 상기 CCR5 상호작용제가 NAMPT 또는 사이토카인 핑거(cif) 모티프를 포함하는 이의 일부 또는 이의 유도체인, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 NAMPT 또는 이의 일부 또는 유도체가 링커(linker), 안정성 또는 신호전달 향상, 전달 향상 또는 표지 모이어티(label moiety)와 같은 하나 이상의 모이어티를 포함하는, 방법.
  14. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 NAMPT 또는 일부 또는 유도체가 단량체, 이량체 또는 다량체 형태인, 방법.
  15. 제1항에 있어서, CCR5 상호작용제를 인코딩하는 상기 조성물이 CCR5 상호작용제를 발현하는 핵산 분자를 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 핵산 분자가 이의 화학적으로 변형된 형태를 포함하는 RNA 또는 DNA 또는 RNA:DNA인, 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 핵산이 바이러스 또는 비-바이러스 벡터의 형태인, 방법.
  18. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CCR5 상호작용제가 소분자인, 방법.
  19. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CCR5 상호작용제가 항체이거나 이의 CCR5 결합 부분을 포함하는, 방법.
  20. 본원 또는 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 CCR5 상호작용제를 포함하거나 인코딩하는 조성물.
  21. 다음 중 1개 또는 2개 또는 3개 또는 4개 또는 5개를 포함하는 약제학적 또는 생리학적 활성 재생 조성물:
    (i) 본원에 정의된 바와 같은 CCR5 상호작용제를 포함하거나 인코딩하는 단계,
    (ii) 위성 세포(satellite cell) 또는 이에 따른 전구체(precursor) 또는 이의 자손(progeny)
    (iii) 대식세포 또는 이에 따른 전구체 또는 이의 자손
    (iv) 스캐폴드(scaffold) 또는 기타 보유 물질(retentive material)
    (v) 조직 전달 향상 성분.
  22. 시험관내, 생체외 또는 시험관내에서 근육 재생을 자극하는 데 사용하기 위한, 본원 또는 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 CCR5 상호작용제를 포함하거나 인코딩하는 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 CCR5 상호작용제가 NAMPT, 또는 사이토카인 핑거(cif) 모티프를 포함하는 이의 C-말단 부분, 또는 이의 기능적 유도체인, 조성물.
  24. 제22항에 있어서, 인공 근육 생산(예: 직접 소비 또는 추가 가공하기 위한 어류 또는 조류 고기를 포함하는 고기)에 사용하기 위한, 조성물.
  25. 제22항에 있어서, 줄기 세포 요법에 사용하거나 줄기 세포 기반 요법의 제조 및 적용에 사용하기 위한, 조성물.
  26. 제22항에 있어서, 근육, 신경근, 또는 근골격의 결핍, 장애 또는 손상을 치료하는 데에 사용하거나, 근육 조직 재생이 섬유증과 관련되어 섬유증을 감소시키는 치료에 사용하기 위한, 조성물.
  27. 사이토카인 핑거(cif) 모티프를 포함하는 NAMPT의 C-말단 부분을 포함하는 NAMPT 폴리펩티드 단편, 또는 이의 변형된 형태, 또는 이의 기능적 유도체.
  28. 제27항에 있어서, 서열번호 1 또는 2 또는 5에 제시된 펩티드 서열, 또는 서열번호 1 또는 2 또는 5에 대해 적어도 80% 동일성(identity)을 갖는 서열을 포함하는, NAMPT 폴리펩티드 단편 또는 이의 변형된 형태 또는 기능적 유도체.
    [청구항 28]
    제27항 또는 제28항에 있어서, 링커, 안정성 향상 모이어티, 신호전달 향상 모이어티, 전달 향상 모이어티, 조직 또는 근육 보유 향상 모이어티, 및 표지 모이어티 중 하나 이상을 포함하는, NAMPT 폴리펩티드 단편.
  29. 제27항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단편이 단량체, 이량체 또는 다량체 형태인, NAMPT 단편.
  30. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 NAMPT 폴리펩티드 단편 또는 유도체, 또는 이를 인코딩하는 핵산 분자, 및 하기 중 어느 하나 이상을 포함하는 조성물:
    (i) 조직 줄기 세포 또는 이에 따른 전구체 또는 이의 자손
    (ii) 대식세포 또는 이에 따른 전구체 또는 이의 자손
    (iii) 스캐폴드 (반고체 또는 고체 지지체) 또는 보유 물질
    (iv) 조직 전달 향상 모이어티 또는 세포 보유 모이어티.
  31. 제30항에 있어서, 상기 스캐폴드 또는 보유 물질이 피브린 또는 아크릴아미드 하이드로겔과 같은 하이드로겔인, 조성물.
    [청구항 31]
    제30항 또는 제31항에 있어서; 또는 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 전달 향상 모이어티 또는 세포 보유 모이어티가 ECM 결합 모이어티인, 조성물; 또는 NAMPT 기능적 유도체.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서; 또는 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신호전달 향상 모이어티가 신데칸(syndecan) 결합 모이어티와 같은 헤파린 설페이트 결합 모이어티인, 조성물; 또는 NAMPT 기능적 유도체.
  33. 조직 재생을 자극하는 방법으로서, 상기 방법이 단리된 또는 조직 상주 조직 줄기 세포(tissue-resident tissue stem cell) 또는 이의 전구체에 CCR5 상호작용제, 및 임의로 조직으로의 전달을 향상시키는 성분을 포함하거나 인코딩하는 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 CCR5 상호작용제가 조직 줄기 세포에 결합하고, 정지(quiescent) 조직 줄기 세포 증식 및 조직 재생을 자극(활성화)하는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 CCR5 상호작용제가 CCR5 작용제인, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 CCR5 작용제가 Mapk/Erk 신호전달 캐스케이드를 활성화하는, 방법.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CCR5 상호작용제가 근육 줄기 세포와의 상호작용을 위해 니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라제(NAMPT)와 경쟁하는, 방법.
  37. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, CCR5 상호작용제가 NAMPT, 또는 사이토카인 핑거(cif) 모티프를 포함하는 이의 일부 또는 이의 유도체인, 방법.
  38. 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 CCR5 상호작용제를 발현하는 세포를 포함하는 세포 조성물인, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 세포가 대식세포인, 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 상기 조성물이 줄기 세포를 추가로 포함하는, 방법.
  41. 제33항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 중의 CCR5 상호작용제가 NAMPT, 또는 사이토카인 핑거(cif) 모티프를 포함하는 이의 일부 또는 이의 유도체인, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 NAMPT 또는 이의 일부 또는 유도체가 링커, 안정성 또는 신호전달 향상, 전달 향상 또는 표지 모이어티와 같은 하나 이상의 모이어티를 포함하는, 방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 NAMPT 또는 이의 일부 또는 유도체가 단량체, 이량체 또는 다량체 형태인, 방법.
  44. 제33항에 있어서, CCR5 상호작용제를 인코딩하는 상기 조성물이 CCR5 상호작용제를 발현하는 핵산 분자를 포함하는, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 핵산 분자가 RNA 또는 DNA 또는 RNA:DNA 또는 이들의 화학적으로 변형된 형태인, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 핵산이 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터의 형태인, 방법.
  47. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CCR5 상호작용제가 소분자인, 방법.
  48. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CCR5 상호작용제가 항체이거나 이의 CCR5 결합 부분을 포함하는, 방법.
  49. 제33항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 재생이 섬유증 없이 또는 실질적으로 섬유증 없이 발생하는, 방법.
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