KR20220165255A - Saga(spt-ada-gcn5-아세틸트랜스퍼레이스) 복합체의 파괴를 통한 cd8+ t 세포의 활성화 및 세포용해 활성을 향상시키기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
T 세포 집단에서 SAGA(Spt-Ada-Gcn5-아세틸트랜스퍼레이스) 유전자 조절 복합체의 하나 이상의 유전자 서브유닛을 저해하는 단계를 포함하는, T 세포 집단에서 T 세포 효과기 기능을 증가시키는 방법이 제공된다. 또한, 암 환자의 치료에서 이러한 T 세포 집단을 사용하는 방법이 제공된다.
Description
본 특허 출원은 2020년 4월 7일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/006,455호에 대한 우선권을 주장한다.
기술 분야
본 출원은 CD8+ T 세포의 활성화, 증식 또는 세포용해 활성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
SAGA 복합체
SAGA(Spt-Ada-Gcn5-아세틸트랜스퍼레이스) 복합체는 19개의 서브유닛을 포함하는 진화적으로 보존된 다작용성 보조 활성인자(co-activator)이다[1]. 이는 구조적 코어, 히스톤 아세틸트랜스퍼레이스(histone acetyltransferase: HAT), 히스톤 데유비퀴티네이스(histone deubiquitinase: DUB) 및 활성인자-결합 모듈을 포함하는 특유의 활성을 갖는 별도의 모듈로 구성되어 있다[2]. SAGA 및 이의 관련 복합체는 주로 2개의 염색질-변형 효소 모듈을 통한 전사 자극을 통해 그리고 단백질-암호화 유전자의 발현에서 중추적인 사건인 TATA 박스 결합 단백질(TATA box binding protein: TBP)을 전달하여 DNA 상에 개시 전 복합체의 핵을 생성함으로써 여러 가지 특유한 신호전달 경로에 관여한다[1].
단백질-암호화 유전자의 전사는 RNA 폴리머레이스 II 및 몇 가지 일반적인 전사 인자를 포함하는 개시 전 복합체(pre-initiation complex: PIC)의 형성으로 시작된다. SAGA 외에도, 또 다른 다중단백질 복합체인 전사 인자 IID(transcription factor IID: TFIID)가 TBP를 유전자 프로모터에 전달할 수 있으며, 효모에서 전체 유전자 발현에 필요하다. 최근 연구에 따르면 TFIID보다 SAGA의 역할이 더 특유한 것으로 나타났다. 예를 들어, SAGA-우세 프로모터는 컨센서스 TATA 박스를 갖는 경향이 있고, 보다 스트레스-조절되고/유도 가능한 유전자이며, 엄격하게 조절되는 경향이 있다[3]. SPT3의 결실 시, Huisinga 등의 SAGA의 TBP-상호작용 서브유닛은 효모 유전자의 대략 90%에 대해 감소되는 TFIID의 서브유닛인 TBP-관련 인자 1(TBP-associated factor 1: Taf1)에 의해 조절되는 것과 비교하여, 총 mRNA의 수준이 효모 유전자의 약 10%에 대해서만 감소되었음을 보여준다[4]. 이는 두 가지 상이한 유전자 부류: (1) Spt3에 의해 양성적으로 조절되지만 본질적으로 Taf1과는 독립적인 SAGA-우세 유전자, 및 (2) Spt3보다 Taf1에 더 의존적인 TFIID-우세 유전자의 더 큰 부류(90%) 사이의 구별을 이끌어내었다[4]. 따라서, 일반적인 모델로서, TBP 동원은 주로 TATA-함유 프로모터에서 SAGA에 의존하지만 TATA-유사(또는 TATA가 없는) 프로모터에서 TFIID에 의해 지배된다는 것이 제안되었다([2]에서 검토됨). 그럼에도 불구하고, 중앙 모듈은 구조적으로 TFIID와 관련이 있는 것으로 나타났으며, 이는 두 복합체의 TBP 결합이 일부 공통의 특징을 공유함을 시사한다.
Baptista의 최근 연구에 따르면 SAGA 고갈 시 대다수의 mRNA의 반감기가 보상적으로 증가하는 것이 관찰되었으며, 이는 다양한 SAGA 돌연변이체 균주에서의 정상-상태(steady-state) mRNA 수준의 제한된 변화를 설명한다[5]. 따라서, SAGA 고갈에 따른 Pol II 전사의 감소는 이전에 Pol II 및 매개인자의 돌연변이 또는 TFIIH의 카이네이스 활성의 저해에 대해 보고된 바와 같이 mRNA 반감기를 증가시킴으로써 보상되었다. 이들 연구는 전사 개시에서 SAGA의 중요성을 보여주며, SAGA 복합체의 구성요소가 손실될 때 보상 메커니즘을 암시한다[5].
CD8+ T 세포 활성화
CD8+ T 세포는 적응 면역계의 세포이다. 적응 면역계의 주요 특징은 특정 항원(또는 외래 병원체)에 대한 면역 반응을 행사하며 항원의 기억을 유지하는 능력이다. CD8+ T 세포는 종양 감시를 위한 면역 방어에 매우 중요할 뿐만 아니라 감염된 세포 및 종양 세포를 죽이는 세포독성제를 전달할 수도 있다[6].
활성화되고 이의 효과기 기능을 수행하기 위해, 미경험 항원 특이적 CD8+ T 세포는 최적의 활성화를 위해 두 가지 신호를 필요로 한다:
신호 1 - 항원 인식
이 신호는 면역 반응의 특이성을 보장하기 위해 T 세포 수용체(T cell receptor: TCR)와 함께 펩타이드: MHC 클래스 I 복합체 항원-보유 세포에 의한 항원 제시를 통해 전달된다. TCR은 특이성을 제공하지만 세포내 신호전달 능력은 가지고 있지 않다. 그러나, 신호 전달은 TCR과 관련된 CD3 분자를 통해 전달된다. CD3 분자는 신호를 전달하기 위해 세포질 꼬리에 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif: ITAM)를 포함한다. TCR과 이의 동족 MHC 클래스 I의 연결은 Src 패밀리 카이네이스인 Lck 및 Fyn에 의한 ITAM의 인산화를 초래한다. 인산화된 ITAM은 Lck와 Fyn으로 구성된 근위 신호전달 복합체 및 제타-관련 단백질 카이네이스 70(zeta-associated protein kinase 70: ZAP-70)이라고 하는 Syk 패밀리 카이네이스를 형성하기 위한 도킹 사이트 역할을 한다. 이들 경로를 통한 하류 신호전달은 칼슘 이온의 세포내 증가를 유발하여 궁극적으로 포스파테이스 칼시뉴린의 활성화로 이어진다. 활성화된 칼시뉴린은 전사 인자의 활성화된 T-세포의 핵-인자(nuclear-factor of activated T-cell: NFAT) 패밀리의 구성원의 탈인산화를 촉진한다. 궁극적으로, TCR의 결합은 하류 신호전달 캐스케이드를 촉발하여 궁극적으로 전사 인자 NFκB, NFAT, AP1이 핵으로 활성화되도록 수렴한다. 전체적으로, 이들은 특정 유전자 전사 프로그램을 유도하여 세포 증식 및 분화를 유도한다[7].
신호
2 - 공동 자극
TCR 신호전달을 지원하기 위해, 제2 공동 자극 신호는 T 세포의 생존 및 확장을 촉진하는 역할을 한다. T 세포에서 발견되는 정형화된 공동 자극 수용체는 대다수의 미경험 T-세포에서 구성적으로 발현되는 CD28이다. CD28의 리간드는 항원-제시 세포(antigen-presenting cell: APC)의 표면에서 발현되는 CD80 및 CD86이다. CD28은 면역학적 시냅스의 중앙 영역에서 TCR과 함께 공동 국부화되어 TCR 결찰 후 근위 신호전달 복합체에서 사건을 강화시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, TCR 신호전달과 함께, CD28은 사이토카인 생성, 세포 순환, 생존 및 분화를 촉진할 수 있다[7, 8].
CD8+ T 세포는 또한 공동 자극 신호전달을 위해 CD28 이외의 다양한 수용체를 디스플레이한다. 예정 세포사 단백질 1(Programmed cell death protein 1: PD-1) 및 세포독성 T-림프구 항원 4(cytotoxic T-lymphocyte antigen 4: CTLA-4)와 같은 다른 수용체 분자가 대신 저해성 신호를 제공할 수 있으며, 이는 활성화보다는 T-세포 저해를 촉진할 수 있다[9]. 공동 자극 및 공동 저해 수용체는 모두 T 세포 수용체(TCR) 신호전달의 기능적 결과를 결정하기 때문에 T 세포 생물학에서 필수적인 역할을 하며; 또한 항상성을 유지하는 데 중요하다[10].
일 양태에서, T 세포 집단의 T 세포에서 SAGA(Spt-Ada-Gcn5-아세틸트랜스퍼레이스) 유전자 조절 복합체의 발현 또는 기능을 저해하는 단계를 포함하는, T 세포 집단에서 T 세포 효과기 기능을 증가시키는 방법이 제공된다.
일 양태에서, T 세포 집단의 T 세포에서 SAGA 유전자 조절 복합체의 하나 이상의 유전자 서브유닛을 저해하는 단계를 포함하는, T 세포 집단에서 T 세포 효과기 기능을 증가시키는 방법이 제공된다. 하나 이상의 유전자 서브유닛은 ADA2B, CCDC101, TADA1, TAF5L, TAF6L, TAF10, SUPT7L 및 TRRAP로부터 선택될 수 있다.
일 양태에서, T 세포 집단을 생체외에서 SAGA 유전자 조절 복합체의 억제제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 치료학적 유효량의 T 세포 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 T 세포 효과기 기능을 증가시키는 방법이 제공된다. 일 실시형태에서, 대상체는 암으로 진단된 환자이다. 일부 실시형태에서, 암은 혈액학적이다. 일부 실시형태에서, 암은 백혈병, 림프종 또는 골수종이다. 일부 실시형태에서, 방법은 면역요법일 수 있는 암 요법을 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함한다. 일 실시형태에서, 방법은 면역 관문 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
위의 모든 방법에서, T 세포는 활성화된 CD8+ T 세포일 수 있다.
다양한 실시형태에서, 방법은 SAGA 유전자 조절 복합체가 저해되지 않은 T 세포 집단에 비해 T 세포에서 SAGA 유전자 조절 복합체의 활성을 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 99% 감소시킨다.
위의 방법의 일부 실시형태에서, T 세포는 키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor: CAR)를 발현한다.
다양한 실시형태에서, 억제제는 소분자; SAGA 유전자 조절 복합체의 유전자 서브유닛을 암호화하는 핵산과 혼성화하여 서브유닛의 발현을 저해할 수 있는 핵산; 및 Cas9 단백질 또는 Cas9 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 CRISPR-cas 시스템 가이드 RNA 폴리뉴클레오타이드로부터 선택될 수 있다.
또 다른 양태에서, 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하고 SAGA 유전자 조절 복합체의 하나 이상의 서브유닛의 발현 또는 기능이 저해된 변형된 T 세포가 제공된다. 또한, 복수의 이러한 변형된 T 세포를 포함하는 세포 집단이 제공된다. 또 다른 양태에서, T 세포 집단을 포함하는 암 치료 방법에서 사용하기 위한 세포 집단이 제공되되, SAGA 유전자 조절 복합체의 하나 이상의 유전자 서브유닛은 T 세포 집단에서 저해된다. 이들 세포 집단의 T 세포는 적절하게 활성화된 CD8+ T 세포이다. 하나 이상의 유전자 서브유닛은 ADA2B, CCDC101, TADA1, TAF5L, TAF6L, TAF10, SUPT7L 및 TRRAP로부터 선택될 수 있다. 다양한 실시형태에서, 이들 T 세포 집단에서 SAGA 유전자 조절 복합체의 활성은 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 99% 저해된다. 일부 실시형태에서, 억제제는 SAGA 유전자 조절 복합체의 유전자 서브유닛을 암호화하는 핵산과 혼성화하여 서브유닛의 발현을 저해할 수 있는 핵산, 또는 Cas9 단백질 또는 Cas9 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 CRISPR-cas 시스템 가이드 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
개시된 실시형태는 다음을 포함한다:
1. T 세포 집단을 포함하는 요법에서 사용하기 위한 조성물로서, SAGA(Spt-Ada-Gcn5-아세틸트랜스퍼레이스) 유전자 조절 복합체의 발현 또는 기능이 T 세포 집단에서 저해되는, 조성물.
2. T 세포 집단을 포함하는 요법에서 사용하기 위한 조성물로서, SAGA 유전자 조절 복합체의 하나 이상의 유전자 서브유닛이 T 세포 집단에서 저해되되, 바람직하게는 상기 하나 이상의 유전자 서브유닛은 ADA2B, CCDC101, TADA1, TAF5L, TAF6L, TAF10, SUPT7L 및 TRRAP로부터 선택되는, 조성물.
3. 실시형태 2에 있어서, 상기 SAGA 유전자 조절 복합체의 하나 이상의 유전자 서브유닛 중 적어도 하나는 SAGA 유전자 조절 복합체의 유전자 서브유닛을 암호화하는 핵산과 혼성화하여 서브유닛의 발현을 저해할 수 있는 핵산에 의해 저해되는, 조성물.
4. 실시형태 2에 있어서, 상기 SAGA 유전자 조절 복합체의 하나 이상의 유전자 서브유닛 중 적어도 하나는 유전자 편집 분자, 선택적으로 Cas9 단백질 또는 Cas9 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 CRISPR-cas 시스템 가이드 RNA 폴리뉴클레오타이드에 의해 저해되는, 조성물.
5. 실시형태 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 요법은 동종이계 세포 요법인, 조성물.
6. 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 T 세포는 활성화된 CD8+ T 세포인, 조성물.
7. 실시형태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 T 세포에서 SAGA 유전자 조절 복합체의 활성은 SAGA 유전자 조절 복합체가 저해된 T 세포 집단에 비해 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 99% 감소된, 조성물.
8. 실시형태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는, 조성물.
9. 실시형태 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, SAGA 유전자 조절 복합체의 하나 이상의 서브유닛의 억제제를 추가로 포함하는, 조성물.
10. 실시형태 9에 있어서, 상기 억제제는 소분자인, 조성물.
11. 실시형태 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 암(예를 들어, 백혈병, 림프종 또는 골수종)을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 조성물.
12. 실시형태 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 요법은 암 요법을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함하는, 조성물.
13. 실시형태 12에 있어서, 상기 암 요법은 바람직하게는 면역 관문 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 면역요법, 조성물.
14. T 세포 집단(바람직하게는 활성화된 CD8+ T 세포)에서 T 세포 효과기 기능을 증가시키는 방법으로서, T 세포 집단의 T 세포에서 SAGA(Spt-Ada-Gcn5-아세틸트랜스퍼레이스) 유전자 조절 복합체의 기능 및/또는 발현을 저해하는 단계를 포함하는, 방법.
15. T 세포 집단(바람직하게는 활성화된 CD8+ T 세포)에서 T 세포 효과기 기능을 증가시키는 방법으로서, SAGA 유전자 조절 복합체의 하나 이상의 유전자 서브유닛의 발현을 저해시키는 단계를 포함하며, 바람직하게는 상기 하나 이상의 유전자 서브유닛은 ADA2B, CCDC101, TADA1, TAF5L, TAF6L, TAF10, SUPT7L 및 TRRAP로부터 선택되고; 선택적으로,
상기 SAGA 유전자 조절 복합체의 하나 이상의 유전자 서브유닛 중 적어도 하나의 발현은 SAGA 유전자 조절 복합체의 유전자 서브유닛을 암호화하는 핵산과 혼성화하여 서브유닛의 발현을 저해할 수 있는 핵산에 의해 저해되고; 그리고/또는
상기 SAGA 유전자 조절 복합체의 하나 이상의 유전자 서브유닛 중 적어도 하나의 발현은 유전자 편집 분자, 선택적으로 Cas9 단백질 또는 Cas9 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 CRISPR-cas9 시스템 가이드 RNA 폴리뉴클레오타이드에 의해 저해되며; 선택적으로,
상기 T 세포 집단의 T 세포의 적어도 일부는 CAR 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하거나, 또는 상기 방법은 CAR 폴리펩타이드를 발현하도록 상기 T 세포를 조작하는 단계를 포함하는, 방법.
도 1. 실시예 1에 따른 풀링된 CRISPR 스크린은 CD8+ T 세포 증식의 음성 조절인자를 식별한다. A) CRISPR 스크린 타임라인의 개략도. B) T 세포 수용체(TCR) 자극 후 카복시플루오레세인 석신이미딜 에스터(CFSE)가 높은(저증식) 그리고 CFSE가 낮은(고증식) 세포의 분류 전략. C) CFSE가 높은(저증식) 집단에서 풍부한 sgRNA 표적을 보여주는 볼케이노 플롯. D) CFSE가 높은(저증식) 집단에서 풍부한 sgRNA 표적의 GSEA. 풍부한 유전자는 CD247, CD3D, CD3G 및 LCK이다. E) 최고 히트(top hit)(IRF4)의 검증. IRF4 유전자에 대한 2개의 sgRNA를 사용한 IRF4의 완전한 넉아웃을 보여주는 웨스턴 블롯. F) 최고 히트(IRF4)의 검증. IRF4 유전자에 대한 2개의 sgRNA를 사용한 IRF4의 넉아웃을 보여주는 유세포 분석. G) 최고 히트(IRF4)의 검증. TCR 자극 후 야생형 및 IRF4 넉아웃 T 세포의 CFSE 염색.
도 2. 실시예 2에 따른 풀링된 CRISPR 스크린은 CD8+ T 세포 활성화의 양성 및 음성 조절인자를 식별한다. A) CRISPR 스크린 타임라인의 개략도. B) 라이브러리에서 가이드에 대한 CD25가 낮은 세포에 대한 CD25가 높은 세포의 로그2 배수 변화(log2 fold-change: LFC) 값의 분포. 하단: 전체 분포를 나타내는 회색 기울기에 오버레이된 CD25가 높은 세포(어두움) 및 고갈된 유전자(밝음)가 풍부한 유전자를 표적으로 하는 4개의 sgRNA 모두에 대한 LFC. C) CD25가 높은(고활성화) 집단 및 D) CD25가 낮은(저활성화) 집단에서 풍부한 sgRNA 표적을 보여주는 볼케이노 플롯. E) CD25가 높은(고활성화) 집단 및 F) CD25가 낮은(저활성화) 집단에서 풍부한 sgRNA 표적의 유전자 온톨로지(Gene Ontology: GO) 농축 분석. G) 최고 히트의 STRING DP 네트워크 분석. H) CD25의 최고 히트와 CFSE 스크린 사이의 상관관계.
도 3. 실시예 3에 따른 풀링된 CRISPR 스크린은 CD8+ T 세포 탈과립의 양성 및 음성 조절인자를 식별한다. A) CRISPR 스크린 타임라인의 개략도. B) 라이브러리에서 가이드에 대한 CD107A가 낮은 세포에 대한 CD107A가 높은 세포의 로그2 배수 변화(LFC) 값의 분포. 하단: 전체 분포를 나타내는 회색 기울기에 오버레이된 CD107A가 높은 세포(어두움) 및 고갈된 유전자(밝음)가 풍부한 유전자를 표적으로 하는 4개의 sgRNA 모두에 대한 LFC. C) CD107A가 높은(고활성화) 집단 및 D) CD107A가 낮은(저활성화) 집단에서 풍부한 sgRNA 표적을 보여주는 볼케이노 플롯. E) CD107A가 높은(고활성화) 집단 및 F) CD107A가 낮은(저활성화) 집단에서 풍부한 sgRNA 표적의 GO 농축 분석. G) 최고 히트의 STRING DP 네트워크 분석. H) CD107A의 최고 히트와 CFSE 스크린 사이의 상관관계.
도 4. CRISPR 스크린에 사용된 렌티바이러스-RNP 전기천공 방법의 확인. 1차 인간 CD8+ T 세포에서 후보 유전자 표적인 CD45의 넉아웃에 효과적이다. Cas9가 없는 CD45 대조군은 넉아웃이 형질도입 48시간 후 Cas9와 복합체화된 CD45 표적화 가이드로 형질도입된 세포에 특이적임을 보여주었다.
도 5. SAGA CRISPR 스크린 결과의 요약. A) CRISPR 스크린에서 발견된 SAGA 복합체 구성요소. B) 모든 CRIPSR 스크린 간에 중첩되는 표적. C) 전체 분포를 나타내는 회색 기울기에 오버레이된 CFSE CRISPR 스크린에서 SAGA 복합체(색이 있는 선은 SAGA 복합체의 모듈에 해당함)의 구성 요소를 표적으로 하는 모든 sgRNA에 대한 LFC. 최상위의 표적은 TADA2B, TAF6L, TADA1이다. D) 전체 분포를 나타내는 회색 기울기에 오버레이된 CD25 CRISPR 스크린에서 SAGA 복합체(색이 있는 선은 SAGA 복합체의 모듈에 해당함)의 구성요소를 표적으로 하는 모든 sgRNA에 대한 LFC. 최상위의 표적은 TADA2B, SUPT7L, TAF10, TAF6L, TADA1이다. E) 전체 분포를 나타내는 회색 기울기에 오버레이된 CD107A CRISPR 스크린에서 SAGA 복합체(색이 있는 선은 SAGA 복합체의 모듈에 해당함)의 구성요소를 표적으로 하는 모든 sgRNA에 대한 LFC. 최상위의 표적은 SGF29(또는 CCDC101), TADA3, TADA2B, SUPT7L, TAF10, TAF6L, TADA1, TAD5L, TRRAP, USP22이다.
도 6. CD25 CRISPR 스크린 I의 검증. A) TCR 자극 후 CD25가 높은(저활성화) 세포 및 CD25가 낮은(고활성화) 세포의 분류 전략. B) CD25가 낮은 집단에서 최고 히트로서 CD25(IL2RA)를 보여주는 볼케이노 플롯. C) TCR 자극 후 CD25 발현을 감소시키는 IRF4 넉아웃 CD8 T 세포의 검증. D) SAGA 표적 넉아웃 후 제7일에 측정된 바와 같이 TCR 자극 후 CD25 발현(및 MFI)을 증가시키는 SAGA 복합체의 구성요소의 초기 검증. E) CD8 T 세포에서 CD25, CD69 및 HLA-DR을 측정하기 위한 SAGA 표적 검증을 위한 최적화된 타임라인의 개략도. F) 대조군에 비해 SAGA 표적 넉아웃을 갖는 CD8 T 세포에서 CD25, CD69 및 HLA-DR의 배수 변화 발현(N=2, 2개의 상이한 생물학적 샘플, 평균 ± SEM). 휴지기에서 24시간 동안 재자극.
도 7. CD107A CRISPR 스크린의 검증. A) TCR 자극 후 CD107A가 높은(저활성화) 세포 및 CD107A가 낮은(고활성화) 세포의 분류 전략. B) 표적 넉아웃 후 제5일에 측정된 바와 같이 TCR 자극 후 CD107A 발현을 증가시키는 SAGA 복합체의 구성요소의 초기 검증을 위한 게이팅 전략. C) CD8 T 세포에서 CD107a, 그랜자임 B(GZMB) 및 퍼포린(PRF1)을 측정하기 위한 SAGA 표적 검증을 위한 최적화된 타임라인의 개략도. D) 대조군에 비해 SAGA 표적 넉아웃을 갖는 CD8 T 세포에서 CD107a, 그랜자임 B(GZMB) 및 퍼포린(PRF1)의 배수 변화 발현(N=2, 2개의 상이한 생물학적 샘플, 평균 ± SEM).
도 8. SAGA 표적 넉아웃과 다중화된 항원 특이적 CD8 T 세포에 의한 표적 살해 가능성의 검증.
A) USP22 유전자 넉아웃(SAGA 표적) 및 CBLB 유전자 넉아웃(양성 대조군)을 갖는 CD8+ T 세포에 의한 표적 세포 살해의 루시퍼레이스 발광 측정(N=3, 단일 생물학적 샘플, 평균 ± SEM).
B) CD8+ T 세포에서 USP22 유전자 넉아웃 시 증가된 수준의 H2BK120-ub를 나타내는 웨스턴 블롯을 통한 기능적 검증(N=2, 2개의 상이한 생물학적 샘플).
도 2. 실시예 2에 따른 풀링된 CRISPR 스크린은 CD8+ T 세포 활성화의 양성 및 음성 조절인자를 식별한다. A) CRISPR 스크린 타임라인의 개략도. B) 라이브러리에서 가이드에 대한 CD25가 낮은 세포에 대한 CD25가 높은 세포의 로그2 배수 변화(log2 fold-change: LFC) 값의 분포. 하단: 전체 분포를 나타내는 회색 기울기에 오버레이된 CD25가 높은 세포(어두움) 및 고갈된 유전자(밝음)가 풍부한 유전자를 표적으로 하는 4개의 sgRNA 모두에 대한 LFC. C) CD25가 높은(고활성화) 집단 및 D) CD25가 낮은(저활성화) 집단에서 풍부한 sgRNA 표적을 보여주는 볼케이노 플롯. E) CD25가 높은(고활성화) 집단 및 F) CD25가 낮은(저활성화) 집단에서 풍부한 sgRNA 표적의 유전자 온톨로지(Gene Ontology: GO) 농축 분석. G) 최고 히트의 STRING DP 네트워크 분석. H) CD25의 최고 히트와 CFSE 스크린 사이의 상관관계.
도 3. 실시예 3에 따른 풀링된 CRISPR 스크린은 CD8+ T 세포 탈과립의 양성 및 음성 조절인자를 식별한다. A) CRISPR 스크린 타임라인의 개략도. B) 라이브러리에서 가이드에 대한 CD107A가 낮은 세포에 대한 CD107A가 높은 세포의 로그2 배수 변화(LFC) 값의 분포. 하단: 전체 분포를 나타내는 회색 기울기에 오버레이된 CD107A가 높은 세포(어두움) 및 고갈된 유전자(밝음)가 풍부한 유전자를 표적으로 하는 4개의 sgRNA 모두에 대한 LFC. C) CD107A가 높은(고활성화) 집단 및 D) CD107A가 낮은(저활성화) 집단에서 풍부한 sgRNA 표적을 보여주는 볼케이노 플롯. E) CD107A가 높은(고활성화) 집단 및 F) CD107A가 낮은(저활성화) 집단에서 풍부한 sgRNA 표적의 GO 농축 분석. G) 최고 히트의 STRING DP 네트워크 분석. H) CD107A의 최고 히트와 CFSE 스크린 사이의 상관관계.
도 4. CRISPR 스크린에 사용된 렌티바이러스-RNP 전기천공 방법의 확인. 1차 인간 CD8+ T 세포에서 후보 유전자 표적인 CD45의 넉아웃에 효과적이다. Cas9가 없는 CD45 대조군은 넉아웃이 형질도입 48시간 후 Cas9와 복합체화된 CD45 표적화 가이드로 형질도입된 세포에 특이적임을 보여주었다.
도 5. SAGA CRISPR 스크린 결과의 요약. A) CRISPR 스크린에서 발견된 SAGA 복합체 구성요소. B) 모든 CRIPSR 스크린 간에 중첩되는 표적. C) 전체 분포를 나타내는 회색 기울기에 오버레이된 CFSE CRISPR 스크린에서 SAGA 복합체(색이 있는 선은 SAGA 복합체의 모듈에 해당함)의 구성 요소를 표적으로 하는 모든 sgRNA에 대한 LFC. 최상위의 표적은 TADA2B, TAF6L, TADA1이다. D) 전체 분포를 나타내는 회색 기울기에 오버레이된 CD25 CRISPR 스크린에서 SAGA 복합체(색이 있는 선은 SAGA 복합체의 모듈에 해당함)의 구성요소를 표적으로 하는 모든 sgRNA에 대한 LFC. 최상위의 표적은 TADA2B, SUPT7L, TAF10, TAF6L, TADA1이다. E) 전체 분포를 나타내는 회색 기울기에 오버레이된 CD107A CRISPR 스크린에서 SAGA 복합체(색이 있는 선은 SAGA 복합체의 모듈에 해당함)의 구성요소를 표적으로 하는 모든 sgRNA에 대한 LFC. 최상위의 표적은 SGF29(또는 CCDC101), TADA3, TADA2B, SUPT7L, TAF10, TAF6L, TADA1, TAD5L, TRRAP, USP22이다.
도 6. CD25 CRISPR 스크린 I의 검증. A) TCR 자극 후 CD25가 높은(저활성화) 세포 및 CD25가 낮은(고활성화) 세포의 분류 전략. B) CD25가 낮은 집단에서 최고 히트로서 CD25(IL2RA)를 보여주는 볼케이노 플롯. C) TCR 자극 후 CD25 발현을 감소시키는 IRF4 넉아웃 CD8 T 세포의 검증. D) SAGA 표적 넉아웃 후 제7일에 측정된 바와 같이 TCR 자극 후 CD25 발현(및 MFI)을 증가시키는 SAGA 복합체의 구성요소의 초기 검증. E) CD8 T 세포에서 CD25, CD69 및 HLA-DR을 측정하기 위한 SAGA 표적 검증을 위한 최적화된 타임라인의 개략도. F) 대조군에 비해 SAGA 표적 넉아웃을 갖는 CD8 T 세포에서 CD25, CD69 및 HLA-DR의 배수 변화 발현(N=2, 2개의 상이한 생물학적 샘플, 평균 ± SEM). 휴지기에서 24시간 동안 재자극.
도 7. CD107A CRISPR 스크린의 검증. A) TCR 자극 후 CD107A가 높은(저활성화) 세포 및 CD107A가 낮은(고활성화) 세포의 분류 전략. B) 표적 넉아웃 후 제5일에 측정된 바와 같이 TCR 자극 후 CD107A 발현을 증가시키는 SAGA 복합체의 구성요소의 초기 검증을 위한 게이팅 전략. C) CD8 T 세포에서 CD107a, 그랜자임 B(GZMB) 및 퍼포린(PRF1)을 측정하기 위한 SAGA 표적 검증을 위한 최적화된 타임라인의 개략도. D) 대조군에 비해 SAGA 표적 넉아웃을 갖는 CD8 T 세포에서 CD107a, 그랜자임 B(GZMB) 및 퍼포린(PRF1)의 배수 변화 발현(N=2, 2개의 상이한 생물학적 샘플, 평균 ± SEM).
도 8. SAGA 표적 넉아웃과 다중화된 항원 특이적 CD8 T 세포에 의한 표적 살해 가능성의 검증.
A) USP22 유전자 넉아웃(SAGA 표적) 및 CBLB 유전자 넉아웃(양성 대조군)을 갖는 CD8+ T 세포에 의한 표적 세포 살해의 루시퍼레이스 발광 측정(N=3, 단일 생물학적 샘플, 평균 ± SEM).
B) CD8+ T 세포에서 USP22 유전자 넉아웃 시 증가된 수준의 H2BK120-ub를 나타내는 웨스턴 블롯을 통한 기능적 검증(N=2, 2개의 상이한 생물학적 샘플).
암에서, 항원 특이적 CD8+ 세포는 종양 항원에 의해 활성화되고, 증식하며 암세포에 항-종양 효과를 발휘하는 효과기 기능을 얻는다. 세포독성 표현형을 갖는 종양-침윤 림프구(Tumour-infiltrating lymphocyte: TIL)는 환자로부터의 다양한 암 조직에서 발견되며, 투여된 요법의 유형에 관계없이 더 나은 생존과 상관관계가 있다[11]. 효과기 사이토카인은 이러한 항-종양 효과를 매개하며, 면역감시 및 종양 제거에 중요하다.
면역 세포에서 SAGA 복합체의 역할은 잘 연구되지 않았다. 최근에, SAGA 복합체의 소정의 모듈을 특성화하는 몇 가지 연구가 있었다. 예를 들어, Zhang 등은 SAGA 복합체의 히스톤 데유비퀴티네이스(DUB) 모듈의 구성요소 중 하나인 유비퀴틴-특이적 펩티데이스 22(USP22)가 초기 발달 단계 1 동안 iNKT 세포에서 고도로 발현되었으며, USP22 결핍이 iNKT 세포 발달 동안 단계 1에서 단계 2로의 전환을 세포 고유의 방식으로 차단함을 발견하였다[12]. 메커니즘적으로, USP22는 iNKT 세포 발달에 관여하는 전사 보조 활성인자인 매개인자 복합체 서브유닛 1(Mediator complex subunit 1: MED1)과 상호작용하여 히스톤 H2A 단일유비퀴틴화의 탈유비퀴틴화를 통해 IL-2Rβ 및 T-bet 유전자 발현에 대한 MED1 기능을 향상시킨다. 보다 최근에, 보고에 따르면 마우스 조절 T 세포 기능에서 SAGA 복합체의 역할을 알 수 없었다.
게놈 전체(게놈 wide) 풀링된 CRISPR 스크린을 사용하여, San Loo 등은 HAT 모듈의 Ccdc101, Tada2b, 및 DUB 모듈의 Tada3, Usp22 및 코어 구조적 모듈로부터의 Tada1, Taf6l, Supt5 및 Supt20을 포함하여 다양한 SAGA 복합체의 구성요소를 양성 Foxp3 조절인자로 식별하였다[13]. 유사하게는, Cortez 등은 Usp22, Atxn7l3을 포함하여 Foxp3의 유사한 SAGA 조절인자를 발견하였다[14]. 이러한 결과는 조절 면역 세포 및 이의 기능을 조절하는 SAGA 복합체의 중요한 역할을 나타내지만, 다른 T 세포 집단에서 SAGA의 역할 및 이것이 어떻게 발생하는지에 대한 메커니즘은 확립되지 않았다.
인간 SAGA 복합체의 유전자 서브유닛 및 이의 서열은 당업계에 공지되어 있으며(예를 들어, HUGO 유전자 명명 위원회의 관련 항목을 참조), 아탁신 7(ATXN7); 아탁신 7 유사 3(ATXN7L3); ENY2 전사 및 보고 복합체 2 서브유닛(ENY2); 라이신 아세틸트랜스퍼레이스 2A(KAT2A); 라이신 아세틸트랜스퍼레이스 2B(KAT2B); SAGA 복합체 관련 인자 29(SGF29); SPT3 상동체, SAGA 및 STAGA 복합체 구성요소(SUPT3H); SPT7 유사, STAGA 복합체 서브유닛 감마(SUPT7L); SPT20 상동체, SAGA 복합체 구성요소(SUPT20H); 전사 어댑터 1(TADA1); 전사 어댑터 2B(TADA2B); 전사 어댑터 3(TADA3); TATA-박스 결합 단백질 관련 인자 5 유사(TAF5L); TATA-박스 결합 단백질 관련 인자 6 유사(TAF6L); TATA-박스 결합 단백질 관련 인자 10(TAF10); TATA-박스 결합 단백질 관련 인자 12(TAF12); 형질전환/전사 도메인 관련 단백질(TRRAP); 유비퀴틴 특정 펩티데이스 22(USP22)를 포함한다. 아미노산 및 암호화 뉴클레오타이드 서열은 또한 NCBI 웹사이트(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)를 통해 이용 가능한 국립 생명공학정보센터(National Center for Biotechnology Information: NCBI) CCDS 데이터베이스를 통해 당업자가 이용할 수도 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 유전자 서브유닛 TADA2B(ADA2B), SGF29(CCDC101), TADA1, TAF5L, TAF6L, TAF10, SUPT7L 및 TRRAP 중 하나 이상을 저해하는 단계를 포함한다.
하기 실시예는 SAGA 복합체가 TCR 자극 후 인간 CD8+ T 세포 증식, 활성화 및 세포용해 가능성을 조절하는 데 중요한 역할을 한다는 증거를 제공한다. 구조적 코어, 히스톤 아세틸트랜스퍼레이스(HAT), 히스톤 데유비퀴티네이스(DUB) 및 활성인자-결합 모듈을 포함한 다양한 SAGA 복합체의 구성요소의 넉아웃은 CD8+ T 세포 증식, 활성화 및 활성 탈과립을 증가시켰다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "T 세포 효과기 기능을 증가시키는"은 T 세포 집단의 증식 증가, T 세포 집단에 의한 세포독성 분자(예를 들어, 퍼포린, 그랜자임, 그래눌리신, Fas 리간드) 또는 사이토카인(예를 들어, TNF-α 및 IFN-γ)의 발현 및/또는 배출의 증가를 포함할 수 있는, 표적 세포를 인식하고/하거나 표적 세포에 대해 증가된 세포독성 효과를 갖는 T 세포 집단의 능력을 향상시키는 것을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "대상체"는 포유동물을 비롯한 동물계의 모든 구성원을 포함하며, 특히 인간을 포함한다.
일부 실시형태에서, 대상체는 암을 진단받았다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "암"은 분화의 상실, 성장 속도의 증가, 주변 조직의 침범을 동반한 특징적인 역형성(anaplasia)을 겪으며 전이가 가능한 악성 신생물을 의미할 수 있다. 전이성 암은 전이성 암이 유래되는 원래(원발성) 암의 기원 부위 이외에 신체의 하나 이상의 다른 부위에 있는 암이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "종양"은 기존 조직의 세포로부터 발생하는 염증성이 아닌 신생물 또는 조직의 비정상적인 덩어리를 지칭한다. 종양은 양성(비암성) 또는 악성(암성)일 수 있다. 종양은 고형일 수 있거나 또는 혈액학적일 수 있다.
혈액학적 종양의 예는 백혈병, 림프종, 골수종을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 고형 종양의 예는 육종 및 암종을 포함한다.
본 명세서에 제공되는 바와 같은 T 세포 효과기 기능을 증가시키는 방법은 다양한 형태의 암을 진단받은 암 환자에게 광범위하게 적용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 대상체는 방광암, 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, 식도암, 두경부암, 신장암, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 다발성 골수종, 난소암, 췌장암 또는 전립선암을 진단받았다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "치료학적 유효량"은 목적하는 치료적 결과를 달성하기 위해 필요한 특정 기간 동안 투여량에서 효과적인 양을 지칭한다. 치료학적 유효량의 약리학적 작용제는 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중 및 개체에서 목적하는 반응을 이끌어내는 약리학적 작용제의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 치료학적 유효량은 또한 약리학적 작용제의 임의의 독성 또는 유해한 효과보다 치료학적으로 유익한 효과가 더 큰 양이다.
본 명세서에서 사용되며 당업계에서 잘 이해되는 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 임상 결과를 포함하여 유익한 또는 목적하는 결과를 얻기 위한 접근을 의미한다. 유익한 또는 목적하는 임상 결과는 하나 이상의 증상 또는 병태의 완화 또는 개선, 질환의 정도의 감소, 질환의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태(예를 들어, 환자가 관해(remission) 상태를 유지함), 질환의 예방 또는 질환 확산의 예방, 질환 진행의 지연 또는 감속, 질환 상태의 개선 또는 경감, 질환의 재발 감소 및 검출 가능 여부에 관계없이 (부분적이든 또는 전체적으로든) 관해를 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다. "치료하는" 및 "치료"는 또한 치료를 받지 않은 경우 예상되는 생존과 비교하여 생존을 연장시키는 것을 의미할 수 있다.
일 실시형태에서, T 세포 집단의 T 세포에서 SAGA 유전자 조절 복합체의 하나 이상의 유전자 서브유닛을 저해하는 단계를 포함하는, T 세포 집단에서 T 세포 효과기 기능을 증가시키는 방법이 제공된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "면역요법"은 면역계에 의한 암세포의 표적화 또는 파괴를 유도하거나 또는 향상시키는 방법 및 조성물을 지칭한다. 면역요법은 면역 관문 억제제, 단일클론 항체, T-세포 요법(예를 들어, CAR-T), 종양세포 용해성(oncolytic) 바이러스 요법 및 암 백신을 포함한다.
공지된 면역 관문 억제제는 이필리무맙, 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙 및 더발루맙을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
면역 관문 차단(Immune checkpoint blockade: ICB)은 여러 유형의 암에서 개선된 임상 결과를 가져왔다. 그러나, ICB로 치료받은 대다수의 환자는 반응하지 않아 전체 반응률은 20% 내지 40%였다. 전임상 연구에 따르면 세포독성 T 세포에 비해 억제 세포의 상대적 존재비가 병용 면역요법의 효능을 결정한다는 것이 입증되었다. 또한, T-세포 염증 종양이 비-T-세포 염증 종양보다 ICB에 더 민감하기 때문에 종양-침윤 T 세포의 존재비는 면역요법에 대한 반응을 예측하는 주요 인자이다. 따라서, 면역 종양 미세환경(immune tumor microenvironment: TME)을 조절하는 전략은 면역요법에 대한 반응률을 개선하는 데 활용될 수 있는 유망한 치료 기회이다.
본 명세서에 제공된 방법의 임상 적용은 입양 세포 요법(예를 들어, 종양-침윤 림프구(TIL) 요법, 조작된 T 세포 수용체(TCR) 요법 및 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법) 분야를 포함하며, 여기서 이러한 표적은 생체외에서 인간의 1차 CD8+ T 세포에서 저해될 수 있으며, CD8+ T 세포는 암 환자의 전반적인 반응률을 개선하기 위한 수단으로서 환자에게 재도입된다. 세포 요법은 자가 또는 동종이계일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "키메라 항원 수용체(CAR)"는 면역 세포에 인공의 특이성을 이식하도록 조작된 T-세포 수용체를 지칭한다. CAR은, 예를 들어, 입양 세포 요법에서 사용하기 위해 T 세포에 단일클론 항체의 특이성을 부여하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, CAR은 종양 관련 항원에 대한 세포의 특이성을 지시한다. 일부 실시형태에서, CAR은 세포내 활성화 도메인, 막관통 도메인 및 종양 관련 항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다.
이러한 표적을 저해하는 방법은 소분자, CRISPR 넉아웃 또는 RNA 간섭 넉다운과 같은 유전공학을 포함한다.
본 명세서에 제공된 방법에서 사용하기 위한 소분자 억제제는 GSK4027 및 L-Moses 억제제(KAT2A의 억제제)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 광범위 히스톤 데아세틸레이스 억제제, 트라이코스타틴 A 및 항신생물제, 피라루비신이 암세포에서 USP22 발현에 영향을 미치는 것으로 보고되었다(PMID: 31007754, PMID: 25323692). 소분자 억제제의 활성을 확인하는 방법은 당업자에게 공지되어 있을 것이며, 추가로 본 명세서에 기재되어 있다. 특히, 도 6 및 도 7에 도시되고 실시예에서 상세히 설명된 방법론을 따를 수 있다.
RNA 간섭은 이중체 구조에 존재하는 작은 리보핵산 분자를 이용함으로써 표적 유전자의 발현을 조절하는 데 사용된다. siRNA 올리고뉴클레오타이드의 세포질 전달 또는 shRNA의 바이러스 통합은 각각 유전자 발현의 일시적이고 안정적인 하향조절을 초래한다. RNAi의 메커니즘은 표적 서열과 동일한 이중-가닥 RNA(dsRNA)의 세포질 전달을 통한 숙주 mRNA의 서열-특이적 분해에 기초한다[15]. 표적 유전자 발현의 분해는 내인성 RNA-유도성 침묵 복합체(RNA-induced silencing complex: RISC)를 포함하는 효소 경로를 통해 달성된다. siRNA 이중체(가이드 가닥)의 한 가닥은 아르고노트(Argonaute: AGO) 단백질 및 이중-가닥 RNA-결합 단백질의 도움으로 RISC에 로딩된다. 그런 다음, RISC는 가이드 가닥을 상보적 mRNA 분자에 위치시키고, 후속적으로 하이브리드의 중간 근처에서 AGO에 의해 절단된다[16]. 대안적으로, 프로그래밍 가능한 RNA 표적화 효소인 Cas13d는 CRISPR RNA(cRNA)를 이용하여 표적 유전자의 발현을 조작하는 데 이용될 수 있다[17]. Cas13d는 숙주 mRNA에서 발견되는 상보적 스페이서 서열(가이드)을 포함하는 cRNA에 의해 RNA로 안내된다. 숙주 mRNA의 분해는 RNA-RNA 혼성화의 Cas13d 매개 절단에 의해 발생한다.
일부 실시형태에서, 임의의 적합한 유전자 편집 기술이 T 세포/T 세포 집단에서 SAGA 복합체의 발현을 저해하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, CRISPR-Cas 시스템은 T 세포 집단에서 SAGA 복합체의 하나 이상의 서브유닛의 발현을 저해하는 데 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 이러한 T 세포는 환자로부터 얻어진다. 당업자에게 공지된 바와 같이, CRISPR 시스템은 세포 내의 표적 뉴클레오타이드 서열에 상보성을 갖도록 설계된 가이드 서열을 포함한다. 표적 서열과 가이드 서열 사이의 혼성화는 표적 서열에 혼성화되고 하나 이상의 Cas 단백질과 복합체화된 가이드 서열의 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하며, 이는 차례로 표적 서열 내 또는 근처에서 폴리뉴클레오타이드의 하나 또는 두 가닥 모두의 절단을 야기한다. CRISPR-Cas 게놈 편집에 필요한 기능적 구성요소의 발현을 위한 벡터 시스템은 또한 당업자에게 공지되어 있으며, 상업적 공급원으로부터 구입할 수 있다. 진핵생물 세포에서의 적용을 포함하여 CRISPR-Cas 시스템에 대한 추가 설명은 WO2014/204727에서 찾을 수 있다. 뮤린 및 인간 T-세포 내를 포함하여 CRISPR-Cas 시스템의 사용에 대한 추가 설명은, 예를 들어, 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 문헌 Choi 등, Henriksson 등, Shifrut 등 및 Su 등에서 찾을 수 있다[18, 19, 20, 21].
RNP는 1차 T 세포에서 유전자를 넉아웃시키는 데 사용된다. RNP는 이전에 기재된 바와 같이 2-성분 sgRNA를 Cas9에 복합체화시킴으로써 생성된다. 간단히 말하면, crRNA 및 tracrRNA는 화학적으로 합성되고, 재조합 Cas9-NLS, D10A-NLS는 재조합적으로 생성되고 정제된다. RNP는 항-CD3/CD28 항체를 이용한 초기 T 세포 활성화 2일 후 전기천공되고, 배지 배양에서 유지된다[22].
적합한 벡터 당업자에게 공지되어 있을 것이며, 벡터는 상업적 공급원으로부터 입수 가능하고, 플라스미드 및 바이러스 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터)를 포함한다.
핵산에 대한 전달 비히클은 당업자에게 공지되어 있으며, 리포솜, 리포플렉스 또는 지질 나노입자를 포함한다.
T 세포 집단에서 SAGA 유전자 조절 복합체의 활성 감소를 평가하고 정량화하는 방법은 당업자에게 공지되어 있을 것이다.
적절하게는, 건강한 공여체로부터 단리된 T 세포는 T 세포에서 단일-표적-유전자 넉아웃을 달성하기 위해 개별 Cas9 리보핵단백질(RNP)로 전기천공된다. 단일-표적-유전자 넉아웃은 유전자 서브유닛 TADA2B(ADA2B), SGF29(CCDC101), TADA1, TAF5L, TAF6L, TAF10, SUPT7L 및 TRRAP 중 하나를 포함한다. 넉아웃의 효율성 및 수준은 야생형 대조군과 비교하여 이들 표적의 단백질 수준을 측정하기 위해 웨스턴 블로팅 및 유세포 분석(가능한 경우)을 통해 평가될 수 있다. SAGA 활성은 웨스턴 블롯에 의해 전체 H2B 유비퀴틴화 및 H3 아세틸화 수준을 측정함으로써 평가된다. 일부 실시형태에서, SAGA 유전자 조절 복합체의 활성은 본 명세서에 기재된 방법에 따라 처리된 T 세포 집단에서 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 99%까지 감소될 수 있다. 이러한 표적의 단일-표적-유전자 넉아웃은 CD25 및 CD107a 발현과 전체 T 세포 세포용해 능력을 모두 양성적으로 조절한다. 다양한 세포외 T 세포 활성화 마커의 발현뿐만 아니라 세포내 발현 및 편집된 T 세포로부터의 세포용해 단백질 및 사이토카인의 분비가 측정될 수 있다.
일부 실시형태에서, T 세포는 단일-표적-유전자 넉아웃으로 전기천공 전에 항-CD3/CD28 항체로 활성화된다. T 세포는 IL-2, IL-7 및 IL-15 사이토카인을 포함하는 배양 배지에서 확장되고 유지된다. 이는 환자에게 다시 주입하기 전에 조작된 항원-특이적 T 세포가 제조되는 과정[23]과 동의어이다.
Stadtmauer 등의 최근 연구는 다중 인간 게놈 조작이 CRISPR-Cas9를 사용하여 안전하며 실현 가능함을 보여주었다[23]. 이 연구에서, 자가 T 세포는 유전자 서열 TRAC, TRBC 및 PDCD1을 표적으로 하는 Cas9 리보핵단백질(RNP)을 사용한 CRISPR 넉아웃이었다. T 세포는 IL-7 및 IL-15가 보충된 배지에서 배양되었다. 배양 2일 후, 이들 T 세포는 항-CD3/CD28 항체-접합된 상자성 마이크로비드(라이프 테크놀로지스(Life Technologies))를 사용하여 활성화되고 확장되었다. 다음날, T 세포는 HLA-A*0201-제한된 NY-ESO-1(SLLMWITQC)-특이적 TCR을 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입되었다. 전략은 알파 및 베타 TCR 도메인 유전자(각각 TRAC 및 TRBC를 결실) 및 PD1 단백질(PDCD1을 결실)의 내인성 발현이 없는 NY-ESO-1 TCR-발현 조작된 T 세포의 제조를 가능하게 하였다.
실시예는 유전적 편집(예컨대, CRISPR)에 의해 또는 약리학적으로(소분자 억제제 또는 분해제) SAGA 복합체를 파괴하면 T 세포 효과기 기능이 증가(T 세포 집단의 증식 증가, 세포독성 분자 또는 사이토카인의 발현 및/또는 배출의 증가를 포함할 수 있음)한다는 증거이며, 본 발명은 TIL, 조작된 T 세포 수용체(TCR) 요법, CAR-T 세포, 등 이용 가능한 다른 세포 요법 접근법과 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 요법 접근법은 T 세포의 수를 늘리고(확장) 암 표적 또는 암 항원에 대한 특이성을 유도하는데 초점을 맞추지만, 이들 세포가 표적 암세포를 죽일 수 있는 가능성(살해 가능성)을 향상시키는 데 초점을 맞추지는 않는다. SAGA 복합체를 파괴함으로써 이러한 면역 세포 요법의 살해 가능성을 향상시키는 신규한 방법이 본 명세서에 제공된다.
암세포 요법을 투여하기 위한 방법 및 프로토콜은 당업자에게 공지되어 있다.
일부 실시형태에서, 암 환자에게 암 요법이 추가로 투여된다. 암 요법은 당업계에 공지되어 있으며, 수술, 화학요법, 방사선 요법, 골수 이식, 면역요법 및 호르몬 요법을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 암 환자에게 면역요법 치료제가 투여된다.
본 명세서에 참조된 모든 문서는 참조에 의해 원용되지만, 본 명세서에 참조에 의해 원용된 임의의 특허, 간행물 또는 기타 공개 자료의 전체 또는 일부는 통합된 자료가 본 개시내용에서 제시된 정의, 진술 또는 기타 공개 자료와 충돌하지 않는 범위 내에서만 통합됨을 이해하여야 한다. 이와 같이 그리고 필요한 범위 내에서, 본 명세서에 명시적으로 제시된 개시내용은 참조에 의해 본 명세서에 원용된 임의의 상충되는 자료를 대체한다.
본 발명의 이점은 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다. 본 명세서에 기재된 실시예 및 이들의 특정 세부사항은 단지 예시를 위해 제시되며 본 발명의 청구범위에 대한 제한으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
실시예 1
풀링된 CRISPR 스크린은 인간 CD8+ T 세포 증식의 음성 조절인자를 나타낸다
풀링된 CRISPR 스크린을 사용하여, 본 발명자들은 인간 CD8+ T 세포의 양성 및 음성 조절인자 및 이들의 기능적 활성을 확인하고자 하였다. 첫 번째 단계로, T 세포 수용체(TCR) 자극에 대한 반응으로 T 세포 증식을 조절하는 유전자 표적을 확인하기 위해 스크리닝을 수행하였다. 본 발명자들은 (공지된 약리학적 활성을 갖는) FDA 승인 약물, 334개의 후성적 조절인자(많은 것이 표적화 가능함) 및 TCR 신호전달 경로의 여러 표준 구성원을 사용하여 657개의 유전자를 표적으로 하는 sgRNA 플라스미드의 맞춤형 Epi-약물 CRISPR 라이브러리를 고안하였다. 도 1A를 참조하여, 건강한 인간 공여자로부터 단리된 CD8+ T 세포에 이 sgRNA 라이브러리를 암호화하는 렌티바이러스를 형질도입시키고, Cas9로 전기천공하고, 전기천공 후 10일 동안 배양물에서 유지하고, 세포 분열을 추적하기 위해 카복시플루오레세인 석신이미딜 에스터(CFSE)로 표지한 다음 TCR로 자극하였다. 도 1B를 참조하여, 세포를 FACS에 의해 2개의 집단으로 분류하였다: 비증식 세포(CFSE 높음) 및 고도로 증식하는 세포(CFSE 낮음). 도 1C 내지 도 1G에 도시된 결과를 참조하여: 예상한 바와 같이, CD3G, LCK 및 CD247과 같은 TCR 신호전달의 필수 구성요소를 표적으로 하는 sgRNA는 세포 증식을 저해하였다. CFSE가 높은 집단에서 확인된 유전자는 TCR 자극과 관련된 주석이 달린 경로로 농축하였다. 유전자 세트 농축 분석(GSEA)은 TCR 신호전달 경로에서 증식하는 세포로부터 고갈된 유전자 표적의 현저한 과잉-제시를 밝혀내었다. 또한, TCR 신호전달의 비-필수 구성요소를 표적으로 하지만 이전에 T 세포 증식에서 중요한 것으로 밝혀진 IRF4와 같은 sgRNA가 발견되었다. 최상위 음성 조절인자는 Cas9 리보핵단백질(RNP)을 사용한 개별 CRISPR 넉아웃에 의해 검증되었다. 종합하면, 이러한 결과는 이전의 증식 기반 CRISPR 스크린과 표적화된 풀링된 CRISPR 스크린의 강력한 일치를 보여주며, 이는 1차 인간 T 세포 활성화 및 기능의 양성 및 음성 조절인자를 발견하는 데 사용될 수 있다.
실시예 2
풀링된 CRISPR 스크린은 인간 CD8+ T 세포 활성화의 양성 및 음성 조절인자를 나타낸다
T 세포 활성화의 조절인자를 조사하기 위하여, 인간 CD8+ T 세포를 자극하고, T 세포 활성화 마커 CD25(IL2RA)에 대한 CRISPR 스크린 분류를 수행하였다(CRISPR 스크린의 개략도는 도 2A에 도시됨). 세포를 FACS에 의해 2개의 집단으로 분류하였다; 고도로 활성화된 세포(CD25 높음) 및 낮게 활성화된 세포(CD25 낮음). 도 2B 내지 도 2H에 도시된 결과를 참조하여: 예상한 바와 같이, CD25(IL2RA) 자체, CD3D, LCK, CD247 및 IRF4를 포함한 T 세포 활성화의 확립된 조절인자를 표적으로 하는 sgRNA를 확인하였다. IRF4를 Cas9 리보핵단백질(RNP)을 사용한 개별 CRISPR 넉아웃으로 검증하였으며, IRF4 넉아웃 후 CD25 발현의 큰 감소가 관찰되었다. 그런 다음, 고도로 활성화된 T 세포(CD25 높은)에서 풍부한 sgRNA를 조사하였다. 흥미롭게도, CD8+ T 세포 활성화의 음성 조절인자 중 TADA2B(HAT 모듈) 및 TADA1, TAF6L, TAF10(코어 구조 모듈)을 포함한 SAGA(Spt-Ada-Gcn5-아세틸트랜스퍼레이스) 복합체의 다양한 구성요소가 확인되었다. 또한, 유전자 온톨로지 분석은 높은 CD25 발현을 보이는 T 세포의 히스톤 아세틸트랜스퍼레이스 및 SAGA 복합체에서 유전자 표적의 현저한 과잉-제시를 밝혀내었다. 종합하면, 이러한 데이터는 CD8+ T 세포 활성화의 양성 조절인자에 관한 이전의 문헌과 일치하며, SAGA 복합체가 CD8+ T 세포 활성화를 조절하는 데 있어서 진가를 인정받지 못한 역할을 보여준다.
실시예 3
풀링된 CRISPR 스크린은 인간 CD8+ T 세포 세포용해 활성의 양성 및 음성 조절인자를 나타낸다
T 세포 활성화에 더하여, 본 발명자들은 CD8+ T 세포 세포용해 활성의 양성 및 음성 조절인자를 확인하고자 하였다(도 3). 표적 세포를 죽이기 위해 CD8+ T 세포가 사용하는 주요 경로는 그랜자임-매개성 치사 전달을 기반으로 한다. CD8+ T 세포는 T 세포와 표적 세포 사이의 면역학적 시냅스에서 그랜자임 B와 퍼포린(기공 형성 당단백질)을 포함하는 과립을 전달하여 카스페이스 및 하류 전-세포자멸사 경로를 활성화하여 DNA 단편화 및 막 완전성의 급속한 손실을 초래한다[24]. T 세포 세포용해 활성의 중요성으로 인해, TCR 자극 후 그랜자임 B가 높은 집단 및 그랜자임 B가 낮은 집단을 분류하는 FACS를 초기에 테스트하였다. 그러나, 세포내 염색 동안 고정 과정으로 인해, 분류된 집단으로부터 양질의 게놈 DNA 수율 및 순도를 유지할 수 없었다. 세포용해 활성의 대체물로서, 본 발명자들은 활성 탈과립 동안 발현된 세포 표면 마커인 CD107a로 TCR 자극된 세포를 염색하였다[25]. 이 CRISPR 스크린 타임라인의 개략도는 도 3A에 도시되어 있다. 세포를 FACS로 2개의 집단으로 분류하였다; 활성 탈과립 세포(CD107a 높음) 및 비-탈과립 세포(CD107a 낮음). 도 3B 내지 도 3H에 도시된 결과를 참조하여: CFSE CRISPR 스크린으로 관찰된 바와 같이, CD3D, LCK, CD247 및 CD3G를 포함하여 T 세포 신호전달의 확립된 조절인자를 표적으로 하는 sgRNA가 확인되었다. 흥미롭게도, 한 가지 예외는 IRF4로, 이는 CD8+ T 세포 증식 및 활성화에 중요한 역할을 하였지만 제한된 탈과립을 보였다. 본 발명자들은 Cas9 리보핵단백질(RNP)로 IRF4 개별 CRISPR 넉아웃을 검증하고, IRF4 넉아웃 후 그랜자임 B 발현의 증가를 관찰하였다. 그런 다음, 활성 탈과립 T 세포(CD107a 높음)에서 풍부한 sgRNA를 조사하였다. 놀랍게도, CD8+ T 세포 탈과립의 음성 조절인자 중 TADA2B 및 CCDC101(HAT 모듈), TADA1, TAF5L, TAF6L, TAF10 및 SUPT7L(코어 구조 모듈) 및 TRRAP(TF 결합 모듈)를 포함하여 SAGA(Spt-Ada-Gcn5-아세틸트랜스퍼레이스) 복합체의 구성요소가 다시 확인되었다. 스크린은 Cas9 리보핵단백질(RNP)을 갖는 SAGA 복합체의 구성요소를 개별적으로 넉아웃시킴으로써 검증하였으며, CD107a 발현의 대략 2-배 증가가 관찰되었다. 또한, 유전자 온톨로지 분석은 CD107a 발현이 높은 T 세포의 히스톤 아세틸트랜스퍼레이스 및 SAGA 복합체에서 유전자 표적의 현저한 과잉-제시를 밝혀내었다. 종합하면, 이러한 데이터는 CD8+ T 세포 세포용해 활성을 조절하는 데 있어서 SAGA 복합체의 진가를 인정받지 못한 역할을 보여준다.
실시예 4
A) USP22 유전자 넉아웃(SAGA 표적) 및 CBLB 유전자 넉아웃(양성 대조군)을 갖는 NY-ESO-1-특이적 1차 CD8+ T 세포에 의한 표적 세포 살해. 도 8A에 도시된 결과를 참조하여: 생물학적 중요성을 입증하기 위해, 루시퍼레이스 발현 표적 세포(NY-ESO-1+ 흑색종 세포주 A375)를 증가하는 비율의 CBLB 유전자 넉아웃(양성 대조군) 또는 USP22 유전자 넉아웃(SAGA 표적)을 갖는 대조군 야생형 CD8+ T 세포 또는 NY-ESO-1-특이적 CD8+ T 세포와 함께 인큐베이션하였다. A375-표적 세포 살해의 수준을 결정하기 위해 발광을 측정하였다(N=3, 단일 생물학적 샘플, 평균 ± SEM). USP22의 넉아웃은 양성 대조군만큼 표적 세포 살해에 효과적이었다.
B) 1차 CD8+ T 세포에서 USP22 유전자 넉아웃의 기능적 검증. 도 8B를 참조하여, USP22의 유전자 넉아웃을 검증하기 위해 웨스턴 블로팅을 수행하였다(N=2, 2개의 상이한 생물학적 샘플). USP22의 유전자 넉아웃은 120번 라이신 잔기에서 히스톤 H2B의 유비퀴틴화를 증가시켰다.
참고 문헌
Claims (21)
- T 세포 집단에서 T 세포 효과기 기능을 증가시키는 방법으로서, 상기 T 세포 집단의 T 세포에서 SAGA(Spt-Ada-Gcn5-아세틸트랜스퍼레이스) 유전자 조절 복합체의 발현 또는 기능을 저해하는 단계를 포함하는, 방법.
- T 세포 집단에서 T 세포 효과기 기능을 증가시키는 방법으로서, 상기 T 세포 집단의 T 세포에서 SAGA(Spt-Ada-Gcn5-아세틸트랜스퍼레이스) 유전자 조절 복합체의 하나 이상의 유전자 서브유닛을 저해하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 서브유닛은 ADA2B, CCDC101, TADA1, TAF5L, TAF6L, TAF10, SUPT7L 및 TRRAP로부터 선택되는, 방법.
- 대상체에서 T 세포 효과기 기능을 증가시키는 방법으로서, T 세포 집단을 생체외에서 SAGA 유전자 조절 복합체의 억제제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 치료학적 유효량의 상기 T 세포 집단을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 대상체는 암으로 진단된 환자인, 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 방법은 암 요법을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 암 요법은 면역요법인, 방법.
- 제7항에 있어서, 면역 관문 억제제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포는 활성화된 CD8+ T 세포인, 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 SAGA 유전자 조절 복합체가 저해된 T 세포 집단에 비해 상기 T 세포에서 상기 SAGA 유전자 조절 복합체의 활성을 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 99% 감소시키는, 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포는 키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor: CAR)를 발현하는, 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제제는 소분자인, 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제제는 상기 SAGA 유전자 조절 복합체의 유전자 서브유닛을 암호화하는 핵산과 혼성화하여 서브유닛의 발현을 저해할 수 있는 핵산을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제제는 Cas9 단백질 또는 상기 Cas9 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 CRISPR-cas 시스템 가이드 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
- 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 변형된 T 세포로서, SAGA(Spt-Ada-Gcn5-아세틸트랜스퍼레이스) 유전자 조절 복합체의 하나 이상의 서브유닛의 발현 또는 기능이 저해된, 변형된 T 세포.
- 세포 집단으로서, 복수의 제15항의 변형된 T 세포를 포함하는, 세포 집단.
- T 세포 집단을 포함하는 암 치료 방법에서 사용하기 위한 세포 집단으로서, SAGA(Spt-Ada-Gcn5-아세틸트랜스퍼레이스) 유전자 조절 복합체의 하나 이상의 유전자 서브유닛이 상기 T 세포 집단에서 저해된, 세포 집단.
- 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 T 세포는 활성화된 CD8+ T 세포인, 세포 집단.
- 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 서브유닛은 ADA2B, CCDC101, TADA1, TAF5L, TAF6L, TAF10, SUPT7L 및 TRRAP로부터 선택되는, 세포 집단.
- 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포에서 상기 SAGA 유전자 조절 복합체의 활성은 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 99% 저해되는, 세포 집단.
- 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제제는 SAGA 유전자 조절 복합체의 유전자 서브유닛을 암호화하는 핵산과 혼성화하여 서브유닛의 발현을 저해할 수 있는 핵산 또는 Cas9 단백질 또는 상기 Cas9 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 CRISPR-cas9 시스템 가이드 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 세포 집단.
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