KR20220162881A - 안구 혈관신생을 저하시키기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

안구 혈관신생을 저하시키기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 항-VEGF 작용제를 코딩하는 핵산 서열을 갖는 rAAV 벡터를 포함하는 제약 조성물을 특정 대상체에게 투여함으로서, 이러한 대상체에서 안구 혈관신생, 예컨대 AMD를 예방 또는 치료하기 위한 제약 조성물 및 그의 방법을 제공한다.

Description

안구 혈관신생을 저하시키기 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR REDUCING OCULAR NEOVASCULARIZATION}
상호 참조
본 출원은 2016년 6월 16일에 출원된 미국 가출원 번호 62/351,231을 우선권 주장하며, 이 가출원의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
혈관 내피 성장 인자 (VEGF)는 맥관형성 및 혈관형성을 자극하는 세포에 의해 생산된 신호 단백질이다. VEGF는 혈액 순환이 불충분할 때 조직으로의 산소 공급을 회복시키는 시스템의 일부일 수 있다. VEGF의 정상적인 기능은 배아 발달 동안 새로운 혈관, 손상 후 새로운 혈관, 운동 후 근육, 및 막힌 혈관을 우회하는 새로운 혈관을 생성할 수 있다.
VEGF의 과다발현은 포유류에서 다양한 질환 상태 및 병태의 원인일 수 있다. 특정 암에서의 VEGF의 발현은 암세포가 성장하고 전이하도록 허용할 수 있다. VEGF의 과다발현은 눈의 망막 및 신체의 다른 부분에서 혈관 질환을 유발할 수 있다.
VEGF 및 VEGF 수용체 (VEGFR)는 맥락막 혈관신생 (CNV) 및 연령 관련 황반 변성의 발병을 포함한 수많은 질환에 연루되어 있다. VEGF 및/또는 VEGFR 활성과 연관된 눈 질환 또는 병태의 예는 신생혈관 (습성) 연령 관련 황반 변성 (AMD), 망막 정맥 폐색증 (RVO) 후 황반 부종, 당뇨병성 황반 부종 (DME), DME 환자에서의 당뇨병성 망막병증 (DR), 허혈성 망막병증, 안구내 혈관신생, 건성 AMD, 망막 혈관신생, 당뇨병성 망막 허혈, 당뇨병성 망막 부종, 증식성 당뇨병성 망막병증, 망막 중심 정맥 폐색증, 및 망막 정맥 분지 폐색증을 포함한다.
일부 단백질-기반 또는 항체-기반 주사 요법, 예를 들어, 라니비주맙(ranibizumab) 및 베바시주맙(bevacizumab)이 AMD의 치료에 이용 가능하긴 하지만, 항-VEGF 작용제를 눈에 전달하는 유전자 요법 방법은 환자에게 개선된 치료 옵션을 제공할 수 있는데, 이는 유전자 요법이 일부 환자에서 염증, 감염 및 다른 부작용의 위험을 증가시킬 수 있는 반복적인 주사를 필요로 하지 않으면서도 생체 내에서 치료제의 연장되거나 또는 지속된 방출을 제공할 수 있기 때문이다. 부가적으로, 유전자 요법은 반복적인 주사가 필요하지 않음으로써, 반복적인 주사가 필요한 요법과 연관된 환자의 순응 및 처방 준수 문제 (준수하지 않으면 시력 상실 및 눈 질환 또는 병태의 악화를 초래할 수 있다)를 해결해 준다. AMD의 영향을 가장 많이 받는 노인 환자 중에는, 투여를 위해 진료소를 반복적으로 또는 자주 방문해야 하는 치료 요법에 순응하지 않고 그 처방을 준수하지 않는 비율이 더 높다. 따라서 유전자 요법을 통해 치료제를 환자의 눈에 전달하는 것이 환자에게 보다 안전하고, 잠재적으로 더 비용 효율적이며, 보다 편리한 치료 옵션을 제공할 수 있고, 비-순응 및 비-처방 준수 문제를 해결함으로써 환자 성과를 개선시킬 수 있다.
본 개시내용은 항-VEGF 작용제, 예컨대 sFlt-1, 라니비주맙, 또는 베바시주맙을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 또는 바이러스 입자의 제약상 유효량을 포함하는 제약 조성물을 망막 하로 또는 유리체 내로 투여함으로써 대상체 (예를 들어, 인간 대상체)에서 안구 혈관신생, 예컨대 AMD 및 CNV를 예방 또는 치료하기 위한 제약 조성물 및 방법에 관한 것이다.
일부 측면에서, 본원에는 눈 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 개시되며, 이러한 방법은 제약 현탁액의 단위 용량을 눈에 주사함으로써 영장류 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 제약 현탁액의 단위 용량은 AAV2 내의 캡시드 단백질 VP1의 아미노산 570-611에 상응하는 위치에 LGETTRP, NETITRP, KAGQANN, KDPKTTN, KDTDTTR, RAGGSVG, AVDTTKF, 및 STGKVPN으로부터 선택된 아미노산 서열의 삽입을 포함하는 변이체 캡시드 단백질; 및 항-혈관 내피 성장 인자 (항-VEGF) 폴리펩티드를 코딩하는 이종 서열을 갖는 rAAV의 1E12 내지 1E13 벡터 게놈을 포함한다. 일부 경우에, 단위 용량은 2E12 내지 6E12 벡터 게놈을 포함한다. 일부 경우에, 대상체는 비-인간 영장류이다. 일부 경우에, 대상체는 인간이다. 일부 경우에, 눈 병태 또는 질환은 신생혈관 (습성) 연령 관련 황반 변성 (AMD), 망막 정맥 폐색증 후 황반 부종, 당뇨병성 황반 부종 (DME), 망막 정맥 폐색증, 또는 DME와 연관된 당뇨병성 망막병증이다. 일부 경우에, 눈 병태 또는 질환은 맥락막 혈관신생 또는 AMD이다. 일부 경우에, 상기 현탁액을 투여하면, 컬러 안저 촬영에 의해 측정된 바와 같이, 등급 IV 병변의 백분율이 비히클 대조군과 비교 시 적어도 5%만큼 저하된다. 일부 경우에, 등급 IV 병변의 백분율에 있어서의 저하는 적어도 10%이다. 일부 경우에, 단위 용량은 100 μL 이하인 용적을 포함한다. 일부 경우에, 단위 용량은 50 μL 이하인 용적을 포함한다. 일부 경우에, 삽입은 AAV2 내의 아미노산 587과 588 사이의 위치에서의 LGETTRP이다. 일부 경우에, 대상체는 라니비주맙, 베바시주맙, 및 sVEGFR-1 중 적어도 하나에 반응한다. 일부 경우에, 대상체는 라니비주맙 또는 베바시주맙으로 미리 치료받은 적이 있다. 일부 경우에, 주사는 유리체 내이다. 일부 경우에, 주사는 망막 하이다. 일부 경우에, 주사에 의해 투여하는 것은 적어도 2년에 1회 이하 일어난다. 일부 경우에, 주사에 의해 투여하는 것은 적어도 5년에 1회 이하 일어난다. 일부 경우에, 투여하는 것은 1회 투여이다. 일부 경우에, 상기 방법은 투여 단계에 앞서 균등한 분배를 보장하기 위해 현탁액을 진탕시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 상기 방법은 투여 단계에 앞서 현탁액을 실온으로 가온시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 현탁액은 계면활성제를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 계면활성제는 폴리소르베이트, 소듐 도데실 술페이트, 소듐 라우릴 술페이트, 라우릴 디메틸 아민 옥시드, 폴리에톡실화 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비탄, 옥톡시놀, 브리즈(Brij), 플루로닉(pluronic), 및 폴리옥실 피마자유로부터 선택된다. 일부 경우에, 현탁액은 페놀, 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 상기 방법은 주사 후에 항생제 용액 또는 아트로핀 술페이트 연고를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 항생제 용액은 시프로플록사신을 포함한다. 일부 경우에, 항-VEGF 폴리펩티드는 인간화 모노클로날 항체이다. 일부 경우에, 항-VEGF 폴리펩티드는 항체 단편 또는 Fab이다. 일부 경우에, 인간화 모노클로날 항체는 라니비주맙 또는 베바시주맙이다. 일부 경우에, 항-VEGF 폴리펩티드는 VEGF 수용체 1의 가용성의 말단절단된 형태 (sVEGFR-1)이다.
다른 측면에서, 또한 본원에는 눈 병태 또는 질환을 치료하는 방법이 개시되며, 이러한 방법은 AAV2 내의 캡시드 단백질 VP1의 아미노산 570-611에 상응하는 위치에 LGETTRP, NETITRP, KAGQANN, KDPKTTN, KDTDTTR, RAGGSVG, AVDTTKF, 및 STGKVPN으로부터 선택된 아미노산 서열의 삽입을 포함하는 변이체 캡시드 단백질; 및 항-혈관 내피 성장 인자 (항-VEGF) 폴리펩티드를 코딩하는 이종 서열을 갖는 rAAV를 포함하는 현탁액 조성물을 진탕시키고; 이러한 현탁액 조성물을 주사를 통해 인간 대상체의 눈에 투여하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 삽입은 AAV2의 아미노산 587과 588 사이의 LGETTRP이다. 일부 경우에, 대상체는 라니비주맙 또는 베바시주맙으로 미리 치료받은 적이 있는 것을 특징으로 한다. 일부 경우에, 대상체는 라니비주맙 및 베바시주맙 중 적어도 하나에 반응한다. 일부 경우에, 항-VEGF 폴리펩티드는 인간화 모노클로날 항체이다. 일부 경우에, 항-VEGF 폴리펩티드는 항체 단편 또는 Fab이다. 일부 경우에, 인간화 모노클로날 항체는 라니비주맙 또는 베바시주맙이다. 일부 경우에, 항-VEGF 폴리펩티드는 VEGF 수용체 1의 가용성의 말단절단된 형태 (sVEGFR-1)이다. 일부 경우에, 대상체에게 투여된 용적은 50 μL 이하이다. 일부 경우에, 대상체에게 투여된 용적은 100 μL 이하이다. 일부 경우에, 용적은 1E12 내지 1E13 벡터 게놈의 단위 용량을 포함한다. 일부 경우에, 용적은 2E12 내지 6E12 벡터 게놈의 단위 용량을 포함한다. 일부 경우에, 투여 단계는 적어도 2년에 1회 이하 일어난다. 일부 경우에, 투여 단계는 1회 주사이다. 일부 경우에, 상기 방법은 조성물을 투여하기 전에 적어도 하나의 승인된 요법에 대한 반응성에 대하여 대상체를 검정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 승인된 요법은 라니비주맙 및 베바시주맙을 포함한다. 일부 경우에, 현탁액은 제약상 허용되는 부형제를 포함한다. 일부 경우에, 부형제는 계면활성제 또는 안정화제를 포함한다. 일부 경우에, 계면활성제는 폴리소르베이트, 소듐 도데실 술페이트, 소듐 라우릴 술페이트, 라우릴 디메틸 아민 옥시드, 폴리에톡실화 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비탄, 옥톡시놀, 브리즈, 플루로닉, 및 폴리옥실 피마자유로부터 선택된다. 일부 경우에, 제약상 허용되는 부형제는 페놀, 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 포함한다. 일부 경우에, 눈 병태 또는 질환은 신생혈관 (습성) 연령 관련 황반 변성 (AMD), 망막 정맥 폐색증 후 황반 부종, 당뇨병성 황반 부종 (DME), 망막 정맥 폐색증, 또는 DME와 연관된 당뇨병성 망막병증이다. 일부 경우에, 눈 병태 또는 질환은 맥락막 혈관신생 또는 AMD이다. 일부 경우에, 주사는 유리체 내이다. 일부 경우에, 주사는 망막 하이다. 일부 경우에, 삽입은 AAV2 내의 아미노산 587과 588 사이의 위치에서의 LGETTRP이다. 일부 경우에, 상기 방법은 투여 전에 현탁액을 실온으로 가온시키는 것을 추가로 포함한다.
다른 측면에서, 또한 본원에는 AAV2 내의 캡시드 단백질 VP1의 아미노산 570-611에 상응하는 위치에 LGETTRP, NETITRP, KAGQANN, KDPKTTN, KDTDTTR, RAGGSVG, AVDTTKF, 및 STGKVPN으로부터 선택된 아미노산 서열의 삽입을 포함하는 변이체 캡시드 단백질; 및 항-혈관 내피 성장 인자 (항-VEGF) 폴리펩티드를 코딩하는 이종 서열을 갖는 rAAV를 포함하는 현탁액의 단위 용량을 포함하는 제약 조성물이 개시된다. 일부 경우에, 단위 용량은 1E12 내지 1E13 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 단위 용량은 2E12 내지 6E12 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 현탁액은 냉장되어 있다. 일부 경우에, 키트는 제약 조성물 및 이러한 제약 조성물을 희석시키기 위한 용액을 포함한다. 일부 경우에, 이러한 용액은 완충제, 염, 알콜, 계면활성제, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 키트는 주사기를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 항-VEGF 폴리펩티드는 인간화 모노클로날 항체이다. 일부 경우에, 항-VEGF 폴리펩티드는 항체 단편 또는 Fab이다. 일부 경우에, 인간화 모노클로날 항체는 라니비주맙 또는 베바시주맙이다. 일부 경우에, 항-VEGF 폴리펩티드는 VEGF 수용체 1의 가용성의 말단절단된 형태 (sVEGFR-1)이다. 일부 경우에, 삽입은 AAV2 내의 아미노산 587과 588 사이의 위치에서의 LGETTRP이다.
참조로 포함됨
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허, 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되도록 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 신규 특징은 첨부된 청구범위에서 상세하게 제시된다. 본 발명의 특징 및 이점의 더 나은 이해는 본 발명의 원리가 활용되는 예시적인 실시양태를 제시하는 하기 상세한 설명 및 첨부 도면을 참조하여 수득될 것이다:
도 1은 비-인간 영장류 모델 (아프리카 그린 원숭이)에서의 레이저 맥락막 혈관신생 (CNV)을 예시한다. 400 mW로 처리한 중심 스팟을 제외한 모든 스팟에 대하여 750 mW, 50 μm, 100 ms의 레이저 방사선 조사를 이용하여 단일 레이저 적용함으로써 9개의 병변을 유도시켰다. 이러한 레이저 처리 직후에 컬러 안저 촬영을 수행하여 레이저 병변을 기록하였다.
도 2는 sVEGFR-1의 핵산 서열을 예시한다.
도 3은 AAV2.7m8-sVEGFR-1의 유리체 내 주사 후 CNV 저하를 예시한다. AAV2.7m8-sVEGFR-1 또는 제제 완충제를 포함하는 비히클 대조군을 2.1 x 1012 vg의 용량 하에 유리체 내 주사를 통해 원숭이의 눈에 투여하였다. 제14일에 수집된 안저 영상 (연회색 막대)에 대하여 비히클 단독의 투여와 비교 시 AAV2.7m8-sVEGFR-1에 대해서는 퍼센트 등급 IV CNV 병변 상의 감소가 관찰되었다. 제28일에 수집된 안저 영상 (암회색 막대)에 의해 측정된 바와 같이 비히클 단독의 투여와 비교 시 AAV2.7m8-sVEGFR-1에 대해서는 퍼센트 등급 IV CNV 병변에 있어서의 유의적 차이가 관찰되지 않았다.
도 4는 유리체 내로로 투여된 AAV2.7m8-라니비주맙이 레이저 유도된 등급 IV CNV 병변의 발생을 방지하였다는 것을 예시한다. AAV2.7m8-라니비주맙, 라니비주맙 단독 (양성 대조군), 또는 제제 완충제를 포함하는 비히클 대조군을 2 x 1012 vg의 용량 하에 유리체 내 주사를 통해 원숭이의 눈에 투여하였다. AAV2.7m8-라니비주맙은 제14일 (연회색 막대) 및 제28일 (암회색 막대)에 수집된 안저 영상에 의해 측정된 바와 같이, 등급 IV CNV 병변을 라니비주맙 단독과 대등한 수준으로 상당히 저하시켰다.
예시를 위해 예시적인 적용을 참조하여 몇 가지 측면이 아래에 설명된다. 본원에 기재된 특징을 완전히 이해하기 위해 수많은 구체적 세부 사항, 관계 및 방법이 제시되어 있다는 것을 이해해야 한다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 특징이 구체적 세부 사항 중 하나 이상 없이도 또는 다른 방법을 사용하여 실시될 수 있다는 것을 용이하게 인식할 것이다. 본원에 기재된 특징은 일부 행위가 상이한 순서로 및/또는 다른 행위 또는 사건과 공동으로 발생할 수 있기 때문에, 행위 또는 사건의 예시된 순서에 의해 제한되지 않는다. 더욱이, 예시된 모든 행위 또는 사건이 본원에 기재된 특징에 따라서 특정 방법론을 구현하는 데 필요한 것은 아니다.
본 개시내용은 항-VEGF 작용제를 코딩하는 핵산 서열 (예를 들어, cDNA)을 포함하는 유전자 요법, 벡터, 또는 구축물을 영장류 (예를 들어, 원숭이 또는 인간)의 눈 내로 유리체 내 또는 망막 하 주사함으로써 투여하는 것을 포함하는, 눈 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 제약 조성물 및 방법에 관한 것이다. 항-VEGF 작용제 또는 트랜스진을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 요법, 벡터, 또는 구축물의 유리체 내 또는 망막 하 주사 시, 항-VEGF 유전자가 표적 세포 또는 조직, 예를 들어, 망막 세포에서 생체내 발현되어, 치료 효과를 발생시키는 항-VEGF 단백질 또는 유전자 산물을 생성한다.
일부 실시양태에서, 항-VEGF 작용제를 포함하는 유전자 요법, 벡터, 또는 구축물은 영장류 또는 인간 대상체에서 신생혈관 (습성) 연령 관련 황반 변성 (AMD), 망막 정맥 폐색증 (RVO), RVO 후 황반 부종, 당뇨병성 황반 부종 (DME), 및/또는 DME 환자에서의 당뇨병성 망막병증 (DR), 또는 혈관신생 (예를 들어, 맥락막 혈관신생 (CNV))을 수반한 임의의 다른 관련 눈 질환 또는 병태를 포함하나 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 눈 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 표준 진료 요법 또는 기존의 치료, 예를 들어, 라니비주맙 또는 베바시주맙 주사에 반응하는 눈 질환 또는 병태를 치료하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 AMD, RVO, DME, DR, 또는 DME 환자에서의 DR에 대한 적어도 하나의 현재의 표준 진료, 예를 들어, 라니비주맙 또는 베바시주맙 주사에 반응하는 눈 질환 또는 병태를 치료하기 위해 사용된다.
본 개시내용은 항-VEGF 작용제를 코딩하는 핵산, 치료용 트랜스진, 또는 sVEGFR-1, 라니비주맙, 베바시주맙, 또는 임의의 다른 공지된 항-VEGF 작용제, 또는 그의 임의의 기능적 단편, 돌연변이체, 또는 변이체와 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 제약상 유효량의 벡터, 예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대 아데노 연관 바이러스 (AAV)를 포함하는, 유전자 요법을 위해 적합화된 제약 조성물을 망막 하로 또는 유리체 내로 투여함으로써 대상체 (예를 들어, 비-인간 영장류 또는 인간)에서 안구 혈관신생을 예방 또는 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 이러한 상동성은 핵산 서열 (예를 들어, cDNA), 아미노산 서열, 공간 입체 형태, 또는 단백질 구조 (예를 들어, 2차, 3차, 또는 4차 구조)에 근거할 수 있다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 벡터는 캡시드 단백질의 용매 노출된 GH 루프 또는 루프 IV 내의 소정의 부위에 돌연변이, 예컨대 5 내지 11개 아미노산의 삽입을 포함하는, 임의의 혈청형의 아데노 연관 바이러스 (AAV)이다. 일부 실시양태에서, 7-량체 아미노산 서열이 AAV 캡시드 단백질의 GH 루프 또는 루프 IV 내에 삽입된다. AAV 캡시드의 GH 루프/루프 IV에 관해서는, 예를 들어, 문헌 [van Vliet et al. (2006) Mol. Ther. 14:809; Padron et al. (2005) J. Virol. 79:5047; and Shen et al. (2007) Mol. Ther. 15:1955]을 참조할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하기 중 어느 하나를 포함하는 아미노산 서열이 AAV 캡시드 단백질 (예를 들어, VP1 캡시드 단백질)의 GH 루프/루프 IV 내에 삽입되고, 이에 따라 각각 변이체 캡시드 단백질을 갖는 AAV 변이체가 생성된다: LGETTRP, NETITRP, KAGQANN, KDPKTTN, KDTDTR, RAGGSVG, AVDTTKF, 및 STGKVPN. 일부 실시양태에서, 이러한 아미노산 삽입은 각각의 AAV 혈청형 내의 하기 위치에서 일어난다: AAV2의 587과 588 사이, AAV1의 아미노산 590과 591 사이, AAV5의 아미노산 575와 576 사이, AAV6의 아미노산 590과 591 사이, AAV7의 아미노산 589와 590 사이, AAV8의 아미노산 590과 591 사이, AAV9의 아미노산 588과 589 사이, 또는 AAV10의 아미노산 589와 590 사이.
일부 실시양태에서, 아미노산은 AAV2의 VP1의 아미노산 570과 611 사이의 위치 또는 또 다른 AAV 혈청형의 캡시드 단백질 내의 상응하는 위치에서의 2개의 인접한 아미노산 사이에 삽입될 수 있다. 일부 실시양태에서, AAV2의 VP1의 아미노산 587과 588 사이에 LGETTRP 아미노산 삽입을 포함하는 AAV2 벡터가 본원에 개시된 유전자 요법을 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 치료 방법은 항-VEGF 작용제 (예를 들어, sVEGFR-1, 라니비주맙, 또는 베바시주맙)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 임의의 혈청형의 AAV를 포함하는 제약 조성물 또는 제형을 망막 하로 또는 유리체 내로 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 제약 조성물의 망막 하 또는 유리체 내 주사는 대상체의 눈 내의 표적 세포, 예를 들어, 망막 세포에서의 항-VEGF 작용제의 발현을 유발하여, 혈관신생 또는 VEGF 발현의 저하 및/또는 생체 내에서의 VEGF 발현 또는 활성의 억제, 또는 생체 내에서의 VEGF-VEGFR 상호 작용의 붕괴를 초래한다. 일부 경우에, 항-VEGF 작용제의 발현은 생체 내에서 내인성 VEGF를 격리시켜 생체 내에서 내인성 VEGF 수용체와의 VEGF 결합 또는 상호 작용을 방지한다.
단백질 주사에 비해 유전자 요법의 한 가지 이점은 유전자 요법이 치료제 (예를 들어, 항-VEGF 작용제)의 연장되거나 또는 지속적인 방출을 제공하고 반복적인 주사를 필요로 하지 않는다는 것이다. 이러한 치료제의 연장되거나 또는 지속적인 방출은 생체 내에서 발현되어 치료 효과를 제공하는 트랜스진을 코딩하는 핵산 서열의 전달로부터 비롯된다.
일부 실시양태에서, rAAV는 눈 내의 표적 세포 또는 조직 (예를 들어, 망막 세포)의 그의 감염력을 증가시키는 캡시드 변이체 단백질을 포함할 수 있어, 치료용 트랜스진을 코딩하는 핵산 서열을 표적 세포 또는 조직 내로 더 효율적으로 전달할 수 있게 해주며, 여기서 치료용 트랜스진은 소정의 기간, 예를 들어, 적어도 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 10년 또는 그 초과에 걸쳐 발현될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같은 유전자 요법은 특이적 관심 조직 또는 세포 유형, 예를 들어, 광수용체 세포를 표적으로 할 수 있으며, 이는 표적을 벗어난 효과를 최소화하거나 또는 생체 내에서 치료용 트랜스진의 더 표적화된 전달을 제공하는 데 도움을 줄 수 있다.
유전자 요법을 통한 생체 내 항-VEGF 작용제의 연장되거나 또는 지속적인 전달을 고려하여, 항-VEGF 작용제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제약 조성물을 단일 용량 또는 1회 용량으로 투여할 수 있을 것이다. 일부 실시양태에서, 대상체에게 투여된 유전자 요법의 총 투여 수는 적어도 1.5년, 적어도 2년, 적어도 3년, 적어도 4년, 적어도 5년, 적어도 6년, 적어도 7년, 적어도 8년, 적어도 9년, 또는 적어도 10년에 1회 이하이다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 작용제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 요법의 투여는 환자의 생애에서 단 1회 또는 한번뿐이다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 작용제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 요법의 1회 투여는 환자에서 1년 초과 동안, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 또는 그 초과 동안 지속되는 치료 효과를 발생시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 작용제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 요법은 환자에게 적어도 2년 이상, 적어도 3년 이상, 적어도 4년 이상, 적어도 5년 이상, 적어도 6년 이상, 적어도 7년 이상, 적어도 8년 이상, 적어도 9년 이상, 또는 적어도 10년 이상에 1회 이하 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 작용제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 요법은 적어도 하나의 현재의 표준 진료 또는 적어도 하나의 기존 요법, 예를 들어, 라니비주맙 또는 베바시주맙에 반응하는 환자에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 상기 유전자 요법은 이러한 유전자 요법을 받기 전에 라니비주맙 또는 베바시주맙으로 미리 치료받았던 환자에게 투여된다.
일부 실시양태에서, 항-VEGF 작용제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 요법의 1회 투여는 환자가 1년 초과 동안, 1.5년 초과 동안, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 초과 동안 눈에서의 혈관신생에 대한 라니비주맙, 베바시주맙, 또는 임의의 다른 단백질-기반 치료제 또는 표준 진료 치료제를 받을 필요를 없게 한다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 작용제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 요법의 주사를 받은 환자는 환자의 나머지 생애 동안 눈에서의 혈관신생에 대하여 라니비주맙, 베바시주맙, 또는 임의의 다른 단백질-기반 치료제 또는 표준 진료 치료제의 어떠한 부가의 주사도 필요로 하지 않는다. 다른 실시양태에서, 항-VEGF 유전자 요법의 1회 주사를 받은 환자는 이러한 유전자 요법을 받은 후 적어도 1.5, 2, 5, 10년 또는 그 초과가 경과한 후에, 필요에 따라 라니비주맙, 베바시주맙, 및/또는 임의의 다른 승인된 치료제로의 요법을 시작할 수 있다.
본 개시내용의 용어는 특별한 경우만을 설명하기 위한 것이며, 본 개시내용의 조성물, 방법 및 조성물을 제한하고자 하는 것은 아니다.
본원에 기재된 바와 같은 본 개시내용의 조성물 및 방법은 달리 표시되지 않는 한, 관련 기술분야의 통상의 기술자의 기술 수준 내에 있는 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 세포 생물학, 생화학, 면역화학 및 안과 기술의 통상적인 기술 및 설명을 이용할 수 있다. 이러한 통상적인 기술은 대상체의 망막 또는 시력, 재조합 바이러스의 클로닝 및 번식, 제약 조성물의 제형, 및 생화학적 정제 및 면역화학을 관찰 및 분석하는 방법을 포함한다. 적합한 기술의 구체적인 예시는 본원의 실시예를 참조할 수 있다. 그러나, 등가의 통상적인 과정이 물론 사용될 수도 있다. 이러한 통상적인 기술 및 설명은 표준 실험 매뉴얼, 예컨대 문헌 [Green, et al., Eds., Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV) (1999); Weiner, et al., Eds., Genetic Variation: A Laboratory Manual (2007); Dieffenbach, Dveksler, Eds., PCR Primer: A Laboratory Manual (2003); Bowtell and Sambrook, DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual (2003); Mount, Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis (2004); Sambrook and Russell, Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2006); and Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2002) (all from Cold Spring Harbor Laboratory Press); Stryer, L., Biochemistry (4th Ed.) W.H. Freeman, N.Y. (1995); Gait, "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" IRL Press, London (1984); Nelson and Cox, Lehninger, Principles of Biochemistry, 3rd Ed., W.H. Freeman Pub., New York (2000); and Berg et al., Biochemistry, 5th Ed., W.H. Freeman Pub., New York (2002)] (이들 모두는 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다)에서 찾을 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에는 (a) (i) 변이체 AAV2 캡시드 단백질 (여기서, 변이체 AAV2 캡시드 단백질은 위치 587과 588 사이에 LGETTRP 삽입을 포함하고, 변이체 캡시드 단백질은 상응하는 비-변이체 AAV2 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교하여 망막 세포의 감염력에 있어서의 증가를 부여해 준다); 및 (ii) 항-VEGF 작용제를 코딩하는 이종 핵산 서열을 포함하는, 유전자 요법을 위해 적합화된 재조합 아데노 연관 바이러스 (rAAV2) 비리온; 및 (b) 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 제형이 개시된다. 일부 실시양태에서, 코딩되는 유전자 산물은 라니비주맙, 베바시주맙, 또는 임의의 다른 공지된 항-VEGF 작용제와 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 상동성을 갖는 폴리펩티드이다.
또한 본원에는 망막 하 또는 유리체 내 주사에 의해 대상체의 눈에 본원에 기재된 바와 같이, 유전자 요법을 위해 적합화된 제약 조성물을 투여하는 것, 즉 생체 내에서 항-VEGF 유전자 산물을 코딩하는 핵산 서열을 전달하는 것을 포함하는, 그에 대한 치료를 위하여 항-VEGF 유전자 산물 (예를 들어, 라니비주맙 또는 베바시주맙)이 권고되거나 또는 승인되는 눈 병태 또는 질환을 치료하는 방법이 개시된다. 일부 실시양태에서, 상기 유전자 요법은 유리체 내 주사에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 작용제는 라니비주맙, 베바시주맙, sVEGFR-1, 또는 그의 임의의 변이체 또는 기능적 단편이다.
또한 본원에는 공지된 항-VEGF 단백질 또는 융합 단백질 (예를 들어, 라니비주맙 또는 베바시주맙)과 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 상동성을 갖는 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 요법 또는 벡터를 포함하는 제약 조성물이 개시되며, 여기서 이러한 제약 조성물은 동결 건조될 수 있거나, 또는 동결 건조된 형태로 공급될 수 있다. 일부 실시양태에서, 동결 건조된 형태의 제약 조성물은 투여 전에 제약 조성물을 재구성하기 위한 용액 또는 완충제와 함께 키트에 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 제약 조성물은 용액, 균질한 용액, 현탁액, 또는 냉장된 현탁액으로서 공급된다.
또한 본원에는 (a) 변이체 AAV 캡시드 단백질 (여기서, 변이체 캡시드 단백질은 상응하는 비-변이체 또는 비변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교하여 망막 세포의 감염력에 있어서의 증가를 부여해 준다); 및 (b) 항-VEGF 활성을 수반한 폴리펩티드 또는 치료용 트랜스진을 코딩하는 이종 핵산 서열을 포함하는, 맥락막 혈관신생을 저하시키기 위한 유전자 요법을 위해 적합화된 재조합 아데노 연관 바이러스 (rAAV) 비리온이 개시된다. 일부 실시양태에서, 유전자 요법을 위해 사용된 rAAV는 rAAV2이다.
또한 본원에는 인간 대상체의 눈에 본원에 기재된 바와 같이, 유전자 요법 및 항-VEGF 작용제, 또는 항-VEGF 활성을 갖는 단백질을 발현시키기 위한 핵산 서열의 생체내 전달을 위해 적합화된 rAAV 비리온을 투여하는 것을 포함하는, 눈 병태 또는 질환을 치료하는 방법이 개시되며; 여기서 인간 대상체는 혈관신생과 연관된 눈 병태가 있는 것으로 이전에 진단받은 적이 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 요법은 승인된 항-VEGF 요법, 예를 들어, 라니비주맙 또는 베바시주맙 중 적어도 하나에 반응하는 환자에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 유전자 요법은 승인된 요법, 예를 들어, 라니비주맙 또는 베바시주맙 중 적어도 하나로 미리 치료받은 환자에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 유전자 요법은 승인된 요법, 예를 들어, 라니비주맙 또는 베바시주맙 주사 중 적어도 하나로 미리 치료받았고 개선을 보이지 않았던 환자에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 유전자 요법을 받는 환자는 눈에 다수의 반복적인 주사를 필요로 하는 요법으로 환자를 치료하는 것을 불리하게 만드는 하나 이상의 위험 요인, 예를 들어, 염증, 감염, 상승된 안구내 압력, 및/또는 다른 부작용의 증가된 위험을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에는 (a) (i) AAV2 내의 캡시드 단백질 VP1의 아미노산 570-611에 상응하는 위치에 LGETTRP, NETITRP, KAGQANN, KDPKTTN, KDTDTTR, RAGGSVG, AVDTTKF, 및 STGKVPN으로부터 선택된 아미노산 삽입을 포함하는 변이체 AAV 캡시드 단백질 (여기서, 변이체 캡시드 단백질은 상응하는 비-변이체 AAV2 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교하여 망막 세포의 감염력에 있어서의 증가를 부여해 준다); 및 (ii) 항-VEGF 작용제를 코딩하는 이종 핵산 서열을 포함하는, 유전자 요법을 위해 적합화된 재조합 아데노 연관 바이러스 (rAAV) 비리온; 및 (b) 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 방법 및 제약 제형이 개시된다. 일부 실시양태에서, 코딩되는 유전자 산물은 융합 단백질, 항체, 또는 항체 단편이다. 일부 실시양태에서, 제약상 허용되는 부형제는 본원에 개시된 제약 조성물에서의 응집을 방지하는 계면활성제를 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본원에 사용된 용어는 특별한 경우만을 설명하기 위한 것이며, 제한하고자 하는 것은 아니다. 본원에 사용된 바와 같은 단수 형태는 문맥상 달리 명백히 표시하지 않는 한, 또한 복수 형태를 포함하는 것으로 의도된다. 더욱이, 용어 "포함한", "포함하다", "갖는", "가지며", "수반한", 또는 그의 파생어가 상세한 설명 및/또는 청구범위에 사용되는 정도로, 상기 용어는 용어 "포함하는"과 유사한 방식으로 포괄적인 것으로 의도된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "포함하는"은 "포함한" 또는 "함유하는"과 동의어이고, 포괄적이거나 또는 제약을 두지 않는다.
본원에서 "또는"에 대한 임의의 언급은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 포함하는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "약" 숫자는 그러한 숫자의 플러스 또는 마이너스 10% 숫자를 지칭한다. 용어 "약" 범위는 그의 최저 값의 마이너스 10% 내지 그의 가장 큰 값의 플러스 10%인 범위를 지칭한다.
용어 "대상체", "환자", 또는 "개체"는 비-인간 영장류, 예를 들어, 아프리카 그린 원숭이 및 레서스(rhesus) 원숭이, 및 인간을 포함한 영장류를 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, 대상체는 인간 또는 인간 환자이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료하다", "치료하는", "치료", "완화하다" 또는 "완화하는" 및 기타 문법적으로 동등한 용어는 질환 또는 병태 증상의 경감, 감소 또는 완화, 부가 증상의 예방, 증상의 근본적인 대사 원인의 완화 또는 예방, 질환 또는 병태의 억제, 예를 들어, 질환 또는 병태의 발생 저지, 질환 또는 병태의 구제, 질환 또는 병태의 퇴행 유발, 질환 또는 병태에 의해 유발된 병태의 구제, 또는 질환 또는 병태의 증상 중지를 포함하고, 예방을 포함하는 것으로 의도된다. 상기 용어는 추가로, 치료적 혜택 및/또는 예방적 혜택을 달성하는 것을 포함한다. 치료적 혜택이란 치료받는 근본적인 질환의 근절 또는 완화를 의미한다. 또한, 치료적 혜택은 근본적인 질환과 연관된 생리학적 증상 중 하나 이상의 근절 또는 완화를 이용하여 달성되므로, 일부 실시양태에서, 환자가 여전히 근본적인 질환을 앓고 있음에도 불구하고, 환자에서 개선이 관찰된다. 예방적 혜택을 위해, 제약 조성물은 특별한 질환이 발생할 위험이 있는 환자, 또는 특정 질환의 진단이 이루어진 적이 없었던 경우에라도, 이러한 질환의 생리학적 증상 중 하나 이상이 보고되는 환자에게 투여된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "투여하다", "투여하는", "투여" 등은 치료제 또는 제약 조성물을 생물학적 작용의 목적하는 부위에 전달할 수 있게 해주는데 사용되는 방법을 지칭할 수 있다. 이러한 방법은 눈에 대한 유리체 내 또는 망막 하 주사를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "유효량", "치료상 유효량" 또는 "제약상 유효량"은 치료되는 질환 또는 병태의 증상 중 하나 이상을 어느 정도 구제시킬, 투여되는 적어도 하나의 제약 조성물 또는 화합물의 충분한 양을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "제약상 허용되는"은 본원에 개시된 화합물의 생물학적 활성 또는 특성을 폐기시키지 않는 물질, 예컨대 담체 또는 희석제를 지칭할 수 있고, 비교적 무독성이다 (즉, 상기 물질을 개체에게 투여할 때, 이는 바람직하지 못한 생물학적 효과를 유발시키지 않거나 또는 이것이 함유되는 조성물의 성분 중 임의의 것과 해로운 방식으로 상호 작용하지도 않는다).
본원에 사용된 바와 같은 용어 "제약 조성물," 또는 간단히 "조성물"은, 예를 들어 담체, 안정화제, 희석제, 분산제, 현탁제, 증점제, 부형제 등이지만 이에 제한되지는 않는 적어도 하나의 제약상 허용되는 화학적 성분과 임의로 혼합된, 생물학적으로 활성인 화합물을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "AAV 벡터" 또는 "rAAV 벡터"는 아데노 연관 바이러스 (AAV) 벡터; 또는 AAV 기원이 아닌 폴리뉴클레오티드 서열 (즉, AAV에 대해 이종인 폴리뉴클레오티드, 예컨대 치료용 트랜스진, 예를 들어, 라니비주맙을 코딩하는 핵산 서열), 전형적으로 세포의 유전적 형질전환에 대한 관심 서열을 포함하는 재조합 AAV (rAAV) 벡터를 지칭한다. 일반적으로, 상기 이종 폴리뉴클레오티드는 적어도 1개, 및 일반적으로 2개의 AAV 역위 말단 반복 서열 (ITRs)에 의해 플랭킹된다. 용어 rAAV 벡터는 rAAV 벡터 입자와 rAAV 벡터 플라스미드 둘 다를 포괄한다. rAAV 벡터는 단일 가닥 (ssAAV)이거나 또는 자기 상보적 (scAAV)일 수 있다.
"AAV 바이러스" 또는 "AAV 바이러스 입자" 또는 "rAAV 벡터 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 (전형적으로 야생형 AAV의 모든 캡시드 단백질) 및 폴리뉴클레오티드 rAAV 벡터로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다. 이러한 입자가 이종 폴리뉴클레오티드 (즉, 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오티드, 예컨대 포유동물 세포에 전달될 트랜스진)를 포함하는 경우, 이는 전형적으로, "rAAV 벡터 입자" 또는 간단히 "rAAV 벡터"로서 지칭된다. 따라서, rAAV 입자의 생산은 반드시, rAAV 벡터의 생산을 포함하는데, 이는 이러한 벡터가 rAAV 입자 내에 함유되기 때문이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "패키징"은 rAAV 입자의 어셈블리 및 캡시드로 둘러 싸기를 발생시킬 수 있는 일련의 세포내 사건을 지칭할 수 있다.
AAV "rep" 및 "cap" 유전자는 아데노 연관 바이러스의 복제 및 캡시드로 둘러싼 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. AAV rep 및 cap는 AAV "패키징 유전자"로서 본원에 지칭된다.
용어 "폴리펩티드"는 자연적으로 발생하는 것과 비-자연적으로 발생하는 단백질 (예를 들어, 융합 단백질), 그의 펩티드, 단편, 돌연변이체, 유도체 및 유사체 둘 다를 포괄할 수 있다. 폴리펩티드는 단량체성, 이량체성, 삼량체성, 또는 중합체성일 수 있다. 추가로, 폴리펩티드는 각각 한 가지 이상의 별개의 활성을 갖는 수많은 상이한 도메인을 포함할 수 있다. 의심의 여지를 없애기 위하여, "폴리펩티드"는 2개의 아미노산보다 더 큰 어떠한 길이일 수도 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "폴리펩티드 변이체" 또는 간단히 "변이체"는 그의 서열이 아미노산 변형을 함유하는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 경우에, 이러한 변형은 참조 단백질 또는 폴리펩티드, 예컨대 천연 또는 야생형 단백질의 아미노산 서열과 비교해서 하나 이상의 아미노산의 삽입, 중복, 결실, 재배열 또는 치환일 수 있다. 변이체는 특정 위치에서의 단일 아미노산이 또 다른 아미노산으로 변화된 하나 이상의 아미노산 점 치환, 참조 단백질의 서열 내의 하나 이상의 아미노산이 각각 삽입 또는 결실되는 하나 이상의 삽입 및/또는 결실, 및/또는 아미노 말단 또는 카르복시 말단 중 하나 또는 둘 다에서의 아미노산 서열의 말단절단을 가질 수 있다. 변이체는 참조 단백질, 또는 비변형된 단백질과 비교해서 동일하거나 또는 상이한 생물학적 활성을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 변이체는, 예를 들어, 그의 대응물 참조 단백질과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 전반적 서열 상동성을 가질 수 있으며, 여기서 참조 단백질은 자연적으로 발생하거나 또는 비-자연적으로 발생할 수 있거나, 또는 자연적으로 발생하는 단백질의 유도체 또는 변이체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 변이체는 야생형 단백질과 적어도 약 90% 전반적 서열 상동성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 변이체는 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 99.5%, 또는 적어도 약 99.9% 전반적 서열 동일성을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은, "재조합"은 (1) 그의 자연적으로 발생하는 환경으로부터 제거되었거나, (2) 유전자가 자연에서 발견되는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부분과 연합되지 않거나, (3) 자연에서는 연결되지 않는 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 연결되거나, 또는 (4) 자연에서는 발생되지 않는 생체 분자, 예를 들어, 유전자 또는 단백질을 지칭할 수 있다. 용어 "재조합"은 클로닝된 DNA 단리물, 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오티드 유사체, 또는 이종 시스템에 의해 생물학적으로 합성되는 폴리뉴클레오티드 유사체뿐만 아니라 이러한 핵산에 의해 코딩된 단백질 및/또는 mRNA와 관련하여 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 세포에 존재하는 재조합 유전자로부터 합성된 mRNA로부터 합성되는 경우에, 예를 들어, 미생물에 의해 합성된 단백질이 재조합이다.
"작동적으로 연결된" 또는 "작동 가능하게 연결된" 또는 "커플링된"은 유전적 요소의 병렬을 지칭할 수 있으며, 여기서 이러한 요소는 그들이 예상된 방식으로 작동할 수 있게 해주는 관계에 있다. 예를 들어, 특정 프로모터가 코딩 서열의 전사를 개시하는 데 도움을 주는 경우, 이러한 프로모터는 코딩 영역과 작동적으로 연결될 수 있다. 이러한 기능적 관계가 유지되는 한은 프로모터와 코딩 영역 사이에 개재 잔기가 있을 수 있다.
용어 "발현 벡터" 또는 "발현 구축물" 또는 "카세트" 또는 "플라스미드" 또는 간단히 "벡터"는 핵산 코딩 서열의 일부 또는 전부가 전사될 수 있고 유전자 요법을 위해 적합화된 유전자 산물을 코딩하는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 함유하는, AAV 또는 rAAV 벡터를 포함한 임의의 유형의 유전적 구축물을 포함할 수 있다. 전사체가 단백질로 번역될 수 있다. 일부 경우에, 이는 부분적으로 번역되거나 또는 번역되지 않을 수 있다. 특정 측면에서, 발현은 유전자의 전사와, mRNA의 유전자 산물로의 번역 둘 다를 포함한다. 다른 측면에서, 발현은 관심 유전자를 코딩하는 핵산의 전사만을 포함한다. 발현 벡터는 또한, 표적 세포에서의 단백질의 발현을 촉진시키기 위해 코딩 영역과 작동적으로 연결된 제어 요소를 포함할 수 있다. 제어 요소와, 발현을 위해 이것과 작동 가능하게 연결되는 유전자(들)의 조합이 종종 "발현 카세트"로서 지칭될 수 있으며, 이의 대다수가 관련 기술분야에 공지되어 있고 입수 가능하거나 또는 관련 기술분야에서 입수 가능한 성분으로부터 용이하게 구축될 수 있다.
용어 "이종"은 그것과 비교되는 실체의 나머지 부분과 유전자형별로 완전히 다른 실체를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 유전 공학 기술에 의해 상이한 종으로부터 유래된 플라스미드 또는 벡터 내로 도입된 폴리뉴클레오티드가 이종 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 그의 천연 코딩 서열로부터 제거되었고 그와는 자연적으로 연결된 것으로 발견되지 않는 코딩 서열과 작동적으로 연결된 프로모터가 이종 프로모터일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "7m8"은 7-량체 아미노산 서열 LGETTRP를 지칭한다.
"7m8 변이체"는 캡시드 단백질의 용매 노출된 GH 루프에 삽입된 아미노산 서열 LGETTRP를 수반한, 임의의 혈청형의 것일 수 있는 rAAV를 지칭한다.
7m8이 rAAV2에 삽입되는 경우 (AAV2.7m8로서 지칭되기도 함), 7-량체 아미노산 서열 LGETTRP는 AAV2 캡시드 단백질의 GH 루프 내로, 예를 들어, AAV2 캡시드 단백질의 위치 587과 588 사이에 삽입된다. 7m8이 rAAV1에 삽입되는 경우 (AAV1.7m8로서 지칭되기도 함), 7-량체 아미노산 서열 LGETTRP는 AAV1 캡시드 단백질의 GH 루프 내로, 예를 들어, AAV1 캡시드 단백질의 아미노산 590과 591 사이에 삽입된다. 7m8이 rAAV5에 삽입되는 경우 (AAV5.7m8로서 지칭되기도 함), 7-량체 아미노산 서열 LGETTRP는 AAV5 캡시드 단백질의 GH 루프 내로, 예를 들어, AAV5 캡시드 단백질의 아미노산 575와 576 사이에 삽입된다. 7m8이 rAAV6에 삽입되는 경우 (AAV6.7m8로서 지칭되기도 함), 7-량체 아미노산 서열 LGETTRP는 AAV6 캡시드 단백질의 GH 루프 내로, 예를 들어, AAV6 캡시드 단백질의 아미노산 590과 591 사이에 삽입된다. 7m8이 rAAV7에 삽입되는 경우 (AAV7.7m8로서 지칭되기도 함), 7-량체 아미노산 서열 LGETTRP는 AAV7 캡시드 단백질의 GH 루프 내로, 예를 들어, AAV7 캡시드 단백질의 아미노산 589와 590 사이에 삽입된다. 7m8이 rAAV8에 삽입되는 경우 (AAV8.7m8로서 지칭되기도 함), 7-량체 아미노산 서열 LGETTRP는 AAV8 캡시드 단백질의 GH 루프 내로, 예를 들어, AAV8 캡시드 단백질의 아미노산 590과 591 사이에 삽입된다. 7m8이 rAAV9에 삽입되는 경우 (AAV9.7m8로서 지칭되기도 함), 7-량체 아미노산 서열 LGETTRP는 AAV9 캡시드 단백질의 GH 루프 내로, 예를 들어, AAV9 캡시드 단백질의 아미노산 588과 589 사이에 삽입된다. 7m8이 rAAV10에 삽입되는 경우 (AAV10.7m8로서 지칭되기도 함), 7-량체 아미노산 서열 LGETTRP는 AAV10 캡시드 단백질의 GH 루프 내로, 예를 들어, AAV10 캡시드 단백질의 아미노산 589와 590 사이에 삽입된다.
일부 실시양태에서, 본원에는 (a) 변이체 AAV 캡시드 단백질 (여기서, 변이체 AAV 캡시드 단백질은 캡시드 단백질의 용매 노출된 영역에 아미노산 변형을 포함하고 상응하는 비-변이체 AAV 캡시드 단백질과 비교하여 망막 세포의 증가된 감염력을 나타낸다); 및 (b) 유전자 산물 또는 치료용 트랜스진을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이종 핵산을 포함하는, 혈관신생을 저하시키기 위한 재조합 아데노 연관 바이러스 (rAAV) 비리온이 개시되며, 여기서 유리체 내 또는 망막 하 주사에 의해 유효량의 rAAV를 영장류 또는 인간 대상체의 눈에 투여하면 눈에서의 혈관신생이 저하된다.
또한 본원에는 (a) 변이체 AAV 캡시드 단백질 (여기서, 변이체 AAV 캡시드 단백질은 AAV 캡시드 단백질의 용매 노출된 영역에 아미노산 변형을 포함하고, 변이체 캡시드 단백질은 눈에서의 내부 제한 막 (ILM)을 가로지를 수 있는 증가된 능력을 부여해 준다); 및 (b) 유전자 산물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이종 핵산을 포함하는, 혈관신생을 저하시키기 위한 재조합 아데노 연관 바이러스 (rAAV) 비리온이 개시되며, 여기서 유리체 내 또는 망막 하 주사에 의해 유효량의 rAAV를 영장류 또는 인간 대상체의 눈에 투여하면 눈에서의 혈관신생이 저하된다.
또한 본원에는 (a) 변이체 AAV 캡시드 단백질 (여기서, 변이체 AAV 캡시드 단백질은 AAV2 내의 587에 상응하는 아미노산 위치 다음에 LGETTRP의 펩티드 삽입을 포함하고, 변이체 캡시드 단백질은 영장류에서 눈의 내부 제한 막 (ILM)을 가로질러 유전자 산물을 전달할 수 있는 증가된 능력을 부여해 준다); 및 (b) 유전자 산물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이종 핵산을 포함하는 재조합 아데노 연관 바이러스 (rAAV) 비리온이 개시된다.
또한 본원에는 (a) (i) 변이체 AAV 캡시드 단백질 (여기서, 변이체 AAV 캡시드 단백질은 캡시드 단백질의 용매 노출된 영역에 아미노산 변형을 포함하고 상응하는 비-변이체 AAV 캡시드 단백질과 비교하여 망막 세포의 증가된 감염력을 나타낸다); 및 (ii) 유전자 산물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이종 핵산 (여기서, 유전자 산물은 형질도입될 때, 영장류 또는 인간 대상체의 눈에서의 혈관신생을 저하시킨다)을 포함하는 재조합 아데노 연관 바이러스 (rAAV) 비리온; 및 (b) 제약상 허용되는 부형제를 포함하는, 안구 병태 또는 질환을 치료하기 위한 단위 용량 형태의 유전자 요법 조성물이 개시되며; 여기서, 상기 rAAV 비리온은 단위 용량으로서 영장류의 눈에 유리체 내 또는 망막 하 주사에 의해 투여될 때 혈관신생을 적어도 부분적으로 저하시키기에 충분한 양으로 존재한다.
또한 본원에는 본원에 기재된 rAAV 유전자 요법의 단위 용량을 대상체, 예를 들어, 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 안구 병태 또는 질환을 치료하는 방법이 개시된다.
용어 "항-VEGF 작용제"는 내인성 VEGF 및/또는 내인성 VEGF 수용체 (VEGFR)의 활성 또는 기능, 또는 생체 내에서의 VEGF-VEGFR 상호 작용 또는 경로를 저하, 방해, 붕괴, 차단 및/또는 억제시킬 수 있는, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 융합 단백질, 다량체성 단백질, 유전자 산물, 항체, 인간 모노클로날 항체, 항체 단편, 앱타머, 작은 분자, 키나제 억제제, 수용체 또는 수용체 단편, 또는 핵산 분자를 포함한 임의의 치료제를 포함한다. 항-VEGF 작용제는 생체 내에서 세포, 조직 또는 대상체 내로 전달될 때, 새로운 혈관 성장 또는 형성 및/또는 부종, 또는 팽윤을 저하시킬 수 있는 공지된 치료제 중 어느 하나, 예를 들어, 라니비주맙 또는 베바시주맙일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 작용제는 자연적으로 발생하거나, 비-자연적으로 발생하거나, 또는 합성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 작용제는 자연적으로 발생하는 분자로부터 유래될 수 있으며, 이는 항-VEGF 활성을 부여하기 위해 연속해서 변형시켰거나 또는 돌연변이시켰다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 작용제는 융합 또는 키메라 단백질이다. 이러한 단백질에서, 기능적 도메인 또는 폴리펩티드는 특정 모이어티(moiety) 또는 폴리펩티드와 인공적으로 융합시켜, 생체 내에서 VEGF를 격리시킬 수 있거나 또는 VEGFR 유인체로서 기능할 수 있는 융합 또는 키메라 단백질을 제조한다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 작용제는 내인성 VEGFR이 그의 리간드와 상호 작용하는 것을 차단시키는 융합 또는 키메라 단백질이다.
본원에 사용된 바와 같은, "VEGF"는 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F, 또는 그의 임의의 조합, 또는 임의의 기능적 단편 또는 변이체를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 달리 요구되지 않는 한 VEGF의 임의의 이소형을 지칭할 수 있다. 달리 요구되지 않는 한, "VEGF"는 하기 구성원을 포함한, VEGF 계열의 임의의 구성원을 지칭할 수 있다: VEGF-A, 태반 성장 인자 (PGF), VEGF-B, VEGF-C, 및 VEGF-D, 또는 그의 임의의 조합, 기능적 단편, 또는 변이체.
본원에 사용된 바와 같은, "VEGF 수용체" 또는 "VEGFR" 또는 "VEGF-R"은 VEGFR-1 (또는 Flt-1), VEGFR-2 (또는 Flk-1/KDR), 및 VEGFR-3 (또는 Flt-4)을 포함하나 이에 제한되지는 않는, VEGF의 수용체 중 어느 하나를 지칭하기 위해 사용될 수 있다. VEGFR은 막 결합되거나 또는 수용성 형태, 또는 수용체의 기능적 단편 또는 말단절단물일 수 있다.
항-VEGF 작용제의 예는 라니비주맙, 베바시주맙, 또는 그의 임의의 조합, 변이체, 또는 기능적 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 섹션 제목은 단지 조직적인 목적을 위한 것이며 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되서는 안된다.
벡터
아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스, 레트로바이러스, 및 렌티바이러스를 포함한 다양한 바이러스 벡터가 유전자 요법에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 제약 조성물 및 방법은 항-VEGF 작용제, 그의 기능적 단편 또는 변이체를 코딩하는 핵산 서열 (예를 들어, cDNA 서열)을, 그를 필요로 하는 인간 대상체 또는 환자 (예를 들어, AMD, RVO, DME를 동반한 것으로 진단된 환자) 내의 망막 세포에 전달하는 것을 제공한다. 전달 시스템, 예컨대 rAAV 또는 바이러스 벡터를 사용하여 환자에게 치료용 트랜스진의 핵산을 전달하는 것이 또한, 유전자 요법으로서 지칭된다.
일부 실시양태에서, 임의의 적합한 "벡터" ("유전자 전달" 또는 "유전자 전이 비히클"로서 지칭되기도 함)를 사용하여 항-VEGF 작용제 핵산 서열의 전달을 수행할 수 있다. 벡터 (예를 들어, rAAV), 전달 비히클, 유전자 전달 비히클 또는 유전자 전이 비히클은 표적 세포, 예를 들어, 광수용체, 망막 신경절 세포, 뮐러(Muller) 세포, 양극성 세포, 아마크린 세포, 수평 세포, 또는 망막 색소 상피 세포를 포함한 망막 세포에 전달될 폴리뉴클레오티드를 포함하는 임의의 적합한 거대분자 또는 분자의 복합체를 포괄할 수 있다. 일부 경우에, 표적 세포는 핵산 분자 또는 유전자가 전달되는 임의의 세포일 수 있다. 전달될 폴리뉴클레오티드는 치료용 트랜스진의 코딩 서열, 예컨대 라니비주맙을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 조성물 및 방법은 항-VEGF (예를 들어, 라니비주맙) 핵산 서열을 비-인간 영장류 또는 인간 대상체의 눈 또는 망막 세포 내로 전달하는 데 적합한 임의의 방법을 제공한다. 일부 경우에, 핵산 분자, 폴리뉴클레오티드, 또는 유전자 요법의 전달은 비-인간 영장류 또는 인간 대상체의 눈 내로의 유리체 내 주사용으로 제형화 또는 적합화시킨다.
일부 실시양태에서, 적합한 벡터는 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스 (AAV), 및 레트로바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 리포솜, 지질 함유 복합체, 나노 입자, 및 폴리뉴클레오티드를 망막 세포로 전달할 수 있는 다른 거대분자 복합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결된 강력한 진핵 프로모터, 예를 들어, 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 또는 구성적 프로모터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 벡터는 하나 이상의 핵산 분자가 혼입되는 재조합 바이러스 벡터를 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, 핵산은 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 핵산과 폴리뉴클레오티드는 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함한다. 일부 경우에, 핵산은 항-VEGF 작용제 또는 치료용 트랜스진의 발현을 위한 DNA (예를 들어, cDNA) 또는 RNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, RNA는 관심 유전자 (예를 들어, 라니비주맙)의 전사체, 인트론, 비번역된 영역 (UTR), 종결 서열 등을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, DNA는 서열, 예컨대 프로모터 서열, 관심 유전자 (예를 들어 라니비주맙), UTR, 종결 서열 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, DNA와 RNA의 조합을 사용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 라니비주맙, 베바시주맙, sFLT-1, 또는 그의 임의의 기능적 단편 또는 변이체의 전달 및 발현을 위한 벡터로서의 재조합 바이러스, 예컨대 재조합 아데노 연관 바이러스 (rAAV)를 제공한다.
일부 실시양태에서, 임의의 적합한 바이러스 벡터는 본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 사용하도록 조작되거나 또는 최적화될 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스 (Ad) 또는 아데노 연관 바이러스 (AAV)로부터 유래된 재조합 바이러스 벡터는 그것이 인간 또는 영장류 대상체에서 복제 결함있는 것이 되도록 변경될 수 있다. 일부 실시양태에서, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법을 사용하여 혼성체 바이러스 벡터 시스템을 수득할 수 있고, 이를 사용하여 항-VEGF 작용제를 코딩하는 핵산을 망막 세포에 전달할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이러스 전달 시스템 또는 유전자 요법은 항-VEGF 유전자를 포함하는 핵산 서열을 표적 세포 게놈 (예를 들어, 망막 세포의 게놈) 내로 통합시킬 수 있고, 이로써 시간 경과에 따라 상기 유전자의 안정적인 유전자 발현이 발생된다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 유전자는 표적 세포 게놈 내로 통합되지 않고, 표적 세포 내로 도입된 플라스미드 또는 벡터로부터 발현된다.
일부 실시양태에서, 항-VEGF의 핵산 서열을 망막 세포 내로 전달하는 데 적합한 바이러스 벡터는 AAV 또는 rAAV이며, 이는 작은 비-외피보유 단일 가닥 DNA 바이러스이다. rAAV는 비-병원성 인간 파르보바이러스이고, 복제를 위하여, 아데노바이러스, 단순 포진 바이러스, 백시니아 바이러스 및 CMV를 포함한 헬퍼 바이러스에 의존적이 되도록 만들 수 있다. 야생형 (wt) AAV에 대한 노출은 임의의 인간 병원체를 유발시키는 것으로 공지되지 않거나 또는 이와 연관되지 않고, 일반적 집단에서 흔한 것이므로, AAV 또는 rAAV를 유전자 요법에 적합한 전달 시스템으로 만들어 준다. 치료용 트랜스진, 예를 들어, 라니비주맙의 전달을 위한 유전자 요법을 위해 사용된 AAV 및 rAAV는 임의의 혈청형의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 제약 조성물 및 방법은 AAV1, AAV2, AAV2.5, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, rh10, AAV-DJ, 및 그의 임의의 혼성체 또는 키메라 AAV를 포함한, 임의의 적합한 AAV 혈청형의 사용을 제공한다. 일부 실시양태에서, 사용된 혈청형은 바이러스의 지향성, 또는 관심 표적 세포의 감염력에 근거한다. 일부 실시양태에서, AAV2 또는 rAAV2는 라니비주맙을 코딩하는 핵산 서열을 유리체 내 또는 망막 하 주사를 통해 대상체의 눈 또는 망막 세포 내로 전달하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, rAAV2.7m8은 라니비주맙의 핵산 서열을 대상체의 망막 세포 내로 전달하기 위해 사용된다.
일부 실시양태에서, 표적 세포, 예를 들어 망막 세포의 증가된 감염력을 갖는 변이체 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 또는 rAAV 바이러스, 입자, 또는 비리온은 망막 세포의 형질도입을 증가시키거나 또는 대상체 내의 망막 세포로의 유전자 전달의 표적화를 증가시키기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, rAAV 비리온은 AAV 캡시드 단백질의 캡시드 단백질 GH 루프/루프 IV 내에 아미노산 변형을 포함한다. 일부 경우에, 이러한 변형 부위는 AAV 캡시드 단백질의 GH 루프/루프 IV의 용매 접근 가능한 부분이다. 7m8 변이체를 포함한 몇 가지 AAV 캡시드 변이체가 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, rAAV 비리온은 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질과 비교하여 캡시드 단백질의 GH 루프 내에 5개 아미노산 내지 11개 아미노산, 예를 들어, 7개 아미노산 서열의 삽입을 포함하는 변이체 AAV 캡시드 단백질을 포함하며, 여기서 이러한 변이체 캡시드 단백질은 상응하는 모 또는 비변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 망막 세포의 감염력과 비교해서 망막 세포의 증가된 감염력을 부여해 준다. 일부 실시양태에서, 하기 아미노산 서열 중 어느 하나의 삽입이 캡시드 단백질의 GH 루프 내에 삽입될 수 있다: LGETTRP (7m8), NETITRP, KAGQANN, KDPKTTN, KDTDTTR, RAGGSVG, AVDTTKF, 및 STGKVPN. 일부 실시양태에서, 라니비주맙을 포함하는 rAAV.7m8이 유전자 요법을 위해 사용된다.
일부 실시양태에서, 하기 아미노산 서열: NETITRP, KAGQANN, KDPKTTN, KDTDTTR, RAGGSVG, AVDTTKF, 및 STGKVPN 중 어느 하나가 하기 위치에 삽입되어, 유전자 요법에 사용하기 위한 rAAV 변이체를 생성시킬 수 있다: AAV2 캡시드 단백질의 위치 587과 588 사이; AAV1 캡시드 단백질의 아미노산 590과 591 사이; AAV5 캡시드 단백질의 아미노산 575와 576 사이; AAV6 캡시드 단백질의 아미노산 590과 591 사이; AAV7 캡시드 단백질의 아미노산 589와 590 사이; AAV8 캡시드 단백질의 아미노산 590과 591 사이; AAV9 캡시드 단백질의 아미노산 588과 589 사이; 또는 AAV10 캡시드 단백질의 아미노산 589와 590 사이.
일부 실시양태에서, 유전자 산물, 예컨대 라니비주맙을 코딩하는 핵산은 유전자의 전사를 개시시키는 프로모터에 의해 전사 제어하에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 그러한 프로모터는 "강력한" 또는 구성적으로 활성인 프로모터, 예를 들어, CMV 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 커넥신 36 프로모터가 치료용 트랜스진, 예를 들어, 라니비주맙의 발현을 구동시키기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 조직-특이적 프로모터가 특이적 조직 또는 세포, 예컨대 망막 세포에서의 전사를 가져다주기 위해 사용되어, 비-표적화된 세포에 대한 잠재적 독성 또는 바람직하지 못한 효과를 저하시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV 바이러스를 생성하기 위해 사용되는 재조합 바이러스 및/또는 플라스미드는 다른 전사 또는 조절 요소, 예컨대 폴리 A (폴리아데닐화) 서열, 비번역된 영역 (UTR), 3' UTR, 또는 종결 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 또는 2개 이상의 단백질의 공동 발현을 허용하거나 또는 다유전자, 또는 폴리시스트론성 mRNA를 생성시키는 유사한 요소를 사용하여 2개 이상의 유전자가 상기 벡터 또는 플라스미드로부터 발현될 수 있다.
일부 실시양태에서, rAAV 바이러스를 생성하기 위해 사용되는 rAAV 및/또는 플라스미드는 하기 핵산 요소를 포함한다: 제1 ITR 서열; 프로모터 서열; 인트론 서열; 제1 UTR 서열; 항-VEGF 트랜스진을 코딩하는 서열; 제2 UTR 서열; 폴리 A 서열; 및 제2 ITR 서열. 일부 실시양태에서, 이들 핵산 요소 각각의 사이에 링커 서열이 사용된다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 트랜스진을 코딩하는 서열은 항-VEGF 트랜스진 융합 단백질 또는 그의 기능적 단편을 코딩하는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 바이러스 벡터는 벡터 게놈으로서 측정된다. 일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 바이러스의 단위 용량은 1x1010 내지 2x1010, 2x1010 내지 3x1010, 3x1010 내지 4x1010, 4x1010 내지 5x1010, 5x1010 내지 6x1010, 6x1010 내지 7x1010, 7x1010 내지 8x1010, 8x1010 내지 9x1010, 9x1010 내지 10x1010, 1x1011 내지 2x1011, 2x1011 내지 3x1011, 3x1011 내지 4x1011, 4x1011 내지 5x1011, 5x1011 내지 6x1011, 6x1011 내지 7x1011, 7x1011 내지 8x1011, 8x1011 내지 9x1011, 9x1011 내지 10x1011, 1x1012 내지 2x1012, 2x1012 내지 3x1012, 3x1012 내지 4x1012, 4x1012 내지 5x1012, 5x1012 내지 6x1012, 6x1012 내지 7x1012, 7x1012 내지 8x1012, 8x1012 내지 9x1012, 9x1012 내지 10x1012, 1x1013 내지 2x1013, 2x1013 내지 3x1013, 3x1013 내지 4x1013, 4x1013 내지 5x1013, 5x1013 내지 6x1013, 6x1013 내지 7x1013, 7x1013 내지 8x1013, 8x1013 내지 9x1013, 또는 9x1013 내지 10x1013 벡터 게놈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 rAAV는 약 2.1x1012 벡터 게놈이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 rAAV는 1010 내지 1013, 1010 내지 1011, 1011 내지 1012, 1012 내지 1013, 1013 내지 1014, 2x1011 내지 4x1011, 3x1011 내지 5x1011, 4x1011 내지 6x1011, 5x1011 내지 7x1011, 6x1011 내지 8x1011, 7x1011 내지 9x1011, 8x1011 내지 10x1011, 1x1012 내지 3x1012, 2x1012 내지 4x1012, 3x1012 내지 5x1012, 4x1012 내지 6x1012, 5x1012 내지 7x1012, 6x1012 내지 8x1012, 7x1012 내지 9x1012, 8x1012 내지 10x1012, 1x1013 내지 5x1013, 5x1013 내지 10x1013, 1012 내지 5x1012, 또는 5x1012 내지 1x1013 벡터 게놈이다.
일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 바이러스는 약 1E10, 약 1.5E10, 약 2E10, 약 2.5E10, 약 3E10, 약 3.5E10, 약 4E10, 약 4.5E10, 약 5E10, 약 5.5E10, 약 6E10, 약 6.5E10, 약 7E10, 약 7.5E10, 약 8E10, 약 8.5E10, 약 9E10, 약 9.5E10, 약 10E10, 약 1E11, 약 1.5E11, 약 2E11, 약 2.5E11, 약 3E11, 약 3.5E11, 약 4E11, 약 4.5E11, 약 5E11, 약 5.5E11, 약 6E11, 약 6.5E11, 약 7E11, 약 7.5E11, 약 8E11, 약 8.5E11, 약 9E11, 약 9.5E11, 약 10E11, 약 1E12, 약 1.3E12, 약 1.5E12, 약 2E12, 약 2.1E12, 약 2.3E12, 약 2.5E12, 약 2.7E12, 약 2.9E12, 약 3E12, 약 3.1E12, 약 3.3E12, 약 3.5E12, 약 3.7E12, 약 3.9E12, 약 4E12, 약 4.1E12, 약 4.3E12, 약 4.5E12, 약 4.7E12, 약 4.9E12, 약 5E12, 약 5.1E12, 약 5.3E12, 약 5.5E12, 약 5.7E12, 약 5.9E12, 약 6E12, 약 6.1E12, 약 6.3E12, 약 6.5E12, 약 6.7E12, 약 6.9E12, 약 7E12, 약 7.1E12, 약 7.3E12, 약 7.5E12, 약 7.7E12, 약 7.9E12, 약 8E12, 약 8.1E12, 약 8.3E12, 약 8.5E12, 약 8.7E12, 약 8.9E12, 약 9E12, 약 9.1E12, 약 9.3E12, 약 9.5E12, 약 9.7E12, 약 9.9E12, 약 10E12, 약 10.1E12, 약 10.3E12, 약 10.5E12, 약 10.7E12, 약 10.9E12, 약 11E12, 약 11.5E12, 약 12E12, 약 12.5E12, 약 13E12, 약 13.5E12, 약 14E12, 약 14.5E12, 약 15E12, 약 15.5E12, 약 16E12, 약 16.5E12, 약 17E12, 약 17.5E12, 약 18E12, 약 18.5E12, 약 19E12, 약 19.5E12, 약 20E12, 약 20.5E12, 약 30E12, 약 30.5E12, 약 40E12, 약 40.5E12, 약 50E12, 약 50.5E12, 약 60E12, 약 60.5E12, 약 70E12, 약 70.5E12, 약 80E12, 약 80.5E12, 약 90E12, 약 95E12, 또는 약 100E12이며, 여기서 E는 지수화를 위한 기수 10에 대한 약칭이고, xEy는 x에 y 제곱 지수에 대한 기수 10을 곱한 것을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 제약 조성물은 적어도 5E11, 적어도 5.5E11, 적어도 6E11, 적어도 6.5E11, 적어도 7E11, 적어도 7.5E11, 적어도 8E11, 적어도 8.5E11, 적어도 9E11, 적어도 9.5E11, 적어도 10E11, 적어도 1E12, 적어도 1.3E12, 적어도 1.5E12, 적어도 2E12, 적어도 2.1E12, 적어도 2.3E12, 적어도 2.5E12, 적어도 2.7E12, 적어도 2.9E12, 적어도 3E12, 적어도 3.1E12, 적어도 3.3E12, 적어도 3.5E12, 적어도 3.7E12, 적어도 3.9E12, 적어도 4E12, 적어도 4.1E12, 적어도 4.3E12, 적어도 4.5E12, 적어도 4.7E12, 적어도 4.9E12, 적어도 5E12, 적어도 5.1E12, 적어도 5.3E12, 적어도 5.5E12, 적어도 5.7E12, 적어도 5.9E12, 적어도 6E12, 적어도 6.1E12, 적어도 6.3E12, 적어도 6.5E12, 적어도 6.7E12, 적어도 6.9E12, 적어도 7E12, 적어도 7.1E12, 적어도 7.3E12, 적어도 7.5E12, 적어도 7.7E12, 적어도 7.9E12, 적어도 8E12, 적어도 8.1E12, 적어도 8.3E12, 적어도 8.5E12, 적어도 8.7E12, 적어도 8.9E12, 적어도 9E12, 적어도 9.1E12, 적어도 9.3E12, 적어도 9.5E12, 적어도 9.7E12, 적어도 9.9E12, 적어도 10E12, 적어도 10.1E12, 적어도 10.3E12, 적어도 10.5E12, 적어도 10.7E12, 적어도 10.9E12, 적어도 11E12, 적어도 11.5E12, 적어도 12E12, 적어도 12.5E12, 적어도 13E12, 적어도 13.5E12, 적어도 14E12, 적어도 14.5E12, 적어도 15E12, 적어도 15.5E12, 적어도 16E12, 적어도 16.5E12, 적어도 17E12, 적어도 17.5E12, 적어도 18E12, 적어도 18.5E12, 적어도 19E12, 적어도 19.5E12, 적어도 20E12, 적어도 20.5E12, 적어도 30E12, 적어도 30.5E12, 적어도 40E12, 적어도 40.5E12, 적어도 50E12, 적어도 50.5E12, 적어도 60E12, 적어도 60.5E12, 적어도 70E12, 적어도 70.5E12, 적어도 80E12, 적어도 80.5E12, 적어도 90E12, 적어도 95E12, 또는 적어도 100E12 벡터 게놈의 재조합 바이러스를 포함하며, 여기서 E는 지수화를 위한 기수 10에 대한 약칭이고, xEy는 x에 y 제곱 지수에 대한 기수 10을 곱한 것을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 바이러스 벡터는 감염 다중도 (MOI)를 사용하여 측정된다. 일부 경우에, MOI는 핵산이 전달될 수 있는 세포에 대한 벡터 또는 바이러스 게놈의 비 또는 배수를 지칭한다. 일부 경우에, MOI는 1x106이다. 일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 바이러스는 적어도 1x101, 1x102, 1x103, 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015, 1x1016, 1x1017 및 1x1018 MOI일 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 바이러스는 1x108 내지 1x1015 MOI일 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 바이러스는 많아야 1x101, 1x102, 1x103, 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015, 1x1016, 1x1017, 및 1x1018 MOI일 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산은 바이러스를 사용하지 않고서도 (즉, 비-바이러스 벡터를 사용함) 전달될 수 있고, 핵산의 수량으로서 측정될 수 있다. 일반적으로, 핵산의 임의의 적합한 양이 본 개시내용의 제약 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있다. 일부 경우에, 핵산은 적어도 1 pg, 10 pg, 100 pg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 μg, 10 μg, 100 μg, 200 μg, 300 μg, 400 μg, 500 μg, 600 μg, 700 μg, 800 μg, 900 μg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng, 500 ng, 600 ng, 700 ng, 800 ng, 900 ng, 1 mg, 10 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg, 1 g, 2 g, 3 g, 4 g, 또는 5 g이다. 일부 경우에, 핵산은 많아야 약 1 pg, 10 pg, 100 pg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 μg, 10 μg, 100 μg, 200 μg, 300 μg, 400 μg, 500 μg, 600 μg, 700 μg, 800 μg, 900 μg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng, 500 ng, 600 ng, 700 ng, 800 ng, 900 ng, 1 mg, 10 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg, 1 g, 2 g, 3 g, 4 g, 또는 5 g일 수 있다.
일부 실시양태에서, 자기 상보적 벡터 (sc)가 사용될 수 있다. 자기 상보적 AAV 벡터의 사용은 바이러스 제2 가닥 DNA 합성에 대한 요구 사항을 우회할 수 있고, 본원에 참조로 포함된 문헌 [Wu, Hum Gene Ther. 2007, 18(2):171-82]에 의해 제공된 바와 같이, 트랜스진 단백질의 더 큰 발현 속도를 유발시킬 수 있다.
일부 측면에서, 항-VEGF 트랜스진과 함께 사용하기 위한 가장 최적의 혈청형 및 프로모터의 선택을 허용해 주기 위해 몇 가지 AAV 벡터가 생성될 수 있다.
일부 경우에, 이러한 벡터는 표적화된 벡터, 특히 특이적 세포, 예컨대 망막 세포, 또는 광수용체, 망막 신경절 세포, 뮐러 세포, 양극성 세포, 아마크린 세포, 수평 세포, 또는 망막 색소 상피 세포의 더 높은 감염력을 나타내는 표적화된 rAAV (예를 들어, AAV2.7m8)일 수 있다. 본 개시내용에 사용하기 위한 바이러스 벡터는 대상체에서 낮은 독성 및/또는 낮은 면역원성을 나타내고 대상체, 예를 들어, 인간 환자에서 치료상 유효량의 항-VEGF 트랜스진을 발현하는 것을 포함할 수 있다.
본원에는 비-인간 영장류 또는 인간 대상체에서 7m8 변이체 캡시드 단백질, 또는 rAAV2.7m8, 및 항-VEGF 트랜스진을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV를 사용하여, 항-VEGF 작용제를 코딩하는 핵산을 대상체의 표적 망막 세포 내로 전달하기 위한 제약 조성물 및 방법이 개시된다. 일부 경우에, 유전자 요법을 통한 항-VEGF 작용제의 전달은 본원에 개시된 안구 질환 또는 병태를 적어도 부분적으로 완화 또는 방지하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, rAAV 변이체 (예를 들어, 7m8 변이체)의 망막 세포 감염력에 있어서의 증가는 상응하는 모 또는 비변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교 시 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 100%이다. 일부 실시양태에서, 망막 세포의 감염력에 있어서의 증가는 상응하는 모 또는 비변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교 시 5% 내지 100%, 5% 내지 95%, 5% 내지 90%, 5% 내지 85%, 5% 내지 80%, 5% 내지 75%, 5% 내지 70%, 5% 내지 65%, 5% 내지 60%, 5% 내지 55%, 5% 내지 50%, 5% 내지 45%, 5% 내지 40%, 5% 내지 35%, 5% 내지 30%, 5% 내지 25%, 5% 내지 20%, 5% 내지 15%, 5% 내지 10%의 증가이다.
일부 실시양태에서, rAAV 변이체의 망막 세포 감염력에 있어서의 증가는 상응하는 모 또는 비변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교해서 적어도 1배, 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 또는 적어도 2배이다. 일부 실시양태에서, 감염력에 있어서의 증가는 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교 시 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배이다. 일부 실시양태에서, 감염력에 있어서의 증가는 상응하는 모 또는 비변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교해서 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 35배, 적어도 40배, 적어도 45배, 적어도 50배, 적어도 55배, 적어도 60배, 적어도 65배, 적어도 70배, 적어도 75배, 적어도 80배, 적어도 85배, 적어도 90배, 또는 적어도 100배이다.
일부 실시양태에서, 망막 세포 감염력에 있어서의 증가는 상응하는 모 또는 비변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교 시 10배 내지 100배, 10배 내지 95배, 10배 내지 90배, 10배 내지 85배, 10배 내지 80배, 10배 내지 75배, 10배 내지 70배, 10배 내지 65배, 10배 내지 60배, 10배 내지 55배, 10배 내지 50배, 10배 내지 45배, 10배 내지 40배, 10배 내지 35배, 10배 내지 30배, 10배 내지 25배, 10배 내지 20배, 또는 10배 내지 15배이다.
일부 실시양태에서, 망막 세포 감염력에 있어서의 증가는 상응하는 모 또는 비변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교 시 2배 내지 20배, 2배 내지 19배, 2배 내지 18배, 2배 내지 17배, 2배 내지 16배, 2배 내지 15배, 2배 내지 14배, 2배 내지 13배, 2배 내지 12배, 2배 내지 11배, 2배 내지 10배, 2배 내지 9배, 2배 내지 8배, 2배 내지 7배, 2배 내지 6배, 2배 내지 5배, 2배 내지 4배, 또는 2배 내지 3배이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 캡시드 단백질의 아미노산 변형은 대상체의 눈에서 내부 제한 막 (ILM)을 가로지를 수 있는, 상응하는 모 또는 비변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온의 능력과 비교 시, 영장류 또는 인간 대상체의 눈에서 ILM을 가로지를 수 있는 능력에 있어서의 증가를 부여해 줄 수 있다. 일부 실시양태에서, ILM을 가로지를 수 있는 능력에 있어서의 증가는 상응하는 모 또는 비변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교 시 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 100%의 증가이다. 일부 실시양태에서, ILM을 가로지를 수 있는 능력에 있어서의 증가는 모 또는 비변형된 AAV 캡시드 단백질과 비교 시 5% 내지 100%, 5% 내지 95%, 5% 내지 90%, 5% 내지 85%, 5% 내지 80%, 5% 내지 75%, 5% 내지 70%, 5% 내지 65%, 5% 내지 60%, 5% 내지 55%, 5% 내지 50%, 5% 내지 45%, 5% 내지 40%, 5% 내지 35%, 5% 내지 30%, 5% 내지 25%, 5% 내지 20%, 5% 내지 15%, 또는 5% 내지 10%의 증가이다.
일부 실시양태에서, ILM을 가로지를 수 있는 능력에 있어서의 증가는 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교해서 적어도 1배, 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 또는 적어도 2배이다. 일부 실시양태에서, ILM을 가로지를 수 있는 능력에 있어서의 증가는 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교 시 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배이다. 일부 실시양태에서, ILM을 가로지를 수 있는 능력에 있어서의 증가는 상응하는 모 또는 비변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교해서 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 35배, 적어도 40배, 적어도 45배, 적어도 50배, 적어도 55배, 적어도 60배, 적어도 65배, 적어도 70배, 적어도 75배, 적어도 80배, 적어도 85배, 적어도 90배, 또는 적어도 100배이다.
일부 실시양태에서, ILM을 가로지를 수 있는 능력에 있어서의 증가는 상응하는 모 또는 비변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교 시 10배 내지 100배, 10배 내지 95배, 10배 내지 90배, 10배 내지 85배, 10배 내지 80배, 10배 내지 75배, 10배 내지 70배, 10배 내지 65배, 10배 내지 60배, 10배 내지 55배, 10배 내지 50배, 10배 내지 45배, 10배 내지 40배, 10배 내지 35배, 10배 내지 30배, 10배 내지 25배, 10배 내지 20배, 또는 10배 내지 15배이다.
일부 실시양태에서, ILM을 가로지를 수 있는 능력에 있어서의 증가는 상응하는 모 또는 비변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교 시 2배 내지 20배, 2배 내지 19배, 2배 내지 18배, 2배 내지 17배, 2배 내지 16배, 2배 내지 15배, 2배 내지 14배, 2배 내지 13배, 2배 내지 12배, 2배 내지 11배, 2배 내지 10배, 2배 내지 9배, 2배 내지 8배, 2배 내지 7배, 2배 내지 6배, 2배 내지 5배, 2배 내지 4배, 또는 2배 내지 3배이다.
일부 실시양태에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 및 HIV-기반 바이러스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서 HIV-기반 바이러스 벡터가 사용될 수 있으며, 여기서 이러한 HIV-기반 바이러스 벡터는 적어도 2개의 벡터를 포함하고, 여기서 gag 및 pol 유전자는 HIV 게놈으로부터의 것이고 env 유전자는 또 다른 바이러스로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, DNA 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 이들 벡터는 폭스 벡터, 예컨대 오르토폭스 또는 아비폭스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 예컨대 단순 포진 I 바이러스 (HSV) 벡터 (문헌 [Geller, A. I. et al., J. Neurochem, 64: 487 (1995); Lim, F., et al., in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995); Geller, A. I. et al., Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A.: 90 7603 (1993); Geller, A. I., et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA: 87:1149 (1990)]), 아데노바이러스 벡터 (문헌 [LeGal LaSalle et al., Science, 259:988 (1993); Davidson, et al., Nat. Genet. 3: 219 (1993); Yang, et al., J. Virol. 69: 2004 (1995)]) 및 아데노 연관 바이러스 벡터 (문헌 [Kaplitt, M. G., et al., Nat. Genet. 8:148 (1994)]) (이들 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다)를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터일 수 있다. 본 개시내용에 사용하기 위한 렌티바이러스 벡터는 인간 및 비-인간 (SIV 포함) 렌티바이러스로부터 유래될 수 있다. 렌티바이러스 벡터의 예는 벡터 번식에 필요한 핵산 서열뿐만 아니라 항-VEGF 단백질 유전자와 작동 가능하게 연결된 조직 특이적 프로모터를 포함할 수 있다. 핵산 서열은 바이러스 LTR, 프라이머 결합 부위, 폴리퓨린 트랙, att 부위, 및 캡시드로 둘러 싸인 부위를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 벡터는 알파바이러스 벡터일 수 있다. 알파바이러스-기반 벡터, 예컨대 셈리키 삼림열 바이러스 (SFV) 및 신드비스 바이러스 (SIN)로부터 제조된 것이 또한, 본 개시내용에 사용될 수 있다. 알파바이러스의 사용이 문헌 [Lundstrom, K., Intervirology 43:247-257, 2000 and Perri et al., Journal of Virology 74:9802-9807, 2000] (그 전문이 본원에 참조로 포함된다)에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 벡터는 폭스 바이러스 벡터일 수 있다. 폭스 바이러스 벡터는 유전자를 세포의 세포질 내로 도입시킬 수 있다. 아비폭스 바이러스 벡터는 유전자 또는 핵산의 단기간 발현만을 발생시킬 수 있다. 아데노바이러스 벡터, 아데노 연관 바이러스 벡터 및 단순 포진 바이러스 (HSV) 벡터가 본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 일부 측면에서, 아데노 연관 바이러스보다 더 단기간 발현 (예를 들어, 약 1개월 미만)을 발생시킬 수 있고, 훨씬 더 긴 발현을 나타낼 수 있다. 선택된 특별한 벡터는 표적 세포 및 치료되는 병태에 좌우될 수 있다.
본원에는 관심 유전자 산물을 코딩하는 핵산을 대상체의 표적 세포 내로 전달하기 위한 조성물 및 방법이 개시된다. 일부 경우에, 관심 유전자 산물은 이러한 유전자 산물을 포함하는 벡터의 투여 후에 대상체에게 전달된다. 일부 경우에, 유전자 산물의 전달은 본원에 개시된 질환 또는 병태를 적어도 부분적으로 완화 또는 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에, 상기 조성물은 유전자 요법으로서 사용될 수 있거나 또는 생체 내에서 항-VEGF의 전달 또는 유전자 요법을 위해 적합화된다.
일부 경우에, 벡터, 전달 비히클, 유전자 전달 비히클, 또는 유전자 전이 비히클은 표적 세포, 조직, 또는 대상체에게 전달될 폴리뉴클레오티드를 포함하는 임의의 적합한 거대분자 또는 분자의 복합체를 지칭한다. 일부 경우에, 표적 세포는 핵산 또는 유전자가 전달되는 임의의 세포일 수 있다.
일부 실시양태에서, 벡터, 예를 들어, 있는 그대로의 DNA 또는 플라스미드는 미셀; 마이크로에멀션; 리포솜; 나노 구체; 나노 입자; 나노 캡슐; 고형 지질 나노 입자; 덴드리머; 폴리에틸렌이민 유도체 및 단일벽 탄소 나노 튜브; 및 표적 세포로의 폴리뉴클레오티드의 전달을 매개할 수 있는 다른 거대분자 복합체를 사용하여 세포, 조직, 또는 대상체 내로 전달될 수 있다. 일부 경우에, 벡터는 유기 또는 무기 분자일 수 있다. 일부 경우에, 벡터는 작은 분자 (즉, <5 kD), 또는 거대분자 (즉, >5 kD)이다.
일부 실시양태에서, 벡터는 하나 이상의 핵산이 혼입되는 재조합 바이러스 벡터 (예를 들어, rAAV 벡터)를 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, 핵산은 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함한다. 일부 경우에, 핵산은 유전자 산물, 또는 앱타머의 발현을 위한 DNA 또는 RNA를 포함한다. 일부 경우에 RNA 분자는 관심 유전자의 전사체, 인트론, 비번역된 영역, 종결 서열 등을 포함할 수 있다. 다른 경우에, DNA 분자는 서열, 예컨대 혼성체 프로모터 유전자 서열, 강력한 구성적 프로모터 서열, 관심 유전자, 비번역된 영역, 종결 서열 등을 포함할 수 있다. 일부 경우에, DNA와 RNA의 임의의 조합이 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 표적 세포 또는 대상체 생체 내에서, 예를 들어, 눈 또는 눈의 유리체에 유전자 산물을 전달하기 위한 유전자 요법, 또는 유전자 산물의 발현을 매개하는 벡터로서의 재조합 바이러스를 제공한다. 임의의 적합한 재조합 바이러스 벡터는 본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 사용하기 위해 최적화하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스 (Ad) 또는 아데노 연관 바이러스 (AAV)로부터 유래된 재조합 바이러스 벡터가 사용될 수 있다.
인간과 비-인간 바이러스 벡터 둘 다가 사용될 수 있고, 재조합 바이러스 벡터는 그것이 인간 또는 특정 대상체에서 복제 결함있는 것이 되도록 변경될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 벡터는 유전자 산물 또는 치료제, 예컨대 항-VEGF 작용제를 코딩하는 치료용 트랜스진과 작동 가능하게 연결된 프로모터를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 복제 결함있는 아데노바이러스 또는 rAAV일 수 있다.
일부 실시양태에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 및 HIV-기반 바이러스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서 HIV-기반 바이러스 벡터가 사용될 수 있으며, 여기서 이러한 HIV-기반 바이러스 벡터는 적어도 2개의 벡터를 포함하고, 여기서 gag 및 pol 유전자는 HIV 게놈으로부터의 것이고 env 유전자는 또 다른 바이러스로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, DNA 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 이들 벡터는 폭스 벡터, 예컨대 오르토폭스 또는 아비폭스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 예컨대 단순 포진 I 바이러스 (HSV) 벡터 (문헌 [Geller, A. I. et al., J. Neurochem, 64: 487 (1995); Lim, F., et al., in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995); Geller, A. I. et al., Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A.: 90 7603 (1993); Geller, A. I., et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA: 87:1149 (1990)]), 아데노바이러스 벡터 (문헌 [LeGal LaSalle et al., Science, 259:988 (1993); Davidson, et al., Nat. Genet. 3: 219 (1993); Yang, et al., J. Virol. 69: 2004 (1995)]) 및 아데노 연관 바이러스 벡터 (문헌 [Kaplitt, M. G., et al., Nat. Genet. 8:148 (1994)]) (이들 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다)를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터일 수 있다. 본 개시내용에 사용하기 위한 렌티바이러스 벡터는 인간 및 비-인간 (SIV 포함) 렌티바이러스로부터 유래될 수 있다. 렌티바이러스 벡터의 예는 벡터 번식에 필요한 핵산 서열뿐만 아니라 항-VEGF 단백질 유전자와 작동 가능하게 연결된 조직 특이적 프로모터를 포함할 수 있다. 핵산 서열은 바이러스 LTR, 프라이머 결합 부위, 폴리퓨린 트랙, att 부위, 및 캡시드로 둘러 싸인 부위를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 아데노바이러스 벡터, 아데노 연관 바이러스 벡터, 및 단순 포진 바이러스 (HSV) 벡터가 본 개시내용의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있다. 사용된 특별한 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 또는 AAV)는 표적 세포, 벡터로부터 발현될 치료용 트랜스진 또는 작용제의 크기, 및/또는 치료되는 병태에 좌우될 수 있다.
일부 실시양태에서, 벡터는 아데노 연관 바이러스 (AAV) 벡터이거나 또는 AAV로부터 유래된다. AAV는 작은 비-외피보유 단일 가닥 DNA 바이러스이다. 이들은 비-병원성 인간 파르보바이러스이고, 복제를 위하여, 아데노바이러스, 단순 포진 바이러스, 백시니아 바이러스 및 CMV를 포함한 헬퍼 바이러스에 의존적일 수 있다. 야생형 AAV에 대한 노출은 임의의 인간 병원체를 유발시키는 것으로 공지되지 않거나 또는 이와 연관되지 않을 수 있고, 일반적 집단에서 흔한 것이며, 통상적으로 아데노바이러스 감염과 관련하여 생후 처음 10년 동안 발생한다.
일부 경우에, rAAV는 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 DJ의 천연 또는 야생형 AAV일 수 있다. 일부 경우에, rAAV는 적어도 2개의 혈청형으로부터의 캡시드 단백질을 포함하는 키메라 AAV일 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV 바이러스 또는 비리온은 변이체 AAV 캡시드 단백질을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 변이체 AAV 캡시드 단백질은 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질과 비교하여 치환, 삽입, 결실, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 변형을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, rAAV 비리온은 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질과 비교하여 캡시드 단백질 내에서의 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개 아미노산의 결실을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV 비리온은 캡시드 단백질 내에서의 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 55, 적어도 60, 적어도 65, 적어도 70, 적어도 75, 적어도 80, 적어도 85, 적어도 90, 적어도 95 또는 적어도 100개 아미노산의 결실을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV 비리온은 캡시드 단백질 내에서의 많아야 약 100개 아미노산, 많아야 약 200, 많아야 약 300, 또는 많아야 약 400개 아미노산의 결실을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV 비리온은 캡시드 단백질 내에서의 약 1 내지 약 100, 약 1 내지 약 90, 약 1 내지 약 80, 약 1 내지 약 70, 약 1 내지 약 60, 약 1 내지 약 50, 약 1 내지 약 40, 약 1 내지 약 30, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 15, 약 1 내지 약 10, 또는 약 1 내지 약 5개 아미노산의 결실을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV 비리온은 캡시드 단백질 내에서의 약 5개 아미노산 내지 약 20개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 19개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 18개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 17개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 16개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 15개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 14개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 13개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 12개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 11개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 10개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 9개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 8개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 7개 아미노산, 또는 약 5개 아미노산 내지 약 6개 아미노산의 결실을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, rAAV 비리온은 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질과 비교하여 캡시드 단백질 내에서의 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개 아미노산의 삽입을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV 비리온은 캡시드 단백질 내에서의 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 55, 적어도 60, 적어도 65, 적어도 70, 적어도 75, 적어도 80, 적어도 85, 적어도 90, 적어도 95 또는 적어도 100개 아미노산의 삽입을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV 비리온은 캡시드 단백질 내에서의 많아야 약 100개 아미노산, 많아야 약 200, 많아야 약 300, 또는 많아야 약 400개 아미노산의 삽입을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV 비리온은 캡시드 단백질 내에서의 약 1 내지 약 100, 약 1 내지 약 90, 약 1 내지 약 80, 약 1 내지 약 70, 약 1 내지 약 60, 약 1 내지 약 50, 약 1 내지 약 40, 약 1 내지 약 30, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 15, 약 1 내지 약 10, 또는 약 1 내지 약 5개 아미노산의 삽입을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV 비리온은 캡시드 단백질 내에서의 약 5개 아미노산 내지 약 20개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 19개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 18개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 17개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 16개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 15개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 14개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 13개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 12개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 11개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 10개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 9개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 8개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 7개 아미노산, 또는 약 5개 아미노산 내지 약 6개 아미노산의 삽입을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, rAAV 비리온은 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질과 비교하여 캡시드 단백질 내에서의 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV 비리온은 캡시드 단백질 내에서의 약 1개 아미노산 내지 약 20개 아미노산, 약 1개 아미노산 내지 약 19개 아미노산, 약 1개 아미노산 내지 약 18개 아미노산, 약 1개 아미노산 내지 약 17개 아미노산, 약 1개 아미노산 내지 약 16개 아미노산, 약 1개 아미노산 내지 약 15개 아미노산, 약 1개 아미노산 내지 약 14개 아미노산, 약 1개 아미노산 내지 약 13개 아미노산, 약 1개 아미노산 내지 약 12개 아미노산, 약 1개 아미노산 내지 약 11개 아미노산, 약 1개 아미노산 내지 약 10개 아미노산, 약 1개 아미노산 내지 약 9개 아미노산, 약 1개 아미노산 내지 약 8개 아미노산, 약 1개 아미노산 내지 약 7개 아미노산, 약 1개 아미노산 내지 약 6개 아미노산, 약 1개 내지 약 5개 아미노산, 약 1개 내지 약 4개 아미노산, 약 1개 내지 약 3개 아미노산, 또는 약 1개 내지 약 2개 아미노산의 치환을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, rAAV 비리온은 상응하는 모, 비변형된 캡시드 단백질과 비교하여 캡시드 단백질 내에서의 적어도 약 1, 적어도 약 2, 적어도 약 3, 적어도 약 4, 적어도 약 5, 적어도 약 6, 적어도 약 7, 적어도 약 8, 적어도 약 9, 적어도 약 10, 적어도 약 11, 적어도 약 12, 적어도 약 13, 적어도 약 14, 적어도 약 15, 적어도 약 16, 적어도 약 17, 적어도 약 18, 적어도 약 19, 또는 적어도 약 20개의 총 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV 비리온은 상응하는 모, 비변형된 캡시드 단백질과 비교하여 캡시드 단백질 내에서의 적어도 약 20, 적어도 약 25, 적어도 약 30, 적어도 약 35, 적어도 약 40, 적어도 약 45, 적어도 약 50, 적어도 약 55, 적어도 약 60, 적어도 약 65, 적어도 약 70, 적어도 약 75, 적어도 약 80, 적어도 약 85, 적어도 약 90, 적어도 약 95, 또는 적어도 약 100개의 총 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV 비리온은 상응하는 모, 비변형된 캡시드 단백질과 비교하여 캡시드 단백질 내에서의 적어도 약 100, 적어도 약 200, 적어도 약 300, 또는 적어도 약 400개의 총 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, rAAV 비리온은 모, 비변형된 AAV 캡시드 단백질의 캡시드 단백질과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 상동인 아미노산 서열을 수반하는 변이체 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 경우에, 변형은 AAV2의 아미노산 587 다음에 올 수 있거나, 또는 또 다른 AAV 혈청형의 캡시드 서브유닛의 상응하는 잔기 다음에 올 수 있다. 잔기 587은 AAV2 캡시드 단백질에 근거한다는 것을 인지해야 한다. 변형은 또한, AAV2 이외의 AAV 혈청형 (예를 들어, AAV8, AAV9 등)에서의 상응하는 부위에 혼입될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 다양한 AAV 혈청형의 캡시드 단백질의 아미노산 서열의 비교에 근거하여, AAV2의 아미노산 587에 상응하는 변형 부위가 임의의 소정의 AAV 혈청형의 캡시드 단백질 내에 존재하는 것을 알 것이다. 예를 들어, AAV1에 대해서는 진뱅크(GenBank) 수탁 번호 NP_049542를 참조하고; AAV5에 대해서는 진뱅크 수탁 번호 AAD13756을 참조하고; AAV6에 대해서는 진뱅크 수탁 번호 AAB95459를 참조하고; AAV7에 대해서는 진뱅크 수탁 번호 YP_077178을 참조하고; AAV8에 대해서는 진뱅크 수탁 번호 YP_077180을 참조하고; AAV9에 대해서는 진뱅크 수탁 번호 AAS99264를 참조하고; AAV10에 대해서는 진뱅크 수탁 번호 AAT46337을 참조한다.
일부 실시양태에서, 아미노산 변형은 단백질 GH 루프 또는 루프 IV 내에서의 약 5개 아미노산 내지 약 11개 아미노산의 삽입이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 변형은 GH 루프를 포함하도록 캡시드 단백질의 용매 노출된 영역을 붕괴시키는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 삽입이다. 일부 구체적 실시양태에서, 변형은 AAV2의 VP1 내의 잔기 587과 588 사이의 아미노산 서열 LGETTRP의 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다른 삽입 또는 AAV2 변이체는 항-VEGF 작용제, 예를 들어, sFLT-1, 라니비주맙, 또는 베바시주맙을 대상체 내로 전달하기 위한 유전자 요법 또는 벡터로서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 캡시드 단백질의 아미노산 변형은 상응하는 모 또는 비변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 망막 세포의 감염력과 비교해서 안구 세포의 감염력에 있어서의 증가를 부여해줄 수 있다. 일부 경우에, 안구 세포는 광수용체 세포 (예를 들어, 간상체; 추상체)일 수 있다. 일부 경우에, 안구 세포는 망막 신경절 세포 (RGC)일 수 있다. 일부 경우에, 망막 세포는 망막 색소 상피 (RPE) 세포일 수 있다. 일부 경우에, 안구 세포는 뮐러 세포일 수 있다. 일부 경우에, 안구 세포는 성상세포일 수 있다. 일부 경우에, 망막 세포는 아마크린 세포, 양극성 세포, 또는 수평 세포를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 감염력에 있어서의 증가는 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교 시 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 100%의 증가이다. 일부 실시양태에서, 감염력에 있어서의 증가는 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교 시 약 5% 내지 약 100%, 약 5% 내지 약 95%, 약 5% 내지 약 90%, 약 5% 내지 약 85%, 약 5% 내지 약 80%, 약 5% 내지 약 75%, 약 5% 내지 약 70%, 약 5% 내지 약 65%, 약 5% 내지 약 60%, 약 5% 내지 약 55%, 약 5% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 45%, 약 5% 내지 약 40%, 약 5% 내지 약 35%, 약 5% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 25%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 15%, 또는 약 5% 내지 약 10%의 증가이다.
일부 실시양태에서, 감염력에 있어서의 증가는 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교해서 적어도 약 1배, 적어도 약 1.1배, 적어도 약 1.2배, 적어도 약 1.3배, 적어도 약 1.4배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 1.6배, 적어도 약 1.7배, 적어도 약 1.8배, 적어도 약 1.9배, 또는 적어도 약 2배이다. 일부 실시양태에서, 감염력에 있어서의 증가는 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교 시 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 또는 적어도 약 10배이다. 일부 실시양태에서, 감염력에 있어서의 증가는 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교해서 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 적어도 약 50배, 적어도 약 55배, 적어도 약 60배, 적어도 약 65배, 적어도 약 70배, 적어도 약 75배, 적어도 약 80배, 적어도 약 85배, 적어도 약 90배, 또는 적어도 약 100배이다.
일부 실시양태에서, 감염력에 있어서의 증가는 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교 시 약 10배 내지 약 100배, 약 10배 내지 약 95배, 약 10배 내지 약 90배, 약 10배 내지 약 85배, 약 10배 내지 약 80배, 약 10배 내지 약 75배, 약 10배 내지 약 70배, 약 10배 내지 약 65배, 약 10배 내지 약 60배, 약 10배 내지 약 55배, 약 10배 내지 약 50배, 약 10배 내지 약 45배, 약 10배 내지 약 40배, 약 10배 내지 약 35배, 약 10배 내지 약 30배, 약 10배 내지 약 25배, 약 10배 내지 약 20배, 또는 약 10배 내지 약 15배이다.
일부 실시양태에서, 감염력에 있어서의 증가는 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교 시 약 2배 내지 약 20배, 약 2배 내지 약 19배, 약 2배 내지 약 18배, 약 2배 내지 약 17배, 약 2배 내지 약 16배, 약 2배 내지 약 15배, 약 2배 내지 약 14배, 약 2배 내지 약 13배, 약 2배 내지 약 12배, 약 2배 내지 약 11배, 약 2배 내지 약 10배, 약 2배 내지 약 9배, 약 2배 내지 약 8배, 약 2배 내지 약 7배, 약 2배 내지 약 6배, 약 2배 내지 약 5배, 약 2배 내지 약 4배, 또는 약 2배 내지 약 3배이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 캡시드 단백질의 아미노산 변형은 대상체의 눈에서 내부 제한 막 (ILM)을 가로지를 수 있는, 상응하는 모 또는 비변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온의 능력과 비교해서, 상기 대상체의 눈에서 ILM을 가로지를 수 있는 능력에 있어서의 증가를 부여해 줄 수 있다.
일부 실시양태에서, ILM을 가로지를 수 있는 능력에 있어서의 증가는 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교 시 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 100%의 증가이다. 일부 실시양태에서, ILM을 가로지를 수 있는 능력에 있어서의 증가는 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교 시 약 5% 내지 약 100%, 약 5% 내지 약 95%, 약 5% 내지 약 90%, 약 5% 내지 약 85%, 약 5% 내지 약 80%, 약 5% 내지 약 75%, 약 5% 내지 약 70%, 약 5% 내지 약 65%, 약 5% 내지 약 60%, 약 5% 내지 약 55%, 약 5% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 45%, 약 5% 내지 약 40%, 약 5% 내지 약 35%, 약 5% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 25%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 15%, 또는 약 5% 내지 약 10%의 증가이다.
일부 실시양태에서, ILM을 가로지를 수 있는 능력에 있어서의 증가는 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교해서 적어도 약 1배, 적어도 약 1.1배, 적어도 약 1.2배, 적어도 약 1.3배, 적어도 약 1.4배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 1.6배, 적어도 약 1.7배, 적어도 약 1.8배, 적어도 약 1.9배, 또는 적어도 약 2배이다. 일부 실시양태에서, ILM을 가로지를 수 있는 능력에 있어서의 증가는 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교 시 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 또는 적어도 약 10배이다. 일부 실시양태에서, ILM을 가로지를 수 있는 능력에 있어서의 증가는 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교해서 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 적어도 약 50배, 적어도 약 55배, 적어도 약 60배, 적어도 약 65배, 적어도 약 70배, 적어도 약 75배, 적어도 약 80배, 적어도 약 85배, 적어도 약 90배, 또는 적어도 약 100배이다.
일부 실시양태에서, ILM을 가로지를 수 있는 능력에 있어서의 증가는 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교 시 약 10배 내지 약 100배, 약 10배 내지 약 95배, 약 10배 내지 약 90배, 약 10배 내지 약 85배, 약 10배 내지 약 80배, 약 10배 내지 약 75배, 약 10배 내지 약 70배, 약 10배 내지 약 65배, 약 10배 내지 약 60배, 약 10배 내지 약 55배, 약 10배 내지 약 50배, 약 10배 내지 약 45배, 약 10배 내지 약 40배, 약 10배 내지 약 35배, 약 10배 내지 약 30배, 약 10배 내지 약 25배, 약 10배 내지 약 20배, 또는 약 10배 내지 약 15배이다.
일부 실시양태에서, ILM을 가로지를 수 있는 능력에 있어서의 증가는 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온과 비교 시 약 2배 내지 약 20배, 약 2배 내지 약 19배, 약 2배 내지 약 18배, 약 2배 내지 약 17배, 약 2배 내지 약 16배, 약 2배 내지 약 15배, 약 2배 내지 약 14배, 약 2배 내지 약 13배, 약 2배 내지 약 12배, 약 2배 내지 약 11배, 약 2배 내지 약 10배, 약 2배 내지 약 9배, 약 2배 내지 약 8배, 약 2배 내지 약 7배, 약 2배 내지 약 6배, 약 2배 내지 약 5배, 약 2배 내지 약 4배, 또는 약 2배 내지 약 3배이다.
유전자 요법의 한 가지 이점은 치료제, 예컨대 본원에 개시된 바와 같은 항-VEGF 작용제를 덜 자주 투여해도 되고, 단백질을 투여하는 통상적인 방법과 비교 시 치료제의 연장되거나 또는 지속적인 방출을 제공해준다는 것이다. 특이적 관심 조직 또는 세포 유형을 표적으로 하는 벡터, 예를 들어, AAV2.7m8을 활용하는 유전자 요법은 또한, 표적을 벗어난 효과를 최소화할 수 있거나, 또는 치료제, 예컨대 항-VEGF 작용제의 더 표적화된 전달을 제공해줄 수 있다. 유전자 요법을 통한 생체 내 항-VEGF 작용제의 연장되거나 또는 지속적인 전달을 고려하여, 상기 제약 조성물을 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 또는 그 초과에 1회 이하 투여할 수 있을 것이다.
치료제
일부 실시양태에서, 유전자 요법은 비-인간 영장류 또는 인간 대상체의 눈 또는 눈의 유리체에 투여하는 데 적합하거나 또는 투여하기 위해 적합화된, 항-VEGF 활성을 갖는 치료용 트랜스진을 전달하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 캡시드 변이체를 포함하는 rAAV (예를 들어, AAV2.7m8)는 항-VEGF 작용제를 코딩하는 이종 핵산 서열을 포함하고, 대상체에 대한 유리체 내 또는 망막 하 주사 시 항-VEGF 유전자의 서열을 망막 세포에 전달하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 유전자를 포함하는 rAAV는 유전자 요법 및 유리체 내 주사를 위하여 제형화된다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 유전자는 그의 기능적 단편 또는 변이체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 작용제, 예컨대 sFLT-1, 라니비주맙, 또는 베바시주맙의 핵산 서열은 용이하게 입수 가능한 그의 아미노산 서열로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 작용제, 예컨대 sFLT-1, 라니비주맙, 또는 베바시주맙의 핵산 서열은 대상체에서의 그의 발현을 개선시키기 위해 추가로 코돈 최적화된다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 작용제의 핵산 서열 및/또는 아미노산 서열은 생체 내에서의 그의 활성, 발현, 안정성, 및/또는 용해도를 증강시키도록 변형된다.
코돈 최적화는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 코돈 최적화는 천연 서열의 적어도 하나의 코돈 (예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100개 또는 그 초과의 코돈)을, 천연 아미노산 서열을 유지하는 동안 숙주 세포에 더 자주 사용되거나 또는 가장 자주 사용되는 코돈으로 대체함으로써, 관심 표적 또는 숙주 세포, 예를 들어, 인간 망막 세포에서의 특정 유전자의 증강된 발현을 위하여 핵산 서열을 변형시키는 프로세스를 지칭한다. 예를 들어, 젠스크립트(GenScript) 코돈 활용 빈도 테이블 도구 (http://www.genscript.com/tools/codon-frequency-table); 코돈 활용 데이터베이스 (http://www.kazusa.or.jp/codon/; 및 문헌 [Nakamura, Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)])를 포함한 코돈 활용 테이블이 용이하게 입수 가능하다.
일부 실시양태에서, 유전자 요법에서 코딩된 항-VEGF 작용제의 아미노산 서열은 하기 항-VEGF 작용제 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 99.99% 또는 100% 상동이다: sFLT-1, 라니비주맙, 또는 베바시주맙. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 유전자 요법 또는 rAAV에 사용된 핵산 서열을 sFLT-1, 라니비주맙, 또는 베바시주맙 중 어느 하나의 아미노산 서열의 상응하는 cDNA 서열과 비교하며, 이는 sFLT-1, 라니비주맙, 또는 베바시주맙 중 어느 하나의 핵산 서열 간에 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 99.99% 또는 100% 서열 상동성을 나타낸다. 일부 경우에, 유전자 요법으로부터 발현된 항-VEGF는 sFLT-1, 라니비주맙, 또는 베바시주맙 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 99.99% 또는 100% 공간상 상동이다 (예를 들어, 그의 2차, 3차, 및 4차 구조 또는 입체 형태의 관점에서). 일부 경우에, 본원에 개시된 제약 조성물 및 방법의 항-VEGF 작용제는 표준 진료에 사용된 sFLT-1, 라니비주맙, 또는 베바시주맙 중 어느 하나와 많아야 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 99.99% 또는 100% 공간상 상동이다 (예를 들어, 2차, 3차, 및 4차 구조 또는 입체 형태).
일부 경우에, rAAV에 근거한 유전자 요법에 포함된 바와 같은 항-VEGF 작용제는 본원에 개시된 바와 같은 캡시드 변이체 (예를 들어, 7m8 변이체)를 포함하고, 항-VEGF 작용제 (예를 들어, sFLT-1, 라니비주맙, 또는 베바시주맙)의 상응하는 cDNA 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100% 상동성을 갖는 단백질, 융합 단백질, 또는 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 및 제약 조성물은 sFLT-1, 라니비주맙, 또는 베바시주맙, 또는 그의 기능적 단편 또는 변이체 또는 돌연변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, sFLT-1, 라니비주맙, 또는 베바시주맙 중 임의의 것의 핵산 서열은 생체 내에서의 그의 활성, 발현, 및/또는 용해도를 증강시키도록 변형되거나 또는 코돈 최적화된다.
일부 실시양태에서, AAV2.7m8은 sFLT-1, 라니비주맙, 또는 베바시주맙 중 어느 하나에 대한 유전자 요법 또는 전달 시스템으로서 사용된다. AAV2.7m8-sVEGFR-1은 AAV2의 캡시드 단백질 VP1의 위치 587과 588 사이에 7m8 삽입을 포함하고 sVEGFR-1을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV2를 지칭한다. AAV2.7m8-라니비주맙은 AAV2의 캡시드 단백질 VP1의 위치 587과 588 사이에 7m8 삽입을 포함하고 라니비주맙을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV2를 지칭한다.
본 개시내용은 하나 이상의 치료제를 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 방법 및 제약 조성물을 고려한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 항-VEGF 작용제이다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 작용제는 rAAV 벡터 또는 유전자 요법으로부터 발현되거나, 또는 생체 내에서 표적 세포, 조직, 또는 대상체 내로 전달된다. 유전자 요법은 치료제, 예를 들어, 항-VEGF 작용제를 생체 내에서 연장된 기간 동안 제공하는 이점을 가지며, 단백질 기반 요법의 투여와 비교 시 반복적인 주사에 대한 필요성을 감소시켜 준다. 이러한 유전자 요법의 이점은 생체 내에서 치료제의 보다 지속적인 전달을 유발시킬 수 있으며, 이는 현재의 표준 진료에 비해 개선을 제공해 준다. 부가적으로, 유전자 요법은 또한, 생체 내에서, 예를 들어, 표적 세포에 대한 치료제의 더 표적화된 전달을 제공할 수 있고, 표적을 벗어난 효과를 최소화시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 유전자 산물은, 발현될 때 대상체의 눈에서의 혈관신생의 저하를 발생시킬 수 있는 폴리펩티드일 수 있다. 일부 경우에, 이와 같이 발현된 폴리펩티드는 항-혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 단백질 또는 펩티드, 또는 혈관형성 억제제일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 유전자 산물은 VEGF를 표적으로 할 수 있거나 또는 VEGF를 적어도 부분적으로 억제할 수 있는 항-VEGF 항체 또는 그의 단편일 수 있다. 일부 경우에, 상기 항체는 가변 영역과 Fc 영역 둘 다를 포함하는 완전한 길이의 항체일 수 있다. 일부 경우에, 상기 항체는 단일 쇄 fv 단편일 수 있다. 일부 경우에, 상기 항체는 VEGF 에피토프에 대한 규정된 결합 친화도를 가질 수 있다. 일부 경우에, 상기 항체는 적어도 약 1 mM, 적어도 약 100 μM, 적어도 약 10 μM, 적어도 약 1 μM, 적어도 약 100 nM, 적어도 약 10 nM, 적어도 약 1 nM, 적어도 약 100 pM, 적어도 약 10 pM, 또는 적어도 약 1 pM의 Kd를 가질 수 있다. 일부 경우에, 항-VEGF 작용제는 상응하는 내인성 VEGFR 또는 VEGF보다 더 강력하게 내인성 VEGF 또는 VEGFR과 결합한다. 항-VEGF 작용제의 더 강력한 결합은 항-VEGF 작용제가 내인성 VEGF를 격리시키도록 허용해 주거나 또는 내인성 단백질이 내인성 VEGFR과 상호 작용하는 것을 차단시킬 수 있게 해준다.
일부 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 인간화 모노클로날 항체일 수 있다. 일부 경우에, 인간화 모노클로날 항체는 rhuMab일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 라니비주맙, 모노클로날 항체 단편, 또는 그의 변이체 또는 단편일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 베바시주맙, 재조합 인간화 모노클로날 항체, 또는 그의 변이체 또는 단편일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 작용제는 PAN-90806, 또는 그의 변이체 또는 단편이다. 일부 실시양태에서, 치료제는 본원에 개시된 바와 같은 항-VEGF 작용제, 예를 들어, 항체, 항체 단편, 모노클로날 항체, 인간화 모노클로날 항체, 융합 단백질, 앱타머 등을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열이다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 작용제는 VEGF와 결합하는 가용성의 수용체 유인체이거나, 또는 생체 내에서 VEGF를 격리시킬 수 있는 하나 이상의 VEGF 수용체의 가용성 형태이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 치료제는 핵산, 예컨대 앱타머, 간섭 RNA, mRNA 등일 수 있다. 일부 경우에, 앱타머는 페갑타닙(pegaptanib)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료제는 스테로이드 또는 작은 분자일 수 있다. 일부 경우에, 스테로이드는 코르티코스테로이드일 수 있다. 코르티코스테로이드의 예는 트리암시놀론, 덱사메타손, 플루오시놀론 아세토니드, 코르티손, 프레드니솔론, 플루메톨론, 및 그의 유도체를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 스테로이드는 항-염증 스테로이드일 수 있다.
본 개시내용의 재조합 바이러스, 유전자 요법, 제약 조성물, 및 방법은 미국 특허 번호 5,712,380, 5,861,484 및 7,071,159에 개시된 바와 같고 또한 미국 공개 번호 2014/0371438에 기재된 바와 같은 VEGF-결합 단백질 또는 그의 기능적 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는 항-VEGF 단백질을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 sFLT-1 단백질, 라니비주맙, 또는 베바시주맙을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 유전자 요법, 제약 조성물, 및 방법은 항-VEGF 단백질, 예를 들어, sFlt-1을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 작용제는 sFlt-1 도메인 2의 서열 또는 상기 서열을 포함한, sFlt-1의 기능적 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 항-VEGF 작용제는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 표준 기술인 유전 코드를 사용하여 상기 서열을 코딩하는 DNA로부터 발현된 서열 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "sFlt-1 단백질" 또는 "sFlt" 또는 "sVEGFR-1"은 인간 sFLT-1 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100% 상동성을 수반한 폴리펩티드 서열, 또는 그의 기능적 단편 또는 변이체를 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용되므로, sFlt-1 단백질 또는 폴리펩티드는 생체 내에서 VEGF 및/또는 VEGF 수용체와 결합한다. 도 2는 sFlt-1의 핵산 서열을 예시한다. 상동성은 두 서열 간의 정렬의 잔기의 % 보존을 지칭한다 (예를 들어, 자연적으로 발생하는 인간 sFLT-1 단백질은 기능적 단편, 삽입, 결실, 치환을 포함하는 서열, 가성 단편, 가성 유전자, 스플라이스 변이체 또는 인공적으로 최적화된 서열을 포함하나 이에 제한되지는 않는 sFLT-1의 임의의 적합한 변이체를 포함할 수 있다). 일부 경우에, "sFLT-1 단백질"은 자연적으로 발생하는 인간 sFLT-1 단백질 서열과 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 상동이다. 일부 실시양태에서, "sFLT-1 단백질"은 자연적으로 발생하는 인간 sFLT-1 단백질 서열과 많아야 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 상동이다. 일부 경우에, "sFLT-1 단백질"은 자연적으로 발생하는 인간 sFLT-1 단백질 입체 형태와 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 공간상 상동이다. 일부 경우에, "sFLT-1 단백질"은 자연적으로 발생하는 인간 sFLT-1 단백질 입체 형태와 많아야 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 공간상 상동이다.
일부 경우에, VEGF 수용체 FLT-1의 가용성의 말단절단된 형태인 sFLT-1은 VEGF의 유일하게 공지된 내인성 억제제이다. sFLT-1은 교대 RNA 스플라이싱에 의해 생성될 수 있고, 막 근위 이뮤노글로불린 유사 도메인, 막횡단 확장 영역 및 세포내 티로신-키나제 도메인이 결여된다.
일부 경우에, sFLT-1을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 유전자 요법 또는 제약 조성물의 투여는 내인성 VEGF와 결합하거나 또는 이를 격리시킴으로써, 또는 VEGF 수용체 FLTt-1 및 FLK-1/KDR의 막 확장 이소형과 불활성 이종이량체를 형성함으로써, VEGF 또는 생체 내에서의 그의 활성를 억제 또는 저하시킬 수 있다. 이러한 sFLT-1의 특성이 문헌 [Kendall and Thomas, 1993; Proc Natl Acad. Sci. 90: 10705-10709] (이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다)에 기재되었다. 일부 실시양태에서, sFLT-1의 기능적 단편이 완전한 길이의 단백질 대신 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, VEGF 결합 도메인 (도메인 2), 또는 또 다른 한편으론 KDR, 또는 또 다른 계열 구성원이 VEGF와 결합하고 이를 불활성화시키기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법 및 제약 조성물은 베바시주맙 또는 라니비주맙인 항-VEGF 작용제, 그의 기능적 단편 또는 변이체를 포함한다 (Catt Research, Group; Martin, DF; Maguire, MG; Ying, GS; Grunwald, JE; Fine, SL; Jaffe, GJ (2011). "Ranibizumab and Bevacizumab for Neovascular Age-Related Macular Degeneration". New England Journal of Medicine. 364 (20): 1897-1908).
라니비주맙 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열은 드럭뱅크(DrugBank) 데이터베이스, 수탁 번호 DB01270 하에 공개적으로 입수 가능하다:
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베바시주맙 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열은 드럭뱅크 데이터베이스, 수탁 번호 DB00112 (BTD00087, BIOD00087) 하에 공개적으로 입수 가능하다:
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베바시주맙은 모든 VEGF-A 이소형과 결합하고 VEGF-A를 억제함으로써 혈관형성을 차단시키는 재조합 인간화 모노클로날 IgG1 항체이다 (Los, M.; Roodhart, J. M. L.; Voest, E. E. (2007). "Target Practice: Lessons from Phase III Trials with Bevacizumab and Vatalanib in the Treatment of Advanced Colorectal Cancer". The Oncologist. 12 (4): 443-50; Shih, T; Lindley, C (November 2006). "Bevacizumab: an angiogenesis inhibitor for the treatment of solid malignancies." Clinical therapeutics. 28 (11): 1779-802).
라니비주맙은 재조합 인간화 IgG1 카파 이소형 모노클로날 항체 단편이고, 베바시주맙보다 더 높은 친화도로 모든 VEGF-A 이소형과 결합한다. 라니비주맙에는 Fc 영역이 결여된다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 작용제는 베바시주맙 또는 라니비주맙, 또는 그의 기능적 단편 또는 변이체이다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 작용제는 아미노산 및/또는 핵산 (예를 들어, cDNA) 서열에 있어서 베바시주맙 또는 라니비주맙과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 99.99% 또는 100% 상동이다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 작용제는 실제로 사용되는 것으로 공지된 아미노산 및/또는 핵산 (예를 들어, cDNA) 서열에 있어서 베바시주맙 또는 라니비주맙과 많아야 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 99.99% 또는 100% 상동이다. 일부 경우에, 항-VEGF 작용제는 2차, 3차, 또는 4차 구조를 포함한 베바시주맙 또는 라니비주맙 단백질 입체 형태와 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 99.99% 또는 100% 공간상 상동이다.
특정 아미노산 서열을 고려해 볼 때, 이에 상응하는 cDNA 또는 핵산 서열을 용이하게 생성시켜 본원에 개시된 유전자 요법에 사용할 수 있다. 아미노산 서열을 역 번역시키는 방법은 http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/ 하에 이용 가능한 EMBOSS 단백질 서열 역 번역 도구를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 작용제의 핵산 서열은 관련 기술분야에 공지된 기술 중 임의의 것, 예를 들어, 젠스크립트 코돈 활용 빈도 테이블 도구 (http://www.genscript.com/tools/codon-frequency-table); 코돈 활용 데이터베이스 (http://www.kazusa.or.jp/codon/; 및 문헌 [Nakamura, Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)])를 사용하여 코돈 최적화된다.
제약 조성물
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 하나 이상의 활성 성분, 예를 들어, 항-VEGF 작용제, 또는 그의 단편 또는 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 AAV2.7m8 뿐만 아니라 목적하는 치료 또는 예방 효과를 달성하기 위해 유리체 내 또는 망막 하 주사를 통해 인간 환자에게 투여하는 데 적합한 하나 이상의 부형제, 담체, 안정화제, 또는 벌킹제를 함유하는 제형이다.
일부 실시양태에서, rAAV 또는 AAV2.7m8, 및 항-VEGF 작용제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제약 조성물은 재구성된 용액 또는 현탁액으로서 공급된다. 다른 실시양태에서, rAAV 또는 AAV2.7m8, 및 항-VEGF 작용제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제약 조성물은 동결 건조된 형태로 공급되고, 환자에게 투여하기 전에 재구성된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 눈 질환 또는 병태의 치료 또는 예방 방법은 먼저, rAAV (예를 들어, AAV2.7m8) 및 항-VEGF 작용제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 동결 건조된 제약 조성물을 완충제에서 재구성, 용해 또는 가용화시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV (예를 들어, AAV2.7m8) 및 본원에 개시된 바와 같은 항-VEGF 작용제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 이러한 동결 건조된 제약 조성물은 동결 방지제, 계면활성제, 염, 안정화제, 또는 그의 임의의 조합을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, rAAV 또는 AAV2.7m8, 및 항-VEGF 작용제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제약 조성물은 현탁액으로서 공급된다. 일부 실시양태에서, 현탁액은 냉장되어 있다. 일부 실시양태에서, 현탁액은 용액이다. 일부 실시양태에서, 상기 제약 조성물을 함유하는 균질한 용액은 미리 채워진 주사기로서 공급된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 제약 조성물은 현탁액으로서 공급된다. 일부 실시양태에서, 현탁액은 냉장되어 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 눈 질환 또는 병태의 치료 또는 예방 방법은 환자에게 투여하거나 또는 유리체 내 주사하기 전에 상기 냉장된 현탁액을 실온으로 가온시키고/시키거나 균등한 분배를 보장하도록 현탁액을 진탕시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 현탁액은 환자에게 투여하기 전에 희석시킨다. 일부 실시양태에서, 이러한 제약 조성물은 계면활성제, 염, 안정화제, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물을 함유하는 현탁액은 미리 채워진 주사기로서 공급된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 유전자 요법 또는 제약 조성물은 현탁액으로서 또는 냉장된 현탁액으로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 현탁액은 제약상 허용되는 부형제, 예를 들어, 계면활성제, 글리세롤, 비이온성 계면활성제, 완충제, 글리콜, 염, 및 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염산 및 수산화나트륨이 용액의 pH를 조정하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 냉장된 현탁액은 중성 pH, 또는 pH 6.5 내지 7.5 하에 있다. 일부 실시양태에서, 냉장된 현탁액의 pH는 약간 염기성 (예를 들어, pH 약 7.5, 8, 8.2, 8.4, 8.5, 또는 9)이다. 일부 실시양태에서, 냉장된 현탁액 또는 용액의 pH는 약간 산성 (예를 들어, pH 약 6.5, 6.3, 6.1, 6, 5.5, 또는 5)이다. 일부 실시양태에서, 냉장된 현탁액은 용액이다. 일부 실시양태에서, 냉장된 현탁액은 미셀을 포함한다. 일부 실시양태에서, 냉장된 현탁액은 투여 전에 진탕시킨다.
일부 실시양태에서, rAAV (예를 들어, AAV2.7m8) 및 본원에 개시된 바와 같은 항-VEGF 작용제를 포함하는 유전자 요법은 본원에 개시된 동결 건조되거나 또는 냉동 건조된 제약 조성물, 및 동결 건조된 제약 조성물을 용해, 희석 또는 재구성하기 위한 완충 용액을 포함하는 키트로서 공급된다. 일부 실시양태에서, 키트는 rAAV (예를 들어, AAV2.7m8)를 포함하는 냉동 건조되거나 또는 동결 건조된 제약 조성물, 및 이러한 제약 조성물을 목적하는 농도 또는 용적으로 재구성하기 위한 용액을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 키트는 본원에 개시된 제약 조성물의 재구성 시 응집되는 것을 방지하는 데 도움을 주는 완충제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 작용제를 포함하는 유전자 요법은 현탁액으로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 미리 채워진 주사기에 제공된다. 일부 실시양태에서, 키트는 이중 챔버 주사기를 포함하며, 여기서 이러한 챔버 중 하나가 제약 조성물을 용해 또는 희석시키기 위한 완충제를 함유한다.
일부 실시양태에서, 키트는 주사를 위한 주사기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 재구성된 용액은 투여 전에 여과시킨다. 일부 실시양태에서, 키트는 환자에게 투여하기 전에 키트 내의 제약 조성물을 여과시키기 위한 필터 또는 필터 주사기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 저장 안정성과 조작의 편의성을 위하여, rAAV (예를 들어, AAV2.7m8) 및 본원에 개시된 바와 같은 항-VEGF 작용제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제약 조성물은 동결 건조 (즉, 냉동 건조)되거나 또는 진공 건조된 분말로서 제형화될 수 있으며, 이는 대상체에게 투여하기에 앞서 식염수, 완충제, 또는 물로 재구성될 수 있다. 또 다른 한편으론, 제약 조성물은 수성 용액 또는 현탁액으로서 제형화될 수 있다. 제약 조성물은 본원에 개시된 바와 같은 항-VEGF 작용제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV 비리온 또는 입자를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상이한 바이러스 또는 전달 시스템, 예를 들어, 나노 입자 또는 지질 기반 복합체가, 본원에 개시된 바와 같은 항-VEGF 작용제를 코딩하는 핵산 서열을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 다양한 부형제, 예컨대 인산염, PBS, 또는 트리스 완충제, 글리콜, 글리세롤, 식염수, 계면활성제 (예를 들어, 플루로닉 또는 폴리소르베이트), 또는 그의 임의의 조합이 제약 조성물을 안정화시키기 위해 사용될 수 있다. 부가적으로, 동결 방지제, 예컨대 알콜, DMSO, 글리세롤, 및 PEG가 동결 건조의 냉동 또는 건조 상태하에 안정화제로서 사용될 수 있거나, 또는 냉장된 현탁액을 만들기 위한 안정화제로서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 항-VEGF 유전자 요법을 포함하는 제약 조성물의 동결 건조된 또는 현탁액은 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 μL의 용적 (또는 재구성된 용적)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 항-VEGF 유전자 요법을 포함하는 제약 조성물의 동결 건조된 또는 현탁액 형태는 0.1 내지 0.5 mL, 0.1 내지 0.2 mL, 0.3 내지 0.5 mL, 0.5 내지 1.0 mL, 0.5 내지 0.7 mL, 0.6 내지 0.8 mL, 0.8 내지 1 mL, 0.9 내지 1.1 mL, 1.0 내지 1.2 mL, 또는 1.0 내지 1.5 mL의 용적을 갖는다. 다른 실시양태에서, 재구성된 용적은 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 또는 1.5 mL 이하이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 제약 조성물은 유리체 내 또는 망막 하 주사를 통해 영장류 (예를 들어, 비-인간 영장류 및 인간 대상체)에게 투여하도록 설계, 조작 또는 적합화된다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 작용제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV 비리온을 포함하는 제약 조성물은 대상체의 눈 내로 유리체 내 주사하도록 제형화된다. 일부 실시양태에서, 상기 제약 조성물은 약 2, 2.5, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200 μL 이하 용적의 유리체 내 주사를 허용해 주는 농도가 되도록 제형화된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 치료 방법은 본원에 개시된 바와 같은 항-VEGF 작용제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV (예를 들어, AAV2.7m8)를 포함하는 용액 또는 현탁액의 약 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150 μL의 용적의 유리체 내 주사를 포함한다.
일부 경우에, 본원에 기재된 항-VEGF 트랜스진의 핵산 서열을 포함하는 AAV2.7m8 비리온이 유전자 요법 제약 조성물의 한 성분일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 7m8 변이체 캡시드 단백질을 포함하는 임의의 혈청형의 rAAV 비리온이 동결 건조된 제약 조성물 또는 제약 조성물의 현탁액을 만들기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV 비리온은 rAAV2이다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물의 동결 건조된 형태 또는 현탁액 형태는 7m8 변이체 캡시드 단백질, 및 본원에 개시된 바와 같은 항-VEGF 작용제를 코딩하는 DNA 서열을 갖는 rAAV2를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 제약 조성물은 인간 환자 또는 비-인간 영장류에서의 치료제로서의 항-VEGF 작용제의 유리체 내 전달을 위하여 또는 유전자 요법을 위해 적합화된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물의 단위 용량은 1x1010 내지 1x1013 바이러스 게놈 (vg)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단위 용량은 약 2.1x1011, 약 2.1x1012, 또는 약 2.1x1013 벡터 게놈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량은 1x1010 내지 3x1012 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량은 1x109 내지 3x1013 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량은 1x1010 내지 1x1011 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량은 1x108 내지 3x1014 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량은 적어도 1x101, 1x102, 1x103, 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015, 1x1016, 1x1017, 또는 1x1018 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량은 1x1010 내지 5x1013 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량은 많아야 약 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015, 1x1016, 1x1017, 및 1x1018 벡터 게놈이다.
일부 경우에, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량은 pfu (플라크 형성 단위)로서 측정될 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량의 pfu는 약 1x108 내지 약 1x1012 pfu일 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량의 pfu는 적어도 약 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011 또는 1x1012 pfu일 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량의 pfu는 많아야 약 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011 또는 1x1012 pfu일 수 있다.
일부 경우에, 본 개시내용의 바이러스 벡터는 벡터 게놈 (vg)으로서 측정될 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량은 1x1010 내지 1x1013 벡터 게놈일 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량은 1x109 내지 1x1014 벡터 게놈일 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량은 1x1010 내지 1x1011 벡터 게놈일 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량은 1x108 내지 1x1015 벡터 게놈일 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량은 적어도 1x101, 1x102, 1x103, 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015, 1x1016, 1x1017 및 1x1018 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량은 1x108 내지 1x1015 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량은 많아야 약 1x101, 1x102, 1x103, 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015, 1x1016, 1x1017 및 1x1018 벡터 게놈이다. 일부 실시양태에서, 단위 용량은 1010 내지 1011, 1011 내지 1012, 1010 내지 1012, 1012 내지 1013, 1011 내지 1013, 1012 내지 1013, 1012 내지 1014, 1011 내지 1014, 1011 내지 1015, 1012 내지 1015, 1013 내지 1014, 1014 내지 1015, 1015 내지 1016, 1016 내지 1017, 1017 내지 1018, 1018 내지 1019, 또는 1019 내지 1020 벡터 게놈이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량은 1x1010 내지 2x1010, 2x1010 내지 3x1010, 3x1010 내지 4x1010, 4x1010 내지 5x1010, 5x1010 내지 6x1010, 6x1010 내지 7x1010, 7x1010 내지 8x1010, 8x1010 내지 9x1010, 9x1010 내지 10x1010, 1x1011 내지 2x1011, 2x1011 내지 3x1011, 2x1011 내지 2.5x1011, 2.5x1011 내지 3x1011, 3x1011 내지 4x1011, 4x1011 내지 5x1011, 5x1011 내지 6x1011, 6x1011 내지 7x1011, 7x1011 내지 8x1011, 8x1011 내지 9x1011, 9x1011 내지 10x1011, 1x1012 내지 2x1012, 2x1012 내지 3x1012, 2.5x1012 내지 3x1012, 3x1012 내지 4x1012, 4x1012 내지 5x1012, 5x1012 내지 6x1012, 6x1012 내지 7x1012, 7x1012 내지 8x1012, 8x1012 내지 9x1012, 9x1012 내지 10x1012, 1x1013 내지 2x1013, 2x1013 내지 3x1013, 3x1013 내지 4x1013, 4x1013 내지 5x1013, 5x1013 내지 6x1013, 6x1013 내지 7x1013, 7x1013 내지 8x1013, 8x1013 내지 9x1013, 또는 9x1013 내지 10x1013 벡터 게놈이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 rAAV의 단위 용량은 2x1011 내지 8x1011 또는 2x1012 내지 8x1012 벡터 게놈이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 rAAV의 단위 용량은 1010 내지 1013, 1010 내지 1011, 1011 내지 1012, 1012 내지 1013, 또는 1013 내지 1014 벡터 게놈이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 rAAV의 단위 용량은 1x1010 내지 2x1010, 2x1010 내지 4x1010, 3x1010 내지 5x1010, 4x1010 내지 6x1010, 5x1010 내지 7x1010, 6x1010 내지 8x1010, 7x1010 내지 9x1010, 8x1010 내지 1011, 1x1011 내지 2x1011, 2x1011 내지 4x1011, 3x1011 내지 5x1011, 4x1011 내지 6x1011, 5x1011 내지 7x1011, 6x1011 내지 8x1011, 7x1011 내지 9x1011, 8x1011 내지 10x1011, 1x1012 내지 3x1012, 2x1012 내지 4x1012, 3x1012 내지 5x1012, 4x1012 내지 6x1012, 5x1012 내지 7x1012, 6x1012 내지 8x1012, 7x1012 내지 9x1012, 8x1012 내지 10x1012, 1x1013 내지 5x1013, 5x1013 내지 10x1013, 1012 내지 5x1012, 5x1012 내지 1x1013, 7x1012 내지 1x1013, 8x1012 내지 2x1013, 9x1012 내지 2x1013, 9x1012 내지 2x1013, 9x1012 내지 4x1013, 1x1013 내지 3x1013, 1x1013 내지 2x1013, 2x1013 내지 3x1013, 3x1013 내지 4x1013, 4x1013 내지 5x1013, 5x1013 내지 6x1013, 6x1013 내지 7x1013, 7x1013 내지 8x1013, 8x1013 내지 9x1013, 또는 8x1013 내지 1x1014 벡터 게놈이다.
일부 실시양태에서, 더 낮은 양 또는 범위의 벡터 게놈이 응집을 피하기 위한 단위 용량에 선택된다. 일부 실시양태에서, 더 높은 양 또는 범위의 벡터 게놈이 단위 용량에 선택되어, 더 작은 용적이 주사에 사용될 수 있다. 더 작은 용적 (예를 들어, 50, 40, 30, 20, 10, 또는 5 μL 미만)의 주사가 안구 압력에 있어서의 변화 및 유리체 내 주사와 연관된 다른 부작용을 저하시키는 데 도움을 줄 수 있다. 일부 실시양태에서, 더 높은 농도의 rAAV가 또한, 치료용 트랜스진을 표적 세포 내로 효율적으로 전달하는 것을 보장하는 데 도움을 준다.
일부 실시양태에서, 단위 용량은 2E12 내지 6E12 벡터 게놈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단위 용량은 약 1E12, 1.5E12, 2E12, 2.5E12, 3E12, 3.5E12, 4E12, 4.5E12, 5E12, 5.5E12, 6E12, 6.5E12, 7E12, 7.5E12, 8E12, 8.5E12, 9E12, 또는 9.5E12 벡터 게놈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단위 용량은 1E12 내지 1.5E12, 1.5E12 내지 2E12, 2E12 내지 2.5E12, 2.5E12 내지 3.0E12, 3.0E12 내지 3.5E12, 3.5E12 내지 4.0E12, 4.0E12 내지 4.5E12, 4.5E12 내지 5.0E12, 5.0E12 내지 5.5E12, 5.5E12 내지 6.0E12, 6.0E12 내지 6.5E12, 6.5E12 내지 7.0E12, 7.0E12 내지 7.5E12, 7.5E12 내지 8.0E12, 8.0E12 내지 8.5E12, 8.5E12 내지 9.0E12, 9.0E12 내지 9.5E12, 또는 9.5E12 내지 10E12 벡터 게놈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단위 용량은 적어도 1E12, 1.5E12, 2E12, 2.5E12, 3E12, 3.5E12, 4E12, 4.5E12, 5E12, 5.5E12, 6E12, 6.5E12, 7E12, 7.5E12, 8E12, 8.5E12, 9E12, 또는 9.5E12 벡터 게놈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단위 용량은 1E12, 1.5E12, 2E12, 2.5E12, 3E12, 3.5E12, 4E12, 4.5E12, 5E12, 5.5E12, 6E12, 6.5E12, 7E12, 7.5E12, 8E12, 8.5E12, 9E12, 또는 9.5E12 벡터 게놈 이하를 포함한다.
일부 경우에, 본 개시내용의 제약 조성물의 단위 용량은 감염 다중도 (MOI)를 사용하여 측정될 수 있다. 일부 경우에, MOI는 핵산이 전달될 수 있는 세포에 대한 벡터 또는 바이러스 게놈의 비 또는 배수를 지칭할 수 있다. 일부 경우에, MOI는 1x106일 수 있다. 일부 경우에, MOI는 약 1x105 내지 약 1x107일 수 있다. 일부 경우에, MOI는 1x104 내지 1x108일 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 바이러스는 적어도 약 1x101, 1x102, 1x103, 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015, 1x1016, 1x1017 및 1x1018 MOI일 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 바이러스는 약 1x108 내지 약 1x1015 MOI일 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 바이러스는 많아야 약 1x101, 1x102, 1x103, 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015, 1x1016, 1x1017 및 1x1018 MOI일 수 있다. 일부 실시양태에서, MOI는 1x1010 내지 2x1010, 2x1010 내지 4x1010, 3x1010 내지 5x1010, 4x1010 내지 6x1010, 5x1010 내지 7x1010, 6x1010 내지 8x1010, 7x1010 내지 9x1010, 8x1010 내지 1011, 1x1011 내지 2x1011, 2x1011 내지 4x1011, 3x1011 내지 5x1011, 4x1011 내지 6x1011, 5x1011 내지 7x1011, 6x1011 내지 8x1011, 7x1011 내지 9x1011, 8x1011 내지 10x1011, 1x1012 내지 3x1012, 2x1012 내지 4x1012, 3x1012 내지 5x1012, 4x1012 내지 6x1012, 5x1012 내지 7x1012, 6x1012 내지 8x1012, 7x1012 내지 9x1012, 8x1012 내지 10x1012, 1x1013 내지 5x1013, 5x1013 내지 10x1013, 1012 내지 5x1012, 5x1012 내지 1x1013, 7x1012 내지 1x1013, 8x1012 내지 2x1013, 9x1012 내지 2x1013, 9x1012 내지 2x1013, 9x1012 내지 4x1013, 1x1013 내지 3x1013, 1x1013 내지 2x1013, 2x1013 내지 3x1013, 3x1013 내지 4x1013, 4x1013 내지 5x1013, 5x1013 내지 6x1013, 6x1013 내지 7x1013, 7x1013 내지 8x1013, 8x1013 내지 9x1013, 또는 8x1013 내지 1x1014이다.
안구 사용에 적합한 제약 조성물은 멸균성 수성 용액 또는 분산액, 및 멸균성 주사 가능한 용액, 현탁액 또는 분산액의 즉각적인 제조를 위한 멸균성 분말을 포함한다. 유리체 내 투여의 경우, 적합한 담체는 생리학적 식염수, 정균 수, 인산염 완충 식염수 (PBS), 및/또는 등장제, 예를 들어, 글리세롤을 포함한다. 모든 경우에, 상기 제약 조성물은 멸균성이어야만 하고, 용이한 주사 가능성 또는 주사성이 존재할 정도로 유동적이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건하에 안정해야만 하고, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대항하여 보존되어야만 한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 등장제, 예컨대 염 또는 글리세롤을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 계면활성제 또는 안정화제가 제약 조성물에 부가되어 응집을 방지한다.
일부 경우에, 부형제는 담체일 수 있다. 담체는, 예를 들어, 물, 식염수, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 임의의 조합을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적당한 유동성은, 예를 들어, 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에는 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 (예를 들어, 트윈™, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80), 소듐 도데실 술페이트 (소듐 라우릴 술페이트), 라우릴 디메틸 아민 옥시드, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB), 폴리에톡실화 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비탄, 옥톡시놀 (트리톤 X100™), N,N-디메틸도데실아민-N-옥시드, 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드 (HTAB), 폴리옥실 10 라우릴 에테르, 브리즈 721™, 담즙 염 (소듐 데옥시콜레이트, 소듐 콜레이트), 플루론산 (F-68, F-127), 폴리옥실 피마자유 [크레모포르(Cremophor™)], 노닐페놀 에톡실레이트 [테르기톨(Tergitol™)], 시클로덱스트린 및 에틸벤제토늄 클로라이드 [히아민(Hyamine™)]의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 크레솔, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 조성물에 등장제, 예를 들어, 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨을 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 내부 조성물의 연장된 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 야기될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제약 담체는 인산나트륨, 염화나트륨, 폴리소르베이트, 및 수크로스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 계면활성제, 예를 들어, 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트, 폴록사머, 또는 플루로닉을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비이온성 계면활성제의 부가는 현탁액 또는 용액에서의 응집을 저하시킨다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 유용한 제약 조성물은 본 개시내용의 적용을 촉진시키기 위해 키트 내에 패키징될 수 있다. 일부 측면에서, 본 방법은 본 개시내용의 재조합 핵산 (예를 들어, 항-VEGF 작용제의 핵산 서열을 포함하는 rAAV)을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 측면에서, 본 방법은 본 개시내용의 재조합 바이러스의 동결 건조된 형태, 및 환자에게 투여하기 전에 상기 바이러스를 재구성하기 위한 용액을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 키트는 본 개시내용의 재조합 바이러스의 현탁액 형태, 및 이러한 현탁액을 희석시키기 위한 용액을 포함한다. 일부 실시양태에서, 현탁액은 미리 채워진 주사기로서 공급된다. 일부 실시양태에서, 현탁액 또는 그의 키트는 냉장되어 있다. 일부 실시양태에서, 현탁액은 투여 전에 실온으로 가온시킨다. 일부 실시양태에서, 현탁액은 투여 전에 균등한 분배를 보장하기 위해 진탕시킨다.
일부 실시양태에서, 키트는 본원에 제공된 재조합 바이러스, 및 대상체의 눈 또는 망막 세포에 치료상 유효량의 재조합 바이러스를 투여하기 위한 설명서를 포함한다. 일부 측면에서, 키트는 재조합 바이러스를 투여하기 위한 제약상 허용되는 염 또는 용액을 포함한다. 임의로, 키트는 표지 또는 별도의 삽입물의 형태의 적합한 작동적 파라미터에 관한 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 의사 또는 실험실 기술자에게 용액 또는 현탁액으로부터 단위 용량의 재조합 바이러스를 제조하고/하거나 동결 건조된 조성물을 재구성하도록 알리는 표준 설명서를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 임의로, 키트는 투여용 장치, 예컨대 주사기, 필터 바늘, 연장 튜빙, 캐눌라, 또는 망막 하 주사기를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 냉장된 현탁액으로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 냉장된 현탁액은 주사기 및/또는 희석을 위한 완충제를 포함할 수 있는 키트에 제공된다. 일부 실시양태에서, 냉장된 현탁액은 미리 채워진 주사기로서 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 제약 조성물에 사용하기 위한 재조합 바이러스 (예를 들어, rAAV)의 생화학적 정제에 적합한 임의의 방법이 사용될 수 있다. 재조합 AAV 바이러스는 세포로부터, 또는 세포를 포함하는 배양 배지로부터 직접적으로 수거될 수 있다. 바이러스는 rAAV 바이러스의 현탁액을 동결 건조 또는 만들기 전에 다양한 생화학적 수단, 예컨대 겔 여과, 여과, 크로마토그래피, 친화 정제, 구배 초원심분리, 또는 크기 배제 방법을 사용하여 정제될 수 있다.
적응증
일부 경우에, 변이체 캡시드 단백질 및 치료용 트랜스진을 포함하는 임의의 혈청형의 rAAV 비리온, 또는 본원에 기재된 바와 같은 그의 제약 조성물은 눈의 혈관신생과 연관되거나 또는 CNV와 연관된 눈 병태 또는 질환을 적어도 부분적으로 완화시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 캡시드 변이체 단백질을 포함하는 rAAV 비리온은 항-VEGF 트랜스진을 인간 대상체의 눈에 전달하기 위해 사용된다.
본원에 기재된 유전자 요법 또는 제약 조성물의 적응증은 신생혈관 (습성) 연령 관련 황반 변성 (AMD), 망막 정맥 폐색증 (RVO) 후 황반 부종, 당뇨병성 황반 부종 (DME), 망막 정맥 폐색증, 및 DME 환자에서의 당뇨병성 망막병증 (DR)을 포함한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법 및 제약 조성물은, 그에 대한 치료를 위하여 항-VEGF 트랜스진이 승인되거나 또는 권고되는 눈 병태 또는 질환을 예방 또는 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 요법 (예를 들어, AAV2.7m8 기반 유전자 요법)은 CNV, 습성 AMD, 건성 AMD, RVO 후 황반 부종, DME, 및 DME 환자에서의 당뇨병성 망막병증을 포함하나 이에 제한되지는 않는 눈 병태/질환에 대한 적어도 하나의 현재의 표준 진료에 반응하는 눈 병태 또는 질환을 치료 또는 예방하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, rAAV 유전자 요법은 혈관신생 또는 CNV를 특징으로 할 수 있는 임의의 눈 병태 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위해 사용된다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 질환, 예컨대, 예를 들어: AMD, DME, RVO, 혈관형성 관련 질환, 암, 자가면역 질환, 감염성 질환 유기체 등의 치료를 위한, 본원에 제공된 제약 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 눈 병태는 당뇨병성 황반 부종일 수 있다. 당뇨병성 황반 부종 (DME)은 황반 내의 혈관으로부터 유체가 누출되기 때문에 당뇨병에서 망막이 부어 오르는 것이다. 황반은 망막의 중앙 부분, 추상체가 많은 작은 영역, 색을 검출하고 낮의 시력에 의존하는 특수한 신경 종말이다. 황반 부종이 발생함에 따라, 중심부 시야의 중간 또는 바로 옆에서 흐려짐이 발생한다. 당뇨병성 황반 부종으로부터의 시력 상실은 수개월에 걸쳐 진행될 수 있으며 명확하게 초점을 맞추지 못하게 한다. DME의 통상적인 증상은 흐릿한 시력, 부유물, 이중 시력이고, 치료를 받지 않으면 결국에는 실명한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 방법 및 제약 조성물은 DME를 치료하기 위해 사용된다.
일부 실시양태에서, 눈 병태는 망막 정맥 폐색증일 수 있다. 망막 정맥 폐색증은 망막으로부터 혈액을 옮기는 작은 정맥의 막힘이다. 망막은 빛의 영상을 신경 신호로 전환시키고 이를 뇌에 보내는 내부 눈의 뒤쪽에 있는 조직의 층이다. 망막 정맥 폐색증은 동맥 경화 (아테롬성 경화증)와 혈전 형성에 의해 가장 종종 유발된다. 망막에서 더 작은 정맥 (분지 정맥 또는 BRVO)의 막힘은 종종, 아테롬성 경화증에 의해 두껍게 되거나 또는 경화된 망막 동맥이 교차하여 망막 정맥에 압력을 가하는 장소에서 발생한다. 망막 정맥 폐색증의 증상은 한쪽 눈 전체 또는 일부의 갑작스런 흐려짐 또는 시력 상실을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 방법 및 제약 조성물은 망막 정맥 폐색증을 치료하기 위해 사용된다.
일부 실시양태에서, 눈 병태는 습성 AMD로서 공지되기도 한 맥락막 혈관신생 (CNV)일 수 있다. 맥락막 혈관신생은 브루크(Bruch) 막의 파열을 통해 망막 하 색소 상피 (sub-RPE) 또는 망막 하 공간으로 진행되는, 맥락막으로부터 유래되는 새로운 혈관의 성장을 수반할 수 있으며, 이는 시력 상실의 주요 원인이 될 수 있다. CNV는 중심 시력의 갑작스러운 악화를 유발할 수 있으며, 몇 주 내에 눈에 띄게 나타난다. 발생할 수 있는 다른 증상은 색상 장애 및 변시증(metamorphopsia) (직선이 물결 모양으로 보이는 왜곡)을 포함한다. 새로운 혈관의 출혈은 CNV의 증상 발병을 가속화시킬 수 있다. CNV는 눈 뒤의 압박감도 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 방법 및 제약 조성물은 CNV, 또는 혈관신생과 연관된 눈 병태를 치료하기 위해 사용된다.
AMD의 진행된 "습성" 형태 (신생혈관 또는 삼출성)는 덜 흔하지만, 환자의 중심 시력의 급격하고 종종 실질적인 상실을 빈번히 유발시킬 수 있다. 습성 형태의 AMD에서는, 맥락막 혈관신생이 형성되어 망막 색소 상피 하에 및 이를 통해 성장할 수 있는 혈관 조직으로 발달된다. 이것은 망막 하 공간으로의 혈장의 누출 및/또는 출혈을 수반하기 때문에, 황반에서 발생하는 경우 중심 시력이 심각하게 갑자기 상실될 수 있다. 용어 "AMD"는 달리 명시되지 않는 한, 건성 AMD 또는 습성 AMD 중 하나일 수 있다. 본 개시내용은 AMD, 습성 AMD 및/또는 건성 AMD의 치료 또는 예방을 고려한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 방법 및 제약 조성물은 AMD를 치료하기 위해 사용된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 방법 및 제약 조성물은 현재의 표준 진료 또는 승인된 요법 중 적어도 하나, 예컨대 라니비주맙 또는 베바시주맙에 반응하는 눈 질환 또는 병태를 예방 또는 치료하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 환자는 항-VEGF 유전자 요법의 투여를 받기 전에 또는 이러한 요법의 투여에 대한 자격 평가 전에, 눈 질환 또는 병태, 또는 그의 임의의 조합에 대하여 라니비주맙, 베바시주맙, 및 임의의 다른 승인된 치료제 중 어느 하나로 미리 치료받은 적이 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 및 제약 조성물, 즉 항-VEGF 작용제를 포함하는 AAV 유전자 요법은 컬러 안저 촬영에 따라서 CNV 형성 후 등급 IV 병변의 백분율로써 측정된 바와 같이, 비히클 또는 완충제 대조군과 비교 시 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 11%, 적어도 12%, 적어도 13%, 적어도 14%, 적어도 15%, 적어도 16%, 적어도 17%, 적어도 18%, 적어도 19%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100%만큼 혈관신생 또는 CNV에 있어서의 저하를 발생시킨다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 및 제약 조성물, 즉 항-VEGF 작용제를 포함하는 AAV 유전자 요법은 컬러 안저 촬영에 따라서 CNV 형성 후 등급 IV 병변의 백분율로써 측정된 바와 같이, 승인된 요법과 대등한 수준으로 혈관신생 또는 CNV에 있어서의 저하를 발생시킨다. 일부 실시양태에서, CNV에 있어서의 저하, 또는 치료 효과는 비-유전자 요법-기반 주사 또는 단백질 주사와 비교 시, 항-VEGF 작용제를 포함하는 유전자 요법의 투여의 경우에 더 오래 지속된다.
일부 경우에, rAAV 비리온 또는 그의 제약 조성물은 눈 병태, 질환, 또는 그의 조합을 적어도 부분적으로 완화시킬 수 있다. 일부 경우에, 이러한 눈 병태 또는 질환은 눈의 혈관신생과 연관될 수 있다. 일부 경우에, 눈 병태 또는 질환은 본 개시내용의 항-VEGF 작용제에 반응하거나 또는 이것으로 치료 가능한 임의의 병태 또는 질환이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 유전자 요법은, 예를 들어, 비정상적인 VEGF 및/또는 VEGFR 활성 또는 발현의 결과로서의 비정상적인 혈관신생, AMD, 당뇨병성 망막병증, 및 자간전증을 수반하는 임의의 눈 질환 또는 병태를 치료하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 유전자 요법에서의 항-VEGF 작용제는 VEGF-A, B, C, D, 및 태반 성장 인자 (PIGF), 또는 그의 임의의 조합 또는 변이체를 포함하는, 포유류에서 VEGF 계열의 구성원을 억제하거나 또는 이를 방해하는 작용제이다. 일부 실시양태에서, 유전자 요법에서의 항-VEGF 작용제는 VEGF 관련 단백질, 예를 들어, 일부 바이러스에 의해 발현된 VEGF-E 및 일부 뱀의 독에서 발견된 VEGF-F 중 어느 하나를 억제하거나 또는 이를 방해하는 작용제이며, 이는 또한, 생체 내에서 혈관형성과 관련된 부가의 적응증에 대한 치료적 특성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 작용제는 또한, 생체 내에서 태반 성장 인자 (PIGF)를 방해하거나, 이와 결합하거나, 또는 이를 억제할 수 있다.
사용 방법
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 제공된 제약 조성물의 제약상 유효량을, 병리학적 혈관형성 관련 눈 질환의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 질환은 연령 관련 황반 변성 (AMD), 습성 AMD, 건성 AMD, 망막 혈관신생, 맥락막 혈관신생 당뇨병성 망막병증, 증식성 당뇨병성 망막병증, 망막 정맥 폐색증, 망막 중심 정맥 폐색증, 망막 정맥 분지 폐색증, 당뇨병성 황반 부종, 당뇨병성 망막 허혈, 허혈성 망막병증 및 당뇨병성 망막 부종, 및 그의 임의의 조합을 포함한 안구 신생혈관 질환의 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 변이체 캡시드 단백질 (예를 들어, rAAV.7m8) 및 항-VEGF 작용제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV를 포함하는 제약 조성물은 건성 AMD 및 습성 AMD를 포함한 AMD를 치료 또는 예방하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 변이체 캡시드 단백질 (예를 들어, rAAV.7m8) 및 항-VEGF 작용제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV를 포함하는 제약 조성물은 CNV를 치료 또는 예방하거나, 또는 등급 IV CNV 병변을 저하시키기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 변이체 캡시드 단백질 (예를 들어, rAAV.7m8) 및 항-VEGF 작용제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV를 포함하는 제약 조성물은 AMD, 습성 AMD, 건성 AMD, 망막 혈관신생, 맥락막 혈관신생 당뇨병성 망막병증, 증식성 당뇨병성 망막병증, 망막 정맥 폐색증, 망막 중심 정맥 폐색증, 망막 정맥 분지 폐색증, RVO, 당뇨병성 황반 부종, 당뇨병성 망막 허혈, 허혈성 망막병증 및 DME 환자에서의 당뇨병성 망막 부종, DR, 및 그의 임의의 조합 중 어느 하나를 치료 또는 예방하기 위해 사용된다.
일부 실시양태에서, AMD, DME, RVO, 또는 DR을 치료하는 방법은 항-VEGF 작용제, 예를 들어, 라니비주맙 또는 베바시주맙의 핵산 서열을 포함하는 유전자 요법을 특정 환자에게 투여하기 전에, 승인된 요법, 예를 들어, 라니비주맙 또는 베바시주맙 주사를 이용하여 동일한 환자를 미리 치료하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 환자는 본원에 개시된 바와 같은 항-VEGF 유전자 요법의 1회 용량을 받기 전에, 승인된 요법으로 미리 치료한다. 일부 실시양태에서, 환자는 본원에 개시된 바와 같은 항-VEGF 유전자 요법의 1회 용량을 받기 전에, 라니비주맙 또는 베바시주맙 주사 중 어느 하나에 반응한다. 일부 실시양태에서, 라니비주맙 또는 베바시주맙 중 어느 하나에 반응하거나, 또는 라니비주맙 또는 베바시주맙 중 하나로 미리 치료받았던 환자는 본원에 개시된 바와 같은 라니비주맙 또는 베바시주맙 유전자 요법으로 치료받은 후, 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 또는 그 초과, 또는 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 또는 그 초과의 기간에 치료하며, 그 동안에는 AMD에 대한 이들 치료 중 어떠한 것도 환자는 받지 않는다. 일부 경우에, 환자가 라니비주맙 또는 베바시주맙 유전자 요법의 유리체 내 주사를 받은 후, 이 환자는 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 또는 그 초과가 경과될 때까지 라니비주맙 또는 베바시주맙 단백질 주사 또는 또 다른 승인된 요법을 받기 시작하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은, 라니비주맙 또는 베바시주맙 유전자 요법, 또는 임의의 다른 항-VEGF 유전자 요법은 1회 투여이다. 일부 실시양태에서, 환자가 본원에 개시된 라니비주맙 또는 베바시주맙 유전자 요법의 단위 용량을 받은 후, 이 환자에게 임의의 다른 승인된 단백질-기반 치료제를 사용할 필요가 없다.
일부 경우에, CNV 또는 AMD에 대한 승인된 요법의 반복적인 주사와 연관된 부작용, 예를 들어, 염증 또는 박테리아성 감염을 경험한 환자는 본원에 개시된 바와 같은, 항-VEGF 유전자 요법, 또는 라니비주맙 또는 베바시주맙 유전자 요법을 이용한 치료에 대한 후보일 수 있다. 일부 경우에, 이러한 위험은 유전자 요법에서 더 낮은데, 이는 환자의 생애 동안 단 한번의 주사만 있으면 되거나, 또는 적어도 2, 5, 10, 20, 30, 40, 또는 50년에 1회 이하로 제공되기 때문이다. 일부 경우에, 본원에 개시된 바와 같은, 항-VEGF 유전자 요법, 또는 라니비주맙 또는 베바시주맙 유전자 요법을 이용한 치료는 단백질-기반 주사보다 비용면에서 더 효과적일 수 있는데, 이는 유전자 요법의 치료 효과가 더 오래 지속될 수 있고 1회 유전자 요법 주사의 비용이 단백질의 다수의 반복적인 주사를 합한 비용보다 더 낮을 수 있기 때문이다.
또한, 유전자 요법은 반복적인 주사가 필요하지 않음으로써, 반복적인 주사가 필요한 요법과 연관된 환자의 순응 및 처방 준수 문제 (준수하지 않으면 (예를 들어, 환자가 1회 이상의 예정된 주사를 잊어버리거나 또는 누락시킨 경우) 시력 상실 및 눈 질환 또는 병태의 악화를 초래할 수 있다)를 해결해 준다. AMD의 영향을 가장 많이 받는 노인 환자 중에는, 투여를 위해 진료소를 반복적으로 또는 자주 방문해야 하는 치료 요법에 순응하지 않고 그 처방을 준수하지 않는 비율이 더 높다. 따라서 유전자 요법을 통해, 예를 들어, 1회 유리체 내 주사로서 항-VEGF 작용제를 환자의 눈에 전달하는 것이 환자에게 보다 편리한 치료 옵션을 제공하고, 비-순응 및 비-처방 준수 문제를 해결함으로써 환자 성과를 개선시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 사용 방법은 현재의 표준 진료, 예를 들어, 라니비주맙 주사, 또는 베바시주맙 주사로 간주되는 승인된 약물을 이용하여 인간 환자 또는 대상체를 미리 치료하고, 라니비주맙 또는 베바시주맙에 대한 상기 환자의 반응성을 결정하며, 본원에 기재된 항-VEGF 유전자 요법을, 승인된 요법에 반응하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 승인된 요법 또는 현재의 표준 진료에 대한 환자의 반응성을 결정하는 것은 혈액 시험, 면역검정, 생체외 실험, 또는 라니비주맙 또는 베바시주맙 단백질 주사를 환자에게 투여하는 것, 및 라니비주맙 또는 베바시주맙에 대한 환자의 반응성을 검정하는 것을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-VEGF 유전자 요법의 사용 방법은 약물 표지에 따라서 본원에 기재된 제약 조성물 (즉, 항-VEGF 핵산 서열을 포함하는 rAAV2.7m8)의 동결 건조된 형태를 재구성하고, 이와 같이 재구성된 항-VEGF 유전자 요법을 대상체 또는 인간 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-VEGF 유전자 요법의 사용 방법은 약물 표지에 따라서 본원에 기재된 제약 조성물의 현탁액을 투여하고, 상기 항-VEGF 유전자 요법의 현탁액을 대상체 또는 인간 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 현탁액을 투여하기 위한 부가의 단계는 사용 전에 현탁액을 진탕시키고/시키거나 현탁액을 실온으로 가온시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이러한 인간 환자는 승인된 단백질 주사 또는 현재의 표준 진료, 예를 들어, 라니비주맙 주사 또는 베바시주맙 주사를 이용하여 미리 치료하였다. 일부 실시양태에서, 상기 환자는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 또는 그 초과 동안 rAAV2.7m8-라니비주맙 유전자 요법의 1회 이하 주사 또는 투여를 받거나; 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 또는 그 초과에 rAAV2.7m8-라니비주맙 유전자 요법의 1회 이하 주사 또는 투여를 받는다.
일부 실시양태에서, 또한 본원에는 눈 병태 또는 질환을 예방 또는 치료하는 방법이 개시되며, 이러한 방법은 상기와 같은 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체, 예를 들어, 승인된 약물에 반응하는 눈 병태 또는 질환이 있는 개체에게, 본원에 기재된 바와 같은, 항-VEGF 작용제, 예를 들어, 라니비주맙 또는 베바시주맙을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV 비리온 또는 그의 제약 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV2.7m8-라니비주맙 비리온은 안구내 주사를 통해, 유리체 내 주사에 의해, 망막 하 주사에 의해, 또는 개체의 눈 내로의 투여의 임의의 다른 편리한 방식 또는 경로에 의해 투여될 수 있다. 다른 편리한 투여 방식 또는 경로는, 예를 들어, 정맥내, 국소, 점안 등을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 및 제약 조성물은 유리체 내 주사에 의한 투여를 수반한다.
본원에 기재된 바와 같은 "치료상 유효량"은 임상 시험을 통하여 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위일 수 있다. 눈에 직접적으로 주사하거나 또는 유리체 내 주사하는 경우, 치료상 유효 용량은 7m8-라니비주맙 또는 임의의 다른 항-VEGF 유전자 요법의 1011 내지 1012 또는 1012 내지 1013 벡터 게놈의 정도일 수 있다. 일부 실시양태에서, 7m8-라니비주맙 또는 임의의 다른 항-VEGF 유전자 요법의 단위 용량 또는 치료상 유효량은 1010 내지 1011, 1011 내지 1012, 1010 내지 1012, 1012 내지 1013, 1011 내지 1013, 1012 내지 1013, 1012 내지 1014, 1011 내지 1014, 1011 내지 1015, 1012 내지 1015, 1013 내지 1014, 1014 내지 1015, 1015 내지 1016, 1016 내지 1017, 1017 내지 1018, 1018 내지 1019, 또는 1019 내지 1020 벡터 게놈이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 7m8-라니비주맙 또는 임의의 다른 항-VEGF 유전자 요법을 포함하는 제약 조성물의 단위 용량은 1x1010 내지 2x1010, 2x1010 내지 3x1010, 3x1010 내지 4x1010, 4x1010 내지 5x1010, 5x1010 내지 6x1010, 6x1010 내지 7x1010, 7x1010 내지 8x1010, 8x1010 내지 9x1010, 9x1010 내지 10x1010, 1x1011 내지 2x1011, 2x1011 내지 3x1011, 2x1011 내지 2.5x1011, 2.5x1011 내지 3x1011, 3x1011 내지 4x1011, 4x1011 내지 5x1011, 5x1011 내지 6x1011, 6x1011 내지 7x1011, 7x1011 내지 8x1011, 8x1011 내지 9x1011, 9x1011 내지 10x1011, 1x1012 내지 2x1012, 2x1012 내지 3x1012, 2.5x1012 내지 3x1012, 3x1012 내지 4x1012, 4x1012 내지 5x1012, 5x1012 내지 6x1012, 6x1012 내지 7x1012, 7x1012 내지 8x1012, 8x1012 내지 9x1012, 9x1012 내지 10x1012, 1x1013 내지 2x1013, 2x1013 내지 3x1013, 3x1013 내지 4x1013, 4x1013 내지 5x1013, 5x1013 내지 6x1013, 6x1013 내지 7x1013, 7x1013 내지 8x1013, 8x1013 내지 9x1013, 또는 9x1013 내지 10x1013 벡터 게놈이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 7m8-라니비주맙 또는 임의의 다른 항-VEGF 유전자 요법의 단위 용량은 2.1x1011 또는 2.1x1012 벡터 게놈이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 rAAV의 단위 용량은 1010 내지 1013, 1010 내지 1011, 1011 내지 1012, 1012 내지 1013, 또는 1013 내지 1014 벡터 게놈이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 7m8-라니비주맙 또는 임의의 다른 항-VEGF 유전자 요법의 단위 용량은 1x1010 내지 2x1010, 2x1010 내지 4x1010, 3x1010 내지 5x1010, 4x1010 내지 6x1010, 5x1010 내지 7x1010, 6x1010 내지 8x1010, 7x1010 내지 9x1010, 8x1010 내지 1011, 1x1011 내지 2x1011, 2x1011 내지 4x1011, 3x1011 내지 5x1011, 4x1011 내지 6x1011, 5x1011 내지 7x1011, 6x1011 내지 8x1011, 7x1011 내지 9x1011, 8x1011 내지 10x1011, 1x1012 내지 3x1012, 2x1012 내지 4x1012, 3x1012 내지 5x1012, 4x1012 내지 6x1012, 5x1012 내지 7x1012, 6x1012 내지 8x1012, 7x1012 내지 9x1012, 8x1012 내지 10x1012, 1x1013 내지 5x1013, 5x1013 내지 10x1013, 1012 내지 5x1012, 5x1012 내지 1x1013, 7x1012 내지 1x1013, 8x1012 내지 2x1013, 9x1012 내지 2x1013, 9x1012 내지 2x1013, 9x1012 내지 4x1013, 1x1013 내지 3x1013, 1x1013 내지 2x1013, 2x1013 내지 3x1013, 3x1013 내지 4x1013, 4x1013 내지 5x1013, 5x1013 내지 6x1013, 6x1013 내지 7x1013, 7x1013 내지 8x1013, 8x1013 내지 9x1013, 또는 8x1013 내지 1x1014 벡터 게놈이다.
일부 실시양태에서, 5 내지 10년의 기간 내에 인간 환자 또는 대상체에게 주사된 7m8-라니비주맙 또는 임의의 다른 항-VEGF 유전자 요법의 총 양은 1010 내지 1013, 1010 내지 1011, 1011 내지 1012, 1012 내지 1013, 또는 1013 내지 1014 벡터 게놈 이하, 또는 1x1010 내지 2x1010, 2x1010 내지 4x1010, 3x1010 내지 5x1010, 4x1010 내지 6x1010, 5x1010 내지 7x1010, 6x1010 내지 8x1010, 7x1010 내지 9x1010, 8x1010 내지 1011, 1x1011 내지 2x1011, 2x1011 내지 4x1011, 3x1011 내지 5x1011, 4x1011 내지 6x1011, 5x1011 내지 7x1011, 6x1011 내지 8x1011, 7x1011 내지 9x1011, 8x1011 내지 10x1011, 1x1012 내지 3x1012, 2x1012 내지 4x1012, 3x1012 내지 5x1012, 4x1012 내지 6x1012, 5x1012 내지 7x1012, 6x1012 내지 8x1012, 7x1012 내지 9x1012, 8x1012 내지 10x1012, 1x1013 내지 5x1013, 5x1013 내지 10x1013, 1012 내지 5x1012, 5x1012 내지 1x1013, 7x1012 내지 1x1013, 8x1012 내지 2x1013, 9x1012 내지 2x1013, 9x1012 내지 2x1013, 9x1012 내지 4x1013, 1x1013 내지 3x1013, 1x1013 내지 2x1013, 2x1013 내지 3x1013, 3x1013 내지 4x1013, 4x1013 내지 5x1013, 5x1013 내지 6x1013, 6x1013 내지 7x1013, 7x1013 내지 8x1013, 8x1013 내지 9x1013, 또는 8x1013 내지 1x1014 벡터 게놈 이하이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 제약 조성물의 치료상 유효량은 2E12 내지 6E12 벡터 게놈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단위 용량은 약 1E12, 1.5E12, 2E12, 2.5E12, 3E12, 3.5E12, 4E12, 4.5E12, 5E12, 5.5E12, 6E12, 6.5E12, 7E12, 7.5E12, 8E12, 8.5E12, 9E12, 또는 9.5E12 벡터 게놈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단위 용량은 1E12 내지 1.5E12, 1.5E12 내지 2E12, 2E12 내지 2.5E12, 2.5E12 내지 3.0E12, 3.0E12 내지 3.5E12, 3.5E12 내지 4.0E12, 4.0E12 내지 4.5E12, 4.5E12 내지 5.0E12, 5.0E12 내지 5.5E12, 5.5E12 내지 6.0E12, 6.0E12 내지 6.5E12, 6.5E12 내지 7.0E12, 7.0E12 내지 7.5E12, 7.5E12 내지 8.0E12, 8.0E12 내지 8.5E12, 8.5E12 내지 9.0E12, 9.0E12 내지 9.5E12, 또는 9.5E12 내지 10E12 벡터 게놈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단위 용량은 적어도 1E12, 1.5E12, 2E12, 2.5E12, 3E12, 3.5E12, 4E12, 4.5E12, 5E12, 5.5E12, 6E12, 6.5E12, 7E12, 7.5E12, 8E12, 8.5E12, 9E12, 또는 9.5E12 벡터 게놈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단위 용량은 1E12, 1.5E12, 2E12, 2.5E12, 3E12, 3.5E12, 4E12, 4.5E12, 5E12, 5.5E12, 6E12, 6.5E12, 7E12, 7.5E12, 8E12, 8.5E12, 9E12, 9.5E12, 또는 10E12 벡터 게놈 이하를 포함한다.
일부 실시양태에서, 더 낮은 농도 (예를 들어, 벡터 게놈)가 응집 (이는 더 높은 농도하에 발생될 수 있다)을 방지하기 위해 단위 용량에 사용된다. 일부 실시양태에서, 더 높은 농도, 예를 들어, 더 높은 벡터 게놈이 유전자 요법의 효능을 증가시키거나, 또는 유전자 요법의 한번 주사 또는 1회 투여에서 항-VEGF 트랜스진의 전달을 최대화하기 위해 단위 용량에 선택된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 제약 조성물의 더 높은 농도는 더 작은 용적의 주사를 허용해 주며, 이는 유리체 내 주사와 연관된 부작용, 예를 들어, 상승된 안구내 압력, 염증, 자극, 또는 통증을 저하시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 7m8-라니비주맙 또는 임의의 다른 항-VEGF 유전자 요법 또는 그의 제약 조성물은 단일 용량 또는 1회 용량으로서 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 2회 이상의 투여를 이용하여, 다양한 간격, 예를 들어, 적어도 2년, 또는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년, 또는 그 초과에 1회 이하의 지속적인 기간에 걸쳐 목적하는 수준의 유전자 발현을 달성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 7m8-라니비주맙 또는 임의의 다른 항-VEGF 유전자 요법의 유리체 내 주사는 환자가 적어도 1년 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30년 또는 그 초과 동안 승인된 단백질 주사를 받을 필요를 없애준다.
실시예
실시예 1: 원숭이에서 7m8-sVEGFR-1의 효능 평가
목적: 아프리카 그린 원숭이에서 레이저 광응고술에 의해 유도된 맥락막 혈관신생 (CNV)의 발생을 억제하기 위하여 2 x 1012 vg 하에 유리체 내 (IVT) 주사 후 7m8-sFLT-1의 효능을 평가하기 위한 것이다. 부가의 목적은 안구 조직에서의 국소 sFLT-1 발현을 평가하기 위한 것일 수 있다.
원숭이에서의 CNV 병변 모델은 혈관신생과 연관된 눈 질환, 예컨대 습성 AMD를 치료하는 요법의 잠재적 효능을 평가하기 위한 표준 영장류 모델로서 일반적으로 허용되고 광범위하게 사용되고 있다.
대상체 모집: 원숭이는 안압 측정법, 슬릿 램프 생체 현미경 검사, 안저 검사, 컬러 안저 촬영 (CFP), 형광 혈관 조영술 (FA) 및 광학 단층 촬영 (OCT)에 의해 안구 및 전반적인 건강 상태를 평가하기 위한 기준선 스크리닝을 받았다. 정상 소견을 보인 39마리의 동물을 본 연구에 등록시켰고 기준선 체중 및 성별에 따라 4가지 처리 군으로 무작위 추출하였다 (표 1). 아트로핀 1% 안과용 연고가 기준선 검사 후에 적용되었다.
<표 1>
처리 배정
Figure pat00001
* CFP는 제14일 영상이 안정화된 수포의 명확한 영상을 보이지 않으면 제21일에 부가적으로 수행될 것이다. 슬릿 램프는 제56일에 레이저 이전에 수행되었지만 제0일 주사 직후에는 수행되지 않았다.
연구 제0일에, 군 1 내지 2 원숭이에게 처리 스케줄에 따라서 AAV2.7m8-sFLT-1 또는 비히클 OU를 IVT 투여하였다 (표 1). IVT 투여에 앞서, 국소 마취제 (0.5% 프로파라카인)를 투여하였고, 눈을 5% 베타딘으로 소독하고 멸균 생리 식염수로 세정하였다. IVT 주사는 중심 유리체를 표적으로 하여 하사 측두엽 내의 윤부 후방 2 mm에 배치된 31번 게이지 0.5인치 바늘을 사용하여 투여할 수 있다.
모든 IVT 주사 후에, 0.3% 시프로플록사신, 또는 등가의 항생제 안과 용액, 및 1% 아트로핀 술페이트 연고를 국소 투여할 수 있다.
제56일에, CNV는 레이저 빔으로 측두 혈관 아케이드 사이에서 유도되었다. 안과 전문의는 레이저 지속 시간 100 ms, 스팟 크기 50 μm, 파워 750 mW의 이리덱스 오쿠라이트(Iridex Oculight) TX 532 nm 레이저를 이용하여 각각의 눈에 9개의 레이저 스팟을 대칭적으로 배치시켰다. 레이저 스팟은 0.9x 접촉 레이저 렌즈를 사용하여 적용되었다. 레이저 스팟의 표적 위치는 레이저 스팟 배치 동안 참조용으로 레이저 처리에 앞서 수득된 컬러 안저 영상 (및 수포 배치 이후)에 훈련된 안과 전문의에 의해 매핑되었다. 레이저 병변을 기록하기 위해 레이저 처리 직후에 컬러 안저 촬영을 수행하였다. 레이저 직후에 심각한 망막/망막 하 출혈을 명확하게 보여주는 어떠한 스팟도 분석에서 배제하였다. 도 1은 레이저 방사선 조사에 의한 CNV 병변의 유도 후 비-인간 영장류의 눈의 예시적인 안저 사진을 예시한다.
캐논 6D 디지털 영상화 하드웨어와 뉴 비젼(New Vision) 안저 영상 분석 시스템 소프트웨어가 장착된 탑콘(Topcon) TRC-50EX 망막 카메라를 사용하여 망막의 양측 컬러 안저 영상을 중심와(fovea)를 중심으로 한 50도의 시야로 포착하였다. FA는 0.1 mL/kg의 10% 소듐 플루오레세인의 정맥내 투여로 수행되었다. CNV 병변의 혈관 조영상에서의 플루오레세인 누출에 등급을 매겼다 (I-IV; 표 2는 영상 강도의 균일한 조정 후에 생성된 복합체를 평가하는 마스킹된 안과 전문의에 의한 것이다). 병변 등급 지정 평가는 다른 두 명의 훈련된 안과 전문의에 의해 안저 영상에서 확인되었다. 이미지J(ImageJ) 소프트웨어를 사용하여 후기 미가공 혈관 조영상의 영상 형광 밀도 측정 분석을 수행할 수도 있다.
<표 2>
레이저 병변 등급 지정 스케일
Figure pat00002
대상체는 일반적인 웰빙을 대하여 1일 2회 평가하였다. 상세한 관찰은 매주 1회 수행되었다. 체중은 기준선 스크리닝 시, 및 평생 연구 동안 2주마다 수득하였다.
모든 동물은 제85일, 또는 그 직후에 영상의 검토가 진행될 때까지 안저 영상화의 품질을 확인한 후 펜토바르비탈로 안락사시켰다. 그 후, 동물을 펜토바르비탈로 안락사시키고 글로브를 적출하였다. 과도한 안와 조직을 잘라내어 OD와 OS 글로브 둘 다를 액체 질소로 급속 동결시킨 다음, 냉동된 조직 평면을 따라 실온하에 해부하여 맥락막 하부조직을 수반한 망막과 유리체를 단리하였다. 유리체의 수집 후, RPE/맥락막을 수반한 신경 망막의 5mm 펀치는 황반과 상측, 하측, 측두 및 비강 영역으로부터 취하였다. 공간이 허용됨에 따라, 부가의 주변 펀치가 만들어졌다. 각각의 펀치로부터의 하층 RPE/맥락막 조직을 수반한 망막을, 미리 용기의 무게를 단 표지된 동결 튜브로 옮기고, 무게를 달고 액체 질소에서 급속 동결시켰다. 펀치 생검을 수집하기 전후에, 그로부터 펀치가 수집된 영역을 기록하기 위해 방향의 지표가 수반된 평평하게 마운트된 망막의 사진을 찍었다.
통계적 방법: 피셔의 직접 확률 시험을 사용하여 상이한 병변 등급의 발생률을 평가하였다. OCT CNV 복합체 면적 및 혈관 조영상 영상 밀도 측정 데이터를 분석하기 위해, 반복적인 측정에 이어 투키-크레이머(Tukey-Kramer) 시험 또는 대조 절차를 이용하는 양방향 ANOVA를 사용하였다. 데이터가 정상적으로 분포되지 않고 분산이 동일하지 않은 경우에는 비모수적 검정을 적용하였다. 0.05 이하의 P 값이 통계상 유의적인 것으로 간주되었다.
도 3은 AAV2.7m8-sVEGFR-1 또는 제제 완충제만을 포함하는 비히클 대조군 중 하나가 유리체 내로 주사된 군 3 및 4의 동물의 제14일 및 제28일의 등급 IV 병변의 백분율의 플롯을 예시한다. CNV 병변은 시험 대상체의 각각의 군에서 주사 직후 레이저 방사선 조사에 의해 유도되었고, 컬러 안저 촬영을 사용하여 I 내지 IV의 스케일로 각각의 병변의 등급을 매겼다. AAV2.7m8-sVEGFR-1로 처리된 원숭이는, 유리체 내로 투여될 때 제14일에 수집된 안저 영상에 대하여 비히클 단독의 투여와 비교해서 등급 IV 병변의 양에 있어서의 약간의 감소를 나타내었다. 유리체 내 AAV2.7m8-sFLT-1로 처리된 원숭이는 제28일에 비히클 단독의 투여와 비교해서 등급 IV 병변의 양에 있어서의 유의적인 감소를 나타내지 않았다.
실시예 2: 원숭이에서 7m8-라니비주맙의 효능 평가
AAV2의 캡시드 단백질 VP1의 위치 587과 588 사이에 삽입된 7m8 서열 및 라니비주맙을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV2인 AAV2.7m8-라니비주맙 및 동일한 프로토콜을 사용하여, 실시예 1에 기재된 바와 유사한 생체내 연구를 원숭이에서 수행하였다.
도 4에 예시된 바와 같이, 유리체 내로 투여된 AAV2.7m8-라니비주맙은 레이저 유도된 등급 IV CNV 병변의 발생을 방지하였다. AAV2.7m8-라니비주맙, 라니비주맙 단독 (양성 대조군), 또는 제제 완충제를 포함하는 비히클 대조군을 2 x 1012 vg의 용량 하에 유리체 내 주사를 통해 비-인간 영장류의 눈에 투여하였다. 이어서, CNV 병변은 모든 군에서 레이저 방사선 조사에 의해 유도시켰고, 컬러 안저 촬영을 사용하여 I 내지 IV의 스케일로 각각의 병변의 등급을 매겼다. 그 후, 등급 IV 병변의 백분율의 측정치를 평균 내고 플롯하였다. AAV2.7m8-라니비주맙은 생체 내에서 CNV 병변을, 제14일 (연회색 막대) 및 제28일 (암회색 막대)에 라니비주맙 단독과 대등한 수준으로 상당히 저하시켰다.
원숭이에서의 이들 생체내 연구는 AAV2.7m8-라니비주맙이 인간에 대하여 실행 가능한 유전자 요법 옵션일 수 있다는 것을 암시하였다.
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Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 395 400 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 420 425 430 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Ser Pro Gly Lys 450 <210> 13 <211> 2064 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60 acaggatcta gttcaggttc aaaattaaaa gatcctgaac tgagtttaaa aggcacccag 120 cacatcatgc aagcaggcca gacactgcat ctccaatgca ggggggaagc agcccataaa 180 tggtctttgc ctgaaatggt gagtaaggaa agcgaaaggc tgagcataac taaatctgcc 240 tgtggaagaa atggcaaaca attctgcagt actttaacct tgaacacagc tcaagcaaac 300 cacactggct tctacagctg caaatatcta gctgtaccta cttcaaagaa gaaggaaaca 360 gaatctgcaa tctatatatt tattagtgat acaggtagac ctttcgtaga gatgtacagt 420 gaaatccccg aaattataca catgactgaa ggaagggagc tcgtcattcc ctgccgggtt 480 acgtcaccta acatcactgt tactttaaaa aagtttccac ttgacacttt gatccctgat 540 ggaaaacgca taatctggga cagtagaaag ggcttcatca tatcaaatgc aacgtacaaa 600 gaaatagggc ttctgacctg tgaagcaaca gtcaatgggc atttgtataa gacaaactat 660 ctcacacatc gacaaaccaa tacaatcata gatgtccaaa taagcacacc acgcccagtc 720 aaattactta gaggccatac tcttgtcctc aattgtactg ctaccactcc cttgaacacg 780 agagttcaaa tgacctggag ttaccctgat gaaaaaaata agagagcttc cgtaaggcga 840 cgaattgacc aaagcaattc ccatgccaac atattctaca gtgttcttac tattgacaaa 900 atgcagaaca aagacaaagg actttatact tgtcgtgtaa ggagtggacc atcattcaaa 960 tctgttaaca cctcagtgca tatatatgat aaagcattca tcactgtgaa acatcgaaaa 1020 cagcaggtgc ttgaaaccgt agctggcaag cggtcttacc ggctctctat gaaagtgaag 1080 gcatttccct cgccggaagt tgtatggtta aaagatgggt tacctgcgac tgagaaatct 1140 gctcgctatt tgactcgtgg ctactcgtta attatcaagg acgtaactga agaggatgca 1200 gggaattata caatcttgct gagcataaaa cagtcaaatg tgtttaaaaa cctcactgcc 1260 actctaattg tcaatgtgaa accccagatt tacgaaaagg ccgtgtcatc gtttccagac 1320 ccggctctct acccactggg cagcagacaa atcctgactt gtaccgcata tggtatccct 1380 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Claims (1)

  1. (a) 캡시드 단백질 VP1의 위치 587과 588 사이에 아미노산 서열 LGETTRP가 삽입되고, 서열식별번호 9의 아미노산 서열과 서열식별번호 10의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 rAAV2 변이체; 및
    (b) 제약상 허용되는 부형제
    를 포함하는 조성물을 사용하여, 눈 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
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