KR20220159983A

KR20220159983A - 코로나 바이러스 감염 치료를 위한 C5a의 억제제

Info

Publication number: KR20220159983A
Application number: KR1020227032613A
Authority: KR
Inventors: 닐스 씨. 리데만; 렌펭 구오
Original assignee: 인플라알엑스 게엠베하
Priority date: 2020-03-27
Filing date: 2020-03-27
Publication date: 2022-12-05
Also published as: EP4126222A1; AU2020438234A1; IL296036A; MX2022012000A; CA3172421A1; JP7535591B2; BR112022019090A2; US20230158060A1; JP2023518884A; CN116390758A; WO2021190770A1

Abstract

본 발명은 코로나 바이러스에 의한 감염에 의해 유발되거나 이와 관련된 C5a 활성 의학적 상태의 억제제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 코로나 바이러스 감염을 앓고 있는 대상체에서 염증 반응의 감소에서 C5a 활성의 억제제의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 코로나 바이러스 감염을 앓고 있는 대상체에서 장기 기능, 특히 폐 기능 및/또는 간 기능의 개선에 사용하기 위한 C5a 활성의 억제제에 관한 것이다.

Description

코로나 바이러스 감염 치료를 위한 C5a의 억제제

본 발명은 코로나 바이러스(corona virus)의 감염에 의해 유발되거나 이와 연관된 C5a 활성 의학적 상태(medical condition)의 억제제에 관한 것이며, 여기서 의학적 상태는 바람직하게는 (i) 폐렴(pneumonia) 및/또는 (ii) 발열(fever)이다. 본 발명은 또한 코로나 바이러스 감염을 앓고 있는 대상체(subject)에서 염증 반응의 감소에서 C5a 활성의 억제제의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 코로나 바이러스 감염을 앓고 있는 대상체에서 장기 기능, 특히 폐 기능 및/또는 간 기능의 개선에 사용하기 위한 C5a 활성의 억제제에 관한 것이다.

C5a

C5a는 보체 활성화시 C5로부터 절단된다. 보체 활성화 산물 중, C5a는 광범위한 범위의 기능을 갖는 가장 강력한 염증성 펩티드 중 하나이다(참조: Guo RF, and Ward PA. 2005. Annu. Rev. Immunol. 23:821-852). C5a는 건강한 인간의 혈액에 존재하는 분자량 11.2kDa의 당단백질이다. C5a의 폴리펩티드 부분은 분자량 8.2kDa을 차지하는 74개의 아미노산을 함유하지만, 탄수화물 부분은 약 3kDa을 차지한다. C5a는 고친화성 C5a 수용체(receptor)(C5aR 및 C5L2)를 통해 그의 효과를 발휘한다(참조: Ward PA. 2009. J. Mol. Med. 87(4):375-378). C5aR은 7개의 막관통 세그먼트를 갖는 G-단백질 결합 수용체의 로돕신 유형 계열에 속하고; C5L2는 유사하지만 G-단백질 결합되지 않는다. 현재 C5a-C5L2 상호작용에 대한 생물학적 반응이 거의 발견되지 않았기 때문에, C5a는 주로 C5a-C5aR 상호작용을 통해 그의 생물학적 기능을 발휘하는 것으로 간주되고 있다. C5aR은 호중구, 호산구, 호염기구 및 단핵구를 포함하는 골수 세포 및 많은 기관, 특히 폐 및 간의 비-골수 세포에서 널리 발현되며, C5a/C5aR 신호전달의 중요성를 나타낸다. C5a는 다양한 생물학적 기능을 갖는다(참조: Guo and Ward, 2005, 상기). C5a는 호중구의 강력한 화학 유인 물질이며, 또한 단핵구와 대식세포에 대한 화학 주성 활성을 갖는다. C5a는 호중구의 산화적 파열(O₂ 소비)을 일으키고, 식균작용 및 과립 효소의 방출을 향상시킨다. C5a는 또한 혈관 확장제인 것으로 밝혀졌다. C5a는 다양한 세포 유형으로부터 사이토카인 발현의 조절에 관여하여 호중구에서 부착 분자의 발현을 향상시키는 것으로 나타났다. C5a는 염증 반응 쇄의 상류에서 기능하는 염증 반응의 강력한 유도제 및 인핸서이기 때문에 질환 환경에서 과도하게 생산되면 매우 해로워진다는 것이 밝혀졌다. 높은 투여량의 C5a는 호중구에 대한 비특이적 화학 주성 "탈감작"을 유발하여 광범위한 기능 장애를 유발할 수 있다(참조: Huber-Lang M et al. 2001. J. Immunol. 166(2):1193-1199).

C5a는 수많은 전염증 반응을 발휘하는 것으로 보고되었다. 예를 들어, C5a는 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 및 대식세포 이동 억제 인자(MIF)와 같은 전염증성 사이토카인의 인간 백혈구로부터의 합성 및 방출을 자극한다(참조: Hopken U et al. 1996. Eur J Immunol 26(5):1103-1109; Riedemann NC et al. 2004. J Immunol 173(2):1355-1359; Strieter RM et al. 1992. Am J Pathol 141(2):397-407). C5a는 폐포 상피 세포에서 TNF-α, 대식세포 염증성 단백질(MIP)-2, 사이토카인 유도 호중구 화학 유인 물질(CINC)-1 및 IL-1β의 생산에서 LPS와 강력한 시너지 효과를 생성한다(참조: Riedemann NC et al. 2002. J. Immunol. 168(4):1919-1925; Rittirsch D et al. 2008. Nat Rev Immunol 8(10):776-787).

C5a의 차단은 또한 패혈증(sepsis) 실험 모델 및 문헌[참조: Klos A. et al (Klos A. et al. 2009. Mol Immunol 46(14):2753-2766) and Allegretti M. et al (Allegretti M et al. 2005. Curr Med Chem 12(2):217-236)]하에 부분적으로 검토된 바와 같은 다양한 종에서 허혈/재관류 손상(ischemia/reperfusion injury), 신장 질환(renal disease), 이식 거부 반응(graft rejection), 말라리아(malaria), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 감염성 장 질환(infectious bowel disease), 염증성 폐 질환(inflammatory lung disease), 루푸스 유사 자가면역 질환(lupus-like auto-immune diseases), 신경퇴행성 질환(neurodegenerative disease) 등의 많은 다른 염증 모델에서 보호적인 것으로 입증되었다. 또한, 최근 에 C5a의 차단은 마우스의 종양 모델에서 강력한 치료적 이점을 나타내는 것으로 발견되었다(참조: Markiewski MM et al. 2008. Nat Immunol 9(11):1225-1235).

코로나 바이러스 감염

지난 수십 년 동안 전세계에서 다양한 코로나 바이러스 발생이 발생했으며, 그 중 특히 세 가지 유형의 바이러스가 사망률이 높은 질환을 초래했다. 중증 급성 호흡기 증후군(Severe Acute Respiratory Syndrome; SARS), 중동 호흡기 증후군(Middle East Respiratory Syndrome; MERS) 및 최근 코로나 바이러스 질환 2019(COVID-19). 코로나 바이러스는 각각 SARS-CoV, MERS-CoV 및 SARS-CoV-2에서 이러한 발생을 담당한다.

중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2)로도 공지된 2019년 신종 코로나 바이러스로 인한 코로나 바이러스 질환 2019(COVID-19)의 발생은 2019년 12월에 중국 후베이성 우한(Wuhan, Hubei Province, China)에서 처음 확인되었으며, 그 이후로 심각한 공중 보건 위협이 되고 있다[Chen et al. 2020; medRxiv, 2020: p. 2020.02.16.20023903; Chen et al [2] 2020, The Lancet, 2020. 395(10223): p. 507-513; Yu et al 2020, Microbes and Infection, 2020. 22(2): p. 74-79]. 2020년 3월 23일 현재 치사율은 중국에서 4.02%로, 후베이성 치사율 4.66% 및 후베이성 이외 지역의 치사율 0.89%를 모두 차지하고 있다. 후베이성 이외 지역의 훨씬 더 낮은 치사율은 주로 조기 진단 및 적시에 개선된 의료 처치를 포함한 개선된 의료 서비스에 기인한 것으로 간주된다[Zhao et al, medRxiv, 2020: p. 2020.03.17.20037572]. 중국 이외의 국가에서는 전염이 지속되고 있다. COVID-19가 계속 확산됨에 따라, 다양한 수준의 의료 처치에 대한 수요가 급증할 것이다. 따라서, 치사율을 효과적으로 낮추기 위해서는 일반적인(경증) 바이러스성 폐렴의 중증 형태로의 발달 및 중증 폐렴의 위험한 질병 상태 또는 ARDS로의 발달을 예방하는 것이 의학적 치료의 초점이 되어야 한다.

COVID-19는 이전에 발생한 다른 치명적인 코로나 바이러스 감염, 중증 급성 호흡기 증후군(SARS) 및 중동 호흡기 증후군(MERS)에 비해 상대적으로 높은 전염성의 주요 기여 요인일 수 있는 긴 무증상 잠복기의 특징을 나타낼 수 있다. COVID-19 환자는 전형적으로 발열 또는 마른 기침 및 호흡 곤란을 포함한 하기도 질병 징후와 같은 독감 유사 증상을 나타낸다[Chen et al [2] supra; Chang et al JAMA, 2020; Wang et al. AMA, 2020; Xiao et al Journal of Medical Virology, 2020]. 증상 이전의 잠복 기간은 미국 질병 통제 예방 센터(CDC)의 분석에 따르면 바이러스 노출 후 2 내지 14일로 추정된다. 질환이 중증 형태로 진행됨에 따라, 폐, 심장, 간, 응고 시스템을 포함한 여러 장기의 기능에 종종 영향을 미친다[Liu et al medRxiv, 2020: p. 2020.02.10.20021584; Fan et al. medRxiv, 2020: p. 2020.02.26.20026971; Tang et al Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2020.]. 이와 같이, 사망은 전형적으로 다른 바이러스성 페렴 유발 패혈증과 유사한 호흡 부전(respiratory failure) 및 다발성 장기 기능 장애(multiple organ dysfunctions)로 인해 발생한다[Zhang et al medRxiv, 2020: p. 2020.02.26.20028191]. 패혈증 및 ARDS는 대부분 질환 발병시 두 번째 주에 발생하고; 생명을 위한 싸움은 종종 심각한 질병의 세 번째 주에 발생한다[Zhou et al The Lancet, 2020].

축적된 데이터는 노년기, 근본적인 건강 상태(예: 심혈관 문제) 및 손상된 면역계가 보다 심각한 형태의 질환 발병 및 더 나쁜 결과를 발전시킬 가능성에 대한 중요한 위험 인자임을 나타낸다[Huang et al The Lancet, 2020. 395(10223): 497-506]. 높은 사망률과 관련된 COVID-19와 함께 상위 3개의 동반 질환은 고혈압(hypertension), 당뇨병(diabetes) 및 관상동맥 심장 질환(coronary heart disease)이다[Zhou et al 상기]. COVID-19 환자, 특히 상기 언급된 위험 인자 또는 동반 질환을 갖는 환자를 위한 안전하고 효과적인 치료 전략을 개발하는 것이 시급하다.

COVID-19는 인류, 특히 노인에게 심각한 건강 위협이 되었다. COVID-19는 바이러스 염증 및 면역 매개 손상의 이중 플레이를 특징으로 할 수 있다. 본원에 개시된 전임상 및 임상 소견에 기초하여, 본 발명자들은 코로나 바이러스 감염, 특히 COVID-19의 진행에서 발생하는 병원성 "보체 폭풍" 이벤트를 제안한다. 항-C5a 요법에 의한 차단은 동물 모델에서 효과적인 치료 효과 및 COVID-19 환자에서 예비 시험을 제공한다. 항-C5a 접근법은 진행성/악화된 경증 형태 및 중증 형태의 질환을 갖는 환자에서 COVID-19와 싸우는 데 실행 가능한 전략이다.

본 발명의 근간이 되는 문제 중 하나는 신규한 SARS-CoV2 바이러스에 의해 유발된 폐렴을 치료하기 위한 치료적 접근법의 제공이었다.

지금까지 항-C5a 치료가 코로나 바이러스에 의해 유발된 폐렴의 치료에 효과적인지 여부는 연구되지 않았으며, 사망률이 높은 균주 SARS-CoV, MERS-CoV 및 SARS-CoV-2는 말할 필요도 없다.

본 출원의 발명자들은 인간 C5a에 대한 매우 강력한 중화 mAb인 IFX-1을 적용하여 H7N9 바이러스 유도 중증 폐렴의 치료에서 보체 억제의 치료 가능성을 탐구했다. 우리가 아는 한, 코로나 바이러스 감염을 앓고 있는 대상체의 폐렴 및 관련 증상의 항-C5a 치료가 연구된 것은 이번이 처음이다.

아래 실험 섹션에 개시된 데이터는 SARS-CoV, MERS-CoV 및 SARS-CoV-2를 포함한 다양한 코로나 바이러스 유형에 의한 감염에서 과도한 보체 활성화가 일어난다는 것을 입증한다.

본 발명자들은 SARS-CoV-2 감염 인간 환자에서의 항-C5a 치료가 혈액 산소화와 ALT/AST 수준의 정상화로 알 수 있는 바와 같이 실질적으로 COVID-19의 주요 증상을 약화시킨다, 즉 발열을 감소시키고, 림프구 수(lymphocyte count)를 향상시키고, CRP 수준을 감소시키고, 장기 기능, 특히 폐 및 간 기능을 개선한다는 것을 발견했다. 이러한 모든 효과는 항-C5a 치료의 적용시 빠른 분해로 나타났다.

또한, 본 발명자들은 상이한 코로나 바이러스 균주에 의한 감염이 어떻게 대규모 보체 활성화를 초래하는지에 대한 기계론적 통찰력을 제공하는 다수의 실험을 개시한다.

이러한 결과는 보체 억제, 특히 C5a 억제가 코로나 바이러스 유발 질환, 특히 코로나 바이러스 유발 호흡기 증후군의 치료를 위한 매우 유망한 전략임을 시사한다.

상기 개요는 본 발명과 관련된 모든 이점 및 이에 의해 해결된 문제점을 반드시 기재하지는 않는다.

발명의 요약

제1 측면에서, 본 발명은 코로나 바이러스 감염에 의해 유발되거나 이와 관련된 의학적 상태의 치료에 사용하기 위한 C5a 활성의 억제제에 관한 것으로서, 여기서 상기 의학적 상태는 바람직하게는 (i) 폐렴 및/또는 또는 (ii) 발열이다.

제2 측면에서, 본 발명은 코로나 바이러스 감염을 앓고 있는 대상체에서 염증 반응을 감소시키는데 사용하기 위한 C5a 활성의 억제제에 관한 것이다.

제3 측면에서, 본 발명은 코로나 바이러스 감염을 앓고 있는 대상체에서 장기 기능, 특히 폐 기능 및/또는 간 기능의 개선에 사용하기 위한 C5a 활성의 억제제에 관한 것이다.

발명의 상세한 설명

정의

본 발명이 이하에서 상세히 기재되기 전에, 본 발명은 이들이 변할 수 있으므로 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약에 제한되지 않는다는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 구현예를 기재하기 위한 것이고, 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아님도 또한 이해되어야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

바람직하게는, 본원에서 사용된 용어는 문헌(참조: "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)에 기재된 바와 같이 정의된다.

본 명세서 및 이하의 청구범위 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다", 및 변형, 예를 들어, "포함한다" 및 "포함하는"은 언급된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 포함하지만 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 배제하지 않음을 의미하는 것으로 이해될 것이다.

여러 문서(예: 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조업체의 사양, 지침, GenBank 수탁 번호 서열 제출 등)는 본 명세서의 텍스트 전반에 걸쳐 인용된다. 본원의 어떠한 내용도 본 발명이 선행 발명에 의해 이러한 개시를 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에서 인용된 일부 문서는 "참고로 포함"되는 것을 특징으로 한다. 이러한 포함된 참고문헌의 정의 또는 교시와 본 명세서에서 인용된 정의 또는 교시 사이에 모순이 있는 경우, 본 명세서의 텍스트가 우선한다.

서열: 본원에 언급된 모든 서열은 그의 전체 내용 및 개시내용과 함께 본 명세서의 일부인 첨부된 서열 목록에 개시되어 있다.

본 발명의 맥락에서, C5a는 특히 인간 C5a를 지칭한다. 인간 C5a는 다음 아미노산 서열을 갖는 74개의 아미노산 펩티드이다:

TLQKKIEEIA AKYKHSVVKK CCYDGACVNN DETCEQRAAR ISLGPRCIKA

FTECCVVASQ LRANISHKDM QLGR (서열번호: 1).

인간 C5의 아미노산 서열은 수탁 번호 UniProtKB P01031(CO5_HUMAN)하에 발견될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "C5a 활성의 억제제"는 어떤 식으로든 C5a의 활성을 감소시키는 임의의 화합물을 지칭한다. 이러한 활성 감소는 C5a의 농도를 직접적으로 또는 간접적으로 낮춤으로써, 또는 C5a의 활성을 감소시킴으로써, 또는 C5a가 그의 수용체 중 하나 이상에 대해(예: C5aR 또는 C5L2에 대해) 그의 효과를 발휘하는 것을 방지하거나, C5a의 하나 이상의 수용체의 농도 또는 활성을 감소시킴으로써 달성될 수 있다.

본 발명의 맥락에서, "C5a 수용체"라는 표현은 세포 표면 상의 임의의 잠재적인 C5a 결합 리간드, 특히 C5a가 결합하여 상기 수용체에 대한 반응(예: 수용체의 활성화 또는 억제)을 발휘할 수 있는 임의의 수용체 단백질을 지칭한다. 용어 "C5a 수용체"는 특히 2개의 수용체 C5aR 및 C5L2를 포함한다. C5aR의 대안적인 명칭은 C5aR1 및 CD88이다. C5L2의 대안적인 명칭은 C5aR2이다.

본 발명의 특정 구현예는 C5a 수용체를 간섭하는 (예를 들어, C5a 수용체에 결합함으로써, 또는 C5a 수용체의 발현을 차단함으로써) C5a의 억제제를 지칭한다. 이러한 문맥에서, 용어 "C5a 수용체"는 (i) C5aR, 또는 (ii) C5L2, 또는 (iii) C5aR 및 C5L2 둘 다를 지칭할 수 있다. 이것은 C5a의 억제제 중 일부가 C5a 수용체 중 하나만(즉, C5aR 또는 C5L2)을 간섭하지만, C5a의 다른 억제제는 C5a 수용체 모두(즉, C5aR 및 C5L2 모두)를 간섭한다는 것을 의미한다.

본 발명의 맥락에서, "단백질 리간드"라는 표현은 분자의 총 크기에 관계없이 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산으로 구성되며, 다른 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 따라서, "단백질 리간드"라는 표현은 올리고펩티드(≤ 100개 아미노산) 및 폴리펩티드(> 100개 아미노산)를 포함한다. "단백질 리간드"라는 표현은 또한 그들의 크기에 관계없이 환형 펩티드를 포함한다. "단백질 리간드"라는 표현은 특히 항체, 항체의 항원 결합 단편, 항체 유사 단백질 및 펩티드 모방체를 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 제1 화합물(예: 단백질 리간드 또는 핵산 앱타머(aptamer))은 제2 화합물(예: 표적 단백질)에 대해 1mM 이하, 바람직하게는 100μM 이하, 바람직하게는 50μM 이하, 바람직하게는 30μM 이하, 바람직하게는 20μM 이하, 바람직하게는 10μM 이하, 바람직하게는 5μM 이하, 보다 바람직하게는 1μM 이하, 보다 바람직하게는 900nM 이하, 보다 바람직하게는 800nM 이하, 보다 바람직하게는 700nM 이하, 보다 바람직하게는 600nM 이하, 보다 바람직하게는 500nM 이하, 보다 바람직하게는 400nM 이하, 보다 바람직하게는 300nM 이하, 보다 바람직하게는 200nM 이하, 더욱 더 바람직하게는 100nM 이하, 더욱 더 바람직하게는 90nM 이하, 보다 더 바람직하게는 80nM 이하, 더욱 더 바람직하게는 70nM 이하, 더욱 더 바람직하게는 60nM 이하, 더욱 더 바람직하게는 50nM 이하, 더욱 더 바람직하게는 40nM 이하, 더욱 더 바람직하게는 30nM 이하, 더욱 더 바람직하게는 20nM 이하, 더욱 더 바람직하게는 10nM 이하의 해리 상수 K_d를 갖는 경우, 상기 제2 화합물에 "결합하는" 것으로 간주된다.

본 발명에 따른 용어 "결합"은 바람직하게는 특이적 결합에 관한 것이다. "특이적 결합"은 화합물(예: 단백질 리간드 또는 핵산 앱타머)이 다른 표적에 대한 결합과 비교하여 특이적인 에피토프와 같은 표적에 더 강하게 결합함을 의미한다. 화합물은 제2 표적에 대한 해리 상수보다 낮은 해리 상수(K_d)로 제1 표적에 결합하는 경우, 제2 표적과 비교하여 제1 표적에 더 강하게 결합한다. 바람직하게는, 화합물이 특이적으로 결합하는 표적에 대한 해리 상수(K_d)는 화합물이 특이적으로 결합하지 않는 표적에 대한 해리 상수(K_d)보다 10배 이상, 바람직하게는 20배 이상, 보다 바람직하게는 50배 이상, 더욱 더 바람직하게는 100배, 200배, 500배 또는 1000배 이상 더 낮다.

본원에 사용된 용어 "K_d"(일반적으로 "mol/L"로 측정되고, 때때로 "M"으로 약칭됨)는 화합물(예: 단백질 리간드)과 표적 분자 사이의 특정 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭하도록 의도된다.

화합물의 결합 친화도를 결정하는 방법, 즉 해리 상수 K_d를 결정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, 당업계에 공지된 하기 방법으로부터 선택될 수 있다: 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기반 기술, 바이오층 간섭법(BLI), 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 유세포 분석, 등온 적정 열량측정(ITC), 분석적 초원심분리, 방사선 면역 검정(RIA 또는 IRMA) 및 강화된 화학 발광(ECL). 전형적으로, 해리 상수 K_d는 20℃, 25℃, 30℃ 또는 37℃에서 결정된다. 달리 구체적으로 지시되지 않는 한, 본원에 인용된 K_d 값은 ELISA에 의해 20℃에서 결정된다.

항원성 결정인자로도 공지된 "에피토프"는 면역계, 구체적으로 항체, B 세포 또는 T 세포에 의해 인식되는 거대분자의 일부이다. 본원에서 사용되는 "에피토프"는 본원에 기재된 화합물(예: 항체 또는 이의 항원 결합 단편)에 결합할 수 있는 거대분자의 일부이다. 이러한 맥락에서, 용어 "결합"은 바람직하게는 특이적 결합에 관한 것이다. 에피토프는 일반적으로 아미노산 및 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹으로 구성되며, 일반적으로 특정 3차원 구조 특성 및 특정 전하 특성을 갖는다. 구조적 에피토프 및 비구조적 에피토프는 후자에 대해서가 아니라 전자에 대한 결합이 변성 용매의 존재하에 손실된다는 점에서 구별될 수 있다.

"파라토프"는 에피토프에 결합하는 항체의 일부이다. 본 발명의 맥락에서, "파라토프"는 에피토프에 결합하는 본원에 기재된 화합물(예: 단백질 리간드)의 일부이다.

용어 "항체"는 전형적으로 이황화 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중(H) 쇄 및 2개의 경(L) 쇄를 포함하는 당단백질, 또는 이의 항원 결합 부분을 지칭한다. 용어 "항체"는 또한 항체, 특히 본원에 기재된 항체, 예를 들어, 원핵생물에서 발현된 항체, 비글리코실화 항체, 진핵생물에서 발현된 항체(예: CHO 세포), 글리코실화 항체, 및 하기 기재된 바와 같은 임의의 항원 결합 항체 단편 및 유도체의 모든 재조합 형태를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 VH 또는 V_H로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL 또는 V_L로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 지칭되는 더 보존된 영역이 산재하는, 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 초가변성 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카르복시 말단을 향해 다음 순서로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예: 이펙터 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 성분(C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 항체의 용어 "항원 결합 단편"(또는 간단히 "결합 부분")은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 항체의 "항원 결합 부분"이라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')₂ 단편; (iii) VH 및 CH 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR); 및 (vii) 임의로 합성 링커에 의해 연결될 수 있는 2개 이상의 단리된 CDR의 조합을 포함한다. 또한, Fv 단편의 두 도메인인 VL과 VH는 별도의 유전자에 의해 코딩되지만, 그들은 재조합 방법을 사용하여 그들이 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄(단일 쇄 Fv(scFv)로서 공지됨; 참조: 예를 들어, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883)로서 제조되도록 하는 합성 링커에 의해 결합될 수 있다. 이러한 단일 쇄 항체는 또한 항체의 "항원 결합 단편"이란 용어 내에 포함되도록 의도된다. 추가의 예는 (i) 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드에 융합된 결합 도메인 폴리펩티드, (ii) 힌지 영역에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH2 불변 영역 및 (iii) CH2 불변 영역에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH3 불변 영역을 포함하는 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질이다. 결합 도메인 폴리펩티드는 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역일 수 있다. 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질은 US2003/0118592 및 US2003/0133939에 추가로 개시되어 있다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 종래 기술을 사용하여 수득되며, 단편은 손상되지 않은 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다. "항원 결합 단편"의 추가의 예는 단일 CDR로부터 유래된 소위 마이크로항체이다. 예를 들어, 문헌(참조: Heap et al., 2005)은 HIV-1의 gp120 엔벨로프 당단백질에 대해 지시된 항체의 중쇄 CDR3으로부터 유래된 17개 아미노산 잔기 마이크로항체를 기재하고 있다(참조: (Heap C.J. et al. (2005) Analysis of a 17-amino acid residue, virus-neutralizing microantibody . J. Gen. Virol. 86:1791-1800). 다른 예는 바람직하게는 동족 프레임워크 영역에 의해 서로 융합된 2개 이상의 CDR 영역을 포함하는 소형 항체 모방체를 포함한다. 동족 V_H FR2에 의해 연결된 V_H CDR1 및 V_L CDR3을 포함하는 이러한 소형 항체 모방체는 문헌[참조: Qiu et al., 2007 (Qiu X.-Q. et al. (2007) Small antibody mimetics comprising two complementary-determining regions and a framework region for tumor targeting. Nature biotechnology 25(8):921-929)]에 기재되어 있다.

따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체 또는 이의 항원 결합 단편"은 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 즉 항원에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 지칭한다. 또한, 표적 분자 또는 표적 에피토프에 특이적으로 결합하기 위해, 예를 들어, 파지 디스플레이를 포함하는 기술을 통해 선택된 면역글로불린-유사 단백질도 또한 포함된다. 본 발명의 면역글로불린 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 유형(예: IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예: IgG1, IgG2, 바람직하게는 IgG2a 및 IgG2b, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류일 수 있다.

본 발명에서 사용 가능한 항체 및 이의 항원 결합 단편은 조류 및 포유동물을 포함하는 임의의 동물 기원으로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 항체 또는 단편은 인간, 침팬지, 설치류(예: 마우스, 래트, 기니피그 또는 토끼), 닭, 칠면조, 돼지, 양, 염소, 낙타, 소, 말, 당나귀, 고양이 또는 개 기원으로부터 유래된다. 항체가 인간 또는 뮤린 기원인 것이 특히 바람직하다. 본 발명에서 사용하기 위한 항체는 또한 하나의 종, 바람직하게는 인간으로부터 유래된 항체 불변 영역이 다른 종, 예를 들어, 마우스로부터 유래된 항원 결합 부위와 조합된 키메라 분자를 포함한다. 또한, 본 발명의 항체는 비인간 종(예: 마우스)으로부터 유래된 항체의 항원 결합 부위가 인간 기원의 불변 영역 및 프레임워크 영역과 조합된 인간화 분자를 포함한다.

본원에 예시된 바와 같이, 본 발명의 항체는 항체를 발현하는 하이브리도마로부터 직접 수득될 수 있거나, 숙주 세포(예: CHO 세포 또는 림프구 세포)에서 클로닝되고 재조합적으로 발현될 수 있다. 숙주 세포의 추가 예는 미생물, 예를 들어, 이. 콜라이(E. coli), 및 진균, 예를 들어, 효모이다. 대안적으로, 그들은 유전자도입 비인간 동물 또는 식물에서 재조합적으로 생산될 수 있다.

용어 "키메라 항체"는 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열 각각의 한 부분이 특정 종으로부터 유래되거나 특정 부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 상동성이며, 쇄의 나머지 세그먼트가 다른 종 또는 부류의 상응하는 서열과 상동성인 항체를 지칭한다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄 둘 다의 가변 영역은 포유동물 중 한 종으로부터 유래된 항체의 가변 영역을 모방하지만, 불변 부분은 다른 종으로부터 유래된 항체의 서열과 상동성이다. 이러한 키메라 형태에 대한 하나의 명백한 이점은 가변 영역이, 예를 들어, 인간 세포 제제로부터 유래된 불변 영역과 조합하여 비인간 숙주 유기체로부터 용이하게 이용 가능한 B-세포 또는 하이브리도마를 사용하여 현재 공지된 공급원으로부터 편리하게 유도될 수 있다는 것이다. 가변 영역은 제조의 용이성과 특이성이 공급원에 의해 영향을 받지 않는다는 이점을 갖는 반면, 인간인 불변 영역은 비인간 공급원으로부터의 불변 영역보다 항체가 주사될 때 인간 대상체로부터 면역 반응을 발휘할 가능성이 적다. 그러나, 정의는 이 특정 예로 제한되지 않는다.

용어 "인간화 항체"는 비인간 종의 면역글로불린으로부터 실질적으로 유래된 항원 결합 부위를 갖는 분자를 지칭하며, 여기서 상기 분자의 나머지 면역글로불린 구조는 인간 면역글로불린의 구조 및/또는 서열에 기초한다. 항원 결합 부위는 불변 도메인에 융합된 완전 가변 도메인 또는 가변 도메인 내의 적절한 프레임워크 영역에 그래프팅된 상보성 결정 영역(CDR)만을 포함할 수 있다. 항원 결합 부위는 야생형이거나 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있고, 예를 들어, 인간 면역글로불린과 더 밀접하게 유사하도록 변형될 수 있다. 일부 형태의 인간화 항체는 모든 CDR 서열을 보존한다(예: 마우스 항체의 6개 CDR 모두를 함유하는 인간화 마우스 항체). 다른 형태는 원래 항체에 대해 변경된 하나 이상의 CDR을 갖는다.

문헌(참조: Almagro & Fransson, 2008, Frontiers in Bioscience, 13:1619-1633, 이의 내용은 전체가 본원에 참고로 포함됨)에 의해 검토된 바와 같이, 항체를 인간화하는 상이한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 문헌(참조: Almagro & Fransson)의 검토 기사는 국제 특허 출원 WO 2011/063980 A1의 국내 단계 진입인 US 2012/0231008 A1에 간략하게 요약되어 있다. US 2012/0231008 A1 및 WO 2011/063980 A1의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

본원에서 사용된 바와 같이, "인간 항체"는 인간 생식계 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식계 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않는 아미노산 잔기(예: 시험관내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발에 의해, 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 본 발명의 인간 항체는, 예를 들어, 미국 특허 제5,939,598호(Kucherlapati & Jakobovits)에 기재된 바와 같이, 인간 면역글로불린 라이브러리 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대한 유전자도입 동물로부터 단리되고, 내인성 면역글로불린을 발현하지 않는 항체를 포함된다.

본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 단일 분자 조성물의 항체 분자의 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체는 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 한 구현예에서, 모노클로날 항체는 비인간 동물, 예를 들어, 불멸화 세포에 융합된 마우스부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성된다.

본원에 사용된 용어 "재조합 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 항체, 예를 들어, (a) 면역글로불린 유전자 또는 이로부터 제조된 하이브리도마에 대해 유전자 도입되거나 염색체 이식된 동물(예: 마우스)로부터 단리된 항체, (b) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터, 예를 들어, 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, (c) 재조합성 조합 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 면역글로불린 유전자 서열의 다른 DNA 서열에 대한 스플라이싱을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성되거나 단리된 항체를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "트랜스펙토마"는 항체를 발현하는 재조합 진핵 생물 숙주 세포, 예를 들어, CHO 세포, NS/0 세포, HEK293 세포, HEK293T 세포, 식물 세포, 또는 효모 세포를 포함하는 진균을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, "이종성 항체"는 이러한 항체를 생산하는 유전자 도입 유기체와 관련하여 정의된다. 이 용어는 유전자 도입 유기체로 구성되지 유기체에서 발견되는 것에 상응하는 아미노산 서열 또는 인코딩 핵산 서열을 가지며, 일반적으로 유전자 도입 유기체 이외의 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, "헤테로하이브리드 항체"는 상이한 유기체 기원의 경쇄 및 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 뮤린 경쇄와 관련된 인간 중쇄를 갖는 항체는 헤테로하이브리드 항체이다.

따라서, 본 발명에서 사용하기에 적합한 "항체 및 이의 항원 결합 단편"은 폴리클로날, 모노클로날, 1가, 이중특이적, 헤테로접합체, 다중특이적, 재조합, 이종성, 헤테로하이브리드, 키메라, 인간화(특히, CDR-그래프트화), 탈면역화, 또는 인간 항체, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, Fd, Fv, 이황화 결합 Fv(dsFv), 단일 쇄 항체(예: scFv), 디아바디 또는 테트라바디(Holliger P. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90(14), 6444-6448), 나노바디(단일 도메인 항체로도 공지됨), 항유전자형(항-Id) 항체(예를 들어, 본원에 기재된 항체에 대한 항-Id 항체 포함) 및 상기 중 임의의 것의 에피토프 결합 단편을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

본원에 기재된 항체는 바람직하게 단리된다. 본원에 사용된 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체를 실질적으로 함유하지 않는 항체를 지칭하도록 의도된다(예를 들어, C5a에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 C5a 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 실질적으로 함유하지 않는다). 그러나, 인간 C5a의 에피토프, 이소형 또는 변이체에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는, 예를 들어, 다른 종(예: C5a 종 상동체, 예를 들어, 래트 C5a)으로부터의 다른 관련 항원에 대한 교차 반응성을 가질 수 있다. 또한, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질을 실질적으로 함유하지 않을 수 있다. 본 발명의 한 구현예에서, "단리된" 모노클로날 항체의 조합은 상이한 특이성을 가지며, 충분히 정의된 조성으로 조합된 항체에 관한 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "자연적으로 발생하는"은 객체에 적용될 때 객체가 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 지칭한다. 예를 들어, 자연에서 공급원으로부터 단리될 수 있는 유기체(바이러스 포함)에 존재하고 자연에서 공급원으로부터 단리될 수 있고, 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 변형되지 않은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 자연적으로 발생한다.

본원에 사용된 용어 "핵산 앱타머"는 시험관내 선택 또는 SELEX(지수 농축에 의한 리간드의 체계적 진화)의 반복 라운드를 통해 표적 분자에 결합하도록 조작된 핵산 분자를 지칭한다(검토를 위해, 참조: Brody E.N. and Gold L. (2000), Aptamers as therapeutic and diagnostic agents. J. Biotechnol. 74(1):5-13). 핵산 앱타머는 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 앱타머는 변형, 예를 들어, 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어, 2'-불소 치환된 피리미딘을 함유할 수 있고/있거나 표준 D-리보스 단위 (또는 D-데옥시리보스 단위) 대신에 L-리보스 단위 (또는 L-데옥시리보스)를 갖는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "항체-유사 단백질"은 표적 분자에 특이적으로 결합하도록 조작된(예를 들어, 루프의 돌연변이유발에 의해) 단백질을 지칭한다. 전형적으로, 이러한 항체-유사 단백질은 양 말단에서 단백질 스캐폴드에 부착된 적어도 하나의 가변 펩티드 루프를 포함한다. 이러한 이중 구조적 제약은 항체 유사 단백질의 결합 친화도를 항체의 결합 친화도에 필적하는 수준까지 크게 증가한다. 가변 펩티드 루프의 길이는 전형적으로 10 내지 20개의 아미노산으로 구성된다. 스캐폴드 단백질은 양호한 용해도 특성을 갖는 임의의 단백질일 수 있다. 바람직하게는, 스캐폴드 단백질은 작은 구형 단백질이다. 항체 유사 단백질은 제한 없이 아피바디, 아필린, 아피머, 아피틴, 알파바디, 안티칼린, 아비머, DARPins(설계된 안키린 반복 단백질), 피노머, 쿠니츠 도메인 펩티드 및 모노바디를 포함한다(검토를 위해, 참조: Binz H.K. et al. (2005) Engineering novel binding proteins from nonimmunoglobulin domains. Nat. Biotechnol. 23(10):1257-1268). 항체 유사 단백질은 돌연변이체의 큰 라이브러리로부터 유래될 수 있고, 예를 들어, 큰 파지 디스플레이 라이브러리로부터 패닝될 수 있고, 일반 항체와 유사하게 단리될 수 있다. 또한, 항체 유사 결합 단백질은 구형 단백질에서 표면 노출된 잔기의 조합 돌연변이유발에 의해 수득될 수 있다. 항체-유사 단백질은 때때로 "펩티드 앱타머" 또는 "항체 모방체"로 지칭될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "펩티도모방체"는 펩티드를 모방하도록 설계된 작은 단백질-유사 쇄이다. 펩티도모방체는 전형적으로 분자의 특성을 변경하기 위해 기존의 펩티드의 변형으로부터 발생한다. 예를 들어, 그들은 분자의 안정성 또는 생물학적 활성을 변경하기 위한 변형으로부터 발생할 수 있다. 이것은 기존 펩티드로부터 약물 유사 화합물의 개발에 역할을 할 수 있다. 이러한 변형은 자연적으로 발생하지 않을 펩티드에 대한 변화(예: 변경된 골격 및 비천연 아미노산의 통합)를 포함한다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "소분자"는 분자량이 2kDa 이하, 바람직하게는 분자량이 1kDa 이하인 분자를 지칭한다. 용어 "소분자"는 특히 올리고펩티드도 올리고뉴클레오티드도 아닌 분자를 지칭한다.

본 발명의 맥락에서, 일반적인 표현 "A가 C에 대한 결합에 대해 B와 경쟁한다"(예를 들어, 표현 "상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 C5a에 대한 결합에 대해 (a)하에 표시된 항체 중 하나와 경쟁한다"에서)는 위치 A에 나열된 화합물의 결합 특성을 정의하는데 사용된다. 상기 화합물 A는 C에 결합하고, 화합물 B는 또한 C에 결합하지만, 화합물 A와 화합물 B는 동시에 C에 결합할 수 없다; 즉, A와 B는 C 상의 동일한 에피토프 (또는 적어도 중복 에피토프)에 결합한다. 결합에서 이러한 경쟁은 경쟁적 ELISA 또는 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기반 기술에 의해 또는 결합 친화도의 결정의 맥락에서 상기 나열된 다른 기술 중 임의의 것에 의해 결정될 수 있다. 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 화합물의 경쟁 결합 특성은 2개의 경쟁 화합물의 등몰 농도를 사용하여 20℃에서 ELISA에 의해 결정된다.

IFX-1(대안적인 명칭: CaCP29; InflaRx GmbH, Germany)은 C5a에 특이적으로 결합하는 항체이다. IFX-1의 CDR 서열 및 FR 서열은 WO 2015/140304 A1(표 3)에 개시되어 있으며, 이의 내용은 전체가 본원에 참고로 포함된다. 그것은 서열번호 34에 따른 가변 중쇄 서열 및 서열번호 359에 따른 가변 경쇄 서열을 포함한다.

INab708(InflaRx GmbH, Germany)은 C5a에 특이적으로 결합하는 또 다른 항체이다. INab708의 CDR 서열 및 FR 서열은 또한 WO 2015/140304 A1(표 3)에 개시되어 있으며, 그 내용은 그 전체가 참고로 포함된다. 그것은 서열번호 36에 따른 가변 중쇄 서열 및 서열번호 37에 따른 가변 경쇄 서열을 포함한다.

MEDI-7814(MedImmune)는 재조합 인간화 항-C5a 항체이다. MEDI7814와의 복합체에서 인간 C5a의 결정 구조는 4UU9(DOI: 10.2210/pdb4uu9/pdb)하의 RCSB 단백질 데이터 뱅크에서 이용 가능하다.

ALXN-1007(Alexion)은 인간화 항-C5a 항체이다.

NOX-D21(Noxxon)은 서열 40kDaPEG-아미노헥실-GCG AUG(dU)GG UGG UGA AGG GUU GUU GGG (dU)GU CGA CGC A(dC)G C(서열번호 34)를 갖는 PEG화된 혼합 L-RNA/DNA-앱타머(Spiegelmer™)이다. NOX-D21은 C5a를 표적화한다(Hyzewicz J, Tanihata J, Kuraoka M, Nitahara-Kasahara Y, Beylier T, Ruegg UT, Vater A, and Takeda S. 2017. Low-Intensity Training and the C5a Complement Antagonist NOX -D21 Rescue the mdx Phenotype through Modulation of Inflammation. Am. J. Pathol., 187(5):1147-1161; electronically published ahead of print: March 18, 2017).

에쿨리주맙(Eculizumab)(대안적인 명칭: Soliris™, 5G1-1; h5G1.1; Alexion Pharmaceuticals)은 뮤린 골수종 세포 배양에 의해 생산되고 표준 바이오프로세스 기술에 의해 정제된 재조합 인간화 모노클로날 IgG2/4κ 항체이다. 에쿨리주맙은 인간 C5에 특이적으로 결합한다. 에쿨리주맙은 인간 IgG2 서열 및 인간 IgG4 서열의 인간 불변 영역 및 인간 프레임워크 경쇄 및 중쇄 가변 영역에 그래프팅된 뮤린 상보성 결정 영역을 함유한다. 에쿨리주맙은 2개의 448개 아미노산 중쇄와 2개의 214개 아미노산 경쇄로 구성되며, 분자량은 약 148kDa이다. 에쿨리주맙의 중쇄 및 경쇄는, 예를 들어, WO 2016/061066 A1에 각각 서열번호 1 및 서열번호 34로서 개시되어 있다. 에쿨리주맙의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 핵산은, 예를 들어, 미국 특허 제6,355,245호에 개시되어 있다.

ALXN1210(대안적인 명칭: BNJ441; Alexion Pharmaceuticals)은 항-C5 항체이다. ALXN1210의 중쇄 및 경쇄는 각각 서열번호 14 및 11로서 WO 2016/209956 A1에 개시되어 있다.

ALXN5500(Alexion)은 인간화된 항-C5 항체이다. 그것은 차세대 에쿨리주맙 후보이다.

LFG316(대안적인 명칭: 테시돌루맙, NOV-4; Morphosys, Novartis)은 항-C5 항체이다.

Coversin™(대안적인 명칭: EV 576; PAS-코버신; rEV 576; 조직 표적화된 Coversin™ - Akari; Akari Therapeutics, Evolutec)은 오르니토드로스 모바타(Ornithodros moubata) 진드기의 타액 분자로부터 유래된 재조합 단백질 분자(16.7kDa)이고, 여기서 그것은 기생충이 숙주 면역학적 반응을 유발하지 않고 섭식하도록 돕는다. EV576 단백질(즉, 코버신(Coversin))의 아미노산 서열 및 그의 코딩 뉴클레오티드 서열은 WO 2008/029167의 도 2에 도시되어 있다. Coversin™은 C5에 결합한다.

RA101495(Ra Pharma)는 C5의 매크로사이클릭 합성 펩티드 억제제이다(Ricardo A, Arata M, DeMarco S, Dhamnaskar K, Hammer R, Fridkis-Hareli M, Rajagopal V, Seyb K, Tang G-Q, Tobe S and Treco D. 2015. Preclinical Evaluation of RA101495, a Potent Cyclic Peptide Inhibitor of C5 for the Treatment of Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria. Blood 126:939).

Zimura®(대안적인 명칭: 항-C5 앱타머; ARC-187; ARC-1905; 아바신캅타드 페골 나트륨; OphthoTech Corporation, Archemix Corporation)은 보체 인자 C5를 억제하는 페길화된 RNA 앱타머이다. ARC1905(즉, 지무라(Zimura))의 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어, WO 2005/079363 A2에서 서열번호 67로서 도시되고, 그의 구조는 WO 2005/079363 A2의 도 22에 도시되어 있다.

AMY-201(Amyndas Pharmaceuticals)은 조절 및 표면 인식 도메인을 직접 연결하는 인자 H의 조작된 형태이고; 따라서, 그것은 미니-FH 분자의 일종이다.

미로코셉트(Mirococept)(대안적인 명칭: APT070 및 APT 070C; 창시자: Adprotech; 개발자: Inflazyme Pharmaceuticals)는 인간 보체 수용체 1의 처음 3개의 짧은 컨센서스 도메인으로 구성되며, 재조합 박테리아에서 제조되며 천연 막 결합 미리스토일-정전기적 스위치 펩티드에 기초한 막 표적화 양친매성 펩티드로 변형된다(Souza DG, Esser D, Bradford R, Vieira AT, and Teixeira MM. 2005. APT070 (Mirococept), a membrane- localised complement inhibitor, inhibits inflammatory responses that follow intestinal ischaemia and reperfusion injury. Br J Pharmacol 145(8):1027-1034).

비카시오맙(Bikaciomab)(Novelmed)은 NM001로 명명된 항-인자 Bb 항체의 F(ab)₂ 단편이다. 항체 NM001은 ATCC 수탁 번호 PTA-8543하에 기탁된 하이브리도마 세포주 1D3에 의해 생산된다.

람팔리주맙(Lampalizumab)(대안적인 명칭: 항-인자 D Fab; FCFD4514S; RG7417; TNX-234; 창시자: Tanox, 개발자: Genentech)은 인자 D 상의 엑소사이트에의 결합을 통해 인자 D와 대안적인 보체 경로(complement pathway)를 억제하는 인간화된 항-인자 D Fab 단편이다.

ALN-CC5(Alnylam)는 인간, 영장류 및 설치류 C5를 표적으로 하는 RNAi 치료제이다. C5 유전자를 표적으로 하는 예시적인 iRNA 조성물은 WO 2016/044419에 기재되어 있다.

아바코판(Avacopan)(명칭 CCX168에 의해 공지되기도 함; Chemocentryx)은 다음 화학식 I의 구조를 갖는 작은 분자(MW = 581.66g/mol)이다:

[화학식 I]

아바코판의 IUPAC/화학명은 (2R,3S)-2-[4-(사이클로펜틸아미노)페닐]-1-(2-플루오로-6-메틸벤조일)-N-[4-메틸-3-(트리플루오로메틸)페닐]피페리딘-3-카르복스아미드이다. 아바코판은 C5aR의 선택적 억제제이다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "아바코판"은 화학식 I에 따른 화합물 및 이의 생리학적으로 허용되는 염을 지칭한다.

본 발명의 실시에 또한 적합한 아바코판과 유사한 화합물은 국제 특허 출원 WO 2010/075257 A1 및 WO 2011/163640 A1에 개시되어 있으며, 그의 내용은 전체가 본원에 참고로 포함된다. 따라서, 일부 구현예에서, C5a 활성의 억제제는 화학식 II의 화합물 및 이의 약제학적으로 허용되는 염, 수화물 및 로토머이다:

[화학식 II]

상기 화학식 II에서,

C¹은 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 여기서 헤테로아릴 그룹은 환원으로서 N, O 및 S로부터 선택되는 1 내지 3개의 헤테로원자를 가지며; 상기 아릴 및 헤테로아릴 그룹은 1 내지 3개의 R¹ 치환기로 임의로 치환되고;

C²는 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 여기서 헤테로아릴 그룹은 환원으로서 N, O 및 S로부터 선택되는 1 내지 3개의 헤테로원자를 가지며; 상기 아릴 및 헤테로아릴 그룹은 1 내지 3개의 R² 치환기로 임의로 치환되고;

C³은 C_1-8 알킬 또는 헤테로알킬, C_3-8 사이클로알킬, C_3-8 사이클로알킬-C_1-4알킬, 아릴, 아릴-C_1-4 알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴-C_1-4 알킬, 헤테로사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬-C_1-4 알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택되고; 여기서 헤테로사이클로알킬 그룹 또는 부분은 N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 갖고, 헤테로아릴 그룹은 환원으로서 N, O 및 S로부터 선택되는 1 내지 3개의 헤테로원자를 가지며, 각각의 C³은 1 내지 3개의 R³ 치환기로 임의로 치환되고;

각 R¹은 할로겐, -CN, -R^c, -CO₂R^a, -CONR^aR^b, -C(O)R^a, -OC(O)NR^aR^b, -NR^bC(O)R^a, -NR^bC(O)₂R^c, -NR^a-C(O)NR^aR^b, -NR^aC(O)NR^aR^b, -NR^aR^b, -OR^a 및 -S(O)₂NR^aR^b로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 각 R^a 및 R^b는 수소, C_1-8 알킬, 및 C_1-8 할로알킬로부터 독립적으로 선택되거나, 동일한 질소 원자에 부착되는 경우, 질소 원자와 결합하여 N, O 또는 S로부터 선택되는 환원으로서 0 내지 2개의 추가 헤테로원자를 갖는 5원 또는 6원 환을 형성하고, 1개 또는 2개의 옥소로 임의로 치환되고; 각 R^c는 C_1-8 알킬 또는 헤테로알킬, C_1-8 할로알킬, C_3-6사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 R^a, R^b 및 R^c의 지방족 및 사이클릭 부분은 임의로 1 내지 3개의 할로겐, 하이드록시, 메틸, 아미노, 알킬아미노 및 디알킬아미노 그룹으로 임의로 추가로 치환되며; 임의로, 2개의 R¹ 치환기가 인접한 원자 상에 존재하는 경우, 결합하여 융합된 5원 또는 6원 카보사이클릭 또는 헤테로사이클릭 환을 형성하고;

각 R²는 할로겐, -CN, -NO₂, -R^f, -CO₂R^d, -CONR^dR^e, -C(O)R^d, -OC(O)NR^dR^e, -NR^eC(O)R^d, -NR^eC(O)₂R^f, -NR^dC(O)NR^dR^e, -NR^dC(O)NR^dR^e, -NR^dR^e, -OR^d, 및 -S(O)₂NR^dR^e로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고; 여기서, 각 R^d 및 R^e는 수소, C_1-8알킬 및 C_1-8 할로알킬로부터 독립적으로 선택되거나, 동일한 질소 원자에 부착된 경우, 질소 원자와 결합하여 N, O 또는 S로부터 선택되는 환원으로서 0 내지 2개의 추가 헤테로원자를 갖는 5원 또는 6원 환을 형성하고, 1개 또는 2개의 옥소로 임의로 치환되고; 각 R은 C_1-8 알킬 또는 헤테로알킬, C_1-8 할로알킬, C_3-6사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 R^d, R^e 및 R^f의 지방족 및 사이클릭 부분은 임의로 1 내지 3개의 할로겐, 하이드록시, 메틸, 아미노, 알킬아미노 및 디알킬아미노 그룹으로 임의로 추가로 치환되며; 임의로, 2개의 R² 그룹이 인접한 원자 상에 존재하는 경우, 그들은 결합하여 5원 또는 6원 환을 형성하고;

각 R³은 할로겐, -CN, -Rⁱ, -CO₂R^g, -CONR^gR^h, -C(O)R^g, -C(O)Rⁱ, -OC(O)NR^gR^h, -NR^hC(O)R^g, -NR^hCO₂Rⁱ, -NR^gC(O)NR^gR^h, -NR^gR^h, -OR^g, -OR^j, -S(O)₂NR^gR^h, -X⁴-R^j, -NH-X⁴-R^j, -O-X⁴-R^j, -X⁴-NR^gR^h, -X⁴-NHR^j, -X⁴-CONR^gR^h, -X⁴-NR^hC(O)R^g, -X⁴-CO₂R^g, -O-X⁴-CO₂R^g, -NH-X⁴-CO₂R^g, -X⁴-NR^hCO₂Rⁱ, -O-X⁴-NR^hCO₂Rⁱ, -NHR^j 및 -NHCH₂R^j로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서, X⁴는 C_1-4 알킬렌이고; 각 R^g 및 R^h는 수소, C_1-8알킬 또는 헤테로알킬, C_3-6사이클로알킬 및 C_1-8 할로알킬로부터 독립적으로 선택되거나, 동일한 질소 원자에 부착된 경우, 질소 원자와 결합하여 환원으로서 N, O 또는 S로부터 선택되는 0 내지 2개의 추가 헤테로원자를 갖는 4원, 5원 또는 6원 환을 형성하고, 1개 또는 2개의 옥소로 임의로 치환되고; 각 Rⁱ는 C_1-8 알킬 또는 헤테로알킬, C_1-8 할로알킬, C_3-6사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고, 각 R^j는 C_3-6사이클로알킬, 이미다졸릴, 피리미디닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 모르폴리닐, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로피라닐 및 S,S-디옥소-테트라하이드로티오피라닐로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기서 R^g, R^h, Rⁱ 및 R^j의 지방족 및 사이클릭 부분은 임의로 1 내지 3개의 할로겐, 메틸, CF₃, 하이드록시, C_1-4알콕시, C_1-4알콕시-C_1-4알킬, -C(O)O-C_1-8알킬, 아미노, 알킬아미노 및 디알킬아미노 그룹으로 임의로 추가로 치환되며; 임의로, 2개의 R³ 그룹이 인접한 원자 상에 존재하는 경우, 그들은 결합하여 5원 또는 6원 환을 형성하고;

X는 수소 또는 CH₃이다.

아바코판과 유사하지만, 개선된 용해도 프로파일을 갖는 화합물은 WO 2017/176620 A2에 개시되어 있으며, 이의 내용은 전체가 본원에 참고로 포함된다. 따라서, 일부 다른 구현예에서, C5a 활성의 억제제는 하기 화학식 III의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:

[화학식 III]

상기 화학식 III에서,

R¹은 H, -O-CH₂-O-P(O)OR^aOR^b, -O-C(O)-C_1-6 알킬렌-L²-X¹, O-P(O)OR^aOR^b, 및 -O-C(O)-A¹-(C_1-3 알킬렌)_n-C_4-7 헤테로사이클릴로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기서 C_4-7 헤테로사이클릴은 1 내지 6개의 R^c 그룹으로 임의로 치환되고;

A¹은 C_6-10 아릴, C_3-10 사이클로알킬, C_5-10 헤테로아릴 및 C_5-10 헤테로사이클릴로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 이들 각각은 동일하거나 상이할 수 있는 1 내지 5개의 R^x로 임의로 치환되고;

n은 0 또는 1이고;

L²는 결합, -O-C(O)-C_1-6 알킬렌-, 및 NR^d-C(O)-C_1-6알킬렌-으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;

X¹은 -NR^eR^f, -P(O)OR^aOR^b, -O-P(O)OR^aOR^b, 및 -CO₂H로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;

R²는 H, -L³-C_1-6 알킬렌-L⁴-X² , -L³- (C_1-6 알킬렌)_m-A²-X² , -P(O)OR^aOC(O)-C_1-6 알킬, -P(O)OR^aNR^gR^h 및 -P(O)OR^aOR^b로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;

L³은 -C(O)-O- 및 -C(O)-로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되며,

L⁴는 결합, -O-C(O)-C_2-6 알케닐렌-, -O-C(O)-C_1-6 알킬렌-, 및 -NR^d-C(O)-C_1- ₆알킬렌-으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 -NR^d-C(O)-C_1- ₆알킬렌- 및 -O-C(O)-C_1-6 알킬렌- 중의 C_1-6 알킬렌은 NR^eR^f로 임의로 치환되고;

X²는 -NR^kR^l, -P(O)OR^aOR^b , -O-P(O)OR^aOR^b, 및 -CO₂H로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;

m은 0 또는 1이고;

A²는 C_6-10 아릴, C_3-10 사이클로알킬, C_5-10 헤테로아릴 및 C_5-10 헤테로사이클릴로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 이들 각각은 동일하거나 상이할 수 있는 1 내지 5개의 R^x로 임의로 치환되고,

R³은 H 또는 -L⁵-P(O)OR^aOR^b이고, 여기서 L⁵는 결합 및 -CH₂-O-로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되며;

각 R^x는 할로겐, C_1-6 알킬, C_1-6 할로알킬, C_1-6 헤테로알킬, CN, NR^yR^z, SR^y 및 OR^y로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;

각 R^c는 할로겐, C_1-6 알킬, C_1-6 할로알킬, C_1-6 헤테로알킬, CN, NR^yR^z, SR^y 및 OR^y로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;

각 R^a, R^b, R^d, R^e, R^f, R^g, R^k, R^l, R^y 및 R^z는 H 및 C_1-6 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;

각 R^h는 H 및 C_1-6 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 C_1-6 알킬은 CO₂H, NRⁱR^j, C_6-10아릴, C_3-10 사이클로알킬, C_5-10 헤테로아릴 및 C_5-10 헤테로사이클릴로부터 독립적으로 선택된 1 내지 5개의 치환기로 임의로 치환되고, 여기서 각 Rⁱ 및 R^j는 독립적으로 H 또는 C_1-6 알킬이고;

여기서, R¹, R² 및 R³ 중 2개는 H이고, R¹, R² 및 R³ 중 하나는 H 이외의 것이다.

PMX-53은 C5aR(CD88)의 강력한 길항제이다. 그것은 Orn-2와 Arg-6 사이에 락탐 브릿지를 갖는 다음 서열: Ac-Phe-사이클로(Orn-Pro-D-Cha-Trp-Arg)을 갖는 6개의 아미노산으로 구성된 환상 펩티드이다. PMX-53은 적어도 하나의 D-아미노산(즉, D-Cha)을 함유하기 때문에, 본 출원의 동봉된 서열 목록에는 포함되지 않는다. PMX-53은 bio-techne GmbH(Wiesbaden-Nordenstadt, Germany), Cat. No. 5473에 의해 시판되고 있다.

본 발명의 실시에 또한 적합한 PMX-53과 유사한 화합물은 국제 특허 출원 WO 99/00406 A1, WO 03/033528 A1 및 WO 2008/009062 A1에 개시되어 있으며, 이들은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 따라서, 일부 구현예에서, C5a 활성의 억제제는 화학식 IV의 사이클릭 펩티드 또는 펩티도모방 화합물이다:

[화학식 IV]

상기 화학식 IV에서,

A는 H, 알킬, 아릴, NH₂, NH-알킬, N(알킬)₂, NH-아릴, NH-아실, NH-벤조일, NHSO₃, NHSO₂-알킬, NHSO₂-아릴, OH, O-알킬, 또는 O-아릴이고;

B는 알킬, 아릴, 페닐, 벤질, 나프틸 또는 인돌 그룹 또는 D- 또는 L-아미노산의 측쇄이지만, 글리신, D-페닐알라닌, L-호모페닐알라닌, L-트립토판, L-호모트립토판, L-티로신 또는 L-호모티로신의 측쇄는 아니고;

C는 D-, L- 또는 호모-아미노산의 측쇄이지만, 이소류신, 페닐알라닌 또는 사이클로헥실알라닌의 측쇄는 아니고;

D는 중성 D-아미노산의 측쇄이지만, 글리신 또는 D-알라닌의 측쇄, 벌키한 평면 측쇄 또는 벌키한 하전된 측쇄는 아니고;

E는 벌키한 치환기이지만, D-트립토판, L-N-메틸트립토판, L-호모페닐알라닌, L-2-나프틸 L-테트라하이드로이소퀴놀린, L-사이클로헥실알라닌, D-류신, L-플루오레닐알라닌 또는 L-히스티딘의 측쇄는 아니고;

F는 L-아르기닌, L-호모아르기닌, L-시트룰린, 또는 L-카나바닌의 측쇄, 또는 이의 생물학적 동배체이고;

X¹은 -(CH₂)_nNH- 또는 (CH₂)_nS-(여기서, n은 1 내지 4의 정수이다); -(CH₂)₂O-; -(CH₂)₃O; -(CH₂)₃-; -(CH₂)₄-, -CH₂-COCHRNH-; 또는 -CH₂-CHCOCHRNH-이고, 여기서 R은 임의의 공통 또는 비공통 아미노산의 측쇄이다.

이 맥락에서, 용어 "공통 아미노산"은 표준 유전자 코드로 정의된 20개의 단백질 생성 아미노산을 지칭한다. 용어 "비공통 아미노산"은 D-아미노산, 호모-아미노산, N-알킬 아미노산, 데하이드로아미노산, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판 이외의 방향족 아미노산, 오르토-, 메타-아미노산 또는 파라-아미노벤조산, 오르니틴, 시트룰린, 카나바닌, 노르류신, δ-글루탐산, 아미노부티르산, L-플루오레닐알라닌, L-3-벤조티에닐알라닌 및 α,α-이치환된 아미노산을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 실시에 적합한 C5aR(CD88)의 특정 길항제는 WO 2008/009062 A1에 개시된 바와 같이, PMX95, PMX218, PMX200, PMX273, PMX205 및 PMX201을 포함한다.

클론 S5/1은 C5a(CD88)의 인간 수용체를 인식하는 모노클로날 항체이다. 클론 S5/1은 C5aR의 N-말단 도메인(Met1-Asn31)을 포함하는 합성 펩티드에 대해 상승되었다. 이 항체는 C5a의 이의 수용체에 대한 결합을 억제하는 것으로 나타났다. 그것은 Hycult Biotech(Uden, The Netherlands), Cat. No. HM2094를 통해 시판되고 있다.

클론 7H110은 C5a(CD88)의 인간 수용체를 인식하는 모노클로날 마우스 항체이다. 그것은 Biomol GmbH(Hamburg, Germany); Cat. No. C2439-60N을 통해 시판되고 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "환자"는 본원에 기재된 화합물에 의한(즉, 본원에 기재된 C5a 활성의 억제제에 의한) 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 임의의 포유동물 또는 조류를 의미한다. 바람직하게는, "환자"는 실험 동물(예: 마우스 또는 래트), 가축(예: 기니피그, 토끼, 닭, 칠면조, 돼지, 양, 염소, 낙타, 소, 말, 당나귀, 고양이 또는 개), 또는 침팬지와 인간을 포함한 영장류로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. "환자"가 인간인 것이 특히 바람직하다.

본원에서 사용된 바와 같이, 질환 또는 장애를 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 다음 중 하나 이상을 달성하는 것을 의미한다: (a) 장애의 중증도 및/또는 지속 기간의 감소; (b) 치료되는 장애(들)의 특징적인 증상의 발병 제한 또는 예방; (c) 치료되는 장애(들)의 특징적인 증상의 악화 억제; (d) 이전에 장애(들)가 있던 환자에서 장애(들)의 재발 제한 또는 예방; 및 (e) 장애(들)에 대해 이전에 증상이 있었던 환자에서 증상의 재발 제한 또는 예방.

본원에서 사용된 바와 같이, 질환 또는 장애를 "예방하다", "예방하는", "예방" 또는 "예방"은 장애가 대상체에서 발생하는 것을 방지하는 것을 의미한다.

"유효량"은 의도된 목적을 달성하기에 충분한 치료제의 양이다. 주어진 치료제의 유효량은 제제의 성질, 투여 경로, 치료제를 받을 동물의 크기 및 종, 및 투여 목적과 같은 인자에 따라 달라질 것이다. 각각의 개별적인 경우에서의 유효량은 당업계에서 확립된 방법에 따라 당업자에 의해 경험적으로 결정될 수 있다.

"약제학적으로 허용되는"은 동물, 더욱 특히 인간에서 사용하기 위해 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되었거나 미국 약전 또는 기타 일반적으로 인정되는 약전에 열거된 것을 의미한다.

본 발명의 구현예

본 발명은 이하 추가로 기재될 것이다. 하기 구절에서, 본 발명의 상이한 측면이 보다 상세하게 정의된다. 이하에 정의되는 각 측면은 반대로 명확하게 나타내지 않는 한 임의의 다른 측면 또는 측면들과 조합될 수 있다. 특히, 바람직하거나 유리한 것으로 표시된 임의의 특징은 바람직하거나 유리한 것으로 표시된 임의의 다른 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다.

제1 측면에서, 본 발명은 코로나 바이러스에 의한 감염에 의해 유발되거나 이와 관련된 의학적 상태의 치료에 사용하기 위한 C5a 활성의 억제제에 관한 것이고, 여기서 의학적 상태는 바람직하게는 (i) 폐렴 및/또는 또는 (ii) 발열이다.

제2 측면에서, 본 발명은 코로나 바이러스 감염을 앓고 있는 대상체에서 염증 반응의 감소에 사용하기 위한 C5a 활성의 억제제에 관한 것이다.

제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 C5a 활성의 억제제로서, 여기서 코로나 바이러스는 SARS-CoV, MERS-CoV 및 SARS-CoV-2를 포함하는 그룹으로부터 선택되는, C5a 활성의 억제제.

코로나 바이러스는 인간을 감염시켜 전형적으로 상기도 감염(URI)을 유도하는 일반적인 바이러스의 일종이다. 7개의 상이한 유형의 인간 코로나 바이러스가 확인되었다. 대부분의 사람들은 일생 동안 적어도 한 가지 유형의 코로나 바이러스로 감염될 것이다. 바이러스는 기침과 재채기, 긴밀한 개인 접촉, 바이러스로 오염된 객체 또는 표면을 만지기, 및 드물게는 분변 오염에 의해 공기를 통해 확산된다. 대부분의 코로나 바이러스로 인한 질병은 일반적으로 단기간 동안 지속되며, 콧물, 인후통, 불쾌감, 기침 및 발열이 특징이다.

심각한 증상을 유발하는 것으로 보고된 인간 코로나 바이러스의 비제한적인 예는 MERS-CoV(중동 호흡기 증후군 또는 MERS를 유발하는 베타 코로나 바이러스), SARS-CoV(중증 급성 호흡기 증후군 또는 SARS를 일으키는 베타 코로나 바이러스), 및 중국 우한에서 시작된 새로운 2019년 신종 코로나 바이러스(2019-nCoV) 발병을 포함한다.

본 발명의 제1 내지 제3 측면의 바람직한 구현예에서, 대상체는 SARS, MERS 또는 COVID-19, 특히 COVID-19를 앓고 있다.

본 발명의 제1 내지 제3 측면의 바람직한 구현예에서, 치료는 다음 중 하나 이상을 초래한다:

- C-반응성 단백질의 감소;

- 발열 감소;

- 혈액에서 림프구 수의 증가;

- ALT/AST의 감소; 및/또는

- 산소 지수(PaO₂/FiO₂)의 증가.

C-반응성 단백질은 일반적으로 건강한 인간에서 0-5mg/L의 범위이다. 코로나 바이러스 감염(예: COVID-19) 환자는 약 50mg/L를 갖는다(참조: Chen et al. The Lancet 2020 oi.org/10.1016/S0140-6736). 따라서, C-반응성 단백질의 감소는 40mg/L 미만, 바람직하게는 30mg/L 미만, 보다 바람직하게는 10mg/L 미만, 보다 바람직하게는 5mg/L 미만으로 감소되는 경우에 달성된다.

혈액 중 림프구 수는 일반적으로 건강한 인간에서 1.1 내지 3.2 x 10⁹/L의 범위이다. 경증 코로나 바이러스 감염(예: COVID-19) 환자는 0.6 내지 1.2 x 10⁹/L의 범위에 있으며, 중앙값은 0.9 x 10⁹/L인 반면, 보다 중증(예: COVID-19) 감염은 0.5 내지 0.9 x 10⁹/L의 범위를 초래하며 중앙값은 0.8 x 10⁹/L이다(참조: Wang et al. JAMA doi:10.1001/jama.2020.1585). 따라서, 각각의 환자에서 림프구 수가 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 100%로 증가되는 경우, 혈액 중 림프구 수의 증가가 달성된다. 절대적 측면에서, 본 발명의 사용을 위한 C5a 억제제는 환자의 림프구 수를 적어도 1.0x10⁹/L, 더욱 바람직하게는 적어도 1.3x10⁹/L까지 증가시킨다.

알라닌 아미노 트랜스퍼라제(ALT)는 일반적으로 건강한 인간에서 9 내지 50U/L의 범위이다. 중증 코로나 바이러스 감염(예: COVID-19) 환자는 15 내지 36U/L의 범위이며 중앙값은 23U/L인 반면, 보다 심각한(예: COVID-19) 감염은 19 내지 57U/L의 범위를 초래하며 중앙값은 35U/L이다(참조: Wang et al. JAMA doi:10.1001/jama.2020.1585). 따라서, 각각의 환자의 ALT가 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 100% 감소하는 경우, ALT의 감소가 달성된다.

아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST)는 일반적으로 건강한 인간에서 15 내지 40U/L의 범위에 있다. 경증 코로나 바이러스 감염(예: COVID-19) 환자는 21 내지 38U/L의 범위이며 중앙값은 29U/L인 반면, 보다 심각한(예: COVID-19) 감염은 30 내지 70U/L의 범위를 초래하며 중앙값은 52U/L이다(참조: Wang et al. JAMA doi:10.1001/jama.2020.1585). 따라서, 각각의 환자의 AST가 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 100% 감소하는 경우, AST의 감소가 달성된다.

산소 지수 PaO₂/FiO₂는 건강한 환자에서 400 내지 500mmHg의 범위이다. 코로나 바이러스 감염(예: COVID-19) 환자는 103 내지 234mmHg의 범위이며 중앙값은 136mmHg이다. 따라서, 각각의 환자의 산소 지수 PaO₂/FiO₂가 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 100% 증가되는 경우, 산소 지수 PaO₂/FiO₂의 증가가 달성된다. 절대적 측면에서, 본 발명의 사용을 위한 C5a 억제제는 환자의 산소 지수 PaO₂/FiO₂를 적어도 250mmHg, 보다 바람직하게는 적어도 300mmHg로 증가시킨다.

본 발명의 임의의 측면의 일부 구현예에서, C5a 활성의 억제제는

- C5의 농도를 감소시키고(예를 들어, C3 전환 효소의 형성 및/또는 활성을 억제함으로써; C5 전환 효소의 형성 및/또는 활성을 억제함으로써; C5 유전자의 전사를 억제함으로써; C5 mRNA의 번역을 차단함으로써; C5 mRNA의 분해를 증가시킴으로써; C5 단백질의 분해를 증가시킴으로써; 또는 간으로부터 C5의 분비를 방지함으로써);

- C5의 C5a 및 C5b로의 절단을 억제하고(예를 들어, C5 전환 효소를 억제하거나 C5 상의 절단 부위에 결합하여 절단을 차단함으로써);

- C5a의 농도를 감소시키고(예를 들어, C5a 단백질의 분해를 증가시킴으로써);

- C5a와 C5a 수용체 사이의 결합을 억제하고(예를 들어, C5a에 결합하거나 C5a 수용체에 결합함으로써);

- C5a 수용체의 농도를 감소시키고(예를 들어, C5a 수용체 유전자의 전사를 억제함으로써; C5a 수용체 mRNA의 번역을 차단함으로써; C5a 수용체 mRNA의 분해를 증가시킴으로써; C5a 수용체 단백질의 분해를 증가시킴으로써); 및/또는

- C5a 수용체의 활성을 억제한다.

본 발명의 임의의 측면의 일부 구현예에서, C5a 활성의 억제제는 단백질 리간드(상기 정의된 바와 같음); 올리고뉴클레오티드; 및 소분자(상기 정의된 바와 같음)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. C5a 활성의 억제제로서 작용하는 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 핵산 분자에 결합함으로써(이로써 전사 및/또는 번역을 억제함), 또는 단백질에 결합함으로써(예를 들어, 올리고뉴클레오티드가 핵산 앱타머인 경우) 그들의 억제 효과를 달성할 수 있다.

본 발명의 임의의 측면의 일부 구현예에서, C5a 활성의 억제제는 C5 단백질, 또는 C5a 단백질, 또는 C5a 수용체 단백질에 특이적으로 결합하는 단백질 리간드이다. 추가 구현예에서, 단백질 리간드는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:

(i) 항체(예: 항-C5 항체, 항-C5a 항체, 항-C5aR 항체, 또는 항-C5L2 항체),

(ii) 항체의 항원 결합 단편,

(iii) 항체 유사 단백질,

(iv) C5a의 억제 변이체(inhibitory variant),

(v) C5a 수용체의 억제 변이체(예: 디코이 수용체),

(vi) 보체 경로에 작용하는 단백질(예: 코버신); 및

(vii) 펩티드(예: RA101495(Ra Pharma, Cambridge, MA); PMX-53(bio-techne GmbH (Wiesbaden-Nordenstadt, Germany)).

본 발명의 임의의 측면의 일부 구현예에서, C5a 활성의 억제제는 인간 C5a의 아미노산 서열 NDETCEQRA(서열번호 2) 및 SHKDMQL(서열번호 3)에 의해 형성된 구조적 에피토프에 특이적으로 결합하는 단백질 리간드 또는 올리고뉴클레오티드, 바람직하게는 단백질 리간드이다. 서열번호 2 및 3에 따른 아미노산 서열에 의해 형성된 형태에 결합하는 것은 단백질 리간드 또는 올리고뉴클레오티드가 서열번호 2에 따른 아미노산 서열 내의 적어도 하나의 아미노산에 결합하고, 서열번호 3에 따른 아미노산 서열 내의 적어도 하나의 아미노산에 결합한다는 것을 의미한다. 서열번호 2는 인간 C5a의 아미노산 30-38에 상응한다. 서열번호 3은 인간 C5a의 아미노산 66-72에 상응한다.

본 발명의 임의의 측면의 일부 구현예에서, 단백질 리간드 또는 올리고뉴클레오티드, 바람직하게는 단백질 리간드는 DETCEQR(서열번호 4)에 따른 아미노산 서열 내의 적어도 하나의 아미노산에 결합한다. 서열번호 4는 인간 C5a의 아미노산 31-37에 상응한다.

본 발명의 임의의 측면의 일부 구현예에서, 단백질 리간드 또는 올리고뉴클레오티드, 바람직하게는 단백질 리간드는 HKDMQ(서열번호 5)에 따른 아미노산 서열 내의 적어도 하나의 아미노산, 더욱 바람직하게는 아미노산 서열 KDM 내의 적어도 하나의 아미노산에 결합한다. 서열번호 5는 인간 C5a의 아미노산 67-71에 상응하고; 서열 KDM은 인간 C5a의 아미노산 68-70에 상응한다.

본 발명의 임의의 측면의 일부 구현예에서, 단백질 리간드 또는 올리고뉴클레오티드, 바람직하게는 단백질 리간드는 아미노산 서열 DETCEQR(서열번호 4) 내의 적어도 하나의 아미노산 및 아미노산 서열 HKDMQ(서열번호: 5) 내의 적어도 하나의 아미노산에 결합한다.

본 발명의 임의의 측면의 일부 구현예에서, 단백질 리간드 또는 올리고뉴클레오티드, 바람직하게는 단백질 리간드는 아미노산 서열 DETCEQR(서열번호 4) 내의 적어도 하나의 아미노산 및 아미노산 서열 KDM 내의 적어도 하나의 아미노산에 결합한다.

본 발명의 임의의 측면의 일부 구현예에서, C5a의 구조적 에피토프를 형성하는 2개의 서열(예: 서열번호 2 및 3; 서열번호 4 및 5; 또는 서열번호 4 및 서열 KDM에 따른 서열 쌍)은 본 발명의 결합 모이어티(binding moiety)에 대한 결합에 참여하지 않는 1 내지 50개의 연속 아미노산에 의해 분리된다. 이하에서, 본 발명의 결합 모이어티에 대한 결합에 참여하지 않는 이러한 아미노산은 "비결합 아미노산"으로 지칭될 것이다. 구조적 에피토프를 형성하는 2개의 서열은 바람직하게는 6 내지 45개의 연속 비결합 아미노산, 보다 바람직하게는 12 내지 40개의 연속 비결합 아미노산, 보다 바람직하게는 18 내지 35개의 연속 비결합 아미노산, 보다 바람직하게는 24 내지 30개의 연속 비결합 아미노산, 보다 바람직하게는 25 내지 29개의 연속 비결합 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 26 내지 28개의 연속 비결합 아미노산, 가장 바람직하게는 27개의 연속 비결합 아미노산에 의해 분리된다.

본 발명의 임의의 측면의 일부 구현예에서, C5a의 구조적 에피토프에 특이적으로 결합하는 단백질 리간드 또는 올리고뉴클레오티드, 바람직하게는 단백질 리간드는 10nM 이하, 바람직하게는 9nM 이하, 보다 바람직하게는 8nM 이하, 보다 바람직하게는 7nM 이하, 보다 바람직하게는 6nM 이하, 보다 바람직하게는 5nM 이하, 보다 바람직하게는 4nM 이하, 보다 바람직하게는 3nM 이하, 보다 바람직하게는 2nM 이하, 더욱 바람직하게는 1nM 이하의 K_d 값을 갖는 인간 C5a에 대한 결합 상수를 갖는다. 본 발명의 임의의 측면의 일부 구현예에서, 결합 모이어티와 인간 C5a 사이의 해리 상수 K_d는 1pM(피코몰) 내지 5nM(나노몰), 더욱 바람직하게는 2pM 내지 4nM, 더욱 바람직하게는 5pM 내지 3nM, 보다 바람직하게는 10pM 내지 2nM, 보다 바람직하게는 50pM 내지 1nM, 보다 바람직하게는 100pM 내지 900pM, 보다 바람직하게는 200pM 내지 800pM, 보다 바람직하게는 300pM 내지 700pM, 더욱 더 바람직하게는 400pM 내지 600pM이다.

본 발명의 임의의 측면의 일부 구현예에서, C5a에 특이적으로 결합하는 단백질 리간드 또는 올리고뉴클레오티드, 바람직하게는 단백질 리간드는 한 분자 C5a, 특히 인간 C5a에 의해 유도된 생물학적 효과에 대해 적어도 75%의 차단 활성, 바람직하게는 적어도 80%의 차단 활성, 더욱 바람직하게는 적어도 85%의 차단 활성, 보다 바람직하게는 적어도 90%의 차단 활성, 보다 바람직하게는 적어도 95%의 차단 활성을 나타낸다. 이들 특정 차단 활성은 결합 모이어티가 C5a, 바람직하게는 인간 C5a에 결합하는 단일 파라토프를 포함하는 이들 구현예를 지칭한다. 결합 모이어티가 2개 이상의 C5a-특이적 파라토프를 포함하는 구현예에서, 하나의 결합 모이어티 분자가 결합 모이어티에 존재하는 C5a-특이적 파라토프의 수와 동일한 C5a 분자의 수와 접촉될 때 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85% 등의 상기 차단 활성이 달성된다. 즉, 본원에 기재된 결합 모이어티의 파라토프 및 C5a가 등몰 농도로 존재하는 경우, 결합 모이어티는 C5a에 의해 유도된 생물학적 활성에 대해 적어도 75%의 차단 활성, 바람직하게는 적어도 80%의 차단 활성, 보다 바람직하게는 적어도 85%의 차단 활성, 더욱 바람직하게는 적어도 90%의 차단 활성, 보다 바람직하게는 적어도 95%의 차단 활성을 나타낸다. 차단되는 바람직한 생물학적 효과는 인간 전혈 세포로부터의 C5a-유도 리소자임 방출이다. 이러한 C5a-유도 리소자임 방출 및 이의 차단을 결정하기 위한 검정은, 예를 들어, WO 2011/063980 A1 및 상응하는 미국 국내 단계 출원 US 2012/0231008 A1에 기재되어 있다.

본 발명의 임의의 측면의 일부 구현예에서, 단백질 리간드는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 여기서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은

(i) 서열번호 6에 제시된 중쇄 CDR3 서열; 또는

(ii) 서열번호 7에 제시된 중쇄 CDR3 서열을 포함하며;

여기서, 상기 중쇄 CDR3 서열은 임의로 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실, 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 포함한다.

(iii) 서열번호 8에 제시된 경쇄 CDR3 서열; 또는

(iv) 서열번호 9에 제시된 경쇄 CDR3 서열을 포함하고;

여기서, 상기 경쇄 CDR3 서열은 임의로 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실, 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 포함한다.

(i) 서열번호 6에 제시된 중쇄 CDR3 서열 및 서열번호 8에 제시된 경쇄 CDR3 서열; 또는

(ii) 서열번호 7에 제시된 중쇄 CDR3 서열 및 서열번호 9에 제시된 경쇄 CDR3 서열을 포함하며;

여기서, 상기 중쇄 CDR3 서열은 임의로 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실, 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 포함하고;

상기 경쇄 CDR3 서열은 임의로 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실, 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 포함한다.

본 발명의 임의의 측면의 일부 구현예에서, 단백질 리간드는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 여기서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기 서열:

(v) 서열번호 10에 따른 중쇄 CDR2 서열;

(vi) 서열번호 11에 따른 중쇄 CDR2 서열;

(vii) 서열번호 12에 따른 경쇄 CDR2 서열;

(viii) 서열번호 13에 따른 경쇄 CDR2 서열;

(ix) 서열번호 14에 따른 중쇄 CDR1 서열;

(x) 서열번호 15에 따른 중쇄 CDR1 서열;

(xi) 서열번호 16에 따른 경쇄 CDR1 서열; 또는

(xii) 서열번호 17에 따른 경쇄 CDR1 서열 중 적어도 하나를 포함하고;

여기서, 상기 중쇄 CDR2 서열은 임의로 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실, 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 포함하고;

상기 경쇄 CDR2 서열은 임의로 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실, 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 포함하고;

상기 중쇄 CDR1 서열은 임의로 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실, 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 포함하고;

상기 경쇄 CDR1 서열은 임의로 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실, 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 포함한다.

특정 구현예에서, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 및 서열번호 17에 따른 아미노산 서열 중 각각 하나에서 상기 인용된 이들 임의의 변화의 총 수, 즉 각 서열에서 교환, 결실 및 부가의 총 수는 1 또는 2이다.

특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 존재하는 모든 CDR에 대해 가산된 교환, 결실 및 부가의 총 수는 1 내지 5(예: 1, 2, 3, 4, 또는 5)이다.

본 발명의 임의의 측면의 일부 구현예에서, 단백질 리간드는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 표 1에 하기 열거된 중쇄 CDR3, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR1 서열의 세트 A 내지 H 중 하나를 포함하고,

여기서, 각각의 중쇄 CDR3 서열은 임의로 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실, 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 포함하고;

각각의 중쇄 CDR2 서열은 임의로 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실, 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 포함하고;

각각의 중쇄 CDR1 서열은 임의로 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실, 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 포함한다:

[표 1]

본 발명의 임의의 측면의 일부 구현예에서, 단백질 리간드는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 표 2에 나열된 경쇄 CDR3, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR1 서열의 다음 세트 I 내지 IV 중 하나를 포함하고,

여기서, 각각의 경쇄 CDR3 서열은 임의로 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실, 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 포함하고;

각각의 경쇄 CDR2 서열은 임의로 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실, 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 포함하고;

각각의 경쇄 CDR1 서열은 임의로 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실, 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 포함한다.

[표 2]

항체 IFX-1의 CDR2 경쇄 서열(서열번호 12)은 항체 INab708의 CDR2 경쇄 서열(서열번호 13)과 동일하기 때문에, 서열번호 13을 포함하는 세트는 서열번호 12를 포함하는 세트에 중복될 것이다. 따라서, 표에는 경쇄 CDR 서열의 네 세트만이 나열되어 있다.

본 발명의 임의의 측면의 일부 구현예에서, 단백질 리간드는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 표 1에 상기 나열된 중쇄 CDR 세트 A 내지 H 중 하나 및 표 2에 상기 나열된 경쇄 CDR 세트 I 내지 IV 중 하나, 즉 다음 세트의 조합: A-I, A-II, A-III, A-IV, B-I, B-II, B-III, B-IV, C-I, C-II, C-III, C-IV, D-I, D-II, D-III, D-IV, E-I, E-II, E-III, E-IV, F-I, F-II, F-III, F-IV, G-I, G-II, G-III, G-IV, H-I, H-II, H-III 또는 H-IV(조합 A-I 및 H-IV가 특히 바람직하다) 중 하나를 포함하고,

각각의 중쇄 CDR1 서열은 임의로 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실, 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 포함하고;

각각의 경쇄 CDR3 서열은 임의로 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 특히 보존적 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실, 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 포함하고;

각각의 경쇄 CDR2 서열은 임의로 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실, 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 포함하고,

본 발명의 임의의 측면의 일부 구현예에서, 단백질 리간드는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, (i) IFX-1의 VH 도메인 또는 (ii) INab708의 VH 도메인을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 이들로 이루어지는 VH 도메인을 포함한다.

IFX-1 및 INab708의 VH 도메인을 정의하는 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 서열은 하기 표 3에 제시되어 있다.

본 발명의 임의의 측면의 일부 구현예에서, 단백질 리간드는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, (i) IFX-1의 VL 도메인 또는 (ii) INab708의 VL 도메인을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 이들로 이루어지는 VL 도메인을 포함한다.

IFX-1 및 INab708의 VL 도메인을 정의하는 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 서열은 아래 표 3에 제시되어 있다.

[표 3]

일부 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다:

(i) 서열번호 34에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 및 서열번호 35에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 서열, 또는 경쇄 및 중쇄 CDR1 내지 CDR3의 서열번호 6, 8, 10, 12, 14 및 16에 따른 아미노산 서열 또는 상기 명시된 바와 같은 이의 변이체를 포함하는 서열번호 34 및 35와 적어도 90%, 적어도 93%, 또는 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 변이체;

(ii) 서열번호 36의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 서열 및 서열번호 37의 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 서열, 또는 경쇄 및 중쇄 CDR1 내지 CDR3의 서열번호 7, 9, 11, 13, 15 및 17에 따른 아미노산 서열 또는 상기 명시된 바와 같은 이의 변이체를 포함하는 서열번호 36 및 37과 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 변이체.

상기 측면에서, CDR은 상기 요약된 바와 같이 변이가 없거나 최소한의 변이, 즉 1, 2 또는 3개의 아미노산을 가지며, 대부분의 아미노산 변형은 프레임워크 영역에 있다.

본 발명의 임의의 측면의 일부 구현예에서, C5a 활성의 억제제는 C5에, 또는 C5a에, 또는 C5a 수용체에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드이다. 추가 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 핵산 앱타머이다. 핵산 앱타머는 DNA-앱타머, D-RNA 앱타머 및 L-RNA 앱타머(예: Spiegelmers™)로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 임의의 측면의 일부 구현예에서, C5a 활성의 억제제는 C5 단백질 또는 C5a 수용체 단백질의 발현을 감소시킨다. 추가 구현예에서, C5 단백질 또는 C5a 수용체 단백질의 발현을 감소시키는 상기 C5a 활성의 억제제는 안티센스 DNA, 안티센스 RNA, siRNA 및 miRNA로 이루어진 그룹으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드이다.

본 발명의 임의의 측면의 일부 구현예에서, C5a 수용체는 C5aR 및/또는 C5L2이다. 본 발명의 임의의 측면의 바람직한 구현예에서, C5a 수용체는 C5aR(CD88 또는 C5aR1로도 공지됨)이다.

본 발명의 임의의 측면의 일부 구현예에서, C5a 활성의 억제제는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:

(a) IFX-1, INab708, MEDI-7814, ALXN-1007, 또는 NOX-D21, 또는 이의 항원 결합 단편;

(b) 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 C5a에 대한 결합에 대해 (a)하에 나타낸 항체 중 하나와 경쟁하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편;

(c) 에쿨리주맙, ALXN1210, ALXN5500, 또는 LFG316, 또는 이의 항원 결합 단편;

(d) 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 C5에 대한 결합에 대해 (c)하에 나타낸 항체 중 하나와 경쟁하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편;

(e) 코버신(Coversin) 또는 RA101495;

(f) 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 단백질 또는 매크로사이클릭 펩티드(macrocyclic peptide)로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 매크로사이클릭 펩티드가 C5에 대한 결합에 대해 (e)하에 나타낸 단백질 또는 펩티드 중 하나와 경쟁하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 단백질 또는 매크로사이클릭 펩티드;

(g) 지무라;

(h) 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 앱타머로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 앱타머가 C5에 대한 결합에 대해 지무라와 경쟁하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 앱타머;

(i) AMY-201 또는 미로코셉트;

(j) 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 단백질로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 단백질이 C3b에 대한 결합에 대해 (i)하에 나타낸 단백질 중 하나와 경쟁하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 단백질;

(k) 비카시오맙;

(l) 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 인자 B에 대한 결합에 대해 비카시오맙과 경쟁하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편;

(m) 람팔리주맙;

(n) 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 인자 D에 대한 결합에 대해 람팔리주맙과 경쟁하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편;

(o) ALN-CC5;

(p) 아바코판 또는 화학식 II 또는 III에 따른 화합물 또는 PMX-53 또는 화학식 IV에 따른 화합물;

(q) 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 C5aR에 대한 결합에 대해 아바코판 또는 PMX-53과 경쟁하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편;

(r) 클론 S5/1 또는 클론 7H110, 또는 이의 항원 결합 단편; 및

(s) 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 C5aR에 대한 결합에 대해 (r)하에 나타낸 항체 중 하나와 경쟁하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.

약제학적 조성물 및 투여 방식

본 발명의 임의의 측면의 실시에서, 화합물(예: 본원에 기재된 C5a 활성의 억제제) 또는 화합물을 포함하는 약제학적 조성물은 충분한 수준의 화합물을 환자에게 제공하는 당업계에서 확립된 임의의 경로에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 그것은 전신 또는 국소 투여될 수 있다. 이러한 투여는 비경구, 경점막, 예를 들어, 경구, 비강, 직장, 질내, 설하, 점막하, 경피, 또는 흡입에 의해 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 투여는 비경구, 예를 들어, 정맥내 또는 복강내 주사를 통해서이고, 또한 동맥내, 근육내, 피내 및 피하 투여를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에 기재된 화합물(예: 본원에 기재된 C5a 활성의 억제제) 또는 상기 화합물을 포함하는 약제학적 조성물이 국소 투여되는 경우, 그것은 치료될 기관 또는 조직에 직접 주사될 수 있다.

경구 투여에 적합한 약제학적 조성물은 캡슐 또는 정제로서; 분말 또는 과립으로서; 용액, 시럽 또는 현탁액(수성 또는 비수성 액체 중)으로서; 식용 발포체 또는 휘핑으로서; 또는 에멀젼으로서 제공될 수 있다. 정제 또는 경질 젤라틴 캡슐은 락토스, 전분 또는 이의 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘, 스테아르산 또는 이들의 염을 포함할 수 있다. 연질 젤라틴 캡슐은 식물성 오일, 왁스, 지방, 반고체, 또는 액체 폴리올 등을 포함할 수 있다. 용액 및 시럽은 물, 폴리올 및 당을 포함할 수 있다.

경구 투여용으로 의도된 활성제는 위장관에서 활성제의 붕해 및/또는 흡수를 지연시키는 물질로 코팅되거나 이와 혼합될 수 있다(예를 들어, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트가 사용될 수 있다). 따라서, 활성제의 지속 방출은 수 시간에 걸쳐 달성될 수 있고, 필요에 따라, 활성제는 위 내에서 분해되는 것으로부터 보호될 수 있다. 경구 투여용 약제학적 조성물은 특정 pH 또는 효소 조건으로 인해 특정 위장 위치에서 활성제의 방출을 촉진하도록 제형화될 수 있다.

경피 투여에 적합한 약제학적 조성물은 수용자의 표피와 장시간 친밀한 접촉을 유지하도록 의도된 별개의 패치로서 제공될 수 있다. 국소 투여에 적합한 약제학적 조성물은 연고, 크림, 현탁액, 로션, 분말, 용액, 페이스트, 겔, 스프레이, 에어로졸 또는 오일로서 제공될 수 있다. 피부, 입, 눈 또는 다른 외부 조직에 국소 투여하기 위해, 국소 연고 또는 크림이 바람직하게 사용된다. 연고로 제형화되는 경우, 활성 성분은 파라핀계 또는 수혼화성 연고 기제와 함께 사용될 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 수중유 기제 또는 유중수 기제를 갖는 크림으로 제형화될 수 있다. 눈에 국소 투여하기에 적합한 약제학적 조성물은 점안제를 포함한다. 이들 조성물에서, 활성 성분은 적합한 담체, 예를 들어, 수성 용매에 용해되거나 현탁될 수 있다. 구강내 국소 투여에 적합한 약제학적 조성물은 로젠지, 정제 및 구강 세척제를 포함한다.

비강 투여에 적합한 약제학적 조성물은 고체 담체, 예를 들어, 분말(바람직하게는 20 내지 500미크론 범위의 입자 크기를 가짐)을 포함할 수 있다. 분말은 코 근처에 보유된 분말의 용기로부터 코를 통해 빠르게 흡입함으로써 코담배를 취하는 방식으로 투여될 수 있다. 대안적으로, 비강 투여용으로 채택된 조성물은 액체 담체, 예를 들어, 비강 스프레이 또는 점비제를 포함할 수 있다. 이들 조성물은 활성 성분의 수성 또는 오일 용액을 포함할 수 있다. 흡입 투여용 조성물은 활성 성분의 소정의 용량을 제공하도록 작제될 수 있는 가압된 에어로졸, 분무기 또는 취입기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 특별히 적합한 장치로 공급될 수 있다. 약제학적 조성물은 또한 비강을 통해 폐에 투여될 수 있다.

직장 투여에 적합한 약제학적 조성물은 좌제 또는 관장제로서 제공될 수 있다. 질 투여에 적합한 약제학적 조성물은 페서리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 폼 또는 스프레이 제형으로서 제공될 수 있다.

비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물은 조성물을 의도된 수령인의 혈액과 실질적으로 등장성으로 만드는 항산화제, 완충제, 정균제 및 용질을 함유할 수 있는, 수성 및 비수성 멸균 주사 가능한 용액 또는 현탁액을 포함한다. 이러한 조성물에 존재할 수 있는 다른 성분은, 예를 들어, 물, 알코올, 폴리올, 글리세린 및 식물성 오일을 포함한다. 비경구 투여에 적합한 조성물은 단위 투여량 또는 다중 투여량 용기, 예를 들어, 밀봉된 앰플 및 바이알로 제공될 수 있고, 사용 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들어, 주입용 멸균 식염수 용액의 첨가만을 필요로 하는 동결 건조(동결건조) 상태로 저장될 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 화합물(예: 본원에 기재된 C5a 활성의 억제제)은 인간에게 정맥내 투여하기에 적합한 약제학적 조성물로서 통상적인 절차에 따라 제형화된다. 전형적으로, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 가용화제 및 주사 부위에서의 통증을 완화시키기 위한 리도카인과 같은 국소 마취제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은 개별적으로 또는 함께 단위 투여 형태로, 예를 들어, 활성제의 양을 나타내는 앰플 또는 사셰와 같은 밀폐 용기 내의 무수 동결건조 분말 또는 물 부재 농축물로서 공급된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 이는 멸균 약제 등급 물 또는 식염수를 함유하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 투여 전에 성분이 혼합될 수 있도록 멸균 식염수의 앰플이 제공될 수 있다.

또 다른 구현예에서, 예를 들어, 화합물(예: 본원에 기재된 C5a 활성의 억제제) 또는 상기 화합물을 포함하는 약제학적 조성물은 제어 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 예를 들어, 화합물은 정맥내 주입, 이식 가능한 삼투압 펌프, 경피 패치, 리포좀, 또는 다른 투여 방식을 사용하여 투여될 수 있다. 한 구현예에서, 펌프가 사용될 수 있다(참조: Sefton (1987) CRC Crit . Ref. Biomed . Eng. 14: 201; Buchwald et al. (1980) Surgery 88:507; Saudek et al. (1989) N. Eng . J. Med. 321: 574). 또 다른 구현예에서, 화합물은 소포, 특히 리포솜으로 전달될 수 있다(참조: Langer (1990) Science 249:1527-1533; Treat et al. (1989) in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, N.Y., 353-365; WO 91/04014; U.S. 4,704,355). 또 다른 구현예에서, 중합체 물질이 사용될 수 있다(참조: Medical Applications of Controlled Release (1974) Langer and Wise (eds.), CRC Press: Boca Raton, Fla.; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, (1984) Smolen and Ball (eds.), Wiley: N.Y.; Ranger and Peppas (1953) J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61; see also Levy et al. (1985) Science 228:190; During et al. (1989) Ann. Neurol . 25: 351; Howard et al. (1989) J. Neurosurg. 71: 105).

또 다른 구현예에서, 제어 방출 시스템은 치료 표적, 즉 표적 세포, 조직, 또는 장기 근처에 위치할 수 있고, 따라서 전신 투여량의 분획만을 필요로 한다(참조: 예를 들어, Goodson (1984) 115-138 in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2). 다른 제어 방출 시스템은 문헌[참조: Langer (1990, Science 249: 1527-1533)]의 검토에서 논의되어 있다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 화합물(예: 본원에 기재된 C5a 활성의 억제제) 또는 상기 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 치료가 필요한 영역에 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 이것은, 예를 들어, 그리고 제한 없이, 수술 중 국소 주입, 예를 들어, 수술 후 상처 드레싱과 조합된 국소 적용, 주사, 카테터, 좌약 또는 임플란트에 의해 달성될 수 있으며, 상기 임플란트는 멤브레인, 예를 들어, 실라스틱 멤브레인 또는 섬유를 포함하는 다공성, 비다공성, 또는 젤라틴형 물질이다.

바람직한 유효 투여량의 선택은 당업자에게 공지되어 있을 몇 가지 인자를 고려하여 당업자에 의해 결정될 것이다. 이러한 인자는 약제학적 조성물의 특정 형태, 예를 들어, 폴리펩티드 또는 벡터, 및 그의 약동학적 파라미터, 예를 들어, 생체이용률, 대사, 반감기 등을 포함하고, 이는 약제학적 화합물의 규제 승인을 획득하는데 전형적으로 사용되는 통상적인 개발 절차 동안 확립되었을 것이다. 투여량을 고려함에 있어서 추가의 인자는 정상적인 개체에서 예방 및/또는 치료되는 상태 또는 질환, 또는 달성되어야 하는 이점, 환자의 체질량, 투여 경로, 투여가 급성 또는 만성인지 여부, 병용 약물, 및 투여된 약제학적 제제의 효능에 영향을 미치는 것으로 익히 공지된 다른 요인을 포함한다. 따라서, 정확한 용량은 표준 임상 기술에 따라, 예를 들어, 개별 환자의 상태 및 면역 상태에 따라 의사의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다.

본 발명의 C5a 활성의 억제제, 특히 IFX-1의 바람직한 용량은 1일당 200mg 내지 500mg, 바람직하게는 1일당 250mg 내지 350mg, 보다 바람직하게는 1일당 300mg의 용량이다. 용량은 바람직하게는 1일 1회, 보다 바람직하게는 C5a 활성의 억제제, 특히 IFX-1을 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 9일, 11일 및 13일째에 투여하는 투여 섭생으로 적용된다.

바람직하게는, C5a 활성의 억제제, 특히 IFX-1은 비경구 적용, 보다 바람직하게는 정맥내 투여에 의해 투여된다.

도 1. SARS- CoV , MERS - CoV 및 SARS- CoV 2의 뉴클레오캡시드 단백질은 MASP -2에 결합한다.
(A) GFP-N 및 GFP-벡터로 형질감염된 293T 세포로부터의 용해물을 2mM CaCl₂ 또는 1mM EDTA의 존재하에 아가로스 비드에 접합된 Flag-태깅된 전장(FL) MASP-2 또는 절단된 돌연변이체(CUB1-EGF-CUB2 및 CCP1-CCP2-SP)로 면역침전에 적용하였다. 면역블롯팅은 항-GFP 및 항-Flag 항체를 사용하여 수행되었다. 배양된 IgG 비드 및 Flag 비드를 음성 대조군으로 사용하였다. (B) Flag-N 또는 Flag-벡터로 형질감염된 293T 세포로부터의 용해물을 인간 혈청(HS) 및 마우스 혈청(MS)과 혼합하고, 항-Flag 아가로스 비드로 면역침전에 적용하였다. 흡착물은 항-Flag 및 항-MASP-2 항체로 프로빙하였다. 정제된 재조합 MASP-2를 마커로 로딩했다. (C) 전장 GFP-N 및 그의 돌연변이체 Δ321-323 및 Δ116-124로 형질감염된 293T 세포로부터의 용해물을 2mM CaCl₂의 존재하에 MASP-2-Flag 접합 아가로스 비드로 면역침전에 적용시키고, 항-GFP 및 항-Flag 항체를 사용하여 면역블롯팅으로 분석했다. (D) GFP-MERS-CoV N 및 그의 절단된 돌연변이체 Δ104-112를 발현하는 293T 세포로부터의 용해물을 2mM CaCl₂의 존재하에 MASP-2-Flag 접합 아가로스 비드를 사용하여 면역침전에 적용하고, 상기 언급된 바와 같이 분석했다. (E) SARS-CoV-2의 HA-태깅된 N을 발현하는 293T 세포로부터의 용해물을 2mM CaCl₂의 존재하에 MASP-2-Flag 접합 아가로스 비드를 사용하여 면역침전에 적용하고, 흡착물을 항-HA 및 항-Flag 항체로 프로빙하였다.
도 2. 뉴클레오캡시드 단백질은 MASP -2 자동-활성화 및 C4 절단을 유도한다.
(A) MASP-2-Myc를 발현하는 세포로부터의 용해물을 정제된 N 또는 MBL과 혼합하고, 2mM CaCl₂의 존재하에 MASP-2-Flag 접합 아가로스 비드로 면역침전에 적용하였다. 항-Myc 항체를 사용하여 면역블롯팅을 수행하였다. (B) 정제된 MASP-2-Flag를 N, MBL 및 만난의 존재/부재하에 37℃에서 12시간 동안 배양하였다. 절단된 MASP-2는 항-Flag 항체로 프로빙하였다. (C) 항-N 모노클로날 항체의 존재/부재하에 정제된 MASP-2 및 N 단백질을 4℃에서 만난 코팅된 플레이트에서 미리 접합된 MBL과 함께 배양하였다. MASP-2의 결합은 항-MASP-2 항체로 검출되었다. *P < 0.05 및 **P < 0.01 vs. 쌍을 이루지 않은 양측 스튜던트의 t-테스트에 의한 HSA. (D) C4를 MASP-2, MBL, 만난, N 단백질 및 HSA와 함께 37℃에서 1시간, 6시간, 12시간 및 24시간 동안 배양하였다. 항-C4α 쇄 항체를 사용하여 C4 및 절단 및 절단된 C4 단편을 검출하였다. (E) C4를 MASP-2, MBL, 만난, N 단백질, C1INH 또는 MASP-2 모노클로날 항체와 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. C4 및 절단된 C4는 C4α-쇄 항체로 검출되었다. (F-H) SARS-CoV, HCoV-229E, SARS-CoV-2 및 MERS-CoV의 N 단백질의 농도와 관련된 C4b 침착.
도 3. N 단백질은 생체내에서 LPS 유발 폐렴을 강화시킨다
(A) BALB/c 마우스(10마리/그룹)는 꼬리 정맥을 통해 1 × 10⁹ PFU Ad-SARS N/Ad-null 또는 식염수 대조군으로 감염시키고, LPS(5mg/kg)를 6일째에 꼬리 정맥을 통해 투여했다. LPS 주사 30분 전에 항-MASP-2 항체(200㎍/kg) 또는 C1INH(4mg/kg)를 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 마우스의 사망률은 게한-브레슬로우-윌콕슨(Gehan-Breslow-Wilcoxon) 테스트에 의해 *P<0.05 및 **P<0.01로 주시되었다. 폐 파라핀 절편은 HE 염색(B)에 의해 분석되었다. 마우스는 꼬리 정맥을 통해 1 x 10⁸ PFU Ad-SARS N/Ad-null로 감염시키고, LPS(5mg/kg)는 6일째에 꼬리 정맥을 통해 비강 점적으로 제공되었다. LPS 도전 6시간 후에 마우스를 희생시켰다. 동결된 폐 절편을 항-C4b 항체(C)로 염색하였다. 동결된 폐 절편에서 SARS-CoV N 및 MASP-2 복합체 형성은 적색 신호로 나타낸 바와 같이 원위치 PLA에 의해 측정되었다. 침착된 C3 단편은 FITC 표지된 항-C3c 항체(녹색), 스케일 바 = 50㎛(D)로 염색되었다. (E) 마우스를 1 x 10⁹ PFU Ad-MERS N/Ad-null로 미리 감염시키고, 상기 언급된 바와 같이 LPS, 항체 또는 C1INH로 처리하고, 생존 마우스를 관찰하였다. (F) Masp2^-/- 및 Masp2^+/+ C57BL/6N 마우스를 N-발현 아데노바이러스로 감염시키고, 상기 언급된 바와 같이 LPS를 주사하고 생존 마우스를 관찰하였다.
도 4. COVID -19 환자에서 보체 활성화
(A-E) 사후 부검으로부터 파라포름알데히드-고정 폐 조직은 파라핀 조직 절편 및 항-MBL, 항-MASP-2, 항-C4α 쇄, 항 C3 또는 C5b-9를 사용하는 면역조직화학적 염색에 사용되었다. 현미경 촬영은 10배 대물렌즈하에 올림푸스 BX52 현미경으로 수행되었다. (F) 건강한 사람, 경증 또는 중증 COVID-19 환자의 혈청 C5a를 ELISA로 분석했다.
도 5. 항- C5a 항체에 의한 COVID -19 환자의 치료
(A) 2명의 환자의 질병 발병 타임라인, SARS-CoV-2 RNA 검출, 및 입원. (B) 환자 #1(왼쪽)과 환자 #2(오른쪽)에서 유동률, 고유량 비강 산소의 흡기 분율(FiO₂), 경피적 산소 포화도(SpO₂) 및 산소화 지수(PaO₂/FiO₂) 또는 SpO₂/FiO₂. (C) 환자 #1(왼쪽) 및 환자 #2에서 체온(TEMP), C 반응성 단백질(CRP) 수준 및 혈액 림프구 수(LYM) 변화. (D) 환자 #1(왼쪽)과 환자 #2(오른쪽)에서 간 기능 변화. ALT: 알라닌 아미노트랜스퍼라제 AST: 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제; TP: 총 단백질. ALB: 알부민.
도 6. SARS/ MERS - CoV 또는 SARS- CoV -2의 N 단백질에 의해 과활성화된 MBL 경로의 개략적 표현
(A) 바이러스는 세포 표면에 결합하고 S 단백질은 MBL을 활성화한다. (B) 바이러스는 세포에 침입하여 N 단백질을 포함하는 바이러스 단백질을 발현한다. (C) N 단백질은 바이러스 복제와 면역계 공격으로 세포 용해 후 방출된다. (D) 세포외 가용성 N 단백질 이량체는 MASP-2와 상호작용하고, MASP-2 자동 활성화와 MBL에 대한 결합을 유도한다. (E) MASP-2의 가속화된 활성화는 MBL 경로의 하류의 보체 캐스케이드 과다 활성화를 유도하고, 분비 또는 보체 매개 세포독성에 의한 세포 용해 및 N 단백질 방출을 촉진하며, 이는 조절되지 않은 조직 손상 및 염증을 초래할 수 있다.
도 7. MASP -2와의 상호작용에 관여하는 N 단백질의 중요한 모티프의 식별.
(A) MASP-2 및 SARS-CoV N 단백질의 도메인 및 돌연변이체. (B) 전장 GFP-N(1-422) 및 그의 절단된 돌연변이체 1-176, 176-251, 252-361 및 362-422로 형질감염된 293T 세포로부터의 용해물을 2mM CaCl₂의 존재하에 MASP-2-Flag 접합 아가로스 비드로 면역침전에 적용하고, 항-GFP 및 항-Flag 항체를 사용한 면역블롯팅으로 분석하였다. Flag-벡터(pCDNA3-Flag)로 형질감염된 세포로부터의 용해물과 함께 배양된 Flag 비드를 음성 대조군으로서 사용했다. (C) N 단백질 이량체화의 면역침전 분석. Flag 태깅된 SARS-CoV N, HCoV-229E N 또는 SARS-CoV N의 돌연변이체(Δ281-322, Δ321-323)를 발현하는 293T 세포로부터의 용해물을 항-Flag 아가로스 비드와 함께 배양하고, N-접합된 아가로스 비드를 균형 있게 하고, 상응하는 GFP-태깅된 N 단백질을 발현하는 293T 세포로부터의 용해물로 면역침전에 적용하고, 항-GFP를 이용한 면역블롯팅으로 분석하였다. (D) SARS-CoV N, MERS-CoV N, HKU5-CoV N, SARS-CoV-2 N, Bat-SARS 유사-CoV N 서열의 비교. 2차 구조 요소는 ESPript 알고리즘을 기반으로 정의된다. 선은 코일을 나타내고, 화살표는 β 가닥을 나타낸다.
도 8.
SARS-CoV 및 MERS-CoV의 N 단백질은 보체 렉틴 경로 캐스케이드를 가속화한다. (A) 도 2D에 언급된 C4 절단 비율은 밀도 측정 분석 및 플롯팅 후 식 절단된 C4/(절단된 C4 + 잔류하는 C4) x 100%로부터 계산되었다. 데이터는 3개 테스트의 평균±S.D.로 제시된다. 쌍을 이루지 않은 양측 스튜던츠 t-테스트에 의한 *P<0.05 및 **P<0.01. (B) 도 2E에서 언급된 C4 절단 비율의 밀도 측정 분석. (C) C4를 MASP-2, MBL, 만난, MERS-CoV N 단백질 또는 돌연변이체 N 단백질과 37℃에서 1시간 또는 2시간 동안 배양했다. C4 및 절단된 C4 단편을 항-C4α 쇄 항체로 측정하였다. (D) N 단백질 농도와 관련하여 Ca-Mg(LP+AP) 또는 Mg-EGTA 완충액(AP 전용)에서 희석된 C1q 고갈 혈청에서 활성화된 C3 침착. (E) N 단백질 농도와 관련하여 활성화된 C3 침착. (F) N 단백질 농도와 관련하여 C5b-9 침착. (G) SARS-CoV 뉴클레오캡시드 단백질의 존재 또는 부재하에 혈청 중 마우스 대식세포의 옵소닌식세포작용 테스트. HSA는 음성 대조군으로서 사용되었다. 포인트는 두 반복 실험으로부터의 평균 값을 나타낸다. 오차 막대, 평균±S.D. 쌍을 이루지 않은 양측 스튜던츠 t-테스트에 의한 *P<0.05 및 **P<0.01.
도 9.
SARS-CoV 뉴클레오캡시드 단백질은 생체내 보체 렉틴 경로 캐스케이드를 가속화한다. (A) 마우스를 꼬리 정맥을 통해 1x10⁸ PFU Ad-N/Ad-null로 3회(1, 2, 3일째) 감염시키고, LPS(5mg/kg)는 6일째에 꼬리 정맥를 통해 비강 점적으로 제공하였다. LPS 도전 6시간 후에 마우스를 희생시켰다. 동결된 폐 절편에서 SARS-CoV N 및 MASP-2 복합체 형성은 적색 신호로 나타낸 바와 같이 염소 항-MASP-2 항체, 마우스 항-N 항체 및 상응하는 2차 시약을 사용하여 원위치 PLA에 의해 측정 되었다. 침착된 C3c 단편은 FITC 표지된 항-C3c 항체(녹색)로 염색되었다. 핵(파란색)은 DAPI로 대조염색되었다. LPS+Ad-null은 도 3D에 도시된 LPS+Ad-N의 음성 대조군 마우스였다. (B) 마우스 Masp2 유전자 녹아웃의 다이아그램. CRISPR/Cas 매개된 게놈 조작에 의한 Masp2 녹아웃 마우스 모델(C57BL/6N)을 생성하기 위해, 마우스 Masp2 유전자의 엑손 9 내지 엑손 11이 표적 부위로서 선택되었다.
도 10
두 환자의 흉부 컴퓨터 단층 촬영. 가장 심각한 평면이 표시되었다. 환자 #1의 CT 스캔은 중증 폐렴이 항-C5a 투여 6일 전과 비교하여 상이한 폐 영역에서 발생했음을 보여주었다.

실시예

요약:

과도한 면역 반응은 SARS-CoV, MERS-CoV 및 SARS-CoV-2의 병인 및 치사율에 기여하지만, 메커니즘은 불분명하다. 이 연구에서 SARS-CoV, MERS-CoV 및 SARS-CoV-2의 N 단백질은 보체 활성화의 렉틴 경로에서 중요한 세린 프로테아제인 MASP-2에 결합하여 구성적 보체 활성화 및 염증성 폐 손상의 악화를 초래하는 것으로 밝혀졌다. N 단백질-MASP-2 상호작용을 차단하거나 보체 활성화를 억제함으로써 시험관내 및 생체내에서 N 단백질 유도 보체 과활성화 및 폐 손상을 상당히 완화시킬 수 있다. COVID-19 환자에서도 보체 과활성화가 관찰되었고, 악화된 환자를 항-C5a 모노클로날 항체로 치료하면 유망한 억제 효과가 관찰되었다. 보체 억제는 이러한 고병원성 베타 코로나 바이러스에 의해 유발된 폐렴에 대한 일반적인 치료 접근법을 나타낼 수 있다. 보체 활성화의 렉틴 경로는 고병원성 코로나 바이러스 유발 폐렴의 치료의 표적이다.

도입

2002년 11월에 중국 광동성에서 최초로 보고된 중증 급성 호흡기 증후군(SARS)은 전염성이 높고 치명적인 호흡기 질환이다(1, 2). 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스(SARS-CoV)는 이 질환의 새로운 병인체로 식별되었다. SARS 발병 거의 10년 후, 새로운 동물 유행성 코로나 바이러스인 중동 호흡기 증후군 코로나 바이러스(MERS-CoV)가 중동 호흡기 증후군의 병인체로 식별되었다(3). 최근에, 새로운 코로나 바이러스인 SARS-CoV-2가 중국 우한에서 최초로 발견되어 중국의 다른 지역과 전세계로 급속히 확산되었다. 2020년 3월 18일 현재 SARS-CoV-2는 180,000명 이상의 사람들을 3.9%의 치사율로 감염시켰다. 바이러스의 감염은 SARS-CoV 감염과 유사한 심각한 비정형 폐렴을 일으켰다(4). 이러한 질환의 병인이 적극적으로 조사되고 있지만, 바이러스 감염이 치사율이 높은 호흡 부전으로 이어지는 이유는 아직 잘 이해되지 않는다(5). SARS-CoV 뉴클레오캡시드(N) 단백질은 다른 공지된 코로나 바이러스의 N 단백질과 20-30% 상동성만을 공유하는 46-kDa 바이러스 RNA 결합 단백질인 반면(6), BLASTP(5, 7)에 의한 SARS-CoV-2(91%) 및 MERS-CoV(51%) 포함하는 고병원성 코로나 바이러스의 N 단백질은 더 유사하다(8). N 단백질은 SARS-CoV 감염 동안 환자 혈청 샘플에서 가장 풍부한 바이러스 구조 단백질 중 하나이다(9). 잠재적으로, N 단백질은 재조합 백시니아 바이러스(10) 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자(11)를 통해 다른 바이러스 단백질이 아닌 N 단백질의 사전 투여로서 바이러스 병인에서 역할을 하여 SARS-CoV로 도전된 노화된 마우스에서 중증 폐렴을 초래하였다.

보체 시스템은 감염에 신속하게 반응하는 면역 감시 시스템으로 기능한다. 보체 시스템의 활성화는 병원체 제거, 염증 조절 적응 면역 반응을 초래했다. 그러나, 조절되지 않은 보체 활성화는 고병원성 바이러스에 의해 유발되는 급성 폐 질환의 발달에 관여했다(12, 13). 보체 시스템은 고전적 경로(CP), 렉틴 경로(LP) 또는 대체 경로(AP)를 통해 활성화될 수 있다(14). LP에서, 만난 결합 렉틴(MBL)(또는 피콜린)은 바이러스의 표면 또는 바이러스 감염 세포의 표면에 있는 만난 및 N-아세틸글루코사민 잔기의 탄수화물 어레이에 결합하여 보체 캐스케이드를 직접 개시할 수 있는 유일한 공지된 MBL 관련 프로테아제인 MBL 관련 세린 프로테아제-2(MASP-2)의 활성화를 초래한다(15, 16). MBL은 시험관내에서 용량 의존적, 칼슘 의존적 및 만난 억제 가능한 방식으로 SARS-CoV 감염 세포에 결합하여 SARS-CoV 상의 보체 C4의 침착을 향상시킨다(17). SARS-CoV 스파이크(S) 단백질 상의 N-연결된 글리코실화 부위 N330은 MBL과의 특이적 상호작용에 중요하다(18). 더 높은 수준의 활성화된 보체 C3 및 C4 단편이 SARS 환자에서 발견되어 보체 경로의 활성화를 나타내지만(19, 20), SARS-CoV 유발 보체 활성화의 메커니즘은 잘 이해되지 않는다. 유사한 병인이 SARS-CoV-2 감염에서 발생하는지 여부도 또한 공지되지 않는다.

이전에, 본 발명자들은 N 단백질이 MBL 관련 세린 프로테아제-2(MASP-2)의 대안적인 스플라이싱 생성물인 MAP19(22)를 포함한 다수의 숙주 단백질과 상호작용한다는 것을 입증했다. 따라서, 이 연구에서, SARS-CoV, MERS-CoV, SARS-CoV-2 N 단백질과 MASP-2의 상호작용이 집중적으로 조사되었고, 숙주 면역 및 염증에 대한 이러한 상호작용의 병리학적 영향도 밝혀졌으며, 이는 현재 COVID-19 전염병에 대한 면역 조절 기반 요법에 대한 메커니즘 지원을 제공한다.

결과

SARS- CoV , SARS- CoV -2 및 MERS - CoV의 N 단백질은 MASP -2와 상호작용 한다

SARS-CoV의 N 단백질과 MASP-2 사이의 결합을 조사하고 두 단백질의 상호작용 도메인을 묘사하기 위해, Flag 태깅된 전장 MASP-2, N-말단 CUB1-EGF-CUB2 영역, 또는 C-말단 CCP1-CCP1-SP 영역(도 7A)을 발현하는 인간 293T 세포 용해물을 항-Flag 항체-접합 아가로스 비드를 사용하여 항-Flag 면역침전에 적용했다. 이어서, 면역침전물을 2mM CaCl₂ 또는 1mM EDTA의 존재하에 GFP 태깅된 SARS-CoV N 단백질(GFP-SARS N) 또는 절단된 돌연변이체를 발현하는 293T 세포 용해물과 함께 배양했다. 흡착물은 면역블롯팅에 의해 항-Flag 또는 항-GFP 항체로 프로빙하였다. Flag-MASP-2와 GFP-SARS N 사이의 연관성은 MASP-2-MBL 결합과 MASP-2 자동 활성화에 대한 Ca² ⁺의 요건과 일치하여 CaCl₂의 존재하에서만 관찰되었다(도 1A). MASP-2의 CCP1-CCP2-SP 영역(도 1A)과 N 단백질의 N-말단 도메인(잔기 1-175)(도 7A 및 7B)이 회합에 중요했지만, 음성 대조군 또는 다른 절단된 영역은 결합하지 않았고, GFP 태깅된 전장 또는 절단된 N 단백질은 마우스 IgG 접합 비드와 공동면역침전되지 않았다(도 1A 및 도 7B).

SARS-CoV N 단백질은 증상 발병 후 1일 이내에 환자 혈청에서 검출될 수 있다(24). 혈청에서 SARS-CoV N 단백질 회합을 시뮬레이션하기 위해, Flag 태깅된 N 단백질(1ng/ml)을 인간 또는 마우스 혈청에 첨가하고 항-Flag 항체 접합 아가로스 비드로 침전시켰다. SARS-CoV N 단백질은 인간 및 마우스 혈청으로부터 유래된 MASP-2와 상호작용했다(도 1B). 추가의 절단 및 결실 분석은 SARS-CoV N 단백질의 코일 모티프(잔기 115-130)에 위치된 아미노산 잔기 116-124가 MASP-2와의 상호작용에 필수적이었음을 보여주었다(도 1C). 그러나, MASP-2와 N 단백질 이량체를 형성하지 못한 돌연변이체인 SARS-CoV NΔ321-323(도 7C)의 회합은 크게 영향을 받지 않았다(도 1C).

MASP2 상호작용을 위한 SARS-CoV N 단백질(잔기 116-124)의 중요한 모티프는 SARS-CoV-2 N(115-123) 및 MERS-CoV N(104-112)의 상응하는 모티프와 높은 동일성을 공유하고(도 7D), SARS-CoV2 및 MERS CoV의 N 단백질이 또한 MASP2와 상호작용 할 것임을 시사한다. 예상된 바와 같이, 외생적으로 발현된 MERS-CoV N 및 SARS-CoV-2 N은 모두 MASP-2와 관련이 있으며(도 1D 및 1E), MERS-CoV N의 Δ104-112 결실 돌연변이체는 예측된 회합 감소를 나타내었다(도 1D). 따라서, 코로나 바이러스 N 단백질에 걸친 공통된 모티프는 MASP-2 결합에 중요하다.

SARS- CoV , MERS - CoV 및 SARS- CoV -2의 N 단백질은 MASP -2 의존성 보체 활성화를 강화시킨다

MASP-2의 CCP1-CCP2-SP 도메인은 자가 활성화 및 기질 결합 활성을 담당하며, 이는 차례로 보체 렉틴 경로의 활성화를 중재한다(25). 상기 입증된 MASP-2:SARS-CoV N 단백질 회합은 N 단백질이 MASP-2 활성화와 이량체화를 필요로 하는 절단을 조절할 수 있음을 시사한다. MASP-2:MASP-2 결합을 입증하기 위해, Flag-태깅된 MASP-2 접합 비드를 N-단백질 및 MBL의 존재/부재하에서 Myc-태깅된 MASP-2를 발현하는 293T 세포의 용해물와 함께 배양했다. MASP-2-Flag에 대한 MASP-2-Myc의 결합은 거의 동일한 몰 화학량론에서 SARS-CoV N 단백질에 의해 강화되었다(도 2A). 다음으로, 정제된 MASP-2-Flag를 SARS-CoV N 단백질의 존재 또는 부재하에 만난 및 MBL과 함께 배양하였다. MASP-2 자동 활성화로부터 생성된 더 높은 수준의 절단된 MASP-2 단편(잔기 445-686)이 SARS-CoV N 단백질의 존재하에서 생성되었다(도 2B).

MASP-2의 MBL 결합 능력에 대한 SARS-CoV N 단백질의 영향을 조사하기 위해, 정제된 MBL 및 MASP-2(26)를 만난 코팅된 마이크로플레이트 웰에서 4℃에서 배양하여 MASP2 활성화를 피하고, MASP-2:MBL 결합의 역학을 항-MASP2 항체를 사용하여 평가하였다. N 단백질에 대한 음성 대조군으로 사용되는 결합 완충액의 고농도 성분인 인간 혈청 알부민(HSA)과 비교하여, MBL에 대한 MASP-2의 결합은 비교적 저농도(MASP2의 1% 내지 0.1%) 및 Ca² ⁺에서 SARS-CoV N 단백질의 존재하에 유의하게 향상되었고, 증강은 항-N 단백질 항체에 의해 효과적으로 역전되었다(도 2C). 또한, Δ116-124 또는 Δ321-323 결실을 보유하는 SARS-CoV N 단백질 또는 덜 병원성 인간 코로나 바이러스 229E-CoV 유래 N 단백질은 전장 SARS-CoV N 단백질과 비교하여 MASP-2:MBL 결합에 대해 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않았다(도 2C). 이러한 결과는 SARS-CoV N 단백질-강화 MASP-2 활성화가 MASP-2 회합뿐만 아니라 N 단백질 이량체화에 의존적임을 나타냈다.

MASP2는 보체 성분 C2와 C4를 절단하여 활성화시 보체 시스템의 렉틴 경로에서 C3 전환효소를 생성한다. 다음으로, LP 보체 활성화에 대한 SARS-CoV N 단백질의 효과는 C4 절단에 의해 평가되었다. 정제된 C4는 등몰 N 단백질의 존재/부재하에 MASP-2, 만난, MBL과 함께 배양하고, C4 절단은 만난 및 MBL의 존재하에서 SARS-CoV N 단백질에 의해 유의하게 강화되는 것으로 관찰되었다(도 2D 및 도 8A). 따라서, SARS-CoV N 단백질(Δ116-124 및 Δ321-323) 및 H229E-CoV의 N 단백질의 돌연변이체는 MASP-2 매개된 C4 가수분해를 촉진할 수 없었다(도 2E 및 도 8B). 특히, 항-MASP-2 모노클로날 항체 또는 MASP-2의 억제제인 C1INH(27)는 SARS-CoV 강화된 C4 가수분해를 차단하였고, N-단백질 강화된 C4 절단은 MASP-2 활성화에 의존적임을 시사했다(도 2E 및 도 8B). 또한, MERS-CoV N은 또한 C4 절단을 강화시키는 것으로 밝혀졌다(도 8C). 이러한 결과는 N 단백질이 C4 절단을 촉진하고, 따라서 MASP-2 회합 및 활성화에 의한 보체 활성화를 촉진함을 보여주었다.

렉틴 경로를 통한 보체 활성화에 대한 SARS-CoV N 단백질의 영향은 보체 침착 검정에 의해 추가로 조사되었다. 정제된 C4를 표시된 N 단백질의 존재하에 고정화된 MBL MASP-2 복합체와 함께 배양하였다. H229E-CoV N이 아니라 SARS-CoV, MERS-CoV 및 SARS-CoV2의 N 단백질이 MASP 2의 활성에 의존적인 C4b 침착을 용량 의존 방식으로 강화시켰다(도 2F, 도 2G 및 도 2H). 이어서, 고정된 만난을 SARS-CoV N 단백질의 존재/부재하에 C1q 고갈된 혈청(고전적 경로를 제거하기 위해)과 함께 배양하고(28), 침착된 C3 단편(C3b, iC3b 및 C3dg)은 항 활성화된 C3 항체에 의해 검출되었다. C4b 침착과 함께, 활성화된 C3의 침착은 최대 약 40nM까지 SARS-CoV N 단백질 수준의 증가와 함께 명백하게 증가하였고(도 8D), C3 전환 효소의 향상된 활성을 시사한다. C3b 침착은 아마도 표면이 고밀도의 C3b로 코팅될 때(29, 30) 혈청 중 가용성 억제제(예: 인자 H 및 인자 I)에 의한 C3b의 추가의 절단으로 인해 고농도의 N 단백질의 존재하에 감소되었다(도 8D 및 8E). 또한, SARS CoV N 단백질은 EGTA를 함유하는 칼슘 부재 완충액에서 활성화된 C3 침착에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않았으며, 이는 SARS CoV N 단백질 강화된 C3 활성화가 대안적인 경로(AP)가 아니라 렉틴 경로(LP)를 통해 일어난다는 것을 시사하고, 여기서 C3 활성화는 Ca² ⁺ 독립적이다(도 8E). 본 발명자들은 또한 C5b 9 복합체의 침착을 테스트했다. 증폭된 보체 캐스케이드의 결과로서, 복합체의 유의하게 증가된 침착은 환자의 혈청에서 관찰된 것과 유사한 훨씬 낮은 농도에서 SARS-CoV N 단백질에 의해 유도되었다(도 8F)(24).

활성화된 보체는 C3b 또는 C5b 매개된 옵소닌화에 의한 병원체 및 세포 파편의 효율적인 식작용에 중요한 역할을 한다(31). 보체 의존적 식작용을 연구하기 위해, 이. 콜라이(E. coli) 및 마우스 복막 대식세포를 SARS-CoV N 단백질을 포함하거나 포함하지 않고 희석된 C1q 고갈된 혈청에서 함께 배양하였다. C3 절단 후의 생성물인 결합된 C3 또는 그의 큰 단편 C3b는 FITC 표지된 항-C3c 항체로 염색하고, C3 접합된 이. 콜라이를 함유하는 FITC-양성 대식세포를 현미경하에 계수하였다. 보체 활성화와 함께, MASP-2를 포함하는 보체 성분을 함유하는 마우스 혈청의 존재하에 마우스 복막 대식세포에 의한 보체 의존적 식작용은 HSA 대조군과 비교하여 SARS-CoV N 단백질에 의해 강화되었다(도 8G). 이러한 발견은 SARS-CoV N 단백질이 비고전적인 경로를 통해 보체 시스템의 활성화와 옵소닌 효과를 효과적으로 촉진함을 나타냈다.

SARS- CoV 및 MERS - CoV의 N 단백질은 MASP -2 관련 보체 활성화에 의해 LPS 유발 폐렴을 악화시킨다

보체의 지속적인 활성화는 통제되지 않은 염증으로 이어진다. 염증에 대한 N 단백질 강화된 MASP-2 활성화의 영향을 조사하기 위해, 마우스를 SARS-CoV N을 발현하는 아데노바이러스(1 × 10⁹ PFU)(Ad-SARS N) 또는 그의 돌연변이체 또는 아데노바이러스 비히클 단독(Ad-null)으로 사전 감염시켰다. 그런 다음, 마우스를 MBL 결합 모티프를 함유하는 LPS로 도전하여 LP를 활성화시키고 염증을 유도했다(32). 아데노바이러스 비히클에 사전 노출된 10마리의 마우스 중 8마리는 5mg/kg의 LPS로 도전되었을 때 생존하였으나(도 3A), Ad-SARS N에 사전 노출된 10마리의 마우스는 모두 동일한 용량의 LPS 투여 후 12시간 이내에 사망하였다(도 3A). 심한 폐 손상과 대규모 염증 세포 침윤이 또한 죽은 마우스에서 관찰되었다(도 3B). 이전 발견과 함께, N 단백질에 각각 Δ116-124 또는 Δ321-323 결실을 보유하는 Ad-229E N 및 Ad-SARS N의 사전 감염은 마우스 사망률에 대한 효과를 유의하게 감소시켰다. 중요하게는, 항-MASP-2 항체 또는 C1INH가 Ad-SARS N 사전 감염된 마우스에서 LPS 투여와 동시에 투여되면, LPS에 의해 유도된 사망률이 유의하게 감소되었다(도 3A). 심한 폐 손상과 대규모 염증 세포 침윤이 이러한 마우스에서 또한 관찰되었다(도 3B). 이러한 결과는 SARS-CoV N 단백질이 LP 관여된 보체 캐스케이드 반응을 개시하는 MASP-2 활성화를 통해 LPS 유발 염증을 크게 강화시킨다는 것을 총체적으로 입증한다.

LPS 및 N 단백질에 의해 유도된 마우스의 보체 활성화를 조사하기 위해, Ad-SARS N(1 x 10⁸ PFU)으로 사전 감염된 마우스는 LPS(5mg/kg)로 도전되었다. LPS 투여 6시간 후 마우스를 희생시키고, 파라포름알데히드 고정된 폐 조직을 항-C4b 항체를 사용하는 면역조직화학 염색(도 3C) 또는 FITC 표지된 항-C3c 항체를 사용하는 면역형광 분석(도 3D)에 적용했다. 폐에서 C4b 및 활성화된 C3 침착은 LPS 및 Ad-null로 처리된 마우스의 폐에서의 약한 염색과 비교하여 SARS-CoV N 단백질을 발현하는 마우스에서 유의하게 증가되었다(도 3C 및 D).

MASP-2와 N 단백질의 생체내 회합은 항-N 항체와 항-MASP-2 항체(도 3D, 도 9A)를 이용한 원위치 근접 결찰 검정(PLA)에 의해 추가로 평가되었고, SARS-CoV N과 MASP-2가 서로 결합한 경우에만 검출 가능할 수 있었던 빨간색 반점은 음성 대조군 동물이 아니라 SARS-CoV N을 발현하는 마우스의 폐 세포에서 풍부하게 관찰되었다. 이러한 결과는 마우스 폐 조직에서 SARS-CoV N에 의한 MASP-2의 원위치 직접 결합 및 활성화를 확인했다.

유사하게, LPS로 도전된 마우스는 심각한 폐렴을 앓았고, MERS-CoV N 단백질을 발현하는 아데노바이러스(Ad-MERS N)로 사전 감염될 때 24시간 이내에 100% 사망하지만, 그의 Δ104-112 돌연변이체(Ad-MERS NΔ104-112)는 7일 동안 C1INH 및 항-MASP-2 항체에 의해 부분적으로 구출되었다(도 3E). 이러한 결과는 N 단백질이 SARS-CoV와 MERS-CoV 모두에 의해 사용되어 MASP-2 매개된 렉틴 경로를 통해 보체 활성화를 촉진한다는 것을 나타낸다.

N 단백질의 병원성은 동일한 방식으로 MASP-2 프로테아제 활성 결핍을 갖는 masp2 녹아웃 마우스를 사용하여 추가로 조사되었다(도 9b). 마우스를 Ad-SARS N 또는 Ad-MERS N(1 x 10⁸PFU)으로 5일 동안 사전 감염시킨 후, LPS로 도전시켰다. 야생형 마우스와 비교하여, masp2 녹아웃 마우스는 더 오래 생존하였고 더 높은 생존율을 보였으며(도 3F), 이는 MASP-2 결핍 때문에 손상된 보체 활성화에 기인할 수 있다.

보체 캐스케이드는 COVID -19 환자의 폐에서 과활성화된다

SARS-CoV 및 SARS-CoV-2는 마우스에서 가벼운 폐 손상만을 유도하고, 마우스 적응 SARS-CoV를 포함한 살아있는 SARS-CoV에 의한 조사는 규정에 의해 허용되지 않기 때문에, 보체 LP 경로의 과활성화가 COVID-19 환자에서 발생했다는 임상 증거 가 수득되었다. COVID-19로 사망한 환자의 파라포름알데히드 고정된 폐 조직을 수집하여 MBL, MASP-2, C4α, C3 또는 C5b-9 항체에 의한 면역조직화학 염색에 적용하였다. 환자 폐 조직에서 MBL, MASP-2, C4, C3 및 C5b-9는 강하게 양성 염색이었고(도 4), 이는 보체 성분이 유형 I 및 유형 II 폐포 상피 세포뿐만 아니라 염증 세포, 일부 과형성 폐 세포 및 괴사성 세포 파편을 수반하는 폐포 공간에서의 삼출물에 침착되었음을 시사한다. 또한, 유의하게 증가된 혈청 C5a 수준이 COVID-19 환자, 특히 심각한 환자에서 또한 관찰되었다. 이러한 결과는 보체 경로가 COVID-19 환자의 폐에서 공격적으로 활성화되었음을 나타낸다.

보체 표적화 요법은 COVID - 19에 대한 유망한 치유 효과를 보여준다

과도한 염증성 및 사이토카인 폭풍은 COVID-19의 중증도 및 치사율에 기여할 수 있으며, 이는 보체 경로의 억제되지 않은 활성화에 기인할 수 있다. 따라서, MASP-2 및 그의 하류 신호 분자, 예를 들어, 강력한 아나필라톡신 C5a의 하향 조절은 SARS-CoV-2에 의해 유발되는 폐렴을 조절하는 새로운 접근법을 제공할 수 있다.

COVID-19 치료에서 본 발견과 그의 잠재력 및 응용에 기초하여, 화농성 한선염(hidradenitis suppurativa)에 대한 단계 II 임상 시험 중이었던 서열번호 34의 가변 중쇄 서열과 서열번호 35의 가변 경쇄 서열을 포함하는 재조합 C5a 항체(동일한 세포주로부터 성장된 이들 가변 영역을 갖는 IgG 항체는 상호 교환적으로 IFX-1 또는 BDB-001이라 칭명된다)는 COVID-19(2020L0003)의 치료를 위한 단계 II 임상 시험을 위해 국립 의료 제품 관리(NMDA)에 의해 신속하게 승인되었다. "경증 COVID-19 환자에서 다중 센터 무작위 이중 맹검 위약 조절 시험" 및 개방 라벨 "중증 및 심각한 COVID-19 환자에서 두 개의 코호트 임상 시험"이 환자의 고지에 입각한 동의와 함께 후오센산 병원(Huoshensan Hospital)의 윤리 위원회의 승인하에 동시에 수행되었다. COVID-19 코호트의 더 많은 환자로부터의 더 큰 데이터 세트가 시험이 완료되면 다른 곳에서 보고될 것이지만, 여기서 본 발명자들은 개방 라벨 시험에서 항-C5a 요법을 투여받은 첫 번째 2명의 환자를 보고한다.

우한시에 거주하는 54세 남성 환자 #1은 발열과 함께 증상이 발병한 후 4일째(질병 5일째)에 동시후 병원에 입원했다. SARS-CoV-2의 감염은 SARS-CoV-2에 대한 rRT-PCR에 의해 확인되었고, 흉부 CT 스캔은 양측 불투명도를 나타냈다. 질환은 고열(38.7℃ 내지 39.8℃), 실내 공기에서 SpO₂ < 93%, CT 스캔에서 폐렴 진행 및 심각한 간 손상으로 질병 9일째부터 악화되었다. 프레드니손(4일 동안 40mg/일)이 질병 10일째부터 13일째까지 투여되었으나 상태가 악화되었고, 환자는 질병 14일째에 중증 COVID-19 환자를 위해 긴급하게 설립된 새로운 병원인 우한 후오센산 병원으로 이송되었으며(도 5A), 1분 동안 실내 공기에 노출될 때 중등도 ARDS(산소화 지수 < 150), 호흡수 30/분 및 77%로 경피 산소 포화도(SpO₂) 강하를 갖는 심각한 상태에서 중증 사례로 간주되었다. SpO₂ > 95%를 표적으로 하는 높은 유량 비강 산소(HFNO)를 포함하는 지지 치유가 제공되었다(도 5B, 왼쪽). 그는 또한 항생제(목시플록사신)와 인간 혈청 알부민이 투여되었지만, 프레드니손은 중단되었다. 항-C5a 모노클로날 항체(BDB001)에 의한 치료는 질병 15일째 아침에 시작되었다. 항체는 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 9일, 11일 및 13일째에 250ml 식염수에서 300mg/d의 용량으로 정맥내 투여되었다. 부작용은 관찰되지 않았고, 같은 날 저녁에 정상 체온(도 5C, 왼쪽), 증가된 산소화 지수(PaO₂/FiO₂)(도 5B, 왼쪽) 및 림프구 세포 수(도 5C, 왼쪽), 감소된 C 반응성 단백질(CRP) 농도(도 5C, 왼쪽), 및 유의하게 개선된 간 기능(감소된 ALT, AST, 및 증가된 총 혈청 단백질 및 혈청 알부민 농도에 의해 나타남, 도 5D, 왼쪽)과 함께 다음날 임상 상태가 개선되었다. 흡기 O₂의 분율과 고유량 비강 산소(HFNO)의 가스 유동률은 결국 SpO₂ > 95%를 표적으로 하는 최고치(80%, 40L/분에서 30%, 20L/분으로)로부터 감소했다(도 5B, 왼쪽). 심각한 상태의 환자를 임시로 설립된 병원(거리 및 우천시)에서 CT 스캔을 촬영하게 될 높은 위험성 때문에, 항-C5a 투여 직전의 CT 스캔은 평가에 이용할 수 없었다. 그럼에도 불구하고, 폐렴은 1차 투여 후 10일 후와 비교하여 1차 투여 후 20일 후에 유의하게 개선되었다(도 10).

환자 #2는 발열 및 기침과 함께 증상 발병 후 5일째(질병의 6일째)에 여섯 번째 병원에 입원한 67세 남성이었다. CT 스캔은 왼쪽 폐의 우수한 엽에 대한 불투명도를 나타냈다(도 10). SARS-CoV-2의 감염은 또한 질병의 11일째에 rRT-PCR에 의해 확인되었다. 항바이러스제(아르비돌) 및 항생제(목시플록사신)가 다른 지지적 치료와 함께 투여되었다. 상태는 8일째까지 심한 기침 및 고열과 함께 악화되었다(39.7℃, 도 5C, 오른쪽). 메틸프레드니솔론(40mg/일, 질병 8일째부터 7일 동안)은 증상의 개선을 거의 나타내지 않았다. 환자는 10일째에 우한 후오센산 병원으로 이송되었고(도 5A), 질병은 SpO₂(14일째 실내 공기에서 < 90%), 고열(10일째 내지 13일째에 39℃ 초과, 도 5C 오른쪽) 및 질병의 11일째에 흉부 CT의 폐렴에 의해 나타난 바와 같이 계속 악화되었다(도 10). 환자는 심한 기침, 흉부 압박감 및 호흡 곤란을 보고했다. HFNO가 SpO₂ > 95%를 유지하기 위해 제공되어야 한다. 항-C5a는 질병 14일째 아침에 투여되었고, 환자 #1에서와 같이 계속되었다. 이어서, 같은 날에 정상 체온이 관찰되었다(도 5C 우측). 기침, 호흡 곤란 및 흉부 압박감은 다음날(질병 15일째) 더 나아지는 것으로 보고되었다. C 반응성 단백질(CRP) 수준의 유의한 감소, 백혈구 수 및 림프구 수의 유의한 증가도 또한 다음날에 관찰되었다(도 5C, 오른쪽). 간 기능은 점차 개선되었다(도 5D 오른쪽, 15 일째 데이터는 이용 가능하지 않음). SpO₂>95%를 유지하는 데 필요한 유동률과 흡기 O₂의 분율은 SpO₂/FiO₂의 증가와 함께 점차적으로 감소되었다(도 5B 오른쪽). 26일째(1차 투여 후 12일째)의 흉부 CT도 또한 폐렴 감소를 보여주었다(도 5B).

이들 데이터는 두 명의 환자가 항-C5a 모노클로날 항체 요법으로부터 유의하게 이익을 얻었음을 시사했다.

토론

지난 17년 동안, 연속적으로 출현한 SARS-CoV, MERS-CoV 및 SARS-CoV-2가 종의 장벽을 뚫고 새로운 전염병과 사회적 패닉을 인간에게 가져 왔다. 이러한 고병원성 코로나 바이러스는 모두 급성 폐 손상과 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS)을 유발하여 중증도와 치사율을 증가시킨다. 바이러스에 감염된 환자는 심한 면역 손상으로 인한 비정형적 폐렴을 일으킬 수 있다. "사이토카인 폭풍"(5)이라고 불리는 전염증성 사이토카인 및 케모카인의 광범위한 방출을 특징으로 하는 과도한 인간 면역 반응은 최신 SARS-CoV-2(4)를 포함한 고병원성 코로나 바이러스로 인한 심각한 폐렴의 주요 개시제인 것으로 생각된다. 면역병인은 SARS 또는 MERS에 부분적으로 연루되어 있지만, 숙주 면역계의 바이러스 유발 과다 활성화를 일으키는 메커니즘은 여전히 잘 이해되지 않고 있다.

여기서, 본 발명자들은 SARS-CoV, MERS-CoV 및 SARS-CoV-2가 바이러스 N 단백질을 MBL의 결합 및 증강, MASP-2의 Ca² ⁺ 의존적 자동 활성화에 연결하는 공통 메커니즘을 공유하여 통제되지 않은 보체 캐스케이드의 활성화, 보체 침착 및 C4 절단의 향상을 유도한다고 개시한다(도 1-2 및 6). MASP-2에 대한 N 단백질의 결합은 MASP-2-매개 렉틴 경로 활성화의 효과를 증폭시킨다. N 단백질 돌연변이체는 MASP-2와 상호작용하지 못하거나 N 이량체를 형성할 수 없으며, MASP-2-매개 렉틴 경로의 활성화에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않으며(도 1C 및 D), 이는 N 단백질의 영향이 결합 및 이량체화에 의존적임을 시사한다.

"양날의 검(double-edged sword)"으로서, 보체는 병원체에 대한 선천적 면역에 중요하다. C3a 및 C5a와 같은 아나필라톡신은 면역 세포를 활성화시킬 수 있고, 따라서 다양한 사이토카인의 방출을 유도한다. 활성화된 보체 캐스케이드는 세포 용해 말단 보체 복합체 C5b-9와 C3b 및 C5b 단편을 생성한다(31, 33). 이러한 펩티드는 프로스타글란딘(PG) E2, 트롬복산 B2 및 류코트리엔을 포함하는 아라키돈산 대사산물의 합성을 유도하며(32, 34), 이는 호중구, 단핵구 및 호산구의 모집 및 활성화를 추가로 유도하고, 다수의 전염증성 사이토카인 및 매개체의 생산을 자극한다(35). 이러한 사이토카인은 염증 과정을 유발하고 유지하며 선척적 면역이 바이러스와 싸울 수 있도록 도와 준다. 그럼에도 불구하고, 보체 관련 선천적 면역 활성화는 억제되지 않은 보체의 활성화가 항상 파종성 혈관내 응고(disseminated intravascular coagulation; DIC), 염증, 세포 사멸 및 면역 마비에 기여하며 결국 다발성 장기 부전 및 사망으로 이어지기 때문에 미세 조정되어야 한다. 코로나 바이러스 N 단백질이 보체 활성화를 강화한다는 놀라운 발견은 SARS-CoV, MERS-CoV 및 SARS-CoV-2 감염에 의해 유발되는 폐렴의 원인에 대한 새로운 통찰력을 제공한다. 또한, 본 발명자들은 Ad-SARS N 또는 Ad-MERS N의 사전 감염이 LPS 유발 폐렴의 치사율을 명백히 증가시킨다는 것을 발견했다(도 3). 그것은 2차 박테리아 감염으로부터 방출되는 대규모 LPS로 인한 조직 손상을 악화시킬 수도 있다(37, 38).

N 단백질-매개 MASP-2의 관여 및 따라서 코로나 바이러스의 병인에서 보체 캐스케이드 과다 활성화는 C5a/C5aR 경로의 공지된 억제제를 사용하는 전략을 제공하여 SARS, MERS 또는 최신 COVID-19를 치료하는 새로운 방법을 제공한다. 첫째, 항체에 의한 혈청 내 N 단백질의 중화는 LPS/Ad-SARS N 또는 LPS/Ad-MERS N 도전된 마우스에서 폐 손상을 효과적으로 완화시키고 치사율을 감소시켰다. 우연히, 스파이크 특이적 항체가 아닌 높은 수준의 N 단백질 특이적 항체를 생산하는 SARS 환자는 보다 쉽게 회복되는 경향이 있으며. 이는 N 항체의 수준이 SARS의 결과와 상관관계가 있음을 시사한다(39). 본 발견에 따르면, 유사한 메커니즘이 MERS-CoV 또는 SARS-CoV-2 감염에 존재할 수 있다.

둘째, Masp2 녹아웃 마우스는 LPS 유도된 N 단백질 부스트 마우스 폐렴 모델에서 유의하게 경증 증상 및 더 짧은 질환 경과를 보였으며, 이 중증 폐렴에서 MASP-2의 유해한 역할을 확인하였다. 따라서, 항-MASP-2 항체 또는 MASP-2 억제제 C1INH의 투여는 유망한 치료 효과를 나타냈다(도 3). 더 높은 친화도와 중화 활성을 갖는 개선된 MASP-2 항체, 예를 들어, OMS721(40)(혈전성 미세혈관병증(thrombotic microangiopathy)에 유망한 효과를 보임), 또는 주사 가능한 C1INH 약물, 예를 들어, HAEGARDA는 효과적인 보호를 제공할 수 있다. 추가 임상 평가는 SARS-CoV 2 유발 폐렴 치료의 치료를 위해 수행되어야 할 가치가 있다.

셋째, 본 발명자들은 죽은 환자의 폐 조직에서 보체 캐스케이드의 과도한 활성화를 관찰했으며, 이는 Ad-SARS N 사전 감염된 및 LPS 프라이밍 마우스 모델에서의 관찰과 일치한다. 높은 수준의 C5a는 경증이 아닌 중증 COVID-19 환자의 혈청에 축적되었다. 따라서, 보체 캐스케이드 산물 표적화 면역조절이 병원성 코로나 바이러스 관련 질환의 염증 조절에 효과적일 수 있다는 것은 의미가 있다. 이 경로에서, C5a는 염증을 유발하는 가장 강력한 보체 단백질이다. Staidson(BDB001) 및 inflaRx GmbH(IFX-1, 동일한 조작 세포주에 의해 생성됨)에 의한 다른 질환의 단계 II 시험에서의 본 관찰 및 안전성 기록에 기초하여, 재조합 항-C5a 항체 BDB001은 중증 및 심각한 COVID-19 환자의 치료를 위한 임상 시험을 위해 NMDA에 의해 승인되었다. 적어도 모두 악화 상태에 있었던 처음 두 명의 환자에서, 항-C5a 항체는 임상의의 예상을 초월하는 신속하고 유망한 효과를 보였다. 최종 효능은 임상 시험이 끝날 때까지 공개될 것이지만, 항-C5a 항체가 COVID-19의 치료를 위한 새로운 접근법을 제공할 것으로 기대할 가치가 있다.

재료 및 방법

세포 배양 및 형질감염

293T 세포주는 베이징 연합 의과 대학의 세포 자원 센터에서 입수되었다. 세포는 10% 열 불활성화된 태아 소 혈청(FBS)(HyClone), 2mM L-글루타민, 100 단위/ml 페니실린 및 100μg/ml 스트렙토마이신으로 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)(Invitrogen)에서 성장시켰다. 세포를 제조업체의 프로토콜에 따라 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 사용하여 플라스미드 DNA로 형질감염시켰다.

단백질의 벡터 및 에피토프 태깅

SARS-CoV의 N 유전자(GenBank 수탁 #AY274119)는 환자 혈청 샘플의 SARS-CoV RNA(업스트림 프라이머: 5'-CGGAATTCCATATGTCTGATAATGGACCCCAA-3'; 다운 스트림 프라이머: 5'-CGGGATCCTTATGCCTGAGTTGAATCAGC-3')로부터 RT-PCR에 의해 증폭시키고, pcDNA3 기반 Flag 벡터(Invitrogen), pCMV-Myc(Clontech), pGEX-4T-2(GE Health care) 및 pEGFPC1(Clontech)의 BglII 및 EcoRI 부위에 클로닝하였다. MERS-CoV의 N 유전자는 화학적으로 합성되었고(Huaxinrcomm Technology Co., Ltd.), BamHI 및 EcoRI 부위에서 pcDNA3 기반 Flag 벡터에 클로닝되었다. SARSCoV-2의 N 유전자는 화학적으로 합성되었고(General Biosystems(Anhui) Co. Ltd), KpnI 및 XbaI 부위에서 pcDNA3.1 기반 HA 벡터로 클로닝되었다.

면역침전 및 면역블롯팅.

세포 용해물은 1% Nonidet P-40을 함유하는 용해 완충액(50mM Tris-HCl, pH 7.5, 1mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 1mM 디티오트레이톨, 10mM 불화나트륨, 10μg/ml 아프로티닌, 10μg/ml 류펩틴, 및 10μg/ml 펩스타틴 A)에서 제조되었다. 가용성 단백질을 항-Flag M2 아가로스(Sigma)를 사용하여 면역침전시켰다. 이어서, 흡착물을 SDS-PAGE로 분리하고, 반건조 트랜스블롯(Biorad)에 의해 Immobilon-P 전달 멤브레인(Millipore) 상으로 옮겼다. 멤브레인은 5% Western-Blocker(Biorad)로 차단되었다. 면역블롯 분석은 서양 고추냉이 퍼옥시다아제(HRP)-접합 항-Flag(Sigma), 항-β-액틴(Sigma), 항-녹색 형광 단백질(GFP)(Clontech), 항-MASP-2(Santa Cruz), 항-C4α(Santa Cruz), HRP-접합 항-Myc(Santa Cruz) 및 염소 항-마우스 면역글로불린 G(IgG)(Amersham/Pharmacia) 항체로 수행되었다. 항원-항체 복합체는 화학발광(GE Health Care)에 의해 가시화되었다.

SARS- CoV 및 MERS - CoV N 단백질의 정제.

위에서 기재된 바와 같이(1), pET22b-SARS/MERS-CoV N을 발현 균주 BL21(DE3)로 형질전환시켰다. 1mM IPTG로 8시간 동안 유도한 후, 박테리아를 원심 분리에 의해 수거하고, 초음파 처리 전에 완충액 A(25mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄(pH 8.0), 1mM EDTA 및 1mM DTT)에 재현탁시켰다. 용해물 중의 가용성 N 단백질은 SP-세파로스 고속 유동(25mM Na2HPO4/NaH2PO4(pH 8.0), 1mM EDTA, 1mM DTT 및 0.35-0.5M NaCl)을 이용한 이온 교환 크로마토그래피에 이어서, Superdex 200 겔 여과(GE Healthcare) 및 완충제 A를 이용한 용출에 의해 정제되었다. 벡터 pET22b로 형질전환된 이. 콜라이는 상기 기재된 바와 같이 용해시켰고, 용출액은 정제된 N 단백질의 음성 대조군으로 사용되었다. 정제된 SARS-CoV-2 N-His는 General Biosystems(Anhui) Co. Ltd.로부터 입수되었다.

MASP -2의 정제 및 재생.

재조합 단백질 발현 및 재생은 기재된 바와 같이 수행되었다(2, 3). 간단히 말해서, pET22b-MASP-2를 발현 숙주 균주 BL21(DE3)로 형질전환시켰다. 1mM IPTG로 유도 후, 세포를 수거하고 초음파 처리했다. 봉입체를 실온에서 6M GuHCl, 0.1M Tris-HCl(pH 8.3) 및 100mM DTT에서 가용화시키고; 이어서 가용화된 단백질을 50mM Tris-HCl, 3mM 환원된 글루타티온(Sigma), 1mM 산화된 글루타티온(Sigma), 5mM EDTA 및 0.5M 아르기닌을 함유하는 재폴딩 완충액으로 희석시켰다. 그런 다음, 단백질 샘플을 4℃로 냉각시켰다. 재생된 단백질을 20mM Tris, 140mM NaCl, pH 7.4에 대해 4℃에서 투석하고, PEG8000으로 농축시키고, 분액화하고 -70℃에서 저장하였다. 고활성 MASP-2를 수득하기 위해, Flag-태깅된 MASP-2를 293T 세포에서 발현시키고, 항-FLAG 자기 비드로 침전시키고, Flag 펩티드(Sigma)로 용출시켰다. MASP-2의 농도를 BCA 키트 및 면역블롯 분석을 사용하여 평가하였고, 정제된 원핵생물 발현 MASP-2를 표준 대조군으로 사용하였다.

MASP -2 자동 활성화 및 C4 절단 검정.

정제된 MASP-2(8nM)를 20mM Tris-HCl(pH 7.4), 150mM NaCl 및 2mM CaCl2에서 각각 50nM, 30nM, 15ng/ml 및 10nM의 농도의 정제된 C4(Calbiochem), 재조합된 MBL(Calbiochem), 만난(Sigma) 및 SARS-CoV N 단백질과 함께 37℃에서 배양했다. 절단은 환원 조건하에서 SDS-PAGE에 이어졌고, C4 단편 및 MASP-2는 항-C4α 쇄 항체(Santa Cruz) 또는 항-Flag 항체(Sigma)를 이용한 면역블롯 분석에 의해 검출되었다.

보체 침착 검정.

C4b 침착 검정은 인간 MBL/MASP-2 검정 키트(Hycult biotech)를 사용하여 수행되었다(4). 간단히 말해서, 희석된 혈청을 고염 결합 완충액과 함께 만난 코팅된 플레이트에서 4℃에서 밤새 배양하고, 세척 제거하고, MBL-MASP-2 복합체를 포획하였다. 정제된 C4 및 N 단백질을 첨가하고, 1.5시간 동안 배양하고, 침착된 C4b를 표준 프로토콜에 따라 검출하였다. LP 및 AP의 기능적 활성은 이전에 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 평가되었다(5). Nunc Maxisorb 플레이트를 실온에서 밤새 100mM Na₂CO₃/NaHCO₃(pH 9.6) 중 웰당 10㎍의 만난으로 코팅되었다. 각 단계 후, 플레이트를 PBST(300㎕/웰)로 3회 세척하였다. 나머지 결합 부위는 10mM Tris-HCl(pH 7.4), 150mM NaCl 및 2% HSA와 함께 실온에서 2 내지 3시간 동안 배양함으로써 차단되었다. 혈청 샘플은 2mM CaCl₂ 및 N 단백질을 포함하거나 포함하지 않고 150mM NaCl, 0.5mM MgCl₂, 0.05% Tween-20, 0.1% 젤라틴을 함유하는 10mM Tris-HCl(pH 7.4)에서 1:80으로 희석하였다. 모든 샘플과 완충액은 얼음 위에서 제조되었다. 이어서, 플레이트를 4℃에서 1시간 동안, 37℃에서 1.5시간 동안 순차적으로 배양한 다음, 세척하였다. 모든 배양 용적은 100μl였다. 보체 결합은 항체를 사용하여 검출한 후 세척하였다. C4, 활성화된 C3 및 C5b-9의 검출은 각각 항-C4α 쇄 항체(Santa Cruz), 항-활성화된 C3 항체(Santa Cruz) 및 항-C5b-9 항체(Calbiochem)를 사용하여 수행되었다. 항체 결합은 HRP-접합 양 항-마우스 항체 또는 당나귀 항-토끼 항체(R & D)를 사용하여 검출되었다. HRP의 효소 활성은 RT에서 30 내지 60분 동안 TMB 배양을 사용하여 검출되었고, 반응은 2M H₂SO₄로 중지시켰다. OD는 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 450nm에서 측정되었다.

MASP - 2:MBL 결합 검정.

MBL에 대한 MASP-2의 결합은 ELISA에 의해 평가되었다. 상기 언급된 바와 같이, Nunc Maxisorb 플레이트를 실온에서 밤새 100mM Na₂CO₃/NaHCO₃(pH 9.6)에서 웰당 10μg 만난으로 코팅하고, 2% HSA로 차단하였다. MBL 단백질(1μg/ml)을 10mM Tris-HCl(pH 7.4), 150mM NaCl, 5mM CaCl₂, 100μg/ml HSA 및 0.5‰ TritonX-100에서 4℃에서 2시간 동안 배양하였다. 정제된 MASP-2 및 N (또는 대조군) 단백질을 상이한 시간에 웰에 첨가하여 각각 0.2mg/ml 및 200ng/ml의 최종 농도를 수득하였다. 4℃에서 32시간 배양 후, 플레이트를 세척하고, MASP-2의 결합은 항-MASP-2 항체에 이어서, HRP-접합 토끼 항-염소 항체로 검출되었다. HRP의 효소 활성은 RT에서 30 내지 60분 동안 TMB 배양을 사용하여 검출되었고, 반응은 2M H₂SO₄로 중지시켰다. OD는 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 450nm에서 측정되었다.

옵소닌식세포작용 검정.

복강으로부터 단리된 마우스 세포를 세척하고, 37℃에서 2시간 동안 96-웰 플레이트에서 RPMI 1640 배지(10% FBS)를 접종하였다. 혈청을 1×PBS, 1mM CaCl₂ 및 2mM MgCl₂를 사용하여 0.781%, 1.562%, 3.125%, 6.25%, 12.5%, 25%, 50% 및 100%로 희석하였다. 희석된 혈청, SARS-CoV N 단백질(100ng/ml) 및 이. 콜라이(세포에 대한 비율은 10:1이었다)를 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 배양했다. pET22b-형질전환된 이. 콜라이로부터의 용출액을 정제된 N 단백질의 음성 대조군으로 사용하여 활성 보체일 수 있는 박테리아 성분으로 인한 영향을 배제하였다. 반응을 중지시키고, 세포를 10% 중성 포르말린으로 고정시켰다. 보체 C3c 침착을 FITC-C3c 항체로 검출하고, 염색된 세포를 계수하였다. 포인트는 2개의 반복 웰의 평균 값을 나타낸다. 오차 막대, 평균±S.D. 쌍을 이루지 않은 양측 스튜던츠 t-테스트 마우스에 의한 ^*P<0.05 및 ^**P<0.01.

masp null 마우스의 생성 및 LPS 도전

BALB/c 마우스 그룹은 군사 의료 과학 아카데미의 실험 동물 센터에서 제공 되었다. MASP-2-/-(KO) 마우스 및 음성 대조군 야생형(WT) 마우스는 Cyagen Biosciences Inc.에서 제공되었다. 모든 마우스는 군대 의료 과학 아카데미의 실험 동물 센터(중국)에서 유지되었다. 마우스(8-10/그룹)는 꼬리 정맥을 통해 1 x 10^8-9 PFU Ad-N/Ad-null(Beijing BAC Biological Technologies) 또는 식염수 대조군으로 3회(1, 2, 3일째) 감염시키고, LPS(5mg/kg)를 5-6일째에 꼬리 정맥을 통해 제공하였다. 항-MASP-2 모노클로날 항체(200μg/kg, HBT), 항-N 모노클로날 항체(200μg/kg, Sino Biolgical) 또는 C1INH(4mg/kg, Calbiochem)를 LPS 주사 30분 전에 꼬리 정맥을 통해 주사하였다.

면역조직화학

후오센산 병원에서 사망한 4명의 환자의 사후 부검은 병원 윤리위원회와 사망자 가족의 승인하에 Xiuwu Bian 박사에 의해 수행되었다. 상세한 결과는 다른 곳에 게시된다. 파라포름알데히드-고정된 폐 조직을 파라핀 조직 절편을 위해 사용하였고, MBL(Santa Cruz), MASP-2(Santa Cruz), C4α 쇄(Santa Cruz), C3(Santa Cruz) 또는 C5b-9(Calbiochem) 항체에 의한 면역조직화학 염색을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다.

COVID -19 환자에서 C5a의 검출.

경증 또는 중증 COVID-19 환자의 혈청은 병원 윤리위원회의 승인하에 수집되었다. 서버 환자는 발열 또는 의심되는 호흡기 감염에 더하여, 호흡률 > 30회 호흡/분, 심한 호흡 곤란 또는 실내 공기에서 SpO₂ < 90% 미만 중 하나로 정의되었다. 폐렴이 있고 중증 폐렴의 징후가 없는 환자는 경증 사례로 정의된다. 평균 56±12.1세 및 평균 26.3±9.1일의 질병을 갖는 10명의 경증 환자(남성 5명, 여성 5명)의 혈청을 검정했다. 신체에 대한 건강한 사람의 혈청은 임상 실험실에서 수집되었다. 혈청 C5a 수준은 이중 항체 샌드위치 ELISA(R&D)에 의해 검출되었다.

C5a 항체 요법.

인간 C5a(Bdb-001 주사)에 대한 마우스-인간(IgG4) 항체는 Staidson Biopharmaceutical Co., Ltd.에서 제공되었고, 이는 우수 제조 프로토콜(Good Manufacturing Protocol)에 따라 제조되었다. 주사는 2019년 건강한 대상체를 대상으로 한 단계 I 임상 시험을 위해 중국의 국가 의약품 관리국(National Medical Product Administration; NMDA)에 의해 승인되었다. SARS-CoV-2 코로나바이러스 유발 폐렴(COVID-19) 발생 후, 이 항체는 2020년 2월 7일(2020L00003)에 COVID-19의 치료를 위한 단계 II 임상 시험을 위해 NMDA에 의해 승인되었다. 인간에 대한 항체의 투여도 또한 우한 후오센산 병원의 윤리 위원회에 의해 승인되었다. 식염수 250ml 중의 300mg의 항-C5a 항체를 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 9일 및 11일째에 정맥내 투여했다. 동맥 혈액 가스(ABG) 테스트, C 반응 단백질(CRP), 혈액 루틴(혈액 RT) 및 간 기능은 정기적으로 결정되었다. SaO₂, 혈압, 심장 박동은 필요에 따라 모니터링했다.

참고문헌

SEQUENCE LISTING <110> InflaRx GmbH <120> Inhibitors of C5a for the Treatment of Corona Virus Infection <130> 680-23 PCT <160> 37 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 74 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Thr Leu Gln Lys Lys Ile Glu Glu Ile Ala Ala Lys Tyr Lys His Ser 1 5 10 15 Val Val Lys Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Cys Val Asn Asn Asp Glu 20 25 30 Thr Cys Glu Gln Arg Ala Ala Arg Ile Ser Leu Gly Pro Arg Cys Ile 35 40 45 Lys Ala Phe Thr Glu Cys Cys Val Val Ala Ser Gln Leu Arg Ala Asn 50 55 60 Ile Ser His Lys Asp Met Gln Leu Gly Arg 65 70 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asn Asp Glu Thr Cys Glu Gln Arg Ala 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser His Lys Asp Met Gln Leu 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Asp Glu Thr Cys Glu Gln Arg 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 His Lys Asp Met Gln 1 5 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IFX-1 CDR3 heavy chain <400> 6 Cys Ala Arg 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<400> 36 Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Asn Thr Phe Ser Gly Tyr Trp 20 25 30 Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 50 55 60 Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95 Arg Arg Gly Leu Tyr Asp Gly Ser Ser Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 37 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 37 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gly Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Val Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Leu Leu Glu Leu Lys 100 105 110

Claims

코로나 바이러스(corona virus) 감염에 의해 야기되거나 이와 관련된 의학적 상태(medical condition)의 치료에 사용하기 위한 C5a 활성의 억제제로서, 상기 의학적 상태가 바람직하게는 (i) 폐렴(pneumonia) 및/또는 (ii) 발열(fever)인, C5a 활성의 억제제.
코로나 바이러스 감염을 앓고 있는 대상체(subject)에서 염증 반응을 감소시키는 데 사용하기 위한 C5a 활성의 억제제.
코로나 바이러스 감염을 앓고 있는 대상체에서 장기 기능, 특히 폐 기능 및/또는 간 기능을 개선하는데 사용하기 위한 C5a 활성의 억제제.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코로나 바이러스가 SARS-CoV, MERS-CoV 및 SARS-CoV-2를 포함하는 그룹으로부터 선택되는, 사용하기 위한 C5a 활성의 억제제.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 SARS, MERS 또는 COVID-19를 앓고 있는, 사용하기 위한 C5a의 억제제.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료가 하기 중 하나 이상을 초래하는, 사용하기 위한 C5a의 억제제:
- C-반응성 단백질의 감소;
- 발열의 감소;
- 혈액에서 림프구 수(lymphocyte count)의 증가;
- ALT/AST의 감소; 및/또는
- 산소 지수(PaO₂/FiO₂)의 증가.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C5a 활성의 억제제가
- C5의 농도를 낮추고;
- C5의 C5a 및 C5b로의 절단을 억제하고;
- C5a의 농도를 낮추고;
- C5a와 C5a 수용체 사이의 결합을 억제하고;
- C5a 수용체의 농도를 낮추고/낮추거나;
- C5a 수용체의 활성을 억제하는, 사용하기 위한 억제제.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C5a 활성의 억제제가 C5에, 또는 C5a에, 또는 C5a 수용체(receptor)에 특이적으로 결합하는 단백질 리간드인, 사용하기 위한 화합물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 리간드가
(i) 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
(iii) 항체 유사 단백질,
(iv) C5a의 억제 변이체(inhibitory variant),
(v) C5a 수용체의 억제 변이체,
(vi) 보체 경로(complement pathway)에 작용하는 단백질; 및
(vii) 펩티드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 사용하기 위한 C5a 활성의 억제제.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C5a 활성의 억제제가 C5에, 또는 C5a에, 또는 C5a 수용체에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드인, 사용하기 위한 화합물.
제10항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 DNA-앱타머(aptamer), D-RNA 앱타머 및 L-RNA 앱타머로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 사용하기 위한 화합물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C5a 활성의 억제제가 C5 단백질 또는 C5a 수용체 단백질의 발현을 감소시키는, 사용하기 위한 화합물.
제12항에 있어서, 상기 C5a 활성의 억제제가 안티센스 DNA, 안티센스 RNA, siRNA 및 miRNA로 이루어진 그룹으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드인, 사용하기 위한 화합물.
제7항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C5a 수용체가 C5aR 및/또는 C5L2인, 사용하기 위한 화합물.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C5a 활성의 억제제가 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 사용하기 위한 화합물:
(a) MEDI-7814, ALXN-1007, 또는 NOX-D21, 또는 이의 항원 결합 단편;
(b) 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 C5a에 대한 결합에 대해 (a) 하에 나타낸 항체 중 하나와 경쟁하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
(c) 에쿨리주맙(Eculizumab), ALXN1210, ALXN5500, 또는 LFG316, 또는 이의 항원 결합 단편;
(d) 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 C5에 대한 결합에 대해 (c) 하에 나타낸 항체 중 하나와 경쟁하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
(e) 코버신(Coversin) 또는 RA101495;
(f) 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 단백질 또는 매크로사이클릭 펩티드(macrocyclic peptide)로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 단백질 또는 매크로사이클릭 펩티드가 C5에 대한 결합에 대해 (e) 하에 나타낸 단백질 또는 펩티드 중 하나와 경쟁하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 단백질 또는 매크로사이클릭 펩티드;
(g) 지무라(Zimura);
(h) 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 앱타머로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 앱타머가 C5에 대한 결합에 대해 지무라와 경쟁하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 앱타머;
(i) AMY-201 또는 미로코셉트(Mirococept);
(j) 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 단백질로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 단백질이 C3b에 대한 결합에 대해 (i) 하에 나타낸 단백질 중 하나와 경쟁하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 단백질;
(k) 비카시오맙(Bikaciomab);
(l) 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 인자 B에 대한 결합에 대해 비카시오맙과 경쟁하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
(m) 람팔리주맙(Lampalizumab);
(n) 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 인자 D에 대한 결합에 대해 람팔리주맙과 경쟁하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
(o) ALN-CC5;
(p) 아바코판(Avacopan) 또는 화학식 II 또는 화학식 III에 따른 화합물; 또는 PMX-53 또는 화학식 IV에 따른 화합물;
(q) 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 C5aR에 대한 결합에 대해 아바코판 또는 PMX-53과 경쟁하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
(r) 클론 S5/1 또는 클론 7H110, 또는 이의 항원 결합 단편; 및
(s) 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 C5aR에 대한 결합에 대해 (r) 하에 나타낸 항체 중 하나와 경쟁하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C5a의 억제제가 인간 C5a의 아미노산 서열 NDETCEQRA(서열번호 2) 및 SHKDMQL(서열번호 3)에 의해 형성된 형태 에피토프(conformational epitope)에 특이적으로 결합하고,
상기 C5a의 억제제가 서열번호 2에 따른 아미노산 서열 내의 적어도 하나의 아미노산, 및 서열번호 3에 따른 아미노산 서열 내의 적어도 하나의 아미노산에 결합하는, 사용하기 위한 C5a의 억제제.
제1항 내지 제9항 또는 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C5a의 억제제가 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고,
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이
(i) 서열번호 6에 제시된 중쇄 CDR3 서열; 또는
(ii) 서열번호 7에 제시된 중쇄 CDR3 서열을 포함하고;
여기서, 상기 중쇄 CDR3 서열이 임의로 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실, 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 포함하는, 사용하기 위한 C5a의 억제제.
제1항 내지 제9항, 제16항 또는 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 모이어티(binding moiety)가 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고,
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이
(iii) 서열번호 8에 제시된 경쇄 CDR3 서열; 또는
(iv) 서열번호 9에 제시된 경쇄 CDR3 서열을 포함하고;
여기서, 상기 경쇄 CDR3 서열이 임의로 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실, 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 포함하는, 사용하기 위한 C5a의 억제제.
제1항 내지 제9항 또는 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 모이어티가 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고,
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이
(v) 서열번호 10에 따른 중쇄 CDR2 서열;
(vi) 서열번호 11에 따른 중쇄 CDR2 서열;
(vii) 서열번호 12에 따른 경쇄 CDR2 서열;
(viii) 서열번호 13에 따른 경쇄 CDR2 서열;
(ix) 서열번호 14에 따른 중쇄 CDR1 서열;
(x) 서열번호 15에 따른 중쇄 CDR1 서열;
(xi) 서열번호 16에 따른 경쇄 CDR1 서열; 또는
(xii) 서열번호 17에 따른 경쇄 CDR1 서열 중 적어도 하나를 포함하고;
여기서, 상기 중쇄 CDR2 서열이 임의로 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실, 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 포함하고;
상기 경쇄 CDR2 서열이 임의로 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실, 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 포함하고;
상기 중쇄 CDR1 서열이 임의로 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실, 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 포함하고;
상기 경쇄 CDR1 서열이 임의로 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실, 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 포함하는, 사용하기 위한 C5a의 억제제.
제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 모이어티가
(i) 서열번호 34에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 및 서열번호 35에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 서열, 또는 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 명시된 경쇄 및 중쇄 CDR1 내지 CDR3 또는 이의 변이체의 서열번호 6, 8, 10, 12, 14 및 16에 따른 아미노산 서열을 포함하는 서열번호 34 및 35와 적어도 90% 아미노산 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 변이체;
(ii) 서열번호 36의 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄 서열 및 서열번호 37에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 서열, 또는 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 명시된 경쇄 및 중쇄 CDR1 내지 CDR3 또는 이의 변이체의 서열번호 7, 9, 11, 13, 15 및 17에 따른 아미노산 서열을 포함하는 서열번호 36 및 37과 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 변이체를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편인, 사용하기 위한 C5a의 억제제.