KR20220157386A - 폴리소르베이트의 검출 방법 - Google Patents

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글락소스미스클라인 인털렉츄얼 프로퍼티 디벨로프먼트 리미티드
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Abstract

본 발명은 제약 제품에서 폴리소르베이트의 검출 방법의 제공에 관한 것이다.

Description

폴리소르베이트의 검출 방법
본 발명은 제약 제품에서 폴리소르베이트의 검출 방법의 제공에 관한 것이다.
폴리소르베이트는 식품 및 생물제약 제품 둘 다에서 통상적으로 사용되는 비-이온성 계면활성제이다. 생물제약 제품에서, 이들은 표면에의 단백질 흡착, 응집 및 입자 형성을 방지하는데 사용될 수 있다. 그러나, 이러한 폴리소르베이트의 분해 산물이 비경구로 사용되는 경우에 주사 부위 자극과 같은 문제를 유발할 수 있다는 우려가 있다. 이러한 사용으로 인해, 폴리소르베이트, 구체적으로 폴리소르베이트 80 (폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노-올레에이트)의 완전성을 모니터링하기 위한 분석 방법의 개발에 큰 관심이 있다. 상업적으로 입수가능한 PS80은 불균질하며, 가장 흔한 공정 관련 아종은 폴리옥시에틸렌 (POE) 기, POE 이소소르비드 모노-에스테르, 및 POE 소르비탄/이소소르비드 디-, 트리-, 테트라-에스테르이고; 따라서, 분석 방법의 개발은 도전적이었다. 여러 방법이 보고되었다.
이들 중 어느 것도 다음을 제공하지 않는다: (1) 특이성 - PS80 모노-에스테르 피크의 면역성은 분해된 샘플에서 정량화를 가능하게 함; (2) 감도, ≤ 20 ppm; (3) 정확도, 95-105%; (4) 정밀도, ≤ 5%; (5) 이동성, 품질 관리 (QC)를 포함; (6) 전통적인 UV-가시광 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 방법과 비슷한 시간과 거의 동일한 비용으로 검증하는 능력; (7) 무손상 및 분해된 PS80 및 관련 아종을 모니터링하는 능력; (8) 단백질-함유 생물제약 제제를 위한 플랫폼 방법으로서 기능하는 능력; (9) 선형도, R2 >0.99; (10) 지방산의 분해; (11) 변환가능한 질량-분광측정법; (12) 유도체화를 이용하지 않고/않거나 (13) 미셀 캡슐화에 의존하는 정량화를 이용하지 않는다.
따라서, 상기 상술된 결함을 해결하고 및/또는 무손상 폴리소르베이트 및/또는 분해된 폴리소르베이트 산물을 검출할 수 있는 개선된 폴리소르베이트 검출 방법을 제공할 필요가 있다.
따라서, 본 발명은 샘플, 예를 들어 단백질을 함유하는 샘플, 예컨대 항원 결합 폴리펩티드(예를 들어, 모노클로날 항체 (mAb))와 같은 제약 단백질 산물의 샘플에서 폴리소르베이트, 예를 들어 무손상 폴리소르베이트 및/또는 분해된 폴리소르베이트 산물을 검출하는 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명의 제1 측면에서,
(i) 단백질을 함유하는 샘플을 유기 양성자성 극성 용매 또는 유기 비양성자성 극성 용매에 노출시킴으로써 단백질을 침전시키는 단계,
(ii) 침전된 샘플을 원심분리하여 단백질을 펠릿화하고 액체 상청액을 수득함으로써 침전된 샘플로부터 단백질을 분리하는 단계,
(iii) 상청액을 크로마토그래피에 적용함으로써 폴리소르베이트를 분리하며, 여기서 크로마토그래피는 상청액을 고정된 시아노 기를 포함하는 고정상 칼럼에 적용하고, 결합된 폴리소르베이트를 이동상 조성 구배를 사용하여 용리시키는 것을 포함하는 것인 단계, 및
(iv) 폴리소르베이트를 확인하기 위하여 발색단-결여 검출기를 사용하여 분리된 폴리소르베이트를 검출하는 단계
를 상기 샘플에 적용하는 것을 포함하는, 단백질을 함유하는 샘플에서 폴리소르베이트, 예를 들어 무손상 폴리소르베이트 및/또는 분해된 폴리소르베이트 산물을 확인하는 방법이 제공된다.
제2 측면에서, 본 발명은
(a) (i) 단백질 샘플을 유기 양성자성 극성 용매 또는 유기 비양성자성 극성 용매에 노출시킴으로써 단백질을 침전시키는 단계,
(ii) 침전된 샘플을 원심분리하여 단백질 또는 펩티드를 펠릿화하고 액체 상청액을 수득함으로써 침전된 샘플로부터 단백질을 분리하는 단계,
(iii) 상청액을 크로마토그래피에 적용함으로써 폴리소르베이트를 분리하며, 여기서 크로마토그래피는 상청액을 고정된 시아노 기를 포함하는 고정상 칼럼에 적용하고, 결합된 폴리소르베이트를 이동상 조성 구배를 사용하여 용리시키는 것을 포함하는 것인 단계, 및
(iv) 폴리소르베이트를 확인하기 위하여 발색단-결여 검출기를 사용하여 분리된 폴리소르베이트를 검출하는 단계
를 포함하는, 상기 단백질 샘플에서 폴리소르베이트를 측정하는 단계;
(b) PS80과 같은 무손상 폴리소르베이트의 수준이 약 10 ppm 내지 약 5000 ppm인 (a)로부터 단백질 샘플(들)을 확인하는 단계;
(c) (b) 단계에서 확인된 상기 단백질(들)의 분리 및 회수 단계
를 포함하는, 예를 들어 다수의 단백질로부터 단백질 샘플(들)을 확인하는 방법을 제공하고, 여기서 상기 확인된 단백질 샘플(들)은 약 10 ppm 내지 약 5000 ppm의 무손상 폴리소르베이트를 함유한다.
또한, 본 발명의 제2 측면의 방법에 의해 수득되거나 또는 수득가능한 단백질 및 의약, 예를 들어 인간 대상체에게 투여하기 위한 제약 제제의 제조에서의 상기 단백질의 용도가 또한 제공된다.
본 발명의 제1 및 제2 측면의 실시양태에서, 제공된 방법은 단백질을 함유하는 샘플, 예를 들어 mAb와 같은 항체 샘플에서 폴리소르베이트 80 (예를 들어 무손상 및/또는 분해된 PS80 폴리소르베이트)을 확인하는 방법이다.
용리와 조합된 침전 및 분리 단계는 샘플 중 폴리소르베이트 산물의 분리를 가능하게 하고, 검출 단계는 상기 무손상 및/또는 분해된 폴리소르베이트 산물, 예컨대 PS80 및/또는 PS60 및/또는 PS40 및/또는 PS20의 검출 및 분석을 가능하게 한다.
본 발명의 제1 및 제2 측면의 한 실시양태에서, 단백질 또는 펩티드를 함유하는 샘플, 예를 들어 본원에 제공된 mAb 샘플과 같은 항체에서 폴리소르베이트를 확인하는 방법은 무손상 및/또는 분해된 산물의, 예를 들어 PS80 및/또는 PS60 및/또는 PS40 및/또는 PS20의 측정을 포함하는, 상기 샘플에 존재하는 폴리소르베이트, 예컨대 PS80 및/또는 PS60 및/또는 PS40 및/또는 PS20의 양의 측정에 사용될 수 있는 정량적 방법이다.
도 1은 PS80에 대한 합성 경로의 마지막 두 단계를 나타낸다.
도 2는 폴리소르베이트에서 가장 흔한 2가지 유형의 분해의 분해 산물을 나타낸다.
도 3은 PS80 모노-에스테르를 정량화하고 4개의 다른 아종 군을 정성적으로/반-정량적으로 모니터링하는 HPLC-CAD 방법을 사용하여 얻은 크로마토그램을 나타낸다.
도 4는 다양한 공급원의 PS80 (실선) 및 블랭크 (점선)에 대한 크로마토그램을 나타낸다.
도 5는 다양한 폴리소르베이트 (실선) 및 블랭크 (점선)에 대한 크로마토그램을 나타낸다.
도 6은 PS80 모노-에스테르의 HPLC-CAD 방법을 사용하여 수득된 크로마토그래피 프로파일을 나타낸다.
도 7은 5, 25, 40, 또는 -70℃에서 21일까지의 샘플에서의 PS80 분해의 동역학을 나타낸다.
도 8은 PS80 모노-에스테르의 분해에 대한 속도 상수 (5, 25 및 40℃에서)의 아레니우스 플롯을 나타낸다.
도 9는 크로마토그램의 오버레이 (200 ppm 표준 용액 (멀티-컴펜디얼 제이.티. 베이커 PS80), 분해된 PS80을 갖는 mAb 샘플, 및 블랭크 용액)를 나타낸다.
본 명세서 내에서, 본 발명은 명확하고 간결한 명세서가 기재될 수 있게 하는 방식으로 실시양태를 참조하여 기재되었다. 실시양태는 본 발명으로부터 벗어나지 않으면서 다양하게 조합되거나 분리될 수 있는 것으로 의도되고 인지되어야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 관련 기술분야 (예를 들어, 세포 배양, 분자 유전학, 핵산 화학, 혼성화 기술 및 생화학에서) 의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 정량적 분석 방법을 위해 표준 기술을 사용하였다.
본 명세서에 인용된, 특허 및 특허 출원을 포함하나 이에 제한되지는 않는 모든 간행물은 완전히 제시된 것처럼 본원에 참조로 포함된다.
"단백질", "폴리펩티드", 및 "펩티드"는 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 폴리펩티드는 천연 (조직-유래) 기원, 원핵 또는 진핵 세포 제제로부터의 재조합 또는 천연 발현일 수 있거나, 또는 합성 방법을 통해 화학적으로 생산될 수 있다. 상기 용어는 1개 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공 화학적 모방체인 아미노산 중합체, 뿐만 아니라 자연 발생 아미노산 중합체 및 비-자연 발생 아미노산 중합체에 적용된다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 지칭한다. 비-천연 잔기는 과학 및 특허 문헌에 잘 설명되어 있고; 천연 아미노산 잔기의 모방체로서 유용한 몇몇 예시적인 비-천연 조성물 및 가이드라인은 아래에서 설명된다. 방향족 아미노산의 모방체는, 예를 들어 D- 또는 L-나필알라닌; D- 또는 L-페닐글리신; D- 또는 L-2 티에닐알라닌; D- 또는 L-1, -2,3- 또는 4-피레닐알라닌; D- 또는 L-3 티에닐알라닌; D- 또는 L-(2-피리디닐)-알라닌; D- 또는 L-(3-피리디닐)-알라닌; D- 또는 L-(2-피라지닐)-알라닌; D- 또는 L-(4-이소프로필)-페닐글리신: D-(트리플루오로메틸)-페닐글리신; D-(트리플루오로메틸)-페닐알라닌: D-p-플루오로-페닐알라닌; D- 또는 L-p-비페닐페닐알라닌; K- 또는 L-p-메톡시-비페닐페닐알라닌: D- 또는 L-2-인돌(알킬)알라닌; 및 D- 또는 L-알킬알라닌으로 대체함으로써 생성될 수 있고, 여기서 알킬은 치환 또는 비치환된 메틸, 에틸, 프로필, 헥실, 부틸, 펜틸, 이소프로필, 이소-부틸, sec-이소틸, 이소-펜틸, 또는 비-산성 아미노산일 수 있다. 비-천연 아미노산의 방향족 고리는 예를 들어 티아졸릴, 티오페닐, 피라졸릴, 벤즈이미다졸릴, 나프틸, 푸라닐, 피롤릴, 및 피리딜 방향족 고리를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "항원 결합 폴리펩티드"는 항원에 결합할 수 있는 항체, 항체 단편 및 다른 단백질 구축물을 지칭한다.
용어 "항체"는 본원에서 가장 넓은 의미로 이뮤노글로불린-유사 도메인 (예를 들어 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE)을 갖는 분자를 지칭하는데 사용되고, 모노클로날, 재조합, 폴리클로날, 키메라, 인간, 인간화, 이중특이적 항체를 비롯한 다중특이적 항체, 및 이종접합체 항체, 단일 가변 도메인 (예를 들어 도메인 항체 (DAB)), 항원 결합 항체 단편, Fab, F(ab')2, Fv, 이황화 결합된 Fv, 단일 사슬 Fv, 이황화 결합된 scFv, 디아바디, TANDABS 등 및 전술한 임의의 것의 변형된 버전을 포함한다 (대안적 "항체" 포맷의 요약에 대해, 문헌 [Holliger and Hudson, Nature Biotechnology, 2005, Vol 23, No. 9, 1126-1136] 참조). 대안적 항체 포맷이 또한 고려되고, 항원 결합 단백질의 1개 이상의 CDR이 적합한 비-이뮤노글로불린 단백질 스캐폴드 또는 골격 상에 배열될 수 있는 대안적 스캐폴드, 예컨대 아피바디, SpA 스캐폴드, LDL 수용체 부류 A 도메인, 아비머 또는 EGF 도메인을 포함한다.
본원에서 상호교환가능하게 사용되는 용어인 완전, 전체 또는 무손상 항체는 대략 150,000 달톤의 분자량을 갖는 이종사량체 당단백질을 지칭한다. 무손상 항체는 공유 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 동일한 중쇄 (HC) 및 2개의 동일한 경쇄 (LC)로 구성된다. 이러한 H2L2 구조는 폴딩되어 'Fab' 단편으로 공지된 2개의 항원-결합 단편 및 'Fc' 결정화가능한 단편을 포함하는 3개의 기능적 도메인을 형성한다. Fab 단편은 아미노-말단의 가변 도메인, 가변 중쇄 (VH) 또는 가변 경쇄 (VL), 및 카르복실 말단의 불변 도메인, CH1 (중쇄) 및 CL (경쇄)로 구성된다. Fc 단편은 쌍을 이룬 CH2 및 CH3 영역의 이량체화에 의해 형성된 2개의 도메인으로 구성된다. Fc는 면역 세포 상의 수용체에 결합함으로써 또는 고전적 보체 경로의 제1 성분인 C1q에 결합함으로써 이펙터 기능을 도출할 수 있다. 5가지 부류의 항체 IgM, IgA, IgG, IgE 및 IgD는 각각 μ, α, γ, ε 및 δ로 불리는 별개의 중쇄 아미노산 서열에 의해 규정되고, 각각의 중쇄는 κ 또는 λ 경쇄와 쌍을 이룰 수 있다. 혈청 중 대다수의 항체는 IgG 부류에 속하며, 인간 IgG의 4종의 이소형으로 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4가 존재하며, 이들의 서열은 주로 힌지 영역에서 상이하다.
본원에 사용된 "단편"은, 단백질 또는 폴리펩티드와 관련하여 사용되는 경우에, 전체 자연 발생 단백질/폴리펩티드의 아미노산 서열의 전부가 아닌 일부와 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드이다. 단편은 "독립적"일 수 있거나, 또는 보다 큰 단백질 또는 폴리펩티드 내에 포함될 수 있으며, 그의 부분 또는 영역을 단일의 보다 큰 단백질/폴리펩티드 내의 단일 연속 영역으로서 형성한다.
용어 "단일 가변 도메인"은 항체 가변 도메인의 특징적인 서열을 포함하는 폴딩된 폴리펩티드 도메인을 지칭한다. 따라서, 이는 완전한 항체 가변 도메인, 예컨대 VH, VHH 및 VL, 및 예를 들어 1개 이상의 루프가 항체 가변 도메인의 특징이 아닌 서열에 의해 대체된 변형된 항체 가변 도메인, 또는 말단절단되거나 N- 또는 C-말단 연장부를 포함하는 항체 가변 도메인, 뿐만 아니라 적어도 전장 도메인의 결합 활성 및 특이성을 보유하는 가변 도메인의 폴딩된 단편을 포함한다. 본원에 정의된 바와 같은 단일 가변 도메인은 상이한 가변 영역 또는 도메인과 독립적으로 항원 또는 에피토프에 결합할 수 있다. "도메인 항체" 또는 "DAB"는 인간 "단일 가변 도메인"과 동일한 것으로 간주될 수 있다. 단일 가변 도메인은 인간 단일 가변 도메인일 수 있지만, 또한 다른 종, 예컨대 설치류 (예를 들어, WO 00/29004에 개시된 바와 같음)로부터의 단일 가변 도메인을 포함하고, 너스 상어 및 낙타류 VHH 낙타류 VHH는 천연적으로 경쇄가 결여된 중쇄 단독 항체를 생산하는 낙타, 라마, 알파카, 단봉낙타 및 구아나코를 비롯한 종으로부터 유래된 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드이다. 상기 VHH 도메인은 당업계에서 이용가능한 표준 기술에 따라 인간화될 수 있고, 상기 도메인은 "단일 가변 도메인"으로 간주된다.
본원에 사용된 용어 "폴리소르베이트"는 폴리소르베이트 80 (PS80), 폴리소르베이트 60 (PS60), 폴리소르베이트 40 (PS40) 및 폴리소르베이트 20 (PS20) 및 그의 분해 산물로부터 선택되는 통상의 무손상 폴리소르베이트 중 어느 하나 (또는 모두)를 지칭한다. 무손상 폴리소르베이트는 모노에스테르로서 존재하는 경우의 폴리소르베이트를 지칭한다. 본 발명의 방법에 의해 검출될 수 있는 폴리소르베이트의 분해 산물은 장쇄 지방산 (예를 들어 팔미트산, 리놀레산, 올레산), 지방산의 POE 에스테르를 포함하는 폴리옥시에틸렌 (POE) 기, 및 단쇄 지방산을 포함한다. 도 2는 폴리소르베이트에서 가장 흔한 2가지 유형의 분해의 분해 산물을 나타낸다.
폴리소르베이트는 통상적으로 식품 및 생물제약 제품 둘 다에서 비-이온성 계면활성제로서 사용된다. 생물제약 제품에서, 이들은 표면에의 단백질 흡착, 응집 및 입자 형성을 방지하는데 사용된다. 그러나, 무손상 폴리소르베이트가 분해되는 경우, 이는 문제가 되는 것으로 공지되어 있으며, 예를 들어 분해된 폴리소르베이트 산물은 제약 제품의 주사제에서 자극을 유발할 수 있고, 또한 샘플, 예를 들어 제약 샘플에서 과도한 탁도를 유발한다. 일반적으로, 약 10 ppm 내지 약 5000 ppm의 무손상 폴리소르베이트가 제약 제품에서 바람직한 양인 것으로 간주된다.
따라서, 폴리소르베이트, 특히 가장 통상적으로 사용되는 폴리소르베이트인 폴리소르베이트 80 (폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노-올레에이트 또는 트윈(Tween) TM 80)의 완전성을 비롯한 이러한 폴리소르베이트를 모니터링하는 분석 방법의 개발에 큰 관심이 있다. 상업적으로 입수가능한 PS80은 불균질하며, 가장 흔한 공정 관련 아종은 폴리옥시에틸렌 (POE) 기, POE 이소소르비드 모노-에스테르, 및 POE 소르비탄/이소소르비드 디-, 트리-, 테트라-에스테르이다. 도 1은 폴리소르베이트 80 (PS80)에 대한 합성 경로의 마지막 두 단계를 나타낸다.
그러나, 무손상 폴리소르베이트, 예컨대 PS80 및 또한 PS60, PS40 및 PS20뿐만 아니라 그의 분해 산물을 검출하기 위한 분석 방법의 개발은 도전과제였으며, 이러한 방법, 특히 단백질-함유 생물제약 제제에 적용될 수 있는 방법에 대한 필요성이 존재한다. 또한, 기관, 예컨대 FDA에 의한 제약상 허용되는 단백질 물질의 방출은 특정 폴리소르베이트 산물을 포함한 규정된 수준의 폴리소르베이트를 함유하는 단백질 물질에 의존한다.
따라서, 본 발명은 제약 제제, 예컨대 단백질을 함유하는 생물제약 제제에서 이러한 폴리소르베이트, 예를 들어 무손상 폴리소르베이트 및/또는 분해된 폴리소르베이트 산물의 확인을 가능하게 하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 단백질 또는 펩티드를 함유하는 생물제약 제제에서 폴리소르베이트의 측정을 가능하게 하는 방법을 제공한다. 본원에 사용된 용어 폴리소르베이트의 "측정"은 상기 폴리소르베이트의 확인 및 또한 정량화를 지칭한다. 측정된 폴리소르베이트는 무손상 및/또는 분해된 폴리소르베이트 산물일 수 있다. 본원에 제공된 방법은 정확하고, 전통적인 HPLC와 유사한 시간 프레임에서 수행될 수 있고, 문제가 될 수 있는 유도체화 또는 미셀 캡슐화의 사용에 의존하지 않기 때문에 유리하다. 유도체화 또는 미셀 캡슐화는 샘플 제조의 복잡성을 증가시킬 수 있고, 정밀도에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 평형 동역학에 좌우될 수 있으며, 신호-대-잡음 비에 부정적인 영향을 미칠 매트릭스에 추가의 성분을 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 제1 측면에서
(i) 단백질을 함유하는 샘플을 유기 양성자성 극성 용매 또는 유기 비양성자성 극성 용매에 노출시킴으로써 단백질을 침전시키는 단계,
(ii) 침전된 샘플을 원심분리하여 단백질 또는 펩티드를 펠릿화하고 액체 상청액을 수득함으로써 침전된 샘플로부터 단백질을 분리하는 단계,
(iii) 상청액을 크로마토그래피에 적용함으로써 폴리소르베이트를 분리하며, 여기서 크로마토그래피는 상청액을 고정된 시아노 기를 포함하는 고정상 칼럼에 적용하고, 결합된 폴리소르베이트를 이동상 조성 구배를 사용하여 용리시키는 것을 포함하는 것인 단계, 및
(iv) 폴리소르베이트를 확인하기 위하여 발색단-결여 검출기를 사용하여 분리된 폴리소르베이트를 검출하는 단계
를 상기 샘플에 적용하는 것을 포함하는, 단백질을 함유하는 샘플, 예를 들어 항체, 예컨대 mAb 샘플에서 폴리소르베이트, 예를 들어 무손상 폴리소르베이트 및/또는 분해된 폴리소르베이트 산물을 확인하는 방법을 제공한다.
용리와 조합된 침전 및 분리 단계는 샘플 내의 폴리소르베이트 산물, 예를 들어 무손상 및 분해된 폴리소르베이트 산물의 분리를 허용하고, 검출 단계는 폴리소르베이트 산물, 예를 들어 무손상 및 분해된 폴리소르베이트 산물, 예컨대 무손상 PS80 및/또는 PS60 및/또는 PS40 및/또는 PS20 및 그의 분해 산물의 검출, 확인 및 정량화를 허용한다. 한 실시양태에서, 단백질 함유 샘플, 예를 들어 항체, 예컨대 본원에 제공된 mAb 샘플에서 무손상 폴리소르베이트를 측정하는 방법은 상기 샘플에 존재하는 무손상 및/또는 분해된 폴리소르베이트 산물, 예컨대 PS80 및/또는 PS60 및/또는 PS40 및/또는 PS20의 양의 측정을 허용하는 정량적 방법이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 예를 들어 이러한 단백질 함유 샘플의 안정성을 평가하기 위해 시간 경과에 따라 샘플, 예컨대 단백질 함유 샘플, 예를 들어 항체, 예컨대 mAb 샘플 또는 이종 치료 유전자를 발현하는 세포 또는 단백질 함유 벡터에서 무손상 폴리소르베이트의 분해를 모니터링하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 단백질 함유 샘플에서 무손상 폴리소르베이트의 양을 측정하기 위한, 예를 들어 이러한 샘플에 존재하는 무손상 PS80 및/또는 무손상 PS60 및/또는 무손상 PS40 및/또는 무손상 PS20의 양을 측정하기 위한 방법의 용도를 제공한다.
제2 측면에서, 본 발명은
(a) (i) 단백질 샘플을 유기 양성자성 극성 용매 또는 유기 비양성자성 극성 용매에 노출시킴으로써 단백질을 침전시키는 단계,
(ii) 침전된 샘플을 원심분리하여 단백질 또는 펩티드를 펠릿화하고 액체 상청액을 수득함으로써 침전된 샘플로부터 단백질을 분리하는 단계,
(iii) 상청액을 크로마토그래피에 적용함으로써 폴리소르베이트를 분리하며, 여기서 크로마토그래피는 상청액을 고정된 시아노 기를 포함하는 고정상 칼럼에 적용하고, 결합된 폴리소르베이트를 이동상 조성 구배를 사용하여 용리시키는 것을 포함하는 것인 단계, 및
(iv) 폴리소르베이트를 확인하기 위하여 발색단-결여 검출기를 사용하여 분리된 폴리소르베이트를 검출하는 단계
를 포함하는, 상기 단백질 샘플에서 폴리소르베이트를 측정하는 단계;
(b) 약 10 ppm 내지 약 5000 ppm인 무손상 폴리소르베이트의 수준을 갖는 (a)로부터의 단백질 샘플(들)을 확인하는 단계;
(c) (b) 단계에서 확인된 상기 단백질(들)의 분리 및 회수 단계
를 포함하는, 예를 들어 다수의 단백질로부터 단백질 샘플(들)을 확인하는 방법을 제공하고, 여기서 상기 확인된 단백질 샘플(들)은 약 10 ppm 내지 약 5000 ppm의 무손상 폴리소르베이트를 함유한다.
본 발명의 제2 측면의 한 실시양태에서, 무손상 폴리소르베이트는 PS80 및/또는 PS60 및/또는 PS40 및/또는 PS20이다.
또한, 본 발명의 제2 측면의 방법에 의해 수득되거나 또는 수득가능한 단백질, 및 또한 의약, 예를 들어 인간 대상체에게 투여하기 위한 제약 제제의 제조에서의 상기 단백질의 용도가 제공된다.
본 발명은 또한 약 10 ppm 내지 약 4000 ppm 또는 내지 약 3000 ppm 또는 내지 약 2000 ppm 또는 내지 약 800 ppm 또는 내지 약 700 ppm의 존재하는 무손상 폴리소르베이트를 함유하는, 본 발명의 제2 측면의 방법으로부터 수득가능하거나 수득된 단백질 (예를 들어 항체), 및 또한 예를 들어 인간 대상체에게 투여하기 위한 제약 제제의 제조에서의 의약에서의 상기 단백질의 용도를 제공한다.
한 실시양태에서, 단백질이 세포 요법에 사용하기 위한 항체 또는 세포 또는 이종 치료 유전자를 발현하는 단백질 함유 벡터인 경우에, 단백질에 존재하는 무손상 폴리소르베이트의 양은 약 10 ppm 내지 약 700 ppm이다. 샘플에 존재하고 본 발명의 방법이 적용될 수 있는 단백질의 농도는 약 5 mg/ml 내지 약 300 mg/ml, 약 5 내지 약 200 mg/ml, 약 5 내지 약 50 mg/ml, 약 5 내지 약 20 mg/ml, 약 5 내지 약 10 mg/ml, 약 10 내지 약 20 mg/ml, 약 15 또는 약 20 mg/ml 내지 약 50 mg/ml일 수 있다.
본 발명의 방법은 임의의 천연 또는 재조합 단백질에 적용될 수 있다. 단백질 샘플은 예를 들어 치료 단백질, 예방 단백질 또는 진단 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 방법은 항원 결합 구축물, 예컨대 항체 또는 항체 단편, 예를 들어 항체의 생물학적 기능적 단편을 포함하는 샘플에 적용될 수 있고, 방법은 또한 이종 치료 유전자를 발현하는 백신 조성물, 세포 또는 단백질 함유 벡터에 적용될 수 있다.
단백질 샘플이 항체인 경우에, 이는 예를 들어 모노클로날 항체 (mAb) 또는 이중특이적 또는 다중특이적 항체 또는 그의 단편일 수 있다. 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체일 수 있다. 단백질이 항체 단편인 경우, 이는 예를 들어 Fab, F(ab')2, Fv, 이황화 결합된 Fv, 단일 사슬 Fv, 이황화 결합된 scFv, 디아바디, TANDABSTM, 항체의 CDR 및 전술한 임의의 것의 변형된 버전일 수 있다.
항체 단편은 또한 단일 가변 도메인 (또는 dAb), 예컨대 인간 VH 또는 VL 단일 가변 도메인, 또는 비-인간 공급원, 예컨대 라마 또는 낙타류, 예를 들어 낙타류 VHH, 예컨대 나노바디(Nanobody)TM (예를 들어 특히 WO 94/04678 및 WO 95/04079에 기재됨)로부터 유래된 단일 가변 도메인일 수 있다. 예를 들어 단백질 스캐폴드의 일부로서 임의의 이들 항체 또는 단일 가변 도메인의 CDR의 사용이 또한 고려된다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 단백질 샘플은 수성 매질 중 액체 또는 현탁액 형태일 수 있거나, 또는 이들은 예를 들어 동결 건조된 다음, 수성 매질 중에서 재구성될 수 있다. 단백질 샘플은 상기 단백질 및 물 이외에 추가의 희석제, 예를 들어 제약상 허용되는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 제약상 허용되는 희석제의 예는 용매, 예컨대 물, 염화나트륨 용액, 당, 아세테이트와 같은 완충제, 염화나트륨과 같은 염, 및/또는 다른 부형제를 포함한다. 한 실시양태에서, 완충제는 아세테이트 및 시트레이트이다.
본 발명의 방법은 단백질 함유 액체 샘플, 예컨대 액체 생물제약 제제, 예를 들어 mAb 제제에서 폴리소르베이트, 예를 들어 무손상 폴리소르베이트 및 폴리소르베이트의 분해된 종, 예를 들어 PS80 및/또는 PS60 및/또는 PS40 및/또는 PS20을 검출하는데 특히 유용하다.
본 발명의 방법은 또한 올리고뉴클레오티드를 포함하는 샘플, 세포 요법을 위한 조작된 세포 및 또한 인간 대상체에게 투여하기 위한 치료 유전자를 함유하는 조작된 벡터 (예를 들어 바이러스 벡터)와 같은 유전자 요법 산물에 적용될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 화학 물질 (NCE)인 소분자를 포함하는 샘플에서 폴리소르베이트를 측정하는데 사용될 수 있고, 이러한 NCE 샘플이 단백질을 포함하지 않는 경우에는, 단백질 침전이 생략될 수 있고, 유기 양성자성 극성 용매 또는 유기 비양성자성 극성의 양이 조정될 수 있다.
본 발명의 방법은 pH 값이 방법의 성능에 중요하지 않기 때문에 넓은 범위의 pH, 예를 들어 약 pH 5 내지 약 pH 10, 또는 약 pH 6 내지 약 pH 8에 걸쳐 수행될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 분석된 단백질 샘플은 약 pH 6.0 내지 약 pH 8.0의 pH, 예를 들어 약 7.4 내지 약 6.8의 pH를 가질 수 있다.
단백질 침전 단계에 사용하기 위한 유기 양성자성 극성 용매는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 본원에 사용된 용어는 불안정한 양성자를 함유하고 이온화가능한 유기 용매를 지칭한다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 이러한 용매의 예는 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 예를 들어 메탄올, 에탄올 및 이소프로필 알콜 (IPA)을 포함한다. 예를 들어, 단백질이 항체인 경우, 메탄올, IPA 또는 아세톤이 단백질 침전 단계에 사용될 수 있다.
단백질 침전 단계에 사용하기 위한 유기 비양성자성 극성 용매는 또한 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 본원에 사용된 용어는 불안정한 양성자를 함유하지 않는 유기 용매를 지칭한다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 이러한 용매의 예는 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 예를 들어 아세톤, 테트라히드로푸란 (THF) 및 아세토니트릴을 포함한다.
방법은 광범위한 농도의 용매에 걸쳐 수행될 수 있고, 방법이 항체를 포함하는 샘플에 대해 수행될 때, 부피/부피 희석은 약 1부 샘플 대 약 5, 9 또는 약 19부 용매일 수 있다.
원심분리 단계는 단백질 펠릿을 수득하기에 충분한 속도 및 시간으로 수행될 수 있고, 예를 들어 적어도 약 10,000 rpm에서 적어도 약 10분 동안 수행될 수 있다.
분리 단계는 칼럼 크로마토그래피 방법, 예를 들어 역상 매질 또는 혼합 모드 체류 크로마토그래피를 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 혼합 모드 크로마토그래피는 2종 이상의 체류 메카니즘, 예를 들어 정상 상, 양이온 교환 및 음이온 교환의 병용을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 방법의 분리 단계는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법을 사용하여 역상 크로마토그래피 칼럼 상에서 수행될 수 있고, 여기서 상기 칼럼은 C3 이상, 예를 들어 C4 내지 약 C18 이하인 탄소 쇄를 갖는 기를 포함한다.
한 실시양태에서, 칼럼은 고정된 시아노 기를 포함하고, 예를 들어 정지상 상에 고정된 시아노 기를 포함하는 역상 크로마토그래피 칼럼이 사용된다. 시아노 기는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, -CN 기를 함유하는 임의의 화학적 화합물이다. 임의의 시아노 기가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 유용하게 사용될 수 있는 CN 기를 포함하는 칼럼은 애질런트 조르박스(Agilent Zorbax) SB300-CN이고, 애질런트 조르박스 SB300-CN, 페노메넥스 루나(Phenomenex Luna) CN, 또는 애질런트 인피니티랩 포로쉘(Agilent InfinityLab Poroshell) 120 EC-CN을 포함한다.
칼럼은 예를 들어 약 80 옹스트롬 이상의 세공 크기를 갖는 실리카 비드 칼럼일 수 있다. 한 실시양태에서, 세공 크기는 약 120 내지 약 300 옹스트롬 크기이다. 예를 들어 약 300 옹스트롬의 세공 크기가 사용될 수 있다. 적합한 실리카 칼럼의 예는 애질런트 조르박스 SB300-CN, 페노메넥스 CN, 또는 애질런트 인피니티랩 포로쉘 120 EC-CN을 포함한다. 한 실시양태에서, 사용된 칼럼은 애질런트 조르박스 SB300-CN, 3.5 um, 150 x 4.6 mm (애질런트 캄파니(Agilent Co.), 미국 캘리포니아주 산타 클라라로부터 입수가능함)이다. 칼럼은 가열될 수 있고, 예를 들어 칼럼의 온도는 약 20℃ 내지 약 80℃, 또는 약 40℃ 내지 약 60℃ 또는 약 50℃일 수 있다.
한 실시양태에서, 용리 단계는 구배 분리된 이동상을 사용하여 수행되고, 이는 예를 들어 A 및 B의 구배 분리된 이동상일 수 있다. 한 실시양태에서, A 및 B의 구배 분리된 이동상이 사용되며, 여기서 A는 H2O에 산 또는 아세트산암모늄의 0.1% 내지 약 10% 혼합물이고, 산은 트리플루오로아세트산 (TFA), 포름산, 아세트산, 디플루오로아세트산으로부터 선택될 수 있고, B는 메탄올, 이소프로판올 또는 아세토니트릴일 수 있다. 한 실시양태에서, H2O에 0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA)의 혼합물인 A 및 B의 구배 분리된 이동상이 사용되고, B는 메탄올 또는 아세토니트릴이다. A 및 B의 구배 분리된 이동상은 하기 표 1에 상술된 바와 같이 수행될 수 있다.
<표 1>
Figure pct00001
본 발명의 방법에 사용되는 검출기는 발색단-결여 검출기이고, 이러한 검출기는 검출용 샘플에 발색단이 결여된 경우에 기능하는 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 검출기는 증발 광 산란 검출기일 수 있거나, 또는 질량 분광측정법이 검출에 사용될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)가 본 발명의 방법에서 검출기로서 사용되며, 이는 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)와 함께 사용되고, 비-휘발성 및 반-휘발성 분석물에 고-전압 코로나 와이어에 의해 하전된 질소 기체를 충전함으로써 작동하는 검출기이다. 이어서, 하전된 분석물 입자는 고-이동성 종 (즉, 용매)을 제거하는 이온 트랩을 통과하고, 수집기로 계속 이동하며, 여기서 이들은 민감한 전위계에 의해 측정된다. 사용될 수 있는 CAD의 예는 코로나 베오(Corona Veo) (미국 매사추세츠주 월섬의 써모(Thermo)로부터 입수가능함), 코로나 베오 RS (미국 매사추세츠주 월섬의 써모로부터 입수가능함), 및 반퀴쉬(Vanquish) (미국 매사추세츠주 월섬으로부터 입수가능함), 코로나 울트라(Corona Ultra) 및 울트라 RS (미국 매사추세츠주 월섬의 써모로부터 입수가능함), 코로나 플러스(Corona Plus) (미국 매사추세츠주 월섬의 써모로부터 입수가능함)를 포함한다.
CAD가 제공하는 특징 중 하나는 하전된 단편을 생성하는 질량 분광측정법과 달리, 분석물의 표면을 하전시킴으로써 무손상 종을 측정하는 능력이다. 추가로, 유사한 표면적 및 밀도를 갖는 분석물에 대해, 반응은 유사하다. 마지막으로, 매우 휘발성인 용리액이 사용되는 경우, CAD 방법은 또한 매우 민감 (서브-나노그램)할 수 있다.
CAD는 쉽게 작동되지만, 표준 HPLC-UV/Vis 분석 방법의 개발에 추가의 고려사항이 있다. 이들은 다음을 포함한다: (1) 유출되지 않는 칼럼을 선택하는 단계; (2) 낮은 재현가능한 기준선을 위한 이동상에서의 고순도 용매의 이용; 및 (3) 오염물로부터의 간섭의 더 큰 가능성으로 인한 유리제품 및 플라스틱의 세정. 다이오드 어레이 또는 질량 분광계 (MS) 검출을 사용할 때와 같이 피크 순도를 식별할 방법이 없기 때문에 CAD를 사용할 때 특이성을 달성하는 것이 중요하다. 또한, 특이성이 달성되지 않으면, 관찰된 신호는 단순히 UV-Vis 분광광도법에서와 같은 반응의 합이 아니고, 반응의 차이는 이동상의 성분에 대한 분석물의 전하, 표면적, 밀도, 및 휘발성의 차이에 의해 종종 복잡해짐을 유의해야 한다. 이러한 이유로, CAD는 PS80의 분석을 위한 검출기로서 매우 적합하다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 사용되는 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)는 코로나 베오(Corona Veo) RS (미국 매사추세츠주 월썸의 써모로부터 입수가능함)이다
CAD를 사용하여 수행된 검출 단계는 선택된 블랭크 용액(들)을 사용하여 기준선이 수득되고 무손상 폴리소르베이트, 분해 산물뿐만 아니라 샘플 중 단백질 및 부형제에 대한 피크 면적을 함유하는 크로마토그램을 수득한다. 곡선하 면적 계산을 사용한 피크 면적의 평가는 폴리소르베이트, 예컨대 PS80, 및/또는 PS60, 및/또는 PS40 및/또는 PS20 및 그의 분해 산물의 정량화를 가능하게 한다. 한 실시양태에서, 방법은 PS80, 예를 들어 무손상 및 분해된 PS80의 확인을 가능하게 한다.
본 발명자들이 본 발명의 방법을 사용한 분리를 언급하는 경우, 이는 무손상 폴리소르베이트 피크 (즉, 모노에스테르)가 올레산 피크로부터 분해되어야 함을 의미한다. 올레산 피크와 무손상 폴리소르베이트 모노스터 피크 사이의 해상도는 1.5 이상이다. 다른 피크는 단순히 서로 구별가능할 필요가 있다. 추가적으로 한 실시양태에서, 약 3 면적% 초과의 무손상 폴리소르베이트 (즉, 모노에스테르)의 체류 시간에서의 간섭 피크가 존재하지 않는다는 특이성 요건이 존재한다. 한 실시양태에서, 본 발명은
(i) 단백질을 함유하는 샘플을 메탄올 또는 IPA에 노출시킴으로써 단백질을 침전시키는 단계,
(ii) 침전된 샘플을 원심분리하여 단백질 또는 펩티드를 펠릿화하고 액체 상청액을 수득함으로써 침전된 샘플로부터 단백질을 분리하는 단계,
(iii) 상청액을 고정된 시아노 기를 포함하는 약 300 옹스트롬의 세공 크기를 갖는 실리카 칼럼 상의 역상 HPLC에 적용하고, A 및 B로 이루어진 이동상 조성물 구배를 사용하여 용리시킴으로써 폴리소르베이트를 분리하는 단계이며, 여기서 A는 H2O에 0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA)의 혼합물이고, B는 메탄올 또는 아세토니트릴인 단계,
(iv) 폴리소르베이트 산물을 확인하기 위하여 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 분리된 폴리소르베이트를 검출하는 단계
를 포함하는, 단백질을 함유하는 샘플 (예를 들어, 항체 샘플)에서 폴리소르베이트를 확인하는 방법을 제공한다.
실시예:
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 추가로 기재된다. 이들 실시예는 단지 본 발명의 다양한 측면을 예시하기 위한 것이며, 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1: (i) PS80 모노-에스테르를 정량화하는 능력을 갖는 본 발명의 방법에 따른 신규 HPLC-CAD 분석, 및 (ii) 증발 광 산란 검출을 사용하는 변형된 HPLC 방법 - HPLC-ELSD 방법을 통한 mAb 약물 제품에 존재하는 PS80 및 그의 아종의 측정의 비교.
사용된 시약 및 방법은 하기와 같다:
멀티-컴펜디얼 제이.티. 베이커(multi-compendial J.T. Baker) PS80은 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific) (미국 조지아주 아틀란타, 02-003-654)으로부터 구입하였다. PS80의 2종의 공급원은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) (미국 미주리주 세인트 루이스)로부터 구입하였다: (1) 천연-색상 플라스틱 용기 (파트 #P1754-25ML)에 보관된 PS80, 및 (2) 호박색 유리 용기 (파트 # 59925-100G)에 보관된 PS80. 매우 정제된 PS80을 크로다 헬스 케어(Croda Health Care) (미국 뉴저지주 에디슨, SR48833)로부터 구입하였다. 올-올레에이트 ChP-부합 PS80은 NOF (미국 뉴욕주 화이트 플레인스), 비-GMP PS80은 POLO80(HX2) 19B803364로부터 구입하였다. 폴리소르베이트 60은 USP 참조 표준물 (미국 메릴랜드주 록빌, 154794)로부터 구입하였다. 폴리소르베이트 40은 피셔 사이언티픽 (미국 조지아주 애틀랜타, AC334142500)으로부터 구입하였다. 올레산은 시그마-알드리치 (미국 미주리주 세인트 루이스, 75090-5ML)로부터 구입하였다. 리놀레산은 피셔 사이언티픽 (미국 조지아주 아틀란타, AC215040250)으로부터 구입하였다. 팔미트산은 엠피 바이오메디칼즈(MP Biomedicals) (미국 캘리포니아주 산타 아나, 100905-10G)로부터 구입하였다. 팔미톨레산은 시그마-알드리치 (미국 미주리주 세인트 루이스, 76169)로부터 구입하였다. 크로마토그래피 (LC-MS 또는 GC) 등급 메탄올은 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific) (미국 조지아주 애틀란타, A456-4) 또는 VWR (허니웰/버딕 앤드 잭슨(Honeywell/Burdick and Jackson), GC 등급, ≥ 99.9% 순도, BJGC 230-4)로부터 구입하였다. 밀리-큐(Milli-Q) 물 정제 시스템 (밀리포어 코포레이션(Millipore Corporation), 미국 매사추세츠주 벌링턴)을 사용하여 초순수 물 (밀리큐 물)을 생성하였다. 트리플루오로아세트산 (TFA)은 시그마-알드리치 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재, 91707-10x1 mL)로부터 구입하였다. 다른 침전 용매 (이소프로판올, 아세톤, 테트라히드로푸란 (THF))는 크로마토그래피 등급이었고, 시그마-알드리치로부터 구입하였다. HPLC-ELSD 방법을 위해, HPLC-등급 메탄올 (646377-4L) 및 아세토니트릴 (439134-4L)을 시그마-알드리치 (미국 미주리주 세인트 루이스)로부터 구입하였다. 허니웰 플루카 포름산 (94318-250ML)은 피셔 사이언티픽 (미국 조지아주 애틀랜타, AC334142500)으로부터 구입하였다.
사용된 기기 및 분석 조건은 하기와 같다:
단백질 침전 및 PS80 추출:
신규 HPLC-CAD 분석 방법의 경우, 이를 하기와 같이 수행하였다:
주사 전에 단백질 [즉, mAb 약물 제품]을 제거하기 위해, 단백질을 침전 용매 (메탄올, 이소프로판올, 및/또는 아세톤)를 통해 침전시켰다. 추가로, 침전을 사용하여 임의의 잠재적인 단백질-PS80 상호작용을 파괴하고, 리파제 또는 에스테라제에 의해 발생하는 임의의 분해를 억제하였다. 일부 폴리소르베이트 종의 제거로 인해 여과는 실행가능한 옵션이 아니었다. 따라서, 침전 용매 900 μL를 사전-행군 (메탄올 또는 침전 용매 사용) 1.5 mL 에펜도르프(Eppendorf) 안전-잠금 튜브 (미국 뉴욕주 하푸지, 022363204) 내의 샘플 100 μL에 첨가하였다. 이어서, 샘플 제제를 볼텍싱에 의해 짧게 (~5초) 혼합하고, 14,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. PS80 종 및 지방산은 상청액에 가용성으로 남아있었다. 최소 60 μL의 상청액을 300 μL 삽입물이 구비된 HPLC 바이알로 옮겼다.
100 ± 10 mg의 멀티-컴펜디얼 제이.티. 베이커 PS80을 100 mL 클래스 A 부피 플라스크로 칭량하고, 메탄올로 부피로 희석함으로써 1,000 ppm PS80 원액 표준 용액을 제조하였다. 100 μL의 밀리큐 물, 20 μL의 1,000 ppm PS80 원액 표준 용액, 및 880 μL의 메탄올을 사전-헹군 (침전 용매 사용) 1.5 mL 에펜도르프 튜브에서 볼텍싱에 의해 혼합함으로써 20 ppm PS80 작업 표준 용액을 제조하였다. 따라서, 표준에 대한 최종 희석제 조성 (90% 침전 용매: 10% 밀리큐 H2O/수성)은 샘플의 것과 동일하였다. PS60, PS40 및 PS20 용액을 동일한 방식으로 제조하였다.
20 ppm PS80 및 5 ppm 올레산 원액 표준 용액을 함유하는 해상도 체크 용액을 제조하였다. 유기 용매 898 μL, 물 100 μL, 및 1,000 ppm PS80 원액 표준 용액 2 μL를 혼합함으로써 민감성 용액을 제조하였다. mAb 제제 완충제를 벌크로 제조하고, 분취하고, 분석일까지 -70℃에서 보관하였다. 20 ppm PS80 제제 완충제 제제를 LC-MS 또는 GC 등급 메탄올로 희석함으로써 제조하였다. 원심분리 단계는 단백질이 결여된 샘플 제제에 요구되지 않았다.
열적으로 스트레스를 받은 샘플의 경우, mAb/단백질-함유 제제의 다중 바이알을 -70, 5, 25 및 40℃에서 3주 동안 인큐베이션하고, 바이알을 각각의 시점 (초기, 1, 2, 3, 4, 7, 14 및 21일)에서 오븐으로부터 제거하고, 분석 시점까지 -70℃에서 동결시켰다.
변형된 HPLC-ELSD 분석 방법의 경우, 이를 하기와 같이 수행하였다:
의심되는 PS80-단백질 상호작용 및 임의의 효소적 분해의 정지로 인해, 단백질을 물로 희석하는 대신에 메탄올로 침전시켰다. 단백질을 침전시키고 PS80을 추출하기 위해, 800 μL의 유기 용매를 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브 내의 200 μL의 샘플에 첨가하고 볼텍싱하여 혼합하였다. 혼합 후, 샘플을 10,000 rpm에서 30분 동안 5℃에서 원심분리하였다. 원심분리 후, 200 μL의 상청액을 300 μL 삽입물이 장착된 HPLC 바이알로 옮겼다.
샘플 중 PS80 함량의 정량화를 보정 곡선의 제조를 통해 달성하였다. HPLC-ELSD 검출기의 성질로 인해, 표준 곡선의 매트릭스는 샘플을 대표해야 한다. 대표적인 매트릭스를 달성하기 위해, 500 mg의 멀티-컴펜디얼 제이.티. 베이커 PS80을 50.0 mL 저 화학선 클래스 A 부피 플라스크로 칭량하고, HPLC 등급 메탄올로 부피로 희석하여 10,000 ppm PS80 원액을 제조하였다. 이어서, 0.5 mL의 10,000 ppm PS80 원액을 10.0 mL 부피 플라스크에 첨가하고, HPLC 등급 메탄올로 부피가 되게 하여 500 ppm 원액을 제조하였다. 500 ppm 원액을 사용하여 10, 25, 50, 100, 150, 200, 및 250 ppm의 예상 PS80 농도로 메탄올/물 용액 (80:20 v/v) 중 보정 표준물을 제조하였다. HPLC 등급 메탄올로 희석하여 20 ppm PS80 제제를 제조하였다. 원심분리 단계는 단백질이 결여된 제제에 대해서는 수행하지 않았다. 샘플 크로마토그램은 도 9에 제공된다. 요약하면, 도 9는 변형된 HPLC-ELSD 방법으로 수집된 크로마토그램 (200 ppm 표준 용액 (멀티-컴펜디얼 제이.티. 베이커 PS80), 분해된 PS80을 갖는 mAb 샘플, 및 블랭크 용액)의 오버레이를 보여준다. 도 9에서, 200 ppm 표준물은 가장 큰 피크를 갖고, -20 샘플은 중간의 더 작은 피크를 갖는다.
신규 HPLC-CAD 방법:
애질런트 HPLC 1260 시스템 (미국 캘리포니아주 산타 클라라)은 2원 용매 매니저, 23℃로 설정된 샘플 매니저, 50℃로 설정된 칼럼 오븐 및 전하 에어로졸 검출기 (CAD) 베오(Veo) RS (써모, 미국 매사추세츠주 월섬)를 포함하였다. CAD를 80 cm의 튜빙 (애질런트, 01078-87305)을 통해 분석 칼럼에 직접 연결하고, 이를 180 mm의 튜빙 (애질런트, G1313-87305)으로 3 μL 펠티어에 직접 연결하였다. HPLC 칼럼 가열기를 표준 튜빙을 통해 HPLC 오토샘플러에 연결하고, UV-VIS 및 칼럼 스위칭 밸브 둘 다를 우회하였다.
분석 칼럼은 애질런트 테크놀로지스 (미국 델라웨어주 윌밍톤)로부터의 조르박스 SB300-CN (150 mm x 4.6 mm, 3.5 μm 300 Å, 863973-905)이었다. 밀리큐 물 중 0.1% v/v TFA (MP A) 및 100% LC-MS 또는 GC 등급 메탄올 (MP B)로 구성된 휘발성 이동상 (MP)을 사용하였다. 추가로, 이동상은 1.2 mL/분으로 35% MP A: 65% MP B에서 유동시키고 CAD가 상기 열거된 파라미터로 10 mV 미만의 기준선 수준을 갖는 것을 보장함으로써 청결도에 대해 사전-스크리닝하였다. PS80 아종의 분리는 구배 용리 (밀리큐 물 중 0.1% TFA: 0분-100%; 1분-100%; 3분-50%; 8분-50%; 27분-5%; 30분-5%; 및 30.1분-100%)에 의해 1.2 mL/분의 유량으로 달성하였다. 방법의 총 실행 시간은 40분이었다. 주입 부피는 30.0 μL였다. 써모 베오 RS CAD를 하기 설정으로 작동시켰다: 증발 온도, 60℃; 전력 함수, 1.00; 출력 오프셋, 0%; 필터, 5.0초; 범위 100 pA. 사내 질소 공급을 사용하였다. CAD 유사체 신호를 e-SAT/IN 모듈 (워터스, 미국 매사추세츠주 밀포드, 668000230)의 사용을 통해 디지털 신호로 전환시켰다.
변형된 HPLC-ELSD 방법:
이 방법은 휴이트 및 코폴루의 방법으로부터 변형된 방법이다. 애질런트 HPLC 1100 시스템 (미국 캘리포니아주 산타 클라라)은 2원 용매 매니저, 25℃로 설정된 샘플 매니저, 30℃로 설정된 칼럼 오븐 및 1260 인피니티 G4260B 증발 광 산란 검출기 (ELSD, 애질런트 테크놀로지스, 미국 델라웨어주 윌밍톤)를 포함하였다. ELSD를 분석 칼럼에 직접 연결하고, 이를 3 μL 펠티어에 직접 연결하였다. HPLC 칼럼 가열기를 표준 튜빙을 통해 HPLC 오토샘플러에 연결하고, UV-VIS 및 칼럼 스위칭 밸브 둘 다를 우회하였다.
분석 칼럼은 워터스 코포레이션(Waters Corporation) (미국 매사추세츠주 밀포드)으로부터의 오아시스® MAX (20 mm x 2.1 mm, 30 μm 80 Å, 파트 #186002052)였다. 밀리큐 물 중 2% v/v 포름산 및 이소프로판올 중 2% v/v 포름산으로 구성된 휘발성 이동상을 사용하였다. 분리는 1.0 mL/분의 유량으로 구배 용리 (밀리큐 물 중 2% 포름산은 0분-90%; 1분-80%; 3.4분-80%; 3.5분-0%; 4.5분-0%; 4.6분-90%; 및 10분-90%였음)에 의해 달성되었고, 유동은 실행의 처음 4분에 ELSD로부터 방향전환되었다. 주입 부피는 50.0 μL였다. 애질런트 1260 인피니티 G4260B ELSD를 하기 설정으로 작동시켰다: LED, 10; 이득 (PMT), 2; 평활 (Smth), 1; 데이터 출력, 80 Hz; 증발 온도, 80℃; 네뷸라이저 온도, 50℃; 기체 유동 (SLM), 1. 사내 질소 공급을 사용하였다. CAD 유사체 신호를 e-SAT/IN 모듈 (워터스, 미국 매사추세츠주 밀포드, 668000230)의 사용을 통해 디지털 신호로 전환시켰다.
신규 HPLC-CAD 분석 방법을 위해, 데이터 분석, 적분 및 계산을 하기와 같이 수행하였다:
삼중 제제의 PS80 모노-에스테르 농도의 평균을 보고하였다. 변형된 HPLC-ELSD 방법과 비교하기 위해 총-에스테르 (모노-에스테르 및 멀티-에스테르)를 정량화하기 위해, 선형성 제제에서 PS80 모노-에스테르 및 멀티-에스테르의 면적을 분류함으로써 총-에스테르에 대해 보정 곡선을 만들었다. 따라서, HPLC-CAD 방법에서의 총-에스테르 면적은 변형된 HPLC-ELSD 방법에서의 단일 피크와 유사하고; POE 기는 단일 피크에 포함되지 않는데, 이는 밸브 스위치가 각각의 주입의 처음 4분 동안 폐기물로 전환되는 경우에 이들이 용리되기 때문이다.
아레니우스 동역학 모델링을 사용하여 PS80 분해 속도를 평가하고, 안정성 또는 활성화 에너지 (Ea)를 추정하였다. PS80 모노-에스테르의 가수분해성 분해는 이전에 기재된 바와 같이 유사 1차인 것으로 가정하였다. 속도 상수는 동적 점도의 변화로 인한 유의한 효과가 없다는 가정 하에, 농도 대 시간의 자연 로그의 플롯의 기울기로부터 결정하였다. 모든 선형 플롯에 대해, 기울기의 상대 오차 분석을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다:
Figure pct00002
식 1
여기서, n은 데이터 점의 수이고, a는 기울기이고, b는 y-절편이다.
변형된 HPLC-ELSD 분석 방법을 위해, 데이터 분석, 통합 및 계산을 엠파워(Empower) 3을 사용하여 수행하여 배치 데이터 처리가 체류 시간, 피크 면적 및 다른 크로마토그래피 성능 지수를 수득하도록 하였다. 유사하게, 신규 HPLC-CAD 방법을 위해, 데이터 분석, 통합 및 계산을 엠파워 3을 사용하여 수행하여 배치 처리 데이터 처리가 체류 시간, 피크 면적, 해상도, S/N, 및 다른 크로마토그래피 성능 지수를 수득하도록 하였다.
결과:
상기 기재된 신규 HPLC-CAD 방법은 PS80 모노-에스테르를 정확하고 명확하게 정량화하고, 정성적으로/반-정량적으로 아종의 4개의 다른 군을 모니터링하는 것으로 밝혀졌다. 단순성을 위해, 본 발명자들은 CAD 반응이 비선형일지라도 선형인 농도 범위를 선택하였다. 보정 곡선은 또한 파워-함수 알고리즘을 적용함으로써 선형화될 수 있지만; 그러나, 기준선의 재현성 없이, 이러한 알고리즘이 항상 참을 유지하는 것은 아닐 수 있다.
매트릭스 간섭은 (1) PS80-무함유 IgG 약물 제품; 및 (2) 완전히 분해된 (<정량 한계 (LOQ)) PS80 모노-에스테르를 갖는 mAb 샘플 (표 2 및 하기 논의 참조)에서의 스파이킹된 PS80의 회수를 평가함으로써 평가하였다. 분해된 샘플은 트레할로스, 메티오닌, 아르기닌, 히스티딘, mM EDTA 및 PS80을 함유하는 수성 완충제에 단백질을 함유하였다. 다른 샘플은 트레할로스, 시트레이트, EDTA 및 PS80을 함유하는 수성 완충제에 단백질을 함유하였다. 분해된 샘플에서의 특이성을 평가하기 위해, 지방산 (리놀레산, 팔미트산, 올레산 및 팔미톨레산)을 또한 20 ppm PS80 작업 표준 용액에 5 ppm의 농도로 스파이킹하였다 (도 3 참조). 요약하면, 도 3은 PS80 모노-에스테르를 정량화하고, 4개의 다른 아종 군을 정성적으로/반-정량적으로 모니터링하는 HPLC-CAD 방법을 이용하여 얻은 크로마토그램을 도시한다. 이는 블랭크 (점선)과 10 ppm 지방산으로 스파이킹된 20 ppm PS80 (멀티-컴펜디얼 제이.티. 베이커) 표준 용액 (실선)의 오버레이를 도시한다. 피크: 1 = 비-보유 제제 완충제 성분 (트레할로스, 아미노산, EDTA, 용매 중 염 불순물, 및/또는 샘플 잔류물); 2 = POE 기; 3 = 팔미톨레산; 4 = 리놀레산; 5 = 팔미트산; 6 = 올레산; 7 = PS80 모노-에스테르 (소르비탄 및 이소소르비드); 8 = 디-에스테르; 9 = 트리-에스테르; 10 = 테트라-에스테르; *존재하는 경우, 에펜도르프 튜브로부터의 오염물. PS80 피크의 확인은 이전에 보고된 LC-MS 결과 [17, 30]와 일치하고, 분석물의 상대 소수성을 기준으로 분석물의 예상된 용리 순서에 의하는 것으로 가정된다.
mAb 약물 제품으로의 방법 정성화를 완료하였다.
이는 정밀도, 선형성, 정확도, 특이성, 및 LOQ로 구성되었다 (표 2). 각각의 주사에 대한 CAD 반응을 사용하여, 평균 농도, 표준 편차 및 상대 표준 편차를 계산하였다. 정밀도는 2 내지 3회 반복 제조의 평균 분석을 통해 평가하였다. 정밀도를 또한 2명의 분석가 사이에 5개의 분석 경우에 대한 중복 주사의 반복성 분석을 통해 제제 완충제 (또는 분석 대조군)를 사용하여 평가하였다. 중간 정밀도는 한 시스템에 대해 2회의 독립적인 분석 경우를 수행하는 한 분석가와, 두 번째 시스템에 대해 3회의 독립적인 분석 경우를 수행하는 두 번째 분석가에 의해 결정되었다.
<표 2> 제제 완충제 및 mAb 제제 중 PS80 모노-에스테르의 정확도, 반복성, 중간 정밀도 및 선형성.
Figure pct00003
mAb 약물 제품을 삼중으로 시험하고, 결과를 통계적으로 분석하여 평균 농도, 표준 편차 및 상대 표준 편차를 결정하였다.
선형성은 2명의 분석가로 5회의 독립적인 분석 경우의 복제를 통해 평가하였다. 각각의 곡선의 결정 계수 (R2)를 선형 회귀에 의해 결정하였다. 정확도는 스파이크 회수 접근법을 사용하여 결정하였다. 2명의 분석가는 제제 중 PS80이 없는 샘플에 20 ppm PS80을 5회 분석 경우에 삼중으로 도입하였다. 이러한 제제를 또한 사용하여 특이성을 확인하였다. 특이성은 또한 해상도 체크 용액 중 PS80 모노-에스테르 및 올레산 피크의 해상에 의해 및 90% 유기 용매/10% 물 블랭크 주입 중 PS80 모노-에스테르의 용리 윈도우 (± 0.5분) 내에 간섭 피크가 없음을 보장함으로써 평가하였다. CAD는 보편적인 검출기이고 때때로 작은 미량의 오염물질을 흡수하기 때문에, 피크 특이성은 표준 면적에 대해 2% 면적 초과의 피크가 관찰되지 않은 것으로 입증되었다. 신호-대-잡음 비 (S/N)는 2 ppm PS80 용액에 대해 ≥ 10인 것으로 추정되었다.
<표 3> PS80 모노-에스테르의 중량-조정된 피크 면적.
Figure pct00004
PS80의 다양한 공급원 및 유형을 이 방법으로 시험하였다 (표 3). 도 4에 의해 입증된 바와 같이, 각각의 PS80 공급원의 크로마토그램은 시각적으로 대등하였다. 요약하면, 도 4는 PS80 (실선) 및 블랭크 (점선)의 다양한 공급원에 대한 크로마토그램을 나타낸다: (A) 올-올레에이트 ChP-부합 PS80; (B) 호박색 유리 용기에 보관된 시그마-알드리치 PS80; (C) 크로다 슈퍼-리파인드 PS80; (D) 천연-색상 플라스틱 용기에 보관된 시그마-알드리치 PS80; 및 (E) 멀티-컴펜디얼 제이.티. 베이커 PS80.
올-올레에이트 PS80 및 멀티-컴펜디얼 제이.티. 베이커 PS80에서 동일한 PS80 모노-에스테르를 가정하면, 올-올레에이트 PS80의 피크 면적은 약간 더 큰 분자량의 결과로서 더 높을 것이다. 폴리소르베이트에 대한 합성 경로의 불일치는 배치 사이의 아종에서의 일부 가변성의 관찰을 초래하였다. 물리화학적 특성은 배치마다 다양한 것으로 입증되었다. 시그마-알드리치 PS80의 대안적 보관 용기에 의해 입증된 바와 같이, PS80 표준 용액은 생물제약 제제에 사용된 PS80과 동일한 공급원 및 로트로부터의 물질로 제조되는 것이 권장된다.
폴리소르베이트 40 (PS40, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노-팔미테이트) 및 폴리소르베이트 60 (PS60, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노-스테아레이트)을 또한 평가하였고 (도 5), 각각의 크로마토그래피 프로파일은 멀티-에스테르로부터 모노-에스테르를 분해하였다. 요약하면, 도 5는 다양한 폴리소르베이트 (실선) 및 블랭크 (점선)에 대한 크로마토그램을 나타낸다: (A) 폴리소르베이트 20 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트); (B) 폴리소르베이트 40 (PS40, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노-팔미테이트); (C) 폴리소르베이트 60 (PS60, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노-스테아레이트); 및 (D) 폴리소르베이트 80 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트). 각각의 크로마토그래피 프로파일은 다중-에스테르로부터 모노-에스테르를 분해하였다. PS60은 2종의 주요 모노-에스테르 형태 또는 상당량의 POE 이소소르비드 모노-에스테르를 함유하는 것으로 보이고; 질량 분광측정법을 통한 추가의 조사가 이들 피크의 정체를 식별하는데 필요할 수 있다. 멀티-컴펜디얼 폴리소르베이트 20 (PS20, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노-라우레이트)이 또한 포함되었지만, 복합 크로마토그램을 생성하였다 (SM 도 7). PS20과의 복합 크로마토그램은 이전에 보고되었고, 보다 간단한 크로마토그램은 모든-라우레이트 PS20의 사용에 의해 달성되었다. PS60은 2종의 주요 모노-에스테르 형태 또는 상당량의 POE 이소소르비드 모노-에스테르를 함유하는 것으로 보이고; 질량 분광측정법을 통한 추가의 조사가 이들 피크의 정체를 식별하는데 필요할 수 있다.
따라서, 이 방법은 PS20, PS40 및 PS60에 유용한 적용을 갖는다.
PS80 모노-에스테르의 관점에서 방법 정확도 및 특이성을 평가하기 위해, 완전한 모노-에스테르 분해를 갖는 샘플을 mAb를 사용하여 스파이킹하고, 분석하였다. PS80 모노-에스테르 분해는 샘플을 5℃에서 36개월 동안 인큐베이션하여 달성하였다 (도 6). 요약하면, 도 6은 mAb를 사용하여 스파이킹하고 분석한, 완전한 모노-에스테르 분해를 갖는 샘플인 PS80 모노-에스테르의 HPLC-CAD 방법을 사용하여 얻은 크로마토그래피 프로파일을 보여준다. PS80 모노-에스테르 분해는 샘플을 5℃에서 36개월 동안 인큐베이션하여 달성하였다. 도면은 36개월 동안 5 및 -20℃에서 보관된 mAb 산물에서의 산화성 분해로 인한 다중-에스테르의 피크 확장을 입증하는 신규 CAD 방법을 통해 수집된 크로마토그램의 오버레이를 보여준다. 추가로, 모노-에스테르의 거의 완전한 분해는 POE 기의 증가에 상응한다. 표준물은 멀티-컴펜디얼 제이.티. 베이커 PS80이었다. 17.5분에서의 피크는 사전-헹구지 않은 에펜도르프 튜브로부터의 가변 오염물이다. 분해된 샘플을 분석하여, 정량가능한 양의 PS80 모노-에스테르의 부재 (<LOQ)를 확인하였다. 예상된 바와 같이, PS80 모노-에스테르의 분해는 POE 기의 현저한 증가를 생성하였다. 후속 분해가 모노-에스테르 정량화를 방해하는지를 결정하기 위해, 스파이킹된 회수 접근법을 사용하였다. 분해된 샘플 제제를 200 ppm PS80 샘플 농도와 상관관계가 있는 20 ppm PS80으로 스파이킹하였다. PS80 모노-에스테르는 93%의 값으로 회수되었으며, 이는 분해 산물의 유의한 증가가 모노-에스테르의 검출에 불리한 영향을 미치지 않는다는 것을 확인시켜 준다. 추가로, 다중-에스테르 피크는 약간 감소하였고, 피크 확장을 입증하였다. 이는 아마도 라디칼-유도된 분해에 참여한 후 약간 상이한 소수성 및/또는 크기를 갖는 산화된 분해물의 분해 및 재형성에 기인할 수 있다.
ELSD 및 CAD 방법의 비교:
두 방법을 사용하여 일련의 샘플을 제조하고 시험하였다. 샘플은 1회의 동결-해동 (FT) 주기가 있거나 없이 5 및 -20℃에서 36개월 동안 보관된 제제 완충제 및 mAb 산물이었다. 변형된 ELSD 방법은 처음 4분 동안 방향전환을 포함하기 때문에, POE 기 및 단백질은 이전에 보고된 방법으로부터 추론된 바와 같이 검출기를 통과하지 않는다고 일컬어진다. 두 방법에서의 총-에스테르의 직접 비교는 표 4에 요약되어 있고, 우수한 일치를 입증하였다.
<표 4> 5℃에서 36 M mAb 샘플을 사용한 변형된 HPLC-ELSD 방법 및 신규 CAD 방법의 비교. 퍼센트 일치는, % 일치 = [C2/C1] * 100%로서 계산되었으며, 여기서 C1 및 C2는 각각 HPLC-HPLC-ELSD 및 HPLC-CAD 방법에 의해 결정된 PS80 총-에스테르 농도이다.
Figure pct00005
이 방법은 IgG1, IgG2, 및 IgG4 mAb로 검증되었다 (표 5). 이 조사 동안, 일부 침전 용매 (예를 들어, 아세톤, THF)는 제제 완충제 중 PS80 모노-에스테르 또는 아종의 낮은 또는 불량한 회수를 갖는 것으로 밝혀졌다 (데이터는 나타내지 않음).
<표 5> 신규 CAD 방법이 입증된 다양한 mAb 제제.
Figure pct00006
실시예 2: PS80 동역학 연구: 신규 HPLC-CAD 방법으로 각각의 시점 (초기, 1, 2, 4, 7, 14, 및 21일)에 대한 PS80 모노-에스테르 및 아종의 양을 정량화함으로써 농도-시간 데이터를 수득하였다 (도 7). 요약하면, 도 7은 5, 25, 40, 또는 -70℃에서 21일까지의 샘플에서의 PS80 분해의 동역학을 나타낸다. (A) 모노-에스테르, (B) 멀티-에스테르 (디-, 트리-, 및 테트라-에스테르), (C) POE 기, 및 (D) 총 질량 균형을 정량화하였다. 여기서, PS80 모노-에스테르 피크는 진정으로 정량적인 반면, 아종은 반-정량적이었다. 신규 HPLC-CAD 방법으로 각각의 시점 (초기, 1, 2, 4, 7, 14 및 21일)에 대한 PS80 모노-에스테르 및 아종의 양을 정량화함으로써 농도-시간 데이터를 수득하였다. 실제로 정량가능한 PS80 모노-에스테르에 대해, 5, 25, 및 40℃ 데이터에 대한 속도 상수를 갖는 PS80 모노-에스테르의 분해에 대해 아레니우스 플롯을 컴파일링하여, 35.8 ± 7.2 kJ/mol의 PS80 모노-에스테르에 대한 활성화 에너지를 생성하였고; 선형 최소 제곱 피팅은 y= 4311.5x-0.1696을 생성하였고, 여기서 R2 = 0.961이었다 (도 8). 키쇼어는 PS80의 처음 ~30%의 분해에 대해 ~35 kJ/mol의 활성화 에너지를 보고하기 때문에, 관찰된 활성화 에너지는 PS80 가수분해에 대해 이전에 공개된 관찰과 유사하다. 그러나, 사용된 분석 방법은 모노- 및 멀티-에스테르 형태를 구별하는 특이성을 갖지 않았다. 본 발명자들의 연구에서, 분해는 리파제의 존재로 인해 대부분 가수분해성 분해일 가능성이 있기 때문에, 이 연구에서 다중-에스테르의 피크 확장이 거의 없었다. 따라서, POE 기 및 다중-에스테르를 또한 정량화하였다 (도 7). POE 기, PS80 모노-에스테르, 및 멀티-에스테르의 농도 (ppm)를 합하여 질량 밸런스를 계산하였고; 모든 질량-밸런스 데이터에 대한 정밀도는 <10%였다. 무시할만한 양의 올레산이 40℃에서 관찰되었다.
멀티-컴펜디얼 제이.티. 베이커 PS80에서의 PS80 모노-에스테르는 다중-에스테르보다 유의하게 덜 안정하였다. 이는 이전에 공개된 데이터와 일치한다. 모노-에스테르는 매우 분해되지만, 단백질 응집으로부터의 보호 또는 콜로이드 안정성은 여전히 남아있는 다량의 다중-에스테르에 의해 달성될 수 있다.
과거에, 의심되는 단백질-PS80 상호작용은 단백질-함유 약물 제품에서 결정된 초기 PS80의 양을 낮추는 것으로 생각되었다. 흥미롭게도, 이 방법은 또한 PS80 모노-에스테르 농도가 감소할 것이고 POE 기의 상응하는 증가가 존재할 것이기 때문에 급속한 분해가 발생하는지를 결정할 수 있다. POE 기의 증가가 없는 경우에, 이는 단백질 또는 용기와의 상호작용일 가능성이 가장 크다.
결론:
HPLC-CAD를 사용하는 생물제약 제제에서 PS80에 대한 신규의 민감하고 특이적인 플랫폼 분석 방법이 개발되었다. 방법은 특이성을 방지하고 임의의 활성 분해 효소 (예를 들어, 리파제 및 에스테라제)를 종결시키는 잠재적 간섭을 완화시키기 위해 단백질의 침전을 사용한다. 특이성은 PS40, PS60, 및 다양한 유형의 PS80을 사용하여 입증되었다. 다중 유형의 IgG mAb를 사용하는 방법의 적용은 신선하고 심하게 분해된 약물 제품을 사용하는 이 방법에 의해 달성가능한 특이성의 추가의 지지를 제공하였다.
상기 방법은 PS80 모노-에스테르, POE 소르비탄/이소소르비드, 지방산 및 다중-에스테르 아종의 분해를 모니터링하도록 크로마토그래피의 특이성을 입증하는데 적합했습니다. 적격성 연구는 방법이 반복성 (2.2% RSD), 중간 정밀도 (6.5% RSD), 정확도 (101% 회수), 선형성 (평균 R2 ≥ 0.999), 특이성 (매트릭스 및 Rs ≥1.5 올레산/PS80 모노-에스테르에서 간섭 피크가 관찰되지 않음), 및 정량화 한계 (샘플의 경우 ~20 ppm 및 단백질이 결여된 샘플의 경우 2 ppm)와 관련하여 적절한 성능을 입증하는 것으로 결론내렸다. 심하게 분해된 mAb 약물 제품의 조사는 PS80 모노-에스테르가 LOQ 미만에서 분해되고 허용가능한 회수가 달성가능하였음을 입증한다 (93%). PS80 모노-에스테르의 감소는 POE 기의 증가와 연결되었음을 주목해야 한다. 심하게 분해된 연구는 또한 모든 에스테르화된 PS 종을 정량화함으로써 낮은 특이성을 갖는 확립된 방법에 대한 특정 방법의 비교를 가능하게 하였다.
따라서, 결론적으로, 상기 기재된 분석적 CAD 방법은 생물제약 제품에서 PS80에 대한 선택적, 민감성, 및 특이적 정량적 및 정성적 정보를 제공하는 것으로 입증되었다. 목적에 맞는 검증으로서 플랫폼 방법으로서 사용하기 위한 이의 잠재력은 침전 용매에 대한 변형을 사용함으로써 IgG mAb의 다중 하위-유형 (IgG1, IgG2, 및 IgG4)을 사용하여 입증되었다. 따라서, 이 방법은 이들 mAb 및 다른 생물제약 약물 제품에 대한 안정성 연구를 지지하는 가치있는 도구이다.

Claims (25)

  1. (i) 단백질을 함유하는 샘플을 유기 양성자성 극성 용매 또는 유기 비양성자성 극성 용매에 노출시킴으로써 단백질을 침전시키는 단계,
    (ii) 침전된 샘플을 원심분리하여 단백질 또는 펩티드를 펠릿화하고 액체 상청액을 수득함으로써 침전된 샘플로부터 단백질을 분리하는 단계,
    (iii) 상청액을 크로마토그래피에 적용함으로써 폴리소르베이트를 분리하며, 여기서 크로마토그래피는 상청액을 고정된 시아노 기를 포함하는 고정상 칼럼에 적용하고, 결합된 폴리소르베이트를 이동상 조성 구배를 사용하여 용리시키는 것을 포함하는 것인 단계, 및
    (iv) 폴리소르베이트를 확인하기 위하여 발색단-결여 검출기를 사용하여 분리된 폴리소르베이트를 검출하는 단계
    를 포함하는, 단백질을 함유하는 샘플에서 폴리소르베이트를 확인하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 무손상 폴리소르베이트 및/또는 분해된 폴리소르베이트 산물을 확인하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 폴리소르베이트를 정량화하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 샘플이 항체를 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 모노클로날 항체 또는 그의 단편인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, PS80, PS60, PS40 및 PS20 중 어느 하나로부터 선택된 폴리소르베이트를 검출하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 발색단-결여 검출기가 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 샘플이 아세테이트 또는 시트레이트 완충제를 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플 중 상기 단백질이 약 5 mg/ml 내지 약 300 mg/ml의 농도로 존재하는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 침전을 메탄올, 이소프로필 알콜 (IPA), THF 또는 아세톤으로부터 선택된 용매를 사용하여 수행하는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리소르베이트의 분리가 고정화된 시아노 기를 포함하는 역상 HPLC 칼럼을 사용하여 수행되는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 칼럼이 ≥ 80 옹스트롬의 세공 크기를 갖는 실리카 칼럼인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용리를 완충제 A 및 완충제 B로 이루어진 이동상인 구배 분리된 이동상을 사용하여 수행하며, 여기서 완충제 A는 H2O 중 0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA)의 혼합물이고 완충제 B는 메탄올 또는 아세토니트릴인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리소르베이트의 분리가 약 20℃ 내지 약 80℃의 온도를 갖는 가열된 칼럼을 사용하여 수행되는 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    (i) 상기 샘플을 메탄올 또는 IPA에 노출시킴으로써 단백질을 침전시키는 단계,
    (ii) 침전된 샘플을 원심분리하여 단백질을 펠릿화하고 액체 상청액을 수득함으로써 침전된 샘플로부터 단백질을 분리하는 단계,
    (iii) 상청액을 고정된 시아노 기를 포함하는 약 300 옹스트롬의 세공 크기를 갖는 실리카 칼럼 상의 역상 HPLC에 적용하고, A 및 B로 이루어진 이동상 조성물 구배를 사용하여 용리시킴으로써 폴리소르베이트를 분리하는 단계이며, 여기서 A는 H2O 중 0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA)의 혼합물이고, B는 메탄올 또는 아세토니트릴인 단계,
    (iv) 폴리소르베이트를 확인하기 위하여 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 분리된 폴리소르베이트를 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  16. (a) (i) 단백질 샘플을 유기 양성자성 극성 용매 또는 유기 비양성자성 극성 용매에 노출시킴으로써 단백질을 침전시키는 단계,
    (ii) 침전된 샘플을 원심분리하여 단백질 또는 펩티드를 펠릿화하고 액체 상청액을 수득함으로써 침전된 샘플로부터 단백질을 분리하는 단계,
    (iii) 상청액을 크로마토그래피에 적용함으로써 폴리소르베이트를 분리하며, 여기서 크로마토그래피는 상청액을 고정된 시아노 기를 포함하는 고정상 칼럼에 적용하고, 결합된 폴리소르베이트를 이동상 조성 구배를 사용하여 용리시키는 것을 포함하는 것인 단계, 및
    (iv) 폴리소르베이트를 확인하기 위하여 발색단-결여 검출기를 사용하여 분리된 폴리소르베이트를 검출하는 단계
    를 포함하는, 상기 샘플에서 폴리소르베이트를 측정하는 단계;
    (b) 약 10 ppm 내지 약 5000 ppm인 무손상 폴리소르베이트의 수준을 갖는 (a)로부터의 단백질 샘플(들)을 확인하는 단계;
    (c) (b) 단계에서 확인된 상기 단백질(들)의 분리 및 회수 단계
    를 포함하는, 약 10 ppm 내지 약 5000 ppm의 무손상 폴리소르베이트를 함유하는 단백질 샘플의 확인 방법.
  17. 제16항에 있어서, (c) 단계에서의 상기 단리된 단백질 샘플이 약 10 ppm 내지 약 700 ppm의 무손상 폴리소르베이트를 함유하는 것인 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 폴리소르베이트가 PS80인 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발색단-결여 검출기가 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)인 방법.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득되거나 또는 수득가능한 단백질 또는 펩티드 폴리소르베이트.
  21. 제20항에 있어서, 모노클로날 항체 또는 그의 단편인 단백질.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 의약에 사용하기 위한 단백질.
  23. 인간 대상체의 요법 또는 진단을 위한, 제20항 또는 제21항에 따른 단백질의 용도.
  24. 인간 대상체에서 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 제20항 또는 제21항에 따른 단백질의 용도.
  25. 제20항 또는 제21항에 따른 단백질을 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제와 조합하여 포함하는 제약 제제.
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