JP2023517765A - ポリソルベートを検出する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、医薬製品中のポリソルベートを検出する方法の提供に関する。

Description

本発明は、医薬製品中のポリソルベートを検出する方法の提供に関する。

ポリソルベートは、食品およびバイオ医薬製品の両方において一般に使用される非イオン性界面活性剤である。バイオ医薬製品において、表面、凝集物、および粒子製剤へのタンパク質吸着を防止するために使用され得る。しかしながら、それらのポリソルベートの分解産物が、非経口的に使用される場合に、例えば、注射部位の刺激を引き起こし得るという問題がある。この使用のために、ポリソルベート、特にポリソルベート８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）の完全性をモニターするための分析法の開発に非常に大きな関心が持たれている。商業的に入手可能なＰＳ８０は不均一であり、最も一般的なプロセス関連の下位種は、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）基、ＰＯＥイソソルビドモノエステル、およびＰＯＥソルビタン／イソソルビド ジ、トリ、テトラエステルである。そのため、分析法の開発は困難であった。いくつかの方法が報告されている。

以下のことは達成されていない：（１）ＰＳ８０モノエステルピークの特異性－免疫が、分解したサンプル中の定量を可能にする（specificity - immunity of the PS80 mono-ester peak enables quantification in degraded samples）；（２）感度、≦２０ｐｐｍ；（３）確度、９５～１０５％；（４）精度≦５％；（５）移転可能性、品質管理（ＱＣ）を含む；（６）従来の紫外可視高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）法と類似する時間、およびほぼ等しいコストでバリデートする能力；（７）インタクトな（intact）ＰＳ８０および分解されたＰＳ８０、ならびに関連する下位種をモニターする能力；（８）タンパク質含有バイオ医薬製剤のためのプラットホーム方法として役割を果たす能力；（９）線形性、Ｒ^２＞０.９９；（１０）脂肪酸の分解能；（１１）質量分析で解釈可能；（１２）誘導体化を利用しない；および／または（１３）ミセルカプセル化に依存する定量を利用しない。

従って、上に詳述した欠点に対処する、かつ／あるいはインタクトなポリソルベートおよび／またはポリソルベート分解産物を検出することができる、ポリソルベートを検出するための改善された方法を提供する必要性が存在する。

従って、本発明は、（例えば、抗原結合ポリペプチド（例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ））などの医薬タンパク質製品の）タンパク質を含有するサンプル中のポリソルベート、例えばインタクトなポリソルベートおよび／またはポリソルベート分解産物を検出する方法を提供する。

それゆえに、本発明の第１の態様において、タンパク質を含有するサンプル中のポリソルベート、例えばインタクトなポリソルベートおよび／またはポリソルベート分解産物を同定する方法であって、前記サンプルを以下の工程：
（ｉ）前記サンプルを有機プロトン性極性溶媒または有機非プロトン性極性溶媒に曝露することによって、前記タンパク質を沈殿させる工程；
（ｉｉ）沈殿させた前記サンプルを遠心分離して前記タンパク質またはペプチドをペレット化することによって、沈殿させた前記サンプルから前記タンパク質を分離し、液体上清を得る工程；
（ｉｉｉ）前記上清をクロマトグラフィーに供することによって、前記ポリソルベートを分離する工程、ここで、前記クロマトグラフィーは、前記上清を、固定化シアノ基を備える固定相カラムに適用すること、および移動相組成物グラジエントを使用して、結合した前記ポリソルベートを溶出させることを含む；および
（ｉｖ）発色団が不要な検出器を使用して、分離された前記ポリソルベートを検出し、ポリソルベートを同定する工程
に供することを含む、方法が提供される。

第２の態様において、本発明は、例えば複数のタンパク質から、タンパク質サンプルを同定する方法であって、
同定された前記タンパク質サンプルが、約１０ｐｐｍ～約５０００ｐｐｍのインタクトなポリソルベートを含有し、
前記方法が、以下の工程：
（ａ）前記サンプル中のポリソルベートを測定する工程であって、以下の工程：
（ｉ）前記サンプルを有機プロトン性極性溶媒または有機非プロトン性極性溶媒に曝露することによって、前記タンパク質を沈殿させる工程、
（ｉｉ）沈殿させた前記サンプルを遠心分離して前記タンパク質またはペプチドをペレット化することによって、沈殿させた前記サンプルから前記タンパク質を分離し、液体上清を得る工程、
（ｉｉｉ）前記上清をクロマトグラフィーに供することによって、前記ポリソルベートを分離する工程、ここで、前記クロマトグラフィーは、前記上清を、固定化シアノ基を備える固定相カラムに適用すること、および移動相組成物グラジエントを使用して、結合した前記ポリソルベートを溶出させることを含む、および
（ｉｖ）発色団が不要な検出器を使用して、分離された前記ポリソルベートを検出し、ポリソルベートを同定する工程
を含む工程；
（ｂ）インタクトなポリソルベート、例えば、ＰＳ８０の濃度が約１０ｐｐｍ～約５０００ｐｐｍである前記タンパク質サンプルを、工程（ａ）から同定する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）において同定された前記タンパク質を単離および回収する工程
を含む、方法を提供する。

さらに、本発明の第２の態様の方法によって得ることができるまたは得られたタンパク質、さらにまた、医薬における前記タンパク質の使用、例えば、ヒト対象に投与するための医薬製剤の調製における前記タンパク質の使用も提供される。

本発明の第１および第２の態様のある実施形態において、タンパク質を含有するサンプル（例えば、ｍＡｂなどの抗体サンプル）中のポリソルベート８０（例えば、インタクトなＰＳ８０ポリソルベートおよび／または分解されたＰＳ８０ポリソルベート）を同定する方法が提供される。

沈殿させる工程、および溶出と組み合わせた分離する工程は、サンプル中のポリソルベート産物の分離を可能にし、また、検出工程は、ＰＳ８０および／またはＰＳ６０および／またはＰＳ４０および／またはＰＳ２０などのインタクトなポリソルベートおよび／またはポリソルベート分解産物の検出および分析を可能にする。

本発明の第１および第２の態様のある実施形態において、タンパク質またはペプチド（例えば、本明細書において提供されるｍＡｂサンプルなどの抗体）を含有するサンプル中のポリソルベートを同定する方法は、（例えば、ＰＳ８０および／またはＰＳ６０および／またはＰＳ４０および／またはＰＳ２０の）インタクトなポリソルベートおよび／またはポリソルベート分解産物の測定を含む、サンプル中に存在するＰＳ８０および／またはＰＳ６０および／またはＰＳ４０および／またはＰＳ２０などのポリソルベートの量を測定するために使用され得る定量法である。

図１は、ＰＳ８０のための合成経路の最後の２工程を示す図である。 図２は、ポリソルベートにおける最も一般的な２種類の分解による分解産物を示す図である。 図３は、ＰＳ８０モノエステルを定量し、下位種の他の４つのグループを定性的／半定量的にモニターするＨＰＬＣ－ＣＡＤ法を使用して得たクロマトグラムを示す図である。 図４は、ＰＳ８０の種々の起源（実線）およびブランク（点線）についてのクロマトグラムを示す図である。 図５は、種々のポリソルベート（実線）およびブランク（点線）についてのクロマトグラムを示す図である。 図６は、ＨＰＬＣ－ＣＡＤ法を使用して得た、ＰＳ８０モノエステルのクロマトグラフィープロファイルを示す図である。 図７は、５℃、２５℃、４０℃、または－７０℃における、２１日間までの、サンプル中のＰＳ８０分解の動力学を示す図である。 図８は、ＰＳ８０モノエステルの分解についての、（５℃、２５℃および４０℃における）速度定数のアレニウスプロットを示す図である。 図９は、クロマトグラム（２００ｐｐｍ標準溶液（複数の公定書に収載されているＪ．Ｔ．ｂａｋｅｒのＰＳ８０）、分解したＰＳ８０を含むｍＡｂサンプルおよびブランク溶液）のオーバーレイを示す図である。

本明細書の中で、明確で簡潔な明細書を記述することが可能になるやり方で、実施形態を参照しながら、本発明が記載されている。それらの実施形態は、本発明から逸脱することなく、様々に組み合わされ得る、または分離され得ることが意図されており、そのように解釈されるべきである。

別段の定めがない限り、本明細書で使用されている全ての技術的および科学的用語は、（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術および生化学における）当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。定量的分析のために、標準的な技術が使用される。

本明細書において引用される全ての刊行物（それらに限定されないが、特許および特許出願を含む）は、完全に記述されているのと同じように、参照により本明細書に組み込まれる。

「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために、本明細書において互換的に使用される。ポリペプチドは、天然（組織由来）起源であり得、原核または真核細胞調製物からのリコンビナントまたは天然発現であり得、または合成方法によって化学的に生成され得る。これらの用語は、１または２以上のアミノ酸残基が、対応する天然起源アミノ酸の人工の化学的模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然起源アミノ酸ポリマーおよび非天然起源アミノ酸ポリマーにあてはまる。アミノ酸模倣物は、あるアミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然起源アミノ酸と類似する様式で機能する化学物質を指す。非天然残基は、科学および特許文献に十分に記述されており、天然のアミノ酸残基の模倣物およびガイドラインとして有用な、いくつかの例示的な非天然成分を以下に示す。芳香族アミノ酸の模倣物は、例えば、Ｄ－またはＬ－ナフチルアラニン（naphylalanine）；Ｄ－またはＬ－フェニルグリシン；Ｄ－またはＬ－２チエニルアラニン（thieneylalanine）；Ｄ－またはＬ－１、２－、３－、または４－ピレニルアラニン（pyreneylalanine）；Ｄ－またはＬ－３チエニルアラニン（thieneylalanine）；Ｄ－またはＬ－（２－ピリジニル）－アラニン；Ｄ－またはＬ－（３－ピリジニル）－アラニン；Ｄ－またはＬ－（２－ピラジニル）－アラニン；Ｄ－またはＬ－（４－イソプロピル）－フェニルグリシン；Ｄ－（トリフルオロメチル）－フェニルグリシン；Ｄ－（トリフルオロメチル）－フェニルアラニン；Ｄ－ｐ－フルオロ－フェニルアラニン；Ｄ－またはＬ－ｐ－ビフェニルフェニルアラニン；Ｋ－またはＬ－ｐ－メトキシ－ビフェニルフェニルアラニン；Ｄ－またはＬ－２－インドール（アルキル）アラニン；およびＤ－またはＬ－アルキルアラニン（alkylainines）によって置換することによって生成され得、ここで、アルキルは、置換または非置換のメチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ－ｉｓｏｔｙｌ、イソペンチル、または非酸性アミノ酸であり得る。非中性アミノ酸の芳香環としては、例えば、チアゾリル、チオフェニル、ピラゾリル、ベンゾイミダゾリル、ナフチル、フラニル、ピロリル、およびピリジル芳香環が挙げられる。

用語「抗原結合ポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、抗体、抗体フラグメント、および抗原に結合することができる他のタンパク質コンストラクトを指す。

用語「抗体」は、本明細書において、免疫グロブリン様ドメインを有する分子（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ）を指すための最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体、リコンビナント抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、およびヘテロコンジュゲート抗体；単一可変ドメイン（例えば、ドメイン抗体（ＤＡＢ））、抗原結合抗体フラグメント、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、単鎖Ｆｖ、ジスルフィド結合ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、ＴＡＮＤＡＢＳなど、ならびに前述の任意のものの修飾形態が挙げられる（代替的な「抗体」形態の概要のために、ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００５、Ｖｏｌ２３、Ｎｏ．９、１１２６－１１３６を参照のこと）。代替的抗体形態もまた意図され、抗原結合タンパク質の１または２以上のＣＤＲが、適切な非免疫グロブリンタンパク質スキャフォールドまたは骨格（例えば、アフィボディー、ＳｐＡスキャフォールド、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン、アビマーまたはＥＧＦドメイン）上に配置されていてもよい、代替的なスキャフォールドが挙げられる。

本明細書において互換的に用いられる用語、完全長（full）抗体、全長（whole）抗体またはインタクトな抗体は、分子量がおよそ１５０,０００ダルトンである、ヘテロテトラマー糖タンパク質を指す。インタクトな抗体は、ジスルフィド共有結合によって連結された、２つの同一の重鎖（ＨＣ）と、２つの同一の軽鎖（ＬＣ）から構成される。このＨ２Ｌ２構造は、折り畳まれて、２つの抗原結合フラグメント（‘Ｆａｂ’フラグメントとして知られる）と、‘Ｆｃ’結晶化可能フラグメントを含む、３つの機能ドメインを形成する。Ｆａｂフラグメントは、アミノ末端の可変ドメイン（可変重（ＶＨ）または可変軽（ＶＬ））と、カルボキシル末端の定常ドメイン（ＣＨ１（重）およびＣＬ（軽））から構成される。Ｆｃフラグメントは、対になるＣＨ２およびＣＨ３領域の二量体化によって形成される、２つのドメインから構成される。Ｆｃは、免疫細胞上の受容体に結合することによって、またはＣ１ｑ（古典的な補体経路の第１成分）と結合することによって、エフェクター機能を誘発し得る。抗体の５つのクラス（ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥおよびＩｇＤ）は、それぞれμ、α、γ、εおよびδと呼ばれる、異なる重鎖アミノ酸配列によって規定され、各重鎖は、κまたはλ軽鎖のいずれかと対になり得る。血清中の抗体の大部分は、ＩｇＧクラスに属し、ヒトＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４という４つのアイソタイプが存在し、それらの配列は、主にヒンジ領域において相異している。

本明細書で使用される場合、「フラグメント」は、タンパク質またはポリペプチドに関して使用される場合、天然起源タンパク質／ポリペプチド全体のアミノ酸配列と、全部ではなく、一部が同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチドである。フラグメントは、「自立型」であり得、またはより大きなタンパク質またはポリペプチドの中に含まれ得る（単一のより大きなタンパク質／ポリペプチド中の単一の連続的な領域として、その部分または領域を形成する）。

用語「単一可変ドメイン」は、抗体可変ドメインに特有な配列を含む、折り畳まれたポリペプチドドメインを指す。「単一可変ドメイン」には、従って、ＶＨ、ＶＨＨおよびＶＬなどの完全抗体可変ドメインおよび改変された抗体可変ドメイン（例えば、１つ以上のループが、抗体可変ドメインに特有ではない配列によって置換されている）、またはトランケートされているか、またはＮもしくはＣ末端伸長を含んでいる抗体可変ドメイン、ならびに少なくとも全長ドメインの結合活性および特異性を保持する可変ドメインの折り畳まれたフラグメントが含まれる。本明細書で規定されている単一可変ドメインは、異なる可変領域またはドメインの抗原またはエピトープとは独立して、抗原またはエピトープと結合することができる。「ドメイン抗体」または「ＤＡＢ」は、ヒト「単一可変ドメイン」と同じであるとみなされ得る。単一可変ドメインは、ヒト単一可変ドメインであり得るが、さらに、げっ歯類（例えば、ＷＯ００／２９００４に記載されているようなげっ歯類）、テンジクザメ科およびラクダ科のＶＨＨなどの他の種由来の単一可変ドメインも含む。ラクダ科のＶＨＨは、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコを含む種由来の免疫グロブリン単一可変領域ポリペプチドであり、天然に軽鎖を欠いている重鎖のみの抗体を産生する。このようなＶＨＨドメインは、当該技術分野において利用可能な標準的な技術によってヒト化され得、またこのようなドメインは、「単一可変ドメイン」であるとみなされる。

本明細書で使用される場合、用語「ポリソルベート」は、ポリソルベート８０（ＰＳ８０）、ポリソルベート６０（ＰＳ６０）、ポリソルベート４０（ＰＳ４０）およびポリソルベート２０（ＰＳ２０）から選択される一般的なインタクトなポリソルベート、ならびにそれらの分解産物のいずれか１つ（または全部）を指す。インタクトなポリソルベートは、モノエステルとして存在する場合のポリソルベートを指す。本発明の方法によって検出され得るポリソルベートの分解産物としては、長鎖脂肪酸（例えば、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸）、脂肪酸のＰＯＥエステルを含むポリオキシエチレン（ＰＯＥ）基、および短鎖脂肪酸が挙げられる。図２は、ポリソルベートにおける最も一般的な２種類の分解による分解産物を示す。

ポリソルベートは、食品およびバイオ医薬製品の両方において、非イオン性界面活性剤として一般に使用される。ポリソルベートは、バイオ医薬製品において、表面、凝集物、および粒子製剤に対するタンパク質吸着を防ぐために使用される。しかしながら、インタクトなポリソルベートが分解される場合に、問題となることが知られており、例えば、ポリソルベート分解産物は、医薬製品の注射剤における刺激を引き起こし得、また、サンプル（例えば、医薬サンプル）における過剰な混濁度にもつながる。約１０ｐｐｍ～約５０００ｐｐｍというインタクトなポリソルベートの量が、医薬製品における望ましい量であると一般に考えられている。

ポリソルベート、特にポリソルベート８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートまたはＴｗｅｅｎ（商標）８０）（これは、最も一般的に使用されるポリソルベートである）の完全性を含む、このようなポリソルベートをモニターする方法の開発に非常に大きな関心が持たれている。商業的に入手可能なＰＳ８０は不均一であり、最も一般的なプロセス関連の下位種は、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）基、ＰＯＥイソソルビドモノエステル、およびＰＯＥソルビタン／イソソルビド ジ、トリ、テトラエステルである。図１は、ポリソルベート８０（ＰＳ８０）のための合成経路の最後の２工程を示す。

しかしながら、ＰＳ８０、さらにＰＳ６０、ＰＳ４０およびＰＳ２０などのインタクトポリソルベートだけではなく、それらの分解産物も検出するための分析法の開発は困難であり、そのような方法の必要性、特にタンパク質含有バイオ医薬製剤に適用し得る方法の必要性が存在する。さらに、ＦＤＡなどの機関による医薬的に許容されるタンパク質材料の許可は、そのタンパク質材料に含まれる、ある特定のポリソルベート産物を含むポリソルベートが所定のレベルであるかによって決まる。

本発明は、従って、タンパク質を含有するバイオ医薬製剤などの医薬製剤中の、このようなポリソルベートの（例えばインタクトなポリソルベートおよび／またはポリソルベート分解産物の）同定を可能にする方法を提供する。

本発明は、また、タンパク質またはペプチドを含有するバイオ医薬製剤中のポリソルベートの測定を可能にする方法も提供する。ポリソルベートの「測定」という用語は、本明細書で使用される場合、そのようなポリソルベートの同定を指し、さらには定量も指す。測定されるポリソルベートは、インタクトなポリソルベートおよび／またはポリソルベート分解産物であり得る。本明細書において提供される方法は、正確であり、従来のＨＰＬＣと同様の時間で実施することができ、問題となり得る誘導体化またはミセルカプセル化の使用に頼らないため、有利である。誘導体化またはミセルカプセル化は、サンプル調製の複雑性を増大させ得、平衡動力学に依存し得（これは、精度に悪影響を与え得る）、マトリックスに対する、信号雑音比に悪影響を与える追加の成分を利用することがあり得る。

それゆえに、第１の態様において、本発明は、タンパク質を含有するサンプル（例えば、ｍＡｂサンプルなどの抗体）中のポリソルベート（例えば、インタクトなポリソルベートおよび／またはポリソルベート分解産物）を同定する方法であって、前記サンプルを以下の工程：
（ｉ）前記サンプルを有機プロトン性極性溶媒または有機非プロトン性極性溶媒に曝露することによって、前記タンパク質を沈殿させる工程；
（ｉｉ）沈殿させた前記サンプルを遠心分離して前記タンパク質またはペプチドをペレット化することによって、沈殿させた前記サンプルから前記タンパク質またはペプチドを分離し、液体上清を得る工程；
（ｉｉｉ）前記上清をクロマトグラフィーに供することによって、前記ポリソルベートを分離する工程、ここで、前記クロマトグラフィーは、前記上清を、固定化シアノ基を備える固定相カラムに適用すること、および移動相組成物グラジエントを使用して、結合した前記ポリソルベートを溶出させることを含む；および
（ｉｖ）発色団が不要な検出器を使用して、分離された前記ポリソルベートを検出し、ポリソルベートを同定する工程
に供することを含む、方法を提供する。

沈殿させる工程、および溶出と組み合わせて分離する工程は、サンプル中のポリソルベート産物（例えば、インタクトなポリソルベートおよびポリソルベート分解産物）の分離を可能にし、また検出工程は、ポリソルベート産物（例えば、インタクトなポリソルベートおよびポリソルベート分解産物、例えば、インタクトなＰＳ８０および／またはＰＳ６０および／またはＰＳ４０および／またはＰＳ２０ならびにそれらの分解産物）の検出、同定および定量を可能にする。一実施形態において、タンパク質含有サンプル（例えば、本明細書において提供されるｍＡｂサンプルなどの抗体）中のインタクトなポリソルベートを測定する方法は、サンプル中に存在するＰＳ８０および／またはＰＳ６０および／またはＰＳ４０および／またはＰＳ２０などのインタクトなポリソルベートおよび／またはポリソルベート分解産物の量の測定を可能にする定量法である。

ある実施形態において、本発明の方法は、タンパク質含有サンプル（例えば、ｍＡｂサンプルなどの抗体、または細胞、または異種治療遺伝子を発現するベクターを含有するタンパク質）などのサンプル中のインタクトなポリソルベートの分解を、例えば、そのようなタンパク質含有サンプルの安定性を評価するための時間にわたって、モニターするために使用され得る。

本発明は、また、タンパク質含有サンプル中のインタクトなポリソルベートの量を、（例えば、そのようなサンプル中に存在するインタクトなＰＳ８０および／またはインタクトなＰＳ６０および／またはインタクトなＰＳ４０および／またはインタクトなＰＳ２０の量を測定するために）測定する方法の使用も提供する。

第２の態様において、本発明は、例えば複数のタンパク質から、タンパク質サンプルを同定する方法であって、
同定された前記タンパク質サンプルが、約１０ｐｐｍ～約５０００ｐｐｍのインタクトなポリソルベートを含有し、
前記方法が、以下の工程：
（ａ）前記タンパク質サンプル中のポリソルベートを測定する工程であって、以下の工程：
（ｉ）前記サンプルを有機プロトン性極性溶媒または有機非プロトン性極性溶媒に曝露することによって、前記タンパク質を沈殿させる工程、
（ｉｉ）沈殿させた前記サンプルを遠心分離して前記タンパク質またはペプチドをペレット化することによって、沈殿させた前記サンプルから前記タンパク質を分離し、液体上清を得る工程、
（ｉｉｉ）前記上清をクロマトグラフィーに供することによって、前記ポリソルベートを分離する工程、ここで、前記クロマトグラフィーは、前記上清を、固定化シアノ基を備える固定相カラムに適用すること、および移動相組成物グラジエントを使用して、結合した前記ポリソルベートを溶出させることを含む、および
（ｉｖ）発色団が不要な検出器を使用して、分離された前記ポリソルベートを検出し、ポリソルベートを同定する工程；
を含む工程；
（ｂ）インタクトなポリソルベートの濃度が約１０ｐｐｍ～約５０００ｐｐｍである前記タンパク質サンプルを、工程（ａ）から同定する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）において同定された前記タンパク質を単離および回収する工程
を含む、方法を提供する。

本発明の第２の態様の一実施形態において、インタクトなポリソルベートは、ＰＳ８０および／またはＰＳ６０および／またはＰＳ４０および／またはＰＳ２０である。

さらに、本発明の第２の態様の方法によって得られたまたは得ることができるタンパク質、さらにまた、医薬における前記タンパク質の使用、例えば、ヒト対象に投与するための医薬製剤の調製における前記タンパク質の使用も提供される。

本発明はまた、本発明の第２の態様の方法から得ることができるまたは得られたタンパク質（例えば、抗体）（前記タンパク質は、約１０ｐｐｍ～約４０００ｐｐｍ、または約１０ｐｐｍ～約３０００ｐｐｍ、または約１０ｐｐｍ～約２０００ｐｐｍ、または約１０ｐｐｍ～約８００ｐｐｍ、または約１０ｐｐｍ～約７００ｐｐｍで存在するインタクトなポリソルベートを含有する）もまた提供し、さらにまた、医薬における、例えば、ヒト対象に投与するための医薬製剤における、前記タンパク質の使用も提供する。

タンパク質が、細胞療法において使用するための抗体、または細胞、または異種治療遺伝子を発現するベクターを含有するタンパク質である実施形態において、タンパク質中に存在するインタクトなポリソルベートの量は、約１０ｐｐｍ～約７００ｐｐｍである。サンプル中に存在する、および本発明の方法が適用され得るタンパク質の濃度は、約５ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ～約２００ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ～約１０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬまたは約２０ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬであり得る。

本発明の方法は、任意の天然またはリコンビナントタンパク質に適用され得る。タンパク質サンプルは、例えば、治療的タンパク質、予防的タンパク質または診断的タンパク質を含み得る。例えば、方法は、抗原結合コンストラクト（例えば、抗体または抗体フラグメント（例えば、抗体の生物学的に機能性のフラグメント））を含むサンプルに適用され得、方法は、また、ワクチン組成物、細胞、または異種治療遺伝子を発現するベクターを含有するタンパク質にも適用され得る。

タンパク質サンプルが抗体である場合、その抗体は、例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）または二重特異性もしくは多重特異性抗体、またはそれらのフラグメントであり得る。抗体は、キメラ、ヒト化またはヒト抗体であり得る。タンパク質が抗体フラグメントである場合、その抗体フラグメントは、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、単鎖Ｆｖ、ジスルフィド結合ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、ＴＡＮＤＡＢＳ（商標）、抗体のＣＤＲ、および前述の任意のものの修飾形態であり得る。

抗体フラグメントはまた、ヒトＶＨもしくはＶＬ単一可変ドメイン、またはラマもしくはラクダ科などの非ヒト起源の単一可変ドメイン（例えば、（なかでも、ＷＯ９４／０４６７８およびＷＯ９５／０４０７９に記載されている）Ｎａｎｏｂｏｄｙ（商標）を含むラクダ科のＶＨＨ）などの単一可変ドメイン（または、ｄＡＢ）でもあり得る。これらの抗体または単一可変ドメインの任意のもののＣＤＲの（例えば、タンパク質スキャフォールドの一部としての）使用もまた意図されている。

本発明の方法において使用するためのタンパク質サンプルは、水性媒体中の液体または懸濁液形態であり得、または、例えば、凍結乾燥され、次いで水性媒体中で再構成され得る。タンパク質サンプルは、タンパク質および水に加えて、追加の希釈剤（例えば、医薬的に許容される希釈剤）をさらに含み得る。このような医薬的に許容される希釈剤としては、例えば、水などの溶媒、塩化ナトリウム溶液、糖、酢酸などのバッファー、塩化ナトリウムなどの塩、および／または他の賦形剤が挙げられる。一実施形態において、バッファーは、酢酸またはクエン酸バッファーであり得る。

本発明の方法は、液体バイオ医薬製剤（例えば、ｍＡｂ製剤）などの液体サンプルを含有するタンパク質中のポリソルベート（例えば、インタクトなポリソルベート）およびポリソルベート（例えば、ＰＳ８０および／またはＰＳ６０および／またはＰＳ４０および／またはＰＳ２０）の分解した種を検出するために特に有用である。

本発明の方法は、また、オリゴヌクレオチドを含むサンプル、細胞療法のための操作された細胞にも適用され得、さらにまた、ヒト対象に投与するための治療的遺伝子を含有する操作されたベクター（例えば、ウイルスベクター）などの遺伝子療法製品にも適用され得る。

本発明の方法はまた、化学物質（ＮＣＥ）である小分子を含むサンプル中のポリソルベートを測定するために使用され得、ここで、そのようなＮＣＥサンプルは、タンパク質を含まず、ゆえにタンパク質沈殿を省略し得、かつ有機プロトン性極性溶媒または有機非プロトン性極性溶媒の量を調節し得る。

本発明の方法は、ｐＨ値はこの方法の実施に決定的ではないため、幅広いｐＨ範囲、例えば、約ｐＨ５～約ｐＨ１０、または約ｐＨ６～約ｐＨ８にわたって実施することができる。本発明の方法に従って分析されるタンパク質サンプルは、約ｐＨ６.０～約ｐＨ８.０のｐＨ、例えば、約７.４～約６.８のｐＨを有し得る。

タンパク質沈殿工程において使用するための有機プロトン性極性溶媒は、当該技術分野においてよく知られており、この用語は、本明細書で使用される場合、化学変化を起こしやすいプロトンを含み、イオン化することができる有機溶媒を指す。本発明の方法において使用することができるこのような溶媒の例は当業者によく知られており、例えば、メタノール、エタノール、およびイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）が挙げられる。例えば、タンパク質が抗体である場合、タンパク質沈殿工程において、メタノール、ＩＰＡまたはアセトンが使用され得る。

タンパク質沈殿工程において使用される有機非プロトン性極性溶媒は、当該技術分野においてよく知られており、この用語は、本明細書で使用される場合、化学変化を起こしやすいプロトンを含まない有機溶媒を指す。本発明の方法において使用することができるこのような溶媒の例は当業者によく知られており、例えば、アセトン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、およびアセトニトリルが挙げられる。

この方法は、幅広い範囲の溶媒濃度にわたって実施することができ、この方法を、抗体を含むサンプルに対して実施する場合、体積／体積希釈は、サンプル約１部に対して溶媒約５部、９部または約１９部であり得る。

遠心分離工程は、タンパク質ペレットを得るために十分な速度および時間で実施することができ、例えば、少なくとも約１０,０００ｒｐｍで、少なくとも約１０分間実施することができる。

分離工程は、カラムクロマトグラフ法を使用して、例えば、逆相媒体またはミックスモード保持クロマトグラフィーを使用して実施することができる。このようなミックスモードクロマトグラフィーは、２つ以上の保持メカニズム、例えば、順相、カチオン交換およびアニオン交換を組み合わせて使用することを含む。

ある実施形態において、本発明の方法の分離方法は、当業者に知られている方法を使用して、逆相クロマトグラフィーカラムで実施することができ、ここで、カラムは、Ｃ３またはそれより長い、例えば、Ｃ４～約Ｃ１８の炭素鎖を有する基を含む。

一実施形態において、固定化シアノ基を備えるカラム（例えば、固定相に固定化シアノ基を備える逆相クロマトグラフィーカラム）が使用される。シアノ基は、当該技術分野においてよく知られており、基－ＣＮを含む任意の化学物質である。本発明の方法において、任意のシアノ基が使用され得る。本発明の方法に従って有用に使用され得る、ＣＮ基を備えるカラムは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ３００－ＣＮであり、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ３００－ＣＮ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ＣＮ、またはＡｇｉｌｅｎｔ ＩｎｆｉｎｉｔｙＬａｂ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ ＥＣ－ＣＮが挙げられる。

カラムは、（例えば、孔径が約８０オングストローム以上の）シリカビーズカラムであり得る。ある実施形態において、孔径は、約１２０～約３００オングストロームである。例えば、約３００オングストロームの孔径が使用され得る。適切なシリカカラムとしては、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ３００－ＣＮ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＣＮ、またはＡｇｉｌｅｎｔ ＩｎｆｉｎｉｔｙＬａｂ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ ＥＣ－ＣＮが挙げられる。一実施形態において、使用されるカラムは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ３００－ＣＮ、３.５μｍ、１５０×４.６ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｃｏ．、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡから入手可能）である。カラムは、加熱してもよく、例えば、カラムの温度は、約２０℃～約８０℃、または約４０℃～約６０℃、または約５０℃であり得る。

ある実施形態において、溶出工程は、グラジエント分離移動相を使用して実施され、このグラジエント分離移動相は、例えば、ＡおよびＢのグラジエント分離移動相であり得る。一実施形態において、ＡおよびＢのグラジエント分離移動相が利用され、ここで、Ａは、酸または酢酸アンモニウムの０.１％～約１０％Ｈ_２Ｏ混合液であり、この酸は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ギ酸、酢酸、ジフルオロ酢酸から選択され得、Ｂは、メタノール、イソプロパノール（isopropranol）またはアセトニトリルであり得る。ある実施形態において、ＡおよびＢのグラジエント分離移動相が利用され、これは、０.１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）のＨ_２Ｏ混合液であり、Ｂは、メタノールまたはアセトニトリルである。ＡとＢのグラジエント分離移動相は、下記表１に詳述するようにして実現され得る。

本発明の方法において使用される検出器は、発色団が不要な検出器であり、そのような検出器は、検出するサンプルが発色団を欠く場合に機能するものである。

ある実施形態において、本発明の方法において使用される検出器は、蒸発光散乱検出器であり得るか、または質量分析法が検出のために使用され得る。

別の実施形態において、荷電化粒子検出器（ＣＡＤ）が、本発明の方法における検出器として使用され、これは、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）と組み合わせて使用される検出器であり、不揮発性および半揮発性分析物を、高電圧コロナワイヤーで荷電させてある窒素ガスで荷電させることによって機能する。この荷電させた分析物粒子を、次いで、高移動度種（すなわち、溶媒）を除去するイオントラップを通過させ、引き続いてコレクターに移動させ、そこで高感度の電位計によって測定される。使用され得るＣＡＤとしては、Ｃｏｒｏｎａ Ｖｅｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡから入手可能）、Ｃｏｒｏｎａ Ｖｅｏ ＲＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡから入手可能）、Ｖａｎｑｕｉｓｈ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡから入手可能）、Ｃｏｒｏｎａ ＵｌｔｒａおよびＵｌｔｒａ ＲＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡから入手可能）、Ｃｏｒｏｎａ Ｐｌｕｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡから入手可能）が挙げられる。

ＣＡＤが提供する特徴の１つは、荷電したフラグメントを生じさせる質量分析法とは異なり、分析物の表面を荷電させることによって、インタクトな種を測定する能力である。さらに、類似する表面積および密度を有する分析物について、応答は類似している。最後に、揮発性が非常に高い溶出液を使用する場合、ＣＡＤ法は、また、非常に高感度（１ナノグラム未満）でもあり得る。

ＣＡＤは操作が容易であるが、標準的なＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓ（紫外可視分光）分析法の開発において、さらに考慮すべきことがある。それらとしては、（１）脱落しないカラムを選択すること；（２）低く、再現性のあるベースラインのために、移動相中に高純度溶媒を利用すること；および（３）混入物による干渉の可能性がより大きいため、ガラス器具およびプラスチックを洗浄することが挙げられる。ダイオードアレイまたは質量分析計（ＭＳ）検出を利用する場合にはピーク純度を識別する方法が存在しないため、ＣＡＤを利用する場合、高い特異性を実現することが重要である。特異性が実現できない場合、観測されるシグナルは、紫外可視分光光度測定における場合のように、単純に応答の合計ではなく、応答における相異は、移動相の成分に対する分析物の電荷、表面積、密度、および電圧の相異によってしばしば複雑化することにも留意すべきである。これらの理由により、ＣＡＤは、ＰＳ８０の分析のための検出器としてよく適している。

ある実施形態において、本明細書に記載されている方法において使用される荷電化粒子検出器（ＣＡＤ）は、Ｃｏｒｏｎａ Ｖｅｏ ＲＳ（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡから入手可能）である。

ＣＡＤを使用して実行される検出工程によって、結果として、選ばれたブランク溶液を使用してベースラインが得られるクロマトグラムであって、サンプル中のインタクトなポリソルベートについての、分解産物についての、ならびにタンパク質および賦形剤についてのピーク面積を含むクロマトグラムが得られる。曲線下面積計算を使用したピーク面積の評価によって、ＰＳ８０、および／またはＰＳ６０、および／またはＰＳ４０、および／またはＰＳ２０などのポリソルベートならびにそれらの分解産物の定量が可能になる。ある実施形態において、この方法によって、ＰＳ８０、例えばインタクトなＰＳ８０および分解されたＰＳ８０の同定が可能になる。

本発明の方法を使用した分離に言及する場合、意味することは、インタクトなポリソルベートピーク（すなわち、モノエステル）が、オレイン酸ピークから分離されなければならないということである。オレイン酸ピークとインタクトなポリソルベートモノエステルピークの間の分解能は、１.５以上である。他のピークは、互いに単純に識別可能である必要がある。さらに、ある実施形態において、インタクトなポリソルベート（すなわち、モノエステル）の保持時間における、面積で約３％を超える妨害ピークが存在しないという特異性要件が存在する。ある実施形態において、本発明は、タンパク質（例えば、抗体サンプル）を含有するサンプル中のポリソルベートを同定する方法であって、以下の工程：
（ｉ）前記サンプルをメタノールまたはＩＰＡに曝露することによって、前記タンパク質を沈殿させる工程；
（ｉｉ）沈殿させた前記サンプルを遠心分離して前記タンパク質またはペプチドをペレット化することによって、沈殿させた前記サンプルから前記タンパク質を分離し、液体上清を得る工程；
（ｉｉｉ）前記上清を、約３００オングストロームの孔径を有し、かつ固定化シアノ基を備えるシリカカラムによる逆相ＨＰＬＣに適用し、ＡおよびＢからなる移動相組成物グラジエントを使用して溶出させることによって、前記ポリソルベートを分離する工程、ここで、Ａは、０.１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）のＨ_２Ｏ混合液であり、Ｂは、メタノールまたはアセトニトリルである；および
（ｉｖ）荷電化粒子検出器（ＣＡＤ）を使用して、分離された前記ポリソルベート産物を検出し、ポリソルベートを同定する工程
を含む、方法を提供する。

以下の実施例を参照しつつ、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明の種々の態様を例証するためのものにすぎず、本発明を限定することを意図するものではない。

実施例１：（ｉ）ＰＳ８０モノエステルを定量する能力を有する、本発明の方法による新しいＨＰＬＣ－ＣＡＤ解析と、（ｉｉ）蒸発光散乱検出－ＨＰＬＣ－ＥＬＳＤ法を使用した改変ＨＰＬＣ法のいずれかによる、ｍＡｂ医薬製品中に存在するＰＳ８０およびその下位種の測定の比較。

使用した試薬および方法は以下の通りである。
複数の公定書に収載されているＪ．Ｔ．ｂａｋｅｒのＰＳ８０は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ、ＵＳＡ、０２－００３－６５４）から購入した。ＰＳ８０の２つの起源は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した：（１）自然色のプラスチック容器（パーツ番号Ｐ１７５４－２５ＭＬ）に保存したＰＳ８０、および（２）褐色のガラス容器（パーツ番号５９９２５－１００Ｇ）に保存したＰＳ８０。高度に精製されたＰＳ８０は、Ｃｒｏｄａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ（Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ、ＳＲ４８８３３）から購入した。全オレエートＣｈＰ適合ＰＳ８０は、ＮＯＦ（Ｗｈｉｔｅ Ｐｌａｉｎｓ、ＮＹ、ＵＳＡ）から購入し、非ＧＭＰのＰＳ８０、ＰＯＬＯ８０（ＨＸ２）（１９Ｂ８０３３６４）であった。ポリソルベート６０は、ＵＳＰ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ、１５４７９４）から購入した。ポリソルベート４０は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ、ＵＳＡ、ＡＣ３３４１４２５００）から購入した。オレイン酸は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ、７５０９０－５ＭＬ）から購入した。リノール酸は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ、ＵＳＡ、ＡＣ２１５０４０２５０）から購入した。パルミチン酸は、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（Ｓａｎｔａ Ａｎａ、ＣＡ、ＵＳＡ、１００９０５－１０Ｇ）から購入した。パルミトレイン酸は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ、７６１６９）から購入した。クロマトグラフィー（ＬＣ－ＭＳまたはＧＣ）グレードのメタノールは、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ、ＵＳＡ、Ａ４５６－４）またはＶＷＲ（Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ／Ｂｕｒｄｉｃｋ＆Ｊａｃｋｓｏｎ、ＧＣグレード、純度≧９９．９％、ＢＪＧＣ ２３０－４）から購入した。超純水（ＭｉｌｌｉＱ水）を生成するために、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ純水製造装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ、９１７０７－１０ｘ１ｍＬ）から購入した。他の沈殿溶媒（イソプロパノール、アセトン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ））は、クロマトグラフィーグレードであり、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ＨＰＬＣ－ＥＬＳＤ法のために、ＨＰＬＣグレードのメタノール（６４６３７７－４Ｌ）およびアセトニトリル（４３９１３４－４Ｌ）をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ （Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ Ｆｌｕｋａのギ酸（９４３１８－２５０ＭＬ）は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ、ＵＳＡ、ＡＣ３３４１４２５００）から購入した。

使用した機器および分析条件は以下の通りである。

タンパク質沈殿およびＰＳ８０抽出
新しいＨＰＬＣ－ＣＡＤ分析法のために、以下のように実施した。注入前にタンパク質［すなわち、ｍＡｂ医薬製品］を除去するために、沈殿溶媒（メタノール、イソプロパノール、および／またはアセトン）によってタンパク質を沈殿させた。さらに、可能性のあるあらゆるタンパク質－ＰＳ８０相互作用を妨害するため、およびリパーゼまたはエステラーゼによって起こるあらゆる分解を阻害するために、沈殿を利用した。濾過は、いくつかのポリソルベート種が除去されるため、実行可能な選択肢ではない。よって、９００μＬの沈殿溶媒を、事前に（メタノールまたは沈殿溶媒で）リンスした１.５ｍＬエッペンドルフセーフロックチューブ（Ｈａｕｐｐａｕｇｅ、ＮＹ、ＵＳＡ、０２２３６３２０４）中の１００μＬのサンプルに加えた。サンプル調製物を、次いで、ボルテックスして短時間（約５秒）混合し、１４,０００ｒｐｍで１０分間遠心した。ＰＳ８０種および脂肪酸は、上清中に可溶性のままであった。最小限の６０μＬの上清を、３００μＬのインサートを備えたＨＰＬＣバイアルに移した。

１００ｍＬクラスＡメスフラスコの中に複数の公定書に収載されているＪ．Ｔ．ＢａｋｅｒのＰＳ８０を１００±１０ｍｇ秤取し、容量までメタノールで希釈することによって、１,０００ｐｐｍＰＳ８０ストック標準溶液を調製した。１００μＬのＭｉｌｌｉＱ水、２０μＬの１,０００ｐｐｍＰＳ８０ストック標準溶液、および８８０μＬのメタノールを、事前に（沈殿溶媒で）リンスした１.５ｍＬエッペンドルフチューブ中でボルテックスして混合することによって、２０ｐｐｍＰＳ８０ワーキング標準溶液を調製した。よって、標準のための最終的な希釈剤組成（９０％沈殿溶媒：１０％ＭｉｌｌｉＱ Ｈ_２Ｏ／水性）は、サンプルのものと同じであった。ＰＳ６０、ＰＳ４０、およびＰＳ２０溶液は、同様にして調製した。

２０ｐｐｍＰＳ８０および５ｐｐｍオレイン酸ストック標準溶液を含有する分解能チェック溶液を調製した。８９８μＬの有機溶媒、１００μＬの水、および２μＬの１,０００ｐｐｍＰＳ８０ストック標準溶液を混合することによって、感度溶液を調製した。ｍＡｂ製剤バッファーをバルクで調製し、アリコートし、分析の日まで－７０℃で保存した。ＬＣ－ＭＳまたはＧＣグレードのメタノールで希釈することによって、２０ｐｐｍＰＳ８０製剤バッファー調製物を作製した。サンプル調製物はタンパク質を含まないので、遠心分離工程は不要であった。

熱的ストレスサンプルのために、ｍＡｂ／タンパク質含有製剤の複数のバイアルを－７０℃、５℃、２５℃、および４０℃で３週間インキュベートし、各タイムポイント（開始時、１日、２日、３日、４日、７日、１４日および２１日）においてバイアルをオーブンから取り出し、分析の時まで－７０℃で凍結させた。

改変ＨＰＬＣ－ＥＬＳＤ分析法のために、以下のようにして実施した。疑われるＰＳ８０－タンパク質相互作用のために、およびあらゆる酵素的分解を停止させるために、水による希釈に代えて、タンパク質をメタノールで沈殿させた。タンパク質を沈殿させ、ＰＳ８０を抽出するために、８００μＬの有機溶媒を、１.５ｍＬマイクロ遠心管中の２００μＬのサンプルに加え、ボルテックスして混合した。混合後、サンプルを５℃、１０,０００ｒｐｍで、３０分間遠心した。遠心後、２００μＬの上清を、３００μＬのインサートを備えたＨＰＬＣバイアルに移した。

サンプル中のＰＳ８０含有量の定量は、較正曲線を作成することによって実現した。ＨＰＬＣ－ＥＬＳＤ検出器の特性のため、標準曲線のマトリックスは、サンプルの代表でなければならない。代表的マトリックスを実現するために、５００ｍｇの複数の公定書に収載されているＪ．Ｔ．ＢａｋｅｒのＰＳ８０を５０.０ｍＬ低化学線クラスＡメスフラスコに秤取し、容量までＨＰＬＣグレードのメタノールで希釈して、１０,０００ｐｐｍＰＳ８０ストック溶液を調製した。さらに、０.５ｍＬの１０,０００ｐｐｍＰＳ８０ストック溶液を、次いで、１０.０ｍＬメスフラスコに加え、ＨＰＬＣグレードのメタノールで容量にして５００ｐｐｍストック溶液を調製した。５００ｐｐｍストック溶液を使用して、メタノール／水溶液（８０：２０（ｖ／ｖ））中の較正標準（予期されるＰＳ８０濃度は１０ｐｐｍ、２５ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、１５０ｐｐｍ、２００ｐｐｍ、および２５０ｐｐｍである）を調製した。２０ｐｐｍＰＳ８０調製物は、ＨＰＬＣグレードのメタノールで希釈することによって作製した。調製物はタンパク質を含まないため、遠心分離工程は行わなかった。サンプルクロマトグラムを図９に示す。要約すると、図９は、改変ＨＰＬＣ－ＥＬＳＤ法によって収集したクロマトグラム（２００ｐｐｍ標準溶液（複数の公定書に収載されているＪ．Ｔ．ＢａｋｅｒのＰＳ８０）、分解したＰＳ８０を含むｍＡｂサンプル、およびブランク溶液）のオーバーレイを示す。図９において、２００ｐｐｍの標準は、最大のピークを有し、－２０℃サンプル（-20 sample）は、中間の、より小さいピークを有する。

新しいＨＰＬＣ－ＣＡＤ法：
Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ１２６０システム（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）は、二成分溶媒マネージャー、２３℃に設定されたサンプルマネージャー、５０℃に設定されたカラムオーブンおよび荷電化粒子検出器（ＣＡＤ）Ｖｅｏ ＲＳ（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を含んでいた。ＣＡＤは、８０ｃｍの配管（Ａｇｉｌｅｎｔ、０１０７８－８７３０５）によって、分析カラムと直接接続され、分析カラムは、１８０ｍｍの配管（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｇ１３１３－８７３０５）によって３μＬのペルチェと直接接続されていた。ＨＰＬＣカラムヒーターは、標準的な配管によってＨＰＬＣオートサンプラーと直接接続されており、紫外可視分光光度計（ＵＶ／Ｖｉｓ）とカラム切り替えバルブは、両方ともバイパスされていた。

分析カラムは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ、ＵＳＡ）から入手したＺｏｒｂａｘ ＳＢ３００－ＣＮ（１５０ｍｍ×４.６ｍｍ、３.５μｍ ３００Å、８６３９７３－９０５）であった。０.１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡのＭｉｌｌｉＱ水溶液（ＭＰ Ａ）と、１００％ＬＣ－ＭＳまたはＧＣグレードのメタノール（ＭＰ Ｂ）からなる揮発性移動相（ＭＰ）を使用した。さらに、清浄度、および上にリストしたパラメーターでＣＡＤのベースラインレベルが１０ｍＶを下回ることを確実にするために、移動相は、３５％ＭＰ Ａ：６５％ＭＰ Ｂで１.２ｍＬ／分で流すことによって、プレスクリーニングした。ＰＳ８０下位種の分離は、流速１.２ｍＬ／分でグラジエント溶出（０.１％ＴＦＡのＭｉｌｌｉＱ水溶液は、０分－１００％；１分－１００％；３分－５０％；８分－５０％；２７分－５％；３０分－５％；および３０.１分－１００％であった）することによって実現した。この方法の全体的なランタイムは、４０分であった。インジェクションボリュームは、３０.０μＬであった。Ｔｈｅｒｍｏ Ｖｅｏ ＲＳ ＣＡＤは、以下の設定で稼働させた：蒸発温度、６０℃；パワーファンクション、１.００；アウトプットオフセット、０％；フィルター、５.０秒；レンジ１００ｐＡ。インハウスの窒素供給を使用した。ＣＡＤアナログ信号を、ｅ－ＳＡＴ／ＩＮモジュール（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ、６６８０００２３０）を使用することによって、デジタル信号に変換した。

改変ＨＰＬＣ－ＥＬＳＤ法：
本発明は、ＨｅｗｉｔｔとＫｏｐｐｏｌｕの方法からの改変法であった。Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ１１００システム（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）は、二成分溶媒マネージャー、２５℃に設定されたサンプルマネージャー、３０℃に設定されたカラムオーブンおよびＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｇ４２６０Ｂ蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ、ＵＳＡ）を含んでいた。ＥＬＳＤは、分析カラムと直接接続され、分析カラムは、３μＬのペルチェと直接接続されていた。ＨＰＬＣカラムヒーターは、標準的な配管によってＨＰＬＣオートサンプラーと直接接続されており、紫外可視分光光度計（ＵＶ／Ｖｉｓ）とカラム切り替えバルブは、両方ともバイパスされていた。

分析カラムは、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）から入手したＯａｓｉｓ（登録商標）ＭＡＸ（２０ｍｍ×２．１ｍｍ、３０μｍ ８０Å、パーツ番号１８６００２０５２）であった。２％（ｖ／ｖ）ギ酸のＭｉｌｌｉＱ水溶液及び２％（ｖ／ｖ）ギ酸のイソプロパノール溶液からなる揮発性の移動相を使用した。フローは、ランの最初の４分間ＥＬＳＤを迂回させ、分離は、流速１.０ｍＬ／分でグラジエント溶出（２％ギ酸のＭｉｌｌｉＱ水溶液は、０分－９０％；１分－８０％；３.４分－８０％；３.５分－０％；４.５分－０％；４.６分－９０％；および１０分－９０％であった）することによって実現した。インジェクションボリュームは、５０.０μＬであった。Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｇ４２６０Ｂ ＥＬＳＤは、以下の設定で稼働させた：ＬＥＤ、１０；ゲイン（ＰＭＴ）、２；ｓｍｏｏｔｈ（Ｓｍｔｈ）、１；データアウトプット、８０Ｈｚ；蒸発温度、８０℃；ネビュライザー温度、５０℃；ガスフロー（ＳＬＭ）、１。インハウスの窒素供給を使用した。ＣＡＤアナログ信号を、ｅ－ＳＡＴ／ＩＮモジュール（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ、６６８０００２３０）を使用することによって、デジタル信号に変換した。

新しいＨＰＬＣ－ＣＡＤ分析データ解析のために、積分および計算を以下のように実施した：
三つ組みの調製のＰＳ８０モノエステル濃度の平均を報告した。改変ＨＰＬＣ－ＥＬＳＤ法との比較のための全エステル（モノエステルおよびマルチエステル）を定量するために、線形性の準備において、ＰＳ８０モノエステルおよびマルチエステルの面積をグループ化することによって全エステルのための較正曲線を作成した。よって、ＨＰＬＣ－ＣＡＤ法における全エステル領域は、改変ＨＰＬＣ－ＥＬＳＤ法における単一ピークと類似しており；ＰＯＥ基は、各注入の最初の４分間の間にバルブ切り替えで廃棄用に迂回している時に溶出するため、単一ピーク中に含まれていない。

アレニウス動力学モデリングを、ＰＳ８０分解の速度を評価するために、および安定性または活性化エネルギー（Ｅ_ａ）を推定するために使用した。ＰＳ８０モノエステルの加水分解性の分解は、以前に説明されているように、擬一次反応であると推定された。速度定数は、動的粘度の変化による影響を及ぼす変化がないという前提で、濃度対時間の自然対数プロットの傾きから決定された。全ての線形プロットについて、傾きの相対誤差解析を、以前に説明したようにして実施した。

式中、ｎは、データポイントの数であり、ａは、傾きであり、ｂは、ｙ切片である。

改変ＨＰＬＣ－ＥＬＳＤ分析法データ解析のために、積分および計算は、バッチデータ処理によって、保持時間、ピーク面積、および他のクロマトグラフィー性能指数の取得が可能になるように、Ｅｍｐｏｗｅｒ３を使用して実施した。同様に、新しいＨＰＬＣ－ＣＡＤ法データ解析のために、積分および計算は、バッチ処理データ処理によって、保持時間、ピーク面積、分解能、Ｓ／Ｎ、および他のクロマトグラフィー性能指数の取得が可能になるように、Ｅｍｐｏｗｅｒ３を使用して実施した。

結果：
上記の新しいＨＰＬＣ－ＣＡＤ法によって、正確かつ精密にＰＳ８０モノエステルが定量され、下位種の他の４つのグループが定性的／半定量的にモニターされることが見出された。本出願人らは、単純さのために、ＣＡＤ応答は非線形であるが、線形である濃度範囲を選択した。較正曲線は、また、検出力関数アルゴリズムを適用することによっても線形化され得る；しかしながら、ベースラインの再現性がなければ、このようなアルゴリズムは、常にあてはまり得るわけではない。

マトリックス干渉は、（１）ＰＳ８０を含まないＩｇＧ医薬製品；および（２）完全に分解した（＜定量限界（ＬＯＱ））ＰＳ８０モノエステルを含むｍＡｂサンプルにおける、添加（スパイク）したＰＳ８０の回収率を評価することによって評価した（表２および以下の議論を参照のこと）。分解したサンプルは、トレハロース、メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、ｍＭ ＥＤＴＡ、およびＰＳ８０を含有する水性バッファー中に、タンパク質を含有していた。他のサンプルは、トレハロース、クエン酸、ＥＤＴＡ、およびＰＳ８０を含有する水性バッファー中に、タンパク質を含有していた。分解したサンプル中の特異性を評価するために、脂肪酸（リノール酸、パルミチン酸、オレイン酸、およびパルミトレイン酸）も、５ｐｐｍの濃度で、２０ｐｐｍＰＳ８０ワーキング標準溶液の中に添加（スパイク）した（図３参照）。要約すると、図３は、ＰＳ８０モノエステルを定量し、下位種の他の４つのグループを定性的／半定量的にモニターする、詳述したＨＰＬＣ－ＣＡＤ法を使用して得たクロマトグラムを示す。このクロマトグラムは、ブランク（破線）と、１０ｐｐｍの脂肪酸を添加（スパイク）した２０ｐｐｍＰＳ８０（複数の公定書に収載されているＪ．Ｔ．ｂａｋｅｒ）標準溶液（実線）のオーバーレイを示す。ピーク：１＝保持されない製剤バッファー成分（トレハロース、アミノ酸、ＥＤＴＡ、溶媒中の塩不純物、および／またはサンプル残渣）；２＝ＰＯＥ基；３＝パルミトレイン酸；４＝リノール酸；５＝パルミチン酸；６＝オレイン酸；７＝ＰＳ８０モノエステル（ソルビタンおよびイソソルビド）；８＝ジエステル；９＝トリエステル；１０＝テトラエステル；＊（もしあれば）、エッペンドルフチューブ由来の混入物。ＰＳ８０ピークの同定は、それらの相対的疎水性に基づいて予期される分析物の溶出順序によって、以前に報告されているＬＣ－ＭＳ結果［１７、３０］と一致しているものと考える。

ｍＡｂ医薬製品による方法の検定は完了した。

検定は、精度、線形性、確度、特異性、およびＬＯＱからなる（表２）。各注入についてＣＡＤ応答を使用して、平均濃度、標準偏差、および相対標準偏差を算出した。精度は、２～３回の機会における三つ組みの調製物の平均の解析によって評価した。精度は、また、製剤バッファー（またはアッセイ対照）を使用して、２回の解析間で、５回のアッセイ機会における二つ組の注入の再現性解析によっても評価した。中間の精度は、１人の分析者が１つのシステムで２回の独立したアッセイ機会を実施し、２人目の分析者が２つ目のシステムで、３回の独立したアッセイ機会を実施することによって決定した。

ｍＡｂ医薬製品は、三つ組みで試験し、結果を統計的に解析して、平均濃度、標準偏差、および相対的標準偏差を決定した。

線形性は、２人の分析者による、５つの独立したアッセイ機会の反復によって評価した。各曲線の決定係数（Ｒ^２）は、線形回帰によって決定した。確度は、添加（スパイク）回収アプローチを使用して決定した。２人の分析者が、５回のアッセイ機会における三つ組みで、２０ｐｐｍＰＳ８０を、調合物中にＰＳ８０を含まないサンプルに導入した。この調製物は、また、特異性を裏付けるためにも使用した。特異性は、また、分解能チェック溶液中のＰＳ８０モノエステルとオレイン酸ピークの分解能によって、および９０％有機溶媒／１０％水ブランク注入におけるＰＳ８０モノエステルの溶出ウィンドウ（±０.５分）の中に、干渉ピークが存在しないことを確実にすることによっても評価した。ＣＡＤは汎用性の検出器であり、混入物のわずかな痕跡を検出する場合があるため、ピーク特異性は、標準品が観察される面積に対して、２％を超える面積のピークが存在しないことによって示される。信号雑音比（Ｓ／Ｎ）は、２ｐｐｍＰＳ８０溶液について、≧１０であると推定された。

ＰＳ８０の種々の起源および種類を、この方法で試験した（表３）。図４に示すように、各ＰＳ８０源のクロマトグラムは、視覚的に同等であった。要約すると、図４は、ＰＳ８０の種々の起源（実線）およびブランク（点線）についてのクロマトグラムを示す：（Ａ）全オレエートＣｈＰ適合ＰＳ８０；（Ｂ）褐色のガラス容器に保存したＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＰＳ８０；（Ｃ）Ｃｒｏｄａ ｓｕｐｅｒ－ｒｅｆｉｎｅｄ ＰＳ８０；（Ｄ）自然色のプラスチック容器に保存したＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＰＳ８０；および（Ｅ）複数の公定書に収載されているＪ．Ｔ．ＢａｋｅｒのＰＳ８０。

全オレエートＰＳ８０および複数の公定書に収載されているＪ．Ｔ．ＢａｋｅｒのＰＳ８０におけるＰＳ８０モノエステルが等しいと仮定すると、分子量がわずかに大きい結果として、全オレエートＰＳ８０のピーク面積は、より大きいであろう。ポリソルベートについての合成経路に一貫性がない結果として、バッチ間で下位種にいくらかの変動が観察されている。物理化学的特性がバッチごとに異なることが示されている。Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＰＳ８０の代替の保存容器によって示されるように、ＰＳ８０標準溶液は、バイオ医薬製剤において使用されるＰＳ８０と同じ起源およびロット由来の材料から調製することが推奨される。

ポリソルベート４０（ＰＳ４０、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）とポリソルベート６０（ＰＳ６０、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート）もまた評価され（図５）、各クロマトグラフプロファイルにおいて、モノエステルは、マルチエステルと分離していた。要約すると、図５は、種々のポリソルベート（実線）およびブランク（点線）についてのクロマトグラムを示す：（Ａ）ポリソルベート２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）；（Ｂ）ポリソルベート４０（ＰＳ４０、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）；（Ｃ）ポリソルベート６０（ＰＳ６０、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート）；および（Ｄ）ポリソルベート８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）。各クロマトグラフプロファイルにおいて、モノエステルは、マルチエステルと分離していた。ＰＳ６０は、２つの主要なモノエステル形態、または相当量のＰＯＥイソソルビドモノエステルを含有しているように思われ、これらのピークの素性を識別するために、質量分析法によるさらなる実験が必要であり得る。複数の公定書に収載されているポリソルベート２０（ＰＳ２０、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）もまた含まれていたが、複雑なクロマトグラムが得られた（ＳＭ図７）。ＰＳ２０による複雑なクロマトグラムは、以前に報告されており、全ラウレートＰＳ２０を使用することによって、より単純なクロマトグラムが得られた。ＰＳ６０は、２つの主要なモノエステル形態、または相当量のＰＯＥイソソルビドモノエステルを含有しているように思われ、これらのピークの素性を識別するために、質量分析法によるさらなる実験が必要であり得る。

よって、この方法は、ＰＳ２０、ＰＳ４０、およびＰＳ６０に対する有用な用途を有している。

ＰＳ８０モノエステルに関する方法の確度および特異性を評価するために、完全なモノエステル分解サンプルを添加（スパイク）し、ｍＡｂを使用して分析した。ＰＳ８０モノエステル分解は、サンプルを、５℃で３６か月インキュベーションすることによって達成した（図６）。要約すると、図６は、ＨＰＬＣ－ＣＡＤ法を使用して得られたＰＳ８０モノエステル（添加（スパイク）された完全モノエステル分解を含み、ｍＡｂを使用して分析されたサンプル）のクロマトグラフプロファイルを示す。ＰＳ８０モノエステル分解は、サンプルを、５℃で３６か月インキュベーションすることによって達成された。この図面は、新しいＣＡＤ法によって収集したクロマトグラムのオーバーレイを示し、５℃および－２０℃で３６か月保存されたｍＡｂ製品における酸化的分解によるマルチエステルのピークのブロード化を示している。さらに、モノエステルの完全に近い分解は、ＰＯＥ基の増加に対応する。標準品は、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒの複数の公定書に収載されているＰＳ８０であった。１７.５分のピークは、事前にリンスしていないエッペンドルフチューブ由来の変動する混入物である。分解したサンプルを分析し、定量可能な量のＰＳ８０モノエステルを含まない（＜ＬＯＱ）ことが確認された。予想したように、ＰＳ８０モノエステルの分解によって、ＰＯＥ基の著しい増加が生じた。その後の分解がモノエステル定量を妨げるか否かを確認するために、添加（スパイク）回収アプローチを採用した。分解したサンプル調製物に２０ｐｐｍＰＳ８０を添加（スパイク）した（これは、２００ｐｐｍＰＳ８０サンプル濃度に相当する）。ＰＳ８０モノエステルは、９３％の値で回収され、分解産物の著しい増加が、モノエステルの検出に悪影響を及ぼさないことが確認された。さらに、マルチエステルピークは、わずかに減少し、ピークブロード化を示した。最もありそうな原因は、ラジカル的に誘発された分解に関与した後の、疎水性および／またはサイズがわずかに異なる酸化分解物の分解および再形成であり得る。

ＥＬＳＤ法とＣＡＤ法の比較
一連のサンプルを調製し、両方の方法を使用して試験した。サンプルは、５℃および－２０℃で３６か月保存し、凍結融解（ＦＴ）サイクルを１回行った、または行っていない、製剤バッファーおよびｍＡｂ製品である。改変ＥＬＳＤ法は、最初の４分間の間に迂回が組み込まれているので、以前に報告されている方法から推測されるように、ＰＯＥ基およびタンパク質は、検出器を通らないとされている。これら２つの方法の直接的な比較は、表４にまとめられており、良好な一致を示す。

この方法は、ＩｇＧ１ｍＡｂ、ＩｇＧ２ｍＡｂ、ＩｇＧ４ｍＡｂで検証されている（表５）。この実験の間に、いくつかの沈殿溶媒（例えば、アセトン、ＴＨＦ）によって、製剤バッファー中のＰＳ８０モノエステルまたは下位種の回収率が低い、または不十分であることが見出された（データ記載せず）。

実施例２：ＰＳ８０動力学研究：濃度－時間データは、新しいＨＰＬＣ－ＣＡＤ法で、各タイムポイント（開始時、１日、２日、４日、７日、１４日、および２１日）について、ＰＳ８０モノエステルと下位種の量を定量することによって得た（図７）。要約すると、図７は、５℃、２５℃、４０℃、または－７０℃における、２１日間までの、サンプル中のＰＳ８０分解の動力学を示す。（Ａ）モノエステル、（Ｂ）マルチエステル（ジ、トリ、およびテトラエステル）、（Ｃ）ＰＯＥ基、および（Ｄ）全マスバランスを定量した。ここで、ＰＳ８０モノエステルピークは、真に定量的であったが、下位種は、半定量的であった。濃度－時間データは、新しいＨＰＬＣ－ＣＡＤ法で、各タイムポイント（開始時、１日、２日、４日、７日、１４日、および２１日）について、ＰＳ８０モノエステルと下位種の量を定量することによって得た。真に定量可能なＰＳ８０モノエステルについて、アレニウスプロットは、５℃、２５℃、および４０℃データについての速度定数によって、ＰＳ８０モノエステルの分解についてコンパイルし、その結果、ＰＳ８０モノエステルについての活性化エネルギーは、３５.８±７.２ｋＪ／ｍｏｌであり；線形最小二乗フィッティングはy＝４３１１.５ｘ－０.１６９６（Ｒ^２＝０.９６１）であった（図８）。観察された活性化エネルギーは、Ｋｉｓｈｏｒｅが、ＰＳ８０の最初の約３０％の分解についての活性化エネルギーを約３５ｋＪ／ｍｏｌと報告しているように、ＰＳ８０加水分解についての以前に発表された観察と類似している。しかしながら、採用された分析法は、モノエステル形態と、マルチエステル形態を識別する特異性を有していなかった。本出願人らの研究において、分解は、リパーゼの存在による最も可能性が高い加水分解性の分解であったため、本研究において、マルチエステルのピークのブロード化は非常に小さく、従って、ＰＯＥ基およびマルチエステルもまた定量された（図７）。マスバランスは、ＰＯＥ基、ＰＳ８０モノエステル、およびマルチエステルの濃度（ｐｐｍ）を合計することによって算出され、全てのマスバランスデータについての精度は＜１０％であった。４０℃において、無視できる量のオレイン酸が観察された。

複数の公定書に収載されているＪ．Ｔ．ＢａｋｅｒのＰＳ８０中のＰＳ８０モノエステルは、マルチエステルと比較して、安定性が有意に低かった。これは、以前に発表されたデータと一致している。モノエステルは大幅に分解されているが、残存する大量のマルチエステルによって、タンパク質凝集からの保護、またはコロイド安定性をなおも実現することが可能である。

以前は、疑われるタンパク質－ＰＳ８０相互作用は、タンパク質含有医薬製品中で測定された初期のＰＳ８０量を低下させると考えられていた。興味深いことに、ＰＳ８０モノエステル濃度は減少し、それに対応するＰＯＥ基の増加が起こるであろうことから、本方法は、急速な分解が起こっているか否かを決定することもできる。もしＰＯＥ基の増加がない場合、タンパク質または容器との相互作用がない可能性が最も高い。

結論：
新しい、高感度な、かつ特異的なプラットホーム分析法が、バイオ医薬製剤中のＰＳ８０について、ＨＰＬＣ－ＣＡＤを使用して開発された。本方法は、特異性を妨げるであろう潜在的な干渉を軽減し、かつあらゆる活性な分解酵素（例えば、リパーゼおよびエステラーゼ）を阻害するために、タンパク質の沈殿を利用する。特異性は、ＰＳ４０、ＰＳ６０、および種々の種類のＰＳ８０を使用して実証された。多くの種類のＩｇＧ ｍＡｂを使用した本発明の適用によって、新鮮で著しく分解した医薬製品を使用して、本方法によって実現され得る特異性のさらなる裏付けが提供されている。

本方法は、分解について、ＰＳ８０モノエステル、ＰＯＥソルビタン／イソソルビド、脂肪酸、およびマルチエステル下位種をモニターするように、クロマトグラフィーの特異性を示すことが検定された。検定研究によって、方法は、再現性（２．２％ＲＳＤ）、中間の精度（６．５％ＲＳＤ）、確度（１０１％回収）、線形性（平均Ｒ^２≧０.９９９）、特異性（マトリックス中に干渉ピークが観察されず、かつＲ_ｓ≧１.５オレイン酸／ＰＳ８０モノエステル）、および定量限界（サンプルについて約２０ｐｐｍ、およびタンパク質を含まないサンプルについて２ｐｐｍ）に関して、十分な性能を示すと結論付けられた。著しく分解したｍＡｂ医薬製品の研究によって、ＰＳ８０モノエステルは、ＬＯＱ未満に分解され、許容できる回収率（９３％）が達成できることが示された。ＰＳ８０モノエステルの減少は、ＰＯＥ基の増加と対になっていたことに注目すべきである。著しく分解したものの研究によって、全てのエステル化されたＰＳ種を定量することによる、特異的な方法と確立された方法の比較も可能となった。

よって、結論として、上記の分析的ＣＡＤ法は、バイオ医薬製品中のＰＳ８０についての、選択的な、高感度な、および特異的な定量的および定性的情報を提供することが示された。この方法の、目的にかなった検証としてのプラットホーム方法として使用される可能性が、ＩｇＧ ｍＡｂ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４）の多数のサブタイプを使用して、沈殿溶媒に対する改変を利用することによって示された。よって、この方法は、これらのｍＡｂおよび他のバイオ医薬製品のための安定性試験をサポートするための有用なツールである。

Claims (25)

1. タンパク質を含有するサンプル中のポリソルベートを同定する方法であって、以下の工程：
   （ｉ）前記サンプルを有機プロトン性極性溶媒または有機非プロトン性極性溶媒に曝露することによって、前記タンパク質を沈殿させる工程；
   （ｉｉ）沈殿させた前記サンプルを遠心分離して前記タンパク質またはペプチドをペレット化することによって、沈殿させた前記サンプルから前記タンパク質を分離し、液体上清を得る工程；
   （ｉｉｉ）前記上清をクロマトグラフィーに供することによって、前記ポリソルベートを分離する工程、ここで、前記クロマトグラフィーは、前記上清を、固定化シアノ基を備える固定相カラムに適用すること、および移動相組成物グラジエントを使用して、結合した前記ポリソルベートを溶出させることを含む；および
   （ｉｖ）発色団が不要な検出器を使用して、分離された前記ポリソルベートを検出し、ポリソルベートを同定する工程
   を含む、方法。
2. 前記方法が、インタクトなポリソルベートおよび／またはポリソルベート分解産物を同定する、請求項１に記載の方法。
3. ポリソルベートを定量する工程をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記タンパク質サンプルが、抗体を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記タンパク質が、モノクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記方法が、ＰＳ８０、ＰＳ６０、ＰＳ４０およびＰＳ２０のいずれか１つから選択されるポリソルベートを検出する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記発色団が不要な検出器が、荷電化粒子検出器（ＣＡＤ）である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記タンパク質サンプルが、酢酸またはクエン酸バッファーを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記サンプル中の前記タンパク質が、約５ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記タンパク質の沈殿が、メタノール、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）、ＴＨＦまたはアセトンから選択される溶媒を使用して実施される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記ポリソルベートの分離が、固定化シアノ基を備える逆相ＨＰＬＣカラムを使用して実施される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記カラムが、≧８０オングストロームの孔径を有するシリカカラムである、請求項１１に記載の方法。
13. 前記溶出が、バッファーＡおよびバッファーＢからなる移動相であるグラジエント分離移動相を使用して実施され、バッファーＡが、０.１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）のＨ_２Ｏ混合液であり、バッファーＢが、メタノールまたはアセトニトリルである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記ポリソルベートの分離が、約２０℃～約８０℃の温度を有する加熱カラムを使用して実施される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 以下の工程：
    （ｉ）前記サンプルをメタノールまたはＩＰＡに曝露することによって、前記タンパク質を沈殿させる工程；
    （ｉｉ）沈殿させた前記サンプルを遠心分離して前記タンパク質をペレット化することによって、沈殿させた前記サンプルから前記タンパク質を分離し、液体上清を得る工程；
    （ｉｉｉ）前記上清を、約３００オングストロームの孔径を有し、かつ固定化シアノ基を備えるシリカカラムによる逆相ＨＰＬＣに適用し、ＡおよびＢからなる移動相組成物グラジエントを使用して溶出させることによって、前記ポリソルベートを分離する工程、ここで、Ａは、０.１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）のＨ_２Ｏ混合液であり、Ｂは、メタノールまたはアセトニトリルである；および
    （ｉｖ）荷電化粒子検出器（ＣＡＤ）を使用して、分離された前記ポリソルベートを検出し、ポリソルベートを同定する工程
    を含む、請求項１に記載の方法。
16. タンパク質サンプルを同定する方法であって、
    同定される前記タンパク質サンプルが、約１０ｐｐｍ～約５０００ｐｐｍのインタクトなポリソルベートを含有し、
    前記方法が、以下の工程：
    （ａ）前記サンプル中のポリソルベートを測定する工程であって、以下の工程：
    （ｉ）前記サンプルを有機プロトン性極性溶媒または有機非プロトン性極性溶媒に曝露することによって、前記タンパク質を沈殿させる工程、
    （ｉｉ）沈殿させた前記サンプルを遠心分離して前記タンパク質またはペプチドをペレット化することによって、沈殿させた前記サンプルから前記タンパク質を分離し、液体上清を得る工程、
    （ｉｉｉ）前記上清をクロマトグラフィーに供することによって、前記ポリソルベートを分離する工程、ここで、前記クロマトグラフィーは、前記上清を、固定化シアノ基を備える固定相カラムに適用すること、および移動相組成物グラジエントを使用して、結合した前記ポリソルベートを溶出させることを含む、および
    （ｉｖ）発色団が不要な検出器を使用して、分離された前記ポリソルベートを検出し、ポリソルベートを同定する工程
    を含む工程；
    （ｂ）インタクトなポリソルベートの濃度が約１０ｐｐｍ～約５０００ｐｐｍである前記タンパク質サンプルを、工程（ａ）から同定する工程；および
    （ｃ）工程（ｂ）において同定された前記タンパク質を単離および回収する工程
    を含む、方法。
17. 工程（ｃ）において単離された前記タンパク質サンプルが、約１０ｐｐｍ～約７００ｐｐｍのインタクトなポリソルベートを含有する、請求項１６に記載の方法。
18. 前記ポリソルベートが、ＰＳ８０である、請求項１６または１７に記載の方法。
19. 前記発色団が不要な検出器が、荷電化粒子検出器（ＣＡＤ）である、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 請求項１６～１９のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるまたは得られたタンパク質またはペプチドポリソルベート。
21. モノクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項２０に記載のタンパク質。
22. 医薬において使用するための、請求項２０または２１に記載のタンパク質。
23. ヒト対象の治療または診断のための、請求項２０または２１に記載のタンパク質の使用。
24. ヒト対象における疾患を治療するための医薬の製造における、請求項２０または２１に記載のタンパク質の使用。
25. 請求項２０または２１に記載のタンパク質を、１種または２種以上の医薬的に許容される賦形剤と組み合わせて含む、医薬製剤。

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