KR20220156058A - 생물학적 샘플 내 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스를 검출하기 위한 그래핀-기반 센서 - Google Patents
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Abstract
일 양태에서, 샘플, 예를 들어, 혈액 샘플 내 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 (SARS-CoV-2 virus)를 검출하기 위한 센서가 개시되며, 해당 센서는 그래핀 층, 기능화된 그래핀 층을 생성하기 위해 상기 그래핀 층에 연결되고, 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스의 적어도 하나의 항원결정기(epitope)에 특이적 결합을 나타내는 결합 에이전트(binding agent), 및 기능화된 그래핀 층의 전기적 특성(예를 들어, DC 전기 저항)을 측정하기 위해 상기 기능화된 그래핀 층에 전기적으로 연결된 복수의 전기 전도체를 포함한다. 일부 실시예에서 이러한 결합 에이전트는 단클론 항체이고, 다른 실시예에서 이들은 다중클론 항체일 수 있다.
Description
관련 출원에 대한 상호-참조(cross-reference to related application)
본 출원은 2020년 5월 11일; 2020년 4월 13일, 및 2020년 3월 20일에 각각 출원된 미국 임시 출원 번호 제 63/023,014호; 제 63/009,209호; 및 제 62/992,677 호에 대한 우선권을 주장한다. 전술한 출원은 그 전체로서 참조에 의해 본 개시에 통합된다.
본 개시는 일반적으로 생물학적 샘플 내 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 (SARS-CoV-2 virus)를 검출하기 위한 센서 및 이 센서를 이용한 방법에 관련되고, 보다 구체적으로 개인으로부터 얻은 비인두 샘플과 같은, 샘플 내 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스를 검출하기 위한 현장-진료(Point-of-Care, POC) 시스템이다.
코로나바이러스는 코로나바이러스과(Coronaviridae)에 속하고 인간은 물론 동물도 감염시킬 수 있는 비-분절 포지티브-센스 RNA 바이러스로 싸여 있다. 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARS-CoV) 및 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV)는 지난 20년 동안 각각 10% 및 37%의 사망률로 수천 명의 개인을 감염시켜왔다.
최근 신종 코로나바이러스(SARS-CoV-2)의 출현은 지대한 건강 및 경제적 불확실성을 야기해왔다. 전 세계에 걸친 바이러스의 많은 국가들에 급격한 전파는 세계보건기구(World Health Organization, WHO)가 세계적 대유행을 선언하게 했다. 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스에 의한 감염의 조기 발견은 바이러스 감염의 확산을 억제하고, 또는 적어도 늦추는 데 유용할 수 있다.
따라서, 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스의 검출을 위한 장치 및 방법, 특히 현장-진료(point-of-care)에서 사용될 수 있는 그러한 장치에 대한 필요성이 존재한다.
일 양태에서, 그래핀 층, 항체-기능화된 그래핀 층을 생성하기 위해 그래핀 층과 연결된 복수의 항-제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 결합 에이전트(binding agent, 예컨대 항체 및/또는 압타머(aptamer)), 및 기능화된 그래핀 층의 적어도 하나의 전기적 특성을 측정하기 위해 기능화된 그래핀 층에 전기적으로 연결된 복수의 전기 전도체를 포함하는, 생물학적 샘플, 예컨대 비인두 샘플 내 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스(SARS-CoV-2)를 검출하는 센서가 개시된다.
일부 실시예에서, 센서는 기준(reference) AC 신호, 예컨대 AC 전압(본 명세서에서 또한 "AC 신호"라고 지칭됨)뿐만 아니라, 일부 실시예에서 기능화된 그래핀 층에 대한 DC 오프셋 전압(예컨대, DC 램프 전압, 본 명세서에서 또한 "DC 신호"라고 지칭됨.) 을 인가하기 위한 기준 전극을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기준 AC 신호는 약 10 kHz에서 약 100 kHz의 범위, 또는 약 50 kHz에서 약 200 kHz의 범위, 또는 약 200 kHz에서 약 300 kHz의 범위, 또는 약 400 kHz에서 약 700 kHz의 범위와 같은, 약 1 kHz에서 약 1 MHz의 범위의 주파수를 가질 수 있고, 또한 인가된 AC 전압의 진폭 (예컨대, 피크-투-피크 진폭)은, 예를 들어, 약 100 밀리볼트에서 약 3 볼트의 범위, 예컨대 약 1 볼트에서 약 2 볼트의 범위가 될 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 일부 실시예에서, DC 램프 전압은 데이터 획득(data acquisition)동안, AC 전압과 함께 기준 전극에 인가된다. DC 램프 전압은, 예를 들어, 약 -10 볼트에서부터 약 +10 볼트까지, 예컨대, 약 -5 볼트에서부터 약 +5 볼트까지의 범위에서, 또는 약 -3 볼트에서부터 약 +3 볼트까지의 범위에서, 또는 약 -1 볼트에서부터 약 +1 볼트까지의 범위까지 변경될 수 있다.
많은 실시예에서, 샘플은 비인두 샘플, 혈액 샘플, 비강 분비물 샘플, 또는 인후 분비물 샘플과 같은, 생물학적 샘플을 포함한다.
일부 실시예에서, 항-제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 항체 및/또는 압타머는 복수의 링커를 통해 그래핀 층에 연결된다. 각각의 링커는 예를 들어 π-π 결합을 통해, 한 단부에서 그래핀 층에 연결되고, 예컨대 공유 결합을 통해, 다른 단부에서 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스의 적어도 하나의 항원결정기(epitope)에 연결된다. 일부 실시예에서, 링커는 1-피렌부톤산 숙시니미딜 에스테르 (1-pyrenebutonic acid succinimidyl ester)를 포함한다.
일부 실시예에서, 그래핀 층은 복수의 하이드록실기(hydroxyl group)으로 기능화될 수 있다. 이러한 일부 실시예에서, 항-제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 항체 및/또는 압타머는 복수의 알데하이드 부분(aldehyde moiety)을 통해 하이드록실기에 연결될 수 있다.
관련 양태에서, 예컨대 비강 면봉, 비인두 면봉, 구강인두 면봉, 타액, 전혈, 핑거스틱(fingerstick), 혈청, 및 혈장과 같은, 생물학적 샘플 내 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스를 검출하는 방법.
일부 실시예에서, 테스트하는 샘플에 항체 및/또는 압타머-기능화된 그래핀 층의 노출에 응답하여 측정되는 기능화된 그래핀 층의 적어도 하나의 전기적 특성은 항체 및/또는 압타머-기능화된 그래핀 층의 DC 전기 저항이다. 예를 들어, 항체 및/또는 압타머-기능화된 그래핀 층의 전기 저항의 변화는 샘플 내 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스가 센서의 검출 한도를 초과하여 존재하는지 여부를 결정하기 위해 측정될 수 있다.
관련 양태에서, 예컨대 비인두 샘플인, 생물학적 샘플 내 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스를 검출하기 위한 센서를 제조하는 방법이 개시되며, 이는 하부 기판 상에 놓인 그래핀 층에 예컨대 π-π 결합을 통해, 복수의 링커를 연결하는 것, 그리고 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스에 특이적 결합을 나타내는 복수의 항체 및/또는 압타머를 링커에 공유적으로 연결하는 것을 포함한다.
관련 양태에서, 예컨대 비인두 샘플인, 생물학적 샘플 내 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스를 검출하기 위한 처분가능한(disposable) 카트리지가 개시되며, 이는 샘플을 수용하기 위한 입구 포트와 출구 포트를 가지는 미세유체 구성요소(microfluidic component)를 포함한다. 센서는 출구 포트로부터 샘플의 적어도 일부를 수용하는 미세유체 구성요소와 유체적으로 연결된다. 그 센서는 그래핀 층, 항체 및/또는 압타머-기능화된 그래핀 층을 생성하기 위해 그래핀 층에 연결된 복수의 항-헤모글로빈 항체를 포함할 수 있다. 복수의 전기 전도체는 항체 및/또는 압타머-기능화된 그래핀 층의 샘플에의 노출에 응답하여 기능화된 그래핀 층의 전기적 특성을 측정하기 위해 기능화된 그래핀 층에 전기적으로 연결된다.
관련 양태에서, 그래핀-기반 센서가 개시되는데, 이는 하부 기판 상에 배치된 그래핀 층, 예컨대 반도체 또는 플라스틱 기판, 및 프로테인, 예컨대 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 또는 그것의 단편의 뉴클레오캡시드(nucleocapsid) 또는 스파이크(spike) 프로테인을 포함하고, 이는 하부 그래핀 층에 연결되고 IgG, IgM 및/또는 IgA 항체와 같은 항체에 결합할 수 있고. 이는 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스에 의한 감염에 응답하여 개인에 의해 생성된다. 적어도 한 쌍의 전기 전도성 전극은 항체-기능화된 그래핀 층에 연결되고, 예컨대 이들은 프로테인으로 기능화되지 않은 그래핀 층의 일부에 놓일 수 있고, 항체-기능화된 그래핀 층의 샘플에 노출에 응답하여 항체-기능화된 그래핀 층의 적어도 하나의 전기적 특성, 예컨대 그것의 DC 전기 저항의 측정을 허용한다. 개인으로부터 얻은 예컨대 혈청 샘플 또는 타액 샘플과 같은 샘플 내 항-제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 항체는 항체-기능화된 그래핀 층의 전기적 특성의 예상되는 변화를 관찰함으로써 검출될 수 있다.
일부 실시예에서. 본 교시에 따른 센서는 관심 있는 DNA 서열과 상보적인 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 서열을 갖는 sgRNA와 촉매적으로 불활성인 CRISPR 복합체로 기능화된 그래핀 층을 포함할 수 있다. 만약 DNA 서열 (예컨대, 표적 돌연변이를 가지는 DNA 서열)이 샘플 (예컨대, 비인두 샘플) 내 존재하는 경우, sgRNA에 대한 DNA 서열의 결합은 기능화된 그래핀 층의 적어도 하나의 전기적 특성의 변화를 야기할 수 있고, 이는 아래 논의된 바와 같이 게놈(genome) 내 돌연변이의 존재를 식별하기 위해 측정되고 분석될 수 있다.
일부 실시예에서, S 및/또는 N 프로테인은 상기 개시된 링커와 같은, 복수의 링커들을 이용해 하부 그래핀 층에 연결될 수 있다.
일부 실시예에서, 미세유체 구성요소는 PDMS (polydimethylsiloxane) 또는 PMMA (polymethyl methacrylate)와 같은, 폴리머 재료(polymeric material)로 형성된다.
본 교시의 다양한 양태에 대한 추가적인 이해는 이하에서 간단하게 설명되는 연관된 도면과 함께 후술하는 상세한 설명을 참조하여 얻을 수 있다.
도면은 반드시 축척되거나 완전한 것은 아니다. 대신, 일반적으로 본 명세서에 설명된 실시예들의 원리들을 표현하는 데 중점을 둔다. 본 명세서에 통합되고 그 일부를 구성하는 첨부된 도면은, 본 개시와 일치하는 몇 가지 실시예를 표현한다. 발명의 상세한 설명과 함께, 도면은 본 개시의 원리를 설명하는 역할을 한다.
도 1a는 일 실시예에 따른 샘플 내 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스(SARS-CoV-2 virus)를 검출하는 처분가능한(disposable) 카트리지를 개략적으로 도시한다.
도 1b는 도 1a에서 도시된 카트리지에 사용되는 그래핀-기반 센서를 개략적으로 도시한다.
도 2는 일 실시예에 따른 복수의 금속성 패드를 포함하여 테스트 중인 샘플과의 상호작용에 응답하여 그것의 전기적 특성을 측정하기 위한 그래핀-기반 센서의 개략도이다.
도 3a는 항체-기능화된 그래핀 층(antibody-functionalized graphene layer)에 인가된 전류에 응답하여, 항체-기능화된 그래핀 층에 걸쳐 유도된 전압을 측정하기 위해 사용될 수 있는 전압-측정 디바이스(device)의 예시 회로도를 도시한다.
도 3b는 항체-기능화된 그래핀 층에 인가된 전류는 물론 전압-측정 디바이스에 의해 측정된 전압을 수신하기 위해 도 3a에서 도시된 전압-측정 디바이스와 커뮤니케이션하는 분석기(analyzer)를 개략적으로 도시한다.
도 3c는 도 3a에 도시된 분석기의 구현 예를 도시한다.
도 3d는 락-인 증폭기(lock-in amplifier)를 통해 검출되는 AC 입력 신호의 인가에 응답하여 기능화된 그래핀 층에 의해 생성되는 본 교시에 따른 신호의 일 실시예를 개략적으로 도시한다.
도 4a 및 4b는 일 실시예에 따른, AC 기준 전극을 포함하는 센서를 개략적으로 도시한다.
도 4c는 일 실시예에 따른, 기판 상에 AC 기준 전극을 포함하는 센서를 개략적으로 도시한다.
도 4d는 본 교시의 일 실시예에 따른 센서의 기준 전극에 인가되는 램프 전압(ramp voltage) 및 AC 전압의 조합(combination)을 개략적으로 도시한다.
도 5는 일 실시예에 따른 그래핀-기반 센서의 어레이(array)를 개략적으로 도시한다.
도 6은 바이랄 프로테인(viral protein)의 링커를 통한 하부 그래핀 층에 연결을 도시하는 센싱 요소 중 하나의 부분도이다.
도 7은 하이드록실-기능화된(hydroxyl-functionalized) 그래핀 층을 개략적으로 도시한다.
도 8은 항체가 부착된 하이드록실-기능화된 그래핀 층을 개략적으로 도시한다.
도 9a는 미세유체 채널을 통과하는 샘플의 수동 혼합을 야기하는 본 교시에 따른 센서의 일부 실시예에서 사용될 수 있는 구불구불한(serpentine) 미세유체(microfluidic) 채널을 개략적으로 도시한다.
도 9b는 미세유체 채널을 통과하는 샘플의 수동 혼합을 야기하는 본 교시에 따른 센서의 일부 실시예에서 사용될 수 있는 나선형(spiral) 미세유체 채널을 개략적으로 도시한다.
도 10은 능동 혼합 요소가 통합된 미세유체 채널이 입구 포트로부터 본 교시에 따른 그래핀-기반 센싱 요소로 샘플을 인도하는 실시예에 따른 센서를 개략적으로 도시한다.
도 11은 복수의 센싱 요소를 가진 본 교시에 따른 센서를 개략적으로 도시한다.
도 12는 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스의 표적 뉴클레오타이드 서열의 검출을 위한 복수의 올리고뉴클레오타이드로 기능화된 그래핀 층을 포함하는 본 교시의 일 실시예에 따른 센서를 개략적으로 도시한다.
도 13은 일 실시예에 따른, 복수의 그래핀-기반 센싱 요소를 가진 센서를 개략적으로 도시한다.
도 14는 스파이크 프로테인을 포함하는 샘플에 노출된 경우 항-스파이크 프로테인 항체 및 동형 대조군 항체(isotype control antibody)로 기능화된 그래핀 층의 전도도를 비교한 실험 결과를 나타낸다.
도 1a는 일 실시예에 따른 샘플 내 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스(SARS-CoV-2 virus)를 검출하는 처분가능한(disposable) 카트리지를 개략적으로 도시한다.
도 1b는 도 1a에서 도시된 카트리지에 사용되는 그래핀-기반 센서를 개략적으로 도시한다.
도 2는 일 실시예에 따른 복수의 금속성 패드를 포함하여 테스트 중인 샘플과의 상호작용에 응답하여 그것의 전기적 특성을 측정하기 위한 그래핀-기반 센서의 개략도이다.
도 3a는 항체-기능화된 그래핀 층(antibody-functionalized graphene layer)에 인가된 전류에 응답하여, 항체-기능화된 그래핀 층에 걸쳐 유도된 전압을 측정하기 위해 사용될 수 있는 전압-측정 디바이스(device)의 예시 회로도를 도시한다.
도 3b는 항체-기능화된 그래핀 층에 인가된 전류는 물론 전압-측정 디바이스에 의해 측정된 전압을 수신하기 위해 도 3a에서 도시된 전압-측정 디바이스와 커뮤니케이션하는 분석기(analyzer)를 개략적으로 도시한다.
도 3c는 도 3a에 도시된 분석기의 구현 예를 도시한다.
도 3d는 락-인 증폭기(lock-in amplifier)를 통해 검출되는 AC 입력 신호의 인가에 응답하여 기능화된 그래핀 층에 의해 생성되는 본 교시에 따른 신호의 일 실시예를 개략적으로 도시한다.
도 4a 및 4b는 일 실시예에 따른, AC 기준 전극을 포함하는 센서를 개략적으로 도시한다.
도 4c는 일 실시예에 따른, 기판 상에 AC 기준 전극을 포함하는 센서를 개략적으로 도시한다.
도 4d는 본 교시의 일 실시예에 따른 센서의 기준 전극에 인가되는 램프 전압(ramp voltage) 및 AC 전압의 조합(combination)을 개략적으로 도시한다.
도 5는 일 실시예에 따른 그래핀-기반 센서의 어레이(array)를 개략적으로 도시한다.
도 6은 바이랄 프로테인(viral protein)의 링커를 통한 하부 그래핀 층에 연결을 도시하는 센싱 요소 중 하나의 부분도이다.
도 7은 하이드록실-기능화된(hydroxyl-functionalized) 그래핀 층을 개략적으로 도시한다.
도 8은 항체가 부착된 하이드록실-기능화된 그래핀 층을 개략적으로 도시한다.
도 9a는 미세유체 채널을 통과하는 샘플의 수동 혼합을 야기하는 본 교시에 따른 센서의 일부 실시예에서 사용될 수 있는 구불구불한(serpentine) 미세유체(microfluidic) 채널을 개략적으로 도시한다.
도 9b는 미세유체 채널을 통과하는 샘플의 수동 혼합을 야기하는 본 교시에 따른 센서의 일부 실시예에서 사용될 수 있는 나선형(spiral) 미세유체 채널을 개략적으로 도시한다.
도 10은 능동 혼합 요소가 통합된 미세유체 채널이 입구 포트로부터 본 교시에 따른 그래핀-기반 센싱 요소로 샘플을 인도하는 실시예에 따른 센서를 개략적으로 도시한다.
도 11은 복수의 센싱 요소를 가진 본 교시에 따른 센서를 개략적으로 도시한다.
도 12는 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스의 표적 뉴클레오타이드 서열의 검출을 위한 복수의 올리고뉴클레오타이드로 기능화된 그래핀 층을 포함하는 본 교시의 일 실시예에 따른 센서를 개략적으로 도시한다.
도 13은 일 실시예에 따른, 복수의 그래핀-기반 센싱 요소를 가진 센서를 개략적으로 도시한다.
도 14는 스파이크 프로테인을 포함하는 샘플에 노출된 경우 항-스파이크 프로테인 항체 및 동형 대조군 항체(isotype control antibody)로 기능화된 그래핀 층의 전도도를 비교한 실험 결과를 나타낸다.
본 개시는 일반적으로 비강 면봉, 비인두 면봉, 구강인두 면봉, 타액, 전혈, 핑거스틱, 혈청, 및 혈장과 같은, 샘플 내 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스(SARS-CoV-2 virus)에 의한 감염 또는 백신접종에 응답하여 생성된 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 및/또는 항체를 검출하기 위해 사용될 수 있는 그래핀-기반 센서에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 다양한 용어는 당업계의 통상적인 의미에 따라 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "약"은 해당 숫자 값을 중심으로 최대 5%, %10, 15%, 또는 20%의 변동을 나타낸다. 용어 "한도"는 본 교시에 따른 센서를 사용하여 양성으로 검출될 수 있는 샘플 내 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 또는 항-제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 항체의 최소 농도를 지칭한다.
일 양태에서, 본 개시는 기능화된 그래핀 층의 생성을 위해 그래핀 층에 연결된 결합 에이전트에 대한 바이러스 또는 항체의 결합과 기능화된 그래핀 층의 적어도 하나의 전기적 특성 변화의 측정을 통해 조사중인 샘플 내 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 또는 항-제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 항체를 검출할 수 있도록 하는 교시를 제공한다. 이러한 결합 에이전트의 일부 예로는, 압타머(aptamer), 항체, 항체 단편(antibody fragment) 등을 포함하고, 이에 한정되지 않는다. 다음의 설명에서, 설명의 용이성을 위해, 용어 "항체"는 임의의 적절한 결합 에이전트, 즉, 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스에 특이적 결합을 나타내는 임의의 결합 에이전트를 지칭하도록 의도된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는, 특이적 결합 친화성을 나타내는 폴리펩타이드, 예컨대, 적어도 하나의 기능성 면역글로불린 가변 도메인 서열(immunoglobulin variable domain sequence)을 포함하는, 면역글로불린 쇄(immunoglobulin chain) 또는 그것의 단편을 지칭할 수 있다. 항체는 전장(full length) 항체 및 항체 단편을 아우른다. 일부 실시예에서, 항체는 항원 결합 또는 전장 항체의 기능적 단편, 또는 전장 면역글로불린 쇄를 포함한다. 예를 들어, 전장 항체는 자연적으로 발생하거나 정상적인 면역글로불린 유전자 단편 재조합 과정을 통해 형성되는 면역글로불린(Ig) 분자(예컨대, IgG 항체)이다. 실시예에서, 항체는 면역학적으로 활성화된, 항체 단편과 같은, 면역글로불린 분자의 항원-결합 부분을 지칭한다. 예컨대, 기능적 단편(functional fragment)과 같은 항체 단편은, 항체의 일부, 예컨대, Fab, Fab', F(ab')2, F(ab)2, 가변 단편 (Fv), 도메인 항체 (dAb), 또는 단일 쇄 가변 단편 (scFv)을 포함한다. 기능적 항체 단편은 온전한(예컨대, 전장) 항체에 의해 인식된 항원과 동일한 항원에 결합한다.
용어 "항체"는 또한 "sdAb" 또는 "VHH"라고 지칭될 수 있는 도메인, 또는 신호 도메인, 항체의 전체 또는 항원 결합 단편을 아우른다. 도메인 항체는 독립형 항체 단편으로 작용할 수 있는 VH 또는 VL 중 하나를 포함한다. 또한, 도메인 항체는 중쇄-전용 항체(heavy-chain-only antibodies, HCAbs)를 포함한다. 항체 분자는 단일특이성(monospecific, 예컨대, 1가 또는 2가), 이중특이성(bispecific, 예컨대, 2가, 3가, 4가, 5가, 또는 6가), 삼중특이성(trispecific, 예컨대, 3가, 4가, 5가, 6가), 또는 더 높은 차수의 특이성(예컨대, 사중특이성(tetraspecific)) 및/또는 6가 이상의 원자가 차수가 될 수 있다. 항체 분자는 경쇄(light chain) 가변 영역의 기능적 단편 및 중쇄 가변 영역의 기능적 단편을 포함할 수 있고, 또는 중쇄 및 경쇄가 단일 폴리펩타이드로 함께 융합될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "압타머"는 표적 분자와의 특이적 결합을 나타내는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 또는 펩타이드(peptide) 분자를 지칭한다. 압타머는 일반적으로 올리고뉴클레오타이드 또는 펩타이드 서열의 큰 무작위 풀(pool)에서 선택되어 생성되지만, 천연 압타머도 또한 존재한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오타이드 결합 요소"는 RNA 또는 단일 가닥 DNA 절편과 같은, 표적 올리고뉴클레오타이드에 특이적 결합을 나타내는 임의의 프로테인, 펩타이드 및/또는 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "전기적 특성"은 전자 이동도(electron mobility), 전기 임피던스(electrical impedance, 예컨대, DC 또는 AC 전기 저항 또는 둘 다), 및/또는 전기 커패시턴스(electrical capacitance)를 포함할 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 코로나바이러스는 코로나바이러스과(Coronaviridae)에 속하고 비-분절 포지티브-센스 RNA 바이러스로 싸여 있다. 바이러스성 폐렴과 유사한 임상 증상을 보이는 중국 후베이성 우한에서 발생한 원인 불명의 일련의 폐렴 사태는 하부 호흡기 검체의 심층 염기서열 분석을 통해, 새로운 코로나바이러스가 식별되었고, 이는 2019 신종 코로나바이러스 (2019-nCoV, 본 명세서에서는 또한 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스(SARS-CoV-2)라고 지칭됨.)로 명명되었다. 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 감염으로 인해 발생되는 호흡기 증후군을 일반적으로 COVID-19라고 지칭한다.
제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스는 베타코로나바이러스 속에 속하고 약 30킬로베이스의 게놈 크기를 가지고, 이는 다중 구조 및 비-구조 프로테인을 암호화한다. 구조 프로테인은 스파이크 (S) 프로테인, 외피 (E) 프로테인, 막 (M) 프로테인,및 뉴클레오캡시드 (N) 프로테인이 포함된다.
일 양태에서, 본 교시는 비인두 샘플과 같은 연구 중인 샘플 내 존재하는 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스에 대해 특이적 결합을 나타내도록 구성된 항체-기능화된 그래핀 층을 가지는 그래핀-기반 센서를 제공한다. 하기 논의되는 바와 같이, S 또는 N 프로테인과 같은, 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스의 적어도 하나의 프로테인의 적어도 하나의 항원결정기(epitope)에 대한 특이적 결합을 나타내는 단클론 및 다중클론 항체가 사용될 수 있다.
도 1a는 일 실시예에 따른 카트리지(100, 본 명세서에서 또한 카세트라고 지칭됨)를 개략적으로 도시하는데 이는 예컨대 비인두 샘플과 같은 샘플 내, 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 많은 실시예에서, 카트리지(100)는 1회용(single-use) 및 처분가능한(disposable) 카트리지이다.
카트리지(100)는 조사 중인 샘플을 센서(400)에 전달하는 미세유체 전달 구성요소(microfluidic delivery component, 200)를 포함한다. 해당 실시예에서, 미세유체 전달 구성요소(200)는 샘플이 미세유체 전달 구성요소 내로 도입될 수 있는 입구 포트(202)로부터 샘플이 센서(400)로 전달될 수 있는 출구 포트(203)로 확장하는 적어도 하나의 유체 채널 (201)을 포함한다. 일부 실시예에서, 미세유체 채널은 모세관 현상(capillary action)에 기초하여 기능할 수 있다. 일부 실시예에서, 미세유체 전달 구성요소(200)는 PDMS (polydimethylsiloxane) 또는 PMMA (polymethyl methacrylate)와 같은 폴리머 재료(polymeric material)로 구성될 수 있고, 미세유체 채널은 에칭(etching) 또는 당업계에 공지된 다른 기술로 형성될 수 있다.
도 1b 및 1c에 도시된 바와 같이, 해당 실시예에서, 센서(400)는 하부 기판(12) 상에 배치되는 그래핀 층(14)을 포함한다. 일부 실시예에서 기판은 반도체일 수 있고, 다른 실시예에서는, 폴리머 기판일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서는, 기판은 실리콘 기판일 수 있고, 다른 실시예에서는 플라스틱 기판일 수 있다. 예를 들어, 하부 기판은 PDMS로 형성될 수 있다. 그리고, 다른 실시예에서는, 하부 기판은 구리 기판과 같은, 금속 기판일 수 있다. 해당 실시예에서, 기판(12)은 실리콘 기판이고 실리콘 산화물 층(13)은 그래핀 층으로부터 기판(12)를 분리한다.
해당 실시예에서, 그래핀 층은 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스의 적어도 하나의 항원결정기에 특이적 결합을 나타내는 복수의 항체(16)로 기능화된다. 항체(16)는 단클론 또는 다중클론 항체일 수 있다. 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스에 특이적 결합을 나타내는 단클론 항체를 생성하는 방법의 예시는 다음과 같다. 또한, 상업적으로 이용가능한 항-제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 항체의 일부 예는 다음을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스를 위한 Anti-N :
mouse mAb from Genetex (GTX632269)
mouse mAb from Ray Biotech (128-10166-1)
mouse mAb from MyBiosource (MBS569937)
제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스를 위한 Anti-S :
mouse mAb from Ray Biotech (128-10168-1)
rabbit pAb from Sino Biological (40150-T62)
rabbit pAb from Sino Biological (40150-R007)
도 1b에서 개략적으로 도시된 바와 같이, 항-제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 항체(anti-SARS-CoV-2 antibodies)를 하부 그래핀 층에 연결하기 위하여, 다양한 링커 분자(linker molecules, 18)가 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 1-피렌부톤산 숙시니미딜 에스테르 (1-pyrenebutonic acid succinimidyl ester)가 하부 그래핀 층에 항-제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 항체를 연결하는 것을 용이하게 하기 위하여 링커로서 사용된다. 해당 실시예에서, 복수의 항-제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 항체는 그래핀 층의 일부, 또는 전체 표면을 커버할 수 있다. 다양한 실시예에서, 분율(fraction)은 그래핀 층 표면의 적어도 약 60% 이상, 적어도 약 70% 이상, 적어도 약 80% 이상, 또는 100%일 수 있다. 그래핀 층 표면의 나머지 부분 (즉, 항체로 기능화되지 않은 표면)은 패시베이션 층(passivation layer, 20)을 통해 패시베이트(passivate)될 수 있다. 예를 들어, 패시베이션 층은 Tween 20, BLOTTO, BSA (Bovine Serum Albumin), 젤라틴 또는 3mM APA (amino-PEGS-alcohol)를 이용하여 형성될 수 있다.
패시베이션 층은 그래핀 층 상에 도입된 관심 있는 샘플과 항체로 기능화되지 않은 그래핀 층의 영역과의 상호작용을 억제할 수 있고, 바람직하게는 방지할 수 있다. 이는 결과적으로 항체 분자와 관심 있는 분석물의 상호작용의 결과로서 생성될 전기 신호 내 노이즈를 낮출 수 있다.
예를 들어, 일부 실시예에서, 하부 기판 (예컨대, 플라스틱, 실리콘과 같은 반도체, 또는 구리 필름과 같은 금속 기판) 상에 형성된 그래핀 층은 상온에서 몇 시간 (예컨대, 2 시간)동안 링커 분자 (예컨대, 1-피렌부톤산 숙시니미딜 에스테르의 5 mM 용액)와 함께 인큐베이트(incubate)될 수 있다.
그 다음 링커 변형된 그래핀 층(linker modified graphene layer)은 선택된 온도 및 선택된 기간 (예컨대, 4°C에서 7-10 시간) 동안 완충 용액 (예컨대, NaCO3-NaHCO3 완충 용액 (pH 9))에서 관심 있는 항체와 함께 인큐베이트될 수 있고, 이어서 탈이온(DI) 수 및 인산염 완충 용액(phosphate buffered solution, PBS)으로 헹군다. 미반응 숙시니미딜 에스테르 기를 켄치(quench)하기 위해, 변형된 그래핀 층은 에탄올아민(ethanolamine)과 함께 인큐베이트될 수 있다. (예컨대, 1 시간 동안 pH 9의 0.1 M 용액).
그 후에, 비-기능화된 그래핀 영역은 도 1b에 개략적으로 도시된 패시베이션 층(20)과 같은, 패시베이션 층을 통해 패시베이트될 수 있다. 예를 들어, 그래핀 층의 비-기능화된 영역의 패시베이션은 예컨대 0.1% Tween 20을 통해 이루어질 수 있다.
일부 실시예에서, 그래핀 층은 π-π 상호작용을 통해 하부 그래핀 층에 연결될 수 있는, 프로테인 G(PrG)로 기능화될 수 있다. 그러고 항체는 PrG에 공유적으로 부착될 수 있다. 일부 실시예에서, PrG는 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스의 검출을 향상시키도록 항체를 유리하게 배향(orient)시킬 수 있다. 예를 들어, 하부 기판 상에 놓인 그래핀 층은 DMF (디메틸 포름아미드, dimethyl formamide) 내 PrG 용액 (예컨대, 100 pg/ml)에서 몇 시간 (예컨대, 2-10 시간) 동안 인큐베이트될 수 있다. PrG로 그래핀 층을 기능화하는 것에 대한 추가 세부사항은, 예컨대 Scientific Reports (2019) 9:1273의, "An investigation into non-covalent functionalization of a single-walled carbon nanotube and a graphene sheet with protein G: A combined experimental and molecular dynamics study,"라는 제목의 아티클에서 찾을 수 있으며, 이는 그 전체로서 참조에 의해 본 개시에 통합된다.
그 다음 PrG 기능화된 그래핀층은 선택된 온도 및 선택된 기간 (예컨대, 4°C에서 7-10 시간) 동안 완충 용액 (예컨대, NaCO3-NaHCO3 완충 용액 (pH 9))에서 관심 있는 항체와 함께 인큐베이트될 수 있고, 이어서 탈이온(DI) 수 및 인산염 완충 용액(phosphate buffered solution, PBS)으로 헹군다. 미반응 숙시니미딜 에스테르 기를 켄치하기 위해, 변형된 그래핀 층은 에탄올아민과 함께 인큐베이트될 수 있다. (예컨대, 1 시간 동안 pH 9의 0.1 M 용액). 하부 그래핀 층에 항체를 연결하기 위한 PrG 프로테인의 사용이 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스에 특이적 결합을 나타내는 항체와 관련하여 본 명세서에서 논의되지만, 이러한 PrG 기능화된 그래핀 층은 또한 다른 유형의 항체, 예컨대 클라미디아(chlamydia)와 같은 다른 병원체에 특이적 결합을 나타내는 항체를 그래핀 층에 연결하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시예에서, 그래핀 층을 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스와 관련된 적어도 하나의 프로테인에 특이적 결합을 나타내는 항체로 기능화하는 것보다, 감염된 사람으로부터 추출한 생물학적 샘플 내 감염된 사람에 의해 생성된 항체를 검출하기 위해 그래핀 층은 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스와 관련된 하나 또는 그 이상의 프로테인으로 기능화될 수 있다. 이러한 실시예에서, 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스에 대해 반응성인 항체의 존재는 그 사람이 이전 감염 또는 백신접종의 결과로 COVID-19에 면역임을 나타낼 수 있다.
제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스에 감염되고 2~3일 후에, 사람의 면역 체계는 아형 항체 (IgM)을 방출한다. 감염이 진행됨에 따라, 이 반응은 주로 IgG 아형 반응으로 바뀐다. 이 항체는 그래핀 층에 연결되는 바이랄 프로테인에 결합할 수 있고 그래핀 층의 전기적 특성, 예컨대 전기 저항의 변화를 일으킬 수 있다. 예를 들어, 이러한 일부 실시예에서, 그래핀 층은 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스와 관련된 N 및/또는 S 프로테인으로 기능화될 수 있다. 또한, 타액 샘플에는 IgA 항체가 포함될 수 있다.
보다 구체적으로, 환자로부터 추출한 생물학적 샘플, 예컨대 혈액 또는 타액 샘플은, 기능화된 그래핀 층과 접촉하게 될 수 있고 기능화된 그래핀 층의 전기적 특성의 변화, 예컨대 그것의 DC 전기 저항의 변화는, 생물학적 샘플 내 이러한 항체의 존재를 검출하기 위해 예컨대 본 명세서에서 개시된 방식으로 측정될 수 있다.
일부 실시예에서, 본 교시에 따른 카트리지는 센싱 요소의 어레이 (예컨대, 도 5 참조) 를 포함할 수 있고, 여기서 적어도 2개의 센싱요소는 상이한 바이랄 프로테인으로 기능화된 그래핀 층을 가진다. 예를 들어, 센싱 요소 중 하나는 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스와 관련된 N 프로테인으로 기능화될 수 있고, 다른 하나는 S 프로테인으로 기능화될 수 있다. 이러한 일부 실시예에서, 이러한 센싱 요소에 의해 생성되는 신호는 결과 신호(resultant signal)를 생성하기 위해 평균화될 수 있고, 이는 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스에 감염되었던 것으로 의심되는 개인으로부터 추출한 생물학적 샘플 내 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스의 검출을 위해 분석될 수 있다.
도 2는 일부 실시예에 따른 센서(400) 를 도시하고, 이는 전기 전도성 패드 (22a, 22b, 24a 및 24b)를 포함하고, 이는 샘플 내 존재하는 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스와 그래핀 층(14)에 연결된 항-제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 항체의 상호작용에 응답하여 기능화된 그래핀 층(14)의 전기적 특성, 예컨대 그것의 전기 저항의 변조(modulation)의 4점 측정(four point measurement)을 가능하게 한다. 특히, 해당 실시예에서, 그래핀 층(14)에 연결된 항-제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 항체와 테스트 중인 샘플 내 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스의 상호작용에 의해 발생되는 하부 그래핀 층(14)의 전기적 특성의 변화를 측정을 가능하게 하기 위해 전도 패드(22a/22b)는 기판(12) 상에 배치되고 기능화된 그래핀 층(14)의 일 단부에 전기적으로 연결되고 또한 전도 패드(24a/24b)는 기판(12) 상에 배치되고 기능화된 그래핀 층(14)의 반대편 단부에 전기적으로 연결된다. 예를 들어, 해당 실시예에서, 하부 그래핀 층(14)의 DC 저항의 변화는 테스트 중인 생물학적 샘플, 예컨대 비인두 샘플, 혈장 샘플 내 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스의 존재를 결정하기 위하여 모니터링될 수 있다.
다른 실시예에서, 그래핀/항체 시스템의 DC 저항 및 커패시턴스의 조합(combination)에 의해 특징지어지는 그래핀 층(14)의 전기 임피던스의 변화는 테스트 중인 샘플 내 프로테인을 검출하기 위해 모니터링될 수 있다. 전기 전도 패드는 무엇보다도, 구리 및 구리 합금과 같은, 다양한 금속을 사용하여 형성될 수 있다.
예를 들어, 도 3a는 본 교시의 일부 실시예에서 사용될 수 있는 전압 측정 회로(301)를 개략적으로 도시한다. 이 개략도는 항체-기능화된 그래핀 층에 대응하는 등가 회로로서의 센서(302)를 도시한다. 고정 전압 V (예컨대, 1.2 볼트)은 버퍼 연산 증폭기(buffer operational amplifier, 303)의 출력에서 생성된다. 이 전압은 다운스트림(downstream) 연산 증폭기(304)의 한 입력(A)에 인가되고 증폭기의 다른 입력 B가 저항 R1을 통해 VR1 접지에 연결된다. 연산 증폭기(304)의 출력 (Vout1)은 센서(302)의 한 단부에 연결되고 VR1 접지에 연결되지 않은 저항 R1의 단부는 센서(302)의 다른 단부에 연결된다(이 개략도에서, 저항 R2는 등가 센서(302)의 한 단부에 있는 두 전극 패드 사이의 저항을 표시하고, 저항 R3은 센서의 두 내부 전극 사이에서 확장되는 그래핀 층의 저항을 표시하고, 그리고 저항 R4는 센서의 다른 단부에 있는 두 전극 패드 사이의 저항을 표시한다). 연산증폭기가 VR1 접지에 연결되지 않은 저항 R1의 단부의 전압을 그것의 입력 (A)에 인가되는 고정 전압, 예컨대 1.2 볼트로 유지함에 따라, 센서(302)를 통해 정전류 흐름(constant current flow)을 제공하고 저항 R1 및 VR1을 통해 접지로 복귀하는 정전류 소스(constant current source)가 생성된다.
항체-기능화된 그래핀 층에 걸쳐 생성된 전압은 센서의 두 내부 전극을 통해 측정된다. 구체적으로, 한 쌍의 내부 전극 패드는 버퍼 연산 증폭기(306)에 연결되고 다른 한 쌍은 그리고 다른 버퍼 연산 증폭기(308)에 연결된다. 항체-기능화된 그래핀 층에 걸친 전압 차이를 제공하는 출력 포트를 가진 차동 증폭기(310)의 입력 포트에 버퍼 연산 증폭기의 출력이 인가된다. 그 다음 이러한 전압 차이(Vout1 - GLO)는 항체-기능화된 그래핀 층에 의해 나타나는 저항을 측정하기 위해 이용될 수 있다. R3을 통해 강제되는 전류는 I = (Vref - VR1)/R1 에 의해 정해지고, 여기서 VR1의 값은 디지털적으로 제어된다. 전류 I의 각각의 값들에 대하여, 상응하는 전압(Vout1_GLO)은 측정되고 저장된다. 항체-기능화된 그래핀 층의 저항은 전류 I에 대한 전압인 Vout1￢_GLO의 미분으로 계산될 수 있고, 즉, R = dV/dI 이다.
도 3b에서 개략적으로 도시된 바와 같이, 일부 실시예에서는, 분석기(600)는 인가된 전류 및 측정된 전압 값을 수신하고 이 값들을 항체-기능화된 그래핀 층의 저항을 계산하는데 이용하기 위해 전압 측정 회로(301)와 커뮤니케이션할 수 있다. 그 다음, 분석기(600)는 계산된 저항값, 예컨대 조사 중인 샘플에 대한 항체-기능화된 그래핀 층의 노출에 응답한 저항의 변화를 사용하여, 샘플이 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스를 함유하는지 여부를 본 교시에 따라 결정하기 위해 사용할 수 있다.
예를 들어, 도 3c에서 개략적으로 도시된 바와 같이, 해당 실시예에서, 분석기(600)는 프로세서(602), 분석 모듈(604), 랜덤 액세스 메모리(RAM, 606), 영구 메모리(608), 데이터베이스(610), 커뮤니케이션 모듈(612), 그래픽 유저 인터페이스(GUI, 614)를 포함할 수 있다. 분석기(600)는 인가된 전류 및 측정된 전압의 값을 수신하기 위하여 전압 측정 회로(301)와 커뮤니케이션하는 커뮤니케이션 모듈(612)을 사용할 수 있다. 커뮤니케이션 모듈(612)은 유선 또는 무선 커뮤니케이션 모듈일 수 있다. 분석기(600)는 사용자가 분석기(600)와 상호작용할 수 있도록 하는 그래픽 유저 인터페이스(614)를 더 포함한다.
예를 들어, 분석 모듈(604)은 조사중인 샘플에 대한 항체-기능화된 그래핀 층의 노출에 응답하여 항체-기능화된 그래핀 층의 저항의 변화를 계산하기 위하여 항체-기능화된 그래핀 층에 인가된 전류의 값은 물론 그래핀 층에 걸쳐 유도된 전압을 사용할 수 있다(예컨대, 옴의 법칙을 이용하여). 이러한 계산을 위한 명령은 영구 메모리(608)에 저장될 수 있고 분석 모듈(604)에 의해 사용하기 위해 프로세서(602)를 통해 런타임(runtime)에 RAM(606)으로 전송될 수 있다. GUI(614)는 사용자가 분석기(600)와 상호작용할 수 있도록 한다.
일부 실시예에서, 분석기(600)는 AC (alternating current) 전류원을 포함할 수 있고, 이는 그래핀 층에 공지된 진폭 및 주파수를 가지는 AC 전류를 인가할 수 있다. 특히, 다양한 실시예는 약 1 kHz에서 약 1 MHz의 범위의, 예컨대, 약 10 kHz에서 약 500 kHz의 범위, 또는 약 20 kHz에서 약 400 kHz의 범위, 또는 약 30 kHz에서 약 300 kHz의 범위, 또는 약 40 kHz에서 약 200 kHz의 범위의 주파수를 가지는 AC 전압을 유리하게 사용할 수 있다. 예를 들어, 기준 전극에 인가되는 AC 전압의 진폭은 약 1 밀리볼트에서 약 3 볼트의 범위, 예컨대 약 100 밀리볼트에서 약 2 볼트의 범위, 또는 약 200 밀리볼트에서 약 1 볼트의 범위, 또는 약 300 밀리볼트에서 약 1 볼트의 범위, 예컨대, 약 0.5 볼트에서 1 볼트의 범위일 수 있다.
분석기(600)는 그래핀 층에 대한 AC 전류의 인가에 응답하여 그래핀 층에 걸쳐 유도되는 AC 전압을 측정하기 위해 AC 전압계 회로를 더 포함할 수 있다. 유도된 AC 전압의 진폭 및/또는 위상 변화를 측정함으로써, 그래핀 층의 전기 임피던스는 당업계에 공지된 방식으로 결정될 수 있다. 다른 실시예에서, 고정된 주파수 및 진폭을 가지는 AC 전압이 기능화된 그래핀 층에 인가될 수 있고 그래핀 층에 연결된 항체에 대한 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스의 특이적 결합을 검출하기 위해 모니터링될 수 있다.
도 3d에 개략적으로 도시된 바와 같이, 일부 실시예에서, AC 전압원(311)은 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스에 특이적 결합을 나타내는 항체로 기능화된 그래핀 층과 같은, 항체-기능화된 그래핀 층에 걸쳐서, 또는 이를 통하여, 예컨대, 약 20 kHz에서 약 100 MHz의 범위의 주파수를 가지는 AC 전압 또는 AC 전류를 인가하기 위해 활용될 수 있다. AC 전압 또는 전류는 또한 AC 전압 또는 전류 (예컨대, 기능화된 그래핀 층에 인가되는 신호에 따른 AC 전압 또는 전류)의 인가에 응답하여 입력 포트가 기능화된 그래핀 층과 관련된 신호를 수신하는 락-인 증폭기(lock-in amplifier, 312)에 기준 신호를 제공할 수 있다. 락-인 증폭기(312)의 출력은 관심 있는 항원 (예컨대, 해당 예에서 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스)이 연구 중인 샘플 내 존재하는지 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 락-인 증폭기(312)의 출력이 기정의된 임계값을 초과하는 경우, 표적 분석물 (예컨대, 항-제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 또는 바이러스 감염에 반응하여 생성된 항체)의 존재를 확인할 수 있다. 락-인 검출에 대한 설명이 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스의 검출과 관련하여 본 명세서에 제공되지만, 클라미디아 박테리아와 같은, 다른 유형의 병원체를 검출하기 위해 사용될 수 있음을 이해해야 한다.
본 교시의 일부 실시예의 실시에 사용될 수 있는 적합한 분석기에 대한 추가 세부사항은, 예컨대 "Device and Method for Chemical Analysis," 라는 제목의 미국 특허번호 제9,664,674호에서 찾을 수 있으며, 이는 그 전체로서 참조에 의해 본 개시에 통합된다.
도 4a, 4b, 및 4c는 본 교시에 따른 센서(700)의 다른 실시예를 개략적으로 도시한다. 센서(700)는 예컨대 반도체 기판인, 하부 기판(702) 상에 배치되고, 항-제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 항체(703)로 기능화된 그래핀 층(701)을 포함한다. 그래핀 층(701)의 표면의 나머지 (즉, 항체로 기능화되지 않은 표면 영역)은 패시베이션 층(708)을 통해 패시베이트될 수 있다. 해당 실시예에서, 실리콘 산화물 층(706)은 그래핀 층을 하부 기판으로부터 분리한다. 샘플과 기능화된 그래핀 층의 상호작용에 응답하여 기능화된 그래핀 층의 하나 또는 그 이상의 전기적 파라미터의 변화를 측정할 수 있도록 허용하는 소스 전극 (S) 및 드레인 전극 (D)은 그래핀 층에 전기적으로 결합된다.
도 4c를 참조하면, 기능화된 그래핀 층(701)의 전기적 특성 변조의 4점 측정을 위하여, 센서(700)는 도 2에 도시된 실시예와 비슷하게 전기 전도 패드 (722a, 722b, 724a, 및 724b)를 포함할 수 있다. 센서(700)는 그래핀 층에 근접하게 배치된 기준 전극 (G, 705)을 더 포함한다. 일부 실시예에서, 기준 전극(G, 705)은 그래핀 층(701)이 배치된 것과 동일한 기판(702)에 배치된다(즉, 기준 전극(705)은 그래핀 층(701)과 실질적으로 동일한 평면에 있음). 도 4c에서 도시된 바와 같이, 일부 실시예에서, 기준 전극(705)은 그래핀 층(701)을 실질적으로 둘러쌀(substantially surround) 수 있다. 위에서 논의된 방식으로, 기준 전극(705)에 AC 전압은 물론 DC 램프 전압의 인가를 허용하기 위하여 기준 전극(705)은 추가 전도 패드(726, 728)에 전기적으로 연결될 수 있다.
사용 시에, 일부 실시예에서, 샘플 내 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스를 검추라기 위해, 기능화된 그래핀 층과, 예컨대 인간 혈청과 같은 샘플의 상호작용에 응답하여 기능화된 그래핀 층의 전기 저항의 변화가 측정될 수 있다.
일부 실시예에서, 기준 전극에 대한 AC (alternating current) 전압원(704)을 통한 AC 기준 전압의 인가는 하나 또는 그 이상의 기능화된 그래핀의 전기적 특성, 예컨대, 항체에 대한 특이적 결합을 나타내는 분석물과 항체의 상호작용에 응답하여 그것의 저항의 변화의 검출을 용이하게 할 수 있다. 특히, 일부 실시예에서, 약 1 kHz에서 약 1 MHz의 범위의 주파수, 예컨대, 약 10 kHz에서 약 500 kHz의 범위, 또는 약 20 kHz에서 약 100 kHz의 범위의 주파수를 가진 AC 전압이 이와 관련해 특히 유리하게 사용될 수 있다. 예를 들어, 기준 전극에 인가되는 AC 전압의 진폭은 약 1 밀리볼트에서 약 3 볼트의 범위, 예를 들어, 0.5 볼트에서 1 볼트의 범위일 수 있다. 또한, 일부 경우에, 기준 전극에 인가되는 전압은 AC 성분 및 DC 오프셋을 가질 수 있고, DC 오프셋은 약 -40 볼트에서 약 +40 볼트의 범위, 예컨대 -1 볼트에서 약 +1 볼트의 범위일 수 있다.
예시로서, 도 4d는 전압(3014)을 초래하는, 기준 전극에 인가되는 AC 전압(3010) 및 DC 오프셋 전압(3012)의 조합(combination)을 개략적으로 도시한다. 예를 들어, DC 오프셋 전압은 약 -10 볼트에서부터 약 10 볼트까지 (예컨대, -1 볼트에서부터 약 1 볼트까지) 확장될 수 있고, 인가된 AC 전압은 상기에 개시된 주파수 및 진폭을 가질 수 있다.
추가로, DC 소스(709)는 항체-기능화된 그래핀 층에 DC 전압 또는 전류를 인가할 수 있고, 여기서 인가된 DC 전압 또는 전류에 항체-기능화된 층의 전기적 응답의 기정의된 변화는 연구 중인 샘플 내 표적 분석물의 존재를 표시할 수 있다. 컨트롤러(711)는 AC 및 DC 소스의 동작을 제어할 수 있다. 컨트롤러는 본 교시에 의해 알려진 바와 같이 당업계에 공지된 기술을 사용하여 하드웨어, 소프트웨어 및/또는 펌웨어로 구현될 수 있다. 예를 들어, 컨트롤러는 분석기를 위한 도 3c와 관련하여 상기 논의된 방식을 통해 구현될 수 있다.
임의의 특정 이론에 제한되지 않고, 일부 실시예에서, 기준 전극에 대한 이러한 전압의 인가는 샘플이 테스트될 때, 기능화된 그래핀 층이 접촉하게 되는, 예컨대 인간 혈청과 같은, 샘플에 관련된 유효 커패시턴스를 최소화, 및 바람직하게는 제거할 수 있고, 이에 의해 항체(703)와 각각의 항원의 상호작용에 응답하여 하부 그래핀 층의 저항의 변화의 검출을 용이하게 한다. 일부 경우에, 샘플의 유효 커패시턴스는 샘플 내 존재하는 이온에 의한 것일 수 있다.
본 교시의 센서 및 방법은 상기 논의된 바와 같은 다양한 샘플 내 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스를 검출하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시예에서, 본 교시에 따른 센서는 센싱 요소의 어레이 (array of sensing elements)를 포함할 수 있고 이것의 신호는 예컨대 혈장 샘플과 같은, 샘플 내 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스의 존재 또는 부존재를 표시하는 결과 신호 (예컨대, 기정의된 임계값 초과)를 생성하기 위하여 평균화될 수 있다.
예를 들어, 도 5는 이러한 복수의 센싱 요소 (52a, 52b, 52c, 및 52d, 본 명세서에서는 집합적으로 센싱 요소(52)라고 지칭됨), 및 센싱 요소 (54a, 54b, 54c, 및 54d, 본 명세서에서는 집합적으로 센싱 요소(54)라고 지칭됨)를 가진 센서(50)를 개략적으로 도시한다. 센싱 요소(52 및 54) 각각은 항-제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 항체로 기능화된 그래핀 층을 포함하고 센서(400 또는 700)와 관련하여 상기 논의된 바와 유사한 구조를 가진다. 일부 실시예에서, 상이한 센싱 요소는 상이한 종류의 항-제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 항체, 예컨대 상이한 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스의 항원결정기에 특이적 결합을 나타내는 항체로 기능화될 수 있다. 일부 실시예에서, 센싱 요소(52)에 의해 생성되는 신호는 결과 신호를 생성하기 위하여 평균화될 수 있다. 또한, 일부 실시예에서, 센싱 요소(52)의 적어도 하나는, 예컨대 인간 혈청과 같은, 샘플 내 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스의 수량화(quantification)를 허용하는 교정 센싱 요소(calibration sensing element)로 구성될 수 있다. 예를 들어, 교정은 교정된 샘플을 활용하고 교정 샘플에 노출에 응답하는 기능화된 그래핀 층의 적어도 하나의 전기적 특성, 예컨대 그것의 전기적 변화 의 변화를 검출함으로써 달성될 수 있다.
일부 실시예에서, 그래핀 층을 항-제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 항체로 기능화하는 것 대신에 또는 이에 더하여, 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 감염 또는 백신접종에 응답하여 개인에 의해 생성된 항체 (예컨대, 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스에 대해 반응성인 항체)를 검출하기 위해, 그래핀 층은 하나 또는 그 이상의 바이랄 프로테인, 예컨대 N 및/또는 S 프로테인으로 기능화될 수 있다. 도 6은 본 명세서에서 개시된 바와 같은, 복수의 링커(802)를 통해 복수의 S 및/또는 N 프로테인(803)과 연결되는 기판(801)을 포함하는 이러한 센서의 부분 개략도이다.
도 7 및 8을 참조하면, 일부 실시예에서, 센서(1000)는 알데하이드 부분(aldehyde moiety)를 함유하는 분자를 통해 항-제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 항체로 추가로 기능화된 하이드록실-기능화된 그래핀 층(1001)을 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 도 8를 참조하면, 해당 실시예에서, 하이드록실-기능화된 그래핀 층(1001)은 표면의 수성 실란화(aqueous silanization)을 허용하기 위해 1시간 동안 95% 에탄올 내 2% 3-아미노프로필 트리에톡시실란 (3-Aminopropyl triethoxysilane, APTES)에 인큐베이트될 수 있다. 그래핀 층은 몇 시간동안 (예컨대, 2시간동안) 밀리-큐 워터 (milli-Q water) 내 2.5% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)에서 인큐베이트될 수 있다. 이 인큐베이션은 알데하이드기(aldehyde group, -COH)를 만들 수 있고, 이는 예컨대 공유 결합을 통해, 항체의 아민기(amine group, -NH2 )와 반응할 수 있고, 따라서 항체를 하이드록실-기능화된 그래핀 층에 연결할 수 있다.
이전 실시예와 유사하게, 해당 실시예에서, 그래핀 층(1001)은 하부 기판(1002)에 초기에 놓일 수 있다. 하부 기판(1002)은, 예를 들어, 실리콘과 같은, 반도체, 또는 예컨대 플라스틱과 같은, 폴리머 기판일 수 있다.
도 8에는 도시되지 않았지만, 상기 센서(700)와 유사하게, 센서(1000)는 항체-기능화된 그래핀 층에 대한 전기 신호 (예컨대, 전류 또는 전압)의 인가를 허용하고 항체-기능화된 그래핀 층의 적어도 하나의 전기적 특성, 예컨대 그것의 DC 전기 저항을 모니터링할 수 있는 금속 패드를 포함한다.
본 교시에 따른 그래핀-기반 센서의 장점은 최소한의 전문 지식을 가진 일반인도 시료 채취 시점에 활용할 수 있다는 점이다. 본 교시에 따른 그래핀-기반 센서의 또 다른 장점은 검출 결과를 신속하게 제공할 수 있다는 점이다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 본 교시에 따른 그래핀-기반 센서는 샘플 준비 단계를 포함하여 수분 내, 예컨대 1-5분 이내에 인간 혈청과 같은 샘플 내 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스를 검출하고 수량화할 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 일부 실시예에서, 본 교시에 따른 센서는 예컨대, 혈액과 같은 샘플을, 샘플을 수용하는 입구 포트로부터 샘플이 이를 통해 본 교시에 따른 그래핀-기반 센싱 요소로 전달되는 출구 포트로 인도하는 미세유체 채널을 포함할 수 있다. 이러한 일부 실시예에서, 이러한 미세유채 채널은 샘플이 미세유체 채널을 통해 통과할 때 샘플을 혼합하기 위해 수동 및/또는 능동 혼합 요소를 포함할 수 있다.
예를 들어, 도 9a는 입구 포트(901)에서 출구 포트(902)까지 확장된 구불구불한 형상을 갖는 이러한 미세유체 채널(900)을 개략적으로 도시하고, 여기서 미세유채 채널의 구불구불한 형상은 샘플이 채널을 통해 통과할 때 샘플의 수동적인 혼합을 제공한다. 도 9b는 입구 포트(921)에서 출구 포트(922)까지 확장된 나선형 형상을 갖는 이러한 미세유체 채널(920)을 개략적으로 도시하고, 여기서 미세유체 채널의 구불구불한 형상은 샘플이 채널을 통해 통과할 때 샘플의 수동적인 혼합을 제공한다. 다른 형상, 예컨대 헤링본(herringbone)과 같은 형상도 또한 샘플의 혼합을 제공할 수 있는 미세유체 채널을 위해 사용될 수 있다. 또한, 일부 실시예에서, 샘플이 채널을 통해 통과할 때 샘플의 혼합을 제공하기 위해 채널의 형상을 구성하는 대신 또는 이에 더하여 미세유체 채널에 장애물이 제공될 수 있다.
그러나, 다른 실시예에서, 본 교시에 따른 센서는 예컨대 인간 혈청과 같은, 샘플의 혼합을 위하여 능동 혼합 요소, 미세유체 펌프(micro-fluidic pump)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 7c에서 개략적으로 도시된 바와 같이, 일부 실시예에서, 하나 또는 그 이상의 압전 소자(940)는 미세유체 채널(941) 내 배치될 수 있고, 이는 입구 포트(943)에서 출구 포트(944)로 확장되고, 이는 샘플을 본 교시에 따른 그래핀-기반 센싱 요소(945)에 전달한다. 압전 소자(940)는 샘플이 미세유체 채널(941)을 통해 통과할 때 샘플의 혼합을 야기하기 위해 작동될 수 있다.
제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스의 역학(epidemiology)과 관련하여, 2003년 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS) 발병을 연구하고 감염 발병 후 바이러스 역가(titer)의 시간적 변화를 보고했다 (Chen et al., "Cellular Immune Responses to Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus (SARS-CoV) Infection in Senescent BALB/c Mice: CD4+ T Cells Are Important in Control of SARS-CoV Infection," J. Virol., 2010, 84 (3) 1289-1301; Hsueh et al., "Chronological evolution of IgM, IgA, IgG and neutralization antibodies after infection with SARS-associated coronavirus," Clin. Microbiol. Infect., 2004, 10(12) 1062-1066; Glass et al., "Mechanisms of host defense following severe acute respiratory syndrome coronavirus pulmonary infection of mice," J. Immunol., 2004, 173(6) 4030-4039; Zhu, "SARS Immunity and Vaccination," Cell. Mol. Immunol., 2004, 1(3) 193-198). 바이러스 역가의 피크는 감염 후 3-4일 경에 발생하고, 감염 발병 후 8-9일 경에 매우 낮은 값으로 감소한다. 이 시점에서, 감염된 개인은 IgM 역가보다 빠르게 증가하는 IgG 역가에 대한 감염에 응답하여 IgG 및 IgM 항체를 생산하기 시작한다.
일부 실시예에서, 본 교시에 따른 센서는 다중 그래핀-기반 센싱 요소를 포함할 수 있고, 이들 중 하나는 적어도 하나의 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스의 바이랄 프로테인, 예컨대 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스의 N 및/또는 S 프로테인에 특이적 결합을 나타내는 항체로 기능화될 수 있고, 이들 중 다른 하나는 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스의 N 바이랄 프로테인으로 기능화되고, 다른 하나는 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스의 S 바이랄 프로테인으로 기능화될 수 있다.
제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스를 검출하도록 구성된 센싱 요소는 개인으로부터, 비강 면봉, 예컨대 비인두 면봉을 통해 얻은 샘플 내 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스가 검출될 수 있는지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있다. 이러한 일부 실시예에서, 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스에 감염된 것으로 의심되는 개인을 테스트하기 위해 사용된 비강 면봉으로 수집된 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스를 추출하기 위해 인산염 완충 용액이 사용될 수 있다. 또한, 이러한 개인으로부터 얻은 혈액 샘플은 S 및 N 프로테인으로 기능화된 그래핀 층을 포함하는 센싱 요소에 도입되어 혈액 샘플 내 IgG 및/또는 IgM 항체의 존재를 결정할 수 있다.
또한, 일부 실시예에서, 본 교시에 따른 센서는 S 프로테인으로 기능화된 그래핀-기반 센싱 요소 한 쌍, N 프로테인으로 기능화된 그래핀-기반 센싱 요소 한 쌍 및 하나 또는 그 이상의 바이랄 프로테인에 특이적 결합을 나타내는 하나 또는 그 이상의 항체로 기능화된 하나 또는 그 이상의 센싱 요소를 포함할 수 있다. 이러한 실시예에서, N 및 S-기능화된 그래핀-기반 센싱 요소 각 쌍에 대해, 쌍 센싱 요소 중 하나는 비강 면봉을 통해 수집된 샘플을 수용하기 위해 구성된 포트를 포함할 수 있고 혈액 샘플 (예컨대, 핑거스틱을 통해 획득한) 또는 타액 샘플을 수용하기 위한 또 다른 포트를 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, 쌍 센싱 요소 중 하나는 비강 면봉 또는 타액 샘플을 통해 얻은 샘플 내 존재하는 그래핀 층에 연결된 바이랄 프로테인에 특이적 결합을 나타내는 IgA 항체를 검출하기 위해 사용될 수 있고 다른 센싱 요소는 혈액 샘플 내 그래핀 층에 연결된 바이랄 프로테인 (예컨대, N 또는 S 프로테인)에 특이적 결합을 나타내는 임의의 IgG 및/또는 IgM 항체를 검출하기 위해 사용될 수 있다.
도 11은 일 실시예에 따른 센서(1200)을 개략적으로 도시하고, 이는 본 교시에 따른 복수의 그래핀-기반 센싱 요소 (1201, 1202, 1203, 1204, 1205, 1206, 1207, 및 1208)를 포함한다. 해당 실시예에서, 센싱 요소(1201)는 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스의 N 프로테인에 특이적 결합을 나타내는 항체로 기능화된 그래핀 층을 포함하고, 센싱 요소(1205)는 S 바이랄 프로테인에 특이적 결합을 나타내는 항체로 기능화된 그래핀 층을 포함한다. 센싱 요소는 포트(1201b 및 1205b)를 포함하고, 이는 개인으로부터 점막 샘플, 및 타액 샘플을 수집하기 위해 사용되는 비강면봉으로부터 바이러스를 추출하기 위해 희석제 (예컨대, 인산염 완충 용액)을 이용하여 생성된 액체 샘플을 수용하기 위해 구성된다.
해당 실시예에서, 센싱 요소(1202 및 1206) 각각은 N 바이랄 프로테인으로 기능화된 그래핀 층을 포함한다. 센싱 요소(1202)는 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스에 대한 노출에 응답하여 감염된 개인에 의해 생성된, IgG 및/또는 IgM을 식별하기 위해, 예컨대 핑거스틱을 통해 얻은, 혈액 샘플을 수용하기 위해 구성된 포트(1202b)를 포함한다. 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스에 의한 감염에 응답하여 생성된 IgA 항체를 검출하기 위해, 센싱 요소(1206)는 차례로 점막 샘플, 예컨대 희석제 (예컨대, 인산염 완충 용액) 내 비강 면봉을 통해 수집한 비강 점막 샘플을 용해시켜 생성된 샘플, 또는 희석제 (예컨대, 인산염 완충 용액) 내 타액을 용해시켜 생성된 타액 샘플을 수용(receive)하기 위해 구성된다.
또한 해당 실시예에서, 각 센싱요소(1203 및 1207)는 S 바이랄 프로테인으로 기능화된 그래핀 층을 포함한다. 센싱 요소(1203)는 타액 샘플을 수용하기 위해 구성된 포트(1203b)를 포함하고 센싱 요소(1207)는 비강 점막 샘플을 수용하기 위해 구성된 부분(1207b)를 포함한다. 따라서, 센싱 요소(1203 및 1207)는 수집된 샘플 내 존재하는 IgG/IgM을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시예에서, S 및 N 바이랄 프로테인으로 기능화된 별도의 센싱 요소 대신에 또는 이에 더하여, 하나 또는 그 이상의 센싱 요소는 S 및 N 바이랄 프로테인 모두로 기능화될 수 있다.
또한, 해당 실시예에서, 센서는 인플루엔자 바이러스의 하나 또는 두 종(strain)에 특이적 결합을 나타내는 항체로 기능화된 그래핀 층을 포함하는 센싱 요소(1204 및 1208)를 포함한다. 예를 들어, 센싱 요소(1204)는 Thermo Fisher Scientific 사가 상표명 (GA2B)로 시판하는 단클론 항체와 같은, 인플루엔자 A 바이러스에 특이적 결합을 나타내는 항체로 기능화될 수 있다. 그리고 센싱 요소(1208)는 Invitrogen (B19)이 시판하는 단클론 항체와 같은, 인플루엔자 B 바이러스에 특이적 결합을 나타내는 항체로 기능화된 그래핀 층을 포함할 수 있다. 센싱 요소(1204 및 1208)는 테스트를 위한 샘플 (비강 면봉을 통해 얻은 샘플)을 수용하기 위한 포트(1204b 및 1208b)를 포함한다.
해당 실시예에서, 각 센싱 요소는 본 교시에 따른 분석기에 센싱 요소를 연결하고, 그래핀 층의 샘플에의 노출에 응답하여 생성되는 전기 신호를 검출하게 하는 커넥터 (예컨대, USB 커넥터)를 포함한다. 이 커넥터는 1201a, 1202a, 1203a, 1204a, 1205a, 1206a, 1207a, 및 1208a로 지정되어 있다. 센서의 원형 형태는 각 센싱 요소를 상기 논의된 바와 같이, 분석기에 쉽게 연결하여, 독립적으로 읽을 수 있게 한다.
사용 시에, 개인으로부터 얻은 비강 점막 샘플 및 혈액 샘플은 바이러스 그 자체 및 개인의 바이러스에 대한 노출에 응답하여 생성된 항체를 검출하기 위해 구성된 상이한 센싱 요소에 비강 면봉 샘플 및 혈액 샘플을 도입함으로써 테스트될 수 있다. 감염이 바이러스 역가가 여전히 검출가능한 기간 내 있는 경우, 바이러스를 검출하도록 구성된 센싱 요소는 바이러스에 의한 감염이 발생했음을 표시할 수 있고, 테스트가 바이러스 역가가 유의하게 감소한, 발병 후 약 9-10일 후에 실시되는 경우 IgM, IgG 및/또는 IgA 항체의 존재는 감염의 존재를 표시할 수 있다. 일부 실시에서, 인간은 백신접종 이후 면역성을 테스트받을 수 있다. IgM, IgG 및/또는 IgA 항체의 존재는 백신접종 이후 면역이 확립되었음을 표시할 수 있다.
일부 실시예에서, IgG 및/또는 IgM 항체를 검출하기 위해 본 교시에 따라 구성된 각각의 상기 센서, 또는 복수의 독립형 센서는 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스에 양성으로 테스트된 환자의 감염의 진화를 모니터링하기 위하여 환자의 주기적 테스트를 제공하기 위해 사용될 수 있다.
또한, 상기 센서는 개인으로부터 수집한 샘플 내 인플루엔자 바이러스를 테스트하기 위해 사용될 수 있다. 이는 상기 센싱 요소 중 오직 하나, 또는 부분집합(subset)을 포함할 수 있는 본 교시에 따른 센서로 이해되어야 한다.
일부 실시예에서, 센싱 요소 중 적어도 하나는 대변 샘플을 수용하도록 구성된 포트를 포함할 수 있다. 이는 유아가 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스에 감염되었는지 테스트하는 데 특히 유용할 수 있다. 특히, 5세 미만 영아의 경우, 대변을 통한 바이러스 배출이 장기간 지속될 수 있음이 밝혀졌다. 따라서, 영아는 전염원이 될 수 있다. 영아의 대변 샘플의 테스트는 바이러스의 전파를 줄이는 데 특히 유용할 수 있다. 일부 실시예에서, 대변 샘플은 당업계에 공지된 방식과 같이, 완충액으로 도입될 수 있고, 그렇게 준비된 샘플은 본 교시에 따른 센싱 요소로 도입될 수 있다.
일부 실시예에서, 본 교시에 따른 센서는 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스와 관련된, RNA 표적과 같은, 표적 뉴클레오타이드를 검출하기 위해 구성될 수 있다. 이러한 일부 센서에서, 이러한 기능은 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 감염에 응답하여 생성된 바이랄 프로테인 및/또는 항체를 검출하기 위해 상기 논의된 센서의 다른 기능에 추가될 수 있다. 예를 들어, 아래에서 더 상세히 논의되는 바와 같이, 이러한 일부 실시예에서, 본 교시에 따른 센서는 복수의 그래핀-기반 센싱 요소와, 그 중 적어도 하나는 적어도 하나의 바이러스의 표적 RNA의 검출을 통해 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스를 검출하기 위해 구성되고, 그 중 적어도 하나는 COVID-19 감염의 결과로 생성되는 하나 또는 그 이상의 항체를 검출하기 위해 구성되고, 상기 언급된 방식으로 하나 또는 그 이상의 바이랄 프로테인의 검출을 통해 바이러스를 검출하도록 구성되는 그래핀-기반 센싱 요소을 포함할 수 있다.
예를 들어, 도 12는 하부 기판(2002) 상에 배치된 그래핀 층(2001)을 포함하는 이러한 실시예에 따른 센서(2000)을 개략적으로 도시한다. 예를 들어, 이전 실시예와 유사하게, 기판(2002)은 실리콘과 같은 반도체 기판, 또는 PDMS와 같은 폴리머 기판일 수 있다. 실리콘 산화물 층(2003)은 기판(2002)을 그래핀 층으로부터 분리한다,
해당 실시예에서, 그래핀 층은 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스의 하나 또는 그 이상의 RNA 표적에 특이적 결합을 나타내는 복수의 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide, 2004)로 기능화된다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 올리고뉴클레오타이드는 관심 있는 RNA 표적에 상응하는 Cdna의 형태일 수 있다. 예를 들어, cDNA는 바이러스 외피 (E) 유전자 또는 그것의 부분에 해당할 수 있다. 예를 들어, 이러한 뉴클레오타이드 서열은 다음과 같다: SEQ. ID. 1: ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG. 다른 실시예에서, 각각의 표적 바이랄 RNA를 검출하기 위해 그래핀 층에 연결된 cDNA 프로브는 바이랄 N 프로테인에 대한 코딩(encoding) 뉴클레오타이드 서열의 일부에 상응하는 다음과 같은 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다: SEQ. ID. 2: CCCCGCATTACGTTGGTGGACC. 이러한 경우, 상보적 서열을 가지는 표적 바이랄 RNA는 프로브 cDNA 서열에 대한 특이적 결합을 나타낼 수 있다. 일부 실시예에서, cDNA 프로브 서열은 cDNA 프로브 서열에 부착된 뉴클레오타이드의 추가 서열을 통해 하부 그래핀 층에 부착될 수 있다. 예를 들어, 하기 뉴클레오타이드 서열은 바이랄 외피 (E) 유전자와 관련된 상기 cDNA에 부착될 수 있다: SEQ. ID. 3: GACCCCAAAATCAGCGAAAT. 이러한 추가 뉴클레오타이드 서열은 cDNA 프로브를 그래핀 표면 위로 확장할 수 있으므로, 상보적인 바이랄 RNA 서열에 더 쉽게 접근할 수 있다.
예를 들어, cDNA는 공지된 합성 기술을 이용해 표적 RNA의 공지된 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 합성될 수 있다.
일부 실시예에서, DNA 프로브 서열은 표적 RNA 서열에 의한 DNA 프로브의 보다 용이한 인식을 허용하는 방식으로 DNA 프로브를 그래핀 층에 연결하기 위한 추가 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 프로브 서열이 관심 있는 하나 또는 그 이상의 바이랄 표적 RNA 서열에 의한 특이적 결합에 충분히 접근할 수 있도록 이러한 추가 뉴클레오타이드는 반드시 프로브 서열로 기능할 필요는 없고, DNA 프로브 서열 및 그래핀 층, 또는 DNA 프로브 서열을 그래핀 층에 연결하는 링커 사이에 위치할 수 있다.
cDNA는 다양한 상이한 방법을 이용해 하부 그래핀 층에 연결될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서, cDNA는 cDNA의 핵염기와 그래핀의 육각형 세포 사이의 π-π 상호작용을 통해 그래핀 층 상에 흡착될 수 있다. 다른 실시예에서, cDNA는 하부 그래핀 층에 공유적으로 결합될 수 있다. 예를 들어, 해당 실시예에서, 그래핀 층은 -COOH기(2007)로 데코레이트(decorate)될 수 있고 cDNA는 이러한 부분(moiety)에 공유적으로 부착될 수 있다. 예를 들어, 그래핀 층을 -COOH기로 데코레이트하는 방법은 3,4,9,10-페릴렌 테트라카르복실산(3,4,9,10-perylene tetracarboxylic acid, PTCA)을 기반으로 할 수 있고, 아세트산 부분의 급속 가열 및 접합이 공지되어 있다. 예를 들어, Nanoscale 2013: 5: 5833-5840 에 게시된 "Label-free electrochemical impedance genosensor based on 1-aminopytelene/graphene hybrids,"라는 제목의 그 전체로서 참조에 의해 본 개시에 통합된 아티클은 이러한 방법을 개시한다.
이전 실시예와 유사하게, cDNA에 연결되지 않은 그래핀 층의 부분은, 예컨대 상기 언급된 방식으로 패시베이션 층 (도 12에 도시되지 않음)을 통해 패시베이트될 수 있다. 그래핀 층 상에 놓인 복수의 전극(2005)은 cDNA 프로브 분자에 대한 표적 바이랄 올리고뉴클레오타이드, 예컨대 표적 RNA 또는 DNA의 특이적 결합의 결과로 변화할 수 있는 그래핀 층의 전기적 특성, 예컨대 전기 저항의 측정을 가능하게 하고, 이는 표적 바이랄 RNA 또는 DNA의 검출을 가능하게 한다. 또한, 이전 실시예와 유사하게, 센서(2000)는 도 10에 개략적으로 도시된 것과 같은, DC-바이어스된 AC 전압이 인가되어 관심 있는 RNA 표적 서열의 검출을 용이하게 할 수 있는 기준 전극 (해당 도면에 도시되지 않음)을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스에 감염된 것으로 의심되는 개인으로부터 얻은 샘플 (예컨대, 비인두 샘플)은, 예를 들어, 아래에서 논의된 방식으로 개인으로부터 수집한 샘플로부터 바이랄 RNA 및/또는 DNA를 방출하도록 처리될 수 있다. 예를 들어, 카오트로픽 염(chaotropic salt) 및 단백분해효소 K (Proteinase K)와 같은 변성제를 함유하는 용해/결합 완충액은 바이랄 RNA 및/또는 DNA를 방출하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 일부 실시예에서, 완충액은 또한 방출된 뉴클레오타이드를 결합하고 안정화할 수 있다.
일부 실시예에서, 추출된 바이랄 RNA 및/또는 DNA는 샘플을 센서에 도입하기 전에, 예컨대 등온 증폭 방법을 이용하여, 증폭될 수 있다. 이러한 방식의 일부 예는, 재조합효소 중합효소 증폭법, 헬리케이스-의존적 증폭법, 및 루프-매개 등온 증폭법(LAMP)이 포함되고 이에 제한되지 않는다.
샘플은 센서와 관련하여 상기 논의된 메커니즘과 같이, 본 교시에 따른 센서에 도입될 수 있다. 관심 있는 RNA 표적의 특이적 결합이 샘플 내 존재하는 경우, 그래핀 층에 연결된 cDNA 프로브와 함께 기능화된 그래핀 층의 적어도 하나의 전기적 특성, 예컨대 DC 전기 저항을 변화시킬 수 있고 바이랄 RNA의 검출로 이어질 수 있다.
도 13은 그래핀-기반 센싱 요소의 어레이(3001, 3002, 3003, 및 3004)를 포함하는 다른 실시예에 따른 센서(3000)를 개략적으로 도시한다. 해당 실시예에서, 센싱 요소(3001)는 그래핀 층에 부착된 항체와 적어도 하나의 바이랄 프로테인과의 상호작용을 통해 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스를 검출하기 위해 상기 논의된 방식에 따라 구성되고, 센싱 요소(3002)는 감염된 개인으로부터 수집한 샘플 내 한 유형의 항원 (예컨대, IgG 및/또는 IgG)을 검출하기 위해 상기 논의된 방식에 따라 구성되고, 센싱 요소(3003)는 감염된 개인으로부터 수집한 샘플 내 다른 유형의 항원 (예컨대, IgA)을 검출하기 위해 상기 논의된 방식에 따라 구성된다. 본 교시에 따른 센서는 생물학적 샘플, 예컨대 대변 샘플 내 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스를 검출하기 위해 사용될 수 있는 빠르고 비용-효율적이고 사용하기 쉬운 도구를 제공한다.
하기 예시는 적어도 하나의 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 항원결정기에 특이적 결합을 나타내는 단클론 항체의 생산 방법을 제공한다.
예시 1
쥐 단클론 항체의 생산
50 마이크로그램의 재조합 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 바이랄 프로테인이 인산염 완충 식염수 (PBS; GIBCO, Grand Island, NY)에 현탁되고 동일한 부피의 프로인트 완전 애쥬번트(complete Freund's adjuvant, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)로 유화된다. 쥐는 3개의 피하 부위 및 1개의 복강내 부위에 에멀젼(emulsion)을 주사하여 면역화된다. 초기 면역화 이후 14일 후, 쥐는 PBS에 현탁되고 동일한 부피의 프로인트 불완전 애쥬번트로 유화된 25 마이크로그램의 재조합 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 바이랄 프로테인으로 추가 면역화 i.p.를 제공받았다. PBS 내 25 pg의 재조합 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 바이랄 프로테인의 2번째 부스터는 또 다른 14일 후에 제공되었다. 10일 후, 소량의 혈액이 수집되고 판에 결합된 재조합 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 바이랄 프로테인 또는 관련 없는 프로테인 (음성 대조군)을 사용한 간접 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA)을 이용하여 역가로 재조합 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 바이랄 프로테인에 대한 혈청 활성이 평가될 수 있다. 최적의 역가를 가진 마우스는 마지막 면역화 후 3주 동안 휴식을 취하고 PBS 내 재조합 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 바이랄 프로테인 25 ug의 정맥 내 주입으로 부스팅된다. 3일 후 쥐를 안락사시키고 비장과 림프 절을 수집하고 세포 현탁액을 만들고, Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)으로 세척한다. 비장/림프 절 세포는 계수(count)되고 비장: 2:1의 골수종 비율을 이용하여 중쇄 또는 경쇄 (heavy or light chain) 면역글로불린 사슬을 분비하는 것이 불가능한 SP 2/0 골수종 세포 (ATCC No. CRL8-006, Rockville, MD)와 혼합한다. 세포는 표준 절차 (Kohler and Milstein, 1975)에 따라 하이포잔틴-아미노프테린-티미딘 (hypoxanthine-aminopterin-thymidine, HAT) 선택 배지 에서 폴리에틸렌 글리콜 1450 (polyethylene glycol 1450, ATCC)을 사용하여 8개의 96-웰 조직 배양 판에 융합된다.
융합 후 10일에서 21일 사이에, 하이브리도마 콜로니(hybridoma colony)가 가시적이게 되고 배양 상층액(culture supernatant)을 수확하고 재조합 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 바이랄 프로테인의 2 pg/ml 수용액 또는 관련 없는 단백질 음성 조절제 50 pl/well로 코팅된 고-프로테인(high-protein) 결합 96-well 효소 면역측정판을 이용해 ELISA에 의해 스크리닝되고 4 °C에서 밤새 배양된다. 과량의 용액이 흡인되고 판이 PBS/0.05% Tween-20으로 세척되고 (3회), 비-특이적 결합을 줄이기 위해 1% BSA (Bovine Serum Albumin, fraction V, Sigma Chemical Co., MO)으로 실온(RT)에서 1시간동안 차단(block)한다. BSA 수용액이 제거되고 각 융합 판 웰(well)로부터 하이브리도마 상층액 50 ul/well이 첨가된다. 그러고 판은 45분동안 37°C에서 인큐베이트되고 PBS/0.05% Tween-20으로 3회 세척된다. 서양고추냉이 퍼옥시다제(Horseradish peroxidase, HRP)-접합 염소(goat) 항-마우스 IgG F(ab)2 (H&L)(Jackson Research Laboratories, Inc., West Grove, PA) 를 1% BSA/PBS에서 1:4000으로 희석하고 각 웰에 첨가한다. 그러고 판은 45분동안 37°C에서 인큐베이트된다. PBS로 세척한 후, 50 ul/well의 3, 3', 5, 5'-테트라메틸벤지딘(Tetramethylbenzidine, TMB) 기질 용액 (ThermoFisher)을 HRP와 작용할 수 있도록 첨가하고 파란색을 생성한다. 몇 분 후 0.16 M 황산 용액 (ThermoFisher)을 사용하여 반응을 억제하면, 파란색이 노란색으로 바뀐다. 450 nm에서 양성 웰의 노란색의 강도는 Spectramaxl90 마이크로타이터 판 판독기 (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA)를 사용하여 평가된다. 항체 생산에 관한 추가 세부사항은 Kearney, JF; Radbruch, A; Liesegang, B; Rajewsky, K. 1979. 에서 찾을 수 있다. 면역글로불린 발현을 상실했지만 항체-분비성 하이브리드 세포주의 구성을 허용하는 새로운 마우스 골수종 세포주. J Immunol 123:1548-1550. and Kohler, G; Milstein, C. 1975. 기정의된 특이성의 항체를 분비하는 융합 세포의 연속 배양. Nature 256:495-497, 이는 그 전체로서 참조에 의해 본 개시에 통합된다.
예시 2
본 교시에 따른 프로토타입(prototype) 센서가 상기 기술된 바와 같이 제조되었고 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스를 나타내는 스파이크 프로테인을 함유하는 샘플을 이용해 테스트되었다. 센서의 그래핀 층은 항-스파이크 프로테인 항체로 기능화되었다. 또한, 그래핀 층의 기능화되지 않은 부분은 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol, PEG) 및 에탄올아민을 이용해 패시베이트시켰다. 동형 대조군(isotype control) 항체로 기능화되었던 대조군 센서도 또한 제조되었다. 두 센서에는 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스의 스파이크 프로테인을 포함하는 샘플이 로드(load)되었고 전기 전도도가 측정되었다. 표 1 및 도 14에 도시된 바와 같이, 프로토타입 센서는 스파이크 프로테인과의 상호작용에 응답하여 더 높은 전자 전도도의 변화 (즉, 스파이크 프로테인을 포함하지 않는 완충제 및 스파이크 프로테인을 포함하는 샘플 사이의 전도도 또는 전자 이동도의 백분율 변화)를 나타냈고, 이는 대조군 센서보다 통계적으로 더 높았다.
| 실험군 | 대조군 | ||
| 항체 | 항-스파이크 | 동형 | |
| 프로테인 | 스파이크 프로테인 | 관련 없는 프로테인 | |
| 전도도 변화 | 칩 1 | 1.561763607 | 0.295613102 |
| 칩 2 | 2.316691922 | 0.632826175 | |
| 칩 3 | 2.572200291 | 0.46214932 | |
| 칩 4 | 0.417339312 | ||
| 평균 | 2.150218607 | 0.451981977 | |
| 표준 편차 | 0.0525386141 | 0.139593861 | |
다양한 실시예에서, 개시된 모듈 중 하나 또는 그 이상은 대응하는 모듈의 기능을 수행하기 위한 하나 이상의 컴퓨터 프로그램을 통해, 또는 이러한 프로그램을 실행하는 컴퓨터 프로세서를 통해 구현된다. 일부 실시예에서, 개시된 모듈 중 하나 이상은 대응하는 모듈의 기능을 수행하기 위한 펌웨어를 실행하는 하나 이상의 하드웨어 모듈을 통해 구현된다. 다양한 실시예에서, 개시된 모듈 중 하나 이상은 모듈에 의해 사용되는 데이터를 저장하기 위한 저장 매체, 또는 모듈에 의해 실행되는 소프트웨어 또는 펌웨어 프로그램을 포함한다. 다양한 실시예에서, 개시된 모듈 또는 개시된 저장 매체 중 하나 이상은 개시된 시스템의 내부 또는 외부에 있다. 일부 실시예에서, 개시된 모듈 또는 개시된 저장 매체 중 하나 이상은 컴퓨팅 "클라우드"를 통해 구현되고, 여기에는 개시된 시스템이 네트워크 연결을 통해 연결되고 그에 따라 외부 모듈 또는 저장 매체를 사용한다. 일부 실시예에서, 정보를 저장하기 위한 개시된 저장 매체는 CD-ROM, 컴퓨터 저장 장치, 예컨대 하드 디스크, 플래시 메모리와 같은, 비-일시적 컴퓨터-판독가능 매체를 포함한다. 또한, 다양한 실시예에서, 저장 매체 중 하나 이상은 다양한 모듈에 의해 실행되는 데이터 또는 컴퓨터 프로그램을 저장하거나, 본 명세서에 개시된 다양한 기술 또는 흐름도를 구현하는 비-일시적 컴퓨터-판독가능 매체이다.
상기 상세한 설명은 첨부된 도면을 참조한다. 동일하거나 또는 유사한 참조 번호는 도면 또는 설명에서 동일 또는 유사한 부분을 지칭하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 유사하게 명명된 요소는 달리 명시되지 않는 한, 유사한 기능을 수행하고 유사하게 설계될 수 있다. 예시적인 실시예의 이해를 제공하기 위해 세부사항이 제시된다. 실시예, 예컨대, 대안적인 실시예는, 이러한 세부사항의 일부 없이도 실시될 수 있다. 다른 예에서, 잘 알려진 기술, 절차, 및 구성요소는 설명된 실시예를 모호하게 하는 것을 피하고자 상세하게 설명하지 않았다.
실시예의 전술한 설명은 단지 예시의 의도로 제시되었다. 이는 빠짐없이 나타낸 것이 아니며 실시예를 개시된 정확한 형태로 제한하지 않는다. 몇몇 예시적인 실시예 및 특징이 설명되었지만, 실시예의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서, 수정, 개조, 및 다른 구현이 가능할 수 있다. 따라서, 명시적으로 달리 언급되지 않는 한, 설명은 하나 이상의 실시예에 관련된 것이고 전체로서 실시예를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 이는 개시가 특징이 "어느(a)," “그(the)," "한(one)," "하나 이상(one or more)," "일부(some)," 또는 "다양한(various)" 실시예와 관련된다고 언급하는지 아닌지 여부와 관계없이 사실이다. 본 명세서에서 사용된, 단수 형태 "어느(a)," "어느(an)," 및 "그(the)"는 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수 형태를 포함할 수 있다. 또한, 용어 "연결된(coupled)"은 두 연결된 항목 사이에 중간 요소의 존재를 배제하지 않는다. 또한, 특징이 존재할 수 있다는 언급은 그 특징이 하나 이상의 실시예에서 존재할 수 있음을 나타낸다.
본 명세서에서, 용어 "포함하다(include)," "포함하다(comprise)," "함유하다(contain)," 및 "가지다(have)," 가 세트 또는 시스템 뒤에 사용될 때, 개방형 포함(open inclusion)을 의미하고 세트에 대해 또는 시스템에 대해 비-열거된, 다른, 구성의 추가를 배제하지 않는다. 또한, 달리 언급하거나 문맥에서 달리 제하지 않는 한, 접속사 "또는(or),"이 사용될 경우, 이는 배타적이지 않고, 대신 의미 및/또는(and/or)을 포함한다. 또한, 이러한 용어가 사용되는 경우, 집합(set)의 부분집합(subset)은 집합의 구성원의 하나 또는 하나 초과를 포함하고, 전부를 포함할 수도 있다.
개시된 시스템, 방법, 및 장치는 임의의 특정 양태 또는 특징 또는 이들의 조합(combination)에 제한되지 않으며, 개시된 시스템, 방법, 및 장치는 임의의 하나 이상의 특정 이점이 존재하거나 또는 문제가 해결될 것을 요구하지 않는다. 임의의 작동 이론은 설명을 용이하게 하기 위한 것이고, 개시된 시스템, 방법, 및 장치는 이러한 작동 이론에 제한되지 않는다.
수정 및 변형은 상기 교시에 비추어 가능하거나 실시예의 실시로부터 얻어질 수 있다. 예를 들어, 설명된 단계는 논의된 순서 또는 동일한 정도의 분리로 동일하게 수행될 필요가 없다. 마찬가지로, 동일하거나 유사한 목적을 이루기 위하여, 필요에 따라, 다양한 단계가 생략되거나, 반복되거나, 결합되거나, 또는 병렬로 수행될 수 있다. 유사하게, 설명된 시스템은 반드시 실시예에서 설명된 모든 부분을 포함할 필요 없으며, 또한 실시예에서 설명되지 않은 다른 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 실시예는 상기-설명된 세부사항에 제한되지 않고, 대신 그들의 균등물의 전체 범위에 비추어 첨부된 청구범위에 의해 정의된다. 또한, 본 개시는 다양한 개시된 실시예, 단독으로 그리고 서로 간의 다양한 조합(combination) 및 하위-조합(sub-combination)의 모든 신규하고 그리고 비-자명한 특징 및 양태에 관한 것이다.
본 개시가 특정 실시예에 관련하여 특히 설명되었지만, 많은 대안, 수정, 및 변형은 전술한 설명에 비추어 명백할 것이다. 따라서 첨부된 청구범위는 본 개시의 진정한 사상 및 범위 내에 속하는 임의의 이러한 대안, 수정, 및 변형을 포함할 것으로 고려된다.
Claims (28)
- 샘플 내 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 (SARS-CoV-2 virus)를 검출하기 위한 센서로서, 상기 센서는:
그래핀 층;
기능화된 그래핀 층을 생성하기 위해 상기 그래핀 층에 연결되고, 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스의 적어도 하나의 항원결정기(epitope)에 특이적 결합을 나타내는 결합 에이전트(binding agent); 및
적어도 하나의 상기 기능화된 그래핀 층의 전기적 특성을 측정하기 위해 상기 기능화된 그래핀 층에 전기적으로 연결된 복수의 전기 전도체를 포함하는, 센서.
- 제1 항에 있어서,
상기 항원결정기는, 상기 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스의 S 프로테인인, 센서.
- 제1 항에 있어서,
상기 항원결정기는, 상기 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스의 N 프로테인인, 센서.
- 제1 항에 있어서,
상기 결합 에이전트는 항-제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 항체 (anit-SARS-CoV-2 antibody)인, 센서.
- 제1 항에 있어서,
상기 센서는, 상기 기능화된 그래핀 층에 기준 AC 신호를 인가하는 기준 전극을 더 포함하는, 센서.
- 제5 항에 있어서,
상기 기준 AC 신호는 1kHz에서 2MHz의 주파수를 갖는, 센서.
- 제1 항에 있어서,
상기 샘플은, 생물학적 샘플(biological sample)을 포함하는, 센서.
- 제7 항에 있어서,
상기 생물학적 샘플은, 혈액 샘플을 포함하는, 센서.
- 제1 항에 있어서,
상기 결합 에이전트는 복수의 링커(linker)를 통해 그래핀 층에 연결되는, 센서.
- 제9 항에 있어서,
상기 링커 각각은 그것의 한 단부에서 그래핀 층에 공유적으로 부착되고 다른 단부에서 적어도 하나의 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스의 항원결정기에 공유적으로 부착되는, 센서.
- 제10 항에 있어서,
상기 링커는 1-피렌부톤산 숙시니미딜 에스테르(1-pyrenebutonic acid succinimidyl ester)를 포함하는, 센서.
- 제1 항에 있어서,
상기 그래핀 층은 복수의 하이드록실기(hydroxyl group)로 기능화된, 센서.
- 제1 항에 있어서,
상기 결합 에이전트는 복수의 알데하이드 부분(aldehyde moiety)을 통해 상기 하이드록실기에 연결되는, 센서.
- 제1 항에 있어서,
상기 결합 에이전트는 프로테인 G를 통해 상기 그래핀 층에 연결되는, 센서.
- 생물학적 샘플(biological sample) 내 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 (SARS-CoV-2 virus)를 검출하기 위한 방법으로서, 상기 방법은:
적어도 하나의 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스의 항원결합기(epitope)에 특이적 결합을 나타내는 복수의 결합 에이전트(binding agent)로 기능화된 그래핀 층에 생물학적 샘플을 도포하는 단계;
적어도 하나의 상기 기능화된 그래핀 층의 전기적 특성을 측정하는 단계; 및
상기 샘플 내 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스를 검출하기 위해 상기 측정된 전기적 특성을 이용하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제15 항에 있어서,
상기 결합 에이전트는 항-제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 항체 (anti-SARS-CoV-2 antibody)인, 방법.
- 제15 항에 있어서,
상기 샘플 내 검출된 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스를 수량화하는 단계를 더 포함하는, 방법.
- 제15 항에 있어서,
적어도 하나의 상기 기능화된 그래핀 층의 상기 전기적 특성은 상기 기능화된 그래핀 층의 DC 전기 저항을 포함하는, 방법.
- 제15 항에 있어서,
상기 측정된 전기적 특성을 이용하는 단계는 상기 기능화된 그래핀 층과 상기 샘플의 상호작용에 응답하는 상기 전기적 특성의 변화를 모니터링하는 것을 포함하는, 방법.
- 생물학적 샘플(biological sample) 내 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 (SARS-CoV-2 virus)에 대해 반응하는 항체를 검출하기 위한 센서를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은:
하부 기판 상에 놓인 그래핀 층에 복수의 링커를 연결하는 단계; 및
적어도 하나의 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스에 특이적 결합을 나타내는 복수의 항체를 상기 링커에 공유적으로 연결하는 단계를 포함하는, 방법.
- 생물학적 샘플 내 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스를 검출하는 처분가능한(disposable) 카트리지로서, 상기 카트리지는:
샘플을 수용하기 위한 입구 포트와 출구 포트를 가지는 미세유체 구성요소(microfluidic component); 및
상기 출구 포트로부터 상기 샘플의 적어도 일부를 수용하는 상기 미세유체 구성요소에 유체적으로 결합된 센서를 포함하고,
상기 센서는:
그래핀 층;
기능화된 그래핀 층을 생성하기 위해 상기 그래핀 층에 연결되고 헤모글로빈 프로테인에 결합하는 복수의 결합 에이전트(binding agent); 및
적어도 하나의 상기 기능화된 그래핀 층의 전기적 특성을 측정하기 위해 상기 기능화된 그래핀 층에 전기적으로 연결된 복수의 전기 전도체를 포함하는, 카트리지.
- 제21 항에 있어서,
상기 결합 에이전트는 항-제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 항체 (anti-SARS-CoV-2 antibody)인, 처분가능한 카트리지.
- 제21 항에 있어서,
상기 미세유체 구성요소는 폴리머 재료(polymeric material)를 포함하는, 처분가능한 카트리지.
- 제23 항에 있어서,
상기 폴리머 재료는 PDMS(polydimethylsiloxane) 및 PMMA(polymethyl methacrylate) 중 어느 하나를 포함하는, 처분가능한 카트리지.
- 감염된 것으로 의심되는 개인으로부터 얻은 샘플 내 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 (SARS-CoV-2 virus)에 대해 반응하는 항체를 검출하는 센서로서, 상기 센서는:
그래핀 층;
기능화된 그래핀 층을 생성하기 위하여 상기 그래핀 층에 연결되는 하나 또는 그 이상의 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 바이랄 프로테인(viral protein); 및
개인으로부터 얻은 생물학적 샘플에 대한 상기 기능화된 그래핀층의 노출에 응답하여 적어도 하나의 상기 기능화된 그래핀층의 전기적 특성을 측정하는 상기 기능화된 그래핀 층에 전기적으로 연결된 복수의 전기 전도체를 포함하는, 센서.
- 샘플 내 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스(SARS-CoV-2 virus)를 검출하기 위한 센서로서, 상기 센서는:
그래핀 층;
기능화된 그래핀 층을 생성하기 위해 상기 그래핀 층에 연결되고, 적어도 하나의 상기 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스의 표적 RNA에 특이적 결합을 나타내는 복수의 DNA 프로브 분자(probe molecule); 및
적어도 하나의 상기 기능화된 그래핀 층의 전기적 특성을 측정하기 위해 상기 기능화된 그래핀 층에 전기적으로 연결된 복수의 전기 전도체를 포함하는, 센서.
- 제26 항에 있어서,
적어도 하나의 상기 DNA 프로브 분자는 Seq. ID. 1. 을 가지는, 센서.
- 생물학적 샘플(biological sample) 내 제2형-중증급성호흡기증후군-코로나바이러스 (SARS-CoV-2 virus)를 검출하는 처분가능한(disposable) 카트리지로서, 상기 카트리지는:
샘플을 수용하기 위한 입구 포트와 출구 포트를 가지는 미세유체 구성요소(microfluidic component); 및
상기 출구 포트로부터 상기 샘플의 적어도 일부를 수용하는 상기 미세유체 구성요소에 유체적으로 결합된 센서를 포함하고,
상기 센서는:
그래핀 층;
기능화된 그래핀 층을 생성하기 위해 상기 그래핀 층에 연결되고 헤모글로빈 프로테인에 결합하는 복수의 결합 에이전트(binding agent); 및
적어도 하나의 상기 기능화된 그래핀 층의 전기적 특성을 측정하기 위해 상기 기능화된 그래핀 층에 전기적으로 연결된 복수의 전기 전도체를 포함하는, 카트리지.
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