KR20220156032A - 재조합 미생물로부터 유기 생성물을 생산하기 위한 생물제조 시스템 및 방법 - Google Patents

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모함마드마틴 하니프자데
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셈비타 팩토리, 인크.
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Abstract

본 개시는 유기 생성물을 생산하기 위한 생물제조 시스템에 관한 것이다. 본 개시는 개선된 유기 기질 생산 능력을 갖는 재조합 미생물, 및 개선된 유기 생성물 생산 능력을 갖는 재조합 미생물에 관한 것이다. 본원에 개시된 시스템 및 재조합 미생물의 이점은 생산 동안 배양 불순물을 발생시키는 유기 기질 및 유기 생성물을 별도로 생산하는 능력을 포함할 수 있다. 본 개시는 본원에 개시된 생물제조 시스템 및 재조합 미생물을 사용하여 유기 생성물을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

재조합 미생물로부터 유기 생성물을 생산하기 위한 생물제조 시스템 및 방법
본 개시는 유기 생성물을 생산하기 위한 생물제조 시스템에 관한 것이다. 본 개시는 개선된 유기 기질 생산 능력을 갖는 재조합 미생물, 및 개선된 유기 생성물 생산 능력을 갖는 재조합 미생물에 관한 것이다. 본원에 개시된 시스템 및 재조합 미생물의 이점은 이의 생산 동안 배양 불순물을 발생시키는 유기 생성물 및 유기 기질을 별도로 및 안전하게 생산하는 능력을 포함할 수 있다. 본 개시는 본원에 개시된 생물제조 시스템 및 재조합 미생물을 사용하여 유기 생성물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본원에 개시된 방법의 이점은 미생물 배양물로부터 하나 이상의 유기 생성물의 생산 증가를 포함할 수 있다. 본원의 방법의 이점은 감소된 양의 부산물 또는 배양 불순물을 함유하는 유기 생성물을 생산하는 능력일 수 있다. 추가적인 이점은 플라스틱, 텍스타일, 및 화학 물질의 생산을 위한 공급원료로서, 및 다른 적용에 사용하기 위한 공급원료로서 유용한 바이오-에틸렌을 생산하기 위한 이산화탄소의 사용일 수 있다. 또 다른 이점은 알켄, 알칸, 폴리엔 및 알코올의 생산을 위한 이산화탄소의 사용이다. 이러한 방법의 또 다른 이점은 산소와 휘발성 유기 화합물의 공동 생산을 피하는 것을 포함한다.
본원에 개시된 방법 및 시스템의 또 다른 이점은 환경으로부터 과량의 이산화탄소의 감소를 포함할 수 있다.
전 세계적으로 전력에 대한 수요 증가는 석유 및 가스와 같은 화석 연료의 연소로부터 이산화탄소의 과잉을 초래하여, 많은 사람이 지구 온난화 위기라고 부르는 것에 실질적으로 기여한다. 산업계는 이산화탄소가 대기로 유입되는 것을 방지하기 위해 너무나 필사적이어서 배기 스트림 및 대기로부터 이산화탄소를 격리시키는 것에 의존하였다. 이후에 이러한 것들은 지하 환경에서 이산화탄소를 저장한다. 그러나, 모든 현재 알려진 방법은 이산화탄소를 지하에 저장함으로써 대기로부터 이산화탄소를 제거한다. 이러한 것들은 실제로 이산화탄소를 다른 유용한 물질로 다시 전환시키지 않는다.
석유의 제한된 공급 및 환경에 대한 이의 유해한 영향은 연료 및 화학물질의 재생 가능한 공급원의 개발을 촉발시켰다. 바이오매스 및 포집된 이산화탄소를 바이오연료와 같은 신제품으로 전환시키는 기술은 석유 수입과 이산화탄소 배출을 줄이는 데 도움을 줄 수 있다. 생물학적 공정을 사용하여 유기 폐기물로부터 가치-부가된 연료 및 다른 유용한 유기 생성물을 생산하는 데 관심이 증가하고 있다. 이러한 유기 생성물 중에서, 에틸렌은 세계에서 가장 널리 생산되는 유기 화합물이고, 플라스틱, 용매 및 텍스타일을 포함하는 광범위한 산업에서 유용하다. 에틸렌은 현재 화석 연료를 증기 분해하거나 에탄을 탈수소화함으로써 생산된다. 수백만 메트릭 톤의 에틸렌이 매년 생산되고 있지만, 이러한 공정에 의해 전 세계 탄소 풋프린트에 크게 기여하기에 충분한 양 이상의 이산화탄소가 생산된다. 따라서, 재생 가능한 방법을 통해 에틸렌을 생산하는 것은 에너지 및 화학 산업의 막대한 수요를 충족시키는 데 도움이 될 뿐만 아니라 환경을 보호하는 데 도움이 될 것이다.
에틸렌은 잠재적으로 재생 가능한 공급원료이기 때문에, 이산화탄소 및 바이오매스와 같은 재생 가능한 공급원으로부터 에틸렌을 생산하기 위한 기술 개발에 큰 관심이 있다. 바이오-에틸렌은 현재 옥수수 또는 사탕수수로부터 유래된 에탄올을 사용하여 생산된다. 박테리아 및 진균을 포함하는 다양한 미생물은 자연적으로 소량으로 에틸렌을 생산한다. 에틸렌 생산 효소의 이종성 발현은 여러 미생물 종에서 입증되었으며, 여기서, 숙주는 리그노셀룰로스 및 이산화탄소를 포함하는, 다양한 탄소 공급원을 사용할 수 있다.
현대 역사를 기초로 하여, 대기 중의 과잉 이산화탄소뿐만 아니라 다른 유기 폐기물은 이를 감소시키는 것이 유리해질 때까지 감소되지 않을 것이라고 말하는 것이 타당하다. 상업적 규모로 에틸렌과 같은 유용한 유기 생성물을 생산하기 위해 미생물 생물제조 시스템 및 공정의 개선이 여전히 필요하다. 보다 효율적인 재생 가능 기술을 통해 탄화수소를 생산할 필요가 여전히 존재한다. 대기로부터 과량의 이산화탄소를 제거할 필요가 존재한다. 산업 및 상업적 적용을 위해 재생 가능한 공급원료로부터 에틸렌을 안전하게 생산하기 위한 개선된 방법이 여전히 필요하다.
본원의 구현예는 유기 생성물을 생산하기 위한 생물제조 시스템에 관한 것이다. 다양한 구현예에서, 시스템은 적어도 하나의 생물반응기 배양 용기를 포함한다. 다양한 구현예에서, 적어도 하나의 생물반응기 배양 용기는 유기 기질 배양액을 함유하며, 여기서, 유기 기질 배양액은 제1 재조합 미생물을 함유한다. 다양한 구현예에서, 제1 재조합 미생물은 개선된 유기 기질 생산 능력을 가지고, 적어도 하나의 비-천연 유기 기질 형성 효소 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써 적어도 하나의 유기 기질 형성 재조합 효소를 발현시키고, 유기 기질을 생산하기 위한 탄소 공급원을 사용할 수 있고, 휘발성 가스, 액체 및 고체 중 적어도 하나를 포함하는, 적어도 하나의 유기 기질 배양 불순물을 생산한다. 다양한 구현예에서, 적어도 하나의 생물반응기 배양 용기는 유기 생성물 배양액을 함유하며, 여기서, 유기 생성물 배양액은 제2 재조합 미생물을 함유한다. 다양한 구현예에서, 제2 재조합 미생물은 개선된 유기 생성물 생산 능력을 가지고, 적어도 하나의 비-천연 유기 생성물 형성 효소를 발현시킴으로써 적어도 하나의 비-천연 유기 생성물 형성 효소를 발현시키고, 적어도 하나의 유기 생성물을 생산하기 위해 유기 기질을 사용할 수 있다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 생물반응기 배양 용기는 탄소 공급원 유입구, 휘발성 가스 유출구 및 전원을 포함하는 제1 생물반응기 배양 용기; 및 제1 생물반응기 배양 용기와 제2 생물반응기 배양 용기에 및 이들 사이에 연결된 유체 유로, 및 유기 생성물 유출구를 포함하는 제2 생물반응기 배양 용기를 포함한다. 이러한 구현예에서, 제1 생물반응기 배양 용기는 유기 기질 배양액을 포함하며, 제2 생물반응기 배양 용기는 유기 생성물 배양액을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 생물반응기 배양 용기 또는 제2 생물반응기 배양 용기는 바이오매스 수집 포트를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 전원은 태양광, 태양열 전원, 전력원 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 시스템은 탄산화 유닛, 아민 스트리퍼, 아민 스크러버, 촉매 변환기, 응축기, 압축기, 가성 타워, 건조기 또는 이들의 조합을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 생물반응기 배양 용기는 탄소 공급원 유입구, 휘발성 가스 유출구, 전원 또는 이들의 조합을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 탄소 공급원은 이산화탄소, 일산화탄소, n-알칸, 에탄올, 식물성 오일, 글리세롤, 글루코스, 수크로스, 단당류, 이당류, 다당류 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 휘발성 가스는 산소, 메탄 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 유기 기질은 알파-케토글루타레이트, 수크로스, 글루코스, 글리세롤, 단당류, 이당류, 다당류 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 유기 생성물은 에틸렌, 알코올, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 에탄 디올, 유기산, 프로피온산, 아세트산, 알데하이드, 포름알데하이드, 장쇄 지방산, n-알칸, 탄화수소 또는 이들의 조합을 포함한다.
특정 구현예에서, 탄소 공급원은 이산화탄소, 일산화탄소, 글리세롤, 글루코스, 프룩토스, 수크로스, 단당류, 이당류, 다당류, 글리코겐, 아세트산, 지방산 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 전원은 태양광, 태양광 전원, 전력원 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 휘발성 가스는 산소, 메탄, 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 유기 기질은 알파-케토글루타레이트, 수크로스, 글루코스, 프룩토스, 자일로스, 아라비노스, 갈락토스, 글리세롤, 단당류, 이당류, 다당류, 글리코겐, 지방산 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 유기 생성물은 알코올, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 에탄 디올, 유기산, 프로피온산, 아세트산, 알데하이드, 포름알데하이드, 장쇄 지방산, n-알칸, 탄화수소, 에탄, 프로펜, 부텐, 에탄, 프로판, 부탄 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 생물반응기 배양 용기는 탄소 공급원 유입구, 휘발성 가스 유출구, 전원 또는 이들의 조합을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 유기 기질 배양액 및 유기 생성물 배양액은 하나의 생물반응기 배양 용기에서 조합된다. 다른 구현예에서, 유기 기질 배양액 및 유기 생성물 배양물은 필터에 의해 분리된다. 특정 구현예에서, 필터는 약 0.2 ㎛ 내지 약 10 ㎛ 이상의 공극 크기를 포함한다.
본원 시스템의 특정 구현예에서, 적어도 하나의 유기 기질은 알파-케토글루타레이트(AKG)를 포함하며, 여기서, 제1 재조합 미생물에 의해 생산된 적어도 하나의 AKG 형성 효소의 양은 비-천연 AKG 형성 효소 발현 뉴클레오타이드 서열이 결여된 대조군 미생물에 비해 생산된 양보다 더 많다. 이러한 구현예에서, 적어도 하나의 유기 생성물은 에틸렌을 포함하며, 여기서, 제2 재조합 미생물에 의해 생산된 적어도 하나의 에틸렌 형성 효소(EFE)의 양은 비-천연 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열이 결여된 대조군 미생물에 비해 생산된 것보다 많다. 특정 구현예에서, 제1 재조합 미생물은 적어도 하나의 비-천연 AKGP 형성 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써 적어도 하나의 알파-케토글루타레이트 퍼미아제 단백질(AKGP)을 발현시킨다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 AKG 형성 효소는 이소시트레이트 데하이드로게나제(ICD) 단백질, 글루타메이트 데하이드로게나제(GDH) 단백질, 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 재조합 미생물은 서열번호 2 또는 서열번호 4와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 비-천연 ICD 단백질 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 서열번호 1 또는 서열번호 3과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 ICD 단백질을 발현시키거나, 제1 재조합 미생물은 서열번호 6과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 비-천연 GDH 단백질 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 서열번호 5와 적어도 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 GDH 단백질을 발현시키거나, 이들의 조합을 발현시킨다. 특정 구현예에서, 제2 재조합 미생물은 서열번호 8과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 비-천연 EFE 단백질 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 서열번호 7과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 EFE 단백질을 발현시킨다.
특정 구현예에서, 제1 재조합 미생물은 광합성 박테리아, 시아노박테리아(Cyanobacteria), 시네코코커스(Synechococcus), 시네코코커스 엘롱가투스(Synechococcus elongatus), 시네코코커스 레오폴리엔시스(Synechococcus leopoliensis), 시네코시스티스(Synechocystis), 아나바에나(Anabaena), 슈도모나스(Pseudomonas), 슈도모나스 시링가에( Pseudomonas syringae ), 슈도모나스 사바스타노이(Pseudomonas savastanoi ), 클라미도모나스( Chlamydomonas ), 및 클라미도모나스 레인하르드티( Chlamydomonas reinhardtii )로 구성된 군으로부터 선택된 미생물을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 재조합 미생물은 에셰리키아( Escherichia ), 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli), 지오박테리아(Geobacteria), 아르트로박터 파라피네우스(Arthrobacter paraffineus), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas Putida), 슈도모나스(Pseudomonas), 슈도모나스 시링가에(Pseudomonas syringae), 슈도모나스 사바스타노이(Pseudomonas savastanoi), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 바실러스 메타테리움(Bacillus metatherium ), 칸디다 팔루디지나( Candida paludigena ), 피치아 이노시토보라( Pichia inositovora ), 토룰롭시스 글라브라타( Torulopsis glabrata), 칸디다 리폴리티카( Candida lipolytica ), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 사카로마이세스 세레비시아에.(Saccharomyces cereviciae.), 아스퍼질러스 종(Aspergillus sp.), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 및 락토바실러스 종(Lactobacillus sp .)으로 구성된 군으로부터 선택된 미생물을 포함한다.
특정 구현예에서, 제1 재조합 미생물은 글루코스-1-포스페이트 아데닐릴트랜스퍼라제 단백질의 발현이 결여된 델타-glgc 돌연변이체 미생물을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 재조합 미생물은 서열번호 10과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 비-천연 수크로스 신타제 단백질 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 서열번호 9와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 수크로스 신타제 단백질을 발현시킨다. 특정 구현예에서, 제1 재조합 미생물은 서열번호 12와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 비-천연 수크로스 포스페이트 신타제 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 서열번호 11과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 수크로스 포스페이트 신타제 단백질을 발현시킨다.
특정 구현예에서, 제1 재조합 미생물에 의해 생산된 적어도 하나의 AKG 형성 효소의 양은 비-천연 AKG 형성 효소 발현 뉴클레오타이드 서열이 결여된 대조군 미생물에 비해 생산된 양보다 약 5% 내지 약 200% 이상 더 많다. 특정 구현예에서, 제2 재조합 미생물에 의해 생산된 EFE 단백질의 양은 비-천연 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열이 결여된 대조군 미생물에 비해 생산된 양보다 약 5% 내지 약 200% 이상 더 많다. 특정 구현예에서, 제2 재조합 미생물에 의해 생산된 EFE 단백질의 양은 유기 생성물 배양액의 리터 당 약 20 그램 내지 약 100 그램이다.
특정 구현예에서, 제2 재조합 미생물은 E. 콜라이(E. Coli)를 포함하며, 제2 재조합 미생물에 의해 생산된 EFE 단백질의 양은 제2 재조합 미생물의 단백질의 총 세포 양의 약 30% 내지 약 80% 이상이다. 특정 구현예에서, 제2 재조합 미생물에 의해 생산된 적어도 하나의 유기 생성물의 생산 속도는 약 1억 파운드/년 내지 약 10억 파운드/년 이상이다. 특정 구현예에서, 제2 재조합 미생물의 세포 집단 농도는 밀리리터 당 약 107 내지 약 1013개의 세포, 또는 리터 당 약 100 그램 내지 약 300 그램의 건조 세포 중량의 유기 생성물 배양액 리터 당 건조 세포 중량의 범위이다.
특정 구현예에서, 비-천연 AKG 형성 효소 발현 뉴클레오타이드 서열 또는 비-천연 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 미생물 발현 벡터에 삽입되며, 미생물 발현 벡터는 박테리아 벡터 플라스미드, 상동 재조합 시스템의 뉴클레오타이드 가이드, 항생제-내성 시스템, 단백질 정제 및 검출을 위한 보조 시스템, CRISPR CAS 시스템, 파지 디스플레이 시스템 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 미생물 발현 벡터에서 약 2 내지 약 500의 복사체 수를 갖는다. 특정 구현예에서, 미생물 발현 벡터는 적어도 하나의 미생물 발현 프로모터를 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 미생물 발현 프로모터는 광 민감성 프로모터, 화학물질 민감성 프로모터, 온도 민감성 프로모터, Lac 프로모터, T7 프로모터, CspA 프로모터, 람다 PL 프로모터, 람다 CL 프로모터, 연속적으로 생산하는 프로모터, psbA 프로모터 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원의 구현예는 유기 생성물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 본 방법은 적어도 하나의 생물반응기 배양 용기를 포함하는 생물제조 시스템을 제공하는 것을 포함하며, 여기서, 적어도 하나의 생물반응기 배양 용기는 유기 기질 배양액을 포함하며; 유기 기질 배양액은 제1 재조합 미생물을 함유하며; 제1 재조합 미생물은 개선된 유기 기질 생산 능력을 가지고, 적어도 하나의 비-천연 유기 기질 형성 효소 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 적어도 하나의 유기 기질 형성 재조합 효소를 발현시키고, 유기 기질을 생산하기 위한 탄소 공급원을 사용할 수 있고, 휘발성 가스, 액체 및 고체 중 적어도 하나를 포함하는, 적어도 하나의 유기 기질 배양 불순물을 생산하며; 적어도 하나의 생물반응기 배양 용기는 유기 생성물 배양액을 함유하며; 상기 유기 생성물 배양액은 제2 재조합 미생물을 함유하며; 제2 재조합 미생물은 개선된 유기 생성물 생산 능력을 가지고, 적어도 하나의 비-천연 유기 생성물 형성 효소 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써 적어도 하나의 유기 생성물 형성 효소를 발현시키고, 적어도 하나의 유기 생성물을 생산하기 위한 유기 기질을 사용할 수 있으며; 적어도 하나의 생물반응기 배양 용기는 탄소 공급원 유입구, 휘발성 가스 유출구 및 전원을 포함하는 제1 생물반응기 배양 용기를 포함하며; 시스템은 제1 생물반응기 배양 용기 및 제2 생물반응기 배양 용기에 및 이들 사이에 연결된 유체 유로, 및 유기 생성물 유출구를 포함하며; 제1 생물반응기 배양 용기는 유기 기질 배양액을 포함하며, 제2 생물반응기 배양 용기는 유기 생성물 배양액을 포함한다. 이러한 구현예에서, 본 방법은 제1 생물반응기 배양 용기에서 소정 양의 적어도 하나의 유기 기질을 생산하기에 충분한 조건하에서 제1 생물반응기 배양 용기에서 제1 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 제2 생물반응기 배양 용기에서 소정 양의 적어도 하나의 유기 생성물을 생산하기에 충분한 조건하에서 제2 생물반응기 배양 용기에서 제2 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 방법은 휘발성 가스 유출구를 통해 유기 기질 배양액으로부터 소정 양의 적어도 하나의 휘발성 가스를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 본 방법은 유기 생성물 유출구를 통해 유기 생성물 배양액으로부터 소정 양의 적어도 하나의 유기 생성물을 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 탄소 공급원이 이산화탄소를 포함하는 경우, 탄소 공급원 유입구를 통해 소정 양의 이산화탄소를 이산화탄소 공급원으로부터 유기 기질 배양액으로 공급하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 본 방법은 유기 기질 배양액 및 유기 생성물 배양액의 pH 수준을 약 5.0 내지 약 8.5로 유지하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 본 방법은 유기 기질 배양액 및 유기 생성물 배양액을 약 25℃ 내지 약 70℃의 온도에서 유지하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 방법은 제2 생물반응기 배양 용기의 총 내부 부피를 기준으로 약 10 부피% 내지 약 1 부피% 이하의 제2 생물반응기 배양 용기 내의 휘발성 가스의 양을 유지하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 제1 생물반응기 배양 용기 또는 제2 생물반응기 배양 용기가 바이오매스 수집 포트를 추가로 포함하는 경우, 본 방법은 바이오매스 수집 포트를 통해 제1 재조합 미생물 또는 제2 재조합 미생물에 의해 생산된 소정 양의 바이오매스를 수집하는 단계를 추가로 포함한다.
본원의 방법의 특정 구현예에서, 비-천연 유기 기질 형성 재조합 효소 발현 뉴클레오타이드 서열 또는 비-천연 유기 생성물 발현 뉴클레오타이드 서열은 미생물 발현 벡터에 삽입되며, 적어도 하나의 미생물 발현 벡터는 적어도 하나의 미생물 발현 프로모터를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 방법은 유기 기질 배양액 또는 유기 생성물 배양액에 적어도 하나의 프로모터 유도 인자를 첨가함으로써, 생산된 적어도 하나의 유기 생성물의 양 또는 적어도 하나의 유기 기질의 양을 제어하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 미생물 발현 프로모터는 광 민감성 프로모터, 화학물질 민감성 프로모터, 온도 민감성 프로모터, Lac 프로모터, T7 프로모터, CspA 프로모터, 람다 PL 프로모터, 람다 CL 프로모터, 연속적으로 생산하는 프로모터, psbA 프로모터 또는 이들의 조합을 포함하며; 적어도 하나의 프로모터 유도 인자가 락토스, 자일로스, IPTG, 저온 쇼크, 열 쇼크 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원의 방법의 특정 구현예에서, 적어도 하나의 유기 기질은 AKG를 포함한다. 이러한 구현예에서, 적어도 하나의 유기 생성물은 에틸렌을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 유기 기질 배양 불순물이 적어도 하나의 휘발성 가스를 포함하는 경우, 본 방법은 휘발성 가스 유출구를 통해 적어도 하나의 휘발성 가스를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 본 방법은 약 1억 파운드/년 내지 약 10억 파운드/년 이상의 속도로 생산된 소정 양의 적어도 하나의 유기 생성물을 회수하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 생산된 소정 양의 적어도 하나의 유기 생성물은 약 1 mol% 이하의 휘발성 가스의 양을 함유한다.
본원의 구현예는 유기 생성물을 생산하는 방법에 관한 것으로, 본 방법은 적어도 하나의 생물반응기 배양 용기를 포함하는 생물제조 시스템을 제공하는 단계를 포함하며; 여기서, 적어도 하나의 생물반응기 배양 용기는 유기 기질 배양액을 함유하며; 유기 기질 배양액은 제1 재조합 미생물을 함유하며; 제1 재조합 미생물은 개선된 유기 기질 생산 능력을 가지고, 적어도 하나의 비-천연 유기 기질 형성 효소 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 적어도 하나의 유기 기질 형성 재조합 효소를 발현시키고, 휘발성 가스, 액체 및 고체 중 적어도 하나를 포함하는, 적어도 하나의 유기 기질 배양 불순물을 생산하며; 적어도 하나의 생물반응기 배양 용기는 유기 생성물 배양액을 함유하며; 유기 생성물 배양액은 제2 재조합 미생물을 함유하며; 제2 재조합 미생물은 개선된 유기 생성물 생산 능력을 가지고, 적어도 하나의 비-천연 유기 생성물 형성 효소 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 적어도 하나의 유기 생성물 형성 효소를 발현시키고, 적어도 하나의 유기 생성물을 생산하기 위한 유기 기질을 사용할 수 있다. 이러한 구현예에서, 유기 기질 배양액 및 유기 생성물 배양액은 하나의 생물반응기 배양 용기에서 조합되며, 여기서, 비-천연 유기 기질 형성 재조합 효소 발현 뉴클레오타이드 서열은 제1 미생물 발현 벡터에 삽입되며, 비-천연 유기 생성물 형성 효소 발현 뉴클레오타이드 서열은 제2 미생물 발현 벡터에 삽입되며, 제1 미생물 발현 벡터 및 제2 미생물 발현 벡터는 각각 적어도 하나의 미생물 발현 프로모터를 포함한다. 이러한 구현예에서, 본 방법은 탄소 공급원 유입구에 연결된 탄소 공급원을 제공하는 단계; 제1 생물반응기 배양 용기에서 제1 생물반응기 배양 용기에서 소정 양의 적어도 하나의 유기 기질을 생산하기에 충분한 조건하에 제1 생물반응기 배양 용기에서 제1 재조합 미생물을 배양하는 단계; 제1 시점에 적어도 하나의 프로모터 유도 인자를 유기 기질 배양액에 첨가함으로써, 소정 양의 적어도 하나의 유기 기질을 생산하는 단계; 제2 생물반응기 배양 용기에서 소정 양의 적어도 하나의 유기 생성물을 생산하기에 충분한 조건하에 제2 생물반응기 배양 용기에서 제2 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 제2 시점에 적어도 하나의 프로모터 유도 인자를 유기 생성물 배양액에 첨가함으로써, 소정 양의 적어도 하나의 유기 생성물을 생산하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 방법은 제2 시점 전에, 제2 생물반응기 배양 용기의 총 내부 부피를 기준으로, 제2 생물반응기 배양 용기에서 산소의 양을 약 10 부피% 내지 약 1 부피% 이하로 감소시키는 단계를 추가로 포함한다.
본원의 구현예는 에틸렌을 생산하는 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 방법은 탄소 공급원 유입구, 휘발성 가스 유출구 및 전원을 포함하는 제1 생물반응기 배양 용기; 및 제1 생물반응기 배양 용기와 상기 제2 생물반응기 배양 용기에 및 이들 사이에 연결된 유체 유로, 및 유기 생성물 유출구를 포함하는 제2 생물반응기 배양 용기를 포함하는 생물제조 시스템을 제공하는 단계를 포함하며, 제1 생물반응기 배양 용기는 유기 기질 배양액을 포함하며, 제2 생물반응기 배양 용기는 유기 생성물 배양액을 포함하며; 유기 기질 배양액은 개선된 유기 기질 생산 능력을 갖는 제1 재조합 미생물을 함유하며, 유기 기질은 AKG를 포함하며, 제1 재조합 미생물은 적어도 하나의 비-천연 유기 기질 형성 효소 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 적어도 하나의 유기 기질 형성 재조합 효소를 발현시키며, 유기 기질 형성 효소는 AKG 형성 효소를 포함하며, 제1 재조합 미생물은 소정 양의 AKG를 생산하기 위한 탄소 공급원을 사용할 수 있으며, 제1 재조합 미생물은 휘발성 가스, 액체 및 고체 중 적어도 하나를 포함하는, 적어도 하나의 유기 기질 배양 불순물을 생산하며; 휘발성 가스는 산소를 포함하며, 유기 생성물 배양액은 개선된 유기 생성물 생산 능력을 갖는 제2 재조합 미생물을 함유하며, 유기 생성물은 에틸렌을 포함하며, 제2 재조합 유기물은 적어도 하나의 비-천연 유기 생성물 형성 효소 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 적어도 하나의 유기 생성물 형성 효소를 발현시키며, 유기 생성물 형성 효소는 EFE를 포함하며, 제2 재조합 유기물은 소정 양의 에틸렌을 생산하기 위한 AKG를 사용할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 방법은 제1 생물반응기 배양 용기에서 소정 양의 AKG를 생산하기에 충분한 조건하에 제1 생물반응기 배양 용기에서 제1 재조합 미생물을 배양하는 단계; 제2 생물반응기 배양 용기에서 소정 양의 EFE를 생산하기에 충분한 조건하에 제2 생물반응기 배양 용기에서 제2 재조합 미생물을 배양하는 단계; 휘발성 가스 유출구를 통해 유기 기질 배양액으로부터 소정 양의 산소를 제거하는 단계; 및 유기 생성물 유출구를 통해 유기 생성물 배양액으로부터 소정 양의 EFE를 제거하는 단계를 포함한다.
상기 요약뿐만 아니라 본 구현예의 하기 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 예시의 목적으로, 일부 구현예가 도면에 도시되어 있으며, 이는 바람직할 수 있다. 도시된 구현예는 도시된 정확한 세부사항으로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 달리 언급되지 않는 한, 도면은 축척이 아니다.
도 1은 본원의 구현예에 따른 미생물에 의한 유기 기질 및 유기 생성물의 생산을 도시하는 예시이다.
도 2는 본원의 구현예에 따른 생물제조 시스템의 예시이다.
도 3a는 본원의 구현예에 따른, 낮은, 중간 또는 높은 복사체 수의 EFE 유전자를 발현시키고, 상이한 성장 배지에서 배양된 E. 콜라이 배양물에서 에틸렌 생산을 도시한 그래프이다.
도 3b는 본원의 구현예에 따른, 보충물 없이, 또는 상이한 성장 보충물과 함께 성장된 E. 콜라이 배양물에서 에틸렌 생산을 도시한 그래프이다.
도 4는 본원의 유기 생성물을 생산하는 방법의 일 구현예를 도시한 흐름도이다.
달리 언급되지 않는 한, 모든 측정은 표준 메트릭 단위(standard metric unit)이다.
달리 언급되지 않는 한, 모든 단수 용어의 경우는 이러한 것들이 수식된 하나 또는 하나 초과의 단어를 지칭할 수 있다.
달리 언급되지 않는 한, 어구 "~ 중 적어도 하나"는 대상 중 하나 이상을 의미한다. 예를 들어, "적어도 하나의 생물반응기 배양 용기"는 하나의 생물반응기 배양 용기, 하나 초과의 생물반응기 배양 용기, 또는 이들의 임의의 조합을 의미한다.
달리 언급되지 않는 한, 용어 "약"은 기술되고 가장 가까운 정수로 반올림된 비-백분율 수의 ±10%를 지칭한다. 예를 들어, 약 20 그램은 18 내지 22 그램을 포함할 것이다. 달리 언급되지 않는 한, 용어 "약"은 백분율 수의 ±5%를 지칭한다. 예를 들어, 약 50%는 45 내지 55%를 포함할 것이다. 용어 "약"이 범위와 관련하여 논의될 때, 용어는 하한 미만 및 상한 초과의 적절한 양을 지칭한다. 예를 들어, 리터 당 약 100 내지 약 300 그램의 건조 세포 중량은 리터 당 90 내지 330 그램의 건조 세포 중량을 포함할 것이다.
달리 언급되지 않는 한, 본원에 기술된 바와 같은 특성(높이, 폭, 길이, 비율 등)은 평균 측정치로 이해된다.
달리 언급되지 않는 한, 용어 "제공하다", "제공된" 또는 "제공하는"은 본원의 임의의 구현예의 임의의 방법 또는 시스템의 임의의 요소, 양, 성분, 시약, 양, 측정, 또는 분석의 공급, 생산, 구매, 제조, 조립, 형성, 선택, 구성, 전환, 도입, 첨가 또는 혼입을 지칭한다.
서열 동일성은 본원에서 서열을 비교함으로써 결정한 경우, 2개 이상의 아미노산(폴리펩타이드 또는 단백질) 서열 또는 2개 이상의 핵산(폴리뉴클레오타이드) 서열 사이의 관계로 정의된다. 대개, 서열 동일성 또는 유사성은 비교된 서열의 전체 길이에 걸쳐 비교된다. 당 분야에서, "동일성"은 또한 경우에 따라, 이러한 서열의 스트링(string) 사이의 매치에 의해 결정하는 경우, 아미노산 또는 핵산 서열 사이의 서열 관련성의 정도를 의미한다. 2개의 아미노산 서열 사이의 "유사성"은 하나의 폴리펩타이드의 아미노산 서열 및 이의 보존된 아미노산 치환체를 제2 폴리펩타이드의 서열과 비교함으로써 결정된다. "동일성" 및 "유사성"은 당업자에게 공지된, 다양한 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다. 일 구현예에서, 서열 동일성은 본원에서 확인된 서열의 전체 길이를 비교함으로써 결정된다.
동일성을 결정하기 위한 예시적인 방법은 시험된 서열 사이에 가장 큰 매치를 제공하도록 설계된다. 동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램에서 성문화된다. 2개의 서열 사이의 동일성 및 유사성을 결정하기 위한 예시적인 컴퓨터 프로그램 방법은, 예를 들어, NCBI 및 다른 출처(BLAST.RTM. Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894)로부터 공개적으로 이용 가능한, BestFit, BLASTP(단백질 기본 국소 정렬 검색 툴), BLASTN(뉴클레오타이드 기본 국소 정렬 검색 툴), 및 FASTA(Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990))를 포함한다. 사용된 가장 예시적인 알고리즘은 EMBOSS(European Molecular Biology Open Software Suite)이다. EMBOSS를 사용한 아미노산 서열 비교를 위한 예시적인 파라미터는 갭 개방 10.0, 갭 확장 0.5, 블로섬 매트릭스(Blosum matrix)이다. EMBOSS를 사용한 핵산 서열 비교를 위한 예시적인 파라미터는 갭 개방 10.0, 갭 확장 0.5, DNA 전체 매트릭스(DNA 동일성 매트릭스)이다. 구현예에서, Gene bank, KEG, BLAST 및 Ensemble와 같은 온라인 데이터를 사용하여 서열의 상동성을 결정하기 위해 상이한 종 중에서 DNA/단백질 서열을 비교하는 것이 가능하다.
선택적으로, 아미노산 유사성의 정도를 결정함에 있어서, 당업자는 또한 당업자에게 명백할 바와 같이 소위 "보존적" 아미노산 치환을 고려할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 상호교환성을 지칭한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 기는 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이며; 지방족-하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 기는 세린 및 트레오닌이며; 아미드 함유 측쇄를 갖는 아미노산 기는 아스파라긴 및 글루타민이며; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 기는 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이며; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 기는 리신, 아르기닌 및 히스티딘이며; 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 기는 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 기는 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린 및 아스파라긴-글루타민이다. 본원에 개시된 아미노산 서열의 치환 변이체는 개시된 서열에서 적어도 하나의 잔기가 제거되고 상이한 잔기가 적소에 삽입된 것이다. 바람직하게는, 아미노산 변화는 보존적이다. 각각의 천연 발생 아미노산에 대한 바람직한 보존적 치환은 다음과 같다: Ala에서 ser로; Arg에서 lys로; Asn에서 gln 또는 his로; Asp에서 glu로; Cys에서 ser 또는 ala로; Gln 내지 asn으로; Glu에서 asp로; Gly에서 pro로; His에서 asn 또는 gln으로; Ile에서 leu 또는 val로; Leu에서 ile 또는 val로; Lys에서 arg로; gln 또는 glu; Met에서 leu 또는 ile로; Phe에서 met, leu 또는 tyr로; Ser에서 thr로; Thr에서 ser로; Trp에서 tyr로; Tyr에서 trp 또는 phe로; 및 Val에서 ile 또는 leu로.
달리 언급되지 않는 한, 용어 "적응된" 또는 "적응된 코돈"은 본원에 개시된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드의 "코돈 최적화"를 지칭하며, 이의 서열은 천연 또는 비-천연일 수 있거나, 다른 미생물에서의 발현을 위해 적응될 수 있다. 코돈 최적화는 폴리펩타이드가 발현되는 유기체의 코돈 편향에 대한 인코딩된 폴리펩타이드를 위한 코돈 사용을 적응한다. 코돈 최적화는 일반적으로, 숙주 세포에서 인코딩된 폴리펩타이드의 생산 수준을 증가시키는 데 도움을 준다.
화석 연료의 사용으로 인한 이산화탄소 배출은 세계적인 규모로 계속 증가하고 있다. 대기 중 이산화탄소 수준의 감소는 기후 변화를 완화하거나 역전시키는 열쇠이다. 탄소 포집 및 저장(CCS)은 대기로부터 산업용 이산화탄소를 제거하기 위한 탁월한 기술이며; 정제 및 다른 산업 공정으로부터 포집된 20조 톤의 이산화탄소는 다양한 유형의 지하 환경 또는 저장 탱크로 수송 및 저장될 수 있는 것으로 추정된다. CCS는 현재 이용 가능한 다른 방법과 비교하여 이산화탄소 배출을 감소시키는 비용 효과적이고 저렴한 방법이지만, 이산화탄소가 배출될 때까지 단지 지하에 저장된다는 문제가 남아 있다. 따라서, CCS 방법은 대기 중의 과잉 이산화탄소를 감소시키는 지속 가능한 해법을 제공하지 못한다. 또한, 환경 규정에 의해 강제되거나 비즈니스 모델의 일부로 이를 수행하기 위해 지불되지 않는 한, 산업체가 이산화탄소를 지하 환경으로 펌핑하는 것에 대한 재정적 인센티브가 거의 없다. 틀림없이, 지구 온난화는 이산화탄소를 처분하는 것보다 이산화탄소를 생산하는 것이 더 유리하기 때문에 위기이다.
보다 효율적이고 지속 가능한 방식으로 대기로부터 과잉의 이산화탄소를 제거할 필요가 있다. 유용한 제품을 제조하기 위해 과잉의 이산화탄소를 이용할 수 있는 기술, 및 산업 및 환경에 유익한 다른 적용에 대한 요구가 존재한다.
석유의 제한된 공급의 문제, 및 환경에 대한 석유 작업의 유해한 영향은 기존 자원으로부터의 산출을 최대화하고, 환경 영향을 최소화할 수 있는 연료 및 화학물질의 재생 가능한 공급원의 개발에 대한 강조를 증가시켰다. 바이오매스 및 포집된 이산화탄소를 바이오연료와 같은 신제품으로 전환시키는 기술은 석유 수입 및 이산화탄소 배출을 줄이는 데 도움이 될 수 있다. 생물학적 공정을 사용하여 유기 폐기물로부터 부가가치 연료 및 다른 유용한 유기 생성물을 생산하는 것에 대한 관심이 증가하고 있다.
이러한 귀중한 유기 생성물 중에서, 에틸렌은 플라스틱, 용매 및 텍스타일을 포함하는 광범위한 산업 분야에서 유용한, 세계에서 가장 널리 생산되는 유기 화합물이다. 에틸렌이 잠재적으로 재생 가능한 공급원료이기 때문에, 이산화탄소 및 바이오매스와 같은 재생 가능한 공급원으로부터 에틸렌을 생산하기 위한 기술 개발에 관심이 있다. 에틸렌은 현재 화석 연료를 증기 분해하거나 에탄을 탈수소화함으로써 생산된다. 그러나, 수백만 매트릭 톤의 에틸렌이 매년 생산됨에 따라, 이러한 공정에 의해 전 세계 탄소 풋프린트에 크게 기여하기에 충분한 양 이상의 이산화탄소가 생산된다. 따라서, 재생 가능한 방법을 통해 에틸렌을 생산하는 것은 에너지 및 화학 산업의 엄청난 수요를 충족시키는 데 도움을 줌과 동시에 환경을 보호하는 데 도움이 된다.
옥수수 또는 사탕수수로부터 유래된 에탄올을 사용하여 바이오-에틸렌을 생산하기 위한 통상적인 방법이 개발되었다. 그러나, 바이오매스(예를 들어, 옥수수 및 사탕수수)로부터 바이오-에틸렌의 생산은 시간-소모적이고 비용-비효율적인 공정이고, 바이오 매스의 땅, 수송 및 소화를 필요로 한다. 예를 들어, 옥수수 및 사탕수수의 성장 및 운송과 관련된 막대한 비효율성이 있으며, 이는 그 자체로 CO2 배출을 야기한다. 박테리아 및 진균을 포함하는 다양한 미생물은 자연적으로 소량으로 에틸렌을 생산한다. 이러한 미생물은 에틸렌-형성 효소(EFE)를 사용한다. 슈도모나스 시링가에 및 페니실륨 디지타툼(Penicillium digitatum)에서 발견되는 것과 같은 에틸렌 경로의 한 유형은 에틸렌 형성 효소에 의해 촉매화되는 반응에서 기질로서 알파-케토글루타레이트(AKG) 및 아르기닌을 사용한다. 에틸렌-형성 효소는 단일 유전자의 발현이 에틸렌 생산에 충분할 수 있기 때문에 유망한 표적을 제공한다. EFE의 이종성 발현을 이용하는 기술은 여러 미생물 종에서 입증되었으며, 여기서, 미생물 숙주는 리그노셀룰로스 및 이산화탄소를 포함하는, 칼빈 주기에서 다양한 탄소 공급원을 사용할 수 있다. 또한, 비용 효율적인 고처리량 유전자 시퀀싱 기술의 최근 개발은 유전자 시퀀싱 기술은 미생물 유전자 발현에 대한 이해를 증가시켰다. 그러나, 현재 이용 가능한 기술은 미생물 활성을 통해 산업적으로 적절한 양의 에틸렌을 생산하지 못한다. 결과적으로, 충분한 양의 에틸렌의 생산에 필요한 생물반응기의 수 및 부피는 엄청나게 높을 수 있다.
미생물 유기 생성물 생산 공정에서 발생할 수 있는 또 다른 문제는 미생물 대사의 부산물이 유기 생성물과 함께 생물반응기 배양물에서 불순물로서 생산될 수 있다는 것이다. 유기 생성물 및 부산물 불순물의 혼합물은 다운스트림 정제 공정에 더 많은 복잡성 및 추가 비용을 추가할 수 있다. 배양 불순물은 휘발성 유기 생성물과 공동 생산될 수 있는 산소와 같은 휘발성 가스를 포함할 수 있다. 예를 들어, 산소는 통상적으로 광합성 미생물에 의해 생산된다. 생물반응기 오프-가스에서 산소의 농도는 안전 위험을 나타내기에 충분히 높을 수 있거나, 규정에 의해 허용되는 최대 양을 초과할 수 있다. 또 다른 과제는 또 다른 부산물, 즉 미생물 배양물의 성장의 결과로 생산되는 바이오매스의 가공을 처리하는 방법이다.
더 큰 효율 및 더 낮은 비용으로 상업적 규모로 에틸렌을 포함하는 유기 생성물을 생산할 수 있는 미생물 생산의 개선이 여전히 필요하다. 정부 규제를 준수하면서 휘발성 가스를 포함하는 유기 생성물 및 배양 불순물의 공동-생산을 안전하게 감소시키거나 제거할 수 있는 미생물 생산의 개선이 여전히 필요하다. 미생물 유기 생성물 생산에서 바이오매스의 생산 및 취급의 개선이 필요하다. 산업 및 다른 적용에 유용한 바이오-에틸렌과 같은 유기 생성물을 생산하기 위해 이산화탄소 공급원료를 사용하는 방법이 여전히 필요하다.
본 개시의 구현예는 상업적으로 판매될 수 있는 가치 있는 유기 생성물을 생산하는 이점과 함께, 환경으로부터 이산화탄소를 제거하는 이점을 제공할 수 있다. 따라서, 본 개시의 구현예는 이산화탄소를 하나 이상의 유용한 유기 화합물로 전환시키기 위해 재조합 미생물 기술을 사용함으로써, 통상적인 이산화탄소 저장에 대한 재생 가능한 대안을 제공할 수 있다. 본 개시의 구현예의 하나의 이점은 시스템 및 방법이 오일 또는 천연 가스 회사가 환경으로부터 이산화탄소를 제거하는 데 경제적으로 이득이 되게 만들 수 있다는 것이다. 석유 회사 또는 이의 계약자는 이산화탄소를 지하 환경으로 펌핑하거나 격리된 이산화탄소를 지하에 남겨두는 대신에, 비용 효율적인 방식으로 이산화탄소를 유용한 유기 생성물로 전환시키기 위해 재조합 미생물의 배양을 위한 탄소 공급원으로서 이산화탄소를 사용할 수 있다. 또한, 방법이 온-사이트에서 실시될 수 있거나, 이러한 것들이 생산하는 것보다 더 많은 이산화탄소를 소비할 것으로 예상되기 때문에, 수송에 의해 많은 이산화탄소가 생성되는 것을 피할 수 있다.
환경을 보호하기 위한 가장 효과적인 방법은 사람들이 실제로 사용하는 방법이다. 이러한 방법은 더 수익성이 있으며, 사람들이 사용할 가능성이 더 높다. 본원에 개시된 방법의 이점 중 하나는 생물반응기 시스템을 사용하는 비용-효율성이다. 본 개시의 구현예는 산업적 규모로 유기 기질을 생산하기 위해 관련 대사 신호전달 경로를 적응시킴으로써, 광합성 유기 기질 생산 미생물을 조작하는 이점을 제공할 수 있다. 본 개시의 구현예는 산업적 규모로 유기 생성물을 생산하기 위해 관련 대사 신호전달을 적응시킴으로써, 유기 생성물을 생산하기 위해 광합성 미생물에 의해 생산된 유기 기질을 사용할 수 있는 유기 생성물 생산 미생물을 조작하는 이점을 제공할 수 있다. 이러한 구현예는 유기 생성물 생산의 증가된 효율 및 더 낮은 비용의 이점을 제공할 수 있다. 이러한 구현예는 대기로부터 이산화탄소를 제거하고, 미생물이 작업을 수행하는 동안 수동적으로 유용한 유기 화합물을 이전에는 상상할 수 없는 규모로 생성하는 것을 유리하게 할 수 있다.
본 개시의 구현예는 또한 유기 생성물의 생산으로부터 하나 이상의 배양 불순물의 생산을 분리함으로써, 유기 생성물 및 배양 불순물의 공동-생산을 감소 또는 제거하는 이점을 제공할 수 있다. 이러한 구현예는 보다 안전한 유기 생성물 생산의 이점을 제공할 뿐만 아니라, 다운스트림 정제의 복잡성 및 비용을 감소시킬 수 있다. 본원의 구현예는 또한 유익한 적용을 위해 생산된 바이오매스의 사용을 용이하게 하면서, 바이오매스 생산을 최소화하는 이점을 제공할 수 있다.
애초에 이산화탄소를 발생시키는 것처럼 이산화탄소를 가치 있는 유기 화합물로 전환하는 것이 더 수익성이 있거나 마찬가지로 수익성이 높아진다면, 지구 온난화 위기는 어떻게 될 것인가? 본원에 개시된 방법은 지구 온난화 회사에서 글로벌 냉각 회사에 이르기까지 에너지 생산자를 변형시킬 수 있다.
본 개시는 유기 생성물을 생산하기 위한 생물제조 시스템에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 이러한 시스템은 개선된 기질 생산 능력을 갖는 제1 재조합 미생물을 함유하는 유기 기질 배양액, 및 개선된 유기 생성물 생산 능력을 갖는 제2 재조합 미생물을 함유하는 유기 생성물 배양액을 포함한다. 도 1을 참조하면, 유기 기질 배양액 및 유기 생성물 배양액 각각에 의한 유기 기질 생산 및 유기 생성물 생산의 일반적인 개요로서, 유기 기질 배양액(100)은 광합성 광 반응(108)에서 물(104) 및 빛(106)과 함께 이산화탄소(102)를 포획하여, 배양 불순물 산소(110) 및 에너지 기질(112)을 생산하며; 효소 경로(114)는 에너지 기질(112)을 이용하여 유기 기질 알파-케토글루타레이트(116)를 생산한다. 유기 기질 알파-케토글루타레이트(116)는 시점(118)에서 프로모터 유도 인자 제어에 의한 생산을 통해, 또는 필터 또는 유로 분리(120)에 의해 유기 생성물 배양액(122)에 들어간다. 효소 경로(124)는 유기 생성물 배양액 알파-케토글루타레이트(126) 및 에틸렌 형성 효소(128)를 사용하여 유기 생성물 에틸렌(130)을 생산한다.
본원에 개시된 생물제조 시스템의 일반적인 개요로서, 도 2를 참조하면, 시스템(200)은 유기 기질 배양액(204), 탄소 공급원 유입구(206), 휘발성 가스 유출구(208), 전원 및/또는 광원(210), 제1 생물반응기 배양 용기(202)에 연결된 물 유출구(214)를 포함하는 압축기/응축기(212) 및 물 유출기(216)를 포함하는 제1 생물반응기 배양 용기(202); 유기 생성물 배양액(220)을 함유하고 제1 유기반응기 배양 용기(202)와 제2 생물반응기 배양 용기(218)에 및 이들 사이에 연결된 유체 유로(222) 및 유기 생성물 유출구(224)를 포함하는 제2 생물반응기 배양 용기(218); 아민 스크러버(232)에 연결된 리치 아민 유출구(228) 및 희박 아민 유입구(230)를 포함하는 아민 스트리퍼(226); 아민 스크러버(232)와 제1 생물반응기 배양 용기(202)에 및 이들 사이에 연결된 이산화탄소 유출구(234); 물 유출구(238)를 포함하는 압축기/응축기(236); 촉매 변환기(240); 가성 타워(242); 재생 가스 유입구(246) 및 물 유출구(248)를 포함하는 건조기(244); 압축기/펌프(250); 및 유기 생성물 유출구(252)를 포함한다.
본 개시는 유기 생성물을 생산하기 위한 방법에 관한 것이다. 본원에 개시된 방법의 일반적인 개요로서, 도 4를 참조하면, 본 방법은 본원의 구현예에 따른 생물제조 시스템을 제공하는 단계(102); 제1 생물반응기 배양 용기에서 소정 양의 적어도 하나의 유기 기질을 생산하기에 충분한 조건하에, 유기 기질 배양액을 함유하는 제1 생물반응기 배양 용기에서 재조합 미생을 배양하는 단계(104); 제2 생물반응기 배양 용기에서 소정 양의 적어도 하나의 유기 기질을 생산하기에 충분한 조건하에, 유기 기질 배양액을 함유하는 제2 생물반응기 배양 용기에서 재조합 미생을 배양하는 단계(106); 유기 기질 배양물로부터 소정 양의 적어도 하나의 휘발성 가스를 제거하는 단계(108); 유기 생성물 배양액으로부터 소정 양의 적어도 하나의 유기 생성물을 제거하는 단계(110); 소정 양의 이산화탄소를 이산화탄소 공급원으로부터 유기 기질 배양액으로 공급하는 단계(112); 유기 기질 배양액 및 유기 생성물 배양액의 pH 수준을 약 5.0 내지 약 8.5로 유지하는 단계(114); 제1 생물반응기 배양 용기로부터 제1 재조합 미생물에 의해 생산된 소정 양의 바이오매스를 수집하는 단계(116), 제2 생물반응기 배양 용기로부터 제2 재조합 미생물에 의해 생산된 소정 양의 바이오매스를 수집하는 단계(118); 및 제2 생물반응기 배양 용기의 총 내부 부피를 기준으로 약 10 부피% 내지 약 1 부피% 이하의 제2 생물반응기 배양 용기 내의 휘발성 가스의 양을 유지하는 단계(120)를 포함한다.
생물제조 시스템의 구현예
본원의 구현예는 유기 생성물을 생산하기 위한 생물제조 시스템에 관한 것이다. 다양한 구현예에서, 시스템은 적어도 하나의 생물반응기 배양 용기를 포함한다. 다양한 구현예에서, 적어도 하나의 생물반응기 배양 용기는 유기 기질 배양액을 함유하며, 여기서, 유기 기질 배양액은 제1 재조합 미생물을 함유한다. 다양한 구현예에서, 제1 재조합 미생물은 개선된 유기 기질 생산 능력을 가지고, 적어도 하나의 비-천연 유기 기질 형성 효소를 발현시킴으로써, 재조합 효소를 형성하는 적어도 하나의 유기 기질을 발현시키고, 클레오타이드 서열은 탄소 공급원을 사용하여 유기 기질을 생산할 수 있고, 휘발성 가스, 액체 및 고체 부산물, 또는 다른 바람직하지 않은 생성물 중 적어도 하나를 포함하는 적어도 하나의 유기 기질 배양물 불순물을 생산한다. 불순물의 예는 가스 또는 액체 상태의 산소 또는 메탄, 또는 이들의 조합일 수 있다. 다양한 구현예에서, 적어도 하나의 생물반응기 배양 용기는 유기 생성물 배양액을 함유하며, 여기서, 유기 생성물 배양액은 제2 재조합 미생물을 함유한다. 다양한 구현예에서, 제2 재조합 미생물은 개선된 유기 생성물 생산 능력을 가지고, 적어도 하나의 비-천연 유기 생성물 형성 효소 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 적어도 하나의 유기 생성물 형성 효소를 발현하고, 적어도 하나의 유기 생성물을 생산하기 위해 유기 기질을 사용할 수 있다. 다양한 구현예에서, 적어도 하나의 유기 생성물은 알켄, 알칸, 폴리엔, 알코올, 휘발성 유기 화합물 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 생물반응기 배양 용기는 탄소 공급원 유입구, 휘발성 가스 유출구 및 전원을 포함하는 제1 생물반응기 배양 용기; 및 제1 생물반응기 배양 용기와 제2 생물반응기 배양 용기에 및 이들 사이에 연결된 유체 유로 및 유기 생성물 유출구를 포함하는 제2 생물반응기 배양 용기를 포함한다. 이러한 구현예에서, 제1 생물반응기 배양 용기는 유기 기질 배양액을 포함하며, 제2 생물반응기 배양 용기는 유기 생성물 배양액을 포함한다. 이러한 구현예는 제2 재조합 유기물에 의한 적어도 유기 생성물의 생산으로부터, 제1 재조합 미생물에 의해 적어도 하나의 유기 기질 배양물 불순물의 생산을 분리하는 이점을 제공할 수 있다. 이러한 구현예에서, 유기 기질 및 다른 영양소는 제2 재조합 미생물의 성장 및 생산을 제공하기 위해 제1 생물반응기 배양 용기와 제2 생물반응기 배양 용기에 및 이들 사이에 연결된 유체 유로를 통해 제2 재조합 미생물에 제공될 수 있다. 이러한 구현예에서, 적어도 하나의 유기 기질 배양 불순물이 휘발성 가스를 포함하는 경우, 휘발성 가스는 휘발성 가스 유출구를 통해 유기 기질 배양액으로부터 제거될 수 있다. 특정 구현예에서, 휘발성 가스는 산소, 메탄 또는 이들의 조합을 포함한다. 이러한 구현예는 제1 재조합 미생물 및 제2 재조합 미생물의 성장 속도의 개선된 제어, 개선된 탄소 포집율 및 개선된 유기 생성물 수율의 이점을 제공할 수 있다.
이러한 구현예에서, 탄소 공급원은 제1 재조합 미생물의 성장 및 적어도 하나의 유기 기질의 생산을 지원하기 위한 영양소로서 탄소 공급원 유입구를 통해 제공될 수 있다. 특정 구현예에서, 탄소 공급원은 이산화탄소, 일산화탄소, 식물성 오일, 글리세롤, 글루코스, 수크로스, 단당류, 이당류, 다당류, 또는 이들의 조합을 포함한다. 이러한 구현예는 유기 생성물의 생산을 위해 산업용 이산화탄소를 이용하는 이점을 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 제1 재조합 미생물에 의해 생산된 적어도 하나의 유기 기질은 알파-케토글루타레이트(AKG), 수크로스, 글루코스, 글리세롤, 단당류, 이당류, 다당류 또는 이들의 조합을 포함한다. 이러한 구현예는 제2 생물반응기 배양 용기에서 유기 생성물의 생산에 이용될 수 있는 제1 생물반응기 배양 용기에서 생산된 비휘발성 유기 기질을 제공하는 이점을 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 제2 생물반응기 배양 용기는 탄소 공급원 유입구, 휘발성 가스 유출구, 전원 또는 이들의 조합을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 제2 재조합 미생물은 에틸렌, 알코올, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 에탄 디올, 유기산, 프로피온산, 아세트산, 알데하이드, 포름알데하이드, 장쇄 지방산, n-알칸, 탄화수소 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 유기 기질은 AKG를 포함하며, 적어도 하나의 유기 생성물은 에틸렌을 포함한다.
특정 구현예에서, 제1 생물반응기 배양 용기 또는 제2 생물반응기 배양 용기는 바이오매스 수집 포트를 추가로 포함한다. 이러한 구현예에서, 바이오매스 수집 포트는 비료, 공급원료, 바이오연료 또는 다른 적용에서 사용하기 위한 바이오매스의 처리 또는 가공을 위한, 제1 생물반응기 배양물, 제2 생물반응기 배양물 또는 이들의 조합으로부터 바이오매스를 수집할 수 있는 이점을 제공할 수 있다.
특정 구현예에서, 전원은 태양광, 태양광 전원, 전력 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 시스템은 탄산화 유닛, 아민 스트리퍼, 아민 스크러버, 촉매 변환기, 응축기, 압축기, 가성 타워, 건조기 또는 이들의 조합을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 유기 기질 배양액 및 유기 생성물 배양액은 하나의 생물반응기 배양 용기에서 조합된다. 일부 구현예에서, 유기 기질 배양액 및 유기 생성물 배양물은 필터에 의해 분리된다. 이러한 구현예에서, 필터는 약 0.2 ㎛ 내지 약 10 ㎛ 이상의 공극 크기를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 필터는 약 1 ㎛ 내지 약 8 ㎛ 이상의 공극 크기를 포함한다. 특정 구현예에서, 필터는 약 3 ㎛ 내지 약 5 ㎛ 이상의 공극 크기를 포함한다. 이러한 구현예는 필터를 통해 유기 기질 배양액으로부터 유기 생성물 배양액으로 유기 기질 및 다른 영양소를 허용하지 않거나 필터를 통한 적어도 하나의 유기 기질 배양물 불순물의 흐름을 감소시키면서, 적어도 하나의 유기 기질 배양물 불순물의 흐름을 허용함으로써, 제2 재조합 유기물에 의한 적어도 하나의 유기 생성물의 생산으로부터, 제1 재조합 미생물에 의한 적어도 하나의 유기 기질 배양 불순물의 생산을 분리하는 이점을 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 유기 기질 배양액 및 유기 생성물 배양액은 필터에 의해 분리되는 현탁된 유기 입자를 함유한다. 특정 구현예에서, 현탁된 유기 입자는 원심분리기를 사용하여 유기 기질 배양액 또는 유기 생성물 배양액으로부터 분리될 수 있다.
유기 기질 배양액 및 유기 생성물 배양액이 하나의 생물반응기 배양 용기에서 조합되는 다른 구현예에서, 적어도 하나의 비-천연 유기 기질 형성 효소 뉴클레오타이드 서열은 제1 재조합 미생물에 의해 발현되고, 적어도 하나의 비-천연 유기 기질은 제2 재조합 미생물에 의해 발현된 천연 유기 생성물 형성 효소 뉴클레오타이드 서열이 각각 제1 미생물 발현 벡터 및 제2 미생물 발현 벡터를 포함한다. 제1 미생물 발현 벡터 및 제2 미생물 발현 벡터는 각각 적어도 하나의 미생물 발현 프로모터를 포함한다. 이러한 구현예는 상이한 시점에 유기 기질 배양액에 또는 유기 생성물 배양액에 적어도 하나의 프로모터 유도 인자를 첨가하여 상이한 시점에 적어도 하나의 유기 기질 및 적어도 하나의 유기 생성물을 생산함으로써, 제2 재조합 미생물에 의해 적어도 하나의 유기 생성물의 생산으로부터, 제1 재조합 미생물에 의해 적어도 하나의 유기 기질 배양 불순물의 생산을 분리하는 이점을 제공할 수 있다.
재조합 미생물의 구현예
본원의 시스템의 특정 구현예에서, 유기 기질은 알파-케토글루타레이트(AKG)를 포함하며, 여기서, 제1 재조합 미생물에 의해 생산된 적어도 하나의 AKG 형성 효소의 양은 비-천연 AKG 형성 효소 발현 뉴클레오타이드 서열이 결여된 대조군 미생물에 비해 생산된 양보다 더 많다. 이러한 구현예에서, 적어도 하나의 유기 생성물은 에틸렌을 포함하며, 여기서, 제2 재조합 미생물에 의해 생산된 적어도 하나의 에틸렌 형성 효소(EFE)의 양은 비-천연 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열이 결여된 대조군 미생물에 비해 생산된 양보다 더 많다. 특정 구현예에서, 제1 재조합 미생물은 적어도 하나의 비-천연 AKGP 형성 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 적어도 하나의 알파-케토글루타레이트 퍼미아제 단백질(AKGP)을 발현한다. 이러한 구현예는 유기 기질 및 적어도 하나의 유기 생성물의 수율을 증가시켜, 상업적 규모로 에틸렌을 생산하는 데 필요한 생물반응기의 수 및 부피를 감소시키는 이점을 제공한다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 AKG 형성 효소는 이소시트레이트 데하이드로게나제(ICD) 단백질, 글루타메이트 데하이드로게나제(GDH) 단백질, 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 재조합 미생물은 서열번호 2와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 비-천연 ICD 단백질 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 서열번호 1과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 ICD 단백질을 발현시킨다. 일 구현예에서, ICD 아미노산 서열은 서열번호 1과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일 구현예에서, ICD 아미노산 서열은 서열번호 1과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일 구현예에서, ICD 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 2와 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 일 구현예에서, ICD 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 비-천연 ICD 단백질 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 서열번호 3과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 ICD 단백질을 발현시킨다. 일 구현예에서, ICD 아미노산 서열은 서열번호 3과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일 구현예에서, ICD 아미노산 서열은 서열번호 3과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일 구현예에서, ICD 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4와 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 일 구현예에서, ICD 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4와 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
특정 구현예에서, 제1 재조합 미생물은 서열번호 6과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 비-천연 GDH 단백질 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 서열번호 5와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 GDH 단백질을 발현시킨다. 일 구현예에서, 제1 재조합 미생물은 서열번호 5와 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 GDH 단백질을 발현한다. 일 구현예에서, 제1 재조합 미생물은 서열번호 5와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는 GDH 단백질을 발현한다. 일 구현예에서, 제1 재조합 미생물은 서열번호 6과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 GDH 뉴클레오타이드 서열을 발현시킨다. 일 구현예에서, 제1 재조합 미생물은 서열번호 6과 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 GDH 뉴클레오타이드 서열을 발현시킨다.
특정 구현예에서, 제1 재조합 미생물은 서열번호 2 또는 서열번호 4와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 비-천연 ICD 단백질 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 서열번호 1 또는 서열번호 3과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 ICD 단백질, 및 서열번호 6과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 비-천연 GDH 단백질 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 서열번호 5와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 GDH 단백질을 발현시킨다.
특정 구현예에서, 제2 재조합 미생물은 서열번호 8과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 비-천연 EFE 단백질 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 서열번호 7과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 EFE 단백질을 발현시킨다. 일 구현예에서, 제2 재조합 미생물은 서열번호 7과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 EFE 단백질을 발현시킨다. 일 구현예에서, 제2 재조합 미생물은 서열번호 7과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는 EFE 단백질을 발현시킨다. 일 구현예에서, 제2 재조합 미생물은 서열번호 8과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 비-천연 EFE 단백질 뉴클레오타이드 서열을 발현시킨다. 일 구현예에서, 제2 재조합 미생물은 서열번호 8과 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 비-천연 EFE 단백질 뉴클레오타이드 서열을 발현시킨다.
특정 구현예에서, 제1 재조합 미생물은 광합성 박테리아, 시아노박테리아, 시네코코커스, 시네코코커스 엘롱가투스, 시네코코커스 레오폴리엔시스, 시네코시스티스, 아나바에나, 슈도모나스, 슈도모나스 시링가에, 슈도모나이스 사바스타노이, 클라미도모나스, 클라미도모나스 레인하르드티로 구성된 군으로부터 선택된 미생물을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 재조합 미생물은 에셰리키아, 에셰리키아 콜라이, 지오박테리아, 아르트로박터 파라피네우스, 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 푸티다, 슈도모나스, 슈도모나스 시링가에, 슈도모나스 사바스타노이, 세라티아 마르세센스, 바실러스 메타테리움, 칸디다 팔루디지나, 피치아 이노시토보라, 토룰롭시스 글라브라타, 칸디다 리폴리티카, 야로위아 리폴리티카, 사카로마이세스 세레비시아에., 아스퍼질러스 종, 바실러스 서브틸리스 및 락토바실러스 종으로 구성된 군으로부터 선택된 미생물을 포함한다.
특정 구현예에서, 제1 재조합 미생물은 글루코스-1-포스페이트 아데닐릴트랜스퍼라제 단백질의 발현이 결여된 델타-glgc(Δglgc) 돌연변이체 미생물을 포함한다. 이러한 구현예에서, 제1 재조합 미생물은 AKG를 포함하는 더 많은 케토산의 생산을 위해 글리코겐 생산으로부터 이의 대사 경로를 이동시킬 것이다. 특정 구현예에서, Δglgc 돌연변이를 포함하는 제1 재조합 미생물은 증가된 수준의 AKG를 생산하고 분비할 것이다. 이러한 구현예는 유기 기질의 양을 증가시킴으로써, 제2 재조합 미생물에 의한 에틸렌 생산을 증가시키는 이점을 제공할 수 있다.
특정 구현예에서, 제1 재조합 미생물은 서열번호 10과 적어도 9% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 비-천연 수크로스 신타제 단백질 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 서열번호 9와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 수크로스 신타제 단백질을 발현시킨다. 일 구현예에서, 제1 재조합 미생물은 서열번호 9와 적어도 80%의 아미노산 서열을 갖는 수크로스 신타제 단백질을 발현시킨다. 일 구현예에서, 제1 재조합 미생물은 서열번호 9와 적어도 98%의 아미노산 서열을 갖는 수크로스 신타제 단백질을 발현시킨다. 일 구현예에서, 제1 재조합 미생물은 서열번호 10과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 비-천연 수크로스 신타제 단백질 뉴클레오타이드 서열을 발현시킨다. 일 구현예에서, 제1 재조합 미생물은 서열번호 10과 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 비-천연 수크로스 신타제 단백질 뉴클레오타이드 서열을 발현시킨다. 이러한 구현예는 제1 재조합 미생물의 성장을 위한 탄소 공급원뿐만 아니라, 제2 재조합 미생물의 성장을 위한 탄소 공급원으로서 증가된 수크로스 생산의 이점을 제공할 수 있다.
특정 구현예에서, 제1 재조합 미생물은 서열번호 12와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 수크로스 포스페이트 신타제 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 서열번호 11과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 수크로스 포스페이트 신타제 단백질을 발현시킨다. 일 구현예에서, 제1 재조합 미생물은 서열번호 11과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 수크로스 포스페이트 신타제 단백질을 발현시킨다. 일 구현예에서, 제1 재조합 미생물은 서열번호 11과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는 수크로스 포스페이트 신타제 단백질을 발현시킨다. 일 구현예에서, 제1 재조합 미생물은 서열번호 12와 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 수크로스 포스페이트 단백질 뉴클레오타이드 서열을 발현시킨다. 일 구현예에서, 제1 재조합 미생물은 서열번호 12와 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을를 갖는 수크로스 포스페이트 단백질 뉴클레오타이드 서열을 발현시킨다. 이러한 구현예는 제1 재조합 미생물의 성장을 위한 추가적인 탄소 공급원뿐만 아니라, 제2 재조합 미생물의 성장을 위한 추가적인 탄소 공급원으로서 수크로스 생산의 이점을 제공할 수 있다.
다양한 구현예에서, 적어도 하나의 AKG 형성 효소의 양은 비-천연 AKG 형성 효소 발현 뉴클레오타이드 서열이 결된 대조군 미생물에 비해 생산된 양보다 더 많다. 특정 구현예에서, 제1 재조합 미생물에 의해 생산된 적어도 하나의 AKG 형성 효소의 양은 비-천연 AKG 형성 효소 발현 뉴클레오타이드 서열이 결여된 대조군 미생물에 비해 생산된 양보다 약 5% 내지 약 200% 이상 더 많다. 일부 구현예에서, 제1 재조합 미생물에 의해 생산된 적어도 하나의 AKG 형성 효소의 양은 비-천연 AKG 형성 효소 발현 뉴클레오타이드 서열이 결여된 대조군 미생물에 비해 생산된 양보다 약 50% 내지 약 150% 이상 더 많다. 특정 구현예에서, 제1 재조합 미생물에 의해 생산된 적어도 하나의 AKG 형성 효소의 양은 비-천연 AKG 형성 효소 발현 뉴클레오타이드 서열이 결여된 대조군 미생물에 비해 생산된 것보다 75% 내지 약 100% 이상 더 많다.
다양한 구현예에서, 제2 재조합 미생물에 의해 생산된 EFE 단백질의 양은 비-천연 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열이 결여된 대조군 미생물에 비해 생산된 양보다 크다. 특정 구현예에서, 제2 재조합 미생물에 의해 생산된 EFE 단백질의 양은 비-천연 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열이 결여된 대조군 미생물에 비해 생산된 양보다 약 5% 내지 약 200% 이상 더 많다. 특정 구현예에서, 제2 재조합 미생물에 의해 생산된 EFE 단백질의 양은 비-천연 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열이 결여된 대조군 미생물에 비해 생산된 양보다 약 50% 내지 약 150% 이상 더 많다. 특정 구현예에서, 제2 재조합 미생물에 의해 생산된 EFE 단백질의 양은 비-천연 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열이 결여된 대조군 미생물에 비해 생산된 양보다 약 75% 내지 약 100% 이상 더 많다.
특정 구현예에서, 제2 재조합 미생물에 의해 생산된 EFE 단백질의 양은 유기 생성물 배양액의 리터 당 약 20 그램 내지 약 100 그램 이상이다. 일부 구현예에서, 제2 재조합 미생물에 의해 생산된 EFE 단백질의 양은 유기 생성물 배양액의 리터 당 약 35 그램 내지 약 85 그램이다. 일부 구현예에서, 제2 재조합 미생물에 의해 생산된 EFE 단백질의 양은 유기 생성물 배양액의 리터 당 약 50 그램 내지 약 70 그램 이상이다.
특정 구현예에서, 제2 재조합 미생물은 E. 콜라이를 포함한다. 이러한 구현예는 제2 재조합 미생물의 빠른 성장 속도 및 유기 생성물 수율을 증가시킬 수 있는 유전적 변형에 이용 가능한 광범위한 툴(tool)의 이점을 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, 제2 재조합 미생물에 의해 생산된 EFE 단백질의 양은 제2 재조합 미생물의 단백질의 총 세포 수의 약 30% 내지 약 80% 이상이다. 일부 구현예에서, 제2 재조합 미생물에 의해 생산된 EFE 단백질의 양은 제2 재조합 미생물의 단백질의 총 세포 양의 약 40% 내지 약 70% 이상이다. 일부 구현예에서, 제2 재조합 미생물에 의해 생산된 EFE 단백질의 양은 제2 재조합 미생물의 단백질의 총 세포 양의 약 50% 내지 약 60% 이상이다.
특정 구현예에서, 제2 재조합 미생물에 의해 생산된 에틸렌의 생산률은 약 1억 파운드/년 내지 약 10억 파운드/년 이상이다. 일부 구현예에서, 제2 재조합 미생물은 약 2억 파운드/년 내지 약 8억 파운드/년 이상이다. 일부 구현예에서, 제2 재조합 미생물에 의해 생산된 에틸렌의 생산률은 약 4억 파운드/년 내지 약 6억 파운드/년 이상이다. 특정 구현예에서, 제2 재조합 미생물에 의해 생산된 에틸렌의 생산률은 개월 당 생물반응기 배양물의 갤런 당 약 0.13 내지 약 8.3 파운드이다. 규모에서, 약 0.13 파운드/갤런-생물반응기/개월 생산성은 최대 약 10억 파운드 이상의 에틸렌의 연간 생산을 위해 최대 642개의 상업적 규모(1,000,000 갤런) 생물반응기를 갖는 산업 플랜트로 바뀔 수 있다. 생산성이 약 8.3 파운드/갤런-생물반응기/개월로 증가하는 경우, 10개의 상업적 규모(1,000,000 갤런)의 생물반응기가 약 10억 파운드/년 이상의 에틸렌 생산을 위한 산업 플랜트에 충분할 것이다.
특정 구현예에서, 제2 재조합 미생물의 세포 집단 농도는 밀리리터 당 약 107 내지 약 1013개 세포의 범위이다. 일부 구현예에서, 제2 재조합 미생물의 농도는 밀리리터 당 약 108 내지 약 1012개 세포의 범위이다. 일부 구현예에서, 제2 재조합 미생물의 농도는 밀리리터 당 약 109 내지 약 1011개의 세포 범위이다. 특정 구현예에서, 제2 재조합 미생물의 농도는 리터 당 약 100 그램 내지 약 300 그램의 건조 세포 중량, 또는 리터 당 약 0.2 그램 내지 약 100 그램의 유기 생성물 배양액의 리터 당 건조 세포 중량의 범위이다. 특정 구현예에서, 제2 재조합 미생물의 농도는 리터 당 약 125 그램 내지 약 275 그램의 건조 세포 중량의 유기 생성물 배양액의 리터 당 건조 세포 중량의 범위이다. 특정 구현예에서, 제2 재조합 미생물의 농도는 리터 당 약 150 그램 내지 약 250 그램의 건조 세포 중량의 유기 생성물 배양액의 리터 당 건조 세포 중량의 범위이다.
특정 구현예에서, 비-천연 AKG 형성 효소 발현 뉴클레오타이드 서열 또는 비-천연 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 미생물 발현 벡터에 삽입되며, 여기서, 미생물 발현 벡터는 박테리아 벡터 플라스미드, 상동 재조합 시스템의 뉴클레오타이드 가이드, 항생제-내성 시스템, 단백질 정제 및 검출을 위한 보조 시스템, CRISPR CAS 시스템, 파지 디스플레이 시스템 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 약 2 내지 약 500개 이상의 미생물 발현 벡터에서의 복사체 수를 갖는다. 일부 구현예에서, EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 약 10 내지 약 300의 미생물 발현 벡터에서의 복사체 수를 갖는다. 일부 구현예에서, EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 약 50 내지 약 100의 미생물 발현 벡터에서의 복사체 수를 갖는다. 이러한 구현예는 증가된 에틸렌 수율의 이점을 제공하여, 상업적 규모로 에틸렌 생산의 부피 및 비용을 감소시킬 수 있다.
특정 구현예에서, 미생물 발현 벡터는 적어도 하나의 미생물 발현 프로모터를 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 미생물 발현 프로모터는 광 민감성 프로모터, 화학물질 민감성 프로모터, 온도 민감성 프로모터, Lac 프로모터, T7 프로모터, CspA 프로모터, 람다 PL 프로모터, 람다 CL 프로모터, 연속적으로 생산하는 프로모터, psbA 프로모터 또는 이들의 조합을 포함한다.
유기 생성물을 생산하는 방법의 구현예
본원의 구현예는 유기 생성물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 본 방법은 적어도 하나의 생물반응기 배양 용기를 포함하는 생물제조 시스템을 제공하는 단계를 포함하며; 여기서, 적어도 하나의 생물반응기 배양 용기는 유기 기질 배양액을 함유하며; 유기 기질 배양액은 제1 재조합 미생물을 함유하며; 제1 재조합 미생물은 개선된 유기 기질 생산 능력을 가지고, 적어도 하나의 비-천연 유기 기질 형성 효소 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 적어도 하나의 유기 기질 형성 재조합 효소를 발현시키고, 유기 기질을 형성하기 위해 탄소 공급원을 사용할 수 있고, 휘발성 가스, 액체 및 고체 중 적어도 하나를 포함하는 적어도 하나의 유기 기질 배양 불순물을 생산하며; 적어도 하나의 생물반응기 배양 용기는 유기 생성물 배양액을 함유하며; 유기 생성물 배양액은 제2 재조합 미생물을 함유하며; 제2 재조합 미생물은 개선된 유기 생성물 생산 능력을 가지고, 적어도 하나의 비-천연 유기 생성물 형성 효소 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 적어도 하나의 유기 생성물 형성 효소를 발현시키고, 적어도 하나의 생성물을 생산하기 위해 유기 기질을 사용할 수 있으며; 적어도 하나의 생물반응기 배양 용기는 탄소 공급원 유입구, 휘발성 가스 유출구 및 전원을 포함하는 제1 생물반응기 배양 용기를 포함하며; 시스템은 제1 생물반응기 배양 용기와 제2 생물반응기 배양 용기에 및 이들 사이에 유체 유로, 및 유기 생성물 유출구를 포함하는 제2 생물반응기 배양 용기를 포함하며; 제1 생물반응기 배양 용기는 유기 기질 배양액을 포함하며, 제2 생물반응기 배양 용기는 유기 생성물 배양액을 포함한다.
이러한 구현예에서, 본 방법은 제1 생물반응기 배양 용기에서 소정 양의 적어도 하나의 유기 기질을 생산하기에 충분한 조건하에, 제1 생물반응기 배양 용기에서 제1 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 제2 생물반응기 배양 용기에서 소정 양의 적어도 하나의 유기 생성물을 생산하기에 충분한 조건하에, 제2 생물반응기 배양 용기에서 제2 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함한다. 이러한 구현예는 제2 재조합 유기물에 의해 적어도 유기 생성물을 생산하는 것과 별도로 제1 재조합 미생물에 의해 적어도 하나의 유기 기질 배양 불순물의 생산의 이점을 제공할 수 있다. 이러한 구현예에서, 유기 기질 및 다른 영양소는 제2 재조합 미생물의 성장 및 유기 생성물의 생산을 제공하기 위해, 제1 생물반응기 배양 용기 및 제2 생물반응기 배양 용기에 및 이들 사이에 연결된 유체 유로를 통해 제2 재조합 미생물에 제공될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 방법은 휘발성 가스 유출구를 통해 유기 기질 배양액으로부터 소정 양의 적어도 하나의 휘발성 가스를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 본 방법은 유기 생성물 유출구를 통해 유기 생성물 배양액으로부터 적어도 하나의 유기 생성물을 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 탄소 공급원이 이산화탄소를 포함하는 경우, 본 방법은 소정 양의 이산화탄소를 이산화탄소 공급원으로부터 탄소 공급원 유입구를 통해 유기 기질 배양액으로 공급하는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 구현예는 제1 재조합 미생물 및 제2 재조합 미생물의 성장 속도의 개선된 제어, 개선된 탄소 포획률, 및 개선된 생성물 수율의 이점을 제공할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 방법은 유기 기질 배양액 및 유기 생성물 배양액의 pH 수준을 약 5.0 내지 약 8.5로 유지하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 본 방법은 유기 기질 배양액 및 유기 생성물 배양액의 pH 수준을 약 5.5 내지 약 8.0으로 유지하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 본 방법은 유기 기질 배양액 및 유기 생성물 배양액의 pH 수준을 약 6.0 내지 약 7.0으로 유지하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 본 방법은 유기 기질 배양액 및 유기 생성물 배양액을 약 25℃ 내지 약 70℃ 이상인 온도로 유지하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 본 방법은 유기 기질 배양액 및 유기 생성물 배양액을 약 35℃ 내지 약 60℃의 온도로 유지하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 본 방법은 유기 기질 배양액 및 유기 생성물 배양액을 약 40℃ 내지 약 50℃의 온도로 유지하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 본 방법은 제2 생물반응기 배양 용기의 총 내부 부피를 기준으로 약 10 부피% 내지 약 1 부피% 이하의 제2 생물반응기 배양 용기 내의 휘발성 가스의 양을 유지하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 본 방법은 제2 생물반응기 배양 용기의 총 내부 부피를 기준으로 약 5 부피% 내지 내지 약 0.5 부피%의 제2 생물반응기 배양 용기 내의 휘발성 가스의 양을 유지하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 본 방법은 제2 생물반응기 배양 용기의 총 내부 부피를 기준으로 약 1 부피% 내지 약 0.1 부피% 이하의 제2 생물반응기 배양 용기 내의 휘발성 가스의 양을 유지하는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 구현예는 안전한 수준의 휘발성 가스를 함유한 적어도 하나의 유기 생성물의 생산 이점을 제공할 수 있다. 이러한 구현예는 규제 한계 내의 휘발성 가스 수준을 함유하는 적어도 하나의 유기 생성물의 생산의 이점을 제공할 수 있다.
특정 구현예에서, 제1 생물반응기 배양 용기 또는 제2 생물반응기 배양 용기가 바이오매스 수집 포트를 추가로 포함하는 경우, 본 방법은 바이오매스 수집 포트를 통해 제1 재조합 미생물 또는 제2 재조합 미생물에 의해 생산된 소정 양의 바이오매스를 수집하는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 구현예는 비료, 공급원료, 바이오연료, 또는 다른 적용에 사용하기 위한 바이오매스의 처분 또는 가공을 위해 바이오매스를 수집하는 이점을 제공할 수 있다.
본원의 방법의 특정 구현예에서, 비-천연 유기 기질 형성 재조합 효소 발현 뉴클레오타이드 또는 비-천연 유기 생성물 발현 뉴클레오타이드 서열은 미생물 발현 벡터에 삽입되며, 적어도 하나의 미생물 발현 벡터는 적어도 하나의 미생물 발현 프로모터를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 방법은 유기 기질 배양액 또는 유기 생성물 배양액에 적어도 하나의 프로모터 유도 인자를 첨가함으로써 생성된 적어도 하나의 유기 기질의 양 또는 적어도 하나의 유기 생성물의 양을 제어하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 미생물 발현 프로모터는 광 민감성 프로모터, 화학물질 민감성 프로모터, 온도 민감성 프로모터, Lac 프로모터, T7 프로모터, CspA 프로모터, 람다 PL 프로모터, 람다 CL 프로모터, 연속적으로 생산하는 프로모터, psbA 프로모터 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 프로모터 유도 인자는 락토스, 자일로스, IPTG, 저온 쇼크, 열 쇼크 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원의 방법의 특정 구현예에서, 적어도 하나의 유기 기질은 AKG를 포함한다. 이러한 구현예에서, 적어도 하나의 유기 생성물은 에틸렌을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 유기 기질 배양물 불순물이 적어도 하나의 휘발성 가스를 포함하는 경우, 본 방법은 휘발성 가스 유출구를 통해 적어도 하나의 휘발성 가스를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 방법은 약 1억 파운드/년 내지 약 10억 파운드/년 이상의 속도로 생산된 에틸렌의 양을 회수하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 약 2억 파운드/년 내지 약 8억 파운드/년 이상의 속도로 생산된 에틸렌의 양을 회수하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 방법은 약 4억 파운드/년 내지 약 6억 파운드/년 이상의 속도로 생산된 에틸렌의 양을 회수하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 방법은 개월 당 생물반응기 배양물 갤런 당 약 0.13 내지 약 8.3 파운드의 속도로 생산된 에틸렌의 양을 회수하는 단계를 포함한다. 규모에서, 0.13 파운드/갤런-생물반응기/개월 생산성은 약 10억 파운드 이상의 에틸렌의 연간 생산을 위해 최대 642개의 상업적 규모(1,000,000 갤런) 생물반응기로 옮겨질 수 있다. 생산성이 약 8.3 파운드/갤런 생물반응기/개월로 증가하는 경우, 10개의 상업적 규모(1,000,000 갤런) 생물반응기가 10억 파운드/년 이상의 에틸렌 생산을 갖는 산업 플랜트에 충분할 것이다. 특정 구현예에서, 생산된 에틸렌의 양은 약 1 몰 퍼센트 이하의 휘발성 가스의 양을 함유한다. 특정 구현예에서, 생산된 에틸렌의 양은 약 0.5 몰% 이하의 휘발성 가스의 양을 함유한다. 특정 구현예에서, 생산된 에틸렌의 양은 약 0.25 몰% 이하의 휘발성 가스의 양을 함유한다.
본원의 구현예는 적어도 하나의 생물반응기 배양 용기를 포함하는 생물정화 시스템을 제공하는 단계를 포함하는 유기 생성물을 생산하는 방법에 관한 것으로서, 여기서, 적어도 하나의 생물반응기 배양 용기는 유기 기질 배양액을 함유하며; 유기 기질 배양액이 제1 재조합 미생물을 함유하며; 제1 재조합 미생물은 개선된 유기 기질 생산 능력을 가지고, 적어도 하나의 비-천연 유기 기질 형성 효소 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 재조합 효소를 형성하는 적어도 하나의 유기 기질을 발현시키고, 탄소 공급원을 이용하여 유기 기질을 생산할 수 있고, 휘발성 가스, 액체 및 고체 중 적어도 하나를 포함하는 적어도 하나의 유기 기질 배양물 불순물을 생산할 수 있으며; 적어도 하나의 생물반응기 배양 용기는 유기 생성물 배양액을 함유하며; 유기 생성물 배양액은 제2 재조합 미생물을 함유하며; 제2 재조합 미생물은 개선된 유기 생성물 생산 능력을 가지고, 적어도 하나의 비-천연 유기 생성물 형성 효소 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 적어도 하나의 유기 생성물 형성 효소를 발현시키고, 적어도 하나의 유기 생성물을 생산하기 위해 유기 기질을 사용할 수 있다. 이러한 구현예에서, 유기 기질 배양액 및 유기 생성물 배양액은 하나의 생물반응기 배양 용기에서 조합되며, 비-천연 유기 기질 형성 재조합 효소 발현 뉴클레오타이드 서열은 제1 미생물 발현 벡터에 삽입되며, 비-천연 유기 생성물 형성효소 발현 뉴클레오타이드 서열은 제2 미생물 발현 벡터에 삽입되며, 제1 미생물 발현 벡터 및 제2 미생물 발현 벡터는 각각 적어도 하나의 미생물 발현 프로모터를 포함한다.
이러한 구현예에서, 본 방법은 탄소 공급원 유입구에 연결된 탄소 공급원을 제공하는 단계; 제1 생물반응기 배양 용기에서 소정 양의 적어도 하나의 유기 기질을 생산하기에 충분한 조건하에, 제1 생물반응기 배양 용기에서 제1 재조합 미생물을 배양하는 단계; 제1 시점에 유기 기질 배양액에 적어도 하나의 프로모터 유도 인자를 첨가함으로써, 소정 양의 적어도 하나의 유기 기질을 생산하는 단계; 제2 생물반응기 배양 용기에서 소정 양의 적어도 하나의 유기 생성물을 생산하기에 충분한 조건하에, 제2 생물반응기 배양 용기에서 제2 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 제2 시점에 유기 기질 배양액에 적어도 하나의 프로모터 유도 인자를 첨가함으로써, 소정 양의 적어도 하나의 유기 기질을 생산하는 단계를 포함한다. 이러한 구현예는 상이한 시점에 유기 기질 배양액에 또는 유기 생성물 배양액에 적어도 하나의 프로모터 유도 인자를 첨가하여 상이한 시점에 적어도 하나의 유기 기질 및 적어도 하나의 유기 생성물을 생산함으로써, 제2 재조합 미생물에 의한 적어도 하나의 유기 생성물의 생산으로부터, 제1 재조합 미생물에 의한 적어도 하나의 유기 기질 배양 불순물의 생산을 분리시키는 이점을 제공할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 방법은 제2 시점 전에, 제2 생물반응기 배양 용기에서의 휘발성 가스의 양을 제2 생물반응기 배양 용기의 총 내부 부피를 기준으로 약 10 부피% 내지 약 1 부피% 이하까지 낮추는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 제2 시점 전에, 제2 생물반응기 배양 용기의 휘발성 가스의 양을 제2 생물반응기 배양 용기의 총 내부 부피를 기준으로 약 5 부피% 내지 약 0.5 부피% 이하까지 낮추는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 방법은 제2 시점 전에, 제2 생물반응기 배양 용기의 휘발성 가스의 양을 제2 생물반응기 배양 용기의 총 내부 부피를 기준으로 약 1 부피%로부터 약 0.1 부피% 이하로 낮추는 단계를 포함한다. 이러한 구현예는 안전한 수준의 휘발성 가스를 함유하는 적어도 하나의 유기 생성물을 생산하는 이점을 제공할 수 있다. 이러한 구현예는 규제 한계 내의 휘발성 가스 수준을 함유하는 적어도 하나의 유기 생성물을 생산하는 이점을 제공할 수 있다.
본원의 구현예는 탄소 공급원 유입구, 휘발성 가스 유출구 및 전원을 포함하는 제1 생물반응기 배양 용기; 및 제1 생물반응기 배양 용기와 제2 생물반응기 배양 용기에 및 이들 사이에 연결된 유체 유로 및 유기 생성물 유출구를 포함하는 제2 생물반응기 배양 용기를 포함하는 생물제조 시스템을 제공하는 단계를 포함하며, 제1 생물반응기 배양 용기는 유기 기질 배양액을 포함하며, 제2 생물반응기 배양 용기는 유기 생성물 배양액을 포함하며; 유기 기질 배양액은 개선된 유기 기질 생산 능력을 갖는 제1 재조합 미생물을 함유하며, 유기 기질은 AKG를 포함하며, 제1 재조합 미생물은 적어도 하나의 비-천연 유기 기질 형성 효소 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 재조합 효소를 형성하는 적어도 하나의 유기 기질을 발현시키며, 유기 기질 형성 효소는 AKG 형성 효소를 포함하며, 제1 재조합 미생물은 소정 양의 AKG를 생산하기 위해 탄소 공급원을 사용할 수 있으며, 제1 재조합 미생물은 휘발성 가스, 액체 및 고체 중 적어도 하나를 포함하는 적어도 하나의 유기 기질 배양물 불순물을 생산하며; 휘발성 가스는 산소를 포함하며, 유기 생성물 배양액은 개선된 유기 생성물 생산 능력을 갖는 제2 재조합 미생물을 함유하며, 유기 생성물은 에틸렌을 포함하며, 제2 재조합 유기물은 적어도 하나의 비-천연 유기 생성물 형성 효소 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 적어도 하나의 유기 생성물 형성 효소를 발현시키며, 유기 생성물 형성 효소는 EFE를 포함하며, 제2 재조합 유기물은 소정 양의 에틸렌을 생산하기 위해 AKG를 사용할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 방법은 제1 생물반응기 배양 용기에서 소정 양의 AKG를 생산하기에 충분한 조건하에, 제1 생물반응기 배양 용기에서 제1 재조합 미생물을 배양하는 단계; 제2 생물반응기 배양 용기에서 소정 양의 EFE를 생산하기에 충분한 조건하에, 제2 생물반응기 배양 용기에서 제2 재조합 미생물을 배양하는 단계; 휘발성 가스 유출구를 통해 유기 기질 배양액으로부터 소정 양의 산소를 제거하는 단계; 및 유기 생성물 유출구를 통해 유기 생성물 배양액으로부터 소정 양의 EFE를 제거하는 단계를 포함한다. 이러한 구현예는 별도의 생물반응기 배양 용기에서 산소 및 에틸렌을 생산하는 이점을 제공할 수 있으며; 이러한 구현예에서, 산소와 에틸렌과 같은 휘발성 생성물의 공동-생산은 감소되거나 제거될 수 있다. 이러한 구현예는 또한 제2 생물반응기 배양 용기에서 에틸렌의 생산에 이용될 수 있는 AKG와 같은 비휘발성 유기 기질을 생산하는 이점을 제공할 수 있다.
추가 구현예:
구현예 1. 유기 생성물을 생산하기 위한 생물제조 시스템으로서,
적어도 하나의 생물반응기 배양 용기를 포함하며;
적어도 하나의 생물반응기 배양 용기는 유기 기질 배양액을 함유하며,
유기 기질 배양액은 개선된 유기 기질 생산 능력을 갖는 제1 재조합 미생물을 함유하며,
제1 재조합 미생물은 적어도 하나의 비-천연 유기 기질 형성 효소 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 적어도 하나의 유기 기질 형성 재조합 효소를 발현시키며,
제1 재조합 미생물은 유기 기질을 생산하기 위해 탄소 공급원을 사용할 수 있으며,
제1 재조합 미생물은 휘발성 가스, 액체, 및 고체 중 적어도 하나를 포함하는 적어도 하나의 유기 기질 배양 불순물을 생산하며,
적어도 하나의 생물반응기 배양 용기는 유기 생성물 배양액을 함유하며,
유기 생성물 배양액은 개선된 유기 생성물 생산 능력을 갖는 제2 재조합 미생물을 함유하며,
제2 재조합 유기물은 적어도 하나의 비-천연 유기 생성물 형성 효소 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 적어도 하나의 유기 생성물 형성 효소를 발현시키며,
제2 재조합 유기물은 적어도 하나의 유기 생성물을 생산하기 위해 유기 기질을 사용할 수 있는 생물제조 시스템.
구현예 2. 구현예 1 또는 임의의 이전 구현예에 있어서, 적어도 하나의 생물반응기 배양 용기가 탄소 공급원 유입구, 휘발성 가스 유출구 및 전원을 포함하는 제1 생물반응기 배양 용기; 및 제1 생물반응기 배양 용기와 제2 생물반응기 배양 용기에 및 이들 사이에 연결된 유체 유로, 및 유기 생성물 유출구를 포함하는 제2 생물반응기 배양 용기를 포함하며;
제1 생물반응기 배양 용기는 유기 기질 배양액을 포함하며, 제2 생물반응기 배양 용기는 유기 생성물 배양액을 포함하거나; 제1 생물반응기 배양 용기 또는 제2 생물반응기 배양 용기는 바이오매스 수집 포트를 추가로 포함하는 시스템.
구현예 3. 구현예 2 또는 임의의 이전 구현예에 있어서, 탄소 공급원이 이산화탄소, 일산화탄소, n-알칸, 에탄올, 식물성 오일, 글리세롤, 글루코스, 수크로스, 단당류, 이당류, 다당류 또는 이들의 조합을 포함하거나;
전원은 태양광, 태양광 전원, 전력원 또는 이들의 조합을 포함하거나;
휘발성 가스는 산소, 메탄 또는 이들의 조합을 포함하거나;
적어도 하나의 유기 기질은 알파-케토글루타레이트, 수크로스, 글루코스, 글리세롤, 단당류, 이당류, 다당류 또는 이들의 조합을 포함하거나;
적어도 하나의 유기 생성물은 알코올, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 에탄 디올, 유기산, 프로피온산, 아세트산, 알데하이드, 포름알데하이드, 장쇄 지방산, n-알칸, 탄화수소 또는 이들의 조합을 포함하거나;
제2 생물반응기 배양 용기는 탄소 공급원 유입구, 휘발성 가스 유출구, 전원 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 시스템.
구현예 4. 구현예 1 또는 임의의 이전 구현예에 있어서, 유기 기질 배양액 및 유기 생성물 배양액이 하나의 생물반응기 배양 용기에서 조합되거나;
유기 기질 배양액 및 유기 생성물 배양물은 약 0.2 ㎛ 내지 약 10 ㎛ 이상의 공극 크기를 포함하는 필터에 의해 분리되거나;
시스템은 탄산화 유닛, 아민 스트리퍼, 아민 스크러버, 촉매 변환기, 응축기, 압축기, 가성 타워, 건조기 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 시스템.
구현예 5. 구현예 1 또는 임의의 이전 구현예에 있어서, 유기 기질이 알파-케토글루타레이트(AKG)를 포함하며, 제1 재조합 미생물에 의해 생산된 적어도 하나의 AKG 형성 효소의 양은 비-천연 AKG 형성 효소 발현 뉴클레오타이드 서열이 결여된 대조군 미생물에 비해 생산된 양보다 더 많거나;
적어도 하나의 유기 생성물 형성 효소는 에틸렌 형성 효소(EFE)를 포함하며, 제2 재조합 미생물에 의해 생산된 EFE의 양은 비-천연 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열이 결여된 대조군 미생물에 비해 생산된 양보다 더 많은 시스템.
구현예 6. 구현예 5 또는 임의의 이전 구현예에 있어서, 제1 재조합 미생물이 적어도 하나의 비-천연 AKGP 형성 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 적어도 하나의 알파-케토글루타레이트 퍼미아제 단백질(AKGP)을 발현시키는 시스템.
구현예 7. 구현예 5 또는 임의의 이전 구현예에 있어서, 적어도 하나의 AKG 형성 효소가 이소시트레이트 데하이드로게나제(ICD) 단백질, 글루타메이트 데하이드로게나제(GDH) 단백질 또는 이들의 조합을 포함하는 시스템.
구현예 8. 구현예 7 또는 임의의 이전 구현예에 있어서, 제1 재조합 미생물이 서열번호 2와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 비-천연 ICD 단백질 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 서열번호 1과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 ICD 단백질을 발현시키거나;
제1 재조합 미생물은 서열번호 6과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 비-천연 GDH 단백질 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 서열번호 5와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 GDH 단백질을 발현시키거나;
이들의 조합이거나;
제2 재조합 미생물이 서열번호 8과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 비-천연 EFE 단백질 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 서열번호 7과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 EFE 단백질을 발현시키는 시스템.
구현예 9. 구현예 1 또는 임의의 이전 구현예에 있어서, 제1 재조합 미생물이 광합성 박테리아, 시아노박테리아, 시네코코커스, 시네코코커스 엘롱가투스, 시네코코커스 레오폴리엔시스, 시네코시스티스, 아나바에나, 슈도모나스, 슈도모나스 시린게, 슈도모나스 사바스타노이, 클라미도모나스, 클라미도모나스 레인하르드티, 에셰리키아, 에셰리키아 콜라이, 지오박테리아, 아르트로박터 파라피네우스, 슈도모나스 플루오레센스, 세라티아 마르세센스, 바실러스 메타테리움, 칸디다 팔루디게나, 피치아 이노시토보라, 토룰롭시스 글라브라타, 칸디다 리폴리티카, 야로위아 리폴리티카, 사카로마이세스 세레비시아에, 아스퍼질러스 종, 바실러스 서브틸리스, 및 락토바실러스 종, 조류, 미세조류, 전기합성 박테리아, 광합성 미생물, 사상성 진균 및 식물 세포로 구성된 군으로부터 선택된 미생물을 포함하거나; 제2 재조합 미생물이 에셰리키아, 에셰리키아 콜라이, 지오박테리아, 아르트로박터 파라피너스, 슈도모나스 플루오레센스, 세라티아 마르세센스, 바실러스 메타테리움, 칸디다 팔루디게나, 피치아 이노시토보라, 토룰롭시스 글라브라타, 칸디다 리폴리티카, 야로위아 리폴리티카, 사카로마이세스 세레비시아에, 아스퍼질러스 종, 바실러스 서브틸리스, 클로렐라 종, 락토바실러스 종, 혐기성 박테리아 및 바실러스 서브틸리스로 구성된 군으로부터 선택된 미생물을 포함하는 시스템.
구현예 10. 구현예 1 또는 임의의 이전 구현예에 있어서, 제1 재조합 미생물이 글루코스-1-포스페이트 아데닐릴트랜스퍼라제 단백질의 발현이 결여된 델타-glgc 돌연변이체 미생물을 포함하거나; 제1 재조합 미생물이 서열번호 10과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 비-천연 수크로스 신타제 단백질 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 서열번호 9와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 수크로스 신타제 단백질을 발현시키거나; 제1 재조합 미생물이 서열번호 12와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 비-천연 수크로스 신타제 단백질 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 서열번호 11과와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 수크로스 신타제 단백질을 발현시키는 시스템.
구현예 11. 구현예 5 또는 임의의 이전 구현예에 있어서, 제1 재조합 미생물에 의해 생산된 적어도 하나의 AKG 형성 효소의 양이 비-천연 AKG 형성 효소 발현 뉴클레오타이드 서열이 결여된 대조군 미생물에 비해 생산된 양보다 약 5% 내지 약 200% 이상 더 많거나;
제2 재조합 미생물에 의해 생산된 EFE 단백질의 양은 비-천연 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열이 결여된 대조군 미생물에 비해 생산된 양보다 약 5% 내지 약 200% 이상 더 많거나;
제2 재조합 미생물에 의해 생산된 EFE 단백질의 양은 유기 생성물 배양액 1 리터 당 약 20 그램 내지 약 100 그램인 시스템.
구현예 12. 구현예 5 또는 임의의 이전 구현예에 있어서, 제2 재조합 미생물이 E. 콜라이(E. Coli)를 포함하며, 제2 재조합 미생물에 의해 생산된 EFE 단백질의 양이 제2 재조합 미생물의 단백질의 총 세포 양의 약 30% 내지 약 80% 이상이거나;
제2 재조합 미생물에 의해 생산된 적어도 하나의 유기 생성물의 생산 속도가 약 1억 파운드/년 내지 약 10억 파운드/년 이상이거나;
제2 재조합 미생물의 세포 집단 농도가 밀리리터 당 약 107 내지 약 1013개의 세포, 또는 리터 당 약 100 그램 내지 약 300 그램의 건조 세포 중량의 유기 생성물 배양액 리터 당 건조 세포 중량의 범위인 시스템.
구현예 13. 구현예 5 또는 임의의 이전 구현예에 있어서, 비-천연 AKG 형성 효소 발현 뉴클레오타이드 서열 또는 비-천연 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열이 미생물 발현 벡터에 삽입되며, 미생물 발현 벡터가 박테리아 벡터 플라스미드, 상동 재조합 시스템의 뉴클레오타이드 가이드, 항생제-내성 시스템, 단백질 정제 및 검출을 위한 보조 시스템, CRISPR CAS 시스템, 파지 디스플레이 시스템 또는 이들의 조합을 포함하는 시스템.
구현예 14. 구현예 5 또는 임의의 이전 구현예에 있어서, EFE 발현 뉴클레오타이드 서열이 미생물 발현 벡터에서 약 2 내지 약 500의 복사체 수를 가지거나; 미생물 발현 벡터가 적어도 하나의 미생물 발현 프로모터를 포함하는 시스템.
구현예 15. 구현예 14 또는 임의의 이전 구현예에 있어서, 적어도 하나의 미생물 발현 프로모터가 광 민감성 프로모터, 화학물질 민감성 프로모터, 온도 민감성 프로모터, Lac 프로모터, T7 프로모터, CspA 프로모터, 람다 PL 프로모터, 람다 CL 프로모터, 연속적으로 생산하는 프로모터, psbA 프로모터 또는 이들의 조합을 포함하는 시스템.
구현예 16. 유기 생성물을 생산하는 방법으로서,
구현예 2 또는 임의의 이전 구현예의 생물제조 시스템을 제공하는 단계;
제1 생물반응기 배양 용기에서 소정 양의 적어도 하나의 유기 기질을 생산하기에 충분한 조건하에, 제1 생물반응기 배양 용기에서 제1 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및
제2 생물반응기 배양 용기에서 소정 양의 적어도 하나의 유기 생성물을 생산하기에 충분한 조건하에, 제2 생물반응기 배양 용기에서 제2 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 17. 구현예 16 또는 임의의 이전 구현예에 있어서,
휘발성 가스 유출구를 통해 유기 기질 배양액으로부터 소정 양의 적어도 하나의 휘발성 가스를 제거하는 단계;
유기 생성물 유출구를 통해 유기 생성물 배양액으로부터 소정 양의 적어도 하나의 유기 생성물을 제거하는 단계;
탄소 공급원이 이산화탄소를 포함하는 경우, 탄소 공급원 유입구를 통해 소정 양의 이산화탄소를 이산화탄소 공급원으로부터 유기 기질 배양액으로 공급하는 단계;
유기 기질 배양액 및 유기 생성물 배양액의 pH 수준을 약 5.0 내지 약 8.5로 유지하는 단계;
유기 기질 배양액 및 유기 생성물 배양액을 약 25℃ 내지 약 70℃의 온도에서 유지하는 단계;
제1 생물반응기 배양 용기 또는 제2 생물반응기 배양 용기가 바이오매스 수집 포트를 포함하는 경우, 바이오매스 수집 포트를 통해 제1 재조합 미생물 또는 제2 재조합 미생물에 의해 생산된 소정 양의 바이오매스를 수집하는 단계; 또는
제2 생물반응기 배양 용기의 총 내부 부피를 기준으로 약 10 부피% 내지 약 1 부피% 이하의 제2 생물반응기 배양 용기 내의 휘발성 가스의 양을 유지하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
구현예 18. 구현예 16 또는 임의의 이전 구현예에 있어서, 비-천연 유기 기질 형성 재조합 효소 발현 뉴클레오타이드 서열 또는 비-천연 유기 생성물 발현 뉴클레오타이드 서열이 미생물 발현 벡터에 삽입되며, 적어도 하나의 미생물 발현 벡터는 적어도 하나의 미생물 발현 프로모터를 포함하며,
유기 기질 배양액 또는 유기 생성물 배양액에 적어도 하나의 프로모터 유도 인자를 첨가함으로써, 생산된 적어도 하나의 유기 생성물의 양 또는 적어도 하나의 유기 기질의 양을 제어하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
구현예 19. 구현예 18 또는 임의의 이전 구현예에 있어서, 적어도 하나의 미생물 발현 프로모터가 광 민감성 프로모터, 화학물질 민감성 프로모터, 온도 민감성 프로모터, Lac 프로모터, T7 프로모터, CspA 프로모터, 람다 PL 프로모터, 람다 CL 프로모터, 연속적으로 생산하는 프로모터, psbA 프로모터 또는 이들의 조합을 포함하며; 적어도 하나의 프로모터 유도 인자가 락토스, 자일로스, IPTG, 저온 쇼크, 열 쇼크 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
구현예 20. 구현예 16 또는 임의의 이전 구현예에 있어서,
적어도 하나의 유기 기질 배양 불순물이 적어도 하나의 휘발성 가스를 포함하는 경우, 휘발성 가스 유출구를 통해 적어도 하나의 휘발성 가스를 제거하는 단계; 또는
약 1억 파운드/년 내지 약 10억 파운드/년 이상의 속도로 생산된 적어도 하나의 유기 생성물의 양을 회수하는 단계를 추가로 포함하거나;
생산된 적어도 하나의 유기 생성물의 양은 약 1 mol% 이하의 휘발성 가스의 양을 함유하는 방법.
구현예 21. 유기 생성물을 생산하는 방법으로서,
구현예 1의 생물복원 시스템(bioremediation system)을 제공하는 단계로서, 유기 기질 배양액 및 유기 생성물 배양액은 하나의 생물반응기 배양 용기에서 조합되며, 비-천연 유기 기질 형성 재조합 효소 발현 뉴클레오타이드 서열은 제1 미생물 발현 벡터에 삽입되며, 비-천연 유기 생성물 형성 효소 발현 뉴클레오타이드 서열은 제2 미생물 발현 벡터에 삽입되며, 제1 미생물 발현 벡터 및 제2 미생물 발현 벡터는 각각 적어도 하나의 미생물 발현 프로모터를 포함하는 단계,
탄소 공급원 유입구에 연결된 탄소 공급원을 제공하는 단계;
제1 생물반응기 배양 용기에서 제1 생물반응기 배양 용기에서 소정 양의 적어도 하나의 유기 기질을 생산하기에 충분한 조건하에, 제1 생물반응기 배양 용기에서 제1 재조합 미생물을 배양하는 단계;
제1 시점에 적어도 하나의 프로모터 유도 인자를 유기 기질 배양액에 첨가함으로써, 적어도 하나의 유기 기질의 양을 생산하는 단계;
제2 생물반응기 배양 용기에서 소정 양의 적어도 하나의 유기 생성물을 생산하기에 충분한 조건하에, 제2 생물반응기 배양 용기에서 제2 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및
제2 시점에 적어도 하나의 프로모터 유도 인자를 유기 생성물 배양액에 첨가함으로써, 소정 양의 적어도 하나의 유기 생성물을 생산하는 단계를 포함하는 방법.
구현예 22. 구현예 21 또는 임의의 이전 구현예에 있어서, 제2 시점 전에, 제2 생물반응기 배양 용기의 총 내부 부피를 기준으로, 제2 생물반응기 배양 용기에서 산소의 양을 약 10 부피% 내지 약 1 부피% 이하로 감소시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
실시예
실시예 1. 시아노박테리아 로의 알파-케토글루타레이트 합성 효소의 클로닝
알파-케토글루타레이트(aKG)는 이소시트레이트 데하이드로게나제(ICD)에 의한 이소시트레이트의 산화성 탈카복실화에 의해, 또는 글루타메이트 데하이드로게나제(GDH)에 의한 글루타메이트의 산화성 탈아민화에 의해 생산된다. 시아노박테리아에서 클로닝 및 aKG 생산을 위한 표적 효소는 ICD 효소: 1.1.1.42, P. 플루오레센스 ICD의 코딩 서열(서열번호 1, 서열번호 2), ICD 효소: 1.1.1.42, 시네코코커스 엘롱가투스 PCC794의 코딩 서열(서열번호 3, 서열번호 4), 및 GDH 효소: 1.4.1.2, P. 플루오레센스의 코딩 서열(서열번호 5, 서열번호 6)을 포함한다.
ICD 및 GDH 유전자는 pSyn6 플라스미드 작제물(pSyn6_ICD 및 pSyn6_GDH)에 클로닝된 gBlock으로서 합성된다. pSyn6 플라스미드로의 클로닝을 위해, S. 엘롱가투스 ICD 코딩 서열은 N-말단 HindIII 및 C-말단 BamHI 인식 부위(서열번호 4)에 인접해 있다. 플라스미드 작제물을 사용하여, ICD 및 GDH 유전자는 변형되지 않은 S. 엘롱가투스 또는 S. 엘롱가투스 Δglgc 돌연변이체 균주에 클로닝된다(실시예 2 참조). 표적 유전자의 1 내지 3개의 복사체가 형질전환될 것이다. ICD 및 GCH 유전자의 클로닝은 PCR 및 시퀀싱에 의해 확인된다. aKG 합성 및 정량화는 SDS PAGE, 웨스턴 블롯, 및 에틸렌 생산 검정에 의해 평가된다.
aKG 생산의 규모 확대에 따라 배양 성장 속도 및 배양 조건이 평가된다.
실시예 2. 알파-케토글루타레이트의 분비를 위한 시아노박테리아 조작
시아노박테리아의 글리코겐 돌연변이체 균주의 생성은 더 높은 농도의 aKG와 같은 케토산을 생산하기 위해 박테리아의 경로를 변경한다.
글리코겐 돌연변이체 시아노박테리아는 glgc 유전자의 돌연변이체(Δglgc)를 통해 글리코겐 결핍 균주를 생성함으로써 발생된다. 암피실린 내성(AmpR) 유전자는 gBlocks로서 합성되고, 플라스미드 작제물에 혼입된다. 플라스미드 작제물은 야생형 시아노박테리아(시네코코커스, 시네코코커스 엘룽가투스 2973, 시네코코커스 엘룽가투스 2434)로 형질전환된다. 야생형 glgc 유전자의 일부는 돌연변이체 균주를 생성하기 위해 AmpR 유전자로 대체된다. Δglgc 돌연변이체 균주는 AmpR 함유 배지에서의 성장, 이후 PCR 및 시퀀싱에 의해 확인된다.
실시예 3. 이산화탄소로부터 수크로스 생산
시아노박테리아(시네코코커스 엘롱가투스, 시네코시스티스)는 에틸렌 다운스트림을 생산하는 미생물(E. 콜라이)의 성장을 위한 기질로서 수크로스를 생산하도록 조작된다.
시네코코커스 엘롱가투스 PCC 7942의 조작은 하나의 유전자(cscB)의 활성화 및 하나의 유전자(GlgC)의 결실을 포함한다. 15 내지 31.5 파운드/갤런-생물반응기/개월의 조작된 박테리아에서 생성된 수크로스의 수율.
수크로스의 대규모 생산은 1-ha 광생물반응기(640,000 리터), 2% 이산화탄소 공급, 300일의 성장 시즌, 1일 8시간의 광(65 uE m2s-1), 및 최대 55 메트릭 톤 수크로스/년의 수율을 이용하여 수행된다.
실시예 4. E. 콜라이로의 에틸렌 형성 효소의 클로닝
E. 콜라이는 유전자 변형을 위한 광범위한 툴의 이용 가능성, 및 이의 빠른 성장 속도로 인한 에틸렌 생산을 위해 선택된다. 현재 플라스미드는 에틸렌 형성 효소를 매우 높은 수율로 생산할 수 있게 한다.
초기에 슈도모나스 사바스타노이 pv. 파세올리콜라 EFE 단백질로부터 적응된 EFE의 폴리뉴클레오타이드 코딩 서열은 선택되며, 유전자는 E. 콜라이(GenBank: KPB44727.1, 서열번호 6)에서 발현을 위해 적응되었다. 합성 DNA 작제물 인코딩 EFE 효소는 합성되고 pET-30a(+) 벡터 플라스미드로 클로닝된다. 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 C-말단 단부에 선택적 His 태그 다음에 정지 코돈 및 HindIII 부위를 함유하는, E. 콜라이(서열번호 5)에서 발현을 위해 적응된 코돈이다. NdeI 부위는 5-프라임 단부에서 클로닝을 위해 사용되며, 여기서, NdeI 부위는 ATG 시작 코돈을 함유한다. E. 콜라이 BL21(DE3) 적격 세포는 재조합 플라스미드로 형질전환된다.
암피실린 카세트는 LacI 유전자의 존재하에 IPTG 유도성 프로모터(pTrc)에 의해 활성화되며; LacI 유전자는 LacIq 프로모터(서열번호 13)에 의해 조절된다.
E. 콜라이 균주 BL21(DE3): 배가 시간(20분), 교반되지 않는 한 세포는 생물반응기의 바닥으로 가라앉는다.
● 이론적 최대 세포 밀도: 정상 조건에서 50 g 건조 세포 중량/L 또는 1×1013개 생존 박테리아/L: 1×1010개의 생존 박테리아/L. 리치 배지(rich media)의 사용은 더 높은 세포 밀도를 상승시킨다.
● 배양물 pH: 7.5 내지 8.5
● 플라스미드: 낮은(2 내지 4), 중간(15 내지 60) 및 높은(50 내지 500) 복사체 수
● 단백질 생산을 위한 프로모터/유도 인자
● Lac 프로모터/락토스: 글루코스의 존재는 락토스와 경쟁할 것이고 단백질 생산에 악영향을 미침
● T7 프로모터/IPTG: 표적 단백질은 총 세포 단백질의 50%를 나타냄
● CspA 프로모터/저온 쇼크: 37℃내지 15℃에서 온도 감소에 따른 단백질 발현
● λpL-λcI 프로모터/열 충격: 37℃ 내지 42℃에서 온도 증가에 따른 단백질 발현
● psbA 프로모터: 유도 인자가 필요하지 않음
● E. 콜라이로부터의 에틸렌 생산의 현재 수율: 188 nmol 에틸렌/OD600/mL
EFE(약 44.5 kDa)_BL2l(DE3)의 파일럿 발현을 EFE 없음, 낮은 복사체 수 작제물(pRK290-PpsbA-efe-Flag), 중간 복사체 수 작제물(pBBR1-PpsbA-efe-Flag), 또는 높은 복사체 수 작제물(pUC-PpsbA-efe-Flag)로 수행하였다. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅을 사용하여 Luria 브로쓰, 0.2% 글루코스를 갖는 M9 배지, 또는 0.2%의 글루코스를 갖는 MOPS 배지에서 성장된 배양물에서 다양한 복사체 수 작제물(GenScript USA, Inc., Piscataway, NJ)에서 EFE 단백질 발현을 모니터링하였다. 블롯을 위해, 알파-GroEL 발현을 양성 대조군으로 측정하였다. 다양한 배양 배지에서 성장된 배양물에서 대조군, 낮은 복사체, 중간 복사체 및 높은 복사체 작제물에 의해 생산된 EFE 단백질의 수준은 도 3a에 도시되어 있다.
pUC-PpsbA-efe-Flag MB1655 작제물로부터의 에틸렌의 수율은 보충물이 없거나 배양 배지에 첨가된 다양한 성장 보충물을 갖는 배양 배지에서의 성장에서 평가하였다(도 3b).
실시예 5: 재조합 미생물에서 컨쥬게이션된 알켄, 폴리엔 및 알칸의 합성 생산
컨쥬게이션된 알켄(디엔 및 폴리엔 포함) 및 알칸은 폴리머 산업 및 생명공학에서 여러 적용을 갖는 중요한 상품 제품이다. 합성 생물학에 의한 컨쥬게이션된 알켄 및 알칸의 재생 가능한 생산은 석유-기반 화학물질의 생산에 대한 대안적인 접근법일 수 있다. 짧은 알칸 및 알켄은 휘발성 가스이다. 이러한 휘발성 가스의 예는 에텐, 에틸렌, 프로펜, 부텐, 메탄, 에탄, 프로판, 부탄 또는 이들의 조합을 포함한다.
알켄 및 알칸의 생산을 위한 자연 공정은 매우 느리다. 여기에서, 본 발명자들은 컨쥬게이션된 알켄 및 알칸의 생산을 위한 유전자 변형 접근법을 적용하였다. 이를 위해, 알켄 및 알칸의 생합성에 관여하는 중요한 효소 경로의 과발현을 수행하였다. 알켄 및 알칸의 생합성을 위한 5가지 효소 경로는 생물정보학 연구를 통해 정의되었다. 유리 지방산 또는 탄수화물(당)은 이러한 반응을 위한 공급원료로서 사용될 수 있다. 유리산 또는 이의 유도체를 알칸 또는 알켄으로 전환시키는 4가지의 효소 경로는 하기를 포함한다:
1- 지방 알데하이드의 탈카복실화, 2- 지방산의 탈카복실화, 3- 헤드 투 헤드 탄화수소 생합성, 4- 폴리케타이드 신타제(PKS) 경로.
이러한 경로들 중에서, 지방 알데하이드의 탈카복실화는 가장 높은 효율을 갖는다. 알데하이드 데카복실라제(AD)는 이러한 경로에서 중요한 역할을 한다. 알데하이드 데카복실라제는 지방족 알데하이드를 알칸 및/또는 알켄으로 전환시킨다. 다른 중요한 효소는 지방 아크릴 담체 단백질(ACP) 리덕타제(AAR) 또는 지방산 리덕타제(FAR)를 포함한다.
지방산의 탈카복실화(알켄/알칸의 생산을 위한)는 Ole T, UndA 및 UndB를 포함하는 3가지의 중요한 효소에 의해 조절된다. Ole ABCD 유전자는 헤드 투 헤드 탄화수소 생합성에 중요하다.
폴리케타이드(PKS) 경로의 중요한 효소는 3-B-케토-아실 신타제(KS), 아실-트랜스퍼라제(AT), 아실 담체 단백질(ACP), B-케토 리덕타제(KR), 데하이드라타제(DH), 에닐 리덕타제(ER)를 포함한다.
알칸 및 알켄을 생산하기 위해, 상기 언급된 유전자 경로를 모델링하였다. E. 콜라이를 숙주 미생물로 사용하였다. 발현 벡터로서 pUC19(높은 복사체 수)를 사용하고 IPTG-유도성 프로모터 하에서 유전자 작제물을 제조하였다. 각 유전자의 발현은 암피실린이 보충된 아가 배지에서의 콜로니 성장, IPTG 및 X-gal, PCR 및 겔 전기영동에 의해 확인된다. 가스 크로마토그래피(GC) 및 HPLC는 각각 가스 상 및 액체 상의 생성물의 검출에 사용된다. psbA 프로모터는 연속 발현 프로모터이다. E. 콜라이 BL21(DE3), DH5알파, 또는 MG1655 세포주가 숙주로서 사용된다.
세포 배양 적응을 LB 및 MOPS를 포함하는 상이한 배지에서 E. 콜라이의 배양에 의해 수행하였다. MOPS 배지의 조성물은 하기 목록으로서 정의된다:
배지 MOPS
글루코스 4 g/L
IPTG 0.5 mM
아르기닌 3 mM
AKG 2 mM
유도 초기에 유도됨
하기에 알칸 및 알켄의 생산에 관여하는 유전자의 목록 및 이들의 절제 번호를 참조한다.
알데하이드 데카복실라제(AD), 지방 아크릴 담체 단백질(ACP) 리덕타제(AAR) 또는 지방산 리덕타제(FAR), 사카로마이세스 세레비시아에 S288C 사작용성 지방산 신타제 서브유닛 FAS1(FAS1), 부분 mRNA NCBI 참조 서열: NM_001179748.1(서열번호 14)
Ole T, UndA 및 UndB.
Ole ABCD 유전자
3-B-케토-아실 신타제(KS), 아실-트랜스퍼라제(AT), 아라비돕시스 탈리아나 HXXXD-타입 아실-트랜스퍼라제 계열 단백질(CER2), mRNA NCBI 참조 서열: NM_1 18584.3(서열번호 15)
아실 담체 단백질(ACP), 렙토모나스 피로코리스(Leptomonas pyrrhocoris) 추정 미토콘드리아 아실 담체 단백질, 추정(ACP) mRNA NCBI 참조 서열: XM_015809471.1(서열번호 16)
B-케토 리덕타제(KR), 데하이드라타제(DH), 에닐 리덕타제(ER).
베타-하이드록시아실-아실 담체 단백질 데하이드라타제/이소머라제[Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655] NCBI 참조 서열: NP_415474.1(서열번호 17)
실시예 6. 실험실 규모 실험 절차
1. 재조합 알켄, 폴리엔, 알칸, 폴리올, 알코올 및 유기산 생합성 경로의 중요한 중간체를 인코딩하는 맞춤형-설계된 DNA 작제물이 발생될 것이다. 2. 신중하게 선택된 광합성 제1 재조합 미생물은 이후 알파 케토글루타레이트, 수크로스, 글루코스, 프룩토스, 자일로스, 갈락토스, 글리세롤, 지방산 등를 포함하는 유기 기질의 클로닝 및 유전자 발현을 위해 확장될 것이다. 3. 이후, 신중하게 선택된 제2 재조합 미생물은 유기 생성물 형성 효소의 클로닝 및 유전자 발현을 위해 확장될 것이다. 4. 이후, 유기 생성물의 연속 생산을 위해 미생물의 유전 및 대사 공학이 수행될 것이다. 5. 이후, 생물공학 미생물은 광생물반응기 및 생물반응기 시스템에서 선택되고 확장될 것이다. 6. 생물반응기 배양 조건(CO2 농도, 광 노출 시간 및 파장, 온도, 및 pH 포함)이 조정될 것이다. 7. 샘플은 수집되고 HPLC에 의해 분석하여 유기 생성물 합성을 측정할 것이다. 8. 유전자 조작된 미생물에서의 유기 생성물 생산이 적응될 것이다. 9. 유기 생성물 생산 공정은 시험관 규모에서 1 리터, 10 리터 및 100 리터 생물반응기로 확장될 것이다. 스케일 업은 각 단계에서 1 내지 10의 비율로 수행될 것이다.
부록
서열번호 1-
MGYKKIQVPAVGDKITVNADHSLNVPDNPIIPFIEGDGIGVDVSPVMIKVVDAAVEKAYGGKRKISWMEVYAGEKATQVYDQDTWLPQETLDAVKDYVVSIKGPLTTPVGGGIRSLNVALRQQLDLYVCLRPVVWFEGVPSPVKKPGDVDMVIFRENSEDIYAGIEWKAGSPEATKVIKFLKEEMGVTKIRFDQDCGIGIKPVSKEGTKRLVRKALQYVVDNDRKSLTIVHKGNIMKFTEGAFKDWGYEVAKEEFGAELLDGGPWMKFKNPKTGREVVVKDAIADAMLQQILLRPAEYDVIATLNLNGDYLSDALAAEVGGIGIAPGANLSDTVAMFEATHGTAPKYAGKDQVNPGSVILSAEMMLRHLGWTEAADLIIKGTNGAIKAKTVTYDFERLMEGATLVSSSGFGEALIKHM
서열번호 2-
ATGGGITACAAGAAGATTCAGGTTCCAGCCGTCGGCGACAAAATCACCGTCAACGCAGACCATTCTCTCAATGTCCCTGATAACCCGATCAITCCCTTCATCGAAGGTGACGGCATTGGCGTCGACGTCAGCCCTGTGATGATCAAAGTGGTTGATGCTGCCGTAGAGAAAGCCTACGGGGGTAAGCGCAAGAITTCCTGGATGGAGGITTATGCTGGCGAAAAAGCAACTCAGGTCTATGACCAGGACACCTGGCTGCCCCAGGAAACCCTGGACGCGGTCAAGGATTACGTGGTCTCCATCAAAGGCCCGCTGACCACTCCGGTCGGTGGCGGCATCCGTTCCCTCAACGTCGCCCTGCGCCAACAGCTCGATCTCTATGTCTGCCTTCGCCCTGTGGTGTGGTTCGAAGGTGTGCCGAGCCCGGTGAAAAAGCCTGGCGACGTCGACATGGTGATCTTCCGCGAGAACTCCGAAGACATTTATGCCGGTATCGAATGGAAAGCCGGCTCCCCTGAGGCCACCAAGGTCATCAAAITCCTGAAAGAAGAAATGGGCGTCACCAAGATCCGTTTCGACCAGGATTGCGGCATCGGCATCAAGCCGGTITCCAAAGAAGGCACCAAGCGTCTGGTGCGCAAGGCGCTGCAATACGTGGTGGACAACGACCGCAAGTCGCTGACCATCGTGCACAAGGGCAACATCATGAAATTCACCGAAGGTGCCTTCAAGGACTGGGGCTACGAGGTGGCGAAGGAAGAATTCGGCGCCGAGCTGCTCGATGGCGGCCCATGGATGAAATTCAAGAACCCGAAAACCGGCCGCGAAGTCGTCGTCAAGGACGCCATCGCCGACGCCATGCTCCAGCAGATCCTGCTGCGTCCGGCCGAATACGATGTGATCGCCACCCTCAACCTCAACGGTGACTACCTGTCCGACGCCCTGGCGGCGGAAGTGGGCGGTATCGGTATCGCGCCGGGTGCCAACCTGTCCGACACCGTAGCCATGITCGAGGCGACCCACGGTACTGCGCCGAAATATGCCGGCAAGGACCAGGTCAACCCGGGITCGGTGATITTGTCGGCGGAAATGATGCTGCGCCACCTGGGCTGGACCGAGGCGGCCGACCTGATCATCAAGGGCACCAATGGCGCCATCAAGGCCAAGACCGTGACCTACGACTTCGAACGTCTGATGGAAGGCGCCACACTGGTGTCITCTTCGGGCTTCGGTGAAGCGCTGATCAAGCACATGTAA
서열번호 3-
MYEKIQPPSEGSKIRFEAGKPIVPDNPIIPFIRGDGTGVDIWPATERVLDAAVAKAYGGQRKITWFKVYAGDEACDLYGTYQYLPEDTLTAIREYGVAIKGPLTTPIGGGIRSLNVALRQIFDLYACVRPCRYYTGTPSPHRTPEQLDVVVYRENTEDIYLGIEWKQGDPTGDRLIKLLNEDFIPNSPSLGKKQIRLDSGIGIKPISKTGSQRLIRRAIEHALRLEGRKRHVTLVHKGNIMKFTEGAFRDWGYELATTEFRTDCVTERESWILANQESKPDLSLEDNARLIEPGYDAMTPEKQAAVVAEVKAVLDSIGATHGNGQWKSKVLVDDRIADSIFQQIQTRPGEYSVLATMNLNGDYISDAAAAVVGGLGMAPGANIGDEAAIFEATHGTAPKHAGLDRINPGSVILSGVMMLEYLGWQEAADLITKGISQAIANREVTYDLARLMEPAVDQPLKCSEFAEAIVKHFDD
서열번호 4-
AGGGCAAGCTTATGTACGAGAAGATTCAACCCCCTAGCGAAGGCAGCAAAATICGCTITGAAGCCGGCAAGCCGATCGTTCCCGACAACCCGATCATTCCCTTCATICGTGGTGACGGCACTGGCGTTGATATCTGGCCCGCAACTGAGCGCGTICTCGATGCCGCTGTCGCTAAAGCCTATGGCGGTCAGCGCAAAATCACTTGGTTCAAAGTCTACGCGGGTGATGAAGCCTGCGACCTCTACGGCACCTACCAATATCTGCCTGAAGATACGCTGACAGCGATCCGCGAGTACGGCGTGGCAATCAAAGGCCCGCTGACGACGCCGATCGGTGGTGGCATTCGATCGCTGAACGTGGCGCTACGGCAAATCTTCGATCTCTATGCCTGCGTCCGCCCCTGTCGCTACTACACCGGCACACCCTCGCCCCACCGCACGCCCGAACAACTCGATGTGGTGGTCTACCGCGAAAACACCGAGGATATCTACCTCGGCATCGAATGGAAGCAAGGTGATCCCACCGGCGATCGCCTGATCAAGCTGCTGAACGAGGACTICATTCCCAACAGCCCCAGCTTGGGTAAAAAGCAAATCCGTTTGGATTCCGGCATTGGTATTAAGCCGATCAGTAAAACGGGTAGCCAGCGTCTGATTCGTCGTGCGATCGAGCATGCCCTACGCCTCGAAGGCCGCAAGCGACATGTCACCCTTGTCCACAAGGGCAACATCATGAAGTICACGGAAGGTGCTTICCGGGACTGGGGCTATGAACTGGCCACGACTGAGTTCCGAACCGACTGTGTGACTGAACGGGAGAGCTGGATTCTIGCCAACCAAGAAAGCAAGCCGGATCTCAGCTTGGAAGACAATGCGCGGCTCATCGAACCTGGCTACGACGCGATGACGCCCGAAAAGCAGGCAGCAGTGGTGGCTGAAGTGAAAGCTGTGCTCGACAGCATCGGCGCCACCCACGGCAACGGTCAGTGGAAGTCTAAGGTGCTGGTIGACGATCGCATTGCTGACAGCATCTTCCAGCAGATTCAAACCCGCCCGGGTGAATACTCGGTGCTGGCGACGATGAACCTCAATGGCGACTACATCTCTGATGCAGCGGCGGCGGTGGTCGGTGGCCTGGGCATGGCCCCCGGTGCCAACATTGGCGACGAAGCGGCGATCTTIGAAGCGACCCACGGCACAGCGCCCAAGCACGCTGGCCTCGATCGCATTAACCCCGGCTCGGTCATCCTCTCCGGCGTGATGATGCTGGAGTACCTAGGCTGGCAAGAGGCTGCTGACTIGATCACCAAGGGCATCAGCCAAGCGATCGCTAACCGTGAGGTCACCTACGATCTGGCTCGGTIGATGGAACCGGCGGTTGATCAACCACTCAAGTGCTCGGAATTTGCCGAAGCCATCGTCAAGCATITCGACGATIAGGGATCCAGCGC
서열번호 5-
MAFFTAASKADFQHQLQAALAQHISEQALPQVALFAEQFFGIISLDELTQRRLSDLAGCTLSAWRLLERFDHAQPQVRVYNPDYERHGWQSTHTAVEVLHHDLPFLVDSVRTELNRRGYSIHTLQTIVLSVRRGSKGELLEILPKGTTGEGVLHESLMYLEIDRCANAAELNVLSKELEQVLGEVRVAVSDFEPMKAKVQEILTKLDNSAFAVDADEKNEIKSFLEWLVGNHFTFLGYEEFTVVDQADGGHIEYDQNSFLGLTKMLRTGL1NEDRHIEDYAVKYLREPTLLSFAKAAHPSRVHRPAYPDYVSIREIDADGKVIKEHRFMGLYTSSVYGESVRVIPFIRRKVEEIERRSGFQAKAHLGKELAQVLEVLPRDDLFQTPVDELFSTVMSIVQIQERNKIRVFLRKDPYGRFCYCLAYVPRDIYSTEVRQKIQQVLMERLKASDCEFWTFFSESVLARVQLILRVDPKNRIDIDPLQLENEVIQACRSWQDDYAALTVETFGEANGTNVLADFPKGFPAGYRERFAAHSAVVDMQHLLNLSEKKPLAMSFYQPLASGPRELHCKLYHADTPLALSDVLPILENLGLRVLGEFPYRLRH1NGREFWIHDFAFTAAEGLDLDIQQLNDTLQDAFVHIVRGDAENDAFNRLVLTAGLPWRDVALLRAYARYLKQIRLGFDLGYIASTLNNHTDIARELTRLFKTRFYLARKLGSEDLDDKQQRLEQAILTALDDVQVLNEDRILRRYLDLIKATLRTNFYQTDANGQNKSYFSFKFNPHLIPELPKPVPKFEIFVYSPRVEGVHLRFGNVARGGLRWSDREEDFRTEVLGLVKAQQVKNSVIVPVGAKGGFLPRRLPLGGSRDEIAAEGIACYRIFISGLLDITDNLKDGKLVPPANVVRHDDDDPYLVVAADKGTATFSDIANGIAIDYGFWLGDAFASGGSAGYDHKKMGITAKGAWVGVQRHFRERGINVQEDSITVVGVGDMAGDVFGNGLLMSDKLQLVAAFNHLHIFIDPNPNPATSFAERQRMFDLPRSAWSDYDTSIMSEGGGIFSRSAKSIAISPQMKERFDIQADKLTPTELLNALLKAPVDLLWNGGIGTYVKASTESHADVGDKANDALRVNGNELRCKVVGEGGNLGMTQLGRVEFGLNGGGSNTDFIDNAGGVDCSDHEVNIKILLNEVVQAGDMTDKQRNQLLASMTDEVGGLVLGNNYKQTQALSLAARRAYARIAEYKRLMSDLEGRGKLDRAIEFLPTEEQLAERVAEGHGLTRPELSVLISYSKIDLKEQLLGSLVPDDDYLTRDMETAFPPTLVSKFSEAMRRHRLKREIVSTQIANDLVNHMGITFVQRLKESTGMTPANVAGAYVIVRDIFHLPHWFRQIEALDYQVSADVQLELMDELMRLGRRATRWFLRARRNEQNAARDVAHFGPHLKELGLKLDELLSGEIRENWQERYQAYVAAGVPELLARMVAGTTHLYTLLPIIEAADVTGQDPAEVAKAYFAVGSALDITWYISQISALPVENNWQALAREAFRDDVDWQQRAITIAVLQAGGGDSDVETRLALWMKQNDAMIERWRAMLVEIRAASGTDYAMYAVANRELNDVALSGQAVVPAAATAELELA
서열번호 6-
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서열번호 7-
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서열번호 8-
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서열번호 9-
MYKLVQTIVNSDEKNVLGDFILELGKDHKRYFLRNEILQAFADYCHQFPKPAYFYHSSSLGTFIQYTHEIILDGENTWFVVRPKIASQEVWLLSADLTKFELMTPKALLDVSDRLVKRYQPHILEIDLHPFYSAAPRIDDSRNIGQGLTVLNHYFCNQALTDPEYWIDALFQSLKRLEYNGIKLLISNHIHSGLQLTKQIKLALEFVSHLSPQTPYIKFKFHLQELGLEPGWGNNAARVRETLELLERLMDNPEPAILETFVSRICAVFRVVLISIHGWVAQEDVLGRDETLGQVIYVLEQARSLENKMRAEIKLAGLDTLGIKPHIIILTRLIPNCEGTFCNLPLEKVDGTENAWILRVPFAESRPEITNNWISKFEIWPYLEKFALDAEAELLKQFQGKPNLIIGNYSDGNLVAFILSRKMKVTQCNIAHSLEKPKYLFSNLYWQDLEAQYHFSAQFTADLISMNAADFIITSSYQEIVGTPDTMGQYESYKCFTMPNLYHVIDGIDLFSPKFNVVLPGVSENIFFPYNQTTNRESHRRQHIQDLIFHQEHPEILGKLDHPHKKPIFSVSPITSIKNLTGLVECFGKSEELQKHSNLILLTSKLHPDLGTNSEEIQEIAKIHAIIDQYHLHHKIRWLGMRLPLRDIAETYRVIADFQGIYIHFALYESFSRSILEAMISGLPTFTTQFGGSLEIIENHDQGFNLNPTDLAGTAKTIINFLEKCENYPEHWLENSQWMIERIRHKYNWNSHTNQLLLLTKMFSFWNFIYPEDNEARDRYMESLFHLLYKPIADHILSEHLSKIRNHN
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서열번호 11:­
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서열번호 12: -
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서열번호 13:-
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gagcctgtac atggacaaag aggaaaccag catgaccaac 120 ctgcagacct ttgaactgcc gaccgaagtg accggttgcg cggcggacat cagcctgggt 180 cgtgcgctga ttcaggcgtg gcaaaaggat ggtatcttcc agattaaaac cgacagcgag 240 caggatcgta agacccaaga agcgatggcg gcgagcaagc aattttgcaa agagccgctg 300 accttcaaaa gcagctgcgt tagcgacctg acctacagcg gttatgtggc gagcggcgag 360 gaagttaccg cgggcaagcc ggatttcccg gaaattttta ccgtgtgcaa ggacctgagc 420 gtgggcgatc agcgtgttaa agcgggttgg ccgtgccatg gtccggttcc gtggccgaac 480 aacacctatc aaaagagcat gaaaaccttt atggaggaac tgggtctggc gggcgagcgt 540 ctgctgaaac tgaccgcgct gggttttgaa ctgccgatca acaccttcac cgacctgacc 600 cgtgatggct ggcaccacat gcgtgtgctg cgtttcccgc cgcagaccag caccctgagc 660 cgtggtattg gtgcgcacac cgactacggt ctgctggtga ttgcggcgca agacgatgtt 720 ggtggcctgt atatccgtcc gccggtggag ggcgaaaagc gtaaccgtaa ctggctgccg 780 ggcgagagca gcgcgggcat gtttgagcac gacgaaccgt ggaccttcgt taccccgacc 840 ccgggtgtgt ggaccgtttt tccgggcgat attctgcagt tcatgaccgg tggccaactg 900 ctgagcaccc cgcacaaggt taaactgaac acccgtgaac gtttcgcgtg cgcgtacttt 960 cacgagccga acttcgaagc gagcgcgtat ccgctgttcg agccgagcgc gaacgaacgt 1020 atccactacg gcgagcactt caccaacatg tttatgcgtt gctatccgga tcgtatcacc 1080 acccaacgta ttaacaaaga aaaccgtctg gcgcacctgg aagacctgaa gaaatacagc 1140 gacacccgtg cgaccggcag c 1161 <210> 9 <211> 808 <212> PRT <213> Anabaena sp. <400> 9 Met Tyr Lys Leu Val Gln Thr Ile Val Asn Ser Asp Glu Lys Asn Val 1 5 10 15 Leu Gly Asp Phe Ile Leu Glu Leu Gly Lys Asp His Lys Arg Tyr Phe 20 25 30 Leu Arg Asn Glu Ile Leu Gln Ala Phe Ala Asp Tyr Cys His Gln Phe 35 40 45 Pro Lys Pro Ala Tyr Phe Tyr His Ser Ser Ser Leu Gly Thr Phe Ile 50 55 60 Gln Tyr Thr His Glu Ile Ile Leu Asp Gly Glu Asn Thr Trp Phe Val 65 70 75 80 Val Arg Pro Lys Ile Ala Ser Gln Glu Val Trp Leu Leu Ser Ala Asp 85 90 95 Leu Thr Lys Phe Glu Leu Met Thr Pro Lys Ala Leu Leu Asp Val Ser 100 105 110 Asp Arg Leu Val Lys Arg Tyr Gln Pro His Ile Leu Glu Ile Asp Leu 115 120 125 His Pro Phe Tyr Ser Ala Ala Pro Arg Ile Asp Asp Ser Arg Asn Ile 130 135 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caccatatat aaaatttaaa 660 tttcatcttc aagaactcgg tttagaacca ggttggggta ataatgcagc cagagtcaga 720 gaaaccttag aactgctgga aagactcatg gataatcccg aacctgcaat tttagaaacc 780 tttgtttctc gcatttgtgc agttttccgc gtcgtcctta tttccatcca tggttgggtt 840 gcacaagaag atgttttagg cagagatgaa acattaggac aagttattta tgttttagaa 900 caagcccgca gtttagaaaa taaaatgcgg gcagaaatta aacttgcagg tttagataca 960 ttaggaatta aaccccatat cattatatta actcgactga ttcccaattg tgaaggcaca 1020 ttttgtaact taccattaga aaaagttgat ggtacagaaa atgcttggat tttgcgcgtt 1080 ccttttgcag aatctcgacc ggaaattacc aacaactgga tttctaaatt tgaaatttgg 1140 ccttatttag aaaaatttgc tcttgatgcc gaagcagaac ttttaaaaca attccaagga 1200 aagcccaatc taattattgg taactacagt gacgggaact tagttgcttt tattctctcc 1260 cgaaaaatga aagttaccca atgtaatatt gcccattccc tcgaaaaacc taaatatcta 1320 tttagtaact tatattggca agatttagaa gcacaatatc acttttctgc ccaatttacc 1380 gctgatttaa tcagtatgaa tgccgcagat tttattatca catcatccta tcaagaaatt 1440 gtaggtacac cagatacaat gggacaatat gaatcttata aatgtttcac catgcccaac 1500 ttatatcatg taattgatgg cattgattta tttagcccta aattcaatgt ggtattacca 1560 ggagtcagtg aaaatatatt ttttccctac aaccaaacaa caaatagaga atcccaccgt 1620 cgtcaacata tccaagacct aattttccat caagaacacc cagaaattct cggtaaatta 1680 gatcatcctc ataaaaaacc gatcttttcc gttagtccca ttacctcaat taaaaacctc 1740 acaggtttag ttgaatgttt cggtaaaagt gaagaattac aaaaacatag taacctaatt 1800 ttattaacca gtaaacttca tccagactta ggaacaaact ccgaagaaat tcaagaaata 1860 gcaaaaattc atgcgattat tgatcaatat catcttcacc ataaaatccg ctggttggga 1920 atgcgtcttc ctctccgcga tattgctgaa acctatcgtg taattgccga ttttcaaggg 1980 atttatattc actttgccct ttatgaatcc tttagcagaa gtattttaga agcaatgatt 2040 tctggattac caacttttac aactcaattt ggtggttcat tagaaattat tgaaaaccat 2100 gatcaaggat ttaacctcaa ccccacagac ttagcaggaa cagccaaaac aattatcaac 2160 ttcttagaaa aatgtgaaaa ttatccagaa cattggctag aaaattctca atggatgatt 2220 gaacgcattc gccataaata taactggaat tcccacacaa atcaactcct gttattaacg 2280 aaaatgttta gcttttggaa cttcatctat cccgaagata acgaagccag 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cctttgcgga tgcaattctc caatatctgg ctcagcaaaa gcgcaccccg 360 acttggattc aggcccacta tgctgatgct ggccaagtgg gatcactgct gagtcgctgg 420 ttgaatgtac cgctaatttt cacagggcat tctctggggc ggatcaagct aaaaaagctg 480 ttggagcaag actggccgct tgaggaaatt gaagcgcaat tcaatattca acagcgaatt 540 gatgcggagg agatgacgct cactcatgct gactggattg tcgccagcac tcagcaggaa 600 gtggaggagc aataccgcgt ttacgatcgc tacaacccag agcgcaagct tgtcattcca 660 ccgggtgtcg ataccgatcg cttcaggttt cagcccttgg gcgatcgcgg tgttgttctc 720 caacaggaac tgagccgctt tctgcgcgac ccagaaaaac ctcaaattct ctgcctctgt 780 cgccccgcac ctcgcaaaaa tgtaccggcg ctggtgcgag cctttggcga acatccttgg 840 ctgcgcaaaa aagccaacct tgtcttagta ctgggcagcc gccaagacat caaccagatg 900 gatcgcggca gtcggcaggt gttccaagag attttccatc tggtcgatcg ctacgacctc 960 tacggcagcg tcgcctatcc caaacagcat caggctgatg atgtgccgga gttctatcgc 1020 ctagcggctc attccggcgg ggtattcgtc aatccggcgc tgaccgaacc ttttggtttg 1080 acaattttgg aggcaggaag ctgcggcgtg ccggtggtgg caacccatga tggcggcccc 1140 caggaaattc tcaaacactg 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agttggcaat tactcaccgg aattggagcc actgcgcagc 2040 tacgagcgcg tctattttgc tgagggccac tatgctaatg gcattctgga agccttaaaa 2100 cactatcgct tttttgaggc gatcgcttaa 2130 <210> 13 <211> 4186 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 13 caattgccct aagacagttg tcgtctttcg aagtctagtt aacattaggg gcgattcttt 60 gtttccactg agtggaagca aacggtatca aggttgcagg cagactcaag gtctagattg 120 cttcacagct tgtgtggcta tatttattat cttcattatt gatggtagtt gtgggtggat 180 ttaagatgga aaagtaacag ataaatgtcg tctttaaggg cgatctagat cgtatcgttt 240 ttaattccta ggtcggcatt tattaatcaa cctcgataca atattttttt gtaaaaactt 300 ctagataaat gactcaagtc tcattgaaag tctggggtgt tgcctcccca gtcaattcaa 360 gattaccaag gcctcgcatc gcctcttcta ttttgtttga aggggaccta acgtgttgcg 420 ccaagctagt tctcgacaga gcatctcaag agcgcgttgc tcgcgggggg caaacagttg 480 gagatcagcc agctcttgca agacttgttg ggtgaggtgg ctggcaaagc taccggcata 540 gcgcagtaag agactgtagt agcgaaattg cggttggccg ttgcaatcgc ggtgaaaggc 600 agcaatttct gcttcgctga ggcagtagac aggggtattg accggcacga tcgcgcgagg 660 aatgccctgt tcgccgtagc gatcgccgcc ctctgtttcc gctaagctgc cgatcaaaac 720 cgtggagagc agcgtgcggg tttcattgat taaatcaggc gtgaatagtg ggtcgggccc 780 acttgaaaga cgcggcccgt tgttcagaaa gaggggatta aacaactgcg agttgtagac 840 cactccgatc gcccaatggc gatcgccttc caaacgaaca aagctgccaa atccatagct 900 ctcggcggct ggtggattgg agacatccat gtcgtcatcc acttggacaa cgtagtcaca 960 gtgcgagttg gatttgacaa ctttgccgag gcgcatggtg ctgccagtgt tacaaccaat 1020 taaccaattc tgacatatgg acaccatcga atggtgcaaa acctttcgcg gtatggcatg 1080 atagcgcccg gaagagagtc aattcagggt ggtgaatgtg aaaccagtaa cgttatacga 1140 tgtcgcagag tatgccggtg tctcttatca gaccgtttcc cgcgtggtga accaggccag 1200 ccacgtttct gcgaaaacgc gggaaaaagt ggaagcggcg atggcggagc tgaattacat 1260 tcccaaccgc gtggcacaac aactggcggg caaacagtcg ttgctgattg gcgttgccac 1320 ctccagtctg gccctgcacg cgccgtcgca aattgtcgcg gcgattaaat ctcgcgccga 1380 tcaactgggt gccagcgtgg tggtgtcgat ggtagaacga agcggcgtcg aagcctgtaa 1440 agcggcggtg cacaatcttc tcgcgcaacg cgtcagtggg ctgatcatta actatccgct 1500 ggatgaccag gatgccattg ctgtggaagc tgcctgcact aatgttccgg cgttatttct 1560 tgatgtctct gaccagacac ccatcaacag tattattttc tcccatgaag acggtacgcg 1620 actgggcgtg gagcatctgg tcgcattggg tcaccagcaa atcgcgctgt tagcgggccc 1680 attaagttct gtctcggcgc gtctgcgtct ggctggctgg cataaatatc tcactcgcaa 1740 tcaaattcag ccgatagcgg aacgggaagg cgactggagt gccatgtccg gttttcaaca 1800 aaccatgcaa atgctgaatg agggcatcgt tcccactgcg atgctggttg ccaacgatca 1860 gatggcgctg ggcgcaatgc gcgccattac cgagtccggg ctgcgcgttg gtgcggatat 1920 ctcggtagtg ggatacgacg ataccgaaga cagctcatgt tatatcccgc cgttaaccac 1980 catcaaacag gattttcgcc tgctggggca aaccagcgtg gaccgcttgc tgcaactctc 2040 tcagggccag gcggtgaagg gcaatcagct gttgcccgtt tcactggtga aaagaaaaac 2100 caccctggcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca 2160 gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga gctttgttga caattaatca 2220 tccggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa gaaggagatg agtattcaac 2280 atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc 2340 cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca 2400 tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc 2460 caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg 2520 ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt gagtactcac 2580 cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca 2640 taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg 2700 agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac 2760 cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg 2820 caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat 2880 taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg 2940 ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg 3000 cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc 3060 aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc 3120 attggtaatt gttcagaacg ctcggtcttg cacaccgggc gttttttctt tgtgagtcca 3180 ggtaccaatc aatctccccc aagtcaagcg gcgctgagac ccagtgtctg ccggtgagtc 3240 agtcttggca agcaaactgt gcctttgcga tttcttaccc tacgcagctc cgggatcgat 3300 cggaggtaac caaggctacg gacaatggcg cgggcaccag ctgttggtaa actgaggagc 3360 gatcgccgct tcagtccaaa ggctatgacg caaaaatccg ttgttattgc tccgtccatt 3420 ctgtcagcgg atttcagccg cttgggcgac gatgtccgcg ctgttgacca ggctggcgct 3480 gactggattc acgtcgatgt gatggatggt cgcttcgtcc ctaacatcac cattggaccg 3540 ctgatcgttg aagcgctgcg cccggtgacc caaaagccgt tggacgtcca cttgatgatc 3600 gtcgagccgg aaaaatatgt gccggatttc gcgaaagcag gggctgacat catctcggtc 3660 caagcagaag cttgccccca cctgcaccgc aacttggctc agatcaaaga cctcggcaag 3720 caagcaggcg tcgtcctcaa cccctctacc ccagtcgaaa ccctggaata cgtgctggag 3780 ttgtgcgacc tgattttgat catgagcgtc aaccctggct tcggtggtca gagtttcatc 3840 ccagctgtcc tgccgaaaat ccgtaagctg cgcgccatgt gcgatgagcg tggccttgat 3900 ccttggattg aagtcgatgg cggcttgaaa gccaataaca cttggcaggt gctggaagcc 3960 ggtgctaacg caattgtggc gggctcggca gtcttcaacg cgccggacta tgctgaagcg 4020 atcgcggcga ttcgcaacag caagcgtcct gaacttgtca ctgcttaggc ttctcgctca 4080 acgctcagtg gagcaatctg aatcttgcag cccttcagtg gatcagtctg ctgaggggtt 4140 ttgctttagg atgggcgatc gcgagtaggg acacggatcg ctggta 4186 <210> 14 <211> 6156 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 14 atggacgctt actctacccg tccgctgacc ctgtctcacg gttctctgga acacgttctg 60 ctggttccga ccgcttcttt cttcatcgct tctcagctgc aggaacagtt caacaaaatc 120 ctgccggaac cgaccgaagg tttcgctgct gacgacgaac cgaccacccc ggctgaactg 180 gttggtaaat tcctgggtta cgtttcttct ctggttgaac cgtctaaagt tggtcagttc 240 gaccaggttc tgaacctgtg cctgaccgaa ttcgaaaact gctacctgga aggtaacgac 300 atccacgctc tggctgctaa actgctgcag gaaaacgaca ccaccctggt taaaaccaaa 360 gaactgatca aaaactacat caccgctcgt atcatggcta aacgtccgtt cgacaaaaaa 420 tctaactctg ctctgttccg tgctgttggt gaaggtaacg ctcagctggt tgctatcttc 480 ggtggtcagg gtaacaccga cgactacttc gaagaactgc gtgacctgta ccagacctac 540 cacgttctgg ttggtgacct gatcaaattc tctgctgaaa ccctgtctga actgatccgt 600 accaccctgg acgctgaaaa agttttcacc cagggtctga acatcctgga atggctggaa 660 aacccgtcta acaccccgga caaagactac ctgctgtcta tcccgatctc ttgcccgctg 720 atcggtgtta tccagctggc tcactacgtt gttaccgcta aactgctggg tttcaccccg 780 ggtgaactgc gttcttacct gaaaggtgct accggtcact ctcagggtct ggttaccgct 840 gttgctatcg ctgaaaccga ctcttgggaa tctttcttcg tttctgttcg taaagctatc 900 accgttctgt tcttcatcgg tgttcgttgc tacgaagctt acccgaacac ctctctgccg 960 ccgtctatcc tggaagactc tctggaaaac aacgaaggtg ttccgtctcc gatgctgtct 1020 atctctaacc tgacccagga acaggttcag gactacgtta acaaaaccaa ctctcacctg 1080 ccggctggta aacaggttga aatctctctg gttaacggtg ctaaaaacct ggttgtttct 1140 ggtccgccgc agtctctgta cggtctgaac ctgaccctgc gtaaagctaa agctccgtct 1200 ggtctggacc agtctcgtat cccgttctct gaacgtaaac tgaaattctc taaccgtttc 1260 ctgccggttg cttctccgtt ccactctcac ctgctggttc cggcttctga cctgatcaac 1320 aaagacctgg ttaaaaacaa cgtttctttc aacgctaaag acatccagat cccggtttac 1380 gacaccttcg acggttctga cctgcgtgtt ctgtctggtt ctatctctga acgtatcgtt 1440 gactgcatca tccgtctgcc ggttaaatgg gaaaccacca cccagttcaa agctacccac 1500 atcctggact tcggtccggg tggtgcttct ggtctgggtg ttctgaccca ccgtaacaaa 1560 gacggtaccg gtgttcgtgt tatcgttgct ggtaccctgg acatcaaccc ggacgacgac 1620 tacggtttca aacaggaaat cttcgacgtt acctctaacg gtctgaaaaa aaacccgaac 1680 tggctggaag aataccaccc gaaactgatc aaaaacaaat ctggtaaaat cttcgttgaa 1740 accaaattct ctaaactgat cggtcgtccg ccgctgctgg ttccgggtat gaccccgtgc 1800 accgtttctc cggacttcgt tgctgctacc accaacgctg gttacaccat cgaactggct 1860 ggtggtggtt acttctctgc tgctggtatg accgctgcta tcgactctgt tgtttctcag 1920 atcgaaaaag gttctacctt cggtatcaac ctgatctacg ttaacccgtt catgctgcag 1980 tggggtatcc cgctgatcaa agaactgcgt tctaaaggtt acccgatcca gttcctgacc 2040 atcggtgctg gtgttccgtc tctggaagtt gcttctgaat acatcgaaac cctgggtctg 2100 aaatacctgg gtctgaaacc gggttctatc gacgctatct ctcaggttat caacatcgct 2160 aaagctcacc cgaacttccc gatcgctctg cagtggaccg gtggtcgtgg tggtggtcac 2220 cactctttcg aagacgctca caccccgatg ctgcagatgt actctaaaat ccgtcgtcac 2280 ccgaacatca tgctgatctt cggttctggt ttcggttctg ctgacgacac ctacccgtac 2340 ctgaccggtg aatggtctac caaattcgac tacccgccga tgccgttcga cggtttcctg 2400 ttcggttctc gtgttatgat cgctaaagaa gttaaaacct ctccggacgc taaaaaatgc 2460 atcgctgctt gcaccggtgt tccggacgac aaatgggaac agacctacaa aaaaccgacc 2520 ggtggtatcg ttaccgttcg ttctgaaatg ggtgaaccga tccacaaaat cgctacccgt 2580 ggtgttatgc tgtggaaaga attcgacgaa accatcttca acctgccgaa aaacaaactg 2640 gttccgaccc tggaagctaa acgtgactac atcatctctc gtctgaacgc tgacttccag 2700 aaaccgtggt tcgctaccgt taacggtcag gctcgtgacc tggctaccat gacctacgaa 2760 gaagttgcta aacgtctggt tgaactgatg ttcatccgtt ctaccaactc ttggttcgac 2820 gttacctggc gtaccttcac cggtgacttc ctgcgtcgtg ttgaagaacg tttcaccaaa 2880 tctaaaaccc tgtctctgat ccagtcttac tctctgctgg acaaaccgga cgaagctatc 2940 gaaaaagttt tcaacgctta cccggctgct cgtgaacagt tcctgaacgc tcaggacatc 3000 gaccacttcc tgtctatgtg ccagaacccg atgcagaaac cggttccgtt cgttccggtt 3060 ctggaccgtc gtttcgaaat cttcttcaaa aaagactctc tgtggcagtc tgaacacctg 3120 gaagctgttg ttgaccagga cgttcagcgt acctgcatcc tgcacggtcc ggttgctgct 3180 cagttcacca aagttatcga cgaaccgatc aaatctatca tggacggtat ccacgacggt 3240 cacatcaaaa aactgctgca ccagtactac ggtgacgacg aatctaaaat cccggctgtt 3300 gaatacttcg gtggtgaatc tccggttgac gttcagtctc aggttgactc ttcttctgtt 3360 tctgaagact ctgctgtttt caaagctacc tcttctaccg acgaagaatc ttggttcaaa 3420 gctctggctg gttctgaaat caactggcgt cacgcttctt tcctgtgctc tttcatcacc 3480 caggacaaaa tgttcgtttc taacccgatc cgtaaagttt tcaaaccgtc tcagggtatg 3540 gttgttgaaa tctctaacgg taacacctct tctaaaaccg ttgttaccct gtctgaaccg 3600 gttcagggtg aactgaaacc gaccgttatc ctgaaactgc tgaaagaaaa catcatccag 3660 atggaaatga tcgaaaaccg taccatggac ggtaaaccgg tttctctgcc gctgctgtac 3720 aacttcaacc cggacaacgg tttcgctccg atctctgaag ttatggaaga ccgtaaccag 3780 cgtatcaaag aaatgtactg gaaactgtgg atcgacgaac cgttcaacct ggacttcgac 3840 ccgcgtgacg ttatcaaagg taaagacttc gaaatcaccg ctaaagaagt ttacgacttc 3900 acccacgctg ttggtaacaa ctgcgaagac ttcgtttctc gtccggaccg taccatgctg 3960 gctccgatgg acttcgctat cgttgttggt tggcgtgcta tcatcaaagc tatcttcccg 4020 aacaccgttg acggtgacct gctgaaactg gttcacctgt ctaacggtta caaaatgatc 4080 ccgggtgcta aaccgctgca ggttggtgac gttgtttcta ccaccgctgt tatcgaatct 4140 gttgttaacc agccgaccgg taaaatcgtt gacgttgttg gtaccctgtc tcgtaacggt 4200 aaaccggtta tggaagttac ctcttctttc ttctaccgtg gtaactacac cgacttcgaa 4260 aacaccttcc agaaaaccgt tgaaccggtt taccagatgc acatcaaaac ctctaaagac 4320 atcgctgttc tgcgttctaa agaatggttc cagctggacg acgaagactt cgacctgctg 4380 aacaaaaccc tgaccttcga aaccgaaacc gaagttacct tcaaaaacgc taacatcttc 4440 tcttctgtta aatgcttcgg tccgatcaaa gttgaactgc cgaccaaaga aaccgttgaa 4500 atcggtatcg ttgactacga agctggtgct tctcacggta acccggttgt tgacttcctg 4560 aaacgtaacg gttctaccct ggaacagaaa gttaacctgg aaaacccgat cccgatcgct 4620 gttctggact cttacacccc gtctaccaac gaaccgtacg ctcgtgtttc tggtgacctg 4680 aacccgatcc acgtttctcg tcacttcgct tcttacgcta acctgccggg taccatcacc 4740 cacggtatgt tctcttctgc ttctgttcgt gctctgatcg aaaactgggc tgctgactct 4800 gtttcttctc gtgttcgtgg ttacacctgc cagttcgttg acatggttct gccgaacacc 4860 gctctgaaaa cctctatcca gcacgttggt atgatcaacg gtcgtaaact gatcaaattc 4920 gaaacccgta acgaagacga cgttgttgtt ctgaccggtg aagctgaaat cgaacagccg 4980 gttaccacct tcgttttcac cggtcagggt tctcaggaac agggtatggg tatggacctg 5040 tacaaaacct ctaaagctgc tcaggacgtt tggaaccgtg ctgacaacca cttcaaagac 5100 acctacggtt tctctatcct ggacatcgtt atcaacaacc cggttaacct gaccatccac 5160 ttcggtggtg aaaaaggtaa acgtatccgt gaaaactact ctgctatgat cttcgaaacc 5220 atcgttgacg gtaaactgaa aaccgaaaaa atcttcaaag aaatcaacga acactctacc 5280 tcttacacct tccgttctga aaaaggtctg ctgtctgcta cccagttcac ccagccggct 5340 ctgaccctga tggaaaaagc tgctttcgaa gacctgaaat ctaaaggtct gatcccggct 5400 gacgctacct tcgctggtca ctctctgggt gaatacgctg ctctggcttc tctggctgac 5460 gttatgtcta tcgaatctct ggttgaagtt gttttctacc gtggtatgac catgcaggtt 5520 gctgttccgc gtgacgaact gggtcgttct aactacggta tgatcgctat caacccgggt 5580 cgtgttgctg cttctttctc tcaggaagct ctgcagtacg ttgttgaacg tgttggtaaa 5640 cgtaccggtt ggctggttga aatcgttaac tacaacgttg aaaaccagca gtacgttgct 5700 gctggtgacc tgcgtgctct ggacaccgtt accaacgttc tgaacttcat caaactgcag 5760 aaaatcgaca tcatcgaact gcagaaatct ctgtctctgg aagaagttga aggtcacctg 5820 ttcgaaatca tcgacgaagc ttctaaaaaa tctgctgtta aaccgcgtcc gctgaaactg 5880 gaacgtggtt tcgcttgcat cccgctggtt ggtatctctg ttccgttcca ctctacctac 5940 ctgatgaacg gtgttaaacc gttcaaatct ttcctgaaaa aaaacatcat caaagaaaac 6000 gttaaagttg ctcgtctggc tggtaaatac atcccgaacc tgaccgctaa accgttccag 6060 gttaccaaag aatacttcca ggacgtttac gacctgaccg gttctgaacc gatcaaagaa 6120 atcatcgaca actgggaaaa atacgaacag tcttaa 6156 <210> 15 <211> 522 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 15 agctctactc ccattattat cgttttctgt gatcttttct acatactgtg cttcaaaaga 60 aaaaggaaaa tgcagcgtgc gttccttcgt cgtctcagca agcgtgccgt cgttcctgca 120 actgcggcgc tgcttcggtt ttctcagacg cagtgcgctg gtcgtgcccc tgttaccgcg 180 tgcgcaggcg ctgttcttgc ctaccagtgc tctatccgag cctactccga tgcccaccac 240 gaggagagcg ctactcgcag cggccaatac ctcctcgaca agaacgacgt gctgacgcgt 300 gtgctcgagg tagtgaagaa cttcgagaag gttgatgcct ctaaggtgac gcctgagtct 360 cacttcgtga acgatctcgg cctcaactct ctcgacgttg tggaggtcgt ttttgccatc 420 gagcaggagt tcatcttaga tatccctgat cacgatgccg aaaagatcca gtccattcct 480 gatgctgtgg agtacattgc gcagaatcca atggccaagt aa 522 <210> 16 <211> 1266 <212> DNA <213> Leptomonas pyrrhocoris <400> 16 atggaaggtt ctccggttac ctctgttcgt ctgtcttctg ttgttccggc ttctgttgtt 60 ggtgaaaaca aaccgcgtca gctgaccccg atggacctgg ctatgaaact gcactacgtt 120 cgtgctgttt acttcttcaa aggtgctcgt gacttcaccg ttgctgacgt taaaaacacc 180 atgttcaccc tgcagtctct gctgcagtct taccaccacg tttctggtcg tatccgtatg 240 tctgacaacg acaacgacac ctctgctgct gctatcccgt acatccgttg caacgactct 300 ggtatccgtg ttgttgaagc taacgttgaa gaattcaccg ttgaaaaatg gctggaactg 360 gacgaccgtt ctatcgacca ccgtttcctg gtttacgacc acgttctggg tccggacctg 420 accttctctc cgctggtttt cctgcagatc acccagttca aatgcggtgg tctgtgcatc 480 ggtctgtctt gggctcacat cctgggtgac gttttctctg cttctacctt catgaaaacc 540 ctgggtcagc tggtttctgg tcacgctccg accaaaccgg tttacccgaa aaccccggaa 600 ctgacctctc acgctcgtaa cgacggtgaa gctatctcta tcgaaaaaat cgactctgtt 660 ggtgaatact ggctgctgac caacaaatgc aaaatgggtc gtcacatctt caacttctct 720 ctgaaccaca tcgactctct gatggctaaa tacaccaccc gtgaccagcc gttctctgaa 780 gttgacatcc tgtacgctct gatctggaaa tctctgctga acatccgtgg tgaaaccaac 840 accaacgtta tcaccatctg cgaccgtaaa aaatcttcta cctgctggaa cgaagacctg 900 gttatctctg ttgttgaaaa aaacgacgaa atggttggta tctctgaact ggctgctctg 960 atcgctggtg aaaaacgtga agaaaacggt gctatcaaac gtatgatcga acaggacaaa 1020 ggttcttctg acttcttcac ctacggtgct aacctgacct tcgttaacct ggacgaaatc 1080 gacatgtacg aactggaaat caacggtggt aaaccggact tcgttaacta caccatccac 1140 ggtgttggtg acaaaggtgt tgttctggtt ttcccgaaac agaacttcgc tcgtatcgtt 1200 tctgttgtta tgccggaaga agacctggct aaactgaaag aagaagttac caacatgatc 1260 atctaa 1266 <210> 17 <211> 172 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 17 Met Val Asp Lys Arg Glu Ser Tyr Thr Lys Glu Asp Leu Leu Ala Ser 1 5 10 15 Gly Arg Gly Glu Leu Phe Gly Ala Lys Gly Pro Gln Leu Pro Ala Pro 20 25 30 Asn Met Leu Met Met Asp Arg Val Val Lys Met Thr Glu Thr Gly Gly 35 40 45 Asn Phe Asp Lys Gly Tyr Val Glu Ala Glu Leu Asp Ile Asn Pro Asp 50 55 60 Leu Trp Phe Phe Gly Cys His Phe Ile Gly Asp Pro Val Met Pro Gly 65 70 75 80 Cys Leu Gly Leu Asp Ala Met Trp Gln Leu Val Gly Phe Tyr Leu Gly 85 90 95 Trp Leu Gly Gly Glu Gly Lys Gly Arg Ala Leu Gly Val Gly Glu Val 100 105 110 Lys Phe Thr Gly Gln Val Leu Pro Thr Ala Lys Lys Val Thr Tyr Arg 115 120 125 Ile His Phe Lys Arg Ile Val Asn Arg Arg Leu Ile Met Gly Leu Ala 130 135 140 Asp Gly Glu Val Leu Val Asp Gly Arg Leu Ile Tyr Thr Ala Ser Asp 145 150 155 160 Leu Lys Val Gly Leu Phe Gln Asp Thr Ser Ala Phe 165 170

Claims (22)

  1. 유기 생성물을 생산하기 위한 생물제조 시스템으로서,
    적어도 하나의 생물반응기 배양 용기를 포함하되,
    적어도 하나의 생물반응기 배양 용기는 유기 기질 배양액을 함유하며,
    유기 기질 배양액은 개선된 유기 기질 생산 능력을 갖는 제1 재조합 미생물을 함유하며,
    제1 재조합 미생물은, 적어도 하나의 비-천연 유기 기질 형성 효소 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 적어도 하나의 유기 기질 형성 재조합 효소를 발현시키며,
    제1 재조합 미생물은 유기 기질을 생산하기 위해 탄소 공급원을 사용할 수 있으며,
    제1 재조합 미생물은 산소, 적어도 가스, 액체 및 고체 상의 부산물을 포함하는, 적어도 하나의 유기 기질 배양 불순물을 생산하며,
    적어도 하나의 생물반응기 배양 용기는 유기 생성물 배양액을 함유하며,
    유기 생성물 배양액은 개선된 유기 생성물 생산 능력을 갖는 제2 재조합 미생물을 함유하며,
    제2 재조합 유기물은, 적어도 하나의 비-천연 유기 생성물 형성 효소 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 적어도 하나의 유기 생성물 형성 효소를 발현시키며,
    제2 재조합 유기물은 적어도 하나의 유기 생성물을 생산하기 위한 유기 기질을 사용할 수 있는 것인, 시스템.
  2. 제1항에 있어서,
    적어도 하나의 생물반응기 배양 용기는, 탄소 공급원 유입구 및 전원을 포함하는 제1 생물반응기 배양 용기; 및 제1 생물반응기 배양 용기와 제2 생물반응기 배양 용기에 및 이러한 용기들 사이에 연결된 유체 유로, 및 유기 생성물 유출구를 포함하는 제2 생물반응기 배양 용기를 포함하며;
    제1 생물반응기 배양 용기는 유기 기질 배양액을 포함하며, 제2 생물반응기 배양 용기는 유기 생성물 배양액을 포함하거나;
    제1 생물반응기 배양 용기 또는 제2 생물반응기 배양 용기는 바이오매스 수집 포트를 추가로 포함하는 것인, 시스템.
  3. 제2항에 있어서,
    탄소 공급원은 이산화탄소, 일산화탄소, 글리세롤, 글루코스, 프룩토스, 수크로스, 단당류, 이당류, 다당류, 글리코겐, 아세트산, 지방산 또는 이들의 조합을 포함하거나;
    전원은 태양광, 태양광 전원, 전력원 또는 이들의 조합을 포함하거나;
    휘발성 가스는 산소, 메탄 또는 이들의 조합을 포함하거나;
    적어도 하나의 유기 기질은 알파-케토글루타레이트, 수크로스, 글루코스, 프룩토스, 자일로스, 아라비노스, 갈락토스, 글리세롤, 단당류, 이당류, 다당류, 글리코겐, 지방산 또는 이들의 조합을 포함하거나;
    적어도 하나의 유기 생성물은 알코올, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 에탄 디올, 유기산, 프로피온산, 아세트산, 알데하이드, 포름알데하이드, 장쇄 지방산, n-알칸, 탄화수소, 에탄, 프로펜, 부텐, 에탄, 프로판, 부탄, C2-C20 알칸, C2-C20 알켄 또는 이들의 조합을 포함하거나;
    제2 생물반응기 배양 용기는 탄소 공급원 유입구, 휘발성 가스 유출구, 전원 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 것인, 시스템.
  4. 제1항에 있어서,
    유기 기질 배양액 및 유기 생성물 배양액은 하나의 생물반응기 배양 용기에서 조합되거나;
    유기 기질 배양액 및 유기 생성물 배양물은 약 0.2 ㎛ 내지 약 10 ㎛ 이상의 공극 크기를 포함하는 필터에 의해 분리되거나;
    시스템은 탄산화 유닛, 아민 스트리퍼, 아민 스크러버, 촉매 전환기, 응축기, 압축기, 가성 타워, 건조기 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 것인, 시스템.
  5. 제1항에 있어서,
    유기 기질은 알파-케토글루타레이트(AKG)를 포함하며, 제1 재조합 미생물에 의해 생산된 적어도 하나의 AKG 형성 효소의 양은 비-천연 AKG 형성 효소 발현 뉴클레오타이드 서열이 결여된 대조군 미생물에 비해 생산된 양보다 더 많거나;
    적어도 하나의 유기 생성물 형성 효소는 에틸렌 형성 효소(EFE)를 포함하며, 제2 재조합 미생물에 의해 생산된 EFE의 양은 비-천연 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열이 결여된 대조군 미생물에 비해 생산된 양보다 더 많은 것인, 시스템.
  6. 제5항에 있어서,
    제1 재조합 미생물은, 적어도 하나의 비-천연 AKGP 형성 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 적어도 하나의 알파-케토글루타레이트 퍼미아제 단백질(AKGP)을 발현시키는 것인, 시스템.
  7. 제5항에 있어서,
    적어도 하나의 AKG 형성 효소는 이소시트레이트 데하이드로게나제(ICD) 단백질, 글루타메이트 데하이드로게나제(GDH) 단백질 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 시스템.
  8. 제7항에 있어서,
    제1 재조합 미생물은, 서열번호 2와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 비-천연 ICD 단백질 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 서열번호 1과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 ICD 단백질을 발현시키거나;
    제1 재조합 미생물은, 서열번호 6과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 비-천연 GDH 단백질 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 서열번호 5와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 GDH 단백질을 발현시키거나,
    이들의 조합을 발현시키거나; 또는
    제2 재조합 미생물은, 서열번호 8과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 비-천연 EFE 단백질 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 서열번호 7과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 EFE 단백질을 발현시키는 것인, 시스템.
  9. 제1항에 있어서,
    제1 재조합 미생물은 광합성 박테리아, 시아노박테리아(Cyanobacteria), 시네코코커스(Synechococcus), 시네코코커스 엘롱가투스(Synechococcus elongatus), 시네코코커스 레오폴리엔시스(Synechococcus leopoliensis), 시네코시스티스(Synechocystis), 아나바에나(Anabaena), 슈도모나스(Pseudomonas), 슈도모나스 시링가에(Pseudomonas syringae), 슈도모나스 사바스타노이(Pseudomonas savastanoi), 클라미도모나스(Chlamydomonas), 및 클라미도모 나스 레인하르 드티(C hlamydomonas reinhardtii )로 구성된 군으로부터 선택된 미생물을 포함하거나;
    제2 재조합 미생물은 에셰리키아( Escherichia ), 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli ), 지오박테리아(Geobacteria), 아르트로박터 파라피네우스(Arthrobacter paraffineus), 슈도모나스 플루오레센스( Pseudomonas fluorescens ), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas Putida), 슈도모나스, 슈도모나스 시링가에, 슈도모나스 사바스타노이, 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 바실러스 메타테리움(Bacillus metatherium), 칸디다 팔루디지나( Candida paludigena ), 피치아 이노시토보라(Pichia inositovora ), 토룰롭시스 글라브라타( Torulopsis glabrata ), 칸디다 리폴리티카(Candida lipolytica ), 야로위아 리폴리티카( Yarrowia lipolytica ), 사카로마이세스 세레비시아에.(Saccharomyces cereviciae.), 아스퍼질러스 종(Aspergillus sp.), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis ) 및 락토바실러스 종(Lactobacillus sp.)으로 구성된 군으로부터 선택된 미생물을 포함하는 것인, 시스템.
  10. 제1항에 있어서,
    제1 재조합 미생물은 글루코스-1-포스페이트 아데닐릴트랜스퍼라제 단백질의 발현이 결여된 델타-glgc 돌연변이체 미생물을 포함하거나; 제1 재조합 미생물은, 서열번호 10과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 비-천연 수크로스 신타제 단백질 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 서열번호 9와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 수크로스 신타제 단백질을 발현시키거나; 제1 재조합 미생물은, 서열번호 12와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 비-천연 수크로스 포스페이트 신타제 뉴클레오타이드 서열을 발현시킴으로써, 서열번호 11과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 수크로스 포스페이트 신타제 단백질을 발현시키는 것인, 시스템.
  11. 제5항에 있어서,
    제1 재조합 미생물에 의해 생산된 적어도 하나의 AKG 형성 효소의 양은 비-천연 AKG 형성 효소 발현 뉴클레오타이드 서열이 결여된 대조군 미생물에 비해 생산된 양보다 약 5% 내지 약 200% 이상 더 많거나;
    제2 재조합 미생물에 의해 생산된 EFE 단백질의 양은 비-천연 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열이 결여된 대조군 미생물에 비해 생산된 양보다 약 5% 내지 약 200% 이상 더 많거나;
    제2 재조합 미생물에 의해 생산된 EFE 단백질의 양은 유기 생성물 배양액의 리터 당 약 20 그램 내지 약 100 그램 이상인, 시스템.
  12. 제5항에 있어서,
    제2 재조합 미생물은 E. 콜라이(E. Coli)를 포함하며, 제2 재조합 미생물에 의해 생산된 EFE 단백질의 양은 제2 재조합 미생물의 단백질의 총 세포 양의 약 30% 내지 약 80% 이상이거나;
    제2 재조합 미생물에 의해 생산된 적어도 하나의 유기 생성물의 생산 속도는 약 1억 파운드/년 내지 약 10억 파운드/년 이상이거나;
    제2 재조합 미생물의 세포 집단 농도는 밀리리터 당 약 107 내지 약 1013개의 세포, 또는 리터 당 약 100 그램 내지 약 300 그램의 건조 세포 중량의 유기 생성물 배양액 리터 당 건조 세포 중량의 범위인 시스템.
  13. 제5항에 있어서,
    비-천연 AKG 형성 효소 발현 뉴클레오타이드 서열 또는 비-천연 EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 미생물 발현 벡터에 삽입되며, 미생물 발현 벡터는 박테리아 벡터 플라스미드, 상동 재조합 시스템의 뉴클레오타이드 가이드, 항생제-내성 시스템, 단백질 정제 및 검출을 위한 보조 시스템, CRISPR CAS 시스템, 파지 디스플레이 시스템 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 시스템.
  14. 제5항에 있어서, EFE 발현 뉴클레오타이드 서열은 미생물 발현 벡터에서 약 2 내지 약 500 개의 복사체 수를 가지거나; 미생물 발현 벡터는 적어도 하나의 미생물 발현 프로모터를 포함하는 것인, 시스템.
  15. 제14항에 있어서,
    적어도 하나의 미생물 발현 프로모터는 광 민감성 프로모터, 화학물질 민감성 프로모터, 온도 민감성 프로모터, Lac 프로모터, T7 프로모터, CspA 프로모터, 람다 PL 프로모터, 람다 CL 프로모터, 연속적으로 생산하는 프로모터, psbA 프로모터 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 시스템.
  16. 유기 생성물을 생산하는 방법으로서,
    제2항의 생물제조 시스템을 제공하는 단계;
    제1 생물반응기 배양 용기에서 소정 양의 적어도 하나의 유기 기질을 생산하기에 충분한 조건하에, 제1 생물반응기 배양 용기에서 제1 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및
    제2 생물반응기 배양 용기에서 소정 양의 적어도 하나의 유기 생성물을 생산하기에 충분한 조건하에, 제2 생물반응기 배양 용기에서 제2 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    휘발성 가스 유출구를 통해 유기 기질 배양액으로부터 소정 양의 적어도 하나의 휘발성 가스를 제거하는 단계;
    유기 생성물 유출구를 통해 유기 생성물 배양액으로부터 소정 양의 적어도 하나의 유기 생성물을 제거하는 단계;
    탄소 공급원이 이산화탄소를 포함하는 경우, 탄소 공급원 유입구를 통해 소정 양의 이산화탄소를 이산화탄소 공급원으로부터 유기 기질 배양액으로 공급하는 단계;
    유기 기질 배양액 및 유기 생성물 배양액의 pH 수준을 약 5.0 내지 약 8.5로 유지하는 단계;
    유기 기질 배양액 및 유기 생성물 배양액을 약 25℃ 내지 약 70℃의 온도에서 유지하는 단계;
    제1 생물반응기 배양 용기 또는 제2 생물반응기 배양 용기가 바이오매스 수집 포트를 포함하는 경우, 바이오매스 수집 포트를 통해 제1 재조합 미생물 또는 제2 재조합 미생물에 의해 생산된 소정 양의 바이오매스를 수집하는 단계; 또는
    제2 생물반응기 배양 용기의 총 내부 부피를 기준으로 약 10 부피% 내지 약 1 부피% 이하의 제2 생물반응기 배양 용기 내의 휘발성 가스의 양을 유지하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  18. 제16항에 있어서,
    비-천연 유기 기질 형성 재조합 효소 발현 뉴클레오타이드 서열 또는 비-천연 유기 생성물 발현 뉴클레오타이드 서열은 미생물 발현 벡터에 삽입되며, 적어도 하나의 미생물 발현 벡터는 적어도 하나의 미생물 발현 프로모터를 포함하며,
    유기 기질 배양액 또는 유기 생성물 배양액에 적어도 하나의 프로모터 유도 인자를 첨가함으로써, 생산된 적어도 하나의 유기 생성물의 양 또는 적어도 하나의 유기 기질의 양을 제어하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    적어도 하나의 미생물 발현 프로모터는 광 민감성 프로모터, 화학물질 민감성 프로모터, 온도 민감성 프로모터, Lac 프로모터, T7 프로모터, CspA 프로모터, 람다 PL 프로모터, 람다 CL 프로모터, 연속적으로 생산하는 프로모터, psbA 프로모터 또는 이들의 조합을 포함하며; 적어도 하나의 프로모터 유도 인자는 락토스, 자일로스, IPTG, 저온 쇼크, 열 쇼크 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 방법.
  20. 제16항에 있어서,
    적어도 하나의 유기 기질 배양 불순물이 적어도 하나의 휘발성 가스를 포함하는 경우, 휘발성 가스 유출구를 통해 적어도 하나의 휘발성 가스를 제거하는 단계; 또는
    약 1억 파운드/년 내지 약 10억 파운드/년 이상의 속도로 생산된 적어도 하나의 유기 생성물의 양을 회수하는 단계를 추가로 포함하거나;
    생산된 적어도 하나의 유기 생성물의 양은 약 1 mol% 이하의 휘발성 가스의 양을 함유하는 것인, 방법.
  21. 유기 생성물을 생산하는 방법으로서,
    제1항의 생물복원 시스템(bioremediation system)을 제공하는 단계로서, 유기 기질 배양액 및 유기 생성물 배양액은 하나의 생물반응기 배양 용기에서 조합되며, 비-천연 유기 기질 형성 재조합 효소 발현 뉴클레오타이드 서열은 제1 미생물 발현 벡터에 삽입되며, 비-천연 유기 생성물 형성 효소 발현 뉴클레오타이드 서열은 제2 미생물 발현 벡터에 삽입되며, 제1 미생물 발현 벡터 및 제2 미생물 발현 벡터는 각각 적어도 하나의 미생물 발현 프로모터를 포함하는 단계,
    탄소 공급원 유입구에 연결된 탄소 공급원을 제공하는 단계;
    제1 생물반응기 배양 용기에서 소정 양의 적어도 하나의 유기 기질을 생산하기에 충분한 조건하에, 제1 생물반응기 배양 용기에서 제1 재조합 미생물을 배양하는 단계;
    제1 시점에 적어도 하나의 프로모터 유도 인자를 유기 기질 배양액에 첨가함으로써, 소정 양의 적어도 하나의 유기 기질을 생산하는 단계;
    제2 생물반응기 배양 용기에서 소정 양의 적어도 하나의 유기 생성물을 생산하기에 충분한 조건하에, 제2 생물반응기 배양 용기에서 제2 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및
    제2 시점에 적어도 하나의 프로모터 유도 인자를 유기 생성물 배양액에 첨가함으로써, 소정 양의 적어도 하나의 유기 생성물을 생산하는 단계를 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    제2 시점 전에, 제2 생물반응기 배양 용기의 총 내부 부피에 기초하여, 제2 생물반응기 배양 용기에서 산소의 양을 약 10 부피% 내지 약 1 부피% 이하로 감소시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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