KR20220154694A - 동물 세포의 배양 방법 - Google Patents

동물 세포의 배양 방법 Download PDF

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KR20220154694A KR1020227032137A KR20227032137A KR20220154694A KR 20220154694 A KR20220154694 A KR 20220154694A KR 1020227032137 A KR1020227032137 A KR 1020227032137A KR 20227032137 A KR20227032137 A KR 20227032137A KR 20220154694 A KR20220154694 A KR 20220154694A
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세이치 사토
유키 아케다
유타 엔도
아야나 마츠바
치히로 츠지
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아지노모토 가부시키가이샤
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Abstract

동물 세포를 발현 숙주로 한 목적 단백질의 제조 방법을 제공한다. 목적 단백질 생산능을 갖는 동물 세포를 (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-에틸에스테르 등의 L-시스테인 유도체의 존재 하에서 배양함으로써 목적 단백질을 제조한다.

Description

동물 세포의 배양 방법
본 발명은, 동물 세포의 배양 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 양태는, 동물 세포에 의한 단백질 등의 목적 물질의 제조 방법에 관한 것이다.
동물 세포의 배양에는, 시스테인(Cys) 등의 아미노산을 함유하는 배지가 널리 사용되고 있다. Cys는 배지 중에서 자연 산화되고, 시스틴((Cys)2)으로 변환된다. (Cys)2는 용해도가 낮기 때문에, 액체 배지 중에 석출되기 쉽다. 이로부터, Cys는 액체 배지의 보존 불안정성의 요인이 되고 있다.
Cys는 피루브산(Pyr)이나 α-케토글루탈산 등의 α-케토산과 축합하여 티아졸리딘 유도체를 형성할 수 있다(비특허문헌 1). α-케토산의 사용에 의해 배지가 안정화되는 것, 및 티아졸리딘 유도체는 동물 세포의 배양에 유효한 것이 보고되어 있다(비특허문헌 1).
(2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-에틸에스테르((2RS,4R)-2-methyl-2,4-thiazolidinedicarboxylic acid 2-ethyl ester)나 (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산((2RS,4R)-2-methyl-2,4-thiazolidinedicarboxylic acid) 등의 시스테인 유도체는, 화장료의 성분으로서 알려져 있다(특허문헌 1).
일본 특허 제5439849호
Kuschelewski J et al., Antioxidant effect of thiazolidine molecules in cell culture media improves stability and performance. Biotechnol Prog. 2017 May;33(3):759-770.
본 발명은, 동물 세포의 배양에 관한 신규의 기술을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은, 동물 세포의 배양 시에 특정한 시스테인 유도체가 시스테인의 대체 물질로서 기능하는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은, 이하와 같이 예시할 수 있다.
[1]
동물 세포 배양용의 배지이며,
유효 성분을 함유하고,
상기 유효 성분이, 후술하는 식 (I)로 나타내지는 화합물인, 배지:
식 (I) 중, 「R1」은 치환기를 갖고 있어도 되는 C1-22알킬기를 나타내고, 「R2」는 수소 원자, 치환기를 갖고 있어도 되는 C6-12아릴기, 또는 치환기를 갖고 있어도 되는 직쇄 C1-6알킬기를 나타낸다.
[2]
상기 「R1」이 C1-12알킬기, 또는 치환기를 갖고 있어도 되는 C6-12아릴기로 치환된 C1-6알킬기이며, 또한/또는
상기 「R2」가 수소 원자, 직쇄 C1-6알킬기, 치환기를 갖고 있어도 되는 C6-12아릴기로 치환된 직쇄 C1-6알킬기, 또는 C1-7아실기로 치환된 직쇄 C1-6알킬기인,
상기 배지.
[3]
상기 유효 성분이, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-에틸에스테르, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-메틸에스테르, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-i-프로필에스테르, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-n-부틸에스테르, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-t-부틸에스테르, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-n-옥틸에스테르, (2RS,4R)-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-에틸에스테르, (2RS,4R)-2-(4-히드록시페닐)메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-메틸에스테르, 그리고 그들의 2R체 및 2S체로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물인, 상기 배지.
[4]
상기 유효 성분이, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-에틸에스테르 그리고 그 2R체 및 2S체로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물인, 상기 배지.
[5]
상기 유효 성분이, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-메틸에스테르 그리고 그 2R체 및 2S체로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물인, 상기 배지.
[6]
유효 성분 농도가 0.92mM 이상인, 상기 배지.
[7]
유효 성분 농도가 5mM 이상인, 상기 배지.
[8]
유효 성분 농도가 10mM 이상인, 상기 배지.
[9]
유가 배지인, 상기 배지.
[10]
초발 배지인, 상기 배지.
[11]
목적 물질의 제조 방법이며,
목적 물질 생산능을 갖는 동물 세포를 배지에서 배양하는 것; 및
목적 물질을 회수하는 것
을 포함하고,
상기 배양이 유효 성분의 존재 하에서 실시되고,
상기 유효 성분이, 후술하는 식 (I)로 나타내지는 화합물인, 방법:
식 (I) 중, 「R1」은 치환기를 갖고 있어도 되는 C1-22알킬기를 나타내고, 「R2」는 수소 원자, 치환기를 갖고 있어도 되는 C6-12아릴기, 또는 치환기를 갖고 있어도 되는 직쇄 C1-6알킬기를 나타낸다.
[12]
상기 목적 물질이 단백질인, 상기 방법.
[13]
동물 세포의 배양 방법이며,
동물 세포를 배지에서 배양하는 것
을 포함하고,
상기 배양이 유효 성분의 존재 하에서 실시되고,
상기 유효 성분이, 후술하는 식 (I)로 나타내지는 화합물인, 방법:
식 (I) 중, 「R1」은 치환기를 갖고 있어도 되는 C1-22알킬기를 나타내고, 「R2」는 수소 원자, 치환기를 갖고 있어도 되는 C6-12아릴기, 또는 치환기를 갖고 있어도 되는 직쇄 C1-6알킬기를 나타낸다.
[14]
상기 「R1」이 C1-12알킬기, 또는 치환기를 갖고 있어도 되는 C6-12아릴기로 치환된 C1-6알킬기이며, 또한/또는
상기 「R2」가 수소 원자, 직쇄 C1-6알킬기, 치환기를 갖고 있어도 되는 C6-12아릴기로 치환된 직쇄 C1-6알킬기, 또는 C1-7아실기로 치환된 직쇄 C1-6알킬기인,
상기 방법.
[15]
상기 유효 성분이, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-에틸에스테르, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-메틸에스테르, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-i-프로필에스테르, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-n-부틸에스테르, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-t-부틸에스테르, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-n-옥틸에스테르, (2RS,4R)-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-에틸에스테르, (2RS,4R)-2-(4-히드록시페닐)메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-메틸에스테르, 그리고 그들의 2R체 및 2S체로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물인, 상기 방법.
[16]
상기 유효 성분이, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-에틸에스테르 그리고 그 2R체 및 2S체로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물인, 상기 방법.
[17]
상기 유효 성분이, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-메틸에스테르 그리고 그 2R체 및 2S체로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물인, 상기 방법.
[18]
상기 유효 성분이, 배양 개시 후에 상기 배지에 공급되는, 상기 방법.
[19]
상기 유효 성분이, 배양 개시 시에 상기 배지에 함유되는, 상기 방법.
[20]
상기 배양 시의 상기 배지 중의 유효 성분 농도가 0.92mM 이상인, 상기 방법.
[21]
상기 배양 시의 상기 배지 중의 유효 성분 농도가 1.5mM 이상인, 상기 방법.
[22]
상기 유효 성분이, 배양 개시 후에 상기 농도로 상기 배지에 함유되도록 해당 배지에 공급되는, 상기 방법.
[23]
상기 유효 성분이, 배양 개시 시에 상기 농도로 상기 배지에 함유되는, 상기 방법.
[24]
상기 유효 성분이, 배양 중의 특정 기간을 통한 평균값으로서, 상기 농도로 상기 배지에 함유되고,
상기 특정 기간이, 배양의 전기간 또는 배지 중에서의 동물 세포의 생세포 밀도가 5×106cells/mL 이상인 기간인, 상기 방법.
[25]
상기 유효 성분이, 배양 중의 특정 기간을 통하여, 1일당 0.1mM 이상의 공급량으로 상기 배지에 공급되고,
상기 특정 기간이, 배양의 전기간 또는 배지 중에서의 동물 세포의 생세포 밀도가 5×106cells/mL 이상인 기간인, 상기 방법.
[26]
상기 유효 성분이, 배양 중의 특정 기간을 통하여, 1일당 0.3mM 이상의 공급량으로 상기 배지에 공급되고,
상기 특정 기간이, 배양의 전기간 또는 배지 중에서의 동물 세포의 생세포 밀도가 5×106cells/mL 이상인 기간인, 상기 방법.
[27]
상기 배양이, 상기 유효 성분을 함유하는 유가 배지를 사용한 관류 배양을 실시하는 것을 포함하는, 상기 방법.
[28]
상기 배양이, 시스테인 관련 물질의 존재 하에서 실시되고,
상기 시스테인 관련 물질이, 상기 유효 성분 이외의, 시스테인 및 그의 유도체에서 선택되는, 상기 방법.
[29]
상기 시스테인 관련 물질이, 시스테인, 시스틴 및 시스테이닐피루브산에서 선택되는, 상기 방법.
[30]
상기 시스테인 관련 물질이, 배양 개시 시에 상기 배지에 함유되는, 상기 방법.
[31]
후술하는 식 (I)로 나타내지는 화합물의 제조 방법이며,
L-시스테인과 후술하는 식 (II)로 나타내지는 피루브산 유도체를 함수 매체 중에서 반응시키고, 이로써 상기 화합물의 결정을 생성하는 것; 및
상기 결정을 회수하는 것
을 포함하는, 방법:
식 (I) 및 식 (II) 중, 「R1」은 C1-C6알킬기를 나타내고, 「R2」는 메틸기를 나타낸다.
도 1은 기초 배지 중의 시스테인 또는 시스테인 유도체가 CHO 세포의 증식에 끼치는 영향을 나타내는 도면.
도 2는 피드(Feed) 배지 중의 시스테인 또는 시스테인 유도체의 농도가 CHO 세포의 증식에 끼치는 영향을 나타내는 도면.
도 3은 피드 배지 중의 시스테인 또는 시스테인 유도체의 농도가 CHO 세포에 의한 항체 생산에 끼치는 영향을 나타내는 도면.
도 4는 피드 배지 중의 시스테인 또는 시스테인 유도체의 농도가 CHO 세포의 증식에 끼치는 영향을 나타내는 도면.
도 5는 피드 배지 중의 시스테인 또는 시스테인 유도체의 농도가 CHO 세포에 의한 항체 생산에 끼치는 영향을 나타내는 도면.
도 6은 피드 배지 중의 시스테인 또는 시스테인 유도체의 농도가 CHO 세포의 증식에 끼치는 영향을 나타내는 도면.
도 7은 피드 배지 중의 시스테인 또는 시스테인 유도체의 농도가 CHO 세포에 의한 항체 생산에 끼치는 영향을 나타내는 도면.
<1> 유효 성분
본 발명에 있어서는, 유효 성분이 사용된다.
유효 성분은, 하기 식 (I)로 나타내지는 화합물이다:
Figure pct00001
식 (I) 중, 「R1」은 치환기를 갖고 있어도 되는 C1-22알킬기를 나타낸다. 식 (I) 중, 「R2」는 수소 원자, 치환기를 갖고 있어도 되는 C6-12아릴기, 또는 치환기를 갖고 있어도 되는 C1-6알킬기를 나타낸다. 식 (I) 중, 「R2」는 특히 수소 원자, 치환기를 갖고 있어도 되는 C6-12아릴기, 또는 치환기를 갖고 있어도 되는 직쇄 C1-6알킬기를 나타내도 된다. 또한, 「R1」 및 「R2」를 각각 「R1」 및 「R2」라고 기재하는 경우가 있다.
즉, 「R1」의 C1-22알킬기는 치환기를 갖고 있어도 되고, 없어도 된다. 또한, 「R2」의 C6-12아릴기 또는 C1-6알킬기는 치환기를 갖고 있어도 되고, 없어도 된다.
이하, 특기하지 않는 한, 「C1-22알킬기」란 치환기를 갖지 않는 C1-22알킬기를 의미하고, 치환기를 갖지 않는 C1-22알킬기에 관한 기재는 치환기를 갖는 C1-22알킬기에도 준용할 수 있다. 또한, 이하 특기하지 않는 한, 「C6-12아릴기」란 치환기를 갖지 않는 C6-12아릴기를 의미하고, 치환기를 갖지 않는 C6-12아릴기에 관한 기재는 치환기를 갖는 C6-12아릴기에도 준용할 수 있다. 또한, 이하 특기하지 않는 한, 「C1-6알킬기」란 치환기를 갖지 않는 C1-6알킬기를 의미하고, 치환기를 갖지 않는 C1-6알킬기에 관한 기재는 치환기를 갖는 C1-6알킬기에도 준용할 수 있다. 치환기를 갖고 있어도 되는 다른 관능기에 대해서도 마찬가지이다.
「C1-22알킬기가 치환기를 갖는」이란, C1-22알킬기를 구성하는 수소 원자의 하나 또는 그 이상이 치환기로 치환되어 있는 것을 의미한다. 「C6-12아릴기가 치환기를 갖는」이란, C6-12아릴기를 구성하는 수소 원자의 하나 또는 그 이상이 치환기로 치환되어 있는 것을 의미한다. 「C1-6알킬기가 치환기를 갖는」이란, C1-6알킬기를 구성하는 수소 원자의 하나 또는 그 이상이 치환기로 치환되어 있는 것을 의미한다. 「R1」의 C1-22알킬기, 「R2」의 C6-12아릴기 또는 「R2」의 C1-6알킬기에 있어서의 치환기로 치환되는 수소 원자의 수는, 예를 들어 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개 또는 1 내지 2개여도 되고, 구체적으로는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개여도 된다. 「R1」의 C1-22알킬기, 「R2」의 C6-12아릴기 또는 「R2」의 C1-6알킬기에 있어서의 치환기로 치환되는 수소 원자의 수는, 「R1」의 C1-22알킬기, 「R2」의 C6-12아릴기 또는 「R2」의 C1-6알킬기가 갖는 치환기의 수로 바꾸어 읽어도 된다. 2개 또는 그 이상의 수소 원자가 치환기로 치환되는 경우, 치환기는 각 수소 원자에 대하여 독립적으로 선택된다. 치환기를 갖고 있어도 되는 다른 관능기에 대해서도 마찬가지이다.
「C1-22알킬기」란, 탄소수 1 내지 22개의 알킬기를 의미한다. C1-22알킬기는 직쇄여도 되고, 분지쇄여도 된다. C1-22알킬기의 탄소수는, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개 또는 22개여도 된다. C1-22알킬기의 탄소수는, 예를 들어 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상이어도 되고, 22개 이하, 21개 이하, 20개 이하, 19개 이하, 18개 이하, 17개 이하, 16개 이하, 15개 이하, 14개 이하, 13개 이하, 12개 이하, 11개 이하, 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하 또는 4개 이하여도 되고, 그들의 모순되지 않는 조합의 범위여도 된다. C1-22알킬기의 탄소수는, 구체적으로는 예를 들어 1 내지 22개, 1 내지 12개 또는 1 내지 6개여도 된다. 탄소수 n개의 알킬기를 「Cn알킬기」라고도 한다. 예를 들어, 「C1-12알킬기」란, 탄소수 1 내지 12개의 알킬기를 의미한다. 또한, 「C1-6알킬기」란, 탄소수 1 내지 6개의 알킬기를 의미한다. C1-22알킬기로서는, 메틸기, 에틸기, 이소프로필기, 프로필기, 부틸기, 이소부틸기, sec-부틸기, tert-부틸기, 펜틸기, sec-펜틸기, tert-펜틸기, 이소펜틸기, 헥실기, 헵틸기, 옥틸기, 2-에틸헥실기, tert-옥틸기, 노닐기, 이소노닐기, 데실기, 이소데실기, 운데실기, 도데실기, 트리데실기, 이소트리데실기, 테트라데실기, 펜타데실기, 헥사데실기, 이소헥사데실기, 헵타데실기, 옥타데실기, 이소옥타데실기, 올레일기, 베헤닐기를 들 수 있다. C1-22알킬기로서는, 특히 메틸기, 에틸기, 이소프로필기를 들 수 있다.
「C1-6알킬기」란, 탄소수 1 내지 6개의 알킬기를 의미한다. C1-6알킬기는 직쇄여도 되고, 분지쇄여도 된다. C1-6알킬기는 특히 직쇄이면 된다. C1-6알킬기로서는, 메틸기, 에틸기, 이소프로필기, 프로필기, 부틸기, 이소부틸기, sec-부틸기, tert-부틸기, 펜틸기, sec-펜틸기, tert-펜틸기, 이소펜틸기, 헥실기를 들 수 있다. 일 양태에 있어서, C1-6알킬기는 이소부틸기 이외의 C1-6알킬기이면 된다. 직쇄 C1-6알킬기로서는, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 부틸기, 펜틸기, 헥실기를 들 수 있다. C1-6알킬기(예를 들어 직쇄 C1-6알킬기)로서는, 특히 메틸기나 에틸기를 들 수 있다. C1-6알킬기(예를 들어 직쇄 C1-6알킬기)로서, 또한 특히는 메틸기를 들 수 있다.
「C6-12아릴기」란, 탄소수 6 내지 12개의 아릴기를 의미한다. C6-12아릴기로서는, 페닐기, 1-나프틸기, 2-나프틸기를 들 수 있다. C6-12아릴기로서는, 특히 페닐기를 들 수 있다.
「R1」의 C1-22알킬기가 갖고 있어도 되는 치환기로서는, 치환기를 갖고 있어도 되는 C6-12아릴기, 치환기를 갖고 있어도 되는 방향족 복소환기, 치환기를 갖고 있어도 되는 C3-10시클로알킬기, 치환기를 갖고 있어도 되는 C3-10시클로알케닐기, 치환기를 갖고 있어도 되는 비방향족 복소환기를 들 수 있다.
「R2」의 C1-6알킬기가 갖고 있어도 되는 치환기로서는, 치환기를 갖고 있어도 되는 C6-12아릴기, 치환기를 갖고 있어도 되는 방향족 복소환기, 치환기를 갖고 있어도 되는 C3-10시클로알킬기, 치환기를 갖고 있어도 되는 C3-10시클로알케닐기, 치환기를 갖고 있어도 되는 비방향족 복소환기, C1-7아실기를 들 수 있다.
C6-12아릴기(「R2」의 C6-12아릴기도 포함함), 방향족 복소환기, C3-10시클로알킬기, C3-10시클로알케닐기, 및 비방향족 복소환기가 갖고 있어도 되는 치환기로서는, 수산기, 옥소기, 할로겐 원자, C1-7알킬기, C1-7알콕시기, C1-7알킬렌디옥시기, C1-7아실기, 아미노기, C1-7알킬아미노기를 들 수 있다. C6-12아릴기(「R2」의 C6-12아릴기도 포함함), 방향족 복소환기, C3-10시클로알킬기, C3-10시클로알케닐기 및 비방향족 복소환기는 모두, 예를 들어 이들 치환기에서 선택되는 동일하거나 또는 다른 1 내지 5개, 또는 1 내지 3개의 치환기를 갖고 있어도 된다.
할로겐 원자로서는, 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자를 들 수 있다.
「C1-7알킬기」란, 탄소수 1 내지 7개의 알킬기를 의미한다. C1-7알킬기는 직쇄여도 되고, 분지쇄여도 된다. C1-7알킬기로서는, 메틸기, 에틸기, 이소프로필기, 프로필기, 부틸기, 이소부틸기, sec-부틸기, tert-부틸기, 펜틸기, sec-펜틸기, tert-펜틸기, 이소펜틸기, 헥실기, 헵틸기를 들 수 있다. C1-7알킬기로서는, 특히 메틸기나 에틸기를 들 수 있다.
「C1-7알콕시기」란, 탄소수 1 내지 7개의 알콕시기를 의미한다. C1-7알콕시기는 직쇄여도 되고, 분지쇄여도 된다. C1-7알콕시기로서는, 메톡시기, 에톡시기, 프로폭시기, 이소프로필옥시기, 부톡시기, 이소부틸옥시기, tert-부틸옥시기, 펜틸옥시기, 헥실옥시기, 헵틸옥시기를 들 수 있다. C1-7알콕시기로서는, 특히 메톡시기나 에톡시기를 들 수 있다.
「C1-7알킬렌디옥시기」란, 탄소수 1 내지 7개의 알킬렌디옥시기를 의미한다. C1-7알킬렌디옥시기는 직쇄여도 되고, 분지쇄여도 된다. C1-7알킬렌디옥시기로서는, 메틸렌디옥시기, 에틸렌디옥시기, 트리메틸렌디옥시기, 테트라메틸렌디옥시기, 펜타메틸렌디옥시기, 헥사메틸렌디옥시기, 헵타메틸렌디옥시기를 들 수 있다. C1-7알킬렌디옥시기로서는, 특히 메틸렌디옥시기나 에틸렌디옥시기를 들 수 있다.
「C1-7아실기」란, 탄소수 1 내지 7개의 아실기를 의미한다. C1-7아실기는 직쇄여도 되고, 분지쇄여도 된다. C1-7아실기로서는, 카르복실기, 카르복사미드기, C1-7알카노일기, 벤조일기, C1-6알콕시-카르보닐기, 페녹시카르보닐기를 들 수 있다. 「C1-7알카노일기」란, 탄소수 1 내지 7개의 알카노일기를 의미한다. C1-7알카노일기는 직쇄여도 되고, 분지쇄여도 된다. C1-7알카노일기로서는, 포르밀기, 아세틸기, 프로피오닐기, 부티릴기, 이소부티릴기, 펜타노일기, 헥사노일기, 헵타노일기를 들 수 있다. 「C1-6알콕시-카르보닐기」란, C1-6알콕시기를 갖는 카르보닐기를 의미한다. 「C1-6알콕시기」란, 탄소수 1 내지 6개의 알콕시기를 의미한다. C1-6알콕시기는 직쇄여도 되고, 분지쇄여도 된다. C1-6알콕시-카르보닐기로서는, 메톡시카르보닐기, 에톡시카르보닐기, 프로폭시카르보닐기, 이소프로폭시카르보닐기, 부톡시카르보닐기, 이소부톡시카르보닐기, sec-부톡시카르보닐기, tert-부톡시카르보닐기를 들 수 있다. C1-6알콕시-카르보닐기로서는, 특히 메톡시카르보닐기나 에톡시카르보닐기를 들 수 있다. C6-12아릴기(「R2」의 C6-12아릴기도 포함함), 방향족 복소환기, C3-10시클로알킬기, C3-10시클로알케닐기, 및 비방향족 복소환기가 갖고 있어도 되는 C1-7아실기로서는, 특히 C1-7알카노일기, 벤조일기, C1-6알콕시-카르보닐기, 페녹시카르보닐기를 들 수 있다. 「R2」의 C1-6알킬기가 갖고 있어도 되는 C1-7아실기로서는, 특히 카르복실기, 카르복사미드기, C1-6알콕시-카르보닐기를 들 수 있다. 「R2」의 C1-6알킬기가 갖고 있어도 되는 C1-7아실기로서, 또한 특히는 카르복실기, 카르복사미드기, 메톡시카르보닐기, 에톡시카르보닐기를 들 수 있다. 「R2」의 C1-6알킬기는, 예를 들어 알킬기의 말단의 수소 원자의 하나가 C1-7아실기로 치환되어 있어도 된다. 또한, 「R2」의 C1-6알킬기에 관한 「알킬기의 말단의 수소 원자」란, C1 알킬기(메틸기)에 있어서는 메틸기의 수소 원자를, C2 이상의 알킬기에 있어서는 5원환과 결합되어 있지 않은 측의 말단 탄소 원자에 결합된 수소 원자를, 각각 의미한다.
「C1-7알킬아미노기」란, C1-7알킬기로 모노치환 또는 디치환된 아미노기를 의미한다. C1-7알킬아미노기로서는, 메틸아미노기, 에틸아미노기, 프로필아미노기, 이소프로필아미노기, 부틸아미노기, 이소부틸아미노기, tert-부틸아미노기, 펜틸아미노기, 이소펜틸아미노기, 네오펜틸아미노기, tert-펜틸아미노기, 헥실아미노기, 헵틸아미노기를 들 수 있다.
「방향족 복소환기」란, 탄소 원자와, 질소 원자, 산소 원자 및 황 원자에서 선택되는 1 내지 4개의 헤테로 원자를 갖는, 환을 구성하는 원자의 수가 5 내지 14원인 방향족성의 환상기를 의미한다. 방향족 복소환기는 단환식이어도 되고, 축합환식이어도 된다. 방향족 복소환기는 특히 5 또는 6원의 단환식 방향족 복소환기이면 된다.
단환식 방향족 복소환기로서는, 티에닐기(티오펜-2-일기, 티오펜-3-일기 등), 푸릴기(푸란-2-일기, 푸란-3-일기 등), 피롤릴기(2-피롤-1-일기, 3-피롤-3-일기 등), 옥사졸릴기(옥사졸-2-일기, 옥사졸-4-일기, 옥사졸-5-일기 등), 이소옥사졸릴기(이소옥사졸-3-일기, 이소옥사졸-4-일기, 이소옥사졸-5-일기 등), 티아졸릴기(티아졸-2-일기, 티아졸-4-일기, 티아졸-5-일기 등), 이소티아졸릴기(이소티아졸-3-일기, 이소티아졸-4-일기, 이소티아졸-5-일기 등), 이미다졸릴기(이미다졸-1-일기, 1H-이미다졸-2-일기, 1H-이미다졸-4-일기 등), 피라졸릴기(1H-피라졸-1-일기, 1H-피라졸-3-일기, 2H-피라졸-3-일기, 1H-피라졸-4-일기 등), 옥사디아졸릴기(1,3,4-옥사디아졸-2-일기, 1,2,3-옥사디아졸-4-일기, 1,2,3-옥사디아졸-5-일기, 1,2,4-옥사디아졸-3-일기, 1,2,4-옥사디아졸-5-일기, 1,2,5-옥사디아졸-3-일기 등), 티아디아졸릴기(1,3,4-티아디아졸-2-일기, 1,2,3-티아디아졸-4-일기, 1,2,3-티아디아졸-5-일기, 1,2,4-티아디아졸-3-일기, 1,2,4-티아디아졸-5-일기, 1,2,5-티아디아졸-3-일기 등), 트리아졸릴기(1,2,4-트리아졸-3-일기, 1,2,4-트리아졸-1-일기, 1,2,3-트리아졸-1-일기, 1,2,3-트리아졸-2-일기, 1,3,4-트리아졸-1-일기 등), 테트라졸릴기(테트라졸-1-일기, 테트라졸-2-일기, 1H-테트라졸-5-일기, 2H-테트라졸-5-일기 등), 피리딜기(피리딘-2-일기, 피리딘-3-일기, 피리딘-4-일기 등), 피리미디닐기(피리미딘-2-일기, 피리미딘-4-일기, 피리미딘-5-일기 등), 피리다지닐기(피리다진-3-일기, 피리다진-4-일기 등), 피라지닐기(피라진-2-일기 등), 트리아지닐기(1,3,5-트리아지닌-2-일기 등)를 들 수 있다.
축합환식 방향족 복소환기로서는, 퀴놀릴기, 이소퀴놀릴기, 퀴나졸리닐기, 퀴녹살릴기, 프탈라지닐기, 신놀리닐기, 나프티리디닐기, 인돌릴기, 벤조이미다졸릴기, 인돌리닐기, 벤조푸라닐기, 벤조티에닐기, 벤조옥사졸릴기, 벤조티아졸릴기, 벤조디옥시닐기, 벤조티아졸릴기, 테트라히드로퀴놀릴기, 디히드로벤조푸라닐기, 디히드로벤조티에닐기, 디히드로벤조디옥시닐기, 인데노티아졸릴기, 테트라히드로벤조티아졸릴기, 5,7-디히드로피롤로[3,4-d]피리미디닐기, 6,7-디히드로-5H-시클로펜타피리미디닐기, 이미다조[2,1-b]티아졸릴기, 프테리디닐기, 푸리닐기를 들 수 있다.
「C3-10시클로알킬기」란, 탄소수 3 내지 10개의 환상의 포화 탄화수소기를 의미한다. C3-10시클로알킬기로서는, 시클로프로필기, 시클로부틸기, 시클로펜틸기, 시클로헥실기, 시클로헵틸기, 시클로옥틸기를 들 수 있다.
「C3-10시클로알케닐기」란, 탄소수 3 내지 10개의, 1개 이상의 이중 결합을 포함하는 환상의 부분 불포화 탄화수소기를 의미한다. C3-10시클로알케닐기로서는, 시클로프로페닐기, 시클로부테닐기, 시클로펜테닐기, 시클로헥세닐기, 시클로헵테닐기, 시클로옥테닐기를 들 수 있다.
「비방향족 복소환기」란, 탄소 원자와, 질소 원자, 산소 원자 및 황 원자에서 선택되는 1 내지 4개의 헤테로 원자를 갖는, 환을 구성하는 원자의 수가 3 내지 14원인 비방향족성의 환상기를 의미한다. 비방향족 복소환기는 단환식이어도 되고 축합환식이어도 된다. 비방향족 복소환기는 특히 3 내지 8원의 단환식 비방향족 복소환기이면 된다. 비방향족 복소환기는 또한 특히는 5 또는 6원의 단환식 비방향족 복소환기이면 된다. 비방향족 복소환기가 헤테로 원자로서 황 원자를 포함하는 경우, 해당 황 원자는 모노옥시드화 또는 디옥시드화되어 있어도 된다.
단환식 비방향족 복소환기로서는, 옥시라닐기, 티올라닐기, 아지리디닐기, 아제티디닐기, 옥세타닐기, 피롤리디닐기, 테트라히드로푸라닐기, 테트라히드로티에닐기, 옥사졸리닐기, 옥사졸리디닐기, 이소옥사졸리닐기, 이소옥사졸리디닐기, 티아졸리닐기, 티아졸리디닐기, 이소티아졸리닐기, 이소티아졸리디닐기, 이미다졸리닐기, 이미다졸리디닐기, 피라졸리닐기, 피라졸리디닐기, 피페리디닐기, 피페리디노기, 피라닐기, 테트라히드로피라닐기, 모르폴리닐기, 모르폴리노기, 티오모르폴리닐기, 티오모르폴리노기, 피페라지닐기, 헥사히드로-1,3-옥사지닐기를 들 수 있다.
축합환식 비방향족 복소환기로서는, 이소크로마닐기, 디히드로벤조피라닐기, 이소크로메닐기, 크로메닐기(2H-크로메닐기, 4H-크로메닐기 등), 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀릴기, 1,2,3,4-테트라히드로퀴놀릴기, 2,3-디히드로벤조푸라닐기, 벤조 [1,3]디옥솔릴기를 들 수 있다.
치환기를 갖고 있어도 되는 C6-12아릴기(「R2」의 치환기를 갖고 있어도 되는 C6-12아릴기도 포함함)로서, 구체적으로는 수산기 및 C1-7알콕시기(메톡시기, 에톡시기 등)에서 선택되는 동일하거나 또는 다른 1 내지 5개(1 내지 3개 등)의 치환기로 치환되어 있어도 되는 C6-12아릴기(페닐기, 나프틸기 등)를 들 수 있다. 치환기를 갖고 있어도 되는 C6-12아릴기(「R2」의 치환기를 갖고 있어도 되는 C6-12아릴기도 포함함)로서, 보다 구체적으로는, 4-히드록시페닐기, 4-메톡시페닐기, 3,4-디히드록시페닐기, 4-히드록시-3-메톡시페닐기, 3-히드록시-4-메톡시페닐기, 2,4-디히드록시페닐기를 들 수 있다. 치환기를 갖고 있어도 되는 C6-12아릴기(「R2」의 치환기를 갖고 있어도 되는 C6-12아릴기도 포함함)로서는, 특히 4-히드록시페닐기나3,4-디히드록시페닐기를 들 수 있다.
치환기를 갖고 있어도 되는 방향족 복소환기로서, 구체적으로는 피리딜기(피리딘-2-일기, 피리딘-3-일기, 피리딘-4-일기 등)를 들 수 있다.
치환기를 갖고 있어도 되는 C3-10시클로알킬기로서, 구체적으로는 시클로헥실기, 시클로펜틸기를 들 수 있다.
치환기를 갖고 있어도 되는 C3-10시클로알케닐기로서, 구체적으로는 바람직하게는 시클로헥세닐기를 들 수 있다.
치환기를 갖고 있어도 되는 비방향족 복소환기로서, 구체적으로는 수산기 및 옥소기에서 선택되는 동일하거나 또는 다른 1 내지 5개(1 내지 3개 등)의 치환기로 치환되어 있어도 되는 비방향족 복소환기(피라닐기, 테트라히드로피라닐기 등)를 들 수 있다. 치환기를 갖고 있어도 되는 비방향족 복소환기로서, 보다 구체적으로는, 테트라히드로-2H-피란-2-일기, 5-히드록시-4-옥소-4H-피란-2-일기를 들 수 있다. 치환기를 갖고 있어도 되는 비방향족 복소환기로서는, 특히 5-히드록시-4-옥소-4H-피란-2-일기를 들 수 있다.
「R1」의 치환기를 갖고 있어도 되는 C1-22알킬기로서, 구체적으로는 치환기를 갖고 있어도 되는 C6-12아릴기로 치환되어 있어도 되는 C1-12알킬기나 치환기를 갖고 있어도 되는 비방향족 복소환기로 치환되어 있어도 되는 C1-12알킬기를 들 수 있다. 「R1」의 치환기를 갖고 있어도 되는 C1-22알킬기로서, 보다 구체적으로는, C1-12알킬기(바람직하게는, C1-6알킬기), 치환기를 갖고 있어도 되는 C6-12아릴기로 치환된 C1-6알킬기, 치환기를 갖고 있어도 되는 비방향족 복소환기로 치환된 C1-6알킬기를 들 수 있다. 「R1」의 치환기를 갖고 있어도 되는 C1-22알킬기로서, 더욱 구체적으로는 메틸기, 에틸기, 프로필, 이소프로필기, 부틸기, 헥실기, 옥틸기, 도데실기, 4-히드록시페닐에틸기(2-(4-히드록시페닐)에틸기 등), 3,4-디히드록시페닐에틸기(2-(3,4-디히드록시페닐)에틸기 등), (5-히드록시-4-옥소-4H-피란-2-일)메틸기를 들 수 있다.
「R2」의 치환기를 갖고 있어도 되는 C1-6알킬기로서, 구체적으로는 치환기를 갖고 있어도 되는 C6-12아릴기로 치환되어 있어도 되는 C1-6알킬기, 치환기를 갖고 있어도 되는 비방향족 복소환기로 치환되어 있어도 되는 C1-6알킬기, C1-7아실기로 치환되어 있어도 되는 C1-6알킬기를 들 수 있다. 「R2」의 치환기를 갖고 있어도 되는 C1-6알킬기로서, 보다 구체적으로는, C1-6알킬기, 치환기를 갖고 있어도 되는 C6-12아릴기로 치환된 C1-6알킬기, 치환기를 갖고 있어도 되는 비방향족 복소환기로 치환된 C1-6알킬기, C1-7아실기로 치환된 C1-6알킬기를 들 수 있다. 「R2」의 치환기를 갖고 있어도 되는 C1-6알킬기로서, 더욱 구체적으로는 메틸기, 에틸기, 이소프로필기, 헥실기, 4-히드록시페닐메틸기, 4-히드록시페닐에틸기(2-(4-히드록시페닐)에틸기 등), 3,4-디히드록시페닐에틸기(2-(3,4-디히드록시페닐)에틸기 등), (5-히드록시-4-옥소-4H-피란-2-일)메틸기, 카르복실기로 치환된 C1-6알킬기(2-카르복시에틸기 등), 카르복사미드기로 치환된 C1-6알킬기(2-카르복사미드에틸기 등), 메톡시카르보닐기로 치환된 C1-6알킬기(2-메톡시카르보닐에틸기 등), 에톡시카르보닐기로 치환된 C1-6알킬기(2-에톡시카르보닐에틸기 등)를 들 수 있다. 「R2」의 치환기를 갖고 있어도 되는 C1-6알킬기로서는, 특히 메틸기나 4-히드록시페닐메틸기를 들 수 있다. 「R2」의 치환기를 갖고 있어도 되는 C1-6알킬기로서, 더욱 특히는 메틸기를 들 수 있다.
일 양태에 있어서, 「R2」의 치환기를 갖고 있어도 되는 C1-6알킬기는 치환기를 갖고 있어도 되는 C1-6알킬기이며, 이소부틸기 이외의 것이어도 된다. 또한, 일 양태에 있어서, 「R2」의 치환기를 갖고 있어도 되는 C1-6알킬기는 치환기를 갖고 있어도 되는 C1-6알킬기이며, 치환기를 갖고 있어도 되는 이소부틸기 이외의 것이어도 된다. 「R2」의 치환기를 갖고 있어도 되는 C1-6알킬기는, 특히 치환기를 갖고 있어도 되는 직쇄 C1-6알킬기이면 된다.
「R2」의 치환기를 갖고 있어도 되는 직쇄 C1-6알킬기로서는, 상기 예시한 「R2」의 치환기를 갖고 있어도 되는 C1-6알킬기이며, C1-6알킬기가 직쇄 C1-6알킬기인 것을 들 수 있다. 즉, 「R2」의 치환기를 갖고 있어도 되는 직쇄 C1-6알킬기로서, 구체적으로는 치환기를 갖고 있어도 되는 C6-12아릴기로 치환되어 있어도 되는 직쇄 C1-6알킬기, 치환기를 갖고 있어도 되는 비방향족 복소환기로 치환되어 있어도 되는 직쇄 C1-6알킬기, C1-7아실기로 치환되어 있어도 되는 직쇄 C1-6알킬기를 들 수 있다. 「R2」의 치환기를 갖고 있어도 되는 직쇄 C1-6알킬기로서, 보다 구체적으로는 직쇄 C1-6알킬기, 치환기를 갖고 있어도 되는 C6-12아릴기로 치환된 직쇄 C1-6알킬기, 치환기를 갖고 있어도 되는 비방향족 복소환기로 치환된 직쇄 C1-6알킬기, C1-7아실기로 치환된 직쇄 C1-6알킬기를 들 수 있다. 「R2」의 치환기를 갖고 있어도 되는 직쇄 C1-6알킬기로서, 더욱 구체적으로는 메틸기, 에틸기, 헥실기, 4-히드록시페닐메틸기, 4-히드록시페닐에틸기(2-(4-히드록시페닐)에틸기 등), 3,4-디히드록시페닐에틸기(2-(3,4-디히드록시페닐)에틸기 등), (5-히드록시-4-옥소-4H-피란-2-일)메틸기, 카르복실기로 치환된 직쇄 C1-6알킬기(2-카르복시에틸기 등), 카르복사미드기로 치환된 직쇄 C1-6알킬기(2-카르복사미드에틸기 등), 메톡시카르보닐기로 치환된 직쇄 C1-6알킬기(2-메톡시카르보닐에틸기 등), 에톡시카르보닐기로 치환된 직쇄 C1-6알킬기(2-에톡시카르보닐에틸기 등)를 들 수 있다. 「R2」의 치환기를 갖고 있어도 되는 직쇄 C1-6알킬기로서는, 특히 메틸기나 4-히드록시페닐메틸기를 들 수 있다. 「R2」의 치환기를 갖고 있어도 되는 직쇄 C1-6알킬기로서, 더욱 특히는 메틸기를 들 수 있다.
유효 성분은, 예를 들어 2R체여도 되고, 2S체여도 되고, 그들의 조합(즉, 2R체와 2S체의 디아스테레오머 혼합물)이어도 된다. 화합물명에 있어서의 「2RS」의 표기는, 당해 화합물이 2R체와 2S체의 조합(즉, 2R체와 2S체의 디아스테레오머 혼합물)인 것을 의미한다. 디아스테레오머 혼합물에 있어서의 2R체와 2S체의 비율은, 특별히 제한되지 않는다. 디아스테레오머 혼합물에 있어서의 2R체 또는 2S체의 비율은, 예를 들어 2R체와 2S체의 총량에 대하여, 몰비로, 1％ 이상, 3％ 이상, 5％ 이상, 10％ 이상, 20％ 이상, 30％ 이상, 40％ 이상, 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상 또는 80％ 이상이어도 되고, 99％ 이하, 97％ 이하, 95％ 이하, 90％ 이하, 80％ 이하, 70％ 이하, 60％ 이하, 50％ 이하, 40％ 이하, 30％ 이하 또는 20％ 이하여도 되고, 그들의 모순되지 않는 조합이어도 된다. 디아스테레오머 혼합물에 있어서의 2R체 또는 2S체의 비율은, 구체적으로는 예를 들어 2R체와 2S체의 총량에 대하여, 몰비로, 1 내지 99％, 10 내지 90％, 20 내지 80％, 30 내지 70％ 또는 40 내지 60％여도 된다. 또한, 유효 성분으로서 2R체 또는 2S체를 선택한 경우, 유효 성분으로서 2R체 또는 2S체가 사용되는 것으로 충분하고, 또한 2S체 또는 2R체가 병용되는 것을 막는 것은 아니다.
유효 성분으로서, 구체적으로는 (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-에틸에스테르((2RS,4R)-2-methyl-2,4-thiazolidinedicarboxylic acid 2-ethyl ester), (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-메틸에스테르, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-i-프로필에스테르, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-n-부틸에스테르, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-t-부틸에스테르, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-n-옥틸에스테르, (2RS,4R)-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-에틸에스테르, (2RS,4R)-2-(4-히드록시페닐)메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-메틸에스테르, 그리고 그들의 2R체 및 2S체를 들 수 있다. 유효 성분으로서는, 특히 (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-에틸에스테르, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-메틸에스테르, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-i-프로필에스테르, (2RS,4R)-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-에틸에스테르, (2RS,4R)-2-(4-히드록시페닐)메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-메틸에스테르, 그리고 그들의 2R체 및 2S체를 들 수 있다. 유효 성분으로서, 더욱 특히는 (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-에틸에스테르 그리고 그 2R체 및 2S체를 들 수 있다.
유효 성분은 프리체로서 사용되어도 되고, 염으로서 사용되어도 되고, 그들의 조합으로서 사용되어도 된다. 즉, 「유효 성분」이라는 용어는, 특기하지 않는 한, 프리체의 유효 성분, 혹은 그의 염 또는 그들의 조합을 의미해도 된다. 바꾸어 말하면, 「식 (I)로 나타내지는 화합물」이란, 특기하지 않는 한, 프리체의 식 (I)로 나타내지는 화합물, 혹은 그의 염 또는 그들의 조합을 의미해도 된다. 염은, 동물 세포의 배양에 이용할 수 있는 것이면, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 카르복실기 등의 산성기에 대한 염으로서는, 암모늄염, 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속과의 염, 칼슘, 마그네슘 등의 알칼리 토류 금속과의 염, 알루미늄염, 아연염, 트리에틸아민, 에탄올아민, 모르폴린, 피롤리딘, 피페리딘, 피페라진, 디시클로헥실아민 등의 유기 아민과의 염, 아르기닌, 리신 등의 염기성 아미노산과의 염을 들 수 있다. 또한, 아미노기 등의 염기성기에 대한 염으로서는, 염산, 황산, 인산, 질산, 브롬화수소산 등의 무기산과의 염, 아세트산, 시트르산, 벤조산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 숙신산, 탄닌산, 부티르산, 히벤즈산, 파모산, 에난트산, 데칸산, 테오클산, 살리실산, 락트산, 옥살산, 만델산, 말산 등의 유기 카르복실산과의 염, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 등의 유기 술폰산과의 염을 들 수 있다. 염으로서는, 1종의 염을 사용해도 되고, 2종 또는 그 이상의 염을 조합하여 사용해도 된다. 유효 성분(예를 들어, 프리체나 염)은 특기하지 않는 한, 비수화물 및 수화물을 포함해도 된다.
유효 성분은, 예를 들어 배지 중에서의 안정성이 높은 것이어도 된다. 「배지 중에서의 안정성이 높은」이란, 예를 들어 유효 성분을 58mM 함유하는 배지를 조제하고, 동 배지를 5℃, 차광 조건에서 보관했을 때, 15일 이상, 20일 이상, 25일 이상 또는 30일 이상 결정의 석출이 눈으로 봐서 확인되지 않는 것을 의미해도 된다.
유효 성분으로서는, 시판품을 사용해도 되고, 적절히 제조하여 취득한 것을 사용해도 된다. 유효 성분의 제조 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 공지된 방법을 이용할 수 있다. 유효 성분은, 예를 들어 화학 합성에 의해 제조할 수 있다(일본 특허 제5439849호).
유효 성분(화합물 I)은 구체적으로는, 예를 들어 하기 반응에 의해, 화합물 II(피루브산 유도체)와 화합물 III(L-시스테인)으로부터 용이하게 제조할 수 있다. 화합물 II의 구조식을 「식 (II)」라고도 한다. 바꾸어 말하면, 화합물 II는 식 (II)로 나타내지는 피루브산 유도체이다. 화합물 I 및 II에 있어서의 「R1」 및 「R2」는 각각, 상기 식 (I)에 있어서의 「R1」 및 「R2」와 동일하다. 유효 성분의 제조에 있어서, 염을 형성할 수 있는 성분은 모두, 프리체로서 사용되어도 되고, 염으로서 사용되어도 되고, 그들의 조합으로서 사용되어도 된다. 즉, 화합물 II가 염을 형성할 수 있을 경우, 「화합물 II」 또는 「피루브산 유도체」라는 용어는, 특기하지 않는 한, 프리체의 화합물 II, 혹은 그의 염 또는 그들의 조합을 의미해도 된다. 또한, 「화합물 III」 또는 「L-시스테인」이라는 용어는, 특기하지 않는 한, 프리체의 화합물 III, 혹은 그의 염 또는 그들의 조합을 의미해도 된다. 염에 대하여는, 유효 성분의 염에 관한 기재를 준용할 수 있다. 또한, 이들 성분(예를 들어, 프리체나 염)은 모두, 특기하지 않는 한, 비수화물 및 수화물을 포함해도 된다. 화합물 II와 화합물 III의 반응은, 예를 들어 물, 수성 완충액, 알코올 또는 함수 알코올 등의 적당한 용매 중에서 실시할 수 있다. 생성된 유효 성분(화합물 I)은, 예를 들어 감압 농축, 용매 추출, 정석, 전용(轉溶), 또는 크로마토그래피 등의 공지된 분리 수단에 의해 단리 정제할 수 있다. 생성된 유효 성분(화합물 I)의 구조는, 예를 들어 NMR 등의 공지된 분석 수단에 의해 확인할 수 있다.
Figure pct00002
일 양태에 있어서, 화합물 II와 화합물 III의 반응을 함수 매체 중에서 실시함으로써 해당 매체 중에서 유효 성분의 결정을 생성할 수 있고, 해당 결정을 회수함으로써 유효 성분을 취득할 수 있다.
즉, 본 발명은, 유효 성분의 제조 방법이며,
화합물 II와 화합물 III를 함수 매체 중에서 반응시키고, 이로써 유효 성분의 결정을 생성하는 것; 및
상기 결정을 회수하는 것
을 포함하는, 방법을 제공한다. 이하, 동 방법을 「직접 정석법」이라고도 한다.
직접 정석법에 의해 유효 성분을 제조하는 경우, 「R1」은 특히 C1-C6알킬기여도 된다. 직접 정석법에 의해 유효 성분을 제조하는 경우, 「R1」은 더욱 특히는 메틸기 또는 에틸기여도 된다. 직접 정석법에 의해 유효 성분을 제조하는 경우, 「R2」는 특히 메틸기여도 된다.
화합물 II와 화합물 III간의 반응은, 그들 화합물을 함수 매체 중에서 공존시킴으로써 진행시킬 수 있다. 예를 들어, 화합물 III를 함수 매체 중에 용해 또는 현탁시키고, 얻어진 용액 또는 현탁액에 화합물 II를 적하해도 된다. 화합물 II와 화합물 III의 사용량은 적절히 설정할 수 있다. 화합물 II의 사용량은, 예를 들어 화합물 III의 사용량 1몰에 대하여 0.5 내지 2몰이어도 되고, 1 내지 2몰이어도 된다. 함수 매체는 물을 함유하는 매체이며, 해당 매체 중에서 유효 성분의 결정이 생성되는(즉, 생성된 유효 성분이 해당 매체 중에서 결정화되는) 것이면 특별히 제한되지 않는다. 함수 매체는 물 그 자체여도 되고, 물과 다른 성분의 혼합물이어도 된다. 그러한 혼합물로서는, 수성 완충액이나 함수 알코올을 들 수 있다. 또한, 함수 매체는 pH가 조정되어 있어도 된다. pH의 조정에는, 예를 들어 산 및/또는 알칼리를 사용할 수 있다. 함수 매체에 있어서의 물의 함유량은, 예를 들어 70％(w/w) 이상, 80％(w/w) 이상, 90％(w/w) 이상, 95％(w/w) 이상, 97％(w/w) 이상 또는 99％(w/w) 이상이어도 된다. 반응 pH는, 예를 들어 5 내지 9여도 되고, 6 내지 8이어도 된다. 반응 온도는, 예를 들어 0℃ 이상, 10℃ 이상, 20℃ 이상, 30℃ 이상, 40℃ 이상 또는 50℃ 이상이어도 되고, 80℃ 이하, 70℃ 이하, 60℃ 이하, 50℃ 이하, 40℃ 이하 또는 30℃ 이하여도 되고, 그들의 모순되지 않는 조합이어도 된다. 반응 온도는, 구체적으로는 예를 들어 10℃ 내지 40℃여도 되고, 실온(예를 들어 약 25℃)이어도 된다. 반응 시간은, 예를 들어 1시간 이상, 5시간 이상, 10시간 이상, 15시간 이상, 20시간 이상 또는 25시간 이상이어도 되고, 36시간 이하, 30시간 이하, 24시간 이하, 20시간 이하 또는 15시간 이하여도 되고, 그들의 모순되지 않는 조합이어도 된다. 반응 시간은, 구체적으로는 예를 들어 1 내지 24시간이어도 된다. 반응은, 예를 들어 교반 또는 진탕하면서 실시해도 된다. 이와 같이 하여 화합물 II와 화합물 III의 반응을 실시함으로써, 함수 매체 중에 유효 성분의 결정이 생성된다.
유효 성분의 결정 회수는, 예를 들어 여과나 원심 분리 등의 공지된 고액 분리 수단에 의해 실시할 수 있다.
직접 정석법에 의해, 예를 들어 2S체 또는 2R체를 주로 포함하는 유효 성분이 얻어져도 된다. 직접 정석법에 의해, 특히 2S체를 주로 포함하는 유효 성분이 얻어져도 된다. 직접 정석법에 의해 얻어지는 유효 성분에 있어서의 2S체 또는 2R체의 비율은, 예를 들어 몰비로, 60％ 이상, 70％ 이상 또는 80％ 이상이어도 된다.
유효 성분으로서 2종 또는 그 이상의 성분이 선택되는 경우, 유효 성분의 「양」 또는 「농도」란, 특기하지 않는 한, 선택된 성분의 총량 또는 총 농도를 의미해도 된다.
<2> 본 발명의 방법
본 발명의 방법은 동물 세포의 배양 방법이며, 동물 세포를 배지에서 배양하는 것을 포함하고, 상기 배양이 유효 성분의 존재 하에서 실시되는 방법이다.
일 양태에 있어서는, 동물 세포의 배양에 의해 목적 물질이 제조되어도 된다. 즉, 동물 세포가 목적 물질 생산능을 갖는 경우, 동 세포의 배양에 의해 목적 물질을 제조할 수 있다. 즉, 본 발명의 방법의 일 양태는 목적 물질의 제조 방법이며, 목적 물질 생산능을 갖는 동물 세포를 배지에서 배양하는 것, 및 목적 물질을 회수하는 것을 포함하고, 상기 배양이 유효 성분의 존재 하에서 실시되는 방법이어도 된다.
목적 물질은, 동물 세포에 의해 제조할 수 있는 것이면, 특별히 제한되지 않는다. 목적 물질로서는, 단백질을 들 수 있다. 목적 물질로서 제조되는 단백질을, 「목적 단백질」이라고도 한다.
동물 세포는 특별히 제한되지 않는다. 동물 세포는, 예를 들어 동물 세포의 용도 등의 여러 조건에 따라서 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 동물 세포를 목적 단백질의 제조에 이용하는 경우, 동물 세포는 목적 단백질을 발현할 수 있는 것이면, 특별히 제한되지 않는다. 동물 세포를 「숙주」, 「발현 숙주」 또는 「숙주 세포」라고도 한다. 동물로서는, 포유류, 조류, 양서류를 들 수 있다. 동물로서는, 특히 포유류를 들 수 있다. 포유류로서는, 설치류나 영장류를 들 수 있다. 설치류로서는, 햄스터, 마우스, 래트, 모르모트를 들 수 있다. 햄스터로서는, 차이니즈 햄스터를 들 수 있다. 영장류로서는, 인간, 원숭이, 침팬지를 들 수 있다. 원숭이로서는, 아프리카 녹색 원숭이를 들 수 있다. 조류로서는, 닭을 들 수 있다. 양서류로서는, 아프리카 발톱개구리를 들 수 있다. 또한, 동물 세포가 유래하는 조직 또는 세포는, 특별히 제한되지 않는다. 동물 세포가 유래하는 조직 또는 세포로서는, 난소, 신장, 부신, 혀 상피, 코 상피, 송과체, 갑상선, 멜라노사이트를 들 수 있다. 차이니즈 햄스터의 세포로서는, 차이니즈 햄스터 난소 유래 세포주(CHO)를 들 수 있다. CHO로서, 구체적으로는 CHO-DG44, CHO-K1, CHO DUX(DHFR-), CHO-S, CHO-MK를 들 수 있다. 인간의 세포로서는, 인간 태아 신장 세포 유래 세포주(HEK)를 들 수 있다. HEK로서, 구체적으로는 HEK293이나 HEK293T를 들 수 있다. 아프리카 녹색 원숭이의 세포로서는, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 유래 세포주(COS)를 들 수 있다. COS로서, 구체적으로는 COS-1을 들 수 있다. 아프리카 발톱개구리의 세포로서, 구체적으로는 아프리카 발톱개구리 난모 세포를 들 수 있다.
「목적 물질 생산능을 갖는 동물 세포」란, 목적 물질을 생산하는 능력을 갖는 동물 세포를 의미한다. 「목적 물질 생산능을 갖는 동물 세포」란, 구체적으로는 배지에서 배양했을 때, 목적 물질을 생성(예를 들어, 목적 단백질을 발현)하고, 회수할 수 있을 정도로 배양물 중에 축적되는 능력을 갖는 동물 세포를 의미해도 된다. 「배양물 중에의 축적」이란, 구체적으로는 배지 중, 세포 표층, 세포 내 또는 그들의 조합에의 축적을 의미해도 된다. 또한, 목적 물질이 세포 외(예를 들어, 배지 중 또는 세포 표층)에 축적되는 경우를, 목적 물질의 「분비」 또는 「분비 생산」이라고도 한다. 즉, 동물 세포는 목적 물질의 분비 생산능(목적 물질을 분비 생산하는 능력)을 갖고 있어도 된다. 목적 물질의 축적량은, 예를 들어 배양물 중에의 축적량으로서, 10μg/L 이상, 1mg/L 이상, 100mg/L 이상 또는 1g/L 이상이어도 된다. 동물 세포는 1종의 목적 물질의 생산능을 갖고 있어도 되고, 2종 또는 그 이상의 목적 물질의 생산능을 갖고 있어도 된다.
동물 세포는 본래적으로 목적 물질 생산능을 갖는 것이어도 되고, 목적 물질 생산능을 갖도록 개변된 것이어도 된다. 또한, 동물 세포는 본래적으로 갖는 목적 물질 생산능이 증강되도록 개변된 것이어도 된다. 목적 물질 생산능을 갖는 동물 세포는, 예를 들어 상기와 같은 동물 세포에 목적 물질 생산능을 부여함으로써, 또는 상기와 같은 동물 세포의 목적 물질 생산능을 증강시킴으로써, 취득할 수 있다. 예를 들어, 목적 단백질 생산능은 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 도입에 의해 부여 또는 증강시킬 수 있다. 목적 단백질을 코딩하는 유전자를, 「목적 단백질 유전자」라고도 한다.
목적 단백질은, 동물 세포를 숙주로 하여 발현 가능한 것이면, 특별히 제한되지 않는다. 단백질은 숙주 유래의 단백질이어도 되고, 이종 단백질(heterologous protein)이어도 된다. 「이종 단백질(heterologous protein)」이란, 동 단백질을 생산하는 숙주(즉, 목적 단백질 생산능을 갖는 동물 세포)에 있어서 외래성(exogenous)인 단백질을 말한다. 목적 단백질은, 예를 들어 천연에 존재하는 단백질이어도 되고, 그들을 개변한 단백질이어도 되고, 인공적으로 아미노산 서열을 디자인한 단백질이어도 된다. 목적 단백질은, 예를 들어 미생물 유래의 단백질이어도 되고, 식물 유래의 단백질이어도 되고, 동물 유래의 단백질이어도 되고, 바이러스 유래의 단백질이어도 된다. 목적 단백질은 특히 인간 유래의 단백질이어도 된다. 목적 단백질은 단량체 단백질이어도 되고, 다량체 단백질이어도 된다. 목적 단백질은 분비성 단백질이어도 되고, 비분비성 단백질이어도 된다. 또한, 「단백질」에는, 올리고펩티드나 폴리펩티드 등의 펩티드라고 불리는 것도 포함된다.
목적 단백질로서, 구체적으로는 효소, 생리 활성 단백질, 리셉터 단백질, 항원 단백질, 기타 단백질을 들 수 있다.
효소로서는, 셀룰라아제, 트랜스글루타미나아제, 프로테인 글루타미나아제, 이소말트 덱스트라나아제, 프로테아제, 엔도펩티다아제, 엑소펩티다아제, 아미노펩티다아제, 카르복시펩티다아제, 콜라게나아제 및 키티나아제를 들 수 있다.
생리 활성 단백질로서는, 성장 인자(증식 인자), 호르몬, 사이토카인, 항체 관련 분자를 들 수 있다.
성장 인자(증식 인자)로서는, 상피 성장 인자(Epidermal growth factor; EGF), 인슐린과 같은 성장 인자-1(Insulin-like growth factor-1; IGF-1), 트랜스 포밍 성장 인자(Transforming growth factor; TGF), 신경 성장 인자(Nerve growth factor; NGF), 뇌 유래 신경 영양 인자(Brain-derived neurotrophic factor; BDNF), 혈관 내피 세포 증식 인자(Vascular endothelial growth factor; VEGF), 과립구 콜로니 자극 인자(Granulocyte-colony stimulating factor; G-CSF), 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자(Granulocyte-macrophage-colony stimulating factor; GM-CSF), 혈소판 유래 성장 인자(Platelet-derived growth factor; PDGF), 에리트로포이에틴(Erythropoietin; EPO), 트롬보포이에틴(Thrombopoietin; TPO), 산성 섬유아세포 증식 인자(Acidic fibroblast growth factor; aFGF 또는 FGF1), 염기성 섬유아세포 증식 인자(Basic fibroblast growth factor; bFGF 또는 FGF2), 각질 세포 증식 인자(Keratinocyte growth factor; KGF-1 또는 FGF7이나, KGF-2 또는 FGF10), 간세포 증식 인자(Hepatocyte growth factor; HGF), 줄기 세포 인자(Stem Cell Factor; SCF), 액티빈(Activin)을 들 수 있다. 액티빈으로서는, 액티빈 A, C, E를 들 수 있다.
호르몬으로서는, 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴(somatostatin), 인간 성장 호르몬(human growth hormone; hGH), 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone; PTH), 칼시토닌(calcitonin), 엑세나티드(exenatide)를 들 수 있다.
사이토카인으로서는, 인터류킨, 인터페론, 종양 괴사 인자(Tumor Necrosis Factor; TNF)를 들 수 있다.
또한, 생리 활성 단백질은 단백질 전체여도 되고, 그 일부여도 된다. 단백질의 일부로서는, 예를 들어 생리 활성을 갖는 부분을 들 수 있다. 생리 활성을 갖는 부분으로서, 구체적으로는 예를 들어 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone; PTH)의 성숙체의 N 말단 34아미노산 잔기를 포함하는 생리 활성 펩티드 테리파라티드(Teriparatide)를 들 수 있다.
「항체 관련 분자」란, 완전 항체를 구성하는 도메인에서 선택되는 단일의 도메인 또는 2 혹은 그 이상의 도메인 조합을 포함하는 분자종을 포함하는 단백질을 의미해도 된다. 완전 항체를 구성하는 도메인으로서는, 중쇄의 도메인인 VH, CH1, CH2 및 CH3, 그리고 경쇄의 도메인인 VL 및 CL을 들 수 있다. 항체 관련 분자는, 상술한 분자종을 포함하는 한, 단량체 단백질이어도 되고, 다량체 단백질이어도 된다. 또한, 항체 관련 분자가 다량체 단백질인 경우에는, 단일의 종류의 서브유닛을 포함하는 호모 다량체여도 되고, 2 또는 그 이상의 종류의 서브유닛을 포함하는 헤테로 다량체여도 된다. 항체 관련 분자로서, 구체적으로는 완전 항체, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fc, 중쇄(H쇄)과 경쇄(L쇄)를 포함하는 2량체, Fc 융합 단백질, 중쇄(H쇄), 경쇄(L쇄), 단쇄 Fv(scFv), sc(Fv)2, 디술피드 결합 Fv(sdFv), diabody, VHH 프래그먼트(nanobody(등록 상표))를 들 수 있다. 항체 관련 분자로서, 보다 구체적으로는, 트라스투주맙(Trastuzumab), 아달리무맙(Adalimumab), 니볼루맙(Nivolumab)을 들 수 있다.
리셉터 단백질로서는, 생리 활성 단백질이나 기타 생리 활성 물질에 대한 리셉터 단백질을 들 수 있다. 기타 생리 활성 물질로서는, 도파민 등의 신경전달 물질을 들 수 있다. 또한, 리셉터 단백질은, 대응하는 리간드가 알려져 있지 않은 오펀 수용체여도 된다.
항원 단백질은, 면역 응답을 야기할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 항원 단백질은, 예를 들어 상정되는 면역 응답의 대상에 따라서 적절히 선택할 수 있다. 항원 단백질은, 예를 들어 백신으로서 사용할 수 있다.
기타 단백질로서는, Liver-type fatty acid-binding protein(LFABP), 형광 단백질, 이뮤노글로불린 결합 단백질, 알부민, 피브로인 유사 단백질, 세포 외 단백질을 들 수 있다. 형광 단백질로서는, Green Fluorescent Protein(GFP)을 들 수 있다. 이뮤노글로불린 결합 단백질로서는, Protein A, Protein G, Protein L을 들 수 있다. 알부민으로서는, 인간 혈청 알부민을 들 수 있다. 피브로인 유사 단백질로서는, WO2017/090665나 WO2017/171001에 개시된 것을 들 수 있다.
세포 외 단백질로서는, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 콜라겐, 오스테오폰틴, 라미닌, 그들의 부분 서열을 들 수 있다. 라미닌은 α쇄, β쇄 및 γ쇄를 포함하는 헤테로 3량체 구조를 갖는 단백질이다. 라미닌으로서는, 포유류의 라미닌을 들 수 있다. 라미닌의 서브유닛쇄(즉, α쇄, β쇄 및 γ쇄)로서는, 5종의 α쇄(α1 내지 α5), 3종의 β쇄(β1 내지 β3), 3종의 γ쇄(γ1 내지 γ3)를 들 수 있다. 라미닌은 이들 서브유닛쇄의 조합에 의해 각종 아이소폼을 구성한다. 라미닌으로서, 구체적으로는 예를 들어 라미닌 111, 라미닌 121, 라미닌 211, 라미닌 213, 라미닌 221, 라미닌 311, 라미닌 321, 라미닌 332, 라미닌 411, 라미닌 421, 라미닌 423, 라미닌 511, 라미닌 521, 라미닌 523을 들 수 있다. 라미닌의 부분 서열로서는, 라미닌의 E8 단편인 라미닌 E8을 들 수 있다. 라미닌 E8은, 구체적으로는 α쇄의 E8 단편(α쇄 E8), β쇄의 E8 단편(β쇄 E8), 및 γ쇄의 E8 단편(γ쇄 E8)을 포함하는 헤테로 3량체 구조를 갖는 단백질이다. 라미닌 E8의 서브유닛쇄(즉, α쇄 E8, β쇄 E8 및 γ쇄 E8)를 총칭하고, 「E8 서브유닛쇄」라고도 한다. E8 서브유닛쇄로서는, 상기 예시한 라미닌 서브유닛쇄의 E8 단편을 들 수 있다. 라미닌 E8은, 이들 E8 서브유닛쇄의 조합에 의해 각종 아이소폼을 구성한다. 라미닌 E8로서, 구체적으로는 예를 들어 라미닌 111E8, 라미닌 121E8, 라미닌 211E8, 라미닌 221E8, 라미닌 332E8, 라미닌 421E8, 라미닌 411E8, 라미닌 511E8, 라미닌 521E8을 들 수 있다.
목적 단백질은, 예를 들어 상기와 같은 단백질의 공지 또는 천연의 아미노산 서열을 갖는 단백질이면 된다. 또한, 목적 단백질은, 예를 들어 상기와 같은 단백질의 공지 또는 천연의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 변이체(variant)여도 된다. 변이체로서는, 공지 또는 천연의 아미노산 서열에 있어서, 1 혹은 수개의 위치에서의 1 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 들 수 있다. 「1 또는 수개」란, 구체적으로는 예를 들어 1 내지 50개, 1 내지 40개, 1 내지 30개, 바람직하게는 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 1 내지 10개, 더욱 바람직하게는 1 내지 5개, 특히 바람직하게는 1 내지 3개를 의미해도 된다. 변이체로서는, 공지 또는 천연의 아미노산 서열 전체에 대하여, 예를 들어 50％ 이상, 65％ 이상, 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 97％ 이상, 특히 바람직하게는 99％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질도 들 수 있다. 또한, 유래하는 생물종에서 특정되는 단백질은, 당해 생물종에 있어서 발견되는 단백질 그 자체에 한정되지 않고, 당해 생물종에 있어서 발견되는 단백질의 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 그들의 변이체를 포함하는 것으로 한다. 변이체는 당해 생물종에 있어서 발견되어도 되고, 발견되지 않아도 된다. 즉, 예를 들어 「인간 유래 단백질」이란, 인간에 있어서 발견되는 단백질 그 자체에 한정되지 않고, 인간에 있어서 발견되는 단백질의 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 그들의 변이체를 포함하는 것으로 한다.
또한, 아미노산 서열간의 「동일성」이란, blastp에 의해 디폴트 설정의 스코어링 파라미터(Scoring Parameters)(Matrix: BLOSUM62; Gap Costs: Existence=11, Extension=1; Compositional Adjustments: Conditional compositional score matrix adjustment)를 사용하여 산출되는 아미노산 서열간의 동일성을 의미한다.
목적 단백질 유전자는, 상기와 같은 목적 단백질을 코딩하는 것이면, 특별히 제한되지 않는다. 목적 단백질 유전자는, 예를 들어 상기와 같은 단백질을 코딩하는 유전자의 공지 또는 천연의 염기 서열을 갖는 유전자이면 된다. 또한, 목적 단백질 유전자는, 예를 들어 상기와 같은 단백질을 코딩하는 유전자의 공지 또는 천연의 염기 서열을 갖는 유전자의 변이체여도 된다. 목적 단백질 유전자는, 예를 들어 상기 예시한 것 같은 변이체 서열을 갖는 단백질을 코딩하도록 개변되어도 된다. 목적 단백질 유전자는 임의의 코돈을 그것과 등가의 코돈으로 치환한 것이어도 된다. 목적 단백질 유전자는, 예를 들어 숙주 세포의 코돈 사용 빈도에 따라서 최적의 코돈을 갖도록 개변되어 있어도 된다.
또한, 본 발명에 있어서, 「유전자」라는 용어는, 대응하는 발현 산물을 코딩하는 한, DNA에 한정되지 않고, 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함해도 된다. 즉, 「목적 단백질 유전자」란, 목적 단백질을 코딩하는 임의의 폴리뉴클레오티드를 의미해도 된다. 목적 단백질 유전자는 DNA여도 되고, RNA여도 되고, 그 조합이어도 된다. 목적 단백질 유전자는 단일쇄여도 되고, 이중쇄여도 된다. 목적 단백질 유전자는 단일쇄 DNA여도 되고, 단일쇄 RNA여도 된다. 목적 단백질 유전자는 이중쇄 DNA여도 되고, 이중쇄 RNA여도 되고, DNA쇄와 RNA쇄를 포함하는 하이브리드쇄여도 된다. 목적 단백질 유전자는 단일의 폴리뉴클레오티드쇄 중에, DNA 잔기와 RNA 잔기의 양쪽을 포함하고 있어도 된다. 목적 단백질 유전자는 인트론을 포함하고 있어도 되고, 포함하고 있지 않아도 된다. 목적 단백질 유전자의 양태는 목적 단백질의 발현 수단 등의 여러 조건에 따라서 적절히 선택할 수 있다.
「(아미노산 또는 염기) 서열을 갖는」이라는 표현은, 특기하지 않는 한, 당해 「(아미노산 또는 염기) 서열을 포함하는」 것을 의미하고, 당해 「(아미노산 또는 염기) 서열을 포함하는」 경우도 포함한다.
목적 단백질은 목적 단백질 유전자로부터 발현한다. 즉, 목적 단백질 생산능을 갖는 동물 세포는, 목적 단백질 유전자를 갖는다. 목적 단백질 생산능을 갖는 동물 세포는, 구체적으로는 목적 단백질 유전자를 발현 가능하게 갖는다. 또한, 목적 단백질 생산능을 갖는 동물 세포는, 원하는 정도로 목적 단백질을 발현할 때까지 목적 단백질 유전자를 갖고 있으면 충분하다. 즉, 목적 단백질 생산능을 갖는 동물 세포는, 목적 단백질의 발현 후에는, 목적 단백질 유전자를 갖고 있어도 되고, 없어도 된다. 또한, 「목적 단백질 유전자의 발현」과 「목적 단백질의 발현」은 동일한 의미로 사용되어도 된다.
목적 단백질 유전자는, 목적 단백질 유전자를 갖는 생물로부터의 클로닝에 의해 취득할 수 있다. 클로닝에는, 동 유전자를 포함하는 게놈 DNA나 cDNA 등의 핵산을 이용할 수 있다. 또한, 목적 단백질 유전자는 화학 합성에 의해서도 취득할 수 있다(Gene, 60(1), 115-127(1987)).
취득한 목적 단백질 유전자는 그대로 혹은 적절히 개변하여, 이용할 수 있다. 즉, 목적 단백질 유전자를 개변함으로써 그 변이체를 취득할 수 있다. 유전자의 개변은 공지된 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들어, 부위 특이적 변이법에 의해, DNA의 목적 부위에 목적으로 하는 변이를 도입할 수 있다. 부위 특이적 변이법으로서는, PCR을 사용하는 방법(Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press(1989); Carter, P., Meth. In Enzymol., 154, 382(1987))이나, 파지를 사용하는 방법(Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. In Enzymol., 154, 350(1987); Kunkel, T. A. et al., Meth. In Enzymol., 154, 367(1987))을 들 수 있다. 또한, 목적 단백질 유전자의 변이체를 화학 합성에 의해 직접 취득해도 된다.
목적 단백질 유전자를 숙주 세포에 도입하는 형태는 특별히 제한되지 않는다. 목적 단백질 유전자는 발현 가능하게 숙주 세포에 유지되어 있으면 된다. 구체적으로는, 예를 들어 목적 단백질 유전자를 DNA 등의 전사를 요하는 형태로 도입하는 경우, 숙주 세포에 있어서, 목적 단백질 유전자는, 당해 숙주 세포에서 기능하는 프로모터의 제어 하에서 발현 가능하게 유지되어 있으면 된다. 숙주 세포에 있어서, 목적 단백질 유전자는 염색체 밖에 존재하고 있어도 되고, 염색체 상에 도입되어 있어도 된다. 2개 또는 그 이상의 유전자를 도입하는 경우, 각 유전자가, 발현 가능하게 숙주 세포에 유지되어 있으면 된다.
목적 단백질 유전자를 발현시키기 위한 프로모터는, 숙주 세포에 있어서 기능하는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 「숙주 세포에 있어서 기능하는 프로모터」란, 숙주 세포에 있어서 프로모터 활성을 갖는 프로모터를 말한다. 프로모터는 숙주 세포 유래의 프로모터여도 되고, 이종 유래의 프로모터여도 된다. 프로모터는 목적 단백질 유전자의 고유한 프로모터여도 되고, 다른 유전자의 프로모터여도 된다. 프로모터는 목적 단백질 유전자의 고유한 프로모터보다도 강력한 프로모터여도 된다. 동물 세포에 있어서 기능하는 프로모터로서는, SV40 프로모터, EF1a 프로모터, RSV 프로모터, CMV 프로모터, SRalpha 프로모터를 들 수 있다. 또한, 프로모터로서는, 각종 리포터 유전자를 사용함으로써, 재래의 프로모터 고활성형의 것을 취득하여 이용해도 된다. 프로모터의 강도에 대한 평가법 및 강력한 프로모터의 예는, Goldstein 등의 논문(Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128(1995)) 등에 기재되어 있다.
목적 단백질 유전자는, 예를 들어 동 유전자를 포함하는 벡터를 사용하여 숙주 세포에 도입할 수 있다. 목적 단백질 유전자를 포함하는 벡터를, 「목적 단백질 유전자의 발현 벡터」라고도 한다. 목적 단백질 유전자의 발현 벡터는, 예를 들어 목적 단백질 유전자를 포함하는 DNA 단편을 벡터와 연결함으로써 구축할 수 있다. 목적 단백질 유전자의 발현 벡터를 숙주 세포에 도입함으로써, 동 유전자를 숙주 세포에 도입할 수 있다. 벡터는 약제 내성 유전자 등의 마커를 구비하고 있어도 된다. 또한, 벡터는, 삽입된 유전자를 발현하기 위한 프로모터 등의 발현 조절 서열을 구비하고 있어도 된다. 벡터는, 숙주 세포의 종류나 목적 단백질 유전자의 도입 형태 등의 여러 조건에 따라서 적절히 선택할 수 있다. 동물 세포에의 유전자 도입에 사용할 수 있는 벡터로서는, 플라스미드 벡터나 바이러스 벡터를 들 수 있다. 바이러스 벡터로서는, 예를 들어 레트로바이러스 벡터나 아데노바이러스 벡터를 들 수 있다. 플라스미드 벡터로서는, 예를 들어 pcDNA 시리즈 벡터(pcDNA3.1 등; Thermo Fisher Scientific), pBApo-CMV 시리즈 벡터(다카라 바이오), pCI-neo(Promega)를 들 수 있다. 또한, 벡터의 종류나 구성에 따라서는, 벡터는 숙주 세포의 염색체에 도입될 수 있고, 숙주 세포의 염색체 밖에서 자율 복제할 수 있거나, 혹은 숙주 세포의 염색체 밖에 일시적으로 유지될 수 있다. 예를 들어, SV40 복제 기점 등의 바이러스의 복제 기점을 갖는 벡터는, 동물 세포의 염색체 밖에서 자율 복제할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 pcDNA 시리즈 벡터는 SV40 복제 기점을 갖고 있고, SV40의 라지 T 항원을 발현하는 숙주 세포(COS-1이나 HEK293T 등)에 있어서 염색체 밖에서 자율 복제할 수 있다.
또한, 목적 단백질 유전자는, 예를 들어 동 유전자를 포함하는 핵산 단편을 숙주 세포에 도입함으로써도, 숙주 세포에 도입할 수 있다. 그러한 핵산 단편으로서는, 직쇄상 DNA나 직쇄상 RNA를 들 수 있다. 직쇄상 RNA로서는, 예를 들어 mRNA나 cRNA를 들 수 있다.
벡터나 핵산 단편 등의 핵산을 숙주 세포에 도입하는 방법은, 숙주 세포의 종류 등의 여러 조건에 따라서 적절히 선택할 수 있다. 동물 세포에 벡터나 핵산 단편 등의 핵산을 도입하는 방법으로서는, DEAE 덱스트란법, 인산칼슘법, 리포펙션법, 일렉트로포레이션법, 미세 주입법을 들 수 있다. 또한, 벡터가 바이러스 벡터인 경우에는, 동 벡터(바이러스)를 숙주 세포에 감염시킴으로써, 숙주 세포에 동 벡터를 도입할 수 있다.
또한, 본래적으로 목적 단백질 유전자를 갖는 세포를, 목적 단백질 유전자의 발현이 증대되도록 개변하여 사용해도 된다. 「유전자의 발현이 증대된」이란, 동 유전자의 세포당 발현량이 비개변 세포와 비교하여 증대된 것을 의미한다. 여기에서 말하는 「비개변 세포」란, 표적의 유전자 발현이 증대되도록 개변되어 있지 않은 대조 세포를 의미한다. 비개변 세포로서는, 야생형의 세포나 개변원의 세포를 들 수 있다. 목적 단백질 유전자의 발현을 증대시키는 방법으로서는, 목적 단백질 유전자의 카피수를 증가시키는 것이나 목적 단백질 유전자의 전사 효율이나 번역 효율을 향상시키는 것을 들 수 있다. 목적 단백질 유전자의 카피수의 증가는, 목적 단백질 유전자를 숙주 세포에 도입함으로써 달성할 수 있다. 목적 단백질 유전자의 도입은, 상술한 바와 같이 실시할 수 있다. 또한, 도입되는 목적 단백질 유전자는, 숙주 세포 유래여도 되고, 이종 유래여도 된다. 목적 단백질 유전자의 전사 효율이나 번역 효율의 향상은, 프로모터 등의 유전자의 발현 조절 서열의 개변에 의해 달성할 수 있다. 예를 들어, 목적 단백질 유전자의 전사 효율의 향상은, 목적 단백질 유전자의 프로모터를 보다 강력한 프로모터로 치환함으로써 달성할 수 있다.
동물 세포의 배양은 유효 성분의 존재 하에서 실시된다. 즉, 동물 세포의 배양은 유효 성분을 사용하여 실시된다.
유효 성분의 사용에 의해, 예를 들어 동물 세포의 배양 성적이 향상되어도 된다. 즉, 유효 성분의 존재 하에서 동물 세포를 배양함으로써, 유효 성분의 비존재 하에서 동물 세포를 배양하는 경우와 비교하여, 동물 세포의 배양 성적이 향상되어도 된다. 유효 성분의 비존재 하에서 동물 세포를 배양하는 경우로서는, 유효 성분을 사용하지 않는 것 이외에는, 유효 성분의 존재 하에서 동물 세포를 배양하는 것과 동일한 조건에서 동물 세포를 배양하는 경우를 들 수 있다. 유효 성분의 사용에 의해, 특히 동물 세포가 배지 중에 충분한 생세포 밀도로 존재하는 기간에 있어서의 동물 세포의 배양 성적이 향상되어도 된다. 동물 세포의 배양 성적의 향상으로서는, 동물 세포의 증식의 향상, 동물 세포의 생존율의 향상, 동물 세포에 의한 목적 물질 생산의 향상, 동물 세포의 배양 기간의 연장을 들 수 있다. 동물 세포의 배양 기간의 연장으로서는, 동물 세포의 증식이 계속되는 기간의 연장, 동물 세포가 유지되는(즉, 동물 세포가 생존하는) 기간의 연장, 동물 세포에 의한 목적 단백질 등의 목적 물질의 생산이 계속되는 기간의 연장을 들 수 있다.
바꾸어 말하면, 본 발명의 방법의 일 양태는, 동물 세포의 배양 성적을 향상시키는 방법이어도 된다. 즉, 본 발명의 방법의 일 양태는, 예를 들어 동물 세포의 증식을 향상시키는 방법이어도 된다. 또한, 본 발명의 방법의 일 양태는, 예를 들어 동물 세포의 생존율을 향상시키는 방법이어도 된다. 또한, 본 발명의 방법의 일 양태는, 예를 들어 동물 세포에 의한 목적 물질 생산을 향상시키는 방법이어도 된다. 또한, 본 발명의 방법의 일 양태는, 예를 들어 동물 세포의 배양 기간을 연장하는 방법이어도 된다. 또한, 본 발명은, 동물 세포의 배양 성적을 향상시키기 위한 유효 성분의 사용을 제공한다.
또한, 유효 성분은 시스테인의 대체 물질로서 기능해도 된다. 「유효 성분이 시스테인의 대체 물질로서 기능하는」이란, 동물 세포의 배양에 있어서 사용될 수 있는 시스테인의 일부 또는 전부가 유효 성분으로 대체할 수 있는 것을 의미해도 된다. 따라서, 유효 성분의 사용에 의해, 예를 들어 동물 세포의 배양에 있어서의 시스테인 등의 시스테인 관련 물질의 사용량이 저감되어도 된다. 유효 성분의 사용에 의해, 특히 동물 세포가 배지 중에 충분한 생세포 밀도로 존재하는 기간에 있어서의 시스테인 관련 물질의 사용량이 저감되어도 된다. 유효 성분이 시스테인의 대체 물질로서 기능하는 것은, 예를 들어 시스테인의 사용량 저감에 수반하는 동물 세포의 배양 성적의 악화를 유효 물질의 사용에 의해 부분적 또는 완전히 상보할 수 있는 것을 확인함으로써 확인할 수 있다. 유효 성분이 시스테인의 대체 물질로서 기능하는 것은, 구체적으로는 예를 들어 실시예에 기재된 조건에 따라서, 유효 성분을 함유하는 피드 배지를 유가하여 동물 세포의 배양을 실시함으로써, 유효 성분 및 시스테인 관련 물질 중 어느 것도 함유하지 않은 피드 배지를 유가하여 동물 세포의 배양을 실시한 경우와 비교하여, 동물 세포의 배양 성적이 향상되는 것을 확인함으로써 확인할 수 있다.
바꾸어 말하면, 본 발명의 방법의 일 양태는, 동물 세포의 배양에 있어서의 시스테인 관련 물질의 사용량을 저감시키는 방법이어도 된다. 또한, 본 발명은, 동물 세포의 배양에 있어서의 시스테인 관련 물질의 사용량을 저감시키기 위한 유효 성분의 사용을 제공한다.
「동물 세포의 배양」에는, 동물 세포의 증식을 목적으로 하는 것에 한정되지 않고, 동물 세포의 유지나 동물 세포에 의한 목적 물질의 제조 등의, 동물 세포의 증식을 목적으로 하지 않는 것도 포함되어도 된다.
배지 조성이나 배양 조건은, 배양이 유효 성분의 존재 하에서 실시되는 것 이외에는, 동물 세포의 배양 목적을 달성 가능한 한, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 동물 세포의 증식을 목적으로 하는 경우, 배지 조성이나 배양 조건은, 동물 세포가 증식하도록 구성할 수 있다. 또한, 예를 들어 동물 세포의 유지를 목적으로 하는 경우, 배지 조성이나 배양 조건은, 동물 세포가 유지되도록(즉, 동물 세포가 생존하도록) 구성할 수 있다. 또한, 예를 들어 목적 단백질 등의 목적 물질의 생산을 목적으로 하는 경우, 배지 조성이나 배양 조건은, 목적 물질이 생산되도록(예를 들어, 목적 단백질이 발현되도록) 구성할 수 있다. 동물 세포의 증식을 목적으로 하지 않을 경우, 배양 시에, 동물 세포는 증식해도 되고, 하지 않아도 된다. 동물 세포의 증식을 목적으로 하지 않는 경우에도, 전형적으로는, 배양 시에 동물 세포는 증식해도 된다. 배지 조성이나 배양 조건은, 예를 들어 동물 세포의 종류 등의 여러 조건에 따라서 적절히 설정할 수 있다. 배양은 유효 성분의 존재 하에서 실시되는 것 이외에는, 예를 들어 동물 세포의 배양에 이용되는 통상의 배지 및 통상의 조건을 그대로, 혹은 적절히 개변하여 사용하여 실시할 수 있다.
배양은, 예를 들어 액체 배지를 사용하여 실시할 수 있다. 배양에 사용하는 배지는, 시판되고 있는 배지여도 되고, 자체 조제한 배지여도 된다. 동물 세포의 배양에 이용할 수 있는 시판되고 있는 배지로서, 구체적으로는 D-MEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), CELLiST Basal Media BASAL3, BASAL4P, BASAL10(아지노모토 가부시키가이샤), Opti-MEM(Thermo Fisher Scientific), RPMI 1640(Thermo Fisher Scientific), CD293(Thermo Fisher Scientific), CHO-S-SFMII(Thermo Fisher Scientific), CHO-SF(Sigma-Aldrich), EX-CELL CD CHO(Sigma-Aldrich), EX-CELLTM302(Sigma-Aldrich), IS CHO-CD(Irvine Scientific), IS CHO-CDXP(Irvine Scientific) 등을 들 수 있다. 배지는, 예를 들어 탄소원, 아미노산, 비타민, 무기 성분, 시스테인 관련 물질, pH 완충제, 성장 인자, 혈청, 혈청 알부민, 선택 약제, 유전자 발현 유도제 등의 각종 배지 성분을 함유하고 있어도 된다. 탄소원으로서는, 글루코오스를 들 수 있다. 아미노산으로서는, 단백질을 구성하는 20종류의 아미노산이나 그들의 유도체를 들 수 있다. 아미노산은, 예를 들어 L체이면 된다. 「시스테인 관련 물질」이란, 유효 성분을 제외한, 시스테인 및 그의 유도체의 총칭이다. 시스테인 유도체로서는, 시스틴이나 티아졸리딘 유도체를 들 수 있다. 티아졸리딘 유도체로서는, 시스테이닐피루브산을 들 수 있다. 시스테인 관련 물질로서는, 특히 시스테인이나 시스테이닐피루브산을 들 수 있다. 시스테인은, 예를 들어 L-시스테인이면 된다. 시스테인 유도체를 구성하는 시스테인은, 예를 들어 L-시스테인이면 된다. 비타민으로서는, 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5, 비타민 B6, 비타민 B7, 비타민 B9, 비타민 B12, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E 및 비타민 K나 그들의 전구체를 들 수 있다. 무기 성분으로서는, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 인이나 그들의 이온 또는 미량 원소, 예를 들어 Co, Cu, F, Fe, Mn, Mo, Ni, Se, Si, Ni, Bi, V 및 Zn을 포함하는 성분이다. pH 완충제로서는, 탄산수소나트륨, 인산염, HEPES를 들 수 있다. 성장 인자로서는, 인슐린, IGF-1, FGF를 들 수 있다.
염을 형성할 수 있는 성분은 모두 프리체로서 사용되어도 되고, 염으로서 사용되어도 되고, 그들의 조합으로서 사용되어도 된다. 즉, 예를 들어 「L-시스테인」이라는 용어는, 특기하지 않는 한, 프리체의 L-시스테인, 혹은 그의 염 또는 그들의 조합을 의미해도 된다. 염에 대하여는, 유효 성분의 염에 관한 기재를 준용할 수 있다. 또한, 이들 성분(예를 들어, 프리체나 염)은 모두, 특기하지 않는 한, 비수화물 및 수화물을 포함해도 된다.
배양 개시 시의 동물 세포의 파종량은, 예를 들어 1×103cells/mL 이상, 1×104cells/mL 이상, 1×105cells/mL 이상, 1×106cells/mL 이상 또는 1×107cells/mL 이상이어도 되고, 1×108cells/mL 이하, 1×107cells/mL 이하, 1×106cells/mL 이하, 1×105cells/mL 이하 또는 1×104cells/mL 이하여도 되고, 그들의 모순되지 않는 조합이어도 된다.
배양은, 예를 들어 동물 세포가 배지 중에 충분한 생세포 밀도로 존재하는 상태에서 개시해도 되고, 동물 세포가 배지 중에 충분한 생세포 밀도로 존재하지 않는 상태에서 개시해도 된다.
「동물 세포가 배지 중에 충분한 생세포 밀도로 존재하는」이란, 예를 들어 배지 중에서의 동물 세포의 생세포 밀도가, 1×106cells/mL 이상, 2×106cells/mL 이상, 3×106cells/mL 이상, 4×106cells/mL 이상, 5×106cells/mL 이상, 6×106cells/mL 이상, 7×106cells/mL 이상, 8×106cells/mL 이상, 9×106cells/mL 이상 또는 1×107cells/mL 이상인 것을 의미해도 된다. 「동물 세포가 배지 중에 충분한 생세포 밀도로 존재하는」이란, 특히 배지 중에서의 동물 세포의 생세포 밀도가 5×106cells/mL 이상인 것을 의미해도 된다. 배양 시에 동물 세포가 충분한 생세포 밀도에 도달하는 것을 「동물 세포가 충분히 증식하는」이라고도 한다.
「동물 세포가 배지 중에 충분한 생세포 밀도로 존재하지 않는」이란, 예를 들어 배지 중에서의 동물 세포의 생세포 밀도가, 1×107cells/mL 미만, 9×106cells/mL 미만, 8×106cells/mL 미만, 7×106cells/mL 미만, 6×106cells/mL 미만, 5×106cells/mL 미만, 4×106cells/mL 미만, 3×106cells/mL 미만, 2×106cells/mL 미만 또는 1×106cells/mL 미만인 것을 의미해도 된다. 「동물 세포가 배지 중에 충분한 생세포 밀도로 존재하지 않는」이란, 특히 배지 중에서의 동물 세포의 생세포 밀도가 5×106cells/mL 미만인 것을 의미해도 된다.
생세포수는, 예를 들어 생사 세포 오토애널라이저 Vi-CELLTM XR(베크만·콜터사)을 사용하여 측정할 수 있다.
배양은 종배양과 본배양으로 나누어 실시해도 된다. 배양이 종배양과 본배양으로 나누어 행해지는 경우, 적어도 본배양이 유효 성분의 존재 하에서 실시되면 된다. 배양이 종배양과 본배양으로 나누어 행해지는 경우, 종배양은 유효 성분의 존재 하에서 실시되어도 되고, 되지 않아도 된다. 배양이 종배양과 본배양으로 나누어 행해지는 경우, 배양에 관한 기재(예를 들어, 「배양 기간(배양의 기간)」이나 「배양 개시」)는, 특기하지 않는 한, 본배양에 관한 것으로서 바꾸어 읽을 수 있다. 종배양과 본배양의 배양 조건은 동일해도 되고, 그렇지 않아도 된다. 본배양의 배양 조건은 종배양의 배양 조건에도 준용할 수 있다. 또한, 목적 단백질 등의 목적 물질의 생산을 목적으로 하는 경우, 목적 물질은 적어도 본배양의 기간에 생산되면 된다. 예를 들어, 종배양에 의해 동물 세포를 충분히 증식시키고 나서, 본배양에 의해 목적 단백질 등의 목적 물질을 제조해도 된다.
배양은 회분 배양(batch culture), 유가 배양(Fed-batch culture), 연속 배양(continuous culture) 또는 그들의 조합에 의해 실시할 수 있다. 연속 배양으로서는, 관류 배양(perfusion culture)을 들 수 있다. 또한, 배양 개시 시의 배지를, 「초발 배지」 또는 「기초 배지」라고도 한다. 또한, 유가 배양 또는 연속 배양에 있어서 배양계(예를 들어, 초발 배지)에 공급되는 배지를, 「유가 배지」라고도 한다. 또한, 유가 배양 또는 연속 배양에 있어서 배양계에 유가 배지를 공급하는 것을, 「유가」라고도 한다. 유가는 배양의 전기간을 통하여 실시되어도 되고, 배양의 일부 기간에 있어서만 실시되어도 된다. 또한, 유가는 연속적으로 실시되어도 되고, 간헐적으로 실시되어도 된다. 배양(특히, 관류 배양 등의 연속 배양) 시에는, 배양액의 인발이 실시되어도 된다. 배양액의 인발은 배양의 전기간을 통하여 실시되어도 되고, 배양의 일부 기간에 있어서만 실시되어도 된다. 배양액의 인발은 연속적으로 실시되어도 되고, 간헐적으로 실시되어도 된다. 배양액의 인발과 유가는 동시에 행해져도 되고, 그렇지 않아도 된다. 또한, 배양이 종배양과 본배양으로 나누어 행해지는 경우, 종배양과 본배양의 배양 형태는 동일해도 되고, 그렇지 않아도 된다.
유효 성분 등의 각종 성분은, 초발 배지, 유가 배지, 또는 그 양쪽에 함유되어 있어도 된다. 즉, 배양의 과정에 있어서, 유효 성분 등의 각종 성분을 단독으로, 혹은 임의의 조합으로 배지에 공급해도 된다. 이들 성분은 모두 1회 또는 복수회 공급되어도 되고, 연속적으로 공급되어도 된다. 초발 배지와 유가 배지의 조성(예를 들어, 함유하는 성분의 종류 및/또는 농도)은 동일해도 되고, 그렇지 않아도 된다. 즉, 초발 배지에 함유되는 성분의 종류는, 유가 배지에 함유되는 성분의 종류와 동일해도 되고, 그렇지 않아도 된다. 또한, 초발 배지에 함유되는 각 성분의 농도는, 유가 배지에 함유되는 각 성분의 농도와 동일해도 되고, 그렇지 않아도 된다. 예를 들어, 유가 배지가 관류 배양에 사용되는 경우에, 초발 배지와 유가 배지의 조성은 동일해도 된다. 또한, 조성(예를 들어, 함유하는 성분의 종류 및/또는 농도)이 다른 2종 또는 그 이상의 유가 배지를 사용해도 된다. 예를 들어, 복수회의 유가가 간헐적으로 행해지는 경우, 각 유가 배지의 조성은 동일해도 되고, 그렇지 않아도 된다. 또한, 유효 성분 등의 각종 성분은, 분말 등의, 유가 배지에 함유되지 않은 형태로, 배지에 공급해도 된다.
배양은, 예를 들어 5 내지 15％ CO2 등의 CO2 함유 분위기 하에서 실시해도 된다. 배지의 pH는, 예를 들어 중성 부근이면 된다. 「중성 부근」이란, 예를 들어 pH 6 내지 8, pH 6.5 내지 7.5 또는 pH 6.8 내지 7.2를 의미해도 된다. 배양 중, 필요에 따라서 배지의 pH를 조정할 수 있다. 배지의 pH는, 암모니아 가스, 암모니아수, 탄산나트륨, 중탄산나트륨, 탄산칼륨, 중탄산칼륨, 탄산마그네슘, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 수산화마그네슘 등의 각종 알칼리성 또는 산성 물질을 사용하여 조정할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들어 30 내지 38℃여도 된다. 배양 기간은, 예를 들어 0.5일 이상, 1일 이상, 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상, 6일 이상, 7일 이상, 8일 이상, 9일 이상, 10일 이상, 12일 이상, 15일 이상 또는 20일 이상이어도 되고, 60일 이하, 50일 이하, 40일 이하, 30일 이하, 25일 이하, 20일 이하, 15일 이하, 12일 이하, 10일 이하, 9일 이하, 8일 이하 또는 7일 이하여도 되고, 그들의 모순되지 않는 조합이어도 된다. 배양 기간은, 구체적으로는 예를 들어 1 내지 60일, 3 내지 25일 또는 5 내지 20일이어도 된다. 배양 시에는, 적절히 목적 단백질 유전자 등의 유전자의 발현을 유도해도 된다.
「배양이 유효 성분의 존재 하에서 실시되는」이란, 예를 들어 배지가 유효 성분을 함유하는 것, 즉, 배양이 유효 성분을 함유하는 배지에서 실시되는 것을 의미해도 된다.
배지 중의 유효 성분 농도는, 예를 들어 0.5mM 이상, 0.6mM 이상, 0.7mM 이상, 0.8mM 이상, 0.9mM 이상, 0.92mM 이상, 1mM 이상, 1.2mM 이상, 1.5mM 이상, 2mM 이상, 2.5mM 이상, 3mM 이상, 3.5mM 이상, 4mM 이상, 4.5mM 이상, 5mM 이상, 5.5mM 이상, 6mM 이상, 6.5mM 이상, 7mM 이상, 7.5mM 이상, 8mM 이상, 8.5mM 이상, 9mM 이상, 9.5mM 이상 또는 10mM 이상이어도 되고, 20mM 이하, 15mM 이하, 12mM 이하, 10mM 이하, 9.5mM 이하, 9mM 이하, 8.5mM 이하, 8mM 이하, 7.5mM 이하, 7mM 이하, 6.5mM 이하, 6mM 이하, 5.5mM 이하, 5mM 이하, 4.5mM 이하, 4mM 이하, 3.5mM 이하, 3mM 이하, 2.5mM 이하, 2mM 이하, 1.5mM 이하 또는 1mM 이하여도 되고, 그들의 모순되지 않는 조합이어도 된다. 배지 중의 유효 성분 농도는, 예를 들어 특히 0.92mM 이상이어도 된다. 배지 중의 유효 성분 농도는, 구체적으로는 예를 들어 0.5 내지 20mM, 1 내지 15mM 또는 1.5 내지 10mM이어도 된다.
유효 성분은, 배양의 전기간에 있어서 배지에 함유되어 있어도 되고, 배양의 일부 기간에만 배지에 함유되어 있어도 된다. 즉, 「배양이 유효 성분의 존재 하에서 실시되는」 또는 「배양이 유효 성분을 함유하는 배지에서 실시되는」이란, 유효 성분이 배양의 적어도 일부 기간에 있어서 배지에 함유되어 있으면 충분하고, 유효 성분이 배양의 전기간에 있어서 배지에 함유되어 있을 것을 요하지 않는다. 유효 성분은, 예를 들어 배양 개시 시에 배지에 함유되어 있어도 되고, 배양 개시 후에 배지에 공급되어도 된다. 또한, 유효 성분은, 예를 들어 배양 개시 시에 배지에 함유되고, 또한 배양 개시 후(예를 들어, 유효 성분의 소비 후)에 배지에 더 공급되어도 된다.
유효 성분은, 예를 들어 배양의 전기간에 있어서 상기 예시한 농도로 배지에 함유되어 있어도 되고, 배양의 일부 기간에만 상기 예시한 농도로 배지에 함유되어 있어도 된다. 즉, 「배양이 어떤 농도의 유효 성분의 존재 하에서 실시되는」 또는 「배양이 어떤 유효 성분 농도의 배지에서 실시되는」이란, 배지 중의 유효 성분 농도가 배양의 적어도 일부 기간에 있어서 당해 농도의 범위 내에 있으면 충분하고, 배지 중의 유효 성분 농도가 배양의 전기간에 있어서 당해 농도의 범위 내에 있을 것을 요하지 않는다. 유효 성분은, 예를 들어 배양 개시 시에 상기 예시한 농도로 배지에 함유되어 있어도 되고, 배양 개시 후에 상기 예시한 농도가 되도록 배지에 공급되어도 된다. 또한, 유효 성분은, 예를 들어 배양 개시 시에 상기 예시한 농도로 배지에 함유되고, 또한 배양 개시 후(예를 들어, 유효 성분의 소비 후)에 상기 예시한 농도가 되도록 배지에 더 공급되어도 된다.
유효 성분의 사용에 관한 「배양의 일부 기간」은, 유효 성분에 의한 원하는 효과가 얻어지는 한, 특별히 제한되지 않는다. 유효 성분의 사용에 관한 「배양의 일부 기간」은, 유효 성분의 종류, 동물 세포의 종류, 배양 기간의 길이, 원하는 목적 물질 생산량 등의 여러 조건에 따라서 적절히 설정할 수 있다. 유효 성분의 사용에 관한 「일부 기간」은, 예를 들어 배양의 전기간의 10％ 이상, 20％ 이상, 30％ 이상, 40％ 이상, 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 97％ 이상 또는 99％ 이상의 기간이면 된다. 또한, 유효 성분의 사용에 관한 「일부 기간」은, 예를 들어 0.5일 이상, 1일 이상, 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상, 6일 이상, 7일 이상, 8일 이상, 9일 이상, 10일 이상, 12일 이상 또는 15일 이상의 기간이어도 된다.
유효 성분의 사용에 관한 「배양의 일부 기간」은, 예를 들어 동물 세포가 배지 중에 충분한 생세포 밀도로 존재하는 기간 또는 그 일부 기간을 포함하고 있어도 된다. 「동물 세포가 배지 중에 충분한 생세포 밀도로 존재하는 기간의 일부 기간」은, 예를 들어 동물 세포가 배지 중에 충분한 생세포 밀도로 존재하는 기간의 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 97％ 이상 또는 99％ 이상의 기간이어도 된다.
또한, 배지 중의 유효 성분 농도는, 예를 들어 배양 중의 특정 기간을 통한 평균값으로서, 상기 예시한 농도로 설정되어 있어도 된다. 즉, 「배양이 어떤 농도의 유효 성분의 존재 하에서 실시되는」 또는 「배양이 어떤 유효 성분 농도의 배지에서 실시되는」이란, 배양 중의 특정 기간을 통한 배지 중의 유효 성분 농도의 평균값이 당해 농도의 범위 내에 있는 것을 의미해도 된다. 「배양 중의 특정 기간을 통한 배지 중의 유효 성분 농도의 평균값」이란, 배양 중의 특정 기간에 있어서의 유효 성분 농도의 변동을 파악할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 배양 중의 특정 기간을 통하여 60분마다, 30분마다, 20분마다 또는 10분마다 측정된 배지 중의 유효 성분 농도의 평균값을 의미해도 된다.
유효 성분의 사용에 관한 「배양 중의 특정 기간」으로서는, 배양의 전기간이나 동물 세포가 배지 중에 충분한 생세포 밀도로 존재하는 기간을 들 수 있다. 유효 성분의 사용에 관한 「배양 중의 특정 기간」으로서는, 특히 동물 세포가 배지 중에 충분한 생세포 밀도로 존재하는 기간을 들 수 있다.
또한, 「배양이 유효 성분의 존재 하에서 실시되는」이란, 예를 들어 배지에 유효 성분이 공급되는 것을 의미해도 된다.
유효 성분은 배양의 전기간을 통하여 배지에 공급되어도 되고, 배양의 일부 기간에 있어서만 배지에 공급되어도 된다. 배지에의 유효 성분의 공급은, 예를 들어 동물 세포가 배지 중에 충분한 생세포 밀도로 존재하는 기간에 개시 또는 실시해도 되고, 동물 세포가 배지 중에 충분한 생세포 밀도로 존재하지 않는 기간에 개시 또는 실시해도 된다. 유효 성분은, 예를 들어 연속적으로 배지에 공급되어도 되고, 간헐적으로 배지에 공급되어도 된다. 유효 성분은, 예를 들어 매일 배지에 공급되어도 되고, 수일 간격으로 배지에 공급되어도 된다.
배지에의 유효 성분의 공급량은, 예를 들어 배양 중의 특정 기간을 통하여, 1일당 0.1mM 이상, 0.15mM 이상, 0.2mM 이상, 0.25mM 이상, 0.3mM 이상, 0.35mM 이상, 0.4mM 이상, 0.45mM 이상, 0.5mM 이상, 0.55mM 이상, 0.6mM 이상, 0.65mM 이상, 0.7mM 이상, 0.75mM 이상, 0.8mM 이상, 0.85mM 이상, 0.9mM 이상, 0.95mM 이상 또는 1mM 이상이어도 되고, 10mM 이하, 7mM 이하, 5mM 이하, 3mM 이하, 2mM 이하, 1.5mM 이하, 1.2mM 이하, 1mM 이하, 0.95mM 이하, 0.9mM 이하, 0.85mM 이하, 0.8mM 이하, 0.75mM 이하, 0.7mM 이하, 0.65mM 이하, 0.6mM 이하, 0.55mM 이하, 0.5mM 이하, 0.45mM 이하, 0.4mM 이하, 0.35mM 이하 또는 0.3mM 이하여도 되고, 그들의 모순되지 않는 조합이어도 된다. 배지에의 유효 성분의 공급량은, 구체적으로는 예를 들어 배양 중의 특정 기간을 통하여, 1일당 0.1 내지 10mM, 0.1 내지 2mM, 0.2 내지 1.5mM 또는 0.3 내지 1mM이어도 된다.
유가 배지의 유가에 의해 유효 성분을 배지에 공급하는 경우, 유가 배지 중의 유효 성분 농도는, 원하는 유효 성분의 공급량이 얻어지는 한, 특별히 제한되지 않는다. 유가 배지 중의 유효 성분 농도는, 예를 들어 상기 예시한 배지 중의 유효 성분 농도의 범위이면 된다. 예를 들어, 유가 배지가 관류 배양에 사용되는 경우에, 유가 배지 중의 유효 성분 농도는, 상기 예시한 배지 중의 유효 성분 농도의 범위이면 된다. 또한, 유가 배지 중의 유효 성분 농도는, 예를 들어 상기 예시한 배지 중의 유효 성분 농도의 1배 이상, 1.1배 이상, 1.3배 이상, 1.5배 이상, 2배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 7배 이상, 10배 이상, 15배 이상 또는 20배 이상의 농도여도 되고, 100배 이하, 70배 이하, 50배 이하, 30배 이하, 20배 이하, 10배 이하 또는 5배 이하의 농도여도 되고, 그들의 모순되지 않는 조합이어도 된다. 또한, 유가 배지 중의 유효 성분 농도는, 예를 들어 1mM 이상, 2mM 이상, 5mM 이상, 10mM 이상, 15mM 이상, 20mM 이상, 25mM 이상, 30mM 이상, 35mM 이상, 40mM 이상, 45mM 이상, 50mM 이상, 55mM 이상 또는 60mM 이상이어도 되고, 포화 농도 이하, 100mM 이하, 95mM 이하, 90mM 이하, 85mM 이하, 80mM 이하, 75mM 이하, 70mM 이하, 65mM 이하, 60mM 이하, 55mM 이하, 50mM 이하, 45mM 이하, 40mM 이하, 35mM 이하, 30mM 이하, 25mM 이하 또는 20mM 이하여도 되고, 그들의 모순되지 않는 조합이어도 된다. 유가 배지 중의 유효 성분 농도는, 구체적으로는 예를 들어 5 내지 100mM, 10 내지 90mM 또는 20 내지 80mM이어도 된다.
배양은 시스테인 관련 물질의 존재 하에서 실시되어도 된다. 즉, 동물 세포의 배양은 시스테인 관련 물질을 사용하여 실시되어도 된다. 시스테인 관련 물질은, 예를 들어 동물 세포를 충분히 증식시키기 위해 사용해도 된다. 시스테인 관련 물질은, 구체적으로는 예를 들어 동물 세포가 배지 중에 충분한 생세포 밀도로 존재하지 않는 상태로 배양을 개시하는 경우에 사용해도 된다.
「배양이 시스테인 관련 물질의 존재 하에서 실시되는」란, 예를 들어 배지가 시스테인 관련 물질을 함유하는 것, 즉, 배양이 시스테인 관련 물질을 함유하는 배지에서 실시되는 것을 의미해도 된다.
배지 중의 시스테인 관련 물질 농도는, 예를 들어 시스테인 농도로 환산하여, 0.1mM 이상, 0.2mM 이상, 0.3mM 이상, 0.4mM 이상, 0.5mM 이상, 0.6mM 이상, 0.7mM 이상, 0.8mM 이상, 0.9mM 이상, 1mM 이상, 1.1mM 이상, 1.2mM 이상, 1.3mM 이상, 1.4mM 이상 또는 1.5mM 이상이어도 되고, 10mM 이하, 7mM 이하, 5mM 이하, 3mM 이하, 2.5mM 이하, 2mM 이하, 1.5mM 이하, 1.4mM 이하, 1.3mM 이하, 1.2mM 이하, 1.1mM 이하, 1mM 이하, 0.92mM 이하, 0.9mM 이하, 0.8mM 이하, 0.7mM 이하, 0.6mM 이하 또는 0.5mM 이하여도 되고, 그들의 모순되지 않는 조합이어도 된다. 「시스테인 농도로 환산한 시스테인 관련 물질 농도」란, 시스테인 관련 물질 농도에, 시스테인 관련 물질 1 분자 중의 시스테인에 상당하는 부위의 개수를 승산하여 이루어지는 값을 의미한다. 예를 들어, 시스틴 농도가 X인 경우, 시스테인 농도로 환산한 시스틴 농도는 2X로 산출된다. 배지 중의 시스테인 관련 물질 농도는, 구체적으로는 예를 들어 시스테인 농도로 환산하여, 0.1 내지 10mM, 0.1 내지 3mM, 0.5 내지 2mM 또는 1 내지 1.5mM이어도 된다.
시스테인 관련 물질은 배양의 전기간에 있어서 배지에 함유되어 있어도 되고, 배양의 일부 기간에만 배지에 함유되어 있어도 된다. 즉, 「배양이 시스테인 관련 물질의 존재 하에서 실시되는」 또는 「배양이 시스테인 관련 물질을 함유하는 배지에서 실시되는」이란, 시스테인 관련 물질이 배양의 적어도 일부 기간에 있어서 배지에 함유되어 있으면 충분하고, 시스테인 관련 물질이 배양의 전기간에 있어서 배지에 함유되어 있을 것을 요하지 않는다. 시스테인 관련 물질은, 예를 들어 배양 개시 시에 배지에 함유되어 있어도 되고, 배양 개시 후에 배지에 공급되어도 된다. 또한, 시스테인 관련 물질은, 예를 들어 배양 개시 시에 배지에 함유되고, 또한 배양 개시 후(예를 들어, 소비 후)에 배지에 더 공급되어도 된다. 시스테인 관련 물질은 특히 적어도, 배양 개시 시에 배지에 함유되어 있어도 된다.
시스테인 관련 물질은, 예를 들어 배양의 전기간에 있어서 상기 예시한 농도로 배지에 함유되어 있어도 되고, 배양의 일부 기간에만 상기 예시한 농도로 배지에 함유되어 있어도 된다. 즉, 「배양이 어떤 농도의 시스테인 관련 물질의 존재 하에서 실시되는」 또는 「배양이 어떤 시스테인 관련 물질 농도의 배지에서 실시되는」이란, 배지 중의 시스테인 관련 물질 농도가 배양의 적어도 일부 기간에 있어서 당해 농도의 범위 내에 있으면 충분하고, 배지 중의 시스테인 관련 물질 농도가 배양의 전기간에 있어서 당해 농도의 범위 내에 있을 것을 요하지 않는다. 시스테인 관련 물질은, 예를 들어 배양 개시 시에 상기 예시한 농도로 배지에 함유되어 있어도 되고, 배양 개시 후에 상기 예시한 농도가 되도록 배지에 공급되어도 된다. 또한, 시스테인 관련 물질은, 예를 들어 배양 개시 시에 상기 예시한 농도로 배지에 함유되고, 또한 배양 개시 후(예를 들어, 소비 후)에 상기 예시한 농도가 되도록 배지에 더 공급되어도 된다. 시스테인 관련 물질은 특히 적어도, 배양 개시 시에 상기 예시한 농도로 배지에 함유되어 있어도 된다.
시스테인 관련 물질의 사용에 관한 「배양의 일부 기간」은, 시스테인 관련 물질에 의한 원하는 효과가 얻어지는 한, 특별히 제한되지 않는다. 시스테인 관련 물질의 사용에 관한 「배양의 일부 기간」은, 동물 세포의 종류, 배양 기간의 길이, 원하는 목적 물질 생산량 등의 여러 조건에 따라서 적절히 설정할 수 있다. 시스테인 관련 물질의 사용에 관한 「배양의 일부 기간」은, 예를 들어 배양의 전기간의 1％ 이상, 3％ 이상, 5％ 이상, 10％ 이상, 20％ 이상, 30％ 이상, 40％ 이상 또는 50％ 이상의 기간이어도 되고, 90％ 이하, 80％ 이하, 70％ 이하, 60％ 이하, 50％ 이하, 40％ 이하, 30％ 이하, 20％ 이하 또는 10％ 이하의 기간이어도 되고, 그들의 모순되지 않는 조합이어도 된다. 또한, 시스테인 관련 물질의 사용에 관한 「일부 기간」은, 예를 들어 0.5일 이상, 1일 이상, 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상 또는 5일 이상의 기간이어도 되고, 15일 이하, 10일 이하, 7일 이하, 5일 이하 또는 3일 이하의 기간이어도 되고, 그들의 모순되지 않는 조합이어도 된다.
시스테인 관련 물질의 사용에 관한 「배양의 일부 기간」은, 예를 들어 동물 세포가 배지 중에 충분한 생세포 밀도로 존재하지 않는 기간 또는 그 일부 기간을 포함하고 있어도 된다. 「동물 세포가 배지 중에 충분한 생세포 밀도로 존재하지 않는 기간의 일부 기간」은, 예를 들어 동물 세포가 배지 중에 충분한 생세포 밀도로 존재하지 않는 기간의 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 97％ 이상 또는 99％ 이상의 기간이어도 된다.
또한, 배지 중의 시스테인 관련 물질 농도는, 예를 들어 배양 중의 특정 기간을 통한 평균값으로서, 상기 예시한 농도로 설정되어 있어도 된다. 즉, 「배양이 어떤 농도의 시스테인 관련 물질의 존재 하에서 실시되는」 또는 「배양이 어떤 시스테인 관련 물질 농도의 배지에서 실시되는」이란, 배양 중의 특정 기간을 통한 배지 중의 시스테인 관련 물질 농도의 평균값이 당해 농도의 범위 내에 있는 것을 의미해도 된다. 「배양 중의 특정 기간을 통한 배지 중의 시스테인 관련 물질 농도의 평균값」이란, 배양 중의 특정 기간에 있어서의 시스테인 관련 물질 농도의 변동을 파악할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 배양 중의 특정 기간을 통하여 60분마다, 30분마다, 20분마다 또는 10분마다 측정된 배지 중의 시스테인 관련 물질 농도의 평균값을 의미해도 된다.
시스테인 관련 물질의 사용에 관한 「배양 중의 특정 기간」으로서는, 배양의 전기간이나 동물 세포가 배지 중에 충분한 생세포 밀도로 존재하지 않는 기간을 들 수 있다. 시스테인 관련 물질의 사용에 관한 「배양 중의 특정 기간」으로서는, 특히 동물 세포가 배지 중에 충분한 생세포 밀도로 존재하지 않는 기간을 들 수 있다.
또한, 「배양이 시스테인 관련 물질의 존재 하에서 실시되는」란, 예를 들어 배지에 시스테인 관련 물질이 공급되는 것을 의미해도 된다.
시스테인 관련 물질은 배양의 전기간을 통하여 배지에 공급되어도 되고, 배양의 일부 기간에 있어서만 배지에 공급되어도 된다. 배지에의 시스테인 관련 물질의 공급은, 예를 들어 동물 세포가 배지 중에 충분한 생세포 밀도로 존재하는 기간에 개시 또는 실시해도 되고, 동물 세포가 배지 중에 충분한 생세포 밀도로 존재하지 않는 기간에 개시 또는 실시해도 된다. 시스테인 관련 물질은, 예를 들어 연속적으로 배지에 공급되어도 되고, 간헐적으로 배지에 공급되어도 된다. 시스테인 관련 물질은, 예를 들어 매일 배지에 공급되어도 되고, 수일 간격으로 배지에 공급되어도 된다.
배지에의 시스테인 관련 물질의 공급량은, 예를 들어 상기 예시한 배지 중의 시스테인 관련 물질 농도가 달성되도록 설정해도 된다.
또한, 배지에의 시스테인 관련 물질의 공급량은, 예를 들어 동물 세포가 배지 중에 충분한 생세포 밀도로 존재하는 기간을 통하여, 시스테인 농도로 환산하여, 몰비로, 배지에의 유효 성분의 공급량의, 50％ 이하, 40％ 이하, 30％ 이하, 20％ 이하, 10％ 이하, 5％ 이하, 2％ 이하, 1％ 이하 또는 제로이면 된다.
또한, 배지에의 시스테인 관련 물질의 공급량은, 예를 들어 동물 세포가 배지 중에 충분한 생세포 밀도로 존재하는 기간을 통하여, 시스테인 농도로 환산하여, 1일당 1mM 이하, 0.5mM 이하, 0.2mM 이하, 0.1mM 이하, 0.01mM 이하, 0.001mM 이하 또는 제로이면 된다.
유가 배지의 유가에 의해 시스테인 관련 물질을 배지에 공급하는 경우, 유가 배지 중의 시스테인 관련 물질 농도는, 원하는 시스테인 관련 물질의 공급량이 얻어지는 한, 특별히 제한되지 않는다. 유가 배지 중의 시스테인 관련 물질 농도는, 예를 들어 상기 예시한 배지 중의 시스테인 관련 물질 농도의 범위이면 된다. 예를 들어, 유가 배지가 관류 배양에 사용되는 경우에, 유가 배지 중의 시스테인 관련 물질 농도는, 상기 예시한 배지 중의 시스테인 관련 물질 농도의 범위이면 된다. 또한, 유가 배지 중의 시스테인 관련 물질 농도는, 예를 들어 상기 예시한 배지 중의 시스테인 관련 물질 농도의 1배 이상, 1.1배 이상, 1.3배 이상, 1.5배 이상, 2배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 7배 이상, 10배 이상, 15배 이상 또는 20배 이상의 농도여도 되고, 100배 이하, 70배 이하, 50배 이하, 30배 이하, 20배 이하, 10배 이하 또는 5배 이하의 농도여도 되고, 그들의 모순되지 않는 조합이어도 된다.
각종 성분의 농도는, 예를 들어 화합물의 검출 또는 동정에 사용되는 공지된 방법에 의해 측정할 수 있다. 그러한 방법으로서는, 예를 들어 HPLC, UPLC, LC/MS, GC/MS, NMR을 들 수 있다. 이들 방법은, 목적 물질이 생성된 것을 확인하는데도 이용할 수 있다. 이들 방법은 1종을 단독으로 사용해도 되고, 2종 또는 그 이상을 적절히 조합하여 사용해도 된다.
상기와 같이 하여 동물 세포를 배양할 수 있다. 동물 세포가 목적 단백질 생산능 등의 목적 물질 생산능을 갖는 경우, 상기와 같이 하여 동물 세포를 배양함으로써, 목적 물질이 생성(예를 들어, 목적 단백질이 발현)되고, 이로써 목적 물질을 함유하는 배양물이 얻어진다. 목적 단백질 등의 목적 물질은, 구체적으로는 배지 중, 세포 표층, 세포 내 또는 그들의 조합에 축적해도 된다.
이하, 특히 목적 단백질을 제조하는 경우를 참조하여 목적 단백질의 생성 확인, 회수, 정제 등의 조작에 대하여 설명하지만, 목적 단백질 이외의 목적 물질에 대해서도, 적절히 그러한 조작을 실시할 수 있다.
목적 단백질이 생성된 것은, 단백질의 검출 또는 동정에 사용되는 공지된 방법에 의해 확인할 수 있다. 그러한 방법으로서는, 예를 들어 SDS-PAGE, 웨스턴 블로팅(Western blotting), 질량 분석, N 말단 아미노산 서열 해석, 효소 활성 측정을 들 수 있다. 이들 방법은 1종을 단독으로 사용해도 되고, 2종 또는 그 이상을 적절히 조합하여 사용해도 된다.
목적 단백질은 적절히 회수할 수 있다. 목적 단백질은, 구체적으로는 목적 단백질을 함유하는 적당한 분획으로서 회수할 수 있다. 그러한 분획으로서는, 예를 들어 배양물, 배양 상청, 배양 세포, 배양 세포의 처리물(파쇄물, 용해물, 추출물(무세포 추출액)을 들 수 있다. 배양 세포는, 예를 들어 아크릴아미드나 카라기난 등의 담체로 고정화한 고정화 세포의 형태로 취득되어도 된다.
목적 단백질은 또한 원하는 정도로 정제되어도 된다.
배지 중에 목적 단백질이 축적되는 경우, 목적 단백질은, 예를 들어 세포 등의 고형분을 원심 분리 등에 의해 배양물로부터 제거한 후, 상청으로부터 정제할 수 있다.
세포 내에 목적 단백질이 축적되는 경우, 목적 단백질은, 예를 들어 세포를 파쇄, 용해 또는 추출 등의 처리에 제공한 후, 처리물로 정제할 수 있다. 세포는 원심 분리 등에 의해 배양물로부터 회수할 수 있다. 세포의 파쇄, 용해 또는 추출 등의 처리는, 공지된 방법에 의해 행할 수 있다. 그러한 방법으로서는, 예를 들어 초음파 파쇄법, 다이노 밀법, 비즈 파쇄, 프렌치 프레스 파쇄, 리소자임 처리를 들 수 있다. 이들 방법은 1종을 단독으로 사용해도 되고, 2종 또는 그 이상을 적절히 조합하여 사용해도 된다.
세포 표층에 목적 단백질이 축적되는 경우, 목적 단백질은, 예를 들어 가용화한 후, 가용화물로 정제할 수 있다. 가용화는 공지된 방법에 의해 행할 수 있다. 그러한 방법으로서는, 예를 들어 염 농도의 상승이나 계면 활성제의 사용을 들 수 있다. 이들 방법은 1종을 단독으로 사용해도 되고, 2종 또는 그 이상을 적절히 조합하여 사용해도 된다.
목적 단백질의 정제(예를 들어, 상기와 같은 상청, 처리물 또는 가용화물로의 정제)는, 단백질의 정제에 사용되는 공지된 방법에 의해 행할 수 있다. 그러한 방법으로서는, 예를 들어 황산암모늄 분획, 이온 교환 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 등전점 침전을 들 수 있다. 이들 방법은 1종을 단독으로 사용해도 되고, 2종 또는 그 이상을 적절히 조합하여 사용해도 된다.
목적 단백질은 유리된 상태로 취득되어도 되고, 수지 등의 고상에 고정화된 고정화 효소의 상태로 취득되어도 된다.
회수한 목적 단백질은 적절히 제제화해도 된다. 제형은 특별히 제한되지 않고, 목적 단백질의 사용 용도 등의 여러 조건에 따라서 적절히 설정할 수 있다. 제형으로서는, 예를 들어 액제, 현탁제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제를 들 수 있다. 제제화 시에는, 예를 들어 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 안정화제, 교미제, 교취제, 향료, 희석제, 계면 활성제 등의 약리학적으로 허용되는 첨가제를 사용할 수 있다.
<3> 본 발명의 배지
본 발명의 배지는, 유효 성분을 함유하는 동물 세포 배양용 배지이다. 본 발명의 배지는, 예를 들어 본 발명의 방법에 사용할 수 있다.
본 발명의 배지에 대하여는, 예를 들어 본 발명의 방법에 사용되는 배지의 기재(유가 배지의 기재도 포함함)를 준용할 수 있다.
본 발명의 배지는 또한 시스테인 관련 물질을 함유하고 있어도 되고, 없어도 된다.
본 발명의 배지는, 예를 들어 기초 배지(초발 배지)여도 되고, 유가 배지여도 된다. 유가 배지는, 예를 들어 유가 배양 또는 연속 배양에 사용하는 것이어도 된다. 유가 배지는, 예를 들어 특히 관류 배양에 사용하는 것이어도 된다.
본 발명의 배지에 있어서의 유효 성분 농도는, 예를 들어 상기 예시한 본 발명의 방법에 있어서의 배지 중의 유효 성분 농도의 기재(유가 배지 중의 유효 성분 농도의 기재도 포함함)를 준용할 수 있다.
본 발명의 배지에 있어서의 시스테인 관련 물질 농도는, 예를 들어 상기 예시한 본 발명의 방법에 있어서의 배지 중의 시스테인 관련 물질 농도의 기재(유가 배지 중의 시스테인 관련 물질 농도의 기재도 포함함)를 준용할 수 있다.
실시예
이하, 비한정적인 실시예를 참조하여, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.
이하의 실험에서 사용한 L-시스테인은, L-시스테인염산염1수화물이다. 이하의 실험에서 사용한 L-시스테인 유도체는, 특기하지 않는 한, 모두 프리체이다.
실시예 1: 기초 배지에의 L-시스테인 유도체의 첨가가 CHO 세포의 증식에 끼치는 영향의 평가
본 실험예에서는, 기초 배지에의 L-시스테인 유도체의 첨가가 CHO 세포의 증식에 끼치는 영향을 평가하였다. L-시스테인 유도체로서는, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-에틸에스테르((2RS,4R)-2-methyl-2,4-thiazolidinedicarboxylic acid 2-ethyl ester; 이하, 「화합물 1」이라고도 함) 및 (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산((2RS,4R)-2-methyl-2,4-thiazolidinedicarboxylic acid; 이하, 「화합물 2」라고도 함)을 사용하였다. CHO 세포로서는, 모노클로날 항체를 생산하도록 개변된 CHO 세포를 사용하였다.
(1) 기초 배지의 조제
CELLiST(등록 상표) Basal media(아지노모토 가부시키가이샤: BASAL3)의 L-시스테인 제외의 배지를 조제하고, L-시스테인 무첨가의 배지로 하였다. L-시스테인 무첨가의 배지에 L-시스테인, 화합물 1 또는 화합물 2를 첨가하고, L-시스테인 1.3mM 함유, 화합물 11.3mM 함유, 화합물 21.3mM 함유의 배지를 조제하였다. 각각의 배지에, LR3-IGF-1(SIGMA-ALDRICH: I1271-1MG, 최종 농도 50μg/mL)과 L-글루타민(Thermo Fisher SCIENTIFIC: 25030081, 최종 농도 6mM)을 첨가하고, 기초 배지를 조제하였다.
(2) 배양 실험
조제한 기초 배지를 사용하여 3×105cells/mL로 조정한 CHO 세포 현탁액 3mL를 6웰 플레이트(CORNING: 3471)에 파종하고, 11일간 배양을 행하였다. 배양은 모든 실험군에 대하여 n=3으로 실시하였다. 배양 온도는 37℃, 교반 속도는 110rpm으로 하였다. 배양 개시 7, 11일째에 세포 배양액을 샘플링하고, 생세포수를 생사 세포 오토애널라이저 Vi-CELLTM XR(베크만·콜터사)을 사용하여 측정하였다.
(3) 배양 결과
배양 7일째의 생세포수를 도 1에 나타낸다. L-시스테인을 사용한 실험구에서는 세포의 증식이 확인되었지만, L-시스테인 무첨가의 실험구에서는 세포의 증식이 확인되지 않았다. 또한, 화합물 1을 사용한 실험구에서는, L-시스테인 무첨가의 실험구와 마찬가지로, 세포의 증식이 확인되지 않았다. 즉, 기초 배지 중의 L-시스테인을 전부 화합물 1로 치환할 수는 없었다. 한편, 화합물 2를 사용한 실험구에서는, L-시스테인을 사용한 실험구와 동등한 세포의 증식이 확인되었다. 즉, 화합물 2는 L-시스테인의 대체물로서 사용 가능하였다.
실시예 2: 피드 배지에의 L-시스테인 유도체 첨가가 CHO 세포의 증식 및 항체 생산에 끼치는 영향의 평가-1
본 실험예에서는, 피드 배지에의 L-시스테인 유도체 첨가가 CHO 세포의 증식 및 항체 생산에 끼치는 영향을 평가하였다. L-시스테인 유도체로서는, 화합물 1 및 2를 사용하였다. CHO 세포로서는, 모노클로날 항체를 생산하도록 개변된 CHO 세포를 사용하였다.
(1) 기초 배지의 조제
CELLiST(등록 상표) Basal media(아지노모토 가부시키가이샤: BASAL3, L-시스테인 1.3mM 함유)에 LR3-IGF-1(SIGMA-ALDRICH: I1271-1MG, 최종 농도 50μg/mL)과 L-글루타민(Thermo Fisher SCIENTIFIC: 25030081, 최종 농도 6mM)을 첨가하고, 기초 배지를 조제하였다.
(2) 피드 배지의 조제
82g/L의 Cellvento(등록 상표) Feed-210(Merck: 1.02488.0005), 70g/L의 글루코오스(와코 쥰야쿠: 043-31163), 및 L-시스테인, 화합물 1 또는 화합물 2를 각각 14.5mM, 29mM 또는 58mM 함유하는 피드 배지(합계 9종류)를 조제하였다. 또한, 82g/L의 Cellvento(등록 상표) Feed-210 및 70g/L의 글루코오스만을 함유하는 L-시스테인 무첨가의 피드 배지를 조제하였다. 별도로, 티로신 농축액(L-티로신2나트륨염2수화물(L-Tyrosine disodium salt dihydrate)(Merck: 122666-87-9) 149.64g/L, pH 11.3)을 조제하였다.
(3) 배양 실험
조제한 기초 배지를 사용하여 3×105cells/mL로 조정한 CHO 세포 현탁액 30mL를 125mL 플라스크(CORNING: 431143)에 파종하고, 14일간 배양을 행하였다. 배양은 모든 실험군에 대하여 n=2로 실시하였다. 배양 온도는 37℃, 교반 속도는 110rpm으로 하였다. 배양 개시 4, 7, 9, 11일째에, 조제한 피드 배지를 각각 1.8mL, 또한 티로신 농축액을 각각 60μL 첨가하였다. 배양 개시 4, 7, 9, 11 및 14일째에 세포 배양액을 샘플링하고, 생세포수를 생사 세포 오토애널라이저 Vi-CELLTM XR(베크만·콜터사)을 사용하여 측정하고, 항체 산생량을 Octet QK(FORTEBIO사)를 사용하여 측정하였다.
(4) 배양 결과
결과를 도 2 및 3에 나타낸다. L-시스테인 무첨가의 실험구에서는, 생세포수 및 항체 생산량이 타실험구와 비교하여 낮았다. 한편, 화합물 1 및 화합물 2를 사용한 실험구에서는, L-시스테인의 실험구와 동등한 항체 생산량이 확인되었다. 즉, 화합물 1은, 기초 배지 중에서는 L-시스테인의 대체물로서 사용할 수 없었지만, 피드 배지 중에서는 시스테인의 대체물로서 사용할 수 있었다. 이것은, 배양 개시 4일 후에는 생세포수가 40×105cells/mL 이상이 되고, 세포의 에스테르 분해 활성이 충분히 높아졌기 때문이라고 추정된다.
실시예 3: 피드 배지 중에서의 L-시스테인 유도체의 안정성 평가
본 실험예에서는, 피드 배지 중에서의 L-시스테인 유도체의 안정성을 평가하였다. L-시스테인 유도체로서는, 화합물 1 및 2를 사용하였다.
82g/L의 Cellvento(등록 상표) Feed-210(Merck: 1.02488.0005), 70g/L의 글루코오스(와코 쥰야쿠: 043-31163), 및 58mM L-시스테인, 58mM 화합물 1 또는 58mM 화합물 2를 함유하는 피드 배지와, 82g/L의 Cellvento(등록 상표) Feed-210 및 70g/L의 글루코오스만을 함유하는 L-시스테인 무첨가의 피드 배지를, Feed-210의 인스트럭션에 기재된 pH 5.2 내지 5.6 및 통상 배양에 사용되는 중성 조건의 pH 7.0으로 조제하고, 합계 8종류의 피드 배지를 얻었다. 어느 피드 배지도, 투명한 용액으로서 조제되었다.
각 피드 배지를, 5℃, 차광 조건에서 보관 후, 결정의 석출을 눈으로 보아 확인하였다. 결과를 표 1에 나타낸다. 표 중, 「-」은 결정의 석출이 확인되지 않은 것을 나타낸다. 표 중, 「+」 내지 「+++」는 결정의 석출이 확인된 것을 나타내고, 「+」의 수가 많을수록, 석출의 정도가 큰 것을 나타낸다. 첨가 조건에서는, 보관 개시 일주일 후부터 현저한 석출이 확인되었다. 또한, 화합물 2 첨가 조건에서는, 보관 개시 22일 후에 석출이 확인되었다. 한편, L-시스테인 무첨가 조건 및 화합물 1 첨가 조건에서는, 보관 개시 30일 후까지 투명한 상태가 계속되고, 결정의 석출은 확인되지 않았다. 이상으로부터, 화합물 1은, 화합물 2보다도 배지 중에서의 안정성이 높은 것이 명백해졌다.
Figure pct00003
실시예 4: L-시스테인 유도체의 제조
(제조예 1)
이하의 방법에 의해, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-메틸에스테르(이하, 「화합물 3」이라고도 함)이며, 2S체를 주로 포함하는 것을 얻었다. 화합물 3의 2S체의 구조를 하기 식 (I-3S)에 나타낸다.
L-시스테인(2.95g, 24.52mmol)을 물(10mL)에 현탁시키고, 피루브산메틸(4mL, 44.27mmol)을 조금씩 적하하였다. 반응액을 실온에서 18시간 교반 후, 석출된 결정을 여과 분별하였다. 여액을 실온에서 방치함으로써, 또한 석출된 고체를 여과 분별함으로써, 화합물 3의 2S체를 주로 포함하는 침상정(약 95％ de)을 얻었다. 당해 2S체를 주로 포함하는 침상정을, 이하 「화합물 3S」라고도 한다.
<분석 데이터>
수율 83％; ESI MS m/z 206.1(M+H)+; 1H NMR(400MHz, CD3OD) δ 4.34(1H, dd, J=6.8, 8.4Hz), 3.74(3H, s), 3.38(1H, dd, J=6.8, 10.0Hz), 3.13(1H, dd, J=8.4, 10.0Hz), 1.84(3H, s).
Figure pct00004
(제조예 2)
이하의 방법에 의해, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-메틸에스테르(화합물 3)이며, 2R체를 주로 포함하는 것을 얻었다. 화합물 3의 2R체의 구조를 하기 식 (I-3R)에 나타낸다.
L-시스테인(2.95g, 24.35mmol)을 50％ 메탄올 수용액(40mL)에 현탁시키고, 피루브산메틸(4mL, 44.27mmol)을 조금씩 적하하였다. 반응액을 실온에서 3시간 교반 후, 감압에 의해 메탄올을 제거하였다. 반응액에 아세트산에틸을 첨가하여 분배 추출하고, 유기층을 무수 황산나트륨으로 탈수 건조 후, 감압에 의해 농축 건고시켰다. 잔사를 아세트산에틸에 용해 후, 헵탄을 첨가하여 -20℃에서 정치하였다. 석출된 고체를 여과 분별함으로써, 화합물 3의 2S체와 2R체의 혼합물을 백색 고체로서 얻었다. 한편, 모액을 농축 건고시킴으로써, 화합물 3의 2R체를 주로 포함하는 백색 고체(약 80％ de)를 얻었다. 당해 2R체를 주로 포함하는 백색 고체를, 이하 「화합물 3R」이라고도 한다.
<분석 데이터>
수율 25％; ESI MS m/z 206.1(M+H)+; 1H NMR(400MHz, CD3OD) δ 4.10(1H, dd, J=6.0, 10.4Hz), 3.82(3H, s), 3.45(1H, dd, J=6.0, 10.4Hz), 2.93(1H, t, J=10.4Hz), 1.70(3H, s).
또한, 별도로, 상기와 마찬가지의 방법으로 얻어진 아세트산에틸 추출물을 물에 현탁시켜 얻어지는 상청을 아세트산에틸로 빠르게 분배 추출함으로써, 화합물 3의 2R체를 약간 많이 포함하는 샘플(약 60％ de)이 얻어지는 것을 확인하였다.
Figure pct00005
(제조예 3)
이하의 방법에 의해, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-에틸에스테르(화합물 1)을 얻었다. 화합물 1의 2S체의 구조를 하기 식 (I-1S)에, 화합물 1의 2R체의 구조를 하기 식 (I-1R)에, 각각 나타낸다.
L-시스테인과 피루브산에틸을 원료로, 제조예 1과 마찬가지의 방법에 의해, 화합물 1(디아스테레오머 혼합물)을 백색 고체로서 얻었다.
<분석 데이터>
수율 82％; 2S체: ESI MS m/z 220.1(M+H)+; 1H NMR(400MHz, CD3OD) δ 4.34(1H, dd, J=6.8, 8.4Hz), 4.20(2H, m), 3.38(1H, dd, J=6.8, 10.4Hz), 3.14(1H, dd, J=8.4, 10.4Hz), 1.84(3H, s), 1.32(3H, t, J=7.2Hz); 2R체: ESI MS m/z 220.1(M+H)+; 1H NMR(400MHz, CD3OD) δ 4.27(2H, m), 4.11(1H, dd, J=6.0, 10.0Hz), 3.46(1H, dd, J=6.0, 10.0Hz), 2.94(1H, t, J=10.0Hz), 1.70(3H, s), 1.29(3H, t, J=7.2Hz).
또한, 별도로, L-시스테인염산염1수화물(4.98g, 28.35mmol)을 물(29.5mL)에 현탁시키고, 8％ 수산화나트륨 수용액(16.84mL)을 조금씩 첨가하고, pH를 6.99로 한 후, 피루브산에틸(3.8mL, 34.12mmol)을 조금씩 적하하였다. 반응액을 실온에서 10시간 교반 후, 10℃에서 12시간 교반하고, 석출된 결정을 여과 분별함으로써, 화합물 1의 2R체를 주로 포함하는 침상정(약 90％ de)을 얻었다.
Figure pct00006
Figure pct00007
(제조예 4)
이하의 방법에 의해, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-i-프로필에스테르(이하, 「화합물 4」라고도 함)를 얻었다. 화합물 4의 2S체 및 2R체의 구조를 하기 식 (I-4S) 및 (I-4R)에 각각 나타낸다.
L-시스테인과 피루브산i-프로필을 원료로, 제조예 1과 마찬가지의 방법에 의해, 화합물 4(디아스테레오머 혼합물)를 백색 고체로서 얻었다.
<분석 데이터>
수율 51％; 2S체: ESI MS m/z 233.9(M+H)+; 1H NMR(400MHz, CD3OD) δ 5.00(1H, m), 4.34(1H, dd, J=6.8, 8.0Hz), 3.38(1H, dd, J=6.8, 10.4Hz), 3.13(1H, dd, J=8.0, 10.4Hz), 1.82(3H, s), 1.28(3H, d, J=6.0Hz), 1.27(3H, d, J=6.4Hz); 2R체: ESI MS m/z 233.9(M+H)+; 1H NMR(400MHz, CD3OD) δ 5.08(1H, m), 4.10(1H, dd, J=6.0, 10.4Hz), 3.45(1H, dd, J=6.0, 10.4Hz), 2.93(1H, t, J=10.4Hz), 1.69(3H, s), 1.31(3H, d, J=6.4Hz), 1.30(3H, d, J=6.4Hz).
Figure pct00008
Figure pct00009
(제조예 5)
이하의 방법에 의해, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-n-부틸에스테르(이하, 「화합물 5」라고도 함)를 얻었다. 화합물 5의 2S체 및 2R체의 구조를 하기 식 (I-5S) 및 (I-5R)에 각각 나타낸다.
L-시스테인과 피루브산n-부틸을 원료로, 제조예 1과 마찬가지의 방법에 의해, 화합물 5(디아스테레오머 혼합물)를 백색 고체로서 얻었다.
<분석 데이터>
수율 41％; 2S체: ESI MS m/z 247.9(M+H)+; 1H NMR(400MHz, CD3OD) δ 4.34(1H, dd, J=6.8, 8.0Hz), 4.15(2H, t, J=6.4Hz), 3.38(1H, dd, J=6.8, 10.4Hz), 3.14(1H, dd, J=8.0, 10.4Hz), 1.84(3H, s), 1.69-1.63(2H, m), 1.50-1.40(2H, m), 0.98(3H, t, J=7.2Hz); 2R체: ESI MS m/z 247.9(M+H)+; 1H NMR(400MHz, CD3OD) δ 4.29-4.18(2H, m), 4.10(1H, dd, J=6.0, 10.4Hz), 3.46(1H, dd, J=6.0, 10.4Hz), 2.93(1H, t, J=10.4Hz), 1.70(3H, s), 1.69-1.63(2H, m), 1.50-1.40(2H, m), 0.99(3H, t, J=7.6Hz).
Figure pct00010
Figure pct00011
(제조예 6)
이하의 방법에 의해, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-t-부틸에스테르(이하, 「화합물 6」이라고도 함)를 얻었다. 화합물 6의 2S체 및 2R체의 구조를 하기 식 (I-6S) 및 (I-6R)에 각각 나타낸다.
L-시스테인과 피루브산t-부틸을 원료로, 제조예 1과 마찬가지의 방법에 의해, 화합물 6(디아스테레오머 혼합물)을 백색 고체로서 얻었다.
<분석 데이터>
수율 64％; 2S체: ESI MS m/z 247.9(M+H)+; 1H NMR(400MHz, CD3OD) δ 4.32(1H, dd, J=7.2, 8.0Hz), 3.37(1H, dd, J=7.2, 10.4Hz), 3.13(1H, dd, J=8.0, 10.4Hz), 1.80(3H, s), 1.49(9H, s); 2R체: ESI MS m/z 246.0(M-H)-; 1H NMR(400MHz, CD3OD) δ 4.08(1H, dd, J=6.0, 8.0Hz), 3.43(1H, dd, J=6.0, 10.4Hz), 2.90(1H, t, J=10.4Hz), 1.66(3H, s), 1.52(9H, s).
Figure pct00012
Figure pct00013
(제조예 7)
이하의 방법에 의해, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-n-옥틸에스테르(이하, 「화합물 7」이라고도 함)를 얻었다. 화합물 7의 2S체 및 2R체의 구조를 하기 식 (I-7S) 및 (I-7R)에 각각 나타낸다.
L-시스테인과 피루브산n-옥티틸을 원료로, 제조예 1과 마찬가지의 방법에 의해, 화합물 7(디아스테레오머 혼합물)을 백색 밀랍상 물질로서 얻었다.
<분석 데이터>
수율 44％; 2S체: ESI MS m/z 304.0(M+H)+; 1H NMR(400MHz, CD3OD) δ 4.35(1H, dd, J=6.8, 8.0Hz), 4.15(2H, t, J=6.8Hz), 3.38(1H, dd, J=6.8, 10.4Hz), 3.14(1H, dd, J=8.4, 10.4Hz), 1.84(3H, s), 1.74-1.64(2H, m), 1.43-1.32(10H, m), 0.94-0.91(3H, m); 2R체: ESI MS m/z 304.0(M+H)+; 1H NMR(400MHz, CD3OD) δ 4.10(1H, dd, J=6.0, 10.0Hz), 4.27-4.17(2H, m), 3.46(1H, dd, J=6.0, 10.4Hz), 2.93(1H, dd, J=10.0, 10.4Hz), 1.74-1.64(5H, m), 1.43-1.32(10H, m), 0.94-0.91(3H, m).
Figure pct00014
Figure pct00015
(제조예 8)
이하의 방법에 의해, (2RS,4R)-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-에틸에스테르(이하, 「화합물 8」이라고도 함)를 얻었다. 화합물 8의 2S체 및 2R체의 구조를 하기 식 (I-8S) 및 (I-8R)에 각각 나타낸다.
L-시스테인과 글리옥실산에틸을 원료로, 제조예 1과 마찬가지의 방법에 의해, 화합물 8(디아스테레오머 혼합물)을 백색 고체로서 얻었다.
<분석 데이터>
수율 67％; 2S체: ESI MS m/z 205.9(M+H)+; 1H NMR(400MHz, CD3OD) δ 4.38(1H, dd, J=6.0, 6.4Hz), 4.31-4.24(2H, m), 3.27(1H, dd, J=6.4, 10.4Hz), 3.11(1H, dd, J=6.0, 10.4Hz), 1.29(3H, t, J=7.2Hz); 2R체: ESI MS m/z 206.0(M+H)+; 1H NMR(400MHz, CD3OD) δ 4.23-4.19(2H, m), 3.96(1H, dd, J=6.4, 10.0Hz), 3.38(1H, dd, J=6.4, 10.0Hz), 2.89(1H, t, J=10.0Hz), 1.31(3H, t, J=6.8Hz).
Figure pct00016
Figure pct00017
(제조예 9)
이하의 방법에 의해, (2RS,4R)-2-(4-히드록시페닐)메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-메틸에스테르(이하, 「화합물 9」라고도 함)를 얻었다. 화합물 9의 2S체 및 2R체의 구조를 하기 식 (I-9S) 및 (I-9R)에 각각 나타낸다.
L-시스테인과 4-히드록시페닐피루브산메틸을 원료로, 제조예 1과 마찬가지의 방법에 의해, 화합물 9(디아스테레오머 혼합물)을 담갈색 사탕 형상 물질로서 얻었다. 화합물 9의 물 현탁액에, 등몰의 탄산수소나트륨을 첨가하여 용해 후, 감압에 의해 농축 건고시킴으로써, 대응하는 Na염을 담갈색 고체로서 얻었다. 이후의 실험에는, Na염을 이용하였다.
<분석 데이터(프리체)>
수율 61％; 2S체: ESI MS m/z 297.9(M+H)+; 1H NMR(400MHz, CD3OD) δ 7.17(2H, d, J=8.4Hz), 6.74(2H, d, J=8.4Hz), 4.19(1H, dd, J=6.4, 8.4Hz), 3.73(3H, s), 3.40-3.32(2H, m), 3.26(1H, dd, J=6.4, 10.0Hz), 2.84(1H, dd, J=8.4, 10.0Hz). 2R체: ESI MS m/z 297.9(M+H)+; 1H NMR(400MHz, CD3OD) δ 7.13(2H, d, J=8.4Hz), 6.68(2H, d, J=8.4Hz), 3.89(1H, dd, J=6.4, 8.4Hz), 3.74(3H, s), 3.19-3.08(2H, m), 2.80(1H, t, J=10.0Hz).
Figure pct00018
Figure pct00019
(제조예 10)
이하의 방법에 의해, (2RS,4R)-2-i-프로필-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-에틸에스테르(이하, 「화합물 10」이라고도 함)를 얻었다. 화합물 10의 2S체 및 2R체의 구조를 하기 식 (I-10S) 및 (I-10R)에 각각 나타낸다.
L-시스테인과 2-케토이소발레르산에틸을 원료로, 제조예 1과 마찬가지의 방법에 의해, 화합물 10(디아스테레오머 혼합물, 주로 2S체)을 백색 고체로서 얻었다.
<분석 데이터>
수율 54％; 2S체: ESI MS m/z 248.0(M+H)+; 1H NMR(400MHz, CD3OD) δ 4.26-4.21(2H, m), 4.13(1H, dd, J=6.4, 9.2Hz), 3.29(1H, dd, J=6.4, 10.4Hz), 2.85(1H, t, J=9.6Hz), 2.48(1H, m), 1.30(3H, t, J=7.2Hz), 1.16(3H, d, J=7.2Hz), 1.08(3H, d, J=6.8Hz); 2R체: ESI MS m/z 247.9(M+H)+.
Figure pct00020
Figure pct00021
(제조예 11)
이하의 방법에 의해, (2RS,4R)-2-i-부틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-메틸에스테르(이하, 「화합물 11」이라고도 함)를 얻었다. 화합물 11의 2S체 및 2R체의 구조를 하기 식 (I-11S) 및 (I-11R)에 각각 나타낸다.
L-시스테인과 2-케토이소카프로산메틸을 원료로, 제조예 1과 마찬가지의 방법에 의해, 화합물 11(디아스테레오머 혼합물)을 무색 사탕 형상 물질로서 얻었다. 화합물 11의 물 현탁액에, 등몰의 탄산수소나트륨을 첨가하여 용해 후, 감압에 의해 농축 건고시킴으로써, 대응하는 Na염을 백색 고체로서 얻었다. 이후의 실험에는, Na염을 이용하였다.
<분석 데이터(프리체)>
수율 58％; 2S체: ESI MS m/z 247.9(M+H)+; 1H NMR(400MHz, CD3OD) δ 4.26(1H, dd, J=6.8, 8.8Hz), 3.73(3H, s), 3.29(1H, dd, J=6.8, 10.4Hz), 2.98(1H, dd, J=8.8, 10.4Hz), 2.30(1H, dd, J=8.0, 14.4Hz), 1.99(1H, dd, J=5.6, 14.4Hz), 1.83(1H, m), 1.02(3H, d, J=6.8Hz), 0.89(3H, d, J=6.8Hz); 2R체: ESI MS m/z 248.0(M+H)+; 1H NMR(400MHz, CD3OD) δ 4.00(1H, dd, J=6.0, 10.0Hz), 3.80(3H, s), 3.38(1H, dd, J=6.0, 10.0Hz), 2.80(1H, t, J=10.0Hz), 2.05(1H, dd, J=6.8, 14.4Hz), 1.90(1H, dd, J=6.0, 14.4Hz), 1.74(1H, m), 0.98(3H, d, J=6.4Hz), 0.84(3H, d, J=6.8Hz).
Figure pct00022
Figure pct00023
실시예 5: 피드 배지에의 L-시스테인 유도체 첨가가 CHO 세포의 증식 및 항체 생산에 끼치는 영향의 평가-2
(1) 기초 배지의 조제
CELLiST(등록 상표) Basal media(아지노모토 가부시키가이샤: BASAL3, L-시스테인 1.3mM 함유)에 LR3-IGF-1(SIGMA-ALDRICH: I1271-1MG, 최종 농도 50μg/mL)과 L-글루타민(Thermo Fisher SCIENTIFIC: 25030081, 최종 농도 6mM)을 첨가하고, 기초 배지를 조제하였다.
(2) 피드 배지의 조제
82g/L의 Cellvento(등록 상표) Feed-210(Merck: 1.02488.0005), 70g/L의 글루코오스(와코 쥰야쿠: 043-31163), 및 L-시스테인, 화합물 3S 또는 화합물 3R을 각각 14.5mM, 29mM 또는 58mM 함유하는 피드 배지를 조제하였다. 별도로, 티로신 농축액(L-티로신2나트륨염2수화물(Merck: 122666-87-9) 74.82g/L, pH 11.3)을 조제하였다.
(3) 배양 실험
조제한 기초 배지를 사용하여 3×105cells/mL로 조정한 CHO 세포 현탁액 3mL를 6웰 플레이트(CORNING, Cat. No. CLS3471)에 파종하고, 14일간 배양을 행하였다. 배양은 모든 실험군에 대하여 n=2로 실시하였다. 배양 온도는 37℃, 교반 속도는 110rpm으로 하였다. 배양 개시 4, 7, 9, 11일째에, 조제한 피드 배지를 각각 0.18mL, 또한 티로신 농축액을 각각 12μL 첨가하였다. 배양 개시 4, 7, 9, 11 및 14일째에 세포 배양액을 샘플링하고, 생세포수를 생사 세포 오토애널라이저 Vi-CELLTM XR(베크만·콜터사)을 사용하여 측정하고, 배양 개시 11 및 14일째의 항체 산생량을 Octet QK(FORTEBIO사)를 사용하여 측정하였다.
(4) 배양 결과
결과를 도 4 및 5에 나타낸다. 피드 배지 중의 L-시스테인을 화합물 3S 또는 화합물 3R로 대체하면, 14.5mM에서는 세포의 증식성은 7할 정도로 감소되기는 하지만 세포 증식이 확인되고, 농도 의존적으로 세포수는 증가하였다. IgG 생산량에 대해서도, 화합물 3S 및 화합물 3R 중 어느 것을 사용했을 때에도 농도 의존적으로 증가하고, 58.0mM 첨가구에서는 L-시스테인염산염1수화물을 14.5mM 또는 29.0mM 첨가구와 동등하였다. 이상의 결과로부터, 화합물 3은 L-시스테인의 대체가 가능하고, 또한 화합물 3의 2S체와 2R체는 동등한 효과를 갖는 것이 나타내졌다.
실시예 6: 피드 배지에의 L-시스테인 유도체 첨가가 CHO 세포의 증식 및 항체 생산에 끼치는 영향의 평가-3
(1) 기초 배지의 조제
CELLiST(등록 상표) Basal media(아지노모토 가부시키가이샤: BASAL3, L-시스테인 1.3mM 함유)에 LR3-IGF-1(SIGMA-ALDRICH: I1271-1MG, 최종 농도 50μg/mL)과 L-글루타민(Thermo Fisher SCIENTIFIC: 25030081, 최종 농도 6mM)을 첨가하고, 기초 배지를 조제하였다.
(2) 피드 배지의 조제
82g/L의 Cellvento(등록 상표) Feed-210(Merck: 1.02488.0005), 70g/L의 글루코오스(와코 쥰야쿠: 043-31163), 및 L-시스테인, 화합물 4, 화합물 8, 화합물 9 또는 화합물 11을 각각 58mM 함유하는 피드 배지를 조제하였다. 또한, 82g/L의 Cellvento(등록 상표) Feed-210 및 70g/L의 글루코오스만을 함유하는 L-시스테인 무첨가의 피드 배지를 조제하였다. 별도로, 티로신 농축액(L-티로신2나트륨염2수화물(Merck: 122666-87-9) 74.82g/L, pH 11.3)을 조제하였다.
(3) 배양 실험
조제한 기초 배지를 사용하여 3×105cells/mL로 조정한 CHO 세포 현탁액 30mL를 125mL 플라스크(CORNING: 431143)에 파종하고, 11일간 배양을 행하였다. 배양은 모든 실험군에 대하여 n=2로 실시하였다. 배양 온도는 37℃, 교반 속도는 110rpm으로 하였다. 배양 개시 4, 7, 9일째에, 조제한 피드 배지를 각각 1.8mL, 또한 티로신 농축액을 각각 120μL 첨가하였다. 배양 개시 4, 7, 9 및 11일째에 세포 배양액을 샘플링하고, 생세포수를 생사 세포 오토애널라이저 Vi-CELLTM XR(베크만·콜터사)을 사용하여 측정하고, 항체 산생량을 Octet QK(FORTEBIO사)를 사용하여 측정하였다.
(4) 배양 결과
결과를 도 6 및 7에 나타낸다. 화합물 4, 화합물 8 또는 화합물 9를 사용한 실험구에서는, L-시스테인 무첨가와 비교하여 높은 세포수 및 항체 생산량이 확인되고, 이들 화합물로 L-시스테인의 대체가 가능한 것이 나타내졌다. 한편, 화합물 11을 사용한 실험구에서는, L-시스테인 무첨가와 비교하여 세포수 및 항체 생산량이 저하되었다.
실시예 7: 완충액 중에서의 L-시스테인 유도체의 안정성 평가
본 실험예에서는, 완충액 중에서의 L-시스테인 유도체의 안정성을 평가하였다. L-시스테인 유도체로서는, 화합물 1, 2, 3S, 3R, 4, 6, 8 및 9를 사용하였다.
PBS Tablets(다카라 바이오사, 제품 코드 T900)를 증류수에 용해시키고, 9.57mM, pH 7.4의 PBS 완충액을 얻었다. PBS 완충액에 L-시스테인 또는 화합물 1, 2, 3S, 3R, 4, 6, 8 혹은 9를 58mM이 되도록 용해시키고, 필요에 따라서 중조수를 첨가하여 pH를 7.0 내지 7.2로 하고, 합계 9종류의 용액을 얻었다. 그들 용액은 모두 투명한 용액으로서 조제되었다.
각 용액을 5℃, 차광 조건에서 보관 후, 결정의 석출을 눈으로 보아 확인하였다. 결과를 표 2에 나타낸다. 표 중, 「-」는 결정의 석출이 확인되지 않은 것을 나타낸다. 표 중, 「+」 내지 「+++」는 결정의 석출이 확인된 것을 나타내고, 「+」의 수가 많을수록, 석출의 정도가 큰 것을 나타낸다. L-시스테인 첨가 조건에서는, 보관 개시 3일 후에 현저한 석출이 확인되었다. 한편, 다른 조건에서는, 보관 개시 24일 후까지 투명한 상태가 계속되고, 결정의 석출은 확인되지 않았다. 이상으로부터, 화합물 1, 2, 3S, 3R, 4, 6, 8 및 9는 모두, L-시스테인보다도 배지 중에서의 안정성이 높은 것이 명백해졌다.
Figure pct00024
본 발명에 따르면, 동물 세포를 배양할 수 있다. 일 양태에 있어서, 본 발명에 따르면, 동물 세포를 이용하여 단백질 등의 목적 물질을 제조할 수 있다.

Claims (31)

  1. 동물 세포 배양용의 배지이며,
    유효 성분을 함유하고,
    상기 유효 성분이 하기 식 (I)로 나타내지는 화합물인, 배지:
    Figure pct00025

    식 (I) 중, 「R1」은 치환기를 갖고 있어도 되는 C1-22알킬기를 나타내고, 「R2」는 수소 원자, 치환기를 갖고 있어도 되는 C6-12아릴기, 또는 치환기를 갖고 있어도 되는 직쇄 C1-6알킬기를 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 「R1」이 C1-12알킬기, 또는 치환기를 갖고 있어도 되는 C6-12아릴기로 치환된 C1-6알킬기이며, 또한/또는
    상기 「R2」가 수소 원자, 직쇄 C1-6알킬기, 치환기를 갖고 있어도 되는 C6-12아릴기로 치환된 직쇄 C1-6알킬기, 또는 C1-7아실기로 치환된 직쇄 C1-6알킬기인,
    배지.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유효 성분이, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-에틸에스테르, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-메틸에스테르, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-i-프로필에스테르, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-n-부틸에스테르, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-t-부틸에스테르, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-n-옥틸에스테르, (2RS,4R)-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-에틸에스테르, (2RS,4R)-2-(4-히드록시페닐)메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-메틸에스테르, 그리고 그들의 2R체 및 2S체로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물인, 배지.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유효 성분이, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-에틸에스테르 그리고 그 2R체 및 2S체로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물인, 배지.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유효 성분이, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-메틸에스테르 그리고 그 2R체 및 2S체로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물인, 배지.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 유효 성분 농도가 0.92mM 이상인, 배지.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 유효 성분 농도가 5mM 이상인, 배지.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 유효 성분 농도가 10mM 이상인, 배지.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 유가 배지인, 배지.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 초발 배지인, 배지.
  11. 목적 물질의 제조 방법이며,
    목적 물질 생산능을 갖는 동물 세포를 배지에서 배양하는 것; 및
    목적 물질을 회수하는 것
    을 포함하고,
    상기 배양이 유효 성분의 존재 하에서 실시되고,
    상기 유효 성분이 하기 식 (I)로 나타내지는 화합물인, 방법:
    Figure pct00026

    식 (I) 중, 「R1」은 치환기를 갖고 있어도 되는 C1-22알킬기를 나타내고, 「R2」는 수소 원자, 치환기를 갖고 있어도 되는 C6-12아릴기, 또는 치환기를 갖고 있어도 되는 직쇄 C1-6알킬기를 나타낸다.
  12. 제11항에 있어서, 상기 목적 물질이 단백질인, 방법.
  13. 동물 세포의 배양 방법이며,
    동물 세포를 배지에서 배양하는 것
    을 포함하고,
    상기 배양이 유효 성분의 존재 하에서 실시되고,
    상기 유효 성분이 하기 식 (I)로 나타내지는 화합물인, 방법:
    Figure pct00027

    식 (I) 중, 「R1」은 치환기를 갖고 있어도 되는 C1-22알킬기를 나타내고, 「R2」는 수소 원자, 치환기를 갖고 있어도 되는 C6-12아릴기, 또는 치환기를 갖고 있어도 되는 직쇄 C1-6알킬기를 나타낸다.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 「R1」이 C1-12알킬기, 또는 치환기를 갖고 있어도 되는 C6-12아릴기로 치환된 C1-6알킬기이며, 또한/또는
    상기 「R2」가 수소 원자, 직쇄 C1-6알킬기, 치환기를 갖고 있어도 되는 C6-12아릴기로 치환된 직쇄 C1-6알킬기, 또는 C1-7아실기로 치환된 직쇄 C1-6알킬기인,
    방법.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유효 성분이, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-에틸에스테르, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-메틸에스테르, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-i-프로필에스테르, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-n-부틸에스테르, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-t-부틸에스테르, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-n-옥틸에스테르, (2RS,4R)-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-에틸에스테르, (2RS,4R)-2-(4-히드록시페닐)메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-메틸에스테르, 그리고 그들의 2R체 및 2S체로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물인, 방법.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유효 성분이, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-에틸에스테르 그리고 그 2R체 및 2S체로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물인, 방법.
  17. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유효 성분이, (2RS,4R)-2-메틸-2,4-티아졸리딘디카르복실산2-메틸에스테르 그리고 그 2R체 및 2S체로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물인, 방법.
  18. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유효 성분이, 배양 개시 후에 상기 배지에 공급되는, 방법.
  19. 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유효 성분이, 배양 개시 시에 상기 배지에 함유되는, 방법.
  20. 제11항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 시의 상기 배지 중의 유효 성분 농도가 0.92mM 이상인, 방법.
  21. 제11항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 시의 상기 배지 중의 유효 성분 농도가 1.5mM 이상인, 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 유효 성분이, 배양 개시 후에 상기 농도로 상기 배지에 함유되도록 해당 배지에 공급되는, 방법.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유효 성분이, 배양 개시 시에 상기 농도로 상기 배지에 함유되는, 방법.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유효 성분이, 배양 중의 특정 기간을 통한 평균값으로서, 상기 농도로 상기 배지에 함유되고,
    상기 특정 기간이, 배양의 전기간 또는 배지 중에서의 동물 세포의 생세포 밀도가 5×106cells/mL 이상인 기간인, 방법.
  25. 제11항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유효 성분이, 배양 중의 특정 기간을 통하여, 1일당 0.1mM 이상의 공급량으로 상기 배지에 공급되고,
    상기 특정 기간이, 배양의 전기간 또는 배지 중에서의 동물 세포의 생세포 밀도가 5×106cells/mL 이상인 기간인, 방법.
  26. 제11항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유효 성분이, 배양 중의 특정 기간을 통하여, 1일당 0.3mM 이상의 공급량으로 상기 배지에 공급되고,
    상기 특정 기간이, 배양의 전기간 또는 배지 중에서의 동물 세포의 생세포 밀도가 5×106cells/mL 이상인 기간인, 방법.
  27. 제11항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양이, 상기 유효 성분을 함유하는 유가 배지를 사용한 관류 배양을 실시하는 것을 포함하는, 방법.
  28. 제11항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양이, 시스테인 관련 물질의 존재 하에서 실시되고,
    상기 시스테인 관련 물질이, 상기 유효 성분 이외의, 시스테인 및 그의 유도체에서 선택되는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 시스테인 관련 물질이, 시스테인, 시스틴 및 시스테이닐피루브산에서 선택되는, 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 시스테인 관련 물질이, 배양 개시 시에 상기 배지에 함유되는, 방법.
  31. 하기 식 (I)로 나타내지는 화합물의 제조 방법이며,
    L-시스테인과 하기 식 (II)로 나타내지는 피루브산 유도체를 함수 매체 중에서 반응시키고, 이로써 상기 화합물의 결정을 생성하는 것; 및
    상기 결정을 회수하는 것
    을 포함하는, 방법:
    Figure pct00028

    Figure pct00029

    식 (I) 및 식 (II) 중, 「R1」은 C1-C6알킬기를 나타내고, 「R2」는 메틸기를 나타낸다.
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