KR20220153078A - 전격성 간 장애의 치료 및/또는 예방용 간 줄기-유사 세포 - Google Patents

전격성 간 장애의 치료 및/또는 예방용 간 줄기-유사 세포 Download PDF

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Abstract

본 발명은 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포의 집단 및 전격성 간 장애를 치료 및 방지하기 위한, 이의 치료학적 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포는 다능성 줄기 세포로부터 안전하게 및 재생가능하게 생성될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포는 생리학적으로 성숙한 간 세포가 알부민 발현 마커(ALB-)를 결여하고 있으므로, 이의 표현형을 나타내지 않지만, 이는 여전히 급성 부전을 지닌 질환이 있는 간에서 이식되어, 질환이 있는 간을 구조하고 간 재생을 촉진할 수 있다. 더욱이, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포의 제조의 다양한 프로토콜이 시행될 수 있고, 모두는 고 품질 및 고 수율의 생산을 야기한다. 최종적으로, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포는 동결보존될 수 있고 또한 스페로이드 입자와 같이 제조될 수 있다.

Description

전격성 간 장애의 치료 및/또는 예방용 간 줄기-유사 세포
본 발명은 간 줄기-유사 세포(hepatic stem-like cell)를 포함하는 세포의 집단, 및 전격성 간 장애(fulminant liver disorder)의 치료 및/또는 예방을 위한 이의 치료학적 용도에 관한 것이다. 특히, ALB 마커(ALB-)를 발현하지 않고, 예컨대, 다능성 줄기 세포(pluripotent stem cell; pSC)로부터 수득된, AFP 마커(AFP+)를 발현하는 간 줄기-유사 세포를 전격성 간 장애, 예를 들면, 급성 간 부전(acute liver failure; ALF) 또는 급성의 만성 간 부전(acute chronic liver failure; ACLF)을 갖는 간에 주사될 수 있고, 간 재생을 증진할 수 있다.
간 장애는 전세계적으로 수백만의 사람에에 영향을 미친다. 간 장애 중에서, 전격성 간 장애는 간 생리학적 성능의 신속하고 중증인 기능장애에 의해 특징화되며, 급성 간 부전(ALF) 및 급성의 만성 간 부전(ACLF)과 같은 장애를 포함한다. ACLF 자체는 간 부전의 급성 에피소드(episode)에 의해 특징화된 간 질환을 포함하고, 이는 만성 간 질환, 예를 들면, 예컨대 비-알코올성 지방 간염(non-alcoholic steato-hepatitis; NASH), 알코올성 간염(alcoholic hepatitis), 바이러스-유도된 간염(viral-induced hepatitis), 잠재성 간 질환(cryptogenic liver disease), 악성 간 질환(malignant liver disease), 예를 들면, 간세포 암종(hepatocellular carcinoma) 및 쓸개관염(cholangiocarcinoma), 암종(carcinoma), 자가면역 간염(autoimmune hepatitis), 혈관 간 질환(vascular liver disease), 예를 들면, 버드-키아리 증후군(Budd-Chiari syndrome), 쓸개즙정체 간 질환(cholestatic liver disease), 유전된 대사 간 질환(inherited metabolic liver disease), 예를 들면, 윌슨 질환(Wilson's disease) 및 우레아 주기 결함(urea cycle defect)과 관련된 진행성 간 악화의 결과이다. 다시 말해서, 전격성 간 장애는 말기-단계 간 질환(End-stage Liver Disease; MELD)에 대한 모델과 같은 기관 할당(organ allocation)을 위한 점수매김 시스템을 사용하는 경우 간 이식(liver transplantation)을 위해 우선 순위가 매겨진 임의의 질환을 지칭한다(Martin 등, 2014).
간 이식은 현재 전격성 및/또는 중증 대사성 간 장애를 지닌 환자를 치료하기 위한 금 표준으로서 고려된다. 서구 국가에서 수만명의 환자가 간 이식을 위한 대기자 명단에 올려져 있다. 1968년부터 2015년까지, 대략 130,000건의 간 이식이 유럽에서 수행되었다(유럽 간 이식 등록(European Liver Transplant Registry)). 그러나, 환자의 10 내지 20%는 기관 공여자의 부족으로 인하여, 간 이식을 위한 대기자 명단에 올려져 있는 상태로 이식을 받지 못하고 죽고 있다.
ALF 및 ACLF는 단기간 생명을 위협하는 질환 및 희귀 상태이며 여기서 간의 급속한 악화는 공지된 기존의 간 장애가 없는(ALF) 또는 있는(ACLF) 개인에서 변경된 정신상태 및 응고장애를 야기한다. ALF 및 ACLF의 주요 임상 신호는 피부와 안구의 급속한 진행의 황달, 복부 통증, 오심, 구토, 쇠약, 및 가벼운 혼란으로 시작하여 혼수상태 및 간 이외의 다중 기관 부전으로 진행할 수 있는 정신 상태에서의 변화이다. ALF 및 ACLF의 생화학적 표시는 일반적으로 비정상적인 간 생화학적 값 및 응고장애를 포함한다. 임상 실시와 일치하고, 위에서 언급한 바와 같이, ALF 및 ACLF의 중증 형태에 대한 현재의 치료 선택은 동소 간(orthotopic liver; OLT)이다.
그러나, OLT는 기증자의 부족으로 인하여 심각하게 제한된다. 지금까지, 간세포 이식(hepatocyte transplantation; HT)는 OLT의 대안으로 고려되어 왔으며, 환자에서 간 기능을 증진시키는 것으로 밝혀졌다. HT는 기술의 안전성 및 예비 효능을 나타내는 것으로 입증되었고, 전세계적으로 발표되었다(Dhawan 등; 2010; Hansel 등; 2014; Dhawan 등, 2019). 그러나, 다량의 기능성 간세포를 재생가능한 품질로 수득하는 것은 어렵다. 또한, HT를 제공받은 환자는 또한 면역억제제로 치료될 수 있으므로, 이식 거부를 제한할 수 있다.
따라서, 시험관 내(in vitro)에서 증폭되고 후속적으로 간세포로 분화되어야 하는, 줄기 세포를 포함하는, 새로운 세포 유형의 잠재능을 탐구할 중요한 필요성이 존재한다. 예시적으로, 최종적인 내배엽 줄기 세포, 사람 배아 줄기 세포(human embryonic stem cell; hESC), 사람 유도된 다능성 줄기 세포(hiPSC) 및 다능성 줄기 세포, 예를 들면, 간엽 줄기 세포를 사용하여 간세포 또는 간세포-유사 세포(hepatocyte-like cell; HCL)를 생성하여 왔다(Pareja 등, 2017).
예를 들면, WO2016043666는 간세포-유사 세포(HLC)를 수득하기 위하여 최종적인 내배엽 줄기 세포를 분화시키는 방법을 개시하였다.
실제로, 사람 배아 줄기 세포(human embryonic stem cell; hESC)는 이론적으로, 간 재생을 위한 기능성 간세포의 제한되지 않은 공급원을 나타낸다. 중간 세포가 미성숙 유전자 발현 프로파일을 나타낼 수 있지만, 사람 배아 줄기 세포(HLC)는 시험관 내에서 간세포-유사 세포(HLC)로 효율적으로 분화될 수 있다(참고: Cameron 등; 2015). 이러한 HLC는 성체 간에서 발견된 세포와 많은 기능 및 유전자 발현 프로파일을 공유한다(Payne 등; 2011). 연구자는 마우스 내 아세트아미노펜-유도된 급성 간 부전 모델에서 신생아 HLC가 종양을 유도하지 않고, 생체 내(in vivo)에서 질환이 있는 간을 소생(repopulate)시키고 재생시킬 수 있는 시킬 수 있음을 나타낼 수 있었다. 이러한 데이타는 hESC 유래된 HLC가 간 질환을 치료하기 위한 간 이식에 대한 대안의 효과적인 치료일 수 있다는 개념의 확실한 증거를 제공한다(Tolosa 등; 2015).
동일한 취지로, 문헌(Roelandt et al. (2010))에서는 분화 배양 배지의 수단으로 hESC로부터 유래된 간세포를 당해 분야의 상태에 제공하려고 시도하였다. 최종의 내배엽 세포의 간세포로의 분화는 다양한 활성인자 및/또는 생리학적 신호전달 경로의 억제제 뿐만 아니라, 다양한 성장 인자의 존재를 사용한 정밀한 유도의 순서를 포함하는 프로토콜의 실행을 필요로 한다. 간세포-유사 세포는 20일 이내에 생산되며, 이러한 세포는 알부민 및 Cyp450s와 같은 성숙한 간세포에 대해 적절한 발현 마커이므로, 이의 해독 능력에 의해 추가로 특징화된다. 문헌(Siller at al. (2015))은 성장 인자가 없는 배양 배지 속에서 다능성 줄기 세포를 간세포로 분화시키는 방법을 추가로 제공하였다.
더욱이, WO2019055345는 재생 의약을 위해 사람 유도된 다능성 줄기 세포(hiPSC)로부터 간세포-유사 세포(HLC)를 재생시키는 방법을 개시하였다. HLC는 알부민 마커(ALB+)를 발현하고 전격성 간 부전을 지닌 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있으므로, 알부민 물질대사시킬 수 있고 해독 특성을 지닐 수 있다.
또한, 문헌(Takayama et al. (2013))은 hESC-유래되고 hiPSC-유래된 간모세포-유사 세포(hepatoblast-like cell; HBC)를 당해 분야의 상태에 제공하였다. 저자는 초기 계대배양된 HBC(P0; ALB- 세포) 및 말기 계대배양된 HBC(P10; ALB+ 세포) 둘 다가 간에서 이식될 수 있음을 나타내었다. 이식 후 hESC-유래된 HBC P0 또는 HBC P10의 간세포 기능성은 수용체 마우스에서 분비된 사람 ALB 수준을 측정함으로써 평가하였다. 다카야마(Takayama) 등은 ALB 발현 수준이 매우 약한 ALB 발현만을 야기한, HBC PO와 비교하여, HBC P10과 함께 이식시, 더 높았음을 관찰하였다. 이와 함께, ALB와 관련된 해독 특성이 가장 진전되어 있으므로, 결과는 간 이식을 위한 HBC P10(ALB+ 세포)의 장점을 취하는 것을 제시한다. 이러한 관찰과 일치하여, 문헌(Takayama et al. (2017))은 후에 계대배양된 HBC(P10)을 사용한 연구를 발표하였으며, 이러한 세포는 간 치료요법에서 세포 이식을 위한 선택 세포로서 구체적으로 사용되었다.
사람 태아 간 세포 이식은 또한 간 질환의 치료를 위해 광범위하게 평가되었다(참고, 예컨대, Pietrosi 등, 2015; Rao 등, 2008; Zheng 등, 2006; Jochheim 등, 2004). 뢸란트(Roelandt) 등에 의해 개시된 간세포와 유사하게, 이러한 연구에 의해 개시된 사람 태아 간 세포는 성숙한 간세포의 마커인, 알부민 단백질(ALB+)을 발현하고 있다.
전적으로, 당해 분야의 상태에서의 실시로부터 이러한 프로토콜에 의해 생성된 간 세포가 건강한 간으로부터 간 세포의 성숙한 상태를 일반적으로 대표하는 마커, 즉, 알부민(ALB+)의 발현에 의해 특징화되는 것으로 나타나며, 이러한 마커는 우레아 물질대사 및 CYP450 해독 특성, 예를 들면, CYP2E1, CYP3A7 및 일부 CYP3A4 활성과 같은 성숙한 간세포의 다른 특성과 관련되어 있다(참고: Carpenter 등, 1996; Chinnici 등, 2015; Pietrosi 등, 2015).
놀랍게도, 이론적으로 미성숙 간세포를 이식하는 것이 가능하지만, 이식을 위해 성숙한 간세포를 갖는 합의는 그러나 다음의 기술에 의해 나타낸 바와 같이, 과학계에서 잘 확립되어 있다: "transplanted cells need to rescue liver functions promptly and therefore are required to be fully mature"(Goldman and Gouon-Evans, 2016). 그러나, 재현가능성이 높다고 해도, 이러한 프로토콜은 시간 소모적이고, 바이러스 및/또는 세균 오염에 취약한 긴 공정을 포함한다.
최종적으로, 간세포의 동결보존은 ALF 및 ACLF를 지닌 환자에서 긴급 이식을 위한 세포 치료요법의 핵심이다. 그러나, 동결보존 사용에 따른 곤란성은 세포가 감소된 세포 생존능을 초래하는 동결 및 해동 단계 둘 다 동안 손상 조건에 적용되기 때문이다(Terry 등; 2010).
따라서, 간 이식을 위한 간 증여자의 부족과 직면하고 간 치료요법이 요구되는 대상체(subject)에서, 특히 제한된 시간 내에, 고 수율로 및 고 품질로 투여될 수 있는 간 세포를 용이하게 생성하기 위한 수단을 제공하기 위한 필요성이 존재한다. 또한 질환이 있는 간, 특히 전격성 간 장애, 보다 특히 ALF 또는 ACLF를 앓는 간을 재생시키고/시키거나 복구하는데 양립될 수 있는 고도의 정량적이고 정성적인 세포를 제공할 필요성이 존재한다. 추가로 간 기증자의 부족 여부에 상관없이, 자가 또는 동종이계(이종) 이식 치료요법 둘 다를 허용하는, 간 세포의 비-제한적인 공급원을 제공할 필요성이 존재한다. 또한 동결보존을 포함하는 저장 상태에 대해 내성인 간 세포를 제공할 필요성이 존재한다. 추가로 공통적으로 이식가능할 수 있으므로, 면역억제제의 동시-투여없이 투여될 수 있는 간 세포를 제공할 필요성이 존재한다. 최종적으로, 매우 가치있는 치료학적 간 세포를 생성하기 위한 새로운 접근법, 특히 우수 의약품 제조 관리 기준(Good Manufacturing Practice; GMP)에 부합되는 접근법을 제공할 필요성이 존재한다.
본 발명의 제1 양태는 알파-페토단백질 마커(alpha-foetoprotein 마커; AFP+)를 발현하고 알부민 마커(ALB-)를 발현하지 않는 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물의 적어도 5%를 포함하는, 세포의 집단, 특히 단리된 세포의 집단에 관한 것이다.
특정의 구현예에서, 간 줄기-유사 세포는 T-Box 전사 인자 3 마커(T-Box Transcription Factor 3 marker; TBX3+) 및/또는 간세포 핵 인자 4 알파 마커(Hepatocyte Nuclear Factor 4 Alpha 마커; HNF4A+), 바람직하게는 T-Box 전사 인자 3 마커(TBX3+) 및 간세포 핵 인자 4 알파 마커(HNF4A+)를 추가로 발현하고 있다.
일부 구현예에서, 간 줄기-유사 세포는 동결보존된다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단을 포함하는 입자, 특히 스페로이드(spheroid)에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단을 포함하는 현탁액에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 (i) 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단, 및/또는 적어도 하나의 입자, 및/또는 현탁액, 및 (ii) 약제학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 여전히 추가의 양태는 본 발명에 따른, 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단, 및/또는 적어도 하나의 입자 및/또는 현탁액, 및/또는 약제학적 조성물을 포함하는 의학 장치에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른, 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 이종 집단을 포함하는 비-사람 동물 모델에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 의약으로서 사용하기 위한, 본 개시내용에 정의된 바와 같은 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물, 또는 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단, 또는 입자, 또는 현탁액, 또는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 전격성 간 장애를 예방 및/또는 치료하는데 사용하기 위한, 본 개시내용에 정의된 바와 같은 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물, 또는 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단, 또는 입자, 또는 현탁액, 또는 약제학적 조성물, 또는 의학 장치에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따라 사용하기 위한, 본 개시내용에 정의된 바와 같은, 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물, 또는 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단, 또는 입자, 또는 현탁액, 또는 약제학적 조성물, 또는 의학 장치에 관한 것이고, 여기서 전격성 간 장애는 급성 간 부전(ALF) 또는 급성의 만성 간 부전(ACLF)이다.
본 발명의 여전히 추가의 양태는 본 발명에 따라 사용하기 위한, 본 발명에서 정의된 바와 같은 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물, 또는 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단, 또는 입자, 또는 현탁액, 또는 약제학적 조성물, 또는 의학 장치에 관한 것이고, 여기서 ACLF는 비-알코올성 지방 간염(NASH), 알코올성 간염, 바이러스-유도된 간염, 잠재성 간 질환, 악성 간 질환, 예를 들면, 간세포 암종 및 쓸개관암(cholangiocarcinoma); 자가면역 간염, 혈관 간 질환, 예를 들면, 버드-키아리 증후군, 쓸개즙정체 간 질환; 및 유전된 대사 간 질환, 예를 들면, 윌슨 질환 및 우레아 주기 장애(urea cycle disorder)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 간 질환과 관련된다.
하나의 추가의 양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은, 입자를 제조하기 위한, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 동결보존된 세포의 집단의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 약물을 스크리닝하기 위한 시험관 내 방법에 관한 것이고, 상기 방법은:
a) 본원에 정의된 바와 같은, 적어도 하나의 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물, 및/또는 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단, 및/또는 입자, 및/또는 본 발명에 따른 현탁액을 제공하는 단계;
b) 단계 a)로부터의, 상기 적어도 하나의 세포 또는 이의 추출물, 및/또는 상기 세포의 집단 또는 이의 추출물, 및/또는 상기 입자, 및/또는 상기 현탁액을 약물 후보물과 접촉시키는 단계;
c) 하나 이상의 생물학적 매개인자(들)을 측정하고 임의로 상기 하나 이상의 생물학적 매개인자(들)를 하나 이상의 참고 매개인자(들)과 비교하는 단계;
d) 약물 후보물이 목적한 치료 및/또는 진단제인지를 측정하는 단계;를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 전격성 간 장애를 치료 및/또는 예방하기 위한 키트에 관한 것이고, 상기 키트는:
a) 본원에 정의된 바와 같은, 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물, 또는 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단, 또는 입자, 또는 현탁액, 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물; 및
b) 상기 세포 또는 이의 추출물, 집단 또는 이의 추출물, 또는 입자, 또는 현탁액 또는 약제학적 조성물을 투여하기 위한 수단을 포함한다.
정의
본 발명에서, 다음의 용어는 다음의 의미를 갖는다:
- 수치 앞의 "약"은 상기 수치의 값의 플러스 또는 마이너스 10% 이하를 포함한다. 용어 "약"이 지칭하는 값 자체가 또한 구체적으로, 및 바람직하게 개시되어 있다.
- "포함하다(Comprise)"은 "함유하다(contain)", "망라하다(encompass)" 및 "포괄하다(include)"를 의미하는 것으로 의도된다. 일부 구현예에서, 용어 "포함하다"는 또한 용어 "로 이루어진(consist of)"을 망라한다.
- "전격성 간 장애"는 공지된 기존의 또는 진단된 간 질환이 있거나 없는 개체내에서 급속하고 중증인 간 악화 상태를 지칭한다. 전격성 간 장애 자체는 비-만성 질환이지만, 만성 간 상태로부터 발생할 수 있음이 이해되어야 한다. 본원에 사용된 바와 같은, 전격성 간 장애는 말기-단계 간 질환(End-stage Liver Disease; MELD)과 같이 기관 할당을 위한 점수매김 시스템을 사용하는 경우 간 이식에 우선순위가 매겨지는 임의의 간 질환을 지칭한다(Martin 등; 2014). 간 이식에 우선순위가 매겨지는 간 질환의 예는 급성 간 장애(ALF) 및 급성의 만성 간 장애(ACLF)를 포함한다
- "간 이식"은 질환이 있거나 손상된 간을 제거하고 이를 다른 개인(즉, 기증자)로부터의 건강한 간의 전체 또는 일부를 대체하기 위해 수행된 외과 수술을 지칭한다. 간은 신체 내에서 자가-재생할 수 있는 유일한 기관이며, 간의 이식된 분절은 수주 내에 정상 크기로 성장할 수 있다.
- 또는 "ALF"로 명명된, "급성 간 부전"은 만성 간 질환이 없는 개체 내에서 간 혈액 시험의 급성 비정상에 의해 특징화되는, 매우 특이적이고 드문 장애를 지칭한다. ALF는 문헌(Larsen et al. (2016))의 발표에서 인식되는 바와 같이, 간 이식의 부재시 80%의 사망률에 의해 주로 특징화된다.
- 또한 "ACLF"로 명명된, "급성의 만성 간 부전"은 만성 간 질환을 앓는 개체 내에서 간 혈액 시험의 급성 비정상에 의해 특징화된, 매우 특이적이고 희귀한 질환을 지칭한다. 일부 구현예에서, ACLF는 또한 문헌(Arroyo et al. (2016))에 개시된 바와 같이, "만성 상태의 급성 간 부전(acute-on-chronic liver failure)"으로서 지칭될 수 있다.
- "간 줄기-유사 세포"는 적합한 배양 조건 하에서 증식할 수 있고 수개의 세포형, 특히 간의 세포(또한 간세포로 지칭됨) 또는 담관세포로 분화될 수 있는 자가-재생가능한 간 줄기 세포를 지칭하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 따른 "간 줄기-유사 세포"는 특이적인 마커의 세트의 발현 및/또는 비-발현에 의해 특히 특징화된다. 본원에 사용된 바와 같은, "pStemHeps"로서 또한 지칭된, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포는 AFP 마커(AFP+, 미성숙 간세포의 마커)를 발현하고 ALB 마커(ALB-)를 발현하지 않는다는 점에서 성숙한 간 세포와는 상이하다. 더욱이, ALB 마커는 일반적으로 성숙한 간 세포의 대사 및 해독 특성과 관련되어 있다.
- 본원에 사용된 바와 같은 "간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포"는 간 줄기-유사 세포로부터 분화된 세포 형으로 분화된 세포를 지칭한다. 설명적으로, 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포는 간-유사 세포(HLC) 및 담관세포를 포함할 수 있고 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포의 후대 세포를 구성한다.
- 본원에 사용된 바와 같은 "간-유사 세포" 또는 "HLC"는 시험관 내에서 생성되고, 기능성의 건강한 간 속에서 일반적으로 발견된 성숙한 간세포의 주요 마커를 지닌 간의 세포(hepatic cell)를 지칭한다. 특히, HLC는 ALB 마커 및 CYP3A4 마커와 같이, 기능성의 건강한 간의 해독 특성과 관련된 마커를 지닌다(발현한다).
- "발현하는" 또는 "발현"은 핵산(RNA) 수준 및/또는 폴리펩타이드 또는 단백질 수준에서, 목적한 마커의 유의적으로 검출가능한 수준의 합성을 지칭한다. 확장하면, "발현하는" 또는 "발현"은 또한 수준 자체를 지칭한다.
- "발현하지 않는" 또는 "비-발현"은 핵산(RNA) 수준 및/또는 폴리펩타이드 또는 단백질 수준에서, 목적한 마커의 유의적인 검출가능한 수준의 합성의 부재를 지칭한다. 확장하면, "발현하지 않는" 또는 "비-발현"은 또한 수준 자체를 지칭한다.
- "마커"는 주어진 세포 또는 세포의 집단에 의해, 발현되거나 발현되지 않는, 특히 차등적으로 발현되거나 발현되지 않는 분자, 바람직하게는 단백질, 당단백질 또는 지단백질을 지칭하고, 이러한 발현 수준은 상기 세포 또는 세포의 집단을 특성화하기 위해, 적합한 기술(예컨대, RT-PCR, RNA 서열분석, ELISA, FACS, 웨스턴 블롯(western blot), 프로테오믹스(proteomics), 면역형광성 염색(immunofluorescence staining), 단백질 합성)에 의해 측정할 수 있다.
- "단리된"은 이러한 세포 또는 집단을 생성하도록 하는 초기 배양 배지로부터 제거된 세포 또는 세포의 집단을 지칭한다.
- "추출물"은 세포액 분획(cytosolic fraction), 세포질성 분획, 막 분획, 가용성 분획, 불용성 분획, 소낭, 엑소좀(exosome), 및 이의 조합을 포함하는 임의의 세포 분획; 또는 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포, 또는 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포의 집단, 특히 단리된 집단의 배양물로부터 수득된 배양 현탁액을 지칭한다. 일부 구현예에서, 추출물은 세포외 소낭(extracellular vesicle; EV), 엑소좀, 또는 엑소좀-유사 입자와 같은 입자를 포함한다.
- "엑소좀"은 중간 식균작용 구획(intermediate endocytic compartment), 다소포체(multivesicular body; MVB)와 혈장 막의 융합시 세포로부터 천연적으로 분비/방출된 세포외 나노소낭을 지칭한다. 다시 말해서, 엑소좀은 세포외 환경(extracellular milieu) 내로 분비/방출된 관강내 소낭(intraluminal vesicle)을 지칭하는 것으로 의도된다.
- "현탁액"은 세포가 3D로 배양되어 배양 배지 속에 부유하는 상태를 지칭한다.
- "입자/스페로이드(Particle/Spheroid)"는 3D 입자를 지칭하는 것으로 의미하며 여기서 세포는 서로 응집된다. 용어 "스페로이드"는 또한 구체적으로 구체형을 지닌 입자를 지칭하는 것으로 의도되지만, "입자"는 타원 또는 관형을 가질 수 있다.
- "체외 생물인공 간(extracorporeal bioartificial liver)" 또는 "EBAL"은 간 기능을 지닌 세포를 포함하는 외부 의학 장치를 지칭함을 의미한다. 상기 장치는 전신계 순환의 수단에 의해, 간 장애를 지닌 환자에게 연결될 수 있고 기능성의 건강한 간에 충당된 해독 활성을 수행하기 위해 의도된다.
- "치료하는" 또는 "치료" 또는 "경감"은 치료학적 치료 및 예방적 또는 방어적 척도를 지칭하고, 여기서 대상은 표적화된 병리학적 상태 또는 장애, 특히 간 장애, 보다 특히 전격성 간 장애를 방지하거나 늦춘다(완화시킨다). 치료를 필요로 하는 것은 상기 장애를 이미 지닌 것 뿐만 아니라 장애로 발달할 경향이 있는 것 또는 장애가 방지되어야 하는 것을 포함한다. 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포의 치료학적 양을 제공받은 후, 개체가 간 장애(특히, 전격성 간 장애)와 관련된 증상 중 하나 이상 속에서 또는 이의 부재 하에서 관찰가능하고/하거나 측정가능한 감소; 감소된 이환율 및 사망률, 및 삶의 질 문제에서의 개선을 나타내는 경우, 개체는 간 장애, 특히 전격성 간 장애에 대해 성공적으로 "치료"된다. 질환에서 성공적인 치료 및 증진을 평가하기 위한 상기 매개변수는 의사 또는 인가된 개인에게 친숙한 통상의 과정으로 용이하게 측정된다.
- "방지하는"은 간 질환, 기관, 조직 또는 세포 기능에서 또는 이의 부재하에서 결핍과 관련된 간 질환, 장애 또는 상태, 특히 전격성 간 장애의 발생, 또는 이의 적어도 하나의 부작용 또는 증상으로부터 지킴을 지칭한다.
- "치료학적 유효량"은 표적에 대해 유의적인 음성 또는 부작용을 유발하지 않고, (1) 간 질환, 장애, 또는 상태, 특히 전격성 간 장애의 발병을 지연 또는 방지하거나; (2) 간 질환, 장애, 또는 상태, 특히 전격성 간 장애의 하나 이상의 증상의 진행, 가중(aggravation), 또는 악화를 늦추거나 정지시키거나; (3) 간 질환, 장애, 또는 상태, 특히 전격성 간 장애의 증상의 경감을 가져오거나; (4) 간 질환, 장애, 또는 상태, 특히 전격성 간 장애의 중증도 또는 발생정도를 감소시키거나; (5) 간 질환, 장애, 또는 상태, 특히 전격성 간 장애를 치유하는 것을 목표로 하는 활성제의 수준 또는 양을 지칭한다. 치료학적 유효량은 간 질환, 장애, 또는 상태, 특히 전격성 간 장애의 발생 전에, 예방 또는 방지 작용을 위해 투여될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 치료학적 유효량은 간 질환, 장애, 또는 상태, 특히 전격성 간 장애의 발생 후 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 조성물의 치료학적 유효량은 간 질환, 장애 또는 상태, 특히 전격성 간 장애의 적어도 하나의 증상을 감소시키는데 효과적이다.
- "간 재생"은 이의 기능적인 생물학적 또는 기능적 특성을 되찾는 간의 능력을 지칭한다. "간 재생"은 내인성의 "건강한" 간세포, 또는 내인성 줄기 세포의 증식의 증가 및 건강한 간 조직 및 건강한 간 중량의 증가를 가져오는 "질환이 있는" 간세포의 사멸을 보충하기 위한 간세포로의 이의 후속적인 분화를 포함할 수 있다. "간 재생"은 또한 간 질환과 관련된 간 염증의 감소를 포함할 수 있다.
- "약제학적으로 허용되는 비히클"은 동물 개체, 바람직하게는 사람 개체에게 투여시 임의의 부작용, 알레르기 또는 다른 원치않는 반응을 생산하지 않는 비히클을 지칭한다. 이는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항세균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 사람 투여를 위해, 제제는 규제 사무소(regulatory Office), 예를 들면, 예컨대, 미국에서 식품의약청(Food and Drug Administration; FDA) 또는 유럽 연합에서 유럽 의약청(European Medicines Agency; EMA)에 의해 요구되는 것으로서 멸균성, 발열성, 일반적인 안전성, 품질 및 순도 기준을 충족할 수 있다.
- "개체"는 동물 개체, 바람직하게는 포유동물 개체, 보다 바람직하게는 사람 개체를 지칭하는 것으로 의도된다. 목적한 비-사람 포유동물 개체 중에서는, 애완동물, 예를 들면, 개, 고양이, 기나아 피크(guinea pig); 경제적으로 중요한 동물, 예를 들면, 소, 염소, 말, 원숭이를 비-제한적으로 언급할 수 있다. 일 구현예에서, 개체는 의학적 처치를 제공받기위해 기다리고 있거나, 의학적 처치를 제공받고 있거나, 의학적 수술의 대상이었거나/이거나/일 것이거나, 질환, 장애 또는 상태, 특히 간 질환, 보다 특히 전격성 간 장애의 발달에 대해 언급된 "환자", 즉, 온혈 동물, 보다 바람직하게는 사람일수 있다. 일 구현예에서, 개체는 성체(예를 들면, 18세 이상의 사람 대상체)이다. 다른 구현예에서, 개체는 어린이(예를 들면, 18세 이하의 사람 대상체)이다. 일 구현예에서, 개체는 남성이다. 다른 구현예에서, 개체는 여성이다.
상세한 설명
예측하지 못하게, 본 발명자는 성숙한 간 세포의 마커 프로파일과 부합되지 않는 마커 프로파일을 갖는, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포가 간의 매우 신속한 재생, 특히 질환이 있는 간 조직 내 건강한 간 조직의 재생을 필요로 하는, 전격성 간 장애, 특히 급성 간 부전(ALF) 또는 급성의 만성 간 부전(ACLF)를 치료하기위한 치료학적 용도일 수 있다. 당해 분야의 상태에서의 편견과는 대조적으로, 본 발명 따른, 즉, AFP 마커를 발현하지만 ALB 마커를 발현하지 않는, 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포의 집단은 여전히 혈청 속의 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALAT) 농도와 같은 매개변수 및 간의 세포 괴사를 매우 신속하게, 즉, 주사 후 24시간 내에 유의적으로 감수시킬 수 있으며, 상기 ALB 마커는 일반적으로 CYP3A4 마커와 함께, 성숙한 간세포의 해독 기능과 관련되어 있다.
다시 말해서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포는 성숙한 간 세포가 아니지만, 건강한 간 조직의 매우 신속한 재생을 요구하는, 전격성 간 부전을 지닌 개체 내에서 질환이 있는 간의 재생을 달성할 수 있다.
이론에 얽매이지 않고, 본 발명자는 ALB 및 CYP3A4 마커에 의해 나타낸 성숙한 간 세포에서 일반적으로 발견된 해독 기능의 존재가 치료 개시 시기에는 필수적이지 않고 거의 진전되지 않은 분화 상태의 세포의 집단에 의존하는 줄기 세포-기반 치료요법이 간 이식 분야에서의 편견과는 대조적으로, 치료학적으로 만족스러운 것으로 고려하고 있다.
또한, 본 발명자는 간 줄기-유사 세포의 비-제한된 양이 다수의 분화 프로토콜을 진행중인, 사람 다능성 줄기 세포(human pluripotent stem cell; hPSC)로부터, 및 특히 사람 배아 줄기 세포(hESC)로부터 생성될 수 있음을 나타내었다.
최종적으로, 본 발명자는 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포의 이식이 면역억제제의 부재하에서조차 수행될 수 있음을 나타내었고, 이는 급성 이식거부 위험이 극도로 낮음을 시사한다. 따라서, 이러한 결과는 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포의 동종이계 이식이 간 치료요법을 필요로 하는, 특히 간 이식을 필요로 하는 환자에서 안전하게 수행될 수 있음을 시사한다.
본 발명의 일 양태는 알파-페토단백질 마커(AFP+)를 발현하고 알부민 마커(ALB-)를 발현하지 않는 간 줄기-유사 세포, 특히, 단리된 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물에 관한 것이다.
본 발명의 범위 내에서, 알파-페토단백질 AFP는 또한 알파-페토단백질, 알파-1-페토단백질, 알파 페토글로불린, HPAFP, AFPD 및 FETA를 비-제한적으로 지칭한다. 본 발명의 범위 내에서, 알부민은 또한 비-제한적으로 혈청 알부민, PRO0883, PRO0903, PRO1341 및 HSA를 지칭한다.
특정의 구현예에서, 세포, 특히 사람 세포, 또는 이의 추출물은 사람 알파-페토단백질(AFP+)을 발현하고 사람 알부민 마커(ALB-)을 발현하지 않는다.
본 발명은 또한 알파-페토 단백질 마커(AFP+)를 발현하지만 알부민 마커(ALB-)를 발현하지 않는 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물의 시험관 내 세포 배양물을 지칭한다.
본 발명은 또한 알파-페토 단백질 마커(AFP+)를 발현하지만 알부민 마커(ALB-)를 발현하지 않는 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단에 의존한다.
보다 특히, 본 발명은 알파-페토 단백질 마커(AFP+)를 발현하지만 알부민 마커(ALB-)를 발현하지 않는 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는, 세포의 집단, 특히 단리된 세포의 집단에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 세포의 집단은 사람 세포의 집단이다.
따라서, 본 발명의 다른 양태는 알파-페토 단백질 마커(AFP+)를 발현하지만 알부민 마커(ALB-)를 발현하지 않는 간 줄기-유사 세포의 적어도 5%를 포함하는, 세포의 집단, 특히 세포의 단리된 집단에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포의 집단은 세포의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 100%가 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포인 집단을 포함한다.
본 발명의 범위 내에서, "적어도 약 5%"라는 표현은 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100%mf 포함한다.
일 구현예에서, 세포의 적어도 약 5%, 바람직하게는 세포의 적어도 약 10%는 알파-페토 단백질 마커(AFP+)를 발현하지만 알부민 마커(ALB-)를 발현하지 않는 간 줄기-유사 세포이다.
일부 구현예에서, 세포의 집단은 세포의 시험관 내 집단, 특히 단리된 세포의 시험관 내 집단이다.
본 발명은 또한 세포의 집단, 특히 사람 세포의 집단을 포함하는 시험관 내 세포 배양물에 관한 것이고, 여기서 상기 세포의 적어도 약 5%는 알파-페토 단백질 마커(AFP+), 특히 사람 알파-페토단백질 마커(AFP+)를 발현하지만 알부민 마커(ALB-), 특히 사람 알부민 마커(ALB-)를 발현하지 않는 간 줄기-유사 세포, 특히 사람 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물이다.
일부 구현예에서, 간 줄기-유사 세포는 사람 알파-페토 단백질 마커(AFP+)를 발현하지만 사람 알부민 마커(ALB-)를 발현하지 않는다.
특정의 구현예에서, 집단은 알파-페토 단백질 마커(AFP+), 특히 사람 알파-페토단백질(AFP+)를 발현하지만 알부민 마커(ALB-), 특히 사람 알부민 마커(ALB-)를 발현하지 않는 간 줄기-유사 세포를 포함하는 단리된 세포의 집단이다.
일부 구현예에서, 단리된 집단은 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포의 적어도 약 50%, 바람직하게는 간 줄기-유사 세포의 적어도 약 70%를 포함한다. 특정의 구현예에서, 단리된 집단은 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포의 실질적으로 순수한 집단이다. 본 발명의 범위 내에서, 표현 "실질적으로 순수한"은 상기 간 줄기-유사 세포가 상기 집단의 총 세포 함량의 적어도 약 50%를 나타내는 집단을 지칭함을 의미한다.
여기서 사용된 바와 같이, "적어도 약 50%"라는 표현은 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100%를 포함한다.
특정의 구현예에서, 본 발명에 따른 단리된 집단은 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포의 적어도 약 75%, 바람직하게는 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 90%를 포함한다.
실제로, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포의 집단 또는 단리된 집단은 간 줄기-유사 세포 및 다른 세포형, 예를 들면, 변형된 섬유아세포를 포함한다. 실제로, 다른 세포형의 특성은 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포를 생성하는데 사용된 세포의 특성에 의존할 수 있다.
이러한 마커의 발현 또는 발현의 부재(비-발현)는 핵산(mRNA) 수준에서 또는 폴리펩타이드 또는 단백질 수준에서, 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 방법으로 모니터링할 수 있다. 실례로, 이러한 방법은 핵산 수준에서, 특이적인 프라이머를 지닌 배양된 세포로부터 추출된 RNA의 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR; qPCR) 분석, RNA 서열분석(RNA sequencing; RNASeq)을 포함한다. 폴리펩타이드 또는 단백질 수준에서, 이러한 방법은 마커 특이적인 항체를 사용한 면역형광성 분석, 웨스턴 블롯팅, ELISA, 유동 세포분석법(또한 형광성 활성화된 세포 분류 또는 FACS로 지칭됨), 또는 임의의 기능성 단백질 활성 검정을 포함한다.
본 발명에 따른 세포의 집단에 포함된 간 줄기-유사 세포의 퍼센트는 상기 세포의 집단 내에서, 선택된 마커, 예를 들면, 특히 AFP 및 ALB 마커의 발현을 정량화하는데 사용된 방법과 관련하여 변할 수 있음이 이해된다.
일부 구현예에서, 세포 AFP mRNA의 전체적인 상대적인 발현은 당해 분야의 상태로부터 공지된 임의의 적합한 방법, 또는 이로부터 조정된 방법에 의해 측정될 수 있다. 예시적으로, 세포 AFP mRNA의 전체적인 상대적인 발현은 qPCR(정량적 PCR, 또한, 실시간 PCR 또는 RT-PCR로 지칭됨)로 평가될 수 있다. 실제로, 세포 AFP mRNA의 전체적인 상대적인 발현은 적절한 프라이머를 사용한, Taqman® 기술의 수단으로 평가된다. 일부 구현예에서, 세포 AFP mRNA의 상대적인 발현은 예컨대, GAPDH와 같은, 하우스키퍼 유전자 발현(housekeeper gene expression)에 대해 표준화될 수 있으며 분화되지 않은 hESC 세포에서 발견된 수준의 배수로서 표시된다.
특정의 구현예에서, 세포 AFP mRNA의 전체적인 상대적인 발현 수준은 qPCR로 평가된 경우 AFP 비 발현-세포에서 검출된 발현 수준보다 적어도 약 102배 더 높다. 본원에 사용된 바와 같이, AFP 비-발현-세포는 AFP mRNA의 유의적으로 검출가능한 수준이 qPCR에 의해 평가하는 경우 달성될 수 없는 세포를 지칭하는 것으로 의도된다.
본 발명의 범위 내에서, "적어도 약 102"라는 표현은 약 102, 5×102, 103, 5×103, 104, 5×104, 105, 5×105, 106, 5×106, 107 또는 이 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 qPCR로 평가하는 경우 AFP 비-발현-세포에서 검출된 발현 수준보다 적어도 약 103배, 바람직하게는 적어도 약 105배 더 높은 AFP의 상대적인 발현을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 세포의 집단 내에서 알파-페토 단백질 마커(AFP+)를 발현하지만 알부민 마커(ALB-)는 발현하지 않는 세포의 집단을 측정하기 위한 면역형광성 검정은 적합한 항-AFP 및 항-ALB 항체의 수단으로 수행될 수 있다. 예시적으로, 적합한 항체는 예컨대, Sigma Aldrich®로부터의 시판되는 항체(마우스 항-AFP 항체, A8452) 및 Cedarlane®로부터 시판되는 항체(마우스 항-ALB 항체, CL2513A)일 수 있다. 실제로, 면역형광성 검정은 당해 분야의 기술로부터의 표준 프로토콜, 또는 이로부터 조정된 프로토콜에 따라 수행된다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 세포의 집단, 특히 단리된 세포의 집단은 면역형광성으로 평가된 바와 같이, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포의 적어도 약 50%를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 세포의 집단 내에서 알파-페토단백질 마커(AFP+)를 발현하고 알부민 마커(ALB-)를 발현하지 않는 세포의 퍼센트를 측정하기 위한 유동 세포분석법 검정은 당해 분야의 기술로부터의 표준 프로토콜, 또는 이로부터 조정된 프로토콜에 따라 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 세포의 집단, 특히 단리된 세포의 집단은 유동 세포분석법으로 평가된 것으로서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포의 적어도 약 5%를 포함한다.
특정의 구현예에서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포는 발현된 AFP를 분비한다.
일부 구현예에서, AFP 분비는 당해 분야의 기술로부터 공지된 임의의 적합한 방법, 또는 이로부터 조정된 방법에 의해 평가될 수 있다. 예시적으로, AFP 분비는 ELISA 기술로 평가될 수 있다. 실제로, ELISA 기술은 당해 분야의 기술로부터의 표준 프로토콜, 또는 이로부터 조정된 프로토콜에 따라 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, ELISA 기술은 예컨대, ABCAM®로부터의 사람 AFP ELISA 정량화 키트와 같은 시판 키트의 수단으로 수행된다. 세포 배양물 속에서 ALB 분비의 부재의 평가는 ELISA에 의해, 특히 예컨대, Bethyl®로부터의 사람 알부민 ELISA 정량화 키트와 같은 시판 키트의 수단으로 확인할 수 있다. 시판 키트를 사용하는 경우, 프로토콜은 적절한 프로토콜을 사용하여, 제조업자의 설명서에 따라 시행된다. 일부 구현예에서, 간 줄기-유사 세포는 적어도 약 25 ng/106개의 세포/24 h의 발현된 AFP를 분비한다.
본 발명의 범위 내에서, "적어도 약 25 ng/106개의 세포/24 h의 발현된 AFP"라는 용어는 25 ng, 50 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng, 500 ng, 600 ng, 700 ng, 800 ng, 900 ng, 1 ㎍, 2 ㎍, 3 ㎍, 4 ㎍, 5 ㎍/106 세포/24 h 또는 그 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 적어도 500 ng/106개의 세포/24 h, 바람직하게는 적어도 1 ㎍/106개의 세포/24 h의 발현된 AFP를 분비한다. 일부 구현예에서, 간 줄기-유사 세포는 약 0.1 ㎍/106개의 세포/24 h 내지 약 100 ㎍/106개의 세포/24 h의 발현된 AFP, 바람직하게는 약 1 ㎍/106개의 세포/24 h 내지 약 70 ㎍/106개의 세포/24 h의 발현된 AFP를 분비한다.
특정의 구현예에서, 본 발명에 따른 줄기-유사 세포는 T-Box 전사 인자 3 마커(TBX3+) 및/또는 간세포 핵 인자 4 알파 마커(HNF4A+), 바람직하게는 T-Box 전사 인자 3 마커(TBX3+) 및 간세포 핵 인자 4 알파 마커(HNF4A+)를 추가로 발현한다.
특정의 구현예에서, 본 발명에 따른 줄기-유사 세포는 사람 T-Box 전사 인자 3 마커(TBX3+) 및/또는 사람 간세포 핵 인자 4 알파 마커(HNF4A+), 바람직하게는 사람 T-Box 전사 인자 3 마커(TBX3+) 및 사람 간세포 핵 인자 4 알파 마커(HNF4A+)를 추가로 발현한다.
특정의 구현예에서, 본 발명에 따른 줄기-유사 세포는 KRT19, EPCAM 및 TTR로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 적어도 하나의 마커, 특히 적어도 2개의 마커, 보다 특히 3개의 마커, 바람직하게는 사람 마커를 추가로 발현한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 줄기-유사 세포는 KRT19, EPCAM, TTR 및 HGF로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 적어도 하나의 마커, 특히 적어도 2개의 마커, 보다 특히 3개의 마커, 심지어 보다 특히 4개의 마커, 바람직하게는 사람 마커를 추가로 발현한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 줄기-유사 세포는 KRT19, EPCAM 및 TTR로 이루어진 그룹에서 선택된, 적어도 하나의 마커, 특히, 적어도 2개의 마커, 보다 특히 3개의 마커, 바람직하게는 사람 마커를 추가로 발현하고/하거나 HGF, 바람직하게는 사람 HGF를 추가로 발현한다.
특정의 구현예에서, 본 발명에 따른 줄기-유사 세포는 알파-페토단백질 마커(AFP+), 특히 사람 알파-페토단백질 마커(AFP+)를 발현하고, 알부민 마커(ALB-), 특히 사람 알부민 마커(ALB-)를 발현하지 않고; T-Box 전사 인자 3 마커(TBX3+)(특히 사람 TBX3+) 및/또는 간세포 핵 인자 4 알파 마커(HNF4A+)(특히 사람 HNF4A+), 바람직하게는 T-Box 전사 인자 3 마커(TBX3+) 민 간세포 핵 인자 4 알파 마커(HNF4A+)(특히 사람 TBX3+ 및 HNF4A+)를 추가로 발현하고; KRT19, EPCAM 및 TTR로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 마커, 특히 적어도 2개의 마커, 보다 특히 3개의 마커, 바람직하게는 사람 마커를 추가로 발현하고/하거나 HGF, 바람직하게는 사람 HGF를 추가로 발현한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포는 AFP, TBX3 및 HNF4A 마커를 발현하고, ALB 마커를 발현하지 않는다. 특정의 구현예에서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포는 AFP, TBX3, HNF4A 및 HGF 마커를 발현하고, ALB 마커를 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포는 AFP, TBX3, HNF4A 및 TTR 마커를 발현하고, ALB 마커를 발현하지 않는다. 특정의 구현예에서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포는 AFP, TBX3, HNF4A, HGF 및 TTR 마커를 발현하고, ALB 마커를 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포는 AFP, TBX3, HNF4A 및 EPCAM 마커를 발현하고, ALB 마커를 발현하지 않는다. 특정의 구현예에서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포는 AFP, TBX3, HNF4A, EPCAM 및 HGF 마커를 발현하고, ALB 마커를 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포는 AFP, TBX3, HNF4A, EPCAM, TTR 및 KRT19 마커를 발현하고, ALB 마커를 발현하지 않는다. 특정의 구현예에서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포는 AFP, TBX3, HNF4A, EPCAM, TTR, KRT19, 및 HGF 마커를 발현하고, ALB 마커를 발현하지 않는다. 바람직하게는 마커는 사람 마커이다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 간 줄기-유사 세포는 EPCAM 마커(EPCAM+)를 추가로 발현하고/하거나 CYP3A4 시토크롬 마커(CYP3A4-)를 추가로 발현하지 않는다.
특정의 구현예에서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포는 사람 EPCAM 마커(EPCAM+)를 발현하고/하거나 사람 CYP3A4 시토크롬 마커(CYP3A4-)를 발현하지 않는다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 줄기-유사 세포는 SOX17 마커 (SOX17+), 바람직하게는 사람 SOX17 마커 및/또는 APOA1 마커(APOA1+), 바람직하게는 사람 APOA1 마커를 추가로 발현한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 줄기-유사 세포는 SERPINA1 마커(SERPINA1+), 바람직하게는 사람 SERPINA1 마커를 추가로 발현한다.
특정의 구현예에서, 본 발명에 따른 줄기-유사 세포는 알파-페토단백질 마커(AFP+), 특히 사람 알파-페토단백질 마커(AFP+)를 발현하고 알부민 마커(ALB-), 특히 사람 알부민 마커(ALB-)를 발현하지 않고; T-Box 전사 인자 3 마커(TBX3+)(특히 사람 TBX3+) 및/또는 간세포 핵 인자 4 알파 마커(HNF4A+)(특히 사람 HNF4A+), 바람직하게는 T-Box 전사 인자 3 마커(TBX3+) 및 간세포 핵 인자 4 알파 마커(HNF4A+)(특히 사람 TBX3+ 및 HNF4A+)를 추가로 발현하고; KRT19, EPCAM 및 TTR로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 적어도 하나의 마커, 특히 적어도 2개의 마커, 보다 특히 3개의 마커, 바람직하게는 사람 마커를 추가로 발현하고/하거나; HGF, 바람직하게는 사람 HGF를 추가로 발현하고/하거나 SOX17 마커(SOX17+), 바람직하게는 사람 SOX17 마커 및/또는 APOA1 마커(APOA1+), 바람직하게는 사람 APOA1 마커를 추가로 발현하고/하거나; SERPINA1 마커(SERPINA1+), 바람직하게는 사람 SERPINA1 마커를 추가로 발현한다.
일 구현예에서, 특히 세포의 집단 내에서 간 줄기-유사 세포는 ALB 마커(ALB-)를 발현하지 않고 CYP3A4 마커(CYP3A4-)를 발현하지 않지만, 특히 AFP 마커(AFP+)를 발현한다. ALB 및 CYP3A4 단백질 둘 다는 건강한 성체 간의 물질대사 및 해독 특성에 관여하는 것으로 알려져 있음이 이해된다. 따라서, 상기 구현예에서, 세포의 집단 내 간 줄기-유사 세포는 ALB 및 CYP3A4 마커와 관련된 물질대사 및 해독 특성을 지니지 않는다.
특정 구현예에서, 특히 세포의 집단 내에서 간 줄기-유사 세포는, 다음의 특징들 중 적어도 2개의 조합에 의해 추가로 특성화될 수 있다:
- 바람직하게는 사람 마커인, 다음의 마커 중 하나 이상의 발현: APOA1, APOA2, APOA4, APOB, APOC3, APOE, BMP2, BMP4, CD164, CD24, CXCR4, DLK1, DPP4, FOXA2, GATA4, GATA6, GJA1, GSTA1, GSTA2, HNF1B, HNF4A, KI67, KRT18, KRT19, KRT8, SEPP1, SMAD7, SOD1, SPARC, TBX3, TTR, VIM, VTN;
- 바람직하게는 사람 마커인, 다음의 마커 중 하나 이상의 발현의 부재(비-발현): ABCB11, ASGR1, CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2B7P, CYP2C9, CYP2E1, CYP3A7, F9, NAGS, PDX1, UGT1A1.
일부 구현예에서, 특히 세포의 집단 내에서 간 줄기-유사 세포는, 다음의 특징들 중 적어도 2개의 조합에 의해 추가로 특성화될 수 있다:
- APOA1, APOA2, APOA4, APOB, APOC3, APOE, BMP2, BMP4, CD164, CD24, CD99, CXCR4, DCN, DLK1, DPP4, EPCAM, FGF19, FOXA2, GATA4, GATA6, GJA1, GPC3, GSTA1, GSTA2, HGF, HMOX1, HNF1B, HNF4A, IGF1, IGFBP3, IL6ST, ITGA6, KI67, KRT18, KRT19, KRT8, LCP1, MKI67, MYDGF, NODAL, PITX2, PROX1, SEPP1, SERPINA1, SMAD7, SNAI2, SOD1, SOX17, SPARC, TBX3, TTR, UGT3A1, VIM, 및 VTN으로 구성된 그룹에서 선택되는, 바람직하게는 사람 마커인, 마커들 중 하나 이상의 발현;
- ABCB11, ASGR1, CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2B7P, CYP2C9, CYP2E1, CYP3A4, CYP3A7, F9, NAGS, PDX1, UGT1A1으로 구성된 그룹에서 선택되는, 바람직하게는 사람 마커인, 마커들 중 하나 이상의 발현의 부재(비-발현).
본 발명의 범위 내에서, EPCAM은 또한 상피 세포부착 분자, 종양-관련 칼슘 신호 형질유도인자(Tumor-Associated Calcium Signal Transducer) 1, 주요 위장 종양-관련 단백질(Major Gastrointestinal Tumor-Associated Protein) GA733-2, 영양배엽 세포 표면 항원(Trophoblast Cell Surface Antigen) 1, 선암종-관련 항원(Adenocarcinoma-Associated Antigen), 세포 표면 당단백질 Trop-1, 상피 강단백질 314, TACSTD1, EGP314, MIC18, TROP1, M4S1, KSA, 모노클로날 항체 AUA1에 의해 확인된 항원, 사람 상피 당단백질-2, 상피 세포 표면 항원, 상피 당단백질, KS 1/4 항원, CD326 항원, GA733-2, HEGP314, HNPCC8, Ep-CAM, DIAR5, EGP-2, EGP40, KS1/4, MK-1, M1S2, ESA 및 EGP를 비-제한적으로 지칭한다.
본 발명의 범위 내에서, CYP3A4는 또한 시토크롬 P450 계열 3 소계열(Subfamily) A 구성원 4, 시토크롬 P450 소계열 IIIA 폴리펩타이드 4, 시토크롬 P450 계열 3 소계열 A 폴리펩타이드 4, 알벤다졸 모노옥시게나제(설폭사이드-형성), 타우로케노데옥시콜레이트 6-알파-하이드록실라제, 1,8-시네올(Cineole) 2-엑소-모노옥시게나제, 콜레스테롤 25-하이드록실라제, 알벤다졸 설폭시다제, 퀴닌 3-모노옥시게나제, 시토크롬 P450 NF-25, 시토크롬 P450-PCN1, 시토크롬 P450 3A3, 시토크롬 P450 3A4, 시토크롬 P450 HLp, 니페디핀 옥시다제, CYPIIIA3, CYPIIIA4, CYP3A3, 시토크롬 P450, 소계열 IIIA 폴리펩타이드 3, 글루코코르티코이드-유도성 P450, P450-III, 스테로이드 유도성, 알벤다졸 모노옥시게나제, P450PCN1, P450C3, CYP3A, NF-25, CP33, CP34 및 HLP를 비-제한적으로 지칭한다.
본 발명의 범위 내에서, APOA1은 또한 아포지단백질 A1, 아포지단백질 A-I, Apo-AI, 에피디다이미스 분비 정자 결합 단백질(Epididymis Secretory Sperm Binding Protein), Apo(A), ApoA-I을 비-제한적으로 지칭하고; APOA2는 또한 아포지단백질 A2, 아포지단백질 A-II, Apo-AII, ApoA-II 및 ApoAII를 비-제한적으로 지칭하고; APOA4는 또한 아포지단백질 A4, 아포지단백질 A-IV, Apo-AIV, 및 ApoA-IV을 비-제한적으로 지칭하고; APOB는 또한 아포지단백질 B, 아포지단백질 B-100, 아포지단백질 B48, Apo B-100, ApoB-100, ApoB-48, LDLCQ4, FCHL2 및 FLDB를 비-제한적으로 지칭하고; APOC3은 또한 아포지단백질 C3, 아포지단백질 C-III, Apo-CIII, ApoC-III 및 APOCIII를 비-제한적으로 지칭하고; APOE는 또한 아포지단백질 E, 알츠하이머 질환 2(APOE*E4-관련된, 말기 발생), 아포지단백질 E3, LDLCQ5, APO-E, ApoE4, Apo-E, LPG 및 AD2를 비-제한적으로 지칭하고; BMP2는 또한 골 형태발생 단백질(Bone Morphogenetic Protein) 2, 골 형태발생 단백질 2A, BMP2A, BMP-2A, SSFSC, BMP-2 및 BDA2를 비-제한적으로 지칭하고; BMP4는 또한 골 형태발생 단백질 4, 골 형태발생 단백질 2B, BMP2B, BMP2B1, MCOPS6, BMP-2B, OFC11, BMP-4, ZYME 및 DVR4를 비-제한적으로 지칭하고; CD164는 또한 CD164 분자, 다중-글리코실화된 코어 단백질(Multi-Glycosylated Core Protein) 24, 시알로무신 코어 단백질(Sialomucin Core Protein) 24, CD164 항원, 시알로무신(Sialomucin), 엔돌린(Endolyn), MGC-24v, MGC-24, MUC-24, 청각장애 보통염색체 우성(Deafness Autosomal Dominant) 66, CD164 항원, DFNA66을 비-제한적으로 지칭하고; CD24는 또한 CD24 분자, CD24 항원, 신호 형질도입인자(Signal Transducer) CD24, CD24A, 소 분자 폐 암종 군집(Small Cell Lung Carcinoma Cluster) 4 항원, CD24 항원을 비-제한적으로 지칭하고; CD99는 또한 CD99 항원, 모노클로날 항체 12E7, F21 및 O13에 의해 확인된 항원, T-세포 표면 당단백질 E2, E2 항원, MIC2X, MIC2Y, MIC2, 세포 표면 항원 HBA-71, 세포 표면 항원 12E7, 세포 표면 항원 MIC2, HBA71, MSK5X, 12E7를 비-제한적으로 지칭하고; CXCR4는 또한 C-X-C 모티프 케모킨 수용체(Motif Chemokine Receptor) 4, 백혈구-유래된 7개의 전이막 도메인 수용체(Leukocyte-Derived Seven Transmembrane Domain Receptor), 리포폴리사카라이드-관련 단백질(Lipopolysaccharide-Associated Protein) 3, 기질 세포-유래된 인자 1 수용체(Stromal Cell-Derived Factor 1 Receptor), 케모킨(C-X-C 모티프) 수용체 4, C-X-C 케모킨 수용체 형(Chemokine Receptor Type) 4, LPS-관련 단백질 3, SDF-1 수용체, CD184 항원, 푸신(Fusin), LAP-3, LESTR, NPYRL, FB22, HM89, LCR1, 7개의-막관통-분절 수용체 비장(Seven-Transmembrane-Segment Receptor Spleen), 케모킨(C-X-C 모티프) 수용체 4, 7개의 막관통 헬릭스 수용체(Seven Transmembrane Helix Receptor), 뉴로펩타이드 Y 수용체(Neuropeptide Y Receptor) Y3, 뉴로펩타이드 Y3 수용체, 케모킨 수용체, D2S201E, HSY3RR, NPYY3R, CXC-R4, CXCR-4, CD184, NPY3R, WHIMS, LAP3, NPYR, WHIM 3을 비-제한적으로 지칭하고; DCN은 또한 데코린(Decorin), SLRR1B, 골 프로테오글리칸(Bone Proteoglycan) II, DSPG2, PG40, 데르마탄 설페이트 프로테오글리칸(Dermatan Sulphate Proteoglycans) II, 작은 류신이 풍부한 단백질(Small Leucine-Rich Protein) 1B, 프로테오글리칸 코어 단백질(Proteoglycan Core Protein), 데코린 프로테오글리칸(Decorin Proteoglycan), PG-S2, CSCD, PGII, PGS2, DCN 5를 비-제한적으로 지칭하고; DLK1은 또한 델타 유사 비-캐노니칼 노치 리간드(Delta Like Non-Canonical Notch Ligand) 1, 단백질 델타 동족체(Protein Delta Homolog) 1, DLK-1, DLK, PG2, 델타-유사 1 동족체(Delta-Like 1 Homolog), 델타-유사 동족체(Delta-Like Homolog), 지방선구 세포 인자(Preadipocyte Factor) 1, 델타-유사 1 동족체, 태아 항원 1, 세크레델틴(Secredeltin), 델타1, Pref-1, PREF1, FA1 및 ZOG를 비-제한적으로 지칭하고; DPP4는 또한 디펩티딜 펩티다제 4, 아데노신 데아미나제 복합화 단백질(Adenosine Deaminase Complexing Protein) 2, 디펩티딜펩티다제 IV, CD26 아데노신 데아미나제 복합화 단백질 2, T-세포 활성화 항원 CD26, 디펩티딜 펩티다제 IV, EC 3.4.14.5, ADCP-2, DPP IV, ADCP2, ADABP, TP103, CD26, 디펩티딜-펩티다제 4, 디펩티딜펩티다제 4, CD26 항원 및 DPPIV를 비-제한적으로 지칭하고; FGF19는 또한 섬유아세포 성장 인자(Fibroblast Growth Factor) 19를 비-제한적으로 지칭하고; FOXA2는 또한 포크헤드 박스(Forkhead Box) A2, 간세포 핵 인자(Hepatocyte Nuclear Factor) 3-베타, 포크헤드 박스 단백질 A2, 전사 인자 3B, HNF-3-베타, HNF-3B, TCF-3B 및 간 핵 인자-3-베타를 비-제한적으로 지칭하고; GATA4는 또한 GATA 결합 단백질 4, 전사 인자 GATA-4, GATA-결합 인자 4, GATA-결합 인자 4, TACHD, ASD2, VSD1 및 TOF를 비-제한적으로 지칭하고; GATA6은 또한 GATA 결합 단백질 6, 전사 인자 GATA-6, GATA-결합 인자 6 및 GATA-결합 단백질 6을 비-제한적으로 지칭하고; GJA1은 또한 Gap 접합 단백질 알파(Junction Protein Alpha) 1, Gap 접합 43 KDa 심장 단백질, Gap 접합 알파-1 단백질, 코넥신(Connexin)-43, GJAL, 눈티아가락 형성이상(Oculodentodigital Dysplasia)(합지증 유형(Syndactyly Type) III), Gap 접합 단백질 알파-유사, 코넥신 43, AVSD3, EKVP3, HLHS1, PPKCA, CMDR, CX43, EKVP, ODDD, Cx43 및 HSS를 비-제한적으로 지칭하고; GPC3은 또한 글리피칸(Glypican) 3, 장 단백질 OCI-5, 글리피칸 프로테오글리칸(Glypican Proteoglycan) 3, 글리피칸-3, GTR2-2, OCI-5, SGBS1, DGSX, MXR7, SGBS, SGB, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸, 분비된 글리피칸-3, SDYS, OCI5를 비-제한적으로 지칭하고; GSTA1은 또한 글루타티온 S-트랜스퍼라제 알파 1, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 A1, 13-하이드록시퍼옥시옥타데타디에노에이트 퍼옥시다제, 안드로스트-5-엔(Ene)-3,17-디온 이소머라제, GST 부류-알파 구성원(Class-Alpha Member) 1, GST HA 소단위 1, GST-엡실론, EC 2.5.1.18, GSTA1-1, GTH1, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 Ha 소단위 1, S-(하이드록시알킬)글루타티온 리아제 A1, 글루타티온 S-알킬트랜스퍼라제 A1, 글루타티온 S-아릴트랜스퍼라제 A1, 고환 조직 단백질(Testicular Tissue Protein) Li 80, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 2, EC 1.11.1., EC 5.3.3. 및 GST2를 비-제한적으로 지칭하고; GSTA2는 또한 글루타티온 S-트랜스퍼라제 알파 2, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 A2, GST 부류-알파 구성원(Class-Alpha Member) 2, GST HA 소단위 2, EC 2.5.1.18, GST-감마, GSTA2-2, GST2, GTH2, 고환 조직 정액-결합 단백질(Testis Tissue Sperm-Binding Protein) Li 59n, S-(하이드록시알킬)글루타티온 리아제 A2, 글루타티온 S-아르알킬트랜스퍼라제 A2, 글루타티온 S-알킬트랜스퍼라제 A2, 글루타티온 S-아릴트랜스퍼라제 A2, 간 GST2 및 GTA2를 비-제한적으로 지칭하고; HGF는 또한 간세포 성장 인자, HPTA, SF, 간세포 성장 인자(헤파포이에틴(Hepapoietin) A; 스캐터 인자(Scatter Factor)), 섬유아세포-유래된 종양 세포독성 인자(Fibroblast-Derived Tumor Cytotoxic Factor), 폐 섬유아세포-유래된 미토겐(Lung Fibroblast-Derived Mitogen), 헤파토포이에틴-A, 스캐터 인자, F-TCF, HGFB, DFNB39를 비-제한적으로 지칭하고; HMOX1은 또한 헴 옥시게나제(Heme Oxygenase) 1, HO-1, 헴 옥시게나제(데사이클링(Decycling)) 1, BK286B10, 열 쇼크 단백질(Heat Shock Protein) 32-KD, HMOX1D, HSP32, HO1, HO를 비-제한적으로 지칭하고; HNF1B는 HNF1 호메오박스(Homeobox) B, 간세포 핵 인자 1-베타, 호메오단백질 LFB3, HNF-1-베타, HNF-1B, VHNF1, TCF-2, TCF2, 변이체 간 핵 인자(Variant Hepatic Nuclear Factor), 변이체 간 핵 인자 1, 전사 인자 2 간, 전사 인자 2, HNF1 베타 A, HNF1베타, HPC11, LF-B3, MODY5, FJHN, HNF2 및 LFB3을 비-제한적으로 지칭하고; HNF4A는 또한 간세포 핵 인자 4 알파, 핵 수용체 소계열 2 그룹 A 구성원(Nuclear Receptor Subfamily 2 Group A Member) 1, 간세포 핵 인자 4-알파, 전사 인자 HNF-4, 전사 인자 14, TCF-14, TCF14, NR2A1, HNF4, 간 핵인자 4 알파, HNF4알파10/11/12, HNF-4-알파, HNF4알파, HNF4a7, HNF4a8, HNF4a9, NR2A21, FRTS4, MODY1, MODY 및 TCF3을 비-제한적으로 지칭하고; IGF1은 또한 인슐린 유사 성장 인자 1, IGF-I, 메카노 성장 인자(Mechano Growth Factor), 소마토메딘(Somatomedin)-C, IGFI, IGF, MGF, 인슐린-유사 성장 인자 IB, IGF1A, IBP1를 비-제한적으로 지칭하고; IGFBP3은 또한 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 3, IGF-결합 단백질 3, IBP3, 140 K IGF 복합체의 의 산 안전성 소단위, 성장 호르몬-의존성 결합 단백질, 결합 단백질 53, 결합 단백질 29, IGFBP-3, BP-53, IBP-3을 비-제한적으로 지칭하고; IL6ST는 또한 인터류킨 6 신호 형질도입인자, 인터류킨-6 수용체 소단위 베타, 온코스타틴-M 수용체 소단위 알파, Gp130 온코스타틴 M 수용체, IL-6 수용체 소단위 베타, 막 당단백질 130, IL-6R 소단위 베타, CD130 항원, IL-6RB, SGP130, CD130, GP130, 류마티스 관절염 항원성 펩타이드-결합 가용성 형태의 Gp130, 인터류킨 수용체 베타 쇄, 인터류킨-6 신호 형질도입인자, 막 당단백질 Gp130, IL-6R-베타, CDW130, HIES4를 비-제한적으로 지칭하고; ITGA6은 또한 인테그린 소단위 알파(Integrin Subunit Alpha) 6, CD49 항원-유사 계열 구성원 F, 인테그린 알파 6, CD49f, VLA-6, 인테그린 알파6B, CD49f 항원, ITGA6B를 비-제한적으로 지칭하고; KRT18은 또한 케라틴 18, 세포 증식-유도 유전자 46 단백질, 케라틴, 제I형 세포골격(Cytoskeletal) 18, 케라틴 18, 제I형, CK-18, CYK18, K18, 사이토케라틴 18, 사이토케라틴-18 및 케라틴-18을 비-제한적으로 지칭하고; KRT19는 또한 케라틴 19, 케라틴 제I형 세포골격 19, 40-KDa 케라틴 중간체 필라멘트(Keratin Intermediate Filament), 케라틴 제I형 40-Kd, 케라틴 19 제I형, 사이토케라틴 19, CK-19, K19, 사이토케라틴-19, 케라틴-19, CK19 및 K1CS을 비-제한적으로 지칭하고; KRT8은 또한 케라틴 8, 케라틴 제II형 세포골격 8, 제II형 케라틴 Kb8, 케라틴 8 제II형, 사이토케라틴-8, CK-8, CYK8, K8, 케라틴-8, CARD2, K2C8, CK8 및 KO를 비-제한적으로 지칭하고; LCP1은 또한 림프구 세포질성 단백질(Lymphocyte Cytosolic Protein) 1, LC64P, PLS2, L-PLASTIN, 플라스틴(Plastin)-2, LCP-1, CP64, L-플라스틴(림프구 세포질성 단백질 1)(LCP-1) (LC64P), BA139H14.1(림프구 세포질성 단백질 1(L-플라스틴)), 림프구 세포질성 단백질 1(L-플라스틴), 림프구 세포질성 단백질-1(플라스민), 부고환 분비 단백질(Epididymis Secretory Protein) Li 37, 플라스틴 2, L-플라스틴, HEL-S-37, LPL 3을 비-제한적으로 지칭하고; MKI67은 또한 증식 Ki-67의 마커, 모노클로날 항체 Ki-67에 의해 확인된 항원, 단백질 포스파타제 1 조절성 소단위 105, 증식 마커 단백질 Ki-67, 항원 Ki67, 증식-관련된 Ki-67 항원, 항원 I-67, PPP1R105, MIB-1, MIB 및 KIA를 비-제한적으로 지칭하고; MYDGF는 또한 골수 유래된 성장 인자, 인터류킨 27 작업 지정(Working Designation), C19orf10, R33729_1, IL25, SF20, 기질 세포-유래된 성장 인자(Stromal Cell-Derived Growth Factor) SF20, 염색체 19 개방 판독 프레임(Open Reading Frame) 10, UPF0556 단백질 C19orf10, EUROIMAGE1875335, 인터류킨-25, IL27w, 및 IL27를 비-제한적으로 지칭한다. NODAL은 또한 Nodal 성장 분화 인자, Nodal 동족체, Nodal 마우스 동족체, HTX5를 비제한적으로 지칭하고; PITX2는 또한 쌍식 유사 호메오도메인(Paired Like Homeodomain) 2, 쌍식-유사 호메오도메인 전사 인자 2, ARP1, ALL1-반응성 단백질 ARP1, 호메오박스 단백질 PITX2, 뇌하수체 호메오박스(Pituitary Homeobox) 2, 솔루르신(Solurshin), Otlx2, RIEG1, Brx1, IGDS, RIEG, RGS, RS, 리에그 비코이드-관련 호메오박스(Rieg Bicoid-Related Homeobox) 전사 인자 1, RIEG 비코이드-관련 호메오박스(Bicoid-Related Homeobox) 전사 인자, All1-반응성 유전자 1, ASGD4, IGDS2, IRID2, IDG2, IHG2를 비-제한적으로 지칭하고; PROX1은 또한 프로스페로 호메오박스(Prospero Homeobox) 1, 모메오박스 스포스페로-유사 단백질(Homeobox Prospero-Like Protein) PROX1, 프로스페로-관련 호메오박스(Prospero-Related Homeobox) 1을 비-제한적으로 지칭하고; SEPP1은 또한 셀레노단백질(Selenoprotein) P, 셀레노단백질 P 혈장 1, SELP, SeP 및 SEPP를 비-제한적으로 지칭하고; SERPINA1은 또한 세르핀 계열 A 구성원 1, 알파-1-안티트립신, AAT, 세르핀 펩티다제 억제제 클래드(Serpin Peptidase Inhibitor Clade) A(알파-1 항프로테이나제, 안티트립신) 구성원 1, 프로테아제 억제제 1(항-엘라스타제) 알파-1-안티트립신, 알파-1 프로테아제 억제제, 알파-1-안티프로테이나제, 세르핀 A1, 알파1AT, A1AT, A1A, PI1, PI, 세린(또는 시스테인) 프로테이나제 억제제 클래드 A(알파-1 안티프로테이나제, 안티트립신) 구성원 1, 세르핀 펩티다제 억제제 클래드 A(알파-1안티프로테이나제, 안티트립신) 구성원 1, 알파-1-안티트립신 짧은 전사체 변이체(Antitrypsin Short Transcript Variant) 1C4, 알파-1-안티트립신 짧은 전사체 변이체 1C5, 세르핀 펩티다제 억제제 클래드 A 구성원 1, 부고환 분비 정자 결합 단백질, 알파-1-안티트립신 널(Alpha-1-Antitrypsin Null), 알파-1 안티트립신, PRO2275, NNIF를 비-제한적으로 지칭하고; SMAD7은 또한 SMAD 계열 구성원 7, 마더스 어게인스트 데카펜타플레긱 동족체(Mothers Against Decapentaplegic Homolog) 7, 마더스 어게인스트 DPP 동족체 8, MAD 동족체 8, HSMAD7, MADH7, MADH8, MAD, 마더스 어게인스트 DPP 동족체 7, MAD 동족체 7, SMAD 7, CRCS3 및 Smad7을 비-제한적으로 지칭하고; SNAI2는 또한 달팽이 계열 전사 리프레서(Snail Family Transcriptional Repressor) 2, SLUGH, 달팽이 계열 아연 핑거(Snail Family Zinc Finger) 2, 아연 핑거 단백질(Zinc Finger Protein) SNAI2, 단백질 달팽이 동족체(Protein Snail Homolog) 2, SLUGH1, SNAIL2, SLUG, 슬러그 동족체 아연 핑거 단백질(Slug Homolog Zinc Finger Protein)(닭), 슬러그(Slug)(닭 동족체) 아연 핑거 단백질, 신경관 전사 인자(Neural Crest transcription factor) SLUG, 신경관 전사 인자 슬러그, 달팽이 동족체 2(드로소필라(Drosophila)), 달팽이 동족체, WS2D 3를 비-제한적으로 지칭하고; SOD1은 또한 슈퍼옥시다제 디스뮤타제 1, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 1 가용성, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 [Cu-Zn], EC 1.15.1.1, HSod1, 근위축성 측색 경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis) 1(Adult), 부고환 분비 단백질(Epididymis Secretory Protein) Li 44, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 시스톨릭(Superoxide Dismutase Cystolic), Cu/Zn 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(Superoxide Dismutase), 인도페놀옥시다제 A, SOD 가용성, 단독이량체(Homodimer), HEL-S-44, IPOA, ALS1, SOD 및 ALS를 비-제한적으로 지칭하고; SOX17은 또한 SRY-Box 전사 인자 17, SRY(성 결정 영역 Y)-Box 17, 전사 인자 SOX-17, SRY-Box 17, SRY-관련 HMG-Box 전사 인자 SOX17, 및 VUR3을 비-제한적으로 지칭하고; SPARC는 또한 산성이고 시스테인이 풍부한 분비된 단백질(Secreted Protein Acidic And Cysteine Rich), 산성이고 시스테인에서 풍부한 분비된 단백질(Secreted Protein Acidic And Rich In Cysteine), 기저-막 단백질(Basement-Membrane Protein) 40, 오스테오넥틴(Osteonectin), BM-40, ON, 산성이고 시스테인-풍부한 분비된 단백질(Secreted Protein Acidic Cysteine-Rich), 시스테인-풍부한 단백질(Cysteine-Rich Protein) 및 OI17를 비-제한적으로 지칭하고; TBX3은 또한 T-Box 전사 인자 3, T-Box 3, T-Box 전사 인자 TBX3, T-Box 단백질 3, 방광 암 관련 단백질 XHL, 척측 유방 증후군(Ulnar Mammary Syndrome), TBX3-ISO, XHL 및 UMS를 비-제한적으로 지칭하고; TTR은 또한 트랜스티레틴(Transthyretin), 프레알부민 아밀로이드증(Prealbumin Amyloidosis) 제I형, PALB, ATTR, TBPA, 부고환 루미날 단백질(Epididymis Luminal Protein) 111, 티록신-결합 프레알부민(Thyroxine-Binding Prealbumin), 카르팔 터널 증후군(Carpal Tunnel Syndrome) 1, 프레알부민, HsT2651, HEL111, CTS1 및 CTS을 비-제한적으로 지칭하고; UGT3A1은 또한 UDP 글리코실트랜스퍼라제 계열 3 구성원 A1, UDP 글리코실트랜스퍼라제 3 계열 폴리펩타이드 A1, UDP-글루쿠로노실트랜스퍼라제 3A1, UDPGT 3A1, FLJ34658을 비-제한적으로 지칭하고; VIM은 또한 비멘틴 및 부고환 분비 정자 결합 단백질(Vimentin and Epididymis Secretory Sperm Binding Protein)을 비-제한적으로 지칭하고; VTN은 또한 비트로넥틴, 혈청 확산 인자(Serum Spreading Factor), 상보체 S-단백질, 소마토메딘(Somatomedin) B, S-단백질, V75, VN, 혈청-확산 인자, 에피볼린 및 VNT을 비-제한적으로 지칭한다.
본 발명의 범위 내에서, ABCB11은 또한 ATP 결합 카세트 소계열 B 구성원(ATP Binding Cassette Subfamily B Member) 11, 담즙 염 배출 펌프(Bile Salt Export Pump), ATP-결합 카세트 소-계열 B(MDR/TAP) 구성원 11, 진행성 가족석 간내 담즙정체증(Progressive Familial Intrahepatic Cholestasis) 2, ATP-결합 카세트 소-계열 B 구성원 11, ABC 구성원 16 MDR/TAP 소계열, BSEP, 시스터 P-당단백질(Sister P-Glycoprotein), EC 3.6.3.44, EC 7.6.2., EC 3.6.3, PFIC-2, ABC16, BRIC2, PFIC2, PGY4 및 SPGP를 비-제한적으로 지칭하고; ASGR1은 또한 아시알로당단백질 수용체(Asialoglycoprotein Receptor) 1, C-형 렉틴 도메인 계열 4 구성원(Type Lectin Domain Family 4 Member) H1, 간 렉틴 H1, CLEC4H1, HL-1, ASGP-R 1, ASGPR 1, ASGPR1 및 ASGPR를 비-제한적으로 지칭하고; CYP1A2는 또한 시토크롬 P450 계열 1 소계열 A 구성원 2, 시토크롬 P450, 소계열 I(방향족 화합물-유도성) 폴리펩타이드 2, 시토크롬 P450 계열 1 소계열 A 폴리펩타이드 2, 하이드로퍼옥시 이고카테트라에노에이트 데하이드라타제, 콜레스테롤 25-하이드록실라제, 시토크롬 P450 1A2, 시토크롬 P(3)450, 시토크롬 P450-P3, 시토크롬 P450 4, CYPIA2, 플라보단백질-연결된 모노옥시게나제(Flavoprotein-Linked Monooxygenase), 아릴 탄화수소 하이드록실라제, 마이크로솜 모노옥시게나제, 제노바이오틱 모노옥시게나제(Xenobiotic Monooxygenase), 디옥신-유도성 P3-450, EC 1.14.14.1, EC 1.14.14., EC 4.2.1.152, P450 Form 4, P450(PA), P3-450 및 CP12를 비-제한적으로 지칭하고; CYP2A6는 또한 시토크롬 P450 계열 2 소계열 A 구성원 6, 시토크롬 P450 계열 IIA(페노바르비탈-유도성) 폴리펩타이드 6, 시토크롬 P450 계열 2 소계열 A 폴리펩타이드 6, 1,4-시네올 2-엑소-모노옥시게나제, 코우마린 7-하이드록실라제, 시토크롬 P450 IIA3, 시토크롬 P450 2A6, 시토크롬 P450(I), CYPIIA6, CYP2A3, 플라보단백질-연결된 모노옥시게나제(Flavoprotein-Linked Monooxygenase), 제노바이오틱 모노옥시게나제, EC 1.14.14.1, EC 1.14.13., P450C2A, P450PB, CYP2A 및 CPA6을 비-제한적으로 지칭하고; CYP2B6은 또한 시토크롬 P450 계열 2 소계열 B 구성원 6, 시토크롬 P450 소계열 IIB(페노바르비탈-유도성) 폴리펩타이드 6, 시토크롬 P450 계열 2 소계열 B 폴리펩타이드 6, 1,4-시네올 2-엑소-모노옥시게나제, 시토크롬 P450 IIB1, 시토크롬 P450 2B6, CYPIIB6, 시토크롬 P450 소계열 IIB(페노바르비탈-유도성), 시토크롬 P450 계열 2 소계열 B, EC 1.14.14.1, EC 1.14.13., CYP2B7P, CYP2B7, CYP2B, CPB6, EFVM, IIB1 및 P450을 비-제한적으로 지칭하고; CYP2B7P는 또한 시토크롬 P450 계열 2 소계열 B 구성원 7 슈도유전자(Pseudogene), 시토크롬 P450 계열 2 소계열 B 폴리펩타이드 7 슈도유전자 1, 시토크롬 P450 계열 2 소계열 B 폴리펩타이드 7 슈도유전자, 시토크롬 P450 소계열 IIB(페노바르비탈-유도성) 폴리펩타이드 7, 시토크롬 P450 2B7 짧은 동형, 시토크롬 P450 2B7 동형, CYP2B7P1, CYP2B7 및 CYP2B를 비-제한적으로 지칭하고; CYP2C9는 또한 시토크롬 P450 계열 2 소계열 C 구성원 9, 시토크롬 P450 계열 2 소계열 C 폴리펩타이드 9, 시토크롬 P450 PB-1, 시토크롬 P450 2C9, 시토크롬 P-450MP, CYP2C10, CYPIIC9, 시토크롬 P450 소계열 IIC(메페니토인 4-하이드록실라제) 폴리펩타이드 9, 시토크롬 P-450 S-메페니토인 4-하이드록실라제, 플라보단백질-연결된 모노옥시게나제, (R)-리모넨 6-모노옥시게나제, (S)-리모넨 6-모노옥시게나제, (S)-리모넨 7-모노옥시게나제, S-메페니토인 4-하이드록실라제, 콜레스테롤 25-하이드록실라제, 마이크로솜 모노옥시게나제(Microsomal Monooxygenase), 네오바이오틱 모노옥시게나제(Xenobiotic Monooxygenase), 시토크롬 P450 MP-4, 시토크롬 P450 MP-8, EC 1.14.14.53, EC 1.14.14.51, EC 1.14.14.52, EC 1.14.14.1, EC 1.14.14, P450IIC9, CYP2C 및 CPC9를 비-제한적으로 지칭하고; CYP2E1은 또한 시토크롬 P450 계열 2 소계열 E 구성원 1, 시토크롬 P450 소계열 IIE(에탄올-유도성) 폴리펩타이드 1, 시토크롬 P450 계열 2 소계열 E 폴리펩타이드 1, 4-니트로페놀 2-하이드록실라제, 시토크롬 P450 2E1, 시토크롬 P450-J, CYPIIE1, CYP2E, 플라보단백질-연결된 모노옥시게나제, 마이크로솜 모노옥시게나제, 제노바이오틱 모노옥시게나제, EC 1.14.13.n7, EC 1.14.14.1, EC 1.14.14., P450C2E, P450-J 및 CPE1을 비-제한적으로 지칭하고; CYP3A7은 또한 시토크롬 P450 계열 3 소계열 A 구성원 7, 시토크롬 P450 계열 3 소계열 A 폴리펩타이드 7, 시토크롬 P450 소계열 IIIA 폴리펩타이드 7, 시토크롬 P450-HFLA, 시토크롬 P450 3A7, CYPIIIA7, P450HLp2, 플라보단백질-연결된 모노옥시게나제, 아릴 탄화수소 하이드록실라제, 마이크로솜 모노옥시게나제, 제노바이오틱 모노옥시게나제, P-450(HFL33), EC 1.14.14.1, EC 1.14.14., P-450111A7, P450-HFLA 및 CP37을 비-제한적으로 지칭하고; F9는 또한 응고 인자 IX, 혈장 트롬보플라스틴 구성성분(Plasma Thromboplastin Component), 혈장 트롬보플라스틱 구성성분(Plasma Thromboplastic Component), 크리스마스 인자(Christmas Factor), EC 3.4.21.22, PTC, 인자 IX F9, 혈우병(Hemophilia) B, 인자 IX, EC 3.4.21, Factor 9, F9 P22, THPH8, HEMB, FIX 및 P19를 비-제한적으로 지칭하고; NAGS는 또한 N-아세틸글루타메이트 신타제, N-아세틸 글루타메이트 신타제 미토콘드리아, 아미노산 아세틸트랜스퍼라제, EC 2.3.1.1, AGAS 및 ARGA를 비-제한적으로 지칭하고; PDX1은 또한, 췌장 및 담관 호메오박스 1(Pancreatic And Duodenal Homeobox) 1, 인슐린 프로모터 인자(Insulin Promoter Factor) 1 모메오도메인 전사 인자(Homeodomain Transcription Factor), 소마토스타틴-전사촉진 인자(Somatostatin-Transactivating Factor) 1, 췌장/십이지장 호메오박스 단백질(Pancreas/Duodenum Homeobox Protein) 1, 소마토스타틴 전사 인자 1, 인슐린 업스트림 인자(Insulin Upstream Factor) 1, 섬/십이지장 호메오박스(Islet/Duodenum Homeobox)-1, 글루코스-민감성 인자, IDX-1, IPF-1, IUF-1, PDX-1, STF-1, IPF1, GSF, 췌장-십이지장 호메오박스 인자 1, 인슐린 프로모터 인자 1, PAGEN1, MODY4, IUF1 및 STF1을 비-제한적으로 지칭하고; UGT1A1은 또한 UDP 글루쿠로노실트랜스퍼라제 계열 1 구성원 A1, UDP 글리코실트랜스퍼라제 1 계열 폴리펩타이드 A1, 빌리루빈-특이적인 UDPGT 이소자임 1, UDP-글루쿠로노실트랜스퍼라제 1-1, UDP-글루쿠로노실트랜스퍼라제 1-A, UDP-글루쿠로노실트랜스퍼라제 1A1, EC 2.4.1.17, UDPGT 1-1, HUG-BR1, UGT1-01, UGT-1A, UGT1*1, UGT1.1, UGT1A, GNT1, UGT1, UDP 글루쿠로노실트랜스퍼라제 1 계열 폴리펩타이드 A1, 빌리루빈 UDP-글루쿠로노실트랜스퍼라제 이소자임 1, 빌리루빈 UDP-글루쿠로노실트랜스퍼라제 1-1, 빌리루빈 UDP-글루쿠로노실트랜스퍼라제, BILIQTL1 및 UDPGT를 비-제한적으로 지칭한다.
예시적으로, UGT1A1 마커는 일반적으로 암모니아 해독 및 빌리루빈 접합과 관련된다. 일 구현예에서, 특히 세포의 집단 내에서, 간 줄기 세포는 UGT1A1 마커(UGT1A1-)의 비-발현, 바람직하게는 사람 UGT1A1 마커의 비-발현에 의해 특징화된다. 실제로, 상기 간 줄기-유사 세포는 암모니아를 해독하고 빌리루빈을 접합시키는 능력이 손상되었다.
우레아 주기를 통한 암모니아 물질대사는 진전된 성숙 상태의 간세포의 필수 기능인 것으로 이해된다. 일부 구현예에서, 암모니아 물질대사는 우레아 주기 유전자(예를 들면, NAGS)의 부재 또는 공지된 농도의 염화암모늄의 첨가 후 24시간의 기간에 걸쳐 세포 배양 상층액 속에 암모니아 농도의 변화에 의해 평가될 수 있다. 실제로, 1 mM의 염화암모늄 표준을 세포 배양에 가할 수 있고, 상층액을 염화암모늄 첨가 시 24시간 째에 수집할 수 있고, 암모니아 농도를 예컨대, 비색 암모니아 검정 키트(colorimetric ammonia assay kit)(BioVision®)를 사용하여 측정할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포는 적어도 하나의 성장 인자 마커, 특히 간세포 성장 인자 마커(HGF+), 및/또는 적어도 하나의 사이토킨, 및/또는 적어도 하나의 소염 특성, 면역억제 특성, 항-섬유증 특성, 항-지방증 특성 및/또는 항-산화 스트레스 특성 등을 가진 분자를 발현한다. 일부 구현예에서, 상기 간 줄기-유사 세포는 다능성 줄기 세포(pSC), 유도된 다능성 줄기 세포(ipSC), 다능성 줄기 세포, 분화된 간 세포 및 경분화된 비-간세포(전환분화된 non-hepatic cell)로 이루어진 그룹에서 선택된 전구체 세포로부터 유래된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "다능성 줄기 세포"는 적절한 조건 하에서, 3개의 배아 층(내배엽, 중배엽, 및 외배엽)으로부터의 세포 계통과 관련된 특성을 총괄적으로 나타내는 세포 형으로 분화를 겪을 수 있는 세포 후대세포를 생성하는 능력을 가진 세포를 지칭한다. 다능성 줄기 세포는 출생전, 출생 후 또는 성체 유기체의 조직에 기여할 수 있다. 표준의 당해 분야에서 허용된 시험, 예를 들면, 8 내지 12주령의 SCID 마우스에서 기형종을 형성하는 능력을 사용하여 세포 집단의 다능성을 확립할 수 있다. 그러나, 다양한 다능성 줄기 세포 특성의 확인을 또한 사용하여 다능성 세포를 확인할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 다능성 줄기 세포는 동물 다능성 줄기 세포, 보다 바람직하게는 사람 다능성 줄기 세포이다.
특정의 구현예에서, 사람 다능성 줄기 세포는 적어도 2개, 및 임의로, SSEA-3, SSEA-4, TRA-I -60, TRA-I -81, TRA-2-49/6E, ALP, SOX2, E-cadherin, UTF-I, OCT4, LIN28, REX1, 및 NANOG로 이루어진 그룹에서 선택된 13개의 마커 모두를 발현할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 표현 "적어도 2개"는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 및 13개를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, "유도된 다능성 줄기 세포"(iPSC)는 비-다능성 세포로부터 인공적으로 유래된 다능성 줄기 세포를 지칭한다. 비-다능성 세포는 다능성 줄기 세포와 비교하여 자가-재생되고 분화되는 능력(또는 효능)이 보다 적은 세포일 수 있다. 보다 적은 효능의 세포는 체세포 줄기 세포, 조직 특이적인 선조 세포, 1차 또는 2차 세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. iPSC는 배아 발달, 증식 및 세포 주기 제어를 위해 중요한 인자, 특히 OCT4, SOX2, c-MYC 및 KLF4 전사 인자 칵테일의 강요된, 유도된 발현 및/또는 과발현에 의해 또는 인자의 대안의 조합에 의해, KLF4 및 c-MYC를 치환시킴에 의해 또는 NANOG 및 LIN28을 가함에 의해, 또는 재프로그래밍 공정(소 분자, 예를 들면, DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제제, miRNA, 비타민, 하이폭시아(hypoxia) 등을 수반하는)을 증진시키기 위해 숙련가로부터 공지된 임의의 방법에 의해 재현가능하게 수득되었다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "재프로그래밍"은 주어진 세포 내에서 인자(또는 재프로그래밍 인자)의 강요된 발현의 수단에 의해 주어진 세포의 죽음(fate)을 상이한 세포형의 것으로 변화시키는 공정을 지칭한다. 재프로그래밍 인자를 암호화하는 발현 벡터를 기반으로 하여 iPSC를 생성하는 방법은 당해 분야, 예컨대, WO2007/69666, EP2096169 및 WO2010/042490에 기술되었다. 실제로, 재프로그래밍은 재프로그래밍 인자, 특히 세균 인공 염색체(BAC) 벡터, 코스미드 벡터, 플라스미드 벡터, 트랜스포손-기반 벡터(예를 들면, PiggyBac), 바이러스 벡터, RNA, 단백질, 소 단백질 등의 이소성 발현을 허용하는 발현 벡터의 사용을 통해 달성될 수 있다. 적합한 발현 벡터는 예컨대, 문헌(Gonzaelez ez 등 (2011))에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, iPSC는 동물 iPSC, 보다 바람직하게는 사람 iPSC(hiPSC)이다. 특정의 구현예에서, iPSC, 바람직하게는 hiPSC는 건강한 대상체로부터 또는 간 장애를 지닌 대상체로부터 동일하게 수득된 세포로부터 유래된다. 일부 구현예에서, iPSC, 바람직하게는 hiPSC는 간 장애를 지니지 않은, 특히 만성 간 장애를 지니지 않은 개체로부터 수득된 세포로부터 유래된다. 일부 대안의 구현예에서, iPSC, 바람직하게는 hiPSC는 간 장애, 특히 만성 간 장애를 지닌 개체로부터 수득된 세포로부터 유래되고, 단 iPSC, 바람직하게는 hiPSC는 간 세포로부터 유래되지 않는다. 실제로, iPSC, 특히 hiPSC의 선택은 자가 이식을 수행하는데 유리할 수 있다. iPSC의 공급원의 비-제한적 예는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 섬유아세포, 간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cell), 비뇨기 세포 등이다.
실제로, iPSC는 예컨대, ATCC®로부터 상업적으로 이용가능할 수 있다. iPSC의 비-제한적인 예는: 표피섬유아세포로부터 유래된 iPSC(ATCC® ACS-7030); 골수 CD34+ 세포로부터의 센다이 바이러스 재프로그램된 hiPSC(ATCC® ACS-1027; ATCC® ACS-1028; ATCC® ACS-1029; ATCC® ACS-1030; ATCC® ACS-1031); 피부 섬유아세포로부터 야마나카 레트로바이러스(Yamanaka retrovirus) 재프로그램된 hiPSC(ATCC® ACS-1023); iPSC-유래된 중배엽 줄기 세포(ATCC® ACS-7010); 간 섬유아세포로부터의 센다이 바이러스 재프로그램된 hiPSC(ATCC® ACS-1020); 심장 섬유아세포로부터 센다이 바이러스 재프로그램된 hiPSC(ATCC® ACS-1021)이다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포의 집단은 임의로 고체 지지체 상에서 다능성 세포, 예를 들면, 중배엽 줄기 세포의 분화로부터 수득될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "다능성"은 적어도 말단으로 분화된 세포형으로 분화할 수 있는 세포를 지칭한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 다능성 세포는 동물 다능성 세포, 보다 바람직하게는 사람 다능성 세포이다.
본원에 사용된 바와 같은, "중배엽 줄기 세포"(MSC)는 일반적으로 구체화된 조직(또한 분화된 조직으로 명명됨)으로부터 유래되고 기관의 수명을 위해 자가-재생할 수 있고(즉, 자체적으로 동일한 카피를 제조할 수 있고) 다능성 분화 효능을 갖는 기질 세포를 지칭한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 MSC는 동물 MSC, 보다 바람직하게는 사람 MSC(hMSC)이다.
실제로, 본 발명을 시행하는데 적합한 hMSC는 따라서 임의의 적절한 단리 방법을 사용하여, 임의의 적합한 조직으로부터 유래된 임의의 적합한 사람 다능성 줄기 세포를 포함한다.
예시적으로, hMSC는 성체 다중계통 유도성(adult multilineage inducible; MIAMI) 세포(D'Ippolito 등; 2004), 제대혈 유래된 줄기 세포(Koegler 등; 2004), 메소혈관모세포(mesoangioblast)(Sampaolesi 등; 2006; Dellavalle 등; 2007), 및 양수 줄기 세포(amniotic stem cell)(De Coppi 등; 2007)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 제대혈 뱅크(예컨대, Etablissement Francais du Sang, 프랑스)는 이식을 위해 이러한 세포의 확실하고 용이하게 이용가능한 공급원이다. hMSC는 예컨대, CREATIVE BIOARRAY®로부터 사업적으로 이용가능하다. hMSC의 비-제한적 예는: HMSC.BM-100; HMSC.AD-100; 사람 중배엽 줄기 세포-성체(HMSC-Ad); 사람 중배엽 줄기 세포 와르톤스 젤리(Human Mesenchymal Stem Cells Wharton's Jelly)(HMSC-WJ); 제대혈 매트릭스로부터의 사람 중배엽 줄기 세포(Human Mesenchymal Stem Cells from Umbilical Cord Matrix; hMSC-UC); 사람 중배엽 줄기 세포-지방(Human Mesenchymal Stem Cells-adipose; HMSC-ad); 사람 중배엽 줄기 세포-골수(Human Mesenchymal Stem Cells-bone marrow; HMSC-bm); 사람 중배엽 줄기 세포-간(Human Mesenchymal Stem Cells-hepatic; HMSC-he)이다.
특정의 구현예에서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포의 집단은 분화된 간 세포, 즉, 성체 간(예컨대, 간세포 선조 세포)로부터 단리된 세포의 분화로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 분화된 간 세포는 동물 분화된 간 세포, 보다 바람직하게는 사람 분화된 간 세포이다.
특정의 구현예에서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포의 집단은 전환분화된(transdifferentiated) 비-간 세포, 즉, 섬유아세포와 같은 체세포의 전환으로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 전환분화된 간 세포는 동물 전환분화된 간 세포, 보다 바람직하게는 사람 전환분화된 간 세포이다.
일부 구현예에서, 상기 다능성 줄기 세포(pSC)는 배아 줄기 세포(ESC)로부터, 바람직하게는 사람 배아 줄기 세포(hESC)로부터 수득된다.
본원에 사용된 바와 같이, "배아 줄기 세포"는 배아 세포를 지칭하고, 이는 3개의 배아 배엽(three embryonic germ layer), 즉, 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 중 어느 하나의 세포로 분화할 수 있거나, 분화되지 않은 상태로 유지할 수 있다. 이러한 세포는 임신 후(즉, 배반포) 후 배아의 착상 전(즉, 착상-전 배반포)에 형성된 배아 조직으로부터 수득된 세포, 착상-후/장배형성-전 단계 배반포로부터 수득된 확장된 배반포 세포(EBC)(참고: WO2006/040763), 임신 동안, 바람직하게는 임신 10주 전 및 수정되지 않은 난황을 사용한 다른 방법, 예를 들면, 단위생식 방법(parthenogenesis method) 또는 핵 전달 동안 임의의 시기에 태아의 생식기 조직으로부터 수득한 배아 생식(embryonic germ; EG) 세포를 포함할 수 있다.
실제로, 적합한 배아 줄기 세포는 잘 공지된 세포-배양 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 예를 들면, hESC는 사람 배반포로부터 단리될 수 있다. 사람 배반포는 전형적으로 사람 생체 내 착상전 배아로부터 또는 시험관 내 수정된(IVF) 배아로부터 수득된다. 대안적으로, 단일 세포 사람 배아는 배반포 단계로 확장될 수 있다. hESC의 제조 방법에서의 추가의 세부사항은 미국 특허 제5,843,780호에서 찾을 수 있다.
실제로, hESC는 문헌(Chung et al. (2008))에 기술된 바와 같이, 배아 파괴 없이, 또는 문헌(Sagi et al. (2016))에 기술된 바와 같이, 수정되지 않은 난모세포의 단위생식 활성화에 의해 유리하게 수득될 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포는 간세포-유사 세포(HLC) 및 담관세포를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "담관세포"는 담관의 상피 세포를 지칭하는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 바와 같은, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포는 상기 간 줄기-유사 세포의 후대 세포를 구성한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "이의 추출물"은 간 줄기-유사 세포, 또는 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포를 포함하는 집단, 특히 단리된 집단을 지칭한다. 용어 "추출물"은 간 줄기-유사 세포의 배양물로부터 수득된 임의의 세포 분획 또는 배양 상층액, 또는 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포의 집단, 특히 단리된 집단을 지칭하고, 단 추출물은 간 줄기-유사 세포, 특히 이의 치료학적 특성의 특성을 보존할 수 있다.
세포 분획은 당해 분야의 기술로부터 공지된 임의의 적합한 방법, 또는 이로부터 수정된 방법에 따라 수득될 수 있다. 세포 분획을 수득하는 것은 기계적, 화학적 및/또는 효소적 세포 분해, 원심분리, 초원심분리, 친화성 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 세포 분획은 세포액 분획(cytosolic fraction), 세포질 분획, 막 분획, 가용성 분획, 불용성 분획, 소낭, 엑소좀(exosome), 및 이의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 간 줄기-유사 세포의 추출물, 또는 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포를 포함하거나 이로 이루어진 세포의 집단, 특히 단리된 집단은 엑소좀 또는 엑소좀-유사 소낭을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "엑소좀"은 신체 내에서 거의 모든 세포형에 의해 천연적으로 분비된 식균작용-유래된 나노소낭(endocytic-derived nanovesicle)을 지칭할 수 있다. 엑소좀은 단백질, 핵산, 및 지질을 포함하는 지질성 소낭이다. 실제로, 엑소좀은 당해 분야의 기술에 공지된 임의의 적합한 방법, 또는 이로부터 수정된 방법에 따라 수집, 단리 및/또는 정제될 수 있다.
예시적으로, 엑소좀 분획은 배양 배지로부터 차등적 원심분리에 의해; 중합체 침전에 의해; 고-성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 단리될 수 있다. 배양 배지로부터의 차등적인 원심분리 방법의 비-제한적 예는 다음의 단계를 포함할 수 있다:
1) 약 300Хg 내지 약 500Хg의 속도에서 10 내지 20분 동안 원심분리하여, 세포를 제거하는 단계;
2) 약 1,500Хg 내지 약 3,000Хg의 속도에서 10 내지 20분 동안 원심분리하여, 죽은 세포를 제거하는 단계;
3) 약 7,500Хg 내지 약 15,000Хg의 속도에서 20 내지 45분 동안 원심분리하여, 세포 부스러기를 제거하는 단계;
4) 약 100,000Хg 내지 약 200,000Хg의 속도에서 30 내지 120분 동안 1회 이상 초원심분리하여, 엑소좀을 펠렛화하는 단계.
대안적으로, 엑소좀 또는 엑소좀-유사 소낭의 단리는 예컨대, exoEasy Maxi Kit(QIAGEN®) 또는 전체 엑소좀 단리 키트(Total Exosome Isolation Kit)(THERMOFISHER SCIENTIFIC®)와 같은 시판 키트의 수단으로 수행할 수 있다.
일부 구현예에서, 엑소좀 또는 엑소좀-유사 소낭은 평균 직경이 약 1 nm 내지 약 250 nm, 바람직하게는 약 20 nm 내지 약 200 nm, 보다 바람직하게는 약 90 nm 내지 150 nm이다. 본 발명의 범위 내에서, "약 1 nm 내지 약 250 nm"라는 표현은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 및 250 nm를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포로부터 수득된 추출물은 알파-페토단백질 마커(AFP+)를 추가로 포함하고 알부민 마커(ALB-)를 발현하지 않는다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포로부터 수득된 추출물은 T-Box 전사 인자 3 마커(TBX3+) 및/또는 간세포 핵 인자 4 알파 마커(HNF4A+), 바람직하게는 T-Box 전사 인자 3 마커(TBX3+) 및 간세포 핵 인자 4 알파 마커(HNF4A+)를 추가로 포함한다.
특정의 구현예에서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포로부터 수득된 추출물은 KRT19, EPCAM 및 TTR로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 마커, 특히 적어도 2개의 마커, 보다 특히 3개의 마커, 바람직하게는 사람 마커를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포로부터 수득된 추출물은 KRT19, EPCAM, TTR 및 HGF로 이루어진 그룹에서 선택된, 적어도 하나의 마커, 특히 적어도 2개의 마커, 보다 특히 3개의 마커, 심지어 보다 특히 4개의 마커, 바람직하게는 사람 마커를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포로부터 수득된 추출물은 KRT19, EPCAM 및 TTR로 이루어진 그룹에서 선택된, 적어도 하나의 마커, 특히 적어도 2개의 마커, 보다 특히 3개의 마커, 바람직하게는 사람 마커를 추가로 포함하고/하거나 HGF, 바람직하게는 사람 HGF를 추가로 발현한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포로부터 수득된 추출물은 AFP, TBX3 및 HNF4A 마커를 추가로 포함하고, ALB 마커는 포함하지 않는다. 특정의 구현예에서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포로부터 수득된 추출물을 AFP, TBX3, HNF4A 및 HGF 마커를 추가로 포함하고, ALB 마커를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포로부터 수득된 추출물은 AFP, TBX3, HNF4A 및 TTR 마커를 추가로 포함하고, ALB 마커를 포함하지 않는다. 특정의 구현예에서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포로부터 수득된 추출물은 AFP, TBX3, HNF4A, HGF 및 TTR 마커를 추가로 포함하고, ALB 마커를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포로부터 수득된 추출물은 AFP, TBX3, HNF4A 및 EPCAM 마커를 추가로 포함하고, ALB 마커를 포함하지 않는다. 특정의 구현예에서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포로부터 수득된 추출물은 AFP, TBX3, HNF4A, EPCAM 및 HGF 마커를 추가로 포함하고, ALB 마커를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포로부터 수득된 추출물은 AFP, TBX3, HNF4A, EPCAM, TTR 및 KRT19 마커를 추가로 포함하고, ALB 마커를 포함하지 않는다. 특정의 구현예에서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포로부터 수득된 추출물은 AFP, TBX3, HNF4A, EPCAM, TTR, KRT19, 및 HGF 마커를 추가로 포함하고, ALB 마커를 포함하지 않는다. 바람직하게는 마커는 사람 마커이다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포로부터 수득된 추출물은, ACTB, ATG1, AFP, ANXA2, ANXA5, ANXA6, APOA1, APOA2, APOA4, APOB, APOC3, APOE, BMP2, BMP4, CD164, CD24, CD63, CD81, CD9, CD99, CLTC, CXCR4, DCN, DLK1, DPP4, EEF1A1, EEF2, ENO1, EPCAM, FGF19, FOXA2, GAPDH, GATA4, GATA6, GJA1, GPC3, GSTA1, GSTA2, HGF, HMOX1, HNF1B, HNF4A, HSP90AA1, HSP90AB, HSPA8, HSPG2, IGF1, IGFBP3, IL6ST, ITGA6, KRT18, KRT19, KRT8, LCP1, MKI67, MYDGF, NODAL, PKM, PITX2, PROX1, SEPP1, SERPINA1, SMAD7, SNAI2, SOD1, SOX17, SPARC, TBX3, TFRC, TUBA1A, TUBB, TUBB3, TUBB6, TUBB4A, TUBB4B, TUBA1B, TUBB2A, TUBB2B, TTR, UGT3A1, VIM, 및 VTN으로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 마커를 포함할 수 있고; 및/또는 ALB, ABCB11, ASGR1, CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2B7P, CYP2C9, CYP2E1, CYP3A4, CYP3A7, F9, NAGS, PDX1, UGT1A1로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 마커를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명은 또한:
a) 유도 배양 배지 속에서 최종 내배엽 세포를 배양함으로써, AFP 마커(AFP+)를 발현하고 ALB 마커(ALB-)를 발현하지 않는 간 줄기-유사 세포를 생성시키는 단계;
b) 단계 a)에서 생성된 간 줄기-유사 세포를 단리하는 단계를 포함하는, 본원에 개시된 바와 같은 간 줄기-유사 세포를 생성하는 방법에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 단리된 간 줄기-유사 세포는 세포의 집단을 구성한다.
본원에 사용된 바와 같은, "최종의 내배엽 세포"는 SOX17 및 FOXA2 마커를 포함하나, 이에 한정되지 않는 최종의 내배엽 분화 상의 특성인 표현형 마커를 발현하는 세포를 지칭한다. 또한, 최종의 내배엽 세포는 ALB 마커(ALB-)를 발현하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은, "유도 배양 배지"는 본 발명에 의해 정의된 바와 같이, 최종의 내배엽 세포를 간 줄기-유사 세포로의 분화를 유도할 수 있는 배양 배지를 지칭한다.
실제로, "배양 배지"는 세포 생물학의 분야에서 일반적으로 허용된 정의, 즉, 목적한 세포의 성장을 촉진시키는데 적합한 임의의 배지를 지칭한다. 일부 구현예에서, 적합한 배양 배지는 화학적으로 정의된 배지, 즉, 명시된 구성성분, 바람직하게는 공지된 화학 구조의 구성성분 만을 함유하는 영양 배지를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 화학적으로 정의된 배지는 혈청이 없고/없거나 공급인자가 없는 배지(feeder-free medium)일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, "혈청이 없는" 배지는 혈청이 가해지지 않은 배양 배지를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은, "공급인자가 없는" 배지는 공급인자 세포가 가해지지 않은 배양 배지를 지칭한다.
본 발명에 따라 사용하기에 적합한 배양 배지는 하나 이상의 염, 탄소원, 아미노산, 비타민, 무기질, 환원제, 완충제, 지질, 뉴클레오사이드, 항생제, 사이토킨, 및 성장 인자와 같은 물질의 조합을 포함할 수 있는 수성 배지일 수 있다. 적합한 배양 배지의 예는 제한없이, RPMI 배지, 윌리암스 E 배지(William's E medium), 기본 배지 이글(Basal Medium Eagle; BME), 이글스 최소 필수 배지(Eagle's Minimum Essential Medium; EMEM), 최소 필수 배지(Minimum Essential Medium; MEM), 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagles Medium; DMEM), 햄스 F-10(Ham's F-10), 햄스 F-12 배지, 카인스 변형 햄스 F-12 배지(Kaighn's modified Ham's F-12 medium), DMEM/F-12 배지, 및 맥코이스 5A 배지(McCoy's 5A medium)를 포함하고, 이는 상술한 물질 중 임의의 하나로 추가로 보충될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 배양 배지는 합성 배양 배지, 예를 들면, RPMI(Roswell Park Memorial Institute medium) 또는 CMRL-1066(Connaught Medical Research Laboratory)일 수 있다.
실제로, 배지는 추가의 첨가제로 보충될 수 있다. 예시적으로, INVITROGEN®으로부터의 시판 B-27 보충물은 인슐린, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD), 카탈라제 및 다른 항-산화제(GSH), 및 유일한 지방산, 예를 들면, 리놀레산, 리놀렌산 및 리포산을 포함하므로, 적합한 보충물을 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, 단계 a)는 골 형성 단백질, 바람직하게는 BMP4를 포함하고/하거나 섬유아세포 성장 인자, 바람직하게는 FGF10를 포함하고, 임의로 간세포 성장 인자 HGF 및/또는 GSK3 억제제, 바람직하게는 CHIR-99021을 포함하는 유도 배양 배지 속에서 약 5일 내지 8일 동안 수행된다.
일부 구현예에서, 골 형성 단백질(BMP)은 예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, GDF-8/마이오스타틴, 노달(Nodal), TGF-베타 1, TGF-베타 2, TGF-베타 3와 같은 AR Smad를 활성화시키는 분자; 및 예컨대, BMP2, BMP4, BMP6, BMP8a, BMP8b, GDF5, GDF6, GDF7, AMH와 같은 BR Smad를 활성화시키는 분자를 포함하는 TGF-베타 소계열의 구성원인 성장 인자의 그룹에서 선택된다. 본 발명에 따른 적합한 BMP는 예컨대, 문헌(Miyazono et al. (2019))에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 섬유아세포 성장 인자(FGF)는 FGF1 소계열, 예를 들면, FGF1(또한 aFGF로 명명됨), FGF2(또한 bFGF로 명명됨); FGF4 소계열로부터의 FGF, 예를 들면, FG4, FGF5, FGF6; FGF7 소계열로부터의 FGF, 예를 들면, FGF3, FGF7, FGF10, FGF22; FGF8 소계열로부터의 FGF, 예를 들면, FGF8, FGF17, FGF18; FGF9 소계열로부터의 FGF, 예를 들면, FGF9, FGF16, FGF20; FGF11 소계열로부터의 FGF, 예를 들면, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14; 및 FGF19 소계열로부터의 FGF, 예를 들면, FGF15/19, FGF21, FGF23을 포함하는 그룹에서 선택된다. 일부 구현예에서, 섬유아세포 성장 인자(FGF)는 FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF15/19, FGF20, FGF21, FGF22 및 FGF23으로 이루어진 그룹에서 선택된다.
실제로, 골 형성 단백질(BMP) 및/또는 섬유아세포 성장 인자(FGF)는 유도 배지 속에 약 0.01 ng/ml 내지 약 500 ng/ml, 바람직하게는 약 0.5 ng/ml 내지 약 250 ng/ml, 보다 바람직하게는 약 1 ng/ml 내지 약 50 ng/ml의 농도에서 존재한다. 본 발명의 범위 내에서, "약 0.01 ng/ml 내지 약 500 ng/ml"라는 표현은 0.01 ng/ml, 0.05 ng/ml, 0.1 ng/ml, 0.5 ng/ml, 1.0 ng/ml, 1.5 ng/ml, 2.0 ng/ml, 2.5 ng/ml, 5.0 ng/ml, 7.5 ng/ml, 10.0 ng/ml, 12.5 ng/ml, 15.0 ng/ml, 17.5 ng/ml, 20 ng/ml, 25 ng/ml, 30 ng/ml, 35 ng/ml, 40 ng/ml, 45 ng/ml, 50 ng/ml, 55 ng/ml, 60 ng/ml, 70 ng/ml, 80 ng/ml, 90 ng/ml, 100 ng/ml, 150 ng/ml, 200 ng/ml, 250 ng/ml, 300 ng/ml, 350 ng/ml, 400 ng/ml, 450 ng/ml, 및 500 ng/ml를 포함한다.
일부 구현예에서, BMP4는 유도 배지 속에 약 0.1 ng/ml 내지 약 100 ng/ml, 바람직하게는 약 0.5 ng/ml 내지 약 50 ng/ml, 보다 바람직하게는 약 1 ng/ml 내지 약 25 ng/ml의 농도로 포함된다.
일부 구현예에서, FGF10은 유도 배지 속에 약 0.1 ng/ml 내지 약 100 ng/ml, 바람직하게는 약 0.5 ng/ml 내지 약 50 ng/ml, 보다 바람직하게는 약 1 ng/ml 내지 약 25 ng/ml의 농도로 포함된다.
본 발명의 범위 내에서, "약 0.1 ng/ml 내지 약 100 ng/ml"라는 표현은 0.1 ng/ml, 0.5 ng/ml, 1.0 ng/ml, 1.5 ng/ml, 2.0 ng/ml, 2.5 ng/ml, 5.0 ng/ml, 7.5 ng/ml, 10.0 ng/ml, 12.5 ng/ml, 15.0 ng/ml, 17.5 ng/ml, 20 ng/ml, 25 ng/ml, 30 ng/ml, 35 ng/ml, 40 ng/ml, 45 ng/ml, 50 ng/ml, 55 ng/ml, 60 ng/ml, 70 ng/ml, 80 ng/ml, 90 ng/ml, 및 100 ng/ml를 포함한다.
유도 배지 속에 존재하는 경우, 간세포 성장 인자 HGF는 약 0.5 ng/ml 내지 약 150 ng/ml, 바람직하게는 약 1 ng/ml 내지 약 100 ng/ml, 보다 바람직하게는 약 5 ng/ml 내지 약 50 ng/ml의 농도로 포함된다. 본 발명의 범위 내에서, "약 0.5 ng/ml 내지 약 150 ng/ml"라는 표현은 0.5 ng/ml, 1.0 ng/ml, 1.5 ng/ml, 2.0 ng/ml, 2.5 ng/ml, 5.0 ng/ml, 7.5 ng/ml, 10.0 ng/ml, 12.5 ng/ml, 15.0 ng/ml, 17.5 ng/ml, 20 ng/ml, 25 ng/ml, 30 ng/ml, 35 ng/ml, 40 ng/ml, 45 ng/ml, 50 ng/ml, 55 ng/ml, 60 ng/ml, 70 ng/ml, 80 ng/ml, 90 ng/ml, 100 ng/ml, 110 ng/ml, 120 ng/ml, 130 ng/ml, 140 ng/ml, 및 150 ng/ml를 포함한다.
본 발명의 범위 내에서, 약 5일 내지 약 8일은 5, 6, 7 및 8일을 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 a) 보다 다능성 줄기 세포(PSC), 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC) 또는 다능성 줄기 세포를 배양 배지 속에서 배양시켜 FOXA2 및 SOX17 마커를 발현하는 최종의 내배엽 세포를 생성시키는 단계 a1)이 선행될 수 있다. 주목하게도, 최종의 내배엽 세포는 ALB 마커(ALB-)를 발현하지 않는다.
특정의 구현예에서, 단계 a1)은 약 3일 내지 약 6일 동안 GSK3 억제제, 바람직하게는 CHIR-99021을 포함하고 임의로 형질전환 성장 인자-베타 화합물, 바람직하게는 ACT-A, 및/또는 Wnt 신호전달 경로의 활성인자, 바람직하게는 Wnt3A를 포함하는 배양 배지 속에서 수행될 수 있다.
본 발명의 범위 내에서, 약 3일 내지 약 6일은 3, 4, 5, 및 6일을 포함한다.
일부 구현예에서, GSK3 억제제는 3F8(CAS 번호 159109-11-2), 알스테르파울론(CAS 번호 237430-03-4), CHIR-98014(CAS 번호 252935-94-7), CHIR-99021(CAS 번호 1797989-42-4), 인디루빈-3'-옥심(CAS 번호 160807-49-8), 켄파울론(CAS 번호 142273-20-9), SB216763(CAS 번호 280744-09-4), TC-G 24(CAS 번호 1257256-44-2) TCS 2002(CAS 번호 1005201-24-0) 및 TWS119(CAS 번호 601514-19-6), 리튬, 구리, 수은, 텅스텐, 아연 쿠르쿠민, 베릴륨, 6-BIO, 디브로모칸타렐린, 하이메니알데신, 인디루빈, 메리디아닌, CT98014, CT98023, CT99021, SB-41528, AR-A014418, AZD-1080, 카츠파울론, 만자민 A, 팔리누린, 트리칸틴, TDZD-8, NP00111, NP031115, 티데글루십, HMK-32, L803-mts, 발프로산, 쿠르쿠민, 알로이신, IM-12, LY2090314를 포함하는 그룹에서 선택된다. 실제로, GSK3 억제제는 예컨대, SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY®, SELLECKCHEM® 및 TOCRIS®로부터 상업적으로 이용가능할 수 있다.
일부 구현예에서, GSK3 억제제는 배양 배지 속에 약 0.01 μM 내지 약 50 μM의 농도에서 존재한다. 본 발명의 범위 내에서, "약 0.01 μM 내지 약 50 μM"라는 표현은 0.01 μM, 0.02 μM, 0.03 μM, 0.04 μM, 0.05 μM, 0.06 μM, 0.07 μM, 0.08 μM, 0.09 μM, 0.1 μM, 0.2 μM, 0.3 μM, 0.4 μM, 0.5 μM, 0.6 μM, 0.7 μM, 0.8 μM, 0.9 μM, 1.0 μM, 1.5 μM, 2.0 μM, 2.5 μM, 3.0 μM, 3.5 μM, 4.0 μM, 4.5 μM, 5.0 μM, 5.5 μM, 6.0 μM, 6.5 μM, 7.0 μM, 7.5 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, 35 μM, 40 μM, 45 μM, 및 50 μM을 포함한다.
일부 구현예에서, GSK3 억제제는 CHIR-99021이다. 일부 구현예에서, CHIR-99021은 배양 배지 속에 약 0.1 μM 내지 약 15 μM, 바람직하게는 약 0.5 μM 내지 약 10 μM, 보다 바람직하게는 약 1 μM 내지 약 5 μM의 농도에서 포함된다. 본 발명의 범위 내에서, "약 0.1 μM 내지 약 15 μM"라는 표현은 0.1 μM, 0.2 μM, 0.3 μM, 0.4 μM, 0.5 μM, 0.6 μM, 0.7 μM, 0.8 μM, 0.9 μM, 1.0 μM, 1.5 μM, 2.0 μM, 2.5 μM, 3.0 μM, 3.5 μM, 4.0 μM, 4.5 μM, 5.0 μM, 5.5 μM, 6.0 μM, 6.5 μM, 7.0 μM, 7.5 μM, 8 μM, 9 μM, 10.0 μM, 11.0 μM, 12.0 μM, 13.0 μM, 14.0 μM, 15.0 μM을 포함한다.
일부 구현예에서, 형질전환 성장 인자-베타 화합물은 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, AMH, BMP2, BMP4, BMP6, BMP8a, BMP8b, GDF5, GDF6, GDF7, GDF-8/아미오스타틴, 노달, TGF-베타 1, TGF-베타 2, TGF-베타 3을 포함하는 그룹에서 선택된다.
실제로, 형질전환 성장 인자-베타는 배양 배지 속에 약 0.01 ng/ml 내지 약 1,000 ng/ml, 바람직하게는 약 0.5 ng/ml 내지 약 500 ng/ml, 보다 바람직하게는 약 1 ng/ml 내지 약 250 ng/ml의 농도에서 존재한다. 본 발명의 범위 내에서, "약 0.01 ng/ml 내지 약 1,000 ng/ml"라는 표현은 0.01 ng/ml, 0.05 ng/ml, 0.1 ng/ml, 0.5 ng/ml, 1.0 ng/ml, 1.5 ng/ml, 2.0 ng/ml, 2.5 ng/ml, 5.0 ng/ml, 7.5 ng/ml, 10.0 ng/ml, 12.5 ng/ml, 15.0 ng/ml, 17.5 ng/ml, 20 ng/ml, 25 ng/ml, 30 ng/ml, 35 ng/ml, 40 ng/ml, 45 ng/ml, 50 ng/ml, 55 ng/ml, 60 ng/ml, 70 ng/ml, 80 ng/ml, 90 ng/ml, 100 ng/ml, 150 ng/ml, 200 ng/ml, 250 ng/ml, 300 ng/ml, 350 ng/ml, 400 ng/ml, 450 ng/ml, 500 ng/ml, 600 ng/ml, 700 ng/ml, 800 ng/ml, 900 ng/ml 및 1,000 ng/ml를 포함한다.
일부 구현예에서, 형질전환 성장 인자-베타 화합물은 액티빈 A(ACT-A)이다. 배양 배지 속에 존재하는 경우, ACT-A는 약 1 ng/ml 내지 약 500 ng/ml, 바람직하게는 약 25 ng/ml 내지 약 250 ng/ml, 보다 바람직하게는 약 50 ng/ml 내지 약 150 ng/ml의 농도에서 포함된다. 본 발명의 범위 내에서, "약 1 ng/ml 내지 약 500 ng/ml"라는 표현은 1 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 75 ng/ml, 100 ng/ml, 150 ng/ml, 200 ng/ml, 250 ng/ml, 300 ng/ml, 350 ng/ml, 400 ng/ml, 450 ng/ml 및 500 ng/ml를 포함한다.
일부 구현예에서, Wnt 신호전달 경로의 활성인자는 Wnt-1(또한 Int-1로서 지칭됨), Wnt-2(또한 Irp(Int-1-관련된 단백질)로서 지칭됨), Wnt-2b(또한 Wnt-13으로서 지칭됨), Wnt-3(Int-4로서 지칭됨), Wnt-3a, Wnt-4, Wnt-5a, Wnt-5b, Wnt-6, Wnt-7a, Wnt-7b, Wnt-8a(Wnt-8d로서 지칭됨), Wnt-8b, Wnt-9a(Wnt-14로서 지칭됨), Wnt-9b(Wnt-14b 또는 Wnt-15로서 지칭됨), Wnt-10a, Wnt-10b(Wnt-12로서 지칭됨), Wnt-11, Wnt-12(또한 Wnt-10b로서 지칭됨), Wnt-13(또한 Wnt-2b로서 지칭됨), Wnt-14(또한 Wnt-9a로서 지칭됨), Wnt-14b(Wnt-9ab로서 지칭됨), Wnt-15(또한 Wnt-9b로서 지칭됨) 및 Wnt-16으로 이루어진 Wnt 계열의 그룹에서 선택된다.
실제로, Wnt 신호전달 경로의 활성인자는 배양 배지 속에 약 0.01 ng/ml 내지 약 1,000 ng/ml, 바람직하게는 약 0.5 ng/ml 내지 약 500 ng/ml, 보다 바람직하게는 약 1 ng/ml 내지 약 250 ng/ml의 농도에서 존재한다. 일부 구현예에서, Wnt 신호전달 경로의 활성인자는 Wnt-3a이다. 배양 배지 속에 존재하는 경우, Wnt-3a는 약 1 ng/ml 내지 약 250 ng/ml, 바람직하게는 약 5 ng/ml 내지 약 150 ng/ml, 보다 바람직하게는 약 25 ng/ml 내지 약 100 ng/ml의 농도에서 포함된다. 본 발명의 범위 내에서, "약 1 ng/ml 내지 약 250 ng/ml"라는 표현은 1 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 15 ng/ml, 20 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 75 ng/ml, 100 ng/ml, 125 ng/ml, 150 ng/ml, 175 ng/ml, 200 ng/ml, 225 ng/ml and 250 ng/ml를 포함한다.
실제로 단계 b)는 예컨대, FACS에 의해 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 방법으로 수행될 수 있고, 임의로, 적절한 배지(배양 배지 또는 적합한 세포 완충제) 속의 세포의 하나 이상의 세척액(들)을 수행하여 배양 배지로부터 원치않는 성분을 제거할 수 있다.
특정의 구현예에서, 단계 a)에 이어 단계 a)를 수행하는데 사용된 배양 용기로부터의 세포를 스트리핑(stripping)함을 포함하는 단계 b1)가 수반될 수 있고, 단계 b) 보다 상기 단계 b1)이 선행된다. 실제로 스트리핑은 화학적 및/또는 효소적 스트리핑, 예를 들면, 세포를 EDTA 및/또는 트립신과 접촉시킴으로써; 및/또는 기계적 스트리핑, 예를 들면, 적합한 도구(예컨대, 스파툴라(spatula))로 스크랩핑(scrapping)하거나, 또는 ebb 및 유동을 생성시킴에 의해 수행될 수 있다.
본 발명자는 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포가 기능적으로 건강한 간 내에서 간의 세포의 성숙한 특성을 나타내는, 간세포-유사 세포(hlc)와 비교하여 용이하게 취급됨을 관찰하였다. 실제로, 시험관 내에서 생성된 HLC는 서로 및 배양 용기에 강력하게 부착한다. 따라서, HLC를 수집하는 것은 화학적 및/또는 효소적 및/또는 기계적 스트라이핑의 혹독한 조건을 요구한다. 산업 규모에서, 기계적 스트라이핑은 흔히 시행하기가 가능하지 않고, 이는 수율에서 부정적인 영향을 야기한다. HLC와는 반대로, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포는 예컨대, 화학적 스프라이핑에 의해 느슨하거나 중간의 스트라이핑 조건으로 간 줄기-유사 세포의 90% 이상을 회수하는 것이 충분하므로, 이를 생성하는데 사용된 배양 용기로부터 보다 용이하게 회수된다.
본원에 사용된 바와 같은, 느슨한 또는 중간의 화학적 및/또는 효소적 스트라이핑 조건은 최대 약 0.5%(v/v) 이하 및/또는 최대 약 1 mM 이하의 EDTA의 최종 농도에서 트립신의 사용을 포함한다.
특정의 구현예에서, 배양 용기로부터 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포의 효소적 스트라이핑은 상기 세포를 약 0.0125% 내지 약 0.5%의 트립신과 접촉시킴을 포함한다. 본 발명의 범위 내에서, "약 0.0125% 내지 약 0.5%의 트립신"이라는 표현은 0.0125%, 0.015%, 0.0175%, 0.02%, 0.0225%, 0.025%, 0.0275%, 0.03%, 0.0325%, 0.035%, 0.0375%, 0.04%, 0.0425%, 0.045%, 0.0475%, 0.05%, 0.0525%, 0.055%, 0.0575%, 0.06%, 0.0625%, 0.0650%, 0.0675%, 0.07%, 0.0725%, 0.075%, 0.0775%, 0.08%, 0.0825%, 0.085%, 0.0875%, 0.09%, 0.0925%, 0.095%, 0.0975%, 0.1%, 0.125%, 0.15%, 0.175%, 0.2%, 0.225%, 0.25%, 0.275%, 0.3%, 0.325%, 0.35%, 0.375%, 0.4%, 0.425%, 0.45%, 0.475% 및 0.5%를 포함한다. 일부 구현예에서, 트립신은 예컨대, THERMOFISCHER SCIENTIFIC®로부터, TrypLETM Express 또는 TrypLETM Select와 같이 상업적으로 이용가능할 수 있다.
특정의 구현예에서, 배양 용기로부터 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포의 화학적 스트라이핑은 상기 세포를 약 0.01 mM 내지 약 1 mM의 EDTA와 접촉시킴을 포함한다. 본 발명의 범위 내에서, "약 0.01 mM 내지 약 1 mM의 EDTA"라는 표현은 0.01 mM, 0.02 mM, 0.03 mM, 0.04 mM, 0.05 mM, 0.06 mM, 0.07 mM, 0.08 mM, 0.09 mM, 0.1 mM, 0.15 mM, 0.2 mM, 0.25 mM, 0.3 mM, 0.35 mM, 0.4 mM, 0.45 mM, 0.5 mM, 0.55 mM, 0.6 mM, 0.65 mM, 0.7 mM, 0.75 mM, 0.8 mM, 0.85 mM, 0.9 mM, 0.95 mM 및 1 mM EDTA를 포함한다.
일부 구현예에서, 다능성 줄기 세포(PSC)는 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC) 또는 배아 줄기 세포(ESC), 바람직하게는 배아 줄기 세포(ESC), 보다 바람직하게는 사람 배아 줄기 세포(hESC)이다.
실제로, 배양 매개변수, 예를 들면, 온도, pH, 염도, 및 O2와 CO2의 수준은 당해 분야의 기술에서 확립된 표준에 따라 조절된다.
일부 구현예에서, 배양 과정 동안 CO2의 수준은 일정하게 유지되며 약 1% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 2.5% 내지 약 7.5%의 범위이다. 본 발명의 범위 내에서, "약 1% 내지 약 10%"라는 표현은 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5% 및 10%를 포함한다.
예시적으로, 본 발명에 따른 세포를 배양하기 위한 온도는 약 30℃ 내지 약 42℃, 바람직하게는 약 35℃ 내지 약 40℃, 및 보다 바람직하게는 약 36℃ 내지 약 38℃의 범위이다. 본 발명의 범위 내에서, "약 30℃ 내지 약 42℃"라는 표현은 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃, 39℃, 40℃, 41℃ 및 42℃를 포함한다.
특정의 구현예에서, 배양 배지는 배양 기간 동안, 적어도 격일마다, 바람직하게는 매일 변화된다. 실제로 배양 배지는 제거되고, 세포는 1회 또는 2회 신선한 배양 배지로 세척될 수 있고 신선한 배양 배지가 세포에 제공된다.
일부 구현예에서, 간 줄기-유사 세포를 생성하기 위한, 적합한 배양 배지 속에서 세포의 배양은 매트릭스, 예컨대, 세포외 매트릭스의 존재하에서 수행될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "매트릭스"는 시험관 내 배양된 세포(예컨대, 평편한 플라스틱웨어와 같은 배양 용기)에 생체 내 유사 형태학 및 생리학적으로 관련된 환경을 제공하는, 중합체 네트워크를 형성하는 구성성분/물질, 천연, 합성 또는 이의 조합을 지칭한다. 다시 말해서, 매트릭스, 특히 세포외 매트릭스는 세포내 상호작용을 강화시키고, 세포 부착을 촉진시키며, 세포 성장 및 분화를 증진시키도록 의도된, 세포가 보다 실제적인 환경으로 배양되도록 제공한다.
일부 구현예에서, 매트릭스, 특히 세포외 매트릭스는 라미닌, 콜라겐, 피브로넥틴, 젤라틴 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 성분을 포함할 수 있다.
특정의 구현예에서, 매트릭스, 특히 세포외 매트릭스는 적어도 하나의 라미닌을 포함하거나 이로 이루어지고, 바람직하게는 여기서 상기 적어도 하나의 라미닌은 라미닌-111(LN-111), 라미닌-211(LN-211), 라미닌-332(LN-332), 라미닌-411(LN-411), 라미닌-421(LN-421), 라미닌-511(LN-511) 및 라미닌-521(LN-521) 및 이의 기능적 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "기능성 단편"은 전체 길이의 라미닌 단백질의 생물학적 기능을 재생산하는 라미닌의 단편을 지칭한다.
일부 구현예에서, 상기 라미닌은 동물 라미닌, 바람직하게는 사람 라미닌, 보다 바람직하게는 사람 재조합 라미닌이다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "재조합"은 상응하는 암호화 핵산으로부터의 발현에 의해 생산된 라미닌을 지칭한다. 다양한 숙주 세포 내에서 폴리펩타이드의 클로닝 및 발현을 위한 시스템은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 실제로 예컨대, 재조합 사람 LN-111 또는 LN-521과 같은 재조합 사람 라미닌은 BIOLAMINA®로부터 상업적으로 이용가능할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 라미닌은 고체 지지체(배양 용기), 예를 들면, 플레이트(예컨대, 페트리 디쉬) 또는 바이알에 대해 약 0.02 μg/ml 내지 약 50 μg/ml, 바람직하게는 약 0.1 μg/ml 내지 약 10 μg/ml, 보다 바람직하게는 약 5 μg/ml의 농도로 코팅될 수 있다. 본 발명의 범위 내에서, "약 0.02 μg/ml 내지 약 50 μg/ml"라는 표현은 0.02 ㎍/ml, 0.05 ㎍/ml, 0.1 ㎍/ml, 0.5 μg/ml, 1.0 μg/ml, 1.5 ㎍/ml, 2.0 μg/ml, 2.5 μg/ml, 5.0 μg/ml, 7.5 μg/ml, 10.0 μg/ml, 12.5 ㎍/ml, 15.0 μg/ml, 17.5 ㎍/ml, 20 μg/ml, 25 ㎍/ml, 30 ㎍/ml, 35 ㎍/ml, 40 ㎍/ml, 45 ㎍/ml 및 50 ㎍/ml를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 라미닌의 기능적 단편은 고체 지지체(배양 용기), 예를 들면, 플레이트(예컨대, 페트리 디쉬) 또는 바이알에, 약 0.02 μg/ml 내지 약 100 μg/ml, 바람직하게는 약 0.1 μg/ml 내지 약 50 μg/ml의 범위, 보다 바람직하게는 약 25 μg/ml의 농도로 코팅될 수 있다. 본 발명의 범위 내에서, "약 0.02 μg/ml 내지 약 100 μg/ml"라는 표현은 0.02 ㎍/ml, 0.05 ㎍/ml, 0.1 ㎍/ml, 0.5 μg/ml, 1.0 μg/ml, 1.5 ㎍/ml, 2.0 μg/ml, 2.5 μg/ml, 5.0 μg/ml, 7.5 μg/ml, 10.0 μg/ml, 12.5 ㎍/ml, 15.0 μg/ml, 17.5 ㎍/ml, 20 μg/ml, 25 ㎍/ml, 30 ㎍/ml, 35 ㎍/ml, 40 ㎍/ml, 45 ㎍/ml, 50 ㎍/ml, 60 ㎍/ml, 70 ㎍/ml, 80 ㎍/ml, 90 ㎍/ml, 및 100 ㎍/ml를 포함한다.
특정의 구현예에서, 매트릭스, 특히 세포외 매트릭스는 특히, 각각의 비가 약 5%/95%; 10%/90%; 20%/80%; 25%/75%; 30%/70%; 40%/60%; 50%/50%; 60%/40%; 70%/30%; 75%/25%; 80%/20%; 90%/10%; 95%/5%인, LN-521 및 LN-111의 혼합물을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
일부 구현예에서, 세포외 매트릭스 속에 포함된 적어도 하나의 콜라겐은 원섬유 콜라겐이다. 일부 구현예에서, 상기 원섬유 콜라겐은 제I형 콜라겐, 제II형 콜라겐, 제III형 콜라겐, 제IV형 콜라겐, 제V형 콜라겐, 제VI형 콜라겐, 제XI형 콜라겐, 제XXIV형 콜라겐, 제XXVII형 콜라겐 및 이의 임의의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정의 구현예에서, 콜라겐, 바람직하게는 원섬유 콜라겐은 배양 배지 속에 약 0.25 mg/ml 내지 약 3.00 mg/ml의 농도로 존재한다. 본 발명의 범위 내에서, "약 0.25 mg/ml 내지 약 3.00 mg/ml"는 약 0.25 mg/ml, 0.50 mg/ml, 0.75 mg/ml, 1.00 mg/ml, 1.25 mg/ml, 1.50 ng/ml, 1.75 mg/ml, 2.00 mg/ml, 2.25 mg/ml, 2.50 mg/ml, 2.75 mg/ml 및 3.00　mg/ml를 포함한다.
일 구현예에서, 존재하는 경우, 피브로넥틴은 약 0.01 mg/ml 내지 약 10 mg/ml의 농도이다. 본 발명의 범위 내에서, "약 0.01 mg/ml 내지 약 10 mg/ml"는 약 0.01 mg/ml, 0.05 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.25 mg/ml, 0.50 mg/ml, 0.75 mg/ml, 1 mg/ml, 1.25 mg/ml, 1.50 ng/ml, 1.75 mg/ml, 2 mg/ml, 2.25 mg/ml, 2.50 mg/ml, 2.75 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml 및 10 mg/ml를 포함한다.
일 구현예에서, 존재하는 경우, 젤라틴은 약 0.01 mg/ml 내지 약 10 mg/ml의 농도이다. 본 발명의 범위 내에서, "약 0.01 mg/ml 내지 약 10 mg/ml"는 약 0.01 mg/ml, 0.05 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.25 mg/ml, 0.50 mg/ml, 0.75 mg/ml, 1 mg/ml, 1.25 mg/ml, 1.50 ng/ml, 1.75 mg/ml, 2 mg/ml, 2.25 mg/ml, 2.50 mg/ml, 2.75 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml 및 10 mg/ml를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 단계 b)에서 단리된, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포를 동결하는 단계 c)를 포함한다.
실제로, 본원에 개시된 방법으로 수득된 간 줄기-유사 세포는 수집, 세척, 이의 추출물을 수득하기 위해 임의로 분획화되고, 바람직하게는 DMSO를 약 0.1%(v/v) 내지 약 20%(v/v), 보다 바람직하게는 약 10%(v/v)의 농도에서 포함하는 보존 배지 속에 현탁시킬 수 있다. 대안적으로, 보존 배지는 DMSO가 없는, 예를 들면, PRIME-XV® MSC FreezIS DMSO가 없는(IRVINE SCIENTIFIC®), STEM-CELLBANKER® DMSO가 없는(AMSBIO®), 이비디 동결 배지(Ibidi Freezing Medium) DMSO가 없는(IBIDI®), CryoSOfree™　DMSO가 없는 동결보존 배지(SIGMA ALDRICH®), 트레할로스-함유 용액일 수 있다(참고: 예컨대 Ntai et al.; 2018). 예시적으로, 보존 배지는 시판(CRYOSTOR®)될 수 있고 예컨대, MERCK®로부터 구입할 수 있다.
본 발명의 범위 내에서, "약 0.1% 내지 약 20%"는 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 및 20%를 포함한다.
간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물은, 적합한 보존 배지 속에서 1회 동결 공정에 적용될 수 있고 이에 의해 최종 온도는 약 -80℃ 내지 약 -196℃의 범위이다.
특정의 구현예에서, 세포의 집단 속에 포함된 간 줄기-유사 세포가 동결보존된다.
본원에 사용된 바와 같이, "동결보존된" 및 "동결된"은 서로 치환될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 수득될 수 있는 동결보존된 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태는 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 동결보존된 집단, 특히 본 발명에 따른 방법에 의해 수득될 수 있는 집단에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 수득될 수 있는 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물의 동결보존된 시험관 내 배양물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명에 따른, 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물, 및/또는 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단, 및/또는 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 입자, 특히 스페로이드에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른, 간 줄기-유사 세포, 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단은 입자 또는 타원체의 형태이다.
특정의 구현예에서, 입자는 스페로이드, 바람직하게는 평균 직경이 약 50 μm 내지 약 250 μm를 포함하는 스페로이드의 형태이다.
본 발명의 범위 내에서, 용어 "약 50 μm 내지 약 250 μm" 는 50 ㎛, 60 ㎛, 70 ㎛, 80 ㎛, 90 ㎛, 100 ㎛, 110 ㎛, 120 ㎛, 130 ㎛, 140 ㎛, 150 ㎛, 160 ㎛, 170 ㎛, 180 ㎛, 190 ㎛, 200 ㎛, 210 ㎛, 220 ㎛, 230 ㎛, 240 ㎛ 및 250 ㎛를 포함한다.
일부 구현예에서, 입자는 약 2개의 간 줄기-유사 세포/입자 내지 약 2,500개의 간 줄기-유사 세포/입자를 포함한다. 특정의 구현예에서, 입자는 약 250개의 간 줄기-유사 세포/입자 내지 약 1,500개의 간 줄기-유사 세포/입자를 포함한다. 본 발명의 범위 내에서, 용어 "약 2 내지 약 2,500 세포/입자"라는 표현은 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1,000, 1,050, 1,100, 1,150, 1,200, 1,250, 1,300, 1,350, 1,400, 1,450, 1,500, 1,550, 1,600, 1,650, 1,700, 1,750, 1,800, 1,850, 1,900, 1,950, 2,000, 2,050, 2,100, 2,150, 2,200, 2,250, 2,300, 2,350, 2,400, 2,450 및 2,500 세포/입자를 포함한다.
실제로, 입자 또는 스페로이드는 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포, 또는 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포의 집단을 임의로, HGF 및/또는 하나 이상의 사이토킨 및/또는 소염성 및/또는 면역억제 특성을 가진 하나 이상의 성분이 보충된 배양 배지 속에서 배양함으로써 수득될 수 있다.
일 구현예에서, 배양 배지 속에 존재하는 경우, HGF는 약 0.1 ng/ml 내지 약 1,000 ng/ml, 바람직하게는 약 1 ng/ml 내지 약 500 ng/ml, 보다 바람직하게는 약10 ng/ml 내지 약 30 ng/ml의 농도로 존재한다. 본 발명의 범위 내에서, "약 0.1 ng/ml 내지 약 1,000 ng/ml"라는 표현은 약 0.1 ng/ml, 0.25 ng/ml, 0.5 ng/ml, 0.75 ng/ml, 1 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 15 ng/ml, 20 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 75 ng/ml, 100 ng/ml, 200 ng/ml, 300 ng/ml, 400 ng/ml, 500 ng/ml, 600 ng/ml, 700 ng/ml, 800 ng/ml, 900 ng/ml 및 1,000 ng/ml를 포함한다.
일 구현예에서, 배양 배지 속에 존재하는 경우, 사이토킨은 약 0.1 ng/ml 내지 약 100 ng/ml, 바람직하게는 약 1 ng/ml 내지 약 50 ng/ml, 보다 바람직하게는 약10 ng/ml 내지 약 30 ng/ml의 농도로 존재한다. 일 구현예에서, 사이토킨은 온코스타틴 M(OSM)이다. 본 발명의 범위 내에서, "약 0.1 ng/ml 내지 약 100 ng/ml"라는 표현은 약 0.1 ng/ml, 0.25 ng/ml, 0.5 ng/ml, 0.75 ng/ml, 1 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 15 ng/ml, 20 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 75 ng/ml 및 100 ng/ml를 포함한다.
특정의 구현예에서, 배양 배지는 소염성 및/또는 면역억제 특성을 갖는 성분, 바람직하게는 코르티코스테로이드를 추가로 포함한다. 배양 배지 속에 존재하는 경우, 코르티코스테로이드는 약 0.01 μM 내지 약 10 μM, 바람직하게는 약 0.1 μM 내지 약 5 μM의 농도로 포함된다. 일 구현예에서, 코르티코스테로이드는 덱사메타손이다. 본 발명의 범위 내에서, "약 0.01 μM 내지 약 10 μM" 라는 표현은 0.01 μM, 0.025 μM, 0.05 μM, 0.075 μM, 0.1 μM, 0.25 μM, 0.5 μM, 0.75 μM, 1 μM, 1.5 μM, 2 μM, 5 μM, 7.5 μM, 및 10 μM를 포함한다.
일부 구현예에서, 입자는 적합한 조건 속에서 1일, 2일 또는 3일 후 수득될 수 있다. 실제로 간 줄기-유사 세포는 고체 지지체(배양 용기) 상에서 배양되어 이의 응집을 촉진시킬 수 있다. 예시적으로, 적합한 지지체는 STEM CELLS TECHNOLOGIES®로부, 예컨대, Aggrewell® 플레이트와 같이 시판될 수 있다.
일부 구현예에서, 입자 또는 스페로이드는 동결보존된 간 줄기-유사 세포, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는, 동결보존된 단리된 세포의 집단으로부터 제조된다.
이론에 얽매이지 않고, 본 발명자는 스페로이드와 같이 3D 구조로 조립된 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포 현탁액은 예컨대, 복강내 세포 이식을 위한, 일부 투여 부위에 대해 단일 세포 현탁액보다 더 적합할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 입자 또는 스페로이드는 간 치료요법이 필요한 개체에게 투여되기에 적합한 생체인공 간(bioartificial liver; BAL)에 존재할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포로부터 분화된 세포, 또는 이의 집단을 포함하는 입자에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명에 따른, 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물, 및/또는 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단, 및/또는 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 현탁액에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 단리된 집단은 현탁액의 형태이다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "현탁액"은 세포 또는 물질이 부유하는 세포 또는 물질인 조성물을 지칭한다.
특정의 구현예에서, 현탁액은 ml 당 약 101 내지 약 1012개의 간 줄기-유사 세포를 포함할 수 있다. 본 발명의 범위 내에서, "ml 당 약 101 내지 약 1012개의 간 줄기-유사 세포"는 ml 당 약 101, 5×101, 102, 5×102, 103, 5×103, 104, 5×104, 105, 5×105, 106, 5×106, 107, 5×107, 108, 5×108, 109, 5×109, 1010, 5×1010, 1011, 5×1011 및 1012 개의 간 줄기-유사 세포를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포로부터 분화된 세포, 또는 이의 집단을 포함하는 현탁액에 관한 것이다.
본 발명은 또한 (i) 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물, 및/또는 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단, 및/또는 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 또는 이의 추출물, 및/또는 본 발명에 따른 적어도 하나의 입자, 및/또는 현탁액 및 (ii) 약제학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, "약제학적으로 허용되는 비히클"은 임의의 용매, 분산 매질, 코팅, 항세균 및/또는 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 지칭한다.
실제로 약제학적으로 허용되는 비히클은 첨가제 폴리펩타이드; 아미노산; 지질; 및 탄수화물의 그룹에서 선택된 하나 이사의 성분(들)을 포함할 수 있다. 탄수화물 중에는 당, 예를 들면, 단당류, 이당류, 삼당류, 사당류, 및 올리고사카라이드; 유도체화된 당, 예를 들면, 알디톨, 알돈산, 에스테르화된 당 등; 및 다당류 또는 당 중합체가 인용될 수 있다.
예시적인 폴리펩타이드성의 약제학적으로 허용되는 비히클은 젤라틴, 카세인 등을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 ml 당 약 101 내지 약 1012개의 간 줄기-유사 세포를 포함할 수 있다. 본 발명의 범위 내에서, "ml 당 약 101 내지 약 1012의 간 줄기-유사 세포"는 ml 당 약 101, 5×101, 102, 5×102, 103, 5×103, 104, 5×104, 105, 5×105, 106, 5×106, 107, 5×107, 108, 5×108, 109, 5×109, 1010, 5×1010, 1011, 5×1011 및 1012 의 간 줄기-유사 세포를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 (i) 본 발명에 따른, 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물, 및/또는 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단, 및/또는 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 또는 이의 추출물, 및/또는 적어도 하나의 입자, 및/또는 현탁액 및 (ii) 약제학적으로 허용되는 비히클로 필수적으로 이루어진 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "로 필수적으로 이루어진"은 본 발명에 따른, 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물, 및/또는 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단, 및/또는 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 또는 이의 추출물, 및/또는 적어도 하나의 입자, 및/또는 현탁액은 조성물의 단독 활성 성분이다.
일부 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포로부터 분화된 세포, 또는 이의 집단, 및 약제학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물, 및/또는 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단, 및/또는 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 또는 이의 추출물, 및/또는 적어도 하나의 입자, 및/또는 현탁액, 및/또는 약제학적 조성물을 포함하는 의학 장치에 관한 것이다.
특정의 구현예에서, 의학 장치는 펌프, 필터, 튜빙(tubing), 카테터(catheter) 등으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 항목을 포함한다.
일부 구현예에서, 의학 장치는 외부 생체인공 간(external bioartificial liver; EBAL)의 형태이다. 일부 구현예에서, 의학 장치, 특히 외부 생체인공 간은 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포, 및/또는 세포의 집단 및/또는 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포를 포함한다. 특정의 구현예에서, 의학 장치, 특히 외부 생체인공 간은 적어도 하나의 헤어핀 펌프, 적어도 하나의 혈장 필터, 적어도 하나의 롤러 펌프(roller pump)를 추가로 포함할 수 있다.
실제로, 의학 장치, 특히 외부 생체인공 간은 심장-폐 바이패스 기구(cardio-pulmonary bypass machine)와 유사한 단위(unit)을 포함할 수 있다. 실제로 의학 장치, 특히 외부 생체인공 간은 환자에게 되돌려주기 전에 환자의 혈액 혈장을 치료하도록 구성된다.
본 발명을 시행하기 위한 적합한 의학 장치의 제한없는 예는 문헌( Struecker et al. (2014); Glorioso et al. (2015); Chen et al. (2019))에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 의학 장치는 체외 간 치료요법(extracorporeal liver therapy)을 위해 사용된다.
본 발명의 다른 양태는 이종의 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물, 및/또는 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 이종 세포의 집단, 및/또는 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 이종 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 비-사람 동물 모델에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "이종"은 비-사람 동물 및 세포가 동일한 종으로부터 기원하지 않음을 의미하는 것으로 의도된다.
일부 구현예에서, 비-사람 동물 모델은 사람화된 비-사람 동물 모델이다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "사람화된"은 비-사람 동물 모델이 본 발명에 따른, 사람 간 줄기-유사 세포, 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 사람 세포, 또는 이의 추출물을 포함함을 의미하는 것으로 의도된다.
일부 구현예에서, 비-사람 동물은 바람직하게는 개, 고양이, 기나아 피그, 랫트, 마우스, 토끼, 소, 양, 염소, 말, 라마, 원숭이로 이루어진 그룹에서 선택된, 비-사람 포유동물이다. 특정의 구현예에서, 비-사람 동물은 마우스 또는 랫트이다.
실제로, 비-사람 동물 모델은 본원에 개시된 바와 같은 간 줄기-유사 세포, 및/또는 세포의 집단, 및/또는 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 및/또는 이의 추출물과 함께 투여됨으로써, 동물의 간은 이종의 간 세포 유사 세포, 및/또는 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 이종 세포, 및/또는 이의 추출물을 포함하도록 할 수 있다. 일부 구현예에서, 비-사람 동물 모델을 사용하여 약물 후보물의 간 독성을 평가할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "간 독성"은 간에 대해 유독한 정도를 지칭하는 것으로 의도된다. 확장하여, 용어 "약물 후보물의 간 독성"은 이에 의해 약물 후보물이 간이 건강한 기능성 간과 비교하여, 이의 자연적이고 생리학적인 해독 기능을 발휘하는 것을 제한, 구속, 억제, 배제 또는 방지하는 정도를 지칭하는 것으로 의도된다.
약물 후보물은 예컨대, 온도, 체중 획득 또는 체중 감소, 호흡능, 뇌수엑스레이(encephalogram), 심박동곡선(cardiogram), 인지능(cognitive capacity), 수용능(mortice capacity), 혈청 마커의 수준, 혈구 수(blood numeration) 등과 같은 언급된 생물학적 매개변수에 대한 이의 영향의 평가를 통해 평가할 수 있다.
일부 구현예에서, 비-사람 동물 모델은 간 장애를 생성하는데 적합한 화합물로 치료될 수 있다. 상기 구현예에서, 간 장애를 지닌 비-사람 동물 모델을 사용하여 상기 간 장애를 치료 또는 방지하기 위해, 특히 질환이 있는 세포의 세포사멸화를 촉진하고/하거나 질환이 있는 세포를 질환이 없는, 특히 정상 세포로 복구하고/하거나 질환이 없는 세포의 증식을 자극시키기 위해 의도된 약물 후보물의 효능을 평가할 수 있다. 간 장애를 생성시키는데 적합한 화합물의 비-제한적 예는 아세트아미노펜(APAP), 알코올, 아스피린, 이부프로펜, 나프록센 나트륨 및 티오아세트아미드를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-사람 동물 모델은 감염성 제제, 예를 들면, 병원성 세균 및/또는 바이러스로 감염될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 의약으로서 사용하기 위한, 본 발명에 따른, 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물, 또는 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단, 또는 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 또는 이의 추출물, 또는 입자, 또는 현탁액, 또는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 의약의 제조 또는 제작을 위한, 본 발명에 따른, 간 줄기-유사 세포, 또는 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포의 집단, 또는 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물로부터 유래된 세포, 또는 입자, 또는 현탁액, 또는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 간 장애를 치료 및/또는 방지하는데 사용하기 위한, 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물, 또는 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단, 또는 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 또는 이의 추출물, 또는 입자, 또는 현탁액, 또는 약제학적 조성물, 또는 의학 장치에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 간 장애를 치료 및/또는 방지하기 위한, 본 발명에 따른, 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물, 또는 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단, 또는 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 또는 이의 추출물, 또는 입자, 또는 현탁액, 또는 약제학적 조성물, 또는 의학 장치의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 치료학적 유효량의 간 줄기-유사 세포, 및/또는 집단, 또는 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 또는 이의 추출물, 또는 입자, 또는 현탁액, 또는 약제학적 조성물을 투여함을 포함하는, 이를 필요로 하는 개체내에서 간 장애를 치료 및/또는 방지하기 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 의학 장치를 시행하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서 간 장애를 치료 및/또는 방지하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한:
a) 개체를 체외 혈액 회로(extracorporeal blood circuit)의 수단에 의해, 본 발며엥 따른 의학 장치에 연결시키는 단계;
b) 상기 개체의 혈장을 지닌 의학 장치를 제공함으로써, 혈장이 의학 장치에 의해 해독되도록 하는 단계; 및
c) 단계 b)에서 생성된 해독된 혈장을 지닌 개체를 제공하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서 간 장애를 치료 및/또는 방지하는 방법에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 개체에서 간 장애를 치료 및/또는 방지하기 위한 방법에서 본 발명에 따른 의학 장치의 용도에 관한 것이다.
특정의 구현예에서, 간 장애는 알라질 증후군(Alagille syndrome); 알코올-관련 간 질환(alcohol-related liver disease); 알파-1 항트립신 결핍증(alpha-1 antitrypsin deficiency); 자가면역 간염(autoimmune hepatitis); 양성 간 종양(benign liver tumor); 쓸개즙 패쇄증(biliary atresia); 간경변(cirrhosis); 혈색소침착증(hemochromatosis); 간성 뇌증(hepatic encephalopathy); A형 간염(hepatitis A); B형 간염(hepatitis B); C형 간염(hepatitis C); 간신 증후군(hepatorenal Syndrome); 임신의 간내 담즙분비중지(intrahepatic cholestasis of pregnancy; ICP); 라이소좀 산 리파제 결핍증(lysosomal acid lipase deficiency; LAL-D); 간 낭종(liver cysts); 간 암(liver cancer); 신생아 황달(newborn jaundice); 비-알코올성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease); 비-알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis); 원발 담즙성 담관염(primary biliary cholangitis; PBC); 원발 경화 쓸개관염(primary sclerosing cholangitis; PSC); 진행성 가족성 간내 담즙정체증(progressive familial intrahepatic cholestasis; PFIC); 라이 증후군(Reye syndrome); 제I형 글리코겐 저장 질환(type I glycogen storage disease); 급성 간 부전(acute liver failure; ALF); 급성 만성 간 부전(acute chronic liver failure; ACLF); 비-알코올성 지질-간염(non-alcoholic steato-hepatitis; NASH); 알코올성 간염(alcoholic hepatitis); 바이러스-유도된 간염(viral-induced hepatitis); 원인불명의 간 질환(cryptogenic liver disease); 예컨대 간세포 암종 및 담관암종과 같은 악성 간 질환(malignant liver disease); 자가면역 간염, 예컨대, 버디-키아리 증후군(Budd-Chiari syndrome)과 같은 혈관 간 질환(vascular liver disease); 담즙정체 간 질환(cholestatic liver disease); 예컨대, 윌슨 질환(Wilson's disease) 및 우레아 주기 장애(urea cycle disorder)와 같은 유전된 대사 간 질환(inherited metabolic liver disease)으로 이루어진 그룹에서 선택된다. 특정의 구현예에서, 간 장애는 전격성 간 장애이다. 상기 언급한 바와 같이, 전격성 간 장애는 기관 할당, 에를 들면, 말기-단계 간 질환(End-stage Liver Disease; MELD)에 대한 점수매김 시스템을 사용하여 간 이식을 위해 우선순위가 매겨진 임의의 장애를 지칭한다.
본 발명의 다른 양태는 전격성 간 장애의 치료 및/또는 방치를 위해 사용하기 위한, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물, 또는 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단, 또는 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 또는 이의 추출물, 또는 입자, 또는 현탁액, 또는 약제학적 조성물, 또는 의학 장치에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 전격성 간 장애의 치료 및/또는 방지를 위한, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물, 또는 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단, 또는 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 또는 이의 추출물, 또는 입자, 또는 현탁액, 또는 약제학적 조성물, 또는 의학 장치의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 치료학적 유효량의 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포, 집단, 또는 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 또는 이의 추출물, 또는 입자, 또는 현탁액, 또는 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여, 이를 필요로 하는 개체에서 전격성 간 장애를 치료 및/또는 방지하기 위한 방법에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 상기 전격성 간 장애는 급성 간 부전(ALF) 및 급성 만성 간 부전(ACLF)으로 이루어진 그룹에서 선택된다.
특정의 구현예에서, 급성 만성 간 부전(ACLF)은 비-알코올성 지방 간염(NASH), 알코올성 간염, 바이러스-유도된 간염, 잠재성 간 질환, 악성 간 질환, 예를 들면, 간세포 암종 및 쓸개관암; 자가면역 간염, 혈관 간 질환, 예를 들면, 버드-키아리 증후군, 쓸개즙정체 간 질환; 및 유전된 대사 간 질환, 예를 들면, 윌슨 질환 및 우레아 주기 장애로 이루어진 그룹으로부터 선택된 간 질환, 특히 만성 간 질환과 관련될 수 있다. 특정의 구현예에서, ACLF는 특히 비-알코올성 지방 간염(NASH); 알코올성 간염; 바이러스-유도된 간염; 잠재성 간 질환; 악성 간 질환, 예를 들면, 간세포 암종 및 쓸개관암; 자가면역 간염; 혈관 간 질환, 예를 들면, 버드-키아리 증후군, 쓸개즙정체 간 질환; 및 유전된 대사 간 질환, 예를 들면, 윌슨 질환 및 우레아 주기 장애로 이루어진 그룹으로부터 선택된 만성 간 질환을 지닌 개체에서 간 혈액 시험의 급성 비정상에 의해 특징화된, 고도로 특이적인 및 희귀 증후군에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 상기 전격성 간 장애는 급성 간 부전(ALF) 또는 급성 만성 간 부전(ACLF)이다.
특정의 구현예에서, 급성 만성 간 부전(ACLF)은 비-알코올성 지방 간염(NASH); 알코올성 간염; 바이러스-유도된 간염; 잠재성 간 질환, 악성 간 질환, 예를 들면, 간세포 암종 및 쓸개관암; 자가면역 간염, 혈관 간 질환, 예를 들면, 버드-키아리 증후군; 쓸개즙정체 간 질환; 및 유전된 대사 간 질환, 예를 들면, 윌슨 질환 및 우레아 주기 장애로 이루어진 그룹으로부터 선택된 간 질환과 관련된다.
일부 구현예에서, 전격성 간 장애는 급성 간 부전(ALF)이다.
특정의 구현예에서, 전격성 간 장애는 급성 만성 간 부전(ACLF)이다.
이론에 얽메이지 않고, 본 발명자는 ALF 및 ACLF를 향한 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포의 간 재생 특성이 이의 증식을 촉진시킴에 의해, 질환이 있는 간 내 건강한 간 세포를 향한 세포의 작용에 의해 구동된다고 고려하고 있다. 다시 말해서, 간 재생 특성은 질환이 있는 세포의 대체에 의해 매개되는 것보다는 질환이 있는 간의 건강한 간 조직의 재생을 주로 촉진시킴으로써 매개된다.
본 발명은 또한 간 장애, 특히 전격성 간 장애를 지닌 개체에게 치료학적 유효량의 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물, 세포의 집단, 또는 이의 추출물, 또는 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 또는 이의 추출물, 또는 입자, 또는 현탁액, 또는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하여, 간 장애, 특히 전격성 간 장애를 지닌 개체에서 간을 재생시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 여전히 다른 양태는 또한 간 장애, 특히 전격성 간 장애를 지닌 개체에게 치료학적 유효량의 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물, 세포의 집단, 또는 이의 추출물, 또는 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 또는 이의 추출물, 또는 입자, 또는 현탁액, 또는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하여, 간 장애, 특히 전격성 간 장애를 지닌 개체의 혈청 속의 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALAT)의 수준을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 또한 간 장애, 특히 전격성 간 장애를 지닌 개체에게 치료학적 유효량의 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물, 세포의 집단, 또는 이의 추출물, 또는 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 또는 이의 추출물, 또는 입자, 또는 현탁액, 또는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하여, 간 장애, 특히 전격성 간 장애를 지닌 개체의 간 괴사를 감소시키는 방법에 관한 것이다.
실제로 간 장애, 특히 전격성 간 장애를 지닌 개체는 임상 시험 및/또는 혈액 시험 및/또는 간 생검의 수단에 이은, 양호한 실시 및 당해 분야에서의 표준으로 진단할 수 있다.
본 발명의 일 양태는 본 개시내용에서 정의된 바와 같은 입자를 제조하기 위한, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 동결보존된 집단의 용도에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 입자는 스페로이드의 형태이다.
특정의 구현예에서, 투여될 치료학적 유효량의 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포, 및/또는 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포의 집단, 및/또는 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 및/또는 이의 추출물, 및/또는 입자, 및/또는 현탁액 및/또는 약제학적 조성물은 숙련가 및/또는 공인된 개인에 의해 용이하게 측정될 수 있다.
실제로, 치료학적 유효량은 다양한 매개변수, 예를 들면, 투여를 위해 선택된 물질, 투여가 단일 용량 또는 다중 용량인지의 여부, 및 개체의 매개변수, 예를 들면, 연령, 체격, 체중, 성별, 및 치료될 전격성 간 장애의 중증도에 의존할 수 있다.
일부 구현예에서, 치료학적 유효량은 ml 당 약 101 내지 약 1012개의 간 줄기-유사 세포이다. 실제로, 치료학적 유효량은 ml 당 101, 5x101, 102, 5x102, 103, 5x103, 104, 5x104, 105, 5x105, 106, 5x106, 107, 5x107, 108, 5x108, 109, 5x109, 1010, 5x1010, 1011, 5x1011 및 1012개의 간 줄기-유사 세포를 포함한다. 특정의 구현예에서, 치료학적 유효량은 cm3 당 약 101 내지 약 1012개의 간 줄기 세포이고, 이는 cm3 당 101, 5x101, 102, 5x102, 103, 5x103, 104, 5x104, 105, 5x105, 106, 5x106, 107, 5x107, 108, 5x108, 109, 5x109, 1010, 5x1010, 1011, 5x1011 및 1012개의 간 줄기-유사 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료학적 유효량은 용량 당 약 101 내지 약 1012개의 간 줄기 세포이고, 용량 당 101, 5x101, 102, 5x102, 103, 5x103, 104, 5x104, 105, 5x105, 106, 5x106, 107, 5x107, 108, 5x108, 109, 5x109, 1010, 5x1010, 1011, 5x1011 및 1012개의 간 줄기-유사 세포를 포함한다.
치료요법을 위해, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포, 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포의 집단, 입자, 현탁액 및 약제학적 조성물은 상이한 경로를 통해 투여될 수 있다. 용량 및 투여 횟수는 공지된 방식으로 숙련가에 의해 최적화될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 간 줄기-유사 세포, 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포의 집단, 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 이의 추출물, 입자, 현탁액 또는 약제학적 조성물은 국소적으로 또는 전신계적으로 투여되어야 한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 간 줄기-유사 세포, 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포의 집단, 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 이의 추출물, 입자, 현탁액 또는 약제학적 조성물은 국소적으로 투여되어야 하며 제한없이, 간내, 주변 또는 근처, 간 실질조직 내에, 간 글리슨 캡슐(liver Glisson's capsule) 하에, 신장 캡슐 하에, 비장내, 췌장 내, 복강내 및 그물막 파우치(omental pouch) 내에 본 발명의 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포의 집단, 입자, 현탁액 또는 약제학적 조성물의 주사 또는 주입 또는 이식을 포함한다. 바람직하게는, 국소 투여는 간을 관개하는 혈관(간 문맥, 동맥, 장간막 정맥)을 통한 주사 또는 주입 또는 이식이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 간 줄기-유사 세포, 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포의 집단, 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 이의 추출물, 입자, 현탁액 또는 약제학적 조성물은 복강내, 정맥내, 내문(intraportal) 또는 비장내 투여를 통해, 특히 복강내, 정맥내, 내문 또는 비장내 주사를 통해 투여되어야 한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 간 줄기-유사 세포, 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포의 집단, 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 이의 추출물, 입자, 현탁액 또는 약제학적 조성물은 본 발명의 사람 간 줄기-유사 세포의 집단에 대한 분화 환경 속에서 투여되어야 한다.
이러한 투여 경로는 수술 과정, 복강경 수술, 카테터 시스템 또는 복강 내 이식을 통해 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 간 줄기-유사 세포, 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포의 집단, 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 이의 추출물, 입자, 현탁액 또는 약제학적 조성물은 전신계적으로 투여되어야 하고 제한없이, 복강내, 피하, 장 또는 비경구 투여를 포함한다.
주사 또는 주입 또는 이식에 대해 채택된 제형의 예는 액체 용액 또는 현탁액, 주사 중에 용액, 또는 주사 중에 현탁액, 주사 전에 액체로 만들기에 적합한 고체 형을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 주사의 예는 내문, 비장내, 정맥내, 대동맥내, 복강내, 피하, 근육내, 피내, 및 복강내 주사, 또는 주입을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 주사된 경우, 본 발명의 간 줄기-유사 세포, 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포의 집단, 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 이의 추출물, 입자, 현탁액 또는 약제학적 조성물은 멸균성이다. 멸균 약제학적 조성물을 수득하는 방법은 GMP 합성("양호한 제작 실시를 위한 GMP 표준")을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 간 줄기-유사 세포, 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포의 집단, 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 이의 추출물, 입자, 현탁액 또는 약제학적 조성물은 캡슐화된다. 캡슐의 예는 제한없이, matrigel®, 생체적합성 하이드로겔을 포함한다. 하이드로겔 속에 생물학적 활성 성분을 캡슐화하는 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. Perez-Luna et al. (2018)를 참고할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "하이드로겔"은 다량의 물 또는 생물학적 유체를 흡수할 수 있고 세포가 인트랩(entrap)된, 친수성의, 3차원 네트워크를 지칭하는 것으로 의도된다. 실제로, 네트워크는 단독중합체 또는 공중합체를 포함하고, 불용성이다. 네트워크를 구성하기에 적합한 중합체는 제한없이, 알긴산나트륨, 아크릴산, 셀룰로스 설페이트, 에틸렌 글리콜, 디메타크릴레이트(EGDMA), 하이알루론산, 하이드록시에틸 메타크릴레이트(HEMA), 하이드록시에톡시에틸 메타크릴레이트(HEEMA), 하이드록시디에톡시에틸 메타크릴레이트(HDEEMA), 메톡시에틸 메타크릴레이트(MEMA), N-비닐-2-피롤리돈(NVP), PEG 아크릴레이트(PEGA), PEG 메타크릴레이트(PEGMA), PEG 디아크릴레이트(PEGDA), PEG 디메타크릴레이트(PEGDMA), 실란화된 하이드록시프로필 메틸 셀룰로스(si-HPMC) 등을 포함한다.
하이드로겔은 특히 Peppas et al. (2000); Narayanaswamy 및 Torchilin (2019)에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 캡슐화된 간 줄기-유사 세포, 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포의 집단, 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 이의 추출물, 입자, 현탁액 또는 약제학적 조성물은 복강내, 정맥내, 내문, 조직내 주사 또는 임의의 다른 적합한 주사 방식을 포함하는 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다.
실제로, 하이드로겔은 본 발명의 간 줄기-유사 세포, 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포의 집단, 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 이의 추출물, 입자, 현탁액 또는 약제학적 조성물을 농축시키기 위해 제공된다. 특정의 구현예에서, 하이드로겔은 파우치, 특히 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포, 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포의 집단, 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 이의 추출물, 입자, 현탁액 또는 약제학적 조성물의 지속적인 방출 및/또는 기능성을 위한 파우치 속에 혼입시킬 수 있다.
본 발명의 일 양태는 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포, 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포의 집단, 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 이의 추출물, 입자, 현탁액 또는 약제학적 조성물, 및 임의로 하이드로겔을 포함하는 파우치에 관한 것이다.
실제로, 파우치는 간, 또는 임의의 기관에 국소적으로 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 간 줄기-유사 세포, 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포의 집단, 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 이의 추출물, 입자, 현탁액 또는 약제학적 조성물은 지속되 방출 형태로 투여되어야 한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 간 줄기-유사 세포, 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포의 집단, 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 이의 추출물, 입자, 현탁액 또는 약제학적 조성물은 제제의 방출을 제어하는 전달 시스템으로서 제형화된다.
일부 구현예에서, 치료학적 유효량의 본 발명의 간 줄기-유사 세포, 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포의 집단, 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 이의 추출물, 입자, 현탁액 또는 약제학적 조성물은 대상체의 생애에서 적어도 1회 또는 수회 투여되어 대상체에서 치료학적 이점을 수득 및/또는 유지하여야 한다.
실제로, 본 발명의 간 줄기-유사 세포, 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단, 입자, 현탁액 또는 약제학적 조성물은 이식체(graft) 또는 이식조직편(transplant)으로서 고려될 수 있다.
예시적으로, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포, 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단, 입자, 현탁액 또는 약제학적 조성물은 조직이식(grafting) 또는 이식(transplantation)으로서 지칭될 수 있다.
특정의 구현예에서, 이식은 자가이다. 특수한 구현예에서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포, 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포의 집단, 또는 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 또는 이의 추출물을 제조하는데 사용된 세포는 이식을받은 개체보다는 동일한 개체로부터 기원한다.
대안의 구현예에서, 이식은 동종이계이다. 이러한 특수한 구현예에서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포, 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포의 집단, 또는 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 또는 이의 추출물을 제조하는데 사용된 세포는 동일한 종으로부터 기원하지만 이식받은 개체와는 구별된다.
일부 구현예에서, 간 장애, 특히 전격성 간 장애를 지닌 개체는 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포, 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포의 집단, 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 또는 이의 추출물, 입자, 현탁액 또는 약제학적 조성물의 투여 전에 질환이 있는 간 조직의 적어도 부분, 특히 괴사된 간 조직의 제거를 위해서와 같이, 수술을 겪을 수 있다.
특정의 구현예에서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포, 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포의 집단, 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 또는 이의 추출물, 입자, 현탁액 또는 약제학적 조성물은 간 재생을 증진시키거나 촉진하는 것으로 의도된, 하나 이상의 추가의 활성제와 함께 공-투여될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "공-투여된"은 동시 투여 및 순차적 투여를 포함한다.
본 발명은 또한 동시, 별개 또는 순차적 투여를 위한, 조합 생성물에 관한 것이고, 이는:
- 본 발명에 따른 적어도 하나의 간 줄기-유사 세포, 간 줄기-유사 세포, 및/또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단, 및/또는 입자, 및/또는 현탁액 및/또는 약제학적 조성물; 및
- 특히 간 재생을 촉진시키는 것으로 의도된 적어도 하나의 추가의 활성제를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, "간 재생을 촉진하다"는 간 조직의 악화의 중지 또는 저하를 지칭하고, 건강한 간 조직의 생리학적 기능의 부분적이거나 완전한 회수를 포함한다. 적합한 추가의 활성제의 비-제한적 예는 소염제, 면역억제제, 항생제, 항-산화제, 항섬유제, 해독제일 수 있다.
소염제의 비-제한적 예는 아스피린, 셀레콕십, 디클로페낙, 에토리콕십, 이부프로펜, 인도메타신, 메페남산 및 나프록센을 포함한다.
면역억제제의 비-제한적 예는 예컨대, 사이클로스포린, 타크롤리무스와 같은 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor); 예컨대, 바실릭시맙, 벤랄리주맙, 브로달루맙, 다클리주맙, 두필루맙, 익세키주맙, 메폴리주맙, 사릴루맙, 토실리주맙과 같은 인터류킨 억제제; 예컨대, 아달리무맙, 에타네르셉트, 골리무맙 및 인플릭시맙과 같은 TNF 알파 억제제를 포함한다.
항생제의 비-제한적 예는 예컨대, 암피실린, 아목시실린 및 디클록사실린과 같은 페니실린; 예컨대, 데메클로사이클릭, 독시사이클린, 에라바사이클린, 미노사이클린, 오마다사이클린 및 테트라사이클린과 같은 테트라사이클린; 예컨대, 세파클로르, 세포탁심, 세프타지딤, 세프트리악손, 및 세푸록심과 같은 세팔로스포린; 예컨대, 시프로플록사신, 레보플록사신 및 목시플록사신과 같은 퀴놀론; 예컨대, 클린다마이신 및 린코마이신과 같은 린코마이신; 예컨대, 아지트로마이신, 클라리트로마이신 및 에리트로마이신과 같은 마클로리드; 예컨대, 설파살라진, 설파메톡사졸 및 트리메토프림과 같은 설폰아미드; 예컨대, 달바반신, 오리타반신, 텔라반신 및 반코마이신가 같은 글리코펩타이드; 예컨대, 아미카신, 젠타마이신 및 토브라마이신과 같은 아미노글리코시드; 예컨대, 도리페넴, 에르타페넴 및 메로페넴과 같은 카르바페넴을 포함한다.
항산화제의 비-제한적 예는 예컨대, 베타-카로텐, 라이코펜, 루테인, 및 제악산틴과 같은 카로테오니드; 셀레늄; 비타민 C 및 비타민 E를 포함한다.
항섬유제의 비-제한적 예는 닌테다닙 및 피르페니돈을 포함한다.
해독제의 비-제한적 예는 N-아세틸 시스테인을 포함한다.
일부 구현예에서, 추가의 활성제는 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포, 간 줄기-유사 세포의 집단, 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 또는 이의 추출물, 입자, 현탁액 또는 약제학적 조성물의 투여 전, 동안 또는 후에 투여될 수 있다.
특정의 구현예에서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포, 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포의 집단, 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 또는 이의 추출물, 입자, 현탁액 또는 약제학적 조성물은 면역억제제와 함께 공-투여되지 않는다. 하기 실시예 단락에 예시된 바와 같이, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포를 사용한 치료 후 ALF-마우스의 생존은 면역억제제가 공-투여되거나 공-투여되지 않는 것에 상관없이 관찰될 수 있다. 유리하게는, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포를 사용한 치료는 알레르겐(이종) 이식 치료요법에 대한 기준으로서 고려될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 약물 후보물을 스크리닝하기 위한 시험관 내 방법에 관한 것이고, 상기 방법은:
a) 적어도 하나의 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물, 및/또는 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단, 및/또는 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 또는 이의 추출물, 및/또는 입자, 및/또는 현탁액을 제공하는 단계;
b) 단계 a)로부터의 상기 적어도 하나의 세포 또는 이의 추출물, 및/또는 세포 및/또는 이의 추출물의 상기 집단, 상기 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 또는 이의 추출물, 및/또는 상기 입자, 및/또는 상기 현탁액을 약물 후보물과 접촉시키는 단계;
c) 하나 이상의 생물학적 매개변수(들)을 측정하고 임의로 상기 하나 이상의 매개변수(들)을 하나 이상의 참고 매개변수(들)과 비교하는 단계;
d) 약물 후보물이 목적한 치료제 및/또는 진단제인지의 여부를 측정하는 단계를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "약물 후보물"은 잠재적인 치료학적 특성 및/또는 목적한 시장성을 지닌 화합물을 지칭한다. 본 발명의 범위 내에서, 약물 후보물은 진통 특성, 항생제 특성, 항암 특성, 항응고 특성, 항-이뇨 특성, 소염 특성, 항바이러스 특성, 지혈 특성, 신경이완 특성, 증식 활성, 항-섬유성, 항-혈전증 활성, 항-산화 스트레스 등을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 약물 후보물은 간 재생 특성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 특히 간세포 유사 세포 또는 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포의 집단으로부터 유래된 간세포 유사 세포(HLC)를 포함하는 세포의 집단은 ALB 마커(ALB+) 및/또는 CYP3A4 마커(CYP3A4+)를 발현하고, 바람직하게는 ALB 마커(ALB+) 및 CYP3A4 마커(CYP3A4+) 둘 다를 발현한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포의 집단으로부터 유래된 간세포 유사 세포(HLC)는 AFP 마커(AFP-)를 발현하지 않는다. 특정의 구현예에서, HLC는 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 사람 HLC이다.
특정의 구현예에서, 단계 a)는 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포, 또는 간 줄기-유사 세포를 포함하는 세포의 집단을 HLC 분화 배양 배지와 함께 항온처리함으로써 수행될 수 있다. 적합한 배양 배지는 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포를 생성하기 위해 기술된 배양 배지, 예컨대, RPMI 배지와 유사하다. 일부 구현예에서, HLC 분화 배양 배지는 덱사메타손, FGF(섬유아세포 성장 인자), FSK(또한 6-[(1Z)-3-플루오로-2-(하이드록시메틸)프로프-1-엔-1-일]-1,5-디메틸피리미딘-2,4(1H,3H)-디온으로 지칭됨), HGF(간세포 성장 인자), KGF(케라틴 성장 인자), GSK3 억제제(예컨대, CHIR-99021와 같음), 온코스타틴 M, TGF/Smad 억제제(예컨대, SB431542와 같음), 노치 억제제(notch inhibitor)와 함께 항온처리함으로써 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 생물학적 매개변수는 혈청 속의 세포의 증식 상태, 세포의 세포자멸사 상태, 세포의 괴사 상태, 효소(예컨대, ALAT, ASAT와 같음) 또는 목적한 화합물(예컨대, 인터류킨, 사이토킨과 같음), 목적한 생체마커의 수준 등으로 이루어진 그룹에서 선택된다. 실제로, 생물학적 매개변수는 핵산 수준, 특히 mRNA 수준에서, 예컨대, RT-PCR에 의해; 또는 폴리펩타이드 또는 단백질 수준에서 예컨대, 면역형광성, FACS, ELISA, 효소 검정 등에 의해 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, 참고 매개변수는 건강한 개체로부터 기원할 수 있고, 특히 상기 매개변수의 평균 값이다. 일부 구현예에서, 참고 매개변수는 약물 후보물과 비교하여 다음의 동일한 조건에 따라 검정된, 위약으로부터 기원할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 약물 후보물을 스크리닝하기 위한 시험관 내 방법은 상기 약물 후보물의 간 독성을 평가하고/하거나 약물 스크리닝을 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 약물 후보물을 스크리닝하기 위한 시험관내 방법을 사용하여 간에 영향을 미치는, 특히 질환이 있는 간을 치유 또는 재생하는 상기 약물 후보물의 능력을 평가할 수 있다.
본 발명은 전격성 간 장애를 치료 및/또는 방지하기 위한 키트(kit)에 관한 것이고, 상기 키트는:
a) 적어도 하나의 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물, 또는 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단, 또는 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 또는 이의 추출물, 또는 입자, 또는 현탁액 또는 약제학적 조성물; 및
b) 상기 세포, 집단, 상기 간 줄기-유사 세포로부터 유래된 세포, 이의 추출물, 입자, 현탁액 또는 약제학적 조성물을 투여하기 위한 수단을 포함한다.
일부 구현예에서, 간 장애는 전격성 간 장애이다.
특정의 구현예에서, 상기 전격성 간 장애는 급성 간 부전(ALF) 및 급성 만성 간 부전(ACLF)으로 이루어진 그룹에서 선택되고; 여기서 ACLF는 비-알코올성 지방 간염(NASH); 알코올성 간염; 바이러스-유도된 간염; 잠재성 간 질환; 악성 간 질환, 예를 들면, 간세포 암종 및 쓸개관암; 자가면역 간염, 혈관 간 질환, 예를 들면, 버드-키아리 증후군, 쓸개즙정체 간 질환; 및 유전된 대사 간 질환, 예를 들면, 윌슨 질환 및 우레아 주기 장애로 이루어진 그룹으로부터 선택된 간 질환과 관련될 수 있다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 ml 당 약 101 내지 약 1012개의 간 줄기-유사 세포를 포함한다.
특정의 구현예에서, 약제학적 조성물은 cm3 당 약 101 내지 약 1012개의 간 줄기-유사 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포 또는 상기 집단을 투여하기 위한 수단은 주사기 또는 카테터이다. 일부 구현예에서, 키트는 특히 소염제, 면역억제제, 항생제, 및 이의 혼합물을 포함하는 그룹에서 선택된 하나 이상의 추가의 활성제(들)을 추가로 포함한다. 추가의 활성제는 간 재생을 촉진하는 것으로 의도됨이 이해된다.
일부 구현예에서, 키트는 세포 이식(체내 치료요법(intracorporeal therapy))을 수행하기 위한 또는 대안적으로 체외 간 치료요법(extracorporeal liver therapy)을 수행하기 위한 용도일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 키트는 본원에 개시된 바와 같이, 의학 장치, 특히 외부 생체인공 간(external bioartificial liver; EBAL)을 생성하기 위한 용도일 수 있다.
도 1a 내지 1d는 RT-qPCR에 측정된, 11일째(pStemHeps)에 다능성(OCT4)(패널 A), 최종의 내배엽(SOX17)(패널 B)), 및 간 선조 유전자(패널 C), AFP(패널 D)를 암호화하는, 마커의 mRNA의 상대적인 수준을 나타내는 히스토그램이다. 상대적인 유전자 발현은 GAPDH 값으로 표준화한 후 2-△△Ct 정량화 방법을 사용하여 계한하고 분화되지 않은 hESC 세포(DO)에서 발견된 수준의 배수(fold)로서 나타낸다. 상대적인 유전자 발현 수준은 SOX17(패널 B), HNF4A(패널 C) 및 AFP(패널 D)에 대해 Log 10 규모이다. * P<0.05.
도 2a 내지 2d는 면역형광성 검정(OCT4, FOXA2, AFP 및 ALB)(패널 A), SOX17/HNF4A(패널 B) 및 CXCR4(패널 C)에 대해 유동 세포분석법에 의해 및 세포 상층액 속에서 AFP 분비를 측정하는 ELISA의해 0일(D0), 5일(D5), 11일(D11)로부터 hESC의 간 분화를 통한 상이한 주요 마커의 발현 또는 비-발현을 나타내는 사진 및 플롯이다, * P<0.05.
도 3a 내지 3c는 hESC의 HLC로의 간 분화 후 D21에 면역형광성 시험에 의한 ALB, AFP 및 HNF4A의 발현(패널 A), 상 대조 현미경에 의해 시험된 pStemHeps의 세포 형태학(패널 B) 및 ELISA 시험에 의해 측정된 HLC에 의한 상층액 속에서 ALB의 분비(패널 C)를 나타내는 사진 및 그래프이다. * 및 ** P<0.05.
도 4는 400 mg/kg의 체중의 아세트아미노펜(APAP)를 제공받지 않거나(플롯 1, APAP가 없는 대조군 마우스, n=10) 및 제공받고(플롯 2 및 3) 실시예 1에 기술된 바와 같이, 프로토콜 A에 따라 제조된 1x106개의 동결된 pStemHeps의 이식을 추가로 제공받거나(플롯 2, APAP + pStemHeps, n=10) 또는 제공받지 않은(플롯 3, APAP 단독을 지닌 대조군 ALF 동물, n=10) 마우스의 생존 퍼센트를 나타내는 플롯이다.
도 5는 도 4에서와 같이 치료된, APAP를 제공받지 않거나(APAP 단독은 없음, n=5), APAP 단독을 제공받거나(APAP 단독, n=6) APAP 및 1x106개의 동결된 pStemHeps(APAP + pStemHeps, n=8)를 제공받은 마우스의 혈액에서 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALAT) 수준(U/L로 나타냄)을 나타내는 플롯이다. 혈청 ALAT는 세포 주사 후 24시간째에 측정하였다. * 및 ** P<0.05.
도 6은 도 4에서와 같이 치료하고(APAP + pStemHeps, n=10; APAP 단독, n=8; No APAP, n=5), 세포 주사 후 24시간째에 마우스의 3개 그룹 내 건강한 조직의 퍼센트를 나타내는 플롯이다. 각각의 플롯은 동물에 상응한다. * 및 ** P<0.05.
도 7은 도 4에서와 같이 치료한, APAP 단독(APAP 단독, n=3)을 제공받은 및 APAP 및 pStemHeps(APAP + pStemHeps, n=9)를 제공받은 동물에서 ELISA에 의해 측정된 동물 혈청내 사람 AFP의 생산 수준을 나타내는 플롯이다. 사람 AFP 수준은 1x106개의 동결된 pStemHeps의 이식 후 24시간 째에 측정하였다. 각각의 도트는 동물에 상응한다. * P<0.05.
도 8은 PCR 분석 및 모세관 전기영동에 의한 PCR 앰플리콘(amplicon) 검출에 의해 측정된 것으로서 도 4에서와 같이 치료되고 1x106개의 동결된 pStemHeps의 이식 후 24시간 째에 치료한 마우스의 3개 그룹으로부터 수집한 간 생검내 사람 Alu 서열의 존재를 나타내는 플롯이다. 화살표는 Alu PCR 앰플리콘에 상응한다. 레인 1 내지 4: APAP + pStemHeps; 레인 5 및 6: APAP 단독; 레인 7 및 8: APAP 없음, 세포 없음; 레인 9: CTL+ (사람 세포로 이식된 마우스의 간); 레인 10: 블랭크(Blank); 레인 11: 래더(ladder).
도 9는 실시예 2에 기술된 바와 같이 프로토콜 A, B 또는 C에 따라 제조된 pStemHeps에서 RT-qPCR에 의해 측정된, 특징적인 세포 마커의 mRNA의 상대적인 수준을 나타내는 히스토그램이다. 상대적인 유전자 발현 수준은 분화되지 않은 hESC에서 발견된 것의 배수로 나타낸다. 이는 hESC와는 유의적으로 상이하다. 상대적인 유전자 발현 수준은 Log 10 규모이다.
도 10은 실시예 2에 기술된 바와 같이 프로토콜 A(n=11; 암 회색 바아(dark grey bar)) 또는 프로토콜 B(n=3; 연회색 바아(light grey bar))에 따라 제조한 pStemHeps에 의한 DGE-Seq에 의해 측정된 일부 특징적인 세포 마커에 대한 mRNA의 발현 또는 비-발현을 나타내는 히스토그램이다. 묘사된 발현된 유전자는 이에 대한 mRNA의 수가 총 mRNA 분자 백만개 당 200개 초과의 분자(고도의 발현, 세트 1)인 유전자, 및 이에 대한 mRNA의 수가 총 mRNA 분자 백만개당 5 내지 200개 분자 사이이고 배 유도 변화 대 분화되지 않은 hESC(n=14)가 5 초과인(세트 1과 비교한 것으로서 보다 낮은 발현 유전자)로서 정의된다. 묘사된 발현되지 않은 유전자는 이에 대한 mRNA의 수가 총 mRNA 분자 백만개 당 0 또는 5개 분자 미만인 유전자로서 정의된다.
도 11a 및 11b는 ELISA 시험에 의한 프로토콜 A, B 또는 C에 따라 제조된 pStemHeps에 의한 AFP의 발현 및 ALB의 비-발현(패널 A) 및 실시예 2에 기술된 바와 같이, 프로토콜 C에 따라 제조된 pStemHeps에 의한, 면역형광성 시험에 의한 AFP, CK19, EPCAM, FOXA2, HNF4A, KI67, SOX17의 발현 및 ALB의 비-발현(패널 B)을 나타내는 플롯 및 사진이다.
도 12는 동결된 pStemHeps를 실시예 2의 표 2에 기술된 바와 같이, 프로토콜 B에 따라 제조하는 것을 제외하고는, 도 4에서와 같이 마우스(각각의 그룹에서 n=10)의 생존 퍼센트를 나타내는 플롯이다. 플롯 1: 대조군(CTRL) APAP 없음, 플롯 2: APAP+ pStemHeps, 플롯 3: APAP 단독.
도 13a 및 13b는 마우스가 실시예 2의 표 2에서 기술된 바와 같이, 프로토콜 C(패널 B)의 프로토콜 B(패널 A)에 따라 제조된 pStemHeps의 이식 직전 간의 1/3을 제거한 수술을 받은 것을 제외하고는, 도 12에서와 같이 마우스의 생존 퍼센트를 나타내는 플롯이다. 패널 A: 플롯 1: APAP + pStemHeps (n=5); 플롯 2: APAP 단독(n=10); 패널 B: 플롯 1: APAP+ pStemHeps (n=5); 플롯 2: APAP 단독(n=5).
도 14a 내지 14c는 동결된 pStemHeps가 실시예 2의 표 2에 기술된 바와 같이 프로토콜 C에 따라 제조된 것을 제외하고는, 도 4에서와 같이 마우스의 생존 퍼센트를 나타내는 플롯 및 사진의 세트(패널 A)이다. 플롯 1: APAP + pStemHeps (n=4), 플롯 2: APAP 단독(n=5); (패널 B 및 C) 700 mg/kg의 체중의 아세트아미노펜을 제공받은 동물(APAP + 세포; 페널 B) 또는 APAP 단독을 제공받지 않은 비처리된 동물(대조군 APAP; 패널 B)에서 1x106개의 pStemHeps의 주사 후 24시간 째에 KI67(MKI67)에 대한 항체를 사용한 면역조직화학에 의한 간 단면에서 증식하는 세포의 수. KI67(MKI67) 양성 세포 핵은 암색 도트로 나타난다. 원래의 확대 x10.
도 15a 및 15b는 1500 mg/kg의 체중의 티오아세트아미드(TAA)을 제공받고 실시예 2의 표 2에 기술된 바와 같은, 프로토콜 C에 따라 제조된 1x106개의 동결된 pStemHeps의 이식을 추가로 받은(플롯 1, TAA+ pStemHeps, 패널 A의 경우 n=9 및 패널 B의 경우 n=5) 또는 받지않은(플롯 2; TAA 만, n=10) 마우스의 생존 퍼센트를 나타내는 플롯이다. 치료된 마우스는 1 mg/kg의 타크롤리무스(5일 동안 매일 및 세포 주사 전 24시간째에 개시)를 제공받거나(패널 A) 제공받지 않는다(패널 B).
도 16은 실시예 2의 표 2에 기술된 바와 같이, 프로토콜 C에 따라 제조된 1x106개의 동결된 pStemHeps를 제공받지 않거나(CTRL), 제공받은 TAA-해독된 C57BL/6 마우스에서 ELISA로 측정한 사람 AFP의 생산 수준을 나타내는 플롯이다. 사람 AFP 수준은 이식 후 24시간 후에 마우스에서 측정하였다. 각각의 도트는 동물에 상응한다. * P<0.05.
도 17a 및 17c는 실시예 3에 기술된 바와 같이, 아그레웰 플레이트(Aggrewell plate) 내로 배양물을 플레이팅하고 배양한지 2일 후 새로이 제조된(패널 A) 및 동결보존된 pStemHeps(패널 B)로부터 제조된 스페로이드의 생성을 나타내는 사진이다. 패널 C는 Live/Dead 검정 면역형광성 시험에 의해 측정된 것으로서, 타원형의 생존능을 나타내는 사진이다. LIVE: 에스테라제 활성, DEAD: 에티티움 단독이량체-1을 사용한 죽은 세포의 염색, NUCLEI: Hoechst 33342를 사용한 세포 핵 염색, LIGHT: 상 대조 현미경.
도 18은 RT-qPCR, SOX17, HNF4A, 및 AFP에 의해 측정된 바와 같은, 실시예 2에 나타낸 바와 같이 배양된 새로이-제조된(pStemHep FRESH) 또는 동결보존된(pStemHep FROZEN) pStemHeps에서 및 실시예 3에 나타낸 바와 같이 생성시키고 2일 동안 배양한 새로이 제조된(SPHE FRESH) 또는 동결보존된 pStemHeps(SPHE FROZEN)로부터 제조된 스페로이드에서 마커의 mRNA의 상대적인 수준을 나타내는 히스토그램이다. 상대적인 유전자 발현 수준은 Log 10 규모이다. 모든 상대적인 유전자 발현 수준은 분화되지 않은 hESC의 것과는 유의적으로 상이하였다.
도 19는 면역형광성 시험에 의해 측정된 pStemHeps로부터 제조된 2일 배양된 스페로이드에 의한 AFP, CK19, FOXA2, HNF4A 및 SOX17의 발현 및 ALB의 비-발현을 나타내는 사진이다.
도 20a 및 20b는 ELISA 시험에 의해 pStemHeps로부터 제조되고 아그레웰 400TM에서 2일 동안 배양된 스페로이드(SPHE)에 의한 AFP의 발현 및 ALB의 비-발현을 나타내는 플롯이다. pStemHeps 및 HLCs(실시예 1에 나타낸 바와 같이 생성됨)은 사람 AFP(패널 A) 및 사람 ALB(패널 B) 각각의 분비를 위한 양성 대조군으로서 사용하였다. * P<0.05.
도 21은 동결된 pStemHeps를 실시예 2의 표 2에서 기술된 바와 같이, 프로토콜 C에 따라 제조한 것을 제외하고는, 도 4에서와 같은 각각의 그룹에서의 마우스(n=5), 및 700 mg/kg의 체중의 아세트아미노펜을 제공받지 않고 복강 내에서 2x07개의 pStemHeps가 추가로 이식된(플롯 1) 및 이식되지 않은(플롯 2) C57BL6 마우스에서 생존 퍼센트를 나타내는 플롯이다.
도 22는 복강 내에 이식된 세포-유리된/예비-성형된 알기네이트 하이드로겔(알기네이트, n=5) 또는 1x107개의 pStemHeps로부터 제조되고 복강(SPHE 알기네이트, n=3) 내에 이식된 2-일 배양된 스페로이드를 함유하는 예비-성형된 알기네이트 하이드로겔을 제공받지 않은(CTRL, n=3), 또는 제공받은 C57BL/6 마우스의 3개 그룹에서 ELISA에 의해 측정된 사람 AFP의 생체 내 생산 수준을 나타내는 플롯이다. 사람 AFP 수준은 이식한지 24시간 후에 마우스에서 측정하였다. 각각의 도트는 동물에 상응한다. * P<0.05.
도 23은 Live/Dead 검정 면역형광성 시험에 의해 측정된 것으로서 이식 후 8일째에 도 21에 나타낸 동물로부터 이식되고 수거된 스페로이드의 높은 생존능을 나타내는 사진이다. 마우스 복강 내에서 8일 후, SPHE 내 세포의 대부분은 높은 에스테라제 활성을 가졌고(LIVE) 단지 소수의 세포 만이 에티디움 단독이량체-1에 대해 양성이었다(DEAD). 세포 핵은 Hoechst 33342(NUCLEI)로 염색하였다.
도 24a 및 24b는 실시간 RT-qPCR에 의해 측정된 것으로서, 8일 동안 시험관 내 배양된 pStemHeps로부터 제조된 스페로이드 및 이식 후 8일 째에 도 21에 묘사된 동물로부터 이식되고 수거된 알기네이트 하이드로겔(시험관 내 SPHE D8) 속에 봉매된 스페로이드에서 간 분화의 주요 마커, 즉, AFP(패널 A) 및 HNF4A(패널 B)의 mRNA의 상대적인 수준을 나타내는 히스토그램이다. 상대적인 유전자 발현 수준은 Log 10 규모이다. * P<0.05.
도 25는 PARTICLEMETRIX® ZetaView 장치를 사용한 나노입자 트래킹 분석(nanoparticle tracking analysis; NTA)을 사용하여 세포 현탁액 속에서 pStemHeps에 의해 분비된 입자의 크기 분포를 나타내는 그래프이다.
도 26a 내지 26c는 ExoView 장치에 의해 pStemHeps에 의해 분비된 세포외 소낭(EV)에서 테트라스파닌의 검출을 나타내는 도해의 세트 및 플롯이다. EV가 항-테트라스파닌 항체에 의해 스폿에서 먼저 포획된 다음, 동일한 테트라스파닌에 대한 형광성-표지된 항체의 조합이 적용되고 판독된다(패널 A). 결과는 4개의 상이한 플롯에서 형광성에 의한 입자 검출을 입증한다(입자는 판독 영역에 의해 표준화된다, MIgG: 동형 대조군)(패널 B). 최종적으로, 모든 스폿에서 발현된 테트라사이클린의 수의 분포가 나타나 있다(패널 C). 3개의 마커는 CD63, CD81, 및 CD9이다.
도 27은 3개의 샘플로부터 검출된 단백질을 기반으로 한(역치(threshold) > PSM) 벤 다이어그램(Venn diagram)을 사용한 세포 분해물, 세포 상층액, 및 정제된 소낭에서 단백질학 분석을 나타내는 개략도이다.
도 28은 ELISA 시험에 의해 측정된 것으로서 프로토콜 C에 따라 제조된 pStemHeps의 배양물의 상층액 속에서 HGF의 발현을 나타내는 플롯이다.
실시예
본 개시내용은 다음의 실시예에 의해 추가로 나타낸다. 달리 기술하지 않는 한, 용어 "pStemHeps"는 본원에서 본 발명에 따른 간 줄기-유사 세포를 지칭한다.
실시예 1
1.1 물질 및 방법
a) 세포 배양
사람 배아 줄기 세포(hESCs) 주는 사람 섬유아세포 공급인자 층에서 현재의 우수의약품제조관리기준(Good Manufacturing Practice; cGMP) 조건 하에 유도되었고 연구 및 임상 등급 양식으로 이용가능하다. hESCs(ESI-BIO)를 5μg/ml의 라미닌 LN521(BIOLAMINA®)으로 예비-코팅시킨 배양 디쉬 상에서 mTeSR1TM 배지(STEM CELL TECHNOLOGIES®) 속에서 37℃로 5% CO2 항온처리기 속에서 매일 배지를 교환하면서 공급인자가 없는 조건 속에서 배양하고 TrypLETM(THERMOFISHER SCIENTIFIC®을 사용하여 계대배양한 다음 24시간 동안 10 μM의 록 억제제(Rock inhibitor) Y-27632(STEM CELL TECHNOLOGIES®)의 존재하에 배양하였다.
b) 시험관 내에서 간 분화(간 줄기 세포의 집단의 생성)
세포(75,000개의 세포/cm2)를 라미닌 LN521(BIOLAMINA®) 상에 5 μg/ml으로 10 μM Y-27632(STEM CELL TECHNOLOGIES®)를 함유하는 mTeSR1TM(STEM CELL TECHNOLOGIES®) 속에서 플레이팅하였다. 24시간 후, 분화가 시작하면(0일째), hESCs 유지 배지를 B27 혈청이 없는 보충물(LIFE TECHNOLOGIES®)이 보충된 RPMI로 대체하고 세포를 이후 매일 교환하였다. 최종의 내배엽 분화 유도의 첫날 동안, 세포를 100 ng/ml의 액티빈 A(MILTENYI BIOTEC®), 50 ng/ml의 Wnt3a(R&D SYSTEMS®) 및 3 μM의 CHIR-99021(STEM CELL TECHNOLOGIES®)의 존재하에서 배양하였다. 이후에, 세포를 1일 동안 100 ng/ml의 액티빈 A(MILTENYI BIOTEC®) 및 50 ng/ml의 Wnt3a(R&D SYSTEMS®)의 존재 하에 및 이후 3일 동안 100 ng/ml의 액티빈 A(MILTENYI BIOTEC®)의 존재 하에 배양하였다. 내배엽 형성 후 간 구체화(hepatic specification)을 유도하기 위하여, 10 ng/ml의 섬유아세포 성장 인자 10(FGF-10)(MILTENYI BIOTEC®) 및 10 ng/ml의 골 형성 단백질 4(BMP-4)(R&D SYSTEMS®)를 5일 동안 사용하였다. 이러한 간 분화 프로토콜 A를 사용한 수, pStemHeps를 CryoStorTM CS10(STEM CELL TECHNOLOGIES®) 속에서 동결시켰다. 간세포-유사 세포(HLCs)를 간 성숙으로 생산하기 위해, 세포를 20 ng/ml의 간세포 성장 인자(HGF) 및 20 ng/ml의 온코스타틴이 보충된 간세포 배양 배지(HCM)(LONZA®) 속에서 배양하고, 배지는 2일마다 교환하였다.
c) RNA 추출 및 실시간 정량적 PCR
전체 mRNA를 RNeasy Mini 키트(QIAGEN®)를 사용하여 제조업자의 추천에 따라 배양물로부터 추출하였다. 실시간 역-전사를 5 ng의 RNA로부터, 1-단계 RT-PCR 키트로 Taqman® 기술(AgPath-IDTM One-Step RT-PCR, LIFE TECHNOLOGIES®) 및Applied Biosystems ViiA 7 실시간 PCR 시스템 및 Taqman 검정(LIFE TECHNOLOGIES®)을 위한 적절한 프라이머: OCT4(Hs00999632_g1), SOX17(Hs00751752_s1), HNF4A(Hs00604435-m1), AFP(Hs00173490_m1), 및 GAPDH(Hs99999905_m1)를 사용하여 수행하였다. 상대적인 유전자 발현을 2-△△Ct 정량화 방법을 사용하여 GAPDH 값으로 정상화한 후 계산하고 분화되지 않은 hESCs 세포에서 발견된 수준의 배수로서 나타내었다.
d) 유동 세포분석법
세포를 수거(harvesting)하고 빙 상에서 Fixable Viability Dye eFluorTM
450(eBioscienceTM 65-0863-14)으로 20분 동안 항온처리하였다. 세포 내 염색을 제조업자의 설명서에 따라 고정/투과 키트(eBioscienceTM 00-5123-43 및 00-5223-56)를 사용하여 SOX17(알로피코시아닌 염소 항-SOX17, R&D SYSTEMS®, #IC1924A) 및 HNF4A(Alexa Fluor 488 마우스 항-HNF4A, SANTACRUZ® #SC-374229)의 존재 또는 부재하에 수행하였다. CXCR4의 검출은 세포 투과없이 항-CXCR4 모노클로날 마우스 IgG2b 항체(R&D SYSTEMS®, #Mab173) 및 Alexa Fluor 568 항-마우스 IgG2b을 사용하여 수행하였다. 분석은 FACSCanto II(BD BIOSCIENCES®) 및 Flow Jo 소프트웨어(TREE STAR®, 미국 오레건주 애쉬랜드)로 수행하였다. 사람 1차 간세포를 Biopredic International로부터 수득하였다.
e) 면역형광성 세포 염색 검정
배양된 세포를 4% 파라포름알데하이드와 함께 15분 동안 실온에서 고정시키고, PBS 중 0.5% 트리톤 X-100으로 15분 동안 투과시키고 PBS 중 1% BSA-0.1% 트리톤으로 30분 동안 차단시켰다. 1차 항체를 PBS 속에서 11% BSA-0.1% 트리톤으로 희석시키고, 1시간 동안 실온(마우스 항-AFP, SIGMA ALDRICH® #A8452, 1/50; 마우스 항-ALB, CEDARLANE® #CL2513A, 1/300; 토끼 항-FOXA2, ABCAM® #ab108422, 1/100; 마우스 항-HNF4A, SANTACRUZ® #SC-374229, 1/100; 토끼 항-OCT4, SANTACRUZ®, #SC-9081, 1/50)에서 항온처리하였다. 2차 항체를 PBS 중 1% BSA-0.1% 트리톤 속에 희석시키고 1시간 동안 실온(Alexa Fluor 488 당나귀 항-마우스 IgG, INVITROGEN® #A21202, 1/200; Alexa Fluor 488 염소 항-토끼 IgG, INVITROGEN® #A21206, 1/200)에서 항온처리하였다. 세포를 커버슬립 및 ProLong Gold Antifade Mountant (LIFE TECHNOLOGIES®)를 사용하여 탑재하였다. 모든 사진은 짜이즈 형광 현미경(Zeiss fluorescent microscope)으로 관찰하였다.
f) 효소-연결된 면역흡착성 검정(ELISA) 분석
배양 배지 내로 분비된 사람 AFP 및 ALB를 사람 AFP Elisa 정량 키트(Quantitation kit)(ABCAM®) 및 사람 알부민 ELISA 정량 키트(Bethyl; http://www.bethyl.com)에 의해 제조업자의 설명서에 따라 측정하였다.
이식된 동물의 혈청 내로 분비된 사람 AFP를 사람 AFP Elisa 정량화 키트(EHAFP, THERMOFISHER SCIENTIFIC®)로 제조업자의 설명서에 따라 측정하였다.
g) 동물 및 급성 간 부전(ALF)의 유도
수컷 NOD/SCID 마우스(6주령)를 400 mg의 아세트아미노펜(APAP)/kg으로 처리하여 세포 이식 3시간 전에 급성 간 부전(ALF)을 유도하였다. ALF는 치료된 동물의 혈청 속에서 트랜스아미나제의 조직학적 염색 및 측정의 수단으로 평가하였다. APAP의 주사 후 3시간 째에, 동물에게 50 μL의 RPMI/B27 배지(LIFE TECHNOLOGIES®) 중 1x106개의 동결된 pStemHeps의 비장내 주사를 제공하였다. 모든 검정은 동결보존되고 해동된 pStemHeps를 사용하여 수행되었다. 대조군 마우스에게 APAP 해독을 제공하고 치료는 하지 않았다. 24시간 후, 마우스를 마취(이소플루란) 하에 희생시켰다. 혈액, 혈청 및 간을 수집하고 분석할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 조직학적 분석을 위해, 포르말린-고정된 층을 탈수시키고, 파라핀 블롯 속에 봉매하고 5 ㎛의 단면으로 절단하였다. 간 단면을 해마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하고, 디지탈 슬라이드 스캐너(Nanozoomer S360, Hamamatsu Photonics)로 x20 확대로 염색하였다. 디지탈 영상을 8-비트 회색 규모로 전환시키고 회색 값을 ImageJ 소프트웨어로 측정하여 정상 및 괴사 조직 부위를 정량적으로 평가하였다. APAP로 해독되지 않은 마우스의 간을 사용하여 정상 간의 회색 값을 정의하였다.
h) PCR Alu
게놈성 DNA를 Genomic DNA를 사용하여 기관 및 세포 키트(MACHEREY-NAGEL®)을 사용하여 제조업자의 설명서에 따라 조직으로부터 추출하였다. Alu PCR을 2개의 프라이머: hAluR: 5'-TTT TTT GAG ACG GAG TCT CGC TC-3'(서열 번호: 1) 및 hAluF: 5'-GGC GCG GTG GCT CAC G-3'(서열 번호: 2)를 사용하여 수행한다. PCR은 헤르쿨라제 키트(Herculase Kit)(AGILENT®)를 사용하여 25 μL의 전체 용적 속에서 10 ng의 게놈성 DNA를 사용하여 수행한다. PCR은 Herculase® 키트(AGILENT®)를 사용하여 25 μL의 전체 용적 속에서 10 ng의 게놈성 DNA를 사용하여 수행한다. PCR 이동 조건(running condition)은 제조업자가 추천한 것이다.
i) 통계적 분석
데이타를 평균 값 ± SEM으로 나타낸다. 통계적 분석을 GraphPad Prism® 7 소프트웨어(GraphPad Software, 캘리포니아주 샌 디에고)를 사용하여 이루었다. 통계적 유의성은 그룹 간의 비교를 위해 스튜던츠 t 시험(Student's t test)을 사용하여 평가하였다. 생존 데이타는 카플란-마이어 시험(Kaplan-Meier test)으로 분석하였다. 생존율의 통계적 유의성은 log-랭크 시험(rank test)으로 측정하였다. 모든 시험에 대해, P < 0.05를 유의적인(*) 것으로 고려하였다.
1.2 결과
a) 간 줄기 세포(pStemHeps)로 hESCs cGMP의 분화
분화 프로토콜 0일째에, hESCs cGMP 배양물은 다능성 마커 옥타머-결합 전사 인자(octamer-binding transcription factors) 4(OCT4)에 대해 양성이었다(도 1 및 2a). hESCs cGMP를 3개 단계의 분화 프로토콜에 적용시켰다. 세포를 최종 내배엽(DE)으로 유도한 다음, 5일까지 간 구체화시켰으며, 여기서 세포는 간 줄기-유사 세포(pStemHeps)로 분화되었다. 도 2a는 다능성(OCT4), DE(FOXA 2), 간 선조세포(AFP) 및 성숙한 간세포(ALB)의 주요 마커의 발현; OCT4 발현의 사라짐, DE 유도 후(5일째) FOXA2의 발현, 간 유도 후(11일째) AFP의 발현 및 알부민(ALB)의 비 발현의 역학을 나타낸다. 11일째에, pStemHeps는 RNA, 면역형광성 및/또는 세포형광성 분석에 의해 측정된 것으로서 AFP, CXCR4(DE 마커), FOXA2, HNF4A 및 SOX17(DE 마커)를 발현하였다(도 1b 내지 1d 및 2a 내지 2c). 따라서, pStemHeps는 AFP를 분비하지만(도 2d) ALB는 분비하지 않는다(도 3c).
동결보존 및 해동 과정은 새로이 단리된 세포와 비교하여 1차 사람 간세포의 생존능 및 기능에서 유해 효과를 가짐을 보고하였다. pStemHeps의 성공적인 동결보존은 2 내지 9개월의 기간 동안에 높은 생존능을 보유하였다(표 1).
Figure pct00001
b) HLCs로 분화하기 위한 hESCs의 효능
pStemHeps의 HLCs로의 간 성숙 후, 분화된 세포의 형태학은 다각형 형태, 명백한 둥근 핵 또는 이중 핵, 및 다수의 액포 또는 소낭을 포함하는 성체 1차 간세포와 많은 특성을 공유하였다(도 3b). HLC는 성숙한 간 세포에 의해 나타난 중요한 기능인 ALB를 분비하였다(도 3c). 세포 면역염색은 HLCs가 ALB, AFP 및 HNF4A에 대해 양성이었음을 나타내었다(도 3a).
c) APAP-유도된 ALF로부터 pStemHeps 구조(rescue)
생체 내에서 pStemHeps의 치료학적 효능을 평가하기 위하여, 면역-절충된 마우스(immuno-compromised mouse)에서 아세트아미노펜 독성(APAP)의 모델을 사용하였으며, 이는 ALF를 모사한다. 당해 모델은 일관된 간독성이 쥐 모엘에서 간세포 손상이 사람 간에서 관찰되었으므로 먼저 선택하였다. 서방 국가에서, 파라세타몰 해독은 ALF의 1차 원인이다.
400 mg/kg의 체중의 아세트아미노펜 용량은 APAP의 투여 후 24시간내로 신속하에 대조군 동물의 급속한 사망을 야기하였다. pStemHeps 이식은 대조군 ALF 동물과 비교하여 동물 생존(>90% 생존)을 유의적으로 증가시켰다(도 4).
따라서, ALF의 유도는 혈액 속에서 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALAT, 주요 간 손상 마커)의 신속한 방출과 일치하였다. pStemHeps 이식은 대조군 ALF 동물과 비교하여 세포 치료요법 후 24시간으로 신속하에 ALAT 값의 감소를 야기하였다(도 5).
추가로, 조직학적 분석은 APAP 및 pStemHeps를 세포 이식 후 24시간 내에 제공받은 동물 그룹과 비교하여 APAP 단독을 제공받은 대조군 동물에서 보다 높은 정도의 간 괴사를 나타내었고(도 6), 이는 pStemHeps 치료요법의 신속한 치료학적 이점을 나타낸다.
사람 AFP는 이식된 마우스의 혈청 속에서 검출되었고 세포 주사 후 24시간째에 이식되지 않은 대조군 마우스의 혈청 속에서 검출되지 않았으며(도 7), 이는 pStemHep 해동 후 신속한 세포 회수 및 기능성을 나타내다.
이식된 세포가 수용체 마우스의 간 내에서 이식되었는지의 여부를 시험하기 위해, 사람 pStemHeps의 존재를 사람 Alu PCR(고도로 반복되는 특정 서열)을 사용하여 검출하였다. 사람 세포는 이식 후 24시간 째에만 간에서 검출되었다(도 8).
1.3 결론
동결보존 및 해동 과정은 새로이 단리된 세포와 비교하여 1차 사람 간세포의 생존능 및 기능에서 유해한 효과를 갖는 것으로 보고되었다(Terry et al., 2010). 높은 생존능 뿐만 아니라 배양되고 추가로 분화되는 능력을 보유한 사람 간 선조세포의 성공적인 동결보존은 후속적인 연구 및 임상 적용에 필요한 세포의 장기간 뱅킹을 허용한다. 간 줄기-유사 세포는 HNF4A 및 AFP와 같은 간 특이적인 마커를 증식하고 발현시킬 수 있다. 추가로 성숙된 경우, 세포는 알부민 분비와 같은 간 특이적인 기능을 나타내었다.
세포 주입 후, pStemHeps를 동결보존된 상태로 신속하게 회수하고, 이식하고, 치명적인 급성 간 부전으로부터 마우스를 보호할 수 있었다. 세포는 24시간 후 이식된 마우스의 간에서 검출되었다. 혈청 ALAT 및 간 조직 괴사에서 유의적이고 신속한 감소 또한 대조군 APAP-ALF 마우스와 비교하여 보고되었다.
여기서, 사람 다능성 줄기 세포로부터 생산된 동결된 간세포는 건강한 조직의 간 재생을 가속화시킴으로써 APAP-ALF로부터 마우스를 구조할 수 있음이 밝혀졌다. pStemHeps는 이식 후 24시간 내에 신속하게 복구하여 기능성이 된다. 전적으로, 이러한 결과는 pStemHeps 이식시 건강한 간 조직의 보다 높은 재생이 따라서 전격성 간 부전, 예를 들면, ALF의 유리한 치료, 및 기존의 만성 간 질환을 지닌 전격성 간 부전, 예를 들면, ACLF의 유리한 치료일 수 있다. 더욱이, ALF와 유사하게, ACLF는 질환이 있는 간 내 건강한 간 조직의 재생으로부터 전격성 간 손상을 치료하기에 유리하다.
실시예 2
2.1 물질 및 방법
a) 세포 배양
사람 배아 줄기 세포(hESCs) 주는 사람 섬유아세포 공급인자 층에서 현재의 우수의약품 제조 관리기준(cGMP) 조건 하에 유도시켰고 연구 및 임상 등급 양식으로 이용가능하다. hESCs(ESI-BIO)를 공급인자가 없는 조건 속에서 mTeSR1 배지(STEM CELL TECHNOLOGIES®) 중 5 μg/mL의 라미닌 LN521(BIOLAMINA®) 또는 0.5 ㎍/cm2의 비트로넥틴(GIBCOTM)으로 37℃에서 5% CO2 항온처리기 속에서 매일 배지를 교환하면서 배양하고, TrypLETM(THERMOFISHER SCIENTIFIC®)를 사용하여 계대배양한 다음 10 μM의 록 억제제(Rock inhibitor) Y-27632(STEM CELL TECHNOLOGIES®)의 존재하에서 24시간 동안 배양하였다.
b) 시험관 내에서 간 분화 및 간 줄기 세포의 특성화
세포(20,000 내지 50,000개의 세포/cm2)를 라미닌 LN521(BIOLAMINA®) 상에 5 μg/ml(프로토콜 A 및 B)에서 또는 LN511(iMatrix 511, AMSBIO®) 상에 mTeSR1TM(STEM CELL TECHNOLOGIES®) 속에서 배양된 0.0625 ㎍/cm2(프로토콜 C)에서 매일 배양물을 교환하면서 플레이팅(plating)하고, TrypLETM(THERMOFISHER SCIENTIFIC®)을 사용하여 계대배양한 다음 24시간 동안 10 μ의 록 억제제 Y-27632(STEM CELL TECHNOLOGIES®)을 사용하여 계대배양하였다.
48시간 후, hESCs의 간 분화를 이후에 실시예 1에서 수행한 바와 같이 배양 프로토콜을 제공하는 표 2에 따라 개시하였다.
Figure pct00002
상기 프로토콜에 의해 생성된 간 줄기-유사 세포를 시험관 내 및 생체 내에서 특성화하였다.
시험관 내 특성화를 위해, 세포의 수거된 밀도, 수율, 세포의 생존능, FOXA2 및 SOX17와 같은 DE 구체화, AFP, APOA1, APOB, HNF1B HNF4A, TBX3, KRT19 및 TTR와 같은 간 줄기 세포 구체화, 및 ALB, ASGR1, CYPs F9, NAGS, 및 UGT1A1과 같은 성숙한 간세포 구체화에 대한 마커의 수준을 평가하였다.
마커의 수준은 언급한 바와 같이 실시간 RT-PCR, ELISA, FACS, 면역형광성 세포 염색으로 평가하였다. Taqman 검정을 위한 qPCR 프라이머에 관한 정보는 표 1에서 및 FOXA2(Hs00232764_m1)의 경우 qPCR 프라이머(LIFE TECHNOLOGIES®), HNF1B 프라이머(Hs01001602-m1), TBX3(Hs00195612_m1), TTR(Hs00174914-m1)를 사용하여 나타낸다. 면역형광성 세포 염색에 대한 항체와 관련된 정보는 실시예 1에 및 항-EPCAM(R&D SYSTEMS®, #AF960), 항-CK19/KRT19(DAKO® #M0888), 항-SOX17(R&D SYSTEMS® #AF1924) 항-KI67(ABCAM® #Ab15580), 및 Alexa Fluor 568 당나귀 항-염소 IgG(INVITROGEN® #A11057)을 사용하여 나타낸다.
대안적으로, 마커의 수준은 3' DGE(DGE-Seq)에 의해 mRNA 발현 프로파일링으로 평가하였다. RNA-서열분석 프로토콜을 10 ng의 총 RNA에 대해 수행하여 문헌(Kilens et al. (2018))에 의해 기술된 바와 같이 전체 mRNA 분자 백만개 당 mRNA 분자의 수를 측정하였다.
c) 동물 및 급성 간 부전(ALF)의 유도
생체 내 특성화를 위해, 간 줄기 세포를 400 mg/kg 또는 720 mg/kg의 용량에서 NOD/SCID 마우스 내 APAP-유도된 ALF를 구조하는 이의 능력에 대해 평가하였다(참고: 상기 실시예 1).
대안적으로, APAP-유도된 ALF를 지닌 NOD/SCID 마우스를 수술하여 간의 대략 1/3을 제거한 후 나타낸 바와 같이 1x106개의 동결보존된 pStemHeps를 이식하였다.
대안적으로, 수컷 C57BL/6 마우스(6주령)를 1,500 mg의 티오아세트아미드(TAA)/kg로 치료하여 ALF를 유도하고 24시간 후에 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행된 1x106개의 동결보존된 pStemHeps를 이식하였다.
희생시점에, 혈액을 수집하고 혈청 분취량을 광으로부터 보호하고 -80℃에서 실시예 1에 기술된 바와 같이 ELISA에 의한 사람 AFP를 측정하는 분석까지 저장하였다.
KI67(MKI67)-양성 세포의 존재는 700 mg/kg의 체중의 APAP를 제공받은 동물 또는 APAP 단독을 제공받은 치료되지 않은 대조군 동물에서 1x106개의 pStemHep(프로토콜 C에서와 같이 제조함; 참고: 표 2)의 주사 후 24시간 째에 포르말린-고정된/파라핀-봉매된 간 단면(3μm)에서 면역조직화학으로 평가하였다. 파라핀을 단면으로부터 추출한 후, 내인성 아비딘/바이오틴 결합 부위를 아비딘/바이오틴 차단 키트(THERMOFISHER SCIENTIFIC®, #00-4303)를 사용하여 차단하고 내인성 퍼옥시다제 활성을 10분 동안 PBS 중 3% H2O2 용액 속에서 항온처리함으로써 억제하였다. Animal Free Blocker(VECTOR LABORATORIES®, #SP-5030-250) 속에서 1시간 동안 항온처리 후, Animal Free Blocker 속에서 1:1,000으로 희석시킨 토끼 폴리클로날 항-KI67 1차 항체(ABCAM®, #ab15580)를 밤새 4℃에서 적용하였다. KI67-양성 세포는 바이오티닐화된 염소 항-토끼 면역글로불린 및 스트렙타비딘-퍼옥시다제(ABCAM®; #ab64261)로 색원체성 기질로서 디아미노벤디딘을 사용하여 나타내었다. 슬라이드를 헤마톡실린 및 크실렌으로 역-염색(counter-staining)하였다.
d) 통계적 분석
통계적 분석을 실시예 1에 나타낸 바와 같이 수행하였다.
2.2 결과
a) 3개의 상이한 프로토콜에 따른 hESCs cGMP의 pStemHeps로의 분화
hESCs는 표 2에서와 같은 3개의 프로토콜(상이한 매트릭스(matrix) 및 칵테일(cocktail)) 중 하나에 따라 간 줄기 세포 내에서 분화시켰다.
상이한 프로토콜에 따라 생산된 pStemHep는 RTqPCR 분석에 의해 평가된 것으로서 모두 AFP를 발현하였지만 또한 FOXA2, HNF1b, HNF4A, TBX3 및 TTR도 발현하였다(도 9). 더욱이 pStemHeps(프로토콜 A 및 B)의 RNAseq 분석은 다음 유전자의 높은 발현을 나타내었다: AFP, APOA1, APOA2, APOB, APOE, CD164, CD24, DPP4, EPCAM, GlA1, GSTA2, KRT18, KRT19, SEPP1, SOD1, SPARC, TTR, VIM, VTN(도 10). 이들은 또한 보다 낮은 상대적인 수준에서 이러한 유전자를 발현하였다: APOA4, BMP2, BMP4, DLK1, GATA4, GATA6, GSTA1, HNF1B, HNF4A, SMAD7, TBX3. 그리고 이들은 성숙한 간세포의 다음의 유전자 특성을 발현하지 않았고: ABCB11, ASGR1, CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2B7P, CYP2C9, CYP2E1, CYP3A4, CYP3A7, F9, NAGS, UGT1A1 PDX1을 발현하지 않았다.
따라서, 프로토콜 A, B 및 C를 사용하여 생산된 pStemHeps는 AFP 단백질을 생산 및 분비하였으나 ALB 단백질은 생산 및 분비하지 않았다(도 11a 및 11b). 도 11b는 또한 pStemHeps가 HNF4A, SOX17, EPCAM, CK19(KRT19), FOXA2 단백질에 대해 양성이었음을 나타내었다. pStemHeps는 또한 증식하는 세포의 마커인, KI67 단백질에 대해 양성이다(도 11b).
b) pStemHeps는 APAP-유도된 ALF로부터 구조된다
프로토콜 A, B 및 C에 의해 생성된 동결보존된 pStemHeps를 NOD/SCID 마우스에서 APAP-유도된 ALF를 구조하는 이의 능력에 대해 평가하였다.
도 4, 12, 13a 및 13b 및 14a 각각은 이러한 프로토콜에 의해 생성된 pStemHeps 모두가 아세트아미노펜-유도된 ALF를 사용한 NOD/SCID 마우스의 생존의 유의적인 증가를 촉진함을 나타낸다(도 4: 프로토콜 A, 도 12: 프로토콜 B, 도 13a 및 13b: 각각 프로토콜 B 및 C, 도 14a: 프로토콜 C).
프로토콜 B 및 C로 생성된 pStemHeps는 간의 1/3을 제거한 수술을 한 후 이러한 세포가 이식된 NOD/SCID 마우스에서 아세토아미노펜-유도된 ALF를 구조할 수 있었다(참고: 도 13a 및 13b 각각).
pStemHeps는 치료되지 않은 대조군 마우스 그룹에서 2일 내에 100%의 마우스 사망을 야기하는 고 용량의 아세트아미노펜에서 해독된 NOD/SCID 마우스에서 ALF를 구조할 수 있다(도 14a).
도 14b 및 14c에 나타낸 바와 같이, pStemHeps는 pStemHeps를 제공받지 않은 아세트아미노펜-유도된 ALF를 지닌 치료되지 않은 대조군 마우스와 비교하여(도 14c) 세포 주사 후 24시간 째에 아세트아미노펜-유도된 ALF를 지닌 NOD/SCID 마우스의 간에서 증식하는 세포의 유의적인 증가를 촉진한다(도 14b). 이러한 결과는 APAP-유도된 ALF 마우스에서 pStemHeps 세포 치료요법 후 보다 신속한 간 재생을 입증한다.
c) pStemHeps는 APAP-유도되지 않은 ALF로부터 구조된다
생성된 동결보존된 pStemHeps를 비-아세트아미노펜 유도된 사람 ALF의 동물 모델로서 간독소 티아아세트아미드(TAA)를 사용한 마우스에서 유도된 ALF를 구조하는 능력에 대해 평가하였다.
도 15a 및 15b는 프로토콜에 의해 생성된 pStemHeps가 타크롤리무스(면역억제제)의 존재 또는 부재하에서 TAA-유도된 ALF로부터 면역적격성 마우스를 구조함을 나타낸다. 전적으로, 이러한 결과는 세포의 낮은 면역원성에 대한 증거를 제공한다.
도 16은 세포 주사 후 24시간 째에 사람 AFP가 이식된 마우스의 혈청 속에서 검출되지만 이식되지 않은 대조군 마우스의 혈청 속에서 검출되지 않음을 나타내고, 마우스에서 비-APAP-유도된 ALF에서 pStemHeps 해동 후 신속한 세포 회수 및 기능성을 나타낸다.
2.3 결론
여기서 hESCs로부터의 간 줄기-유사 세포(pStemHeps)의 획득은, 수개의 프로토콜이 마우스 모델에서 급성 간 부전을 치료하기 위한 유의적으로 등가의 치료학적 결과와 함께 시행될 수 있음이 나타나 있다. 더욱이, pStemHeps는 APAP-유도된 및 비-APAP 유도된 ALF를 구조할 수 있다. pStemHeps는 세포 해동 및 ALF(24시간 내에 발생하는 첫번째 사망)로부터 및/또는 면역억제의 부재하에서 마우스를 구조하기 위한 세포 해동 및 세포 이식 후 충분히 신속하게(24시간 내) 치료학적으로 활성이 되었다. 전적으로, 이러한 결과는 pStemHeps 이식이 ALF와 같은 전격성 간 부전의 상태에서 뿐만 아니라, ACLF에서와 같은, 기존의 만성 간 질환을 지닌 전격성 간 부전의 상태에서 건강한 조직의 보다 높은 간 재생을 허용함을 시사한다. 다시, ALF의 경우, ACLF는 질환이 있는 간 내에서 건강한 간 조직의 재생으로부터 전격성 간 부전을 치료하는데 유리하다.
실시예 3
3.1 물질 및 방법
a) pStemHeps로부터 스페로이드의 생성
pStemHeps 상세 분화 단계(specification differentiation stage)의 말기에(참고: 실시예 2)에 기술된 프로토콜), pStemHeps 세포를 Ca/Mg가 들어있지 않은 PBS(GIBCO®)로 세정하고 TrypLETM(LIFE TECHNOLOGIES®)과 함께 10분 동안 37℃에서 항온처리하였다. RPMI/B27(LIFE TECHNOLOGIES®)을 용해된 세포 현탁액에 가하고 세포를 조심스럽게 플러싱(flushing)하여 완전히 해리시켰다. 이후에, 세포를 Aggrewell 400TM 플레이트(STEM CELL TECHNOLOGIES®)에 플레이팅하여 10 μM의 Y27632(STEM CELL TECHNOLOGIES®), 20 ng/ml HGF(MILTENYI®), 20 ng/ml OSM(MILTENYI®) 및 1 μ M 덱사메타손(SIGMA ALDRICH®)(D0 SPHE)이 보충된 완전 HCM(LONZA®) 중 1000개의 세포/스페로이드의 최종 밀도를 획득하였다. 세포를 48시간 동안 37℃, 5% CO2에서 배지 변화없이 항온처리하였다.
b) 유전자 발현 분석
마커의 수준을 상기 언급한 바와 같이, RT-qPCR 및 ELISA로 분석하였다.
면역형광성 세포 염색을 위해, 스페로이드를 Ca/Mg 보충된 PBS로 세정하고 30분 동안 4% PFA를 사용하여 고정시키고, PBS 중 0.5% 트리톤으로 15분 동안 투과시켰다. 세포 면역염색을 스페로이드를 0.1% 트리톤 및 1% BSA(차단 완충제)를 함유하는 PBS 속에서 1시간 동안 1차 항체와 함께 및 1시간 동안 적절한 2차 항체와 실온에서 항온처리함으로써 수행하였다(표 3).
Figure pct00003
b) 세포 생존능
시험관 내 세포 생존능을 평가하기 위하여, 0.4 μM의 칼세인-AM 및 4 μM 에티디움 단독이량체-1(LIVE/DEAD 생존능/세포독성 키트, LIFE TECHNOLOGIES®) 및 10 ㎍/ml Hoechst 33342(LIFE TECHNOLOGIES®)를 배양 배지에 영상화 전 30분 동안 가하였다.
c) 스페로이드의 이식 및 생체 내 기능성
이식 전에, 스페로이드를 알기네이트 하이드로겔 속에 봉매하였다. 이를 위해, 2일 배양된 스페로이드를 상술한 바와 같이 생성시키고, Aggrewell로부터 수거하고, 100xg에서 5분 동안 원심분리하고 칼슘/마그네슘이 들어있지 않은 PBS(LIFE TECHNOLOGIES®) 속에 재현탁시켰다. 스페로이드를 8.9% 초-순수 알긴산나트륨과, 저 점도 및 고 글루코론산(Pronova SLG20, NOVAMATRIX®)과 함께 혼합한 다음 0.0225 M의 CaCO3(SIGMA ALDRICH®), 및 0.045 M의 글루코노-d-락톤(SIGMA ALDRICH®)과 함께 혼합하여 20x106/ml(대략 2x104개의 스페로이드)의 최종 세포 농도를 획득하였다. 250 μl의 하이드로겔의 겔화는 실온에서 3분 동안 일어났다. 2개의 250 μl의 예비-성형된 알기네이트 하이드로겔을 함유하거나 함유하지 않는 스페로이드를 개복술(laparotomy) 하에 면역적격 C57BL/6 내로 복강내 이식하였다.
스페로이드의 생체 내 생존능을 평가하기 위하여, 알기네이트 하이드로겔을 이식된 동물로부터 8일-이식 후에 수거하고, 0.1 M EDTA(LIFE TECHNOLOGIES®), 및 0.2 M 삼염기성 시트르산나트륨(SIGMA ALDRICH®)을 함유하는 칼슘 및 마그네슘이 들어있지 않은 PBS(LIFE TECHNOLOGIES®)의 용액을 사용하여 해리시켰다. 완전한 하이드로겔 해리 후, 스페로이드를 100 xg에서 5분 동안 회전시키고, 0.4 μM의 카세인-AM 및 4μM 에티디움 단독이량체-1(LIVE/DEAD 생존능/세포독성, LIFE TECHNOLOGIES®) 및 10 ㎍/ml의 Hoechst 33342(LIFE TECHNOLOGIES®)를 함유하는 신선한 RPMI/B27 속에서 영상화 전 90분 동안 항온처리하였다.
스페로이드 내 유전자 발현 수준을 상술한 바와 같이 알기네이트 하이드로겔을 수거 및 용해한 후 실시간 RT-PCR에 의한 이식 후 8일째에 평가하였다. 이식된 동물의 혈청 AFP를 사람 AFP(EHAFP, THERMOFISHER SCIENTIFIC®)에 대해 특이적인 AFP Elisa 정량화 키트에 의해 제조업자의 설명서에 따라 측정하였다.
d) 통계적 분석
통계적 분석을 실시예 1에 나타낸 바와 같이 수행하였다.
3.2 결과
도 17a 내지 17c에 나타낸 바와 같이, 새로이 제조되거나 동결보존된 pStemHeps를 응집시키고 Aggrewell 플레이트 내로 이식한 후 48시간 내에 스페로이드를 형성시켰다. 수거시, 스페로이드는 높은 에스테라제 활성을 가졌고 에티디움 단독이량체-1 염색에 대해 양성이 아니었다. 응집되지 않는 세포 만이 에티디움 단독이량체-1에 대해 양성이었고 임의의 에스테라제 활성을 나타내지 않았다. 이러한 결과는 모든 스페로이드의 높은 생존능을 나타내었다. 또한, 새로이 제조되거나 동결보존된 pStemHeps로부터 제조된 스페로이드는 이로부터 이들이 제조된 pStemHeps의 것과 유사한 고 수준의 AFP, HNF4A 및 SOX17 mRNA를 발현하였다(도 18).
면역형광성 검정을 스페로이드에서 추가로 수행하여, 간 분화의 일부 주요 마커의 발현 수준을 평가하였다. 결과는 스페로이드가 AFP, CK19(KRT19), FOXA2, HNF4A, 및 SOX17 단백질을 발현하지만, 이들은 ALB 단백질을 발현하지 않았음을 나타내었다(도 19).
최종적으로, 세포 상층액 샘플에서 수행된 AFP에 대한 ELISA는 스페로이드가 AFP를 분비하며, 이러한 수준은 pStemHeps의 것과 유사한 수준이었다(도 20a). 또한, 2일 배양된 스페로이드에 의한 ALB의 분비는 HLC와는 대조적으로, 발견되지 않았다(도 20b).
스페로이드의 생체 내 기능성을 평가하기 위하여, 총 약 10x106개의 pStemHeps를 함유하는 2개의 예비-성형된 알기네이트 하이드로겔을 CB57BL/6 마우스 내로 복강내 이식시켰다. 또한, 2x107개의 pStemHeps를 CB57BL/6 ALF-마우스 내에 복강내 이식시키고 생존을 구조하였다(도 21).
도 22는 사람 AFP가 스페로이드를 함유하는 예비-성형된 알기네이트 하이드로겔을 사용한 이식 후 2일째에 약 320 ng/ml의 평균 수준에서 검출되었음을 나타낸다.
이식 후 8일 후에, 알기네이트 하이드로겔 속에 봉매된 스페로이드는 매우 생존가능하며(도 23) AFP 및 HNF4A를 8일 동안 시험관 내에서 배양된 스페로이드(알기네이트 하이드로겔 속에 봉매되지 않음)의 것보다 유사한 수준에서 발현하였다(도 24a 및 b).
3.3 결론
여기서 새로이 제조되거나 동결보존된 단리된 pStemHeps 세포로부터 스페로이드를 신속하고 효율적으로 생성할 수 있음이 본원에 나타나 있다. 스페로이드는 시험관 내에서 높은 생존능을 나타내며 이의 선조 상태는 pStemHeps 세포와 유사한 상태를 유지하였고, 특히 AFP 마커는 발현되지만 ALB 마커는 발현되지 않았다. 알기네이트 하이드로겔 속에 봉매된 이러한 스페로이드는 생체 내에서 AFP를 분비하고 급성 간 부전으로부터 구조되기에 충분한 시간인, 면역 적격성 동물의 복강에서 적어도 8일 동안 생존한다 (사멸은 5일 이내에 발생한다. 참고: 실시예 1 및 실시예 2). 또한, 복강내에 이식된 pStemHeps는 ALF로부터 마우스를 구조한다. 전적으로, 이러한 결과는 하이드로겔 속에 봉매된 pStemHep가 따라서 전격성 간 부전, 예를 들면, ALF의 치료에 유리할 수 있고 또한 ACLF와 같은 기존의 만성 간 질환을 지닌 전격성 간 손사의 치료에 유리할 수 있음을 뒷받침한다.
실시예 4
4.1 물질 및 방법
a) 세포 상층액 속에서 pStemHep에 의해 분비된 세포외 소낭(EV)의 정제 및 크기 분포
세포 상층액을 2,000 xg에서 10분 동안 정화(clarifying)하여 세포 부스러기를 제거하였다. 이후에, 이를 40 ml의 튜브 속에 분취량화하고 -80℃에서 동결시켰다. 이러한 튜브를 해동시키고 입자 크기 분포 및 농도를 나노입자 트래킹 분석(nanoparticle tracking analysis; NTA)으로 405 nm 레이저가 장착된 ZetaView(PARTICLEMETRIX®, 독일)를 사용하여 측정하였다. 측정 전에, EV를 멸균 PBS(NTA 측정에 의해 입자-유리된 것으로 확인됨)인 것으로 확인되었다. 각각의 샘플에 대해, 80의 민감성 및 100의 셔터(shutter)를 설정하였다.
b) EV의 추가의 특성화
세포 상층액으로부터의 EV를 농축시키고 150,000xg에서 90분 동안 MAX-XP 한외원심분리(BECKMAN COULTER®, 영국)를 사용하는 한외원심분리의 2회의 연속적인 수행으로 정제하였다. 농축된 EV를 ExoView(NANOVIEW BIOSCIENCES®, 미국)로 분석하였다. 샘플을 키트 시약 속에서 1x108개의 EV/ml에서 희석시켰다. 샘플을 ExoView Tetraspanin Chip 상에서 14-웰 플레이트(14-well plate)에 위치한 사람 EV에 대해 16시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 칩(chip)을 시약 A로 3회 세척하였다. 칩을 항-CD81 Alexa-555, 항-CD63 Alexa-488, 및 항-CD9 Alexa-647로 이루어진 ExoView 테트라사포닌 표지화 항체와 함께 항온처리하였다. 항체를 면역형광성 차단 용액 속에서 1:600으로 희석시켰다. 칩을 250 μl의 표지화 용액과 함께 1시간 동안 항온처리하고, 용액 A(0.05% 트윈-20이 들어있는 PBS)에 이어서, 용액 B(PBS 단독) 속에서 3회 세척하고, 건조시켰다. 칩을 ExoView R100 판독기로 NScan 획득 소프트웨어를 사용하여 영상화하였다. 데이타는 ExoViewer를 사용하여 분석하였다.
사람 HGF를 사람 HGF Elisa 정량화 키트(THERMOFISHER SCIENTIFIC®)에 의해 제조업자의 설명서에 따라 구체적으로 측정하였다.
c) 나노LC-MS/MS 단백질 확인 및 정량화
S-TrapTM 마이크로 스핀 컬럼(PROTIFI®, 미국 헌팅톤) 소화를 40 ㎍의 세포 분해물, 상층액 및 엑스트라-비히클(extra-vesicle)에서 제조업자의 설명서에 따라 수행하였다. 요약하면, 단백질을 5% SDS 및 1.2% 수성 인산 중 50 mM 요오도아세트아미드로 알킬화하였다. 콜로이드성 단백질 입자를 S-Trap 결합 완충제(90% 수성 메탄올, 100 mM TEAB, pH 7.1)의 샘플 용적의 6배를 첨가하여 형성시켰다. 단백질 혼합물을 S-Trap 마이크로 컬럼 내로 이전시키고 4,000xg에서 30초 동안 원심분리하고, 150 μL의 S-Trap 결합 완충제로 세척하였다. 이후에, 샘플을 4 μg의 트립신(PROMEGA®)으로 47℃에서 1시간 동안 소화시켰다. 펩타이드를 제조업자의 프로토콜에 따라 용출시키고, Speed Vacuum 속에서 건조시켰다.
이를 10% ACN, HPLC-등급의 물 중 0.1% TFA 속에 LC-MS+MS 분석을 위해 nanoRSLC-Q Exactive PLUS(RSLC Ultimate 3000(THERMOFISHER SCIENTIFIC®, 미국 메사츄세츠주 왈탐)를 사용하여 재현탁시켰다. 펩타이드(1-2 ㎍)를 μ-예비컬럼(Acclaim PepMap 100 C18, 카트릿지, 300 μm, i.d. x5 MM, 5μMm, THERMOFISHER SCIENTIFIC®) 상에 로딩(loading)하고, 50 cm 역상 액체 크로마토그래피 컬럼(0.075 mm ID, Acclaim PepMap 100, C18, 2 ㎛, THERMOFISHER SCIENTIFIC®) 상에서 이동 상 A(0.1% 포름산이 들어있는 H20), 및 이동상 B(80% 아세토니트릴, 0.08% 포름산)을 사용하여 분리하였다. 펩타이드를 컬럼으로부터 5% 내지 40%의 구배로 120분 동안, 40% 내지 80%의 구배로 1분 동안 용출시킨 다음, 구배를 80%에서 5분 동안 유지한 후 이를 5%로 되돌려 다음 주사 전 20분 동안 컬럼을 재-평형화시켰다.
용출된 펩타이드를 데이타 의존성 MS/MS로, 상위-10 획득 방법을 사용하여 분석하고 고-에너지 충돌 해리(higher-energy collisional dissociation; HCD)로 단편화하였다. MS 스캔 및 MS/MS 스캔을 각각 70,000 및 17,5000의 해상도에서 수행하였다. MS 및 MS/MS AGC 표적을 각각 200 ms 및 120 ms로 설정된 최대 주입 시간으로 3x106 및 1x105 개의 카운트로 설정하였다. MS 스캔은 400 내지 2,000 m/z의 범위이다. 역학적 배제를 30초에서 설정하였다.
MS 파일을 Proteome Discoverer 소프트웨어 버젼 2.4.0.305으로 진행시키고 Mascot 조사 엔진을 사용하여 UniProtKB/Swiss-Prot 호모 사피엔스 데이타베이스(2019년 4월 15일자로 방출, 20415 entries)에 대해 조사하였다. 모 질량 및 단편 이온을 조사하기 위하여, 질량 편차를 각각 3 ppm 및 20 ppm으로 설정하였다. 다른 조사 매개변수를 포함하였다: 트립신 절단을 위한 엄격한 특이성을 지닌 7개 아미노산의 최소 펩타이드 길이, 고정된 변형으로서 카브아미도메틸화(Cys), 반면에 가변 변형으로서 산화(Met) 및 N-말단 아실화.
4.2 결과
a) 세포 상층액 속에서 pStemHep에 의해 분비된 EV의 정제 및 크기 분포
세포 상층액을 NTA로 연구하였다. 4.2±0.4x109개의 입자/mL의 높은 수의 분자를 측정하였고, 이는 대략 103개의 입자/세포를 의미하는, 2x109개의 씨딩된(seeded) 세포에 대해 (2.0±0.2)x1012의 총 입자에 상응한다. 대략 100 nm의 이의 크기는 EV 분포에 잘 상응한다(도 25 및 표 4).
Figure pct00004
b) EV의 추가의 특성화
수득된 데이타는 EV가 스폿(spot) 당 대략 150 내지 300개의 입자가 검출되는, 3개의 시험된 항-테트라사포닌(CD63/CD81/CD9 항체; 참고: 도 26a)에 의해 면역-포획될 수 있었음을 나타내었다. 신호의 대부분은 CD63(40 내지 70%) 및 CD81 마커와 더 적은 정도(35 내지 70%)로 관련되었다(도 26b). 각각 2 및 16%의 면역 포획된 EV는 3개의 테트라스파닌 마커 중 3 또는 2개를 발현하였다(도 26c). 이는 정제된 입자 중에서 EV(테트라스판닌 양성)의 존재를 확인한다.
c) NanoLC-MS/MS 단백질 확인 및 정제
정제된 입자 상의 단백질체학 분석을 세포 분해물 및 전체 상층액으로부터의 단백질과 비교하였다. 분석된 0,5 ㎍의 단백질로부터, 소낭(vesicle) 샘플은 발현된 단백질에서 최고의 다양성을 나타내었고, 이들 중 대부분은 세포 분해물과 공유하였다(도 27). EV 속에 전통적으로 존재하는 많은 세포질성 및 막 단백질은 소낭 샘플과 고 농도에서 접촉하였다. 이러한 단백질체학 분석으로, 배양된 세포의 상층액 속에 유의적인 EV 및 엑소좀이 존재하였고 이를 정제하는 것이 가능하였음을 입증하였다. 물론, EV는 세포와 동일한 목적한 단백질, 예를 들면, AFP, HGF, 지단백질(표 5 및 6, 도 28) 뿐만 아니라, EV에서 일반적으로 발견된 단백질(표 7)을 함유한다.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
[참고문헌]
- Arroyo V, Moreau R, Kamath PS, Jalan R, Gines P, Nevens F, Fernandez J, To U, Garcia-Tsao G, Schnabl B. Acute-on-chronic liver failure in cirrhosis. Nat Rev Dis Primers. 2016 Jun 9(2):16041.
- Cameron K, Tan R, Schmidt-Heck W, Campos G, Lyall MJ, Wang Y, Lucendo-Villarin B, Szkolnicka D, Bates N, Kimber SJ, Hengstler JG, Godoy P, Forbes SJ, Hay DC. Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 2015 Dec 8;5(6):1250-1262.
- Carpenter SP, Lasker JM, Raucy JL. Expression, induction, and catalytic activity of the ethanol-inducible cytochrome P450 (CYP2E1) in human fetal liver and hepatocytes. Mol Pharmacol. 1996;49(2):260-268.
- Chen S, Wang J, Ren H, Liu Y, Xiang C, Li C, Lu S, Shi Y, Deng H, Shi X. Hepatic spheroids derived from human induced pluripotent stem cells in bio-artificial liver rescue porcine acute liver failure. Cell Research (2019) 0:1-3; https://doi.org/10.1038/s41422-019-0261-5.
- Chinnici CM, Timoneri F, Amico G, Pietrosi G, Vizzini G, Spada M, Pagano D, Gridelli B, Conaldi PG. Characterization of Liver-Specific Functions of Human Fetal Hepatocytes in Culture. Cell Transplant. 2015;24(6):1139-1153.
- Chung Y, Klimanskaya I, Becker S, Li T, Maserati M, Lu SJ, Zdravkovic T, Ilic D, Genbacev O, Fisher S, Krtolica A, Lanza R. Human embryonic stem cell lines generated without embryo destruction. Cell Stem Cell. 2008 Feb 7;2(2):113-7.
- De Coppi P1, Bartsch G Jr, Siddiqui MM, Xu T, Santos CC, Perin L, Mostoslavsky　G, Serre AC, Snyder EY, Yoo JJ, Furth ME, Soker S, Atala A. Isolation of amniotic stem cell lines with potential for therapy. Nat Biotechnol. 2007　Jan;25(1):100-6.
- Dellavalle A1, Sampaolesi M, Tonlorenzi R, Tagliafico E, Sacchetti B, Perani L, Innocenzi A, Galvez BG, Messina G, Morosetti R, Li S, Belicchi M, Peretti G, Chamberlain JS, Wright WE, Torrente Y, Ferrari S, Bianco P, Cossu G. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat Cell Biol. 2007 Mar;9(3):255-67.
- Dhawan A, Strom SC, Sokal E, Fox IJ. Human hepatocyte transplantation. Methods Mol Biol. 2010;640:525-34.
- Dhawan A, Chaijitraruch N, Fitzpatrick E, Bansal S, Filippi C, Lehec SC, Heaton ND, Kane P, Verma A, Hughes RD, Mitry RR. Alginate microencapsulated human hepatocytes for the treatment of acute liver failure in children. J Hepatol. 2020 May;72(5):877-884.
- D'Ippolito G, Diabira S, Howard GA, Menei P, Roos BA, Schiller PC. Marrow-isolated adult multilineage inducible (MIAMI) cells, a unique population of postnatal young and old human cells with extensive expansion and differentiation potential. J Cell Sci. 2004 Jun 15;117(Pt 14):2971-81.
- Glorioso JM, Mao SA, Rodysill B, Mounajjed T, Kremers WK, Elgilani F, Hickey　RD, Haugaa H, Rose CF, Amiot B, Nyberg SL. Pivotal preclinical trial of the spheroid reservoir bioartificial liver. J Hepatol. 2015 Aug;63(2):388-398.
- Gonzalez F, Boue S, Izpisua Belmonte JC. Methods for making induced pluripotent stem cells: reprogramming a la carte. Nat Rev Genet. 2011 Apr;12(4):231-42.
- Hansel MC, Gramignoli R, Skvorak KJ, Dorko K, Marongiu F, Blake W, Davila　J, Strom SC. The history and use of human hepatocytes for the treatment of liver diseases: the first 100 patients. Curr Protoc Toxicol. 2014 Nov 6;62:14.12.1-23. Parallel derivation of isogenic human primed and naive induced pluripotent stem cells.
- Jochheim A, Hillemann T, Kania G, Scharf J, Attaran M, Manns MP, Wobus AM, Ott M. Quantitative gene expression profiling reveals a fetal hepatic phenotype of murine ES-derived hepatocytes. Int J Dev Biol. 2004 Feb;48(1):23-9.
- Kilens S, Meistermann D, Moreno D, Chariau C, Gaignerie A, Reignier A, Lelievre　Y, Casanova M, Vallot C, Nedellec S, Flippe L, Firmin J, Song J, Charpentier E, Lammers J, Donnart A, Marec N, Deb W, Bihouee A, Le Caignec C, Pecqueur C, Redon R, Barriere P, Bourdon J, Pasque V, Soumillon M, Mikkelsen　TS, Rougeulle C, Freour T, David L; Milieu Interieur Consortium. Nat　Commun. 2018 Jan 24;9(1):360. doi: 10.1038/s41467-017-02107-w.).
- Koeler G, Sensken S, Airey JA, Trapp T, Muechen M, Feldhahn N, Liedtke S, Sorg　RV, Fischer J, Rosenbaum C, Greschat S, Knipper A, Bender J, Degistirici O, Gao J, Caplan AI, Colletti EJ, Almeida-Porada G, Mueller HW, Zanjani E, Wernet　P. A new human somatic stem cell from placental cord blood with intrinsic pluripotent differentiation potential. J Exp Med. 2004 Jul 19;200(2):123-35.
- Larsen FS, Schmidt LE, Bernsmeier C, Rasmussen A, Isoniemi H, Patel VC, Triantafyllou E, Bernal W, Auzinger G, Shawcross D, Eefsen M, Bjerring PN, Clemmesen JO, Hockerstedt K, Frederiksen HJ, Hansen BA, Antoniades CG, Wendon J. High-volume plasma exchange in patients with acute liver failure: An open randomised controlled trial. J Hepatol. 2016;64(1):69-78.
- Miyazono K, Kusanagi K, Inoue H. Divergence and convergence of TGF-beta/BMP signaling. J Cell Physiol. 2001 Jun;187(3):265-76. Review. Narayanaswamy R. and Torchilin VP. Hydrogels and their applications in targeted drug delivery. Molecules 2019, 24, 603.
- Ntai A, La Spada A, De Blasio P, Biunno I. Trehalose to cryopreserve human pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 2018;31:102-112.
- Pareja E, Gomez-Lechon MJ, Tolosa L. Alternative Cell Sources to Adult Hepatocytes for Hepatic Cell Therapy. Methods Mol Biol. 2017;1506:17-42.
- Payne CM, Samuel K, Pryde A, King J, Brownstein D, Schrader J, Medine CN, Forbes SJ, Iredale JP, Newsome PN, Hay DC. Persistence of functional hepatocyte-like cells in immune-compromised mice. Liver Int. 2011 Feb;31(2):254-62.
- Peppas NA, Bures P, Leobandung W, Ichikawa H. Hydrogels in pharmaceutical formulations. Eur J Pharm Biopharm. 2000 Jul;50(1):27-46.
- Perez-Luna VH, Gonzalez-Reynoso O. Encapsulation of Biological Agents in Hydrogels for Therapeutic Applications. Gels. 2018 Jul 11;4(3). pii: E61. doi: 10.3390/gels4030061.
- Pietrosi G, Vizzini G, Gerlach J, Chinnici C, Luca A, Amico G, D'Amato M, Conaldi PG, Li Petri S, Spada M, Tuzzolino F, Alio L, Schmelzer E, Gridelli B. Phases I-II Matched Case-Control Study of Human Fetal Liver Cell Transplantation for Treatment of Chronic Liver Disease. Cell Transplant. 2015;24(8):1627-38.
- Rao MS, Khan AA, Parveen N, Habeeb MA, Habibullah CM, Pande G. Characterization of hepatic progenitors from human fetal liver during second trimester. World J Gastroenterol. 2008 Oct 7;14(37):5730-7.
- Roelandt P, Pauwelyn KA, Sancho-Bru P, Subramanian K, Bose B, Ordovas L, Vanuytsel K, Geraerts M, Firpo M, De Vos R, Fevery J, Nevens F, Hu W-S, Verfaillie CM. Human Embryonic and Rat Adult Stem Cells with Primitive Endoderm-Like Phenotype Can Be Fated to Definitive Endoderm, and Finally Hepatocyte-Like Cells. PLoS One. 2010; 5(8): e12101.
- Sagi I, Chia G, Golan-Lev T, Peretz M, Weissbein U, Sui L, Sauer MV, Yanuka O, Egli D, Benvenisty N. Derivation and differentiation of haploid human embryonic stem cells. Nature. 2016 Apr 7;532(7597):107-11.
- Sampaolesi M, Blot S, D'Antona G, Granger N, Tonlorenzi R, Innocenzi A, Mognol P, Thibaud JL, Galvez BG, Barthelemy I, Perani L, Mantero S, Guttinger M, Pansarasa O, Rinaldi C, Cusella De Angelis MG, Torrente Y, Bordignon C, Bottinelli R, Cossu G. Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs. Nature. 2006 Nov 30;444(7119):574-9.
- Siller R, Greenhough S, Naumovska E, Sullivan GJ. Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2015　May　12;4(5):939-52.
- Struecker B, Raschzok N, Sauer IM. Liver support strategies: cutting-edge technologies. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2014 Mar;11(3):166-76.
- Takayama K, Nagamoto Y, Mimura N, Tashiro K, Sakurai F, Tachibana M, Hayakawa T, Kawabata K, Mizuguchi H. Long-term self-renewal of human ES/iPS-derived hepatoblast-like cells on human laminin 111-coated dishes. Stem Cell Reports. 2013 Oct 3;1(4):322-35.
- Takayama K, Akita N, Mimura N, Akahira R, Taniguchi Y, Ikeda M, Sakurai F, Ohara O, Morio T, Sekiguchi K, Mizuguchi H. Generation of safe and therapeutically effective human induced pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like cells for regenerative medicine. Hepatol Commun. 2017 Oct 12;1(10):1058-1069.
- Terry C, Dhawan A, Mitry RR, Lehec SC, Hughes RD. Optimization of the cryopreservation and thawing protocol for human hepatocytes for use in cell transplantation. Liver Transpl. 2010 Feb;16(2):229-37.
- Tolosa L, Caron J, Hannoun Z, Antoni M, Lopez S, Burks D, Castell JV, Weber　A, Gomez-Lechon MJ, Dubart-Kupperschmitt A. Transplantation of hESC-derived hepatocytes protects mice from liver injury. Stem Cell Res Ther. 2015 Dec 12;6:246.
- Warren L, Manos PD, Ahfeldt T, Loh YH, Li H, Lau F, Ebina W, Mandal PK, Smith ZD, Meissner A, Daley GQ, Brack AS, Collins JJ, Cowan C, Schlaeger TM, Rossi DJ. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 2010 Nov 5;7(5):618-30.
- Zheng JF, Liang LJ, Wu CX, Chen JS, Zhang ZS. Transplantation of fetal liver epithelial progenitor cells ameliorates experimental liver fibrosis in mice. World　J　Gastroenterol. 2006 Dec 7;12(45):7292-8.
<110> GOLIVER THERAPEUTICS NANTES UNIVERSITE INSERM (Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale) <120> HEPATIC STEM-LIKE CELLS FOR THE TREATMENT AND/OR THE PREVENTION OF FULMINANT LIVER DISORDERS <130> IP20224183FR <150> EP20305267.5 <151> 2020-03-13 <160> 2 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer hAluR <400> 1 ttttttgaga cggagtctcg ctc 23 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer hAluF <400> 2 ggcgcggtgg ctcacg 16

Claims (15)

  1. 알파-페토단백질 마커(AFP+)를 발현하고 알부민 마커(ALB-)를 발현하지 않는 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 적어도 5% 포함하는, 세포의 집단, 특히 단리된 세포의 집단.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 간 줄기-유사 세포는 T-Box 전사 인자 3 마커(TBX3+) 및/또는 간세포 핵 인자 4 알파 마커(HNF4A+), 바람직하게는 T-Box 전사 인자 3 마커(TBX3+) 및 간세포 핵 인자 4 알파 마커(HNF4A+)를 추가로 발현하는, 세포의 집단.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 간 줄기-유사 세포는 동결보존되는, 세포의 집단.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른, 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단을 포함하는 입자, 특히 스페로이드(spheroid).
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른, 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단을 포함하는 현탁액.
  6. (i) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른, 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단, 및/또는 제4항에 따른 적어도 하나의 입자, 및/또는 제5항에 따른 현탁액, 및 (ii) 약제학적으로 허용되는 비히클을 포함하는, 약제학적 조성물.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 간 줄기-유사 세포 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단, 및/또는 제4항에 따른 적어도 하나의 입자, 및/또는 제5항에 따른 현탁액, 및/또는 제6항에 따른 약제학적 조성물을 포함하는, 의학 장치(Medical device).
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른, 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 이종 집단을 포함하는, 비-사람 동물 모델(non-human animal model).
  9. 의약으로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물, 또는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단, 또는 제4항에 따른 적어도 하나의 입자, 또는 제5항에 따른 현탁액, 또는 제6항에 따른 약제학적 조성물.
  10. 전격성 간 장애(fulminant liver disorder)를 예방 및/또는 치료하는데 사용하기 위한, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물, 또는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단, 또는 제4항에 따른 적어도 하나의 입자, 또는 제5항에 따른 현탁액, 또는 제6항에 따른 약제학적 조성물, 또는 제7항에 따른 의학 장치.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 전격성 간 장애는 급성 간 부전(ALF) 또는 급성의 만성 간 부전(ACLF)인, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물, 또는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단, 또는 제4항에 따른 적어도 하나의 입자, 또는 제5항에 따른 현탁액, 또는 제6항에 따른 약제학적 조성물, 또는 제7항에 따른 의학 장치.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 ACLF는 비-알코올성 지방 간염(NASH), 알코올성 간염, 바이러스-유도된 간염, 잠재성 간 질환, 간세포 암종 및 쓸개관암과 같은 악성 간 질환; 자가면역 간염, 버드-키아리 증후군과 같은 혈관 간 질환; 쓸개즙정체 간 질환; 및 윌슨 질환 및 우레아 주기 장애와 같은 유전된 대사 간 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 간 질환과 관련되는, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물, 또는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단, 또는 제4항에 따른 적어도 하나의 입자, 또는 제5항에 따른 현탁액, 또는 제6항에 따른 약제학적 조성물, 또는 제7항에 따른 의학 장치.
  13. 제4항에 따른 입자를 제조하기 위한, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 동결보존된 세포의 집단의 용도.
  14. 약물을 스크리닝하기 위한 시험관 내 방법으로서:
    a) 적어도 하나의 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물, 및/또는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 간 줄기-유사 세포 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단, 및/또는 제4항에 따른 입자, 및/또는 제5항에 따른 현탁액을 제공하는 단계;
    b) 단계 a)로부터의, 상기 적어도 하나의 세포 또는 이의 추출물, 및/또는 상기 세포의 집단 또는 이의 추출물, 및/또는 상기 입자, 및/또는 상기 현탁액을 약물 후보물과 접촉시키는 단계;
    c) 하나 이상의 생물학적 매개인자(들)을 측정하고, 선택적으로 상기 하나 이상의 생물학적 매개인자(들)를 하나 이상의 참고 매개인자(들)과 비교하는 단계;
    d) 상기 약물 후보물이 목적한 치료 및/또는 진단제인지를 결정하는 단계;를 포함하는, 방법.
  15. 전격성 간 장애를 치료 및/또는 예방하기 위한 키트로서:
    a) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물, 또는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 간 줄기-유사 세포, 또는 이의 추출물을 포함하는 세포의 집단, 또는 제4항에 따른 입자, 또는 제5항에 따른 현탁액, 또는 제7항에 따른 약제학적 조성물; 및
    b) 상기 세포 또는 이의 추출물, 집단 또는 이의 추출물, 또는 입자, 또는 현탁액 또는 약제학적 조성물을 투여하기 위한 수단;을 포함하는, 키트.
KR1020227035513A 2020-03-13 2021-03-15 전격성 간 장애의 치료 및/또는 예방용 간 줄기-유사 세포 KR20220153078A (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN114480253B (zh) * 2022-01-30 2023-02-28 深圳市三启生物技术有限公司 多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的培养基及培养方法和用途
CN115851578B (zh) * 2022-12-23 2023-11-21 华南理工大学 一种3d悬浮诱导持续扩增肝祖细胞类器官和/或肝细胞类器官的试剂盒及其应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
US8354277B2 (en) 2004-10-12 2013-01-15 Technion Research & Development Foundation Ltd. Isolated primate embryonic cells derived from extended blastocysts
BRPI0619794B8 (pt) 2005-12-13 2022-06-14 Univ Kyoto Uso de um fator de reprogramação, agente para a preparação de uma célula-tronco pluripotente induzida a partir de uma célula somática e métodos para preparar uma célula- tronco pluripotente induzida método e para preparar uma célula somática e uso de células-tronco pluripotentes induzidas
AU2008297024B2 (en) 2007-10-31 2014-08-28 Kyoto University Nuclear reprogramming method
WO2010042490A1 (en) 2008-10-06 2010-04-15 Boston Medical Center Corporation A single lentiviral vector system for induced pluripotent (ips) stem cells derivation
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