KR20220150101A - Extraction method of paclitaxel using negative pressure cavitation - Google Patents
Extraction method of paclitaxel using negative pressure cavitation Download PDFInfo
- Publication number
- KR20220150101A KR20220150101A KR1020210057407A KR20210057407A KR20220150101A KR 20220150101 A KR20220150101 A KR 20220150101A KR 1020210057407 A KR1020210057407 A KR 1020210057407A KR 20210057407 A KR20210057407 A KR 20210057407A KR 20220150101 A KR20220150101 A KR 20220150101A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- paclitaxel
- extraction
- negative pressure
- biomass
- mmhg
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D305/00—Heterocyclic compounds containing four-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atoms
- C07D305/14—Heterocyclic compounds containing four-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atoms condensed with carbocyclic rings or ring systems
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
- A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
Description
본 발명은 음압 캐비테이션을 이용한 파클리탁셀 추출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 파클리탁셀을 포함하는 바이오매스 (biomass)에 유기 용매를 혼합한 후 특정 범위의 음압을 가하여 캐비테이션을 발생시켜 용매-용질 간 물질 전달 속도를 증가시키고, 바이오매스 표면을 파쇄함으로써 파클리탁셀을 효율적으로 회수할 수 있는 파클리탁셀 추출방법을 제공한다.The present invention relates to a method for extracting paclitaxel using negative pressure cavitation, and more particularly, mixing an organic solvent with biomass containing paclitaxel and then applying a negative pressure in a specific range to generate cavitation to transfer solvent-solute mass Provided is a method for extracting paclitaxel capable of efficiently recovering paclitaxel by increasing the speed and crushing the biomass surface.
파클리탁셀 (paclitaxel)은 주목 (yew tree)의 표피에서 발견된 디테르페노이드 (diterpenoid)계 항암물질로, 현재 가장 많이 사용되고 있는 항암제이다. 난소암, 유방암, 두경부암 (head and neck cancer), 카포시종양(kaposi’s sarcoma), 비소세포성 폐암(non-small cell lung cancer) 치료에 대해 미국 FDA (U.S Food and Drug Adnimistration) 허가를 취득한 바 있으며, 계속되는 적응증 (알츠하이머 치료, 류마티스성 관절염) 및 치료 방법의 개발로 파클리탁셀 수요는 계속해서 늘어날 전망이다. 파클리탁셀의 주요 생산 방법에는 주목나무 (yew tree)에서 직접 추출하는 방법, 전구체 (precursor)를 얻어 반합성하는 방법, 식물체로부터 캘러스 (callus)를 유도하여 식물세포를 배양하여 얻는 방법이 있다. 이들 중 식물세포 배양방법은 다른 방법에 비해 외부인자 (기후, 환경)에 의한 영향을 받지 않고, 생물반응기 내에서 일정한 품질의 파클리탁셀을 안정적으로 생산하는 것이 가능하기 때문에 대량생산에 매우 유리하다. 식물세포 배양에 의해 생산된 파클리탁셀은 대부분 바이오매스 (식물세포)에 포함되어 있으며, 파클리탁셀 생산은 여러 단계의 추출 및 정제 공정으로 이루어져 있다 [Kim et al., Korean J. Chem. Eng., 32, 1023-1028(2015); Choi et al., Process Biochem., 40, 1113-1117(2005); Kim et al., Process Biochem., 59, 216-222(2017)].Paclitaxel is a diterpenoid type anticancer substance discovered in the epidermis of yew tree, and is currently the most used anticancer agent. It has obtained US Food and Drug Adnimistration (FDA) approval for the treatment of ovarian cancer, breast cancer, head and neck cancer, kaposi's sarcoma, and non-small cell lung cancer. Demand for paclitaxel is expected to continue to grow with the development of new indications, treatments for Alzheimer's disease, rheumatoid arthritis, and treatment methods. The main production methods of paclitaxel include direct extraction from a yew tree, a method of semisynthesis by obtaining a precursor, and a method of culturing plant cells by inducing callus from a plant. Among them, the plant cell culture method is very advantageous for mass production because it is not affected by external factors (climate, environment) compared to other methods and it is possible to stably produce paclitaxel of a certain quality in a bioreactor. Most of the paclitaxel produced by plant cell culture is contained in biomass (plant cells), and paclitaxel production consists of several steps of extraction and purification [Kim et al., Korean J. Chem. Eng., 32 , 1023-1028 (2015); Choi et al., Process Biochem ., 40 , 1113-1117 (2005); Kim et al., Process Biochem ., 59 , 216-222 (2017)].
경제적인 관점에서 먼저 바이오매스 내에 포함되어 있는 파클리탁셀을 높은 수율로 회수하는 것이 매우 중요하다. 기존 문헌 [Kim et al., Biotechnol. Bioproc. Eng., 23, 532-540(2018)]에 따르면, 회수 공정은 먼저 유기용매로 추출 (conventional solvent extraction)하는 것이 일반적이며, 메틸렌 클로라이드, 메틸-t-부틸 에테르, 에탄올, 이소프로필 알코올, 클로로포름, 디에틸 에테르, 아세톤, 메탄올 등과 같은 다양한 종류의 유기용매를 이용하여 추출 경향을 조사한 결과, 메탄올이 가장 적은 양으로 가장 높은 회수율을 얻어 바이오매스 추출에 가장 효과적임을 알 수 있었다. 또한, 주요 공정변수로 메탄올 농도, 바이오매스/메탄올 혼합 비율, 추출 시간, 추출 횟수 등을 최적화하여 바이오매스로부터 파클리탁셀 회수율을 증가시키고자 하였으나, 전통적 용매 추출 방법의 경우 낮은 추출 효율로 인해 많은 유기 용매와 시간과 소요되는 단점이 있었다. 2008년에는 마이크로웨이브를 이용한 추출로 바이오매스로부터 파클리탁셀을 회수하는 방법이 보고되었고 [Kim et al., Korean Chem. Eng. Res., 58, 273-279(2020)], 최근에는 초음파 (ultrasound)를 이용한 추출이 세포벽을 파쇄하여 목적 성분의 추출 효율을 향상시킬 수 있다는 점에서 매우 효과적인 방법으로 보고되었다 [Davoud, S. et al., Ind. Crop. Prod., 55, 163-172(2014); Chunying, L. et al., J. Sep. Sci., 38, 291-300(2015); Pstsaporn, P. et al., Sep. Purif. Technol., 144, 37-45(2015); Ana, C, S. et al., Trends Food Sci. Technol., 21, 323-331(2010); Ming, G. et al., Food Chem., 175, 181-188(2015)]. 이러한 방법은 마이크로웨이브 또는 초음파를 통해 추출 횟수를 단축시킴으로써 조업시간을 단축하였으나, 높은 회수율을 위해 추가 장치와 비용이 발생할 뿐만 아니라 공정이 복잡하고 위험하며 번거롭고 많은 에너지가 소모되어 산업적 대량 생산 공정에 적용하기에 한계가 있다. 결과적으로, 추출 횟수를 단축하기 위해 요구되는 장치를 최소화 또는 단순화함과 동시에 설비 절감, 에너지 절약뿐만 아니라 공정 편리성(convenient)과 공정 실행 가능성(feasibility)이 있는 고효율 바이오매스 추출 공정의 개발이 여전히 필요한 실정이다. 따라서, 본 발명에서는 음압 캐비테이션 (negative pressure cavitation)을 이용한 추출을 통해 바이오매스로부터 파클리탁셀 회수방법을 획기적으로 개선시킨 새로운 추출방법을 개발하고자 하였다.From an economical point of view, it is very important to first recover paclitaxel contained in biomass in a high yield. Previous literature [Kim et al., Biotechnol. Bioproc. Eng ., 23 , 532-540 (2018)], the recovery process generally involves first extraction with an organic solvent (conventional solvent extraction), methylene chloride, methyl-t-butyl ether, ethanol, isopropyl alcohol, and chloroform. As a result of investigating the extraction tendency using various types of organic solvents such as , diethyl ether, acetone, and methanol, it was found that methanol was the most effective for biomass extraction by obtaining the highest recovery rate with the smallest amount. In addition, it was attempted to increase the recovery rate of paclitaxel from biomass by optimizing methanol concentration, biomass/methanol mixing ratio, extraction time, and number of extractions as major process variables. and time-consuming disadvantages. In 2008, a method for recovering paclitaxel from biomass by extraction using microwaves was reported [Kim et al., Korean Chem. Eng. Res., 58 , 273-279 (2020)], and recently, extraction using ultrasound has been reported as a very effective method in that it can improve the extraction efficiency of the target component by breaking the cell wall [Davoud, S. et al., Ind. Crop. Prod., 55 , 163-172 (2014); Chunying, L. et al., J. Sep. Sci., 38 , 291-300 (2015); Pstsaporn, P. et al., Sep. Purif. Technol ., 144 , 37-45 (2015); Ana, C, S. et al., Trends Food Sci. Technol., 21 , 323-331 (2010); Ming, G. et al., Food Chem ., 175 , 181-188 (2015)]. Although this method shortens the operation time by shortening the number of extractions through microwave or ultrasound, additional equipment and costs are incurred for high recovery rate, and the process is complicated, dangerous, cumbersome, and consumes a lot of energy, so it is applied to industrial mass production processes There is a limit to this. As a result, the development of a high-efficiency biomass extraction process that minimizes or simplifies the equipment required to reduce the number of extractions, and at the same time reduces equipment and energy, as well as process convenience and process feasibility, is still is in need. Therefore, in the present invention, it was attempted to develop a new extraction method that dramatically improved the method of recovering paclitaxel from biomass through extraction using negative pressure cavitation.
본 발명은 상술한 과제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 음압 캐비테이션을 이용한 추출방법을 통해 바이오매스로부터 항암물질인 파클리탁셀의 회수율을 획기적으로 증가시킴과 동시에, 경제적이고 공정이 단순화된 파클리탁셀 추출방법을 제공하는데 목적이 있다.The present invention has been devised to solve the above problems, and provides an economical and simplified process for extracting paclitaxel while dramatically increasing the recovery rate of paclitaxel, an anticancer substance, from biomass through an extraction method using negative pressure cavitation. there is a purpose to
상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 다음의 a) 내지 c) 단계를 포함하는 파클리탁셀 추출방법을 제공한다: a) 파클리탁셀을 포함하는 택서스속 (Taxus genus) 식물체 유래 바이오매스 (biomass)를 수득하는 단계; b) 상기 바이오매스를 유기용매와 혼합하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계의 혼합물에 음압을 가하여 파클리탁셀을 추출하는 단계.In order to solve the above problems, the present invention provides a paclitaxel extraction method comprising the following steps a) to c): a) Taxus genus plant-derived biomass containing paclitaxel (biomass) obtaining; b) mixing the biomass with an organic solvent; and c) extracting paclitaxel by applying negative pressure to the mixture of step b).
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 a) 단계의 바이오매스는 택서스속 식물체, 이의 세포, 이의 세포 조각(cell debris) 및 이의 세포 배양액으로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상을 포함할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the biomass of step a) may include at least one selected from the group consisting of Taxus plants, its cells, its cell debris and its cell culture solution. .
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 b) 단계의 유기용매는 C1 ~ C4의 알코올 및 물로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상을 포함할 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the organic solvent of step b) may include at least one selected from the group consisting of C 1 to C 4 alcohol and water.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 b) 단계의 바이오매스와 유기용매는 1:1 ~ 1:6 (w/v) 비율로 혼합될 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the biomass and the organic solvent in step b) may be mixed in a ratio of 1:1 to 1:6 (w/v).
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 c) 단계의 음압을 가하여 파클리탁셀을 추출하는 단계는 1회 수행될 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the step of extracting paclitaxel by applying the negative pressure of step c) may be performed once.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 c) 단계는 500 mmHg 내지 700 mmHg의 음압을 가하여 캐비테이션 버블을 발생시키는 것일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, step c) may be to generate a cavitation bubble by applying a negative pressure of 500 mmHg to 700 mmHg.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 c) 단계는 20분 이하의 시간 동안 수행될 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, step c) may be performed for 20 minutes or less.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 c) 단계는 0 내지 30℃에서 수행될 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, step c) may be performed at 0 to 30 ℃.
본 발명의 음압 캐비테이션을 이용한 파클리탁셀 추출방법은 음압 캐비테이션 버블 생성 및 붕괴로 세포벽 (세포 표면)을 충분히 파쇄하고, 음압 도입에 의해 추출속도상수, 유효확산계수 및 물질전달계수가 증가하여 세포 내 축적되어 있는 파클리탁셀을 효과적으로 추출 및 회수할 수 있다. 이를 통해, 기존 용매 추출 방법의 한계였던 많은 유기용매 사용과 긴 추출시간 문제를 해결하고, 동시에 마이크로웨이브 또는 초음파를 이용한 추출 공정의 한계였던 공정의 복잡성, 장치의 위험성 및 많은 에너지 소모에 의한 고비용 문제를 획기적으로 개선할 수 있다. 따라서, 본 발명의 파클리탁셀 추출방법은 택서스속(Taxus genus) 식물체 유래 바이오매스(biomass)로부터 항암물질인 파클리탁셀의 상업적 대량생산에 매우 유용하게 활용될 수 있을 것으로 판단된다.In the method of extracting paclitaxel using negative pressure cavitation of the present invention, the cell wall (cell surface) is sufficiently crushed by the generation and collapse of negative pressure cavitation bubbles, and the extraction rate constant, effective diffusion coefficient, and mass transfer coefficient are increased by introducing negative pressure and accumulated in the cell. It is possible to effectively extract and recover paclitaxel in Through this, the problem of the use of many organic solvents and long extraction time, which were the limitations of the existing solvent extraction method, is solved, and at the same time, the complexity of the process, which was the limitation of the extraction process using microwave or ultrasound, and the high cost due to the risk of the device and the high energy consumption can be significantly improved. Therefore, the paclitaxel extraction method of the present invention is considered to be very useful for commercial mass production of anticancer substance paclitaxel from biomass derived from plants of the genus Taxus .
도 1은 바이오매스로부터 파클리탁셀을 추출하는 공정을 나타낸 개략도로, (A)는 기존 용매 추출 방법인 전통적 추출 방법을 나타낸 것이고, (B)는 음압 캐비테이션을 이용한 추출 방법을 나타낸 것이다.
도 2는 상온 (25℃)에서 전통적 추출과 음압 변화 (600 mmHg 및 500 mmHg) 및 조업 시간에 따른 바이오매스로부터의 파클리탁셀 수율 변화를 나타낸 그래프이다. 바이오매스:메탄올의 비율은 1:2 (w/v)이고, 교반 속도는 500 rpm이다.
도 3은 대기압 및 상이한 음압 조건을 이용한 추출 시 발생하는 버블을 관찰한 사진으로, (A)는 대기압 760 mmHg, (B)는 음압 600 mmHg, (C)는 음압 500 mmHg에서의 버블 이미지를 나타낸다.
도 4는 상이한 방법을 이용한 용매 추출로 수득된 바이오매스 시료를 건조시킨 후, 주사전자현미경 (SEM) 분석을 통해 바이오매스 표면을 관찰한 사진으로, (A)는 추출 전, (B)는 기존의 전통적인 용매 추출 방법 (760 mmHg), (C)는 600 mmHg 음압 캐비테이션을 이용한 추출 방법, (D)는 500 mmHg 음압 캐비테이션을 이용한 추출 방법에 대한 주사전자현미경 사진이다.1 is a schematic diagram showing a process for extracting paclitaxel from biomass, (A) shows a conventional extraction method, which is a conventional solvent extraction method, (B) shows an extraction method using negative pressure cavitation.
2 is a graph showing changes in the yield of paclitaxel from biomass according to the conventional extraction and negative pressure changes (600 mmHg and 500 mmHg) and operating time at room temperature (25° C.). The ratio of biomass:methanol is 1:2 (w/v), and the stirring speed is 500 rpm.
3 is a photograph observing bubbles generated during extraction using atmospheric pressure and different negative pressure conditions, (A) is an atmospheric pressure of 760 mmHg, (B) is a negative pressure of 600 mmHg, (C) is a bubble image at a negative pressure of 500 mmHg .
Figure 4 is a photograph of observing the biomass surface through scanning electron microscope (SEM) analysis after drying the biomass sample obtained by solvent extraction using a different method, (A) is before extraction, (B) is the existing of the conventional solvent extraction method (760 mmHg), (C) is an extraction method using 600 mmHg negative pressure cavitation, and (D) is a scanning electron micrograph of the extraction method using 500 mmHg negative pressure cavitation.
상술한 바와 같이, 기존 용매 추출 방법은 높은 수율로 파클리탁셀을 회수하기 위해 많은 양의 유기용매와 시간이 소요되는 단점이 있었다. 마이크로웨이브 또는 초음파를 이용한 추출은 추출 횟수를 단축하였으나, 높은 회수율을 위해 추가 장치와 비용이 발생할 뿐만 아니라 공정이 복잡하고, 위험하며, 번거로운 면이 있고, 많은 에너지가 소모되어 산업적 대량생산 공정에 적용하기에 한계가 있었다. 따라서, 추출 횟수를 단축하기 위해 요구되는 장치를 최소화 및/또는 단순화함과 동시에 설비 절감, 에너지 절약뿐만 아니라 공정 편리성 (convenient)과 공정 실행 가능성 (feasibility)이 있는 고효율 바이오매스 추출 공정 개발이 여전히 필요한 실정이다.As described above, the conventional solvent extraction method has a disadvantage in that a large amount of organic solvent and time are required to recover paclitaxel in high yield. Extraction using microwaves or ultrasound shortens the number of extractions, but for high recovery, additional equipment and costs are incurred, and the process is complicated, dangerous, cumbersome, and consumes a lot of energy, so it is applied to industrial mass production processes There was a limit to doing this. Therefore, the development of a high-efficiency biomass extraction process that minimizes and/or simplifies the equipment required to reduce the number of extractions, and at the same time reduces equipment and energy, as well as process convenience and process feasibility, is still is in need.
이에, 본 발명은 a) 파클리탁셀을 포함하는 택서스속 (Taxus genus) 식물체 유래 바이오매스 (biomass)를 수득하는 단계; b) 상기 바이오매스를 유기용매와 혼합하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계의 혼합물에 음압을 가하여 파클리탁셀을 추출하는 단계를 포함하는 파클리탁셀 추출방법을 제공함으로써, 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 본 발명의 파클리탁셀 추출방법은 기존 용매 추출 공정의 한계였던 많은 유기용매 사용과 긴 추출시간 문제를 해결하고, 동시에 마이크로웨이브 또는 초음파를 이용한 추출 공정의 한계였던 공정의 복잡성 또는 장치의 위험성 및 많은 에너지 소모에 의한 고비용 문제를 획기적으로 개선할 수 있다.Accordingly, the present invention comprises the steps of: a) obtaining a biomass derived from a taxus genus plant containing paclitaxel; b) mixing the biomass with an organic solvent; and c) applying a negative pressure to the mixture of step b) to extract paclitaxel. The paclitaxel extraction method of the present invention solves the problems of using a lot of organic solvent and long extraction time, which were the limitations of the existing solvent extraction process, and at the same time, the complexity of the process or the risk of the device and the consumption of a lot of energy, which were the limitations of the extraction process using microwave or ultrasonic waves can dramatically improve the high cost problem caused by
먼저, 파클리탁셀을 포함하는 택서스속(Taxus genus) 식물체 유래 바이오매스를 수득하는 a) 단계를 설명한다.First, step a) of obtaining a biomass derived from a plant of the genus Taxus including paclitaxel will be described.
본 발명의 파클리탁셀 추출방법에 있어서, 상기 a) 단계의 바이오매스는 택서스속 식물체, 이의 세포, 이의 세포 조각(cell debris) 및 이의 세포 배양액으로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상을 포함할 수 있다.In the paclitaxel extraction method of the present invention, the biomass of step a) may include one or more selected from the group consisting of plants of the genus Taxus, cells thereof, cell debris thereof, and cell cultures thereof.
본 발명의 파클리탁셀 추출방법에 있어서, 파클리탁셀을 추출하고자 하는 대상은 택서스속 식물체의 잎으로부터 얻은 캘러스 (callus)를 이용한 식물세포배양으로부터 회수한 식물세포인 바이오매스 (biomass)인 것이 바람직하다.In the paclitaxel extraction method of the present invention, the target to be extracted paclitaxel is preferably biomass, which is plant cells recovered from plant cell culture using callus obtained from leaves of plants of the genus Taxus.
또한, 상기 택서스속 식물체는 택서스 브레비폴리아(Taxus brevifolia), 택서스 카나덴시스(Taxus canadensis), 택서스 쿠스피다타(Taxus cuspidata), 택서스 바카타(Taxus baccata), 택서스 글로보사(Taxus globosa), 택서스 플로리다나(Taxus floridana), 택서스 월리치아나(Taxus wallichiana), 택서스 메디아(Taxus media) 또는 택서스 치넨시스(Taxus chinensis) 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In addition, the taxus genus plants are Taxus brevifolia ( Taxus brevifolia ), Taxus canadensis ( Taxus canadensis ), Taxus cuspidata ( Taxus cuspidata ), Taxus baccata ( Taxus baccata ), Taxus glow Bossa ( Taxus globosa ), Taxus floridana ( Taxus floridana ), Taxus wallichiana ( Taxus wallichiana ), Taxus media ( Taxus media ) or Taxus chinensis ( Taxus chinensis ) and the like may be included, but are limited thereto it is not
상기 바이오매스를 수득하는 단계는 통상적으로 식물세포 배양액으로부터 바이오매스를 수득하는 방법이라면 특별히 제한하지 않는다.The step of obtaining the biomass is not particularly limited as long as it is a method of obtaining biomass from a conventional plant cell culture medium.
다음으로, 상기 바이오매스를 유기용매와 혼합하는 b) 단계를 설명한다.Next, step b) of mixing the biomass with an organic solvent will be described.
본 발명의 파클리탁셀 추출방법에 있어서, 상기 유기용매는 통상적으로 식물체에서 유효성분을 추출하기 위해 사용하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 C1 ~ C4의 알콜 및 물로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상을 포함할 수 있다.In the paclitaxel extraction method of the present invention, the organic solvent is not particularly limited as long as it is normally used to extract the active ingredient from a plant, but preferably at least one selected from the group consisting of C 1 to C 4 alcohol and water. may include.
상기 유기용매의 구체적인 예로는 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 메틸렌 클로라이드로 이루어진 군에서 선택한 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바이오매스로부터 파클리탁셀을 가급적 많이 회수할 수 있는 유기용매로 바람직하게는 메탄올을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 80 내지 100%의 농도의 메탄올을 사용할 수 있다. 본 발명자의 이전 연구 [Kim, Korean Chem. Eng. Res., 58, 273-279(2020)] 결과에 따르면, 다양한 종류의 유기 용매 (아세톤, 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 메틸렌 클로라이드)를 이용하여 파클리탁셀 추출 효율을 조사한 결과, 다른 유기 용매에 비해 메탄올을 추출 용매로 사용하였을 때, 현저하게 높은 회수율을 나타내었는바, 본 발명에서는 최적의 추출 용매로 메탄올을 선택하여 사용하였다.Specific examples of the organic solvent may be one or a mixture of two or more selected from the group consisting of methanol, ethanol, propanol and methylene chloride, and preferably methanol as an organic solvent capable of recovering as much paclitaxel from biomass as possible. may be used, and more preferably, methanol having a concentration of 80 to 100% may be used. Previous studies of the present inventors [Kim, Korean Chem. Eng. Res., 58 , 273-279 (2020)] According to the results, as a result of investigating the extraction efficiency of paclitaxel using various types of organic solvents (acetone, chloroform, ethanol, methanol, methylene chloride), methanol compared to other organic solvents When used as an extraction solvent, a remarkably high recovery rate was exhibited. In the present invention, methanol was selected and used as the optimal extraction solvent.
또한, 상기 b) 단계의 바이오매스와 유기용매는 1:1 ~ 1:6(w/v) 비율로 혼합될 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니며, 통상적으로 식물체에서 유효성분을 추출하기 위해 사용할 수 있는 비율이라면 특별히 제한하지 않는다. 본 발명의 일구현예에서는 최적의 추출 효율을 위하여 바이오매스와 유기용매를 1:2(w/v) 비율로 일정하게 혼합하였다.In addition, the biomass and organic solvent of step b) may be mixed in a ratio of 1:1 to 1:6 (w/v), but is not limited thereto, and can be used to extract active ingredients from plants in general. If there is a ratio, it is not particularly limited. In one embodiment of the present invention, the biomass and the organic solvent were uniformly mixed at a ratio of 1:2 (w/v) for optimal extraction efficiency.
상기 최적화된 추출 용매의 종류, 농도 및 비율은 바이오매스를 추출 대상으로 하였을 때 파클리탁셀 회수율을 극대화할 수 있는 조건이므로, 추출 대상이 달라짐에 따라, 추출 대상에 따른 최적화된 추출 용매의 종류, 농도 및 비율을 확인하기 위한 수많은 반복 실험이 별도로 요구된다. Since the type, concentration and ratio of the optimized extraction solvent are conditions that can maximize the recovery rate of paclitaxel when biomass is extracted as the target, as the extraction target changes, the type, concentration and ratio of the optimized extraction solvent according to the extraction target Numerous replicates to confirm the ratio are separately required.
다음으로, 상기 b) 단계의 혼합물에 음압을 가하여 파클리탁셀을 추출하는 c) 단계에 대해 설명한다.Next, step c) of extracting paclitaxel by applying negative pressure to the mixture of step b) will be described.
본 발명에서, 용어 "음압 (negative pressure)"은 대기압 (760 mmHg)보다 낮은 압력을 말한다. 따라서, 본 발명의 파클리탁셀 추출방법에 있어서, 상기 c) 단계의 음압은 대기압 760 mmHg보다 낮은 압력을 지칭하며, 구체적으로 500 mmHg 내지 700 mmHg, 바람직하게는 500 mmHg 내지 600 mmHg의 범위의 압력을 말한다.In the present invention, the term "negative pressure" refers to a pressure lower than atmospheric pressure (760 mmHg). Therefore, in the paclitaxel extraction method of the present invention, the negative pressure in step c) refers to a pressure lower than the atmospheric pressure of 760 mmHg, specifically 500 mmHg to 700 mmHg, preferably 500 mmHg to 600 mmHg It refers to a pressure in the range .
본 발명의 파클리탁셀 추출방법에 있어서, 상기 c) 단계는 전술한 범위의 음압을 가하여 캐비테이션 버블을 발생시킴으로써 수행될 수 있다.In the paclitaxel extraction method of the present invention, step c) may be performed by applying a negative pressure in the above-described range to generate cavitation bubbles.
본 발명에서 용어 "음압 캐비테이션 (negative pressure cavitation)은 음압으로 야기되는 캐비테이션으로, 액체-고체 시스템 (liquid-solid system)에 도입되어 추출 용매와 매트릭스 사이의 교류 (turbulence), 충돌 (collision) 및 물질 전달을 증가시킨다. In the present invention, the term "negative pressure cavitation" refers to cavitation caused by negative pressure, which is introduced into a liquid-solid system to induce turbulence, collision, and material between the extraction solvent and the matrix. increase transmission.
본 발명의 구체적인 일실시예에서는 파클리탁셀 추출 시 음압이 추출 효율에 미치는 영향을 평가하기 위해, 압력 조건을 760 mmHg, 600 mmHg 및 500 mmHg로 달리하여 각각의 조건에서의 파클리탁셀 회수율을 평가하였다. 그 결과, 도 2에서 확인되는 바와 같이 음압 도입이 없는 전통적 용매 추출 방법의 경우, 파클리탁셀 회수율이 77%였으나, 600 mmHg 및 500 mmHg에서는 파클리탁셀 회수율이 각각 87% 및 100%를 나타내어 진공도가 증가할수록 파클리탁셀 회수율이 증가됨을 알 수 있었다.In a specific embodiment of the present invention, in order to evaluate the effect of negative pressure on extraction efficiency during paclitaxel extraction, the pressure conditions were changed to 760 mmHg, 600 mmHg, and 500 mmHg to evaluate the recovery rate of paclitaxel under each condition. As a result, as shown in FIG. 2 , in the case of the traditional solvent extraction method without negative pressure introduction, the recovery rate of paclitaxel was 77%, but at 600 mmHg and 500 mmHg, the recovery rates of paclitaxel were 87% and 100%, respectively. It was found that the recovery rate was increased.
본 발명에서 용어 "진공도 (degree of vacuum)"는 대기압과의 차이를 말한다.In the present invention, the term “degree of vacuum” refers to a difference from atmospheric pressure.
만일, 500 mmHg 미만의 압력에서 추출을 수행하는 경우, 추출 용매의 과도한 증발과 이로 인한 파클리탁셀 회수율 감소로 추출 효율이 급격히 감소할 수 있고, 700 mmHg를 초과하는 압력에서 추출을 수행하는 경우, 대기압에서 추출을 수행하였 때와 비교하여 파클리탁셀 회수율 증가 효과가 미미할 수 있다. 따라서, 파클리탁셀 추출 효율을 극대화하기 위해서는 상기 범위 내의 음압에서 파클탁셀을 추출하는 것이 바람직하다.If the extraction is performed at a pressure of less than 500 mmHg, the extraction efficiency may be sharply reduced due to excessive evaporation of the extraction solvent and a decrease in the recovery rate of paclitaxel resulting therefrom. The effect of increasing the recovery rate of paclitaxel may be insignificant compared to when extraction is performed. Therefore, in order to maximize paclitaxel extraction efficiency, it is preferable to extract paclitaxel at a negative pressure within the above range.
본 발명의 파클리탁셀 추출방법에 있어서, 음압 하에 파클리탁셀을 추출하는 c) 단계는 단 1회 수행하는 것만으로도 바이오매스로부터 파클리탁셀을 약 90 내지 100%까지 회수할 수 있다.In the paclitaxel extraction method of the present invention, step c) of extracting paclitaxel under negative pressure can be performed only once to recover about 90 to 100% of paclitaxel from biomass.
이때, 상기 c) 단계는 20분 이하의 시간 동안 수행될 수 있다. 바람직하게는 5분 내지 20분, 보다 바람직하게는 10분 내지 20분 동안 수행될 수 있다.In this case, step c) may be performed for 20 minutes or less. Preferably it may be carried out for 5 minutes to 20 minutes, more preferably for 10 minutes to 20 minutes.
만일, 음압 캐비테이션을 이용한 추출이 5분 미만으로 수행되는 경우, 바이오매스로부터 파클리탁셀을 충분히 회수하지 못할 수 있고, 20분을 초과하여 수행되는 경우, 시간 경과에 따른 파클리탁셀 회수율 증가 효과가 미미하여 불필요한 조업 시간의 증가를 야기할 수 있다.If extraction using negative pressure cavitation is performed for less than 5 minutes, it may not be possible to sufficiently recover paclitaxel from biomass, and if it is performed for more than 20 minutes, the effect of increasing the recovery rate of paclitaxel over time is insignificant and unnecessary operation time may cause an increase in
상기 결과를 통해, 본 발명의 음압 캐비테이션을 이용한 파클리탁셀 추출방법은 기존의 최적화된 용매 추출 방법과 비교하여 조업 시간이 현저하게 단축되고, 조업 시간 단축에 따른 추출 효율이 획기적으로 증가한다는 것을 확인할 수 있었다.Through the above results, it was confirmed that the paclitaxel extraction method using negative pressure cavitation of the present invention significantly shortened the operation time compared to the conventional optimized solvent extraction method, and the extraction efficiency according to the reduction in operation time was significantly increased. .
본 발명의 파클리탁셀 추출방법은 특별히 고안된 음압 캐비테이션 장치 없이 시판되는 진공 조절기 (vacuum controller) 및 진공 펌프 (vacuum pump)만을 이용하여 추출 용매 내로 음압을 가하는 방식으로 수행될 수 있다. The paclitaxel extraction method of the present invention can be performed by applying a negative pressure into the extraction solvent using only a commercially available vacuum controller and a vacuum pump without a specially designed negative pressure cavitation device.
일반적으로 추출 시간이 길어질수록 장시간 캐비테이션 버블을 발생시킬 수 있도록 질소와 같은 기타 가스를 추출 용매 내로 도입하는 것이 요구될 수 있으나, 본 발명의 파클리탁셀 추출 방법은 20분 이하의 짧은 시간 안에 조업이 완료되므로 추출 과정에서 추출 용기에 질소를 도입하는 것은 필요치 않다. 따라서, 본 발명의 음압 캐비테이션을 이용한 파클리탁셀 추출방법은 추출 횟수를 단축하기 위해 요구되는 장치를 최소화 및/또는 단순화함으로써, 마이크로웨이브 또는 초음파를 이용한 추출 공정의 한계였던 공정의 복잡성, 장치의 위험성 및 많은 에너지 소모에 의한 고비용 문제를 획기적으로 개선할 수 있다.In general, as the extraction time increases, it may be required to introduce other gases such as nitrogen into the extraction solvent to generate cavitation bubbles for a long time. It is not necessary to introduce nitrogen into the extraction vessel during the extraction process. Therefore, the paclitaxel extraction method using negative pressure cavitation of the present invention minimizes and/or simplifies the apparatus required to reduce the number of extractions, thereby limiting the extraction process using microwaves or ultrasound, the complexity of the process, the risk of the apparatus, and many The high cost problem caused by energy consumption can be remarkably improved.
또한, 본 발명의 구체적인 다른 일실시예에서는 음압 케비테이션 추출 시 버블 발생 유무를 관찰하였다. 대기압에서 수행된 전통적 용매 추출의 경우, 도 3의 (A)에서 확인되는 바와 같이 캐비테이션 버블이 전혀 관찰되지 않은 반면, 음압 600 mmHg 및 500 mmHg을 이용한 추출의 경우, 도 3의 (B) 및 (C)에서 확인되는 바와 같이 캐비테이션 버블이 발생하였으며, 진공도가 증가할수록 캐비테이션 버블이 더 많이 발생한다는 것을 알 수 있었다. 즉, 음압으로 인해 캐비테이션 버블이 발생하여 용매-용질 간 물질 전달 속도가 향상되어 결과적으로 파클리탁셀 추출 효율이 현저하게 향상되었다.In addition, in another specific embodiment of the present invention, the presence or absence of bubbles during extraction of negative pressure cavitation was observed. In the case of the conventional solvent extraction performed at atmospheric pressure, no cavitation bubbles were observed as shown in (A) of FIG. 3, whereas in the case of extraction using negative pressures of 600 mmHg and 500 mmHg, (B) and ( As shown in C), cavitation bubbles occurred, and it was found that as the vacuum degree increased, more cavitation bubbles occurred. That is, cavitation bubbles were generated due to the negative pressure, and the mass transfer rate between the solvent-solute was improved, and as a result, the paclitaxel extraction efficiency was significantly improved.
한편, 본 발명의 구체적인 일실시예에서는 주사전자현미경(MIRA LMH; Tescan, Czech Republic)을 이용하여 대기압에서 수행되는 전통적 용매 추출 방법 및 음압 캐비테이션을 이용한 추출 후 바이오매스 표면을 관찰하였다. 추출 전 바이오매스의 경우, 도 4의 (A)에서 확인되는 바와 같이 표면이 매우 매끄러운 형태를 보였으며, 전통적 추출 (760 mmHg) 후에는 도 4의 (B)에 나타난 바와 같이 바이오매스 표면이 약간 주름진 형태를 보였다.Meanwhile, in a specific embodiment of the present invention, the biomass surface was observed after extraction using a conventional solvent extraction method and negative pressure cavitation performed at atmospheric pressure using a scanning electron microscope (MIRA LMH; Tescan, Czech Republic). In the case of the biomass before extraction, the surface was very smooth as confirmed in FIG. 4(A), and after the conventional extraction (760 mmHg), as shown in FIG. appeared wrinkled.
반면, 음압 600 mmHg 및 500 mmHg 조건의 캐비테이션 버블을 이용한 추출의 경우, 도 4의 (C) 및 (D)에서 확인되는 바와 같이 바이오매스 표면아 음압 캐비테이션 버블의 붕괴 (collapse)에 의한 강한 충격으로 매우 거칠고 오그라든 (파쇄된) 형태를 보였으며, 진공도가 증가할수록 표현이 더 주름진 형태를 보였다. 즉, 세포 내 함유되어 있는 파클리탁셀이 효과적으로 추출될 수 있도록 충분히 오그라든 (파쇄된) 표면이 형성되었고, 결과적으로 추출 효율이 획기적으로 향상되었다. 이러한 결과로부터 음압 캐비테이션을 이용한 추출로 바이오매스로부터 파클리탁셀을 효과적으로 추출/회수할 수 있음을 확인할 수 있었다.On the other hand, in the case of extraction using cavitation bubbles under the conditions of negative pressure of 600 mmHg and 500 mmHg, as confirmed in (C) and (D) of FIG. It showed a very rough and shrunken (crushed) form, and as the degree of vacuum increased, the expression became more wrinkled. That is, a sufficiently shrunken (crushed) surface was formed so that the paclitaxel contained in the cell could be effectively extracted, and as a result, the extraction efficiency was remarkably improved. From these results, it was confirmed that paclitaxel could be effectively extracted/recovered from biomass by extraction using negative pressure cavitation.
본 발명의 파클리탁셀 추출방법에 있어서, 상기 c) 단계의 음압 캐비테이션을 이용한 추출은 0 내지 30℃, 바람직하게는 5 내지 30℃, 보다 바람직하게는 10 내지 30℃에서 수행될 수 있다.In the paclitaxel extraction method of the present invention, the extraction using negative pressure cavitation in step c) may be performed at 0 to 30°C, preferably 5 to 30°C, more preferably 10 to 30°C.
본 발명에서는 바이오매스에 일정 비율의 유기 용매를 첨가한 후, 상온을 포함하는 온도 범위 (예를 들어, 5 내지 30℃)에서 500 mmHg 내지 700 mmHg의 음압 범위에서 20분 이하의 동안 추출을 수행하는 것만으로도 파클리탁셀의 회수율을 현저하게 개선시킬 수 있으므로, 고온 추출에 의한 추가 에너지가 필요로 하지 않아 대량생산 공정에 적용하기에 적합하다.In the present invention, after adding a certain proportion of an organic solvent to the biomass, extraction is performed for 20 minutes or less in a negative pressure range of 500 mmHg to 700 mmHg in a temperature range including room temperature (eg, 5 to 30° C.) Since it is possible to significantly improve the recovery rate of paclitaxel just by doing it, it does not require additional energy by high-temperature extraction, so it is suitable for mass production process.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 단, 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는바, 이하에서 기술하는 특정 실시예 및 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발 명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니다. 본 발명의 범위는 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, since the present invention can have various changes and can have various forms, the specific examples and descriptions described below are only for helping the understanding of the present invention, and the present invention is limited to specific disclosed forms it's not meant to be It should be understood that the scope of the present invention includes all modifications, equivalents and substitutes included in the spirit and scope of the present invention.
바이오매스 준비biomass preparation
본 실시예에 사용된 식물세포 배양액은 택서스 치넨시스 (Taxus chinensis)의 잎으로부터 얻은 세포주 (cell line)를 이용하여 배양하였다. 택서스 치넨시스 (Taxus chinensis)로부터 기원된 현탁액 세포는 24℃ 암조건 (darkness condition)에서 150 rpm으로 교반하여 배양하였다. 현탁 (suspension) 세포는 수정된 갬보그 B5 배지 (Gamborg's B5 medium), 30 g/L 수크로스, 10 mM 나프탈렌 아세트산 (naphthalene acetic acid), 0.2 μM 6-벤질아미노퓨린 (6-benzylaminopurine), 1 g/L 카제인 가수분해물 (casein hydrolysate), 1 g/L 2-(N-모르폴리노) 에탄술폰산 (2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid)에서 배양하였다. 세포 배양은 2 주마다 새로운 배지(medium)로 갈아주었고, 배양 시간을 연장시키기 위해 7 일과 21 일째 되는 날에 1∼2% (w/v)의 말토스 (maltose)를 첨가해 주고, 유도인자 (elicitor)로서 배양 초기에 4 mM의 AgNO3를 첨가해 주었다[7,19]. 식물세포배양 후 배양액으로부터 데칸터 (decanter; Westfalia, CA150 Claritying Decanter)와 고속원심분리기 (α-Laval, BTPX205GD-35CDEEP)를 이용하여 식물세포와 세포조각 (cell debris)을 회수하였다. 회수한 식물세포와 세포조각을 합하여 바이오매스라 하였다.The plant cell culture medium used in this example was cultured using a cell line obtained from the leaves of Taxus chinensis . Suspension cells derived from Taxus chinensis were cultured by stirring at 150 rpm at 24° C. in dark conditions. Suspension cells were prepared using modified Gamborg's B5 medium, 30 g/L sucrose, 10 mM naphthalene acetic acid, 0.2 μM 6-benzylaminopurine, 1 g Incubated in /L casein hydrolysate, 1 g/L 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid). Cell culture was replaced with a fresh medium every 2 weeks, and in order to extend the culture time, 1-2% (w/v) maltose was added on the 7th and 21st days, and inducer As an elicitor, 4 mM AgNO 3 was added at the beginning of the culture [7,19]. After plant cell culture, plant cells and cell debris were recovered from the culture medium using a decanter (Westfalia, CA150 Claritying Decanter) and a high-speed centrifuge (α-Laval, BTPX205GD-35CDEEP). The recovered plant cells and cell fragments were combined and referred to as biomass.
음압 캐비테이션을 이용한 추출 (negative pressure cavitation extraction)Negative pressure cavitation extraction
식물세포배양에 의해 생산된 파클리탁셀은 대부분 바이오매스(식물세포)에 포함되어 있으며, 기존 문헌 [Kim et al., Biotechnol. Bioproc. Eng., 23, 532-540(2018)에 따르면, 여러 가지 유기용매를 이용하여 추출 효율을 조사한 결과 메탄올이 가장 효과적이었다. 주요 공정 변수의 최적화를 위하여, 기존 문헌 [Kim et al., Korean Chem. Eng. Res., 58, 273-279(2020)]에서 확인된 1:2 (w/v)의 최적의 바이오매스:메탄올 비로 일정하게 유지하고, 음압 진공도와 조업 시간에 따른 영향을 조사하였다.Most paclitaxel produced by plant cell culture is contained in biomass (plant cells), and the existing literature [Kim et al., Biotechnol. Bioproc. According to Eng ., 23 , 532-540 (2018), as a result of investigating extraction efficiency using various organic solvents, methanol was the most effective. For optimization of key process parameters, the existing literature [Kim et al., Korean Chem. Eng. Res., 58 , 273-279 (2020)], the optimal biomass:methanol ratio of 1:2 (w/v) was kept constant, and the effect of negative pressure vacuum degree and operating time was investigated.
실시예 1의 식물세포 배양액으로부터 회수한 바이오매스와 메탄올의 비를 1:2 (w/v)로 하고, 추출 온도를 25℃로 설정한 후, 진공조절기 (vacuum controller unit; EYELA NVC-3000, Japan)와 다이아프램 진공 펌프 (diaphragm vacuum pump; EYELA NVP-1000, Japan)를 이용하여 추출 용액 내로 음압을 가하였다. 이때, 진공도를 500, 600 및 760 mmHg로 각각 달리하여 파클리탁셀 추출 효율에 미치는 영향을 조사하였다. 또한, 조업 시간을 각각 1, 3, 5, 10 및 20분으로 변화시켜 교반 (~500 rpm) 하에 1 회 추출하였다. 추출 후, 여과지 (185 mm, ADVANTEC)로 감압 여과하여 파클리탁셀 추출 여액을 회수하고, 농축기 (CCA-1100, EYELA, Japan)를 이용하여 농축한 다음 40 ℃, 760 mmHg에서 하룻밤 동안 완전 진공 건조하였다. 건조된 미가공 파클리탁셀 (crude paclitaxel)을 HPLC 분석을 통해 파클리탁셀 순도와 수율을 측정하였다. The ratio of biomass and methanol recovered from the plant cell culture solution of Example 1 was 1:2 (w/v), and the extraction temperature was set to 25° C., and then a vacuum controller unit (EYELA NVC-3000, Japan) and a diaphragm vacuum pump (EYELA NVP-1000, Japan) were used to apply negative pressure into the extraction solution. At this time, the effect on paclitaxel extraction efficiency was investigated by varying the degree of vacuum to 500, 600 and 760 mmHg, respectively. In addition, the operation time was changed to 1, 3, 5, 10 and 20 minutes, respectively, and extraction was performed once under stirring (~500 rpm). After extraction, the paclitaxel extraction filtrate was collected by filtration under reduced pressure with filter paper (185 mm, ADVANTEC), concentrated using a concentrator (CCA-1100, EYELA, Japan), and then completely vacuum dried at 40° C., 760 mmHg overnight. Purity and yield of paclitaxel were measured from dried crude paclitaxel through HPLC analysis.
파클리탁셀 함량 분석을 위해 HPLC 시스템 (SCL-10AVP, Shimadzu, Japan)과 캅셀팩 C18 (Capcell Pak C18; 250 Х 4.6 mm, Shiseido, Japan) 칼럼을 사용하였다. 이동상은 증류수와 아세토니트릴 혼합 용액 (65/35~35/65, v/v, 구배용매조성법)을 유속 1.0 ㎖/분으로 흘려주었다. 시료 주입량은 20 ㎕이며 227 nm에서 UV에 의해 검출하였다. HPLC 분석은 표준정량곡선을 이용하였으며 표준시료는 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich) 제품 (순도: >97%)을 사용하였다For the analysis of paclitaxel content, an HPLC system (SCL-10AVP, Shimadzu, Japan) and a Capcell Pak C 18 (Capcell Pak C 18 ; 250 Х 4.6 mm, Shiseido, Japan) column were used. For the mobile phase, distilled water and a mixed solution of acetonitrile (65/35~35/65, v/v, gradient solvent composition method) were flowed at a flow rate of 1.0 ml/min. The sample injection amount was 20 μl and was detected by UV at 227 nm. For HPLC analysis, a standard quantitation curve was used, and the standard sample was a Sigma-Aldrich product (purity: >97%).
종래의 전통적 추출 방법과 본 발명의 음압 캐비테이션을 이용한 바이오매스 추출 방법을 도 1에 비교하여 나타내었다. 또한, 파클리탁셀 수율 (회수율)은 다음과 같이 계산하였다.The conventional conventional extraction method and the biomass extraction method using negative pressure cavitation of the present invention are shown in comparison with FIG. 1 . In addition, the yield (recovery rate) of paclitaxel was calculated as follows.
[수학식 1][Equation 1]
도 2에서 확인되는 바와 같이, 음압 도입이 없는 전통적 추출 (conventional solvent extraction) 방법의 경우 파클리탁셀 회수율은 77%를 나타낸 반면, 추출 시 음압 진공도가 각각 600 및 500 mmHg로 도입된 경우 파클리탁셀 회수율은 각각 87% 및 100%를 나타내어 진공도가 증가할수록 파클리탁셀 회수율이 증가되었다. 또한, 조업 시간이 증가할수록 파클리탁셀의 회수율이 증가하였다. 이러한 결과는 음압 캐비테이션 버블의 붕괴 (collapse)에 의해 세포벽을 파쇄하여 세포 내 함유되어 있는 파클리탁셀이 효과적으로 추출되어 추출 효율이 향상된 것으로 판단된다. 그러나, 음압 500 mmHg 미만에서는 추출 용매로 사용한 메탄올의 과도한 증발과 이로 인한 추출 회수율 감소로 조업에 어려움이 있었다.As can be seen in FIG. 2 , in the case of the conventional solvent extraction method without negative pressure introduction, the recovery rate of paclitaxel was 77%, whereas when the negative pressure vacuum level was introduced at 600 and 500 mmHg during extraction, the recovery rate of paclitaxel was 87, respectively. % and 100%, as the degree of vacuum increased, the recovery rate of paclitaxel was increased. In addition, as the operation time increased, the recovery rate of paclitaxel increased. These results indicate that the cell wall is disrupted by the collapse of the negative pressure cavitation bubble, and the paclitaxel contained in the cell is effectively extracted, thereby improving the extraction efficiency. However, at a negative pressure of less than 500 mmHg, there was a difficulty in operation due to excessive evaporation of methanol used as an extraction solvent and a decrease in extraction recovery rate due to this.
음압 캐비테이션 추출 시 버블 형태 관찰Observation of bubble shape during negative pressure cavitation extraction
실시예 2의 음압 캐비테이션 추출 시 버블의 형태를 관찰하였다. 대기압 (760 mmHg) 추출의 경우, 도 3의 (A)에서 확인되는 바와 같이 캐비테이션 버블이 전혀 관찰되지 않았다. 이에 반해, 음압 600 mmHg 및 500 mmHg을 이용한 추출 (1 회 추출)의 경우, 도 3의 (B) 및 (C)에서 확인되는 바와 같이 캐비테이션 버블이 발생하였으며, 진공도가 증가할수록 캐비테이션 버블이 더 많이 발생한다는 것을 알 수 있었다. 즉, 음압으로 인해 캐비테이션 버블이 발생하여 용매-용질 간 물질 전달 속도가 향상되어 결과적으로 파클리탁셀 추출 효율이 효과적으로 향상되었다. 또한, 대기압 추출에 비해 음압 600 mmHg 및 500 mmHg의 조건에서 추출 속도 상수 (extraction rate constant)는 각각 20% 및 36% 증가하였고, 파클리탁셀의 유효확산계수 (effective diffusion coefficient)는 각각 19% 및 27% 증가하였으며, 물질전달계수 (mass transfer coefficient)는 각각 59% 및 66% 증가하였다. 이러한 결과로부터 음압 캐비테이션을 이용한 추출로 바이오매스로부터 파클리탁셀을 효과적으로 추출/회수할 수 있음을 확인할 수 있었다.The shape of the bubble was observed during the negative pressure cavitation extraction of Example 2. In the case of atmospheric pressure (760 mmHg) extraction, no cavitation bubbles were observed as shown in (A) of FIG. 3 . On the other hand, in the case of extraction (one extraction) using negative pressure of 600 mmHg and 500 mmHg, cavitation bubbles occurred as shown in (B) and (C) of FIG. 3, and as the degree of vacuum increased, the number of cavitation bubbles increased. was known to occur. That is, cavitation bubbles were generated due to negative pressure, and the mass transfer rate between solvent-solute was improved, and as a result, paclitaxel extraction efficiency was effectively improved. In addition, the extraction rate constant increased by 20% and 36%, respectively, under the conditions of negative pressure of 600 mmHg and 500 mmHg compared to atmospheric pressure extraction, and the effective diffusion coefficient of paclitaxel was 19% and 27%, respectively. increased, and the mass transfer coefficient increased by 59% and 66%, respectively. From these results, it was confirmed that paclitaxel could be effectively extracted/recovered from biomass by extraction using negative pressure cavitation.
주사전자현미경 (SEM) 분석을 통한 바이오매스의 형태 조사Investigation of the morphology of biomass through scanning electron microscopy (SEM) analysis
바이오매스 표면을 관찰하기 위하여 주사전자현미경 (MIRA LMH; Tescan, Czech Republic)을 이용하였다. 분석량은 1 mg이며, 가속 전압 10-15 kV에서 추출 전후의 바이오매스 형태를 조사하였다.A scanning electron microscope (MIRA LMH; Tescan, Czech Republic) was used to observe the biomass surface. The amount of analysis is 1 mg, and the biomass form before and after extraction was investigated at an accelerating voltage of 10-15 kV.
추출 전 바이오매스는 도 4의 (A)에서 확인되는 바와 같이 표면이 매우 매끄러운 형태를 보였으며, 전통적 추출 (760 mmHg) 후에는 도 4의 (B)에 나타난 바와 같이 바이오매스 표면이 약간 주름진 형태를 보였다. 음압 600 mmHg 및 500 mmHg 조건의 캐비테이션 버블을 이용한 추출의 경우, 도 4의 (C) 및 (D)에서 확인되는 바와 같이 바이오매스 표면아 음압 캐비테이션 버블의 붕괴 (collapse)에 의한 강한 충격으로 매우 거칠고 오그라든 (파쇄된) 형태를 보였으며, 음압 진공도가 증가할수록 표면이 더 주름진 형태를 보였다 (도 4의 (C): 음압 600 mmHg, 도 4의 (D): 음압 500 mmHg). 즉, 세포 내 함유되어 있는 파클리탁셀이 모두 추출될 수 있도록 충분히 오그라든 (파쇄된) 표면이 형성되고, 이에 따라 추출 효율이 현저하게 향상되었다. 이러한 결과로부터 음압 캐비테이션 버블을 이용한 추출로 바이오매스로부터 파클리탁셀을 효과적으로 추출/회수할 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 음압 캐비테이션 버블 유무에 관계없이 바이오매스 추출에서 수득된 파클리탁셀 순도는 ~4.5%로 거의 차이가 없음을 알 수 있었다 (데이터 미도시).Before extraction, the biomass had a very smooth surface as shown in FIG. 4A, and after conventional extraction (760 mmHg), the biomass surface was slightly wrinkled as shown in FIG. showed In the case of extraction using cavitation bubbles under negative pressure of 600 mmHg and 500 mmHg, as confirmed in (C) and (D) of FIG. 4, the biomass surface is very rough due to the strong impact caused by the collapse of the negative pressure cavitation bubble. It showed a shrunken (crushed) form, and the surface showed a more wrinkled form as the negative pressure vacuum level increased (FIG. 4(C):
상기와 같은 결과를 통해, 전통적 추출 방법의 한계였던 많은 유기용매의 사용과 긴 추출 시간 문제를 해결하고, 동시에 마이크로웨이브 또는 초음파를 이용한 추출 공정의 한계였던 공정의 복잡성, 장치의 위험성 및 많은 에너지 소모에 의한 고비용 문제를 획기적으로 개선할 수 있었다.Through the above results, the problem of the use of many organic solvents and long extraction time, which were the limitations of the traditional extraction method, is solved, and at the same time, the complexity of the process, the risk of the device, and the energy consumption, which were the limitations of the extraction process using microwave or ultrasonic It was possible to significantly improve the high cost problem caused by
Claims (8)
a) 파클리탁셀을 포함하는 택서스속 (Taxus genus) 식물체 유래 바이오매스 (biomass)를 수득하는 단계;
b) 상기 바이오매스를 유기용매와 혼합하는 단계; 및
c) 상기 b) 단계의 혼합물에 음압을 가하여 파클리탁셀을 추출하는 단계.A method for extracting paclitaxel comprising the following steps a) to c):
a) obtaining a biomass derived from a taxus genus plant containing paclitaxel;
b) mixing the biomass with an organic solvent; and
c) extracting paclitaxel by applying negative pressure to the mixture of step b).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210057407A KR102573289B1 (en) | 2021-05-03 | 2021-05-03 | Extraction method of paclitaxel using negative pressure cavitation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210057407A KR102573289B1 (en) | 2021-05-03 | 2021-05-03 | Extraction method of paclitaxel using negative pressure cavitation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220150101A true KR20220150101A (en) | 2022-11-10 |
| KR102573289B1 KR102573289B1 (en) | 2023-08-30 |
Family
ID=84101767
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210057407A KR102573289B1 (en) | 2021-05-03 | 2021-05-03 | Extraction method of paclitaxel using negative pressure cavitation |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102573289B1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20170019291A (en) * | 2015-08-11 | 2017-02-21 | 공주대학교 산학협력단 | Pre-purification of paclitaxel comprising pre-treatment of paclitaxel with water |
| KR20170106660A (en) * | 2016-03-04 | 2017-09-22 | 공주대학교 산학협력단 | Extraction method of paclitaxel using ultrasound-assisted extraction |
| KR20210147374A (en) * | 2020-05-28 | 2021-12-07 | 공주대학교 산학협력단 | Fractional precipitation method using gas bubbles in purifying paclitaxel |
-
2021
- 2021-05-03 KR KR1020210057407A patent/KR102573289B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20170019291A (en) * | 2015-08-11 | 2017-02-21 | 공주대학교 산학협력단 | Pre-purification of paclitaxel comprising pre-treatment of paclitaxel with water |
| KR20170106660A (en) * | 2016-03-04 | 2017-09-22 | 공주대학교 산학협력단 | Extraction method of paclitaxel using ultrasound-assisted extraction |
| KR20210147374A (en) * | 2020-05-28 | 2021-12-07 | 공주대학교 산학협력단 | Fractional precipitation method using gas bubbles in purifying paclitaxel |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Trends in Food Science & Technology 52 (2016) p.98~108, "Negative pressure cavitation extraction: A novel method for extraction of food bioactive compounds from plant materials" (2016.04.16.)* * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102573289B1 (en) | 2023-08-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH08501792A (en) | Method for obtaining 10-deacetylbaccatin ▲ I ▼ ▲ I ▼ ▲ I ▼ | |
| KR102440644B1 (en) | Fractional precipitation method using gas bubbles in purifying paclitaxel | |
| KR101789409B1 (en) | Extraction method of paclitaxel using ultrasound-assisted extraction | |
| CN107189949B (en) | Rhizopus oryzae LJH3 and application thereof in preparation of genistein by biotransformation of sophoricoside | |
| CN104726347B (en) | One plant of fox excrement mould fungal bacterial strain and the method for preparing left-handed 7 hydroxyl butylphenyl phthaleine using the bacterial strain | |
| KR102090882B1 (en) | Fractional precipitation method performed by ultrasound treatment in purifying paclitaxel | |
| CN107893033B (en) | Aspergillus fumigatus SQH4 and application thereof in preparation of taxifolin by biotransformation method | |
| Min et al. | Study of the extraction kinetics and calculation of effective diffusivity and mass transfer coefficient in negative pressure cavitation extraction of paclitaxel from Taxus chinensis | |
| Yang et al. | Fermentation engineering for enhanced paclitaxel production by taxus media endophytic fungus MF-5 (Alternaria sp.) | |
| CN105132472B (en) | The purposes of one seed sand streptomycete and the production method of vanillic aldehyde | |
| KR102573289B1 (en) | Extraction method of paclitaxel using negative pressure cavitation | |
| Kim et al. | Elucidation of the mechanism and kinetics of ultrasonic extraction of paclitaxel from plant cell cultures of Taxus chinensis | |
| CN1227243C (en) | Method of high effect preparing rhoxadunol | |
| KR20220135587A (en) | Extraction method of paclitaxel using gas bubble | |
| JP4435988B2 (en) | Method for isolating 10-deacetyl baccatin III from the recoverable part of Taxus sp. Plants | |
| KR101756529B1 (en) | Pre-treatment method of paclitaxel extract using water | |
| WO2013171424A1 (en) | Strain producing turanose and uses thereof | |
| CN113736835A (en) | Industrial preparation process for producing taxol by fermenting taxus chinensis endophytic fungi mutant | |
| CN106754575B (en) | Streptomyces strain and method for preparing echinomycin by using same | |
| KR102572099B1 (en) | Pre-treatment method of paclitaxel extract through a tandem water and hexane washing and purification method of paclitaxel using the same | |
| KR102558908B1 (en) | Fractional precipitation method performed by introducing negative pressure cavitation in purifying paclitaxel | |
| KR20210007265A (en) | Method for removing residual solvent from paclitaxel | |
| KR102372632B1 (en) | Adsorption method of paclitaxel using ultrasonic cavitation bubbles or gas bubbles | |
| CN115976093B (en) | Method for preparing orcein by using aspergillus oryzae | |
| CN110343639B (en) | Streptomyces producing 15(S) -O-ethyl rapamycin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |