KR102440644B1 - Fractional precipitation method using gas bubbles in purifying paclitaxel - Google Patents
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Abstract
본 발명은 파클리탁셀 정제 시 가스 버블을 이용한 분별침전방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 파클리탁셀의 정제 시 분별침전단계에서 파클리탁셀을 포함하는 침전 용액에 가스 버블을 주입하여 분별침전 시간을 획기적으로 단축시킨 분별침전방법, 및 상기 분별침전방법을 수행하여 전체 공정 시간을 현저하게 단축시킬 뿐만 아니라 기존의 파클리탁셀 정제방법과 유사한 수준의 수율 및 순도의 파클리탁셀을 수득할 수 있는 파클리탁셀 정제방법에 관한 것이다.The present invention relates to a fractionation precipitation method using gas bubbles during purification of paclitaxel, and more particularly, fractionation in which gas bubbles are injected into a precipitation solution containing paclitaxel in the fractional precipitation step during purification of paclitaxel to dramatically shorten the fractionation precipitation time It relates to a precipitation method and a method for purifying paclitaxel capable of not only significantly shortening the overall process time by performing the fractional precipitation method, but also obtaining paclitaxel with a yield and purity similar to those of the existing paclitaxel purification method.
Description
본 발명은 파클리탁셀 정제 시 가스 버블을 이용한 분별침전방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 파클리탁셀의 정제 시 분별침전단계에서 파클리탁셀을 포함하는 침전 용액에 가스 버블을 주입하여 분별침전 시간을 획기적으로 단축시킨 분별침전방법, 및 상기 분별침전방법을 수행하여 전체 공정 시간을 현저하게 단축시킬 뿐만 아니라 기존의 파클리탁셀 정제방법과 유사한 수준의 수율 및 순도의 파클리탁셀을 수득할 수 있는 파클리탁셀 정제방법에 관한 것이다.The present invention relates to a fractionation precipitation method using gas bubbles during purification of paclitaxel, and more particularly, fractionation in which gas bubbles are injected into a precipitation solution containing paclitaxel in the fractional precipitation step during purification of paclitaxel to dramatically shorten the fractionation precipitation time It relates to a precipitation method and a method for purifying paclitaxel capable of not only significantly shortening the overall process time by performing the fractional precipitation method, but also obtaining paclitaxel with a yield and purity similar to those of the existing paclitaxel purification method.
파클리탁셀(paclitaxel)은 주목(yew tree)의 표피에서 발견된 디테르페노이드(diterpenoid)계 항암물질로 1971년 Wani 등에 의하여 파클리탁셀의 화학적 구조가 규명되었으며(Wani et al (1971), J. Am. Chem. Soc., 93, 2325-2327), 1979년 Schiff 등에 의하여 항암 기작이 밝혀졌다(Schiff et al., Nature, 277, 655-667). 파클리탁셀은 난소암, 유방암, 카포시 종양(Kaposi's sarcoma), 비소세포성 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC) 치료에 대해 미국 FDA (U.S. Food and Drug Administration) 허가를 취득하여 현재 가장 많이 사용되고 있는 항암제이며, 폐암, 류마티스성 관절염, 알츠하이머 치료 등의 적용증이 계속 확대되고 있고, 여러 다른 치료 방법들과의 복합처방에 관한 임상시험이 진행 중에 있어 향후 파클리탁셀의 수요는 계속 늘어날 전망이다. 이러한 파클리탁셀의 주요 생산방법으로는 주목나무에서 직접 추출(extraction)하는 방법, 주목나무의 잎에서 전구체(baccatin Ⅲ, 10-deacetylbaccatin Ⅲ, 10-deacetylpaclitaxel 등)를 얻어 곁사슬(side chain)을 화학적으로 결합하는 반합성(semi-synthesis) 방법, 주목나무에서 캘러스(callus)를 유도하고 종균배양(seed culture)을 거쳐 주배양기(main bioreactor)에서 식물세포배양(plant cell culture)을 하여 얻는 방법이 있다.Paclitaxel is a diterpenoid anticancer substance discovered in the epidermis of yew tree, and the chemical structure of paclitaxel was elucidated by Wani et al. in 1971 (Wani et al (1971), J. Am. Chem. Soc., 93, 2325-2327), an anticancer mechanism was revealed by Schiff et al. in 1979 (Schiff et al., Nature, 277, 655-667). Paclitaxel has been approved by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) for the treatment of ovarian cancer, breast cancer, Kaposi's sarcoma, and non-small cell lung cancer (NSCLC). Demand for paclitaxel is expected to continue to increase in the future as the application for lung cancer, rheumatoid arthritis, and Alzheimer's treatment continues to expand, and clinical trials for complex prescription with several other treatment methods are ongoing. The main production methods of paclitaxel include direct extraction from yew trees, and chemically bonding the side chains by obtaining precursors (baccatin Ⅲ, 10-deacetylbaccatin Ⅲ, 10-deacetylpaclitaxel, etc.) from the leaves of yew trees. There is a semi-synthesis method, which is obtained by inducing callus from a yew tree, performing seed culture, and then culturing plant cells in a main bioreactor.
이들 중 직접추출법과 반합성법은 원료의 계속적인 공급이 어렵고 추출/정제에도 많은 어려움이 있으며 환경보호수인 주목나무의 보호에도 적합하지 않은 방식이다. 하지만 식물세포배양법은 기후, 환경 등의 외부 인자에 의한 영향을 받지 않고 생물반응기 내에서 안정적으로 생산이 가능하기 때문에 일정한 품질의 파클리탁셀을 대량 생산할 수 있다는 장점이 있다.Among them, the direct extraction method and the semi-synthetic method are difficult to continuously supply raw materials, have many difficulties in extraction/refining, and are not suitable for protecting the yew tree, which is an environmental protection tree. However, the plant cell culture method has the advantage of being able to mass-produce paclitaxel of a certain quality because it can be stably produced in a bioreactor without being affected by external factors such as climate and environment.
식물세포배양에 의한 파클리탁셀의 분리 및 정제는 여러 단계의 추출 및 정제 공정을 거쳐 높은 순도(>98%)의 제품을 생산하게 된다. 일반적으로 분리 및 정제 과정은 원료인 바이오매스 (파클리탁셀을 함유한 식물체 또는 식물세포)로부터 파클리탁셀을 먼저 유기용매로 추출하고, 전 처리 공정(pre-purification process)을 거쳐 최종정제(purification)를 통하여 제품을 생산하는 공정으로 이루어져 있다. 이 과정에서 특히 전 처리(pre-purification) 공정은 최종 정제 비용에 많은 영향을 미친다. 기존 문헌에 보고된 공정 중에는 정제를 위한 전 처리 공정으로 고가의 크로마토그래피를 이용하고 있거나 전 처리 없이 추출을 거친 미가공 파클리탁셀 (crude paclitaxel)을 HPLC (high performance liquid chromatography)에 의해서 바로 최종 정제하여 경제적 측면에서 많은 문제가 있었으며 또한 스케일 업(scale-up) 및 산업적 대량생산에 많은 어려움이 따랐다.Isolation and purification of paclitaxel by plant cell culture produces a product of high purity (>98%) through several steps of extraction and purification processes. In general, the separation and purification process involves first extracting paclitaxel with an organic solvent from the raw material biomass (plants or plant cells containing paclitaxel), going through a pre-purification process, and then finalizing the product through purification. It consists of a process for producing In this process, in particular, the pre-purification process greatly affects the final purification cost. Among the processes reported in the existing literature, expensive chromatography is used as a pretreatment process for purification, or crude paclitaxel that has undergone extraction without pretreatment is directly purified by HPLC (high performance liquid chromatography), resulting in economical aspects. There were many problems in the industry, and there were also many difficulties in scale-up and industrial mass production.
대체로 바이오매스로부터 유기용매를 이용하여 파클리탁셀을 추출하면 순도는 0.5% 정도이며, 간단한 전 처리 공정 후에도 10% 이하의 순도로 매우 낮다. 이러한 시료를 바로 HPLC에 의하여 최종 정제할 경우 많은 양의 유기용매 사용, 컬럼 팩킹 물질 (레진)의 수명 단축, 처리량 감소 등 상당히 비경제적이며 대량 생산을 위한 공정으로는 적합하지 않다. 따라서 전 처리 공정을 통하여 시료의 순도를 가능한 한 높여 주어야 최종 정제, 특히 HPLC를 이용한 정제에서의 비용을 줄일 수 있다.In general, when paclitaxel is extracted from biomass using an organic solvent, the purity is about 0.5%, and even after a simple pre-treatment process, the purity is very low with less than 10%. When these samples are finally purified by HPLC, it is quite uneconomical to use a large amount of organic solvent, shortens the lifespan of the column packing material (resin), and reduces throughput, and is not suitable as a process for mass production. Therefore, it is necessary to increase the purity of the sample as much as possible through the pre-treatment process to reduce the cost of final purification, especially purification using HPLC.
이러한 전처리 공정 중 분별침전(fractional-precipitation)은 파클리탁셀의 용해도 차이를 이용하여 간단하고 효율적으로 높은 순도의 파클리탁셀을 고수율로 얻을 수 있는 방법이다. 기존에 보고된 문헌에서는 이러한 분별침전을 최적화하고 개선하기 위하여 다양한 연구들이 시도되었다. 2000년 분별침전 공정으로 높은 순도(>50%)의 파클리탁셀을 얻을 수 있는 방법이 최초로 보고되었으며(Kim et al (2000), Biotechnology Letters, 22, 1753-1756), 2002년에는 분별침전을 위한 최적의 메탄올 함량에 대한 연구가 수행되었으며(Kim et al (2000), Process Biochemistry, 37, 679-682), 2006년에는 분별침전 후 보관 온도에 대한 연구가 수행되어 고순도 및 고수율의 파클리탁셀을 얻을 수 있었다(Kim et al., Process Biochemistry, 41, 276-280).Among these pretreatment processes, fractional-precipitation is a method for obtaining high-purity paclitaxel in high yield simply and efficiently by using the solubility difference of paclitaxel. In the previously reported literature, various studies have been attempted to optimize and improve this fractional precipitation. In 2000, a method for obtaining paclitaxel with high purity (>50%) was first reported by the fractionation process (Kim et al (2000), Biotechnology Letters, 22, 1753-1756), and in 2002, the optimal method for fractionation precipitation A study on the methanol content was performed (Kim et al (2000), Process Biochemistry, 37, 679-682), and in 2006, a study on the storage temperature after fractional precipitation was conducted to obtain high purity and high yield of paclitaxel. (Kim et al., Process Biochemistry, 41, 276-280).
하지만 분별침전의 가장 큰 단점은 침전에 많은 시간(~3 일)이 소요되며 저온(0-4℃에서 침전이 이루어지기 때문에 경제성 측면에서 파클리탁셀 대량생산 공정에 적용하기에 한계가 있다 (Kim et al (2006), Kor. J. Biotechnol. Bioeng, 21, 1-10; Kim et al (2000), Biotechnology Letters, 22, 1753-1756; Kim et al (2002), Process Biochemistry, 37, 679-682; Kim et al (2006), Process Biochemistry, 41, 276-280).However, the biggest disadvantage of fractional precipitation is that it takes a lot of time (~3 days) for precipitation, and since precipitation is performed at low temperature (0-4 ℃), there is a limit to applying it to the mass production process of paclitaxel in terms of economic feasibility (Kim et al. (2006), Kor. J. Biotechnol. Bioeng, 21, 1-10; Kim et al (2000), Biotechnology Letters, 22, 1753-1756; Kim et al (2002), Process Biochemistry, 37, 679-682; Kim et al (2006), Process Biochemistry, 41, 276-280).
따라서 이러한 문제점을 개선하기 위하여 2009~2013년 동안 유리 비드(glass beads) 또는 이온교환수지 등 표면적증가물질을 이용하여 반응기 내부 표면적(surface area per working volume, S/V)을 증가시켜 분별침전 효율을 향상시키려는 연구와 분별침전 시 조추출물(crude extract) 순도 및 순수 파클리탁셀 함량의 영향을 확인하여 침전효율을 향상시키려는 연구가 진행되었다. 이러한 연구들을 통하여 분별침전에 소요되는 긴 침전시간을 어느 정도 단축시켰지만 파클리탁셀의 대량생산을 위한 공정에 적용시키기에는 여전히 미흡한 점이 있고, 높은 수율과 높은 순도를 얻기에는 어려운 실정이다.Therefore, in order to improve this problem, the surface area per working volume (S/V) of the reactor was increased by using a surface area increasing material such as glass beads or ion exchange resin from 2009 to 2013 to improve the fractionation precipitation efficiency. A study to improve the precipitation efficiency was conducted by confirming the effect of crude extract purity and pure paclitaxel content during fractional precipitation. Although the long precipitation time required for fractional precipitation has been shortened to some extent through these studies, it is still insufficient for application to the process for mass production of paclitaxel, and it is difficult to obtain high yield and high purity.
이에 따라, 본 발명자들은 분별침전에 소요되는 긴 침전시간과 장시간 저온보관해야 하는 기존 문제들을 획기적으로 개선할 수 있는 방법을 제시하고자 하였다. 즉, 다양한 순도의 시료(crude paclitaxel)를 사용하여 분별침전한 후 기포 발생기를 이용하여 침전 용액에 가스 버블 (공기 버블)을 주입함으로써 분별침전에 소요되는 시간, 침전물의 수율 및 순도를 조사하고, 궁극적으로 분별침전 시간을 획기적으로 단축시킴과 동시에 침전물의 수율과 순도를 획기적으로 향상시킬 수 있는 방법을 개발하고자 하였다.Accordingly, the present inventors tried to propose a method capable of remarkably improving the existing problems of long settling time required for fractional precipitation and long-term low temperature storage. That is, after fractional precipitation using samples of various purity (crude paclitaxel), gas bubbles (air bubbles) are injected into the precipitation solution using a bubble generator to investigate the time required for fractionation precipitation, yield and purity of the precipitate, Ultimately, it was attempted to develop a method that could dramatically shorten the fractionation precipitation time and dramatically improve the yield and purity of the precipitate.
본 발명은 상술한 과제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 파클리탁셀 정제 시 분별침전단계에서 가스 버블을 주입하여 분별침전 시간을 획기적으로 단축시킬 수 있는 분별침전방법 및 상기 분별침전방법을 이용하여 침전수율 및 순도를 획기적으로 향상시킨 파클리탁셀 정제방법을 제공하는데 목적이 있다.The present invention has been devised to solve the above problems, and a fractional precipitation method that can dramatically shorten the fractional precipitation time by injecting gas bubbles in the fractional precipitation step during purification of paclitaxel, and the precipitation yield and An object of the present invention is to provide a method for purifying paclitaxel with dramatically improved purity.
상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 파클리탁셀 정제 시 가스 버블을 주입하여 수행되는 분별침방법을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a method for fractionation needles performed by injecting gas bubbles during purification of paclitaxel.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 분별침전방법은 파클리탁셀을 포함하는 시료를 수용성 유기용매와 혼합하고 물을 첨가한 후 가스 버블을 주입하는 것일 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the fractional precipitation method may include mixing a sample containing paclitaxel with a water-soluble organic solvent, adding water, and then injecting gas bubbles.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 수용성 유기용매는 C1 내지 C4의 알코올 및 메틸렌 클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택된 1종을 포함하는 것일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the water-soluble organic solvent may include one selected from the group consisting of C1 to C4 alcohols and methylene chloride.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 물은 수용성 유기용매와 물의 부피비가 50:50 내지 80:20이 될 때까지 첨가할 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the water may be added until the volume ratio of the water-soluble organic solvent to the water becomes 50:50 to 80:20.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 가스 버블은 기포발생기를 이용하여 주입할 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the gas bubble may be injected using a bubbler.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 가스 버블의 주입 시 가스 유량은 1.00L/분 이상일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, when the gas bubble is injected, the gas flow rate may be 1.00 L/min or more.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 가스 버블은 30분 이하의 시간 동안 주입될 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the gas bubble may be injected for a time of 30 minutes or less.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 분별침전방법은 상온에서 이루어질 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the fractional precipitation method may be performed at room temperature.
본 발명은 또한, a) 택서스속(Taxus genus) 식물체의 세포 배양액으로부터 바이오매스를 수득하는 단계; b) 유기용매 추출을 수행하는 단계; c) 액체-액체 추출을 수행하는 단계; d) 흡착제를 처리하는 단계; e) 헥산 침전 추출을 수행하는 단계; 및 f) 전술한 분별침전단계; 를 포함하는 파클리탁셀 정제방법을 제공한다.The present invention also provides a method comprising: a) obtaining biomass from a cell culture medium of a taxus genus plant; b) performing organic solvent extraction; c) performing liquid-liquid extraction; d) treating the adsorbent; e) performing hexane precipitation extraction; and f) the above-mentioned fractional precipitation step; It provides a method for purifying paclitaxel comprising a.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 a) 단계의 바이오매스는 택서스속 식물체, 이의 세포, 이의 세포 조각(cell debris) 및 이의 세포 배양액으로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the biomass of step a) comprises at least one selected from the group consisting of Taxus plants, its cells, its cell debris and its cell culture solution. it could be
본 발명에 따른 분별침전방법 및 이를 포함하는 파클리탁셀 정제방법은 1.00L/분 이상의 가스 유량으로 가스 버블을 주입함으로써 분별침전시간을 획기적으로 단축시키면서 기존의 파클리탁셀 정제방법보다 우수한 수율 및 순도의 파클리탁셀을 수득할 수 있도록 한다. 또한, 분별침전을 위한 저온 보관도 필요치 않으므로, 파클리탁셀의 대량생산을 위한 공정에 적합하다.The fractional precipitation method and the paclitaxel purification method comprising the same according to the present invention dramatically shorten the fractionation precipitation time by injecting gas bubbles at a gas flow rate of 1.00 L/min or more, while obtaining paclitaxel with superior yield and purity than the existing paclitaxel purification method make it possible In addition, since low-temperature storage for fractionation is not required, it is suitable for the process for mass production of paclitaxel.
도 1의 (A)는 파클리탁셀의 정제 시 통상적인 분별침전방법의 개략도를 나타낸 것이고, (B)는 본 발명에 따른 가스 버블 주입에 의해 개선된 분별침전방법의 개략도를 나타낸 것이다.
도 2는 가스 버블이 분별침전방법에서 수득되는 파클리탁셀의 수율에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 3은 가스 버블이 분별침전방법에서 수득되는 파클리탁셀의 순도에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.Figure 1 (A) shows a schematic diagram of a conventional fractionation precipitation method for the purification of paclitaxel, and (B) shows a schematic diagram of a fractional precipitation method improved by gas bubble injection according to the present invention.
2 is a graph showing the effect of gas bubbles on the yield of paclitaxel obtained in the fractional precipitation method.
3 is a graph showing the effect of gas bubbles on the purity of paclitaxel obtained in the fractional precipitation method.
상술한 바와 같이, 종래 기술에서는 파클리탁셀의 정제방법에서 분별침전에 소요되는 긴 침전시간을 어느 정도 단축시켰지만, 이를 파클리탁셀의 대량생산을 위한 공정에 적용시키기에는 여전히 미흡한 점이 있고, 높은 수율과 높은 순도를 얻기에는 어려운 문제점이 있다.As described above, in the prior art, the long precipitation time required for fractional precipitation in the purification method of paclitaxel was shortened to some extent, but it is still insufficient to apply it to the process for mass production of paclitaxel, and high yield and high purity It is difficult to obtain.
이에 본 발명자들은 시료 내 파클리탁셀의 순도에 따라 분별침전방법에서 가스 버블 주입 조건을 달리하여, 분별침전 시간을 획기적으로 단축시킨 분별침전방법, 및 상기 분별침전방법을 수행하여 시간을 현저하게 단축시킬 뿐만 아니라 기존의 파클리탁셀 정제방법보다 높은 수준의 수율 및 순도의 파클리탁셀을 수득할 수 있는 파클리탁셀 정제방법을 개발하였다. 본 발명에 따른 분별침전방법 및 이를 포함하는 파클리탁셀 정제방법은 시료 내 파클리탁셀의 순도에 따라 분별침전 단계에서 가스 버블 주입 조건을 달리 처리하여, 분별침전 시간을 획기적으로 단축시키면서 기존의 파클리탁셀 정제방법보다 높은 수준의 수율 및 순도의 파클리탁셀을 수득할 수 있도록 한다. 또한, 분별침전을 위한 저온 보관도 필요치 않으므로, 파클리탁셀의 대량생산을 위한 공정에 적합하다.Accordingly, the present inventors changed the gas bubble injection conditions in the fractional precipitation method according to the purity of paclitaxel in the sample to dramatically shorten the fractional precipitation time, and the fractional precipitation method significantly shortens the time. In addition, a paclitaxel purification method that can obtain paclitaxel with higher yield and purity than the existing paclitaxel purification method was developed. The fractional precipitation method and the paclitaxel purification method comprising the same according to the present invention treat gas bubble injection conditions differently in the fractional precipitation step depending on the purity of paclitaxel in the sample, thereby dramatically shortening the fractionation precipitation time and higher than the existing paclitaxel purification method. to obtain a level of yield and purity of paclitaxel. In addition, since low-temperature storage for fractionation is not required, it is suitable for the process for mass production of paclitaxel.
이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.Hereinafter, with reference to the accompanying drawings, embodiments of the present invention will be described in detail so that those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains can easily implement them. The present invention may be embodied in many different forms and is not limited to the embodiments described herein.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.Throughout this specification, when a part "includes" a certain component, it means that other components may be further included, rather than excluding other components, unless otherwise stated.
본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B"의 기재는, "A 또는 B, 또는, A 및 B"를 의미한다.Throughout this specification, reference to “A and/or B” means “A or B, or A and B”.
본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.As used herein, the terms “about,” “substantially,” and the like, to the extent used herein, are used in or close to the numerical value when the manufacturing and material tolerances inherent in the stated meaning are presented, and to aid in the understanding of the present application. It is used to prevent an unconscionable infringer from using the mentioned disclosure unfairly.
본 발명은 파클리탁셀 정제 시 가스 버블을 주입하여 수행되는 분별침전방법을 제공한다.The present invention provides a fractional precipitation method performed by injecting gas bubbles during purification of paclitaxel.
통상적으로 바이오매스로부터의 파클리탁셀 추출 및 정제방법은 용매추출, 액체-액체 추출, 흡착제 처리, 헥산침전 및 분별침전의 단계로 구성된다 (Kim et al (2002), Process Biochem., 37, 679-682; Kim et al (2004), Process Biochem., 39, 1985-1991; Kim et al (2006), Korean J. Biotechnol. Bioeng., 21, 1-10).Typically, paclitaxel extraction and purification methods from biomass consist of the steps of solvent extraction, liquid-liquid extraction, adsorbent treatment, hexane precipitation and fractionation (Kim et al (2002), Process Biochem., 37, 679-682). Kim et al (2004), Process Biochem., 39, 1985-1991; Kim et al (2006), Korean J. Biotechnol. Bioeng., 21, 1-10).
바이오매스를 이용하여 용매추출, 액체-액체 추출, 흡착제 처리, 헥산 침전 및 분별침전을 거치면 시료의 순도는 각각 0.5-0.7%, 6-9%, 9-10%, 21-27%, 46-61% 정도로 향상된다. 이러한 전처리 공정을 통해 불순물은 다량 제거되었고, 미가공 파클리탁셀(crude paclitaxel)의 순도는 매우 증가하여 최종 HPLC 공정에 적합하게 되었다. 그러나, 분별침전은 침전에 많은 시간(~3 일)이 소요되고 저온(0-4℃에서 침전이 이루어지기 때문에 경제성 측면에서 파클리탁셀 대량생산 공정에 적용하기에 한계가 있었다.When biomass is used for solvent extraction, liquid-liquid extraction, adsorbent treatment, hexane precipitation, and fractional precipitation, the purity of the sample is 0.5-0.7%, 6-9%, 9-10%, 21-27%, 46- improved by 61%. Through this pretreatment process, a large amount of impurities were removed, and the purity of crude paclitaxel was greatly increased, making it suitable for the final HPLC process. However, because fractional precipitation takes a lot of time (~3 days) for precipitation and precipitation is performed at low temperature (0-4°C), there is a limit to its application to the mass production process of paclitaxel in terms of economic feasibility.
본 발명자들은, 파클리탁셀 정제에 있어서 분별침전단계에서 침전 용액에 가스 버블을 주입하는 경우 침전시간을 획기적으로 단축시킬 수 있다는 것을 확인하였다.The present inventors have confirmed that, in the case of injecting gas bubbles into the precipitation solution in the fractional precipitation step in the purification of paclitaxel, the precipitation time can be remarkably shortened.
이에 따라, 본 발명의 분별침전방법은 파클리탁셀을 포함하는 미가공의 시료를 수용성 유기용매와 혼합하고 물을 첨가한 후 가스 버블을 주입하는 것으로 수행된다.Accordingly, the fractional precipitation method of the present invention is performed by mixing a raw sample containing paclitaxel with a water-soluble organic solvent, adding water, and then injecting gas bubbles.
본 발명의 분별침전방법에 있어서, 시료를 수용성 유기용매에 용해하는 것은 수용성 유기용매에 시료를 균일하게 분산할 수 있는 함량으로 용해하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 수용성 유기용매에 순수 파클리탁셀의 함량이 0.1% 내지 1%(w/v)가 되도록 용해시킬 수 있다.In the fractional precipitation method of the present invention, dissolving the sample in the water-soluble organic solvent is not particularly limited as long as the sample is dissolved in an amount capable of uniformly dispersing the sample in the water-soluble organic solvent, but preferably pure paclitaxel in the water-soluble organic solvent. It can be dissolved so that the content is 0.1% to 1% (w/v).
상기 수용성 유기용매는 통상적으로 식물체에서 유효성분을 추출하기 위해 사용하는 유기용매라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 C1 내지 C4의 알콜 및 메틸렌 클로라이드로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 메탄올을 포함할 수 있다.The water-soluble organic solvent is not particularly limited as long as it is an organic solvent typically used for extracting the active ingredient from a plant, but preferably includes one or more of the group consisting of C1 to C4 alcohol and methylene chloride, and more Preferably, it may contain methanol.
그 다음으로, 시료를 수용성 유기용매에 용해시킨 다음 수용성 유기용매와 물의 부피비가 50:50 내지 80:20이 될 때까지 물(증류수)을 첨가하여 분별침전을 수행한다. 이때, 물은 증류수를 사용할 수 있고, 교반 하에 한 방울씩 떨어뜨려 첨가하는 것이 바람직하다.Next, after dissolving the sample in a water-soluble organic solvent, fractional precipitation is performed by adding water (distilled water) until the volume ratio of the water-soluble organic solvent and water becomes 50:50 to 80:20. In this case, distilled water may be used as the water, and it is preferable to add it drop by drop under stirring.
교반 속도는 100 내지 300rpm으로 이루어질 수 있다. 만약, 100rpm 미만의 속도로 교반할 경우, 교반으로 인해 수득할 수 있는 이점인 파클리탁셀 침전 속도가 느려 파클리탁셀 침전 시간이 증가하는 문제가 발생할 수 있으며, 300rpm을 초과하는 속도로 교반할 경우, 과도한 혼합으로 조업효율이 저하되는 문제가 발생할 수 있다.The stirring speed may be 100 to 300 rpm. If stirring at a speed of less than 100 rpm, the paclitaxel precipitation rate, which is an advantage that can be obtained due to stirring, is slow, and there may be a problem in that the paclitaxel precipitation time increases. There may be a problem that the operation efficiency is lowered.
상기 물의 첨가량은 수용성 유기용매와 물의 부피비가 50:50 내지 80:20이 될 때까지 혼합할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 수용성 유기용매와 물의 부피비가 53:47 내지 65:35가 될 때까지 혼합할 수 있다.The amount of water added may be mixed until the volume ratio of the water-soluble organic solvent and water is 50:50 to 80:20, and more preferably, the water-soluble organic solvent and water are mixed until the volume ratio is 53:47 to 65:35. can do.
물을 첨가하는 것이 완료되면, 가스 버블을 주입한다. 가스 버블은 시료 내 파클리탁셀의 순도와 관계 없이 일정한 가스 유량으로 주입될 수 있다. 바람직하게는, 1.00L/분 이상의 일정한 가스 유량으로 가스 버블을 주입하는 경우, 가스 유량에 관계 없이 30분 이하로 분별침전시간이 단축될 수 있다.When the water addition is complete, inject gas bubbles. The gas bubble may be injected at a constant gas flow rate regardless of the purity of paclitaxel in the sample. Preferably, when gas bubbles are injected at a constant gas flow rate of 1.00 L/min or more, the fractionation precipitation time can be reduced to 30 minutes or less regardless of the gas flow rate.
분별침전 시 가스 버블은 기포발생기를 이용하여 침전 용액에 주입할 수 있다. 예를 들어, 기포발생기의 산소 토출구에 에어 호스 (hose), 튜브 (tube) 또는 관 (pipe) 등을 연결하여 가스 버블을 주입할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.During fractional precipitation, gas bubbles can be injected into the precipitation solution using a bubbler. For example, an air hose, a tube, or a pipe may be connected to the oxygen outlet of the bubble generator to inject gas bubbles, but the present invention is not limited thereto.
주입되는 가스 버블의 직경은 0.5 내지 5.0mm일 수 있으나, 버블이 형성될 수 있는 크기의 직경이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 0.5mm 이하의 범위의 미세 버블을 주입하여 분별침전을 수행하는 것 또한 가능하다.The diameter of the injected gas bubble may be 0.5 to 5.0 mm, but as long as the diameter of the bubble can be formed, it may be used without limitation. For example, it is also possible to perform fractional precipitation by injecting microbubbles in the range of 0.5 mm or less.
본 발명의 분별침전방법은 가스 버블의 주입으로 용질의 물질 전달이 향상되고, 가스 버블의 표면이 핵 형성의 중심으로 작용하여 파클리탁셀의 침전을 촉진시키는 것으로 판단되며, 이에 따라 분별침전시간이 획기적으로 단축되는 것으로 판단된다. In the fractional precipitation method of the present invention, it is determined that the mass transfer of the solute is improved by the injection of gas bubbles, and the surface of the gas bubble acts as a center of nucleation to promote the precipitation of paclitaxel, and accordingly, the fractional precipitation time is significantly reduced. considered to be shortened.
본 발명의 분별침전방법은 상온에서 이루어질 수 있다. 파클리탁셀 정제 시 종래의 분별침전방법은 0 내지 4 ℃의 저온에서 이루어져 경제성 측면에서 파클리탁셀 대량생산 공정에 적용하기에 한계가 있었다.The fractional precipitation method of the present invention may be performed at room temperature. In the case of paclitaxel purification, the conventional fractional precipitation method was performed at a low temperature of 0 to 4 °C, and there was a limitation in applying it to the mass production process of paclitaxel in terms of economical efficiency.
그러나, 본 발명의 파클리탁셀 정제 시 수행되는 분별침전방법은 상온에서 파클리탁셀의 순도가 5 내지 70%인 시료의 침전 용액에 가스 버블을 주입하여 수행되므로, 분별침전을 위한 저온 보관을 필요로 하지 않아 대량생산 공정에 적용하기에 적합하다.However, since the fractional precipitation method performed during the purification of paclitaxel of the present invention is performed by injecting gas bubbles into the precipitation solution of a sample having a purity of 5 to 70% of paclitaxel at room temperature, it does not require low-temperature storage for fractional precipitation. It is suitable for application in the production process.
또한, 본 발명은 전술한 분별침전방법을 포함하는 파클리탁셀 정제방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for purifying paclitaxel comprising the above-described fractional precipitation method.
본 발명의 파클리탁셀 정제방법은 상기 분별침전 단계 전에 a) 택서스속(Taxus genus) 식물체의 세포 배양액으로부터 바이오매스를 수득하는 단계; b) 유기용매 추출을 수행하는 단계; c) 액체-액체 추출을 수행하는 단계; 및 d) 흡착제를 처리하는 단계;를 수행할 수 있다.The method for purifying paclitaxel of the present invention comprises the steps of: a) obtaining biomass from a cell culture medium of a plant of the genus Taxus ; b) performing organic solvent extraction; c) performing liquid-liquid extraction; and d) treating the adsorbent.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 a) 내지 d) 단계를 거쳐 수득된 순도 20.48%의 파클리탁셀 조추출물의 침전 용액에 각각 1.15, 4.52 및 9.41 L/분의 가스 유량으로 가스 버블을 주입하였을 때, 침전에 소요되는 시간, 파클리탁셀 수율 및 순도를 확인하였다.In a specific embodiment of the present invention, when gas bubbles are injected at a gas flow rate of 1.15, 4.52 and 9.41 L/min, respectively, to the precipitation solution of the crude paclitaxel extract having a purity of 20.48% obtained through steps a) to d), the precipitation The time required for , the yield and purity of paclitaxel were confirmed.
그 결과 도 2 및 3에 서 확인되는 바와 같이, 침전시간은 약 30분 정도 소요되었고, 가스 유량 변화에 따른 큰 영향 없이 각각 86.12, 86.75 및 87.01%의 일정한 수율과 33.44, 33.57 및 33.59%의 일정한 순도를 나타냈다. 반면, 가스 버블을 주입하지 않은 대조군의 경우 침전시간은 약 36시간 정도 소요되었고, 수율 및 순도는 각각 57.99% 및 29.67%를 나타냈다. 이를 통해, 분별침전단계에서 저온 보관 없이 상온에서 가스 버블을 침전 용액에 주입하는 경우 분별침전 시간이 획기적으로 단축될 뿐만 아니라, 보다 높은 수율로 높은 순도의 파클리탁셀을 수득할 수 있다는 것을 확인하였다.As a result, as can be seen in FIGS. 2 and 3, the precipitation time took about 30 minutes, and the constant yields of 86.12, 86.75, and 87.01% and 33.44, 33.57, and 33.59% of constant yields respectively, without significant effect due to the change in gas flow rate, were obtained. showed purity. On the other hand, in the case of the control group that did not inject gas bubbles, the precipitation time was about 36 hours, and the yield and purity were 57.99% and 29.67%, respectively. Through this, it was confirmed that when gas bubbles are injected into the precipitation solution at room temperature without low temperature storage in the fractional precipitation step, the fractional precipitation time is remarkably shortened, and high-purity paclitaxel can be obtained in a higher yield.
또한, 본 발명의 파클리탁셀 정제방법은 상기 분별침전 단계 전에 a) 택서스속(Taxus genus) 식물체의 세포 배양액으로부터 바이오매스를 수득하는 단계; b) 유기용매 추출을 수행하는 단계; c) 액체-액체 추출을 수행하는 단계; d) 흡착제를 처리하는 단계; 및 e) 헥산 침전 추출을 수행하는 단계;를 수행할 수 있다.In addition, the paclitaxel purification method of the present invention comprises the steps of: a) obtaining biomass from a cell culture solution of a plant of the genus Taxus ; b) performing organic solvent extraction; c) performing liquid-liquid extraction; d) treating the adsorbent; and e) performing hexane precipitation extraction; may be performed.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 a) 내지 e) 단계를 거쳐 수득된 순도 63.6%의 파클리탁셀 조추출물의 침전 용액에 각각 1.15, 4.52 및 9.41 L/분의 가스 유량으로 가스 버블을 주입하였을 때, 침전에 소요되는 시간, 파클리탁셀 수율 및 순도를 확인하였다.In a specific embodiment of the present invention, when gas bubbles are injected at a gas flow rate of 1.15, 4.52, and 9.41 L/min, respectively, to the precipitation solution of the crude extract of paclitaxel having a purity of 63.6% obtained through steps a) to e), precipitation The time required for , the yield and purity of paclitaxel were confirmed.
그 결과 도 2 및 3에서 확인되는 바와 같이, 침전시간은 약 20분 정도 소요되었고, 가스 유량 변화에 따른 큰 영향 없이 각각 93.12, 93.99 및 95.01%의 일정한 수율과 82.16, 83.15, 83.46%의 일정한 순도를 나타냈다. 반면, 가스 버블을 주입하지 않은 대조군의 경우 침전시간은 약 12시간 정도 소요되었고, 수율 및 순도는 각각 70.41% 및 84.90%를 나타냈다. 이를 통해, 분별침전단계에서 저온 보관 없이 상온에서 가스 버블을 침전 용액에 주입하는 경우 분별침전 시간이 획기적으로 단축될 뿐만 아니라, 보다 높은 수율로 높은 순도의 파클리탁셀을 수득할 수 있다는 것을 확인하였다.As a result, as can be seen in FIGS. 2 and 3, the precipitation time was about 20 minutes, and there was a constant yield of 93.12, 93.99, and 95.01%, respectively, and a constant purity of 82.16, 83.15, and 83.46% without a significant effect due to the change in gas flow rate. showed On the other hand, in the case of the control group that did not inject gas bubbles, the precipitation time was about 12 hours, and the yield and purity were 70.41% and 84.90%, respectively. Through this, it was confirmed that when gas bubbles are injected into the precipitation solution at room temperature without low temperature storage in the fractional precipitation step, the fractional precipitation time is remarkably shortened, and high-purity paclitaxel can be obtained in a higher yield.
결과적으로, 상온에서 침전 용액에 가스 버블을 주입하여 분별침전을 수행하는 경우, 1.00L/분 이상의 유량만 유지한다면, 가스 유량 변화에 큰 영향을 받지 않고 30분 내로 침전시간이 획기적으로 단축된다는 것을 확인하였다. 또한, 수율 및 순도를 고려하였을 때에도, 통상의 분별침전을 수행한 경우와 비교하여 훨씬 더 개선된 수율 및 순도의 파클리탁셀을 수득할 수 있다는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 가스 버블을 이용한 분별침전방법은 기존의 분별침전방법에 비해 파클리탁셀의 정제 효율 및 경제성이 모두 우수하여 보다 간편한 정제 공정 개발 및 생산 원가 절감에 크게 기여할 것으로 예상된다. As a result, when performing fractional precipitation by injecting gas bubbles into the precipitation solution at room temperature, if only a flow rate of 1.00 L/min or more is maintained, the precipitation time is dramatically shortened within 30 minutes without being greatly affected by changes in the gas flow rate. Confirmed. In addition, it was confirmed that even when the yield and purity were considered, paclitaxel of much improved yield and purity could be obtained compared to the case of performing conventional fractional precipitation. Therefore, the fractional precipitation method using gas bubbles of the present invention is expected to greatly contribute to the development of a simpler refining process and reduction of production costs because both the purification efficiency and economic feasibility of paclitaxel are excellent compared to the conventional fractionation precipitation method.
본 발명의 파클리탁셀 정제방법에 있어서, 상기 a) 단계의 택서스속(Taxus genus) 식물체의 세포 배양액으로부터 수득한 바이오매스는 택서스속 식물체, 이의 세포, 이의 세포 조각(cell debris) 및 이의 세포 배양액으로 이루어진 군 중에서 선택한 1종 이상을 포함할 수 있다.In the method for purifying paclitaxel of the present invention, the biomass obtained from the cell culture medium of the taxus genus plant of step a) is a taxus genus plant, its cells, its cell debris and its cell culture medium. It may include one or more selected from the group consisting of.
또한, 상기 택서스속 식물체는 택서스 브레비폴리아(Taxus brevifolia), 택서스 카나덴시스(Taxus canadensis), 택서스 쿠스피다타(Taxus cuspidata), 택서스 바카타(Taxus baccata), 택서스 글로보사(Taxus globosa), 택서스 플로리다나(Taxus floridana), 택서스 월리치아나(Taxus wallichiana), 택서스 메디아(Taxus media) 또는 택서스 치넨시스(Taxus chinensis) 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In addition, the taxus genus plants are Taxus brevifolia ( Taxus brevifolia ), Taxus canadensis ( Taxus canadensis ), Taxus cuspidata ( Taxus cuspidata ), Taxus baccata ( Taxus baccata ), Taxus glow Bossa ( Taxus globosa ), Taxus floridana ( Taxus floridana ), Taxus wallichiana ( Taxus wallichiana ), Taxus media ( Taxus media ) or Taxus chinensis ( Taxus chinensis ) and the like may be included, but are limited thereto it is not
상기 바이오매스를 수득하는 단계는 통상적으로 식물세포배양액으로부터 바이오매스를 수득하는 방법이라면 특별히 제한하지 않는다.The step of obtaining the biomass is not particularly limited as long as it is a method of obtaining biomass from a plant cell culture medium.
본 발명의 파클리탁셀 정제방법에 있어서, 상기 b) 단계의 유기용매 추출은 통상적으로 식물체에서 유효성분을 추출하기 위해 사용하는 유기용매를 사용하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 C1 내지 C4의 알코올을 포함할 수 있다.In the method for purifying paclitaxel of the present invention, the organic solvent extraction in step b) is not particularly limited as long as it uses an organic solvent normally used to extract the active ingredient from a plant, but preferably a C1 to C4 alcohol. may include
상기 유기용매의 구체적인 예로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 메틸렌 클로라이드에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바이오매스로부터 파클리탁셀을 가급적 많이 회수할 수 있는 유기용매로 바람직하게는 메탄올을 사용할 수 있다.As a specific example of the organic solvent, one or a mixture of two or more selected from methanol, ethanol, propanol, and methylene chloride may be used, and as an organic solvent capable of recovering as much paclitaxel as possible from biomass, methanol is preferably used. can
나아가, 상기 유기용매 추출의 조건은 통상적으로 식물체에서 유효성분을 추출하는 방법에서 사용할 수 있는 조건이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 20 내지 45℃에서 30분 내지 2시간 동안 수행할 수 있다.Furthermore, the conditions of the organic solvent extraction are not particularly limited as long as they are conditions that can be used in a method for extracting an active ingredient from a plant in general, but it is preferably carried out at 20 to 45° C. for 30 minutes to 2 hours.
만약, 20℃미만의 온도로 처리할 경우, 낮은 온도로 인해 파클리탁셀의 추출 효율이 감소하는 문제가 발생할 수 있으며, 45℃를 초과하는 온도로 처리할 경우, 높은 온도로 인해 파클리탁셀이 분해되는 문제가 발생할 수 있다.If the treatment is performed at a temperature of less than 20 ° C, there may be a problem in that the extraction efficiency of paclitaxel is reduced due to the low temperature, and when treated at a temperature exceeding 45 ° C, there is a problem that paclitaxel is decomposed due to the high temperature can occur
만약, 30분 미만으로 처리할 경우, 바이오매스 내의 파클리탁셀이 모두 추출되지 않아 파클리탁셀의 추출효율이 낮아지는 문제가 발생할 수 있으며, 2시간을 초과하는 시간으로 처리할 경우, 과도한 조업 시간으로 경제적인 문제가 발생할 수 있다.If it is treated for less than 30 minutes, not all of the paclitaxel in the biomass is extracted, so there may be a problem that the extraction efficiency of paclitaxel is lowered. may occur.
더불어, 상기 용매 추출은 1회 내지 수회 반복 수행할 수 있으며, 바람직하게는 2회 이상, 더욱 바람직하게는 3회 내지 5회 반복 수행할 수 있고, 이후 수득된 추출액은 감압상태 하에서 농축한 뒤 건조하여 액체-액체 추출단계에 사용할 수 있다.In addition, the solvent extraction may be repeated 1 to several times, preferably 2 or more times, more preferably 3 to 5 times repeated, and then the obtained extract is concentrated under reduced pressure and dried Thus, it can be used in the liquid-liquid extraction step.
본 발명의 파클리탁셀 정제방법에 있어서, 상기 c) 단계의 액체-액체 추출은 통상적으로 비극성 유기용매와 극성 유기용매의 상분리를 이용하여 파클리탁셀에 함유되어 있는 극성 불순물을 제거하는 방법이라면 특별히 제한하지 않는다.In the method for purifying paclitaxel of the present invention, the liquid-liquid extraction of step c) is not particularly limited as long as it is a method of removing polar impurities contained in paclitaxel using phase separation of a non-polar organic solvent and a polar organic solvent.
예를 들어, 상기 비극성 유기용매는 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트 및 에테르로 이루어진 군 중에서 선택한 1종 이상의 화합물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 극성 유기용매는 C1 내지 C4의 알코올로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.For example, the non-polar organic solvent may include at least one compound selected from the group consisting of methylene chloride, ethyl acetate, and ether. In addition, the polar organic solvent may include at least one selected from the group consisting of C1 to C4 alcohols.
또한, 상기 액체-액체 추출은 1회 내지 수회 반복 수행할 수 있으며, 바람직하게는 2회 이상, 더욱 바람직하게는 3회 내지 5회 반복 수행할 수 있다.In addition, the liquid-liquid extraction may be repeated one to several times, preferably two or more times, more preferably three to five times repeated.
나아가, 만약 극성 유기용매가 C1 내지 C4의 알코올인 경우, 비극성 유기용매로 메틸렌 클로라이드를 사용하는 것이 바람직하고, 메틸렌 클로라이드는 알코올 농축액의 20 내지 30 %(v/v)로 바람직하게 사용될 수 있으며, 과도한 메틸렌 클로라이드의 사용은 후속 공정에 많은 부담을 초래하게 된다. Furthermore, if the polar organic solvent is a C1 to C4 alcohol, it is preferable to use methylene chloride as the non-polar organic solvent, and methylene chloride may be preferably used in 20 to 30% (v/v) of the alcohol concentrate, Excessive use of methylene chloride causes a great burden on the subsequent process.
본 발명의 파클리탁셀 정제방법에 있어서, 상기 d) 단계의 흡착제 처리는 타르 등의 불순물을 제거하기 위해 실리카계 흡착제를 사용하는 것이 바람직하며, 실리카계 흡착제를 사용하는 경우, 바이오매스 유래 왁스, 타르 등의 불순물을 효과적으로 제거할 수 있으며, 파클리탁셀의 순도 및 정제공정의 효율성을 높이는데 효과적이다.In the method for purifying paclitaxel of the present invention, in the adsorbent treatment in step d), it is preferable to use a silica-based adsorbent to remove impurities such as tar, and when using a silica-based adsorbent, biomass derived wax, tar, etc. It can effectively remove impurities of paclitaxel and is effective in increasing the purity of paclitaxel and the efficiency of the purification process.
또한, 상기 d) 단계의 흡착제는 상기 c) 단계에서 수득된 조추출물/흡착제의 비율이 1:0.5 내지 1:2.5 (w/w)가 되도록 처리할 수 있다.In addition, the adsorbent in step d) may be treated so that the ratio of the crude extract/adsorbent obtained in step c) is 1:0.5 to 1:2.5 (w/w).
상기 흡착제는 20 내지 60℃에서 20분 내지 40분 동안 처리할 수 있고, 이후 여과지로 여과하여 감압상태에서 건조할 수 있다.The adsorbent may be treated at 20 to 60° C. for 20 to 40 minutes, and then filtered through filter paper and dried under reduced pressure.
본 발명의 파클리탁셀 정제방법에 있어서, 상기 e) 단계의 헥산 침전 추출은 d) 단계에서 수득한 조추출물에 헥산을 첨가함으로써 파클리탁셀보다 비극성인 물질을 제거할 수 있다.In the method for purifying paclitaxel of the present invention, the hexane precipitation extraction in step e) can remove a non-polar material than paclitaxel by adding hexane to the crude extract obtained in step d).
더불어, 본 발명은 상술한 바와 같은 파클리탁셀의 정제방법으로 정제한 파클리탁셀을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물은 통상적으로 파클리탁셀을 포함할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 항암제, 류마티스 관절염 치료제 또는 알츠하이머 치료제일 수 있다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising paclitaxel purified by the method for purifying paclitaxel as described above. The pharmaceutical composition is not particularly limited as long as it can include paclitaxel, but may preferably be an anticancer agent, a therapeutic agent for rheumatoid arthritis, or a therapeutic agent for Alzheimer's disease.
상기 항암제는 악성종양의 치료를 위하여 사용되는 화학요법제의 총칭으로, 대부분의 항암제는 암세포의 각종 대사경로에 개입하여 주로 헥산의 합성을 억제하거나 항암활성을 나타내는 약제이다. 정상세포를 손상하지 않고 종양세포만을 저해하는 것은 어렵기 때문에 작용 메커니즘이 여러 가지로 다른 각양각색의 약제가 많은 기업에 의하여 연구되어 왔다. 의약품에 관련된 생물공학의 응용 중 가장 주력하고 있는 분야이다. 현재 판매되고 있는 항암제는 작용 메커니즘에 따라 면역을 부활화하는 것, 대사길항작용이 있는 것, 종양세포를 직접 살상하는 항생물질의 세 가지 종류로 대별된다.The anticancer agent is a generic term for chemotherapeutic agents used for the treatment of malignant tumors, and most anticancer agents are agents that mainly inhibit the synthesis of hexane or exhibit anticancer activity by intervening in various metabolic pathways of cancer cells. Since it is difficult to inhibit only tumor cells without damaging normal cells, various drugs with different mechanisms of action have been studied by many companies. Among the applications of biotechnology related to pharmaceuticals, it is the most focused field. According to the mechanism of action, anticancer drugs currently on the market are roughly divided into three types: those that revitalize immunity, those that have anti-metabolic action, and antibiotics that directly kill tumor cells.
본 발명에 따른 정제방법으로 정제한 파클리탁셀을 포함하는 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.The pharmaceutical composition containing paclitaxel purified by the tableting method according to the present invention can be prepared in an oral dosage form such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories or It may be formulated in the form of a sterile injectable solution and used.
상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.Specifically, in the case of formulation, it may be prepared using a diluent or excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, a surfactant, etc. normally used.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 파클리탁셀에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and these solid preparations include at least one excipient in the paclitaxel, for example, starch, calcium carbonate, sucrose ( sucrose), lactose, gelatin, etc. may be mixed and prepared. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used.
경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.Liquid formulations for oral use include suspensions, solutions, emulsions, syrups, etc., and various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin may be included. have.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등 이 사용될 수 있다.Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized formulations and suppositories. Non-aqueous solvents and suspending agents include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate. As the base of the suppository, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin, etc. can be used.
이하 본 발명을 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 단, 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는바, 이하에서 기술하는 특정 실시예 및 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발 명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니다. 본 발명의 범위는 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, since the present invention can have various changes and can have various forms, the specific examples and descriptions described below are only for helping the understanding of the present invention, and the present invention is limited to specific disclosed forms it's not meant to be It should be understood that the scope of the present invention includes all modifications, equivalents and substitutes included in the spirit and scope of the present invention.
바이오매스의 준비Preparation of biomass
식물재료와 배양조건Plant materials and culture conditions
본 실시예에서 사용된 식물세포 배양액은 택서스 치넨시스(Taxus chinensis)의 잎으로부터 얻은 세포주(cell line)를 이용하여 배양하였다. 택서스 치넨시스로부터 기원된 현탁액 세포는 24℃ 암조건(darkness condition)에서 150 rpm으로 교반하여 배양하였다. 현탁(suspension) 세포는 수정된 Gamborg's B5 배지, 30 g/l 수크로오스, 10 mM 나프탈렌 아세트산, 0.2 mM 6-벤질아미노퓨린, 1 g/l 카제인 가수분해물, 1 g/l 2-(N-모르폴리노) 에탄설폰산에서 배양하였다. 세포 배양은 2주마다 새로운 배지(medium)로 갈아주었으며 생산과 배양을 연장시키기 위해 7 일과 21 일 째 되는 날에 1~2%(w/v)의 말토오스를 첨가해 주고 유도인자(elicitor)로서 배양초기에 4 mM의 AgNO3를 첨가해 주었다. 식물세포배양 후 배양액으로부터 데칸터 (Westfalia, CA150 Claritying Decanter)와 고속원심분리기(α-Laval, BTPX205GD-35CDEEP)를 이용하여 식물세포와 세포조각(cell debris)을 회수하였다. 회수한 식물세포와 세포조각을 합하여 바이오매스(biomass)라 하였다.The plant cell culture medium used in this Example was cultured using a cell line obtained from the leaves of Taxus chinensis . Suspension cells originating from Taxus chinensis were cultured under agitation at 150 rpm at 24° C. in dark conditions. Suspension cells were prepared from modified Gamborg's B5 medium, 30 g/l sucrose, 10 mM naphthalene acetic acid, 0.2 mM 6-benzylaminopurine, 1 g/l casein hydrolysate, 1 g/l 2-(N-morpholine). No) Cultured in ethanesulfonic acid. Cell culture was changed to a fresh medium every 2 weeks, and in order to prolong production and culture, 1~2% (w/v) of maltose was added on the 7th and 21st days as an inducer. At the beginning of the culture, 4 mM AgNO 3 was added. After plant cell culture, plant cells and cell debris were recovered from the culture medium using a decanter (Westfalia, CA150 Claritying Decanter) and a high-speed centrifuge (α-Laval, BTPX205GD-35CDEEP). The recovered plant cells and cell fragments were combined and referred to as biomass.
분별침전을 위한 시료 준비Sample preparation for fractional precipitation
상기 실시예 1에서 식물세포 배양액으로부터 회수한 바이오매스와 메탄올의 비율을 1/1 (w/v)로 하여 상온(room temperature)에서 30 분 동안 추출하여 여과하고, 바이오매스에 새로운 메탄올을 첨가하여 동일한 방법으로 4 회 반복하여 추출하였다. 이 추출액을 회전증발기(rotary evaporator, CCA-1100, EYELA, Japan)에서 감압상태 하에 농축(원액의 30%)하고 메틸렌 클로라이드를 첨가(농축액의 25%)하여 실온에서 30분 동안 교반 후 정체시켜 상 분리를 유도하였다.The ratio of biomass and methanol recovered from the plant cell culture solution in Example 1 was 1/1 (w/v), extracted and filtered at room temperature for 30 minutes, and fresh methanol was added to the biomass. Extraction was repeated 4 times in the same manner. The extract was concentrated (30% of the stock solution) under reduced pressure in a rotary evaporator (rotary evaporator, CCA-1100, EYELA, Japan), methylene chloride was added (25% of the concentrated solution), stirred at room temperature for 30 minutes, and the phase was stagnant. Separation was induced.
극성 불순물이 포함된 상층의 메탄올 층을 제거한 후, 하층인 메틸렌 클로라이드 층은 회수하여 회전증발기를 이용하여 감압상태에서 농축/건조하였다. 액체-액체 추출을 통해 얻은 건조된 조추출물을 시료로 사용하였고 남은 조추출물을 메틸렌 클로라이드에 20% (v/w) 비율로 녹이고 상용흡착제인 실로퓨트 (Fuji Silysia Chemical Ltd., Japan)를 건조된 조추출물 대비 100% (w/w) 비율로 첨가하여 40℃ 항온조(PS-1000, EYELA, Japan)에서 30분 동안 교반하며 반응시킨 후 여과하였다. 이 여과액을 30℃ 감압 하에 건조하여 헥산 침전 공정에 이용하였다. After removing the upper methanol layer containing the polar impurities, the lower methylene chloride layer was recovered and concentrated/dried under reduced pressure using a rotary evaporator. The dried crude extract obtained through liquid-liquid extraction was used as a sample, and the remaining crude extract was dissolved in methylene chloride at a ratio of 20% (v/w), and a commercial adsorbent, Silopute (Fuji Silysia Chemical Ltd., Japan) was dried The crude extract was added in a ratio of 100% (w/w) and reacted with stirring for 30 minutes in a thermostat (PS-1000, EYELA, Japan) at 40° C., followed by filtration. The filtrate was dried under reduced pressure at 30° C. and used in the hexane precipitation process.
건조된 시료를 메틸렌 클로라이드에 녹여 헥산(hexane)에 떨어뜨려(methylene chloride/hexane = 1/10, v/v) 침전을 유도하여 비극성 불순물(non-polar impurity)을 제거하였다. 헥산 침전 후, 여과를 통하여 얻어진 침전물을 35℃에서 24 시간 진공 건조하여 분별침전 공정에 이용하였다. 헥산 침전 공정을 통하여 얻은 다양한 순도의 미가공 파클리탁셀 (crude paclitaxel, 순도: 20.48, 63.6%)을 분별침전을 위한 시료로 사용하였다.The dried sample was dissolved in methylene chloride and dropped into hexane (methylene chloride/hexane = 1/10, v/v) to induce precipitation to remove non-polar impurity. After hexane precipitation, the precipitate obtained through filtration was vacuum-dried at 35° C. for 24 hours and used in the fractional precipitation process. Crude paclitaxel (purity: 20.48, 63.6%) of various purities obtained through the hexane precipitation process was used as a sample for fractional precipitation.
가스 버블 주입을 이용한 분별침전(fractional precipitation)Fractional precipitation using gas bubble injection
메탄올 용액에서 파클리탁셀의 용해도 차이를 이용한 분별침전 공정의 개략도를 도 1에 나타내었다. 구체적으로, 도 1의 (A)는 전통적인 분별침전 공정이고, 도 1의 (B)는 가스 버블을 이용한 개선된 분별침전 공정을 나타내고 있다.A schematic diagram of the fractional precipitation process using the difference in solubility of paclitaxel in methanol solution is shown in FIG. 1 . Specifically, Figure 1 (A) is a traditional fractionation precipitation process, Figure 1 (B) shows an improved fractionation precipitation process using gas bubbles.
본 실시예에서는 상기 실시예 2에서 수득된 미가공 파클리탁셀의 시료 (순도: 20.48, 63.6%)를 분별침전을 위해 순수 파클리탁셀 함량이 0.5%(w/v)가 되도록 메탄올에 용해하고 상온에서 메탄올/물 비율 (v/v)이 61.5:38.5이 될 때까지 증류수를 교반(180 rpm) 하에 한 방울씩 떨어뜨렸다. 증류수 첨가 끝난 뒤 용액에 기포발생기를 이용하여 침전 용액 내에 가스 버블(공기 버블)를 주입해주었다. 기포발생기의 가스 버블의 유량에 따른 영향을 조사하기 위하여 기포발생기(SH-A2, Amazonpet, Korea)에서 가스 유량(1.15, 4.52, 9.41 L/분) 변화에 따른 침전시간, 수율 및 순도를 조사하였다. 침전 후 침전물을 여과하여 40℃에서 24 시간 동안 진공오븐(UP-2000, EYELA, Japan)에서 건조하였다. 건조된 침전물의 순도와 수율은 HPLC로 분석하였다.In this example, the raw paclitaxel sample (purity: 20.48, 63.6%) obtained in Example 2 was dissolved in methanol so that the pure paclitaxel content was 0.5% (w/v) for fractional precipitation, and methanol/water at room temperature. Distilled water was added dropwise under stirring (180 rpm) until the ratio (v/v) was 61.5:38.5. After the addition of distilled water was completed, gas bubbles (air bubbles) were injected into the precipitation solution using a bubble generator. In order to investigate the effect of the gas bubble flow rate in the bubbler generator (SH-A2, Amazonpet, Korea), sedimentation time, yield, and purity according to the gas flow rate (1.15, 4.52, 9.41 L/min) change were investigated. . After precipitation, the precipitate was filtered and dried in a vacuum oven (UP-2000, EYELA, Japan) at 40°C for 24 hours. The purity and yield of the dried precipitate were analyzed by HPLC.
HPLC에 의한 파클리탁셀 분석Analysis of paclitaxel by HPLC
파클리탁셀 함량 분석을 위해 HPLC (high performance liquid chromatography) 시스템 (Waters, USA)과 Capell Pak C18 (250 × 4.6 mm, Shiseido, Japan) 컬럼을 사용하였다. 이동상은 아세토니트릴과 증류수 혼합용액(65/35~35/65, v/v, 구배 모드)을 유속 1.0 ㎖/분으로 흘려주었다. 시료 주입량은 20 ㎕이며 227 nm에서 UV에 의해 검출하였다. HPLC 분석은 표준정량곡선을 이용하였으며 표준시료는 Sigma-Aldrich 제품(순도: 95%)을 사용하였다.For the analysis of paclitaxel content, a high performance liquid chromatography (HPLC) system (Waters, USA) and a Capell Pak C 18 (250 × 4.6 mm, Shiseido, Japan) column were used. For the mobile phase, a mixed solution of acetonitrile and distilled water (65/35~35/65, v/v, gradient mode) was flowed at a flow rate of 1.0 ml/min. The sample injection amount was 20 μl and was detected by UV at 227 nm. For HPLC analysis, a standard quantitation curve was used, and a standard sample manufactured by Sigma-Aldrich (purity: 95%) was used.
도 2에 나타난 바와 같이, 가스 버블을 주입하지 않은 대조군(control group)의 경우, 시료 순도가 각각 20.48% 및 63.6 %일 때 침전시간은 각각 36시간 및 12시간 정도 소요되었고, 수율은 각각 57.99% 및 70.41%를 나타내었다. 반면 기포발생기에 의해 가스 버블(공기 버블)을 주입했을 경우, 공기 유량 1.15, 4.52 및 9.41 L/분에서 시료 순도가 20.48%일 때 침전시간 30분 정도의 소요로 수율은 각각 86.12, 86.75 및 87.01%를 나타냈고, 시료 순도가 63.6 %일 때는 침전시간 20분 정도 소요로 수율은 각각 93.12, 93.99 및 95.01%를 나타내었다.As shown in FIG. 2 , in the case of the control group that did not inject gas bubbles, when the sample purity was 20.48% and 63.6%, respectively, the precipitation time was about 36 hours and 12 hours, respectively, and the yield was 57.99%, respectively. and 70.41%. On the other hand, when gas bubbles (air bubbles) are injected by a bubbler, when the sample purity is 20.48% at an air flow rate of 1.15, 4.52, and 9.41 L/min, it takes about 30 minutes of settling time, and the yield is 86.12, 86.75 and 87.01, respectively. %, and when the sample purity was 63.6%, it took about 20 minutes for precipitation time, and the yields were 93.12, 93.99 and 95.01%, respectively.
또한, 분별침전 후 시료의 순도는 도 3에서 확인되는 바와 같이 가스 버블을 주입하지 않은 대조군의 경우, 시료 순도가 20.48 및 63.6%일 때 침전시간은 각각 36시간 및 12시간 정도 소요되었으며, 순도는 각각 29.67 및 84.90%를 나타내었다. 반면 가스 버블을 주입했을 경우, 공기 유량 1.15, 4.52 및 9.41 L/분에서 시료 순도가 20.48%일 때 침전시간 30분 정도 소요로 순도는 각각 33.44, 33.57 및 33.59%를 나타내었고, 시료 순도가 63.6%일 때는 침전시간 20분 정도 소요로 각각 82.16, 83.15 및 83.46%의 순도를 나타냈다.In addition, as shown in FIG. 3, the purity of the sample after fractional precipitation was about 36 hours and 12 hours, respectively, when the sample purity was 20.48 and 63.6% in the control group that did not inject gas bubbles, and the purity was 29.67 and 84.90%, respectively. On the other hand, when gas bubbles were injected, when the sample purity was 20.48% at an air flow rate of 1.15, 4.52, and 9.41 L/min, it took about 30 minutes for precipitation time to be 33.44, 33.57, and 33.59%, respectively, and the purity of the sample was 63.6. %, it took about 20 minutes for precipitation time to show purity of 82.16, 83.15, and 83.46%, respectively.
유사한 수율과 순도를 얻기 위해 기존 분별침전에서는 저온(0~4℃) 조업으로 3일(72시간) 정도의 침전시간이 소요되었으며[Kim et al. (2004), A large-scale purification of paclitaxel from cell cultures of Taxus chinensis, Process Biochemistry, 39, 1985-1991; Kim et al. (2000), Fractional precipitation for paclitaxel pre-purification from plant cell cultures of Taxus chinensis, Biotechnology Letters, 22, 1753-1756; Kim et al. (2002), A novel prepurification for paclitaxel from plant cell cultures, Process Biochemistry, 37, 679-682; Kim et al. (2006) Optimal temperature control in fractional precipitation for paclitaxel pre-purification, Process Biochemistry, 41, 276-280], 반응액 부피당 표면적(surface area per volume of reaction solution, S/V)이 증가된 개선된 분별침전(표면적 증가 물질: 유리 비드 (glass bead), Amberlite 200, 또는 Amberlite IRA 400 등)의 경우에도 [Kim et al. (2009), Improvement of fractional precipitation process for pre-purification of paclitaxel, Process Biochemistry, 44, 736-741; Kim et al. (2012) Effect of reactor type on the purification efficiency of paclitaxel in the increased surface area fractional precipitation process, Separation and Purification Technology, 99, 14-19; Kim et al. (2010) Development of a micelle-fractional precipitation hybrid process for the pre-purification of paclitaxel from plant cell cultures, Process Biochemistry, 45, 1368-1374; Kim et al. (2012), Evaluation of the effect of crude extract purity and pure paclitaxel content on the increased surface area fractional precipitation process for the purification of paclitaxel, Process Biochem, 47, 2388-2397], 저온(0-4℃) 조업으로 ~12시간 정도의 침전시간이 소요되었다.In order to obtain similar yield and purity, in the existing fractional precipitation, it took about 3 days (72 hours) of precipitation time due to low temperature (0~4℃) operation [Kim et al. (2004), A large-scale purification of paclitaxel from cell cultures of Taxus chinensis, Process Biochemistry, 39, 1985-1991; Kim et al. (2000), Fractional precipitation for paclitaxel pre-purification from plant cell cultures of Taxus chinensis , Biotechnology Letters, 22, 1753-1756; Kim et al. (2002), A novel prepurification for paclitaxel from plant cell cultures, Process Biochemistry, 37, 679-682; Kim et al. (2006) Optimal temperature control in fractional precipitation for paclitaxel pre-purification, Process Biochemistry, 41, 276-280], improved fractional precipitation with increased surface area per volume of reaction solution (S/V) ( Surface area increasing materials: glass beads, Amberlite 200, or Amberlite IRA 400, etc.) [Kim et al. (2009), Improvement of fractional precipitation process for pre-purification of paclitaxel, Process Biochemistry, 44, 736-741; Kim et al. (2012) Effect of reactor type on the purification efficiency of paclitaxel in the increased surface area fractional precipitation process, Separation and Purification Technology, 99, 14-19; Kim et al. (2010) Development of a micelle-fractional precipitation hybrid process for the pre-purification of paclitaxel from plant cell cultures, Process Biochemistry, 45, 1368-1374; Kim et al. (2012), Evaluation of the effect of crude extract purity and pure paclitaxel content on the increased surface area fractional precipitation process for the purification of paclitaxel, Process Biochem, 47, 2388-2397], with low temperature (0-4℃) operation ~ The settling time was about 12 hours.
이에 반해, 본 발명에서는 상온에서 분별침전 시 가스 버블을 주입하는 경우 시료 순도가 20.48 및 63.6%일 때 침전시간은 1.00L/분 이상의 일정한 가스(공기) 유량만 유지한다면, 가스(공기) 유량 변화에 관계 없이 각각 30분 및 20분 내에 침전이 완료되는 것을 확인하였다. 이러한 현상은 분별침전 시 가스 버블의 주입으로 용질의 물질 전달이 향상되고 가스 버블의 표면이 핵 생성의 중심으로 작용하여 침전이 빨라지는 것으로 판단된다. 이는 초음파(ultrasound)를 이용한 분별침전과 유사하나 (Kim et al. (2019), Ultrasound-assisted fractional precipitation of paclitaxel from Taxus chinensis cell cultures, Process Biochem, 87, 238-243), 경제성 측면에서 본다면 오히려 초음파를 이용한 분별침전보다 본 발명의 가스 버블을 이용한 분별침전이 동일한 효과 대비 경제성이 우수하여 파클리탁셀의 원가 절감에 기여할 수 있을 것으로 판단된다.In contrast, in the present invention, when gas bubbles are injected during fractional precipitation at room temperature, when the sample purity is 20.48 and 63.6%, the precipitation time is 1.00 L/min or more. If only a constant gas (air) flow rate is maintained, the gas (air) flow rate changes Regardless, it was confirmed that the precipitation was completed within 30 minutes and 20 minutes, respectively. It is considered that this phenomenon improves the mass transfer of the solute by the injection of gas bubbles during fractional precipitation, and the surface of the gas bubble acts as the center of nucleation, thereby speeding up precipitation. This is similar to fractional precipitation using ultrasound (Kim et al. (2019), Ultrasound-assisted fractional precipitation of paclitaxel from Taxus chinensis cell cultures, Process Biochem, 87, 238-243). It is judged that fractional precipitation using gas bubbles of the present invention is more economical compared to the same effect than fractional precipitation using
결과적으로, 분별침전 시 침전 용액에 가스 버블을 주입하는 경우 통상의 분별침전방법에 비해 침전시간을 획기적으로 단축시킬 수 있을 뿐만 아니라, 동일한 침전시간 시간 대비 파클리탁셀의 수율 및 순도를 획기적으로 향상시킬 수 있고, 나아가 분별침전을 위한 조업 조건 (저온 조업) 또한 획기적으로 개선시킬 수 있다.As a result, when gas bubbles are injected into the precipitation solution during fractional precipitation, the precipitation time can be significantly shortened compared to the conventional fractional precipitation method, and the yield and purity of paclitaxel can be dramatically improved compared to the same precipitation time. Furthermore, the operating conditions (low-temperature operation) for fractional precipitation can also be dramatically improved.
Claims (10)
상기 가스 버블은 1.00L/분 이상의 가스 유량으로 30분 이하의 시간 동안 주입되는, 분별침전방법.A fractional precipitation method performed by injecting gas bubbles during purification of paclitaxel,
The gas bubble is injected for a time of 30 minutes or less at a gas flow rate of 1.00 L/min or more, fractional precipitation method.
b) 유기용매 추출을 수행하는 단계;
c) 액체-액체 추출을 수행하는 단계;
d) 흡착제를 처리하는 단계;
e) 헥산 침전 추출을 수행하는 단계; 및
f) 제1항의 분별침전단계; 를 포함하는 파클리탁셀 정제방법.a) obtaining biomass from a cell culture medium of a taxus genus plant;
b) performing organic solvent extraction;
c) performing liquid-liquid extraction;
d) treating the adsorbent;
e) performing hexane precipitation extraction; and
f) the fractional precipitation step of paragraph 1; A method for purifying paclitaxel comprising a.
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