KR20220148613A - 다중 면역조직화학염색을 이용한 암 환자의 면역 관문 억제제에 대한 치료 반응성을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법 - Google Patents
다중 면역조직화학염색을 이용한 암 환자의 면역 관문 억제제에 대한 치료 반응성을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
다중 면역조직화학염색을 이용하여 암 환자의 면역 관문 억제제에 대한 치료 반응성을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것으로, 암 환자의 종양 조직에 다중 면역조직화학염색을 수행하여 면역 관문 분자의 발현 수준을 자동화된 방법에 의해 측정함으로써, 정확하고 신속하게 암 환자의 면역 관문 억제제 치료 반응성에 대한 예측이 가능하다. 또한, 기존의 단일 면역조직화학염색을 이용하는 방법과는 다르게 하나의 세포에서 동시에 발현되는 마커를 분석하여 자동화된 방법으로 평가함으로써 검사자에 따른 오류를 줄일 수 있으므로, 면역 관문 억제제에 대한 동반진단 방법으로서 널리 활용될 것이다.
Description
다중 면역조직화학염색을 이용하여 암 환자의 면역 관문 억제제에 대한 치료 반응성을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
2010년대 중반 면역 항암제 경쟁에서 개발 속도가 앞섰던 BMS 社의 옵디보(opdivo, 성분명: nivolumab)를 머크(MSD) 社의 키트루다(Keytruda, 성분명: Pembrolizumab)가 이길 수 있었던 결정적인 이유는 동반진단 기준이였다.
BMS는 비소세포폐암 1차 치료제로서 니볼루맙을 테스트하는 임상 3상에서 PD-L1 발현 기준을 5%로 설정하였으나, 선정한 환자에서 표준 화학 항암제 대비 우수성을 입증하지 못하였다. 반면에, 머크는 비소세포폐암 환자 대상 임상3상에서 PD-L1 기준을 50%로 높게 잡았으며 표준 화학 항암제 대비 무진행생존률(PFS)과 생존 기간(OS)을 유의미하게 증가시킨 결과를 바탕으로 2016년 FDA로부터 비소세포폐암 1차 치료제 승인을 받았다. 이는 동반진단의 중요성을 보여주는 사례이다.
한편, 동반진단(companion diagnostics)은 특정 약물 처방에 대한 환자의 반응을 측정하는데 사용되는 생물학적 진단 방법으로, 의약품과 같이 개발 출시되는 진단 제품 및 이를 활용한 진단 방법을 의미한다. 이러한 동반진단을 이용한 맞춤 의료를 통해 항암제 부작용에 따르는 위험을 감소시키는 보다 안전한 처방이 가능하다.
현재, 많은 제약 회사들이 면역 항암 치료제 개발에 있어서 적합한 동물 모델의 부재와 동반 진단 평가 방법의 부재로 인한 어려움을 겪고 있는 상황이다. 따라서 다중 마커 분석이 가능하며 세포들의 프로파일링을 동시에 가능한 멀티플렉스 면역 병리 시스템 구축과 대량으로 전체 슬라이드를 고속 촬영이 가능하면서 획득한 결과를 병리 임상의의 감독 하에서 정확한 분석이 대량으로 가능한 시스템 구축이 절실히 필요한 상황이다. 또한, 면역 항암제 처방 이후 치료 반응에 대한 면역 모니터링 및 종합적인 판단이 가능한 시스템 구축에 대한 요구가 급증하고 있는 상황이다.
이에, 본 발명자들은 암 환자의 면역 관문 억제제에 대한 치료 반응성을 정확하게 예측하기 위한 방법을 연구한 결과, 암 조직에 다중 면역조직화학염색을 수행하여 면역 관문 분자의 발현 수준을 자동화된 방법으로 측정함으로써 면역 관문 억제제에 대한 반응성을 정확하게 예측할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은, 암 환자의 면역 관문 억제제에 대한 치료 반응성을 예측하기 위한 정보를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 일 양상은 암 환자로부터 수득한 종양 조직에 다중 면역조직화학염색(Multiplex Immunohistochemistry)을 수행하여 면역 관문(Immune Checkpoint) 분자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 면역 관문 억제제에 대한 암 환자의 치료 반응성을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
다중 면역조직화학염색(Multiplex Immunohistochemistry, multiplex IHC) 분석법은 하나의 슬라이드에서 다중 타겟을 동시 염색이 가능한 기법이다. 일반적인 조직 염색은 항체 사용의 제한으로 한 슬라이드에 3개 이상의 타겟을 염색하기가 힘들지만 multiplex IHC 분석법은 최대 9개의 타겟을 동시 염색 가능한 것으로 알려져 있다. 또한, 일반적인 형광 현미경이나 공초점 현미경에서는 Bleedthrough (excitation cross-talk와 emission cross-talk으로 파장이 겹쳐지는 현상)으로 가까운 spectrum의 형광 염료를 사용하기 어려움이 있지만, multiplex IHC 분석법은 자동화한 알고리즘으로 spectrum unmixing이 가능한 장비로 영상화하여 각각의 고유 형광 뿐만 아니라 조직의 자가 형광을 분리함으로써 정확한 영상의 결과를 얻을 수 있다. Multiplex IHC 분석법은 영상화를 통해 정보를 획득하고 자동으로 조직 및 세포를 segmentation하여, 각각의 타겟과 면역 세포들 간의 연관 관계를 자동 분석하며, 조직 시료의 대량 분석과 정량 분석이 가능한 방법이다.
용어 "면역 관문 억제제(immune checkpoint inhibitor)"는 인체가 가진 면역세포의 면역기능을 활성화시켜 암세포와 싸우게 하는 암 치료법을 의미한다.
용어 "치료 반응성"은 개개의 환자의 암에 대해 특정 약물 예를 들어, 항암제가 치료 효과를 나타내는지 여부를 의미한다. 용어 "암 환자의 치료 반응성 예측"은 약제의 투약이 암의 치료에 유용할 수 있는지의 여부를 투약 전에 미리 예측하는 것을 의미할 수 있고, 면역 관문 분자의 발현 수준을 측정하여 약제에 대한 치료 반응성을 예측하는 것일 수 있다. 용어 "예측"은 면역 관문 분자의 발현 수준과 같은 특징의 확인을 통해 특정 결과 예컨대, 치료 반응성을 미리 판단하는 것을 의미할 수 있다.
상기 면역 관문 분자는 PD-L1, PD-1 및 CTLA-4로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
일 구현예에서, 비소세포폐암 환자의 조직의 암세포 및 면역세포로부터 PD-L1 및 PD-1의 발현 수준을 측정한 결과를 확인할 수 있다.
용어 "PD-L1(Programmed death-ligand 1)"은 암세포의 표면이나 조혈세포에 있는 단백질을 의미하며, CD274, B7-H1라고도 부른다. 암세포의 표면에 있는 단백질인 PD-L1, PD-L2가 T세포의 표면에 있는 단백질인 PD-1과 결합하면, T세포는 암세포를 공격하지 못한다. 면역 항암제는 T세포의 PD-1 수용체에 달라붙어 암세포의 회피 기능을 억제한다. MSD의 키트루다와 옵디보가 작용하는 원리다.
용어 "PD-1(Programmed death-ligand 1)"은 활성화된 T세포(면역세포)의 표면에 있는 단백질을 의미하며, CD279라고도 부른다.
용어 "CTLA-4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4)"는 면역 관문 역할을 하고 면역 반응을 하향 조절하는 단백질 수용체를 의미하며, CD152 (cluster of differentiation 152)라고도 부른다. CTLA4는 regulatory T cells에서 본질적으로 발현되지만 활성화 후 기존 T 세포에서만 상향 조절된다. 이 현상은 특히 암에서 두드러지며, 항원 제시 세포 표면의 CD80 또는 CD86에 결합되는 경우에 "off" 스위치로서 작동한다.
상기 면역 관문 분자의 발현 수준은 암 세포 및/또는 면역 세포에서 측정할 수 있다.
상기 면역 관문 분자의 발현 수준은 TPS (Tumor proportion score) 또는 CPS(combined positive score) 값으로 측정할 수 있다.
용어 "TPS (Tumor proportion score)"는 면역 관문 분자를 발현하는 암세포의 비율을 의미하고, 용어 "CPS(combined positive score)"는 면역 관문 분자를 발현하는 암세포와 면역세포의 비율을 의미한다.
TPS (Tumor proportion score) 또는 CPS(combined positive score)를 계산하는 식은 다음과 같다.
상기 다중 면역조직화학염색법은 암세포 및 면역세포 각각에 특이적인 마커의 항체를 사용하여 수행할 수 있다.
일 구현예에서, CD4는 Helper T cell, CD8은 Cytotoxic T cell, Foxp3은 Regulatory T cell, pan-Cytokeratin (CK)은 종양 세포, DAPI는 핵에 대한 특이적 마커이며, 면역 관문 분자인 PD-1 및 PD-L1의 항체를 사용하여 비소세포폐암 환자의 조직을 염색하였다.
이러한 항체의 구성은 CD3 (total T cell), CD68 (pan-macrophage), PD-L1, PD-1, CK, DAPI 또는 CD8, Foxp3, CD68, PD-1, PD-L1, CK, DAPI로 변경할 수 있다.
상기 면역 관문 분자의 발현 수준은 염색 형태를 기반으로 하여 기계 학습(Machine Learning)을 통하여 측정할 수 있다.
용어 "기계 학습(Machine Learning)"은 컴퓨터 프로그램이 데이터와 처리 경험을 이용한 학습을 통해 정보 처리 능력을 향상시키는 것 또는 이와 관련된 연구 분야를 의미하며, 다수의 파라미터로 구성된 모델을 이용하여, 주어진 데이터로 파라미터를 최적화할 수 있다.
기존의 단일 IHC를 이용한 PD-L1의 동반진단의 경우에는 PD-L1의 발현이 양성인 세포를 병리의가 직접 판단하고 이의 개수 측정을 수작업에 의하므로 병리의에 따른 편차가 존재하는 문제점이 존재한다. 따라서, 이를 기계 학습에 의한 자동화된 방식으로 측정하여 정확도를 높일 수 있다.
상기 염색 형태는 염색 강도, 염색 위치, 염색 유사도, 자가 형광으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 일 수 있다.
염색 강도는 염색의 진한 정도로서, 예를 들어, weak, mild, strong 등으로 구분할 수 있고, 염색 위치는 세포막, 핵, 세포질 등으로 구분할 수 있으며, 염색 유사도는 단일 IHC 이미지와 비교하여 유사한 정도이고, 자가 형광은 조직 자체의 형광을 의미할 수 있다.
상기 기계 학습은 종양 세포 군집(nest) 및 스트로마(stroma)를 구분하는 단계; 암세포 및 면역세포를 구분하는 단계; 및 상기 암세포 및 면역세포 각각에서 면역 관문 분자를 발현하는지 여부를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 암은 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 흑색종, 호지킨림프종, 위암, 요로상피세포암, 두경부암, 간암, 대장암, 전립선암, 췌장암, 간암, 고환암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 방광암, 뇌암, 유방암, 및 신장암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
일 양상에 따른 암 환자의 종양 조직에 다중 면역조직화학염색을 수행하여 면역 관문 분자의 발현 수준을 자동화된 방법에 의해 측정함으로써, 정확하고 신속하게 암 환자의 면역 관문 억제제 치료 반응성에 대한 예측이 가능하며, 기존의 단일 면역조직화학염색을 이용하는 방법과는 다르게 하나의 세포에서 동시에 발현되는 마커를 분석하여 평가함으로써 검사자에 따른 오류를 줄일 수 있으므로, 면역 관문 억제제에 대한 동반진단 방법으로서 널리 활용될 것이다.
도 1은 일 양상에 의한 비소세포폐암 환자의 종양 조직에 다중 면역조직화학염색하여 수득한 이미지를 각 파장대 별로 spectral unmixing을 수행하는 과정을 나타내고 도 2는 그 결과이다.
도 3은 일 양상에 의한 비소세포폐암 환자의 종양 조직에 다중 면역조직화학염색하여 수득한 이미지를 pathology view를 통해 각 dye 별 항체 발현을 확인한 결과이다.
도 4는 일 양상에 의한 비소세포폐암 환자의 종양 조직에 다중 면역조직화학염색하여 수득한 이미지를 기계 학습을 통하여 tissue segmentation을 수행한 결과이다.
도 5는 일 양상에 의한 비소세포폐암 환자의 종양 조직에 다중 면역조직화학염색하여 수득한 이미지를 기계 학습을 통하여 cell segmentation을 수행한 결과이다.
도 6은 일 양상에 의한 비소세포폐암 환자의 종양 조직에 다중 면역조직화학염색하여 수득한 이미지를 기계 학습을 통하여 Phenotyping을 수행한 결과이다.
도 7은 일 양상에 의한 비소세포폐암 환자의 종양 조직에 다중 면역조직화학염색하여 수득한 이미지를 기계 학습을 통하여 Phenotyping 한 결과를 정량적으로 분석한 결과이다.
도 8은 일 양상에 의한 비소세포폐암 환자의 종양 조직에 다중 면역조직화학염색하여 수득한 이미지를 기계 학습을 통하여 분석한 결과로 TPS 값을 계산한 결과이다.
도 9는 일 양상에 의한 비소세포폐암 환자의 종양 조직에 다중 면역조직화학염색하여 수득한 이미지를 기계 학습을 통하여 분석한 결과로 CPS 값을 계산한 결과이다.
도 3은 일 양상에 의한 비소세포폐암 환자의 종양 조직에 다중 면역조직화학염색하여 수득한 이미지를 pathology view를 통해 각 dye 별 항체 발현을 확인한 결과이다.
도 4는 일 양상에 의한 비소세포폐암 환자의 종양 조직에 다중 면역조직화학염색하여 수득한 이미지를 기계 학습을 통하여 tissue segmentation을 수행한 결과이다.
도 5는 일 양상에 의한 비소세포폐암 환자의 종양 조직에 다중 면역조직화학염색하여 수득한 이미지를 기계 학습을 통하여 cell segmentation을 수행한 결과이다.
도 6은 일 양상에 의한 비소세포폐암 환자의 종양 조직에 다중 면역조직화학염색하여 수득한 이미지를 기계 학습을 통하여 Phenotyping을 수행한 결과이다.
도 7은 일 양상에 의한 비소세포폐암 환자의 종양 조직에 다중 면역조직화학염색하여 수득한 이미지를 기계 학습을 통하여 Phenotyping 한 결과를 정량적으로 분석한 결과이다.
도 8은 일 양상에 의한 비소세포폐암 환자의 종양 조직에 다중 면역조직화학염색하여 수득한 이미지를 기계 학습을 통하여 분석한 결과로 TPS 값을 계산한 결과이다.
도 9는 일 양상에 의한 비소세포폐암 환자의 종양 조직에 다중 면역조직화학염색하여 수득한 이미지를 기계 학습을 통하여 분석한 결과로 CPS 값을 계산한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 종양 조직의 준비
비소세포폐암 환자에서 약물 투여 전 진단을 위한 생검 조직의 포르말린 고정 파라핀 포매(Formalin Fixation and Paraffin Embedding, FFPE)를 이용하였다. 비소세포폐암 환자의 생검 조직을 포르말린을 이용하여 고정을 하였으며 탈수, 투명, 파라핀 침투를 통해 파라핀 블록을 제작하였다.
실시예 2. 다중 면역조직화학염색(Multiplex Immunohistochemistry)
비소세포폐암 환자 종양 조직의 포르말린 고정 파라핀 포매 블록을 4 μm 두께로 절단하여 슬라이드를 제작하였다. 슬라이드를 Leica Bond Rx™ Automated Stainer (Leica Biosystems, Newcastle, UK)로 다중 면역 형광 염색을 수행하였다.
구체적으로, 슬라이드를 30분 동안 60℃의 건조 오븐에서 가열하여 파라핀을 녹인 후에 Leica Bond Dewax 용액(# AR9222, Leica Biosystems)으로 탈 왁스 처리한 다음, pH 9.0 용액에서 30분 동안 Bond Epitope Retrieval 2(# AR9640, Leica Biosystems)로 항원 복원(retrieval)을 과정을 수행하였다.
첫 번째 항원의 1차 항체를 30분 동안 반응시킨 후, Polymer HRP(horseradish peroxidase) Ms + Rb (ARH1001EA, AKOYA Biosciences)를 사용하여 10분 동안 2차 항체를 반응시켰다. 첫 번째 항체의 시각화는 10분 동안 형광 표지 TSA (Tyramide signal amplification; 일반적으로 1:150으로 희석)를 사용하여 수행하였으며, 그 후 슬라이드에 20분 동안 Bond Epitope Retrieval 1(# AR9961, Leica Biosystems)을 처리하여 순차적인 다음 단계 전에 결합된 항체를 제거하였다.
다른 항원에 대해서도 각 마커의 최적 조건하에서 첫 번째 항체 시각화와 동일한 방법으로 수행하였다. 마지막 항체의 경우는 시각화를 위해 10분 동안 TSA-DIG(1:100으로 희석)으로 표지한 후 anti-DIG 780 항체를 사용하여 수행하였다.
슬라이드에 대한 다중 마커 염색이 끝난 후 마지막으로 핵을 DAPI로 염색하여 시각화하고 슬라이드를 ProLong Gold 안티 페이드 시약(P36934, Invitrogen)을 사용하여 커버 슬립을 덮었다.
실시예 3. 다중 면역조직화학염색 이미지 수득
실시예 2에 기재된 방법에 의해 다양한 항체로 염색된 슬라이드는 Vectra Polaris Automated Quantitative Pathology Imaging System (Akoya Biosciences, Marlborough, MA)을 사용하여 스캔함으로써 이미지를 수득하였다.
실시예 4. 다중 면역조직화학염색 이미지의 디지털 분석
실시예 3에 기재된 방법으로 수득한 이미지는 inform 2.4 소프트웨어 및 TIBCO Spotfire™ (Akoya Biosciences, Marlborough, MA)를 사용하여 다음과 같이 분석하였다.
정확한 spectral unmixing을 위하여 각 단일 스펙트럼의 대표적인 슬라이드와 염색되지 않은 조직 슬라이드를 사용하였다. 개별적으로 염색된 각각의 슬라이드는 다중 스펙트럼 분석에 필요한 형광 단일 스펙트럼 라이브러리를 설정하는데 사용하였다. 설정된 스펙트럼 라이브러리는 spectral unmixing을 사용하여 다중 스펙트럼 데이터로부터 각 마커에 해당하는 형광 이미지를 추출하였으며, 핵 스펙트럼(DAPI)을 감지하여 각 세포를 식별하였다.
InForm 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 종양 세포 군집(tumor cell nest)과 stroma 부위로 tissue segmentation을 수행하였으며, DAPI 염색을 통해 cell segmentation을 수행하였다. 그리고 나서, 각각의 면역 세포 특이적 마커 염색을 이용하여 각 세포들의 분석 알고리즘을 구축하고, 구축한 알고리즘을 이용하여 스캔한 슬라이드 중에서 선택된 영역의 phenotyping을 수행하였다. Phenotyping 결과를 Spotfire™ 소프트웨어로 전송하여 필요한 데이터를 분석하였다.
실험예 1. 비소세포폐암 환자 폐 조직의 다중 면역화학조직염색
실시예 2에 기재된 방법을 사용하여, 실시예 1에서 준비한 비소세포폐암 환자의 7명의 폐 조직 슬라이드 각각을 하기의 표 1에 기재된 구성으로 다중 면역화학조직염색을 수행하였다.
| Antibody | Titration | TSA | Titration | |
| Tissue | Lung Pannel 1 | |||
| 1 st | Foxp3 | 1:100 | Opal480 | 1:300 |
| 2 nd | PD-L1 | 1:300 | Opal520 | 1:300 |
| 3 rd | CD8 | 1:300 | Opal570 | 1:300 |
| 4 th | CD4 | 1:100 | Opal620 | 1:300 |
| 5 th | PD-1 | 1:500 | Opal690 | 1:300 |
| 6 th | CK | 1:300 | Opal780 | 1:300 |
CD4는 Helper T cell, CD8은 Cytotoxic T cell, Foxp3은 Regulatory T cell, pan-Cytokeratin (CK)은 종양 세포, DAPI는 핵에 대한 특이적 항체이며, PD-1 및 PD-L1은 면역 관문 분자이다.
실험예 2. 다중 면역화학조직염색 이미지의 디지털 분석을 통한 TPS 및 CPS 값의 계산
실험예 1에서 염색한 7개의 슬라이드를 실시예 3에 기재된 방법으로 스캔하여 이미지를 수득하고, 실시예 4에 기재된 방법으로 데이터를 분석하였다.
구체적으로, 도 1에 나타낸 바와 같이, 다중 면역화학조직염색한 슬라이드를 각 마커의 파장대 별로 spectral unmixing을 수행하고(도 2), pathology view를 통해 CK, CD8, PD-L1, CD4, PD-1, Foxp3가 발현되는 것을 확인하였다(도 3).
Cytokeratin이 염색된 영역을 인지하여 종양 세포 군집(붉은색)으로 판단하고 그 이외의 영역은 stroma(녹색)로 판단하는 기계 학습(Machine training)을 통하여, tissue segmentation을 수행하였다(도 4).
Counterstain (DAPI)를 이용하여 cell segmentation을 수행하였다(도 5). 다양한 세포의 핵 모양에 대하여 최대한 정확히 설정하여 세포 영역을 구분하였다.
Cytokeratin은 상피 세포와 종양을 중심으로 세포막에 염색된 경우, CD4와 CD8는 세포막에 진하게 염색된 경우, Foxp3는 핵에 진하게 염색된 경우, PD-L1은 종양 내 및 종양 인접 주위 기질에 있는 면역 세포 및 종양 세포 세포막에 염색된 경우를 양성으로 판단하는 phenotyping 분석 알고리즘을 구축하였다. 구축된 분석 알고리즘을 사용하는 Train classifier를 통해 phenotyping되지 않은 전체 이미지 영역에 대한 training을 진행하였다(도 6). 2~3회 반복하여 phenotyping을 진행하였으며, 분석 이미지 상의 phenotyping이 구분 될 때까지 진행하였다.
Cytokeratin 에 대하여 양성으로 판단되는 세포는 암 세포로 지정하고, PD-L1 마커가 공동으로 염색된 세포와 아닌 세포를 구분하여 PD-L1 발현 암세포와 일반 암세포를 구분하였다. 또한, CD4에 대하여 양성으로 판단되는 세포는 Helper T cell, CD8에 대하여 양성으로 판단되는 세포는 Cytotoxic T cell, Foxp3에 대하여 양성으로 판단되는 세포는 Regulatory T cell로 지정하고, PD-L1 마커가 공동으로 염색된 세포와 아닌 세포를 구분하여 PD-L1 발현 면역세포와 일반 면역세포를 구분하였다.
Phenotyping이 완료된 이미지 파일을 Spotfire™ 소프트웨어로 전송하여 종양 세포 군집 또는 stroma에서 CD4, CD8, PD-1, Foxp3, PD-L1에 대하여 양성으로 판단된 세포의 수를 정량화하였다(도 7).
정량화된 데이터 값을 하기의 식에 대입하여 7명 비소세포폐암 환자의 TPS와 CPS 값을 계산하였다(도 8 및 도 9).
TPS = 100 * [PD-L1+ tumor cell] / [Total tumor cell]
CPS = 100 * ([PD-L1+ tumor cell] + [PD-L1+ helper T cell] + [PD-L1+ Treg] + [PD-L1+ cytotoxic T cell]) / [Total tumor cell]
또한, 7명의 비소세포폐암 환자에게 면역 관문 억제제를 투여한 치료 반응에 대한 임상 결과와 상기 과정을 통해 확보한 TPS와 CPS 값 및 기존 방법인 22C3과 SP23을 통하여 측정한 결과와 비교한 데이터는 하기의 표 2에 기재된 바와 같다.
22C3(PD-L1 IHC 22C3 pharmDx Overview; Agilent)은 PD-L1에 대한 단일 면역조직화학염색을 이용하여, PD-1 타겟 치료제인 키트루다 투여에 적합한지 여부를 진단하는 방법으로, cutoff 50% 이상인 경우에 키트루다 투여에 적합하다고 판단한다.
SP263(VENTANA PD-L1 (SP263) assay; Roche)은 비소세포폐암과 요로 피암종 조직의 PD-L1 면역조직화학염색을 통해 임핀지 또는 키트루다 투여 환자 선별에 이용되며 옵티보 투여는 치료 예후 분석에 사용되고 있다. 이 방법은 병리의에 의해 해석되어야 하며 약의 투여 가이드는 약물별로 구분이 된다.
| 환자 | TPS | CPS | 22C3 | SP263 | 치료 반응 |
| 1 | 93 | 105 | - | 100% | 부분 관해 |
| 2 | 18 | 18 | - | - | 부분 관해 |
| 3 | 1 | 1 | 60% | 50% | 진행 병변 |
| 4 | 5 | 5 | 20% | 15% | 진행 병변 |
| 5 | 44 | 47 | 80% | 70% | 부분 관해 |
| 6 | 37 | 46 | 60% | 55% | 안정 병변 |
| 7 | 10 | 11 | 20% | 20% | 진행 병변 |
그 결과, 본 발명을 통하여 측정한 TPS와 CPS 값이 높은 환자는 대부분 면역 관문 억제제를 투여한 경우에 치료 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 한편, 환자 3의 경우에, 본 발명으로 분석한 결과 1%의 낮은 수치를 나타내지만 기존 결과는 50% 이상의 높은 수치를 나타내고, 치료 반응은 진행 병변으로서, 기존 방법의 예측이 어긋난 것을 확인하였다. 기존 방법은 수작업에 의하므로 병리 의사의 숙련도에 의존하는 것으로서, 암 세포에 발현되는 PD-L1, 면역 세포에 발현되는 PD-L1의 양을 단순 하나의 마커로 분석하는 것은 본 발명과 비교하여 정확도가 낮은 것을 알 수 있었다.
Claims (9)
- 암 환자로부터 수득한 종양 조직에 다중 면역조직화학염색(Multiplex Immunohistochemistry)을 수행하여 면역 관문(Immune Checkpoint) 분자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 면역 관문 억제제에 대한 암 환자의 치료 반응성을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
- 청구항 1에 있어서,
상기 면역 관문 분자는 PD-L1, PD-1 및 CTLA-4로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 면역 관문 분자의 발현 수준은 암 세포 또는 면역 세포에서 측정하는 것인 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 면역 관문 분자의 발현 수준은 TPS (Tumor proportion score) 또는 CPS(combined positive score) 값으로 측정하는 것인 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 다중 면역조직화학염색법은 암세포 및 면역세포 각각에 특이적인 항체를 사용하여 수행하는 것인 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 면역 관문 분자의 발현 수준은 염색 형태를 기반으로 하여 기계 학습(Machine Learning)을 통하여 측정하는 것인 방법. - 청구항 6에 있어서,
상기 염색 형태는 염색 강도, 염색 위치, 염색 유사도, 자가 형광으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 방법. - 청구항 6에 있어서,
상기 기계 학습은 종양 세포 군집(nest) 및 스트로마(stroma)를 구분하는 단계; 암세포 및 면역세포를 구분하는 단계; 및 상기 암세포 및 면역세포 각각에서 면역 관문 분자를 발현하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 것인 방법. - 제1항에 있어서,
상기 암은 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 흑색종, 호지킨림프종, 위암, 요로상피세포암, 두경부암, 간암, 대장암, 전립선암, 췌장암, 간암, 고환암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 방광암, 뇌암, 유방암, 및 신장암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 방법.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210055916A KR102546414B1 (ko) | 2021-04-29 | 2021-04-29 | 다중 면역조직화학염색을 이용한 암 환자의 면역 관문 억제제에 대한 치료 반응성을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법 |
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