KR20220148441A - 미세플라스틱 노출에 의해 유도되는 암 진단용 바이오마커 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

미세플라스틱 노출에 의해 유도되는 암 진단용 바이오마커 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미세플라스틱 노출에 의해 유도되는 암 진단용 바이오마커 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 미세플라스틱 (PS)에 노출된 위암 조직에서 ASGR2, PITX2, PLEKHS1 및 EQTN의 발현 수준 변화가 확인되었으며, 상기 ASGR2, PITX2, PLEKHS1 및 EQTN은 PS 노출에 의해 아형의 발현 변화가 나타나는 것이 확인되었으며, 상기 유전자의 발현 수준 변화에 의해 전체 생존율에도 영향을 미치는 것으로 확인됨에 따라, 상기 유전자들은 PS에 노출에 의해 유도된 위암을 진단하기 위한 바이오마커로 제공될 수 있다.

Description

미세플라스틱 노출에 의해 유도되는 암 진단용 바이오마커 조성물 및 이의 용도{Biomarker composition for diagnosing cancer induced by microplastic exposure and uses thereof}
본 발명은 미세플라스틱 노출에 의해 유도되는 암 진단용 바이오마커 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
위암은 아시아에서 매우 흔한 암이며, 세계적으로 암 사망의 주된 원인 중 하나이다. 지난 수년간 위암의 조기 진단 및 치료뿐만 아니라 그 발암 기작에 대한 이해를 증진시키기 위해, 위암의 발달과 관련된 생물학적 프로세스들을 더 잘 규명하기 위한 많은 시도들이 있었으나, 위암의 발암과 관련된 분자적 기작들은 여전히 집중적인 연구 대상으로 남아 있다.
우리나라의 경우 전체 암 중 발생 빈도 1위, 사망 원인 2위일 정도로 많이 발생하는 암으로, 위암은 종양의 주변 구조 침범 정도, 부위 림프절로의 전이, 다른 장기로의 전이 등 진행 정도에 따라 병기가 결정되는데, 이에 따라 치료법과 예후가 달라진다. 병기가 증가할수록 예후는 점점 나빠지고, 특히 말기(Stage 4)에서는 5년 생존율이 3% 밖에 되지 않을 정도로 예후가 좋지 않다.
플라스틱은 기능이 우수하고 가격이 저렴하여 현대인의 풍요로운 일상 생활과 산업발달에 크게 이바지해왔지만, 버려지는 플라스틱이 시간 경과에 따라, 시각적으로 확인하기 어려운 미세한 크기로 분해되어 최근에는 환경을 오염시키고 인체 건강을 위협하는 원인으로 보고되어졌으나, 미세플라스틱이 암 질환에 미치는 영향에 대해서는 연구되어 있지 않다.
대한민국 공개특허 제10-2017-0067137호 (2017.06.15. 공개)
본 발명은 미세플라스틱 노출에 의해 유도되는 암을 진단하기 위한 바이오마커 조성물, 이를 이용한 암 진단용 키트 및 진단에 유용한 정보를 제공하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 ASGR2, PITX2, PLEKHS1 및 EQTN으로 이루어진 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 하나 또는 둘 이상 선택되며, 미세플라스틱 노출에 의해 유도되는 암 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
본 발명은 ASGR2, PITX2, PLEKHS1 및 EQTN으로 이루어진 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 하나 또는 둘 이상 선택되며, 상기 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 검출하는 제제를 유효성분으로 함유하는 미세플라스틱 노출에 의해 유도되는 암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 진단용 조성물을 포함하는 미세플라스틱 노출에 의해 유발되는 암 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 검체로부터 분리된 시료로부터 ASGR2, PITX2, PLEKHS1 및 EQTN으로 이루어진 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 하나 또는 둘 이상 선택되며, 상기 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 확인하는 단계; 및
상기 발현 수준을 정상대조군과 비교하는 단계를 포함하는 미세플라스틱 노출에 의해 유도되는 암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 미세플라스틱 (PS)에 노출된 위암 조직에서 ASGR2, PITX2, PLEKHS1 및 EQTN의 발현 수준 변화가 확인되었으며, 상기 ASGR2, PITX2, PLEKHS1 및 EQTN은 PS 노출에 의해 아형의 발현 변화가 나타나는 것이 확인되었으며, 상기 유전자의 발현 수준 변화에 의해 전체 생존율에도 영향을 미치는 것으로 확인됨에 따라, 상기 유전자들은 PS에 노출에 의해 유도된 위암을 진단하기 위한 바이오마커로 제공될 수 있다.
도 1은 마우스 위 조직에 축적된 미세입자 (MP)가 유전자의 발현 변화를 촉진시키는 것을 확인한 결과로, 도 1A는 사람 위암 세포주에 폴리스티렌 미세입자(PS)를 노출시킨 과정을 나타내는 모식도로, 500 ppm, PS (10 μm diameter)를 정상 세포 배양 배지에 혼합하고 4주간 계대 배양하였다. 도 1B는 HGC 세포주에서 DNMT1 발현을 확인한 웨스턴 블롯 분석 결과로, MKN45을 제외하고 모든 사람 위암세포 (HGC)에서 PS 노출에 의해 DNMT1 감소를 확인한 결과이며, 도 1C는 낮은 DNMT1 발현이 예후에 미치는 영향을 확인한 환자의 전체 생존기간에 대한 Kaplan-Meier plot 결과이며 (P 값: log rank t-test), 도 1D는 PS에 노출된 생체 모델 제작 과정을 나타낸 모식도로, BALB/c 누드 마우스에 폴리스티렌 미세입자 (PS, 10 μm diameter) 100 ppm/100 μL를 4주간 노출시킨 후 PS 노출 마우스로 부터 위를 추출하고 RNAseq 분석을 수행하였다. 도 1E는 위 조직에서 형광 녹색 폴리스티렌 (FG-PE)의 축적을 확인한 대표적인 현미경 이미지이며 (magnification: x20, scale bar, 100 μm), 도 1F는 DEGs (Cut-off: |FC|>2 and p < 0.05)의 계층적 군집 분석 결과로, 클러스터그램에서 PS 노출에 의한 유전자 변화를 나타낸 것으로 발현 데이터는 Z 값으로 수정되어 표시되었으며, 상대적으로 낮은 발현은 파랑 (blue)으로 표시되었으며, 높은 발현은 적색 (red)으로 표시되었다. 도 1G는 위 조직에서 2 배 또는 그 이상의 PSMS 유도 유전자와 연관된 MSigDB를 가장 낮은 p 값으로 순위를 나타낸 결과로, 막대 그래프는 주요 유전자 세트 (H)와 종양 유전자 (C6) 범주 간에 겹치는 유전자의 수를 나타내며, 적색선은 MSigDB 분석 결과 p 값의 log10을 나타내며, 도 1H는 유전자 군의 분석 결과이다.
도 2는 PS 노출 후 RNA 아형 변화를 확인한 결과로, 도 2A는 DEG 및 생존 분석을 통한 아형 단백질 전환 방법에 대한 모식도로, “PS on”은 대조군에서 PS 노출에 의해 증가된 유전자의 아형 비율을 의미하며, 반대로 “PS off”은 대조군에서 PS 노출에 의해 감소된 유전자의 아형 비율을 의미하며, 상기 방법을 이용하여 1162 유전자가 확인되었으며, 전환 유전자 및 DEG 확인을 통하여 9개의 유전자가 확인되었으며, 마지막으로 STAD 환자의 OS, DEGs 및 아형 전환 사이에서 확인된 연관 유전자를 나타낸 결과이다. 도 2B는 ΔFR 프로파일을 그래프로 나타낸 결과이며, 도 2C는 아형 전환 분석에서 PS on 및 PS off와 연관된 |ΔFR| > 0.8 및 p < 0.05를 표시한 결과로, Vn은 변이체 n이며, j는 하나 이상의 junction match가 존재하는 다중 엑손이며, k는 기준을 포함하는 것이다. 도 2D는 DEG, 아형 전환 및 전체 생존기간 사이의 상관관계 유전자를 확인한 결과이다 (n>3, mean ± SD, * P value: *p<0.05, Student’s t-test).
도 3은 ASGR2, PITX2, PLEKHS1 및 EQTN의 발현 수준에 따른 STAD 환자의 생존기간을 확인한 Kaplan-Meier 플롯 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
미세플라스틱 (Microplastics, MP)은 해수, 퇴적물 및 생물군을 포함한 글로벌한 해양환경에서 확인되는 오염물질로, 해양 생물의 MP 오염은 해산물의 안전에 영향을 미치는 환경문제로 대두되고 있으며, 미세플라스틱에 오염된 해산물을 섭취한 사람의 건강에도 영향을 미칠 것으로 예상되나, 실제 미세플라스틱 노출에 의한 암 질환의 발병 여부를 확인할 수 있는 방법에 대해서는 연구가 미흡한 실정이다. 이에 본 발명의 발명자들은 실제 미세플라스틱을 노출시킨 세포 및 동물 모델에서 특이적으로 발현 차이를 나타내는 바이오마커를 확인함에 따라, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 ASGR2, PITX2, PLEKHS1 및 EQTN으로 이루어진 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 하나 또는 둘 이상 선택되며, 미세플라스틱 노출에 의해 유도되는 암 진단용 바이오마커 조성물을 제공할 수 있다.
보다 상세하게는 상기 ASGR2 및 PITX2는 미세플라스틱 노출에 의해 유발된 암세포에서 발현 증가되는 것일 수 있으며, PLEKHS1 및 EQTN은 미세플라스틱 노출에 의해 유도된 암세포에서 발현 감소되는 것일 수 있다.
상기 "ASGR2"는 NCBI accession no. 433 일 수 있으며, 상기 "PITX2"는 NCBI accession no. 5308 일 수 있으며, 상기 "PLEKHS1"은 NCBI accession no. 79949 일 수 있으며, 상기 "EQTN"은 NCBI accession no. 54586 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 ASGR2, PITX2, PLEKHS1 및 EQTN은 미세플라스틱 노출에 의해 유발된 암세포에서 아형 (isoform) 발현 변화가 확인되는 것일 수 있다.
상기 ASGR2의 아형 발현 변화는 미세플라스틱 노출에 의해 유발된 암세포에서 ASGR2 아형 1이 감소하는 것일 수 있다.
상기 PITX2의 아형 발현 변화는 미세플라스틱 노출에 의해 유발된 암세포에서 PITX2 아형 1이 증가하는 것일 수 있다.
상기 PLEKHS1의 아형 발현 변화는 미세플라스틱 노출에 의해 유발된 암세포에서 PLEKHS1 아형 1이 감소하는 것일 수 있다.
또한, 상기 EQTN의 아형 발현 변화는 미세플라스틱 노출에 의해 유발된 암세포에서 EQTN 아형 1이 감소하고, EQTN 아형 2가 증가하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 “ASGR2 아형 1”은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시될 수 있고,“ASGR2 변이체 1”이라고 지칭할 수 있으며, NCBI Reference Sequence ID. NM_001181.4 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 “PITX2 아형 1”은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시될 수 있고, “PITX2 변이체 1”이라고 지칭할 수 있으며, NCBI Reference Sequence ID. NM_153427.2 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 “PLEKHS1 아형 1”은 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시될 수 있고, “PLEKHS1 변이체 1”이라고 지칭할 수 있으며, NCBI Reference Sequence ID. NM_182601.2 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 “EQTN 아형 1”및 “EQTN 아형 2”는 각각 서열번호 4 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시될 수 있고, 각각 “EQTN 변이체 1”및 “EQTN 변이체 2”라고 지칭할 수 있으며, 각각 NCBI Reference Sequence ID. NM_020641.3 및 NCBI Reference Sequence ID. NM_001161585.2 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 미세플라스틱은 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리아미드(Polyamide, PA), 아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌 (Acrylonitrile-butadiene-styrene, ABS), 폴리테트라플루오르에틸렌(Polytetrafluoroethylene, PTFE), 셀룰로오스아세테이트(Cellulose Acetate, CA), 폴리카보네이트(Polycarbonate, PC), 폴리메틸메타크릴레이트(Polymethyl methacrylate, PMMA), 폴리비닐 클로라이드 (Polyvinyl chloride, PVC) 및 폴리에틸렌 테레프타레이트 (Polyethylene terephthalate, PET)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 암은 위암, 유방암, 자궁암, 간암, 대장암, 신장암, 폐암, 전립선암, 구강암 및 췌장암으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명은 ASGR2, PITX2, PLEKHS1 및 EQTN으로 이루어진 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 하나 또는 둘 이상 선택되며, 상기 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 검출하는 제제를 유효성분으로 함유하는 미세플라스틱 노출에 의해 유도되는 암 진단용 조성물을 제공할 수 있다.
상기 조성물은 ASGR2 아형 1, PITX2 아형 1, PLEKHS1 아형 1, EQTN 아형 1 및 EQTN 아형 2로 이루어진 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 하나 또는 둘 이상 선택되며, 상기 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 검출하는 제제를 추가로 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 제제는 프라이머, 프로브, 항체, 펩타이드 및 앱타머로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 상기 진단용 조성물을 포함하는 미세플라스틱 노출에 의해 유발되는 암 진단용 키트를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 검체로부터 분리된 시료로부터 ASGR2, PITX2, PLEKHS1 및 EQTN으로 이루어진 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 하나 또는 둘 이상 선택되며, 상기 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 확인하는 단계; 및
상기 발현 수준을 정상대조군과 비교하는 단계를 포함하는 미세플라스틱 노출에 의해 유도되는 암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공할 수 있다.
상기 방법은 ASGR2, PITX2, PLEKHS1 및 EQTN의 아형 (isoform) 발현 변화를 추가로 더 확인하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단이란 미세플라스틱 노출에 의한 암의 발병 여부, 바람직하게는 위암의 발병 여부를 확인하는 것이다.
본 발명에 있어서, "바이오마커"는 위암이 발생한 대상체의 조직 또는 세포를 정상 대조군의 조직 또는 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 대조군에 비하여 질환이 발생한 대상체의 조직 또는 세포에서 증가 또는 감소 양상을 보이는 단백질 또는 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.
본 발명에 있어서, "유전자의 발현 수준을 확인하는 방법"에는 중합효소반응(PCR), 역전사 중합효소반응 (RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(northern blotting), 또는 DNA 마이크로어레이 분석법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, "단백질 발현 또는 활성 수준을 확인하는 방법"에는 웨스턴 블랏팅(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석법(Radioimmunoassay), 방사면역 확산법 (Radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(Rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역 침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), 유세포분석법 (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 또는 단백질 칩(protein chip) 분석법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험예>
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 세포 주 및 PS 노출 생체외 모델
사람 위암 세포 주인 AGS, MKN1, MKN45 및 KATO III을 한국세포주은행 (Korea Cell line Bank, KLCB, Korea)에서 얻었으며, NCI-N87은 American Type Culture Collection (ATCC, USA)에서 얻었다. 모든 세포주를 10% 태아소혈청 (FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 RPMI 1640 배지 (Corning, USA)에서 37℃, 5% CO2 조건으로 유지시켰다.
위암세포에서 미세플라스틱의 영향을 확인하기 위해, 폴리스티렌 미소구체 (polystyrene microspheres, PS, 500 mg, 9.5-11.5 μm, Cospheric, USA)를 사용하였다. PSs를 10% 태아소혈청 및 1% 항생제가 포함된 일반적인 RPMI 배양 배지 10 mL와 혼합하고, 초음파 분쇄 및 vortexing을 반복수행하여 5% PS 현탁액을 준비하였다. 상기 현탁액을 계대배양 동안 원하는 농도로 세포 배양 배지에 분취하였다.
이후 PS는 PBS로 3회 세척하여 제거하였으며, EDTA-트립신을 사용하여 계대배양하였다.
2. 위암 조직에 마이크로플라스틱 축적을 위한 동물모델
위암 조직에서 미세플라스틱 축적을 확인하기 위해, 형광 녹색 폴리스티렌 미소구체(100 ppm/100 μL; 10-20 μm; Cospheric, USA)를 사용하였다. 상기 미소구체를 5주령 BALB/c 누드 마우스 (Orient Bio Inc., Korea.)에 4주간 매일 경구투여하였다. 4주 후 CO2를 이용하여 안락사시키고 위를 추출하여 4% PFA로 4℃에서 하룻밤 동안 고정시켰다. 급속 냉각 물질 (optimal cutting temperature, OCT)을 이용하여 냉동 절편 (8 μm 두께)를 제작하고 슬라이드 글라스에 부착시켰다.
세포 핵을 DAPI (ThermoFisher Scientific, USA)로 염색한 후 IN cell analyzer 2200 (GE Healthcare, USA)를 이용하여 이미지를 확인하였다.
3. 웨스턴 블롯 (Western blot)
Extraction Enhancer Buffer (Abcam, UK)가 포함된 Extraction Cell Lysis Buffer 1× (Abcam, UK)를 이용하여 세포 추출물을 얻었으며, BCA assay (ThermoFisher Scientific, USA)로 단백질 농도를 확인하였다.
마우스로부터 부터 분리된 종양 조직을 가위를 이용하여 작은 조각으로 절단한 후 Extraction Enhancer Buffer (Abcam, UK)가 포함된 단백질 추출 세포 용해 완충액 1× (Abcam, UK)을 첨가하여 균질화하였다.
bicinchoninic acid assay (ThermoFisher Scientific, USA)로 단백질 농도를 확인하였으며, 항-DNMT1(Abcam, UK., ab134148) 및 항-Beta Actin (Abcam, UK., ab6276) 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
4. TCGA-STAD 데이터 분석
Cancer Genome Atlas-Stomach Adenocarcinoma (TCGA-STAD) 데이터 세트 내 354 환자들로부터 얻은 RNAseq 데이터를 이용하여 Human Protein ATLAS web toolkit (https://www.proteinatlas.org/)로 종합적인 생존 분석을 수행하였다.
각 유전자의 FPKM 값을 기초로, 환자들을 두 그룹(높음 및 낮음)으로 분류하고, 발현 수준 및 환자 생존율 간의 상관관계를 확인하였다. 두 발현 범주를 분류하기 위해, Protein ATLAS web-toolkit에서 최상의 발현 컷오프 값을 이용하였다.
각 그룹의 환자의 예후를 Kaplan-Meier survival estimators로 확인하고, 두 그룹의 생존 결과를 log-rank test로 비교하였다.
전체 생존(OS) 결과는 모든 단계 I-IV 및 N/A 환자를 포함하였으며, Human Protein ATLAS에서 권고한 1 이상의 FPKM 값 및 p < 0.0001 값을 유의한 OS로 판단하였다.
5. RNA 분리 및 RNA 시퀀싱 (RNA-seq)
위암 조직에서 폴리스티렌 미소구체 (PS)에 의한 유전자 발현 변화를 확인하기 위해, 4 주간 10-μm PS (100 ppm/100 μL PBS)를 마우스에 경구 투여하고, 위 조직으로부터 전체 RNA를 추출하였다. 그룹 당 3개의 RNA 세트를 수집하였다.
간략하게, 단편 서열 시퀀싱을 위해 RNA를 무작위로 단편화하고 5′및 3′말단에 부착된 상이한 어댑터로 cDNA를 역전사시켰다. 시퀀싱이 가능한 정도로 PCR 증폭을 수행하고, 제조사의 설명서에 따라, NovaSeq 6000 Sequencing System (illumina, USA)에 사용될 200-400 bp의 삽입 크기를 얻기 위한 크기 선택을 수행하였다.
6. RNAseq 데이터 분석
분석 전 저품질 서열 및 어댑터 서열을 제거하기 위해 시퀀서로부터 원본 염기서열을 미리 분석하였으며, HISAT v2.1을 이용하여 생쥐(Mus musculus, mm10)에 대한 염기서열 분석을 수행하여 정렬시켰다.
HISAT는 정렬을 위해 2 가지 타입의 지수(글로벌 전체 게놈 지수 및 수만개의 소규모 지역 지수)가 사용되었다. 상기 2 가지 타입의 지수는 Bowtie2와 동일한 BWT (Burrows-Wheeler transform)/graph FM index (GFM)를 사용하여 구성되었으며, 이러한 효율적인 데이터 구조와 알고리즘 사용으로 인하여, HISAT는 보편적으로 사용되는 Bowtie 및 BWA 보다 몇 배 빠르게 접합 정렬을 생성하였다.
생쥐의 참조 게놈 서열과 주석 데이터는 NCBI에서 다운로드하였다. 그 후 StringTie v1.3.4d로 알려진 전사체의 transcript assembly, 신규한 전사체 (novel transcripts) 및 선택적 스플라이싱 전사체 (alternative splicing transcripts)를 확인하였다. 상기 결과를 바탕으로, 전사체 및 유전자의 발현량을 샘플당 판독 수 또는 FPKM 값 (Fragments Per Kilobase of exon per Million fragments mapped)으로 계산하였다.
발현 프로파일은 DEG (differentially expressed genes)와 같은 추가적인 분석을 위해 사용되었다. 또한, 가설 검정(statistical hypothesis testing)을 통하여 다른 조건의 그룹에서 차별적으로 발현된 유전자 또는 전사체를 필터링하였다.
RNA 시퀀싱 데이터의 변형을 확인하기 위해, STAR을 사용하여 정제된 염기서열을 생쥐에 대하여 정렬시켰다. 염기서열 배열은 Samtools v1.9의 mpileup module 및 BCFtools v1.9의 call module에서 변형을 확인하기 위해 사용되었다.
Samtools mpileup은 주입된 BAM에서 요약된 정보를 수집하였으며, 가능한 유전자형이 주어진 데이터의 가능성을 계산하여 BCF 형식으로 저장하였다. BCFtool은 앞선 데이터를 적용하고 실제 데이터를 불러온다. 또한, BCF 파일을 연결하고, 신속한 random access를 위해 BCF를 VCF로 변환한다.
vcftools v0.1.16의 varFilter module에서 root mean square (RMS) mapping 우수성 (Q ≥ 20) 및 판독 깊이 (d ≥ 100)를 기반으로 각 샘플에 대한 변이체 필터링을 수행하였다.
7. 유전자 발현 수준의 통계분석
유전자의 상대 빈도를 StringTie를 이용하여 판독 계수로 확인하였다.
먼저 샘플에서 각 유전자에 대한 빈도를 측정하여 발현 차이를 나타내는 유전자를 통계적으로 분석하였다. 샘플에서 0개 이상의 판독 계수 값을 가진 유전자는 제외되었다. 필터링된 데이터는 log2 변환되었으며, RLE 표준화되었다. 발현 차이 데이터의 통계학적 유의성은 DESeq2 nbinomWaldTest 및 배수 변화를 이용하여 확인되었으며, 귀무가설 (null hypothesis)은 그룹간 차이가 없음을 의미한다.
FDR (false discovery rate)은 Benjamini-Hochberg 알고리즘을 이용하여 p 값을 조정하여 제어하였다. DEG 세트는 유사성의 척도로 완전 연결 및 기하학적 거리를 이용하여 계층적 군집분석 (hierarchical clustering analysis)을 수행하였다.
8. 계층적 군집화 (Hierarchical clustering)
계층적 군집 분석은 완전 연결 및 기하학적 거리를 유사성의 척도로 이용하여 |fold change| > 2 및 raw p < 0.05에 만족하는 발현 차이를 나타내는 전사체의 발현 패턴을 표시하기 위해 수행되었다.
9. GSEA, 유전자 그룹 분석 및 DAVID GO 분석
유전자 그룹 및 유전자 세트를 Broad Institute (http://software/broadinstitute.org/gsea/msigdb)의 MSigDB website로 부터 얻었다. 주요 유전자 바이오마커 (H) 세트 및 종양 유전자 바이오마커 (C6) 세트를 DEG 유전자 목록(fold change > 2, p < 0.05)의 정량을 위하여 선택하였다.
모든 최상위 유전자 세트는 정확한 기능 및 경로 범주를 확인하기 위해, 수동으로 큐레이션되었다 (p <0.05). 유전자 그룹 분석 toolkit에서 제공하는 웹 사이트를 설명서에 따라 사용하였다. DAVID 설명서에 따라 GO 카테고리를 할당하기 위해 DAVID web toolkit (http://david.avcc.ncifcrf.goc)를 사용하여 분석하였다.
10. 네트워크 분석: String
STRING software로 상호작용 네트워크를 분석하였다.
간략하게, Cytoscape (v3.8.0)와 String App (Version 1.4.0)를 공식 웹사이트에서 다운로드 받았으며, 네트워크 분석을 위해 중요한 DEGs (fold change > 2, p < 0.05) 및 SNV (p < 0.05) 유전자 목록을 선택하였다.
<실시예 1> 미세 플라스틱이 위암 조직 내 RNA 발현 변화에 미치는 영향 확인
도 1A와 같은 과정으로 폴리스티렌 (PS)이 유전자 발현 변화를 유도하는 지를 확인하기 위해, 위암 세포주에 PS를 4주간 처리하였다. PS는 메틸화 과정에서 교란을 유도할 것으로 가정하고, 위암 세포주에서 PS 노출 후 DNMT1 발현 변화가 나타나는 지 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다.
그 결과, 도 1B와 같이 5개의 위암 세포주 중 MKN45에서 DNMT1이 증가하였으며, 다른 4개의 세포주에서는 감소가 나타났다.
상기 결과로부터 PS 노출은 메틸화 과정을 방해하는 것이 확인되었다.
도 1C를 참고하면 Cancer Genome Atlas Stomach Adenocarcinoma (TCGA-STAD) 전제 생존기간 (overall survival, OS) 데이터에서 DNMT1 감소가 TCGA-STAD 환자에게 부정적인 영향을 나타내는 것으로 나타났다. DNMT1 발현이 낮은 환자는 5년 생존율이 43%에서 23%까지 감소하였다.
다음으로, 생체 내에서 PS 노출의 영향을 확인하였다. 먼저, 소화관에서 미세입자 (MP)의 축적을 확인하기 위해, 도 1D와 같은 과정으로 BALB/누드 마우스에 10-20 μm 형광 녹색 폴리스티렌 (FG-PE)을 4주간 매일 공급하였다.
그 결과, 도 1E와 같이 FG-PE가 위조직에 축적된 것이 확인되었다.
또한, 위 조직에서 RNA 발현 변화를 확인하여 장기간의 PS 투여로 인하여 암이 유발될 수 있는 지 확인하였다. RNA 발현 변화 확인을 위하여, 10 μm 폴리스티렌 미세입자 100 ppm/100 μL를 4주간 매일 BALB/누드 마우스에 공급하였다.
4주간 PS 노출 후 마우스 위 조직에서 발현 차이를 나타내는 유전자 (differentially expressed gene; DEG)를 분석한 결과, 도 1F와 같이 대조군과 비교하여 PS 노출군에서 유의하게 발현 차이를 나타내는 194 (cut off fold change > 2, P < 0.05)개의 유전자가 확인되었다.
MSigDB을 사용한 유전자 세트 농축 분석 (Gene set enrichment analysis)은 암 특징 마커 (H) 및 종양 형성 바이오마커 (C6) 세트의 유전자를 확인하였다.
그 결과, 도 1G와 같이 특정 유전자 세트 중 생체 이물대사 (xenobiotic metabolism), 응집 (coagulation) 및 보체 유전자 세트에서 가장 강하게 유사성이 나타났다.
또한, 유전자 그룹 분석에서 6개의 사이토카인 및 성장 인자, 17개의 상호작용 인자, 3개의 homeodomain 단백질, 5개의 세포 분화 마커, 7개의 단백질 키나아제, 2개의 전좌된 암 유전자, 2개의 종양 유전자가 확인되었으며, 종양억제 유전자는 발현되지 않았다.
상기 결과로부터 장기간의 마이크로 크기의 PS는 위 조직과 상호작용하여 RNA 발현 변화를 촉진시키는 것이 확인되었다.
<실시예 2> 위 조직에서 PS 노출에 따른 유전자 아형(isoform) 변화 확인
모든 샘플에서 RNA의 아형 변화를 확인하였다.
그 결과, 대조군에서는 27262.0 (SD 2214.1)개의 아형 변화가 확인되었으며, PS 노출 후 조직에서는 28788.7 (SD 211.5) 개의 아형 변화가 확인되었다. 인트론 (y)의 정보를 포함할 경우, 대조군은 29.3 (SD 1.5)개 및 PS 노출 후에는 35.7 (SD 2.3) 개의 아형 변화가 확인되었다.
PS 노출 후 아형의 변화를 확인하기 위한 아형 전환 방법(isoform switch method; The Landscape of Isoform Switches in Human Cancers. Mol Cancer Res 15, 1206-1220 (2017))을 이용하여 유전자 아형의 FPKM 합의 비율을 계산하였다.
그 결과, 도 2A와 같이 PS 노출 전 및 후 사이에 유전자에 전환 변화가 있음이 확인되었으며 (p < 0.05), 1541 개의 상당한 아형 변화가 확인되었다.
다음으로, ΔFPKM 비율 (ΔFR) ([FPKMPS]avg- [FPKMcontrol]avg )을 분석한 결과, 표 1과 같이 ΔFR > 0 일 때, 최소 한 개의 junction match (j)가 있는 다중 엑손은 495개, reference (reverse containment) 이벤트(k)가 포함된 아형 변화는 6개, 인트론 부분을 부분적으로 커버하는 단일 엑손 트랜스 프랙(transfrags) 및 가능한 pre-mRNA 단편 이벤트(e)가 0개 확인되었으며, 완전한 사건의 수는 377 개로 확인되었다.
또한, ΔFR < 0 일 경우, j 상태는 357개, k 상태는 4개, e 상태는 1개가 확인되었으며, 확인된 완전한 사건의 수는 301개 였다.
각 유전자 ΔFR 변화의 분포를 도 4B와 같이 volcano plot으로 나타내었다. 그 중 ΔFR > 0.8 및 ΔFR < - 0.8 변화를 나타내는 대표적인 유전자를 도 2C와 같이 확인하였다.
State PS on PS off
ΔFR>0 ΔFR<0
e 0 1
j 495 357
k 6 4
= 377 301
total 878 663
다음으로, 아형 전환 현상이 발생한 유전자 중 발현차이 (DEG) 변화가 나타난 유전자 (FC > 2, p < 0.05)를 확인하였다. 그 결과, 도 2A와 같이 9개의 유전자 (증가 6개 및 감소 3개)가 확인되었다.
상기 유전자 중 TCGA-STAD 환자에게서 악성 영향을 나타낸 유전자를 선별한 결과, 도 2A와 같이 4개의 유전자 (ASGR2, PITX2, PLEKHS1 및 EQTN)이 확인되었다.
아형 전환 방법을 이용하여 PS 노출이 상기 유전자의 RNA 아형 변화를 유도할 수 있는 지 확인하였다. 아형 변화는 암의 EMT, 약물 저항성 및 줄기 세포 분화를 촉진시킨다.
도 2D를 참고하면, ASGR2 유전자는 PS 노출에 의해 8.44 배 발현 증가하였으나, 변이체 1의 평균 발현율이 89.53%에서 25.64%로 감소하였다 (p < 0.05). PITX2 유전자는 PS 노출에 의해 3.08 배 발현 증가되었으며, 변이체 1의 발현이 14.82%에서 81.30%로 (p < 0.05) 증가하였다.
또한, PLEKHS1 유전자는 PS 노출에 의해 3.10 배 발현 감소하였으며, 변이체 1의 발현율이 47.94% 에서 8.58% (p < 0.05)로 감소되었다. EQTN 유전자는 PS 노출에 의해 2.46 배 발현 감소하였으며, PS 노출전에는 변이체 1만 확인되었으나, PS 노출 후에는 변이체 2가 30.45% 증가하였고, 변이체 1은 100% 에서 69.55% (p < 0.05)로 감소하였다.
한편, 앞선 실험에서 확인된 바와 같이 PS 노출에 의해 발현 및 아형 변화가 나타난 ASGR2, PITX2, PLEKHS1 및 EQTN 유전자의 발현 수준이 위암 환자의 전체 생존기간에 미치는 영향을 확인하였다.
그 결과, 도 3과 같이 발현 증가된 ASGR2 및 PITX2 유전자는 위암 환자의 전체 생존율에 부정적인 영향을 주는 것을 확인하였으며, PLEKHS1 및 EQTN 유전자의 발현 감소 역시 위암 환자의 전체생존율에 부정적인 영향을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터 PS 노출은 위암을 유발시킬 수 있으며, PS에 노출된 위암 조직에서 ASGR2, PITX2, PLEKHS1 및 EQTN의 유전자의 발현 수준 변화가 확인되었으며, 특히 ASGR2, PITX2, PLEKHS1 및 EQTN의 유전자는 PS 노출에 의해 아형 변화가 나타는 것이 확인됨에 따라, 상기 ASGR2, PITX2, PLEKHS1 및 EQTN은 PS에 노출에 의해 유도된 위암을 진단하기 위한 바이오마커로 제공될 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> KOREA INSTITUTE OF RADIOLOGICAL & MEDICAL SCIENCES <120> Biomarker composition for diagnosing cancer induced by microplastic exposure and uses thereof <130> ADP-2021-0160 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 311 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> ASGR2 isoform 1 <400> 1 Met Ala Lys Asp Phe Gln Asp Ile Gln Gln Leu Ser Ser Glu Glu Asn 1 5 10 15 Asp His Pro Phe His Gln Gly Glu Gly Pro Gly Thr Arg Arg Leu Asn 20 25 30 Pro Arg Arg Gly Asn Pro Phe Leu Lys Gly Pro Pro Pro Ala Gln Pro 35 40 45 Leu Ala Gln Arg Leu Cys Ser Met Val Cys Phe Ser Leu Leu Ala Leu 50 55 60 Ser Phe Asn Ile Leu Leu Leu Val Val Ile Cys Val Thr Gly Ser Gln 65 70 75 80 Ser Glu Gly His Arg Gly Ala Gln Leu Gln Ala Glu Leu Arg Ser Leu 85 90 95 Lys Glu Ala Phe Ser Asn Phe Ser Ser Ser Thr Leu Thr Glu Val Gln 100 105 110 Ala Ile Ser Thr His Gly Gly Ser Val Gly Asp Lys Ile Thr Ser Leu 115 120 125 Gly Ala Lys Leu Glu Lys Gln Gln Gln Asp Leu Lys Ala Asp His Asp 130 135 140 Ala Leu Leu Phe His Leu Lys His Phe Pro Val Asp Leu Arg Phe Val 145 150 155 160 Ala Cys Gln Met Glu Leu Leu His Ser Asn Gly Ser Gln Arg Thr Cys 165 170 175 Cys Pro Val Asn Trp Val Glu His Gln Gly Ser Cys Tyr Trp Phe Ser 180 185 190 His Ser Gly Lys Ala Trp Ala Glu Ala Glu Lys Tyr Cys Gln Leu Glu 195 200 205 Asn Ala His Leu Val Val Ile Asn Ser Trp Glu Glu Gln Lys Phe Ile 210 215 220 Val Gln His Thr Asn Pro Phe Asn Thr Trp Ile Gly Leu Thr Asp Ser 225 230 235 240 Asp Gly Ser Trp Lys Trp Val Asp Gly Thr Asp Tyr Arg His Asn Tyr 245 250 255 Lys Asn Trp Ala Val Thr Gln Pro Asp Asn Trp His Gly His Glu Leu 260 265 270 Gly Gly Ser Glu Asp Cys Val Glu Val Gln Pro Asp Gly Arg Trp Asn 275 280 285 Asp Asp Phe Cys Leu Gln Val Tyr Arg Trp Val Cys Glu Lys Arg Arg 290 295 300 Asn Ala Thr Gly Glu Val Ala 305 310 <210> 2 <211> 317 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> PITX2 isoform 1 <400> 2 Met Glu Thr Asn Cys Arg Lys Leu Val Ser Ala Cys Val Gln Leu Gly 1 5 10 15 Val Gln Pro Ala Ala Val Glu Cys Leu Phe Ser Lys Asp Ser Glu Ile 20 25 30 Lys Lys Val Glu Phe Thr Asp Ser Pro Glu Ser Arg Lys Glu Ala Ala 35 40 45 Ser Ser Lys Phe Phe Pro Arg Gln His Pro Gly Ala Asn Glu Lys Asp 50 55 60 Lys Ser Gln Gln Gly Lys Asn Glu Asp Val Gly Ala Glu Asp Pro Ser 65 70 75 80 Lys Lys Lys Arg Gln Arg Arg Gln Arg Thr His Phe Thr Ser Gln Gln 85 90 95 Leu Gln Glu Leu Glu Ala Thr Phe Gln Arg Asn Arg Tyr Pro Asp Met 100 105 110 Ser Thr Arg Glu Glu Ile Ala Val Trp Thr Asn Leu Thr Glu Ala Arg 115 120 125 Val Arg Val Trp Phe Lys Asn Arg Arg Ala Lys Trp Arg Lys Arg Glu 130 135 140 Arg Asn Gln Gln Ala Glu Leu Cys Lys Asn Gly Phe Gly Pro Gln Phe 145 150 155 160 Asn Gly Leu Met Gln Pro Tyr Asp Asp Met Tyr Pro Gly Tyr Ser Tyr 165 170 175 Asn Asn Trp Ala Ala Lys Gly Leu Thr Ser Ala Ser Leu Ser Thr Lys 180 185 190 Ser Phe Pro Phe Phe Asn Ser Met Asn Val Asn Pro Leu Ser Ser Gln 195 200 205 Ser Met Phe Ser Pro Pro Asn Ser Ile Ser Ser Met Ser Met Ser Ser 210 215 220 Ser Met Val Pro Ser Ala Val Thr Gly Val Pro Gly Ser Ser Leu Asn 225 230 235 240 Ser Leu Asn Asn Leu Asn Asn Leu Ser Ser Pro Ser Leu Asn Ser Ala 245 250 255 Val Pro Thr Pro Ala Cys Pro Tyr Ala Pro Pro Thr Pro Pro Tyr Val 260 265 270 Tyr Arg Asp Thr Cys Asn Ser Ser Leu Ala Ser Leu Arg Leu Lys Ala 275 280 285 Lys Gln His Ser Ser Phe Gly Tyr Ala Ser Val Gln Asn Pro Ala Ser 290 295 300 Asn Leu Ser Ala Cys Gln Tyr Ala Val Asp Arg Pro Val 305 310 315 <210> 3 <211> 465 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> PLEKHS1 isoform 1 <400> 3 Met Ala Gly Gly Lys Gln Phe Thr Phe Ser Tyr Glu Asn Glu Val Cys 1 5 10 15 Lys Gln Asp Tyr Phe Ile Lys Ser Pro Pro Ser Gln Leu Phe Ser Ser 20 25 30 Val Thr Ser Trp Lys Lys Arg Phe Phe Ile Leu Ser Lys Ala Gly Glu 35 40 45 Lys Ser Phe Ser Leu Ser Tyr Tyr Lys Asp His His His Arg Gly Ser 50 55 60 Ile Glu Ile Asp Gln Asn Ser Ser Val Glu Val Gly Ile Ser Ser Gln 65 70 75 80 Glu Lys Met Gln Ser Val Gln Lys Met Phe Lys Cys His Pro Asp Glu 85 90 95 Val Met Ser Ile Arg Thr Thr Asn Arg Glu Tyr Phe Leu Ile Gly His 100 105 110 Asp Arg Glu Lys Ile Lys Asp Trp Val Ser Phe Met Ser Ser Phe Arg 115 120 125 Gln Asp Ile Lys Ala Thr Gln Gln Asn Thr Glu Glu Glu Leu Ser Leu 130 135 140 Gly Asn Lys Arg Thr Leu Phe Tyr Ser Ser Pro Leu Leu Gly Pro Ser 145 150 155 160 Ser Thr Ser Glu Ala Val Gly Ser Ser Ser Pro Arg Asn Gly Leu Gln 165 170 175 Asp Lys His Leu Met Glu Gln Ser Ser Pro Gly Phe Arg Gln Thr His 180 185 190 Leu Gln Asp Leu Ser Glu Ala Thr Gln Asp Val Lys Glu Glu Asn His 195 200 205 Tyr Leu Thr Pro Arg Ser Val Leu Leu Glu Leu Asp Asn Ile Ile Ala 210 215 220 Ser Ser Asp Ser Gly Glu Ser Ile Glu Thr Asp Gly Pro Asp Gln Val 225 230 235 240 Ser Gly Arg Ile Glu Cys His Tyr Glu Pro Met Glu Ser Tyr Phe Phe 245 250 255 Lys Glu Thr Ser His Glu Ser Val Asp Ser Ser Lys Glu Glu Pro Gln 260 265 270 Thr Leu Pro Glu Thr Gln Asp Gly Asp Leu His Leu Gln Glu Gln Gly 275 280 285 Ser Gly Ile Asp Trp Cys Leu Ser Pro Ala Asp Val Glu Ala Gln Thr 290 295 300 Thr Asn Asp Gln Lys Gly Asn Ile Pro Asp Glu Ser Gln Val Glu Lys 305 310 315 320 Leu Asn Val Phe Leu Ser Pro Pro Asp Val Ile Asn Tyr Leu Ala Leu 325 330 335 Thr Glu Ala Thr Gly Arg Ile Cys Val Ser Gln Trp Glu Gly Pro Pro 340 345 350 Arg Leu Gly Cys Ile Phe Cys His Gly Asp His Leu Leu Ala Val Asn 355 360 365 Asp Leu Lys Pro Gln Ser Leu Glu Glu Val Ser Leu Phe Leu Thr Arg 370 375 380 Ser Ile Gln Lys Glu Asp Ser Phe Arg Ile Leu Ser Tyr Gln Val Ala 385 390 395 400 Phe Gly Glu Gly Thr Glu Leu Arg Asp Arg Ala Pro Gly Phe Arg Thr 405 410 415 Ser Asp Arg His Asp Val Ala Lys Arg Ala Cys Met Glu Ser Asp Trp 420 425 430 Cys Arg Asp Ser Lys Thr Ala Pro Ser Thr Asn Leu Cys Leu Ser Phe 435 440 445 Leu Phe Cys Lys Ile Met Thr Asn Asp Gly Ala Gly Cys Trp Ile Ile 450 455 460 Lys 465 <210> 4 <211> 294 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> EQTN isoform 1 <400> 4 Met Asn Phe Ile Leu Phe Ile Phe Ile Pro Gly Val Phe Ser Leu Lys 1 5 10 15 Ser Ser Thr Leu Lys Pro Thr Ile Glu Ala Leu Pro Asn Val Leu Pro 20 25 30 Leu Asn Glu Asp Val Asn Lys Gln Glu Glu Lys Asn Glu Asp His Thr 35 40 45 Pro Asn Tyr Ala Pro Ala Asn Glu Lys Asn Gly Asn Tyr Tyr Lys Asp 50 55 60 Ile Lys Gln Tyr Val Phe Thr Thr Gln Asn Pro Asn Gly Thr Glu Ser 65 70 75 80 Glu Ile Ser Val Arg Ala Thr Thr Asp Leu Asn Phe Ala Leu Lys Asn 85 90 95 Asp Lys Thr Val Asn Ala Thr Thr Tyr Glu Lys Ser Thr Ile Glu Glu 100 105 110 Glu Thr Thr Thr Ser Glu Pro Ser His Lys Asn Ile Gln Arg Ser Thr 115 120 125 Pro Asn Val Pro Ala Phe Trp Thr Met Leu Ala Lys Ala Ile Asn Gly 130 135 140 Thr Ala Val Val Met Asp Asp Lys Asp Gln Leu Phe His Pro Ile Pro 145 150 155 160 Glu Ser Asp Val Asn Ala Thr Gln Gly Glu Asn Gln Pro Asp Leu Glu 165 170 175 Asp Leu Lys Ile Lys Ile Met Leu Gly Ile Ser Leu Met Thr Leu Leu 180 185 190 Leu Phe Val Val Leu Leu Ala Phe Cys Ser Ala Thr Leu Tyr Lys Leu 195 200 205 Arg His Leu Ser Tyr Lys Ser Cys Glu Ser Gln Tyr Ser Val Asn Pro 210 215 220 Glu Leu Ala Thr Met Ser Tyr Phe His Pro Ser Glu Gly Val Ser Asp 225 230 235 240 Thr Ser Phe Ser Lys Ser Ala Glu Ser Ser Thr Phe Leu Gly Thr Thr 245 250 255 Ser Ser Asp Met Arg Arg Ser Gly Thr Arg Thr Ser Glu Ser Lys Ile 260 265 270 Met Thr Asp Ile Ile Ser Ile Gly Ser Asp Asn Glu Met His Glu Asn 275 280 285 Asp Glu Ser Val Thr Arg 290 <210> 5 <211> 265 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> EQTN isoform 2 <400> 5 Met Asn Phe Ile Leu Phe Ile Phe Ile Pro Gly Val Phe Ser Leu Lys 1 5 10 15 Ser Ser Thr Leu Lys Pro Thr Ile Glu Ala Leu Pro Asn Val Leu Pro 20 25 30 Leu Asn Glu Asp Val Asn Lys Gln Glu Glu Lys Asn Glu Asp His Thr 35 40 45 Pro Asn Tyr Ala Pro Ala Asn Glu Lys Asn Gly Asn Tyr Tyr Lys Asp 50 55 60 Ile Lys Gln Tyr Val Phe Thr Thr Gln Asn Pro Asn Gly Thr Glu Ser 65 70 75 80 Glu Ile Ser Val Arg Ala Thr Thr Asp Leu Asn Phe Ala Leu Lys Asn 85 90 95 Gly Ser Thr Pro Asn Val Pro Ala Phe Trp Thr Met Leu Ala Lys Ala 100 105 110 Ile Asn Gly Thr Ala Val Val Met Asp Asp Lys Asp Gln Leu Phe His 115 120 125 Pro Ile Pro Glu Ser Asp Val Asn Ala Thr Gln Gly Glu Asn Gln Pro 130 135 140 Asp Leu Glu Asp Leu Lys Ile Lys Ile Met Leu Gly Ile Ser Leu Met 145 150 155 160 Thr Leu Leu Leu Phe Val Val Leu Leu Ala Phe Cys Ser Ala Thr Leu 165 170 175 Tyr Lys Leu Arg His Leu Ser Tyr Lys Ser Cys Glu Ser Gln Tyr Ser 180 185 190 Val Asn Pro Glu Leu Ala Thr Met Ser Tyr Phe His Pro Ser Glu Gly 195 200 205 Val Ser Asp Thr Ser Phe Ser Lys Ser Ala Glu Ser Ser Thr Phe Leu 210 215 220 Gly Thr Thr Ser Ser Asp Met Arg Arg Ser Gly Thr Arg Thr Ser Glu 225 230 235 240 Ser Lys Ile Met Thr Asp Ile Ile Ser Ile Gly Ser Asp Asn Glu Met 245 250 255 His Glu Asn Asp Glu Ser Val Thr Arg 260 265

Claims (16)

  1. ASGR2, PITX2, PLEKHS1 및 EQTN으로 이루어진 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 하나 또는 둘 이상 선택되며, 미세플라스틱 노출에 의해 유도되는 암 진단용 바이오마커 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 ASGR2 및 PITX2는 미세플라스틱 노출에 의해 유발된 암세포에서 발현 증가되는 것을 특징으로 하는 암 진단용 바이오마커 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 PLEKHS1 및 EQTN은 미세플라스틱 노출에 의해 유발된 암세포에서 발현 감소되는 것을 특징으로 하는 암 진단용 바이오마커 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 ASGR2, PITX2, PLEKHS1 및 EQTN은 미세플라스틱 노출에 의해 유발된 암세포에서 아형 (isoform) 발현 변화가 확인되는 것을 특징으로 하는 암 진단용 바이오마커 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 ASGR2의 아형 발현 변화는 미세플라스틱 노출에 의해 유발된 암세포에서 ASGR2 아형 1이 감소하는 것을 특징으로 하는 암 진단용 바이오마커 조성물.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 PITX2의 아형 발현 변화는 미세플라스틱 노출에 의해 유발된 암세포에서 PITX2 아형 1이 증가하는 것을 특징으로 하는 암 진단용 바이오마커 조성물.
  7. 청구항 4에 있어서, 상기 PLEKHS1의 아형 발현 변화는 미세플라스틱 노출에 의해 유발된 암세포에서 PLEKHS1 아형 1이 감소하는 것을 특징으로 하는 암 진단용 바이오마커 조성물.
  8. 청구항 4에 있어서, 상기 EQTN의 아형 발현 변화는 미세플라스틱 노출에 의해 유발된 암세포에서 EQTN 아형 1이 감소하고, EQTN 아형 2가 증가하는 것을 특징으로 하는 암 진단용 바이오마커 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 미세플라스틱은 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리아미드(Polyamide, PA), 아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌 (Acrylonitrile-butadiene-styrene, ABS), 폴리테트라플루오르에틸렌(Polytetrafluoroethylene, PTFE), 셀룰로오스아세테이트(Cellulose Acetate, CA), 폴리카보네이트(Polycarbonate, PC), 폴리메틸메타크릴레이트(Polymethyl methacrylate, PMMA), 폴리비닐 클로라이드 (Polyvinyl chloride, PVC) 및 폴리에틸렌 테레프타레이트 (Polyethylene terephthalate, PET)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암 진단용 바이오마커 조성물.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 암은 위암, 유방암, 자궁암, 간암, 대장암, 신장암, 폐암, 전립선암, 구강암 및 췌장암으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암 진단용 바이오마커 조성물.
  11. ASGR2, PITX2, PLEKHS1 및 EQTN으로 이루어진 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 하나 또는 둘 이상 선택되며, 상기 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 검출하는 제제를 유효성분으로 함유하는 미세플라스틱 노출에 의해 유도되는 암 진단용 조성물.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 조성물은 ASGR2 아형 1, PITX2 아형 1, PLEKHS1 아형 1, EQTN 아형 1 및 EQTN 아형 2로 이루어진 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 하나 또는 둘 이상 선택되며, 상기 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 검출하는 제제를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 미세플라스틱 노출에 의해 유도되는 암 진단용 조성물.
  13. 청구항 11에 있어서, 상기 제제는 프라이머, 프로브, 항체, 펩타이드 및 앱타머로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 미세플라스틱 노출에 의해 유발되는 암 진단용 조성물.
  14. 청구항 11의 조성물을 포함하는 미세플라스틱 노출에 의해 유발되는 암 진단용 키트.
  15. 검체로부터 분리된 시료로부터 ASGR2, PITX2, PLEKHS1 및 EQTN으로 이루어진 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 하나 또는 둘 이상 선택되며, 상기 단백질의 발현 또는 활성 수준, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 확인하는 단계; 및
    상기 발현 수준을 정상대조군과 비교하는 단계를 포함하는 미세플라스틱 노출에 의해 유도되는 암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 방법은 ASGR2, PITX2, PLEKHS1 및 EQTN 아형 (isoform)의 발현 변화를 추가로 더 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세플라스틱 노출에 의해 유도되는 암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
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