KR20220147424A - 신규한 kcnq4 단백질 변이체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

신규한 KCNQ4 단백질 변이체, 이를 이용한 칼륨 채널병증 진단용 조성물, 키트 및 이를 이용한 정보 제공방법에 관한 것이다.
일 양상에 따른 칼륨 채널병증을 진단하기 위한 조성물, 키트, 및 이를 이용한 칼륨 채널병증을 진단하기 위한 정보제공 방법에 따르면, 칼륨 채널병증의 발병 여부 및 예후를 객관적이고, 신속하고, 높은 정확도 및 특이도로 검출하는데 이용할 수 있다.

Description

신규한 KCNQ4 단백질 변이체 및 이의 용도 {Novel KCNQ4 protein variant and use thereof}
신규한 KCNQ4 단백질 변이체, 이를 이용한 칼륨 채널병증 진단용 조성물, 키트 및 이를 이용한 정보 제공방법에 관한 것이다.
청각장애는 인간의 감각기관 장애 중 가장 흔하며, 약 1000명중 1명에서(0.1%) 탄생 시(congenital) 심한 고도난청 이상의 청각장애를 보이고 어른이 되기 전 소아기에 1000명에 1명 꼴로 추가 청각장애자(acquired)가 발생한다. 나이가 들면서 이독성 약물, 사고, 노인성 난청 등 다양한 원인으로 난청이 될 확률은 더욱 많아지며, 인구대비로 볼 때 65 dBHL 이상의 고도난청자가 30~50세의 연령층에서는 0.3%, 60~70세의 연령층에서는 2.3%까지 증가하게 된다. 최근 효과적인 예방주사의 등장으로 influenza, measles, mumps 등의 감염질환이 감소하였고 적극적인 계몽과 치료로 인하여 이독성 약물이나 사고로 인한 내이손상도 줄어들게 되어, 상대적으로 유전성 난청의 발병율이 증가되었다.
내이는 매우 복잡한 구조로 이루어져 있고 다양한 세포가 유기적인 기능을 수행하도록 되어 있으므로 난청을 일으키는 원인 유전질환도 매우 다양할 것이라 예상된다. 최근 분자생물학적 연구의 발달은 유전성 난청의 원인 유전자를 밝혀내는 큰 학문적 진전을 가져왔고 난청이 오는 기전을 이해할 수 있게 됨으로써 나아가 그 치료법을 모색할 수 있는 임상응용의 단계에 이르렀다.
유전성 난청의 약 1/3은 증후군을 동반(syndromic)하고 나머지 2/3는 비증후군성(nonsyndromic)이다. 증후군성 난청은 특징적인 임상증상으로 쉽게 분류되므로 같은 원인을 가진 환자들을 많이 모아서 그 원인 유전자를 추적할 수 있다. 하지만 다른 증상이 없이 난청만을 보이는 비증후군성 난청(nonsyndromic hearing loss)의 경우 원인 유전자를 찾기 위하여는 난청 환자가 많이 발생한 큰 가계(pedigree)를 분석하는 수 밖에 없다.
한편, 소리를 듣는 과정에서 중요한 역할을 하는 전압 개폐 칼륨 채널(voltage-gated K+ channel)인 KCNQ4는 주로 내이(inner ear) 달팽이관의 유모세포(hair cell)에서 발현하며, 달팽이관 내 K+ 이온의 항상성 유지에 핵심적인 역할을 한다. KCNQ4 유전자에 돌연변이가 발생할 경우 비증후군성 진행형 난청(non-syndromic progressive deafness)인 상염색체 우성 비증후군성 난청 2(deafness nonsyndromic autosomal dominant 2, DFNA2)이 발병하는데, 이러한 난청은 진행성이며, 중등도의 난청소견을 보인다. 난청의 예방 및 치료를 위해 시도된 많은 연구들에도 불구하고, 난청의 명확한 분자기전 및 예방과 치료 방안이 아직까지 제시되지 못하고 있다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 비증후군성 난청을 보다 효과적으로 진단하고 치료방법을 제시하기 위해 노력한 결과, 신규한 KCNQ4 변이를 발견하고, 이를 통해 비증후군성 난청을 효과적으로 진단할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
일 양상은 신규한 KCNQ4 단백질 변이체, 이의 단편 또는 상기 단백질 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 검출하기 위한 제제를 포함하는, 칼륨 채널병증(potassium channelopathy) 진단용 조성물을 제공한다.
다른 양상은 상기 진단용 조성물을 포함하는 건선 환자에서 심혈관 동반질환을 진단하기 위한 키트를 제공한다.
또 다른 양상은 KCNQ4 단백질 변이체, 이의 단편 또는 상기 단백질 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 검출하거나 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 칼륨 채널병증의 진단 또는 치료를 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
또 다른 양상은 KCNQ4 야생형 단백질 및 KCNQ4 단백질 변이체를 발현하는 형질전환체를 포함하는, 칼륨 채널 활성 억제제 스크리닝용 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 상기 형질전환체를 이용한 칼륨 채널 활성 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
일 양상은 KCNQ4(Voltage-Gated Potassium Channel Subunit Kv7.4) 단백질 변이체, 이의 단편 또는 상기 단백질 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 검출하기 위한 제제를 포함하는, 칼륨 채널병증(potassium channelopathy) 진단용 조성물로서, 상기 KCNQ4 단백질 변이체는 a) 271번째 및 272번째 아미노산인 알라닌 및 아스파라긴산이 결실된 변이체, b) 331번째 아미노산인 아르기닌이 글루타민으로 치환된 변이체 및 c) 319번째 아미노산인 글라이신이 아스파라긴산으로 치환된 변이체로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것인, 조성물을 제공하는 것이다.
본 명세서에서 용어 "KCNQ4(Voltage-Gated Potassium Channel Subunit Kv7.4)"은 내이의 유모세포 기저부에 존재하는 칼륨 채널을 구성하는 단백질로서, 칼륨의 재순환을 통해 유모세포 내 전기 생리학적 안정성을 유지시킴으로서 소리 전달에 있어 매우 중요한 기능을 하는 것으로 알려져 있다.
상기 KCNQ4 유전자에 돌연변이가 발생하는 경우, 칼륨 채널의 기능 소실로 인하여 유모세포로부터 칼슘 이온이 배출이 되지 않아 지속적으로 유모세포 내 탈분극 상태가 유지되고, 이에 따른 세포의 피로와 칼륨 독성에 의해 서서히 난청이 발생하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 신규한 KCNQ4 변이체인 G319D 변이체의 경우, 기존에 알려진 다른 돌연변이와는 다르게 칼륨 채널이 과활성화되어 유모세포 내 칼슘 이온이 밖으로 과도하게 유출되는 채널 활성 증강 기전에 의한 비증후군성 난청이 발생할 수 있음을 확인하였다.
상기 KCNQ4 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 것일 수 있다.
상기 271번째 및 272번째 아미노산인 알라닌 및 아스파라긴산이 결실된 KCNQ4 단백질 변이체(A271_D272del)는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 상기 331번째 아미노산인 아르기닌이 글루타민으로 치환된 KCNQ4 단백질 변이체(R331Q)는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 319번째 아미노산인 글라이신이 아스파라긴산으로 치환된 치환된 KCNQ4 단백질 변이체(G319D)는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 KCNQ4 단백질 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 a) 811번째 내지 816번째 염기가 결실된 변이, b) 992번째 염기인 G가 A로 치환된 변이, 및 c) 956번째 염기인 G가 A로 치환된 변이로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로 a) 811번째 내지 816번째 염기가 결실된 변이는 271번째 및 272번째 아미노산인 알라닌 및 아스파라긴산이 결실된 변이체를 암호화하고, b) 992번째 염기인 G가 A로 치환된 변이는 331번째 아미노산인 아르기닌이 글루타민으로 치환된 변이체를 암호화하며, c) 956번째 염기인 G가 A로 치환된 변이는 319번째 아미노산인 글라이신이 아스파라긴산으로 치환된 변이체를 암호화하는 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오타이드는 상기의 KCNQ4의 변이 부위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 단편을 포함하는 것일 수 있다.
상기 KCNQ4 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 2의 염기서열로 구성된 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "칼륨 채널병증(potassium channelopathy)"은 다양한 세포와 세포소기관의 막에 위치하고 있는 칼륨 채널의 기능 이상으로 인해 발병하는 질병을 의미하는 것으로서, 구체적으로 KCNQ4 단백질 또는 상기 단백질로 구성된 칼륨 채널의 기능 이상을 원인으로 발병하는 것일 수 있으며, 상기 KCNQ4 단백질의 기능 이상은 KCNQ4 유전자의 돌연변이 또는 KCNQ4 단백질 변이체에 의해 발생하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 '기능 이상'은 단백질이 가지는 생체 내에서의 정상적인 생물학적 활성이 감소되거나 소멸된 것 또는 과도하게 증가되는 것을 의미한다. 따라서, 기능 이상은 기능 상실(Loss-of-function) 또는 기능 획득(Gain-of-function)을 포함하는 의미이다. 상기의 기능 이상은 유전자 전사활성의 이상, 번역(translation)의 이상, RNA 프로세싱의 이상, 단백질의 안정성 및 3차원 구조의 이상, 이동 및 활성의 이상 또는 이들의 조합에 기인할 수 있다.
전압 개폐　칼륨　채널(voltage gated potassium channel)인 KCNQ4 단백질에 기능 이상이 발생할 경우 활동전압에 따른　칼륨　이온의 통과가 정상적이지 못하며, 자극에 의해 유입된　칼륨　이온이 세포 밖으로 유출되지 못하거나, 과도하게 유출됨으로서　칼륨　이온의 항성성이 붕괴된다. 따라서, 본 발명의 조성물로 진단할 수 있는　칼륨　채널병증은 KCNQ4 단백질의 기능 이상으로 인해　칼륨　이온의 항상성이 유지되지 못하는 모든 질환을 포함하며, 예를 들어 신경근긴장증(neuromyotonia), 간헐성 운동실조(Episodic Ataxia), 저칼륨혈증 주기성마비(hypokalaemic periodic paralysis), 간질(epilepsy) 및 비증후군성 난청(non-syndromic deafness)을 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로, 비증후군성 난청일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "비증후군성 난청(non-syndromic deafness)"은 다른 증상이 없이 내이 기능 이상에 의한 난청만을 보이는 질병으로서,'비증후군성 감각신경성 난청'와 동일한 의미로 사용된다. 비증후군성 난청은 유전성 난청의 약 2/3을 차지하고 있으며, 보통 단일 유전자 이상에 의한 것이며 여러 유전형태를 보인다. 유전자의 좌위에 따라 상염색체우성형(deafness nonsyndromic autosomal dominant, DFNA), 상염색체열성형(DFNB), 성염색체유전형(DFN)으로 명명된다.
상기 조성물은 KCNQ4 단백질 변이체, 이의 단편 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 발현 수준을 측정할 수 있는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 KCNQ4 단백질 변이체 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 발현 수준을 대조군(KCNQ4 단백질 야생형, 하우스키핑 단백질 등)의 발현 수준과 비교하여, 상기 KCNQ4 단백질 변이체가 이형접합(heterozygous) 변이체 또는 돌연변이인지, 동종접합(homozygous) 변이체 또는 돌연변이인지 판별할 수 있는 것일 수 있다. 상기 이형접합 변이는 한쌍의 상동 염색체의 한쪽에만 변이가 있는 경우를 의미하며, 동종접합 변이는 양쪽 모두 변이가 있는 경우를 의미한다.
따라서, 상기 조성물은 상기 KCNQ4 단백질 변이체가 이형접합 돌연변이인지 확인할 수 있는 바, 상기 조성물을 이용하여 319번째 아미노산인 글라이신이 아스파라긴산으로 치환된 KCNQ4 단백질 이형접합 변이체를 검출함으로서, 칼륨 채널의 과활성화에 의해 발병하는 칼륨 채널병증 또는 비증후군성 난청을 진단할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "검출 또는 발현 수준의 측정"은 특정 단백질(펩타이드) 또는 이의 단편, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 여부 또는 발현 정도를 측정하는 것을 의미한다. 상기 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준은 상기 단백질 또는 이의 단편의 상대적 양 또는 절대적인 양일 수 있다.
상기 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 것은 상기 단백질 또는 이의 단편의 양을 측정하는 것일 수 있다. 상기 유전자의 발현 수준은 상기 단백질들을 암호화하는 mRNA의 발현 수준일 수 있다. mRNA의 발현 수준은 mRNA의 상대적 양 또는 절대적인 양일 수 있다. 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 것은 mRNA의 양을 측정하는 것일 수 있다.
상기 단백질의 검출 또는 발현 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏팅 (Western blotting), ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석 (RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법 (radical immunodiffusion), 오우크테로니면역 확산법 (Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동 (rocket immunoeletrophoresis), 면역조직화학염색법 (immunohistochemical staining), 면역침전분석법 (immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법 (complenent Fixation Assay), 면역형광법 (immunofluorescence), 면역크로마토그래피법 (immunochromatography), FACS 분석법 (fluorescenceactivated cell sorter analysis) 또는 단백질 칩 방법 (protein chip technology)인 것일 수 있다.
상기 mRNA 또는 유전자의 검출 또는 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합반응 (RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응 (competitive RT-PCR), 실시간 역전사 효소 중합효소반응 (real time quantitative RT-PCR), 정량적 중합효소반응 (quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RNase protection method), 노던 블랏팅 (Nothern blotting) 또는 DNA 칩 방법 (DNA chip technology)인 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "검출 또는 발현 수준을 측정하는 제제"는 특정 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 검출 또는 발현 수준을 확인하기 위하여 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 구체적으로 상기 단백질 또는 상기 유전자를 검출 및/또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "특정 유전자 또는 단백질을 검출할 수 있는 제제”는 상기 특정 유전자 또는 단백질에 특이적으로 결합하여 인식할 수 있도록 하거나, 검출하여 증폭시킬 수 있는 제제를 의미하고, “특정 유전자 또는 단백질을 증폭할 수 있는 제제”는 상기 특정 유전자 또는 단백질의 복제를 반복하여 그 수를 증가시킬 수 있는 제제를 의미하며, 예를 들어 상기 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 특이적으로 결합할 수 있는 프로브를 의미하는 것일 수 있다.
상기 제제는 상기 단백질 변이체 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 앱타머(aptamer)일 수 있다. 용어 "항체(antibody)"는 용어 "면역글로불린(immunoglobulin)"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 항체는 폴리 클론 항체 또는 모노클론 항체일 수 있다. 상기 항체는 전장 항체일 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 항원 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드를 말한다. 상기 항원 결합 단편은 단일-도메인 항체(single-domain antibody), Fab, F(ab'), F(ab')2 또는 Fv일 수 있다. 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 고체 지지체에 부착된 것일 수 있다. 상기 고체 지지체는 예를 들어, 금속 칩, 플레이트, 또는 웰(well)의 표면이다. 상기 앱타머는 상기 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 단일 가닥의 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)이나 펩티드일 수 있다.
상기 제제는 상기 단백질 변이체 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 동일하거나 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산일 수 있다. 상기 핵산은 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 상기 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그의 말단 또는 내부에 형광 물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 또는 방사성 동위원소 등으로 표지된 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "프라이머(primer)"는 자유 3-말단 수산화기 (free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 특정 염기 서열에 대해 상보적인 주형 (template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4가지의 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 바이오마커를 암호화하는 유전자의 mRNA에 대한 특이적인 프라이머로서 7개 내지 50개의 뉴클레오티드 서열을 가진 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성량의 측정을 통해 건선이 발병된 개체의 심혈관 동반질환 발병 가능성을 예측할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다. 상기 프라이머는 10 내지 100, 15 내지 100, 10 내지 80, 10 내지 50, 10 내지 30, 10 내지 20, 15 내지 80, 15 내지 50, 15 내지 30, 15 내지 20, 20 내지 100, 20 내지 80, 20 내지 50, 또는 20 내지 30 nt를 갖는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "프로브(probe)"란 표적 핵산 예를 들면, mRNA와 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 특정 mRNA의 존재 유무, 함량 및 발현량을 확인할 수 있도록 라벨링(labeling)되어 있을 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단일가닥 DNA (single strand DNA) 프로브, 이중가닥 DNA(double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 예를 들면 본 발명의 바이오마커를 암호화하는 유전자의 mRNA와 상보적인 핵산 서열을 갖는 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 정도를 통해 mRNA의 발현량을 측정함으로써 건선이 발병된 개체의 심혈관 동반질환 발병 가능성을 예측할 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다. 상기 프로브는 10 내지 100, 15 내지 100, 10 내지 80, 10 내지 50, 10 내지 30, 10 내지 20, 15 내지 80, 15 내지 50, 15 내지 30, 15 내지 20, 20 내지 100, 20 내지 80, 20 내지 50, 또는 20 내지 30 nt를 갖는 것일 수 있다.
또한, 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트 (phosphoramidite) 고체 지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 또한 이러한 핵산 서열은 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법을 통해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 또는 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 또한 프라이머 또는 프로브는 검출 가능한 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형될 수 있다. 상기 표지의 예는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 또는 바이오틴을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "진단"은, 특정 개체에 대하여 칼륨 채널병증이 이미 발병하였는지 여부를 판별하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어, "예측"은, 특정 개체에 대하여 칼륨 채널병증이 발병할 가능성이 있는지, 발병할 가능성이 있다면 칼륨 채널병증이 발병할 가능성이 불특정 다수인에 비하여 상대적으로 높은지 여부를 판별하는 것을 의미한다.
다른 양상은 상기 칼륨 채널병증 진단용 조성물을 포함하는, 칼륨 채널병증 진단용 키트를 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 키트에도 공히 적용된다.
상기 키트는 상기 KCNQ4 단백질 변이체, 이의 단편 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 검출하거나 발현 수준을 측정함으로써, 칼륨 채널병증의 발병 가능성 및 예후 등을 진단 또는 예측할 수 있는 효과가 있다.
상기 키트는 칼륨 채널병증의 발병을 예측하는데 필요한 시료를 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 고체 지지체, 항체 또는 항원 결합 단편의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적합한 완충용액, 발색 효소, 형광물질로 표지된 2 차 항체, 또는 발색 기질을 포함할 수 있다. 상기 키트는 핵산 검출을 위하여, 중합효소, 완충제, 핵산, 조효소, 형광물질, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 중합 효소는 예를 들어 Taq 중합효소이다.
구체적으로 상기 키트는 PCR 키트, RT-PCR 키트, qRT-PCR 키트, DNA 칩 키트, 웨스턴 블랏 키트, 또는 ELISA 키트 일 수 있다.
상기 PCR 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. PCR 키트는, 상기 유전자들 또는 메틸화 영역에 대한 특이적인 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액 (pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수 (DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다.
상기 RT-PCR 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있으며, RT-PCR 키트는, 상기 유전자들 또는 메틸화 영역에 대한 특이적인 각각의 프라이머 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 디옥시뉴클레오타이드(dNTPs), 디디옥시뉴클레오타이드(ddNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
상기 DNA 칩 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있으며, DNA 칩 키트는 상기 유전자들 또는 메틸화 영역에 대한 특이적인 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브가 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 핵산을 포함할 수 있다.
또 다른 양상은 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 KCNQ4 단백질 변이체, 이의 단편 또는 상기 단백질 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 검출하거나 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 칼륨 채널병증의 진단 또는 치료를 위한 정보 제공 방법으로서, 상기 KCNQ4 단백질 변이체는 a) 271번째 및 272번째 아미노산인 알라닌 및 아스파라긴산이 결실된 변이체, b) 331번째 아미노산인 아르기닌이 글루타민으로 치환된 변이체 및 c) 319번째 아미노산인 글라이신이 아스파라긴산으로 치환된 변이체로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것인, 방법을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 방법에도 공히 적용된다.
본 명세서에서 용어, "개체"는 칼륨 채널병증이 발병되거나 발병될 가능성이 있는 모든 생물체를 의미하며, 구체적인 예로, 포유동물, 예를 들면, 인간, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다.
상기 생물학적 시료는 상기 개체로부터 수득된 시료를 말한다. 상기 생물학적 시료는 예를 들면 혈액, 혈장, 혈청, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 점막액, 양수, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 생물학적 시료는 시료로부터 수득된 단백질 시료 또는 핵산 시료를 포함하며, 상기 핵산 시료는 DNA, mRNA, 또는 mRNA로부터 합성되는 cDNA 등을 포함하는 것일 수 있다.
상기 검출하거나 발현 수준을 측정하는 단계는 상기 생물학적 시료와, 상기 단백질 변이체 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 앱타머를 인큐베이션시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 측정하는 단계는 전기영동, 면역블로팅, 효소 결합 면역흡착 분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA), 단백질 칩, 면역침강, 마이크로어레이, 전자현미경법(electron microscopy), 또는 이들의 조합으로 수행될 수 있다. 상기 전기영동은 SDS-PAGE, 등전점 전기영동, 2차원 전기영동, 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 검출하거나 발현 수준을 측정하는 단계는 상기 생물학적 시료와, 상기 단백질 변이체 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 동일하거나 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드와 인큐베이션시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 측정하는 단계는 노던 블로팅(Northern blotting) 또는 폴리머라제 증폭 반응(polymerase chain reaction: PCR)으로 수행될 수 있다. 상기 PCR은 실시간 PCR 또는 역전사 PCR일 수 있다.
상기 방법은 상기 분리된 생물학적 시료로부터 상기의 KCNQ4 단백질 변이체, 이의 단편 또는 상기 단백질 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 검출될 경우, 상기 개체를 칼륨 채널병증이 발병한 것으로 판별하거나 발병 위험을 높은 수준으로 예측하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 KCNQ4 단백질 변이체, 이의 단편 또는 상기 단백질 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 검출하거나 발현수준을 측정하는 단계는 상기 KCNQ4 단백질 변이체가 이형접합 변이체/돌연변이인지 또는 동종접합 변이체/돌연변이인지 확인하는 것을 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법은 상기 KCNQ4 단백질 변이체가 271번째 및 272번째 아미노산인 알라닌 및 아스파라긴산이 결실된 변이체 또는 331번째 아미노산인 아르기닌이 글루타민으로 치환된 변이체인 경우, 상기 칼륨 채널병증은 칼륨 채널 기능의 불활성화 또는 저활성화에 의한 것으로 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 상기 변이체는 이형접합 또는 동종접합일 수 있다.
상기 방법은 상기 KCNQ4 단백질 변이체가 319번째 아미노산인 글라이신이 아스파라긴산으로 치환된 변이체로서 이형접합(heterozygous) 변이체인 경우, 상기 칼륨 채널병증은 칼륨 채널 기능의 과활성화에 의한 것으로 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법은 상기 KCNQ4 단백질 변이체가 319번째 아미노산인 글라이신이 아스파라긴산으로 치환된 변이체로서 동종접합 변이체인 경우, 상기 칼륨 채널병증은 칼륨 채널 기능의 불활성화 또는 저활성화에 의한 것으로 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법은 상기 KCNQ4 단백질 변이체가 331번째 아미노산인 아르기닌이 글루타민으로 치환된 변이체로서 이형접합 변이체인 경우, 상기 개체를 칼륨 채널 활성제를 이용한 치료 대상으로 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 칼륨 채널 활성제는 레티가빈(retigabine, Ret), 아연 피리티온(zinc pyrithione, ZnPy) 등을 포함하는 KCNQ 오프너 또는 PIP5K(Phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase)를 포함하는 PIP2(Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate) 활성화제일 수 있다.
상기 방법은 상기 KCNQ4 단백질 변이체가 319번째 아미노산인 글라이신이 아스파라긴산으로 치환된 변이체로서 이형접합 변이체인 경우, 상기 개체를 칼륨 채널 활성 억제제를 이용한 치료 대상으로 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 칼륨 채널 활성 억제제는 리노피르딘(Linopirdine) 등을 포함하는 KCNQ 억제제 또는 PLL (polycation poly-L-lysine) 등을 포함하는 PIP2 킬레이트제를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서는 신규한 KCNQ4 변이체인 a) 271번째 및 272번째 아미노산인 알라닌 및 아스파라긴산이 결실된 변이체(A271_D272del), b) 331번째 아미노산인 아르기닌이 글루타민으로 치환된 변이체(R331Q) 및 c) 319번째 아미노산인 글라이신이 아스파라긴산으로 치환된 변이체(G319D)를 발견하였으며, 상기 변이체를 검출함으로서 KCNQ4 칼륨 채널의 기능 이상 및 이에 의한 비증후군성 난청을 진단할 수 있음을 확인하였다.
또한, R331Q 이형접합 변이의 경우 칼륨 채널 기능이 억제되고 칼륨 채널 활성화제를 처리한 경우 채널 기능이 회복되는 것을 확인하였으며, G319D 이형접합 변이의 경우 반대로 칼륨 채널 기능이 과활성화되고 칼륨 채널 활성 억제제를 처리한 경우 채널 기능이 정상화되는 것을 확인하였다. 따라서, 이를 이용하면 비증후군성 난청을 포함하는 칼륨 채널병증의 근본적인 발병원인을 확인할 수 있을 뿐만 아니라, 효과적인 치료방식을 제안할 수 있다.
또 다른 양상은 KCNQ4 단백질 및 319번째 아미노산인 글라이신이 아스파라긴산으로 치환된 KCNQ4 단백질 변이체를 발현하는 형질전환체를 포함하는, 칼륨 채널 활성 억제제 스크리닝용 조성물을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다.
본 명세서에서 용어, "형질전환"이란, 유전자조작 기법을 사용하여 외부로부터 도입된 핵산을 포함하는 플라스미드 또는 유전체에 의해 숙주세포(원핵 및 진핵생물, 동물세포 및 식물세포)의 유전형질이 변화되는 현상을 의미하며, 용어 "형질전환체"란 외부로부터 도입된 플라스미드 유전자 또는 유전체 DNA가 세포분열을 반복 하더라도 안정적으로 유전자를 보유하며, 안정적으로 유전자의 발현을 유지하는 세포를 의미한다. 상기 형질전환을 수행하기 위하여는, 핵산을 유기체, 세포, 조직, 기관 또는 핵산내로 도입하는 어떤 방법도 사용될 수 있고, 구체적으로 당해 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "숙주세포"란, 외부 핵산의 도입 대상이 되는 세포를 의미하며, 구체적으로 대장균(Escherichiacoli), 바실러스 서브틸리스(Bacillussubtilis), 스트렙토마이세스 속(Streptomycessp.), 슈도모나스 속(Pseudomonassp.), 프로테우스 미라빌리스(Proteusmirabilis) 또는 스타필로코쿠스 속(Staphylococcussp.)과 같은 원핵생물; 진균(예를 들어, 아스페르길러스 속(Aspergillussp.)), 효모(예를 들어, 피키아 파스토리스 (Pichiapastoris), 사카로마이세스 세르비시애 (Saccharomycescerevisiae), 쉬조사카로마이세스 속 (Schizosaccharomyces　sp.), 뉴로스포라 크라사 (Neurosporacrassa) 등과 같은 하등 진핵생물; 곤충 세포, 식물 세포, CHO, HeLa, HEK293, 및 COS-1과 같은 포유 동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포 등이 사용될 수 있다. 또한, 당 업계에서 일반적으로 사용되는, 배양된 세포 (in vitro), 이식된 세포 (graft cell) 및 일차 세포 배양 (인 비트로(in vitro) 및 엑스 비보(ex vivo)), 및 인 비보 (in vivo) 세포, 및 또한 인간을 포함하는 포유동물의 세포 (mammalian cell)일 수 있다.
상기 조성물은 상기 KCNQ4 야생형 단백질 및 KCNQ4 단백질 변이체가 형질주입된 안정성 세포 모델(stable cell line)의 형태일 수 있다.
상기 형질전환체는 상기 KCNQ4 야생형 단백질 및 KCNQ4 단백질 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터가 포함된 것일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "발현벡터"란, 적당한 숙주세포에 도입되어 목적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 상기 용어 "작동가능하게 연결된(operably linked)"이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 적합한 발현벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 일반 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있고, 원핵 세포의 경우에는 lac, tac, T3 및 T7 프로모터, 진핵세포의 경우에는 원숭이 바이러스 40(SV40), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 사람 면역 결핍 바이러스(HIV), 예를 들어 HIV의 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스, 시토메갈로바이러스(CMV), 엡스타인 바 바이러스(EBV), 로우스 사코마 바이러스(RSV) 프로모터뿐만 아니라, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈, 사람 근육 크레아틴, 사람 메탈로티오네인 유래의 프로모터 등이 있지만, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함할 수 있다. 선택마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하므로 형질전환된 세포가 선별 가능하다. 또한, 벡터가 복제가능한 발현벡터인 경우, 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 복제원점(replication origin)을 포함할 수 있다.
외래 유전자를 삽입하기 위한 재조합 발현 벡터로는 플라스미드, 바이러스, 코즈미드 등 다양한 형태의 벡터를 사용할 수 있다. 재조합 벡터의 종류는 원핵세포 및 진핵세포의 각종 숙주세포에서 원하는 유전자를 발현하고 원하는 단백질을 생산하는 기능을 하는 한 특별히 제한되지 않지만, 구체적으로 강력한 활성을 나타내는 프로모터와 강한 발현력을 보유하면서 자연 상태와 유사한 형태의 외래 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 벡터가 이용될 수 있다.
본 발명의 단백질을 발현시키기 위하여, 다양한 숙주와 벡터의 조합이 이용될 수 있다. 진핵숙주에 적합한 발현 벡터로는 이에 제한되지 않지만, SV40, 소 유두종바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adenoassociated virus), 시토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 조절 서열 등이 포함될 수 있다. 세균 숙주에 사용할 수 있는 발현 벡터로는 이에 제한되지 않지만, pET21a, pET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, pUC 벡터, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 또는 이들의 유도체 등을 포함하는 대장균(Escherichia coli)에서 얻어지는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, λgt10, λgt11 또는 NM989 등의 파지 람다(phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지 등이 포함될 수 있다. 효모 세포에는 2℃플라스미드 또는 그의 유도체 등이 사용될 수 있으며, 곤충 세포에는 pVL941 등이 사용될 수 있다.
상기 형질전환체는 상기 KCNQ4 단백질 및 KCNQ4 단백질 변이체를 공동으로 발현하는 것으로서, 상기 KCNQ4 단백질 및 KCNQ4 단백질 변이체는 7:1 내지 1:2의 비율로 발현되는 것일 수 있으며, 구체적으로 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1 또는 1:2의 비율로 발현되는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 1:1의 비율로 발현되는 것일 수 있다.
상기 형질전환체는 상기 KCNQ4 야생형 단백질 및 KCNQ4 단백질 변이체를 포함하는 융합단백질을 발현하는 것일 수 있다. 상기 KCNQ4 야생형 단백질 및 KCNQ4 단백질 변이체는 각각에 직접적으로 연결될 수도 있고, 링커를 통해 연결될 수도 있다.
상기 링커는 KCNQ4 야생형 단백질 및 KCNQ4 단백질 변이체 각각의 활성을 나타내게 하는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로는 글라이신, 알라닌, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 리신, 아르기닌산 등의 아미노산을 사용하여 연결시킬 수 있고, 보다 구체적으로는 발린, 루이신, 아스파르트산, 글라이신, 알라닌, 프롤린 등을 여러개 사용하여 연결시킬 수 있으며 상기 아미노산을 1개 내지 20개씩 연결하여 사용할 수 있다.
상기 융합 단백질에서 상기 KCNQ4 단백질 변이체는 KCNQ4 야생형 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 연결된 것일 수 있으며, 구체적으로 C-말단에 연결된 것일 수 있다.
상기 융합 단백질은 상기 KCNQ4 야생형 단백질 및 KCNQ4 단백질 변이체가 공동-발현되어, 구체적으로 1:1로 발현됨으로서 야생형 및 변이체가 2:2의 비율로 조립된 KCNQ4 채널을 구성할 수 있다.
상기 KCNQ4 야생형 단백질 및 319번째 아미노산인 글라이신이 아스파라긴산으로 치환된 KCNQ4 단백질 변이체가 공동발현되어 조립된 KCNQ4 이종사량체 채널은 KCNQ4 야생형 단백질로 조립된 동종사량체 채널보다 칼륨 채널이 과활성화되며, 칼륨 채널 활성 억제제 또는 KCNQ4 억제제를 처리할 경우 칼륨 채널의 활성화가 억제되는 것을 확인하였다. 따라서, 상기의 KCNQ4 이종사량체 채널 및 이를 포함하는 형질전환체를 이용하면 칼륨 채널 활성 억제제를 효율적으로 스크리닝할 수 있다.
또 다른 양상은 1) KCNQ4 야생형 단백질 및 319번째 아미노산인 글라이신이 아스파라긴산으로 치환된 KCNQ4 단백질 변이체를 발현하는 형질전환체에 칼륨 채널 활성 억제제 후보물질을 처리하는 단계; 및 2) 상기 후보물질이 처리된 형질전환체의 칼륨 채널 활성화 정도를 측정하는 단계를 포함하는, 칼륨 채널 활성 억제제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 방법에도 공히 적용된다.
상기 방법은 상기 후보물질에 의해 칼륨 채널의 활성화가 억제되는 경우 상기 후보물질을 칼륨 채널 활성 억제제로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법에서 칼륨 채널 활성화 정도를 측정하는 단계는 세포 내 칼륨 이온의 잔류랑 또는 칼륨 이온의 이동 수준을 측정하거나, 칼륨 이온의 이동에 따른 전류 및/또는 전압의 변화 정도를 측정하는 등의 전기생리학적 분석을 통해 확인하는 것일 수 있으며, 구체적으로 패치 클램프(patch clamp)를 이용하는 것일 수 있다.
일 양상에 따른 칼륨 채널병증을 진단하기 위한 조성물, 키트, 및 이를 이용한 칼륨 채널병증을 진단하기 위한 정보제공 방법에 따르면, 칼륨 채널병증의 발병 여부 및 예후를 객관적이고, 신속하고, 높은 정확도 및 특이도로 검출하는데 이용할 수 있다.
도 1은 신규한 KCNQ4 변이체를 포함하는 가계도의 청각적 표현형 및 시퀀싱 분석 결과를 나타낸 도면이다:
(A) 상이한 청각적 표현형을 갖는 4명의 계보발단자의 순음 청력검사 결과를 나타낸다: 고주파수 청력 손실(SB228 및 SB155), 중간 주파수 청력 손실(SB356) 및 저주파수 청력 손실(SB62).
(B) 가계도 별 생어 시퀀싱 크로마토 그램 분석 결과를 나타낸다:
(C) 다양한 KCNQ4 오솔로그 및 파라로그에서 신규한 변이체가 잘 보존되어 있음을 확인하였다.
도 2는 KCNQ4의 기능성 도메인 맵에 대한 개략도를 나타낸다. 구체적으로, 본 발명에서 확인한신규한 KCNQ4 변이체는 기공 루프 도메인에 위치한 p.A271_D272del, 막 횡단 S6 세그먼트의 C- 말단 부분에 위치한 p.G319D, 근위 세포질 C- 말단에 위치한 p.R331Q.이다.
도 3은 KCNQ4 변이체 채널의 손상된 채널 전도도 및 우성-음성 효과를 나타낸 도면이다:
(A) KCNQ4 WT, p.S269del, p.A271_D272del, p.G319D, p.R331Q 또는 GFP를 일시적으로 발현하는 HEK293T 세포로부터 기록된 전체 세포 K+ 전류를 나타낸다. 동종체 KCNQ4 변이 채널에서 KCNQ4-매개 K+ 전류인 리노피르딘 (30μM)-민감성 K+ 전류 ('subtracted')는 거의 감지되지 않았다.
(B) KCNQ4 WT 및 변이체의 콘카테머에서의 KCNQ4-매개 K+ 전류의 전류-전압(I-V) 관계를 나타낸 도면이다.
(C) KCNQ 오프너는 동종체 KCNQ4 변이 채널을 활성화시키지 않음을 확인하였다. 구체적으로, 레티가빈 (Ret, 10μM) 또는 Ret와 아연 피리티온 (Ret/ZnPy 10μM)의 조합은 변이 채널을 활성화시키지 못했다.
(D) 동종체 KCNQ4 변이 채널에 KCNQ 오프너를 처리한 후의 전류 밀도는 GFP의 밀도와 크게 다르지 않았다 (n = 7-9).
도 4는 KCNQ4 변이체 채널의 우성-음성적 효과를 나타낸다.
(A) 각각의 KCNQ4 변이체 (p.S269del, p.A271_D272del, p.G319D 또는 p.R331Q)는 KCNQ4 야생형(WT)와 표시된 몰비(야생형:변이체)공동발현되었고, + 40mV에서 KCNQ4-매개 K+ 전류가 측정되었다. K+ 전류 트레이스 아래의 점선은 -80mV의 유지 전위에서 전류 레벨이 0임을 나타낸다.
(B) +40mV (n=6-17)에서 야생형:변이체 cDNA 몰비에 따른 전류 밀도(pA/pF)를 나타낸 도면이며, cDNA의 총량은 빈 pRK5 벡터를 추가하여 모든 실험군에서 동일하게 하였다.
(C) KCNQ4 변이체 (var.) 채널의 공동 발현에 의한 WT 매개 전류 억제 정도를 나타낸 도면이다. +40 mV에서 전류 밀도의 평균 값을 정규화하고 전류 억제 비율을 WT / (WT + var.) cDNA 몰비에 대해 그래프화하였다. 정사각형 기호가 있는 점선은 우성-음성적 서브 유닛이 있는 사량체화 채널에 대해 예상되는 전류 억제 비율을 나타낸다.
도 5는 KCNQ4 변이체 텐덤 콘카테머 채널의 우성-음성적 효과를 나타낸다.
(A) KCNQ4 변이체 텐덤 콘카테머 채널의 구조에 대한 개략적인 모식도를 나타낸다.
(B) KCNQ4 WT 및 변이체의 콘카테머로 조립된 KCNQ4 채널로부터 기록된 전체 세포 K+ 전류를 나타낸다. GFP로 형질주입된 세포를 음성 대조군으로 사용하고, 비교를 위해 리노피르딘-민감성 전류를 뺐다.
(C) KCNQ4 WT 및 변이체의 콘카테머에서의 KCNQ4-매개 K+ 전류의 전류-전압(I-V) 관계를 나타낸 도면이다 (n = 4-21).
도 6은 KCNQ4 p.A271_D272del 또는 p.R331Q 변이체의 기능성을 확인한 도면이다.
(A) KCNQ4 WT, KCNQ4 p.A271_D272del 및 KCNQ4 p.R331Q로 형질주입된 HEK293T 세포의 면역 형광 관찰 결과를 나타낸 도면이다.
(B) KCNQ4 WT, KCNQ4 p.A271_D272del 및 KCNQ4 p.R331Q로 형질주입된 HEK293T 세포 표면의 바이오틸화 분석 결과를 나타낸 도면이다 (***, 통계적으로 유의미함).
도 7은 KCNQ4 변이 채널의 PIP5K에 의한 기능 회복 여부를 확인한 도면이다:
(A) 동종체 KCNQ4 변이 채널 (p.R331Q 및 p.G319D)과 텐덤 콘카테머로 조립된 이종체 KCNQ4 변이 채널(WT-p.R331Q 및 WT-p.G319D)에서 PIP5K 발현의 효과를 비교하였다. 전체 K+ 전류는 HEK 293T 세포에서 PIP5K 부재 (-PIP5K) 또는 PIP5K 발현 (+ PIP5K) 상태에서 측정되었다.
(B) WT-WT, WT-p.R331Q 및 WT-p.G319D로 조립된 탠덤 콘카테머 채널의 I-V 곡선을 나타낸다.
(C) WT-WT, WT-p.R331Q 및 WT-p.G319D로 조립된 탠덤 콘카테머 채널의 정상-상태 활성화 곡선을 나타낸다.
(D 및 E) WT, p.R331Q, p.G319D 동종체 채널 및 WT-WT, WT-p.R331Q 및 WT-p.G319D 탠덤 콘카테머 채널의 PIP5K 처리 유무에 따른 +40 Mv에서의 K+ 전류 밀도 및 반-활성화 전압(V0.5)을 나타낸다. 그래프의 수평 점선은 동종체 WT 채널 (WT)에서 얻은 값을 나타낸다(n = 10-12); ** P <0.01, *** P <0.005; NS, not significant.
도 8은 텐덤 콘카테머로 조립된 KCNQ4 변이체 채널의 KCNQ 오프너 처리에 따른 기능 회복 여부를 확인한 도면이다.
(A) HEK 293T 세포에서 PIP5K 부재 (-PIP5K) 또는 PIP5K 발현 (+PIP5K) 상태에서의 KCNQ 오프너 처리(ZnPy)에 따른 전체 K+ 전류를 측정하였다.
(B 및 C) WT, p.R331Q, p.G319D 동종체 채널 및 WT-WT, WT-p.R331Q 및 WT-p.G319D 탠덤 콘카테머 채널의 PIP5K 처리 유무 및 KCNQ 오프너(Ret 10 μM, ZnPy 10 μM 및 ML213 3 μM) 처리 유무에 따른 +40 Mv에서의 K+ 전류 밀도 및 반-활성화 전압(V0.5)을 나타낸다. 그래프의 수평 점선은 PIP5K 및 KCNQ 오프너가 처리되지 않은 동종체 WT 채널 (WT)에서 얻은 값을 나타낸다(n = 10-12).
도 9는 WT-p.G319D 텐덤 콘카테머로 조립된 KCNQ4 변이체 채널의 KCNQ 억제제 또는 PIP2 스크리닝에 따른 과활성화 억제 효과를 확인한 도면이다.
(A) WT-p.G319D 텐덤 콘카테머 채널의 리노피르딘 (3-10 μM) 처리에 따른 I-V 곡선(왼쪽) 및 활성화 곡선(오른쪽)을 나타낸다.
(B 및 C) WT-p.G319D 텐덤 콘카테머 채널의 PIP5K 처리 유무 및 폴리-L-라이신 (PLL, 10 또는 30 μg/ml) 처리에 따른 I-V 곡선(왼쪽) 및 활성화 곡선(오른쪽)을 나타낸다.
도 10은 본 발명의 신규한 KCNQ4 변이체인 G319D의 비증후군성 난청 발병 기전을 나타낸 도면이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 개체(실험군) 수집
본 명세서의 모든 실시예 및 실험예의 과정은 서울대학교 병원 (IRB-H-0905-041-281)과 분당 서울대학교 병원 (IRB-B-1007-105-402)의 기관 심의위원회의 승인을 받았으며, 대상 환자로부터 동의를 받았다. 하기 실시예에서는 4개의 가족군 (SB228, SB155, SB356 및 SB62)이 참여하였으며, 이와 관련된 개개인은 병력 인터뷰, 신체 검사, 영상 및 청력 평가를 포함한 포괄적인 표현형 평가를 받았다.
실시예 2: 분자유전학 검사 및 진단
표적 패널 시퀀싱 (Otogenetics, Norcross, GA, USA)은 NimbleGen Sequence Catcher (Roche NimbleGen Inc., Madison, WI, USA)를 사용하여 수행하였으며, 처음에는 표현형 마커가 없는 개체에서 134개의 알려진 난청 유전자에 대해 테스트하였다. 개체가 청각 장애 패널에서 유력한 변이체를 가지고 있지 않은 경우, 진유전체(Exome) 시퀀싱을 수행한 다음 생물정보학(bioinformatics) 분석을 수행했다. 판독 결과를 UCSC hg19 참조 게놈과 비교하고, 비동의 단일염기다형성(non-synonymous single nucleotide polymorphism)을 40의 뎁스(depth)로 필터링했다. dbSNP138은 플래그된 SNP를 제외하고 필터링되었다. 포괄적인 필터링 과정을 사용하여, 희귀한 단일 염기 변이, 인델 indels) 또는 스플라이스-위치 변이를 선택했다. 인종적으로 일치하는 한국인 참조 유전체 데이터베이스 (Korean Reference Genome Database, KRGDB)와 ExAC (Exome Aggregation Consortium, http://exac.broadinstitute.org/) 및 gnomAD (genome aggregation database, (http://gnomad.broadinstitute.org/)를 포함한 글로벌 MAF (Minor Allele Frequency) 데이터베이스를 모두 사용하여 변이의 유병률을 확인했다. 그 후, 후보 난청 유전자의 변이를 확인하기 위해 생어(sanger) 시퀀싱 및 분리 분석을 수행하였다.
검출된 각 변이의 병원성 가능성을 예측하기 위해, 인실리코(in silico) CADD(Combined Annotation Dependent Depletion, https://cadd.gs.washington.edu/) 및 REVEL(Rare Exome Variant Ensemble Learner, https://sites.google.com/site/revelgenomics/) 점수 분석이 수행되었다. 또한, UCSC Genome Browser의 GERP++(Genomic Evolutionary Rate Profiling) 점수를 사용하여 아미노산 잔기의 진화적 보존을 결정했다. 본 발명에서의 신규한 변이의 병원성 가능성은 ACMG/AMP(American College of Medical Genetics and Genomics/Association for Molecular Pathology) 가이드라인에 따라 평가되었다.
실시예 3: 플라스미드 구축, 세포 배양 및 형질주입
KCNQ4 WT cDNA는 pEGFP-N1의 SgfI 및 KgockI 부위에 클로닝되었다. 원숭이 배아 신장 세포주 COS-7 (한국 배양 은행, 한국)은 10% 소태아혈청(FBS)을 함유한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 유지되었다. 일시적 형질주입(transfection) 전에, 세포를 실험실 Tek II 챔버에 70-80%의 밀도로 시딩하였다. 상기 세포에 Lipofectamine 3000 (Invitrogen, Seoul, Korea)을 이용하여 KCNQ4 야생형 또는 변이체 벡터를 형질주입시키고, 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 이 후, 상기 세포를 콘카나발린 A(concanavalin A)으로 염색하였다.
실시예 4: 전기생리학적 분석을 위한 세포 배양 및 KCNQ4 채널의 형질주입
HEK293T 세포는 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Thermofisher)이 첨가된 DMEM에서 37℃에서 5% CO2 조건으로 유지되었다. 세포를 70-90% 밀도로 계대 배양하고 형질주입을 위해 플레이팅하였다. 형질주입 하루 전, 세포를 6웰 배양 접시에 70-90%의 밀도로 플레이팅했다. 동종사량체 KCNQ4 채널의 전체 세포 이온 전류를 측정하기 위해, pRK5 벡터에 KCNQ4 WT, p.S269del, p.A271_D272del, p.G319D 및 p.R331Q를 클로닝하고, cDNA (4.0 μg)는 pEGFPN-1 (0.4 μg, BD Biosciences)로 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 사용하여 HEK293T 세포에서 일시적으로 발현되었다. KCNQ4 WT 서브유닛 또는 하나의 WT 및 하나의 변이 서브유닛의 텐덤 콘카테머(Tandem concatemer)는 서브 유닛 C-말단을 N-말단에 융합함으로써 생성되었다. KCNQ4 WT와 융합된 5개의 텐덤 콘카테머(WT-WT, WT-p.S269del, WT-p.A271_D272del, WT-p.G319D 및 WT-p.R331Q)는 pRK5 벡터에 클로닝되었고, cDNA (8.0 μg)는 pEGFPN-1 (0.4 μg)로 HEK293T 세포에서 일시적으로 발현되었다. 빈 pRK5 벡터 및 GFP로 형질주입된 HEK293T 세포를 형질주입되지 않은 대조군(GFP)으로 사용했다. pEGFP 벡터에 클로닝된 PIP5K (phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase)의 cDNA는 KCNQ4 cDNA와 함께 HEK293T 세포에 일시적으로 발현되었다. 형질주입 하루 후, 0.05% 트립신/EDTA (Thermofisher)로 세포를 분리하고, 전체 세포 패치 클램프(whole-cell patch-clamp) 분석을 수행하였다.
실시예 5: 전체-세포 패치-클램프(Whole-cell patch-clamp)
KCNQ4 채널 전류는 종래의 전체 세포 패치 클램프(whole-cell patch-clamp)로 측정/기록되었다. 패치 피펫은 붕규산염 유리 튜브 (WPI, Sarasota, FL, USA)에서 빼내고, 피펫 팁은 마이크로 포지 (MF-83; Narishige, Japan)로 불로 연마되었다. 피펫 용액이 채워졌을때의 최종 피펫 팁 저항은 1.5-3 MΩ이었다. 전체-세포 K+ 전류는 Axopatch-1D 증폭기 (Axon Instrument, USA)로 측정 및 기록되었다. 전류는 5KHz에서 필터링되고, 10kHz의 샘플링 비율로 수집되었다. 이온 전류를 얻기 전에 직렬 저항이 보상되었고, 패치 클램프 증폭기의 회로를 사용하여 세포 막 정전용량(capacitance, Cm)을 측정 및 캔슬되었다. K+ 전류는 2-s 탈분극 전압 단계(-70 ~ +40mV 범위에서 10mV 단위로 증가됨)로 생성된 다음, 1-s 과분극 전압 단계 -50mV로 생성되었다.
KCNQ4 채널의 전압-의존적 게이팅을 분석하기 위해, 정상 상태 활성화 곡선을 구성했다. 측정된 피크 테일 전류 진폭은 사전-펄스 전압 활성화에 대해 플롯화되었고, 볼츠만 함수에 의해 반-활성화 전압 (V0.5, act)이 계산되었다. 필요한 경우 정규화된 전도도 (G/Gmax)를 계산하여 I-V 곡선에서 V0.5, act 값을 얻었다. 총 전체 세포 전류에서 KCNQ4-매개 K+ 전류는 세포를 KCNQ 억제제 (리노피르딘, 30μM)로 처리하여 약리학적으로 분리하고, 리노피르딘-민감성 성분은 디지털 감산으로 얻었다. 막 PIP2의 음전하를 중화하기 위해, 다양이온성 제제(polycationic agent)인 폴리-L-라이신 (PLL, 10 또는 30 μg/ml)을 전체-세포 피펫 용액에 포함시켰다. 비교를 위해 +40 mV에서 측정된 KCNQ4 전류 진폭을 측정된 Cm으로 나누고 전류 밀도 (pA/pF)로 표현했다. 모든 패치 클램프 측정/기록은 실온(~23℃)에서 수행되었다. 상기 측정된 전류는 Clampex 소프트웨어 (pCLAMP 7.0; Axon Instrument)를 사용하여 분석되었다. 전압 게이트 채널 활성화에 대한 KCNQ4 변이체의 효과를 테스트하기 위해, 패치 클램프 기록을 통해 WT 및 변이체 단백질로 일시적으로 형질주입된 HEK293T 세포의 전체-세포 전류를 측정했다. 빈 pRK5 벡터 및 GFP로 형질주입된 HEK293T 세포에 대한 전체-세포 전류를 음성 대조군으로 사용했다.
실시예 6: 전기생리학적 분석을 위한 화학제제 및 용액
전체-세포 전압 클램프 측정을 위한 외부 배스 용액은 147 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 및 10 mM D-글루코스로 구성되며, NMDG (N-methyl-D-glucamine)를 사용하여 pH 7.4로 조정되었다. 내부 패치 피펫 용액은 130 mM KCl, 10 mM NaCl, 10 mM EGTA, 10 mM HEPES, 3 mM Mg-ATP, 및 0.5 mM CaCl2를 포함하며, KOH를 사용하여 pH 7.2로 조정되었다. 계산된 유리 Ca2+ 농도는 ~10 nM 이다. 리노피르딘 중염산염(Linopirdine dihydrochloride, Tocris Bioscience), 레티가빈(retigabine, Glentham Life Science), ML213 (Tocris Bioscience) 및 아연 피리티온(zinc pyrithione, Sigma-Aldrich)는 DMSO에 용해시켰으며, 1,000x 스톡 (5-30 mM) 용액으로 준비했다. 상기 스톡 용액은 사용 전에 외부 배스 용액으로 희석되었다.
실시예 7: KCNQ4 야생형 및 변이체의 세포내 추적 평가
인큐베이션 후 형질주입된 세포를 4% 파라포름알데히드에 15분 동안 고정시킨 후, PBS 세척을 3 회 반복하였다. 상기 고정된 세포를 1차 항체 [ANTI-FLAG (Sigma Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA)]로 24℃에서 160분 동안 배양하고, 냉장 (4℃ PBS로 3회 세척하고, 2차 항체[F (ab ') 2-Goat anti-Mouse IgG (H + L), Invitrogen, Seoul, Korea]로 상온에서 90분동안 배양했다. 상기 배양된 세포는 VECTASHIELD 고정 배지(Vector Laboratories, CA, USA)로 슬라이드에 고정되었고, 이미지는 공초점 현미경 (Carl Zeiss, LSM710)으로 촬영되었다.
실시예 8: 세포 표면 바이오틸화 어세이
5.0 x 106 COS-7 세포 (T75 플라스크)에 Lipofectamine Plus (Life Technologies, Inc.)을 사용하여 KCNQ4 WT 및 변이체 플라스미드(WT, p.R331Q 및 p.A271_D272del)를 형질주입시키고, 24시간동안 37℃, 5% CO2에서 배양했다. 세포 표면 단백질 (세포 표면에서 KCNQ4 WT 또는 변이체 단백질이 발현)은 PIERCETM 세포 표면 단백질 분리 키트(Thermo Scientific)로 분리하고, Myc-tag (Abcam) 기반 ELISA 키트 (Thermo Scientific)를 사용하여 분석했다.
실시예 9: 통계적 분석
데이터는 Origin 소프트웨어 (버전 6.1, OriginLab)로 플로팅되었으며 평균±평균 표준 오차 (SEM)로 표시되었으며 n은 샘플 번호를 나타낸다. 통계적 유의성은 짝을 이루거나 짝이 없는 스튜던트 티-검정(Student's t-test) 또는 ANOVA 검정에 의해 결정되었으며 P<0.05의 차이는 유의한 것으로 간주되었다.
실험예 1: 4종류의 KCNQ4 변이체의 임상적 표현형 분석
KCNQ4 변이 종류로 구분할 수 있는 4개의 상염색체 우성 비증후군성 난청 2(DFNA2)를 갖는 가족군에서 다양한 청각학적 특징이 관찰되었다. 대체로 청력학적 특징은 다음의 세 가지 유형으로 분류되었다: 고음역대 청력 손실 (SB228 및 SB155), 중음역대 청력 손실 (SB356) 및 저음역대 청력 손실 (SB62) (도 1A). SB228, SB356 및 SB62의 감각신경성 난청(Sensorineural hearing loss, SNHL)은 상염색체 우성인 반면 SB155에서는 산발적이었다. SB228 가족군에서 SNHL의 발병 연령과 계보발단자 SB228-442의 확인 연령은 각각 20대 초반과 33세였다. 계보발단자의 형제 자매와 아버지를 포함하는 SB228 가족군에서 영향을 받은 사람들은 20대 후반에 고음역대 청력이 발달되었으며, 현재에는 진행성 청력 저하로 인해 보청기를 사용하고 있다. SB155 가족군에서 계보발단자인 SB155-272는 처음에 11세에 하향 경사 형태로 최소의 점진적 대칭 고음역대 청력 손실을 보여주었다. SB228의 경우와는 달리, SB155에서는 두 부모 모두 모든 주파수에서 정상적인 청력 임계값을 가졌다. SB356 가족군에서, 계보발단자인 SB356-697 (확인 당시 33세)은 중등도-중증 정도의 청력 손실을 나타내며, 주로 중음역대 청력 손실 (양쪽 귀에서 1kHz에서 최대 60dB HL의 대칭 노치)을 나타내는, 쿠키 바이트 형태를 나타낸다. 영향을 받은 개인의 경우, 1년 이상의 추적 기간 동안 청력 임계값에 변화가 없었다. 계보발단자의 아버지의 청력 상태는 좋지 않았다고 확인되었으나, 문서화되지 않았다. SB62 가족군에서, 계보발단자 SB62-118 (확인 당시 58세)은 약 40dB HL의 대칭적인 저음역대 및 중음역대 청력 손실을 나타냈다. 상기 가계는 청력 상실에서 상염색체 우성 유전을 나타낸다. 10년의 추적 기간 동안, SB62-118은 모든 주파수에서 양측 청력이 확연히 점진적으로 저하되었으며, 어음명료도(speech discrimination scores) 또한 감소했다. 계보발단자의 청력도는 결국 양쪽 귀에서 모든 주파수에서 65dB HL의 청력 임계값을 나타냈다. 계보발단자의 어머니는 60세부터 양쪽 귀의 청력 상실을 경험했다.
4개 가족군에서 영향을 받은 사람은 온도눈떨림검사(Caloric tests) 또는 비디오두부충동검사(video head impulse tests)에서 안진증(nystagmus) 또는 균형 장애의 징후를 보이지 않았다. 영향을 받은 사람들에서 방사선학 평가에서 달팽이관 전정 기형은 발견되지 않았다.
실험예 2: KCNQ4 유전자의 신규한 변이체 동정
상기 실시예 1에서 확인한 4개의 가족군에서, KCNQ4에서 비증후군성 난청 의 잠재적 원인이 되는 4가지 변이에 대해 확인하였다. 이 중 3종의 변이인 c.811_816del:p.Ala271_Asp272del (A271_D272del, SB155 가족군), c.G956>A:p.G319D (G319D, SB356 가족군), 및 c.G992>A:p.R331Q (R331Q, SB62 가족군)은 신규한 변이인 것으로 확인되었으며 (도 1B), 나머지 1종(SB228 가족군)은 이전에 보고된 프레임 내 삭제 변이(c.806_808del : p.Ser269del (p.S269del))를 나타냈다. 구체적으로, SB155에서 생물학적 부모 중 누구도 표현형에 영향을 받지 않았고, A271_D272del을 보유하지 않았으며, 이는 A271_D272del 변이가 SB155 가족군의 원인이 되는 변이로서 새로이 발생했음을 나타낸다. 삼중 ES 데이터에서 일배체형 위상 분석에 의해 확인된 SB155의 생물학적 부모는 표현형에 영향을 받지 않았으며 변이체의 운반자도 아니었다. KCNQ4의 신규한 프레임 내 결실 변이체 A271_D272del은 기공 루프 도메인(pore loop domain) 에 위치하며(도 2), 여기서 청력 손실과 관련된 알려진 KCNQ4 변이의 대부분이 클러스터로 발견되었다. 구체적으로 6개의 핵산 (GCCGAC)이 결실되면 알라닌과 아스파라긴산이 결손되었다. 상기 결손은 한국인 참조 유전체 데이터베이스 (KRGDB, 1722 개체)뿐만 아니라 ExAC 및 gnomAD을 포함하는 글로벌 MAF에도 존재하지 않았다. 상기 잔기는 KCNQ4 오솔로그(orthologs) 및 파라로그(paralogs) (http://genome.ucsc.edu/) 사이에서 매우 보존되었으며(도 1C), 높은 GERP++ 점수 5.08를 나타냈다. 상기 변이는 CADD를 포함한 컴퓨터시뮬레이션(in silico 분석을 통해 '질병을 유발(disease-causing)'할 수 있는 것으로 일관되게 예측되었다. A271_D272del의 신규한 발생의 확인은 난청과 관련하여 PS2에 대한 적절한 증거를 나타낸다. 또한, 양성 변이없이 잘 연구된 기능 도메인에 의해 입증된 바와 같이, 변이 A271_D272del이 KCNQ4 기공 형성 영역에 존재했기 때문에 PM1이 적용될 수 있다. 따라서, 변이 A271_D272del은 PS2_moderate, PM1, PM2 및 PS3_supporting을 포함하여 변이를 분류하는 데 사용되는 ACMG/AMP 가이드라인에 따라 "병원성 가능성이 높은(likely pathogenic)"것으로 분류될 수 있다.
또 다른 신규한 미스센스 변이인 G319D는 막 횡단 S6 세그먼트 (도 2)의 말단부에 있으며, KCNQ4 오솔로그 및 파라로그 (http://genome. ucsc.edu/) 사이에서 매우 보존되었으며 (도 1C), 5.27의 높은 GERP++ 점수로 뒷받침된다. 상기 변이는 공개된 데이터베이스에서 발견되지 않았다. 상기 변이는 CADD 및 REVEL 을 포함하는 인실리코 분석에 의해 '질병을 유발(disease-causing)'할 수 있는 것으로 일관되게 예측되었다. 따라서 G319D 변이는 ACMG/AMP 가이드라인을 기반으로 "불확실한 유의성 변수 (variant of uncertain significance, VUS)"로 분류될 수 있다.
마지막으로 신규한 미스센스 변이인 R331Q는 근위 세포질 C-말단(proximal cytoplasmic C-terminus)에서 보고된 첫 번째 변이이다 (도 2). 상기 잔기는 KCNQ4 오솔로그 및 파라로그 사이에서 매우 보존되었으며 (도 1C), 5.44의 높은 GERP++ 점수로 뒷받침된다. 상기 변이는 매우 낮은 MAF를 보이며, PM2 기준을 충족한다. 상기 변이는 SIFT (Sorting Intolerant from Tolerant) 및 PolyPhen-2를 통해 각각 "손상(damaging)" 또는 "손상 가능성(probable damaging)"으로 지속적으로 예측되었다. CADD와 REVEL은 각각 33점과 0.768점으로 더 높은 점수를 보이며, '질병 유발(disease-causing)' 병원성을 나타낸다. 또한, 상기 변이 단백질은 야생형(WT) 단백질에 비해 거의 완전히 폐기된 전압-활성화된 칼륨 전류를 나타내어 PS3의 증거를 뒷받침한다. REVEL 점수 0.8이 높기 때문에, PP3도 적용될 수 있다. 총괄하면 변이 R331Q는 "VUS"로 분류되었다 (표 1).
상기 분석 결과는 하기의 표 1에 정리하여 기재하였다.
가족군 SB228-442 SB155-271 SB356-697 SB62-110
게놈 위치
(GRCh37/hg19) 		Chr1:41285116-41285118 Chr1:41285121-41285126 Chr1:41285847 Chr1:41285883
HGVS 뉴클레오티드
변이 		c.806_808del c.811_816del c.956G>A c.992G>A
아미노산
변이 		p.Ser269del(p.S269del) p.Ala271_Asp272del(p.A271_D272del) p.Gly319Asp(p.G319D) p.Arg331Gln(p.R331Q)
접합성
(Zygosity) 		이형접합체
(heterozygote)		 이형접합체 이형접합체 이형접합체
유전(Inheritance) 우성
(Dominant)		 데노버*
(De novo)		 우성 우성
인-실리코 예측 CADD 19.1 22.7 29.7 33
REVEL NA NA 0.938 0.919
GERP 5.08 5.08 5.27 5.44
민족성 MAF
- KRGDB (1722 개체) 		부재 부재 부재 부재
글로벌 MAF ExAC 부재 부재 부재 부재
gnomAD 부재 부재 부재 0.000004102/1
ACMG/AMP 2018 가이드라인 기준
(Criteria 		PM1, PM2, PM4 PS3_supporting PS2_moderate, PM1, PM2, PM4, PS3_supporting PM2, PP3, PS3_supporting PM2 PP3, PS3_supporting
분류
(Classification) 		Likely pathogenic Likely pathogenic VUS VUS
- 약어: MAF, Minor allele frequency; Het, heterozygote; VUS, variant uncertain significance; NA, not available
- Refseq transcript accession number NM_001174069.1;
- Refseq protein accession number NP_001167540
- HGVS: Human Genome Variation Society (https://www.hgvs.org/)
- Sequence Variant Nomenclature (http://varnomen.hgvs.org/)
- CADD: Combined Annotation Dependent Depletion
(https://cadd.gs.washington.edu/)
- REVEL: Rare Exome Variant Ensemble Learner
(https://sites.google.com/site/revelgenomics/)
- KRGDB: Korean Reference Genome Database
(http://coda.nih.go.kr/coda/KRGDB/index.jsp)
- ExAC: Exome Aggregation Consortium databases
- gnomAD: The Genome Aggregation Database
(https://gnomad.broadinstitute.org/)
- ACMG/AMP 2018 guideline (http://wintervar.wglab.org/)
* SB155의 생물학적 부모는 트리오 엑솜 시퀀싱 데이터로부터 일배체형 위상 분석에 의해 확인된 바와 같이, 표현형 영향을 받지않았고 변이체의 운반자도 아니었음.
실험예 3: 신규한 변이체의 KCNQ4 채널 기능에 대한 영향 분석
KCNQ4 변이체의 전압-게이트 채널 활성에 대한 영향을 확인하기 위해, 패치 클램프 기록을 통해 KCNQ4 야생형(WT) 및 변이체 단백질로 일시적으로 형질주입된 HEK 293T 세포의 전체 세포 전류를 확인했다. 빈 pRK5 벡터 및 GFP로 형질주입된 HEK 293T 세포에 대한 전체 세포 전류를 음성 대조군으로 사용했다. 또한, DFNA2를 유발하는 것으로 알려진 S269del KCNQ4 변이체로 형질주입된 세포를 null 기능 대조군으로 사용하였다.
WT 단백질의 KCNQ4-매개 칼륨 전류는 전압-의존성의 느린 활성화 및 외부 정류를 갖는 전형적인 KCNQ4 채널 전류를 나타냈다 (도 3A 및 B). WT 단백질을 발현하는 세포는 +40mV (n=12)에서 121.8 ± 25.4pA/pF의 피크 전류 밀도를 갖는 전압 의존적 칼륨 전류를 나타냈다. 대조적으로, KCNQ4 변이체 단백질을 발현하는 세포(p.A271_D272del, p.R331Q 및 p.G319D)에 의해 생성된 외부 칼륨 전류는 거의 감지할 수 없었으며, 이는 null 기능 대조군 및 음성 대조군과 유사했다 (도 3B). 따라서, 본 발명에서 새롭게 확인된 KCNQ4 변이체는 모두 상동 발현(homologous expression) 조건에서는 기능이 완전히 손실되는 것을 알 수 있다.
다음으로, 상기 변이체 단백질에서 손실된 채널 활성이 기존에 알려진 KCNQ 채널 오프너인 레티가빈(retigabine, Ret, 10 μM), 아연 피리티온(zinc pyrithione, ZnPy, 10 μM), 또는 이들의 조합 (Ret/ZnPy)에 의해 회복되는지 확인하였다. 채널 오프너들의 조합 (Ret/ZnPy)의 경우 WT 단백질의 KCNQ4 매개 칼륨 전류를 2배 이상 높였다 (도 3C 및 D). 그러나, 신규한 KCNQ4 변이체 (p.A271_D272del, p.R331Q 및 p.G319D)를 포함하는 동종사량체 채널은 채널 오프너를 사용해도 칼륨 전류가 거의 나타나지 않았으며, 전류는 null 기능 대조군 및 음성 대조군의 전류와 비슷했다. 따라서, 본 발명에서 새롭게 확인된 KCNQ4 변이체는 모두 상동 발현 조건에서는 KCNQ 채널 오프너를 처리하여도 채널 기능이 회복되지 않음을 알 수 있다.
실험예 4: 신규한 KCNQ4 변이체의 우성-음성적 효과(Dominant negative effects) 확인
본 발명의 신규한 KCNQ4 변이체의 발병 기전을 확인하기 위해, 이종체(heteromeric) 시스템에서 다양한 몰 비율 (야생형/변이 비율을 4:0부터 0:4까지)로 WT 및 각 변이체 cDNA를 공동 발현하는 HEK 293T 세포에서 칼륨 전류를 측정했다.
그 결과, 생성된 KCNQ4-매개 칼륨 전류는 WT 단백질에 대한 변이 단백질의 명확한 우성-음성 효과없이 변이 cDNA의 농도 (도 4A 및 B)와 반비례하는 것으로 확인되었다: KCNQ4WT:벡터 (2:2)의 피크 전류 밀도: +40 mV에서 131.7 ± 21.1 pA/pF, n=11; WT:p.A271_D272del (2:2)의 피크 전류 밀도: +40 mV에서 69.8 ± 19.9 pA/pF, n=7; WT: p.G319D (2:2)의 피크 전류 밀도: +40 mV에서 152.7 ± 45.7 pA/pF, n=11; WT: p.R331Q (2:2)의 피크 전류 밀도: + 40mV에서 55.1 ± 17.8pA/pF, n=6.
null 기능 대조군 (p. S269del pore 변이체)을 제외하고, 신규한 KCNQ4 변이체 채널의 경우 WT 및 우성-음성 서브 유닛을 포함하는 공동-조립 사량체 에 대한 예측된 채널 기능 억제 비율을 벗어났다. 예를 들어, WT:p.G319D-매개 전류는 예측에서 크게 벗어나 3:1 또는 2:2 cDNA 비율에서 WT 채널보다 큰 전류를 나타냈다. 또한 동일한 그룹 내 전류 진폭의 분산 및 특이값으로 인해 확실한 결론을 내릴 수 없었다 (도 4C). 상기 결과를 종합해보면, 신규한 KCNQ4 변이체와 WT가 공동-발현된 채널의 경우 일반적인 우성-음성적 효과를 반드시 보여주지는 않는다는 것을 알 수 있다.
실험예 5: KCNQ4 변이체 텐덤 콘카테머 제작 및 이의 우성-음성적 효과 확인
상기 실시예 4에서 확인한, KCNQ4 WT와 변이체를 포함하는 이종체 채널의 우성-음성적 효과를 보다 명확히 확인하기 위해, 변이체와 WT가 2:2의 비율로 포함되도록(즉, 균일한 이종사량체화로 구성되도록) KCNQ4 WT와 변이체가 연결된 텐덤 콘카테머(tandem concatemer)를 제작하였다(도 5A). 상기 콘카테머는 WT이 N-말단, 변이체가 C-말단에 위치하도록 제작되었다.
상기에서 제작한 KCNQ4 콘카테머 채널을 이용하여 우성-음성적 효과를 확인한 결과, WT-p.A271_D272del 콘카테머 채널은 null 기능성 대조군 (WT-p.S269del 콘카테머) 및 음성 GFP 대조군에 의해 생성된 것과 유사하게 칼륨 전류를 거의 감지할 수 없었으며, 이는 비-전도성 KCNQ4 변이 채널을 나타낸다 (도 5B). WT-p.R331Q 콘카테머의 KCNQ4-매개 칼륨 전류는 동종체 p.R331Q의 전류보다 약간 더 컸으나, 통계적 유의성은 나타나지 않았고 진폭은 WT-WT 콘카테머의 값보다 훨씬 낮았다 (도 5B 및 C). 한편, WT-p.R331Q 콘카테머를 발현하는 일부 세포는 WT-p.S269del 콘카테머 및 음성 GFP 발현 세포보다 더 큰 전류를 보였는데, 이는 막 인지질 수준의 개별 세포 간 가변성에 의해 설명될 수 있다.
상기 결과를 종합해보면, 신규한 기공 영역 변이체인 p.A271_D272del이 WT 채널에 우세한 음성 효과를 발휘하는 반면, p.R331Q는 제한된 조건에서 WT 단백질과 조립될 때 기능의 일부를 복원할 수 있는 변이체임을 알 수 있다. 세포 표면 발현 분석은 상기 두 가지 KCNQ4 변이체 단백질이 원형질막에 성공적으로 도달했으며, 이들의 발현 수준은 이들 변이체의 발병성으로 인한 결함 있는 원형질막 트래피킹을 제외하고, WT 단백질과 비슷하다는 것을 보여주었다(도 6).
실험예 6: WT-p.G319D 콘카테머 채널의 칼륨 채널 활성화 분석
상기 실시예 4에서 확인한 바와 같이, WT 및 p.R331D 변이체 cDNA가 공동-형질주입된 경우, 이종체 p.G319D 채널의 칼륨 전류는 동종체 WT 채널보다 더 높았다. 따라서, 신규한 KCNQ4 변이체인 p.R331D의 우성-음성적 효과를 확인하기 위해, WT-p.G319D 콘카테머 채널의 기능을 분석하였다.
그 결과, WT-p.G319D 콘카테머는 WT-WT 콘카테머(95.2±10.4 pA/pF)와 비교하여 KCNQ4-매개 전류의 평균값 (+40mV에서 174.9±51.5 pA/pF, P <0.05)에서 통계적으로 유의한 차이를 나타냈다. (도 5C).
다음으로, WT-WT, WT-p.G331Q 및 WT-p.G319D 콘카테머 채널에 대한 채널 기능성을 분석한 결과, WT-p.G319D 콘카테머의 전체 칼륨 전류(+40mV에서 198.7±15.0 pA/pF)는 WT-WT 콘카테머의 약 2배였다(110.2±7.8 pA/pF)(도 7A 및 D). WT-p.G319D 콘카테머는 전류-전압 (I-V) 관계에서 현저한 이동과 음전위에 대한 활성화의 전압 의존성을 보여주었다 (도 7B). WT-p.G319D 콘카테머의 계산된 반-활성화 전압(V0.5)은 -38.2±0.6mV이고, WT-WT 콘카테머의 V0.5는 -21.1±1.0Mv였다 (도 7C 및 E). 상기 결과를 토대로, p.G319D는 다른 신규한 변이체와 달리 WT 채널에 우세-음성 억제 효과를 나타내지 않는다는 것을 알 수 있으며, 오히려 KCNQ4 야생형 서브유닛과 이종사량화될 때 기능 획득 변이(gain-of-function)를 갖는 활성 DFNA2 변이체로 판단된다.
실험예 7: KCNQ4 변이체 채널의 PIP5 및 KCNQ 오프너 처리에 따른 기능 획복 확인
KCNQ4 변이체 채널의 기능 이상을 회복할 수 있는 지 확인하기 위해, KCNQ 채널을 활성화시키는 것으로 알려진 PIP5K 및 KCNQ 오프너를 WT-WT, WT-p.G331Q 및 WT-p.G319D 콘카테머 채널에 처리한 후, 채널 기능 회복여부를 확인하였다.
그 결과, PIP5K를 발현하여 PIP2 농도를 높이면, WT 및 WT-WT 채널 전류는 2배 이상 향상되었으며 V0.5 값이 약 -10mV만큼 음전하 쪽으로 이동하였다 (도 7). PIP5K 발현과 함께, KCNQ 채널 오프너(Ret 10 μM, ZnPy 10 μM 및 ML213 3 μM)를 처리한 경우 채널 전류를 더욱 향상 시켰지만, 조합 처리에 따른 보다 강화된 향상 효과는 관찰되지 않았다 (도 8). 상기 결과는 KCNQ4 WT 동종체 채널 및 KCNQ4 WT-WT 콘카테머 채널이 PIP2에 대한 민감성을 유지하면서 KCNQ 오프너에 반응함을 나타낸다.
이와는 대조적으로, 두 개의 기공 영역 변이체 (p.S269del 및 p.A271_D272del)는 콘카테머 형태 (WT-p.S269del 및 WT-p.A271_D272del)에서 PIP5K, KCNQ 채널 오프너 또는 둘의 조합으로 처리한 경우에도 채널 기능이 회복되지 않았다 (도 7 및 도 8).
다음으로, p.R331Q 변이의 경우 동종체 p.R331Q 변이 채널의 손상된 전도도는 PIP5K, KCNQ 채널 오프너 또는 둘 모두의 조합을 처리한 경우에도 회복되지 않았으나, 대조적으로 이종체 WT-p.R331Q 콘카테머 채널은 PIP5K, KCNQ 채널 오프너 또는 둘 모두의 조합을 처리한 경우 채널 기능이 회복되었으며, 이는 V0.5 값이 음전하 쪽으로 이동한 것으로 알 수 있다 (도 7 및 도 8). 구체적으로, PIP5K 발현만으로는 WT-p.R331Q 콘카테머의 전도도가 회복되었으며, 이는 정상적인 동종체 WT 또는 WT-WT 콘카테머 채널의 전류와 유사한 결과를 보여준다(도 7B 내지 E). 또한, PIP5K 발현이 없더라도 3종의 KNCQ 오프너 (Ret 10μM, ZnPy 10μM 및 ML213 3μM)는 WT-p.R331Q 콘카테머의 전도도를 정상 WT 전류의 최대 70%까지 크게 증가시켰다 (도 8A 내지 B). PIP5K가 발현되는 경우, KCNQ 오프너에 의한 WT-p.R331Q 콘카테머의 활성화가 두드러졌으며, 전류는 PIP5K가 없을때 측정된 정상적인 WT 또는 WT-WT 전류 수준에 도달했다 (도 8B-C). 상기 결과를 종합해보면, 병원성 이종체 WT-p.R331Q 채널은 증가된 PIP2 농도, KCNQ 오프너의 약물 또는 둘 다에 의해 기능이 회복될 수 있음을 알 수 있다.
다음으로, p.R319D 변이의 경우, 비-전도성 동종체 p.G319D 변이체 채널은 PIP5K 또는 KCNQ 오프너 또는 둘의 조합에 의해 채널 기능이 회복되지 않았다. 반면, 과활성화된 WT-p.G319D 콘카테머 채널은 PIP5K 또는 KCNQ 오프너 또는 둘 다에 반응했으며, WT-WT 및 WT-p.R331Q 콘카테머와 같이, PIP5K 또는 KCNQ 오프너에 의한 WT-p.G319D 콘카테머의 전류의 증가는 V0.5의 음전하 쪽으로의 이동 정도에 비례했으며, 이는 PIP2 활성화가 전압-의존성 채널 게이팅의 촉진에 의해 매개되었음을 의미한다 (도 7 및 도 8).
과활성화된 WT-pG319D 채널을 정상화하는 것은 채널 활성을 정상 WT 수준으로 감소시키는 것을 의미한다. 상기와 같은 정상화가 가능한지 확인하기 위해, WT-p.G319D 콘카테머 채널에 KCNQ 억제제 및 PIP2 킬레이트제를 처리하여 전류 감소 효과를 확인하였다. 기존에 알려진 KCNQ 억제제인 리노피르딘을 처리한 경우 양전위쪽으로 V0.5 값이 이동하는 것을 확인하였는 바, KCNQ 억제제를 처리하여 과활성화된 WT-p.G319D- 매개 전류를 감소시킬 수 있음을 알 수 있다 (도 9A). PIP5K 발현 조건의 유무에 관계없이, 세포 내 적용된 PIP2 킬레이트제인 PLL (polycation poly-L-lysine, 10 또는 30 μg/ml)에 의한 WT-G319D 채널에서의 PIP2 활성화의 간섭은 V0.5값을 양전위쪽으로 이동시켰는 바, 전류를 감소시키는 것을 알 수 있다 (도 9B-C). 그러나, PIP2만 제거한 경우에는 채널 증가된 활성을 WT 수준으로 완전히 회복시키지 못했다. PLL-처리된 세포는 WT 콘카테머 채널보다 40% 더 높은 칼륨 전류를 보였으며, V0.5는 WT-WT와 비교했을 때 -10mV 음전하쪽에 위치했다. 결과적으로, KCNQ 억제제는 채널 전류를 줄이는 데 더 효과적이었고 PIP2 킬레이트제는 채널 활성화의 전압 의존성을 표준화하는 데 더 효과적이었다. 따라서, 상기 결과를 토대로 이종체 WT-p.G319D의 과활성화된 채널 전도도는 KCNQ 억제제 (리노피르딘), PIP2 활성화 억제 또는 이들의 조합을 통해 하향-조절될 수 있음을 알 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY HOSPITAL <120> Novel KCNQ4 protein variant and use thereof <130> PN137403KR <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 695 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KCNQ4_AA <400> 1 Met Ala Glu Ala Pro Pro Arg Arg Leu Gly Leu Gly Pro Pro Pro Gly 1 5 10 15 Asp Ala Pro Arg Ala Glu Leu Val Ala Leu Thr Ala Val Gln Ser Glu 20 25 30 Gln Gly Glu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Pro Arg Arg Leu Gly Leu Leu 35 40 45 Gly Ser Pro Leu Pro Pro Gly Ala Pro Leu Pro Gly Pro Gly Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Ala Cys Gly Gln Arg Ser Ser Ala Ala His Lys Arg Tyr 65 70 75 80 Arg Arg Leu Gln Asn Trp Val Tyr Asn Val Leu Glu Arg Pro Arg Gly 85 90 95 Trp Ala Phe Val Tyr His Val Phe Ile Phe Leu Leu Val Phe Ser Cys 100 105 110 Leu Val Leu Ser Val Leu Ser Thr Ile Gln Glu His Gln Glu Leu Ala 115 120 125 Asn Glu Cys Leu Leu Ile Leu Glu Phe Val Met Ile Val Val Phe Gly 130 135 140 Leu Glu Tyr Ile Val Arg Val Trp Ser Ala Gly Cys Cys Cys Arg Tyr 145 150 155 160 Arg Gly Trp Gln Gly Arg Phe Arg Phe Ala Arg Lys Pro Phe Cys Val 165 170 175 Ile Asp Phe Ile Val Phe Val Ala Ser Val Ala Val Ile Ala Ala Gly 180 185 190 Thr Gln Gly Asn Ile Phe Ala Thr Ser Ala Leu Arg Ser Met Arg Phe 195 200 205 Leu Gln Ile Leu Arg Met Val Arg Met Asp Arg Arg Gly Gly Thr Trp 210 215 220 Lys Leu Leu Gly Ser Val Val Tyr Ala His Ser Lys Glu Leu Ile Thr 225 230 235 240 Ala Trp Tyr Ile Gly Phe Leu Val Leu Ile Phe Ala Ser Phe Leu Val 245 250 255 Tyr Leu Ala Glu Lys Asp Ala Asn Ser Asp Phe Ser Ser Tyr Ala Asp 260 265 270 Ser Leu Trp Trp Gly Thr Ile Thr Leu Thr Thr Ile Gly Tyr Gly Asp 275 280 285 Lys Thr Pro His Thr Trp Leu Gly Arg Val Leu Ala Ala Gly Phe Ala 290 295 300 Leu Leu Gly Ile Ser Phe Phe Ala Leu Pro Ala Gly Ile Leu Gly Ser 305 310 315 320 Gly Phe Ala Leu Lys Val Gln Glu Gln His Arg Gln Lys His Phe Glu 325 330 335 Lys Arg Arg Met Pro Ala Ala Asn Leu Ile Gln Ala Ala Trp Arg Leu 340 345 350 Tyr Ser Thr Asp Met Ser Arg Ala Tyr Leu Thr Ala Thr Trp Tyr Tyr 355 360 365 Tyr Asp Ser Ile Leu Pro Ser Phe Arg Glu Leu Ala Leu Leu Phe Glu 370 375 380 His Val Gln Arg Ala Arg Asn Gly Gly Leu Arg Pro Leu Glu Val Arg 385 390 395 400 Arg Ala Pro Val Pro Asp Gly Ala Pro Ser Arg Tyr Pro Pro Val Ala 405 410 415 Thr Cys His Arg Pro Gly Ser Thr Ser Phe Cys Pro Gly Glu Ser Ser 420 425 430 Arg Met Gly Ile Lys Asp Arg Ile Arg Met Gly Ser Ser Gln Arg Arg 435 440 445 Thr Gly Pro Ser Lys Gln His Leu Ala Pro Pro Thr Met Pro Thr Ser 450 455 460 Pro Ser Ser Glu Gln Val Gly Glu Ala Thr Ser Pro Thr Lys Val Gln 465 470 475 480 Lys Ser Trp Ser Phe Asn Asp Arg Thr Arg Phe Arg Ala Ser Leu Arg 485 490 495 Leu Lys Pro Arg Thr Ser Ala Glu Asp Ala Pro Ser Glu Glu Val Ala 500 505 510 Glu Glu Lys Ser Tyr Gln Cys Glu Leu Thr Val Asp Asp Ile Met Pro 515 520 525 Ala Val Lys Thr Val Ile Arg Ser Ile Arg Ile Leu Lys Phe Leu Val 530 535 540 Ala Lys Arg Lys Phe Lys Glu Thr Leu Arg Pro Tyr Asp Val Lys Asp 545 550 555 560 Val Ile Glu Gln Tyr Ser Ala Gly His Leu Asp Met Leu Gly Arg Ile 565 570 575 Lys Ser Leu Gln Thr Arg Val Asp 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gctggtcttc agctgcctgg tgctgtctgt gctgtccact 360 atccaggagc accaggaact tgccaacgag tgtctcctca tcttggaatt cgtgatgatc 420 gtggttttcg gcttggagta catcgtccgg gtctggtccg ccggatgctg ctgccgctac 480 cgaggatggc agggtcgctt ccgctttgcc agaaagccct tctgtgtcat cgacttcatc 540 gtgttcgtgg cctcggtggc cgtcatcgcc gcgggtaccc agggcaacat cttcgccacg 600 tccgcgctgc gcagcatgcg cttcctgcag atcctgcgca tggtgcgcat ggaccgccgc 660 ggcggcacct ggaagctgct gggctcagtg gtctacgcgc atagcaagga gctgatcacc 720 gcctggtaca tcgggttcct ggtgctcatc ttcgcctcct tcctggtcta cctggctgag 780 aaggacgcca actccgactt ctcctcctac gccgactcgc tctggtgggg gacgattaca 840 ttgacaacca tcggctatgg tgacaagaca ccgcacacat ggctgggcag ggtcctggct 900 gctggcttcg ccttactggg catctctttc tttgccctgc ctgccggcat cctaggctcc 960 ggctttgccc tgaaggtcca ggagcagcac cggcagaagc acttcgagaa gcggaggatg 1020 ccggcagcca acctcatcca ggctgcctgg cgcctgtact ccaccgatat gagccgggcc 1080 tacctgacag ccacctggta ctactatgac agtatcctcc catccttcag agagctggcc 1140 ctcttgtttg agcacgtgca acgggcccgc 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cctgtggacc acgaggacat ctccgtctcc 2040 gcacagacgc tcagcatctc ccgctcggtc agcaccaaca tggactga 2088 <210> 3 <211> 693 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KCNQ4_A271_D272del_AA <400> 3 Met Ala Glu Ala Pro Pro Arg Arg Leu Gly Leu Gly Pro Pro Pro Gly 1 5 10 15 Asp Ala Pro Arg Ala Glu Leu Val Ala Leu Thr Ala Val Gln Ser Glu 20 25 30 Gln Gly Glu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Pro Arg Arg Leu Gly Leu Leu 35 40 45 Gly Ser Pro Leu Pro Pro Gly Ala Pro Leu Pro Gly Pro Gly Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Ala Cys Gly Gln Arg Ser Ser Ala Ala His Lys Arg Tyr 65 70 75 80 Arg Arg Leu Gln Asn Trp Val Tyr Asn Val Leu Glu Arg Pro Arg Gly 85 90 95 Trp Ala Phe Val Tyr His Val Phe Ile Phe Leu Leu Val Phe Ser Cys 100 105 110 Leu Val Leu Ser Val Leu Ser Thr Ile Gln Glu His Gln Glu Leu Ala 115 120 125 Asn Glu Cys Leu Leu Ile Leu Glu Phe Val Met Ile Val Val Phe Gly 130 135 140 Leu Glu Tyr Ile Val Arg Val Trp Ser Ala Gly Cys Cys Cys Arg Tyr 145 150 155 160 Arg Gly Trp Gln Gly Arg Phe Arg Phe Ala Arg Lys Pro Phe Cys Val 165 170 175 Ile Asp Phe Ile Val Phe Val Ala Ser Val Ala Val Ile Ala Ala Gly 180 185 190 Thr Gln Gly Asn Ile Phe Ala Thr Ser Ala Leu Arg Ser Met Arg Phe 195 200 205 Leu Gln Ile Leu Arg Met Val Arg Met Asp Arg Arg Gly Gly Thr Trp 210 215 220 Lys Leu Leu Gly Ser Val Val Tyr Ala His Ser Lys Glu Leu Ile Thr 225 230 235 240 Ala Trp Tyr Ile Gly Phe Leu Val Leu Ile Phe Ala Ser Phe Leu Val 245 250 255 Tyr Leu Ala Glu Lys Asp Ala Asn Ser Asp Phe Ser Ser Tyr Ser Leu 260 265 270 Trp Trp Gly Thr Ile Thr Leu Thr Thr Ile Gly Tyr Gly Asp Lys Thr 275 280 285 Pro His Thr Trp Leu Gly Arg Val Leu Ala Ala Gly Phe Ala Leu Leu 290 295 300 Gly Ile Ser Phe Phe Ala Leu Pro Ala Gly Ile Leu Gly Ser Gly Phe 305 310 315 320 Ala Leu Lys Val Gln Glu Gln His Arg Gln Lys His Phe Glu Lys Arg 325 330 335 Arg Met Pro Ala Ala Asn Leu Ile Gln Ala Ala Trp Arg Leu Tyr Ser 340 345 350 Thr Asp Met Ser Arg Ala Tyr Leu Thr Ala Thr Trp Tyr Tyr Tyr Asp 355 360 365 Ser Ile Leu Pro Ser Phe Arg Glu Leu Ala Leu Leu Phe Glu His Val 370 375 380 Gln Arg Ala Arg Asn Gly Gly Leu Arg Pro Leu Glu Val Arg Arg Ala 385 390 395 400 Pro Val Pro Asp Gly Ala Pro Ser Arg Tyr Pro Pro Val Ala Thr Cys 405 410 415 His Arg Pro Gly Ser Thr Ser Phe Cys Pro Gly Glu Ser Ser Arg Met 420 425 430 Gly Ile Lys Asp Arg Ile Arg Met Gly Ser Ser Gln Arg Arg Thr Gly 435 440 445 Pro Ser Lys Gln His Leu Ala Pro Pro Thr Met Pro Thr Ser Pro Ser 450 455 460 Ser Glu Gln Val Gly Glu Ala Thr Ser Pro Thr Lys Val Gln Lys Ser 465 470 475 480 Trp Ser Phe Asn Asp Arg Thr Arg Phe Arg Ala Ser Leu Arg Leu Lys 485 490 495 Pro Arg Thr Ser Ala Glu Asp Ala Pro Ser Glu Glu Val Ala Glu Glu 500 505 510 Lys Ser Tyr Gln Cys Glu Leu Thr Val Asp Asp Ile Met Pro Ala Val 515 520 525 Lys Thr Val Ile Arg Ser Ile Arg Ile Leu Lys Phe Leu Val Ala Lys 530 535 540 Arg Lys Phe Lys Glu Thr Leu Arg Pro Tyr Asp Val Lys Asp Val Ile 545 550 555 560 Glu Gln Tyr Ser Ala Gly His Leu Asp Met Leu Gly Arg Ile Lys Ser 565 570 575 Leu Gln Thr Arg Val Asp Gln Ile Val Gly Arg Gly Pro Gly Asp Arg 580 585 590 Lys Ala Arg Glu Lys Gly Asp Lys Gly Pro Ser Asp Ala Glu Val Val 595 600 605 Asp Glu Ile Ser Met Met Gly Arg Val Val Lys Val Glu Lys Gln Val 610 615 620 Gln Ser Ile Glu His Lys Leu Asp Leu Leu Leu Gly Phe Tyr Ser Arg 625 630 635 640 Cys Leu Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Gly Ala Val Gln Val Pro 645 650 655 Leu Phe Asp Pro Asp Ile Thr Ser Asp Tyr His Ser Pro Val Asp His 660 665 670 Glu Asp Ile Ser Val Ser Ala Gln Thr Leu Ser Ile Ser Arg Ser Val 675 680 685 Ser Thr Asn Met Asp 690 <210> 4 <211> 695 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KCNQ4_R331Q_AA <400> 4 Met Ala Glu Ala Pro Pro Arg Arg Leu Gly Leu Gly Pro Pro Pro Gly 1 5 10 15 Asp Ala Pro Arg Ala Glu Leu Val Ala Leu Thr Ala Val Gln Ser Glu 20 25 30 Gln Gly Glu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Pro Arg Arg Leu Gly Leu Leu 35 40 45 Gly Ser Pro Leu Pro Pro Gly Ala Pro Leu Pro Gly Pro Gly Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Ala Cys Gly Gln Arg Ser Ser Ala Ala His Lys Arg Tyr 65 70 75 80 Arg Arg Leu Gln Asn Trp Val Tyr Asn Val Leu Glu Arg Pro Arg Gly 85 90 95 Trp Ala Phe Val Tyr His Val Phe Ile Phe Leu Leu Val Phe Ser Cys 100 105 110 Leu Val Leu Ser Val Leu Ser Thr Ile Gln Glu His Gln Glu Leu Ala 115 120 125 Asn Glu Cys Leu Leu Ile Leu Glu Phe Val Met Ile Val Val Phe Gly 130 135 140 Leu Glu Tyr Ile Val Arg Val Trp Ser Ala Gly Cys Cys Cys Arg Tyr 145 150 155 160 Arg Gly Trp Gln Gly Arg Phe Arg Phe Ala Arg Lys Pro Phe Cys Val 165 170 175 Ile Asp Phe Ile Val Phe Val Ala Ser Val Ala Val Ile Ala Ala Gly 180 185 190 Thr Gln Gly Asn Ile Phe Ala Thr Ser Ala Leu Arg Ser Met Arg Phe 195 200 205 Leu Gln Ile Leu Arg Met Val Arg Met Asp Arg Arg Gly Gly Thr Trp 210 215 220 Lys Leu Leu Gly Ser Val Val Tyr Ala His Ser Lys Glu Leu Ile Thr 225 230 235 240 Ala Trp Tyr Ile Gly Phe Leu Val Leu Ile Phe Ala Ser Phe Leu Val 245 250 255 Tyr Leu Ala Glu Lys Asp Ala Asn Ser Asp Phe Ser Ser Tyr Ala Asp 260 265 270 Ser Leu Trp Trp Gly Thr Ile Thr Leu Thr Thr Ile Gly Tyr Gly Asp 275 280 285 Lys Thr Pro His Thr Trp Leu Gly Arg Val Leu Ala Ala Gly Phe Ala 290 295 300 Leu Leu Gly Ile Ser Phe Phe Ala Leu Pro Ala Gly Ile Leu Gly Ser 305 310 315 320 Gly Phe Ala Leu Lys Val Gln Glu Gln His Gln Gln Lys His Phe Glu 325 330 335 Lys Arg Arg Met Pro Ala Ala Asn Leu Ile Gln Ala Ala Trp Arg Leu 340 345 350 Tyr Ser Thr Asp Met Ser Arg Ala Tyr Leu Thr Ala Thr Trp Tyr Tyr 355 360 365 Tyr Asp Ser Ile Leu Pro Ser Phe Arg Glu Leu Ala Leu Leu Phe Glu 370 375 380 His Val Gln Arg Ala Arg Asn Gly Gly Leu Arg Pro Leu Glu Val Arg 385 390 395 400 Arg Ala Pro Val Pro Asp Gly Ala Pro Ser Arg Tyr Pro Pro Val Ala 405 410 415 Thr Cys His Arg Pro Gly Ser Thr Ser Phe Cys Pro Gly Glu Ser Ser 420 425 430 Arg Met Gly Ile Lys Asp Arg Ile Arg Met Gly Ser Ser Gln Arg Arg 435 440 445 Thr Gly Pro Ser Lys Gln His Leu Ala Pro Pro Thr Met Pro Thr Ser 450 455 460 Pro Ser Ser Glu Gln Val Gly Glu Ala Thr Ser Pro Thr Lys Val Gln 465 470 475 480 Lys Ser Trp Ser Phe Asn Asp Arg Thr Arg Phe Arg Ala Ser Leu Arg 485 490 495 Leu Lys Pro Arg Thr Ser Ala Glu Asp Ala Pro Ser Glu Glu Val Ala 500 505 510 Glu Glu Lys Ser Tyr Gln Cys Glu Leu Thr Val Asp Asp Ile Met Pro 515 520 525 Ala Val Lys Thr Val Ile Arg Ser Ile Arg Ile Leu Lys Phe Leu Val 530 535 540 Ala Lys Arg Lys Phe Lys Glu Thr Leu Arg Pro Tyr Asp Val Lys Asp 545 550 555 560 Val Ile Glu Gln Tyr Ser Ala Gly His Leu Asp Met Leu Gly Arg Ile 565 570 575 Lys Ser Leu Gln Thr Arg Val Asp Gln Ile Val Gly Arg Gly Pro Gly 580 585 590 Asp Arg Lys Ala Arg Glu Lys Gly Asp Lys Gly Pro Ser Asp Ala Glu 595 600 605 Val Val Asp Glu Ile Ser Met Met Gly Arg Val Val Lys Val Glu Lys 610 615 620 Gln Val Gln Ser Ile Glu His Lys Leu Asp Leu Leu Leu Gly Phe Tyr 625 630 635 640 Ser Arg Cys Leu Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Gly Ala Val Gln 645 650 655 Val Pro Leu Phe Asp Pro Asp Ile Thr Ser Asp Tyr His Ser Pro Val 660 665 670 Asp His Glu Asp Ile Ser Val Ser Ala Gln Thr Leu Ser Ile Ser Arg 675 680 685 Ser Val Ser Thr Asn Met Asp 690 695 <210> 5 <211> 695 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KCNQ4_G319D_AA <400> 5 Met Ala Glu Ala Pro Pro Arg Arg Leu Gly Leu Gly Pro Pro Pro Gly 1 5 10 15 Asp Ala Pro Arg Ala Glu Leu Val Ala Leu Thr Ala Val Gln Ser Glu 20 25 30 Gln Gly Glu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Pro Arg Arg Leu Gly Leu Leu 35 40 45 Gly Ser Pro Leu Pro Pro Gly Ala Pro Leu Pro Gly Pro Gly Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Ala Cys Gly Gln Arg Ser Ser Ala Ala His Lys Arg Tyr 65 70 75 80 Arg Arg Leu Gln Asn Trp Val Tyr Asn Val Leu Glu Arg Pro Arg Gly 85 90 95 Trp Ala Phe Val Tyr His Val Phe Ile Phe Leu Leu Val Phe Ser Cys 100 105 110 Leu Val Leu Ser Val Leu Ser Thr Ile Gln Glu His Gln Glu Leu Ala 115 120 125 Asn Glu Cys Leu Leu Ile Leu Glu Phe Val Met Ile Val Val Phe Gly 130 135 140 Leu Glu Tyr Ile Val Arg Val Trp Ser Ala Gly Cys Cys Cys Arg Tyr 145 150 155 160 Arg Gly Trp Gln Gly Arg Phe Arg Phe Ala Arg Lys Pro Phe Cys Val 165 170 175 Ile Asp Phe Ile Val Phe Val Ala Ser Val Ala Val Ile Ala Ala Gly 180 185 190 Thr Gln Gly Asn Ile Phe Ala Thr Ser Ala Leu Arg Ser Met Arg Phe 195 200 205 Leu Gln Ile Leu Arg Met Val Arg Met Asp Arg Arg Gly Gly Thr Trp 210 215 220 Lys Leu Leu Gly Ser Val Val Tyr Ala His Ser Lys Glu Leu Ile Thr 225 230 235 240 Ala Trp Tyr Ile Gly Phe Leu Val Leu Ile Phe Ala Ser Phe Leu Val 245 250 255 Tyr Leu Ala Glu Lys Asp Ala Asn Ser Asp Phe Ser Ser Tyr Ala Asp 260 265 270 Ser Leu Trp Trp Gly Thr Ile Thr Leu Thr Thr Ile Gly Tyr Gly Asp 275 280 285 Lys Thr Pro His Thr Trp Leu Gly Arg Val Leu Ala Ala Gly Phe Ala 290 295 300 Leu Leu Gly Ile Ser Phe Phe Ala Leu Pro Ala Gly Ile Leu Asp Ser 305 310 315 320 Gly Phe Ala Leu Lys Val Gln Glu Gln His Arg Gln Lys His Phe Glu 325 330 335 Lys Arg Arg Met Pro Ala Ala Asn Leu Ile Gln Ala Ala Trp Arg Leu 340 345 350 Tyr Ser Thr Asp Met Ser Arg Ala Tyr Leu Thr Ala Thr Trp Tyr Tyr 355 360 365 Tyr Asp Ser Ile Leu Pro Ser Phe Arg Glu Leu Ala Leu Leu Phe Glu 370 375 380 His Val Gln Arg Ala Arg Asn Gly Gly Leu Arg Pro Leu Glu Val Arg 385 390 395 400 Arg Ala Pro Val Pro Asp Gly Ala Pro Ser Arg Tyr Pro Pro Val Ala 405 410 415 Thr Cys His Arg Pro Gly Ser Thr Ser Phe Cys Pro Gly Glu Ser Ser 420 425 430 Arg Met Gly Ile Lys Asp Arg Ile Arg Met Gly Ser Ser Gln Arg Arg 435 440 445 Thr Gly Pro Ser Lys Gln His Leu Ala Pro Pro Thr Met Pro Thr Ser 450 455 460 Pro Ser Ser Glu Gln Val Gly Glu Ala Thr Ser Pro Thr Lys Val Gln 465 470 475 480 Lys Ser Trp Ser Phe Asn Asp Arg Thr Arg Phe Arg Ala Ser Leu Arg 485 490 495 Leu Lys Pro Arg Thr Ser Ala Glu Asp Ala Pro Ser Glu Glu Val Ala 500 505 510 Glu Glu Lys Ser Tyr Gln Cys Glu Leu Thr Val Asp Asp Ile Met Pro 515 520 525 Ala Val Lys Thr Val Ile Arg Ser Ile Arg Ile Leu Lys Phe Leu Val 530 535 540 Ala Lys Arg Lys Phe Lys Glu Thr Leu Arg Pro Tyr Asp Val Lys Asp 545 550 555 560 Val Ile Glu Gln Tyr Ser Ala Gly His Leu Asp Met Leu Gly Arg Ile 565 570 575 Lys Ser Leu Gln Thr Arg Val Asp Gln Ile Val Gly Arg Gly Pro Gly 580 585 590 Asp Arg Lys Ala Arg Glu Lys Gly Asp Lys Gly Pro Ser Asp Ala Glu 595 600 605 Val Val Asp Glu Ile Ser Met Met Gly Arg Val Val Lys Val Glu Lys 610 615 620 Gln Val Gln Ser Ile Glu His Lys Leu Asp Leu Leu Leu Gly Phe Tyr 625 630 635 640 Ser Arg Cys Leu Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Gly Ala Val Gln 645 650 655 Val Pro Leu Phe Asp Pro Asp Ile Thr Ser Asp Tyr His Ser Pro Val 660 665 670 Asp His Glu Asp Ile Ser Val Ser Ala Gln Thr Leu Ser Ile Ser Arg 675 680 685 Ser Val Ser Thr Asn Met Asp 690 695

Claims (19)

  1. KCNQ4(Voltage-Gated Potassium Channel Subunit Kv7.4) 단백질 변이체, 이의 단편 또는 상기 단백질 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 검출하기 위한 제제를 포함하는, 칼륨 채널병증(potassium channelopathy) 진단용 조성물로서,
    상기 KCNQ4 단백질 변이체는 a) 271번째 및 272번째 아미노산인 알라닌 및 아스파라긴산이 결실된 변이체(A271_D272del), b) 331번째 아미노산인 아르기닌이 글루타민으로 치환된 변이체(R331Q) 및 c) 319번째 아미노산인 글라이신이 아스파라긴산으로 치환된 변이체(G319D)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것인, 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 KCNQ4 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 KCNQ4 단백질 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 a) 811번째 내지 816번째 염기가 결실된 변이, b) 992번째 염기인 G가 A로 치환된 변이, 및 c) 956번째 염기인 G가 A로 치환된 변이로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것인, 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 KCNQ4 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것인, 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 KCNQ4 단백질 변이체, 이의 단편 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 발현 수준을 측정할 수 있는 것인, 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 칼륨 채널병증은 비증후군성 난청(non-syndromic deafness)을 포함하는 것인, 조성물.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 칼륨 채널병증 진단용 키트.
  8. 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 KCNQ4 단백질 변이체, 이의 단편 또는 상기 단백질 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 검출하거나 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 칼륨 채널병증의 진단 또는 치료를 위한 정보 제공 방법으로서,
    상기 KCNQ4 단백질 변이체는 a) 271번째 및 272번째 아미노산인 알라닌 및 아스파라긴산이 결실된 변이체, b) 331번째 아미노산인 아르기닌이 글루타민으로 치환된 변이체 및 c) 319번째 아미노산인 글라이신이 아스파라긴산으로 치환된 변이체로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것인, 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 방법은
    상기 분리된 생물학적 시료로부터 KCNQ4 단백질 변이체, 이의 단편 또는 상기 단백질 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 검출되거나 발현될 경우, 상기 개체를 칼륨 채널병증이 발병한 것으로 판별하거나 발병 위험을 높은 수준으로 예측하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 방법은
    상기 KCNQ4 단백질 변이체가 271번째 및 272번째 아미노산인 알라닌 및 아스파라긴산이 결실된 변이체 또는 331번째 아미노산인 아르기닌이 글루타민으로 치환된 변이체인 경우, 상기 칼륨 채널병증은 칼륨 채널 기능의 불활성화 또는 저활성화에 의한 것으로 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 방법은
    상기 KCNQ4 단백질 변이체가 319번째 아미노산인 글라이신이 아스파라긴산으로 치환된 변이체로서 이형접합(heterozygous) 변이체인 경우, 상기 칼륨 채널병증은 칼륨 채널 기능의 과활성화에 의한 것으로 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  12. 청구항 9에 있어서, 상기 방법은
    상기 KCNQ4 단백질 변이체가 331번째 아미노산인 아르기닌이 글루타민으로 치환된 변이체로서 이형접합 변이체인 경우, 상기 개체를 칼륨 채널 활성제를 이용한 치료 대상으로 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  13. 청구항 9에 있어서, 상기 방법은
    상기 KCNQ4 단백질 변이체가 319번째 아미노산인 글라이신이 아스파라긴산으로 치환된 변이체로서 이형접합 변이체인 경우, 상기 개체를 칼륨 채널 활성 억제제를 이용한 치료 대상으로 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  14. KCNQ4 야생형 단백질 및 319번째 아미노산인 글라이신이 아스파라긴산으로 치환된 KCNQ4 단백질 변이체를 발현하는 형질전환체를 포함하는, 칼륨 채널 활성 억제제 스크리닝용 조성물.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 KCNQ4 야생형 단백질 및 KCNQ4 단백질 변이체는 7:1 내지 1:2의 비율로 발현되는 것인, 조성물.
  16. 청구항 14에 있어서, 상기 KCNQ4 야생형 단백질 및 KCNQ4 단백질 변이체는 서로 연결된 형태인 것인, 조성물.
  17. 1) KCNQ4 야생형 단백질 및 319번째 아미노산인 글라이신이 아스파라긴산으로 치환된 KCNQ4 단백질 변이체를 발현하는 형질전환체에 칼륨 채널 활성 억제제 후보물질을 처리하는 단계; 및
    2) 상기 후보물질이 처리된 형질전환체의 칼륨 채널 활성화 정도를 측정하는 단계
    를 포함하는, 칼륨 채널 활성 억제제 스크리닝 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 방법은
    상기 후보물질에 의해 칼륨 채널의 활성화가 억제되는 경우 상기 후보물질을 칼륨 채널 활성 억제제로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  19. 청구항 17에 있어서, 상기 칼륨 채널 활성화 정도를 측정하는 단계는 패치 클램프(patch clamp)를 이용하는 것인, 방법.
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