KR20220146459A - 불활화 인플루엔자 백신의 제조 방법 및 그 백신 조성물 - Google Patents

Abstract

면역원성이 높은 불활화 인플루엔자 백신 및 그 제조법을 제공한다.
포름알데히드를 사용하여 불활화 처리를 실시하는 불활화 인플루엔자 백신의 제조 방법으로서, 숙주로부터 회수한 인플루엔자 바이러스를 포함하는 바이러스액을 β-프로피오락톤으로 미리 처리하는 공정을 포함하는, 방법.

Description

불활화 인플루엔자 백신의 제조 방법 및 그 백신 조성물

본 발명은 면역원성이 높은 불활화 인플루엔자 백신 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

인간의 인플루엔자 바이러스는 오르토믹소바이러스속의 1 본쇄 RNA 바이러스이며, 내부 항원의 항원성에 따라 A 형, B 형 및 C 형으로 분류된다. 이 중 동기 (冬期) 를 중심으로 매년 큰 유행을 일으키는 것은 A 형 및 B 형이며, 일본에 있어서도 연간 추정 약 1000 만명 이상이 이환하는 것이 알려져 있다. 이와 같이 매년 큰 유행을 일으키는 인플루엔자 바이러스의 예방에 가장 유효한 수단이 백신이다. 일본의 인플루엔자 바이러스에 대한 백신은, 1957년에 유행한 아시아 감기를 계기로 도입되었고, 당시에는 정제한 인플루엔자 바이러스를 불활화 처리한 불활화 전입자 백신이었다.

그 후, 발열 등의 부반응 저감을 도모하여, 디에틸에테르나 계면 활성제 처리로 바이러스 입자를 해렬 (解裂) 하고, 지질 성분을 제거한 스플릿 백신이 승인되어, 현재는 세계적으로 스플릿 백신이 널리 보급되어 있다. 한편, 프리팬데믹 백신인, A/H5N1 아형에 대한 백신은, 감염력이나 백신 접종력이 없기 때문에, 현재에도 항원으로서 불활화 전입자가 사용되고 있다.

불활화 전입자 백신이나 스플릿 백신은, 모두 병원체인 바이러스의 감염성이 소실된, 이른바 불활화 백신이다. 백신의 불활화 처리에는, β-프로피오락톤, 포름알데히드 및 바이러스 입자의 해렬에 사용하는 디에틸에테르나 계면 활성제에 의한 처리를 들 수 있으며 (비특허문헌 1), 가장 사용 실적이 있는 것은 포름알데히드 처리이다. 전술한 불활화 전입자 백신 및 스플릿 백신은, 모두 포름알데히드로 불활화한 백신이며, 포름알데히드는 불활화제로서 뿐만 아니라, 보존 안정화제로서, 백신 제조 공정에서 사용되거나 백신 제제의 하나의 성분으로서 사용되고 있다.

한편, 불활화 전입자 백신은 스플릿 백신과 비교해서 높은 기초 면역 효과 (프라이밍 효과) 를 갖는데, 이러한 효과는 바이러스 핵산이 세포 내에 도입되어, Toll-Like Receptor7 (TLR7) 을 개재하여 자연 면역이 활성화 되는 것에 기인한다 (Akira S. Phil. Trans. R. Soc. B 2011 ; 366 : 2748-2755). 불활화 전입자 백신에 의한 높은 프라이밍 효과는, 불활화 전입자 백신이 바이러스 핵산을 많이 포함하고 있기 때문이라고 말할 수 있다. 또한, 스플릿 백신에 있어서도 불활화 전입자 백신과 비교하면 함량은 낮기는 하지만, 바이러스 핵산은 포함되어 있어, 그 면역원성에 적잖이 기여하고 있다.

포름알데히드는, 단백질의 1 급 아민이나 티로신의 페닐기 등 및 핵산의 염 기의 1 급 아민에 반응하여 가교 형성하는 것이 알려져 있기 때문에, 포름알데히드에 의한 바이러스 핵산의 과도한 변성은, 불활화 전입자 백신 및 스플릿 백신 중 어느 것에 대해서도 면역원성의 저감을 초래하는 것이 우려된다. 이 때문에, 포름알데히드에 의한 불활화 처리는, 자연 면역 활성을 감약시키지 않는 적절한 조건하에서 실시되는 것이 요구되고 있다.

Pawar SD, Murtadak VB, Kale SD, Shinde PV, Parkhi SS. Evaluation of different inactivation methods for high and low pathogenic avian influenza viruses in egg-fluids for antigen preparation. J Virol Methods. 2015 Sep 15 ; 222 : 28-33.

본 발명은 면역원성이 높은 불활화 인플루엔자 백신 및 그 제조법을 제공하는 것에 관한 것이다.

본원 발명자들은, 인플루엔자 바이러스를 포름알데히드로 불활화 처리하는 경우의 백신 항원의 자연 면역 활성의 저하를 억제하기 위해서 예의 연구한 결과, 의외로 포름알데히드와 마찬가지로 바이러스 불활화제로서 사용되는 β-프로피오락톤으로 인플루엔자 바이러스를 미리 처리한 다음에 포름알데히드 처리를 하면, 포름알데히드에 의한 인플루엔자 백신 항원의 자연 면역 활성화능의 저하를 억제할 수 있는 것을 알아내었다.

즉, 본 발명은 이하의 1) ∼ 5) 에 관련된 것이다.

1) 포름알데히드를 사용하여 불활화 처리를 실시하는 불활화 인플루엔자 백신의 제조 방법으로서, 숙주로부터 회수한 인플루엔자 바이러스를 포함하는 바이러스액을 β-프로피오락톤으로 미리 처리하는 공정을 포함하는, 방법.

2) 포름알데히드를 사용한 불활화 처리가, 바이러스액에 포르말린을 종농도 0.005 ∼ 0.015 vol% 가 되도록 첨가하는, 1) 의 방법.

3) 포름알데히드를 사용한 불활화 처리가, 2 ∼ 8 ℃ 에서 3 ∼ 14 일간 반응시키거나 또는 20 ∼ 30 ℃ 에서 3 일간 반응시키는, 2) 의 방법.

4) β-프로피오락톤 처리가, 회수된 인플루엔자 바이러스를 포함하는 바이러스액에 β-프로피오락톤을 종농도로 0.0125 ∼ 0.1 vol% 가 되도록 첨가하고, 2 ∼ 8 ℃ 에서 18 시간 이상 반응시키는, 1) ∼ 3) 중 어느 것의 방법.

5) 1) ∼ 4) 중 어느 것의 방법에 의해 제조된, 인플루엔자 바이러스의 불활화 전입자 백신 혹은 스플릿 백신.

본 발명의 방법에 의하면, 포름알데히드 처리에 의한 발열 활성 저하 효과를 유지한 채로, 포름알데히드 처리에 의한 인플루엔자 백신 항원의 자연 면역 활성화능의 저하를 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 면역원성이 높고 또한 가능한 한 발열 활성이 저감된 불활화 인플루엔자 백신의 제공을 가능하게 하여, 의약품 업계에 크게 공헌할 수 있다.

도 1 은, 인플루엔자 바이러스 입자의 TLR7 활성화능의 평가이다.
도 2 는, 포름알데히드 처리에 의한 TLR 활성화능의 저하이다.
도 3 은, β-프로피오락톤 처리에 의한 포름알데히드에 대한 내성이다.
도 4 는, (A) : B/Yamagata 계통의 항원에 있어서의 포름알데히드 처리 조건과 TLR 의 활성 변화 (반응 온도 : 4 ℃), (B) : B/Yamagata 계통의 항원에 있어서의 포름알데히드 처리 조건과 TLR 의 활성 변화 (반응 온도 : 25 ℃) 이다.
도 5 는, (A) : A/H3N2 아형의 항원에 있어서의 포름알데히드 처리 조건과 TLR 의 활성 변화 (반응 온도 : 4 ℃), (B) : A/H3N2 아형의 항원에 있어서의 포름알데히드 처리 조건과 TLR 의 활성 변화 (반응 온도 : 25 ℃) 이다.
도 6a 는, 포름알데히드 처리에 의한 뉴클레오프로테인의 고밀도화 평가 (처리 없음) 이다.
도 6b 는, 포름알데히드 처리에 의한 뉴클레오프로테인의 고밀도화 평가 (4 ℃, 0.02 %, 3 일간) 이다.
도 6c 는, 포름알데히드 처리에 의한 뉴클레오프로테인의 고밀도화 평가 (4 ℃, 0.02 %, 14 일간) 이다.
도 6d 는, 포름알데히드 처리에 의한 뉴클레오프로테인의 고밀도화 평가 (25 ℃, 0.02 %, 3 일간) 이다.
도 6e 는, 포름알데히드 처리에 의한 뉴클레오프로테인의 고밀도화 평가 (25 ℃, 0.02 %, 14 일간) 이다.
도 7 은, 포름알데히드 처리에 의한 바이러스 게놈의 고밀도화의 평가이다.
도 8a 는, 마우스 면역원성 시험 (A/H1N1) 의 결과 (HI 항체가) 이다.
도 8b 는, 마우스 면역원성 시험 (A/H3N2) 의 결과 (HI 항체가) 이다.
도 8c 는, 마우스 면역원성 시험 (B/Victoria) 의 결과 (HI 항체가) 이다.
도 9a 는, 마우스 면역원성 시험 (A/H1N1) 의 결과 (항원 특이적 IgG 역가) 이다.
도 9b 는, 마우스 면역원성 시험 (A/H3N2) 의 결과 (항원 특이적 IgG 역가) 이다.
도 9c 는, 마우스 면역원성 시험 (B/Victoria) 의 결과 (항원 특이적 IgG 역가) 이다.
도 10 은, 영장류에 있어서의 발열 활성 평가이다.

이하에 본 발명의 적합한 실시형태에 대해서 상세하게 설명한다. 단, 본 발명은 이하의 실시형태에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 「인플루엔자 바이러스」 란, A 형 인플루엔자 바이러스 혹은 B 형 인플루엔자 바이러스, 또는 그 양자를 나타낸다. 또, 인플루엔자 바이러스는, 현재 알려져 있는 모든 아형, 및 장래 단리 및 동정 (同定) 되는 아형도 포함한다.

본 발명에 있어서, 「인플루엔자 백신」 이란, 적어도 A 형 인플루엔자 바이러스 또는 B 형 인플루엔자 바이러스 중 어느 것의 항원을 포함하고 있는 백신을 의미한다. 즉, 본 발명의 인플루엔자 백신은, A 형 인플루엔자 바이러스 또는 B 형 인플루엔자 바이러스 중 일방만을 포함하는 단가 백신이어도 되고, 그것들을 양방 포함하고 있는 다가 백신이어도 된다. 또, 항원은 바이러스 입자의 형태를 유지한 채로 감염성을 소실한 불활화 전입자 백신이어도 되고, 바이러스 입자를 계면 활성제 혹은 디에틸에테르 등의 유기 용매로 해렬한 스플릿 백신이어도 된다.

본 발명의 백신 조제에 사용하는 인플루엔자 바이러스주는, 감염 동물 또는 환자로부터 단리된 주여도 되고, 유전자 공학적으로 배양 세포에서 수립된 재조합 바이러스여도 된다.

본 발명의 불활화 인플루엔자 백신의 제조 방법은, 포름알데히드를 사용하여 불활화 처리를 실시하는 방법으로서, 숙주로부터 회수한 인플루엔자 바이러스를 포함하는 바이러스액을 β-프로피오락톤으로 미리 처리하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.

β-프로피오락톤으로 처리되는 바이러스액은, 숙주 안에서 감염, 배양되고, 회수하여 얻어진 인플루엔자 바이러스를 포함하는 바이러스 용액이다.

여기서 인플루엔자 바이러스의 증식에 사용되는 「숙주」 로는, 배양 세포 또는 발육 계란 중 어느 것이어도 된다. 즉, 본 발명의 방법에 있어서, 처리의 대상이 되는 인플루엔자 바이러스는, 발육 계란법 또는 세포 배양법 중 어느 방법에 의해 증식된 것이어도 된다.

「발육 계란법」 이란, 바이러스주를 부화 계란에 접종하여 배양한 후, 바이러스 부유액을 청정화, 농축 및 정제 및 불활화하여, 바이러스 입자를 포함하는 바이러스액을 얻는 방법이다.

여기서, 배양은 인플루엔자 바이러스를 부화 계란에 접종하여, 30 ∼ 37 ℃ 에서 1 ∼ 7 일 정도, 바람직하게는 33 ∼ 35 ℃ 에서 2 일간 정도 실시된다. 배양 종료 후, 바이러스 부유액 (감염 요막강액) 이 회수되고, 청정화를 위해서, 원심 분리 또는 여과가 실시된다. 이어서, 농축을 위해서, 한외 여과가 실시된다. 바이러스 정제는, 자당 밀도 구배 원심 분리 등의 초원심 분리나 액체 크로마토그래피 등의 수단을 사용하여 실시할 수 있다.

「세포 배양법」 이란, 배양 세포에 바이러스주를 접종하여 배양하고, 발육 계란법과 마찬가지로 청정화, 농축 및 정제 및 불활화하여, 바이러스 입자를 포함하는 바이러스액을 얻는 방법이다.

여기서, 배양 세포는 인플루엔자 바이러스가 증식성을 나타내는 세포이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어, MDCK (Madin-Darby Canine Kidney), Vero, Caco-2, PER. C6, EB66 및 바이러스가 침입에 사용하는 리셉터를 고발현하도록 재조합한 이들의 세포를 들 수 있다.

발육 계란법 혹은 세포 배양법으로 배양하고, 회수된 인플루엔자 바이러스 부유액을 청정화, 농축 또는 정제하는 어느 것의 시기에 β-프로피오락톤 처리가 실시된다.

통상적으로, 인플루엔자 바이러스 부유액을 청정화, 농축 또는 정제하는 어느 것의 시기에, 포름알데히드에 의한 불활화 처리가 실시되지만, 본 발명에 있어서는, 당해 포름알데히드 처리 전에, 미리 β-프로피오락톤 처리가 실시된다.

즉, 본 발명의 방법에 있어서, β-프로피오락톤 처리 및 그것에 이어지는 포름알데히드 처리는, 청정화 공정, 농축 공정 및 정제 공정의 전후에서 실시할 수 있으며, 바람직하게는 정제 공정의 전후, 보다 바람직하게는 정제 공정의 후이다. 또, 스플릿 백신의 경우에는, 바이러스의 해렬 공정의 전후여도 된다.

β-프로피오락톤은, 많은 백신의 조제에 있어서 바이러스 불활성화를 위해서 널리 사용되는 모노알킬화제이다. 본 발명에 있어서, β-프로피오락톤 처리로는, 배양 후에 회수된 인플루엔자 바이러스를 포함하는 바이러스액에, 종농도로 0.0125 ∼ 0.1 vol%, 바람직하게는 0.025 ∼ 0.075 vol%, 보다 바람직하게는 0.05 vol% 가 되도록 β-프로피오락톤을 첨가하고, 2 ∼ 8 ℃ 에서, 18 시간 이상, 바람직하게는 20 시간 이상, 보다 바람직하게는 24 시간 이상, 또한 50 시간 이하, 바람직하게는 30 시간 이하로 반응시키는 방법을 들 수 있다.

보다 바람직한 양태로서, 예를 들어 2 ∼ 8 ℃, 0.05 % 로 24 시간 처리하는 것을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 포름알데히드 처리는, 상기 β-프로피오락톤 처리된 바이러스액에 대해서 실시되지만, 그 처리 조건으로는, 바이러스액에 대하여, 포르말린을 종농도로 0.015 vol% 이하, 바람직하게는 0.005 ∼ 0.015 vol%, 보다 바람직하게는 0.01 ∼ 0.015 vol%, 보다 바람직하게는 0.01 vol% 가 되도록 첨가하고, 2 ∼ 8 ℃ 에서 14 일 이내 혹은 20 ∼ 30 ℃ 에서 3 일간 이내의 반응을 실시하는 공정을 들 수 있다.

보다 바람직한 양태로서, 예를 들어, 종농도 0.01 vol% 가 되도록 포르말린을 첨가하여, 4 ℃ 에서 3 ∼ 14 일간 혹은 25 ℃ 에서 3 일간 반응을 실시하는 것을 들 수 있다.

통상적으로, 포름알데히드 처리는, 불활화 효과를 발휘시키기 위해서, 포르말린을 종농도 0.02 ∼ 0.1 vol%, 2 ∼ 8 ℃ 에서 14 일간 실시되지만, 본 발명에 있어서는, 상기와 같이 완화 조건으로 실시하는 것이 가능하다.

또한, 본 발명에 있어서, 「포르말린」 이란, 포름알데히드를 35 ∼ 41 % 함유하는 포름알데히드 수용액을 의미한다.

이렇게 하여 제조된, 인플루엔자 백신은, TLR 활성화능이 저감되지 않고, 또 포르말린 처리에 의한 발열 활성 저하 효과를 보유하기 때문에, 높은 면역원성을 유지하고, 가능한 한 발열 활성을 저감한 불활화 백신이 된다.

여기서, TLR 활성화능이 저감되지 않는다는 것은, β-프로피오락톤 처리만의 항원 혹은 불활화 처리하지 않은 인플루엔자 바이러스에 비해 TLR 자극 활성이 유의하게 저하되지 않는 것을 의미한다.

또한, TLR 자극 활성의 측정은, 예를 들어, 후술하는 실시예에서 기재하는 바와 같이, TLR7 유전자와 분비형 알칼리 포스파타아제 (SEAP) 유전자를 짜넣은 RAW264.7 세포에, 본 발명의 불활화 전입자 인플루엔자 항원을 폭로했을 때의 배양 상청 중의 SEAP 활성을 측정함으로써 실시할 수 있다.

본 발명의 불활화 인플루엔자 백신은, 헤마글루티닌 양으로서 바이러스 1 주 당 7.5 μg 이상, 즉 7.5 μgHA/주 이상이고, 바람직하게는 9 ∼ 21 μgHA/주이며, 보다 바람직하게는 15 μgHA/주이다. 또한, 헤마글루티닌 함량은, 일원 방사 면역 확산 시험법 등의, WHO 나 국가의 기준으로 정해진 시험법으로 측정함으로써 얻어지는 값이다. 또, 백신에 포함되는 항원량은 바이러스의 종류 또는 투여 대상에 따라 적절히 변경해도 된다.

본 발명의 불활화 인플루엔자 백신에는, 인플루엔자 바이러스의 항원 이외에, 추가로 의약품으로서 허용될 수 있는 담체를 포함하고 있어도 된다. 당해 담체로는, 백신의 제조에 통상적으로 사용되는 담체를 들 수 있으며, 구체적으로는, 완충제, 유화제, 보존제, 등장화제, pH 조정제 혹은 아쥬반트 등이 예시된다.

본 발명의 불활화 인플루엔자 백신의 제형은, 예를 들어 액상, 동결 건조 분말, 캡슐 및 정제 (錠劑) 여도 된다.

본 발명의 불활화 인플루엔자 백신의 투여 경로는, 예를 들어, 피하 투여, 근육내 투여, 피내 투여, 경비 투여, 설하 투여 또는 경구 투여여도 되며, 그 투여 방법은, 예를 들어, 시린지, 마이크로 니들, 마이크로 니들을 장착한 시린지, 경피적 패치 또는 스프레이에 의한 투여 방법이어도 된다.

본 발명의 불활화 인플루엔자 백신의 투여 대상은, 인간 및 인간을 제외한 포유 동물을 들 수 있지만, 인간이 바람직하다. 인간을 제외한 포유 동물로는, 예를 들어, 마우스, 래트, 모르모트, 토끼, 돼지, 소, 말, 염소, 양, 개, 고양이, 붉은털원숭이, 게잡이원숭이, 오랑우탄, 침팬지 등을 들 수 있다.

실시예

이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들에 조금도 한정되는 것은 아니다.

참고예 1 인플루엔자 바이러스의 TLR 활성화능의 평가

12 일령의 발육 계란의 장뇨막강 내에 B/Phuket/3073/2013 주의 바이러스를 접종하여, 3 일간 배양 후에 장뇨액을 채취하였다. 채취한 장뇨액을 필터 여과로 청정화 한 후, 황산바륨염에 흡착시키고, 12 % 시트르산나트륨 용액으로 용출하여 인플루엔자 바이러스를 회수하였다. 회수한 바이러스는, 추가로 한외 여과로 6.7 mM 인산 완충 생리 식염액 (pH 7.2) 으로 치환하고, 버퍼 치환 후에 자당 밀도 구배 원심으로 인플루엔자 바이러스를 포함하는 획분을 회수함으로써 정제하였다. 얻어진 바이러스액을 정제 인플루엔자 바이러스액이라고 칭한다. 또, 이 정제 인플루엔자 바이러스액에 종농도 0.05 % 가 되도록 불활화제인 β-프로피오락톤을 첨가하여, 4 ℃, 24 시간의 반응으로 인플루엔자 바이러스의 감염성을 불활화 시켰다. 이 불활화 반응 후에 한외 여과 (MWCO : 100,000) 로 버퍼를 1 w/w% 자당 함유 6.7 mM 인산 완충 생리 식염액 (pH 7.2) 으로 치환하고, 이것을 β-프로피오락톤 처리 불활화 전입자 백신으로 하였다.

분비형 알칼리 포스파타아제 유전자를 짜넣은 RAW264.7 (NBP2-26261) 의 1.5 × 10⁶ 세포에 대하여, TLR7/8/9 의 안타고니스트인 ODN2088 (Miltenyi 사) 을 종농도로 0, 0.1, 1 및 10 μM 가 되도록 첨가하였다. ODN2088 을 첨가한 세포에, 상기와 같이 조제한 B/Phuket/3073/2013 주의 불활화 전입자 백신을 총 단백질로 5 μg 또는 이미퀴모드를 5 μg 첨가하여, 37 ℃, 5 % CO₂ 조건하에서 24 시간 배양하였다. 배양 후, 상청을 회수하여, 상청의 알칼리 포스파타아제 활성을 SEAP Reporter Assay Kit (상품명, Cayman 사) 로 측정하고, 불활화 전입자 백신 및 이미퀴모드 각각에서 ODN2088 을 첨가하고 있지 않은 시그널에 대한, 각 농도의 ODN2088 의 시그널의 상대값을 산출하고, 이것을 상대 활성값으로 하였다.

각 농도의 ODN2088 로 전처리 했을 때의 상대 활성값은, 도 1 에 나타내는 바와 같다. 불활화 전입자 백신 및 이미퀴모드의 상대 활성값은, 모두 ODN2088 의 농도 의존적으로 저하되는 경향이 확인되고, 이에 따라 불활화 전입자 백신이 갖는 TLR7 활성화능은, NBP2-26261 을 사용한 in-vitro 의 계에서 평가 가능한 것으로 생각되었다.

참고예 2 포름알데히드 처리에 의한 TLR 활성화능의 저하

전술한 참고예 1 에 기재하는 방법으로 조제한 정제 인플루엔자 바이러스액을 단백 농도가 200 μg/mL 가 되도록 조정하고, 거기에 10 % 중성 완충 포르말린액 (후지 필름 와코 순약, 포름알데히드 함량 : 3.8 ∼ 4.1 %) 을 포르말린이 종농도로, 0, 0.01 또는 0.02 % 가 되도록 첨가하여, 4 ℃ 에서 3, 7 및 14 일간의 반응을 실시하였다. 반응 후, 종농도로 10 mM 가 되도록 글리신을 첨가하여 포름알데히드의 반응을 정지하고, 그것을 4 ℃, 1,000,000 × g 으로 4 시간 원심 분리하였다. 원심 분리 후에 상청을 폐기하고, 얻어진 바이러스의 펠릿을 6.7 mM Phosphate Buffered Saline 으로 현탁하여, 이것을 포름알데히드 처리 바이러스로 하였다.

1.5 × 10⁶ 세포의 NBP2-26261 에 대하여, 각종 포름알데히드 처리 바이러스를 총 단백량으로서 10 μg 첨가하고, 37 ℃, 5 % CO₂ 조건하에서 24 시간 배양하였다. 배양 후, 상청을 회수하여, 상청의 알칼리 포스파타아제 활성을 SEAP Reporter Assay Kit (상품명, Cayman 사) 로 측정하였다. 측정 결과로부터, 검체마다 포르말린 첨가하지 않은 조건 (포르말린 농도 : 0) 에서 얻어진 시그널에 대한 상대값을 산출하고, 이것을 상대 활성값으로 하였다.

도 2 에 결과를 나타내는 바와 같이, 포름알데히드 처리에 있어서, 고농도이고, 반응일수가 길어질수록, 상대 활성값은 저하되는 경향이 확인되었다. 따라서, 강한 포름알데히드 처리에 의해 TLR 활성화능은 저하되고, 그 때문에 자연 면역 활성 및 면역원성의 저하를 일으키는 것으로 생각되었다.

실시예 1 β-프로피오락톤 처리에 의한 포름알데히드에 대한 내성

전술한 참고예 1 에서 조제한 정제 인플루엔자 바이러스액 및 β-프로피오락톤 처리 불활화 전입자 백신을 각각, 단백 농도가 200 μg/mL 가 되도록 조정하고, 거기에 10 % 중성 완충 포르말린액 (후지 필름 와코 순약, 포름알데히드 함량 : 3.8 ∼ 4.1 %) 을 포르말린이 종농도로, 0, 0.01 또는 0.02 % 가 되도록 첨가하였다. 포르말린 첨가 후, 4 ℃ 에서 14 일간 반응하고, 반응 후에 종농도로 10 mM 가 되도록 글리신을 첨가하여 포름알데히드의 반응을 정지하고, 그것을 4 ℃, 1,000,000 × g 으로 4 시간 원심 분리하였다. 원심 분리 후에 상청을 폐기하고, 얻어진 바이러스의 펠릿을 6.7 mM Phosphate Buffered Saline 으로 현탁하고, 검체로 하였다.

1.5 × 10⁶ 세포의 NBP2-26261 에 대하여, 조제한 검체를 총 단백량으로서 10 μg 첨가하고, 37 ℃, 5 % CO₂ 조건하에서 24 시간 배양하였다. 배양 후, 상청을 회수하여, 상청의 알칼리 포스파타아제 활성을 SEAP Reporter Assay Kit (상품명, Cayman 사) 로 측정하였다. 측정 결과로부터, 검체마다 포르말린 첨가하지 않은 조건 (포르말린 농도 : 0) 에서 얻어진 시그널에 대한 상대값을 산출하고, 이것을 상대 활성값으로 하였다.

도 3 에 나타내는 바와 같이, β-프로피오락톤 처리를 사전에 실시함으로써, 포름알데히드에 의한 TLR 활성화능의 저하를 억제할 수 있는 것을 알 수 있었다. 따라서, 포름알데히드 처리를 실시하기 전에, β-프로피오락톤 처리를 실시해 둠으로써, 자연 면역 활성화능을 유지한 인플루엔자 백신 항원을 조제할 수 있는 것으로 생각되었다.

실시예 2 포름알데히드 처리 조건의 최적화

참고예 1 에 기재된 방법과 동일한 방법으로 B/Phuket/3073/2013 주 (B/Yamagata 계통) 및 A/Kansas/14/2017 주 (A/H3N2 아형) 의 β-프로피오락톤 처리 불활화 전입자 백신을 조제하고, 각 주의 백신에 10 % 중성 완충 포르말린액 (후지 필름 와코 순약, 포름알데히드 함량 : 3.8 ∼ 4.1 %) 을 포르말린이 종농도로, 0, 0.01 또는 0.02 % 가 되도록 첨가하였다. 포르말린 첨가 후, 4 ℃ 혹은 25 ℃ 에서 3, 7 및 14 일간의 반응을 실시하고, 반응 후에 종농도로 10 mM 가 되도록 글리신을 첨가하여 포름알데히드의 반응을 정지하고, 그것을 4 ℃, 1,000,000 × g 으로 4 시간 원심 분리하였다. 원심 분리 후에 상청을 폐기하고, 얻어진 바이러스의 펠릿을 6.7 mM Phosphate Buffered Saline 으로 현탁하고, 검체로 하였다.

1.5 × 10⁶ 세포의 NBP2-26261 에 대하여, 조제한 검체를 총 단백량으로서 10 μg 첨가하고, 37 ℃, 5 % CO₂ 조건하에서 24 시간 배양하였다. 배양 후, 상청을 회수하여, 상청의 알칼리 포스파타아제 활성을 SEAP Reporter Assay Kit (상품명, Cayman 사) 로 측정하였다. 측정 결과로부터, 검체마다 포르말린 첨가하지 않은 조건 (포르말린 농도 : 0) 에서 얻어진 시그널에 대한 상대값을 산출하고, 이것을 상대 활성값으로 하였다.

B/Phuket/3073/2013 주 (B/Yamagata 계통) 의 β-프로피오락톤 처리 불활화 전입자 백신에 대한 포름알데히드 처리의 영향을 도 4 에 나타낸다. 4 ℃ 반응 조건하에서는, 0.01 % 의 포르말린 농도에서는 3 ∼ 14 일간의 반응일수에 있어서 명확한 TLR 활성화능의 저하는 확인되지 않았지만 (도 4 A), 25 ℃ 반응 조건하에서는, 어느 반응일수에 있어서도 포르말린 농도가 높아짐에 따라서, TLR 활성화능의 저하 경향이 확인되었다 (도 4B). 이하의 표 1 에 상대 활성값의 평균값을 정리했지만, 본 평가계는 세포를 사용하여, 효소 활성을 기초로 정량적인 평가를 실시하기 때문에, 평가 방법의 편차를 고려하면 30 % 이상의 변화로 유의한 저하인 것으로 판단하였다. 따라서, 표 중의 밑줄로 나타내는 조건에서는 TLR 활성화능의 유의한 저하가 확인된 것으로 생각된다.

한편, A/Kansas/14/2017 주 (A/H3N2 아형) 의 β-프로피오락톤 처리 불활화 전입자 백신에 대한 포름알데히드 처리의 영향은, 도 5 에 나타내는 바와 같이 4 ℃ 이더라도 0.02 % 의 포르말린 농도에서는 어느 반응일수에 있어서도 명확한 TLR 활성화능의 저하가 확인되었다 (도 5A). 또, 25 ℃ 에서는, 0.01 % 의 포르말린 농도이더라도 7 일간 이상의 반응에서 TLR 활성화능의 큰 저감이 확인된다 (도 5B). 이하의 표 2 에 A/Kansas/14/2017 주에서의 상대 활성값을 나타내지만, B/Phuket/3073/2013 주와는 달리, 30 % 이내의 변화였던 것은, 4 ℃ 포르말린 농도 0.01 %, 3 ∼ 14 일간의 반응 혹은 25 ℃ 포르말린 농도 0.01 %, 3 일간의 반응이며, 그것 이외에는 30 % 를 초과하는 TLR 활성화능의 저하가 확인되었다.

따라서, 종래에는 포르말린 농도 0.02 % 에 있어서, 4 ℃ 에서 장시간의 반응으로 바이러스의 불활화 처리를 실시하는 경우가 있었지만, 주에 따라서는 포름알데히드에 대한 감수성이 높고, TLR 활성화능이 저하되는 것이 시사되었다. 따라서, A 및 B 형 중 어느 바이러스주에 대해서도, β-프로피오락톤 처리를 실시하고, 그 후, 저농도의 포르말린으로, 예를 들어 실온 정도에서 몇 일간 포름알데히드 처리함으로써, TLR 활성화능을 유지하는 것이 가능해진다. 또, 종래의 포름알데히드 처리 조건이 비교적 고농도로 장시간 실시되고 있었던 것은, 바이러스의 불활화를 달성하기 위해서이며, 본 발명에서는 사전에 β-프로피오락톤 처리를 실시함으로써, 포름알데히드 처리 조건은 비교적 마일드해도 충분한 불활화를 달성 가능하다.

참고예 3 포름알데히드 처리에 의한 바이러스 게놈과 뉴클레오프로테인 (NP) 의 가교 형성

참고예 1 에 기재된 방법과 동일한 방법으로 B/Phuket/3073/2013 주 (B/Yamagata 계통) 의 β-프로피오락톤 처리 불활화 전입자 백신을 조제하고, 표 3에 기재하는 각 조건으로 포름알데히드 처리를 실시하였다. 각 반응 후에 종농도로 10 mM 가 되도록 글리신을 첨가하여 포름알데히드의 반응을 정지하고, 그것을 4 ℃, 1,000,000 × g 으로 4 시간 원심 분리하였다. 원심 분리 후에 상청을 폐기하고, 얻어진 바이러스의 펠릿을 6.7 mM Phosphate Buffered Saline 으로 현탁하였다. 현탁액에 종농도로 1 % 가 되도록 도데실황산나트륨을 첨가하고, 그것을 분획 밀도 10 ∼ 60 w/w% 의 자당 밀도 구배 원심 분리 (4 ℃, 206, 500 × g 으로 3 시간) 로 23 프랙션으로 분획하였다.

각 프랙션 용액과 SDS-PAGE 용 샘플 버퍼 (8 % SDS, 40 % 글리세롤/250 mM Tris-HCl Buffer pH 6.8) 를 등량 혼합하고, 95 ℃ 에서 5 분간 반응시켜, 이것을 Western blotting (웨스턴 블롯팅) 에 제공하였다. 또, 조건 1, 3 및 5 의 각 프랙션 용액 100 μL 에 ProteinaseK (Roche) 12.5 μL 를 첨가하고, 70 ℃ 에서 15 분간 반응시켜, 이것을 바이러스 게놈 정량의 qPCR 에 제공하였다. 웨스턴 블롯팅은 이하에 기재하는 방법에 따라서 실시하고, qPCR 은 High Pure Viral RNA Kit (Roche) 로 바이러스 게놈을 추출하고, 인플루엔자 진단 매뉴얼 (제 4 판) 에 기재되는 방법으로 Type B 의 NS 유전자를 표적으로 하여, B 형 바이러스의 게놈 정량을 실시하였다.

웨스턴 블롯팅은, 샘플 버퍼를 첨가한 프랙션 용액을 12.5 % 폴리아크릴아미드 겔 (아토사 제조 ePAGEL) 로 전기 영동하고, 세미드라이식 전사 장치 (아토사 제조) 로 PVDF 막으로의 전사 반응을 실시하였다. 전사 후의 PVDF 막을 75 mL 의 블로킹 버퍼 (10 % 스킴 밀크 함유 TBS) 에 담그고, 실온에서 4 시간의 마스킹 반응을 실시하였다. 반응 후, 적당량의 TBS 로 PVDF 막을 3 회 세정하고, 그 후 PVDF 막을 항NP 항체 용액 (LifeSpan BioScience 사) 에 담가 4 ℃ 에서 약 16 시간 반응시켰다 (1 차 항체 반응). 1 차 항체 반응 후, Tween20 (상품명) 함유 TBS 로 PVDF 막을 5 회 세정하고, HRP 표지 항마우스 항체 (Jackson Immuno Research Laboratories 사) 용액을 첨가하여 실온에서 60 분간 반응시켰다 (2 차 항체 반응). 2 차 항체 반응 후, Tween20 (상품명) 함유 TBS 로 PVDF 막을 5 회 세정하고, Super Signal (상품명) Western Lightning-Plus ECL (상품명, Perkin Elmer 사 제조) 로 뉴클레오프로테인의 검출을 실시하였다.

먼저, 웨스턴 블롯팅의 결과를 도 6 에 나타내지만, 포름알데히드 처리 없음 (조건 1, 도 6a) 및 포르말린 농도 0.02 % 로 4 ℃, 3 일간의 반응 (조건 2, 도 6b) 에서는, 뉴클레오프로테인은 저밀도에만 검출되었다. 또, 포르말린 농도 0.02 % 로 4 ℃, 14 일간의 반응 (조건 3, 도 6c) 및 포르말린 농도 0.02 % 로 25 ℃, 3 일간의 반응 (조건 4, 도 6d) 에서는, 고밀도와 저밀도의 각각에 뉴클레오프로테인이 검출되었다. 또한, 0.02 % 로 25 ℃, 14 일간의 반응 (조건 5, 도 6e) 에서는, 고밀도에만 뉴클레오프로테인이 검출되었다. 이들 결과로부터, 포름알데히드 처리를 강하게 함으로써, 뉴클레오프로테인은 고밀도로 시프트하는 것이 확인되었다.

qPCR 에 의한 바이러스 게놈의 정량 결과에서는, 조건 1, 3 및 5 에 대해 실시했는데, 뉴클레오프로테인의 검출과 마찬가지로, 조건 1 에서는 저밀도에서만 검출되었지만, 조건 3 에서는, 고밀도 및 저밀도의 양방에서 바이러스 게놈은 검출되고, 조건 5 에서는 고밀도에만 바이러스 게놈이 국재하는 것을 알 수 있었다. 포름알데히드 처리가 강해짐에 따라서, 바이러스 게놈의 정량값이 낮은 값이 되는 것은 포름알데히드의 가교 반응이 일부 남아 있기 때문에, 폴리머라아제 연쇄 반응이 저해되는 것에 기인하는 것으로 생각되지만, 검출된 바이러스 게놈의 프랙션은 웨스턴 블롯팅으로 검출된 뉴클레오프로테인의 프랙션과 거의 동일하다. 따라서, 포름알데히드 처리에 의해 뉴클레오프로테인과 바이러스 게놈은 가교를 형성하고, 이 가교 반응이 과잉으로 진행됨으로써 TLR 활성화능이 감약하는 것으로 생각되었다.

실시예 3 마우스 면역원성 시험

실시예 2 에 기재된 방법과 동일하게 3 주 (A/H1N1 : A/Brisbane/02/2018, A/H3N2 : A/Kansas/14/2017, B/Victoria 계통 : B/Maryland/15/2016) 의 1) β-프로피오락톤 처리 불활화 전입자 항원, 2) β-프로피오락톤 처리 후, 종농도 0.01 % 포르말린으로 4 ℃, 14 일간 처리한 불활화 전입자 항원, 3) β-프로피오락톤 처리 후, 종농도 0.02 % 포르말린으로 25 ℃, 14 일간 처리한 불활화 전입자 항원, 을 각각 조제하였다. 각 항원은 0.2 mL 당 각 주의 헤마글루티닌이 15 μgHA 가 되도록 1 w/w% 자당 함유 6.7 mM 인산 완충 생리 식염액 (pH 7.2) 으로 조정하고, 불활화 전입자 백신 (WV) 으로서, 마우스 면역원성 시험에 제공하였다.

불활화 전입자 백신과 대조로서 인플루엔자 HA 백신 (스플릿 백신, SV) 을, 5 주령이고 암컷인 BALB/c 마우스의 후배부 (後背部) 피하에 15 μgHA/투여가 되도록 투여하고, 투여 21 일 후에 각 마우스로부터 얻어진 혈청의 HI 항체가 및 항원 특이적 IgG 역가를 측정하였다.

HI 항체가 측정의 결과를, 도 8a ∼ 8c 에 나타내지만, 어느 주에 대해서도, SV 에 비해 β-프로피오락톤 처리만의 WV 에서는 높은 항체 유도를 나타내고, 자연 면역 부활화능이 감약하지 않는 「0.01 % 포르말린으로 4 ℃, 14 일간 처리한 WV (WV-0.01)」 에서는, β-프로피오락톤 처리만의 WV 와 동일한 정도의 항체 유도였다. 또, 자연 면역 부활화능이 크게 저하되는 「0.02 % 포르말린으로 25 ℃, 14 일간 처리한 WV (WV-0.02)」 에서는, 모든 주에 있어서 WV-0.01 에 비해 유의한 항체 유도의 저하가 확인되었다 (맨·휘트니 검정, p ＜ 0.05).

항원 특이적 IgG 역가의 결과를 도 9a ∼ 9c 에 나타내지만, HI 항체가와 동일한 경향을 나타내고 있으며, WV-0.01 은 β-프로피오락톤 처리만의 WV 와 동일한 정도의 항체 유도를 나타내고, WV-0.02 는 WV-0.01 에 비해 유의한 항체 유도의 저하가 확인되었다 (맨·휘트니 검정, p ＜ 0.01).

따라서, 자연 면역 부활화능과 항체 유도능은 상관하는 것이 나타나고, 인플루엔자 백신의 면역원성을 높게 유지하기 위해서는, 백신 항원이 갖는 자연 면역 부활화능을 저해하지 않고, 본래의 활성을 유지하는 것이 중요하다.

실시예 4 영장류에 있어서의 발열 활성 평가

검역을 마친 게잡이원숭이 12 마리에 마취 전 투약으로서 아트로핀 황산염 수화물을 근육내 투여하고, 다음으로, 염산케타민을 근육내 투여하여 동물을 진정화 시켰다. 진정화 후, 이소플루란 흡입 마취하에서, 텔레메트리 송신기 (TL11M2-D70-PCT, Data Sciences International Inc.) 를 복강내에 매립하고 복벽에 고정시켰다. 또한, 수술 직전에는 감염 예방을 위해서 항생 물질 및 통증 완화를 위해서 케토프로펜을 근육내 투여하였다. 텔레메트리 송신기의 매립 수술로부터의 약 3 주간의 관찰 기간을 마련하고, 동물에 이상이 없는 것을 확인하고 시험에 제공하였다.

텔레메트리 송신기를 매립한 게잡이원숭이에 생리 식염수 (오츠카 제약 공장) 를 각 개체에 0.5 mL 투여하고 (Day 0), 투여 후 24 시간의 체온을 측정하였다 (각 개체의 베이스 라인 측정). 생리 식염수의 투여로부터 7 일 후에, 실시예 3 과 동일하게 조제한 각종 4 가 불활화 전입자 백신 (15 μgHA/주/0.5 mL, WV) 및 인플루엔자 HA 백신 (15 μgHA/주/0.5 mL, SV) 을 각 개체에 0.5 mL 를 투여하고, 투여 후 24 시간의 체온을 측정하여 개체마다 베이스 라인 측정값과의 차분을 계산하였다. 체온의 차분을 발열로 하여, 도 10 에 결과를 정리하였다.

도 10 에 나타내는 바와 같이, 스플릿 백신인 인플루엔자 HA 백신은 발열 활성을 나타내지 않고, β-프로피오락톤 처리만의 불활화 전입자 백신에서는 가장 높은 발열 활성이 확인되었다. 이 β-프로피오락톤 처리만의 불활화 전입자 백신에 대해, 어느 포르말린 처리한 불활화 전입자 백신도 발열 활성이 저하되는 것을 알 수 있었다. WV-0.01 과 WV-0.02 를 비교하면, 자연 면역 부활화능이 저하되는 WV-0.02 쪽이 발열 활성은 낮지만, 발열의 피크값 (WV-0.01 이 0.7 ℃, WV-0.02 가 0.3 ℃) 은 0.4 ℃ 의 차였다.

따라서, 발열 활성은 포르말린 처리에 의해 저하되고, 보다 강한 (고농도, 고온, 장기) 조건으로 실시함으로써 발열 활성의 저하는 크지만, 실시예 3 에 나타내는 바와 같이 WV-0.02 는 면역원성의 유의한 저하를 나타내기 때문에, 유효성 및 안전성의 양방이 우수한 백신은, WV-0.01 과 같이 자연 면역 부활화능을 저해하지 않고, 가능한 한 발열 활성을 저감한 백신이다.

Claims (5)

1. 포름알데히드를 사용하여 불활화 처리를 실시하는 불활화 인플루엔자 백신의 제조 방법으로서, 숙주로부터 회수한 인플루엔자 바이러스를 포함하는 바이러스액을 β-프로피오락톤으로 미리 처리하는 공정을 포함하는, 방법.
2. 제 1 항에 있어서,
   포름알데히드를 사용한 불활화 처리가, 바이러스액에 포르말린을 종농도로 0.005 ∼ 0.015 vol% 가 되도록 첨가하는, 방법.
3. 제 2 항에 있어서,
   포름알데히드를 사용한 불활화 처리가, 2 ∼ 8 ℃ 에서 3 ∼ 14 일간 반응시키거나 또는 20 ∼ 30 ℃ 에서 3 일간 반응시키는, 방법.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
   β-프로피오락톤 처리가, 회수된 인플루엔자 바이러스를 포함하는 바이러스액에 β-프로피오락톤을 종농도로 0.0125 ∼ 0.1 vol% 가 되도록 첨가하고, 2 ∼ 8 ℃ 에서 18 시간 이상 반응시키는, 방법.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조된, 인플루엔자 바이러스의 불활화 전입자 백신 혹은 스플릿 백신.

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