KR20220145891A - 핵산 분자를 보호하기 위한 시스템 및 방법 - Google Patents

핵산 분자를 보호하기 위한 시스템 및 방법 Download PDF

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막시밀리언 딘
아라쉬 애쉬 알리자데
제이콥 제이. 차본
데이비드 엠. 커츠
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더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
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Abstract

핵산 분자를 보호하기 위한 공정 및 재료가 개시된다. 생검에서 신생물을 감지하는 공정 및 재료가 개시된다. 시퀀싱 라이브러리를 구축하기 위한 공정 및 재료가 개시된다. 무세포(cell-free) 핵산은 시퀀싱될 수 있으며 그 시퀀싱 결과는 신생물에서 유래된 서열을 검출하는 데 사용될 수 있다.

Description

핵산 분자를 보호하기 위한 시스템 및 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 2월 24일에 출원된 "Methods of Analyzing Cell Free Nucleic Acids and Applications its Applications"라는 명칭의 미국 가특허출원 번호 62/980,972의 이익을 주장하며, 이 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
연방 지원 연구에 관한 진술
본 발명은 국립 보건원(National Institutes of Health)이 수여한 계약 CA186569 및 CA188298 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 가진다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식의 전자 제출되는 서열목록을 포함하며, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 2021년 2월 22일에 생성된 ASCII 사본의 이름은 06342PCT2_SeqList_ST25.txt이고 크기는 4,818 바이트이다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 핵산을 분석하는 방법에 관한 것이며, 보다 구체적으로 반응성 산소종으로부터 핵산을 보호하는 방법에 관한 것이다.
개체(예를 들어, 인간 개체)의 생물학적 샘플에서 유래된 핵산 분자는 개체의 상태(예를 들어, 유전적 돌연변이(들), 질환의 존재, 그러한 질환에 대한 치료의 진행, 등)에 대한 정보를 암호화할 수 있다. 예를 들어, 무세포(cell-free) 핵산(예를 들어, 무세포 데옥시리보핵산(cfDNA) 또는 무세포 리보핵산(cfRNA))의 분석을 기반으로 체세포 변형(예를 들어, 돌연변이 핵산)을 검출할 수 있는 비침습적 혈액 검사는, 생물학적 표본(예를 들어, 생물학적 유체)을 얻기가 상대적으로 쉽기 때문에 암 검진 및 기타 응용 분야에서 매력적인 후보가 될 수 있다.. 생물학적 샘플에서 발견되는 핵산의 핵산 서열의 정확한 결정을 촉진하기 위한 방법, 시스템 및 조성물이 필요하다.
본 발명은 개체의 생물학적 샘플 내의 또는 이로부터 유래된 하나 이상의 핵산 분자의 변경(예를 들어, 전환과 같은 돌연변이)을 감소 또는 방지하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물 및 방법은 시험관내(in vitro) 또는 생체외(ex vivo) 샘플에서 하나 이상의 핵산 분자에 가해지는 손상, 예를 들어 반응성 산소종에 의해 가해지는 손상을 감소시키거나 예방할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 예를 들어, 질환 진단, 질환 모니터링, 또는 개체에 대한 치료 결정을 위한 이러한 하나 이상의 핵산 분자(예를 들어, cfDNA, cfRNA)의 분석 동안 오류의 정도 및/또는 비율(예를 들어, 시퀀싱 오류, 백그라운드 오류)을 감소시킬 수 있다. 본 발명의 방법 및 시스템은 이러한 하나 이상의 핵산 분자의 분석, 예를 들어 암-유래 또는 질환-유래 핵산의 검출의 민감성, 특이성 및/또는 신뢰성을 향상시킬 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 (i) 핵산 분자 및 (ii) 설핀산 기를 포함하는 이종 항산화 모이어티를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 구체예에서, 이종 항산화 모이어티는 다음 구조를 갖는다:
Figure pct00001
,
상기 식에서, R1은 C1-C6 알킬아민이다.
본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 이종 항산화 모이어티는 하이포타우린(hypotaurine)이다.
한 측면에서, 본 발명은 (i) 핵산 분자 및 (ii) 반응성 산소종의 분해를 유도할 수 있는 올리고머 단백질을 포함하는 이종 항산화 모이어티를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 올리고머 단백질은 카탈라제이다. 본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 카탈라제는 서열번호 1에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 이종 항산화 모이어티는 핵산 분자의 하나 이상의 뉴클레오티드의 전환(transversion)을 감소시킨다. 본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 전환은 퓨린에서 피리미딘으로의 점 돌연변이를 포함한다. 본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 전환은 구아닌에서 티민으로의 점 돌연변이를 포함하거나 그 반대를 포함한다. 본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 조성물이 약 47℃에서 약 8시간 동안 있을 때, 조성물은 이종 항산화 모이어티가 결여된 상응하는 대조군 조성물과 비교하여, 핵산 분자의 하나 이상의 뉴클레오티드의 감소된 전환을 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 그 이상 경험한다.
본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 조성물 중 이종 항산화 모이어티의 양은 약 0.1 밀리몰 내지 약 100 밀리몰이다. 본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 조성물 중 이종 항산화 모이어티의 양은 약 0.5 밀리몰 내지 약 50 밀리몰이다. 본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 조성물 중 이종 항산화 모이어티의 양은 약 1 밀리몰 내지 약 10 밀리몰이다.
본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 조성물 중 핵산 분자를 포함하는 핵산 분자 집단의 양은 약 10 나노몰 내지 약 10 마이크로몰이다. 본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 조성물 중 핵산 분자 집단의 양은 약 100 나노몰 내지 약 1 마이크로몰이다. 본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 조성물 중 핵산 분자 집단의 양은 약 100 나노몰 내지 약 300 나노몰이다.
본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 조성물은 혈장 샘플을 추가로 포함하고, 상기 혈장 샘플은 핵산 분자를 포함한다.
본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 조성물은 단리된 데옥시리보핵산(DNA) 샘플을 추가로 포함하고, 상기 단리된 DNA 샘플은 핵산 분자를 포함한다.
본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 조성물은 핵산 분석 샘플을 추가로 포함하고, 상기 핵산 분석 샘플은 핵산 분자를 포함한다. 본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 조성물은 핵산 분자의 풀로부터 핵산 분자를 포획하도록 설계된 하나 이상의 핵산 프로브를 추가로 포함한다.
본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 조성물은 (1) 핵산 리가제(nucleic acid ligase), (2) 핵산 폴리머라제(nucleic acid polymerase), 또는 (3) 핵산 분자의 적어도 일부의 시퀀싱을 위한 핵산 헬리카제(nucleic acid helicase)를 추가로 포함한다.
본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 무세포(cell-free) 핵산 분자이다.
본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 조성물은 생체외(ex vivo) 또는 시험관내(in vitro) 조성물이다.
본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 개체의 생물학적 샘플에서 유래한다. 본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 개체는 인간 개체이다. 본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 개체는 대조군과 비교하여 더 많은 산화 스트레스에 노출되었거나 노출된 것으로 의심된다.
한 측면에서, 본 발명은 (i) 핵산 분자 및 (ii) 설핀산 기를 포함하는 이종 항산화 모이어티를 혼합하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 이종 항산화 모이어티는 다음 구조를 갖는다:
Figure pct00002
,
상기 식에서, R1은 C1-C6 알킬아민이다.
본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 이종 항산화 모이어티는 하이포타우린이다.
한 측면에서, 본 발명은 (i) 핵산 분자 및 (ii) 반응성 산소종의 분해를 유도할 수 있는 올리고머 단백질을 포함하는 이종 항산화 모이어티를 혼합하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 올리고머 단백질은 카탈라제이다. 본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 카탈라제는 서열번호 1에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 이종 항산화 모이어티는 핵산 분자의 하나 이상의 뉴클레오티드의 전환을 감소시킨다. 본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 전환은 퓨린에서 피리미딘으로의 점 돌연변이를 포함한다. 본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 전환은 구아닌에서 티민으로의 점 돌연변이를 포함한다. 본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 핵산 분자 및 이종 항산화 모이어티를 포함하는 혼합물을 약 47℃에서 약 8시간 동안 처리할 때, 혼합물은, 이종 항산화 모이어티가 결여된 상응하는 대조군 조성물과 비교하여, 핵산 분자의 하나 이상의 뉴클레오티드의 감소된 전환을 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 그 이상 경험한다.
본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 혼합 시, 이종 항산화 모이어티의 양은 약 0.1 밀리몰 내지 약 100 밀리몰이다. 본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 혼합 시, 이종 항산화 모이어티의 양은 약 0.5 밀리몰 내지 약 50 밀리몰이다.
본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 혼합 시, 이종 항산화 모이어티의 양은 약 1밀리몰 내지 약 10밀리몰이다.
본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 혼합 시, 혼합물 중 핵산 분자를 포함하는 핵산 분자 집단의 양은 약 10 나노몰 내지 약 10 마이크로몰이다. 본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 혼합물 중 핵산 분자 집단의 양은 약 100 나노몰 내지 약 1 마이크로몰이다. 본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 혼합물 중 핵산 분자 집단의 양은 약 100 나노몰 내지 약 300 나노몰이다.
본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 방법은 (i) 핵산 분자를 포함하는 혈장 샘플 및 (ii) 설핀산 기를 포함하는 이종 항산화 모이어티를 혼합하는 단계를 포함한다.
본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 방법은 (i) 핵산 분자를 포함하는 단리된 데옥시리보핵산(DNA) 샘플 및 (ii) 설핀산 기를 포함하는 이종 항산화 모이어티를 혼합하는 단계를 포함한다.
본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 무세포 핵산 분자이다.
본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 혼합은 생체외 또는 시험관내 조성물에서 수행된다.
본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 개체의 생물학적 샘플에서 유래한다. 본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 개체는 인간 개체이다. 본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 개체는 대조군과 비교하여 더 많은 산화 스트레스에 노출되었거나 노출된 것으로 의심된다.
본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, (i) 핵산 분자 및 (ii) 이종 항산화 모이어티를 포함하는 혼합물을, 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일 동안 저장하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 방법은 혼합 전, 혼합과 동시에 또는 혼합 후에 하나 이상의 핵산 프로브를 통해 핵산 분자를 포획하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 방법은 혼합 후에 핵산 분자의 적어도 일부를 시퀀싱하는 단계를 추가로 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 장치의 표면에 커플링된 이종 항산화 모이어티를 포함하는, 핵산 분자를 고정하기 위한 장치를 제공하며, 이종 항산화 모이어티는 설핀산 기를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 반응 혼합물에서 반응성 산소종 스캐빈저 또는 효소를 이용하여 서열 라이브러리 제조를 수행하는 단계를 포함하는, 시퀀싱 라이브러리 제조 동안 발생하는 뉴클레오티드 전환을 완화하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 서열 포획 반응은 반응 혼합물에서 반응성 산소종 스캐빈저 하이포타우린을 이용하여 수행된다.
본원에 개시된 방법 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 반응성 산소종 스캐빈저는 글루타티온, 하이포타우린, 또는 아황산나트륨이고; 효소는 우라실-DNA 글리코실라제(UDG), 포름아미도피리미딘[fapy]-DNA 글리코실라제(FPG), 또는 카탈라제 효소이다.
본원 발명의 설명 및 청구범위는 다음의 도면 및 데이터 그래프를 참조하여 보다 완전하게 이해될 것이나, 이는 본 발명의 예시적인 실시예로서 제시된 것이고 본 발명의 범위의 완전한 인용으로 해석되어서는 안 된다.
도 1은 하나 이상의 반응성 산소종에 의한 산화적 손상으로부터 하나 이상의 핵산 분자를 보호하기 위한 조성물의 예를 제공한다.
도 2는 하나 이상의 반응성 산소종에 의한 산화적 손상으로부터 하나 이상의 핵산 분자를 보호하는 방법의 흐름도를 제공한다.
도 3은 시퀀싱 결과에서 순환성-종양 핵산 서열의 검출에 기초하여 개인에 대한 임상적 개입을 수행하는 프로세스의 흐름도를 제공한다.
도 4a는 다양한 화학적 또는 효소적 제품으로 처리된 샘플에서 오류율 (및 발생하는 오류의 상응하는 유형)을 식별하는 차트를 제공한다. 도 4B는 생체 내 담배 연기 또는 시험관 내 반응성 산소종(ROS)의 발암 물질들이 DNA에 손상을 주어 8-옥소구아닌을 생성하고, 그 결과 G>T 전환이 생성되는 화학적 메커니즘을 보여주는 다이어그램 (도 4B, 상단), 및 ROS 스캐빈저의 첨가가 시험관 내에서 산화적-손상-유래 G>T 인공물을 감소시키는 제안된 메커니즘을 보여주는 다른 다이어그램(도 4B, 하단)을 제공한다.
도 5는 대립형질 수준의 검출을 위한 민감도를 개선하기 위해, 고유하고 성공적으로 시퀀싱된 cfDNA 분자의 수율을 최대화하는 동시에 연관된 시퀀싱 오류 프로파일을 최소화하기 위해 몇 가지 방법론이 개발되고 테스트되었음을 보여준다.
도 6은 하이포타우린이 존재 또는 부재한 건강한 성인의 cfDNA 샘플의 오류 프로파일을 비교했을 때, ROS 스캐빈저로 포획된 샘플이 상당히 낮은 백그라운드 오류율과 더 적은 G>T 오류를 가짐이 관찰되었음을 보여준다. 하이브리드 포획 반응에 존재하는 ROS 스캐빈저 하이포타우린의 존재 또는 부재에서 포획된 건강한 대조군 cfDNA 샘플(n = 12개 개체)에서 염기 치환 분포의 비교가 표시된다(도 6, 좌측). paired two-sided t-test (P < 1 Х 10-8)을 사용하여 G>T 전환에 해당하는 오류 수를 비교하였다. 또한 전체 선택기(aggregate selector) 전체에서 중복 제거되지 않은(도 6, 중간) 및 중복 제거된(도 6, 우측) 백그라운드 오류율이 표시하였고 이들 결과는 도 6(좌측)에 요약되어 있다.
도 7은 하이포타우린의 부재에서 포획된 대조군 cfDNA 샘플과 비교하여 ROS 스캐빈저를 이용하여 포획된 건강한 대조군 cfDNA 샘플에서 G>T 오류의 상대적 감소 (모든 오류의 16% vs 57%, Wilcoxon rank-sum test, P < 1x10-8) 및 백그라운드 오류율의 상대적 감소(약 50% 감소, Wilcoxon rank-sum test, P < 0.0001)가 관찰되었다. 도 7 (좌측)은 하이브리드 포획 반응에서 ROS 스캐빈저 하이포타우린이 있거나 (존재; 하단, n = 104) 없는 (부재; 상단, n = 69) 상태에서 cfDNA 샘플이 프로파일링된 건강한 대조군의 2개 코호트 전반에 걸쳐 선택기(selector)-전체에서 중복 제거된 백그라운드 오류율과 염기 치환 분포를 비교한 결과를 나타낸다. 또한 도 7(우측)은 도 7(좌측)의 결과를 요약한 것으로, 전체 선택기 전체에서의 오류율을 보여준다.
본 발명의 다양한 구현예들이 본원에 기술 및 언급되었지만, 당해 기술 분야의 당업자라면 이러한 구현예들이 단순 예로서 제공된다는 것이 자명할 것이다. 당해 기술 분야의 당업자라면 본 발명으로부터 이탈하지 않으면서 수많이 변형, 변화 및 치환을 행할 수 있다. 본원에 기술된 본 발명의 구현예에 대한 다양한 대안들 역시 채택 가능한 것으로 이해하여야 한다.
본원에 사용된 용어 "항산화 모이어티(antioxidant moiety)"는 일반적으로, 반응성 산소종(ROS)의 활성을 환원 또는 중화시키는 (예를 들어, 자유 라디칼과 반응하여 중화할 수 있음) 분자 (예를 들어, 하나 이상의 소분자, 폴리펩티드 등) 또는 복수의 분자들의 복합체 (예를 들어, 올리고머 단백질)를 지칭한다. 항산화 모이어티는 반응성 산소종(ROS)의 스캐빈저, 예를 들어 ROS와 반응하여 다른 분자로 변형할 수 있는 소분자일 수 있다. 항산화 모이어티는 ROS를 분해할 수 있는 (또는 이러한 분해를 촉매할 수 있는) 단백질 (예를 들어, 효소)일 수 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 바와 같은 항산화제 모이어티의 존재는 ROS에 의해 수행되는 세포 손상을 감소 또는 억제할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 바와 같은 항산화제 모이어티의 존재는 표적 분자, 예컨대 핵산 분자 (예를 들어, 무세포 핵산 분자)에 대한 ROS-매개 손상을 감소 또는 억제할 수 있다.
본원에서 상호교환가능하게 사용되는 용어 "올리고머 단백질" 또는 "올리고머 폴리펩티드"는 일반적으로, 2개 이상의 폴리펩티드 분자 (또는 서브유닛)를 포함하는 폴리펩티드 복합체를 지칭하며, 상기 서브유닛은 (예를 들어, 비공유 상호작용을 통해) 서로 복합체를 형성하여 폴리펩티드 복합체를 형성한다. 이러한 폴리펩티드 복합체는 단일 서브유닛의 것보다 더 큰 정도로 특이적 활성 (예를 들어, 효소 활성)을 나타낼 수 있다. 일부 경우에, 복수의 서브유닛은 동일할 수 있다(예를 들어, 동종-올리고머 단백질). 일부 경우에, 복수의 서브유닛은 상이할 수 있다(예를 들어, 이종-올리고머 단백질). 일부 경우에, 올리고머 단백질은 이량체, 삼량체, 사량체 등일 수 있다.
본원에서 상호교환가능하게 사용되는 용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드" 또는 "올리고뉴클레오티드"는 일반적으로, 단일-, 이중- 또는 다중-가닥 형태 중 어느 하나의, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 이들의 유사체인, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 핵산 분자는 세포에 대해 외인성일 수 있다. 핵산 분자는 무세포(cell-free) 환경에 존재할 수 있다. 핵산 분자는 유전자, 이의 단편, 또는 이의 유도체(예를 들어, 증폭된 카피)일 수 있다. 핵산 분자는 DNA일 수 있다. 핵산 분자의 비-제한적인 예는 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비-코딩 영역, 연결 분석으로부터 정의된 유전자좌 (locus), 엑손, 인트론, 메신저 RNA (mRNA), 전달 RNA (tRNA), 리보솜 RNA (rRNA), 짧은 간섭 RNA (siRNA), 짧은-헤어핀 RNA (shRNA), 마이크로 RNA (miRNA), 리보자임, 상보적 DNA (cDNA), 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지형 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 무세포 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 무세포 DNA (cfDNA) (예를 들어, 종양 cfDNA, 태아(fetal) cfDNA, 태아기(prenatal) cfDNA 등), 무세포 RNA(cfRNA)), 핵산 프로브 및 프라이머를 포함한다.
조성물
한 측면에서, 본 발명은 (i) 핵산 분자 및 (ii) 이종 항산화 모이어티를 포함하는 조성물을 제공한다. 이종 항산화 모이어티는 하나 이상의 반응성 산소종(ROS)에 의한 산화적 손상으로부터 핵산 분자를 보호하도록 구성될 수 있다. 핵산 분자 및 이종 항산화 모이어티는 개체(예를 들어, 환자)의 동일한 생물학적 샘플에서 유래하지 않을 수 있다. 핵산 분자와 이종 항산화 모이어티는 동일한 공급원에서 유래하지 않을 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자와 이종 항산화 모이어티는 자연적으로 함께 발견되지 않을 수 있다.
도 1은 하나 이상의 ROS에 의한 산화적 손상으로부터 하나 이상의 핵산 분자(예를 들어, cfDNA 또는 cfRNA)를 보호하기 위한 예시적인 조성물(100)을 도시한다. 조성물(100)은 하나 이상의 핵산 분자(110)를 포함할 수 있다. 조성물은 산화적 손상으로부터 하나 이상의 핵산 분자(110)를 보호하도록 구성된 하나 이상의 이종 항산화 모이어티(120)를 추가로 포함할 수 있다.
이종 항산화 모이어티 화합물
일부 실시양태에서, 이종 항산화 모이어티는 하나 이상의 항산화 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 항산화 화합물은 비-단백질성일 수 있다. 항산화 화합물의 비-제한적인 예는 베타-카로틴, 비타민 C, 비타민 E, 셀레늄, 유비퀴논, 루에틴, 토코트리에놀, 이소플라본, S-아데노실메티오닌, 글루타티온, 타우린, N-아세틸시스테인, 리포산, L-카르니틴, 아스타잔틴, 헤스페리딘, 루테인, 리코펜, 폴리페놀, 제아잔틴 및 아황산나트륨을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 이종 항산화 모이어티는 설피닐 기를 포함할 수 있다. 이종 항산화 모이어티는 설피닐기-함유 화합물일 수 있다. 일부 예에서, 이종 항산화 모이어티는 설피닐 기를 포함하는 화합물일 수 있다. 상기 화합물은 적어도 또는 최대 1개의 설피닐 기, 적어도 또는 최대 2개의 설피닐 기, 적어도 또는 최대 3개의 설피닐 기, 적어도 또는 최대 4개의 설피닐 기, 적어도 또는 최대 5개의 설피닐 기, 적어도 또는 최대 6개의 설피닐 기, 적어도 또는 최대 7개의 설피닐 기, 적어도 또는 최대 8개의 설피닐 기, 적어도 또는 최대 9개의 설피닐 기, 또는 적어도 또는 최대 10개의 설피닐 기를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 이종 항산화 모이어티는 다음 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00003
,
상기 식에서, R1 은 치환기이고, R2는 치환기이다.
일부 경우에, 이종 항산화 모이어티는 설핀산 기를 포함할 수 있다. 이종 항산화 모이어티는 설핀산 기-함유 화합물일 수 있다. 일부 예에서, 이종 항산화 모이어티는 설핀산 기를 포함하는 화합물일 수 있다. 화합물은 적어도 또는 최대 1개의 설핀산 기, 적어도 또는 최대 2개의 설핀산 기, 적어도 또는 최대 3개의 설핀산 기, 적어도 또는 최대 4개의 설핀산 기, 적어도 또는 최대 5개의 설핀산 기, 설핀산 기, 적어도 또는 최대 6개의 설핀산 기, 적어도 또는 최대 7개의 설핀산 기, 적어도 또는 최대 8개의 설핀산 기, 적어도 또는 최대 9개의 설핀산 기, 또는 적어도 또는 최대 10개의 설핀산 기를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 이종 항산화 모이어티는 다음 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00004
,
상기 식에서, R1 은 치환기이다. 일부 예에서, R1 은 알킬아민이다. 일부 예에서, R1 은 C1-C6 알킬아민이다. 일부 예에서, R1 은C1-C4 알킬아민이다.
일부 경우에, 이종 항산화 모이어티는 타우린 합성 (예를 들어, 시스테인으로부터의 생합성)의 중간체일 수 있다. 일부 경우에, 이종 항산화 모이어티는 다음 구조를 갖는 하이포타우린일 수 있다:
Figure pct00005
본 명세서에 개시된 바와 같은 이종 항산화 모이어티 화합물은 이의 모든 입체이성질체, 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 혼합물, 라세미체, 회전장애이성질체 및 호변이성질체를 포함할 수 있다.
선택적 치환기의 비-제한적인 예는 히드록실기, 술프히드릴기, 할로겐, 아미노기, 니트로기, 니트로소기, 시아노기, 아지도기, 술폭시드기, 술폰기, 술폰아미드기, 카르복실기, 카르복스알데히드기, 이민기, 알킬기, 할로-알킬기, 알케닐기, 할로-알케닐기, 알키닐기, 할로-알키닐기, 알콕시기, 아릴기, 아릴옥시기, 아랄킬기, 아릴알콕시기, 헤테로사이클릴기, 아실기, 아실옥시기, 카바메이트기, 아미드기, 우레이도기, 에폭시기 및 에스테르기를 포함한다.
이종 항산화 모이어티의 추가적인 예는 n-옥틸설핀산; 프로판설핀산; 2-푸란설핀산; 시스테인설핀산; F-옥탄설핀산; 2-프로판설핀산; 퓨린-6-설핀산; 1-헵탄설핀산; 1-펜탄설핀산; L-시스테인설핀산; 2-나프틸설핀산; 피페리딘설핀산; 3-피리딘설핀산; 4-피리딘설핀산; 1-나프틸설핀산; ω-D-캄포르설핀산; 크로몬-3-설핀산; 사이클로헥산설핀산; 부트-2-엔-2-설핀산; 티오펜-2-설핀산; 4-모르폴린설핀산; 티오펜-2-설핀산; 피리미딘-2-설핀산; 2-클로로에틸설핀산; 3-아미노프로판설핀산; l-호모시스테인설핀산; 노르켈린-6-설핀산; 인단-1-온-6-설핀산; 에틸 설핀산 클로라이드; 2-벤조티아졸설핀산; 4-클로로벤젠설핀산; 아세나프텐-3-설핀산; 퍼플루오로부탄설핀산; 2-아미노(H)에탄설핀산; 2-이미다졸린-2-일설핀산; 에탄설핀산 나트륨염; 1-메틸피롤-2-설핀산; 1-메틸피롤-3-설핀산; 3-메틸-부탄-1-설핀산; 2-메틸-1-프로판설핀산; 4-아미노-톨루엔-2-설핀산; 3-니트로-톨루엔-4-설핀산; 2-메틸프로판-2-설핀산; 2-에틸헥스-1-엔-1-설핀산; 2-부틸논-1-엔-1-설핀산; 나트륨, 7H-퓨린-6-설핀산; 1-옥탄술폰-2-설핀산; 1H-벤즈이미다졸-2-설핀산; 클로로 설핀산 메틸 에스테르; P-톨루엔 설핀산 아연염; 톨루엔-4-설핀산-무수물; 1-메틸이미다졸-2-설핀산; 2-나프틸설핀산 나트륨염; 부탄-1-설핀산 에틸 에스테르; 2'-히드록시비페닐-2-설핀산; 톨루엔-4-설핀산 부틸 에스테르; 2-피리딘설핀산나트륨염; 5-메틸셀레노펜-2-설핀산; 8-니트로-나프탈렌-1-설핀산; 6-메틸나프탈렌-2-설핀산; 푸란-2-설핀산, 리튬염; 프로판-2-설핀산 메틸 에스테르; 톨루엔-4-설핀산 메틸 에스테르; 프로판-1-설핀산 메틸 에스테르; 톨루엔-4-설핀산 페닐 에스테르; 톨루엔-4-설핀산 벤질 에스테르; 4-클로로벤젠설핀산나트륨; 2-클로로-5-니트로벤젠설핀산; 5-클로로-나프탈렌-1-설핀산; 2-프로펜-1-설핀산, 에틸 에스테르; 3-옥소-3-페닐프로판-1-설핀산; 4,6-디아미노피리미딘-2-설핀산; 6-아세틸아미노-톨루엔-3-설핀산; 6-메틸-4-옥소크로멘-3-설핀산; 2,1,3-벤조티아디아졸-4-설핀산; 톨루엔-4-설핀산 사이클로헥실아미드; 톨루엔-4-설핀산, 암모늄염; 벤조푸란-2-설핀산 리튬염; 벤조-2,1,3-티아디아졸-4-설핀산; 톨루엔-4-설핀산 벤즈히드릴 에스테르; 나프탈렌-2-설핀산 메틸 에스테르; 나프탈렌-1-설핀산 메틸 에스테르; 3-클로로벤젠설핀산나트륨염; 3,5-디메틸-1,2-옥사졸-4-설핀산; 2-클로로-5-니트로-톨루엔-4-설핀산; 1H-퓨린-6-설핀산, 일나트륨염; 2-아세트아미도아니솔-4-설핀산, 수화물; 5-디메틸아미노나프탈렌-1-설핀산; 벤조티아졸-2-설핀산 디메틸아미드; 2-메틸-8-니트로-나프탈렌-1-설핀산; 2-메틸-5-니트로-나프탈렌-1-설핀산; 3-옥소-3-티오펜-2-일프로판-1-설핀산; 4-아세트아미도-2,6-디메틸벤젠설핀산; 3-(tert-부톡시)-3-옥소프로판-1-설핀산; 2-메틸-프로판-1-설핀산 메틸 에스테르; 2-메틸-프로판-2-설핀산 메틸 에스테르; p-톨루엔설핀산; (R)-(+)-2-메틸-프로판-2-설핀산 아미드; 4-브로모-2,1,3-벤조티아디아졸-7-설핀산; 톨루엔-4-설핀산-(1-메틸-헵틸 에스테르); 2-부텐-1-설핀산, 4-페닐-, 메틸 에스테르; 3-포르밀-1H-인돌-2-설핀산 메틸 에스테르; 3-옥소-3-(페네틸아미노)프로판-1-설핀산; 나트륨, 2-아세트아미도-1,3-티아졸-5-설핀산; 3-(4-메톡시페닐)-3-옥소프로판-1-설핀산; 2,5-디클로로티오펜-3-설핀산 나트륨염; 3-트리플루오로메틸페닐설핀산나트륨염; 2,5-디클로로티오펜-3-설핀산 나트륨염; 설핀산, 2-클로로-5-니트로벤젠-, 나트륨염; 7-옥텐-1-설핀산, 2-옥소-2-페닐에틸 에스테르; 9,10-디옥소-9,10-디히드로-안트라센-1-설핀산; 4-아미노-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-설핀산; 2-히드록시-트리데칸-1-설핀산 4-메틸-아닐리드; 2-메틸-프로판-2-설핀산 사이클로헥실리덴아미드; 1,1,2,2,3,3,4,4,4-노나플루오로-부탄-1-설핀산 아미드; 4-클로로-1,1,2,2,3,3,4,4-옥타플루오로부탄-1-설핀산; (1R)-2-메틸-프로판-2-설핀산 4-플루오로-벤질리덴아미드; 2-메틸-프로판-2-설핀산 1-p-톨릴-메트-(E)-일리덴아미드; (R,R)-2-메틸프로판-2-설핀산 1-(나프탈렌-1-일)에틸아미드; 및 톨루엔-설핀산-(4)-(1-페닐-에틸 에스테르)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 임의의 화합물은 정제될 수 있다. 본원의 화합물은 적어도 1% 순수, 적어도 2% 순수, 적어도 3% 순수, 적어도 4% 순수, 적어도 5% 순수, 적어도 6% 순수, 적어도 7% 순수, 적어도 8% 순수, 적어도 9% 순수, 적어도 10% 순수, 적어도 11% 순수, 적어도 12% 순수, 적어도 13% 순수, 적어도 14% 순수, 적어도 15% 순수, 적어도 16% 순수, 적어도 17% 순수, 적어도 18% 순수, 적어도 19% 순수, 적어도 20% 순수, 적어도 21% 순수, 적어도 22% 순수, 적어도 23% 순수, 적어도 24% 순수, 적어도 25% 순수, 적어도 26% 순수, 적어도 27% 순수, 적어도 28% 순수, 적어도 29% 순수, 적어도 30% 순수, 적어도 31% 순수, 적어도 32% 순수, 적어도 33% 순수, 적어도 34% 순수, 적어도 35% 순수, 적어도 36% 순수, 적어도 37% 순수, 적어도 38% 순수, 적어도 39% 순수, 적어도 40% 순수, 적어도 41% 순수, 적어도 42% 순수, 적어도 43% 순수, 적어도 44% 순수, 적어도 45% 순수, 적어도 46% 순수, 적어도 47% 순수, 적어도 48% 순수, 적어도 49% 순수, 적어도 50% 순수, 적어도 51% 순수, 적어도 52% 순수, 적어도 53% 순수, 적어도 54% 순수, 적어도 55% 순수, 적어도 56% 순수, 적어도 57% 순수, 적어도 58% 순수, 적어도 59% 순수, 적어도 60% 순수, 적어도 61% 순수, 적어도 62% 순수, 적어도 63% 순수, 적어도 64% 순수, 적어도 65% 순수, 적어도 66% 순수, 적어도 67% 순수, 적어도 68% 순수, 적어도 69% 순수, 적어도 70% 순수, 적어도 71% 순수, 적어도 72% 순수, 적어도 73% 순수, 적어도 74% 순수, 적어도 75% 순수, 적어도 76% 순수, 적어도 77% 순수, 적어도 78% 순수, 적어도 79% 순수, 적어도 80% 순수, 적어도 81% 순수, 적어도 82% 순수, 적어도 83% 순수, 적어도 84% 순수, 적어도 85% 순수, 적어도 86% 순수, 적어도 87% 순수, 적어도 88% 순수, 적어도 89% 순수, 적어도 90% 순수, 적어도 91% 순수, 적어도 92% 순수, 적어도 93% 순수, 적어도 94% 순수, 적어도 95% 순수, 적어도 96% 순수, 적어도 97% 순수, 적어도 98% 순수, 적어도 99% 순수, 적어도 99.1% 순수, 적어도 99.2% 순수, 적어도 99.3% 순수, 적어도 99.4% 순수, 적어도 99.5% 순수, 적어도 99.6% 순수, 적어도 99.7% 순수, 적어도 99.8% 순도, 또는 적어도 99.9% 순수할 수 있다.
허용되는 염
본원에 기재된 임의의 치료 화합물은 염(예를 들어, 약학적으로 허용되는 염)의 형태로 제공될 수 있다. 허용되는 염은 예를 들어 산-부가염 및 염기-부가염을 포함한다. 산-부가염을 형성하기 위해 화합물에 첨가되는 산은 유기산 또는 무기산일 수 있다. 염기 부가 염을 형성하기 위해 화합물에 첨가되는 염기는 유기 염기 또는 무기 염기일 수 있다. 일부 경우에, 허용되는 염이 금속염이다. 일부 경우에, 허용되는 염이 암모늄 염이다.
금속 염은 무기 염기를 본 발명의 화합물에 첨가함으로써 발생할 수 있다. 무기 염기는 예를 들어 수산화물, 탄산염, 중탄산염 또는 인산염과 같은 염기성 반대 이온과 쌍을 이루는 금속 양이온으로 구성된다. 금속은 알칼리 금속, 알칼리 토금속, 전이 금속 또는 주족 금속일 수 있다. 일부 경우에, 금속은 리튬, 나트륨, 칼륨, 세슘, 세륨, 마그네슘, 망간, 철, 칼슘, 스트론튬, 코발트, 티타늄, 알루미늄, 구리, 카드뮴 또는 아연이다.
일부 경우에, 금속염은 리튬염, 나트륨염, 칼륨염, 세슘염, 세륨염, 마그네슘염, 망간염, 철염, 칼슘염, 스트론튬염, 코발트염, 티탄염, 알루미늄염, 구리염, 카드뮴염 또는 아연염일 수 있다.
암모늄 염은 암모니아 또는 유기 아민을 본 발명의 화합물에 첨가함으로써 발생할 수 있다. 일부 경우에, 유기 아민은 트리에틸 아민, 디이소프로필 아민, 에탄올 아민, 디에탄올 아민, 트리에탄올 아민, 모르폴린, N-메틸모르폴린, 피페리딘, N-메틸피페리딘, N-에틸피페리딘, 디벤질아민, 피페라진, 피리딘, 피라졸, 피피라졸, 이미다졸, 피라진 또는 피피라진이다.
일부 경우에, 암모늄 염은 트리에틸 아민 염, 디이소프로필 아민 염, 에탄올 아민 염, 디에탄올 아민 염, 트리에탄올 아민 염, 모르폴린 염, N-메틸모르폴린 염, 피페리딘 염, N-메틸피페리딘염, N-에틸피페리딘염, 디벤질아민염, 피페라진염, 피리딘염, 피라졸염, 피피라졸염, 이미다졸염, 피라진염 또는 피피라진염이다.
산 부가 염은 본 발명의 화합물에 산을 첨가함으로써 발생할 수 있다. 일부 경우에, 산은 유기물이다. 일부 경우에, 산은 무기물이다. 일부 경우에, 산은 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 질산, 아질산, 황산, 아황산, 인산, 이소니코틴산, 락트산, 살리실산, 타르타르산, 아스코르브산, 겐티신산, 글루콘산, 글루카론산, 사카린산, 포름산, 벤조산, 글루탐산, 판토텐산, 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 푸마르산, 숙신산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산, 시트르산, 옥살산 또는 말레산이다.
일부 경우에, 염은 염산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염, 질산염, 아질산염, 황산염, 아황산염, 인산염, 이소니코틴산염, 락테이트염, 살리실레이트염, 타르트레이트염, 아스코르베이트염, 겐티시네이트염, 글루코네이트염, 글루카로네이트염, 사카레이트염, 포르메이트염, 벤조에이트염, 글루타메이트염, 판토테네이트염, 아세테이트염, 프로피오네이트염, 부티레이트염, 푸마레이트염, 숙시네이트염, 메탄술포네이트 (메실레이트)염, 에탄술포네이트염, 벤젠술포네이트염, p-톨루엔술포네이트염, 시트레이트염, 옥살레이트염 또는 말레에이트염이다.
이종 항산화 모이어티 단백질
일부 경우에, 이종 항산화 모이어티는 반응성 산소종의 분해를 수행 (예를 들어, 유도)할 수 있는 폴리펩티드 (예를 들어, 효소와 같은 단백질)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 효소적 이종 항산화 모이어티는 과산화수소의 물과 산소로의 분해를 촉매할 수 있다. 이러한 효소적 이종 항산화 모이어티의 비-제한적인 예는 우라실-DNA 글리코실라제(UDG), 포름아미도피리미딘 [fapy]-DNA 글리코실라제 (FPG), 카탈라제, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제, 글루타티온 퍼옥시다제, 글루타티온 리덕타제, 및 글루타티온 S-트랜스퍼라제를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 이종 항산화 모이어티는, 폴리펩티드가 과산화수소와 반응하도록 하는 하나 이상의 철-함유 헴(heme) 기를 포함할 수 있다. 이종 항산화 모이어티는 적어도 또는 최대 약 1개의 철-함유 헴 기, 적어도 또는 최대 약 2개의 철-함유 헴 기, 적어도 또는 최대 약 3개의 철-함유 헴 기, 적어도 또는 최대 약 4개의 철-함유 헴 기, 적어도 또는 최대 약 5개의 철-함유 헴 기, 적어도 또는 최대 약 6개의 철-함유 헴 기, 적어도 또는 최대 약 7개의 철-함유 헴 기, 적어도 또는 최대 약 8개의 철-함유 헴 기, 적어도 또는 최대 약 9개의 철-함유 헴 기, 또는 적어도 또는 최대 약 10개의 철-함유 헴 기를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 폴리펩티드 기반 이종 항산화 모이어티는 반응성 산소종의 분해를 수행할 수 있는 올리고머 단백질을 포함할 수 있다. 올리고머 단백질은 서브유닛으로서 2개 이상의 폴리펩티드 분자를 포함할 수 있고, 상기 서브유닛은 반응성 산소종의 분해에 영향을 미칠 수 있는 복합체를 집합적으로 형성한다. 올리고머 단백질은 서브유닛으로서 적어도 또는 최대 약 2개, 적어도 또는 최대 약 3개, 적어도 또는 최대 약 4개, 적어도 또는 최대 약 5개, 또는 적어도 또는 최대 약 6개의 폴리펩티드 분자를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 올리고머 단백질-기반의 이종 항산화 모이어티는 4개의 서브유닛을 포함하는 사량체일 수 있다. 사량체의 4개 서브유닛의 각 서브유닛은 동일할 수 있다. 대안적으로, 사량체의 4개의 서브유닛의 제1 서브유닛은 사량체의 4개의 서브유닛의 제2 서브유닛과 상이할 수 있다. 일부 예에서, 올리고머 단백질은 카탈라아제 또는 이의 기능적 변이체일 수 있다. 카탈라제의 서브유닛 폴리펩티드 분자는 인간 카탈라아제(서열번호 1)에 대해 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 서열 동일성, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 의 서열 동일성을 가질 수 있다
서열번호 1:
MADSRDPASD QMQHWKEQRA AQKADVLTTG AGNPVGDKLN VITVGPRGPL
LVQDVVFTDE MAHFDRERIP ERVVHAKGAG AFGYFEVTHD ITKYSKAKVF
EHIGKKTPIA VRFSTVAGES GSADTVRDPR GFAVKFYTED GNWDLVGNNT
PIFFIRDPIL FPSFIHSQKR NPQTHLKDPD MVWDFWSLRP ESLHQVSFLF
SDRGIPDGHR HMNGYGSHTF KLVNANGEAV YCKFHYKTDQ GIKNLSVEDA
ARLSQEDPDY GIRDLFNAIA TGKYPSWTFY IQVMTFNQAE TFPFNPFDLT
KVWPHKDYPL IPVGKLVLNR NPVNYFAEVE QIAFDPSNMP PGIEASPDKM
LQGRLFAYPD THRHRLGPNY LHIPVNCPYR ARVANYQRDG PMCMQDNQGG
APNYYPNSFG APEQQPSALE HSIQYSGEVR RFNTANDDNV TQVRAFYVNV
LNEEQRKRLC ENIAGHLKDA QIFIQKKAVK NFTEVHPDYG SHIQALLDKY
NAEKPKNAIH TFVQSGSHLA AREKANL
조성물의 추가적인 측면
본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 이종 항산화 모이어티는 핵산 분자의 하나 이상의 뉴클레오티드의 변경(예를 들어, 돌연변이, 예를 들어, 전환 또는 전이)을 감소시킬 수 있다. 일부 경우에, 이종 항산화 모이어티는 핵산 분자의 하나 이상의 뉴클레오티드의 전환을 감소시킬 수 있다. 전환은 단일 퓨린(A 또는 G)이 피리미딘(T 또는 C)으로 변경되거나 그 반대의 경우인 핵산 분자의 편집(예를 들어, 점 돌연변이)일 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 이러한 전환은 (i) 구아닌에서 티민으로, 또는 그 반대로, (ii) 구아닌에서 시토신으로, 또는 그 반대로, (iii) 아데닌에서 시토신으로, 또는 그 반대로, 또는 (iv) 아데닌에서 티민으로 또는 그 반대로의 전환일 수 있다. 예를 들어, 이종 항산화 모이어티는 구아닌에서 티민으로 또는 그 반대로 하나 이상의 뉴클레오티드의 전환을 감소시킬 수 있다.
본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 조성물이 일정 기간(예를 들어, 미리 정해진 기간) 동안 실온(약 25℃) 이상 온도에 있을 때, 조성물은, 이종 항산화 모이어티가 결여된 상응하는 대조군 조성물과 비교하여, 핵산 분자의 하나 이상의 뉴클레오티드의 감소된 전환을 적어도 또는 최대 약 5%, 적어도 또는 최대 약 10%, 적어도 또는 최대 약 15%, 적어도 또는 최대 약 20%, 적어도 또는 최대 약 25%, 적어도 또는 최대 약 30%, 적어도 또는 최대 약 35%, 적어도 또는 최대 약 40%, 적어도 또는 최대 약 45%, 적어도 또는 최대 약 50%, 적어도 또는 최대 약 약 55%, 적어도 또는 최대 약 60%, 적어도 또는 최대 약 약 65%, 적어도 또는 최대 약 70%, 적어도 또는 최대 약 75%, 적어도 또는 최대 약 80%, 적어도 또는 최대 약 85%, 적어도 또는 최대 약 90%, 적어도 또는 최대 약 95%, 적어도 또는 최대 약 99%, 또는 약 100% 경험할 수 있다.
일부 경우에, 감소된 전환은, 조성물 및 상응하는 대조군 조성물이 각각 적어도 또는 최대 약 30℃, 적어도 또는 최대 약 35℃, 적어도 또는 최대 약 35℃, 적어도 또는 최대 약 40℃, 적어도 또는 최대 약 45℃, 적어도 또는 최대 약 50℃, 적어도 또는 최대 약 55℃, 적어도 또는 최대 약 60℃, 적어도 또는 최대 약 65℃, 적어도 또는 최대 약 70℃, 적어도 또는 최대 약 75℃, 적어도 또는 최대 약 80℃, 적어도 또는 최대 약 85℃, 또는 적어도 또는 최대 약 90℃ 의 온도에 있을 때 관찰될 수 있다. 예를 들어, 감소된 전환은 조성물 및 상응하는 대조군 조성물이 각각 약 47℃일 때 관찰될 수 있다.
일부 경우에, 감소된 전환은, 조성물 및 상응하는 대조군 조성물이 각각 적어도 또는 최대 약 5분, 적어도 또는 최대 약 10분, 적어도 또는 최대 약 15분, 적어도 또는 최대 약 20분, 적어도 또는 최대 약 25분, 적어도 또는 최대 약 30분, 적어도 또는 최대 약 40분, 적어도 또는 최대 약 50분, 적어도 또는 최대 약 60분, 적어도 또는 최대 약 2시간, 적어도 또는 최대 약 3시간, 적어도 또는 최대 약 6시간, 적어도 또는 최대 약 12시간, 적어도 또는 최대 약 18시간, 적어도 또는 최대 약 24시간, 적어도 또는 최대 약 36시간, 적어도 또는 최대 약 48시간, 적어도 또는 최대 약 60시간, 또는 적어도 또는 최대 약 72시간 동안 온도(또는 온도 범위)에 있을 때 관찰될 수 있다.
일부 경우에, 감소된 전환은 조성물 및 상응하는 대조군 조성물이 각각 약 1시간 내지 약 96시간 동안 온도(또는 온도 범위)에 있을 때 관찰될 수 있다. 감소된 전환은 조성물 및 상응하는 대조군 조성물이 각각 적어도 약 1시간 동안 온도(또는 온도 범위)에 있을 때 관찰될 수 있다. 감소된 전환은 조성물 및 상응하는 대조군 조성물이 각각 최대 약 96시간 동안 온도(또는 온도 범위)에 있을 때 관찰될 수 있다. 감소된 전환은 조성물 및 상응하는 대조군 조성물이 각각 약 1 시간 내지 약 2 시간, 약 1 시간 내지 약 4 시간, 약 1 시간 내지 약 8 시간, 약 1 시간 내지 약 12 시간, 약 1 시간 내지 약 16 시간, 약 1 시간 내지 약 20 시간, 약 1 시간 내지 약 24 시간, 약 1 시간 내지 약 36 시간, 약 1 시간 내지 약 48 시간, 약 1 시간 내지 약 72 시간, 약 1 시간 내지 약 96 시간, 약 2 시간 내지 약 4 시간, 약 2 시간 내지 약 8 시간, 약 2 시간 내지 약 12 시간, 약 2 시간 내지 약 16 시간, 약 2 시간 내지 약 20 시간, 약 2 시간 내지 약 24 시간, 약 2 시간 내지 약 36 시간, 약 2 시간 내지 약 48 시간, 약 2 시간 내지 약 72 시간, 약 2 시간 내지 약 96 시간, 약 4 시간 내지 약 8 시간, 약 4 시간 내지 약 12 시간, 약 4 시간 내지 약 16 시간, 약 4 시간 내지 약 20 시간, 약 4 시간 내지 약 24 시간, 약 4 시간 내지 약 36 시간, 약 4 시간 내지 약 48 시간, 약 4 시간 내지 약 72 시간, 약 4 시간 내지 약 96 시간, 약 8 시간 내지 약 12 시간, 약 8 시간 내지 약 16 시간, 약 8 시간 내지 약 20 시간, 약 8 시간 내지 약 24 시간, 약 8 시간 내지 약 36 시간, 약 8 시간 내지 약 48 시간, 약 8 시간 내지 약 72 시간, 약 8 시간 내지 약 96 시간, 약 12 시간 내지 약 16 시간, 약 12 시간 내지 약 20 시간, 약 12 시간 내지 약 24 시간, 약 12 시간 내지 약 36 시간, 약 12 시간 내지 약 48 시간, 약 12 시간 내지 약 72 시간, 약 12 시간 내지 약 96 시간, 약 16 시간 내지 약 20 시간, 약 16 시간 내지 약 24 시간, 약 16 시간 내지 약 36 시간, 약 16 시간 내지 약 48 시간, 약 16 시간 내지 약 72 시간, 약 16 시간 내지 약 96 시간, 약 20 시간 내지 약 24 시간, 약 20 시간 내지 약 36 시간, 약 20 시간 내지 약 48 시간, 약 20 시간 내지 약 72 시간, 약 20 시간 내지 약 96 시간, 약 24 시간 내지 약 36 시간, 약 24 시간 내지 약 48 시간, 약 24 시간 내지 약 72 시간, 약 24 시간 내지 약 96 시간, 약 36 시간 내지 약 48 시간, 약 36 시간 내지 약 72 시간, 약 36 시간 내지 약 96 시간, 약 48 시간 내지 약 72 시간, 약 48 시간 내지 약 96 시간, 또는 약 72 시간 내지 약 96 시간 동안 온도(또는 온도 범위)에 있을 때 관찰될 수 있다. 감소된 전환은, 조성물 및 상응하는 대조군 조성물이 각각 약 1시간, 약 2시간, 약 4시간, 약 8시간, 약 12시간, 약 16시간, 약 20시간, 약 24시간, 약 36시간, 약 48시간, 약 72시간, 또는 약 96시간 동안 온도(또는 온도 범위)에 있을 때 관찰될 수 있다. 예를 들어, 감소된 전환은 조성물 및 상응하는 대조군 조성물이 각각 약 16시간 동안 온도(또는 온도 범위)에 있을 때 관찰될 수 있다. 다른 예에서, 감소된 전환은 조성물 및 상응하는 대조군 조성물이 각각 약 48시간 동안 온도(또는 온도 범위)에 있을 때 관찰될 수 있다. 다른 예에서, 감소된 전환은 조성물 및 상응하는 대조군 조성물이 각각 약 72시간 동안 온도(또는 온도 범위)에 있을 때 관찰될 수 있다.
본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 조성물 중 이종 항산화 모이어티의 양은 약 0.01밀리몰(mM) 내지 약 500mM일 수 있다. 조성물 중 이종 항산화 모이어티의 양은 약 0.001mM 이상일 수 있다. 조성물 중 이종 항산화 모이어티의 양은 최대 약 500mM일 수 있다. 조성물 중 이종 항산화 모이어티의 양은 약 0.001 mM 내지 약 0.005 mM, 약 0.001 mM 내지 약 0.01 mM, 약 0.001 mM 내지 약 0.05 mM, 약 0.001 mM 내지 약 0.1 mM, 약 0.001 mM 내지 약 0.5 mM, 약 0.001 mM 내지 약 1 mM, 약 0.001 mM 내지 약 5 mM, 약 0.001 mM 내지 약 10 mM, 약 0.001 mM 내지 약 50 mM, 약 0.001 mM 내지 약 100 mM, 약 0.001 mM 내지 약 500 mM, 약 0.005 mM 내지 약 0.01 mM, 약 0.005 mM 내지 약 0.05 mM, 약 0.005 mM 내지 약 0.1 mM, 약 0.005 mM 내지 약 0.5 mM, 약 0.005 mM 내지 약 1 mM, 약 0.005 mM 내지 약 5 mM, 약 0.005 mM 내지 약 10 mM, 약 0.005 mM 내지 약 50 mM, 약 0.005 mM 내지 약 100 mM, 약 0.005 mM 내지 약 500 mM, 약 0.01 mM 내지 약 0.05 mM, 약 0.01 mM 내지 약 0.1 mM, 약 0.01 mM 내지 약 0.5 mM, 약 0.01 mM 내지 약 1 mM, 약 0.01 mM 내지 약 5 mM, 약 0.01 mM 내지 약 10 mM, 약 0.01 mM 내지 약 50 mM, 약 0.01 mM 내지 약 100 mM, 약 0.01 mM 내지 약 500 mM, 약 0.05 mM 내지 약 0.1 mM, 약 0.05 mM 내지 약 0.5 mM, 약 0.05 mM 내지 약 1 mM, 약 0.05 mM 내지 약 5 mM, 약 0.05 mM 내지 약 10 mM, 약 0.05 mM 내지 약 50 mM, 약 0.05 mM 내지 약 100 mM, 약 0.05 mM 내지 약 500 mM, 약 0.1 mM 내지 약 0.5 mM, 약 0.1 mM 내지 약 1 mM, 약 0.1 mM 내지 약 5 mM, 약 0.1 mM 내지 약 10 mM, 약 0.1 mM 내지 약 50 mM, 약 0.1 mM 내지 약 100 mM, 약 0.1 mM 내지 약 500 mM, 약 0.5 mM 내지 약 1 mM, 약 0.5 mM 내지 약 5 mM, 약 0.5 mM 내지 약 10 mM, 약 0.5 mM 내지 약 50 mM, 약 0.5 mM 내지 약 100 mM, 약 0.5 mM 내지 약 500 mM, 약 1 mM 내지 약 5 mM, 약 1 mM 내지 약 10 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 약 1 mM 내지 약 100 mM, 약 1 mM 내지 약 500 mM, 약 3 mM 내지 약 7 mM, 약 5 mM 내지 약 10 mM, 약 5 mM 내지 약 50 mM, 약 5 mM 내지 약 100 mM, 약 5 mM 내지 약 500 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 100 mM, 약 10 mM 내지 약 500 mM, 약 50 mM 내지 약 100 mM, 약 50 mM 내지 약 500 mM, 또는 약 100 mM 내지 약 500 mM일 수 있다. 조성물 중 이종 항산화 모이어티의 양은 약 0.001 mM, 약 0.005 mM, 약 0.01 mM, 약 0.05 mM, 약 0.1 mM, 약 0.5 mM, 약 1 mM, 약 5 mM, 약 10 mM, 약 50 mM, 약 100 mM, 또는 약 500 mM 일 수 있다.
본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 조성물 중 이종 항산화 모이어티의 양은 약 10 밀리그램/리터(mg/L) 내지 약 5,000 mg/L일 수 있다. 조성물 중 이종 항산화 모이어티의 양은 약 10 mg/L 이상일 수 있다. 조성물 중 이종 항산화 모이어티의 양은 최대 약 5,000 mg/L일 수 있다. 조성물 중 이종 항산화 모이어티의 양은 약 10 mg/L 내지 약 50 mg/L, 약 10 mg/L 내지 약 100 mg/L, 약 10 mg/L 내지 약 200 mg/L, 약 10 mg/L 내지 약 400 mg/L, 약 10 mg/L 내지 약 500 mg/L, 약 10 mg/L 내지 약 550 mg/L, 약 10 mg/L 내지 약 600 mg/L, 약 10 mg/L 내지 약 800 mg/L, 약 10 mg/L 내지 약 1,000 mg/L, 약 10 mg/L 내지 약 2,000 mg/L, 약 10 mg/L 내지 약 5,000 mg/L, 약 50 mg/L 내지 약 100 mg/L, 약 50 mg/L 내지 약 200 mg/L, 약 50 mg/L 내지 약 400 mg/L, 약 50 mg/L 내지 약 500 mg/L, 약 50 mg/L 내지 약 550 mg/L, 약 50 mg/L 내지 약 600 mg/L, 약 50 mg/L 내지 약 800 mg/L, 약 50 mg/L 내지 약 1,000 mg/L, 약 50 mg/L 내지 약 2,000 mg/L, 약 50 mg/L 내지 약 5,000 mg/L, 약 100 mg/L 내지 약 200 mg/L, 약 100 mg/L 내지 약 400 mg/L, 약 100 mg/L 내지 약 500 mg/L, 약 100 mg/L 내지 약 550 mg/L, 약 100 mg/L 내지 약 600 mg/L, 약 100 mg/L 내지 약 800 mg/L, 약 100 mg/L 내지 약 1,000 mg/L, 약 100 mg/L 내지 약 2,000 mg/L, 약 100 mg/L 내지 약 5,000 mg/L, 약 200 mg/L 내지 약 400 mg/L, 약 200 mg/L 내지 약 500 mg/L, 약 200 mg/L 내지 약 550 mg/L, 약 200 mg/L 내지 약 600 mg/L, 약 200 mg/L 내지 약 800 mg/L, 약 200 mg/L 내지 약 1,000 mg/L, 약 200 mg/L 내지 약 2,000 mg/L, 약 200 mg/L 내지 약 5,000 mg/L, 약 400 mg/L 내지 약 500 mg/L, 약 400 mg/L 내지 약 550 mg/L, 약 400 mg/L 내지 약 600 mg/L, 약 400 mg/L 내지 약 800 mg/L, 약 400 mg/L 내지 약 1,000 mg/L, 약 400 mg/L 내지 약 2,000 mg/L, 약 400 mg/L 내지 약 5,000 mg/L, 약 500 mg/L 내지 약 550 mg/L, 약 500 mg/L 내지 약 600 mg/L, 약 500 mg/L 내지 약 800 mg/L, 약 500 mg/L 내지 약 1,000 mg/L, 약 500 mg/L 내지 약 2,000 mg/L, 약 500 mg/L 내지 약 5,000 mg/L, 약 550 mg/L 내지 약 600 mg/L, 약 550 mg/L 내지 약 800 mg/L, 약 550 mg/L 내지 약 1,000 mg/L, 약 550 mg/L 내지 약 2,000 mg/L, 약 550 mg/L 내지 약 5,000 mg/L, 약 600 mg/L 내지 약 800 mg/L, 약 600 mg/L 내지 약 1,000 mg/L, 약 600 mg/L 내지 약 2,000 mg/L, 약 600 mg/L 내지 약 5,000 mg/L, 약 800 mg/L 내지 약 1,000 mg/L, 약 800 mg/L 내지 약 2,000 mg/L, 약 800 mg/L 내지 약 5,000 mg/L, 약 1,000 mg/L 내지 약 2,000 mg/L, 약 1,000 mg/L 내지 약 5,000 mg/L, 또는 약 2,000 mg/L 내지 약 5,000 mg/L일 수 있다. 조성물 중 이종 항산화 모이어티의 양은 약 10 mg/L, 약 50 mg/L, 약 100 mg/L, 약 200 mg/L, 약 400 mg/L, 약 500 mg/L, 약 550 mg/L, 약 600 mg/L, 약 800 mg/L, 약 1,000 mg/L, 약 2,000 mg/L, 또는 약 5,000 mg/L일 수 있다.
본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 조성물은 약 1,000,000:1 내지 약 1,000,000:5,000, 약 1,000,000:1 내지 약 1,000,000:2,000, 약 1,000,000:1 내지 약 1,000,000:1,000, 약 1,000,000:1 내지 약 1,000,000:500, 약 1,000,000:1 내지 약 1,000,000:400, 약 1,000,000:1 내지 약 1,000,000:300, 약 1,000,000:1 내지 약 1,000,000:200, 약 1,000,000:1 내지 약 1,000,000:180, 약 1,000,000:1 내지 약 1,000,000:160, 약 1,000,000:1 내지 약 1,000,000:140, 약 1,000,000:1 내지 약 1,000,000:120, 약 1,000,000:1 내지 약 1,000,000:100, 약 1,000,000:1 내지 약 1,000,000:80, 약 1,000,000:1 내지 약 1,000,000:60, 약 1,000,000:1 내지 약 1,000,000:50, 약 1,000,000:1 내지 약 1,000,000:40, 약 1,000,000:1 내지 약 1,000,000:30, 약 1,000,000:1 내지 약 1,000,000:20, 약 1,000,000:1 내지 약 1,000,000:10, 또는 약 1,000,000:1 내지 약 1,000,000:5의 몰비(HAM:NA)로 하나 이상의 핵산 분자(NA) 및 이종 항산화 모이어티(HAM)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 몰비(HAM:NA)는 약 1,000,000:10 내지 약 1,000,000:500, 약 1,000,000:20 내지 약 1,000,000:400, 또는 약 1,000,000:25 내지 약 1,000,000:200 일 수 있다. 일부 예에서, 몰비 (HAM:NA)는 약 1,000,000:30 및 약 1,000,000:40일 수 있다. 일부 예에서, 몰비 (HAM:NA)는 약 1,000,000:100 및 약 1,000,000:200일 수 있다.
본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 조성물은 약 100:1 내지 약 100:100, 약 100:1 내지 약 100:80, 약 100:1 내지 약 100:60, 약 100:1 내지 약 100:50, 약 100:1 내지 약 100:40, 약 100:1 내지 약 100:30, 약 100:1 내지 약 100:20, 약 100:1 내지 약 100:15, 약 100:1 내지 약 100:12, 약 100:1 내지 약 100:10, 또는 약 100:1 내지 약 100:5 의 몰비(HAM:NA)로 하나 이상의 핵산 분자(NA) 및 이종 항산화 모이어티(HAM)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 중량비(HAM:NA)는 약 100:5 내지 약 100:50일 수 있다. 일부 예에서, 중량비(HAM:NA)는 약 100:9일 수 있다. 일부 예에서, 중량비(HAM:NA)는 약 100:40일 수 있다.
본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 조성물 중 하나 이상의 핵산 분자의 양은 약 10 나노몰(nM) 내지 약 10,000 nM일 수 있다. 조성물 중 하나 이상의 핵산 분자의 양은 약 10nM 이상일 수 있다. 조성물 중 하나 이상의 핵산 분자의 양은 최대 약 10,000nM 일 수 있다. 조성물 중 하나 이상의 핵산 분자의 양은 약 10 nM 내지 약 100 nM, 약 10 nM 내지 약 120 nM, 약 10 nM 내지 약 150 nM, 약 10 nM 내지 약 200 nM, 약 10 nM 내지 약 400 nM, 약 10 nM 내지 약 600 nM, 약 10 nM 내지 약 800 nM, 약 10 nM 내지 약 1,000 nM, 약 10 nM 내지 약 2,000 nM, 약 10 nM 내지 약 5,000 nM, 약 10 nM 내지 약 10,000 nM, 약 100 nM 내지 약 120 nM, 약 100 nM 내지 약 150 nM, 약 100 nM 내지 약 200 nM, 약 100 nM 내지 약 400 nM, 약 100 nM 내지 약 600 nM, 약 100 nM 내지 약 800 nM, 약 100 nM 내지 약 1,000 nM, 약 100 nM 내지 약 2,000 nM, 약 100 nM 내지 약 5,000 nM, 약 100 nM 내지 약 10,000 nM, 약 120 nM 내지 약 150 nM, 약 120 nM 내지 약 200 nM, 약 120 nM 내지 약 400 nM, 약 120 nM 내지 약 600 nM, 약 120 nM 내지 약 800 nM, 약 120 nM 내지 약 1,000 nM, 약 120 nM 내지 약 2,000 nM, 약 120 nM 내지 약 5,000 nM, 약 120 nM 내지 약 10,000 nM, 약 150 nM 내지 약 200 nM, 약 150 nM 내지 약 400 nM, 약 150 nM 내지 약 600 nM, 약 150 nM 내지 약 800 nM, 약 150 nM 내지 약 1,000 nM, 약 150 nM 내지 약 2,000 nM, 약 150 nM 내지 약 5,000 nM, 약 150 nM 내지 약 10,000 nM, 약 200 nM 내지 약 400 nM, 약 200 nM 내지 약 600 nM, 약 200 nM 내지 약 800 nM, 약 200 nM 내지 약 1,000 nM, 약 200 nM 내지 약 2,000 nM, 약 200 nM 내지 약 5,000 nM, 약 200 nM 내지 약 10,000 nM, 약 400 nM 내지 약 600 nM, 약 400 nM 내지 약 800 nM, 약 400 nM 내지 약 1,000 nM, 약 400 nM 내지 약 2,000 nM, 약 400 nM 내지 약 5,000 nM, 약 400 nM 내지 약 10,000 nM, 약 600 nM 내지 약 800 nM, 약 600 nM 내지 약 1,000 nM, 약 600 nM 내지 약 2,000 nM, 약 600 nM 내지 약 5,000 nM, 약 600 nM 내지 약 10,000 nM, 약 800 nM 내지 약 1,000 nM, 약 800 nM 내지 약 2,000 nM, 약 800 nM 내지 약 5,000 nM, 약 800 nM 내지 약 10,000 nM, 약 1,000 nM 내지 약 2,000 nM, 약 1,000 nM 내지 약 5,000 nM, 약 1,000 nM 내지 약 10,000 nM, 약 2,000 nM 내지 약 5,000 nM, 약 2,000 nM 내지 약 10,000 nM, 또는 약 5,000 nM 내지 약 10,000 nM 일 수 있다. 조성물 중 하나 이상의 핵산 분자의 양은 약 10 nM, 약 100 nM, 약 120 nM, 약 150 nM, 약 200 nM, 약 400 nM, 약 600 nM, 약 800 nM, 약 1,000 nM, 약 2,000 nM, 약 5,000 nM, 또는 약 10,000 nM 일 수 있다.
본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 조성물 중 하나 이상의 핵산 분자의 양은 약 1 mg/L 내지 약 5,000 mg/L일 수 있다. 조성물 중 하나 이상의 핵산 분자의 양은 적어도 약 1 mg/L일 수 있다. 조성물 중 하나 이상의 핵산 분자의 양은 최대 약 5,000 mg/L일 수 있다. 조성물 중 하나 이상의 핵산 분자의 양은 약 1 mg/L 내지 약 10 mg/L, 약 1 mg/L 내지 약 20 mg/L, 약 1 mg/L 내지 약 50 mg/L, 약 1 mg/L 내지 약 100 mg/L, 약 1 mg/L 내지 약 150 mg/L, 약 1 mg/L 내지 약 200 mg/L, 약 1 mg/L 내지 약 300 mg/L, 약 1 mg/L 내지 약 400 mg/L, 약 1 mg/L 내지 약 500 mg/L, 약 1 mg/L 내지 약 1,000 mg/L, 약 1 mg/L 내지 약 5,000 mg/L, 약 10 mg/L 내지 약 20 mg/L, 약 10 mg/L 내지 약 50 mg/L, 약 10 mg/L 내지 약 100 mg/L, 약 10 mg/L 내지 약 150 mg/L, 약 10 mg/L 내지 약 200 mg/L, 약 10 mg/L 내지 약 300 mg/L, 약 10 mg/L 내지 약 400 mg/L, 약 10 mg/L 내지 약 500 mg/L, 약 10 mg/L 내지 약 1,000 mg/L, 약 10 mg/L 내지 약 5,000 mg/L, 약 20 mg/L 내지 약 50 mg/L, 약 20 mg/L 내지 약 100 mg/L, 약 20 mg/L 내지 약 150 mg/L, 약 20 mg/L 내지 약 200 mg/L, 약 20 mg/L 내지 약 300 mg/L, 약 20 mg/L 내지 약 400 mg/L, 약 20 mg/L 내지 약 500 mg/L, 약 20 mg/L 내지 약 1,000 mg/L, 약 20 mg/L 내지 약 5,000 mg/L, 약 50 mg/L 내지 약 100 mg/L, 약 50 mg/L 내지 약 150 mg/L, 약 50 mg/L 내지 약 200 mg/L, 약 50 mg/L 내지 약 300 mg/L, 약 50 mg/L 내지 약 400 mg/L, 약 50 mg/L 내지 약 500 mg/L, 약 50 mg/L 내지 약 1,000 mg/L, 약 50 mg/L 내지 약 5,000 mg/L, 약 100 mg/L 내지 약 150 mg/L, 약 100 mg/L 내지 약 200 mg/L, 약 100 mg/L 내지 약 300 mg/L, 약 100 mg/L 내지 약 400 mg/L, 약 100 mg/L 내지 약 500 mg/L, 약 100 mg/L 내지 약 1,000 mg/L, 약 100 mg/L 내지 약 5,000 mg/L, 약 150 mg/L 내지 약 200 mg/L, 약 150 mg/L 내지 약 300 mg/L, 약 150 mg/L 내지 약 400 mg/L, 약 150 mg/L 내지 약 500 mg/L, 약 150 mg/L 내지 약 1,000 mg/L, 약 150 mg/L 내지 약 5,000 mg/L, 약 200 mg/L 내지 약 300 mg/L, 약 200 mg/L 내지 약 400 mg/L, 약 200 mg/L 내지 약 500 mg/L, 약 200 mg/L 내지 약 1,000 mg/L, 약 200 mg/L 내지 약 5,000 mg/L, 약 300 mg/L 내지 약 400 mg/L, 약 300 mg/L 내지 약 500 mg/L, 약 300 mg/L 내지 약 1,000 mg/L, 약 300 mg/L 내지 약 5,000 mg/L, 약 400 mg/L 내지 약 500 mg/L, 약 400 mg/L 내지 약 1,000 mg/L, 약 400 mg/L 내지 약 5,000 mg/L, 약 500 mg/L 내지 약 1,000 mg/L, 약 500 mg/L 내지 약 5,000 mg/L, 또는 약 1,000 mg/L 내지 약 5,000 mg/L일 수있다. 조성물 중 하나 이상의 핵산 분자의 양은 약 1 mg/L, 약 10 mg/L, 약 20 mg/L, 약 50 mg/L, 약 100 mg/L, 약 150 mg/L, 약 200 mg/L, 약 300 mg/L, 약 400 mg/L, 약 500 mg/L, 약 1,000 mg/L, 또는 약 5,000 mg/L 일 수 있다.
본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 조성물은 생물학적 샘플, 예를 들어 개체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어 동물 또는 인간)의 생물학적 샘플(예를 들어, 형장 샘플 또는 혈청 샘플)을 포함할 수 있고, 조성물의 하나 이상의 핵산 분자는 생물학적 샘플에서 유래할 수 있다. 생물학적 샘플의 비-제한적인 예는 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 외림프액, 대변, 타액, 정액, 양수, 뇌척수액, 담즙, 땀, 눈물, 가래, 활액, 구토물, 뼈, 심장, 흉선, 동맥, 혈관, 폐, 근육, 위, 장, 간, 췌장, 비장, 신장, 담낭, 갑상선, 부신, 유선, 난소, 전립선, 고환, 피부, 지방, 눈, 뇌, 감염된 조직, 병든 조직, 악성 조직, 석회화된 조직 및 건강한 조직을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 개체(예를 들어, 인간 개체)는 상응하는 대조군 개체와 비교하여 더 많은 산화 스트레스에 노출될 수 있거나 노출된 것으로 의심될 수 있다. 산화 스트레스에 대한 노출은, 흡연(예를 들어, 담배 또는 시가와 같은 담배 제품), 자외선(UV) 노출, 알코올 섭취, 비만, 다이어트(예를 들어, 고지방식이, 고당 식이), 방사선 노출, 오염, 살충제 노출, 특정 약물(예를 들어, 니무스틴, 악티노마이신 D, 독소루비신, 미토마이신 C, 미톡산트론, 카르모푸르, 젬시타빈, 메르캅토퓨린, 캄프토테신, 파클리탁셀, 빈블라스틴, 비노렐빈), 및 하나 또는 이상의 질환(예를 들어, 루게릭병, 파킨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 다발성 경화증; 심혈관 질환; 암 또는 종양; 노화와 같은 신경퇴행성 질환)을 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 공급원에서 유래할 수 있다. 예를 들어, 현재 및/또는 이전 흡연자는 비-흡연(non-smoking) 또는 평생 비-흡연(never-smoking) 개체에 비해 더 많은 산화 스트레스 (예를 들어, 다환 방향족 탄화수소에 대한 더 많은 노출으로 인해)에 노출될 수 있다. 이러한 흡연자의 생물학적 샘플에서 파생된 핵산 분자(예를 들어, cfDNA 또는 cfRNA)는 본 명세서에 개시된 이종 항산화 모이어티의 부재 하에서 손상되거나 변경될 수 있는 고유한 특징을 나타낼 수 있다 (예를 들어, 구아닌-시토신(G-C) 쌍에서 티민-아데닌(T-A) 쌍으로 돌연변이 유발).
본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 조성물은 단리된 핵산 샘플(예를 들어, 단리된 DNA 샘플, 단리된 RNA 샘플)을 포함할 수 있다. 단리된 핵산 샘플은, 예를 들어 이종 항산화 모이어티를 조성물에 첨가하기 전에, 하나 이상의 세포의 전체 게놈 및/또는 전사된 핵산의 벌크가 실질적으로 없거나 또는 실질적으로 없도록 단리된 하나 이상의 핵산(예를 들어, DNA, RNA) 분자를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 핵산 분석 샘플을 포함할 수 있다. 핵산 분석 샘플의 하나 이상의 핵산 분자는 본원에 개시된 바와 같이 개체의 생물학적 샘플로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, 핵산 분석 샘플의 하나 이상의 핵산 분자는 이러한 샘플에서 하나 이상의 표적 핵산 서열의 증폭을 위해 준비될 수 있다 (예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해). 또 다른 대안에서, 핵산 분석 샘플의 하나 이상의 핵산 분자는 생물학적 샘플로부터의 하나 이상의 핵산 주형으로부터 유래(예를 들어, PCR을 통해 증폭)될 수 있다.
일부 경우에, 핵산 분석 샘플은 샘플에서 (예를 들어, 하나 이상의 프로브를 사용한 혼성화 포획/풀-다운 분석을 통해) 하나 이상의 표적 핵산 서열의 식별 및/또는 단리를 위해 준비될 수 있다. 하나 이상의 표적 핵산 서열은 관심 핵산 서열에 대해 적어도 부분적으로 상보성을 갖는 핵산 프로브를 사용하여 확인될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같은 조성물은 핵산 프로브(들)를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 핵산 프로브는 활성화 가능한 리포터 제제를 포함할 수 있다. 활성화 가능한 리포터 제제는, (i) 핵산 프로브를 샘플내 표적 핵산 서열에 혼성화 (예를 들어, 분자 비콘 (molecular beacon), 이클립스 프로브 (eclipse probe), 앰플리플루오르 프로프 (amplifluor probe), 스콜피온 PCR 프라이머 (scorpions PCR primer) 및 연장시 형광 발광성 PCR 프라이머 (light upon extension fluorogenic PCR primer)(LUX 프라이머)) 및 (ii) 샘플내(예를 들어, 가수분해 프로브에서 표적 핵산 서열에 혼성화된 개별 핵산 프로브의 적어도 일부의 탈혼성화 (예를 들어, 가수분해 프로브(예를 들어, TaqMan 프로브), 이중 하이브리드화 프로브 및 QZyme PCR 프라이머) 중 어느 하나에 의해 활성화될 수 있다. 일부 예에서, 본원에 개시된 바와 같은 핵산 프로브는 포획/풀-다운 분석을 위한 풀-다운 태그를 포함할 수 있다. 풀-다운 태그는 특정 서브세트(예를 들어, 하나 이상의 표적 핵산 서열)에 대한 샘플(예를 들어, 개체로부터 수득되거나 유래된 생물학적 샘플)을 농축하는 데 사용될 수 있다. 풀-다운 태그는 핵산 바코드를 포함할 수 있다 (예를 들어, 핵산 프로브의 한쪽 또는 양쪽에). 핵산 바코드에 상보성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 비드 또는 기질을 이용함으로써, 핵산 바코드는 표적 무세포 핵산 분자에 혼성화되는 임의의 핵산 프로브를 풀-다운하고 농축하는데 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 핵산 바코드는 임의의 시퀀싱 데이터(예를 들어, 증폭에 의한 시퀀싱)로부터 표적 무세포 핵산 분자를 식별하는 데 사용될 수 있다.
일부 경우에, 풀-다운 태그는 친화성 결합 모이어티에 의해 특이적으로 인식되고 결합될 수 있는 친화성 표적 모이어티를 포함할 수 있다. 친화성 결합 모이어티는 친화성 표적 모이어티에 특이적으로 결합하여 친화성 쌍을 형성할 수 있다. 일부 경우에, 친화성 결합 모이어티를 포함하는 비드 또는 기질을 이용함으로써, 친화성 표적 모이어티는 표적 무세포 핵산 분자에 혼성화되는 임의의 핵산 프로브를 풀다운하고 농축하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 풀-다운 태그는 친화성 결합 모이어티를 포함할 수 있는 반면, 비드/기질은 친화성 표적 모이어티를 포함할 수 있다. 친화성 쌍의 비-제한적인 예는 비오틴/아비딘, 항체/항원, 비오틴/스트렙타비딘, 금속/킬레이터, 리간드/수용체, 핵산 및 결합 단백질, 및 상보적 핵산을 포함할 수 있다. 예에서, 풀-다운 태그는 비오틴을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 핵산 분석 샘플은 샘플에서 하나 이상의 핵산 분자의 시퀀싱을 위해 준비될 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 시퀀싱 방법은 1세대 시퀀싱 방법(예를 들어, Maxam-Gilbert 시퀀싱, Sanger 시퀀싱)일 수 있다. 시퀀싱 방법은 고처리량 시퀀싱 방법, 예를 들어 차세대 시퀀싱(NGS)(예를 들어, 합성에 의한 시퀀싱)일 수 있다. 고처리량 시퀀싱 방법은 약 10,000개 이상, 약 100,000개 이상, 약 100만 개 이상, 약 1000만 개 이상, 약 1억 개 이상, 약 10억 개 이상, 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드 분자(예를 들어, 무세포 핵산 분자 또는 이의 유도체)를 동시에(또는 실질적으로 동시에) 시퀀싱할 수 있다. NGS는 임의의 세대 번호의 시퀀싱 기술(예를 들어, 2세대 시퀀싱 기술, 3세대 시퀀싱 기술, 4세대 시퀀싱 기술 등)일 수 있다. 고처리량 시퀀싱 방법의 비-제한적 예는 대규모 병렬 시그니처 시퀀싱, 폴로니 시퀀싱 (polony sequencing), 피로시퀀싱 (pyrosequencing), 시퀀싱 바이 합성 (sequencing-by-synthesis), 조합 프로브 앵커 합성 (combinatorial probe anchor synthesis, cPAS), 시퀀싱-바이-라이게이션 (sequencing-by-ligation)(예를 들어, SOLiD (sequencing by oligonucleotide ligation and detection) 시퀀싱), 반도체 시퀀싱 (semiconductor sequencing)(예를 들어, Ion Torrent semiconductor sequencing), DNA 나노볼 시퀀싱 (DNA nanoball sequencing) 및 단일-분자 시퀀싱, 시퀀싱-바이-혼성화 (sequencing-by-hybridization) 을 포함한다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 조성물은 시퀀싱에 관여하거나 시퀀싱에 필요한 하나 이상의 제제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 핵산 시퀀싱을 수행하기 위해 다음 구성원 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (1) 핵산 리가아제(예를 들어, 표적 핵산 분자에 단일 가닥 DNA 또는 RNA 올리고를 부가하기 위한 T4 DNA 리가아제), (2) 핵산 폴리머라제(예를 들어, PCR용 DNA 또는 RNA 폴리머라제), 또는 (3) 핵산 헬리카제(예를 들어, 나노포어 시퀀싱용).
본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 조성물 내의 이종 항산화 모이어티는, 이종 항산화 모이어티가 결여는 대조군 조성물과 비교하여, 조성물내 하나 이상의 핵산 분자(예를 들어, cfDNA, cfRNA)의 시퀀싱의 오류 정도 및/또는 비율 (예를 들어, 시퀀싱 오류, 백그라운드 오류)를 적어도 또는 최대 약 5%, 적어도 또는 최대 약 10%, 적어도 또는 최대 약 15%, 적어도 또는 최대 약 20%, 적어도 또는 최대 약 25%, 적어도 또는 최대 약 30%, 적어도 또는 최대 약 35%, 적어도 또는 최대 약 40%, 적어도 또는 최대 약 45%, 적어도 또는 최대 약 50%, 적어도 또는 최대 약 55%, 적어도 또는 최대 약 60%, 적어도 또는 최대 약 65%, 적어도 또는 최대 약 70%, 적어도 또는 최대 약 75%, 적어도 또는 최대 약 80%, 적어도 또는 최대 약 85%, 적어도 또는 최대 약 90%, 적어도 또는 최대 약 95%, 적어도 또는 최대 약 99%, 또는 약 100% 감소시킬 수 있다. 시퀀싱의 오류 정도 및/또는 비율은 약 1% 내지 약 100%, 약 1% 내지 약 80%, 약 1% 내지 약 60%, 약 1% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 30%, 또는 약 10% 내지 약 20% 감소될 수 있다. 시퀀싱의 오류 정도 및/또는 비율은 복수의 상이한 뉴클레오티드 돌연변이(예를 들어, 복수의 전환 돌연변이 및/또는 전이 돌연변이)로 인한 시퀀싱의 전체적인 오류 정도 및/또는 비율일 수 있다. 대안적으로, 시퀀싱의 오류 정도 및/또는 비율은 특정 유형의 뉴클레오티드 돌연변이(예를 들어, G>T 전환)로 인한 시퀀싱의 오류 정도 및/또는 비율일 수 있다.
본원에 개시된 조성물 중 어느 하나의 일부 실시양태에서, 조성물 내의 이종 항산화 모이어티는, 이종 항산화 모이어티가 결여는 대조군 조성물과 비교하여, 조성물내 하나 이상의 핵산 분자(예를 들어, cfDNA, cfRNA) 를 분석(예를 들어, 프로브-매개 식별 또는 풀-다운, 시퀀싱)하는 민감성 또는 특이성을 적어도 또는 최대 약 5%, 적어도 또는 최대 약 10%, 적어도 또는 최대 약 15%, 적어도 또는 최대 약 20%, 적어도 또는 최대 약 25%, 적어도 또는 최대 약 30%, 적어도 또는 최대 약 35%, 적어도 또는 최대 약 40%, 적어도 또는 최대 약 45%, 적어도 또는 최대 약 50%, 적어도 또는 최대 약 55%, 적어도 또는 최대 약 60%, 적어도 또는 최대 약 65%, 적어도 또는 최대 약 70%, 적어도 또는 최대 약 75%, 적어도 또는 최대 약 80%, 적어도 또는 최대 약 85%, 적어도 또는 최대 약 90%, 적어도 또는 최대 약 100%, 적어도 또는 최대 약 150%, 또는 적어도 또는 최대 약 200% 향상시킬 수 있다.
방법
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 조성물 중 임의의 하나를 생성하는 방법을 제공한다. 도 2에 도시된 흐름도에 의해 예시된 바와 같이, 상기 방법은 (i) 본원에 개시된 핵산 분자(들) 중 임의의 하나 및 (ii) 본원에 개시된 이종 항산화 모이어티 중 임의의 하나를 제공하는 단계(공정 210)를 포함할 수 있다. 상기 방법은, 예를 들어 (1) 하나 이상의 표적 핵산 서열의 식별 및/또는 단리, (2) 조성물 내 하나 이상의 핵산 분자(들)의 시퀀싱, 또는 (3) 핵산 분자(들)의 전달 또는 저장을 위한 조성물을 생성하기 위해, 핵산 분자(들) 및 이종 항산화 모이어티를 혼합하는 단계를 추가로 포함할 수 있다(공정 220). 일부 예에서, 이종 항산화 모이어티는 설핀산 기 (예를 들어, 하이포타우린)를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 이종 항산화 모이어티는 단백질 (예를 들어, 카탈라제)을 포함할 수 있다.
장치
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 핵산 분자(들) 중 어느 하나를 고정(holding)하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 장치는 본원에 개시된 이종 항산화 모이어티 중 임의의 하나를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 이종 항산화 모이어티는 장치의 표면(예를 들어, 내부 표면)에 (예를 들어, 직접 또는 간접적으로) 커플링될 수 있다. 예를 들어, 장치의 표면은 이종 항산화 모이어티로 코팅될 수 있다. 일부 경우에, 이종 항산화 모이어티는 장치의 표면에 공유적으로 부착될 수 있다. 장치는, 예를 들어 (1) 하나 이상의 표적 핵산 서열의 식별 및/또는 단리, (2) 조성물 내 하나 이상의 핵산 분자(들)의 시퀀싱, 또는 (3) 핵산 분자(들)의 전달 또는 저장을 위한 조성물을 생성하기 위해 핵산 분자(들)을 고정하는데 사용될 수 있다. 일부 예에서, 이종 항산화 모이어티는 단백질(예를 들어, 카탈라제)을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 장치의 비-제한적인 예로는 주사기, 주사기 팁, 튜브(예를 들어, 생물학적 샘플 또는 시험관 내 샘플를 수집하기 위한 코니칼 튜브), 바이알(예를 들어, 저온 튜브 바이알), 피펫 팁, 플레이트(예를 들어, 조직 배양 장소, PCR 플레이트) 등을 포함할 수 있다.
추가적인 실시양태
무세포 핵산 시퀀싱 및 검출
이제 도면 및 데이터를 참조하면서, 무세포 핵산 시퀀싱 및 암 검출과 관련된 실시양태가 제공된다. 일부 실시양태에서, 무세포 핵산(cfDNA 또는 cfRNA)은 액체 생검으로부터 추출되고 시퀀싱을 위해 준비된다. 많은 실시양태에서, 무세포 핵산의 시퀀싱 결과는 순환성-종양 핵산(ctDNA 또는 ctRNA) 서열(예를 들어, 신생물로부터 유래된 핵산의 서열)을 검출하기 위해 컴퓨터 모델에 의해 분석된다. 따라서, 다양한 실시양태에서, 개체로부터 액체 생검을 추출하고 그 액체 생검으로부터 유래된 무세포 핵산을 시퀀싱하여 순환성-종양 핵산 서열을 검출함으로써 개체에서 신생물(암 포함)이 검출될 수 있고, 순환성-종양 핵산 서열은 개인이 신생물을 가지고 있음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 신생물의 검출에 기초하여 개체에 대해 임상적 개입이 실시된다.
도 3은 개인의 생물학적 샘플에서 순환성-종양 핵산의 검출에 기초하여 임상적 개입을 수행하는 프로세스를 제공한다. 일부 실시양태에서, 순환성-종양 핵산의 검출은 신생물(예를 들어, 암)이 존재함을 나타내므로, 적절한 임상적 개입이 수행될 수 있다.
프로세스(300)는 비-침습적 생검(예를 들어, 액체 또는 배출물 생검)으로부터 얻은 무세포 핵산을 수득하고, 준비하고, 시퀀싱하는 단계(301)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, cfDNA 및/또는 cfRNA는 혈장, 혈액, 림프, 타액, 소변, 대변 및/또는 기타 적절한 체액으로부터 추출된다. 일부 실시양태에서, 암의 임의의 징후 이전에 생검을 추출한다. 일부 실시양태에서, 신생물(예를 들어, 암)을 검출하기 위한 조기 스크리닝을 제공하기 위해 생검이 추출된다. 일부 실시양태에서, 치료 후에 잔류 신생물(예를 들어, 암)이 존재하는지 검출하기 위해 생검이 추출된다. 특정 암에 대한 스크리닝을 수행할 수 있다. 개입를 위해 검출할 수 있는 암의 예에 대한 자세한 내용은 "임상적 개입" 섹션을 참조한다.
일부 실시양태에서, 생검은 장애의 가족력이 있거나 알려진 위험 인자(예를 들어, 담배 흡연자)가 있는 사람과 같은, 암 발병 위험이 알려진 개체로부터 추출된다. 많은 구체예에서, 생검은 일반 인구 내의 모든 개인에서 추출된다. 일부 실시양태에서, 생검은 50세 이상의 노화 개체와 같이, 암 위험이 더 높은 특정 연령 그룹 내의 개체로부터 추출된다.
많은 구현예에서, 추출된 무세포 핵산은 시퀀싱을 위해 준비된다. 따라서, 무세포 핵산은 시퀀싱을 위한 분자 라이브러리로 변환된다. 일부 실시양태에서, 어댑터 및 프라이머는 시퀀싱을 용이하게 하기 위해 무세포 핵산 상에 부착된다. 일부 실시양태에서, 특정 게놈 유전자좌의 표적화된 시퀀싱이 수행되어야 하므로, 특정 유전자좌에 상응하는 특정 서열은 시퀀싱 전에 혼성화를 통해 포획된다. 일부 실시양태에서, 다양한 시약이 라이브러리 및/또는 포획 작업 동안 포함되어 교란인자들을 완화한다. 일부 실시양태에서, 항산화제는 뉴클레오티드 전환을 초래하는 다양한 뉴클레오티드의 산화를 방지하기 위해 하나 이상의 시퀀싱 준비 작업 동안 포함된다. 일부 실시양태에서, 항산화제 하이포타우린은 다양한 시퀀싱 준비 작업에 사용된다.
일부 구현예에서, 순환성-종양 핵산을 나타내는 서열 변이를 검출할 수 있는 임의의 적절한 시퀀싱 기술이 이용될 수 있다. 시퀀싱 기술에는 454 시퀀싱, Illumina 시퀀싱, SOLiD 시퀀싱, Ion Torrent 시퀀싱, 싱글-리드 시퀀싱 (single-read sequencing), 페어링된-엔드 시퀀싱 (paired-end sequencing) 등이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
프로세스(300)는 순환성-종양 핵산 서열을 검출하기 위해 무세포 핵산 시퀀싱 결과를 분석(303)한다. 신생물(특히 전이성 종양)은 활발하게 성장하고 확장되기 때문에, 신생물 세포는 종종 생체분자(특히 핵산)를 혈관계, 림프계 및/또는 폐기 시스템 (waste system)으로 방출한다. 또한, 국소 환경의 생물물리학적 제약으로 인해 신생물 세포는 종종 파열되어 내부 세포 내용물을 혈관계, 림프계 및/또는 폐기 시스템으로 방출한다. 따라서, 원위 원발성 종양 및/또는 전이를 액체 또는 배출물 (waste) 생검으로부터 검출하는 것이 가능하다.
다수의 실시양태에서, 무세포 핵산 시퀀싱 결과는, 무세포 핵산 샘플 내에 체세포 단일 뉴클레오티드 변이체(SNV), 카피수 변이체(CNV), 게놈 위치 특징, 및/또는 생식계열 SNV가 세포 내에 존재하는지 여부를 검출하기 위해 분석된다. 일부 실시양태에서, 특정 체세포 SNV, CNV, 게놈 위치 특징 및/또는 생식계열 SNV의 존재는 순환성-종양 핵산 서열을 나타낸다 (따라서 종양이 존재함을 나타냄). 다양한 실시양태에서, 컴퓨터 모델은 검출된 체세포 SNV, CNV, 게놈 위치 특징, 및/또는 생식계열 SNV를 분석하여, 이들 검출된 분자 요소들이 순환성-종양 핵산을 나타내는지 여부를 결정하는데 이용된다. 일부 실시양태에서, 컴퓨터 모델은 특정 샘플이 순환성-종양 핵산을 함유하는지 여부에 대한 상대적 표시(예를 들어, 수치적 신뢰도 점수)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 컴퓨터 모델은 환자 및 매치되는 대조군에서 검출된 체세포 SNV, CNV, 게놈 위치 특징, 및/또는 생식선 SNV에 대해 훈련된다.
일부 실시양태에서, 교란 인자들은 무세포 핵산 시퀀싱 결과로부터 제거된다. 이제 클론성 조혈(clonal hematopoiesis: CH)이 무세포 핵산 샘플 내에서 체세포 SNV 및 CNV의 교란 소스라는 것이 알려졌다. 따라서, 다양한 실시양태에서, CH와 관련된 체세포 SNV 및 CNV 가 추가 분석에서 제거된다. 일부 실시양태에서, CH로부터 유래된 체세포 SNV 및 CNV는 분석된 각각의 특정 개체에 대해 결정된다. CH로부터 유래된 개인의 특정 체세포 SNV 및 CNV를 감지하기 위해, 개인의 류코사이트 또는 백혈구(WBC) 또는 조혈 세포를 수집하고 이들의 핵산을 추출 및 시퀀싱하여, 해당 세포에서 유래된 체세포 SNV 및 CNV를 검출한다. 일부 실시양태에서, WBC에서 검출된 체세포 SNV 및 CNV는 무세포 핵산 시퀀싱 결과의 분석 동안 제거된다.
순환성-종양 핵산 서열의 검출은 검사 대상 개체에 신생물이 존재함을 나타낸다. 따라서, 순환성-종양 핵산의 검출에 기초하여 임상적 개입이 수행될 수 있다(305). 일부 실시양태에서, (예를 들어) 혈액 검사, 의료 영상화, 신체 검사, 종양 생검, 또는 이들의 임의의 조합과 같은 임상 절차가 수행된다. 일부 실시양태에서, 진단은 암의 특정 단계를 결정하기 위해 수행된다. 일부 실시양태에서, (예를 들어) 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 호르몬 요법, 표적 약물 요법, 의료 감시, 또는 이들의 임의의 조합과 같은 치료가 수행된다. 일부 실시양태에서, 개인은 의사, 간호사, 영양사 등의 의료 전문가에 의해 평가 및/또는 치료된다.
무세포 핵산을 분자적으로 분석하고 임상적 개입을 수행하기 위한 프로세스의 특정 예시들이 위에서 설명되었지만, 프로세스의 일부 작업은 다른 순서로 수행될 수 있고 특정 작업은 선택적일 수 있다. 따라서 프로세스의 일부 작업은 특정 응용의 요구사항에 적절하게 사용될 수 있다. 또한, 주어진 응용의 요구사항에 적합한 무세포 핵산을 분자적으로 분석하기 위한 다양한 프로세스 중 임의의 것이 사용될 수 있다.
서열 라이브러리 제조
일부 실시양태는 시퀀싱을 위해 무세포 DNA(cfDNA) 및/또는 무세포 RNA(cfRNA)를 포함하는, 핵산의 무세포 샘플의 제조에 관한 것이다. 따라서, 실시양태들은 세포외 핵산을 갖는 생물학적 샘플로부터 핵산을 추출하는 것을 포함한다. 생물학적 샘플에는 혈액, 혈장, 림프액, 뇌척수액, 타액, 소변, 대변 등이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 무세포 핵산은 당업계에 공지된 임의의 적절한 수단에 의해 단리 및 정제될 수 있다. 일부 실시양태에서, 컬럼 정제가 이용된다 (예를 들어, Qiagen, Hilden, Germany의 QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit). 일부 실시양태에서, 단리된 RNA 단편은 추가 다운스트림 분석을 위해 상보적 DNA로 전환될 수 있다.
일부 실시양태는 시퀀싱을 위한 세포-유래 핵산 샘플의 제조에 관한 것이다. 따라서, 일부 실시양태는 분석할 세포 및/또는 조직(예를 들어, 종양 세포, 신생물 세포, 혈액 세포)을 단리한다. 세포 및 조직은 당업계에서 이해되는 바와 같이 추출 및 단리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 혈액 세포(예를 들어, 백혈구)는 원심분리를 통해 혈장으로부터 단리된다. 또한, 세포 및 조직으로부터의 핵산은 당업계에 공지된 임의의 적절한 수단에 의해 단리 및 정제될 수 있다. 일부 실시양태에서, 컬럼 정제가 이용된다 (예를 들어, Qiagen, Hilden, Germany의 DNeasy Blood and Tissue Kit). 핵산은 적절한 수단(예를 들어, 초음파 처리)을 통해 라이브러리 준비를 위해 더 작은 조각들(예를 들어, 50-450bp)으로 분해될 수 있다.
일부 실시양태에서, 단리된 핵산 단편은 시퀀싱 라이브러리로 제조될 수 있다. 많은 실시양태에서, 각각 최적화된 GC 함량 및 서열 다양성을 갖는 고유 식별자(UID) 및 이중 인덱스 샘플 바코드를 갖는 어댑터를 사용하여 라이브러리를 구축한다. 이들 실시예의 다수에서, UID 및 이중 인덱스 바코드는 분리된다 (예를 들어, 각각은 별개의 바코드임). 일부 실시양태에서, UID는 오류-수정의 이점을 제공하기 위해 미리 정의된(예를 들어, 무작위가 아닌) 시퀀스이다. UID 또는 샘플 바코드의 오류는 종종 라이브러리 제조 중에 도입되어, 시퀀싱에 의해 관찰된 고유 분자의 부정확한 열거를 초래할 수 있다. 이러한 오류를 수정하기 위해, 일부 실시예는 오류 수정에 사용될 수 있는 pair-wise Hamming edit distance 를 갖는 미리 정의된 시퀀스를 사용한다. 예를 들어, 6bp UID 시퀀스를 사용하는 경우, 시퀀스는 pair-wise Hamming edit distance ≥ 3으로 설계되어 1bp 오류 수정 및 2bp 오류 검출이 가능하다. 마찬가지로, 8bp 샘플 바코드 시퀀스를 사용하는 경우, 시퀀스는 pair-wise Hamming edit distance ≥ 5로 설계될 수 있으므로 1 또는 2bp 오류를 수정하고 3bp 오류를 검출할 수 있다.
일부 구현예는 시퀀싱 반응에 사용되는 라이브러리 분자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 DNA이므로 라이브러리 제조에 직접 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 RNA이므로 라이브러리 제조 전에 cDNA로의 변환이 필요하다. 많은 실시양태에서, 한 쌍의 오류-수정 UID가 DNA (또는 cDNA) 단편에 부착되어 DNA (또는 cDNA)는 UID의 양쪽 측면에 인접하게 된다. 한 쌍의 측면 UID는 생물학적 공급원에서 유래된 특정 핵산 분자의 표시를 제공하여, 원래의 고유한 분자를 보다 정확하게 열거할 수 있다 (예를 들어, 각 UID 쌍은 증폭 작업 전에 발생하는 해당 핵산 분자의 결찰 이벤트를 나타내며, 증폭 작업으로 인해 발생하는 중복 분자를 식별할 수 있다). 일부 실시양태에서, 한 쌍의 인덱스 샘플 바코드가 DNA(또는 cDNA) 단편에 부착되어, DNA (또는 cDNA)는 샘플 소스를 나타내는 인덱스 샘플 바코드의 양쪽 측면에 인접하게 된다 (예를 들어, 샘플에서 유래된 모든 분자는 한 쌍의 인덱스 샘플 바코드가 인접한다). 일부 실시양태에서, 이중 인덱스 샘플 바코드의 사용은, 두 인덱스 바코드가 적절하게 측면에 위치함으로써 결정된 바와 같이, 시퀀싱 산물이 실제로 샘플 소스로부터의 진정한 산물임을 더 잘 보장한다. 일부 실시양태에서, 인접 UID 및 인접 샘플 바코드를 포함하는 단리된 샘플 DNA(또는 cDNA) 단편은 PCR 및/또는 시퀀싱을 위한 범용 프라이머를 위한 어닐링 부위를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 시퀀싱을 수행하기 위해 조합될 수 있는 다수의 샘플에 대해 라이브러리가 제조된다. 따라서, 이들 실시양태의 다수에서, 각각의 샘플은 이식 PCR로부터 유래될 수 있는 고유한 샘플-특이적 오류-수정 바코드를 갖는다. 또한, 일부 실시양태에서, 각각의 샘플 라이브러리는 동일한 범용 PCR 프라이머 어닐링 서열(들)을 공유하여, 조합된 샘플이 시퀀싱 전에 동일한 반응에서 증폭되도록 한다. 그리고 일부 실시양태에서, 조합된 샘플은 동일한 반응에서 시퀀싱된다.
일부 실시양태에서, 라이브러리는 (예를 들어) 단일 뉴클레오티드 변이체(SNV), 특히 게놈의 유전자좌와 같은 특정 분자 요소를 검출하는 것을 돕도록 향상된다. 특히 분자 요소가 희귀 및/또는 체세포 SNV인 경우, 검출 한계 이상의 분자 요소를 검출할 수 있기 위해서는 향상이 필요할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 제조된 라이브러리에 대해 표적화된 시퀀싱이 수행된다. 많은 실시양태에서, 포획 혼성화를 이용하여 특정 서열(예를 들어, 관심 게놈 유전자좌의 서열)을 갖는 라이브러리 분자를 선택적으로 풀다운한다. 일부 실시양태에서, 시퀀싱을 통해 유전자좌에서 분자 특징을 검출하기 위해, 라이브러리에서 포획 혼성화를 수행하여 특정 게놈 유전자좌를 갖는 DNA 분자를 풀다운한다. 일부 실시양태에서, 암 및/또는 발암성 병리와 관련된 SNV를 보유하는 것으로 알려진 게놈 유전자좌에서 희귀 및/또는 체세포 SNV를 검출하기 위해, 라이브러리에서 포획 혼성화를 수행한다. 일부 실시양태에서, 종양 샘플의 이전 시퀀싱 결과에서 검출된 바와 같이, SNV를 보유하는 것으로 알려진 게놈 유전자좌에서 희귀 및/또는 체세포 SNV를 검출하기 위해, 라이브러리에서 포획 혼성화를 수행한다.
포획 혼성화(Capture Hybridization)
일부 구현예는 표적화된 시퀀싱을 수행하기 위해 포획 혼성화 기술을 활용한다. 무세포 핵산에 대한 시퀀싱을 수행할 때 특정 게놈 유전자좌에 대한 분해능을 향상시키기 위해 시퀀싱 전에 하이브리드화를 통해 라이브러리 제품을 포획할 수 있다. 포획 혼성화는 특정 게놈 유전자좌의 샘플로부터 체세포 변이체 및/또는 생식계열 변이체를 검출하고자 할 때 특히 유용할 수 있다. 일부 상황에서, 체세포 변이체의 검출은 종양 또는 기타 신생물 공급원에서 유래된 핵산을 포함하는 핵산의 공급원을 나타낸다. 일부 상황에서, 신생물 발병과 관련된 특정 생식계열 변이체의 확인은 신생물이 존재한다는 근거를 제공할 수 있다. 따라서, 포획 혼성화는 무세포 핵산 내에서 순환성-종양 핵산의 검출을 향상시킬 수 있는 도구이다.
포획-기반 시퀀싱 방법에서 관찰되는 가장 일반적인 시퀀싱 아티팩트 중 하나는, 하이브리드 포획 단계 동안 발생하는 구아닌(G)의 산화일 수 있으며, 이는 구아닌을 8-옥소구아닌으로 변환시키는 결과를 가져온다 (예를 들어, 본원에 제공된 in silico 분석). 이 의도하지 않은 시험관 내 산화 결과는, 특히 샘플에서 다형성 변이체를 검색할 때 시퀀싱 결과를 혼동할 수 있는, G>T 전환을 초래할 수 있다. G>T 변환은 생체 내, 특히 신생물 또는 암에서 발생하는 일반적인 돌연변이유발 이벤트일 수 있다. 일부 환경 인자(예를 들어, 자외선, 담배 연기, 자유 라디칼)는 구아닌(G)을 산화시켜 G>T 전환을 유발하므로, 추출 전에 생물학적 공급원 내에서 G>T 전환이 이미 발생했을 수 있다(도 4A 및 4B). 따라서, 교란되는 시험관내 돌연변이유발을 완화하기 위해, 본원에 개시된 바와 같은 이종 항산화 모이어티 중 임의의 하나(예를 들어, 효소 및/또는 항산화제)는 하이브리드 포획 동안 발생하는 산화를 방지할 수 있다. 확인을 위해, 효소 및/또는 반응성 산소종(ROS) 스캐빈저를 사용하여(예를 들어, 최종 혼합물 중 5mM에서) 어떤 스캐빈저가 포획 혼성화 동안 8-옥소구아닌의 시험관내 형성을 방지할 수 있는지 확인하였다. 테스트한 효소에는 우라실-DNA 글리코실라제(UDG), 포름아미도피리미딘[fapy]-DNA 글리코실라제(FPG) 및 카탈라제 효소가 포함된다. 테스트한 항산화제에는 글루타티온(GTT), 하이포타우린 및 아황산나트륨(Na2SO3)이 포함되었다. 일부 이러한 효소 및 화합물, 예를 들어 하이포타우린 및 카탈라아제는 포획 혼성화 동안 8-옥소구아닌의 형성을 개별적으로 완화시키는 것으로 밝혀졌다(도 4A 및 4B).
일부 실시양태에서, 항산화제 및/또는 효소는 하이브리드 포획 어세이 동안 포함된다. 이들 실시양태 중 일부에서, 항산화제는 하이포타우린이다. 다양한 실시양태는 하이포타우린이 혼성화 반응 혼합물에 첨가되는 포획 혼성화 방법에 관한 것이다. 이들 실시양태 중 다수에서, 시퀀싱 준비 동안 발생하는 시퀀싱 결과에서 시험관내 G>T 전환의 검출을 완화하기 위해, 시퀀싱 프로토콜 내에서 하이포타우린이 사용된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 하이포타우린은 이후 시퀀싱 반응에 사용되는 특정 DNA 분자를 포획하는 데 사용된다.
무세포 핵산에서 순환성-종양 핵산의 검출
일부 실시양태는 무세포 핵산 샘플이 순환성-종양 핵산을 포함하는지 여부를 결정하기 위한 컴퓨터 모델의 활용에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 무세포 핵산 샘플의 시퀀싱 결과 내의 SNV 및/또는 CNV는, 그 SNV 및/또는 CNV가 순환성-종양 핵산으로부터 유래되었는지 여부를 결정하기 위해 컴퓨터 모델을 통해 분석된다. 일부 실시양태에서, 컴퓨터 모델은 암 환자 및 영향을 받지 않은 개체로부터 유래된 핵산 샘플에 대해 훈련된다.
일부 실시양태에서, 컴퓨터 모델은 무세포 핵산 시퀀싱 결과 내의 변이체가 순환성-종양 핵산으로부터 유래되었는지 여부를 결정하기 위해 체세포 단일 뉴클레오티드 변이체 모듈을 이용할 수 있다. 체세포 SNV는 신생물 세포에서 유래한 핵산에서 매우 흔하므로, 순환성-종양 핵산에서 흔하다. 따라서, 무세포 핵산 시퀀싱 결과에서 체세포 SNV의 검출은 SNV의 소스가 종양 조직에서 유래한다는 표시를 제공한다.
체세포 SNV는 종종 신생물 조직에서 유래하지만, 검출된 체세포 SNV는 종종 자연적 노화, 클론적 조혈, 및 기타 무해한 공급원들을 포함하는(그러나 이에 제한되지 않음), 신생물 성장 이외의 이유로 인해 발생할 수 있다. 따라서 검출된 SNV가 신생물 공급원에서 유래하는지 여부를 정확하게 예측할 수 있는 시스템을 활용하는 것이 좋다. 일부 실시양태에서, 무세포 핵산 시퀀싱 결과에서 검출된 SNV가 순환성-종양 핵산 분자로부터 진정으로 유래되었는지 여부의 표시를 제공하기 위해 컴퓨터 모델이 이용된다.
일부 실시양태에서, 순환성-종양 핵산 분자로부터 유래된 SNV를 확인하기 위한 모델은, 변이체의 백그라운드 빈도, 무세포 핵산 분자의 단편 크기, 특정 공급원에 공통된 변이 시그니처, 암(또는 특정 암 유형)에서 빈번하게 변이되는 게놈 유전자좌(예를 들어, 발암성 유전자)의 존재, 변이체가 CH에서 유래할 가능성, 및 돌연변이의 존재가 조혈 세포에서의 위치 깊이(positional depth) 및 cfDNA의 변이체의 VAF 에 비해 숙주 조혈 세포에서 자신 있게 평가될 수 있는지 여부를 포함하는 (그러나 이에 제한되지 않음) 각 개별 변이체에 특이적인 생물학적 및 기술적 특징을 통합한다. 예를 들어, 일련의 모델 특징을 사용하여, 특정 SNV가 순환성-종양 핵산 분자에서 유래되었는지 여부 및 모델에 대한 기여도를 결정할 수 있다. 이러한 특징들의 예시적인 세트는 WBC 베이지안 백그라운드(WBC Bayesian background), cfDNA 베이지안 백그라운드(cfDNA Bayesian background), 변이체 대립유전자 빈도(VAF %), 생식선 깊이(germline depth), 평균 바코드 패밀리 크기, 짧은 단편 점수(short fragment score) 1, 짧은 단편 점수 2, 전이/전환, 이중 지원 (duplex support), 통과 이상값(pass outlier), 매핑 품질(mapping quality), 암 핫스팟(cancer hotspot), UMI 오류 수정, Phred 품질(Phred quality), 및 리드 내 변형 위치를 포함한다. 이러한 특징에 대한 자세한 내용은, 예시적인 실시예 섹션을 참조한다. 이러한 특징들의 예시적인 세트는 비소세포 폐암(NSCLC)에서 ctDNA를 식별하기 위해 특별히 개발되었지만, 동일 및/또는 유사한 특징 세트가 범암(pan-cancer) 또는 기타 특정 암에 대한 모델에서도 사용될 수 있다. 따라서, 다양한 실시양태는 하기 특징 중 하나 이상을 통합하는 SNV의 식별을 기반으로 순환성-종양 핵산을 검출하기 위한 모델을 활용한다: 세포-유래 DNA 베이지안 백그라운드, cfDNA 베이지안 백그라운드, 변이 대립유전자 빈도(VAF %), 생식선 깊이, 평균 바코드 패밀리 크기, 짧은 단편 점수 1, 짧은 단편 점수 2, 전이/전환, 이중 지원, 통과 이상값, 매핑 품질, 암 핫스팟, UMI 오류 수정, Phred 품질, 및 리드 내 변형 위치. 일부 실시양태에서, 모델은 이들 특징 중 2개 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 모델은 이들 특징 중 3개 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 모델은 이들 특징 중 4개 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 모델은 이들 특징 중 5개 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 모델은 이러한 특징 중 6개 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 모델은 이들 특징 중 7개 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 모델은 이러한 특징을 8개 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 모델은 이들 특징 중 9개 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 모델은 이러한 특징 중 10개 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 모델은 이러한 특징 중 11개 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 모델은 이러한 특징 중 12개 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 모델은 이러한 특징 중 13개 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 모델은 이러한 특징 중 14개 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 모델은 이러한 특징 중 15가지 모두를 포함한다.
임상적 개입
다양한 실시양태는 임상적 개입을 수행하기 위한 암 검출의 사용에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 개체는, 개체가 암에 가지므로 개입가 수행되어야 함을 나타내기 위해 본원에 기재된 방법에 의해 스크리닝 및 처리된 액체 또는 배출물 생검을 갖는다. 임상적 개입에는 임상 절차 및 치료가 포함된다. 임상 절차에는 혈액 검사, 의료 영상화, 신체 검사, 및 종양 생검이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 치료에는 화학 요법, 방사선 요법, 면역 요법, 호르몬 요법, 표적 약물 요법, 및 의료 감시가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 진단은 암의 특정 단계를 결정하기 위해 수행된다. 일부 실시양태에서, 개인은 의사, 간호사, 영양사 등과 같은 의료 전문가에 의해 평가 및/또는 치료된다.
A. 임상적 개입을 위한 암의 검출
본원에 기재된 일부 실시양태에서, 암은 혈액, 혈청, 뇌척수액, 림프액, 소변 또는 대변으로부터 유래된 무세포 핵산의 시퀀싱 결과를 이용하여 검출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 무세포 핵산의 시퀀싱 결과가 순환성-종양 핵산의 서열을 포함하는지 여부에 대한 보다 강력한 결정을 제공하기 위해, 또 다른 숙주 공급원이 시퀀싱된다(예를 들어, 조혈 세포). 조혈 세포를 시퀀싱에 사용하면 자연적 노화, 클론적 조혈 및 기타 무해한 공급원들에서 유래된 체세포 SNV 및 CNV와 같은 교란 신호를 식별하고 제거하는 데 도움이 될 수 있다. 다양한 실시양태는 표적화된 시퀀싱을 수행하는 실시양태에서 하이브리드 포획 동안 항산화제(예를 들어, 하이포타우린)를 활용한다. 또한, 일부 실시양태는 계산 모델에 의해 제공된 신뢰 점수에 기초하여 무세포 핵산의 시퀀싱 결과가 순환성-종양 핵산의 서열을 포함하는지 여부를 결정하기 위해 본원에 기재된 것을 비롯한 계산 모델을 활용한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 무세포 핵산을 추출, 처리 및 시퀀싱하고, 시퀀싱 결과를 분석하여 암을 검출한다. 이 프로세스는 진단 스캔을 제공하는 임상 환경에서 특히 유용하다.
개인의 진단 스캔을 위한 예시적인 절차는 다음과 같다:
(a) 개인에서 액체 또는 배출물 생검 추출
(b) 무세포 핵산 및 숙주 공급원(예를 들어, WBC)의 준비 및 시퀀싱
(c) 무세포 핵산 시퀀싱 결과 내에서 순환성-종양 핵산 서열을 검출하기 위해 하나 이상의 컴퓨터 모델에서 시퀀싱 결과를 사용
(d) 순환성-종양 핵산 서열의 검출에 기초한 임상적 개입 수행
다양한 실시양태에서, 진단 스캔을, 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 항문암, 성상세포종, 기저 세포 암종, 담관암, 방광암, 유방암, 버킷 림프종, 자궁경부암, 만성 림프성 백혈병 (CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 골수증식성 신생물, 결장직장암, 미만성 거대 B-세포 림프종, 자궁내막암, 상의세포종, 식도암, 감각신경모세포종, 유잉 육종, 자궁관암, 소포성 림프종, 담낭암, 위암, 위장계 유암종, 모발상세포 백혈병, 간세포성 암, 호지킨 림프종, 하인두암, 카포시 육종, 신장암, 랑게르한스 세포 조직구증, 후두암, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 메르켈 세포 암, 중피종, 구강암, 신경모세포종, 비-호지킨 림프종, 비-소 세포성 폐암, 골육종, 난소암, 췌장암, 췌장 신경내분비 종양, 인두암, 뇌하수체 종양, 전립선암, 직장암, 신장 세포 암, 망막모세포종, 피부암, 소 세포성 폐암, 소장암, 편평 경부 암 (squamous neck cancer), T-세포 림프종, 고환암, 흉선종, 갑상선암, 자궁암, 질암 및 혈관 종양 등을 (비-제한적으로) 포함하는 임의 신생물 타입에 대해 수행할 수 있다.
일부 실시양태에서, 진단 스캔은 암의 조기 검출을 제공하기 위해 이용된다. 일부 실시양태에서, 진단 스캔은 I기, II기 또는 III기 암을 갖는 개체에서 암을 검출할 수 있다. 일부 실시양태에서, 진단 스캔을 사용하여 암 치료 후 개체에서 잔류 암을 검출한다.
B. 암 진단 및 치료
일부 실시양태는 개체의 무세포 핵산에 대한 진단 스캔을 수행한 다음, 암을 나타내는 스캔 결과에 기초하여 추가적인 임상 절차를 수행하고 및/또는 개체를 치료하는 것에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 항문암, 성상세포종, 기저 세포 암종, 담관암, 방광암, 유방암, 버킷 림프종, 자궁경부암, 만성 림프성 백혈병 (CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 골수증식성 신생물, 결장직장암, 미만성 거대 B-세포 림프종, 자궁내막암, 상의세포종, 식도암, 감각신경모세포종, 유잉 육종, 자궁관암, 소포성 림프종, 담낭암, 위암, 위장계 유암종, 모발상세포 백혈병, 간세포성 암, 호지킨 림프종, 하인두암, 카포시 육종, 신장암, 랑게르한스 세포 조직구증, 후두암, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 메르켈 세포 암, 중피종, 구강암, 신경모세포종, 비-호지킨 림프종, 비-소 세포성 폐암, 골육종, 난소암, 췌장암, 췌장 신경내분비 종양, 인두암, 뇌하수체 종양, 전립선암, 직장암, 신장 세포 암, 망막모세포종, 피부암, 소 세포성 폐암, 소장암, 편평 경부 암 (squamous neck cancer), T-세포 림프종, 고환암, 흉선종, 갑상선암, 자궁암, 질암 및 혈관 종양 등을 (비-제한적으로) 포함하는 다양한 유형의 신생물이 검출될 수 있다.
일부 실시양태에서, 일단 신생물 성장의 진단이 표시되면, 신체 검사, 의료 영상, 유방 조영술, 내시경 검사, 대변 샘플링, 세포진 검사, 알파 -태아단백 혈액검사, CA-125 검사, 전립선특이항원(PSA) 검사, 생검 적출, 골수흡인, 종양표지자 검출검사 의료 영상화에는 X선, 자기공명영상(MRI), 컴퓨터 단층촬영(CT), 초음파, 양전자방출단층촬영(PET)이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 내시경 검사에는 기관지 내시경, 대장 내시경, 질 확대경, 방광 내시경, 식도 내시경, 위 내시경, 복강경, 신경 내시경, 직장 내시경 및 S상 결장 내시경이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 일단 신생물 성장의 진단이 표시되면, 수술, 화학요법, 방사선 요법, 면역요법, 표적 요법, 호르몬 요법, 줄기 세포 이식 및 수혈을 비롯한 (그러나 이에 제한되지 않음) 일부 치료가 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 알킬화제, 플라티늄 제제, 탁산, 빈카 물질 (vinca agent), 항-에스트로겐 약물, 아로마타제 저해제, 난소 억제제, 내분비/호르몬제, 비스포스포네이트 요법 물질 (bisphophonate therapy agent) 및 표적화된 생물학적 요법 물질 (targeted biological therapy agent)을 포함하는 (그러나 이에 제한되지 않음) 항암 및/또는 화학치료제를 투여한다. 약물로는 사이클로포스파미드, 플루오로우라실 (또는 5-플루오로우라실 또는 5-FU), 메토트렉세이트, 티오테파, 카보플라틴, 시스플라틴, 탁산, 파클리탁셀, 단백질-결합형 파클리탁셀, 도세탁셀, 비노렐빈 (vinorelbine), 타목시펜 (tamoxifen), 랄록시펜 (raloxifene), 토레미펜 (toremifene), 풀베스트란트 (fulvestrant), 겜시타빈 (gemcitabine), 이리노테칸 (irinotecan), 익사베필론 (ixabepilone), 테모졸로미드 (temozolomide), 토포테칸 (topotecan), 빈크리스틴 (vincristine), 빈블라스틴 (vinblastine), 에리불린 (eribulin), 무타마이신 (mutamycin), 카페시타빈 (capecitabine), 카페시타빈 (capecitabine), 아나스트로졸 (anastrozole), 엑세메스탄 (exemestane), 레트로졸 (letrozole), 루프롤라이드, 아바렐릭스 (abarelix), 부세렐린, 고세렐린, 메게스트롤 아세테이트, 리세드로네이트 (risedronate), 파미드로네이트 (pamidronate), 이반드로네이트 (ibandronate), 알렌드로네이트 (alendronate), 졸레드로네이트 (zoledronate), 타이커브 (tykerb), 다우노루비신 독소루비신, 에피루비신 (epirubicin), 이다루비신 (idarubicin), 발루비신 (valrubicin) 미톡산트론 (mitoxantrone), 베박시주맵 (bevacizumab), 세투시맵 (cetuximab), 이필리무맵 (ipilimumab), 아도-트라스투주맵 엠탄신 (ado-trastuzumab emtansine), 아파티닙 (afatinib), 알데스루킨 (aldesleukin), 알렉티닙 (alectinib), 알렘투주맵 (alemtuzumab), 아테졸리주맵 (atezolizumab), 아벨루맵 (avelumab), 액티닙 (axtinib), 벨리무맵 (belimumab), 벨리노스타트 (belinostat), 베박시주맵 (bevacizumab), 블리나투모맵 (blinatumomab), 보르테조밉 (bortezomib), 보수티닙 (bosutinib), 브렌툭시맙 베도틴 (brentuximab vedotin), 브리가티닙 (brigatinib), 카보잔티닙 (cabozantinib), 카나키누맵 (canakinumab), 카르필조밉 (carfilzomib), 세르티닙 (certinib), 세투시맵 (cetuximab), 코비메티닙 (cobimetinib), 크리조티닙 (crizotinib), 다브라페닙 (dabrafenib), 다라투무맵 (daratumumab), 다사티닙 (dasatinib), 데노수맵 (denosumab), 디누툭시맵 (dinutuximab), 두르발루맵 (durvalumab), 엘로투주맵 (elotuzumab), 에나시데닙 (enasidenib), 에를로티닙 (erlotinib), 에베롤리무스 (everolimus), 게피티닙 (gefitinib), 이브리투모맵 티욱세탄 (ibritumomab tiuxetan), 이브루티닙 (ibrutinib), 이델랄리십 (idelalisib), 이마티닙 (imatinib), 이필리무맵 (ipilimumab), 이사조맵 (ixazomib), 라파티닙 (lapatinib), 렌바티닙 (lenvatinib), 미도스타우린 (midostaurin), 네시투무맵 (necitumumab), 네라티닙 (neratinib), 닐로티닙 (nilotinib), 니라파립 (niraparib), 니볼루맵 (nivolumab), 오비누투주맵 (obinutuzumab), 오파투무맵 (ofatumumab), 올라파립 (olaparib), 올라라투맵 (olaratumab), 오시메르티닙 (osimertinib), 팔보시클립 (palbociclib), 파니투무맵 (panitumumab), 파노비노스타트 (panobinostat), 펨브롤리주맵 (pembrolizumab), 퍼투주맵 (pertuzumab), 포나티닙 (ponatinib), 라무시루맵 (ramucirumab), 레고라페닙 (regorafenib), 리보시클립 (ribociclib), 리툭시맵 (rituximab), 로미뎁신 (romidepsin), 루카파립 (rucaparib), 룩솔리티닙 (ruxolitinib), 실투시맵 (siltuximab), 시풀루셀-T (sipuleucel-T), 소니데깁 (sonidegib), 소라페닙 (sorafenib), 템시롤리무스 (temsirolimus), 톡실리주맵 (tocilizumab), 토팍시티닙 (tofacitinib), 토시투모맵 (tositumomab), 트라메티닙 (trametinib), 트라스투주맵 (trastuzumab), 반데타닙 (vandetanib), 베무라페닙 (vemurafenib), 베네토클락스 (venetoclax), 비스모데깁 (vismodegib), 보리노스타트 (vorinostat) 및 지브-아플리베르셉트 (ziv-aflibercept)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 개체는 단일 약물 요법에 의해 또는 본원에 기술된 약물 조합으로 치료할 수 있다. 일반적인 치료 조합은 사이클로포스파미드, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (CMF)이다.
많은 실시양태는 개인의 암 치료 동안 수행되는 진단 또는 동반 진단 스캔에 관한 것이다. 치료 중 진단 스캔을 수행하는 경우, 종양 성장을 치료하는 약제의 능력을 모니터링할 수 있다. 대부분의 항암 치료제는 신생물 세포의 사멸 및 괴사를 초래하며, 이는 이들 세포로부터 테스트될 샘플로 더 많은 양의 핵산을 방출할 수 있다. 따라서, 순환성-종양 핵산의 수준은 치료 동안 증가할 수 있고 신생물 세포의 수가 감소함에 따라 감소하기 시작할 수 있기 때문에, 시간이 지남에 따라 모니터링될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료는 신생물 세포에 대한 치료 효과에 기초하여 조정된다. 예를 들어, 치료가 신생물 세포에 대한 세포독성이 아닌 경우, 투여량을 증가시키거나 세포독성이 더 높은 약제를 투여할 수 있다. 또는 신생물 세포의 세포독성은 좋으나 원치 않는 부작용이 많은 경우에는 투여량을 줄이거나 부작용이 적은 약제를 투여할 수 있다.
다양한 실시양태는 또한, 잔류 질환 및/또는 신생물 성장의 재발을 검출하기 위해 개체의 치료 후에 수행되는 진단 스캔에 관한 것이다. 진단 스캔이 종양 성장의 잔류 및/또는 재발을 나타내는 경우, 본원에 설명된 대로 추가적인 진단 테스트 및/또는 치료를 수행할 수 있다. 종양 성장 및/또는 개체가 재발하기 쉬운 경우에는 진단 스캔을 자주 수행하여 잠재적인 재발을 모니터링할 수 있다.
실시예
본 발명의 실시양태들은 본원에 제공된 여러 실시예를 통해 더 잘 이해될 수 있다. 무세포 핵산 시퀀싱 도구 및 방법에 대한 많은 예시적인 결과가 설명된다. 또한 진단, 특히 비소세포폐암(NLCLC)에 대한 설명도 제공된다.
실시예 1: 비침습성 조기 폐암 검출을 위한 게놈 특징 통합
폐암은 암 사망의 주요 원인이며 대부분의 환자는 일반적으로 치료할 수 없는 전이성 질환으로 진단된다. 그럼에도 불구하고, 국소 질환(I-III기) 환자들 중 상당수가 완치될 수 있어 조기 발견의 유용성을 보여준다. 실제로 저선량 컴퓨터 단층촬영(LDCT) 스캔을 통한 고위험 성인의 스크리닝은 폐암-관련 사망률을 감소시키므로, 결과적으로 고위험 인구에 대한 연간 방사선 검진이 권장될 수 있다. 그 효능에도 불구하고, LDCT 스크리닝은 높은 위발견율(false discovery rate)(>90%)과 현재 미국에서 적격자의 <5% 만이 스크리닝을 받는 낮은 순응성으로 인해 임상적 유용성이 복잡하다. 적격의 방사선 센터에 대한 제한된 접근과 환자의 불편 비롯한 다양한 요인들이 이러한 낮은 채택률에 기여한다. 따라서, 고위험군에서 절제 가능한 조기 폐암의 조기 발견을 개선하기 위한 새로운 접근법에 대한 필요가 여전히 충족되지 않고 있다.
cfDNA의 분석에 기초하여 종양-유래 체세포 변형을 검출할 수 있는 비침습적 혈액 검사는 혈액 표본을 수득하는 것이 상대적으로 쉽기 때문에 암 스크리닝 적용을 위한 매력적인 후보이다. 그러나 현재 임상에서 사용되는 cfDNA 분석은 ctDNA 수준이 초기 단계의 종양 환자보다 상당히 높은 진행성 질환 환자의 비침습적 유전형 분석을 위해 사용된다. 이와는 별도로, 국소 비소세포폐암(NSCLC) 환자의 ctDNA를 조사하는 일부 연구에서는 종양 조직의 유전자형을 먼저 분석해야 하는 종양 정보 접근 방식을 사용할 수 있다. 이 접근 방식은 민감도를 최대화하지만, 스크리닝에는 유용하지 않을 수 있다. 마지막으로, 비-악성 조혈 전구 세포에서 체세포 변경을 획득하고 돌연변이 무세포 DNA 단편을 생성하는 클론성 조혈(CH)은, 조기 암 검출을 위한 ctDNA의 사용을 복잡하게 만든다.
이 실시예에는 초기 단계 암에서 ctDNA 검출 또는 치료 후 잔류 암 검출을 용이하게 하는 딥 시퀀싱(CAPP-Seq)에 의한 암 개인맞춤 프로파일링에 대한 방법론적 향상이 설명되어 있다 (CAPP-Seq 에 대한 보다 자세한 내용은 A. M. Newman Nat. Biotechnol. 34, 547-555 (2016) 을 참고하며, 이 문헌은 원용에 의해 본원에 포함된다). 상기 향상된 방법은 초기 NSCLC 환자의 혈장 및 종양 샘플에 적용되었으며, 처음에는 종양에서 검출 가능한 ctDNA를 방출하는 환자의 비율을 결정하기 위해 종양-정보 전략을 사용하였다. 이 방법은 폐암 환자와 폐암 위험이 높은 대조군의 혈장 샘플을 스크리닝하기 위해 종양-나이브(tumor-na
Figure pct00006
ve) 접근 방식을 사용하여 조기 검출로 확장되었다. 두 경우 모두와 대조군들 유래의 cfDNA가 순환성 체세포 변이체를 보유하고 있는 것으로 확인되었고, 그중 대다수는 CH에 기인할 수 있다. 중요하게도, CH 변이체를 종양-유래 돌연변이와 구별하는 돌연변이 시그니처 및 단편 길이 프로파일을 포함한 주요 분자 특징들이 확인되었다. 마지막으로, 이러한 발견은 비침습성 조기 폐암 검출을 위한 Lung-CLiP (Lung Cancer Likelihood in Plasma) 분석을 개발하고 이를 독립적으로 검증하는 데 활용되었다.
매우 희귀한(ultra-rare) 순환성 변이체의 검출 개선
국소적 폐암에서 ctDNA 수준이 낮고, I기 질환을 갖는 환자의 대부분은 순환성 변이 대립유전자 빈도(VAF) 수준이 약 0.1% 미만인 것으로 입증되었다. 이러한 낮은 대립 유전자 수준의 검출에 대한 민감도를 개선하기 위해, 고유하고 성공적으로 시퀀싱된 cfDNA 분자의 수율을 최대화하는 동시에 관련 시퀀싱 오류 프로파일을 최소화하기 위한 몇 가지 방법론이 개발 및 테스트되었다(도 5).
샘플 교차 오염을 방지하는 이중-인덱스 오류-수정 샘플 바코드(dual-indexed error-correcting sample barcode)를, 고유한 cfDNA 분자들의 보다 정확한 열거 를 가능하게 하는 오류-수정 이중 분자 바코드(error-correcting duplex molecular barcode)(예를 들어, 고유 식별자 또는 'UID')를 조합하여, 라이브러리 제조를 위한 새로운 어댑터 스키마(adapter schema)를 개발하였다. 또한 UID와 샘플 바코드를 분리하면, 적용에 따라 UID 다양성 및 다중화 용량(multiplexing capacity)을 독립적으로 조정할 수 있다.
그런 다음, 우리는 이러한 맞춤 어댑터를 사용하여 고유한 cfDNA 분자의 최대 손실과 관련된 주요 작업을 확인하고자 하였다. 이를 위해 라이브러리 제조 시작부터 CAPP-Seq 분자 생물학 워크플로의 in silico 시뮬레이션 내에서의 이들의 최종 시퀀싱까지 cfDNA 단편의 개별 가닥을 추적하였다. 이 시뮬레이션은, 하이브리드 포획 작업에서 가장 큰 손실이 발생했으며 표적 농축을 위한 하이브리드화 반응에 각 증폭된 시퀀싱 라이브러리의 작은 부분(small fraction)만 일반적으로 입력하기 때문이라고 예측하였다. 이러한 효과는 PCR 후 원래 분자의 불균일한 표현으로 인해 발생한다. 많은 하이브리드 포획 시퀀싱 방법은 포획 작업에서 샘플을 다중화하므로(예를 들어, 단일 반응에서 많은 샘플을 함께 포획함) 포획되는 각 라이브러리의 총량의 작은 부분이 발생할 수 있다. 예를 들어, 각 시퀀싱 라이브러리가 2,000ng 이고 20개의 샘플을 단일 1,000ng 포획 반응으로 다중화하려는 경우, 각 개별 시퀀싱 라이브러리의 2.5% (50ng)만이 포획 반응에 입력된다. 반응에 대한 라이브러리 입력의 비율을 증가시키면 분자 회복이 개선된다. 예를 들어, 라이브러리 입력의 분율을 8.3%에서 100%로 증가시키면, 총 고유 분자 및 두 가닥이 시퀀싱된 소스 cfDNA 듀플렉스의 분율 모두의 회복이 크게 개선되었다. 특히, 시퀀싱 라이브러리의 입력 백분율을 8.3%에서 25%로 증가시키면, 고유한 분자 회복에서 가능한 대부분의 이득이 달성되고, 50% 이상을 입력하면 두 가닥이 시퀀싱된 원래 cfDNA 듀플렉스의 분율이 개선되었다. 또한, 바이트(bait)(예를 들어, 관심 게놈 영역을 농화하는 데 사용되는 비오틴화된 올리고뉴클레오티드)를 포획하기 위한 시퀀싱 라이브러리 입력의 비율 역시, 포획 반응 후 분자 회복에 영향을 미친다.
CAPP-Seq의 기술적 오류 프로파일을 추가적으로 개선하고자 하였다. CAPP-Seq 및 기타 하이브리드 포획 기반 시퀀싱 방법들에서 관찰되는 가장 일반적인 시퀀싱 아티팩트는, 하이브리드 포획 반응 중에 발생하고 8-옥소구아닌의 생성으로 이어지는 산화 손상으로 인해 발생하는, G>T 전환이다 (A. M. Newman, et al., Nat. Biotechnol. (2016), cited supra; and M. Costelleo, et al., Nucleic Acids Res. 41, 1-12 (2013) 을 참고하며, 이 문헌은 원용에 의해 본원에 포함된다). 흥미롭게도, G>T 전환은 또한 폐암에서 가장 흔한 염기 치환이며, 담배 연기의 발암 물질에 노출된 결과 생체 내에서 발생한다(도 4A 및 4B). 따라서, 하이브리드 포획 동안 시험관내 산화로부터의 G>T 전환은 진정한 폐암-유래 돌연변이의 검출을 모방하고 교란시킬 수 있다. 반응성 산소종(ROS)의 스캐빈저를 추가하면 산화 손상으로 인한 G>T 아티팩트가 감소할 것으로 가정되었다(도 4A 및 4B).
생물학적 샘플(예를 들어, 종양 생검 샘플)로부터 DNA를 추출하고, 정량화 및 단편화하고, 전단된 DNA(예를 들어, 약 100나노그램 미만)를 라이브러리 제조에 사용하였다 (예를 들어, 샘플 바코드를 포함하는 어댑터에 커플링함). 라이브러리 제조 후 하이브리드 포획(예를 들어, SeqCap EZ Choice, NimbleGen)를 수행하였다. 이 연구는 폐암에서 반복적으로 돌연변이되는 255개 유전자와 클론적 조혈과 정규적으로 연관된 11개 유전자를 표적으로 하는 맞춤형 355kb NSCLC 집중 패널을 활용하였다. 이종 항산화 모이어티(예를 들어, 하이포타우린)를 최종 작업 농도(예를 들어, 5mM)로 하이브리드 포획 반응에 추가한 것을 제외하고는, 제조업체의 프로토콜에 따라 하이브리드 포획를 수행하였다. 모든 포획 단계는 47 ℃의 열 순환기에서 수행하였다. 농축 후 라이브러리는 2 X 150-bp 페어드-엔드 리드를 이용하여 (예를 들어, Illumina HiSeq4000 에서) 시퀀싱하였다. 시퀀싱 레인 점유율은 cfDNA 입력 및 원하는 바코드 패밀리 크기를 기반으로 결정되었다. 중앙값 시퀀싱 깊이는 사례의 경우 23,570Х/5,012Х (nominal/unique)이고 대조군의 경우 19,534Х/4,075Х 였다.
여러 항산화제 및 자유 라디칼 스캐빈저를 테스트한 결과, 설핀산인 하이포타우린이 유리한 후보로 확인되었다. 하이포타우린은 시스테인에서 타우린으로의 경로의 자연 발생 중간체이며 ROS에 대한 비-효소적 보호 효과를 갖는다. 하이포타우린의 존재 및 부재에서 건강한 성인 12명의 cfDNA 샘플의 오류 프로파일을 비교했을 때, ROS 스캐빈저로 포획한 샘플은 백그라운드 오류율이 현저히 낮고 G>T 오류가 더 적었다(Wilcoxon rank-sum test P < 0.001, 도 6). 하이포타우린의 부재에서 포획된 69개의 대조군 cfDNA 샘플과 비교시 ROS 스캐빈저로 포획된 104개의 건강한 대조군 cfDNA 샘플에서, G>T 오류 (모든 오류의 16% vs 57%, Wilcoxon rank-sum test, P < 1x10-8) 및 백그라운드 오류 비율(약 50% 감소, Wilcoxon rank-sum test, P < 0.0001)의 유사한 상대적 감소가 관찰되었다 (도 7).
혈장에서 폐암 가능성을 추정하는 방법
Lung-CLiP (Lung Cancer Likelihood in Plasma) 분석이 개발되었다. 종양 변이체에 대한 사전 지식을 사용하지 않고, 혈장 샘플이 종양-유래 cfDNA를 포함할 가능성을 추정하기 위해 확률론적 접근을 사용하였다. 이 접근 방식은 혈장 cfDNA 및 매치되는 백혈구의 딥 시퀀싱을 포함하며, SNV 및 게놈-와이드 카피 수 분석을 통합한다. Lung-CLiP 분석은 4개 암 센터에서 매년 폐암 방사선 검진을 받는 104명의 폐암 환자와 56명의 고위험 대조군의 샘플을 사용하여 훈련되었다. 이 분석을 개발하기 위해, 모델이 먼저 훈련되어 주어진 cfDNA SNV가 종양-유래일 확률을 추정하는, 다계층 머신 러닝(multi-tiered machine learning) 접근 방식을 사용하였다. SNV 모델은 백그라운드 빈도, cfDNA 단편 크기, 흡연 시그니처 기여도, NSCLC에서 자주 돌연변이되는 유전자의 존재, 및 CH 가능성을 포함하는, 각 개별 변이체에 특이적인 주요 생물학적 및 기술적 특징을 활용한다. 또한, CNV(카피 수 변이체)를 식별하기 위해, 게놈을 5MB 영역으로 분류하고 CAPP-Seq의 온- 및 오프- 타겟 시퀀싱 리드 모두를 사용하여 게놈-와이드 카피 수 변경을 식별하였다. SNV 모델의 결과는, 주어진 혈액 샘플이 폐암 유래 cfDNA 를 포함할 가능성을 추정하는 최종 환자-수준 확률적 분류기 내에서(즉, "CLiP 점수") 게놈-와이드 카피 수 변경(온- 및 오프- 타겟 시퀀싱 리드 분석을 통해 생성됨)과 통합되었다.
Lung-CLiP 점수를 종양-정보 ctDNA 수준 및 임상병리학적 특징과 비교하였다. 중요하게도, 98% 특이성의 민감도는 종양-정보 ctDNA 분석을 사용하여 관찰된 것과 크게 다르지 않았으며, 이는 Lung-CLiP가 종양-정보 ctDNA 검출과 유사한 민감도를 달성함을 나타낸다.
연구 설계 및 환자
이 연구에서 분석된 모든 생체 표본은 Stanford University, MD Anderson Cancer Center, Mayo Clinic, Vanderbilt University Medical Center, 및 Massachusetts General Hospital 을 비롯한 각각의 센터에서 Institutional Review Board 승인 프로토콜에 등록된 개체로부터 사전 동의하에 수집되었다. 모든 환자는 신원이 확인되지 않았고 AJCC v7 I-III기 NSCLC를 가졌고 수술 또는 방사선 요법으로 치료 목적의 치료를 받았다.
이 연구는 2개의 코호트, 즉 발견 코호트 및 검증 코호트로 구성되었다. 발견 코호트는 (1) 종양-정보 NSCLC 환자 및 (2) Lung-CLiP 훈련 NSCLC 사례의 두 그룹의 환자로 구성되었다. 이 두 그룹은 2009년 11월부터 2018년 7월 사이에 Stanford University (n=80), Vanderbilt University (n=21), Mayo Clinic (n=14) 및 MD Anderson Cancer Center (n=7)에 등록한 폐암 환자로 구성되었다. 종양-정보 NSCLC 사례는 이용 가능한 매치되는 종양 조직을 가진 85명의 환자로 구성되었으며, 대부분(67/85)은 도 5에 설명된 개선된 CAPP-Seq 워크플로의 모든 측면으로 분석되었다. Lung-CLiP 훈련 그룹은 개선된 워크플로우로 분석된 환자에게만 제한되었고(n=104) Lung-CLiP 분류기의 훈련 그룹 역할을 하는 종양-나이브 분석을 위해 연구되었다. Lung-CLiP 훈련 NSCLC 사례 104건 중 67건이 종양-정보 그룹의 85명 환자와 중복된다. 비침습적 분류기의 초기 훈련 후, 독립 검증 코호트(46건의 폐암 사례)의 NSCLC 환자는 2018년 1월과 12월 사이에 Massachusetts General Hospital (MGH)에 전향적으로 등록되었다.
발견 코호트는 2개의 개별 대조군으로 구성되었다. 첫 번째 그룹은 위험에 대해 매치되지 않는 42명의 성인 헌혈자로 구성되었다("저위험 대조군"). 두 번째 그룹은 스탠포드 대학에서 폐암에 대한 음성의 저선량 컴퓨터 단층 촬영(LDCT) 스크리닝 스캔을 받았으며 Lung-CLiP 분류기의 훈련 그룹 역할을 하는, 연령, 성별 및 흡연 상태가 매치되는 성인 56명("위험-매치 대조군")으로 구성되었다. 검증 코호트에는 2018년 1월과 12월 사이에 전향적으로 등록된, 매사추세츠 종합 병원에서 LDCT 검사를 받는 48명의 위험-매치 성인으로 구성된 세 번째 대조군이 포함되었다. 이 대조군은 Lung-CLiP 모델의 검증에만 고려되었다.
혈액 수집 및 처리
K2EDTA 튜브에 수집된 전혈은 즉시 또는 4℃에서 보관 후 4시간 이내에 처리하였다. Cell-Free DNA BCT(STRECK) 튜브에 수집된 전혈은 72시간 이내에 처리하였다. K2EDTA 튜브를 1,800 x g에서 10분 동안 1회 원심분리하고 STRECK 튜브를 실온에서 1,600 x g에서 10분 동안 2회 원심분리하였다. 원심분리 후, 혈장은 cfDNA가 분리될 때까지 -80℃에서 1.8ml 분취량으로 저장하였다. 혈장이 고갈된 전혈은 백혈구로부터 DNA 분리를 위해 -80℃에서 보관하였다.
무세포 DNA는 QIAamp 순환성 핵산 키트 (Qiagen)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 2 내지 16mL의 혈장(3.6mL의 중앙값)에서 추출하였다. 분리 후 Qubit dsDNA 고감도 키트(Thermo Fisher Scientific) 및 고감도 NGS 단편 분석기(Agilent)를 사용하여 cfDNA를 정량화하였다. Qiagen DNeasy 혈액 및 조직 키트를 사용하여, 매치되는 혈장-고갈된 전혈(즉, "WBC" 또는 "백혈구")의 게놈 DNA(gDNA)를 추출하고, Qubit dsDNA 고감도 키트를 사용하여 정량화하고, Covaris S2 초음파 처리기를 사용하여 170bp의 표적 크기로 단편화하였다. 초음파 처리 후, 단편화된 gDNA를 QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen)를 사용하여 정제하였다. cfDNA의 경우 중앙값 38 ng (8-85 ng)을 라이브러리 제조에 입력하였다. 사용 가능한 경우 단편 분석기 데이터를 기반으로 50-450 bp 크기 범위에서 40ng의 cfDNA 입력을 목표로 하여, DNA 입력을 조정하여 고분자량 DNA 오염을 제어하였다. 백혈구의 gDNA의 경우 ≤100ng의 단편화된 gDNA를 라이브러리 제조에 입력하였다.
검증 코호트의 예상 수집과 관련된 Logistical 고려사항은 STRECK 혈액 수집 튜브의 사용을 필요로 하는 반면, K2EDTA 수집 튜브는 훈련 코호트에 사용되었다. 검증 코호트(즉, 사례 및 대조군) 내의 모든 샘플이 STRECK 튜브에서 수집되었기 때문에, 본 연구 설계는 사례 대 대조군의 분류를 유도하는 사전 분석 변수를 방지한다. 그럼에도 불구하고, 수집 튜브의 유형이 Lung-CLiP 모델을 혼동하지 않는다는 것을 확인하기 위해, K2EDTA 및 STRECK 튜브에 3명의 건강한 기증자로부터의 혈액을 수집하고, Lung-CLiP 분류, cfDNA 돌연변이 일치성, 단편 크기, cfDNA 농도, 분자 회복 및 오류 프로파일을 포함한 주용 지표들을 비교한 결과, 이들 중 어느 것도 사용된 수집 튜브의 유형에 따라 크게 영향을 받지 않는 것으로 나타났다.
종양 조직 수집 및 처리
종양 DNA는 Qiagen DNeasy 혈액 및 조직 키트를 사용하여 동결된 생검 샘플에서 또는 Qiagen AllPrep DNA/RNA FFPE 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 FFPE 생검 샘플에서 추출하였다. 추출 후, 혈장이 고갈된 전혈로부터의 gDNA와 동일한 방식으로 DNA를 정량화하고 단편화하고, ≤100ng의 전단된 DNA를 라이브러리 제조에 입력하였다.
라이브러리 제조 및 시퀀싱
새로운 어댑터 스키마인, FLexible Error-correcting dupleX adapters ("FLEX adapters")는, 샘플 바코드가 포함된 부분으로부터 이중 분자 바코드(즉, 고유 식별자 또는 "UID")를 포함하는 어댑터 부분을 분리하도록 개발되었다. FLEX 어댑터는 최적화된 GC 함량 및 시퀀스 다양성과 함께 8bp 샘플 바코드 (pairwise edit distance≥ 5) 및 6bp 오류 수정 UID (pairwise edit distance ≥ 3)의 이중-인덱스를 사용한다. KAPA Hyper Prep Kit 제조업체의 지침에 따라, 말단 수리, A-테일링, 및 어댑터 결찰을, 4℃ 에서 밤새 수행한 결찰과 함께 수행하였다. 6 bp UID 및 연결에 필요한 T 돌출부를 포함하는 부분 Y 어댑터를 사용하여 어댑터 결찰을 수행하였다. 결찰 후, SPRIselect 자기 비드(Beckman Coulter)를 사용하여 비드 클린업을 수행하였다. 다음으로, 이중-인덱스 8 bp 샘플 바코드 및 기능적 Illumina 시퀀싱 라이브러리를 만드는 데 필요한 나머지 어댑터 시퀀스를 추가하기 위해 "그래프팅 PCR"을 수행하였다. 또 다른 SPRI 비드 클린업 후, 범용 PCR을 수행하였다.
라이브러리 준비 후, 하이브리드 포획(SeqCap EZ Choice, NimbleGen)을 수행하였다. 이 연구에서는 폐암에서 반복적으로 돌연변이되는 255개 유전자와 클론적 조혈과 정규적으로 연관된 11개 유전자를 표적으로 하는 맞춤형 355kb NSCLC 집중 패널을 활용하였다. 하이브리드 포획은 예를 들어 이종 항산화 모이어티(예를 들어, 하이포타우린)의 존재 하에 수행되었다. 농축 후 라이브러리는 2x150 bp 페어드-엔드 리드를 이용하여 Illumina HiSeq4000 상에서 시퀀싱하였다.
시퀀싱 데이터 분석 및 변이체 호출
Fastq 파일은, 8bp 샘플 바코드와 6bp UID 모두가 오류-수정 후 예상 시퀀스와 매치되는 경우에만 판독 쌍이 고려되는 맞춤형 파이프라인을 사용하여 역다중화하였다. 역다중화 후 UID를 제거하고, 짧은 조각들을 보존하기 위해 AfterQC를 사용하여 리드의 3' 말단에서 어댑터 리드-스루를 트리밍하였다. BWA ALN을 사용하여 인간 참조 게놈(hg19)에 대해 리드를 정렬하였다.
오류 억제 및 변이체 호출: 분자 바코드-매개 오류 억제 및 백그라운드 폴리싱을 이전에 설명된 대로 수행하였다(A. M. Newman, Nat. Biotechnol. (2016), cited supra 참조). 본원에 개시된 바와 같이 이종 항산화 모이어티(예를 들어, 하이포타우린)를 갖는 샘플을 포획함으로써 제공되는 개선된 오류 프로파일을 활용하기 위해, 하이포타우린으로 포획된 12개의 보류된 건강한 대조군 혈장 샘플로부터 구축된 백그라운드 데이터베이스를 백그라운드 폴리싱에 사용하였다. 오류 억제 후, 딥 시퀀싱 데이터로부터 낮은 대립유전자 빈도 변이체의 검출을 위해 최적화된 맞춤형 변이체 호출 알고리즘을 사용하여 이전에 설명된 바와 같이 선택기-전체 단일 뉴클레오티드 변이체(SNV) 호출을 수행하였다(A. M. Newman, Nat. Biotechnol. (2016) 참조, 위에서 언급됨).
"적응형 변이 호출(adaptive variant calling)"이라고 하는 이 접근 방식은, 각 샘플 내 위치별 변이체 호출 임계값을 결정하기 위해 백그라운드 오류율의 로컬 및 전역 변동을 고려한다.
균등론
전술한 발명의 설명은 많은 특정 실시양태들을 포함하지만, 이들은 본 발명의 범위에 대한 제한으로서 해석되어서는 안되며, 오히려 이의 일 실시양태의 예시로서 해석되어야 한다. 따라서, 본 발명의 범위는 예시된 실시양태들이 아니라 첨부된 특허청구범위 및 그 균등물에 의해 결정되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University <120> SYSTEMS AND METHODS FOR PROTECTING NUCLEIC ACID MOLECULES <130> S31-06342.PCT2 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 527 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Asp Ser Arg Asp Pro Ala Ser Asp Gln Met Gln His Trp Lys 1 5 10 15 Glu Gln Arg Ala Ala Gln Lys Ala Asp Val Leu Thr Thr Gly Ala Gly 20 25 30 Asn Pro Val Gly Asp Lys Leu Asn Val Ile Thr Val Gly Pro Arg Gly 35 40 45 Pro Leu Leu Val Gln Asp Val Val Phe Thr Asp Glu Met Ala His Phe 50 55 60 Asp Arg Glu Arg Ile Pro Glu Arg Val Val His Ala Lys Gly Ala Gly 65 70 75 80 Ala Phe Gly Tyr Phe Glu Val Thr His Asp Ile Thr Lys Tyr Ser Lys 85 90 95 Ala Lys Val Phe Glu His Ile Gly Lys Lys Thr Pro Ile Ala Val Arg 100 105 110 Phe Ser Thr Val Ala Gly Glu Ser Gly Ser Ala Asp Thr Val Arg Asp 115 120 125 Pro Arg Gly Phe Ala Val Lys Phe Tyr Thr Glu Asp Gly Asn Trp Asp 130 135 140 Leu Val Gly Asn Asn Thr Pro Ile Phe Phe Ile Arg Asp Pro Ile Leu 145 150 155 160 Phe Pro Ser Phe Ile His Ser Gln Lys Arg Asn Pro Gln Thr His Leu 165 170 175 Lys Asp Pro Asp Met Val Trp Asp Phe Trp Ser Leu Arg Pro Glu Ser 180 185 190 Leu His Gln Val Ser Phe Leu Phe Ser Asp Arg Gly Ile Pro Asp Gly 195 200 205 His Arg His Met Asn Gly Tyr Gly Ser His Thr Phe Lys Leu Val Asn 210 215 220 Ala Asn Gly Glu Ala Val Tyr Cys Lys Phe His Tyr Lys Thr Asp Gln 225 230 235 240 Gly Ile Lys Asn Leu Ser Val Glu Asp Ala Ala Arg Leu Ser Gln Glu 245 250 255 Asp Pro Asp Tyr Gly Ile Arg Asp Leu Phe Asn Ala Ile Ala Thr Gly 260 265 270 Lys Tyr Pro Ser Trp Thr Phe Tyr Ile Gln Val Met Thr Phe Asn Gln 275 280 285 Ala Glu Thr Phe Pro Phe Asn Pro Phe Asp Leu Thr Lys Val Trp Pro 290 295 300 His Lys Asp Tyr Pro Leu Ile Pro Val Gly Lys Leu Val Leu Asn Arg 305 310 315 320 Asn Pro Val Asn Tyr Phe Ala Glu Val Glu Gln Ile Ala Phe Asp Pro 325 330 335 Ser Asn Met Pro Pro Gly Ile Glu Ala Ser Pro Asp Lys Met Leu Gln 340 345 350 Gly Arg Leu Phe Ala Tyr Pro Asp Thr His Arg His Arg Leu Gly Pro 355 360 365 Asn Tyr Leu His Ile Pro Val Asn Cys Pro Tyr Arg Ala Arg Val Ala 370 375 380 Asn Tyr Gln Arg Asp Gly Pro Met Cys Met Gln Asp Asn Gln Gly Gly 385 390 395 400 Ala Pro Asn Tyr Tyr Pro Asn Ser Phe Gly Ala Pro Glu Gln Gln Pro 405 410 415 Ser Ala Leu Glu His Ser Ile Gln Tyr Ser Gly Glu Val Arg Arg Phe 420 425 430 Asn Thr Ala Asn Asp Asp Asn Val Thr Gln Val Arg Ala Phe Tyr Val 435 440 445 Asn Val Leu Asn Glu Glu Gln Arg Lys Arg Leu Cys Glu Asn Ile Ala 450 455 460 Gly His Leu Lys Asp Ala Gln Ile Phe Ile Gln Lys Lys Ala Val Lys 465 470 475 480 Asn Phe Thr Glu Val His Pro Asp Tyr Gly Ser His Ile Gln Ala Leu 485 490 495 Leu Asp Lys Tyr Asn Ala Glu Lys Pro Lys Asn Ala Ile His Thr Phe 500 505 510 Val Gln Ser Gly Ser His Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ala Asn Leu 515 520 525

Claims (56)

  1. (i) 핵산 분자 및 (ii) 설핀산 기를 포함하는 이종 항산화 모이어티
    를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    이종 항산화 모이어티가 하기 구조를 갖는 것인, 조성물:
    Figure pct00007

    상기 식에서, R1은 C1-C6 알킬아민임.
  3. 제1항에 있어서,
    이종 항산화 모이어티가 하이포타우린(hypotaurine)인, 조성물.
  4. (i) 핵산 분자 및 (ii) 반응성 산소종의 분해를 유도할 수 있는 올리고머 단백질을 포함하는 이종 항산화 모이어티
    를 포함하는 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    올리고머 단백질이 카탈라제인, 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    카탈라제가 서열번호 1에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것인, 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    이종 항산화 모이어티가 핵산 분자의 하나 이상의 뉴클레오티드의 전환을 감소시키는 것인, 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 전환이 퓨린에서 피리미딘으로의 점 돌연변이를 포함하는 것인, 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 전환이 구아닌에서 티민으로의 점 돌연변이 또는 그 반대를 포함하는 것인, 조성물.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물이 약 47℃에서 약 8시간 동안 있을 때, 상기 조성물은, 이종 항산화 모이어티가 결여된 상응하는 대조군 조성물과 비교하여, 핵산 분자의 하나 이상의 뉴클레오티드의 감소된 전환을 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 그 이상 경험하는 것인, 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물 중 이종 항산화 모이어티의 양이 약 0.1 밀리몰 내지 약 100 밀리몰인, 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 조성물 중 이종 항산화 모이어티의 양이 약 0.5 밀리몰 내지 약 50 밀리몰인, 조성물.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 조성물 중 이종 항산화 모이어티의 양이 약 1 밀리몰 내지 약 10 밀리몰인, 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물 내의 핵산 분자를 포함하는 핵산 분자 집단의 양이 약 10 나노몰 내지 약 10 마이크로몰인, 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 조성물 중 핵산 분자 집단의 양이 약 100 나노몰 내지 약 1 마이크로몰인, 조성물.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 조성물 중 핵산 분자 집단의 양이 약 100 나노몰 내지 약 300 나노몰인, 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    혈장 샘플을 포함하고, 상기 혈장 샘플이 핵산 분자를 포함하는 것인, 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    단리된 데옥시리보핵산(DNA) 샘플을 포함하고, 상기 단리된 DNA 샘플은 핵산 분자를 포함하는 것인, 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산 분석 샘플을 포함하고, 상기 핵산 분석 샘플이 핵산 분자를 포함하는 것인, 조성물.
  20. 제19항에 있어서,
    핵산 분자의 풀로부터 핵산 분자를 포획하도록 설계된 하나 이상의 핵산 프로브를 추가로 포함하는, 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    (1) 핵산 리가제, (2) 핵산 폴리머라제, 또는 (3) 핵산 분자의 적어도 일부의 시퀀싱을 위한 핵산 헬리카제를 추가로 포함하는, 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산 분자가 무세포(cell-free) 핵산 분자인, 조성물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물이 생체외(ex vivo) 또는 시험관내(in vitro) 조성물인, 조성물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산 분자가 개체로부터의 생물학적 샘플로부터 유래된 것인, 조성물.
  25. 제24항에 있어서,
    개체가 인간 개체인, 조성물.
  26. 제24항에 있어서,
    개체가 대조군과 비교하여 더 많은 산화 스트레스에 노출되었거나 노출된 것으로 의심되는, 조성물.
  27. (i) 핵산 분자 및 (ii) 설핀산 기를 포함하는 이종 항산화 모이어티를 혼합하는 단계를 포함하는, 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    이종 항산화 모이어티가 하기 구조를 갖는 것인, 방법:
    Figure pct00008

    상기 식에서, R1은 C1-C6 알킬아민임.
  29. 제27항에 있어서,
    이종 항산화 모이어티가 하이포타우린인, 방법.
  30. (i) 핵산 분자 및 (ii) 반응성 산소종의 분해를 유도할 수 있는 올리고머성 단백질을 포함하는 이종 항산화 모이어티를 혼합하는 단계를 포함하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    올리고머 단백질이 카탈라제인, 방법.
  32. 제31항에 있어서,
    카탈라제가 서열번호 1에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것인, 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    이종 항산화 모이어티가 핵산 분자의 하나 이상의 뉴클레오티드의 전환을 감소시키는 것인, 방법.
  34. 제33항에 있어서,
    상기 전환이 퓨린에서 피리미딘으로의 점 돌연변이를 포함하는 것인, 방법.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 전환이 구아닌에서 티민으로의 점 돌연변이를 포함하는 것인, 방법.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산 분자 및 이종 항산화 모이어티를 포함하는 혼합물을 약 47℃에서 약 8시간 동안 처리할 때, 상기 혼합물은, 이종 항산화 모이어티가 결여된 상응하는 대조군 조성물과 비교하여, 핵산 분자의 하나 이상의 뉴클레오티드의 감소된 전환을 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 그 이상 경험하는 것인, 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    혼합 시, 이종 항산화 모이어티의 양이 약 0.1 밀리몰 내지 약 100 밀리몰인, 방법.
  38. 제37항에 있어서,
    혼합 시, 이종 항산화 모이어티의 양이 약 0.5 밀리몰 내지 약 50 밀리몰인, 방법.
  39. 제37항에 있어서,
    혼합 시, 이종 항산화 모이어티의 양이 약 1 밀리몰 내지 약 10 밀리몰인, 방법.
  40. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    혼합 시, 혼합물 내의 핵산 분자를 포함하는 핵산 분자 집단의 양이 약 10 나노몰 내지 약 10 마이크로몰인, 방법.
  41. 제40항에 있어서,
    혼합물 중 핵산 분자 집단의 양이 약 100 나노몰 내지 약 1 마이크로몰인, 방법.
  42. 제40항에 있어서,
    혼합물 중 핵산 분자 집단의 양이 약 100 나노몰 내지 약 300 나노몰인, 방법.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 핵산 분자를 포함하는 혈장 샘플 및 (ii) 설핀산 기를 포함하는 이종 항산화 모이어티를 혼합하는 단계를 포함하는, 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 핵산 분자를 포함하는 단리된 데옥시리보핵산(DNA) 샘플 및 (ii) 설핀산 기를 포함하는 이종 항산화 모이어티를 혼합하는 단계를 포함하는, 방법.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산 분자가 무세포(cell-free) 핵산 분자인, 방법.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혼합이 생체외(ex vivo) 또는 시험관내(in vitro) 조성물에서 수행되는 것인, 방법.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산 분자가 개체의 생물학적 샘플로부터 유래된 것인, 방법.
  48. 제47항에 있어서,
    개체가 인간 개체인, 방법.
  49. 제47항에 있어서,
    개체가 대조군과 비교하여 더 많은 산화 스트레스에 노출되었거나 노출된 것으로 의심되는 것인, 방법.
  50. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 핵산 분자 및 (ii) 이종 항산화 모이어티를 포함하는 혼합물을, 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일 동안 저장하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서,
    혼합 전, 혼합과 동시에 또는 혼합 후에 하나 이상의 핵산 프로브를 통해 핵산 분자를 포획하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  52. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
    혼합 후에, 핵산 분자의 적어도 일부를 시퀀싱하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  53. 장치의 표면에 커플링된 이종 항산화 모이어티를 포함하는, 핵산 분자를 고정하기 위한 장치로서,
    상기 이종 항산화 모이어티가 설핀산 기를 포함하는 것인, 장치.
  54. 반응 혼합물에서 반응성 산소종 스캐빈저 또는 효소를 이용하여 서열 라이브러리 제조를 수행하는 단계를 포함하는,
    시퀀싱 라이브러리 제조 동안 발생하는 뉴클레오티드 전환을 완화하는 방법.
  55. 제54항에 있어서,
    서열 포획 반응이 반응 혼합물에서 반응성 산소종 스캐빈저 하이포타우린을 이용하여 수행되는 것인, 방법.
  56. 제54항 또는 제55항에 있어서,
    반응성 산소종 스캐빈저가 글루타티온, 하이포타우린, 또는 아황산나트륨이고; 효소는 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG), 포름아미도피리미딘 [fapy]-DNA 글리코실라제 (FPG), 또는 카탈라제 효소인, 방법.
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