KR20220145135A - 휴대용 디지털 pcr 진단 시스템 및 이를 이용한 디지털 pcr 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 휴대용 디지털 PCR 진단 시스템 및 디지털 PCR 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 PCR 시스템은 소형화된 디지털 PCR 시스템에서 플라즈모닉 기반의 히팅으로 작동하여 빠른 시간 안에 DNA 증폭과정을 수행할 수 있고, PCR이 완료된 시료에서 다수의 질병을 한 번에 진단할 수 있어, 다양한 질병의 진단에 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 휴대용 디지털 PCR 진단 시스템 및 디지털 PCR 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 소형화된 디지털 PCR 시스템에서 플라즈모닉 기반의 히팅으로 작동하여 빠른 시간 안에 DNA 증폭과정을 수행할 수 있고, PCR이 완료된 시료에서 다수의 질병을 한 번에 진단할 수 있는 장치 및 방법에 관한 것이다.
중합효소 연쇄 반응 (이하 'PCR')은 표적 시료를 간편하고 신속하게 증폭시킬 수 있는 분석 기술로서, 바이러스 또는 세균 감염을 원인으로 하는 질병 진단, 특히 수요가 증가하고 있는 POC (Point of Care) 진단 분야에서 유용하게 활용되고 있다.
실시간 PCR (이하 'qPCR')은 PCR의 매 주기마다 증폭 산물을 실시간으로 관찰하는 방법으로, 기존의 PCR 대비 정확도 및 민감도가 뛰어난 점, 결과의 정량화가 용이한 점, 자동화가 가능한 점, 분석 방식이 신속하고 간편한점 등의 장점이 있다. 최근에 개발된 디지털 PCR (이하 'dPCR')은 표적 시료를 다수의 구획에 나누어 포획한 후 각 구획에서 개별적으로 반응을 시키는 방법으로, 소량의 시료를 대상으로 하고, 각 구획에는 하나의 복제시료 가 존재하거나 복제시료가 존재하지 않음을 분석의 전제로 하고 있어, 민감도 및 정확도, 그리고 결과의 정량화 측면에서 qPCR 보다 우수한 것으로 알려져 있다.
PCR 주기는 변성(denaturation), 결합(annealing), 신장(elongation)의 3단계로 이루어지며, 각각의 단계는 서로 다른 불연속적인 온도 조건을 필요로 한다. 따라서 각각의 단계에서 요구되는 온도 조건에 따라 시료를 신속하게 가열 및 냉각시킬 수 있으며, 현장 진단에 적용이 용이하도록 간단하고 간편한 열 순환(가열 및 냉각) 시스템이 요구된다.
다만, 기존의 PCR 시스템은 전력소비가 상대적으로 크고, 시스템 전체의 부피가 상당해 휴대성이 떨어지는 단점이 있었다. 한편, 최근 코로나 바이러스가 전 세계적으로 확산됨에 따라 현장진단의 수요가 급증하고 있으며, 또한, 최근 코로나 바이러스가 전 세계적으로 확산됨에 따라 현장진단의 수요가 급증하고 있으며, 이를 위한 휴대용 진단 시스템 개발의 필요성이 대두되고 있다.
이러한 배경에서, 휴대성이 뛰어나고 동시에 다양한 질병을 진단할 수 있는 PCR 시스템에 대한 필요성이 대두되고 있는 상황이다.
이에 본 발명자들은 휴대용 디지털 PCR 진단 시스템을 제작하였으며, 이의 휴대성이 우수하고, 동시에 다양한 질병을 검출할 수 있는 효과가 월등히 우수한 것을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 PCR 시스템을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 휴대용 PCR 시스템을 이용한 PCR 분석 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 휴대용 PCR 시스템에 관한 것으로, 본 발명에 따른 PCR 시스템은 휴대성이 우수하고, 동시에 다양한 질병을 진단할 수 있는 효과를 나타낸다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는, 일측에 배치되고 제1광원을 포함하는 광원부; 제1광원과 일정거리 이격되도록 상기 제1광원의 상측에 배치되어 시료에서 방출된 광을 투과시키고 상기 제1광원에서 방출된 광을 굴절시키도록 배치되는 다이크로익 미러, 마이크로웰 어레이 칩이 배치되는 홈부, 및 제1광원에서 방출된 광이 통과하는 여기 필터 (excitation filter)를 포함하는 미러부; 시료에서 방출된 여기광이 입사되는 이미지 센서를 포함하는 이미징 센서부; 광원부와 미러부 사이에 배치되며 제1광원에서 방출된 광이 통과하는 렌즈를 포함하는 렌즈부; 미러부와 이미징 센서부 사이에 배치되고 시료에서 방출된 여기광이 통과하는 출사 필터 (emission filter)를 포함하는 필터부; 시료가 배치될 수 있고 일면에 금속층 및 미세 금속선을 포함하는 레이어, 및 레이어의 온도를 측정하는 제어부를 포함하는 제1기판; 제1기판과 이격되어 레이어의 하측에 배치되고 레이어를 가열시키는 광을 방출하는 제2광원을 포함하는 제2기판; 및 제1기판 및 제2기판과 이격되어 배치되고, 이미징 센서부와 상기 제어부에서 출력된 데이터를 처리하는 프로세서를 포함하는 제3기판; 을 포함하는, PCR 시스템.
본 발명에 있어서 시료는 특정 질병 감염된 환자 또는 감염되었을 것으로 예상되는 환자에서 얻어진 검체를 포함할 수 있고, 검체는 검사 대상이 되는 개체로부터 얻어지는 생물학적 시료로, 예를 들어, 생검, 배양 세포, 타액, 피부 조직, 혈액, 분변 및 소변으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 시료는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서상의 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기 (free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산서열로 상보적인 템플레이트 (template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 단일-가닥의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시될 수 있다.
본 명세서상의 용어 "프로브 (probe)"란 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA (single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA (double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이한 검출을 위해 라벨링 될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 각 프로브는 일 말단에 형광단 (fluorescence)이 표지되고, 다른 일 말단에 소광체 (fluorescence)가 표지될 수 있다.
본 명세서상의 용어 "형광단"은 특정 파장의 빛을 흡수하여 다른 파장의 빛을 방출하는 형광화합물을 의미하고, "소광체"는 형광단의 여기상태에 작용하여 여기에너지를 제거하고 발광을 저해하는 분자를 의미한다.
본 발명의 일 구현예에서, 형광단은 2-클로로-7-페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인 (2-chloro-7-phenyl-1,4-dichloro-6-carboxyfluorescein; VIC), 6-카르복시플루오레세인 (6-carboxyfluorescein; FAM), ABY, JUN, 플루오레세인 (fluorescein), 헥사클로로6-카르복시플루오레세인 (hexachloro-6-carboxyfluorescein; HEX), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인 (tetrachloro-6-carboxyfluorescein; TET), 2,7-디메톡시-4,5-디클로로-6-카르복시플루오레세인 (2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluorescein; JOE), 5-((2-아미노에틸)아미노)나프탈렌-1-술폰산 (5-((2-aminoethyl)amino)naphthalene-1-sulfonic acid), 쿠마린 (coumarin) 및 쿠마린 유도체, 시아닌-5 (Cyanine-5; Cy5), 루시퍼 옐로우 (lucifer yellow), 텍사스 레드 (texas red), 테트라메틸로다민 (tetramethylrhodamine; TAMRA), 야키마 옐로우 (Yakima Yellow; YG), 및 칼 플루오르 레드 610 (Cal Fluor Red 610; CFR)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 제1광원은 멀티 컬러 LED (multi color LED)인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 광원부, 미러부, 이미징 센서부, 렌즈부 및 필터부는 각각 스페이서에 의해서 서로 이격되도록 배치되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 여기 필터 및 출사 필터는 둘 이상의 형광채널을 포함하는 것일 수 있다.
즉, 본 발명의 PCR 시스템의 여기 필터 및 출사 필터가 둘 이상의 형광채널을 포함함에 따라, PCR 시스템은 다른 PCR이 완료된 시료에서 각기 다른 질병에 대한 둘 이상의 형광이미지를 촬영할 수 있고, 이의 형광이미지를 분석함에 따라 각기 다른 타겟 DNA에 대해 PCR 결과를 정량적으로 진단할 수 있으며, 이에 따라, 둘 이상의 질병을 동시에 진단할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 여기 필터는 500-528 nm 및 574-618 nm의 형광채널을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 출사 필터는 460-488 nm 및 540-560 nm의 형광채널을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 다이크로익 미러는 30도 내지 60도, 35도 내지 55도, 40 도 내지 50도, 예를 들어, 45도 기울어지도록 배치되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 다이크로익 미러는 기울어지도록 배치될 수 있고, 이에 따라, 제1광원에서 방출된 광이 다이크로익 미러에서 굴절되어 시료로 가이드될 수 있다. 또한, 이에 따라, 광원부, 미러부, 이미징 센서부, 렌즈부 및 필터부가 선형으로 배치되는 것이 아닌, 꺾인 방향으로 배치될 수 있고, PCR 시스템의 전체 부피가 최소화될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 마이크로웰 어레이 칩은 가장자리에 하나 이상의 홈을 포함하고 중심부에 하나 이상의 마이크로웰을 포함하는 패널을 하나 이상 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, PCR 시스템은 제1기판, 제2기판 및 제3기판 중 적어도 하나와 연결되도록 배치되는 쿨링팬을 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 이미지 센서는 광을 수신하여 수신된 광을 통해 이미지를 형성하도록 할 수 있는 장치면 이를 제한하지 않으나, 이미지센서는 예들 들어 전하결합소자 (CCD), CMOS 카메라 모듈일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 제1광원, 제2광원, 이미징 센서부 및 제어부는 프로세서에 의해 제어되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 금속층은 레이어의 일면에 증착되고, 미세 금속선은 증착된 금속층에 식각된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, PCR 시스템은 제1기판의 일측에 지지판이 배치되고, 미러부, 렌즈부 및 광원부는 지지판에 결착되어 지지되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 광원부, 이미징 센서부, 렌즈부 및 필터부는, 광원부 및 렌즈부의 중심을 관통하는 제1중심축 및 필터부 및 이미징 센서부의 중심을 관통하는 제2중심축은 직교하도록 배치되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 제1기판, 제2기판 및 제3기판은 스페이서에 의해 서로 이격되도록 배치되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 양태는, 다음 단계를 포함하는 PCR 시스템을 이용한 PCR 분석 방법이다:
시료를 포함하는 마이크로웰 어레이 칩을 레이어 상에서 가열하여 PCR을 수행하는 반응 단계;
PCR 과정이 수행된 마이크로웰 어레이 칩을 홈부에 위치시켜, 시료의 형광 이미지를 촬영하는 촬영 단계; 및
형광 이미지를 분석하는 분석 단계를 포함하고,
PCR 시스템은,
일측에 배치되고 제1광원을 포함하는 광원부; 제1광원과 일정거리 이격되도록 제1광원의 상측에 배치되고 시료에서 방출된 광을 투과시키고 제1광원에서 방출된 광을 굴절시키도록 배치되는 다이크로익 미러, 마이크로웰 어레이 칩이 배치되는 홈부, 및 제1광원에서 방출된 광이 통과하는 여기 필터 (excitation filter)를 포함하는 미러부; 시료에서 방출된 여기광이 입사되는 이미지 센서를 포함하는 이미징 센서부; 광원부와 미러부 사이에 배치되며 제1광원에서 방출된 광이 통과하는 렌즈를 포함하는 렌즈부; 미러부와 이미징 센서부 사이에 배치되고 시료에서 방출된 여기광이 통과하는 출사 필터 (emission filter)를 포함하는 필터부; 시료가 배치될 수 있고 일면에 금속층 및 미세 금속선을 포함하는 레이어, 및 레이어의 온도를 측정하는 제어부를 포함하는 제1기판; 제1기판과 이격되어 레이어의 하측에 배치되고 레이어를 가열시키는 광을 방출하는 제2광원을 포함하는 제2기판; 및 제1기판 및 제2기판과 이격되어 배치되고, 이미징 센서부와 제어부에서 출력된 데이터를 처리하는 프로세서를 포함하는 제3기판;을 포함함.
본 발명은 휴대용 디지털 PCR 진단 시스템 및 디지털 PCR 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 PCR 시스템은 소형화된 디지털 PCR 시스템에서 플라즈모닉 기반의 히팅으로 작동하여 빠른 시간 안에 DNA 증폭과정을 수행할 수 있고, PCR이 완료된 시료에서 다수의 질병을 한 번에 진단할 수 있어, 다양한 질병의 진단에 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 시스템의 사시도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 시스템의 PCR 장치부의 사시도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 시스템의 PCR 장치부의 분해 사시도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 시스템의 이미지 촬영부의 사시도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 시스템의 이미지 촬영부의 분해 사시도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 시스템의 마이크로웰 어레이 칩의 상면도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 시스템의 마이크로웰 어레이 칩의 사진이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 시스템의 레이어의 PCR 진행 시의 저항과 온도와의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 시스템의 레이어의 PCR 진행 시의 인가전압에 따른 최대 가열 비율 (heating rate)를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 시스템을 이용한 PCR 진행 시 적외선 카메라 이미지를 나타낸 도면이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 시스템을 이용한 PCR 진행 시 온도 프로파일을 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 시스템을 이용한 PCR 진행 시 PCR 가열 사이클 온도 프로파일을 나타낸 그래프이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 시스템을 이용한 PCR 진행 시 Ramping rate를 나타낸 그래프이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 시스템을 이용하여 PCR이 진행된 시료의 형광 이미지를 촬영한 사진이다.
도 15는 본 발명의 PCR이 진행된 시료의 형광 이미지를 분석한 결과를 나타낸 사진이다.
도 16은 PCR이 진행된 시료의 형광 이미지에서 형광 세기를 히스토그램으로 나타낸 그래프이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 시스템을 이용한 디지털 PCR 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 18은 PCR 분석 후 타겟 농도에 따른 마이크로웰 어레이 칩에서의 positive 웰의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 시스템의 PCR 장치부의 사시도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 시스템의 PCR 장치부의 분해 사시도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 시스템의 이미지 촬영부의 사시도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 시스템의 이미지 촬영부의 분해 사시도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 시스템의 마이크로웰 어레이 칩의 상면도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 시스템의 마이크로웰 어레이 칩의 사진이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 시스템의 레이어의 PCR 진행 시의 저항과 온도와의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 시스템의 레이어의 PCR 진행 시의 인가전압에 따른 최대 가열 비율 (heating rate)를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 시스템을 이용한 PCR 진행 시 적외선 카메라 이미지를 나타낸 도면이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 시스템을 이용한 PCR 진행 시 온도 프로파일을 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 시스템을 이용한 PCR 진행 시 PCR 가열 사이클 온도 프로파일을 나타낸 그래프이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 시스템을 이용한 PCR 진행 시 Ramping rate를 나타낸 그래프이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 시스템을 이용하여 PCR이 진행된 시료의 형광 이미지를 촬영한 사진이다.
도 15는 본 발명의 PCR이 진행된 시료의 형광 이미지를 분석한 결과를 나타낸 사진이다.
도 16은 PCR이 진행된 시료의 형광 이미지에서 형광 세기를 히스토그램으로 나타낸 그래프이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 시스템을 이용한 디지털 PCR 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 18은 PCR 분석 후 타겟 농도에 따른 마이크로웰 어레이 칩에서의 positive 웰의 비율을 나타낸 그래프이다.
상술한 목적, 특징 및 장점은 첨부된 도면을 참조하여 후술되어 있는 상세한 설명을 통하여 보다 명확해질 것이며, 그에 따라 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명의 기술적 사상을 용이하게 실시할 수 있을 것이다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서 본 발명과 관련된 공지기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에 그 상세한 설명을 생략하기로 한다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함(comprising 또는 including)"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 또한, 명세서에 기재된 "…부"의 용어는 적어도 하나의 기능이나 동작을 처리하는 단위를 의미하며, 이는 하드웨어나 소프트웨어 또는 하드웨어 및 소프트웨어의 결합으로 구현될 수 있다. 나아가, "일(a 또는 an)", "하나(one)", 및 유사 관련어는 본 발명을 기술하는 문맥에 있어서 본 명세서에 달리 지시되거나 문맥에 의해 분명하게 반박되지 않는 한, 단수 및 복수 모두를 포함하는 의미로 사용될 수 있다.
또한, 어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "연결되어" 있다거나 "접속되어" 있다고 언급된 때에는, 그 다른 구성요소에 직접적으로 연결되어 있거나 또는 접속되어 있을 수도 있지만, 중간에 다른 구성요소가 존재할 수도 있다고 이해 되어야할 것이다. 반면에, 어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "직접 연결되어" 있다거나 "직접 접속되어" 있다고 언급된 때에는, 중간에 다른 구성요소가 존재하지 않는 것으로 이해되어야 할 것이다. 구성요소들 간의 관계를 설명하는 다른 표현들, 즉 "~사이에"와 "바로 ~사이에" 또는 "~에 이웃하는"과 "~에 직접 이웃하는" 등도 마찬가지로 해석되어야 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 시스템의 사시도이다.
도 1을 참고하면, 일 실시예에 따른 PCR 시스템 (1000)은 광원부 (110), 미러부 (130), 이미징 센서부 (150), 렌즈부 (120), 필터부 (140), 제1기판 (210), 제2기판 (220) 및 제3기판 (230)을 포함할 수 있다.
일 실시예에 따른 PCR 시스템은 광원부 (110), 미러부 (130), 이미징 센서부 (150), 렌즈부 (120) 및 필터부 (140)를 포함하는 이미지 촬영부 (100), 및 제1기판 (210), 제2기판 (220) 및 제3기판 (230)을 포함하는 PCR 장치부 (200)를 포함할 수 있다.
이미지 촬영부 (100)는 PCR 장치부 (200)의 상측에 배치될 수 있고, 이때, 이미지 촬영부는 (100) 이미지 촬영부 (100) 및 PCR 장치부 (200)의 사이에 배치된 지지판 (240)에 의해서 견고하게 지지될 수 있다. 그리고, 지지판 (240)은 광원부 (110), 렌즈부 (120) 및 미러부 (130) 크기의 합과 대응되는 크기를 가질 수 있고, 이에 따라 안정적으로 이미지 촬영부 (100) 전체를 지탱할 수 있다.
이미지 촬영부 (100) 및 PCR 장치부 (200)는 직접 또는 지지판 (240)을 통하여 전기적으로 연결될 수 있다. 이에 따라, 제1광원 (115) 및 이미지 센서 (155)는 제3기판 (230)의 프로세서 (235)에 의해 제어되고, 프로세서 (235)는 이미징 센서부 (150)에서 출력된 데이터를 처리할 수 있다.
이미지 촬영부 (100)에서 광원부 (110), 미러부 (130), 이미징 센서부 (150), 렌즈부 (120) 및 필터부 (140)는 각각 스페이서 (s)에 의해서 서로 이격되도록 배치될 수 있고, PCR 장치부 (200)에서 제1기판 (210), 제2기판 (220) 및 제3기판 (230) 또한 스페이서 (s')에 의해서 이격되도록 배치될 수 있다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 시스템의 PCR 장치부의 사시도이고, 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 시스템의 PCR 장치부의 분해 사시도이다.
도 2 내지 도 3을 참조하면, 일 실시예에 따른 PCR 장치부 (200)는 제1기판 (210), 제2기판 (220), 제3기판 (230) 및 쿨링팬 (260)을 포함할 수 있다.
제1기판 (210) 상에는 시료가 배치될 수 있고 일면에 금속층 및 미세 금속선을 포함하는 레이어 (215) 및 레이어 (215)의 온도를 측정하는 제어부 (미도시)를 포함할 수 있다.
레이어 (215) 상에는 시료를 포함하는 마이크로웰 어레이 칩 (310)이 제공될 수 있고, 이에 다라, 레이어 (215)에서 발생된 열을 통해서 마이크로웰 어레이 칩 (310) 내의 시료가 가열될 수 있으며, 시료는 변성 (denaturation), 결합 (annealing), 신장 (elongation)의 PCR의 3단계가 진행되면서 PCR이 진행될 수 있다.
금속층은 레이어 (215)의 일면에 제공되며, 일반적인 스퍼터링 방식으로 증착되어 제공될 수 있다. 금속층은 nm 두께로 레이어에 증착될 수 있으며, 서로 상이한 금속이 다층으로 증착될 수도 있다. 금속층은 제2광원에 의해 플라즈몬 가열될 수 있고, 시료는 금속층의 가열에 의해 가열될 수 있다. 금속층의 두께 및 조성은 금속층의 주요 흡수 파장과 제2광원 (225)의 주요 방출 파장이 서로 대응되도록 결정될 수 있다. 예를 들어, 제2광원 (225)으로 청색 LED를 사용되는 경우, 금속층의 두께 및 조성은 파란색 범위에 해당하는 파장을 주로 흡수할 수 있도록 선택 및 결정될 수 있다.
금속층은 금(Au), 은(Ag), 백금(Pt), 크롬(Cr), 팔라듐(Pd), 니켈(Ni) 등 중 적어도 하나를 포함하는 소재가 사용될 수 있으며, 전술한 바와 같이 제2광원 (225)의 방출 파장 범위에 따라 금속층의 흡수 파장 범위를 고려하여 적절하게 선택 사용될 수 있다.
미세 금속선은 레이어 (215) 일면에 금속층과 함께 제공되며, 구체적으로 포토 레지스트 및 포토 마스크를 사용하여 금속층에 패턴을 형성한 후 일반적인 식각공정을 거쳐 금속층에 제공될 수 있다. 미세금속선의 패턴은, 예를 들어, 다수의 변곡점을 포함하는 S자 형성으로 배치될 수 있다.
금속층은 제2광원에 의해 플라즈몬 가열되는 가열영역과 가열되지 않는 비가열영역으로 구분될 수 있고, 미세 금속선은 금속층의 가열영역 전반에 걸쳐 제공될 수 있다. 미세 금속선은 금속층의 가열영역에 구비됨으로써 시료의 온도를 측정하는 온도 센서의 역할을 수행할 수 있으며, 제어부는 미세 금속선의 저항정보를 측정함으로써 시료의 온도를 산출할 수 있다.
제어부는 레이어 (215)의 금속층 및 미세 금속선의 가열에 의해 시료의 온도 변화를 산출할 수 있으며, 구체적으로 미세 금속선의 저항정보로부터 시료의 온도를 산출할 수 있다. 제어부는 미세 금속선의 저항정보를 측정하는 저항측정모듈과 저항측정모듈에 의해 측정된 미세 금속선의 저항정보로부터 시료의 온도를 산출하는 온도산출모듈을 포함할 수 있다. 구체적으로, 저항측정모듈은 휘트스톤 브리지일 수 있고, 온도산출모듈은 ADC(아날로그 디지털 컨버터, analog to digital converter)일 수 있다.
제어부는 온도산출모듈에 의해 산출된 시료의 온도와 미리 설정된 온도 프로파일을 기초로 하여 광원의 밝기를 조절함으로써 시료의 온도를 조절할 수 있다. 구체적으로, 제어부는 산출된 시료의 온도 및 미리 설정된 온도 프로파일을 기초로 PID 제어기와 같은 피드백 루프를 통해 제2광원의 밝기를 조절할 수 있다.
제2기판 (220)은 제1기판 (210)과 이격되어 제1기판 (210)의 하측에 배치될 수 있고, 레이어 (215)를 가열시키는 광을 방출하고 레이어 (215)의 하측에 배치되는 제2광원 (225)을 포함할 수 있다.
제2광원 (225)은 레이어 (215)의 금속층 및 미세 금속선을 가열할 수 있으며, 제2광원 (225)은 적외선, 가시광선, 자외선 범위의 파장을 방출하는 것으로 선택될 수 있다. 예를 들어, 제2광원 (225)은 LED PCB, 다이오드 레이저 어레이 등일 수 있고, 적절한 세기의 빛을 방출하기 위해 임의의 개수로 선택되어 구비될 수 있다. 또한, 제2광원 (225)은 히트싱크와 함께 구비되어 제2광원 (225)의 과열에 대비할 수 있다.
제3기판 (230)은 제1기판 (210) 및 제2기판 (220)과 이격되어 배치될 수 있고, 이미징 센서부 (150)와 제어부에서 출력된 데이터를 처리하는 프로세서 (235)를 포함할 수 있다.
PCR 장치부 (200)는 제1기판 (210), 제2기판 (220) 및 제3기판 (230) 중 적어도 하나와 연결되도록 배치되는 쿨링팬 (260)을 포함할 수 있다.
쿨링팬 (260)은 미리 설정된 온도 프로파일에 따라 저온의 공기를 시료 및 미세 금속선이 형성된 금속층으로 가이드 하여 시료 등을 냉각시킬 수 있으며, 쿨링팬 (260)을 구비함으로써 열 순환 속도를 향상시키고, 시스템의 전력 소모를 줄일 수 있다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 시스템의 이미지 촬영부의 사시도이고, 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 시스템의 이미지 촬영부의 분해 사시도이다.
도 4 내지 도 5를 참조하면, 이미지 촬영부 (100)는 광원부 (110), 미러부 (130), 이미징 센서부 (150), 렌즈부 (120), 필터부 (140)를 포함할 수 있다.
광원부 (110)는 일측에 배치될 수 있으며, 제1광원 (115)을 포함할 수 있다. 제1광원 (115)은 미러부 (130)에 배치된 다이크로익 미러 (135)를 향해 광을 출력할 수 있고, 제1광원 (115)은 적외선, 가시광선, 자외선 범위의 파장을 방출하는 것으로 선택될 수 있다. 제1광원 (115)은 LED PCB, 다이오드 레이저 어레이 등일 수 있으며, PCR이 진행된 시료에서 동시에 형광 이미지 촬영을 위해 다양한 파장의 광을 동시에 출력할 수 있고, 예를 들어, 멀티 컬러 LED (multi color LED)일 수 있다.
렌즈부 (120)는 광원부 (110)와 미러부 (130) 사이에 배치될 수 있고, 제1광원 (115)에서 방출된 광이 통과하는 렌즈 (125)를 포함할 수 있다.
렌즈 (125)는 다이크로익 미러 (135) 및 제1광원 (115) 사이에 배치되면서 제1광원 (115)에서 출력된 광을 집광하여 세기를 증폭시킬 수 있고, 이를 다이크로익 미러 (135)를 향해 통과시킬 수 있다.
미러부 (130)는 제1광원 (115)과 일정거리 이격되도록 제1광원 (115)의 상측에 배치되고 제1광원 (115)에서 방출된 광을 굴절시키도록 기울여져서 배치되는 다이크로익 미러 (135)를 포함할 수 있다. 그리고, 미러부 (135)는 제1광원 (115)에서 방출된 광이 투과되는 마이크로웰 어레이 칩 (310)이 배치되는 홈부 (133), 및 제1광원 (115)에서 방출된 광이 통과하는 여기 필터 (excitation filter) (137)를 포함할 수 있다.
다이크로익 미러 (135)는 제1광원 (115)을 기준으로 제1광원 (115)의 상측에 배치될 수 있다. 즉, 다이크로익 미러 (135)를 포함하는 미러부 (130)는 제1광원 (115)을 포함하는 광원부 (110)와 나란하게 배치될 수 있다.
다이크로익 미러 (135)는 제1광원 (115)에서 방출된 광을 이미지 센서 (155)를 향해 굴절시키도록 기울여져서 배치될 수 있고, 예를 들어, 30도 내지 60도, 35도 내지 55도, 40 도 내지 50도, 예를 들어, 45도 기울어지도록 배치되는 것일 수 있다.
홈부 (133)는 다이크로익 미러에서 굴절된 광이 통과하는 위치에 배치될 수 있으며, 홈부 (133)는 마이크로웰 어레이 칩 (310)이 안정적으로 배치되도록, 마이크로웰 어레이 칩 (310)과 대응되는 크기를 가질 수 있다.
여기 필터 (137)는 제1광원 (115)으로부터 방사된 광을 여기시킬 수 있도록 자외선 등을 필터링할 수 있다. 이때, 여기 필터 (137)는 둘 이상의 형광채널을 포함할 수 있고, 이에 따라, 제1광원 (115)에서 출력된 광은 여기 필터 (137)를 통과함에 따라 각기 다른 둘 이상의 파장대의 빛을 포함할 수 있고, 마이크로웰 어레이 칩 (310)에 포함된 시료의 형광물질, 예를 들어, 서로 다른 여기 파장을 가진 프로브를 각각 여기시킬 수 있다. 구체적으로, 여기 필터 (137)는 500-528 nm 및 574-618 nm 파장범위의 형광채널을 포함하는 것일 수 있다.
필터부 (140)는 미러부 (130)와 이미징 센서부 (150) 사이에 배치되고 다이크로익 미러 (135)에서 반사된 광이 통과하는 출사 필터 (emission filter) (145)를 포함할 수 있다.
출사 필터 (145)는 시료에서 방출된 광을 통과시키고, 자외선 등을 필터링 할 수 있다. 출사 필터 (145)는 둘 이상의 형광채널을 포함할 수 있고, 이에 따라, 여기광에 의해 시료에서 방출되는 각기 다른 둘 이상의 파장을 포함하는 빛을 투과시킬 수 있다. 구체적으로, 출사 필터 (145)는 460-488 nm 및 540-560 nm 파장범위의 형광채널을 포함하는 것일 수 있다. 그리고, 출사필터의 각 형광채널은 여기필터의 각 형광채널의 파장의 범위가 상이할 수 있고, 이에 따라, 제1광원에서 방출된 광이 다이크로익 미러에의해 반사되어 형광채널을 투과하는 것을 방지할 수 있다.
이미징 센서부 (150)는 시료에서 방출된 여기광이 입사되는 이미지 센서 (155)를 포함할 수 있다. 이미지 센서 (155)는 광을 수신하여 수신된 광을 통해 이미지를 형성하도록 할 수 있는 장치면 이를 제한하지 않으나, 이미지 센서 (155)는 예들 들어 전하결합소자 (CCD), CMOS 카메라 모듈일 수 있다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 시스템의 마이크로웰 어레이 칩의 상면도이고, 도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 시스템의 마이크로웰 어레이 칩의 사진이다.
마이크로웰 어레이 칩 (310)은 시료를 포함할 수 있으며, 레이어 (215)의 상측에 배치될 수 있다. 마이크로웰 어레이 칩 (310) 내부의 시료는 레이어 (215)로부터 전달되는 열 에너지를 통해 PCR 반응이 진행될 수 있다.
마이크로웰 어레이 칩 (310)은 가장자리에 하나 이상의 홈 (313)을 포함하고, 중심부에 하나 이상의 마이크로웰을 포함하는 패널 (315)을 하나 이상 포함할 수 있다. 이때, 하나 이상의 홈 (313)은 패널에 샘플링 되지 않는 시료들이 흘러나가도록 가이드할 수 있다.
마이크로웰 어레이 칩 (310)은 PMMA (폴리메타크릴산 메틸, poly-(methylmethacrylate)) 소재를 포함할 수 있다. 또는, 마이크로웰 어레이 칩 (310)은 PDMS (폴리디메틸실록산, poly-dimethylsiloxane), 유리, 실리콘 또는 기타 이와 유사 한 소재를 포함하는 것일 수 있다.
마이크로웰 어레이 칩은, 345개의 웰이 하나의 패널(315)을 이루도록 구성되며, 총 64개의 패널 (315)로 이루어진 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
제조예: PCR 시스템의 제작
일 실시예에 따른 PCR 시스템을 고안하였다. 통합된 시스템은 라즈베리파이를 기반으로 작동하며, 소프트웨어를 통해 제어할 수 있도록 구성하였다. 휴대용 디지털 PCR 분석 시스템의 크기는 5.6 x 9.5 x 18 cm이며, 보조배터리 및 스마트폰을 통한 작동이 가능하도록 설계하였다. 또한. 각 시스템의 연결부 및 외형은 3D프린터를 통해 제작하였으며, 작동 소프트웨어는 파이썬 기반으로 개발되었다.
일 실시예에 따른 PCR 장치부는 레이어, 온도 측정 및 조절을 위한 제1PCB (printed circuit board) (제1기판), LED 및 쿨링팬 작동을 위한 제2PCB (제2기판), 쿨링팬 및 마운트로 구성하였으며, 라즈베리파이 (제3기판)를 기반으로 작동한다. 제1PCB는 금 박막 레이어 연결을 위한 패드와 박막의 저항을 측정하기 위한 휘트스톤 브릿지, 측정된 저항을 기반으로 온도를 계산하는 ADC (Analog digital converter)로 구성되었다. 제2PCB는 4개의 LED와 쿨링팬 연결을 위한 패드, LED 및 쿨링팬 제어를 위한 MOSFET (metal-oxide-semiconductor field-effect transistor)으로 구성되었다.
이미징 촬영부는 형광이미지 촬영을 위한 CMOS 카메라 모듈, 2개의 채널을 지닌 출사 필터 (λpeak = 500-528 nm, 574-618 nm)와 여기 필터 (λex = 460-488 nm, 540-560 nm), 광원 반사를 위한 다이크로익 미러, 광원으로 작용하는 멀터 컬러 LED (red, green, blue, amber)로 구성하였으며, LED 작동 및 이미지 촬영은 라즈베리파이를 통해 제어되었다. 이미징 시스템의 각 파트는 3D 프린터로 제작된 몰드와 볼트 및 너트로 체결되었다.
실시예 1: PCR 장치부의 온도조절 성능 평가
PCR 장치부의 온도조절 성능을 검증하였다.
실험 결과, 금 박막 레이어의 저항이 온도에 따라 선형적으로 증가하여 정밀하게 온도를 측정할 수 있었고 (도 8 참조), 인가되는 전압이 증가함에 따라 heating rate가 최대 11 °C/sec까지 증가하였다 (도 9 참조). 적외선 카메라를 통해 금 박막 레이어의 표면 온도를 측정한 결과, 레이어 표면이 전체적으로 고르게 가열되었고, 표면 온도가 ± 0.5 °C 이내로 정밀하게 제어된 것을 확인할 수 있었다. (도 10 참조). 온도 조절기를 통해 PCR thermal cycle을 구현한 결과, hot start 단계 (10분)와 40 cycle을 30분 만에 완료할 수 있었고, cycle이 작동하는 동안 heating rate와 cooling rate가 균일하게 작용한 것을 확인할 수 있었다 (도 11 내지 13참조). 결과적으로, 높은 heating rate를 지닌 일 실시예에 따른 PCR 장치부는 PCR 분석 시간을 단축할 수 있음을 확인하였다.
실시예 2: PCR 반응의 정확도 평가
디지털 PCR 분석을 위해 마이크로웰 어레이 칩을 구성하였다. 마이크로웰 어레이 칩의 한 패널당 20 μm 직경의 마이크로웰이 345개씩 분배되어, 총 22,080개의 마이크로웰이 구성되었다 (도 7 참조). PCR 샘플은 master mix, 포워드 프라이머, 리버스 프라이머, 프로브, 타겟 DNA로 구성하였으며, 서로 다른 2개의 타겟 DNA (이하 타겟A, 타겟B) 프로브로 각각 FAM (λex = 492 nm, λex = 518 nm)과 TAMRA (λex = 555 nm, λex = 580 nm)를 사용하였다. 각기 다른 농도 (타겟A: 10,000 copies/μL, 타겟B: 100,000 copies/μL)를 가진 10 μL의 PCR 샘플을 마이크로웰 어레이 칩에 로딩한 후, 본 발명의 PCR 시스템을 통해 PCR 증폭 과정 (35 cycles)을 진행하였다.
PCR 과정이 끝난 후, 이미지 촬영부를 통해 2 개의 형광 이미지 (타겟A (green), 타겟B (red))를 촬영하였다 (도 14 참조). 이후 자체 개발한 알고리즘을 활용하여 해당 형광이미지를 분석하였고, 형광이 발현된 마이크로웰의 형광 세기를 측정하였다 (도 15 참조). 측정된 형광 세기를 히스토그램 그래프로 표현하였고, 그래프를 기반으로 타겟 DNA가 담지된 positive well과 타겟 DNA가 없는 negative well의 기준점이 되는 threshold를 설정하였다 (도 16 참조). Positive well과 negative well의 비율을 포아송 분포도로 계산하였고, 계산된 값을 통해 해당 샘플의 농도를 측정하였다 (도 17 참조).
도 18에서 확인할 수 있듯이, 작동 범위 검증을 위해 다양한 농도의 타겟 DNA를 사용하여 실험한 결과, 100 copies/μL부터 250,000 copies/μL까지의 농도를 오차율 20% 이내로 측정할 수 있었다. 결과적으로, 본 발명에 따른 PCR 시스템은 2 개의 타겟 물질을 동시에 정량적으로 진단할 수 있다는 것을 확인하였다.
이상에서 설명한 본 발명은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능하므로 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것은 아니다.
Claims (15)
- 일측에 배치되고 제1광원을 포함하는 광원부;
상기 제1광원과 일정거리 이격되도록 상기 제1광원의 상측에 배치되어 시료에서 방출된 광을 투과시키고 상기 제1광원에서 방출된 광을 굴절시키도록 배치되는 다이크로익 미러, 상기 마이크로웰 어레이 칩이 배치되는 홈부, 및 상기 제1광원에서 방출된 광이 통과하는 여기 필터 (excitation filter)를 포함하는 미러부;
상기 시료에서 방출된 여기광이 입사되는 이미지 센서를 포함하는 이미징 센서부;
상기 광원부와 미러부 사이에 배치되며 상기 제1광원에서 방출된 광이 통과하는 렌즈를 포함하는 렌즈부;
상기 미러부와 상기 이미징 센서부 사이에 배치되고 상기 시료에서 방출된 여기광이 통과하는 출사 필터 (emission filter)를 포함하는 필터부;
상기 시료가 배치될 수 있고 일면에 금속층 및 미세 금속선을 포함하는 레이어, 및 상기 레이어의 온도를 측정하는 제어부를 포함하는 제1기판;
상기 제1기판과 이격되어 상기 레이어의 하측에 배치되고 상기 레이어를 가열시키는 광을 방출하는 제2광원을 포함하는 제2기판; 및
상기 제1기판 및 상기 제2기판과 이격되어 배치되고, 상기 이미징 센서부와 상기 제어부에서 출력된 데이터를 처리하는 프로세서를 포함하는 제3기판;
을 포함하는, PCR 시스템. - 제1항에 있어서, 상기 제1광원은 멀티 컬러 LED (multi color LED)인 것인, PCR 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 광원부, 상기 미러부, 상기 이미징 센서부, 상기 렌즈부 및 상기 필터부는 각각 스페이서에 의해서 서로 이격되도록 배치되는 것인, PCR 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 여기 필터 및 상기 출사 필터는 둘 이상의 형광채널을 포함하는 것인, PCR 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 여기 필터는 500-528 nm 및 574-618 nm의 형광채널을 포함하는 것인, PCR 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 출사 필터는 460-488 nm 및 540-560 nm의 형광채널을 포함하는 것인, PCR 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 마이크로웰 어레이 칩은,
가장자리에 하나 이상의 홈을 포함하고,
중심부에 하나 이상의 마이크로웰을 포함하는 패널을 하나 이상 포함하는 것인, PCR 시스템. - 제1항에 있어서, 상기 PCR 시스템은 상기 제1기판, 상기 제2기판 및 상기 제3기판 중 적어도 하나와 연결되도록 배치되는 쿨링팬을 더 포함하는 것인, PCR 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 금속층은 상기 레이어의 일면에 증착되고,
상기 미세 금속선은 상기 증착된 금속층에 식각된 것인, PCR 시스템. - 제1항에 있어서, 상기 PCR 시스템은,
상기 제1기판의 일측에 지지판이 배치되고,
상기 미러부, 상기 렌즈부 및 상기 광원부는 상기 지지판에 결착되어 지지되는 것인, PCR 시스템. - 제1항에 있어서,
상기 광원부, 상기 이미징 센서부, 상기 렌즈부 및 상기 필터부는,
상기 광원부 및 상기 렌즈부의 중심을 관통하는 제1중심축 및 상기 필터부 및 상기 이미징 센서부의 중심을 관통하는 제2중심축은 직교하도록 배치되는 것인, PCR 시스템. - 제1항에 있어서,
상기 제1기판, 상기 제2기판 및 상기 제3기판은 스페이서에 의해 서로 이격되도록 배치되는 것인, PCR 시스템. - 제1항에 있어서, 상기 이미지 센서는 CMOS 카메라 모듈인 것인, PCR 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 제1광원, 상기 제2광원, 상기 이미징 센서부 및 상기 제어부는 상기 프로세서에 의해 제어되는 것인, PCR 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 다이크로익 미러는 45 도 기울어지도록 배치되는 것인, PCR 시스템.
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