CN115078313A - 基于微流控芯片的生物分子分析系统 - Google Patents

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CN115078313A CN202110266030.7A CN202110266030A CN115078313A CN 115078313 A CN115078313 A CN 115078313A CN 202110266030 A CN202110266030 A CN 202110266030A CN 115078313 A CN115078313 A CN 115078313A
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Abstract

本发明提供了基于微流控芯片的生物分子分析系统。本发明的系统包括：(M1)温控模块，对所述微流控芯片的进行预定的温度变化控制，从而使得所述微流控芯片中各个微液滴独立地进行生化反应；(M2)成像模块，用激发光照射所述微流控芯片从而使得微液滴产生荧光，并记录所述微流控芯片中各微液滴产生的荧光信号；(M3)数据处理模块，对所述成像模块获取的微流控芯片中各微液滴产生的荧光信号，进行数据处理，从而获得分析结果；和(M4)输出模块，输出所述的分析结果。本发明系统具有体积较小、成本低，可对微流控芯片实现非均一的温度控制，并对整个微流控芯片进行成像，从而完成对目标生物分子检测的优点。

Description

基于微流控芯片的生物分子分析系统
技术领域
本发明涉及生物化学反应分析领域，尤其涉及一种基于微流控芯片的生物分子分析系统。
背景技术
生物分子检测是生物学科学研究的重要手段也是现代分子医学检测的基础。生物分子检测通常可以分为针对核酸(nucleic acid)和蛋白质(protein)等生物大分子以及糖等小生物分子。因为这些生物分子的重要意义，所以研究人员研发了很多基于不同原理的生物分子分析方法和分析系统，其中最具有代表性的是针对核酸的聚合酶链反应(PCR)以及针对蛋白质的免疫检测反应。很多生物分子检测反应都需要在一定温度下进行，并进行实时(real time)或终点(end point)的光学检测，从而对生物分子进行定性(identification)和定量(quantification)的检测。
核酸检测反应通常需要在一定的温度下进行。例如，聚合酶链反应(PCR)是一种广泛用于分子生物学的研究及实验方法，可以以特定序列DNA片段为模板扩增成为多个拷贝。聚合酶链反应通过将反应物重复的加热和冷却的热循环，以实现DNA变性解旋和酶驱动的DNA复制。聚合酶链反应使用的主要试剂包括：引物(与靶DNA区域互补的序列的寡核苷酸的短单链DNA片段，通常为十几至几十个核苷酸长)、DNA聚合酶、dNTP等。在PCR的第一步中，DNA双螺旋的两条链在高温下(通常为95℃左右)进行双链部分或全部的分离，暴露出DNA单链序列。在第二步中，降低至特定的温度(通常为50℃-60℃左右)，引物与互补的DNA序列通过碱基互补配对的方式结合。然后，这条双链DNA链成为DNA聚合酶的模板，从游离核苷酸(DNA的构建模块)中酶促组装新的DNA链。随着PCR的进行，产生的DNA本身用作复制的模板，启动指数扩增的链式反应。
由于PCR反应需要热循环，对温度准确性要求高，近年来科学家研发了一系列恒温基因扩增(isothermal nucleic acid amplification)的方法。这些恒温基因扩增方法不再需要热循环，可以在一个较为恒定的温度下完成基因的扩增和检测。这些恒温基因扩增方法的原理多种多样，其中比较具有代表性包括：1)基于核酸序列的扩增nucleic acidsequence-based amplification(NASBA)，其可以在41℃核酸进行扩增；2)重组酶聚合酶扩增recombinase polymerase amplification(RPA)，其可以在37摄氏度左右的温度对核酸进行扩增；3)环介导的等温扩增Loop-mediated isothermal amplification(LAMP)，其可以在63摄氏度左右的温度对核酸进行扩增。此外还有很多基于不同原理的恒温基因扩增反应。这些恒温基因扩增反应的共同点就是需要在一个相对恒定的温度下进行反应。
免疫分析技术是分析蛋白质的重要手段，在临床具有十分广泛的用途。免疫分析多基于抗原-抗体反应，该反应具有高度特异性，可特异性识别相应靶分子。免疫学三大经典标记技术包括酶免疫技术、放射免疫技术及荧光免疫技术，其中放射免疫技术由于放射性污染等问题，已逐渐被其他非放射性方法所取代。酶免疫技术中应用最广泛的是酶联免疫吸附试验(ELISA)，酶联免疫吸附试验可分为常用于抗原检测的双抗体夹心法，常用于抗体检测的间接法及竞争法等。以双抗体夹心法为例，将待测样本在固相抗体表面进行孵育，并使用酶标抗体在固相表面形成抗体-待测抗原-酶标抗体结构的免疫复合物，即可对待测抗原的含量进行定量检测。抗原抗体反应的影响因素有很多，电解质、酸碱度、温度等都可能对结果产生影响。以温度为例，温度过低不利于分子间相互作用，温度过高可能会导致蛋白质变性，因此，抗原抗体反应多在37℃下恒温进行。
光学检测是判断上述生物分子检测反应是否发生以及进行程度的重要方法。其中光学检测包括可见光、红外光、紫外光、荧光、拉曼等形式。在核酸检测中较为常见的需要光学检测的是实时荧光定量PCR方法(real time quantitative PCR)。其通过检测核酸扩增反应的热循环中特定荧光信号的变化，通过与一系列标准品的对比和相应的算法，可以完成对目标核酸的定量检测。在蛋白质的检测中，通常会使用酶标仪(plate reader)以一定的时间间隔进行反应的光学信号检测。在这些蛋白质检测反应中，通常会有反应底物被分解产生具有光学信号分子的过程。所以通过检测反应中的光学信号即可判断目标蛋白质的存在及其相应的浓度。
上述的生物分子检测反应通常是在反应管(0.2-0.5mL体积)或者孔板(通常为96孔或384孔)中以5-200μL的体积进行。因此，如果需要进行多重反应或高通量的检测，则需要消耗大量的样品和反应试剂，反应的成本很高。并且这些检测通常需要体积较大且较为昂贵的仪器设备，而且很多需要较为复杂的手动操作，所以广泛使用存在较大困难。
微流控生物芯片(microfluidics)是一种在微观尺度操作流体的技术。其特点是所需样品和试剂量小，可以在一定程度上实现多个功能的集成，并且便于进行高通量的筛选。其中具有代表性的是微液滴微流控(micro-droplet microfluidics)、微阀微流控(micro-valve microfluidics)及滑动式微流控(SlipChip microfluidics)等。特别的，滑动式微流控芯片可以通过其不同子芯片相对物理位置的变化完成对微体积液体的操作。虽然这些微流控芯片在一定程度上可以实现对微小体积流体的控制，并实现在微流控芯片上的生物分子检测，但对微流控芯片的温度控制和光学检测通常是通过传统的加热仪器和显微镜等仪器完成。检测系统非集成化且通常体积较大价格昂贵，对操作人员的要求较高。因此，本领域技术人员致力研发的小型集成式的可以实现对微流控芯片温度控制和光学检测的仪器设备具有重要的意义和广泛的应用前景。
因此，本领域迫切需要开发使用集成度高、使用简便、耗时少、应用场景广的对基于微流控生物芯片的小型生物分子分析系统，以解决现有技术中存在的上述技术问题。
发明内容
本发明提供了一套基于微流控生物芯片的小型生物分子分析系统，实现了对微流控芯片的温度控制和荧光检测，从而实现了在微流控芯片上的核酸定性和定量分析。
本申请公开了一种基于微流控芯片的生物分子分析系统，包括：
(M1)温控模块，所述温控模块被配置为：对所述微流控芯片的进行预定的温度变化控制，从而使得所述微流控芯片中各个微液滴独立地进行生化反应，其中所述温度变化进行升温、降温、和保温；
(M2)成像模块，所述成像模块被配置为：用激发光照射所述微流控芯片从而使得微液滴产生荧光，并记录所述微流控芯片中各微液滴产生的荧光信号；
(M3)数据处理模块，所述数据处理模块被配置为：对所述成像模块获取的微流控芯片中各微液滴产生的荧光信号，进行数据处理，从而获得分析结果；和
(M4)输出模块，所述输出模块被配置为输出所述的分析结果。
在另一优选例中，所述的分析系统还包括滑动式微流控芯片。
在另一优选例中，所述的生物分子分析系统为便携式。
在另一优选例中，所述的温控模块包括：
微处理器，所述微处理器对输入信号进行处理，并输出控制信号；
导热板，所述导热板的上主表面与所述微流控芯片的下表面接触，从而使得热量通过传导从导热板传导给微流控芯片或从微流控芯片传导给导热板；
升降温装置，所述升降温装置用于向所述导热板提供热量，从而实现导热板的升温，以及向所述导热板发生散热，从而实现导热板的降温；
任选的散热装置，所述散热装置用于向升降温装置提供进一步散热；
温度传感器，所述的温度传感器用于探测升降温装置和/或导热板的温度，并传递给微处理器；
电路控制装置，所述的电路控制装置被配置为控制升降温装置升降温装置的工作状态，其中，所述的电路控制装置与微处理器、升降温装置电气连接，从而接收来自处理器的控制信号，并基于控制信号进一步控制升降温装置的工作状态。
在另一优选例中，所述的工作状态包括：开、关、功率大小。
在另一优选例中，在所述的温度传感器和微处理器之间设置有第一模数转换器，用于将温度传感器的模拟信号转换为数字信号。
在另一优选例中，所述的电路控制装置包括PWM模块。
在另一优选例中，所述的微处理器包括微型计算机。
在另一优选例中，所述微处理器输出控制信号，达到升降温装置，调节所述升降温装置的温度；
所述温度传感器探测所述升降温装置的温度，通过所述温度数据传输装置，以数字信号传回至所述微处理器；
所述微处理器根据PID控制算法，输出下一时刻的控制信号，用于调控升降温装置的工作状态，从而使得导热板的发生预定的温度变化。
在另一优选例中，所述的温度传感器设置在升降温装置和导热板之间。
在另一优选例中，所述的温度传感器设置在导热板中。
在另一优选例中，所述的微处理器被配置为对多个温度传感器的信号(或温度值)进行比较，如果任二个温度传感器的信号差值(或温度差值)≥预定的温差阈值Y0(注：小部分区域可能不合格)，则对可能不合格的区域进行标记，以便在后期的数据处理模块对数据进行处理时，进行剔除处理。
在另一优选例中，所述的微处理器被配置为对多个温度传感器的信号(或温度值)进行比较，如果任二个温度传感器的信号差值(或温度差值)≥预定的温差阈值Y1(注：一部分区域可能不合格)，则对可能不合格的区域进行标记，以便在后期的数据处理模块对数据进行处理时，进行剔除处理或注明可能失败。
在另一优选例中，所述的成像模块包括：成像单元和光源单元。
在另一优选例中，所述升降温装置包括基于帕尔贴效应的热电半导体材料，还包括金属加热板。
在一个优选例中，所述升降温装置的加热区域面积为4-100cm2。
较佳地，所述的升降温装置为a×b的矩形，其中a为2-8cm，b为2-8cm。
在一个优选例中，所述温度传感器包括一个或多个热敏电阻。
在另一优选例中，当所述热敏电阻为多个时，其横向和/或纵向方向上规则排列。
在一个优选例中，所述热敏电阻的阻值范围为10-1000欧姆。
在一个优选例中，所述散热装置包括散热片和风扇。
较佳地，所述散热装置安装于所述升降温装置下方，用于为升降温装置散热，从而降低导热板的温度。
在一个优选例中，所述滑动式微流控芯片包括：上芯片和下芯片，
其中，所述上芯片具有相互连接的、“珍珠链”几何形状的微孔；
所述下芯片具有圆形扩展微孔；
所述滑动式微流控芯片基于滑移诱导自分割机制(slip-induced self-partitioning mechanism)生成纳升液滴。
在另一优选例中，所述滑动式微流控芯片用选自下组的材料制成：玻璃、有机玻璃、塑料、硅基材料或其组合。
在另一优选例中，所述滑动式微流控芯片由多层材料制成，包括的第一层和第二层，所述第一层由生物反应兼容性良好的塑料制成，所述第二层由导热性良好的硅基材料制成；
所述第一层位于所述第二层之上。
在另一优选例中，所述滑动式微流控芯片厚度d的范围为：0＜d＜1mm。
在另一优选例中，所述的分析结果为定量分析结果。
在一个优选例中，所述温控模块包括加热片和温度传感器，所述的加热片被设置为对所述的微流控芯片进行均匀的温度控制，或进行梯度温度控制，或进行非均匀的温度控制。
在另一优选例中，所述加热片的材料选自下组：金属、陶瓷、石墨、石墨烯、无机物导热材料、有机物导热材料、聚合物导热材料、或液态导热材料。
在一个优选例中，所述成像单元被设置为对微流控芯片的功能区域进行全幅成像。
在另一优选例中，所述的成像单元被设置为对微流控芯片进行实时光学检测。
在另一优选例中，所述的成像单元被设置为在一定时间间隔内对同一所述微流控芯片进行多次成像。
在另一优选例中，所述微流控芯片是通过芯片内不同子芯片相对位置的变化实现对反应溶液的操控。
在另一优选例中，所述光源单元包括光源和滤光片，所述滤光片位于所述光源和所述微流控芯片之间，所述滤光片的允许通过光线的中心波长为480±20nm，所述面光源是一对蓝光LED光源，所述LED光源与所述微流控芯片呈小于90度的夹角，对称布置在与所述微流控芯片两侧，使得所述LED光源产生的光线通过所述滤光片后平行照射在所述微流控芯片上。
在另一优选例中，所述成像单元包括透镜和成像设备，
在另一优选例中，所述透镜是一个或多个。
在另一优选例中，所述透镜位于成像设备和微流控芯片之间。
在另一优选例中，所述发射光经过透镜后被成像设备采集到。
在另一优选例中，所述成像单元还包括滤镜。
在另一优选例中，所述滤镜是一个或一组。
在另一优选例中，所述滤镜位于透镜和微流控芯片之间。
在另一优选例中，所述发射光经过滤镜和透镜后被成像设备采集到。
在另一优选例中，所述滤镜允许通过光线的中心波长为520±10nm。
在另一优选例中，所述透镜的成像范围为4cm*4cm。
在另一优选例中，所述成像设备的分辨率为4384pixel*3288pixel。
在一个优选例中，所述的数据处理模块包括：
(Z1)甲基化分析子模块，所述的甲基化分析子模块被配置为对所述成像模块获取的微流控芯片中各微液滴产生的荧光信号，进行数据处理，从而获得被检测样品中多个核酸分子的各自的熔解曲线和/或Tm值，进而获得所述被检测样品中甲基化分子和非甲基化分子的定量检测结果。
在另一优选例中，所述的甲基化分析子模块被配置为对熔解曲线进行求导处理，得出一阶导数曲线，从而获得所述熔解曲线的峰值图。
在另一优选例中，所述的甲基化分析子模块被配置基于所述的峰值图，对各核酸分子是否甲基化进行逐个判断。
在另一优选例中，所述的多个核酸分子为q个，q为≥5的正整数，较佳地q为5-100000，更佳地10-10000，最佳地100-5000个。
在另一优选例中，当q个核酸分子中，q1个为甲基化分子，q2个为非甲基化分子时，其中q1+q2＝q，则所述检测样品中甲基化分子的相对含量为q1/(q1+q2)。
在另一优选例中，当所述的甲基化分子和非甲基化分子的Tm值的差值ΔTm≥1℃，Tm≥2℃，较佳地≥3℃，更佳地≥4℃，如4-6℃。
在一个优选例中，用于生物分子的检测分析。
在另一优选例中，所述的检测分析选自下组：病原体定量检测、实时荧光定量分析、数字PCR检测、核酸甲基化分析、或其组合。
在另一优选例中，所述的检测分析包括诊断性和非诊断性的检测分析。
在另一优选例中，所述的生物分子选自下组：核酸分子(如DNA、RNA)。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1是本发明的工作原理图；
图2是本发明的生物分子分析系统的温控模块的一个电路连接图；
图3是本发明的生物分子分析系统的成像模块的一个较佳实施例；
图4是本发明的生物分子分析系统的的一个较佳实施例；
图5是本发明的生物分子分析系统的成像模块的一个较佳实施例；
图6是本发明的生物分子分析系统的温控模块的一个较佳实施例；
图7是本发明的生物分子分析系统的温控模块的温度传感器的布置方式示意图；
图8是使用本发明的生物分子分析系统进行的荧光定量分析程序的荧光信号强度曲线图；
图9是使用本发明的生物分子分析系统进行的甲基化荧光检测的每个微孔中甲基化分子的熔解曲线图；
图10是使用本发明的生物分子分析系统进行的甲基化荧光检测的每个微孔中甲基化分子的熔解曲线峰值图；
图11是使用本发明的生物分子分析系统进行的甲基化荧光检测的每个微孔中甲基化分子的熔解曲线图；
图12是使用本发明的生物分子分析系统进行的甲基化荧光检测的每个微孔中甲基化分子的熔解曲线峰值图；
图13是使用本发明的生物分子分析系统进行的甲基化荧光检测的每个微孔中甲基化分子的熔解曲线峰值图；
图14是TracePro拟合的相对光强；
图15是2240个被测微孔的灰度值频率分布直方图。
其中：
10-成像单元
1-成像设备
20-光源单元
2-光源
3-微流控芯片
4-导热板
50-激发光
5-透镜
60-发射光
6-滤镜
71-散热片
72-铜管
8-风扇
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地研发了一种基于微流控芯片的生物分子分析系统。通过实验表明，本发明的系统和装置可以实现对生物分子样品(例如生物核苷酸样品)更加精准和快速的检测和分析，极大地降低了实验成本，节省了实验时间。在此基础之上，完成了本发明。
术语
基于微流控芯片的分析系统
如本文所用，术语“生物分子分析系统”、“本发明的分析系统”“本发明的系统”、“本发明的分析设备”可互换使用，指本发明第一方面所述的基于微流控芯片的分析系统。
甲基化和CpG岛
CpG：指双核苷酸胞嘧啶(C)—磷酸(P)—鸟嘌呤(G)的缩写。
CpG岛(CpG island)：DNA上的一个区域，此区域含大量相连的胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)，以及使两者相联的磷酸酯键(P)。哺乳类基因的启动子上，含有约40％的CpG岛(人类约70％)，一般CpG岛的长度约300-3000个碱基对(bp)。研究表明，CpG双核苷酸在人类基因组中的分布很不均一，而在基因组的某些区段，CpG保持或高于正常概率。
帕尔贴效应
所谓珀尔帖效应，是指当直流电流通过两种半导体材料组成的电偶时，其一端吸热，一端放热的现象。当有电流流过时，会产生“热”侧和“冷”侧。是致冷还是加热，以及致冷、加热的速率，由通过它的电流方向和大小来决定。
半峰全宽(full width at half maxima)
简称FWHM。色谱分析的术语，指色谱峰高一半处的峰宽度，即通过峰高的中点作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间的距离。用符号Y1/2或2△t1/2表示。半峰全宽亦称半宽度，半峰宽，半峰宽度，区域宽度，区域半宽度。
便携式基于微流控芯片的生物分子分析系统
本发明提供了一种如第一方面中所述的便携式基于微流控芯片的生物分子分析系统。
本发明系统的原理如图1至图3所示，本系统包括温控模块M1、成像模块M2、数据处理模块M3、输出模块M4；本系统还包括滑动式微流控芯片3；其中，成像模块M2包括成像单元10和光源单元20，光源单元20的激发光50照射到微流控芯片3上，微流控芯片3是通过芯片内不同子芯片相对位置的变化实现对反应溶液的操控，使得微流控芯片3上的生物化学反应产生发射光60，成像单元10通过检测产生的发射光60对PCR过程进行定量分析。本系统还包括固件控制模块，固件控制模块控制温控模块M4对微流控芯片3进行反应温度调节，控制光源单元20开启或关闭、控制电源单元给温控模块40、光源单元20、微流控芯片3供电。
温控模块M4包括：
微处理器，对输入信号进行处理，并输出控制信号。优选地，微处理器可以为Raspberry Pi计算机。
升降温装置，包括基于Peltier(珀尔帖效应)效应实现温度控制的半导体器件。升温和降温统一由帕尔贴和导热板实现，帕尔贴可以单独实现升温和降温的功能。
可选地，该半导体器件可以划分为多个(例如2～4个)部分，并且每个部分配置有一个热敏电阻和一个输入接口。
温度传感器，用于探测升降温装置和/或导热板的温度，并传递给微处理器。温度传感器且为接触式金属温度传感器，可以是热电偶传感器或热敏电阻传感器，其中热电偶传感器可以是J型、K型、E型热电偶中的一种。优选地，使用热敏电阻PT1000。PT1000的阻值跟温度的变化成正比，温度的采集范围可以在-200℃～+200℃，湿度采集范围是0％～100％。
温度数据传输装置，包括A/D转换器，连接于温度传感器与微处理器之间；以及D/A转换器，D/A转换器连接在微处理器之后。优选地，通过MAX31865来采集PT1000的阻值变化并转换成温度值，在与STM32F030F4P6进行SPI通信。
电路控制装置，将D/A转换器输出的电压控制信号通过电路连接首先进行电压放大，再通过功率放大，优选地，采用两片LM338构成的功率放大。可选地，电路控制装置还可以包括温度传感器驱动器(例如，PT1000驱动)、模拟多路复用器，所述模拟多路复用器可选地为ADG507A。
散热装置；包括金属散热器及风扇，金属散热器为多层金属散热片结构，风扇设置在金属散热器中部。温控模块通过四根铜管连接于散热器上方。
优选地，散热装置可设置于升降温装置下部，以防帕尔贴在长时间工作过程中产生热量堆积，影响帕尔贴工作效率，导致升降温速率变慢。
在本发明中，微流控芯片可选地由以下单一材料组成：
表1
材料 导热系数
玻璃 0.5-2W/mk
有机玻璃/塑料 0.08-0.4W/mk
硅基材料 7-150W/mk
为了保证良好的传热，微流控芯片的厚度通常小于1mm，优选的芯片的厚度小于0.5mm
优选地，微流控芯片3也可以是多层材料制成，例如下层0.5mm为高热率材料(例如硅基材料)，上层为生物反应兼容性更好的塑料材料，但导热率低(例如PC，COP)等。
为了提高导热，微流控芯片3也可以是复合材料制成，例如在塑料中混入一定比例的(0.01％-10％)的碳纳米管或石墨烯材料以提高芯片的导热率。
在本发明中，温控模块M4可以对温度进行+/-0.1摄氏度以内的精准控制，其可以对微流控芯片3提供均匀或非均匀的加热/冷却/恒温操作，也可以对微流控芯片3进行热循环操作(在高温和低温区间内变化)，也可以对微流控芯片3进行非均匀的温度控制。
温控模块M4的材料可以为如下材料中的一种：金属、陶瓷、石墨、石墨烯、无机物导热材料、有机物导热材料、聚合物导热材料、液态导热材料。
温控模块M4的加热原理可以是电加热、光加热(如红外线加热)、直接接触加热、改变环境温度(如改变周围气体温度)加热。
优选地，温控模块M4的具体温度控制机制可以基于半导体材料的珀尔帖(Peltier)效应实现，其反馈机制可以通过热电偶实现。
在本发明中，光源单元20可以发出特定波长的激发光50(excitation light)，照射在被检测模块(生物芯片)上；生物芯片上所产生的发射光60(emission light)可以由成像单元10通过拍照的形式检测到。光源单元20包括光源2、透镜5和滤镜6。光源2可以是点光源、线光源、面光源或以上的组合，其可以发出特定波长的激发光50，或者是较为广谱的激发光50；特定波长的滤光片位于光源2和微流控芯片3之间。可选地，光源单元20由TracePro70软件驱动。激发光50的强度和照射时间可以被精准调控。
温度控制
在本发明的便携式基于微流控芯片的生物分子分析系统中，一方面配有可对微流控芯片进行升温、降温和保温的导热板以及相应的加热元件，另一方面通过微处理器对导热板整个主表面进行全域的准确控温，从而首次在便携式的小型设备上实现高精度的数字PCR等生化检测。
由于在当设定值比当前温度高很多时(例如，设定值≥帕尔贴半导体器件的温度，且温度差值的绝对值≥预定值，例如约1℃或2℃)控制增量都为正，而只有当温度上升到设定值以上(即设定值＜帕尔贴半导体器件的温度)时，控制增量才切换为0或负值。优选地，本系统采用时间最优的PID控制，即当前值与设定值偏差较大(如差值的绝对值≥5℃，较佳地≥2℃)的情况下，采用比例调节，全功率(最大电压输出)加热(或制冷)；当前值与设定值偏差较小(如差值的绝对值＜5℃，较佳地＜2℃)的情况下，采用积分调节，仅用部分功率加热(或制冷)。
铂热电阻PT1000微处理器根据比例调节输出控制信号，经过D/A转换器，经由运算放大器达到帕尔贴半导体器件的输入接口，PT1000的阻值经由A/D处理器返回Raspberrypi微型计算机；
Raspberry pi自动将采集到的实际温度与事先设定的温度预设值进行对比，然后根据程序实时计算，获得比例、积分、微分控制器参数；
当实际温度高于预设值时，Raspberry pi将此时的温度数据作为根据将控制信号传输给D/A，D/A将数字信号转化为模拟信号，然后将模拟信号传递给散热装置，进而控制风扇启动，从而完成对温度的控制。
如图2所示，温度控制方法采用分段式PID算法调节脉冲宽度调制(PWM)的占空比控制对帕尔贴的加热，具体包括以下步骤：当PT1000的测量的当前温度值TC与设定温度值TM的差值大于等于T1时，(TC-TM)≥T1，通过比例调节控制对帕尔贴的加热；当帕尔贴的测量的当前温度TC与设定温度TM的差值小于设定值T1大于等于设定值T2时，T1＞(TC-TM)≥T2，每隔时间S1采集一次帕尔贴的温度，使用积分调节控制帕尔贴的加热；当帕尔贴的测量温度TC与目标温度TM的差值小于设定值T2时，(TC-TM)＜T2，每隔时间S2采集一次温度，使用微分调节控制对帕尔贴的加热。
在一具体实施例中，可设定值T1为5度，设定值T2为2度，时间S1为50ms，时间S2为50ms。
本发明中，分段式PID控制算法按下式计算：
Figure BDA0002971934760000131
其中T为采样周期。Kp为比例系数，Ti为积分常数，Td为微分常数，e(k)为第k次采样的偏差值。Kp，Ti，Td需根据帕尔贴温度阻值曲线的实际情况，使用Ziegler-Nichols方法进行标定。
一种具体标定方法如下：使用P比例调节，即PID控制算法公式简化。根据经验参考定义若干临界增益Kp的值，如分别取值1.5，3，6，7等，设定采样周期为5秒，目标温度为95℃，每个采样周期结束后可根据当前温度与目标温度的差值计算得出下个采样周期内加热的占空比值，以此占空比值在下个采样周期内对帕尔贴进行加热。从而可得出每一个选取的Kp值对应的温度震荡曲线，从中选取稳定的最接近控制目标的震荡曲线。根据选定的震荡曲线确定Kp值和震荡周期Pc。
1.当温度偏差大于5℃时，上述计算公式中的β＝0,γ＝0；
2.当温度偏差小于5℃，大于2℃时，上述计算公式中的β＝1,γ＝0；
3.当温度小于2℃时，上述计算公式中的β＝1,γ＝1。反应结束后，将升降温装置设置为关闭状态。
应用
本发明的便携式基于微流控芯片的生物分子分析系统可应用于多种生化检测，尤其是基于核酸的检测，例如针对病原体基因的定量检测、实时荧光定量实验。
优选地，本发明系统可用于对核酸样品中甲基化水平(或程度)进行定性和/或定量检测。
典型地，在一个优选例中，本发明的基于实时荧光检测的甲基化分子定量测试方法，包括以下步骤：
S1.将包含甲基化标准品和非甲基化标准品的混合溶液配置成PCR反应混合物；
S2.在所述PCR反应混合物中加入包含CpG的引物，得到样品溶液；
S3.将所述样品溶液装入根据权利要求7所述的滑动式微流控芯片中，形成微孔阵列；
S4.使用本发明所述的生物分子分析系统对装入滑动式微流控芯片的微孔阵列进行PCR扩增；
S5.使用所述生物分子分析系统的成像模块以固定的时间间隔记录多张所有微孔的荧光信号；
S6.使用所述生物分子分析系统的数据处理模块对所记录的图像，计算出每个微孔内随温度变化的荧光信号平均值，得到甲基化样品和非甲基化样品的熔解曲线和相应峰值图，从而获得甲基化分析结果。
本发明的主要技术效果包括：
1、本发明的系统结合微流控芯片，可以对微流控芯片进行实时荧光检测，可以极大的减少实时荧光检测所需要的试剂量，兼容不同原理的进行生物分子检测的微流控芯片(可以是数字PCR，数字恒温，多重PCR，多重恒温基因检测，蛋白质检测)；
2、本发明的装置小型便捷，系统设计简单，可以很大的降低成本；
3、本发明的装置的温度控制模块可以进行非均一的温度控制(不同部位的温度可以不同)；
4、本发明的系统可以在微流控芯片上对核酸进行熔解曲线分析(melt curveanalysis)；
5、系统的成像单元可以对整个微流控芯片进行成像，不需要采集多张图片；
6、本发明也可以应用于其他生物芯片同时需要温度控制，及实时荧光检测的生物及化学反应或过程。
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
实施例1
便携式基于微流控芯片的生物分子分析系统
参见图3至图4，本实施例的微流控芯片生物分子分析系统，从上到下依次包括：成像设备1，透镜5，滤镜6，光源2，微流控芯片3以及散热装置。其中成像设备1可以是手机，云相机或数码相机等移动式拍照设备，也可以是有成像功能的光电芯片，被设置为能够对微流控芯片3每间隔一段时间进行拍照，进行实时荧光检测；透镜5可以是一个或一组；滤镜6是特定波长，可以是一个或一组；成像设备1还可以包含手动或自动的对焦装置。为了避免反射光对成像设备1的干扰，光源2与被检测的微流控芯片3所在的平面并非垂直的，而是呈一定角度。
如图3所示为本发明的成像单元10与光源单元20的具体结构示意图，在本实施例中，构成成像单元10与光源单元20的具体部件为：
光源2：2个蓝光LED光源，自带480nm中心波长滤光片；
滤镜6：520nm中心波长滤光片；
成像设备1：摄像机镜头套件；
其中，一对CREE蓝光LED光源通过480nm中心波长的滤光片平行照射在芯片样本上，样本受光激发产生绿色荧光，该荧光通过520nm中心波长的滤光片由镜头及摄像机成像。滤光片的存在有效滤除不相干的光源对于成像的干扰，保证了图像及数据分析的可靠性。镜头与相机的成像范围与分辨率分别为4cm*4cm和4384pixel*3288pixel，足够有效分辨整块芯片上的荧光分布情况。成像单元10能够对微流控芯片3的功能区域进行全幅成像。并且成像单元10经过设置，可在一定时间间隔内对同一微流控芯片3进行多次成像。
成像模块M2获取的荧光图像表明，该系统可以实现均匀照明，其变异系数为8.2％，并且具有2240个被测微孔的灰度值频率分布直方图(图14)。具有高斯拟合的半峰全宽(FWHM)为4.62。因此，可以认为照明场是相对均匀的。
如图4至图6所示为本发明温控模块M4的具体结构示意图。其中温控模块M4包括散热装置，散热装置包含散热片71、金属铜管72以及风扇8。散热片71的上表面设置有导热板4。该导热板4的上表面与微流控芯片3紧密接触，用于控制微流控芯片3的温度。特别的，温度控制可以通过半导体材料的Peltier(珀尔帖效应)效应实现。在其他实施例中，温度控制也可以通过导热液体进行。在本实施例中，温控模块M4具有通过热电偶实现的反馈控制机制。
具体地，本实施例中的温控模块M4采用以下构成：
微处理器：Raspberry Pi微型计算机；
升降温装置：帕尔贴热电半导体制冷-加热器件；
温度传感器：热敏电阻PT1000；
温度数据传输装置：热敏电阻至数字输出转换器MAX31865；
电路控制装置：继电器；
散热装置：金属散热片、铜管及风扇。
如图2所示是温控模块M4的电路连接图。Raspberry Pi为整个系统的计算模块，负责接收，处理，发送数据及信号，以维持整个系统的运转，其本质为基于Linux系统的微型电脑。Raspberry Pi在温度控制模块中负责接收温度数值，并计算输出功率。帕尔贴将电源输送的电能转化为热能，负责直接的温度输出，由热敏电阻PT1000探测帕尔贴当前时刻温度，该温度引起PT1000电阻自身阻值变化，变化的阻值由MAX31865模块读取并转换成为Linux系统可辨认的数字信号，Raspberry Pi接收该数字信号，并依据该数字信号，结合PID控制算法计算下一时刻的输出功率，通过控制继电器调节电源供给帕尔贴的功率大小，进而对温度进行控制。金属散热片及风扇负责对整个温度模块进行散热，以保证系统不会因长时间的加热导致其他部件温度升高，从而保证系统的稳定性。
在其他实施例中，电源和固件控制模块未被附图所标示出其具体构成为：
(1)12V稳压电源
(2)12V转5V变压器，12V转6V变压器
(3)继电器
(4)Raspberry Pi微型计算机
其中，12V稳压电源为整个设备提供电力，包括温度控制，荧光检测，触碰显示及固件控制和散热装置。具体的电能分配由Raspberry Pi进行计算分析，交由变压器与继电器进行分配，包括光源的开启及关闭，帕尔贴的工作功率等。固件控制模块通过python算法程序的编写，利用树莓派的输出信号端口，可以对整个系统的固件进行控制，包括确定各个模块运行的顺序，运行的时长以及效能等，以确保系统正常稳定工作。
实施例2
定量检测金黄葡萄球菌nuc基因
使用本发明所述系统定量检测金黄葡萄球菌nuc基因。
在本实施例中，成像单元10的FAM和ROX荧光检测滤光片和相应的光学器件采购于ThorLabs和尼康公司。本实施例中，成像单元10还包括以下光路通道：CY5通道、FAM通道、ROX通道、HEX通道。
升降温装置中的导热板为机械加工的不锈钢材料，其表面氧化处理为黑色。
微流控芯片3的设计参照已发表的论文Lab Chip 2010 10:2666-2672。
检测所需的物质包括40微升的反应溶液，具体包含：
20微升的2×SsoFast EvaGreen预混PCR反应液，来自于美国伯乐公司(Biorad)；
1微升的引物-1：5'-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3'(SEQ ID No:1)，浓度为10微摩尔/升；
1微升的引物-2：5'-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3'(SEQ ID No:2)，浓度为10微摩尔/升)；
15微升的PCR用清洁水；
2微升的含有金黄葡萄球菌基因的样品；
1微升ROX染料；
具体测定步骤为，将反应溶液充分混合后，加入到滑动式微流控芯片3中(具体设计发表于Lab on a Chip 2010 10:2666-2672)。将微流控芯片3放置在导热板上。
升降温装置的升降温速度可达升温4.5℃/s，降温3℃/s。升降温装置的温度为95℃ 1分钟，55℃ 30秒，72℃ 30秒，循环40次。
在72℃进行到25秒时，打开ROX通道荧光检测，曝光时间0.5秒；随后打开FAM通道进行荧光检测，曝光时间为1秒。采集到的ROX和EvaGreen(FAM通道)的荧光信号强度可以进行后续分析，得到相应的定量结果。
用程序可自动追踪分析出每个循环中各微孔荧光信号平均强度并绘制各微孔的实时荧光曲线。在相同浓度的样本条件下定量结果具有良好的一致性，对微孔的荧光进行实时监测，根据扩增曲线可有效剔除假阳性微孔，结合微流控芯片的数字化结果，实现高灵敏度高特异性的地量监测。
实施例3
HPV18质粒实时荧光定量实验
使用本发明的系统进行实时荧光定量聚合酶链式反应分析。温控模块利用微处理器可对微芯片中温度进行精准控制；成像模块由两侧各一的激发光源、滤光片及相机组成，通过处理器控制，可在指定时间内对微流控芯片荧光信号进行实时监测。
本实施例的系统可选地在固件控制模块包括一触摸屏(图中未示出)，用于设置和显示参数，设置的参数包括：预设温度、反馈调节比例系数、微分时间、积分时间，触摸屏把设置的参数传递温控模块的微处理器，显示的参数是温度传感器PT1000的实际温度；温度传感器实时采集帕尔贴半导体器件的温度，把该半导体器件的实际温度反馈给微处理器。
该微流控芯片为滑动式微流控芯片，基于滑移诱导自分割机制(slip-inducedself-partitioning mechanism)生成纳升液滴。该滑动式微流控芯片利用包含微孔的流体通道(microchannels)，流体通道具有浅、窄、桥形的造型，并连通微孔，以进行样品的加载，而与微孔的对齐方式无关。
具体步骤：
(1)制备微流控芯片3，微流控芯片3由匀胶铬板通过光刻技术制备得到。
(2)制备完成的微流控芯片3使用浓硫酸：过氧化氢(2：1)进行洗涤以充分暴露表面羟基并除去表面可能残留的杂质。使用去离子水冲洗干净表面并干燥后将芯片置于等离子体清洗机中再次清洗。随后将芯片置于密闭容器中并使用二氯二甲基硅烷进行表面疏水化处理2小时。
(3)取出表面处理完成的芯片，并依次使用氯仿、丙酮、乙醇洗涤芯片表面，去除可能在表面残余的硅烷试剂。
(4)上下两层芯片在通过真空除气的油(矿物油：十四烷＝2：1)内进行组装。
(5)使用TA克隆得到的HPV18质粒作为模板进行实时荧光定量PCR反应，共进行了三种浓度质粒样本的反应，终浓度分别为20pg，2pg，200fg。
检测所需的物质包括50ul的反应溶液，具体包含：
25ul SsoFast EvaGreen Supermix预混PCR反应液，来自于美国伯乐公司(Biorad)；
2ul的引物-F：5'-ACACAGTTTTGGAAGATGGTGA-3'(SEQ ID No:3)，浓度为10微摩尔/升；
2ul的引物-R：5'-GGATGGTTACAGGTAGACTGACA-3'(SEQ ID No:4)，浓度为10微摩尔/升)；
2.5ul的牛血清白蛋白(BSA)，浓度为2mg/ml；
10ul的HPV18质粒；
8.5ul的ddH2O。
反应条件为：预变性95℃300s，95℃变性40s，58℃退火延升40s，共35个循环。
(6)将反应混合物通过进样口加入到微流控芯片3中，待混合物充满通道内部后，通过上下芯片的相对滑动以形成相互分隔且不与外界接触的微反应液滴，微液滴外部被油层包裹，液体内部包含有反应所需的所有试剂。
(7)将完成进样后的微流控芯片3放置在温控模块40的金属导热板上，保证二者之间紧密接触。
运行系统内置的实时荧光定量PCR反应程序，该程序包括了温控模块及成像模块。
(8)在反应循环的第二阶段，试剂内的EVAGREEN将与DNA双链结合发出绿色荧光信号，通过对微孔内每个循环结束后的荧光信号进行分析可绘制出该微孔的实时荧光扩增曲线(如图8所示)。
每个液滴当中平均含有的目标基因拷贝数(Copy per droplet,CPD)和阳性微滴比总的微滴的关系公式如下：
CPD＝-ln(1-P)
其中P是阳性微滴比总微滴的比例数。
每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，公式如下：
Ct＝-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)
其中，X0为初始模板量，Ex为扩增效率，N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。
起始拷贝数越多，Ct值越小。
(9)待反应完成后，运行系统内的实时荧光定量分析程序，该程序可选地为平均Ct。使用该程序可自动分析出每个循环后各微孔荧光信号平均强度并绘制各微孔的实时荧光曲线。结果如图9所示。
图中各曲线对应Ct值如表2所示(使用该系统反应的不同浓度HPV18质粒体系计算所得的Ct值，每个浓度取三个点进行分析)。
表2
Figure BDA0002971934760000201
(10)由于Log(起始浓度)与循环数呈线性关系，通过已知其实拷贝数的标准品可作出标准曲线，即得到该扩增反应存在的线性关系。利用Mean Ct可得到标准曲线公式，其中，横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。
y＝-3.487x+37.52
扩增效率E的计算：
E＝10-1/斜率-1
根据该反应所得到的反应扩增效率为93.54％
(11)只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。因此将上表Ct值带入线性方程，可算得未知样品拷贝数。
实施例4
DNA甲基化水平定量分析
使用本发明的系统进行DNA样品的甲基化水平定量分析。装置包括一个含有2040个微孔的微流控芯片，一个平板PCR仪和一个荧光检测系统，实现了数字PCR和数字高分辨率熔解曲线分析。
本系统的温控模块M4中，升降温装置为基于帕尔贴效应的半导体器件，如图7所示，半导体器件中设置有4个热敏电阻PT1000，帕尔贴半导体器件划分为4个相同的三角形区域Q1、Q2、Q3、Q4，并且每个区域包括一个PT1000。
可选地，电路控制装置包括总线控制器，每个PT1000通过导线与总线控制器电连接。
总线控制器包括四组通讯接口和一组差分RS485接口及单片机；通讯接口的P、N引脚连接温度传感器电源，四组通讯接口独立使用，每组通过总线至少可以连接一个温度传感器，每组通讯接口将PT1000温度传感器中的温度数据读取并存储至单片机的内存中。
总线控制器的单片机内置控制器软件，控制器软件可选地由比较器驱动，主要包括温度比较子模块：将经过A/D转换器的T1、T2、T3、T4两两进行比较，当任意两个温度信号之差大于温度差预设值Y1时，标记该对比较结果，并对该对温度比较结果所属的区域连续进行三次温度比较，若三次比较读取到两个温度信号之差均大于温度差预设值Y1，则记录为故障，以便在后期的数据处理模块对数据进行处理时，进行剔除处理。
具体步骤：
(1)将完全甲基化标准品和完全非甲基化标准品按一定比例混合后进行重亚硫酸盐转化，按照50ul体系配置PCR反应混合物：
TaKaRa EpiTaq HS(5U/ul)0.25ul；
10×EpiTaq PCR Buffer(Mg2+free)5ul；
25Mm MgCl2 5ul；
dNTP Mixture(各2.5mM)6ul；
模板 2.5ul；
引物1(10pmol)1ul；
引物2(10pmol)1ul；
ddH20 26.5ul；
20X Evagreen 2.5ul；
triton 0.25ul；
BSA 2.5ul。
引物是在非CpG岛设计的一对针对亚硫酸盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG。
引物序列如下：
hMLH1 Primer I:5′-GGAGTGAAGGAGGTTACGGGTAAGT-3′(SEQ ID No:5)
hMLH1 Primer II:5′-AAAAACGATAAAACCCTATACCTAATCTATC-3′(SEQ ID No:6)
(2)将上下两片芯片在油中装配好，将样品溶液从入口处打入芯片中，通过滑动形成2040个微孔阵列，甲基化的分子以泊松分布的形式分散在微孔中，每个微孔里至多含有一个甲基化分子。
(3)将其放到平板PCR上进行PCR扩增，PCR程序如下：95℃30s，59℃30s，72℃1min，进行40个循环。
根据微处理器的控制对帕尔贴半导体器件输出升温控制信号，使其加热导热板上的微流控芯片。控制方法及原理同实施例3所述。
当Evagreen荧光染料与双链DNA结合，有模板的微孔呈现荧光信号。
(4)最后对其进行熔解曲线分析，熔解曲线的程序设置如下：95℃60s，40℃60s，以0.2℃为间隔从65℃逐渐升温到95℃，每度拍摄5张照片，得到一系列随温度变化的荧光图片。
双链核苷酸的热稳定性受其长度和碱基组成的影响，序列变化会导致升温过程中dsDNA解链行为的改变。因为所用的荧光染料只能嵌入并结合到dsDNA上，因此通过实时监测dsDNA熔解过程中荧光信号值的变化，就能生成不同形状的熔解曲线。熔解温度(meltingtemperature，Tm)是指使DNA双螺旋结构解开一半时所需要的温度。在对DNA加热的过程中，紫外光吸收值达到最大值的50％的温度即熔解温度。若感兴趣的CpG岛发生了甲基化，重亚硫酸盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中GC含量发生改变，从而导致熔解温度的变化。甲基化样本中CG含量多，非甲基化样本中Tm值高，AT含量多，Tm值低，因此可以通过Tm值的变化区分甲基化和非甲基化样本，从而实现对甲基化水平的定量。
(5)数据分析：用第一张图片作为掩膜，通过Python圈出所有的阳性点，所有的照片自动和掩膜对齐并得到每一张照片的每一个阳性孔的绿色平均值，也就是每一个微孔随温度变化的绿色平均值，分别将其拟合成一条光滑的曲线，可以得到每个微孔中甲基化分子的熔解曲线(图10，图12)。对其求一阶导数，可以得到熔解曲线的峰值图(图11，图13)。
将完全甲基化和非甲基化的标准品按照一定比例混合后进行重亚硫酸盐转化，随后进行PCR扩增和数字熔解曲线分析。实验结果表明通过熔解温度可以实现对假阳性的判断，图9和图10是其中四个阳性微孔的熔解曲线和峰值图，从图中可以看出，甲基化的分子(分子2、分子3和分子4)的Tm值为85.05℃，85.98℃，86.04℃，假阳性点(分子1)Tm值为75.68℃。
此外，本发明还可以通过Tm值对甲基化分子和非甲基化分子进行区分，实现定量。图12和图13是其中六个微孔的熔解曲线和峰值图，从图中可以看出，甲基化的分子(分子4、分子5和分子6)的Tm值在85.05，85.90，85.92，非甲基化的分子(分子1、分子2和分子3)的Tm值在80.12，79.97，79.60。
对于某一检测样品，若基于微流控芯片的数字化检测结果仅有6个孔有检测结果，则该检测样品中甲基化分子的定量检测结果为3/(3+3)＝50％。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 基于微流控芯片的生物分子分析系统
<130> P2020-2337
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcgattgatg gtgatacggt t 21
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agccaagcct tgacgaacta aagc 24
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acacagtttt ggaagatggt ga 22
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggatggttac aggtagactg aca 23
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggagtgaagg aggttacggg taagt 25
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaaaacgata aaaccctata cctaatctat c 31

Claims (10)

1.一种基于微流控芯片的生物分子分析系统，其特征在于，包括：
(M1)温控模块，所述温控模块被配置为：对所述微流控芯片的进行预定的温度变化控制，从而使得所述微流控芯片中各个微液滴独立地进行生化反应，其中所述温度变化进行升温、降温、和保温；
(M2)成像模块，所述成像模块被配置为：用激发光照射所述微流控芯片从而使得微液滴产生荧光，并记录所述微流控芯片中各微液滴产生的荧光信号；
(M3)数据处理模块，所述数据处理模块被配置为：对所述成像模块获取的微流控芯片中各微液滴产生的荧光信号，进行数据处理，从而获得分析结果；和
(M4)输出模块，所述输出模块被配置为输出所述的分析结果。
2.根据权利要求1的生物分子分析系统，其特征在于，所述的温控模块包括：
微处理器，所述微处理器对输入信号进行处理，并输出控制信号；
导热板，所述导热板的上主表面与所述微流控芯片的下表面接触，从而使得热量通过传导从导热板传导给微流控芯片或从微流控芯片传导给导热板；
升降温装置，所述升降温装置用于向所述导热板提供热量，从而实现导热板的升温，以及向所述导热板发生散热，从而实现导热板的降温；
任选的散热装置，所述散热装置用于向升降温装置提供进一步散热；
温度传感器，所述的温度传感器用于探测升降温装置和/或导热板的温度，并传递给微处理器；
电路控制装置，所述的电路控制装置被配置为控制升降温装置升降温装置的工作状态，其中，所述的电路控制装置与微处理器、升降温装置电气连接，从而接收来自处理器的控制信号，并基于控制信号进一步控制升降温装置的工作状态。
3.根据权利要求2的生物分子分析系统，其特征在于，所述微处理器输出控制信号，达到升降温装置，调节所述升降温装置的温度；
所述温度传感器探测所述升降温装置的温度，通过所述温度数据传输装置，以数字信号传回至所述微处理器；
所述微处理器根据PID控制算法，输出下一时刻的控制信号，用于调控升降温装置的工作状态，从而使得导热板的发生预定的温度变化。
4.根据权利要求2的生物分子分析系统，其特征在于，所述的微处理器被配置为对多个温度传感器的信号(或温度值)进行比较，如果任二个温度传感器的信号差值(或温度差值)≥预定的温差阈值Y0(注：小部分区域可能不合格)，则对可能不合格的区域进行标记，以便在后期的数据处理模块对数据进行处理时，进行剔除处理。
5.根据权利要求2的生物分子分析系统，其特征在于，所述升降温装置的加热区域面积为4-100cm2。
6.根据权利要求2的生物分子分析系统，其特征在于，所述温度传感器包括一个或多个热敏电阻。
7.根据权利要求1的生物分子分析系统，其特征在于，还包括：滑动式微流控芯片，所述滑动式微流控芯片包括：上芯片和下芯片，
其中，所述上芯片具有相互连接的、“珍珠链”几何形状的微孔；
所述下芯片具有圆形扩展微孔；
所述滑动式微流控芯片基于滑移诱导自分割机制(slip-induced self-partitioningmechanism)生成纳升液滴。
8.根据权利要求1的生物分子分析系统，其特征在于，所述温控模块包括加热片和温度传感器，所述的加热片被设置为对所述的微流控芯片进行均匀的温度控制，或进行梯度温度控制，或进行非均匀的温度控制。
9.根据权利要求1的生物分子分析系统，其特征在于，所述的数据处理模块包括：
(Z1)甲基化分析子模块，所述的甲基化分析子模块被配置为对所述成像模块获取的微流控芯片中各微液滴产生的荧光信号，进行数据处理，从而获得被检测样品中多个核酸分子的各自的熔解曲线和/或Tm值，进而获得所述被检测样品中甲基化分子和非甲基化分子的定量检测结果。
10.根据权利要求9的生物分子分析系统，其特征在于，所述的甲基化分析子模块被配置为对熔解曲线进行求导处理，得出一阶导数曲线，从而获得所述熔解曲线的峰值图。
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