KR20220144662A - 루꼴라 추출물을 함유하는 노인성 황반 변성 예방, 개선 및 치료용 조성물 - Google Patents
루꼴라 추출물을 함유하는 노인성 황반 변성 예방, 개선 및 치료용 조성물 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20220144662A KR20220144662A KR1020210051266A KR20210051266A KR20220144662A KR 20220144662 A KR20220144662 A KR 20220144662A KR 1020210051266 A KR1020210051266 A KR 1020210051266A KR 20210051266 A KR20210051266 A KR 20210051266A KR 20220144662 A KR20220144662 A KR 20220144662A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- arugula
- extract
- retinal
- cells
- pharmaceutical composition
- Prior art date
Links
- 235000014755 Eruca sativa Nutrition 0.000 title claims abstract description 113
- 239000000284 extract Substances 0.000 title claims abstract description 108
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 title claims abstract description 23
- 206010064930 age-related macular degeneration Diseases 0.000 title claims abstract description 18
- 241001149093 Eruca vesicaria subsp. sativa Species 0.000 title claims abstract 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title abstract description 25
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 14
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims abstract description 11
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 235000000183 arugula Nutrition 0.000 claims description 111
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 16
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 14
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 claims description 12
- 230000036541 health Effects 0.000 claims description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 claims description 11
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 10
- 206010038848 Retinal detachment Diseases 0.000 claims description 6
- 230000006872 improvement Effects 0.000 claims description 6
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 claims description 4
- 206010012688 Diabetic retinal oedema Diseases 0.000 claims description 4
- 208000035719 Maculopathy Diseases 0.000 claims description 4
- 208000007014 Retinitis pigmentosa Diseases 0.000 claims description 4
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 claims description 4
- 201000011190 diabetic macular edema Diseases 0.000 claims description 4
- 230000004264 retinal detachment Effects 0.000 claims description 4
- 208000033379 Chorioretinopathy Diseases 0.000 claims description 3
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 claims description 3
- 206010046851 Uveitis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000208 Wet Macular Degeneration Diseases 0.000 claims description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 3
- 208000008515 Choroidal sclerosis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000036893 GUCY2D-related dominant retinopathy Diseases 0.000 claims description 2
- 208000032087 Hereditary Leber Optic Atrophy Diseases 0.000 claims description 2
- 201000003533 Leber congenital amaurosis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000002158 Proliferative Vitreoretinopathy Diseases 0.000 claims description 2
- 206010064145 Retinal aneurysm Diseases 0.000 claims description 2
- 201000007527 Retinal artery occlusion Diseases 0.000 claims description 2
- 206010038910 Retinitis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010038933 Retinopathy of prematurity Diseases 0.000 claims description 2
- 206010038934 Retinopathy proliferative Diseases 0.000 claims description 2
- 241000576755 Sclerotia Species 0.000 claims description 2
- 208000027073 Stargardt disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000002741 leukoplakia Diseases 0.000 claims description 2
- 230000004379 myopia Effects 0.000 claims description 2
- 208000001491 myopia Diseases 0.000 claims description 2
- 208000021971 neovascular inflammatory vitreoretinopathy Diseases 0.000 claims description 2
- 208000008798 osteoma Diseases 0.000 claims description 2
- 230000006785 proliferative vitreoretinopathy Effects 0.000 claims description 2
- 208000004644 retinal vein occlusion Diseases 0.000 claims description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 2
- 210000001325 yolk sac Anatomy 0.000 claims description 2
- 208000003569 Central serous chorioretinopathy Diseases 0.000 claims 1
- 208000002691 Choroiditis Diseases 0.000 claims 1
- 208000003971 Posterior uveitis Diseases 0.000 claims 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 claims 1
- 230000003325 follicular Effects 0.000 claims 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 7
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 5
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 abstract description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 abstract description 2
- 244000024675 Eruca sativa Species 0.000 description 99
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 68
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 38
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 23
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 20
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 18
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 14
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 14
- 108091008038 CHOP Proteins 0.000 description 13
- 102100029145 DNA damage-inducible transcript 3 protein Human genes 0.000 description 13
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 13
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 13
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 13
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 13
- 102000008165 X-Box Binding Protein 1 Human genes 0.000 description 12
- 108010035430 X-Box Binding Protein 1 Proteins 0.000 description 12
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 12
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 11
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 11
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 11
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 10
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 9
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 9
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 9
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 8
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- LNTHITQWFMADLM-UHFFFAOYSA-N gallic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 LNTHITQWFMADLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 7
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 7
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 7
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 7
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 6
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- -1 Opadry Polymers 0.000 description 6
- REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N Quercetin Chemical compound C=1C(O)=CC(O)=C(C(C=2O)=O)C=1OC=2C1=CC=C(O)C(O)=C1 REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 6
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 6
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 208000005590 Choroidal Neovascularization Diseases 0.000 description 5
- 206010060823 Choroidal neovascularisation Diseases 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 4
- 108010052419 NF-KappaB Inhibitor alpha Proteins 0.000 description 4
- 102100039337 NF-kappa-B inhibitor alpha Human genes 0.000 description 4
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 4
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000000469 ethanolic extract Substances 0.000 description 4
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 4
- 229940074391 gallic acid Drugs 0.000 description 4
- 235000004515 gallic acid Nutrition 0.000 description 4
- 238000007602 hot air drying Methods 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 4
- 229940032147 starch Drugs 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 3
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 3
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZVOLCUVKHLEPEV-UHFFFAOYSA-N Quercetagetin Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=C(O)C(O)=C(O)C=C2O1 ZVOLCUVKHLEPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- HWTZYBCRDDUBJY-UHFFFAOYSA-N Rhynchosin Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=CC(O)=C(O)C=C2O1 HWTZYBCRDDUBJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 210000003161 choroid Anatomy 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 3
- MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N kaempferol Natural products OC1=C(C(=O)c2cc(O)cc(O)c2O1)c3ccc(O)cc3 MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 229960001285 quercetin Drugs 0.000 description 3
- 235000005875 quercetin Nutrition 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 3
- 239000010421 standard material Substances 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 3
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 230000006711 vascular endothelial growth factor production Effects 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 2
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 101710151717 Stress-related protein Proteins 0.000 description 2
- HATRDXDCPOXQJX-UHFFFAOYSA-N Thapsigargin Natural products CCCCCCCC(=O)OC1C(OC(O)C(=C/C)C)C(=C2C3OC(=O)C(C)(O)C3(O)C(CC(C)(OC(=O)C)C12)OC(=O)CCC)C HATRDXDCPOXQJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000299461 Theobroma cacao Species 0.000 description 2
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 2
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 2
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 2
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 108091008695 photoreceptors Proteins 0.000 description 2
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 2
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 2
- IXFPJGBNCFXKPI-FSIHEZPISA-N thapsigargin Chemical compound CCCC(=O)O[C@H]1C[C@](C)(OC(C)=O)[C@H]2[C@H](OC(=O)CCCCCCC)[C@@H](OC(=O)C(\C)=C/C)C(C)=C2[C@@H]2OC(=O)[C@@](C)(O)[C@]21O IXFPJGBNCFXKPI-FSIHEZPISA-N 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 2
- 239000012130 whole-cell lysate Substances 0.000 description 2
- LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N (2s,3r)-2-[[(2r)-1-[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxybutanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCCCN LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N 0.000 description 1
- BNGXYYYYKUGPPF-UHFFFAOYSA-M (3-methylphenyl)methyl-triphenylphosphanium;chloride Chemical compound [Cl-].CC1=CC=CC(C[P+](C=2C=CC=CC=2)(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)=C1 BNGXYYYYKUGPPF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009020 BCA Protein Assay Kit Methods 0.000 description 1
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000219193 Brassicaceae Species 0.000 description 1
- 238000003650 Calcium Assay Kit Methods 0.000 description 1
- 102000003952 Caspase 3 Human genes 0.000 description 1
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 1
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 1
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 1
- PTHCMJGKKRQCBF-UHFFFAOYSA-N Cellulose, microcrystalline Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 PTHCMJGKKRQCBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000003556 Dry Eye Syndromes Diseases 0.000 description 1
- 206010013774 Dry eye Diseases 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102100030013 Endoribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 239000004386 Erythritol Substances 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 description 1
- OUVXYXNWSVIOSJ-UHFFFAOYSA-N Fluo-4 Chemical compound CC1=CC=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCCOC=2C(=CC=C(C=2)C2=C3C=C(F)C(=O)C=C3OC3=CC(O)=C(F)C=C32)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C1 OUVXYXNWSVIOSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 101001010783 Homo sapiens Endoribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 108010055717 JNK Mitogen-Activated Protein Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000019145 JUN kinase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 229940126560 MAPK inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 206010025421 Macule Diseases 0.000 description 1
- 102000009664 Microtubule-Associated Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010020004 Microtubule-Associated Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920000881 Modified starch Polymers 0.000 description 1
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 229940122907 Phosphatase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 1
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000582770 Salvelinus neiva Species 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 235000005764 Theobroma cacao ssp. cacao Nutrition 0.000 description 1
- 235000005767 Theobroma cacao ssp. sphaerocarpum Nutrition 0.000 description 1
- 238000010162 Tukey test Methods 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YKTSYUJCYHOUJP-UHFFFAOYSA-N [O--].[Al+3].[Al+3].[O-][Si]([O-])([O-])[O-] Chemical compound [O--].[Al+3].[Al+3].[O-][Si]([O-])([O-])[O-] YKTSYUJCYHOUJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 235000013334 alcoholic beverage Nutrition 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- CEGOLXSVJUTHNZ-UHFFFAOYSA-K aluminium tristearate Chemical compound [Al+3].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O CEGOLXSVJUTHNZ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940063655 aluminum stearate Drugs 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003579 anti-obesity Effects 0.000 description 1
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 1
- 230000000767 anti-ulcer Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 1
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 235000001046 cacaotero Nutrition 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- FUFJGUQYACFECW-UHFFFAOYSA-L calcium hydrogenphosphate Chemical compound [Ca+2].OP([O-])([O-])=O FUFJGUQYACFECW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000378 calcium silicate Substances 0.000 description 1
- 229910052918 calcium silicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012241 calcium silicate Nutrition 0.000 description 1
- CJZGTCYPCWQAJB-UHFFFAOYSA-L calcium stearate Chemical compound [Ca+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O CJZGTCYPCWQAJB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000013539 calcium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008116 calcium stearate Substances 0.000 description 1
- OYACROKNLOSFPA-UHFFFAOYSA-N calcium;dioxido(oxo)silane Chemical compound [Ca+2].[O-][Si]([O-])=O OYACROKNLOSFPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 239000004203 carnauba wax Substances 0.000 description 1
- 235000013869 carnauba wax Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000003570 cell viability assay Methods 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000019219 chocolate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229940075614 colloidal silicon dioxide Drugs 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 238000013211 curve analysis Methods 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 235000019700 dicalcium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 235000019414 erythritol Nutrition 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N erythritol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- 229940009714 erythritol Drugs 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 230000004438 eyesight Effects 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002443 hepatoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 108091008147 housekeeping proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 description 1
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 235000015243 ice cream Nutrition 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010832 independent-sample T-test Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 229960001375 lactose Drugs 0.000 description 1
- VMPHSYLJUKZBJJ-UHFFFAOYSA-N lauric acid triglyceride Natural products CCCCCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCCCCCC VMPHSYLJUKZBJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 1
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 208000018769 loss of vision Diseases 0.000 description 1
- 231100000864 loss of vision Toxicity 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 229960003511 macrogol Drugs 0.000 description 1
- 239000000845 maltitol Substances 0.000 description 1
- 235000010449 maltitol Nutrition 0.000 description 1
- VQHSOMBJVWLPSR-WUJBLJFYSA-N maltitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O VQHSOMBJVWLPSR-WUJBLJFYSA-N 0.000 description 1
- 229940035436 maltitol Drugs 0.000 description 1
- 229960001855 mannitol Drugs 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 239000012457 nonaqueous media Substances 0.000 description 1
- 235000012149 noodles Nutrition 0.000 description 1
- 239000002417 nutraceutical Substances 0.000 description 1
- 235000021436 nutraceutical agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003565 oculomotor Effects 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 235000019449 other food additives Nutrition 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 150000008442 polyphenolic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940069328 povidone Drugs 0.000 description 1
- 235000019814 powdered cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920003124 powdered cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 230000004243 retinal function Effects 0.000 description 1
- 210000000844 retinal pigment epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 210000000513 rotator cuff Anatomy 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 235000013580 sausages Nutrition 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 108091006024 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034285 signal transducing proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000008591 skin barrier function Effects 0.000 description 1
- 235000011888 snacks Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229920003109 sodium starch glycolate Polymers 0.000 description 1
- 229940079832 sodium starch glycolate Drugs 0.000 description 1
- 239000008109 sodium starch glycolate Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 235000014347 soups Nutrition 0.000 description 1
- 238000001256 steam distillation Methods 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 235000013616 tea Nutrition 0.000 description 1
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
- 238000002137 ultrasound extraction Methods 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- ZQFGRJWRSLZCSQ-ZSFNYQMMSA-N verteporfin Chemical compound C=1C([C@@]2([C@H](C(=O)OC)C(=CC=C22)C(=O)OC)C)=NC2=CC(C(=C2C=C)C)=NC2=CC(C(=C2CCC(O)=O)C)=NC2=CC2=NC=1C(C)=C2CCC(=O)OC ZQFGRJWRSLZCSQ-ZSFNYQMMSA-N 0.000 description 1
- 229960003895 verteporfin Drugs 0.000 description 1
- 230000007998 vessel formation Effects 0.000 description 1
- 230000004382 visual function Effects 0.000 description 1
- 230000004393 visual impairment Effects 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000003809 water extraction Methods 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/31—Brassicaceae or Cruciferae (Mustard family), e.g. broccoli, cabbage or kohlrabi
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2200/00—Function of food ingredients
- A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2300/00—Processes
- A23V2300/10—Drying, dehydrating
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Botany (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Alternative & Traditional Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
Abstract
본 발명은 루꼴라 추출물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물, 식품 조성물에 관한 것으로서 세포독성이 없으면서도 항염증, 소포체 스트레스 억제, VEGF 억제 효과가 탁월하여 AMD 예방, 치료, 개선용 약학적 조성물, 식품 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 루꼴라 추출물을 함유하는 약학적 조성물, 식품 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 루꼴라 추출물을 함유하여 망막 세포의 항염증, 소포체 스트레스 억제 및 VEGF 억제 효과가 우수한 노인성 황반 변성 예방, 개선 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
노인성 황반 변성(age-related macular degeneration, AMD) 환자는 2019년에 약 20만 명으로 조사되어 2014년을 기준으로 매년 약 20% 증가하는 추세이다(Health Insurance Review & Assessment Service, 2020). 황반변성은 크게 망막의 광수용체와 세포들이 죽는 건성과 황반 아래 맥락막에서 새 혈관이 자라는 습성으로 나뉜다. 습식 노인성 황반변성은 비정상적으로 생성된 맥락막신생혈관(Choroidal Neovascularization, CNV)이 특징이며(Ambati 등, 2012) 생성된 혈관에서의 출혈 및 부종으로 인한 시력의 손실 및 망막의 기능손실을 유발하여 망막 박리(Retinal detachment)를 유발할 수 있다(Do 등, 2020).
ARPE-19 세포는 사람 눈의 맥락막과 광수용체 사이에 있는 시각기능을 위한 세포층을 나타내는 망막 상피세포로 AMD, 당뇨망막병증(diabetic retinopathy) 등의 안구질환에 관여하기 때문에 안구질환 연구에서 주요한 망막 세포주로 사용된다(Boulton 등, 2001).
소포체 스트레스는 ARPE-19 세포의 손상 및 VEGF(vascular endothelial growth factor)를 과발현하여 CNV 형성에 기여한다(Chen 등, 2014; Salminen 등, 2010). VEGF는 혈관 형성을 자극하는 세포에서 생성되는 신호 단백질로 혈관의 새로운 형성과 관련된 중요한 단백질이며 ARPE-19 세포에서의 VEGF의 과발현은 망막 상피세포의 CNV 형성에 중요한 역할을 하여 AMD의 주요 원인이다(Jager 등, 2008; Lopez 등, 1996; Datta 등, 2017). 또한, 안구에서 염증은 안구 건조증(dry eyes)이나 포도막염(uveitis)과 당뇨망막병증(diabetic retinopathy)을 유발하는 원인으로 작용한다(Hong 등, 2020; Qin 등, 2014). 안구염증에 의하여 발병된 망막병증은 CNV 형성에 관여할 수 있으며 ARPE-19 세포에서의 염증관련 사이토카인의 발현이 CNV 형성을 증가켜 염증은 AMD 발병의 원인으로 제시되었다(Izumi 등, 2007). 즉, ARPE-19 세포에서 염증과 소포체 스트레스의 억제 및 VEGF의 억제는 AMD 발병 억제의 가능성을 의미한다.
AMD의 치료를 위해 주로 사용하는 방법은 베르테포핀(Verteporfin)으로 명명되는 물질을 사용하여 AMD에 의하여 생성된 신생 혈관을 특정적으로 염색하여 제거하는 것이다. 베르테포핀을 사용한 치료법은 비교적 안전하지만 병태의 원인을 제거하는 치료가 아니기 때문에 치료를 반복해야 하는 단점이 있으며(Bressler 등, 2001) 자각 증상이 거의 없어 약물의 처방이 어렵다(Sin 등, 2013). 또한, AMD 발병자는 지속해서 증가하고 있으며 자각 증상이 늦게 나타나 조기 치료가 힘들어 의학적 치료의 한계를 보이며, 치료 후에도 재발 가능성이 높다. 따라서, 망막 병태의 진행을 예방하거나 지연시키는 것은 AMD 예방, 치료에 합리적인 전략이 될 수 있으며 의학적 치료의 대안으로 비의료적 치료법인 기능성 식품 섭취를 통한 AMD의 예방이 될 수 있다. 또한, 천연물에서 추출한 기능성 식품은 일반적으로 부작용이 적은 것으로 보고되어(Granato 등, 2020) 장기간 섭취에 대한 안전성을 기대할 수 있다.
한편, 루꼴라는 십자화과(Brassicaceae)에 속하는 식물로 항비만 및 혈당 저하 효과(Piragine 등, 2020), 항산화 효과(Son 등, 2020; Taviano 등, 2017; Heimler 등, 2007), 항혈전 형성(Fuentes 등, 2014), 항균 활성과 피부장벽 개선 효과(Kim 등, 2014), 간 보호 효과(Alqasoumi, 2010) 및 위 병변에 대한 항궤양 활성(Alqasoumi 등, 2009) 등의 다양한 생리활성이 보고된 바 있다. 하지만 루꼴라의 망막 질환의 예방, 치료 효과에 대해서는 아직 알려진 바 없다.
이에 본 발명자들은 안전성이 입증된 천연물 소재인 루꼴라로부터 루꼴라 추출물의 망막 세포에 대한 항염증, 소포체 스트레스 억제 및 VEGF 억제 효과를 확인하여 AMD 예방, 개선 및 치료 용도로 사용될 수 있음을 확인하였다. 또한, 루꼴라 열수 추출물에 비해 루꼴라 에탄올 추출물은 다양한 농도에서 우수한 항염증, 소포체 스트레스 억제 및 VEGF 억제 효과를 나타내었고, 루꼴라 동결 건조물에 비해 열풍 건조물에 대한 에탄올 추출물에서 더욱 뛰어난 망막 세포의 항염증, 소포체 스트레스 억제 및 VEGF 억제 효과를 확인하여, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 루꼴라 추출물을 유효성분으로 포함하는 망막 질환의 예방, 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 루꼴라 추출물을 유효성분으로 함유하는 망막 질환의 예방, 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제들은 이상에서 언급된 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 유효성분으로 루꼴라 추출물을 함유하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 "추출"은 당업계에 공지된 추출, 분리 및 분획하는 방법을 사용하여 천연으로부터 추출, 분리 및 분획하여 수득한 것을 사용할 수 있다. 본 발명에서 정의된 "추출물"은 적적한 용매를 이용하여 루꼴라로부터 추출 처리에 의해 얻어지는 것이며, 예를 들어 루꼴라 줄기, 잎, 뿌리 또는 이들의 혼합의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 루꼴라 추출물은 다양한 추출 용매와 추출 방법에 따라 추출될 수 있으며, 루꼴라로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 예를 들어, 상기 용매로는 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 등의 C1-C4 알코올 또는 이의 혼합용매를 사용할 수 있다. 본 발명의 추출물의 추출 용매로 에탄올, 50 내지 90% (v/v) 에탄올 또는 80% (v/v) 에탄올을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 에탄올을 사용하여 루꼴라 추출물을 제조하는 경우 루꼴라 추출물 내 지용성 및 수용성 활성성분이 모두 충분히 녹아들 수 있고, 이에 최적 효과를 나타내는 추출물을 제조할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 루꼴라 추출물은 탄소수 1 내지 4의 알코올로 추출된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 루꼴라 추출물은 70 내지 90% (v/v) 에탄올을 추출용매로 하여 추출된 것을 특징으로 한다.
상기 추출 온도는 상온인 것이 바람직하며, 이에 제한되지 않는다. 또한 추출방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법이 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 루꼴라 추출물은 루꼴라를 동결 건조, 열풍 건조 또는 이들의 조합으로 건조시킨 후 추출하는 것이다. 구체적으로, 루꼴라를 동결 건조시킨 후 추출한 루꼴라 동결건조 추출물, 루꼴라를 열풍 건조시킨 후 추출한 루꼴라 열풍건조 추출물일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 건조 방법에 따른 루꼴라 추출물의 LPS에 의해 염증이 유도된 망막 세포주에서 염증관련 사이토카인(TNFα, IL-1β)의 생성에 미치는 영향을 실험한 결과 모든 루꼴라 추출물에서 대조군과 비교하여 발현이 감소함을 확인하였다. 동결건조 루꼴라 추출물은 TNFα, IL-1β를 높은 비율로 감소시켰으며, 열풍건조 루꼴라 추출물은 TNFα 발현을 감소시켰다.
본 발명의 일 실시예에서는 건조 방법에 따른 루꼴라 추출물의 LPS에 의해 염증이 유도된 망막 세포주에서 염증관련 단백질(p-NF-κB, p-IκBα) 인산화에 미치는 영향을 실험한 결과, 동결건조 루꼴라 추출물은 NF-κB의 인산화를, 열풍건조 루꼴라 추출물은 NF-κB와 IκBα의 인산화를 억제시켰다.
본 발명의 일 실시예에서는 건조 방법에 따른 루꼴라 추출물의 LPS에 의해 염증이 유도된 망막 세포주에서 염증 경로를 유발하는 MAPK 단백질(p-JNK) 발현에 미치는 영향을 실험한 결과, 열풍건조 루꼴라 추출물은 p-JNK의 발현을 감소시켰다.
본 발명의 실시예에서는 건조 방법에 따른 루꼴라 추출물의 타프시가진에 의해 소포체 스트레스가 유도된 망막 세포주에 대한 항소포체 스트레스 효과를 확인하기 위해 소포체 스트레스 단백질(CHOP, XBP-1) 발현에 미치는 영향을 실험한 결과 열풍건조 루꼴라 추출물은 CHOP, XBP-1 발현을 감소시켰다.
본 발명의 일 실시예에서는 건조 방법에 따른 루꼴라 추출물의 타프시가진에 의해 소포체 스트레스가 유도된 망막 세포주의 세포사멸을 확인하기 위한 cleaved-caspase 9, cleaved-caspase 3 단백질 발현에 미치는 영향을 실험한 결과, 열풍건조 루꼴라 에탄올 추출물은 cleaved-caspase 9, cleaved-caspase 3 발현을 감소시켰다.
본 발명의 일 실시예에서는 루꼴라 추출물이 타프시가진에 의해 소포체 스트레스가 유도된 망막 세포주에서 VEGF 생산 및 칼슘 수준에 미치는 영향을 실험한 결과, 루꼴라 추출물은 VEGF 억제 및 세포질 내 칼슘 수준을 감소시켰다.
루꼴라 추출물을 얻은 이후에는 당업계에서 알려진 통상의 방법으로 상온에서 냉침, 가열 및 여과하여 액상물을 얻을 수 있으며, 또는 추가로 용매를 증발, 분무건조 또는 동결건조할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제조한 루꼴라 추출물은 추가적으로 증류한 후 분획하여 얻을 수 있으며, 구체적으로는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획으로도 얻을 수 있으며, 바람직하게는 박층크로마토그래피를 이용하여 분획할 수 있으나 이에 본 발명이 제한되는 것은 아니고, 적절한 용매를 이용하여 추가 분획물을 얻을 수 있는 방법이라면 어느 것이든지 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 분획물을 얻기 위해 사용하는 용매는 클로로포름, 에틸 아세트산, 부탄올 및 물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있으며, 클로로포름, 에틸 아세트산, 부탄올을 사용할 수 있으며, 에틸 아세트산을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 루꼴라 추출물은 건조시킨 루꼴라를 에탄올을 첨가한 후 60 ~ 80℃에서 2 ~ 4 시간 환류 냉각한 후 여과하여 감압 농축하는 것을 포함하는 방법에 의하여 제조된다.
본 발명에 따른 치료용 약학적 조성물은 루꼴라 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 망막 질환의 예방, 치료용 식의약학적 조성물이다.
본 발명의 실시예에서 LPS가 유도하는 ARPE-19 세포의 염증 반응에서 염증관련 사이토카인(TNFα, IL-1β)의 mRNA 발현 수준 및 염증관련 단백질(NF-κB와 IκBα, JNK)의 인산화와 타프시가진이 유도하는 ARPE-19 세포의 소포체 스트레스 단백질(CHOP, XBP-1, cleaved-caspase 9, cleaved-caspase 3), VEGF 및 세포질 내 칼슘 수준을 분석하여, 루꼴라 추출물은 항염증, 소포체 스트레스, VEGF를 억제, 세포질 내 칼슘 수준을 감소시킴을 확인하여 이와 관련된 망막 질환의 예방, 치료에 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 망막 질환은 노인성 황반 변성, 습식 노인성 황반 변성, 당뇨병 황반 부종, 당뇨병 망막증(당뇨병 황반 부종 제외), 포도막염, 중심성 삼출성 맥락망막증, 망막색소선조증, 망막 색소 상피 박리, 다발성 맥락막염, 신생혈관 황반증(고도 근시, 경사 유두 증후군 또는 맥락막 골종을 원인으로 하는 사례에 한함), 미숙아 망막증, 망막 색소변성증, 레베르병(Leber's disease), 망막 동맥 폐색증, 망막 정맥 폐색증, 중심성 장액성 맥락망막증, 망막 동맥류, 망막 박리, 증식성 유리체망막증, 스타가르트병(Stargardt's disease), 맥락막 경화증, 전맥락막위축증, 난황상 황반 이영양증, 오구치병, 안저백점증, 백점상 망막염 및 뇌회전형망맥락막위축증으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상이다.
상기에 언급한 바와 같이 본 발명을 의약으로 사용하는 경우 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바납, 합성규산 알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 조성물은 실제 임상 투여시에 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있으며, 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 이용하는 것이 바람직하다. 상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등이 있다.
상기 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 또한, 상기 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
상기 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 상기 비경구투여는 피부 외용 또는 복강 내 주사, 직장 내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 주입방식을 사용하여 이루어질 수 있다.
상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명에 있어서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 의하면 상기 약학적 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 망막 질환의 예방 및 치료방법을 제공한다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 루꼴라 추출물을 유효성분으로 포함하는, 망막 질환의 예방, 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 루꼴라 추출물은 C1-C4 알코올로 추출된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 루꼴라 추출물은 50 내지 90%(v/v) 에탄올을 추출용매로 하여 추출된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 루꼴라 추출물은 루꼴라를 동결 건조 또는 열풍 건조한 것을 추출하는 것이다.
본 발명에 따른 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강기능식품은 유효성분인 본 발명에 따른 루꼴라 추출물 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합 양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 초코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.
상술한 본 발명의 조성물에 대한 설명은 중복된 내용의 기재에 의한 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
본 발명에 의한 루꼴라 추출물을 함유하는 약학적 조성물 및 식품 조성물은 세포독성이 없으면서도 항염증 효과, 소포체 스트레스 및 VEGF 억제 효과가 탁월하여 노인성 황반변성 예방, 개선 및 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 루꼴라 추출물(ESE) 및 LPS가 세포 생존력에 미치는 영향을 MTT 분석을 통해 실험한 결과이다. (A) 세포를 루꼴라 추출물 (25 ~ 1,000 μg/mL)로 3 시간 동안 전처리하고 LPS가 없는 상태에서 24 시간 동안 배양한 결과. (B) 세포를 LPS (0.25 ~ 4 μg/mL)로 처리하고 24 시간 동안 배양한 결과. (C) 세포를 루꼴라 추출물(100 ~ 1,000 μg/mL)로 3 시간 동안 전처리하고 LPS가 있는 상태에서 24 시간 동안 배양한 결과 (유의성 수준은 LPS 0 μg/mL 대비 ***P<0.001, 각 값은 평균 ± SD, n = 3)
도 2는 루꼴라 추출물(ESE) 및 타프시가진(thapsigargin)이 세포 생존력에 미치는 효과를 MTT 분석을 통해 실험한 결과이다. (A) 세포를 타프시가진(0.5 ~ 10 μM)으로 처리하고 24 시간 동안 배양한 결과. (B) 세포를 루꼴라 추출물(100 ~ 1,000 μg/mL)로 3 시간 동안 전처리한 후 타프시가진 존재하에 24 시간 동안 배양한 결과 (유의성 수준은 P < 0.05, 각 값은 평균± SD, n = 3)
도 3은 루꼴라 추출물(ESE)이 LPS 유도 ARPE-19 세포에서 TNFα, IL-1β 발현에 미치는 영향을 정량적 실시간 PCR 분석으로 실험한 결과이다. (A),(B)는 열풍 건조 루꼴라 추출물(ESH) (A) 및 동결 건조 루꼴라 추출물(ESF) (B)에서 TNFα의 상대적 mRNA 수준을 나타낸 결과. (C), (D)는 열풍 건조 루꼴라 추출물(ESH) (C) 및 동결 건조 루꼴라 추출물(ESF) (D)에서 IL-1β의 상대적 mRNA 수준을 나타낸 결과. (GAPDH는 내부 표준으로 사용, 유의성 수준 P < 0.05, 각 값은 평균± SD, n = 3).
도 4는 루꼴라 추출물(ESE)이 LPS에 의해 염증이 유도된 ARPE-19 세포에서 p-NF-κB, p-IκBα 및 p-JNK 발현에 미치는 영향을 실험한 결과이다. (A), (B)는 p-NF-κB, (C), (D)는 p-IκBα, (E), (F)는 p-JNK의 수준을 각 대조군의 값에 따라 추정한 결과. 표시된 평균은 LPS 존재 또는 부재 그룹간에 차이가 있었다(유의성 수준 각 *P<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001, 각 값은 평균± SD, n = 3).
도 5는 루꼴라 추출물이(ESE) 타프시가진에 의해 소포체 스트레스가 유도된 ARPE-19 세포에서 CHOP, XBP-1, cleaved-caspase 9 및 cleaved-caspase 3 발현에 미치는 영향을 실험한 결과이다. (A), (B)는 CHOP, (C), (D)는 XBP-1, (E), (F)는 cleaved-caspase 9, (G), (H)는 cleaved-caspase 3의 수준을 측정한 결과. 타프시가진의 유무에 따라 유의하게 차이가 있었다 (유의성 수준 각 P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001, 각 값은 평균 ± SD, n = 3).
도 6은 루꼴라 추출물(ESE)이 타프시가진에 의해 소포체 스트레스가 유도된 ARPE-19 세포에서 VEGF 생산 및 세포 내 칼슘 수준에 미치는 영향을 실험한 결과이다. (A)는 루꼴라 추출물 및 타프시가진 처리 후 상층액을 수집하여 VEGF 생산을 측정한 결과. (B)는 세포 내 칼슘 수준을 측정한 결과.(유의성 수준 각 P <0.05, 각 값은 평균 ± SD, n = 3).
도 2는 루꼴라 추출물(ESE) 및 타프시가진(thapsigargin)이 세포 생존력에 미치는 효과를 MTT 분석을 통해 실험한 결과이다. (A) 세포를 타프시가진(0.5 ~ 10 μM)으로 처리하고 24 시간 동안 배양한 결과. (B) 세포를 루꼴라 추출물(100 ~ 1,000 μg/mL)로 3 시간 동안 전처리한 후 타프시가진 존재하에 24 시간 동안 배양한 결과 (유의성 수준은 P < 0.05, 각 값은 평균± SD, n = 3)
도 3은 루꼴라 추출물(ESE)이 LPS 유도 ARPE-19 세포에서 TNFα, IL-1β 발현에 미치는 영향을 정량적 실시간 PCR 분석으로 실험한 결과이다. (A),(B)는 열풍 건조 루꼴라 추출물(ESH) (A) 및 동결 건조 루꼴라 추출물(ESF) (B)에서 TNFα의 상대적 mRNA 수준을 나타낸 결과. (C), (D)는 열풍 건조 루꼴라 추출물(ESH) (C) 및 동결 건조 루꼴라 추출물(ESF) (D)에서 IL-1β의 상대적 mRNA 수준을 나타낸 결과. (GAPDH는 내부 표준으로 사용, 유의성 수준 P < 0.05, 각 값은 평균± SD, n = 3).
도 4는 루꼴라 추출물(ESE)이 LPS에 의해 염증이 유도된 ARPE-19 세포에서 p-NF-κB, p-IκBα 및 p-JNK 발현에 미치는 영향을 실험한 결과이다. (A), (B)는 p-NF-κB, (C), (D)는 p-IκBα, (E), (F)는 p-JNK의 수준을 각 대조군의 값에 따라 추정한 결과. 표시된 평균은 LPS 존재 또는 부재 그룹간에 차이가 있었다(유의성 수준 각 *P<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001, 각 값은 평균± SD, n = 3).
도 5는 루꼴라 추출물이(ESE) 타프시가진에 의해 소포체 스트레스가 유도된 ARPE-19 세포에서 CHOP, XBP-1, cleaved-caspase 9 및 cleaved-caspase 3 발현에 미치는 영향을 실험한 결과이다. (A), (B)는 CHOP, (C), (D)는 XBP-1, (E), (F)는 cleaved-caspase 9, (G), (H)는 cleaved-caspase 3의 수준을 측정한 결과. 타프시가진의 유무에 따라 유의하게 차이가 있었다 (유의성 수준 각 P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001, 각 값은 평균 ± SD, n = 3).
도 6은 루꼴라 추출물(ESE)이 타프시가진에 의해 소포체 스트레스가 유도된 ARPE-19 세포에서 VEGF 생산 및 세포 내 칼슘 수준에 미치는 영향을 실험한 결과이다. (A)는 루꼴라 추출물 및 타프시가진 처리 후 상층액을 수집하여 VEGF 생산을 측정한 결과. (B)는 세포 내 칼슘 수준을 측정한 결과.(유의성 수준 각 P <0.05, 각 값은 평균 ± SD, n = 3).
이하, 본 발명을 제조예, 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 제조예, 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 제조예, 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 루꼴라 추출물의 제조
루꼴라는 2018년 5월 그림팜(Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 루꼴라의 이물질 제거를 위해 흐르는 물에 세척하였고 열풍 건조 및 동결 건조로 시료를 건조하였다.
시료의 동결 건조는 -70 ℃ 딥 프리저(MDF-U52 V, Sanyo, Osaka, Japan)에서 냉동시켜 동결 건조기(ED 8512, Ilshin, Yangju, Korea)에서 72 시간 동안 건조시켰다. 시료의 열풍 건조는 열풍 건조기(HJ120, Hanil, Jangseong, Korea)를 이용하여 60 ℃에서 40 시간 건조시켰다. 열풍건조 및 동결건조된 시료는 분쇄기(SMX-M41KP, Shinil, Cheonan, Korea)를 사용하여 80 mesh로 분쇄하여 -70 ℃에 보관하여 사용하였다.
루꼴라 추출물은 열풍 건조 및 동결 건조 분말 각 100 g에 80 % 에탄올 1.5 L를 첨가한 후 65 ℃에서 3시간 환류 냉각을 3회 반복하였다. 추출물은 여과지(Whatman No.2, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)로 여과하여 로터리 진공 증발기(N-1110S-W, EYELA, Tokyo, Japan)로 감압농축한 후 동결건조 처리하였다. 건조된 추출물은 -70 ℃에 냉동 보관하여 사용하였다.
실시예 2 : ARPE-19 (retinal pigment epithelial cell line) 세포 배양
ARPE-19 세포는 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)에서 구입하여 사용하였다. ARPE-19 세포는 10 % FBS(fetal bovine serum; Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)과 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신이 혼합된 항생제(Thermo Scientific Inc., MA, USA)를 첨가한 DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12; Gibco)를 사용하여 37 ℃, 5 % CO₂의 인큐베이터(VS-2180CW, Vision Scientific Co. LTD., Daejeon, Korea)에서 배양하였다.
세포 생존율을 측정하기 위해 96-well plate에 ARPE-19 세포를 2.0 x 104 cell/well 농도로 분주 후 24 시간 동안 37 ℃, 5 % CO₂의 인큐베이터에서 배양하였다. qRT-PCR 및 웨스턴 블롯 실험에서는 6-well plate에 5.0 x 105 cell/well 농도로 분주 후 37 ℃, 5 % CO₂의 인큐베이터에서 48 시간 동안 배양하였다.
실시예 3 : ARPE-19 세포 생존력 분석
루꼴라 추출물, LPS(lipopolysaccharides) 및 타프시가진(thapsigargin)이 ARPE-19 세포 생존율에 미치는 영향은 MTT 분석(Mosmann, 1983)을 통하여 측정하였다. 96-well plate에 ARPE-19 세포를 배양한 후 1 % FBS 조건 하에 루꼴라 추출물, LPS, 타프시가진, LPS + 루꼴라 추출물, 타프시가진 + 루꼴라 추출물을 처리하여 37 ℃, 5 % CO₂조건으로 24 시간 동안 배양하였다.
LPS 및 타프시가진의 각 농도에서 ARPE-19 세포의 세포 생존율을 확인할 때는 루꼴라 추출물 대신 1 % FBS 배지를 사용하였으며 루꼴라 추출물의 세포 생존율을 확인할 때는 LPS 및 타프시가진 대신 1 % FBS 배지를 사용하였다. 루꼴라 추출물(ESE)의 경우 동결 건조물 추출물(ESF) 과 열풍 건조물 추출물(ESH)에 대한 실험을 구분하여 진행하였다.
MTT(3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium Bromide; Biosesang, Seoul, Korea)는 5.5 mg/mL(in 1 x PBS)로 20 μL를 처리하여 4 시간 동안 배양하고 웰의 배지를 모두 제거한 후 DMSO를 100 μL 넣어 포르마잔(formazan)을 용해하여 1 시간 상온에서 반응을 기다린 후 540 nm 흡광도에서 측정하였으며 아래와 같이 계산하였다.
세포 생존률 (%) = (시료 흡광도 / 대조군 흡광도) x 100
실험 결과, ARPE-19 세포에서 루꼴라 열풍 건조 추출물(ESH) 및 루꼴라 동결 건조 추출물(ESF) 처리군 모두 25 ~ 1,000 μg/mL 농도에서 유의적인 차이가 없었다(도 1 A).
ARPE-19 세포에서 LPS(from Escherichia coli O55:B5, Sigma)의 처리 시 LPS 농도 2 μg/mL까지 유의적인 차이를 보이지 않았으며, 4 μg/mL에서 12.58% 감소하였다(도 1 B).
LPS 1 μg/mL가 처리된 ARPE-19 세포에서 루꼴라 추출물(ESE)을 처리한 세포 생존율은 LPS 1 μg/mL 처리한 대조군과 LPS 1 μg/mL 및 ESE를 각 100, 250, 500, 1,000 μg/mL 처리하였을 때의 실험군 간 세포 생존율에 유의적인 차이가 없었다(도 1 C).
ARPE-19 세포에서 타프시가진의 처리 시 타프시가진은 0.5, 1, 2.5, 5, 10 μM 농도로 24 시간 동안 처리하였을 때 각 100, 91.67, 84.17, 64.27, 49.31, 18.70 %의 세포 생존율이 나타나 농도 의존적인 감소를 확인할 수 있었고 5 μM 농도에서 49.31%로 반수 치사량에 가까운 세포사멸률을 확인하였다(도 2 A).
타프시가진 5 μM가 처리된 ARPE-19 세포에서 루꼴라 추출물(ESE)의 세포 생존율은 타프시가진 5 μM이 처리된 대조군은 무 처리 세포에 비하여 세포 생존율이 49.16% 감소하였고 타프시가진 5 μM 및 ESE를 각 100, 250, 500, 1,000 μg/mL 처리하였을 때 세포 생존율의 추가적인 감소는 없었다(도 2 B).
루꼴라 추출물은 모든 처리 농도에서 세포 생존률에 영향을 미치지 않음을 확인하였다.
실시예 4: 페놀 및 플라보노이드 함량 측정
루꼴라 동결 건조 추출물, 루꼴라 열풍 건조 추출물의 페놀 및 플라보노이드 함량을 측정하였다. 페놀 함량은 Gutfinger 방법(Gutfinger T., Journal of the American Oil Chemists Society, Vol. 58, No.11, 1981)을 응용하여 측정하였다. 추출 시료용액 1㎖에 50% Foiln-Ciocalteu's phenol 시약 0.5 ㎖를 가하여 실온에서 3분간 반응시켰다. 반응용액에 Na2CO3 포화용액 1 ㎖와 7.5 ㎖ 증류수를 차례로 혼합하여 30 분간 방치시킨 뒤, 12,000 rpm에서 10 분간 원심분리한 후 상청액을 취해 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 갈릭산(gallic acid)을 표준물질로 이용하여 작성한 검량선에 따라 함량을 구하였으며 측정단위로는 GAE(Gallic acid equivalent)/g을 사용하였다
각각의 추출물에 존재하는 총 페놀 함량은 3회에 거쳐 실험한 후 나온 값의 평균값과 표준 편차값을 계산하였고 갈릭산 표준용액의 표준검정곡선을 통해 추출물 및 용매 분획물의 중량 1g당 함유하고 있는 갈릭산의 양(GAE; gallic acid equivalent)으로 환산하여 측정하였다. 갈릭산을 표준물질로 하여 측정한 결과, 하기 표 1에 나타냈다.
플라보노이드 함량은 Nieva Moreno 방법(김미혜, 남부대학교 박사학위논문, 2012)을 응용하여 측정하였다. 각 샘플 0.1 ㎖와 80 % 에탄올 0.9 ㎖을 혼합한 혼합물 0.5 ㎖에 10 % 질산 알루미늄과 1M 아세트산 칼륨 0.1 ㎖ 그리고 80% 에탄올 4.3㎖을 가하여 실온에 40 분 방치한 뒤 415 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 케르세틴(quercetin)을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다.
각각의 추출물에 존재하는 총 플라보노이드 함량은 3회에 거쳐 실험한 후 나온 값의 평균값과 표준 편차값을 계산하였고 케르세틴 표준용액의 표준검정곡선을 통해 추출물 및 용매 분획물의 중량 1g당 함유하고 있는 케르세틴의 양(QE; quercetin equivalent)으로 환산하여 측정되었다. 케르세틴을 표준물질로 하여 측정한 결과를 표 1에 나타냈다.
| 총 페놀 함량(GAE mg/g) | 총 플라보노이드 함량(QE mg/g) | |
| 루꼴라 동결 건조 추출물(ESF) | 163.43 ± 1.75 | 317.88 ± 5.40 |
| 루꼴라 열풍 건조 추출물(ESH) | 150.52 ± 2.00 | 301.99 ± 6.14 |
루꼴라 동결 건조 추출물은 페놀 163.43±1.75 GAE mg/g을, 루꼴라 열풍 건조 추출물은 페놀 150.52 ± 2.00 mg/g을 함유하며, 루꼴라 동결 건조 추출물은 플라보노이드 317.88 ± 5.40 QE mg/g를, 루꼴라 열풍 건조 추출물은 플라보노이드 301.99 ± 6.14 QE mg/g를 함유함을 확인하였다.
실시예 5: 총 RNA 분리 및 실시간 중합효소 연쇄 반응(PCR)
루꼴라 추출물이 LPS에 의해 염증이 유도된 ARPE-19 세포에서 염증관련 사이토카인(TNFα, IL-1β) 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해 총 RNA 분리 및 실시간 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 수행하였다.
ARPE-19 세포에 루꼴라 추출물 0.1 ~ 100 mg/mL 처리하여 최종농도 1 ~ 1000μg/mL이 되도록 한 후 3 시간 동안 배양하였다(이 때, 대조군과 LPS군은 루꼴라 추출물의 용매인 DMSO를 넣어준다). 이후 염증을 유도하는 LPS 500 μg/mL를 3 μL 넣어 최종농도 1 μg/mL가 되도록 하여 2 시간 동안 배양하였다.
위와 같이 처리된 ARPE-19 세포는 NucleoZOL(Macherey-Nagel, Duren, Germany)을 사용하여 제조업체 지침에 따라 총 RNA를 추출하고 DNA-free™ Kit(Thermo Fisher)를 제조업체 지침에 따라 처리하였다. 추출한 RNA는 SpectraDrop™ Micro-Volume Microplate(SpectraMax iD3, Molecular Devices, San Jose, CA, USA)를 사용하여 정량하였다. 그리고 iScript™ cDNA Synthesis Kit(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) 지침에 따라 RNA 1 ug을 cDNA로 역전사시켰다. cDNA 합성은 T100 Thermal Cycler(Bio-Rad)를 사용하여 Priming(25℃ 5분), Reverse transcription(46℃, 20분), RT inactivation(95℃, 1분) 단계로 진행하였다.
qRT-PCR은 CFX Connect Real-Time PCR Detection System(BIo-Rad)을 사용하여 수행하였고 사용한 프라이머는 표 2와 같다.
| Gene | Abbreviation | Custom Primer | Sequence (5'→ 3') |
| Interleukin 1 beta | IL-1β | Foward | CTC GCC AGT GAA ATG ATG GCT |
| Reverse | GTC GGA GAT TCG TAG CTG GAT | ||
| Tumor necrosis factor alpha | TNFα | Foward | GGC AGT CAG ATC ATC TTC TCG |
| Reverse | GGT TTG CTA CAA CAT GGG CTA | ||
| Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase |
GAPDH | Foward | GGC CTC CAA GGA GTA AGA CC |
| Reverse | AGG GGA GAT TCA GTG TGG TG |
Multiplate™ 96-Well PCR Plates(Bio-Rad)의 각 웰에 cDNA 2 μL, 10 μM forward primer 1 μL, 10 μM reverse primer 1 μL, Nuclease-free water 5 μL, SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix(Bio-Rad) 11 μL로 총 부피 20 μL를 넣었고 Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film(Bio-Rad)을 덮어 반응시켰다. Thermal cycling은 polymerase activation, DNA Denaturation(95℃ 30초)가 선행되었고 Denaturation(95℃,10초)와 Annealing/Extension and Plate Read(55℃, 30초)가 49회 반복 진행되어 Melt Curve Analysis(65℃, 5초; 95℃, 5초)로 마무리되었다. 정량화는 Bio-Rad CFX Maestro로 진행하였다. House keeping gene인 GAPDH를 내부 대조군으로 사용하였으며 상대적 mRNA 수준(fold change)은 아래의 식과 같이 계산하여 표기하였다.
Fold change = 2ESE 값 (Primer qv - GPADH qv) - 대조군 값 (Primer qv - GPADH qv) (qv : quantification value)
LPS로 유도된 ARPE-19 세포에서의 염증관련 사이토카인(TNFα, IL-1β)의 mRNA 발현 정도(fold change)는 도 3에 나타냈다. ESH와 ESF를 전처리한 ARPE-19 세포에서 LPS로 유도된 TNFα의 mRNA 발현은 LPS에 의해 유의적으로 증가하였으며 ESH의 500, 1,000 μg/mL 농도에서 20.15, 25.59% 감소하였고 ESF의 100, 500, 1,000 μg/mL 농도에서 40.76, 45.69, 51.19% 감소하였다(도 3 A, B). IL-1β의 mRNA 발현 정도는 LPS에 의하여 유의적으로 증가하였고 ESH의 100, 500, 1,000 μg/mL 농도에서는 감소하지 않았으나 ESF는 100, 500, 1,000μg/mL 농도에서 각각 98.70%, 75.83%, 59.87% mRNA 발현이 감소하였다.
ESH 1,000 μg/mL에서 TNFα를 ESF 1,000 μg/mL에서 TNFα와 IL-1β의 mRNA 발현 억제를 확인하여, 루꼴라 추출물은 염증관련 사이토카인의 mRNA 발현 수준을 낮추는 것을 확인하였다.
실시예 6: 웨스턴 블롯
ESE와 LPS의 처리는 실시예 5와 동일하게 진행하였으며 ESE와 타프시가진의 처리는 ARPE-19 세포에 루꼴라 추출물 0.1 ~ 100 mg/mL 처리하여 최종농도 1 ~ 1000 μg/mL이 되도록 한 후 3 시간 배양한다(이때 대조군과 타프시가진 처리군은 루꼴라 추출물의 용매인 DMSO를 넣어준다). 이후 소포체 스트레스를 유도하는 타프시가진 5 mM을 1.5 μL 넣어 최종농도 5μM이 되도록 하여 24 시간 동안 배양하였다.
ESE, LPS 및 타프시가진이 처리된 ARPE-19 세포는 Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Single-Use Cocktail_100X(Thermo fisher) 및 radioimmunoprecipitation assay(RIPA) lysis buffer(ATTO, MA, USA)가 1 : 99 비율로 혼합된 용해 버퍼(lysis buffer)에서 추출되었다. digital sonifier(BRANSON, Danbury, CT, USA)를 사용하여 초음파 처리하고 12,000g, 4 ℃에서 20 분간 원심분리하여 상층액을 얻었다. 단백질 함량은 Pierce™ BCA Protein Assay Kit(Thermo fisher)을 사용하여 측정하였으며, 단백질 30 μg(SDS loading buffer x5 포함) 10% 혹은 15% 아크릴아미드(30% Acrylamide-Bis Solution) 젤에서 PowerPac™ HC Power Supply(Bio Rad)를 사용하여 전기영동하였다. 전기영동에 의하여 분자량대로 분리된 겔은 PVDF(polyvinylidene fluoride) 멤브레인(Millipore, Temecula, CA, USA)으로 트랜스퍼를 120 volt에서 1시간 30분 진행하였다. 그리고 5% 스킴 밀크(BD biosciences, Bedford, MA, USA)함유된 TBST(tris buffered saline with tween 20Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)으로 1시간 동안 교반 하여 블로킹하였다. 블로킹 후 멤브레인은 TBST로 3회 세척하여 1차 항체(표 3)를 4℃에서 9~18 시간 반응시켰다. 1차 항체와 반응한 멤브레인은 TBST로 3회 세척한 후, 상온에서 2차항체로 1시간 반응시켰다.
| Antibody | Catalog number | Dilution Factor | Corporation | |
| Primary antibody | p-JNK | 9251 | 1 : 500 | Cell Signaling |
| p-IκBα | 2859 | 1 : 1,000 | Cell Signaling | |
| p-NF-κB | 3033 | 1 : 1,000 | Cell Signaling | |
| CHOP | 2895 | 1 : 2,000 | Cell Signaling | |
| XBP-1 | 83418 | 1 : 1,000 | Cell Signaling | |
| Cleaved-caspase 3 | 9661 | 1 : 1,000 | Cell Signaling | |
| Cleaved-caspase 9 | 9507 | 1 : 1,000 | Cell Signaling | |
| β-actin | sc-47778 | 1 : 2,000 | Santa cruz | |
| α-tublin | sc-8035 | 1 : 1,000 | Santa cruz | |
| Secondary antibody | Anti-rabbit IgG | 7074 | 1 : 3,000 | Cell Signaling |
| Anti-mouse IgG | 7076 | 1 : 1,000 | Cell Signaling |
이후 멤브레인을 TBST로 3회 세척하고 super signal west pico plus(Thermo-fisher)를 사용하여 chemidoc(Davinch western system, Seoul, Korea)으로 스캔하여 Image J software(ver 1.8, National Institutes of Health, MD, USA)를 사용하여 정량화하였다. 단백질 발현 정도는 하우스 키핑 단백질 인 α-tublin 또는 β-actin을 내부 대조군으로 사용하여 각 단백질 발현의 정량 값을 대조군에서의 정량 값에 대한 fold 값으로 나타내어 결과의 평균은 도 4 내지 5에 나타냈다.
NF-κB 관련 단백질 발현 분석
인간 망막 상피세포에서 ESE의 항염증 효과를 확인하기 위해 주요 염증 신호전달 경로 단백질인 NF-κB(Nuclear Factor Kappa light chain enhancer of activatedB cells)와 IκBα(nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor, alpha)의 인산화 정도를 확인하였다.
ARPE-19 세포를 ESH 또는 ESF (0, 100, 500 또는 1,000 μg/mL)로 3 시간 동안 전처리 한 다음 LPS (1 μg/mL)로 2 시간 동안 전처리하였다. 웨스턴 블롯 분석을 위해 ARPE-19 전체 세포 용해물을 준비했으며, α-tublin은 내부 표준으로 사용하였다. 3 개의 독립적인 실험의 정량적 데이터가 각 패널에 표시되며 대표적인 웨스턴 블롯이 삽입으로 표시된다. 각 단백질의 상대적인 양은 밀도 분석에 의해 결정되었다.
ESH와 ESF를 전처리한 ARPE-19 세포에서 LPS로 유도된 p-NF-κB와 p-IκBα의 단백질 발현 정도는 도 4 A-D에 나타냈다. p-NF-κB와 p-IκBα는 모두 LPS 처리 하에 유의적으로 증가되는 것을 확인할 수 있었다. ESH가 처리된 ARPE-19 세포의 p-NF-κB는 1,000 μg/mL에서 53.53% 감소하였다. p-IκBα 또한 1,000 μg/mL에서 52.87% 감소하는 것을 확인하였다. ESF 처리된 ARPE-19 세포의 p-NF-κB 단백질 발현 정도는 100, 500, 1,000 μg/mL에서 각각 34.92, 51.38, 74.25%의 농도 의존적인 감소가 나타났다. 그 결과 ESF와 ESH 모두 NF-κB의 인산화를 억제하고 ESH는 IκBα의 인산화를 억제하여, 루꼴라 추출물의 항염증 효과를 확인하였다.
MAPK 관련 단백질 발현 분석
MAPK(Microtubule Associated Protein Kinase) familly 단백질은 LPS에 의해 자극되어 NF-κB를 활성화하거나 다른 염증 경로를 유발하기 때문에 MAPK familly 단백질의 발현을 확인하여 항염증 효과를 확인하였다.
ESH, ESF 전처리 및 LPS 처리된 ARPE-19 세포의 MAPK 단백질(p-JNK)의 발현 정도는 도 4 E, F에 나타냈다. p-JNK는 LPS 처리 하에 유의적으로 증가되는 것을 확인할 수 있었다. ESH가 처리된 ARPE-19 세포의 p-JNK 단백질 발현은 1,000 μg/mL에서 67.47% 유의적으로 감소하였다.
그 결과, 루꼴라 추출물은 NF-κB의 인산화를 억제하는 것과 함께 MAPK의 인산화를 억제하여 항염증 효과를 기대할 수 있다.
소포체 스트레스 관련 단백질 발현 분석
루꼴라 추출물(ESE)의 소포체 스트레스의 억제 효과를 확인하기 위해 소포체 스트레스 관련 단백질(CHOP, BiP, XBP-1)의 발현 수준을 확인하였다. 또한, 소포체 스트레스에 의한 ARPE-19의 세포사멸을 확인하기 위해 cleaved-caspase 9, cleaved-caspase 3 단백질의 발현 수준을 확인하였다.
ARPE-19 세포를 ESH 또는 ESF(0, 100, 500 또는 1,000 μg/mL)로 3 시간 동안 전처리 한 다음, 타프시가진(5 μM)으로 24 시간 동안 전처리하였다. ARPE-19 세포를 성장시킨 다음 웨스턴 블롯 분석을 위해 전체 세포 용해물을 준비하였다. β-actin은 내부 표준으로 사용하였다. 3 개의 독립적인 실험에서 얻은 정량 데이터가 각 패널에 표시되었으며 대표적인 웨스턴 블롯이 삽입으로 표시되었다. 각 단백질의 상대적인 양은 밀도 분석에 의해 결정되었다.
타프시가진 처리된 ARPE-19 세포에서 ESH, ESF 전처리에 의한 CHOP, XBP-1 단백질의 발현 정도는 그림 A 내지 F에 나타냈다. CHOP, XBP-1 모두 타프시가진 처리하에 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. ESH가 처리된 ARPE-19 세포에서 CHOP은 1,000 μg/mL에서 51.91%로 유의적으로 감소하였다. XBP-1 또한 1,000 μg/mL에서 40.59%로 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다.
ER 스트레스에 의하여 발생하는 ARPE-19 세포 사멸에서 ESH, ESF에 의한 cleaved-caspase 9, cleaved caspase-3 단백질의 발현 정도는 도 5 E 내지 H에 나타냈다. cleaved-caspase 9, cleaved-caspase 3는 타프시가진 처리하에 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. ESH가 처리된 ARPE-19 세포에서 cleaved-caspase 9은 1,000 μg/mL에서 41.20 %로 단백질 발현이 감소하였다. Cleaved-caspase 3는 1,000 μg/mL에서 48.67%로 유의적인 감소를 확인하였다.
활성화된 IRE1은 XBP-1을 스플라이싱시킬 수 있고 후속적으로 발현하는 BiP(Hirota 등, 2006)과 CHOP은 소포체 스트레스를 확인하는 지표로 사용될 수 있다. CHOP에 의하여 나타나는 세포사멸에서 cleaved-caspase 9,3(활성화된 caspase)는 세포사멸을 확인할 수 있는 단백질의 발현 정도를 확인하였다. ESH가 1,000 μg/mL 농도에서 CHOP, XBP-1, cleaved-caspase 9, cleaved-caspase 3의 단백질 발현을 억제하는 것을 확인하여, ESH는 XBP-1 단백질의 발현을 억제하여 CHOP에 의하여 유도되는 세포사멸 단백질의 발현을 낮춘다고 추측된다.
실시예 7: VEGF 억제 및 세포질 내 칼슘 수준 분석
타프시가진으로 소포체 스트레스가 유도된 ARPE-19 세포에서 루꼴라 추출물(ESE)의 전처리에 의해 VEGF의 억제를 확인함으로 소포체 스트레스의 기능적인 감소를 확인하여 AMD의 예방 효과를 확인하는 실험을 수행하였다. 또한, 타프시가진으로 인하여 소포체 내 칼슘 저장의 항상성이 파괴된 세포는 세포질 내로 칼슘을 방출하기 때문에 세포질 내의 칼슘의 감소를 확인함으로 타프시가진로 인한 소포체 스트레스의 억제를 확인하여 AMD의 예방 효과를 확인해 볼 수 있다.
ARPE-19 세포를 ESH, ESF 또는 U0126 (0, 100, 500 또는 1,000 μg/mL)으로 3 시간 동안 전처리 한 다음 타프시가진 5 μM로 24 시간 동안 전처리했다.
VEGF는 abcam에서 제조한 Human VEGF ELISA Kit (ab222510)를 사용하여 측정하였으며 해당 제품에서 제공하는 프로토콜에 의거하여 실험을 진행하였다. 세포질 내 칼슘수준은 Thermo Fisher Scientifi에서 제조한 Fluo-4 NW Calcium Assay Kit (F36206)을 사용하여 측정하였으며 제품에서 제공하는 프로토콜에 의거하여 실험을 진행하였다.
그 결과, 타프시가진 처리된 ARPE-19 세포에서 ESH, ESF 전처리에 의한 VEGF 발생 정도는 도 6 A에 나타냈다. VEGF는 타프시가진 처리하에 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. VEGF는 ESH가 500, 1,000 μg/mL 농도로 처리된 ARPE-19 세포에서 농도 의존적으로 감소하였다. VEGF는 ESF가 500, 1,000 μg/mL 농도로 처리된 ARPE-19 세포에서 농도 의존적으로 감소하였다. MAPK 억제제인 U0126을 전처리하였을 때 타프시가진으로 증가된 VEGF를 억제하는 것을 확인할 수 있었으며 ESH와 ESF 1,000 μg/mL에서와 비슷한 억제 효과를 나타내었다.
타프시가진 처리된 ARPE-19 세포에서 ESH, ESF 전처리에 의한 세포질 내 칼슘 농도는 도 6 B에 나타냈다. 세포질 내의 칼슘은 타프시가진 처리하에 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. ESH가 처리된 ARPE-19 세포에서 세포질 내의 칼슘은 1,000 μg/mL 농도에서 유의적으로 감소하였다.
모든 실험은 3회 실시하였고 각 실험의 결과값을 평균 ± 표준편차로 표현하였다. SPSS 25.0(Statistical Package for the Social Science, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 독립표본 T 검정, one-way ANOVA를 이용하여 분석하고, P<0.05 수준에서 Tukey's post-hoc test를 실시하여 각 시료 간의 유의성을 검증하였다.
Claims (11)
- 루꼴라 추출물을 유효성분으로 포함하는 망막 질환의 예방, 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 루꼴라 추출물은 C1-C4의 알코올로 추출되는 것인 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 루꼴라 추출물은 50 내지 90%(v/v) 에탄올을 추출용매로 하여 추출되는 것인 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 루꼴라 추출물은 루꼴라를 동결 건조 또는 열풍 건조한 것을 추출하는 것인 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 루꼴라 추출물은 항염증 효과, 소포체 스트레스 억제 효과 또는 VEGF 억제 효과를 갖는 것인 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 망막 질환은 노인성 황반 변성, 습식 노인성 황반 변성, 당뇨병 황반 부종, 당뇨병 망막증(당뇨병 황반 부종 제외), 포도막염, 중심성 삼출성 맥락망막증, 망막색소선조증, 망막 색소 상피 박리, 다발성 맥락막염, 신생혈관 황반증(고도 근시, 경사 유두 증후군 또는 맥락막 골종을 원인으로 하는 사례에 한함), 미숙아 망막증, 망막 색소변성증, 레베르병(Leber's disease), 망막 동맥 폐색증, 망막 정맥 폐색증, 중심성 장액성 맥락망막증, 망막 동맥류, 망막 박리, 증식성 유리체망막증, 스타가르트병(Stargardt's disease), 맥락막 경화증, 전맥락막위축증, 난황상 황반 이영양증, 오구치병, 안저백점증, 백점상 망막염 및 뇌회전형망맥락막위축증으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인 것인 약학 조성물.
- 루꼴라 추출물을 유효성분으로 포함하는, 망막 질환의 예방, 개선용 건강기능식품.
- 제7항에 있어서, 상기 루꼴라 추출물은 C1-C4의 알코올로 추출되는 것인 건강기능식품.
- 제7항에 있어서, 상기 루꼴라 추출물은 50 내지 90%(v/v) 에탄올을 추출용매로 하여 추출되는 것인 건강기능식품.
- 제7항에 있어서, 상기 루꼴라 추출물은 루꼴라를 동결 건조 또는 열풍 건조한 것을 추출하는 것인 건강기능식품.
- 제7항에 있어서, 상기 루꼴라 추출물은 항염증 효과, 소포체 스트레스 억제 효과 또는 VEGF 억제 효과를 갖는 것인 건강기능식품.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210051266A KR102578902B1 (ko) | 2021-04-20 | 2021-04-20 | 루꼴라 추출물을 함유하는 노인성 황반 변성 예방, 개선 및 치료용 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210051266A KR102578902B1 (ko) | 2021-04-20 | 2021-04-20 | 루꼴라 추출물을 함유하는 노인성 황반 변성 예방, 개선 및 치료용 조성물 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220144662A true KR20220144662A (ko) | 2022-10-27 |
| KR102578902B1 KR102578902B1 (ko) | 2023-09-13 |
Family
ID=83810387
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210051266A KR102578902B1 (ko) | 2021-04-20 | 2021-04-20 | 루꼴라 추출물을 함유하는 노인성 황반 변성 예방, 개선 및 치료용 조성물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102578902B1 (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20180043251A (ko) * | 2015-08-28 | 2018-04-27 | 네이춰스 선샤인 프로덕츠, 인코포레이티드 | 산화질소 수준을 급성으로 올리기 위한 조성물 및 방법 |
-
2021
- 2021-04-20 KR KR1020210051266A patent/KR102578902B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20180043251A (ko) * | 2015-08-28 | 2018-04-27 | 네이춰스 선샤인 프로덕츠, 인코포레이티드 | 산화질소 수준을 급성으로 올리기 위한 조성물 및 방법 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 한국식품영양과학회 학술대회 발표집. p.458 (2020.10.)* * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102578902B1 (ko) | 2023-09-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TWI380823B (zh) | 脂聯素（Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）濃度上升劑 | |
| JP2008526737A (ja) | 虚血性疾患及び退行性脳疾患の予防と治療のためのイネ科植物抽出物を含む組成物およびその使用 | |
| US10201578B2 (en) | Pharmaceutical composition or health food comprising Lonicera caerulea var. edulis fruit extracts as active ingredients for preventing or improving ischemic cerebrovascular diseases | |
| CN113262247A (zh) | 包含天然混合物提取物作为活性成分的预防或治疗糖尿病并发症和血管性水肿的药物组合物 | |
| KR102578902B1 (ko) | 루꼴라 추출물을 함유하는 노인성 황반 변성 예방, 개선 및 치료용 조성물 | |
| KR100926454B1 (ko) | 옻나무 추출물, 이의 분획물 또는 상기 분획물에서 분리한화합물을 포함하는 당뇨병 합병증 예방 및 치료용 조성물 | |
| KR101536974B1 (ko) | 여주, 산수유, 오미자 및 대추의 혼합 추출물을 함유하는 당뇨 예방 및 개선용 조성물. | |
| KR20210000214A (ko) | 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 | |
| KR102239066B1 (ko) | 식물 추출물의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 | |
| US20190262412A1 (en) | Composition for preventing or treating obesity containing ethanolic extract of ramulus mori | |
| WO2014042316A1 (ko) | 센티페드그라스 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물 | |
| KR102481709B1 (ko) | 들쭉 추출물을 유효성분으로 포함하는 안구건조증 치료용 조성물 | |
| KR102275492B1 (ko) | 증숙 생강 추출물, 또는 이로부터 분리된 1-디하이드로-6-진저다이온을 유효성분으로 함유하는 위염 및 위궤양의 치료 또는 예방용 조성물 | |
| KR20150135602A (ko) | 압출성형 천마를 유효성분으로 포함하는 혈행 개선용 조성물 | |
| KR101579820B1 (ko) | 퀘시아 운둘라타의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 암 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물 | |
| KR102229760B1 (ko) | 멜리사엽 추출물 분획 및 이를 포함하는 신규 약학적 조성물 | |
| KR20210000294A (ko) | 한속단 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물 | |
| KR20170097499A (ko) | 노근 추출물을 유효성분으로 함유하는 항암제 부작용에 의한 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 | |
| KR102718502B1 (ko) | 쌍별귀뚜라미 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 비알코올성 지방간 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 이의 제조방법 | |
| KR20220058412A (ko) | 차즈기 추출물을 유효성분으로 하는 근 위축증 또는 근 감소증 예방 또는 치료용 조성물 | |
| KR102153250B1 (ko) | 클로로겐산을 표준물질로 함유하는 블루베리의 항염증 조성물 | |
| KR102266418B1 (ko) | 영여자 추출물을 유효성분으로 함유하는 전립선 질환의 예방 및 치료용 조성물 | |
| KR20120092271A (ko) | 선복화 추출물을 포함하는 뇌암 치료용 조성물 및 건강 기능성 식품 | |
| KR20190052287A (ko) | 천궁 추출물을 포함하는 암의 예방 및 치료용 조성물 | |
| KR102376510B1 (ko) | 산달래 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |