KR20220143453A - Method of aptamer screening through primer region masking and NGS analysis of each round DNA pool - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 매 라운드 DNA 풀의 NGS 분석 및 프라이머 영역 가림 방식을 통한 앱타머 스크리닝 방법에 관한 것이다.The present invention relates to an aptamer screening method through NGS analysis of a DNA pool every round and a primer region masking method.
바이오센서에서 표적 물질의 검출을 위해 항체를 널리 이용한다. 이는 검출하고자 하는 타겟 물질(항원)을 동물의 몸에 주입하여 생체의 면역시스템을 통해 만들어지는 항체를 확보한 후 정제 과정을 거치기 때문에 시간 및 비용의 소요가 많다. 또한 독성물질에 대해서는 면역반응을 기대하기 어렵기 때문에 항체의 제작에 어려움이 있다. 또한 제작에 있어서 배치에 따라 결합력의 차이가 있을 수 있어서 생산 후 품질 보증 면에서도 불편함이 있다. 그 크기 면에서도 항체는 100KDa 이상의 매우 큰 단백질이기 때문에 전기화학 기반 등의 바이오센서로 응용시에 신호 검출 부분에 있어 제약이 있을 수 있고, 열 안전성이 DNA나 다른 화학물질에 비해 현저히 떨어지는 문제가 있다. 이는 저장 및 운송에 큰 제약이 되며 특히 개발 도상국에서의 활용에 큰 문제가 되기도 한다. 그러므로 바이오 센서의 개발에 있어서 항체를 이용한 기술은 비용과 시간 면에서 효율적이지 않고, 적용범위가 다양하지 않아 응용에 있어 제한적인 문제점들이 있다.Antibodies are widely used for detection of target substances in biosensors. This takes a lot of time and money because the target substance (antigen) to be detected is injected into the body of an animal to secure the antibody made through the immune system of the living body and then undergoes a purification process. In addition, since it is difficult to expect an immune response to toxic substances, there is a difficulty in the production of antibodies. In addition, there may be a difference in bonding strength depending on the arrangement in the production, which is inconvenient in terms of quality assurance after production. In terms of its size, since an antibody is a very large protein of 100 KDa or more, there may be restrictions in the signal detection part when applied as an electrochemical-based biosensor, and there is a problem that the thermal stability is significantly lower than that of DNA or other chemicals. . This is a big constraint on storage and transportation, and it is also a big problem for utilization, especially in developing countries. Therefore, in the development of a biosensor, a technology using an antibody is not efficient in terms of cost and time, and there are limitations in application because the scope of application is not diverse.
이러한 문제점들을 개선할 수 있는 새로운 인식물질로서 다양한 타겟 물질에 대한 제한없이 특이적으로 높은 친화도를 보이는 핵산 구조체인 앱타머를 이용하는 연구가 많이 이루어지고 있다. 앱타머는 특정 타겟에 대해 높은 특이성과 친화도를 가지는 단일가닥 DNA 또는 RNA의 구조체이다. 앱타머는 타겟에 대한 친화도가 높고 열 안정성이 우수하며 in vitro에서 합성이 가능하기 때문에 비용면에서도 기존의 센서 분야에서 이용되는 감지물질들 보다 우위에 있다.As a new recognition material capable of improving these problems, many studies have been conducted using an aptamer, which is a nucleic acid construct that specifically shows high affinity without limitation to various target materials. Aptamers are single-stranded DNA or RNA structures with high specificity and affinity for a specific target. Aptamer has a high affinity for the target, excellent thermal stability, and can be synthesized in vitro, so it has an advantage over existing sensing materials used in the sensor field in terms of cost.
합성한 앱타머의 경우에는 열에 안정적이며, 배치간의 차이가 없어 품질 관리에 있어서도 유리하고, 운송 및 저장 조건에 대해 상대적으로 제약이 없는 장점이 있다. 또한 타겟 물질에 제약이 없어 단백질, 아미노산 같은 생분자나 환경호르몬이나 항생제 같은 작은 유기화학 물질, 박테리아 등의 다양한 타겟은 물론, 면역반응을 기대할 수 없는 독성물질에 대한 앱타머까지 개발할 수 있다. 이러한 앱타머의 특성으로 인해 최초로 개발된 90년대 초반 이후에 꾸준히 신약 개발, 약물전달 시스템 그리고 바이오센서 등의 연구에 앱타머를 활용하기 위해 많은 연구가 이루어지고 있어, 바이오센서에서 기존의 항체를 대체하는 새로운 capturing probe로 이용되고 있다. 앱타머는 합성 후 수식이 자유로워 바이오 센서 이외에도, 약물전달, 바이오이미징 등에 대한 적용 연구도 세계적으로 활발하게 이루어지고 있다.In the case of the synthesized aptamer, it is stable to heat, there is no difference between batches, so it is advantageous in quality control, and there are advantages in that there are relatively no restrictions on transportation and storage conditions. In addition, since there are no restrictions on target materials, biomolecules such as proteins and amino acids, small organic chemicals such as environmental hormones and antibiotics, and various targets such as bacteria, as well as aptamers for toxic substances that cannot expect an immune response can be developed. Due to these characteristics of aptamers, since the early 1990s, when they were first developed, many studies have been conducted to use aptamers for research on new drug development, drug delivery systems, and biosensors. It is being used as a new capturing probe for Since aptamers can be freely modified after synthesis, not only biosensors, but also applied research on drug delivery and bioimaging are being actively conducted around the world.
앱타머를 개발하기 위해서는 1012~1014 종류의 핵산으로 이뤄진 랜덤 라이브러리를 타겟 물질과 반응시킨 후에 타겟 물질에 결합을 한 핵산 분자들을 분리해서 증폭을 시키는 과정을 반복한다. 이 과정을 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) 라고 하는데, 반응, 분리, 증폭의 과정으로 이루어진다. 증폭을 위해서는 핵산 라이브러리의 양말단에 프라이머 영역이 필수적이다. 이는 크기면에서 약 40 %의 비중을 차지하여 앱타머 개발의 효율을 저해하기 때문에 본 발명에서는 프라이머의 영역이 없는 소형 앱타머를 개발하는 방법을 개발하고자 한다. To develop an aptamer, a random library consisting of 10 12 to 10 14 types of nucleic acids is reacted with a target material, and then the process of separating and amplifying the nucleic acid molecules bound to the target material is repeated. This process is called SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment), and consists of a process of reaction, isolation, and amplification. For amplification, primer regions are essential at both ends of the nucleic acid library. Since this accounts for about 40% of the size and inhibits the efficiency of aptamer development, the present invention intends to develop a method for developing a small aptamer without a primer region.
앱타머의 크기를 줄이면 바이오 센서에 적용할 때에 단위 부피 당 많은 수를 고정할 수 있고, 약물로 사용할 때에는 보다 원활하게 세포벽을 통과할 수 있기 때문에, 소형 앱타머에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 일반적으로는 소형 앱타머를 선별하기 위하여 선별 이후에 별도의 post-SELEX 과정을 통해 truncation 연구를 수행하고 있으나 이는 많은 시간과 비용이 추가적으로 필요하여 post-SELEX 과정 없이 소형 앱타머를 개발할 수 있는 기술이 필요하다.When the size of the aptamer is reduced, a large number per unit volume can be fixed when applied to a biosensor, and when used as a drug, it can pass through the cell wall more smoothly, so research on small aptamers is being actively conducted. In general, truncation research is conducted through a separate post-SELEX process after screening to select small aptamers, but this requires a lot of time and additional money, so there is no technology capable of developing small aptamers without post-SELEX process. need.
앱타머를 개발하기 위해서는 반응, 분리, 증폭의 반복을 여러번 (6-20회) 수행한 후에 마지막 라운드에서 얻은 풀을 대상으로 클로닝을 거쳐 서열 분석을 하거나, 최근에는 차세대 염기서열 분석법 (NGS, next generation sequencing)을 통해서 앱타머 후보군을 도출하고, 도출한 앱타머의 성능 분석을 수행한다. NGS는 기존의 클로닝과 생어 시퀀싱 방법을 대체할 수 있는 서열 분석 기법으로서 서열 분석에 필요한 시간과 비용의 절감을 시켜준다. 이는 최종 산물의 서열분석 뿐만 아니라 매라운드에서 얻은 핵산 풀에 대한 정보를 제공하기 때문에 앱타머 선별과정 전반에 걸쳐 특정 서열의 라운드 별 증감을 모니터링할 수 있다.To develop an aptamer, after repeating the reaction, separation, and amplification several times (6-20 times), the pool obtained from the last round is subjected to cloning and sequence analysis, or, more recently, the next-generation sequencing method (NGS, next generation sequencing) to derive an aptamer candidate group, and perform performance analysis of the derived aptamer. NGS is a sequencing technique that can replace the existing cloning and Sanger sequencing methods, reducing the time and cost required for sequencing. Since this provides information on the nucleic acid pool obtained from every round as well as sequencing of the final product, it is possible to monitor the increase or decrease of a specific sequence by round throughout the aptamer selection process.
본 발명의 발명자는 핵산 랜덤 라이브러리의 프라이머 영역을 가리고 앱타머를 선별하여 소형 앱타머를 개발하는 기법과 매 라운드의 풀을 대상으로 NGS를 수행하는 방식을 접목하여 최종 개발되는 앱타머의 갯수를 높이는 동시에 앱타머를 소형화시키는 기술을 연구한 결과 본 발명을 완성하였다.The inventor of the present invention covers the primer region of the nucleic acid random library and selects the aptamer to increase the number of aptamers that are finally developed by combining the technique of developing small aptamers and the method of performing NGS on the pool of every round. At the same time, the present invention was completed as a result of researching a technology for miniaturizing the aptamer.
이에 본 발명은 양 말단에 프라이머 영역을 가지는 단일가닥 DNA 풀(pool)과 표적물질의 결합을 유도하는 단계를 포함하는 DNA 앱타머 스크리닝 방법에 있어서, 상기 프라이머 영역은 이와 결합 가능한 제제에 의해 가려져(masking) 있고, 매 사이클에서 NGS를 수행하는 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머 스크리닝 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.Accordingly, the present invention provides a DNA aptamer screening method comprising the step of inducing binding of a target substance to a single-stranded DNA pool having primer regions at both ends, wherein the primer region is covered by an agent capable of binding thereto ( masking), and an object of the present invention is to provide a DNA aptamer screening method characterized in that NGS is performed in every cycle.
또한, 본 발명은 트롬빈에 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머를 제공하는 것을 목적으로 한다.Another object of the present invention is to provide an aptamer capable of specifically binding to thrombin.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 양 말단에 프라이머 영역을 가지는 단일가닥 DNA 풀(pool)과 표적물질의 결합을 유도하는 단계를 포함하는 DNA 앱타머 스크리닝 방법에 있어서, 상기 프라이머 영역은 이와 결합 가능한 제제에 의해 가려져(masking) 있는 것인, DNA 앱타머 스크리닝 방법을 제공한다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention provides a DNA aptamer screening method comprising inducing binding of a single-stranded DNA pool having primer regions at both ends and a target substance, wherein the primer region is It provides a method for screening a DNA aptamer, which is masked by an agent capable of binding thereto.
본 발명의 일 구현예로, 상기 프라이머 영역과 결합 가능한 제제는 올리고뉴크레오티드, 앱타머, 펩티드 또는 화합물일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the agent capable of binding to the primer region may be an oligonucleotide, an aptamer, a peptide or a compound.
본 발명의 일 구현예로, 상기 단일가닥 DNA는 양 말단 프라이머 영역 내부에 30 내지 50개의 임의의 염기를 가질 수 있다.In one embodiment of the present invention, the single-stranded DNA may have 30 to 50 arbitrary bases within the primer region at both ends.
본 발명의 일 구현예로, 상기 표적물질은 트롬빈일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the target material may be thrombin.
본 발명의 일 구현예로, a) 상기 DNA 풀과 표적물질의 결합을 유도하는 단계 이후In one embodiment of the present invention, after a) inducing the binding of the DNA pool and the target material
b) 표적물질과 결합하지 않은 단일가닥 DNA를 제거하는 단계;b) removing single-stranded DNA not bound to the target material;
c) 표적물질과 결합한 단일가닥 DNA를 증폭하는 단계;c) amplifying single-stranded DNA bound to a target material;
d) 상기 c)단계에서 얻어진 DNA에 대하여 차세대 염기서열 분석법(next generation sequencing, NGS)을 수행하여 앱타머를 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다.d) performing next generation sequencing (NGS) on the DNA obtained in step c) may further include the step of selecting an aptamer.
본 발명의 일 구현예로, 상기 a) 내지 d) 단계는 6회 내지 20회 반복될 수 있다.In one embodiment of the present invention, steps a) to d) may be repeated 6 to 20 times.
또한, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 9 또는 서열번호 10으로 표시되는, 트롬빈에 특이적으로 결합하는 앱타머를 제공한다.In addition, the present invention provides an aptamer that specifically binds to thrombin, which is represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10.
또한, 본 발명은 상기 앱타머를 포함하는 트롬빈 검출용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for detecting thrombin comprising the aptamer.
또한, 본 발명은 상기 앱타머를 포함하는 트롬빈 검출용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for detecting thrombin comprising the aptamer.
본 발명은 핵산 라이브러리의 프라이머 영역을 가린채로 소형 앱타머를 개발할 수 있는 기술을 제공한다. 프라이머 영역을 가리기 때문에 스크리닝 과정 이후에 프라이머 영역이 없는 소형 앱타머를 선별할 수 있으며, 프라이머 영역이 표적 단백질과 결합시 방해되는 것을 막을 수 있다. 또한 매 라운드의 DNA 풀을 NGS를 통해 서열 분석하기 때문에 보다 선별할 수 있는 앱타머 후보군의 갯수가 많다.The present invention provides a technology capable of developing a small aptamer while covering the primer region of a nucleic acid library. Since the primer region is covered, it is possible to select a small aptamer without a primer region after the screening process, and it is possible to prevent the primer region from interfering with binding to a target protein. In addition, since the DNA pool of each round is sequenced through NGS, the number of aptamer candidates that can be selected more is large.
또한 모델 타겟으로 사용된 트롬빈 단백질에 대해 앱타머를 이용하여 효과적으로 검출함으로써 기존에 사용되고 있는 항체 기반 분석보다 더 민감하고 일관성 있게 트롬빈 단백질의 농도를 측정할 수 있다. 아울러, DNA 앱타머는 항체에 비해 생산비용이 적고 표면에 고정화하기가 쉬우므로 바이오센서 칩 제작에 유리하다. 이러한 트롬빈 결합 특이적 DNA 앱타머를 이용하여 트롬빈 단백질 농도를 민감하고 정확하게 측정할 수 있는 바이오 센서를 통해 트롬빈 검출을 보다 정확히 할 수 있다.In addition, by effectively detecting the thrombin protein used as a model target using an aptamer, the concentration of thrombin protein can be measured more sensitively and consistently than the antibody-based assay used in the past. In addition, DNA aptamer is advantageous for biosensor chip production because it has a lower production cost and is easy to immobilize on the surface compared to an antibody. By using such a thrombin-binding-specific DNA aptamer, thrombin detection can be performed more accurately through a biosensor that can sensitively and accurately measure the thrombin protein concentration.
도 1은 본 발명 방법을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 트롬빈 결합 앱타머의 특이성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 트롬빈 결합 앱타머의 트롬빈에 대한 해리 상수(Kd) 측정 결과를 나타낸 것이다.1 schematically shows the method of the present invention.
Figure 2 shows the results of analysis of the specificity of the thrombin-binding aptamer.
3 shows the dissociation constant (K d ) of the thrombin-binding aptamer for thrombin measurement.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 양 말단에 프라이머 영역을 가지는 단일가닥 DNA 풀(pool)과 표적물질의 결합을 유도하는 단계를 포함하는 DNA 앱타머 스크리닝 방법에 있어서, 상기 프라이머 영역은 이와 결합 가능한 제제에 의해 가려져(masking) 있는 것인, DNA 앱타머 스크리닝 방법을 제공한다.The present invention provides a DNA aptamer screening method comprising the step of inducing binding of a target substance to a single-stranded DNA pool having primer regions at both ends, wherein the primer region is masked by an agent capable of binding thereto. ), which provides a DNA aptamer screening method.
본 발명에서 앱타머(Aptamer)란 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산 (DNA, RNA 또는 변형핵산)을 의미한다.In the present invention, an aptamer refers to a single-stranded nucleic acid (DNA, RNA or modified nucleic acid) having a stable tertiary structure by itself and having high affinity and specificity to bind to a target molecule.
본 발명에서 프라이머 영역이란 단일가닥 DNA를 PCR을 이용하여 증폭시키기 위해 프라이머가 결합할 수 있는 서열이 위치하는 곳을 의미한다.In the present invention, the primer region means a place where a sequence capable of binding a primer is located in order to amplify single-stranded DNA using PCR.
본 발명에서 표적물질이란 앱타머의 결합 목표가 되는 대상을 의미하며 앱타머가 결합할 수 있는 대상이라면 특별히 제한되지 않는다.In the present invention, the target material refers to a target that is a binding target of the aptamer, and is not particularly limited as long as it is a target to which the aptamer can bind.
본 발명에서 상기 프라이머 영역은 이와 결합 가능한 제제에 의해 가려져(masking) 있는 것을 특징으로 한다. 프라이머 영역을 가리기 때문에 스크리닝 과정 이후에 프라이머 영역이 없는 소형 앱타머를 선별할 수 있으며, 프라이머 영역이 표적물질과 상호작용하여 앱타머 서열과 표적물질 결합을 방해하는 것을 막을 수 있다. In the present invention, the primer region is characterized in that it is masked by an agent capable of binding thereto. Since the primer region is covered, it is possible to select small aptamers without a primer region after the screening process, and it is possible to prevent the primer region from interacting with the target material and interfering with the binding of the aptamer sequence to the target material.
상기 프라이머 영역과 결합 가능한 제제는 프라이머 영역과 상호작용하여 프라이머 영역이 앱타머 서열과 표적물질 결합을 방해하는 것을 막을 수 있는 물질이면 족하고 프라이머 영역을 완전히 가릴 필요는 없다.The agent capable of binding to the primer region is sufficient as long as it is capable of interacting with the primer region to prevent the primer region from interfering with the binding of the aptamer sequence to the target substance, and it is not necessary to completely cover the primer region.
본 발명에서 프라이머 영역과 결합 가능한 제제는 올리고뉴크레오티드, 앱타머, 펩티드 또는 화합물일 수 있다.In the present invention, the agent capable of binding to the primer region may be an oligonucleotide, an aptamer, a peptide or a compound.
상기 제제는 프라이며 영역의 염기서열에 따라 차이가 있으며, 당업자라면 프라이머 영역의 염기서열을 아는 경우 이와 상호작용 가능한 상기 제제의 제조가 가능하다.The agent is a fry, and there is a difference depending on the base sequence of the region, and if a person skilled in the art knows the base sequence of the primer region, it is possible to prepare the agent capable of interacting therewith.
본 발명에서 상기 단일가닥 DNA는 양 말단 프라이머 영역 내부에 30 내지 50개의 임의의 염기를 가질 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the single-stranded DNA may have 30 to 50 arbitrary bases within the primer region at both ends, but is not limited thereto.
본 발명에서 상기 표적물질은 트롬빈일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the target material may be thrombin, but is not limited thereto.
본 발명은 a) 상기 DNA 풀과 표적물질의 결합을 유도하는 단계 이후The present invention a) after the step of inducing the binding of the DNA pool and the target material
b) 표적물질과 결합하지 않은 단일가닥 DNA를 제거하는 단계;b) removing single-stranded DNA not bound to the target material;
c) 표적물질과 결합한 단일가닥 DNA를 증폭하는 단계;c) amplifying single-stranded DNA bound to a target material;
d) 상기 c)단계에서 얻어진 DNA에 대하여 차세대 염기서열 분석법(next generation sequencing, NGS)을 수행하여 앱타머를 선별하는 단계를 더 포함하는 것인, DNA 앱타머 스크리닝 방법을 제공한다.d) performing next generation sequencing (NGS) on the DNA obtained in step c) to further include the step of selecting an aptamer, it provides a DNA aptamer screening method.
본 발명은 매 사이클마다 NGS를 수행하므로 최종 라운드만 NGS를 수행하는 방법에 비해 우수한 결합 강도를 가지는 앱타머를 확보할 가능성이 높아진다. 본 발명의 실시예 5에 의하면 7라운드에서 NGS 결과 트롬빈에 대한 결합능이 높은 2개의 앱타머를 선별하였는데, 이는 종래의 마지막 라운드에서만 NGS를 수행하는 방법으로는 선별할 수 없었던 앱타머이다.Since the present invention performs NGS every cycle, the possibility of securing an aptamer having superior bonding strength is increased compared to a method of performing NGS only in the final round. According to Example 5 of the present invention, two aptamers having high binding ability to thrombin were selected as a result of NGS in round 7, which is an aptamer that could not be selected by the method of performing NGS only in the last round.
본 발명에서 상기 a) 내지 d) 단계는 6회 내지 20회 반복될 수 있다.In the present invention, steps a) to d) may be repeated 6 to 20 times.
다른 양태로서 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 9 또는 서열번호 10으로 표시되는, 트롬빈에 특이적으로 결합하는 앱타머를 제공한다.In another aspect, the present invention provides an aptamer that specifically binds to thrombin, which is represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10.
다른 양태로서 본 발명은 상기 앱타머를 포함하는 트롬빈 검출용 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a composition for detecting thrombin comprising the aptamer.
다른 양태로서 본 발명은 상기 앱타머를 포함하는 트롬빈 검출용 키트를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a kit for detecting thrombin comprising the aptamer.
상기 조성물 또는 키트에는 상기 앱타머 이외에 당해 분야에서 통상적으로 이용되는 시약 등의 물질이 포함될 수 있다.The composition or kit may include materials such as reagents commonly used in the art in addition to the aptamer.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of Examples. However, these Examples are for explaining the present invention in more detail, and the scope of the present invention is not limited to these Examples.
<실시예><Example>
<실시예 1: TALON bead에 트롬빈 고정><Example 1: Thrombin fixation to TALON bead>
히스티딘(Histidine)이 태깅(tagging)된 트롬빈(1473-SE-010, RnD systems)과 히스티딘이 수식된 단백질에 특이적으로 결합하는 TALON beads (TALON Metal Affinity Resin, Takara bio)를 버퍼용액(145 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.05% Tween 20)에 넣고 상온에서 30 분 반응시켰다. 반응 후 동일한 버퍼용액으로 비드를 세척하여 결합하지 않은 트롬빈을 제거하였다.Histidine-tagged thrombin (1473-SE-010, RnD systems) and TALON beads (TALON Metal Affinity Resin, Takara bio) that specifically bind to histidine-modified protein were mixed with a buffer solution (145 mM). NaCl, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgCl 2 , 1.8 mM CaCl 2 , 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.05% Tween 20) and reacted at room temperature for 30 minutes. After the reaction, the beads were washed with the same buffer solution to remove unbound thrombin.
<실시예 2: 임의의 염기서열을 가지는 DNA 풀(pool) 합성><Example 2: DNA pool synthesis having an arbitrary base sequence>
74bp DNA 라이브러리로서 양 끝에 PCR을 위한 프라이머 영역(primer region)이 있고 중앙에 40개의 임의의 염기를 가진 DNA 풀을 종래의 phosphite triester 법을 이용하여 아래와 같은 서열로 합성하였다.As a 74bp DNA library, a DNA pool having primer regions for PCR at both ends and 40 arbitrary bases in the center was synthesized with the following sequence using the conventional phosphite triester method.
5'-GTGGTCTAGCTGTACTC-40N-CCACAGTCAACGAGCTA-3'5'-GTGGTCTAGCTGTACTC-40N-CCACAGTCAACGAGCTA-3'
<실시예 3: 프라이머 영역을 가린 DNA 풀의 제조><Example 3: Preparation of DNA pool covering the primer region>
실시예 2에서 합성된 랜덤 DNA 풀의 프라이머 영역에 하기의 상보적인 서열을 일반적인 하이브리다이제이션 방법으로서 95℃ 5 분, ice 5분, 처리 후 실온에서 15분간 방치시켜서 상보적 결합을 유도하였다.As a general hybridization method, the following complementary sequence was applied to the primer region of the random DNA pool synthesized in Example 2 at 95° C. for 5 minutes, ice for 5 minutes, and left for 15 minutes at room temperature after treatment to induce complementary binding.
5'-GTGGTCTAGCTGTACTC-3'5'-GTGGTCTAGCTGTACTC-3'
5'-TAGCTCGTTGACTGTGG-3'5'-TAGCTCGTTGACTGTGG-3'
<실시예 4: 트롬빈과 결합한 DNA 앱타머의 선별><Example 4: Selection of DNA aptamers bound to thrombin>
실시예 3에서 형성한 프라이머 영역이 가려진 랜덤 DNA 풀을 트롬빈이 고정되어 있는 TALON 비드와 함께 버퍼용액 (145 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.05% Tween 20)에 넣고 혼합하여 30분간 상온에서 반응시킨 후, 트롬빈과 결합하지 않은 DNA를 제거하기 위해 버퍼용액으로 5회 세척하였다.The random DNA pool with the primer region formed in Example 3 was mixed with TALON beads immobilized with thrombin in a buffer solution (145 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgCl 2 , 1.8 mM CaCl 2 , 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.05% Tween 20), mixed, reacted at room temperature for 30 minutes, and washed 5 times with a buffer solution to remove DNA not bound to thrombin.
트롬빈과 결합한 DNA를 용리하기 위하여 TALON 비드와 DNA 결합체를 6M 구아니딘(Guanidine)에 넣어 분리시킨 다음 에탄올 침전법으로 용리된 DNA를 확보하였다.In order to elute DNA bound to thrombin, TALON beads and DNA conjugate were put in 6M guanidine to separate them, and then the eluted DNA was obtained by ethanol precipitation.
<실시예 5: 트롬빈과 결합 가능한 DNA 앱타머 풀의 제조><Example 5: Preparation of DNA aptamer pool capable of binding to thrombin>
트롬빈 결합 특이적인 DNA의 양을 늘리기 위해 이미 알고 있는 프라이머 영역을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 생산물은 이중가닥 DNA이므로 이를 효소를 이용하여 단일가닥으로 분리하는 과정을 위하여, 하기와 같이 하나의 프라이머를 인산화 하였다.In order to increase the amount of thrombin-binding-specific DNA, PCR was performed using a known primer region. Since the PCR product is double-stranded DNA, for the process of separating it into single-stranded DNA using an enzyme, one primer was phosphorylated as follows.
forward FP 5'-GTGGTCTAGCTGTACTC-3'forward FP 5'-GTGGTCTAGCTGTACTC-3'
reverse RP 5'-p-TAGCTCGTTGACTGTGG-3'reverse RP 5'-p-TAGCTCGTTGACTGTGG-3'
PCR 반응물을 정제키트(purification kit)를 이용하여 정제한 후 이중가닥 DNA를 단일가닥으로 만들기 위해 인산화된 서열을 분해하는 핵산외부가수분해효소를 처리하였다. 효소 처리가 끝난 증폭 산물은 다시 에탄올 침전법을 사용하여 단일가닥 DNA를 확보하였다. 이 때 확보된 DNA 풀의 일부는 NGS 서열분석을 위해 보관하고 다른 일부는 다시 처음의 트롬빈이 고정되어 있는 TALON 비드 용액과 혼합하여 트롬빈과 반응시켰다. After the PCR reaction was purified using a purification kit, a nucleic acid exohydrolase was treated to decompose the phosphorylated sequence to make the double-stranded DNA single-stranded. Single-stranded DNA was obtained from the enzyme-treated amplification product again by ethanol precipitation. At this time, a part of the obtained DNA pool was stored for NGS sequencing, and the other part was mixed with the TALON bead solution to which the initial thrombin was fixed and reacted with thrombin.
이제까지의 일련의 과정을 한 번의 선별(selection)이라 하면 총 10번의 선별과정을 거쳐 트롬빈에 결합하는 DNA 풀을 얻었다. If the series of processes so far is called one selection, a DNA pool that binds to thrombin was obtained through a total of 10 selection processes.
2라운드 이후에서부터는 트롬빈이 고정되지 않은 TALON 비드와 DNA 풀을 반응시킨 후 TALON bead에 결합하지 않는 DNA 만을 취하여 선별에 사용하였다. 5라운드 이후부터는 결합의 경쟁을 유도하여 비특이적으로 결합하는 DNA를 차단하고 트롬빈에만 높은 친화도를 가지고 특이적으로 결합하는 DNA 풀을 확보할 수 있도록 헤파린(heparin)과 정자 DNA(sperm DNA)를 함께 사용하였다.After the second round, after reacting the TALON beads to which thrombin is not immobilized with the DNA pool, only DNA that does not bind to the TALON beads was taken and used for selection. From round 5 onwards, heparin and sperm DNA are used together to block non-specific binding DNA by inducing binding competition and to secure a DNA pool that specifically binds to thrombin with high affinity. was used.
매 라운드에서 얻어진 DNA 풀을 ION torrent 차세대 시퀀싱을 이용하여 염기분석을 시행한 결과, 트롬빈에 특이적으로 결합하는 서로 다른 11종의 DNA 앱타머 후보군을 확보하여 그 결과를 표 1에 제시하였다.As a result of nucleotide analysis of the DNA pool obtained in each round using ION torrent next-generation sequencing, 11 different DNA aptamer candidates that specifically bind to thrombin were obtained, and the results are presented in Table 1.
※ 앱타머 번호에서 중간 숫자는 앱타머를 선별한 라운드를 의미함※ The middle number in the aptamer number means the round in which the aptamer is selected.
<실시예 6: 트롬빈 결합 앱타머의 특이성 분석><Example 6: Specificity analysis of thrombin-binding aptamer>
실시예 5에서 선별한 11종의 트롬빈 결합 앱타머가 다른 유사물질, 인간혈청알부민(Human serum albumin), IgG, 피브리노겐(Fibrinogen)에 대한 특이성을 보이지 않고 트롬빈에 특이적으로 작용하는지 확인하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다.In order to confirm that the 11 types of thrombin-binding aptamers selected in Example 5 do not show specificity for other analogs, human serum albumin, IgG, and fibrinogen, and specifically act on thrombin, the following Experiments were performed.
SPR (Surface Plasmon Resonance) 분석을 수행하기 위하여, 스트렙타비딘이 고정되어 있는 비아코아 센서칩에 바이오틴이 붙어있는 실시예 5의 각각의 앱타머를 고정시켰다. 여기에 동일한 양(400 nM)의 트롬빈과 유사물질들 (Human serum albumin, IgG, Fibrinogen)을 버퍼용액 (145 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.05% Tween 20)안에서 각각 120 초 간 반응시킨 후, 같은 버퍼용액으로 결합하지 않은 물질을 씻어냈다.In order to perform SPR (Surface Plasmon Resonance) analysis, each aptamer of Example 5 having biotin attached thereto was immobilized on the Biacore sensor chip to which streptavidin was immobilized. The same amount (400 nM) of thrombin and similar substances (Human serum albumin, IgG, Fibrinogen) was added in a buffer solution (145 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgCl 2 , 1.8 mM CaCl 2 , 20 mM Tris-HCl). , pH 7.5, 0.05% Tween 20) for 120 seconds each, and then washed off the unbound material with the same buffer solution.
SPR 결과를 분석한 결과, 가장 트롬빈에 대한 특이성이 높은 것으로 관찰된 4 종의 앱타머인 앱타머 s-10-1, 앱타머 s-7-1 및 앱타머 s-7-2에 대하여 그 친화도를 도 2와 같이 제시하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, 앱타머 s-10-1, 앱타머 s-7-1 및 앱타머 s-7-2는 모두 트롬빈에는 매우 높은 결합력을 보이는 반면, 유사물질인 인간혈청알부민, IgG, 피브리노겐에 대해서는 잘 결합하지 않는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 본 발명에 따른 트롬빈 특이적 핵산 앱타머가 트롬빈의 특이적 검출이 가능함을 제시한다.As a result of analyzing the SPR results, the affinity for aptamer s-10-1, aptamer s-7-1 and aptamer s-7-2, which are four types of aptamers observed to have the highest specificity for thrombin The figure is presented as in FIG. 2 . As shown in Figure 2, aptamer s-10-1, aptamer s-7-1, and aptamer s-7-2 all showed a very high binding affinity to thrombin, while analogous substances such as human serum albumin, IgG, It was found that it did not bind well to fibrinogen. These results suggest that the thrombin-specific nucleic acid aptamer according to the present invention is capable of specific detection of thrombin.
<실시예 7: 트롬빈 결합 앱타머의 트롬빈에 대한 해리 상수 (Kd)의 측정><Example 7: Measurement of dissociation constant (Kd) of thrombin-binding aptamer to thrombin>
상기 제작한 11 종의 트롬빈 결합 특이적인 앱타머 중에서 특이성 가장 높은 앱타머 s-10-1, 앱타머 s-7-1 및 앱타머 s-7-2에 대하여 트롬빈에 대한 결합측정법(binding assay)을 실시하였다.Binding assay to thrombin for aptamer s-10-1, aptamer s-7-1, and aptamer s-7-2 having the highest specificity among the 11 types of thrombin-binding-specific aptamers prepared above was carried out.
실시예 6과 동일한 방법으로 앱타머를 고정시킨 후 서로 다른 농도의 트롬빈을 버퍼용액 145 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.05% Tween 20)에서 120 초간 반응시켰다. 해리상수를 구하기 위해서 각각의 반응 정도는 각 농도별 평형치 값을 플라팅해서 계산하였다. 여기에 Y = Bmax*X/(Kd + X)식을 이용하여 해리상수가 결정되었다(X는 트롬빈의 농도, Y 는 트롬빈에 의한 RU, Bmax = 외삽으로 계산한 최대의 RU 값).After fixing the aptamer in the same manner as in Example 6, different concentrations of thrombin were added to buffer solution 145 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgCl 2 , 1.8 mM CaCl 2 , 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.05% Tween 20) for 120 seconds. To obtain the dissociation constant, the degree of each reaction was calculated by plotting the equilibrium value for each concentration. Here, the dissociation constant was determined using the formula Y = Bmax*X/(Kd + X) (X is the concentration of thrombin, Y is the RU by thrombin, Bmax = the maximum RU value calculated by extrapolation).
그 결과 도출된 앱타머 s-10-1, 앱타머 s-7-1 및 앱타머 s-7-2의 Kd 값이 각각 18.45, 11.36, 16.16 nM로써 트롬빈에 강력하게 결합하는 것이 확인되었고 이에 대한 분석 데이터를 도 3에 제시하였다As a result, it was confirmed that the K d values of the derived aptamer s-10-1, aptamer s-7-1 and aptamer s-7-2 were 18.45, 11.36, and 16.16 nM, respectively, to strongly bind to thrombin. The analysis data for this is presented in FIG. 3
<110> Daegu-Gyeongbuk Medical Innovation Foundation <120> Method of aptamer screening through primer region masking and NGS analysis of each round DNA pool <130> P210226 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer s-10-1 <400> 1 gagggccgga gtctcggggt tggggaggtt tttggacgag 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer s-10-2 <400> 2 acacgaggag taggttgggt agggtggtcg tatcgtgctg 40 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer s-10-3 <400> 3 gtgtcgggtg cgataggatg ggtagggtgg ttaagccccg 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer s-10-4 <400> 4 cagggcgagt tgcacgcatg gtaggaatgg gtagggtggt 40 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer s-10-5 <400> 5 agtgggaagt tcctaggatg ggtagggtgg tggtacttct 40 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer s-9-1 <400> 6 cgcaggggct aggatgggta gggtggtgcc ccgaggctgt 40 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer s-9-2 <400> 7 acggctaggt tgggtagggt ggtgccggga gcgtgggtat 40 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer s-9-3 <400> 8 gagcgagcgg taggatgggt agggtggtcc gctcaggccg 40 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer s-7-1 <400> 9 ggggcgaagc gaaatggatg tcatggttgg gaagggcgag 40 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer s-7-2 <400> 10 gcattcgaag gatggtcggg tgggcagaat gcgggcggtt 40 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer s-7-3 <400> 11 tggggaactt gggtaggatg ggtagggtgg tgccaagaaa 40 <110> Daegu-Gyeongbuk Medical Innovation Foundation <120> Method of aptamer screening through primer region masking and NGS analysis of each round DNA pool <130> P210226 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer s-10-1 <400> 1 gagggccgga gtctcggggt tggggaggtt tttggacgag 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer s-10-2 <400> 2 acacgaggag taggttgggt agggtggtcg tatcgtgctg 40 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer s-10-3 <400> 3 gtgtcgggtg cgataggatg ggtagggtgg ttaagccccg 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer s-10-4 <400> 4 cagggcgagt tgcacgcatg gtaggaatgg gtagggtggt 40 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer s-10-5 <400> 5 agtgggaagt tcctaggatg ggtagggtgg tggtacttct 40 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer s-9-1 <400> 6 cgcaggggct aggatgggta gggtggtgcc ccgaggctgt 40 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer s-9-2 <400> 7 acggctaggt tgggtagggt ggtgccggga gcgtgggtat 40 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer s-9-3 <400> 8 gagcgagcgg taggatgggt agggtggtcc gctcaggccg 40 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer s-7-1 <400> 9 ggggcgaagc gaaatggatg tcatggttgg gaagggcgag 40 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer s-7-2 <400> 10 gcattcgaag gatggtcggg tgggcagaat gcgggcggtt 40 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer s-7-3 <400> 11 tggggaactt gggtaggatg ggtagggtgg tgccaagaaa 40
Claims (9)
In the DNA aptamer screening method comprising the step of inducing binding of a target substance to a single-stranded DNA pool having primer regions at both ends, the primer region is masked by an agent capable of binding thereto Phosphorus, DNA aptamer screening method.
According to claim 1, wherein the agent capable of binding to the primer region is an oligonucleotide, an aptamer, a peptide or a compound, DNA aptamer screening method.
The DNA aptamer screening method according to claim 1, wherein the single-stranded DNA has 30 to 50 arbitrary bases within the primer region at both ends.
The method of claim 1, wherein the target material is thrombin.
b) 표적물질과 결합하지 않은 단일가닥 DNA를 제거하는 단계;
c) 표적물질과 결합한 단일가닥 DNA를 증폭하는 단계;
d) 상기 c)단계에서 얻어진 DNA에 대하여 차세대 염기서열 분석법(next generation sequencing, NGS)을 수행하여 앱타머를 선별하는 단계를 더 포함하는 것인, DNA 앱타머 스크리닝 방법.
The method of claim 1, wherein after a) inducing binding of the DNA pool to the target material
b) removing single-stranded DNA not bound to the target material;
c) amplifying single-stranded DNA bound to a target material;
d) performing next generation sequencing (NGS) on the DNA obtained in step c) to further include the step of selecting an aptamer, DNA aptamer screening method.
The DNA aptamer screening method according to claim 5, wherein steps a) to d) are repeated 6 to 20 times.
Represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10, an aptamer that specifically binds to thrombin.
A composition for detecting thrombin comprising the aptamer of claim 7.
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