JP5495088B2 - PQQGDH controlled aptamer and its use - Google Patents
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Description
本発明は、ピロロキノリンキノングルコースデヒドロゲナーゼに結合してその酵素活性を変化させることができるアプタマー分子及びその用途に関する。 The present invention relates to an aptamer molecule that can bind to pyrroloquinoline quinone glucose dehydrogenase and change its enzymatic activity, and uses thereof.
様々な疾病の早期診断・早期治療を行う上で、疾病マーカーとなるペプチドや蛋白質の検出は極めて重要である。現在、最も一般的にこのような疾病マーカーを検出する技術として用いられているのが、抗体を利用したＥＬＩＳＡ（Enzyme Linked Immunosorbent Assay）である。この方法では、標的分子に結合する抗体を担体上に固定化し、標的分子と標的分子の異なる箇所に結合する二つ目の抗体を添加して担体固定化抗体にトラップさせる検出方法である。トラップされなかった抗体の分離操作は必要であるが、比較的高感度、簡便に検出することが可能な系である。 In early diagnosis and treatment of various diseases, detection of peptides and proteins serving as disease markers is extremely important. Currently, ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) using an antibody is most commonly used as a technique for detecting such a disease marker. This method is a detection method in which an antibody that binds to a target molecule is immobilized on a carrier, and a second antibody that binds to a different portion of the target molecule and the target molecule is added and trapped on the carrier-immobilized antibody. Although it is necessary to separate the antibody that has not been trapped, it is a system that can be detected easily with relatively high sensitivity.
しかしながら、ELISAには次のような問題点がある。まず、一点目として、抗体は標的と結合した際に信号発信を行わないので、標的分子の異なる箇所に結合する二種類の抗体が必要となる点である。一つの標的分子の異なる箇所に結合する二種類の抗体を作製することは難しく、また抗体はそもそも作製に時間と労力がかかり、値段も高価である。二点目としては、一つの抗体に酵素などの分子を修飾することで信号発信を行うので、標的分子に結合しなかった抗体を除去する、Ｂ／Ｆ分離の操作が必須な点である。 However, ELISA has the following problems. First, since the antibody does not emit a signal when bound to the target, two types of antibodies that bind to different portions of the target molecule are required. It is difficult to produce two types of antibodies that bind to different parts of a single target molecule, and antibodies are time-consuming and laborious to produce, and are expensive. Secondly, since signal transmission is performed by modifying one antibody with a molecule such as an enzyme, an operation of B / F separation that removes the antibody that has not bound to the target molecule is essential.
疾病を早期治療するためには、早期診断が必須であり、その為には採取した血液をその場で測定することが可能な簡便・迅速な検出システムが求められる。しかし、ELISAでは分離操作が必要であるため、その分時間がかかり、迅速な系とは言えない。 In order to treat diseases early, early diagnosis is essential. For this purpose, a simple and rapid detection system capable of measuring collected blood on the spot is required. However, since ELISA requires a separation operation, it takes time and cannot be said to be a rapid system.
一方、任意の分子と特異的に結合するオリゴヌクレオチドであるアプタマーが知られている。アプタマーは、市販の核酸合成機を用いて化学的に全合成できるので、特異抗体に比べてはるかに安価であり、修飾が容易であるため、センシング素子としての応用が期待されている。所望の標的分子と特異的に結合するアプタマーは、SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment)と呼ばれる方法により作出可能である(非特許文献１)。この方法では、標的分子を担体に固定化し、これに膨大な種類のランダムな塩基配列を有する核酸から成る核酸ライブラリを添加し、標的分子に結合する核酸を回収し、これをPCRにより増幅して再び標的分子を固定化した担体に添加する。この工程を１０回程度繰り返すことにより、標的分子に対して結合力の高いアプタマーを濃縮し、その塩基配列を決定して、標的分子を認識するアプタマーを取得する。なお、上記核酸ライブラリーは、核酸の自動化学合成装置により、ランダムにヌクレオチドを結合していくことにより容易に調製可能である。このように、ランダムな塩基配列を有する核酸ライブラリーを用いた、偶然を積極的に利用する方法により、任意の標的物質と特異的に結合するアプタマーを作出できる。 On the other hand, aptamers that are oligonucleotides that specifically bind to arbitrary molecules are known. Since aptamers can be chemically synthesized using a commercially available nucleic acid synthesizer, they are much cheaper than specific antibodies and can be easily modified. Therefore, aptamers are expected to be applied as sensing elements. Aptamers that specifically bind to a desired target molecule can be produced by a method called SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment) (Non-patent Document 1). In this method, a target molecule is immobilized on a carrier, a nucleic acid library consisting of nucleic acids having a large number of random base sequences is added to the target molecule, nucleic acids that bind to the target molecule are recovered, and this is amplified by PCR. Again, the target molecule is added to the immobilized carrier. By repeating this step about 10 times, aptamers having high binding power to the target molecule are concentrated, the base sequence thereof is determined, and the aptamer that recognizes the target molecule is obtained. The nucleic acid library can be easily prepared by binding nucleotides at random using an automatic nucleic acid synthesizer. Thus, an aptamer that specifically binds to an arbitrary target substance can be produced by a method that actively uses chance by using a nucleic acid library having a random base sequence.
本願発明者らは、Ｂ／Ｆ分離の操作が不要な疾病マーカー検出技術として、特定の分子の検出を行う際に、その分子を認識するアプタマーと酵素制御アプタマー(酵素活性に変化を及ぼすアプタマー)を連結することで、アプタマーを酵素のサブユニットとして用いたセンシング技術であるＡＥＳ（Aptameric Enzyme Subunit)を構築している（特許文献１）。検出原理は、特定の分子が存在した場合、その分子に対するアプタマーが結合すると、連結されている酵素制御アプタマーの構造に影響を及ぼし、その結果酵素活性に変化が生じるので、その変化を測定するというものである。この検出法の利点として、ＥＬＩＳＡによる検出と異なり、標的分子の結合を直接、酵素活性のシグナルとして検出するため、Ｂ／Ｆ分離を必要としない、迅速で簡便な検出が可能である点があげられる。また、一度、酵素活性を阻害するアプタマーを獲得してしまえば、検出したい標的分子に結合するアプタマーは１種類でよく、様々な標的分子の検出に用いることも可能である。さらに、アプタマーは抗体に比べ、作成が簡単で安価である。 As a disease marker detection technique that does not require a B / F separation operation, the inventors of the present application recognize an aptamer that recognizes a molecule and an enzyme-controlled aptamer (an aptamer that changes enzyme activity) when detecting a specific molecule. As a result, AES (Aptameric Enzyme Subunit), which is a sensing technique using an aptamer as an enzyme subunit, is constructed (Patent Document 1). The detection principle is that when a specific molecule is present, the binding of an aptamer to that molecule affects the structure of the linked enzyme-controlled aptamer, resulting in a change in enzyme activity, so that the change is measured. Is. The advantage of this detection method is that, unlike the detection by ELISA, the binding of the target molecule is directly detected as a signal of the enzyme activity, so that rapid and simple detection without requiring B / F separation is possible. It is done. Further, once an aptamer that inhibits enzyme activity is obtained, only one type of aptamer binds to the target molecule to be detected, and it can be used for detection of various target molecules. Furthermore, aptamers are easier to make and less expensive than antibodies.
ただし、特許文献１に記載のＡＥＳは、分子認識アプタマーとしてアデノシンアプタマーを、酵素制御アプタマーとしてトロンビンアプタマーを用いたものであって、アデノシンをフィブリン凝固時間の変化により検出するものである。かかる検出方法は、測定に比較的時間がかかるため迅速性に欠けるという欠点がある。 However, AES described in Patent Document 1 uses an adenosine aptamer as a molecular recognition aptamer and a thrombin aptamer as an enzyme-controlled aptamer, and detects adenosine by a change in fibrin clotting time. Such a detection method has a drawback in that it takes a relatively long time for measurement and thus lacks rapidity.
ピロロキノリンキノングルコースデヒドロゲナーゼ(ＰＱＱＧＤＨ)は、溶存酸素の影響を受けず、高い触媒活性を示すことから、市販の血糖値測定用グルコースセンサーに使用されている酵素である。本酵素の利点は、一点目として、およそ５０００Ｕ／ｍｇと高い触媒活性を有するためシグナル増幅が期待できる点、二点目として、血糖値測定に用いられているグルコースセンサーのセンシングシステムを適用できる点である。このような利点より、既存の酵素の中ではセンシング素子として非常に有効な酵素であると考えられる。ＡＥＳにＰＱＱＧＤＨを利用することができれば、さらに迅速な検出方法を提供することができる。 Since pyrroloquinoline quinone glucose dehydrogenase (PQQGDH) is not affected by dissolved oxygen and exhibits high catalytic activity, it is an enzyme used in a glucose sensor for measuring a blood glucose level. The advantage of this enzyme is that it has a high catalytic activity of about 5000 U / mg as the first point, and signal amplification can be expected, and the second point is that the glucose sensor sensing system used for blood glucose level measurement can be applied. It is. From these advantages, it is considered that the existing enzyme is a very effective enzyme as a sensing element. If PQQGDH can be used for AES, a more rapid detection method can be provided.
しかしながら、アプタマーの創製方法は、上記した通り偶然を積極的に利用する方法であるので、標的物質に対して高い結合能を有するアプタマーが得られるかどうかは、実際に膨大な実験を行なってみなければわからない。特に、ＡＥＳを構築する場合、酵素制御アプタマーとしては、センシング素子として利用する酵素との結合能を有し、かつ、分子認識アプタマーと対象分子との結合により、酵素活性に変化を生じさせることのできるアプタマーを創製しなければならないため、ＡＥＳの酵素制御アプタマーに利用し得るアプタマーを取得することは非常に困難である。 However, since the aptamer creation method is a method that actively uses chance as described above, whether or not an aptamer having a high binding ability to a target substance can be obtained by actually conducting an enormous experiment. I don't know without it. In particular, when constructing AES, the enzyme-controlled aptamer has a binding ability to an enzyme used as a sensing element, and causes a change in enzyme activity due to the binding between a molecule recognition aptamer and a target molecule. Since it is necessary to create an aptamer that can be used, it is very difficult to obtain an aptamer that can be used as an AES enzyme-controlled aptamer.
従って、本発明の目的は、Ｂ／Ｆ分離の操作をすることなく、疾病マーカーを簡便・迅速・高感度に検出するための手段を提供することにある。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a means for detecting a disease marker simply, rapidly, and with high sensitivity without performing a B / F separation operation.
本願発明者らは、ＰＱＱＧＤＨに結合し、その活性に影響を及ぼすアプタマーの探索をするに当たり、ランダムライブラリーからのアプタマーのスクリーニング工程において、(1)ＰＱＱＧＤＨ固定化担体として負に帯電している磁性ビーズを用いる手法、(2)担体としてニトロセルロース膜を用い、ＰＱＱＧＤＨと共に腫瘍マーカータンパク質を担体に固定化して競合させる手法の２種類の探索方法を用いて、ＰＱＱＧＤＨに対するアプタマーの探索を行うことにより、ＰＱＱＧＤＨへの高い結合能を有するアプタマーを取得し、さらに、該アプタマーの中から、ＰＱＱＧＤＨの活性を上昇又は阻害することができるアプタマーを見出し、本願発明を完成した。 In searching for an aptamer that binds to PQQGDH and affects its activity, the inventors of the present application (1) in the aptamer screening process from a random library, (1) a negatively charged magnet as a PQQGDH immobilization carrier By searching for aptamers to PQQGDH using two types of search methods: a technique using beads, (2) a nitrocellulose membrane as a support, and a technique in which a tumor marker protein is immobilized on a support together with PQQGDH, Aptamers having a high binding ability to PQQGDH were obtained, and aptamers capable of increasing or inhibiting the activity of PQQGDH were found from the aptamers, and the present invention was completed.
すなわち、本発明は、以下の(a)ないし(c)のいずれかの塩基配列から成るアプタマー分子であって、ピロロキノリンキノングルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱＧＤＨ）に結合し、ＰＱＱＧＤＨの酵素活性を上昇させる能力を有するアプタマー分子を提供する； (a)配列表の配列番号２、３及び２９のいずれかに示される塩基配列、(b) (a)の塩基配列のうち１ないし数個の塩基が置換し、欠失し及び／又は挿入された塩基配列であって、その二次構造においてステム部及びループ部の位置関係及びサイズが配列番号２、３及び２９のいずれかに示される塩基配列と等しい塩基配列、(c) (a)又は(b)の塩基配列を部分配列として含む塩基配列であって、その二次構造においてステム部及びループ部の位置関係及びサイズが配列番号２、３及び２９のいずれかに示される塩基配列と等しい塩基配列。また、本発明は、配列番号２、３、１１、１２、１６、１８、２０、２４及び２９のいずれかに示される塩基配列から成りＰＱＱＧＤＨに結合する能力を有するアプタマー分子から選択される同一又は異なる２つのアプタマー分子が２つ連結された構造を有するアプタマー分子であって、ＰＱＱＧＤＨに結合し、ＰＱＱＧＤＨの酵素活性を上昇させる能力を有するアプタマー分子を提供する。さらに、本発明は、上記本発明のアプタマー分子の二次構造に基づいて構成される酵素制御アプタマー部位と、標的物質を認識して結合する認識アプタマー部位とを含むポリヌクレオチドであって、標的物質の前記認識アプタマー部位への結合により、前記酵素制御アプタマー部位がＰＱＱＧＤＨの酵素活性を上昇させる能力が低下するポリヌクレオチドであって、上記本発明のアプタマー分子のループ構造内のいずれかの部位で分断して得られる断片をそれぞれ含む２分子のポリヌクレオチド鎖から成り、一方のポリヌクレオチド鎖の分断側末端には前記認識アプタマー部位を形成する認識アプタマー分子がリンカーを介して又は介さずに連結され、他方のポリヌクレオチド鎖の分断側末端には該認識アプタマー分子中の少なくとも一部と相補的な領域がリンカーを介して又は介さずに連結され、２分子のポリヌクレオチド鎖の分子内及び／又は分子間ハイブリダイゼーションにより酵素制御アプタマー部位の二次構造が形成されるポリヌクレオチドを提供する。さらに、本発明は、上記本発明のポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドの前記酵素制御アプタマー部位に結合したＰＱＱＧＤＨとを含む測定試薬を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の測定試薬を、標的物質を含み得る検体と接触させ、次いで、前記酵素制御アプタマー部位に結合した前記ＰＱＱＧＤＨの酵素活性を測定し、該酵素活性を指標として検体中の標的物質を測定することを含む、標的物質の測定方法を提供する。 That is, the present invention is an aptamer molecule having any one of the following base sequences (a) to (c), which has the ability to bind to pyrroloquinoline quinone glucose dehydrogenase (PQQGDH) and increase the enzymatic activity of PQQGDH. (A) a base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 2, 3 and 29 in the sequence listing, (b) one to several bases of the base sequence of (a) are substituted, A deleted and / or inserted nucleotide sequence , wherein the positional relationship and size of the stem part and loop part in the secondary structure is equal to the nucleotide sequence shown in any of SEQ ID NOs: 2, 3 and 29 , (c) (a) or the nucleotide sequence of (b) a nucleotide sequence comprising a partial sequence, positional relationship and size of the stem portion and the loop portion in its secondary structure SEQ ID NO: 2, 3, and 29 Neu Z A base sequence that is equal to the base sequence shown in it . Further, the present invention is the same or selected from aptamer molecules having the ability to bind to PQQGDH comprising the base sequence shown in any of SEQ ID NOs: 2, 3, 11, 12, 16, 18, 20, 24 and 29. Provided is an aptamer molecule having a structure in which two different aptamer molecules are linked, and has the ability to bind to PQQGDH and increase the enzymatic activity of PQQGDH. Furthermore, the present invention is a polynucleotide comprising an enzyme-controlled aptamer site constituted based on the secondary structure of the aptamer molecule of the present invention, and a recognition aptamer site that recognizes and binds to a target substance, the target substance Is a polynucleotide in which the ability of the enzyme-regulated aptamer site to increase the enzyme activity of PQQGDH is reduced by binding to the recognition aptamer site, and is divided at any site in the loop structure of the aptamer molecule of the present invention. A recognition aptamer molecule that forms the recognition aptamer site is linked to the split end of one polynucleotide chain through or without a linker. At the fragmented side end of the other polynucleotide chain, at least a part of the recognition aptamer molecule and Complementary specific regions are connected not through or via a linker, to provide polynucleotides that secondary structure of the enzyme control aptamer sites are formed by hybridization between two molecules of polynucleotide strands intramolecular and / or intermolecular . Furthermore, the present invention provides a measurement reagent comprising the polynucleotide of the present invention and PQQGDH bound to the enzyme-regulated aptamer site of the polynucleotide. Furthermore, the present invention is a method in which the measurement reagent of the present invention is brought into contact with a sample that may contain a target substance, and then the enzyme activity of the PQQGDH bound to the enzyme-controlled aptamer site is measured, and the sample is used with the enzyme activity as an index. A method for measuring a target substance comprising measuring a target substance therein is provided.
本発明により、ＰＱＱＧＤＨへの高い結合能を有し、且つ、ＰＱＱＧＤＨの酵素活性を上昇させることができるアプタマーが初めて提供された。さらに、該アプタマー構造を利用した標的物質測定システムも構築された。本発明のアプタマーと、疾病マーカー等の所望の標的物質を認識する他のアプタマーとを組み合わせれば、ＰＱＱＧＤＨの高い触媒活性を利用して、高感度に標的物質を測定するシステムを構築することができる。アプタマーはDNA合成機を用いて化学的に合成することができるため、抗体に比べると作製に労力がかからず、費用も安価であり、測定キットそのものの価格を下げることが可能である。迅速・簡便・安価に疾病マーカーの検出を行うことができる本検出システムは、疾病の早期診断への極めて大きな貢献が期待できる。また、ＰＱＱＧＤＨは市販のグルコースセンサーにも使用されている酵素であり、これらのグルコースセンサーの検出システムをそのまま応用することが可能であるから、実用化の面でも極めて有利である。 According to the present invention, an aptamer having a high binding ability to PQQGDH and capable of increasing the enzyme activity of PQQGDH is provided for the first time. Furthermore, a target substance measurement system using the aptamer structure was also constructed. By combining the aptamer of the present invention with another aptamer that recognizes a desired target substance such as a disease marker, it is possible to construct a system for measuring the target substance with high sensitivity using the high catalytic activity of PQQGDH. it can. Since aptamers can be chemically synthesized using a DNA synthesizer, they require less labor and are less expensive than antibodies and can reduce the price of the measurement kit itself. This detection system that can detect a disease marker quickly, simply, and inexpensively can be expected to contribute greatly to early diagnosis of a disease. Further, PQQGDH is an enzyme that is also used in commercially available glucose sensors, and these glucose sensor detection systems can be applied as they are, which is extremely advantageous in terms of practical use.
本発明のアプタマー分子は、ＰＱＱＧＤＨに結合し、その酵素活性を上昇させる能力を有するアプタマー分子である。該アプタマー分子は、一本鎖のポリヌクレオチドから成るものであり、下記いずれかの塩基配列から成る。
(a) 配列表の配列番号２、３及び２９のいずれかに示される塩基配列。
(b) (a)の塩基配列のうち１ないし数個の塩基が置換し、欠失し及び／又は挿入された塩基配列であって、その二次構造においてステム部及びループ部の位置関係及びサイズが配列番号２、３及び２９のいずれかに示される塩基配列と等しい塩基配列。
(c) (a)又は(b)の塩基配列を部分配列として含む塩基配列であって、その二次構造においてステム部及びループ部の位置関係及びサイズが配列番号２、３及び２９のいずれかに示される塩基配列と等しい塩基配列。
The aptamer molecule of the present invention is an aptamer molecule that has the ability to bind to PQQGDH and increase its enzyme activity. The aptamer molecule consists of a single-stranded polynucleotide, and consists of one of the following base sequences.
(a) The base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 2, 3 and 29 in the sequence listing.
(b) A base sequence in which one to several bases are substituted, deleted and / or inserted in the base sequence of (a), wherein the positional relationship between the stem part and the loop part in the secondary structure and A base sequence whose size is equal to the base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 2, 3, and 29 .
(c) A base sequence comprising the base sequence of (a) or (b) as a partial sequence, wherein the positional relationship and size of the stem part and loop part in the secondary structure is any one of SEQ ID NOs: 2, 3 and 29 A base sequence equal to the base sequence shown in .
ポリヌクレオチドは、DNAでもＲＮＡでもよく、またＰＮＡ等の人工核酸でもよいが、安定性の観点からDNAが好ましい。 The polynucleotide may be DNA or RNA, or may be an artificial nucleic acid such as PNA, but DNA is preferred from the viewpoint of stability.
「酵素活性を上昇させる」とは、本発明のアプタマー分子が結合していない状態のＰＱＱＧＤＨと比較して、ＰＱＱＧＤＨの酵素活性が上昇することをいう。以下、本明細書において、このような酵素活性を上昇させる能力のことを「酵素制御能」といい、酵素制御能を有するアプタマーを「酵素制御アプタマー」という。 The "make increased enzymatic activity", as compared with the PQQGDH of state aptamer molecules are not bound to the present invention, it means that the enzyme activity of PQQGDH is increased. Hereinafter, in the present specification, such ability to increase enzyme activity is referred to as “enzyme control ability”, and an aptamer having enzyme control ability is referred to as “enzyme control aptamer”.
本発明のアプタマーの結合能は、ＰＱＱＧＤＨへの結合能がある限り、ＰＱＱＧＤＨ以外の他のタンパク質にも結合し得るものであってよいが、ＰＱＱＧＤＨへの特異性及び親和性が高く、他のタンパク質への結合が全くないかあるとしても相対的に無視できるほど少量しか結合しないことが好ましい。 The aptamer of the present invention may bind to other proteins other than PQQGDH as long as it has the ability to bind to PQQGDH, but has high specificity and affinity for PQQGDH, and other proteins It is preferred that there is only a relatively small amount of binding, even if there is no or no binding.
配列表の配列番号２〜３３にそれぞれ示される塩基配列は、下記実施例に記載される30merのランダム領域を含むssDNAライブラリー（配列番号１）のスクリーニングにより、ＰＱＱＧＤＨ制御アプタマーの候補として取得されたssDNAの塩基配列である。これらのうち、配列番号２、３及び２９は、ＰＱＱＧＤＨへの結合能を有し、かつ、ＰＱＱＧＤＨの酵素活性を上昇させる能力を有するアプタマー（それぞれMag1、Mag2及びPGa9）の塩基配列である（実施例１−４及び２−６参照）。これらのアプタマーが所定の条件下（フォールディング条件下）で形成する二次構造は、コンピューターを用いた常法により容易に決定することができる。最近接塩基対法を用いた周知の核酸構造予測プログラムであるm-fold（商品名、Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-15, (2003)、The Bioinformatics Center at Rensselaer and Wadsworth のウェブサイトからダウンロード可能）を用いて決定した、Mag1、Mag2及びPGa9の二次構造を、それぞれ図５及び図８(C)中に示す。なお、「フォールディング条件」とは、１分子のアプタマーの一部の領域同士が分子内で塩基対合して二本鎖から成るステム部を形成する条件であり、公知の通常のアプタマーの使用条件でもある。通常、室温下で、所定の塩濃度を有し、カルシウムキレート剤、さらに所望により界面活性剤を含む水系緩衝液中である。例えば、下記実施例で採用した、10mM MOPS及び1mM CaCl2を含む水溶液や、20mM Tris-HCl及び150mM NaClを含む水溶液中で、室温下にてフォールディングを行なうことができる。なお、本明細書において、「フォールディングする」という語は、アプタマー分子の分子内における塩基対合によりステム部を形成することのみならず、複数のポリヌクレオチド分子の分子間における塩基対合も包含する意味で用いる。 The nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 33 in the sequence listing were obtained as PQQGDH-regulated aptamer candidates by screening an ssDNA library (SEQ ID NO: 1) containing a 30-mer random region described in the Examples below. This is the base sequence of ssDNA. Among these, SEQ ID NOs: 2, 3 and 29 are base sequences of aptamers (Mag1, Mag2 and PGa9, respectively) having the ability to bind to PQQGDH and the ability to increase the enzyme activity of PQQGDH (respectively). See Examples 1-4 and 2-6). The secondary structure formed by these aptamers under predetermined conditions (folding conditions) can be easily determined by a conventional method using a computer. M-fold (trade name, Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-15, (2003), The Bioinformatics Center at Rensselaer and Wadsworth website) The secondary structures of Mag1, Mag2 and PGa9 determined using the above-mentioned data are shown in FIGS. 5 and 8C, respectively. The “folding conditions” are conditions under which partial regions of one molecule of aptamer form base pairs in the molecule to form a double-stranded stem part. Conditions for using known normal aptamers But there is. Usually, it is in an aqueous buffer solution having a predetermined salt concentration at room temperature and containing a calcium chelating agent and optionally a surfactant. For example, folding can be performed at room temperature in an aqueous solution containing 10 mM MOPS and 1 mM CaCl 2 or an aqueous solution containing 20 mM Tris-HCl and 150 mM NaCl, which is employed in the following examples. In the present specification, the term “folding” includes not only the formation of a stem part by base pairing within an aptamer molecule, but also base pairing between molecules of a plurality of polynucleotide molecules. Used in meaning.
酵素制御アプタマーは、その二次構造においてステム部及びループ部の位置関係及びサイズが等しいものであれば、同様のアプタマー活性（結合能及び酵素制御能）を発揮し得る。例えば、末端から少数の塩基を欠失させても、もとのアプタマー活性を維持し得る。ステム部を形成する塩基については、対合する塩基の位置を相互に入れ替えた塩基配列としてもよいし、また、対合する塩基対を例えばa-t対からg-c対に置き換えてもよい。具体的には、例えば、配列番号２９に示す塩基配列から成るアプタマーPGa9では、4ntのcと20ntのgが対合してステム部を構成するが、4ntをgとして20ntをcにしてもよいし、また、4ntと20ntのg-c対をa-t対に変えてもよい。また、ループ部を形成する塩基については、その位置に同じサイズのループが形成される限り、他の塩基配列を採用してもよい。また、下記実施例にもある通り、標的タンパク質との結合に重要ではないループ構造であれば、該ループ構造内に任意の塩基配列を付加させても、アプタマー活性を維持できる。下記実施例では、アプタマーをループ部で分断し、互いに相補な塩基配列をその分断部位に連結させているが、このような分割アプタマーでもアプタマー活性が維持されているため、互いに相補な領域を持つ塩基配列をループ構造内に挿入させた場合であっても、同様にアプタマー活性が維持されると考えられる。従って、配列番号２、３及び２９の塩基配列のうち、１ないし数個（好ましくは１又は２個）の塩基が上記に例示したように置換し、欠失し及び／又は挿入された塩基配列から成るアプタマーも、もとの塩基配列から成るアプタマーと同様のアプタマー活性を有し得るので、本発明の範囲に包含される。 An enzyme-controlled aptamer can exhibit the same aptamer activity (binding ability and enzyme-controlling ability) as long as the positional relationship and size of the stem part and loop part are equal in its secondary structure. For example, even when a small number of bases are deleted from the terminal, the original aptamer activity can be maintained. The base forming the stem part may have a base sequence in which the positions of the bases to be paired with each other are replaced with each other, or the base pair to be paired may be replaced with, for example, an at-t pair to a g-c pair. Specifically, for example, in aptamer PGa9 consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 29, 4 nt c and 20 nt g are paired to form a stem part, but 4 nt may be g and 20 nt may be c. Alternatively, the 4nt and 20nt gc pairs may be changed to at pairs. As for the base forming the loop part, other base sequences may be adopted as long as a loop of the same size is formed at that position. In addition, as described in the following examples, if a loop structure is not important for binding to a target protein, aptamer activity can be maintained even if an arbitrary base sequence is added to the loop structure. In the following examples, aptamers are divided at the loop portion, and base sequences complementary to each other are linked to the fragmentation sites. However, since such aptamers also maintain aptamer activity, they have mutually complementary regions. Even when the base sequence is inserted into the loop structure, it is considered that the aptamer activity is similarly maintained. Accordingly, among the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 2, 3 and 29, 1 to several (preferably 1 or 2) nucleotides are substituted, deleted and / or inserted as exemplified above. Since aptamers consisting of can have the same aptamer activity as aptamers consisting of the original base sequence, they are also included in the scope of the present invention.
また、アプタマーの一端又は両端に任意の塩基配列を付加させても、アプタマー領域においてステム部及びループ部の位置関係及びサイズが等しい限り、同様のアプタマー活性を有し得る。従って、配列番号２、３又は２９の塩基配列を部分配列として含む塩基配列から成るアプタマーも、本発明の範囲に包含される。任意の付加配列のサイズは特に限定されないが、あまりに長いとアプタマー合成の手間とコストがかかる。従って、付加配列のサイズは、通常、合計で40塩基程度以下、好ましくは10塩基程度以下、より好ましくは１〜２塩基程度である。ただし、付加配列が他のアプタマー配列である場合にはこの限りではなく、付加されるアプタマー配列の鎖長に応じてサイズが定まる。 Moreover, even if an arbitrary base sequence is added to one end or both ends of the aptamer, the aptamer region can have the same aptamer activity as long as the positional relationship and size of the stem portion and the loop portion are equal in the aptamer region. Therefore, aptamers composed of a base sequence containing the base sequence of SEQ ID NO: 2, 3 or 29 as a partial sequence are also included in the scope of the present invention. The size of any additional sequence is not particularly limited, but if it is too long, it takes time and cost for aptamer synthesis. Therefore, the size of the additional sequence is generally about 40 bases or less in total, preferably about 10 bases or less, more preferably about 1 to 2 bases. However, this is not the case when the additional sequence is another aptamer sequence, and the size is determined according to the chain length of the added aptamer sequence.
なお、本発明において、「Ｘnt」（Ｘは数字）は、その配列における、5'末端からＸ番目の塩基を示す。また、「mer」はヌクレオチド数を示す。 In the present invention, “Xnt” (X is a number) represents the Xth base from the 5 ′ end in the sequence. “Mer” indicates the number of nucleotides.
また、本発明は、配列番号２、３、１１、１２、１６、１８、２０、２４及び２９のいずれかに示される塩基配列から成りＰＱＱＧＤＨに結合する能力を有するアプタマー分子（以下「モノマーアプタマー」ということがある）から選択される同一又は異なる２つのアプタマー分子が２つ連結された構造を有するアプタマー分子であって、ＰＱＱＧＤＨに結合し、ＰＱＱＧＤＨの酵素活性を上昇させる能力を有するアプタマー分子（以下「ダイマーアプタマー」ということがある）を提供する。ＰＱＱＧＤＨはダイマー構造の酵素であるため、上記モノマーアプタマーの結合部位はＰＱＱＧＤＨ分子上に２箇所存在する。従って、アプタマーをダイマー化することにより、アプタマー１分子でＰＱＱＧＤＨ分子上の２箇所の結合部位に結合することができるようになるため、モノマーアプタマーよりも結合能を高めることができ、ひいては、モノマー状態では発揮できなかった酵素制御能を発揮させることができるようになる。例えば、下記実施例に具体的に記載される通り、モノマーアプタマーPGa4（配列番号２４）はスクリーニング前のランダムライブラリーと同程度の酵素活性上昇作用を示すのみで、ＰＱＱＧＤＨに対する酵素制御能は有さないといえるが、これをダイマー化することにより（D-PGa4、配列番号３４、図８(C)）、結合能が高まり、ＰＱＱＧＤＨの酵素活性を半分程度にまで低下させることができるようになる（下記実施例２−５及び２−６）。 The present invention also relates to an aptamer molecule (hereinafter referred to as “monomer aptamer”) having the ability to bind to PQQGDH, which comprises the base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 2, 3, 11, 12, 16, 18, 20, 24 and 29. An aptamer molecule having a structure in which two aptamer molecules selected from the same or different selected from the above are linked, and has the ability to bind to PQQGDH and increase the enzymatic activity of PQQGDH "Sometimes called" dimer aptamer "). Since PQQGDH is a dimer-type enzyme, there are two binding sites for the monomer aptamer on the PQQGDH molecule. Therefore, by dimerizing the aptamer, one aptamer molecule can bind to two binding sites on the PQQGDH molecule, so that the binding ability can be increased more than that of the monomer aptamer. The ability to control the enzyme that could not be demonstrated can be exhibited. For example, as specifically described in the Examples below, the monomer aptamer PGa4 (SEQ ID NO: 24) only exhibits an enzyme activity increasing effect comparable to that of a random library before screening, and has no enzyme control ability for PQQGDH. However, by dimerizing this (D-PGa4, SEQ ID NO: 34, FIG. 8 (C)), the binding ability increases and the enzyme activity of PQQGDH can be reduced to about half. (Examples 2-5 and 2-6 below).
連結するモノマーアプタマーは同一でも異なっていてもよい。モノマーアプタマーがＰＱＱＧＤＨの酵素活性を上昇させるものである場合には、かかるモノマーをダイマー化することにより、酵素活性を上昇させる割合がさらに高まると考えられる。連結する際には、必要に応じアデニン又はチミンのいずれかのみから成るリンカーを介して連結することができる。すなわち、5'上流側のモノマーアプタマーの3'末端領域及び／又は3'下流側のモノマーアプタマーの5'末端領域にステムループ構造が存在する場合には、直接連結させるとステムループ構造が望ましく形成されないおそれがあるため、かかる場合にはリンカーを介して連結させることが好ましい。リンカーの鎖長は、ダイマーアプタマー中の各モノマー領域が所期の二次構造をとるために十分なだけのスペースを確保できる鎖長であればよく、特に限定されないが、通常は1mer〜20mer程度、好ましくは5mer〜15mer程度である。 The monomer aptamers to be linked may be the same or different. In the case where the monomer aptamer increases the enzyme activity of PQQGDH, it is considered that the ratio of increasing the enzyme activity is further increased by dimerizing the monomer. When linking, it can be linked via a linker consisting only of either adenine or thymine as necessary. That is, when a stem loop structure is present in the 3 ′ terminal region of the 5 ′ upstream monomer aptamer and / or the 5 ′ terminal region of the 3 ′ downstream monomer aptamer, the stem loop structure is desirably formed by direct linking. In such a case, it is preferable to connect them via a linker. The chain length of the linker is not particularly limited as long as the monomer region in the dimer aptamer can secure a sufficient space for the desired secondary structure to be taken. It is preferably about 5 mer to 15 mer.
本発明はまた、上記した本発明のＰＱＱＧＤＨ制御アプタマー分子の二次構造に基づいて構成される酵素制御アプタマー部位と、標的物質を認識して結合する認識アプタマー部位とを含むポリヌクレオチド（以下「酵素制御ポリヌクレオチド」と呼ぶ）を提供する。酵素制御ポリヌクレオチドは、１分子又は２分子のポリヌクレオチド鎖から成り（以下、1分子からなるものを「1分子性酵素制御ポリヌクレオチド」、2分子からなるものを「２分子性酵素制御ポリヌクレオチド」ということがある）、標的物質が認識アプタマー部位へ結合することにより、酵素制御アプタマー部位がＰＱＱＧＤＨの酵素活性を変化させる能力が変化することを特徴とする。酵素制御アプタマー部位が有する酵素活性を変化させる能力の変化は、該部位に結合したＰＱＱＧＤＨの活性の変化を調べることで知ることができる。酵素制御アプタマー部位に結合しているＰＱＱＧＤＨは、該部位の作用により、酵素活性が上昇又は低下した状態にあるが、この状態で、認識アプタマー部位に標的物質が結合すると、酵素活性がさらに変化する（すなわち、酵素制御アプタマー部位が有する「酵素活性を変化させる能力」が変化する）。通常は、酵素制御アプタマー部位に結合しているＰＱＱＧＤＨの酵素活性は、活性が上昇又は低下した状態から、もとの活性に戻る（すなわち、酵素制御アプタマー部位が有する「酵素活性を変化させる能力」が低下する）。この、酵素活性を変化させる能力の低下の原理は、例えば、図１１に示されるように、認識アプタマー部位への標的物質の結合により、酵素制御ポリヌクレオチドの立体構造が変化し、制御アプタマー部位からＰＱＱＧＤＨが離脱することによるものと考えられるが、これに限定されない。 The present invention also includes a polynucleotide (hereinafter referred to as “enzyme”) that includes an enzyme-controlled aptamer site constituted based on the secondary structure of the PQQGDH-controlled aptamer molecule of the present invention described above and a recognition aptamer site that recognizes and binds to a target substance. Referred to as “control polynucleotides”). Enzyme-controlled polynucleotides consist of one or two molecules of a polynucleotide chain (hereinafter referred to as “single-molecule enzyme-controlled polynucleotides” consisting of one molecule and “bi-molecular enzyme-controlled polynucleotides consisting of two molecules”). The ability of the enzyme-controlled aptamer site to change the enzyme activity of PQQGDH is changed by binding of the target substance to the recognition aptamer site. Changes in the ability of the enzyme-regulated aptamer site to change the enzyme activity can be determined by examining changes in the activity of PQQGDH bound to the site. PQQGDH bound to the enzyme-regulated aptamer site is in a state where the enzyme activity is increased or decreased due to the action of the site. In this state, when the target substance binds to the recognition aptamer site, the enzyme activity further changes. (That is, the “ability to change enzyme activity” of the enzyme-regulated aptamer site changes). Usually, the enzyme activity of PQQGDH bound to the enzyme-regulated aptamer site returns to the original activity from the state where the activity is increased or decreased (that is, the “ability to change enzyme activity” of the enzyme-regulated aptamer site) Decreases). For example, as shown in FIG. 11, the principle of the ability to change the enzyme activity is that the three-dimensional structure of the enzyme control polynucleotide changes due to the binding of the target substance to the recognition aptamer site. Although it is thought to be due to the separation of PQQGDH, it is not limited to this.
具体的には、例えば、酵素制御アプタマー部位がＰＱＱＧＤＨの酵素活性を上昇させる能力を有する場合、標的物質が認識アプタマー部位に結合することにより、通常、酵素活性を上昇させる能力が低下し、制御アプタマー部位に結合しているＰＱＱＧＤＨの酵素活性は、認識アプタマー部位への標的物質の結合により低下することになる。従って、上記本発明のポリヌクレオチドの酵素制御アプタマー部位にＰＱＱＧＤＨを結合させて調製した酵素−ポリヌクレオチド複合体を用いれば、ＰＱＱＧＤＨ活性の変化を指標として、検体中の標的物質の測定を行なうことができる。すなわち、本発明は、上記した本発明の酵素制御ポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドの酵素制御アプタマー部位に結合したＰＱＱＧＤＨとを含む標的物質測定試薬をも提供する。なお、本発明において、「測定」には検出、定量及び半定量が包含される。 Specifically, for example, when the enzyme-controlled aptamer site has the ability to increase the enzyme activity of PQQGDH, the ability to increase the enzyme activity usually decreases due to the binding of the target substance to the recognition aptamer site, and the control aptamer The enzyme activity of PQQGDH bound to the site is reduced by binding of the target substance to the recognition aptamer site. Therefore, when an enzyme-polynucleotide complex prepared by binding PQQGDH to the enzyme-controlled aptamer site of the polynucleotide of the present invention is used, the target substance in the sample can be measured using the change in PQQGDH activity as an index. it can. That is, the present invention also provides a reagent for measuring a target substance comprising the above-described enzyme-controlled polynucleotide of the present invention and PQQGDH bound to the enzyme-controlled aptamer site of the polynucleotide. In the present invention, “measurement” includes detection, quantification, and semi-quantification.
「アプタマー分子の二次構造に基づいて構成される」とは、上記酵素制御ポリヌクレオチド中で酵素制御アプタマー部位がとる二次構造が、１分子で構成される本発明のアプタマー分子がとる二次構造と近似するようにして構成されることをいう。従って、酵素制御アプタマー部位を構成する領域は、上記酵素制御ポリヌクレオチドを構成するポリヌクレオチド鎖中において、必ずしも連続する１つの領域として存在する必要はなく、１分子又は２分子のポリヌクレオチド鎖中に分断して存在するものであってもよい。分断して存在していても、ポリヌクレオチド鎖をフォールディング条件下でハイブリダイズさせ、分子内及び／又は分子間の適当な部位において塩基対を形成させることにより、それらの領域が組み合わされて、もとにしたアプタマー分子の二次構造と近似した二次構造を形成することが可能な限り、酵素制御アプタマー部位の構成態様として許容される。具体的には、例えば下記実施例に記載されるように、Mag2（配列番号３）の塩基配列を1nt〜31ntと32nt〜65ntの2つの領域に分断し、これらの断片を2分子のポリヌクレオチド鎖に分けて含ませた構成（配列番号３６及び３７）としてもよい。このように構成しても、酵素制御ポリヌクレオチド中で望ましく酵素制御能を発揮できる。 “Constructed based on the secondary structure of the aptamer molecule” means that the secondary structure taken by the enzyme-controlled aptamer site in the enzyme-controlled polynucleotide is the secondary taken by the aptamer molecule of the present invention consisting of one molecule. It is configured to approximate the structure. Therefore, the region constituting the enzyme-regulated aptamer site does not necessarily have to be present as one continuous region in the polynucleotide chain constituting the enzyme-regulated polynucleotide, but in one molecule or two molecules of the polynucleotide chain. It may be divided and present. Even if they are disrupted, the regions are combined by hybridizing the polynucleotide strands under folding conditions and forming base pairs at appropriate sites within and / or between the molecules. As long as it is possible to form a secondary structure approximate to the secondary structure of the aptamer molecule, it is allowed as a configuration aspect of the enzyme-controlled aptamer site. Specifically, for example, as described in the Examples below, the base sequence of Mag2 (SEQ ID NO: 3) is divided into two regions of 1nt to 31nt and 32nt to 65nt, and these fragments are divided into two molecules of polynucleotide. It is good also as a structure (sequence number 36 and 37) included by dividing into chains. Even if comprised in this way, an enzyme control ability can be exhibited desirably in an enzyme control polynucleotide.
本発明のアプタマー分子の塩基配列を分断する位置としては、ループ構造内のいずれかの部位が好ましい。ループ構造内で分断すれば、分断後の断片をそれぞれ含む２分子のポリヌクレオチド鎖を調製しても、これらのポリヌクレオチド鎖をフォールディング条件下で塩基対合させることにより、ステム部分が望ましく形成され、もとにしたアプタマー分子の二次構造を再現できる（もとにしたアプタマー分子の二次構造と近似した二次構造を形成する）可能性が高く、ひいては酵素制御アプタマー部位がもとのアプタマー分子の有する結合能及び酵素制御能を維持する可能性が高くなる（以下、このような、もとの1分子のアプタマーと近似した二次構造をとり得る、2分子のポリヌクレオチド鎖から成るポリヌクレオチドを「分割アプタマー」と呼ぶことがある)。例えば、上述した通り、実施例ではMag2（配列番号３）を31ntと32ntの間で分断しているが、Mag2のループ構造を形成する領域は25nt〜39ntの領域であり、これはループ構造内での分断である。このようにして構築した2分子性の酵素制御ポリヌクレオチドは、後述するとおり、認識アプタマー部位への標的物質の結合により、酵素制御アプタマー部位がＰＱＱＧＤＨの酵素活性を上昇させる能力を好ましく低下させることができる。なお、アプタマー分子がとる二次構造は、上述の通りコンピューターを用いた常法により容易に決定することができる（図５、図８参照）。 As a position for dividing the base sequence of the aptamer molecule of the present invention, any site in the loop structure is preferable. By dividing within the loop structure, even if two polynucleotide strands each containing the fragment after fragmentation are prepared, the stem portion is desirably formed by base pairing these polynucleotide strands under folding conditions. It is highly possible that the secondary structure of the original aptamer molecule can be reproduced (forms a secondary structure that approximates the secondary structure of the original aptamer molecule), and thus the enzyme-controlled aptamer site is the original aptamer. The possibility of maintaining the binding ability and enzyme control ability of the molecule is increased (hereinafter, a polynucleotide consisting of two polynucleotide chains that can take a secondary structure similar to the original one aptamer). Nucleotides may be referred to as “split aptamers”). For example, as described above, Mag2 (SEQ ID NO: 3) is divided between 31 nt and 32 nt in the examples, but the region forming the loop structure of Mag2 is a region of 25 nt to 39 nt, which is within the loop structure. It is a division at. As described later, the bimolecular enzyme-regulated polynucleotide constructed in this way preferably reduces the ability of the enzyme-regulated aptamer site to increase the enzyme activity of PQQGDH by binding the target substance to the recognition aptamer site. it can. In addition, the secondary structure which an aptamer molecule takes can be easily determined by a conventional method using a computer as described above (see FIGS. 5 and 8).
上記認識アプタマー部位は、標的物質に対し特異的に結合する能力を有するアプタマー部位である。認識アプタマー部位として利用できるアプタマーは、ピロロキノリンキノン及びＰＱＱＧＤＨ以外の物質を標的とする限り、特に限定されず、公知の種々のアプタマーを利用することができるし、所望の標的物質に対して新規に創製したアプタマーを利用することもできる。ただし、複数のステムを持つ複雑な構造のアプタマーについては本発明の酵素制御ポリヌクレオチドの調製が困難な場合があるので、ステム部の少ない（好ましくは１〜３箇所程度）二次構造を有するアプタマーがより好ましい。具体的には、例えば下記実施例に記載のアデノシンアプタマー（配列番号３５）等を利用することができる。標的物質は、それに対するアプタマーが調製できるものであれば特に限定されず、ピロロキノリンキノン及びＰＱＱＧＤＨ以外の物質であればいかなるものであってもよい。 The recognition aptamer site is an aptamer site having an ability to specifically bind to a target substance. Aptamers that can be used as recognition aptamer sites are not particularly limited as long as they target substances other than pyrroloquinoline quinone and PQQGDH, and various known aptamers can be used. Aptamers created can also be used. However, since aptamers with complex structures having a plurality of stems may be difficult to prepare the enzyme-controlled polynucleotide of the present invention, aptamers having a secondary structure with few stem parts (preferably about 1 to 3 sites). Is more preferable. Specifically, for example, an adenosine aptamer (SEQ ID NO: 35) described in the Examples below can be used. The target substance is not particularly limited as long as an aptamer for the target substance can be prepared, and any substance other than pyrroloquinoline quinone and PQQGDH may be used.
酵素制御ポリヌクレオチド分子中において、認識アプタマー部位を設ける位置は特に限定されず、酵素制御アプタマー構造の末端部であってもよく、また、酵素制御アプタマー部位のループ構造に付加するようにして設けてもよい。例えば、ループ構造内で分断した分割アプタマーの、一方のポリヌクレオチド鎖の分断部位側末端に認識アプタマーを連結させることにより、酵素制御アプタマーのループ構造部に認識アプタマー部位を設定した、2分子性の酵素制御ポリヌクレオチドを得ることができる。この際、他方の断片の分断部位側末端に、該認識アプタマー配列中の少なくとも一部の領域と相補的な配列から成る断片を連結させると、認識アプタマーと該相補配列断片とがハイブリダイズして塩基対を形成するので、酵素制御アプタマー部位の二次構造を安定させることができ好ましい。該相補配列断片のサイズは、採用する認識アプタマーのサイズに応じて、該認識アプタマーの全長と同一以下の任意のサイズを選択することができ、特に限定されないが、通常3mer以上20mer以下（ないしは認識アプタマーの全長の半分以下）程度である。このように、ループ構造内で分断した酵素制御アプタマーを用いて調製した本発明の2分子性の酵素制御ポリヌクレオチドは、後述するとおり、認識アプタマー部位の構造変化を効率的に酵素制御アプタマーに伝えることができるため、1分子の酵素制御アプタマーの末端に認識アプタマーを連結して調製される1分子性の酵素制御ポリヌクレオチドよりも好ましい。 In the enzyme-controlled polynucleotide molecule, the position at which the recognition aptamer site is provided is not particularly limited, and may be the terminal part of the enzyme-controlled aptamer structure, or provided so as to be added to the loop structure of the enzyme-controlled aptamer site. Also good. For example, a split aptamer fragmented within the loop structure is linked to a fragmented aptamer end of one polynucleotide chain, thereby establishing a recognition aptamer site in the loop structure part of the enzyme-controlled aptamer. Enzyme-controlled polynucleotides can be obtained. At this time, when a fragment consisting of a sequence complementary to at least a part of the recognition aptamer sequence is linked to the end of the other fragment at the fragmentation site side, the recognition aptamer and the complementary sequence fragment are hybridized. Since it forms a base pair, the secondary structure of the enzyme-controlled aptamer site can be stabilized, which is preferable. The size of the complementary sequence fragment can be selected from any size that is equal to or less than the full length of the recognition aptamer according to the size of the recognition aptamer to be employed, and is not particularly limited, but usually 3 mer to 20 mer (or recognition) Less than half of the total length of the aptamer). Thus, the bimolecular enzyme-regulated polynucleotide of the present invention prepared using the enzyme-regulated aptamer fragmented in the loop structure efficiently transmits the structural change of the recognition aptamer site to the enzyme-regulated aptamer as described later. Therefore, it is preferable to a single-molecule enzyme-controlled polynucleotide prepared by linking a recognition aptamer to the end of one molecule of an enzyme-controlled aptamer.
酵素制御アプタマー部位と認識アプタマー部位とは、直接連結してもよいが、リンカーを介して連結させてもよい。例えば、酵素制御アプタマーと認識アプタマーとをそれぞれの末端部で連結させて1分子性の酵素制御ポリヌクレオチドを調製する場合には、ダイマーアプタマーについて上述したように、連結部近傍の二次構造を保持する観点から、適当な鎖長のリンカーを介して連結させてもよい。また、ループ部で分断した分割アプタマーを用いて2分子性の酵素制御ポリヌクレオチドを調製する場合にも、認識アプタマーをリンカーを介して分断部末端に連結させることができる。リンカーを介する場合、上記相補配列断片には、リンカーと相補的な領域を含ませることが好ましい。なお、相補配列断片の連結もリンカーを介するものであってよい。リンカーは、アデニンのみ又はチミンのみから成ることが好ましい。リンカーの鎖長は、酵素制御アプタマーと認識アプタマーとを末端部で連結させる場合には、上記したダイマーアプタマーにおけるリンカーの条件と同様に、通常は1mer〜20mer程度、好ましくは5mer〜15mer程度である。また、分割アプタマーを用いてループ部分に認識アプタマーを設ける場合には、特に限定されないが、通常1mer〜10mer程度、好ましくは1mer〜5mer程度である。 The enzyme-controlled aptamer site and the recognition aptamer site may be directly linked, or may be linked via a linker. For example, when preparing a monomolecular enzyme-controlled polynucleotide by ligating an enzyme-regulated aptamer and a recognition aptamer at each end, as described above for the dimer aptamer, the secondary structure in the vicinity of the ligation is retained. From this viewpoint, they may be linked via a linker having an appropriate chain length. In addition, when preparing a bimolecular enzyme-controlled polynucleotide using a split aptamer split at the loop part, the recognition aptamer can be linked to the end of the split part via a linker. When using a linker, the complementary sequence fragment preferably contains a region complementary to the linker. The complementary sequence fragments may be linked via a linker. The linker preferably consists of only adenine or thymine. When the enzyme-controlled aptamer and the recognition aptamer are linked at the end, the linker chain length is usually about 1mer to 20mer, preferably about 5mer to 15mer, similar to the linker conditions in the dimer aptamer described above. . Moreover, when providing a recognition aptamer in a loop part using a split aptamer, although it does not specifically limit, Usually, it is about 1mer-10mer, Preferably it is about 1mer-5mer.
認識アプタマー部位を構成する領域は、標的物質との結合能を有するアプタマー配列のみから成るものであってもよく、また、酵素制御ポリヌクレオチド分子中で認識アプタマー部位の二次構造を安定化させるため等に有用な任意の塩基配列をさらに含ませてもよい。例えば、下記実施例で用いているアデノシンアプタマーは、配列番号３５に示される塩基配列から成るアプタマーであるが、その二次構造はバルジ型であり、図１１(A)に示す通り5'末端のgと3'末端のcが対合してステム部を構成する。この場合には、アデノシンと結合したときのアデノシンアプタマー部位の立体構造をより安定化する観点から、アデノシンアプタマー断片のうち分割アプタマーと連結していないフリーの末端部（図１１(B)の例においてはアデノシンアプタマー断片の3'末端部）に、リンカーと相補的な塩基を1ないし数個程度付加させてもよい。 The region constituting the recognition aptamer site may consist only of an aptamer sequence capable of binding to the target substance, and also stabilize the secondary structure of the recognition aptamer site in the enzyme-controlled polynucleotide molecule. Any base sequence useful for the above may be further included. For example, the adenosine aptamer used in the following Examples is an aptamer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 35, but its secondary structure is a bulge type, and as shown in FIG. g and 3 'end c pair to form a stem part. In this case, from the viewpoint of further stabilizing the three-dimensional structure of the adenosine aptamer site when bound to adenosine, the free terminal portion of the adenosine aptamer fragment that is not linked to the split aptamer (in the example of FIG. 11B). May add about 1 to several bases complementary to the linker to the 3 'end of the adenosine aptamer fragment.
酵素制御アプタマー部位のループ構造に認識アプタマー部位を連結した2分子性のポリヌクレオチドにＰＱＱＧＤＨを結合させた、本発明の標的物質測定試薬の想定される測定スキームを図１１(B)に示す。図１１(B)中に例示する本発明の試薬は、酵素制御アプタマー部位としてMag2の分割アプタマー、認識アプタマー部位としてアデノシンアプタマーを用いたものであり、測定対象となる標的物質はアデノシンである。Mag2は上述した通りＰＱＱＧＤＨの酵素活性を上昇させる作用を有する。アデノシンの非存在下では、アデノシンアプタマーが部分相補鎖とハイブリ形成して、Ｍａｇ２は安定した構造をとり、ＰＱＱＧＤＨを活性化する。一方で、アデノシン存在下ではアデノシンアプタマーがアデノシンと結合し、リジットな構造を形成することで、連結しているＭａｇ２の構造が不安定になり、ＰＱＱＧＤＨ活性化能が減少する。即ち、アデノシンをＰＱＱＧＤＨ活性の減少で検出する系が想定される。 FIG. 11 (B) shows a possible measurement scheme of the target substance measurement reagent of the present invention in which PQQGDH is bound to a bimolecular polynucleotide in which a recognition aptamer site is linked to the loop structure of the enzyme-controlled aptamer site. The reagent of the present invention illustrated in FIG. 11B uses a Mag2 split aptamer as an enzyme-controlled aptamer site and an adenosine aptamer as a recognition aptamer site, and the target substance to be measured is adenosine. Mag2 has the effect of increasing the enzyme activity of PQQGDH as described above. In the absence of adenosine, the adenosine aptamer hybridizes with the partially complementary strand, and Mag2 takes a stable structure and activates PQQGDH. On the other hand, in the presence of adenosine, the adenosine aptamer binds to adenosine and forms a rigid structure, so that the structure of linked Mag2 becomes unstable and PQQGDH activation ability decreases. That is, a system in which adenosine is detected by a decrease in PQQGDH activity is assumed.
本発明の標的物質測定試薬は、本発明の酵素制御ポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチド中の酵素制御アプタマー部位に結合したＰＱＱＧＤＨとを含むものである。該ＰＱＱＧＤＨは、上記した通り、試薬中の認識アプタマー部位への標的物質の結合により、酵素活性が低下する。具体的には、酵素制御ポリヌクレオチドに採用される酵素制御アプタマーが、ＰＱＱＧＤＨの活性を上昇させる作用を有する場合、標的物質測定試薬では、認識アプタマー部位への標的物質の結合により、ＰＱＱＧＤＨの酵素活性が低下する。従って、標的物質を含み得る検体と本発明の試薬を接触させ、試薬のＰＱＱＧＤＨの酵素活性の変化を調べることにより、標的物質を測定することができる。標的物質の濃度が既知の試料を用いて酵素活性を調べ、検量線を作成すれば、検体中の標的物質を定量することも可能である。ＰＱＱＧＤＨの酵素活性は、例えば、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）及び2,6−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）等の適当な活性試薬を含む溶液中で、基質であるグルコースを反応させ、吸光度を測定することにより、容易に測定することができる。
The target substance measurement reagent of the present invention comprises the enzyme-controlled polynucleotide of the present invention and PQQGDH bound to the enzyme-controlled aptamer site in the polynucleotide. As described above, the enzyme activity of the PQQGDH decreases due to the binding of the target substance to the recognition aptamer site in the reagent. Specifically, when the enzyme-controlled aptamer employed in the enzyme-controlled polynucleotide has an action of increasing the activity of PQQGDH, the target substance measurement reagent uses the enzyme activity of PQQGDH by binding the target substance to the recognition aptamer site. Decreases. Therefore, the target substance can be measured by bringing the specimen of the present invention into contact with the reagent of the present invention and examining the change in the enzyme activity of the reagent PQQGDH. It is also possible to quantify the target substance in the specimen by examining the enzyme activity using a sample with a known target substance concentration and creating a calibration curve. The enzyme activity of PQQGDH is measured by reacting glucose as a substrate in a solution containing an appropriate active reagent such as phenazine methosulfate (PMS) and 2,6-dichlorophenolindophenol (DCIP). Therefore, it can be easily measured.
本発明のアプタマー分子及び酵素制御ポリヌクレオチドは、市販の核酸合成機を用いて常法により容易に調製することができる。また、標的物質測定試薬は、下記実施例に詳述されるように、酵素制御ポリヌクレオチドをフォールディング後、ホロ化させたＰＱＱＧＤＨと混合し、室温で5分〜30分程度インキュベートすることにより、容易に調製することができる。 The aptamer molecule and enzyme-controlled polynucleotide of the present invention can be easily prepared by a conventional method using a commercially available nucleic acid synthesizer. In addition, as detailed in the following examples, the target substance measurement reagent can be easily obtained by folding an enzyme-controlled polynucleotide, mixing it with hololated PQQGDH, and incubating at room temperature for about 5 to 30 minutes. Can be prepared.
本発明のＰＱＱＧＤＨ制御アプタマー分子の主な用途は、バイオセンサーのセンシング素子としての利用であり、具体的には、本発明の酵素制御ポリヌクレオチドや測定試薬への適用のような、特許文献１記載のＡＥＳへの利用を挙げることができる。ただし、本発明のアプタマー分子の用途はこれらに限定されず、ＰＱＱＧＤＨへの結合能を利用して、それ自体周知の方法により、ＰＱＱＧＤＨの測定に使用することもできる。この場合には、ＰＱＱＧＤＨ制御アプタマーは、アプタマーによる周知の通常の方法に従って使用することができ、例えば抗体の代わりに本発明のアプタマーを利用した免疫測定法を行なうことができる。また、下記実施例に記載されるアプタマーブロッティングや、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）等の周知の方法によってもＰＱＱＧＤＨの測定を行なうことができる。被検試料としてはＰＱＱＧＤＨを含む溶液であればいかなるものであってもよい。 The main use of the PQQGDH-regulated aptamer molecule of the present invention is as a sensing element of a biosensor. Specifically, it is described in Patent Document 1, such as application to the enzyme-controlled polynucleotide of the present invention and a measurement reagent. Can be used for AES. However, the use of the aptamer molecule of the present invention is not limited to these, and can also be used for measurement of PQQGDH by a method known per se using the binding ability to PQQGDH. In this case, the PQQGDH-regulated aptamer can be used in accordance with a well-known normal method using an aptamer. For example, an immunoassay using the aptamer of the present invention can be performed instead of an antibody. Further, PQQGDH can also be measured by known methods such as aptamer blotting and surface plasmon resonance (SPR) described in the following examples. The test sample may be any solution containing PQQGDH.
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
実施例１−１ アプタマーのスクリーニングに適したＰＱＱＧＤＨ固定担体の検討
ＰＱＱＧＤＨに対して高い親和性と特異的を有するＤＮＡアプタマーを効率よくスクリーニングするために、ＰＱＱＧＤＨでなく、ＰＱＱＧＤＨの固定担体に非特異的に吸着してしまうＤＮＡ量を最小限に抑える必要がある。そこで、より溶液系に近い自由度の高い環境で非特異的に吸着したＤＮＡを洗浄、除去するためにＰＱＱＧＤＨの固定担体として、磁性ビーズを用いることとした。さらに、ＤＮＡのリン酸骨格が負電荷を帯びていることに着目し、負のゼータ電位を帯びている磁性ビーズを用いると静電的な反発により、ＤＮＡの磁性ビーズへの非特異吸着を抑えることができると考えた。
Example 1-1 Examination of PQQGDH immobilized carrier suitable for aptamer screening In order to efficiently screen DNA aptamer having high affinity and specificity for PQQGDH, it is not specific to PQQGDH but to PQQGDH immobilized carrier. It is necessary to minimize the amount of DNA adsorbed on the surface. Therefore, in order to wash and remove non-specifically adsorbed DNA in a highly flexible environment closer to a solution system, magnetic beads were used as a PQQGDH immobilization carrier. Furthermore, paying attention to the fact that the phosphate skeleton of DNA is negatively charged, using magnetic beads with negative zeta potential suppresses nonspecific adsorption of DNA to magnetic beads by electrostatic repulsion. I thought it was possible.
ＤＮＡと静電的相互作用を示すと考えられる正のゼータ電位を帯びたビーズ１と、ＤＮＡと静電的に反発すると考えられる負のゼータ電位を帯びたビーズ２、ビーズ３の計３種類の同粒径(５００〜７５０ｎｍ)のビーズで検討を行った。まず、スクリーニングで用いるライブラリーである、FITC修飾66mer ssDNA（18merのプライマー配列を30merのランダム配列の両末端に付加したもの、配列番号１）を１５μＭとなるようにBinding Buffer（10mM MOPS、1mM CaCl2、pH 7.0）で調製したものを２５０μｌ用意した。その後、５００ ｍｇ／ｍｌのビーズ溶液を２０μｌ添加し、１時間室温で振とうした後、上清を除き、Binding bufferで１５分間、５分間、５分間、５分間ずつ洗浄を行った。５００μｌの7M ureaを加え、８０℃で７分振等することで吸着ＤＮＡを溶出する作業を２回行った。溶出ＤＮＡをエタノール沈殿させ、真空乾燥させた後、２０μｌのMilliQ水でペレットを溶解し、１０倍希釈して、蛍光分光測定（Ex:495nm、Em:520nm）により各ビーズの非特異吸着ＤＮＡ量を比較した。 There are a total of three types: a bead 1 having a positive zeta potential that is considered to exhibit an electrostatic interaction with DNA, a bead 2 having a negative zeta potential that is considered to repel electrostatically with DNA, and a bead 3. The examination was performed with beads having the same particle diameter (500 to 750 nm). First, a FITC-modified 66mer ssDNA (18mer primer sequence added to both ends of a 30mer random sequence, SEQ ID NO: 1), which is a library used for screening, is Binding Buffer (10 mM MOPS, 1 mM CaCl2) so as to be 15 μM. 2 , 250 μl prepared at pH 7.0) was prepared. Thereafter, 20 μl of a 500 mg / ml bead solution was added and shaken at room temperature for 1 hour, and then the supernatant was removed, followed by washing with a binding buffer for 15 minutes, 5 minutes, 5 minutes, and 5 minutes. 500 μl of 7M urea was added and the adsorbed DNA was eluted twice by shaking for 7 minutes at 80 ° C. The eluted DNA is ethanol precipitated, vacuum dried, the pellet is dissolved in 20 μl of MilliQ water, diluted 10-fold, and the amount of non-specifically adsorbed DNA on each bead is measured by fluorescence spectroscopy (Ex: 495 nm, Em: 520 nm) Compared.
その結果、ゼータ電位が＋３０ｍＶで正に帯電しているビーズ１は、負に帯電しているビーズ２、ビーズ３に比べると圧倒的に高い蛍光強度を示した。これより、ビーズ1と核酸が静電的相互作用を示したため、核酸が大幅に非特異吸着してしまったと考えられる。一方で、負に帯電しているビーズ２、ビーズ３はビーズ１と比較すると蛍光強度が著しく低い値を示した。これより、ビーズ２、３と核酸が静電的に反発して、核酸の非特異吸着量が低下したと考えられる。さらに、ビーズ２とビーズ３を比較するとゼータ電位はそれぞれ、−６０ｍＶ、−５０ｍＶであり、負の絶対値のより大きいビーズ２はビーズ３と比べ、さらに低い蛍光強度を示し、今回比較したビーズの中で、最も核酸の非特異吸着量が低いビーズであるといえる。また、ビーズ２は負に帯電しているので、スクリーニング時のｐＨ７．０で正に帯電するＰＱＱＧＤＨを固定する際に静電的に物理吸着させることも可能である。これらより、ビーズ２が今回の目的であるＰＱＱＧＤＨに対するアプタマーのスクリーニングに最も適していると考えられる。 As a result, the bead 1 positively charged with a zeta potential of +30 mV showed an overwhelmingly higher fluorescence intensity than the negatively charged beads 2 and 3. From this, since the bead 1 and the nucleic acid showed an electrostatic interaction, it is considered that the nucleic acid was largely non-specifically adsorbed. On the other hand, the negatively charged beads 2 and 3 showed significantly lower fluorescence intensity than the beads 1. From this, it is considered that the beads 2 and 3 and the nucleic acid were electrostatically repelled, and the nonspecific adsorption amount of the nucleic acid was reduced. Furthermore, when comparing beads 2 and 3, the zeta potentials are −60 mV and −50 mV, respectively, and beads 2 with larger negative absolute values show lower fluorescence intensity than beads 3. Among them, it can be said that the beads have the lowest non-specific adsorption amount of nucleic acid. Further, since the beads 2 are negatively charged, they can be physically adsorbed electrostatically when fixing PQQGDH positively charged at pH 7.0 during screening. From these, it is considered that the beads 2 are most suitable for the screening of aptamers against PQQGDH, which is the current purpose.
実施例１−２ 磁性ビーズを用いたＰＱＱＧＤＨに対するＤＮＡアプタマーの探索
６６ｍｅｒイニシャルライブラリーをBinding buffer（10mM MOPS、1mM CaCl2、pH7.0）で1nmol/100μLに調製し、95℃で3分間加熱した後、30分間で室温の25℃まで徐々に冷却することにより、フォールディングさせた。一ラウンド目に限り、15 mgのビーズに100μg（1 nmol相当）のビーズを固定化し、5μM、500μMのライブラリーとインキュベートし、（GDH : ssDNA = 1nmol : 2.5nmol）、2ラウンド目以降は2ｍｇの磁性ビーズに１０μｇのＰＱＱＧＤＨを固定化したものを０．５μＭ、１００μｌのフォールディングさせた６６ｍｅｒイニシャルライブラリーと１時間室温にてインキュベート（GDH : ssDNA = 100pmol : 50 pmol）した後、Binding buffer（10mM MOPS、1mM CaCl2、pH7.0）で１５分間、３回洗浄した。その後、フェノール／クロロホルムでＰＱＱＧＤＨに結合したｓｓＤＮＡを抽出し、イソプロパノール沈殿により生じたペレットを３０μｌのTE bufferに溶かした。そのうちの一部を３０サイクルでＰＣＲ増幅し、一本鎖を調製した。その後、イソプロパノール沈殿により生じたペレットを３０μｌのTE bufferに溶かし、次のラウンドのライブラリーとした。同様の操作をＰＱＱＧＤＨを固定化していない等量のビーズに対しても行い、ビーズに親和性の高いｓｓＤＮＡが濃縮されていないかどうか検討した。以上の操作を１ラウンドとし、合計６ラウンド行なった。なお、ライブラリーに含まれていたｓｓＤＮＡのモル数に対する、ＰＱＱＧＤＨに吸着したｓｓＤＮＡのモル数の割合を回収率として算出した。また、一本鎖調製は具体的には次のようにして行った。すなわち、PCR産物に、その1/10倍量の×50 TE Bufferおよび1/5倍量の5 M NaClを添加し、この溶液をアビジン固定化アガロースに加え、30分インキュベートした。その後、上清を取り除き、Column buffer (30 mM HEPES、500 mM NaCl、5mM EDTA、pH7.0)で2回洗浄した。上清を取り除いた後、0.15 M NaOHを加えて10分間攪拌し、上清を回収する操作を2回繰り返し行うことにより、ssDNAを溶出させた。ssDNAを含む上清を2M HClで中和し、エタノール沈殿によりssDNAを回収した。
Example 1-2 Search for DNA aptamer against PQQGDH using magnetic beads A 66mer initial library was prepared to 1 nmol / 100 μL with Binding buffer (10 mM MOPS, 1 mM CaCl 2 , pH 7.0) and heated at 95 ° C. for 3 minutes. Then, it was folded by gradually cooling to 25 ° C. at room temperature in 30 minutes. For the first round only, immobilize 100 μg (equivalent to 1 nmol) of beads on 15 mg beads, incubate with 5 μM and 500 μM libraries (GDH: ssDNA = 1 nmol: 2.5 nmol), 2 mg after the second round 10 μg of PQQGDH immobilized on 10 μg of magnetic beads was incubated with 0.5 μM and 100 μl of the folded 66mer initial library for 1 hour at room temperature (GDH: ssDNA = 100 pmol: 50 pmol), and then binding buffer (10 mM) MOPS, 1 mM CaCl 2 , pH 7.0) was washed 3 times for 15 minutes. Thereafter, ssDNA bound to PQQGDH was extracted with phenol / chloroform, and the pellet produced by isopropanol precipitation was dissolved in 30 μl of TE buffer. A part of them was PCR-amplified in 30 cycles to prepare a single strand. Thereafter, the pellet generated by isopropanol precipitation was dissolved in 30 μl of TE buffer to prepare a library for the next round. The same operation was performed on an equal amount of beads on which PQQGDH was not immobilized, and it was examined whether ssDNA having high affinity for the beads was concentrated. The above operation was made 1 round, and a total of 6 rounds were performed. The ratio of the number of moles of ssDNA adsorbed to PQQGDH to the number of moles of ssDNA contained in the library was calculated as the recovery rate. Moreover, the single strand preparation was specifically performed as follows. That is, 1/10 times the amount of x50 TE buffer and 1/5 times the amount of 5 M NaCl were added to the PCR product, and this solution was added to avidin-immobilized agarose and incubated for 30 minutes. Thereafter, the supernatant was removed and washed twice with Column buffer (30 mM HEPES, 500 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 7.0). After removing the supernatant, 0.15 M NaOH was added and stirred for 10 minutes, and the operation of recovering the supernatant was repeated twice to elute ssDNA. The supernatant containing ssDNA was neutralized with 2M HCl, and ssDNA was recovered by ethanol precipitation.
６ラウンド目までの回収率の変遷を図１に示す。ＰＱＱＧＤＨを固定化していない磁性ビーズに対する回収率はラウンドを重ねてもほとんど変化が見られず、また、ＰＱＱＧＤＨを固定化したものより回収率が低いので、ビーズに対して親和性の高いｓｓＤＮＡは濃縮されていないと考えられる。一方、ＰＱＱＧＤＨを固定化したものはラウンドを重ねるごとに回収率が上昇していることがわかる。６ラウンド目では、回収率が２０％程度まで上昇したので、ＰＱＱＧＤＨに対して親和性の高いアプタマーが濃縮されていると考えられたので、６ラウンド目に抽出したｓｓＤＮＡのシーケンス解析を行った。結果を表１に示す。配列の収束及び相同性の高い領域は見られなかった。なお、表１中には両末端のプライマー配列を省略したランダム領域の配列のみを示す。 Figure 1 shows the changes in the collection rate up to the sixth round. The recovery rate for magnetic beads without PQQGDH immobilized is almost unchanged even after rounds, and the recovery rate is lower than that with PQQGDH immobilized, so ssDNA with high affinity for beads is concentrated. It is thought that it is not done. On the other hand, it can be seen that the recovery rate of the fixed PQQGDH increases with each round. In the 6th round, since the recovery rate increased to about 20%, it was considered that aptamers with high affinity for PQQGDH were concentrated. Therefore, the sequence analysis of the ssDNA extracted in the 6th round was performed. The results are shown in Table 1. No regions with high sequence convergence or homology were found. In Table 1, only the sequence of the random region in which the primer sequences at both ends are omitted is shown.
実施例１−３ シーケンシングの結果得られた各クローンのＰＱＱＧＤＨに対する結合能の評価
各クローンのＰＱＱＧＤＨに対する結合能の評価は、(1)アプタマーブロッティング、(2)ＳＰＲで評価した。
Example 1-3 Evaluation of binding ability of each clone obtained as a result of sequencing to PQQGDH Evaluation of binding ability of each clone to PQQGDH was performed by (1) aptamer blotting and (2) SPR.
(1) アプタマーブロッティングでの評価
ＰＱＱＧＤＨ、血清を１×２ｃｍ２のニトロセルロース膜に滴下し、片面で２５０ｎｇ（ＰＱＱＧＤＨ ２．５ｐｍｏｌに相当）を固定化した。その後、４％スキムミルクを用いて、室温で１時間ブロッキングを行った。Binding-T（10mM MOPS、1mM CaCl2、0.05% Tween、pH7.0）で洗浄した後、１ｎＭのＦＩＴＣ修飾した１９本それぞれのｓｓＤＮＡ溶液３ｍｌとインキュベートさせ、洗浄した。ＨＲＰ修飾した坑ＦＩＴＣ抗体とインキュベートさせ、洗浄した後、各タンパク質に結合したＤＮＡ量を化学発光により検出した。なお、結合能の比較を行うために、イニシャルライブラリーと１９本のクローンを等量ずつ混ぜた（終濃度１ｎＭ）Ｍｉｘライブラリーを用いて同様の操作を行った。
(1) Evaluation by aptamer blotting PQQGDH and serum were dropped on a 1 × 2 cm 2 nitrocellulose membrane, and 250 ng (corresponding to 2.5 pmol of PQQGDH) was immobilized on one side. Thereafter, blocking was performed for 1 hour at room temperature using 4% skim milk. After washing with Binding-T (10 mM MOPS, 1 mM CaCl 2 , 0.05% Tween, pH 7.0), each was incubated with 3 ml of 19 ssDNA solutions modified with 1 nM FITC and washed. After incubation with HRP-modified anti-FITC antibody and washing, the amount of DNA bound to each protein was detected by chemiluminescence. In addition, in order to compare the binding ability, the same operation was performed using a Mix library in which the initial library and 19 clones were mixed in equal amounts (final concentration 1 nM).
検出結果を図２に示す。１９本のクローンのうち、ほとんどのクローンにおいてＰＱＱＧＤＨへの結合を示すスポットがイニシャルライブラリーのスポットよりも強度が強く検出された。これより、多くのクローンがＰＱＱＧＤＨに対し、高い親和性をもつことが示された。しかし、全てのクローンにおいて、血清に対するスポットも検出されており、また、多くのクローンで、ＰＱＱＧＤＨと血清に対するスポットの強度に違いが見られなかった。各クローンが血清中の正電荷に富んだタンパク質に結合してしまった可能性が考えられる。化学発光強度解析の結果、ＰＱＱＧＤＨに対する親和性が高く、さらに血清よりもＰＱＱＧＤＨに対する親和性が高いクローンである、Ｍａｇ１、Ｍａｇ２、Ｍａｇ３、Ｍａｇ７、Ｍａｇ１０、Ｍａｇ１１、Ｍａｇ１３、Ｍａｇ１５、Ｍａｇ１７、Ｍａｇ１９などが有力であると考えられた。 The detection results are shown in FIG. Of the 19 clones, in most of the clones, spots showing binding to PQQGDH were detected with a higher intensity than the spots of the initial library. From this, it was shown that many clones have high affinity with respect to PQQGDH. However, in all clones, spots against serum were also detected, and in many clones, there was no difference in the intensity of spots against PQQGDH and serum. It is possible that each clone has bound to a positively charged protein in serum. As a result of the chemiluminescence intensity analysis, Mag1, Mag2, Mag3, Mag7, Mag10, Mag11, Mag13, Mag15, Mag17, Mag19 and the like, which are clones having high affinity for PQQGDH and higher affinity for PQQGDH than serum, are prominent. It was thought that.
(2) ＳＰＲでの評価
アプタマーブロッティングでの結合能の評価の結果からＰＱＱＧＤＨへの結合能が比較的高いと考えられる７つのクローン（Ｍａｇ１、２、１０、１１、１５、１７、１９）に関して、ＳＰＲでの結合能の評価を試みた。まず、ＣＭ５チップにアミンカップリングでＰＱＱＧＤＨを２２０００ＲＵ固定化した後、各クローンを1、0.5、0.25、0.13、0.06、0.03、0.015、0.0075μＭの８点の濃度に振って、それぞれ流速１０μｌ／ｍｉｎで４０μｌインジェクトした。なお、チップの再生化は２５０ｍＭのＮａＣｌで行った。イニシャルライブラリーに関しても同様に測定を行った。
(2) Evaluation by SPR Regarding seven clones (Mag 1, 2, 10, 11, 15, 17, 19) considered to have relatively high binding ability to PQQGDH from the results of evaluation of binding ability by aptamer blotting, An attempt was made to evaluate the binding ability with SPR. First, PQQGDH was immobilized on a CM5 chip by amine coupling at 22000 RU, and each clone was shaken to 8 concentrations of 1, 0.5, 0.25, 0.13, 0.06, 0.03, 0.015, and 0.0075 μM, and each flow rate was 10 μl / min. 40 μl was injected. The chip was regenerated with 250 mM NaCl. The same measurement was performed for the initial library.
C richであるＭａｇ１０、１１、１５、１７、１９に関してはイニシャルライブラリーと同程度のシグナルしか得られなかった。一方で、G richであるＭａｇ１、２に関しては、アプタマーブロッティングの結果と同様に、どのＤＮＡ濃度においても、イニシャルライブラリーの３倍程度のＳＰＲシグナルが確認された。特にＭａｇ２のＰＱＱＧＤＨに対する結合能が最も優れていることが示され、スキャッチャードを作成し算出された解離定数はおよそ２００ｎＭ程度であった。図３にイニシャルライブラリーとＭａｇ２の各ＤＮＡ濃度におけるＳＰＲシグナルを示す。 As for Mag 10, 11, 15, 17, 19 which is C rich, only signals comparable to those of the initial library were obtained. On the other hand, regarding Mag 1 and 2 which are G rich, SPR signals of about 3 times that of the initial library were confirmed at any DNA concentration, as in the results of aptamer blotting. In particular, it was shown that the binding ability of Mag2 to PQQGDH was the best, and the dissociation constant calculated by creating Scatchard was about 200 nM. FIG. 3 shows the SPR signal at each DNA concentration of the initial library and Mag2.
実施例１−４ 各クローンのＰＱＱＧＤＨ活性に与える影響の評価
アプタマーブロッティングでの結合能の評価の結果からＰＱＱＧＤＨへの結合能が比較的高いと考えられる7つのクローン（Ｍａｇ１、２、１０、１１、１５、１７、１９）が、ＰＱＱＧＤＨ活性に与える影響の評価を試みた。
Example 1-4 Evaluation of the Influence of Each Clone on PQQGDH Activity Seven clones (Mag 1, 2, 10, 11, which are considered to have relatively high binding ability to PQQGDH from the results of the evaluation of binding ability in aptamer blotting) 15, 17, 19) tried to evaluate the effect on PQQGDH activity.
酵素活性の測定は、ＰＭＳ-ＤＣＩＰ系を用い、ＤＣＩＰの６００ｎｍにおける吸光度変化を３０秒間追跡し、その吸光度の減少速度を酵素の反応速度とした。 The enzyme activity was measured by using a PMS-DCIP system. The change in absorbance of DCIP at 600 nm was followed for 30 seconds, and the rate of decrease in absorbance was taken as the enzyme reaction rate.
まず、終濃度３．８ｎＭ ＰＱＱＧＤＨ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１μＭ ＰＱＱとなる混合溶液２０μｌをBinding bufferを用いて調製し、１０分間室温でインキュベートしてＰＱＱＧＤＨをホロ化した。その後、ホロ化したＰＱＱＧＤＨ溶液にフォールディングしたクローン溶液をそれぞれＰＱＱＧＤＨの１０倍量となるように１０μｌ加え、混合溶液３０μｌとし、これを１５分間室温でインキュベートして、ｓｓＤＮＡとＰＱＱＧＤＨを結合させた。インキュベート後の溶液に１４１μｌのBinding buffer、９μｌの活性試薬（終濃度 ０．６ｍＭ ＰＭＳ、０．０６ｍＭ ＤＣＩＰ）、２０μｌグルコース（終濃度 ２０ｍＭ）を加え、３０秒間、吸光度測定を行った。各クローンのＰＱＱＧＤＨ活性に与える影響を調べるために、クローン溶液のかわりに等量のBinding bufferとインキュベートしたサンプル（ｎｏ ＤＮＡサンプル）の酵素活性を測定した。 First, 20 μl of a mixed solution with a final concentration of 3.8 nM PQQGDH, 2 mM CaCl 2 and 1 μM PQQ was prepared using a binding buffer, and incubated at room temperature for 10 minutes to make PQQGDH holo. Thereafter, 10 μl of the clone solution folded into the holoformed PQQGDH solution was added so as to be 10 times the amount of PQQGDH to make 30 μl of the mixed solution, which was incubated at room temperature for 15 minutes to bind ssDNA and PQQGDH. 141 μl of Binding buffer, 9 μl of active reagent (final concentration 0.6 mM PMS, 0.06 mM DCIP) and 20 μl glucose (final concentration 20 mM) were added to the solution after the incubation, and the absorbance was measured for 30 seconds. In order to examine the influence of each clone on the PQQGDH activity, the enzyme activity of a sample (no DNA sample) incubated with an equal amount of Binding buffer was measured instead of the clone solution.
活性測定結果を図４に示す。C richであるＭａｇ１０、１１、１５、１７、１９に関してはイニシャルライブラリーと同様に、ほとんどＰＱＱＧＤＨ活性に影響を与えないことが示された。一方でG-richであるＭａｇ１、２に関しては、ＰＱＱＧＤＨ活性を向上させる傾向が見られた。特に、Ｍａｇ２はＰＱＱＧＤＨ活性を３０％程度向上させることが示された。mfoldで予測したMag1、2の二次構造を図５に示す。 The activity measurement results are shown in FIG. It was shown that Mag 10, 11, 15, 17, and 19 that are rich have almost no effect on PQQGDH activity as in the initial library. On the other hand, regarding Mag1 and 2 which are G-rich, the tendency which improves PQQGDH activity was seen. In particular, Mag2 was shown to improve PQQGDH activity by about 30%. The secondary structure of Mag1, 2 predicted by mfold is shown in FIG.
実施例２−１ ＰＱＱＧＤＨを標的としたＳＥＬＥＸを始めるにあたっての、固定化タンパク質量とブロッキング溶液の検討
本実施例では、ＰＱＱＧＤＨに対するＳＥＬＥＸを始めるにあたり、担体に固定化するタンパク質量及びブロッキング溶液の種類、濃度の検討をAptamer blotting法により行った。なお、血清中でＧＤＨに対するアプタマーを利用することを考えているため、血清中の他のタンパク質には結合しないように、血清をブロッキング溶液として用いることを試みた。
Example 2-1 Examination of immobilized protein amount and blocking solution when starting SELEX targeting PQQGDH In this example, when starting SELEX against PQQGDH, the amount of protein immobilized on a carrier and the type of blocking solution, The concentration was examined by the Aptamer blotting method. Since it is considered to use an aptamer for GDH in serum, an attempt was made to use serum as a blocking solution so as not to bind to other proteins in serum.
より具体的には、ＧＤＨを１０ｍＭ ＭＯＰＳで希釈し、12.5、2.5、0.5、0.1ｇ／ｌの濃度の溶液を調製した。各々をＰＱＱ、ＣａＣｌ２を終濃度１μＭ、１ｍＭとなるように添加してホロ化した後、1 cm×1 cm四方のニトロセルロース膜に片面1μlずつＰＱＱＧＤＨを滴下し乾燥させた。その後、４％スキムミルクまたは４％、２０％、１００％の血清のいずれかを用いて、室温で１時間ブロッキングを行った。ＴＢＳ−Ｔ(20mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.05% Tween、1mM EDTA、pH 7.4)で洗浄を行った後、1μMのＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）修飾した一本鎖ＤＮＡランダムライブラリー（配列番号１）溶液１．５ ｍｌとインキュベートさせ、洗浄し、さらにＨＲＰ（horseradish peroxidase）修飾した抗ＦＩＴＣ抗体とインキュベートさせ、再び洗浄を行った。タンパク質に結合したＤＮＡ量を確認するため、ＨＲＰに対する基質用溶液を添加して化学発光により検出した。 More specifically, GDH was diluted with 10 mM MOPS to prepare solutions having concentrations of 12.5, 2.5, 0.5, and 0.1 g / l. Each was added with PQQ and CaCl 2 to a final concentration of 1 μM and 1 mM to make a holo, and then 1 μl of PQQGDH was added dropwise to a 1 cm × 1 cm square nitrocellulose membrane and dried. Thereafter, blocking was performed for 1 hour at room temperature using either 4% skim milk or 4%, 20%, or 100% serum. After washing with TBS-T (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween, 1 mM EDTA, pH 7.4), 1 μM FITC (fluorescein isothiocyanate) modified single-stranded DNA random library (SEQ ID NO: 1) The solution was incubated with 1.5 ml of the solution, washed, further incubated with an anti-FITC antibody modified with HRP (horseradish peroxidase), and washed again. In order to confirm the amount of DNA bound to the protein, a substrate solution for HRP was added and detected by chemiluminescence.
その結果、４％スキムミルクを用いてブロッキングを行った膜に比べ、血清を用いた膜ではタンパク質を固定化していない部分に対する結合が少なかった。１００％、２０％、４％の各血清では、検出結果に大きな違いが見られず、4％でも十分にブロッキングが行えていると考えられる。また、固定化するタンパク質量については、２５、５、１μgで検出できることが明らかになった。よって、ＳＥＬＥＸでは、４％の血清を用いてブロッキングを行い、加えるＤＮＡとの比が１：１となるように２５μgのＧＤＨを固定化し、１ラウンド目を行うこととした。 As a result, compared to the membrane blocked with 4% skim milk, the membrane using serum had less binding to the portion where the protein was not immobilized. In the serums of 100%, 20%, and 4%, no significant difference is seen in the detection results, and it is considered that 4% is sufficiently blocking. Further, it was revealed that the amount of protein to be immobilized can be detected at 25, 5, and 1 μg. Therefore, in SELEX, blocking was performed using 4% serum, and 25 μg of GDH was immobilized so that the ratio to the added DNA was 1: 1, and the first round was performed.
実施例２−２ ＰＱＱＧＤＨを標的としたアプタマーの探索
本実施例においては、ＰＱＱＧＤＨに対してＳＥＬＥＸを７ラウンド行った。競合タンパク質として大腸癌の腫瘍マーカーであるＣＲＰ(C-reactive protein)、肝細胞癌の腫瘍マーカーであるＡＦＰ(Alpha-fetoprotein)を用いた。また、一本鎖ＤＮＡランダムライブラリーは１８残基のプライマー配列と３０残基のランダム配列を有する合計６６残基の長さのものを用いた（配列番号１）。
Example 2-2 Search for aptamer targeting PQQGDH In this example, 7 rounds of SELEX were performed on PQQGDH. As competing proteins, CRP (C-reactive protein), which is a tumor marker for colon cancer, and AFP (Alpha-fetoprotein), which is a tumor marker for hepatocellular carcinoma, were used. A single-stranded DNA random library having a total length of 66 residues having a primer sequence of 18 residues and a random sequence of 30 residues was used (SEQ ID NO: 1).
具体的な方法について以下に示す。ＧＤＨを１０ｍＭ ＭＯＰＳで希釈し、任意の濃度の溶液を調製した後に、ＰＱＱ、ＣａＣｌ２を終濃度１μＭ、１ｍＭとなるように添加してホロ化をした。その後、ニトロセルロース膜にＰＱＱＧＤＨ、ＣＲＰ、ＡＦＰを各々滴下し（表２に示す通り、１ラウンド目は25μg、２ラウンド目は5μgというように各ラウンドにおいて、各タンパク質の固定化量を変化させた）乾燥させ、4％血清を用いて室温で1時間ブロッキングを行った。ＴＢＳ−Ｔ(20mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.05% Tween、1mM EDTA、pH 7.4)で洗浄をし、1μMのＦＩＴＣ修飾した一本鎖ＤＮＡランダムライブラリー溶液２５０μｌとインキュベートさせ、再度洗浄した。タンパク質が固定化された膜の一部を切り取り、結合したＤＮＡを回収し、ＰＣＲ増幅して次のラウンドのライブラリーとした。以上の操作を１ラウンドとし、計７ラウンドを行った。また、各ラウンドにおいて、タンパク質に結合したＤＮＡ量を確認するために、上記と同様の方法で検出用の膜を用意し、ＤＮＡとインキュベートさせた後に、二次抗体として抗ＦＩＴＣ抗体を用いてタンパク質に結合するＤＮＡ量を化学発光により確認した。 Specific methods are shown below. GDH was diluted with 10 mM MOPS to prepare a solution of an arbitrary concentration, and then PQQ and CaCl 2 were added to a final concentration of 1 μM and 1 mM to make a holo. Thereafter, PQQGDH, CRP, and AFP were dropped onto the nitrocellulose membrane (as shown in Table 2, the amount of protein immobilized was changed in each round, such as 25 μg for the first round and 5 μg for the second round. ) Dried and blocked with 4% serum for 1 hour at room temperature. The plate was washed with TBS-T (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween, 1 mM EDTA, pH 7.4), incubated with 250 μl of 1 μM FITC-modified single-stranded DNA random library solution, and washed again. A part of the protein-immobilized membrane was cut out, and the bound DNA was collected and PCR amplified to obtain a library for the next round. The above operation was set as 1 round, and a total of 7 rounds were performed. In addition, in each round, in order to confirm the amount of DNA bound to the protein, a membrane for detection was prepared by the same method as described above, and after incubation with DNA, the protein was obtained using an anti-FITC antibody as a secondary antibody. The amount of DNA bound to was confirmed by chemiluminescence.
７ラウンド目において、ＰＱＱＧＤＨを固定化した部分にのみ一本鎖ＤＮＡの結合が確認された（図６参照）。１ラウンド目に用いた、ラウンドを重ねていないランダムライブラリー（イニシャル）ではＰＱＱＧＤＨに対してＤＮＡの結合が見られないことから、ＰＱＱＧＤＨに特異的に結合する一本鎖ＤＮＡの濃縮が起こっていると考えられる。 In the seventh round, binding of single-stranded DNA was confirmed only at the portion where PQQGDH was immobilized (see FIG. 6). In the random library (initial) used in the first round, DNA binding to PQQGDH is not observed in the random library (initial) which is not overlapped, so that single-stranded DNA specifically binding to PQQGDH is concentrated. it is conceivable that.
実施例２−３ ＳＥＬＥＸで得られたＰＱＱＧＤＨに結合する一本鎖ＤＮＡの配列解析
本実施例においては、６ラウンド目に回収したＤＮＡの配列の解析を行った。
Example 2-3 Sequence Analysis of Single-Stranded DNA that Binds to PQQGDH Obtained by SELEX In this example, the sequence of DNA collected in the sixth round was analyzed.
具体的な方法を以下に示す。6ラウンド目に回収した一本鎖ＤＮＡをＰＣＲ増幅し、ＤＮＡの精製を行った。その後、ＴＡクローニング、形質転換、培養を行い、得られた４５個の白色コロニーをＬＢ培地で一晩培養した後、プラスミドを抽出した。抽出したプラスミドは、プライマーを用いて目的の断片をＰＣＲ増幅し、コロニーＰＣＲで目的の断片を確認した。目的の断片が挿入されていることが確認されたプラスミドは、塩基配列をダイデオキシ法により決定した。 A specific method is shown below. The single-stranded DNA collected in the sixth round was PCR amplified to purify the DNA. Thereafter, TA cloning, transformation and culture were performed, and 45 white colonies obtained were cultured overnight in LB medium, and then the plasmid was extracted. From the extracted plasmid, the target fragment was PCR amplified using primers, and the target fragment was confirmed by colony PCR. The plasmid in which the target fragment was confirmed to be inserted was determined for the base sequence by the dideoxy method.
配列解析の結果を表３に示す。得られた４５本のクローンのうち、重複するものが複数見られ、最終的に１３本の配列を得ることが出来た。配列間には、相同的な領域が見られるものもあり、ＰＱＱＧＤＨに特異的に結合する配列の濃縮が起こっていたと考えられた。なお、表３中には両末端のプライマー配列を省略したランダム領域の配列のみを示す。 The results of sequence analysis are shown in Table 3. Among the 45 clones obtained, a plurality of duplicates were found, and finally 13 sequences could be obtained. Some sequences showed homologous regions, and it was considered that enrichment of sequences that specifically bound to PQQGDH had occurred. In Table 3, only the sequence of the random region in which the primer sequences at both ends are omitted is shown.
実施例２−４ Aptamer blotting法による１３個のアプタマーの結合能評価
本実施例においては、得られた１３種類のアプタマーのＰＱＱＧＤＨに対する結合能の評価をAptamer blotting法により行った。
Example 2-4 Evaluation of binding ability of 13 aptamers by Aptamer blotting method In this example, the binding ability of 13 types of aptamers obtained to PQQGDH was evaluated by the Aptamer blotting method.
具体的な方法を以下に示す。ＰＱＱＧＤＨ、ＣＲＰ、ＡＦＰをニトロセルロース膜に滴下し固定化させた（PQQGDH:1.25μg、CRP:5μg、AFP:0.35μg）。その後、１０％血清を用いて、室温で1時間ブロッキングを行った。ＴＢＳ−Ｔ（20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、0.05% Tween、1 mM EDTA、pH 7.4)で洗浄を行った後、ビオチン修飾した一本鎖ＤＮＡ溶液とインキュベートし、さらにＨＲＰ修飾したアビジンとインキュベートして、化学発光により蛋白質に結合したＤＮＡを検出した。 A specific method is shown below. PQQGDH, CRP, and AFP were dropped onto the nitrocellulose membrane and immobilized (PQQGDH: 1.25 μg, CRP: 5 μg, AFP: 0.35 μg). Thereafter, blocking was performed for 1 hour at room temperature using 10% serum. After washing with TBS-T (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween, 1 mM EDTA, pH 7.4), it was incubated with a biotin-modified single-stranded DNA solution, and further with HRP-modified avidin. After incubation, DNA bound to the protein was detected by chemiluminescence.
ＰＱＱＧＤＨに対する各アプタマーの検出結果を図７に示す。ＰＧａ４アプタマーでは、ＰＱＱＧＤＨに対して強度の強いスポットが検出され、競合させたＣＲＰ、ＡＦＰに対してはＤＮＡの結合が見られなかった。ＰＧａ９アプタマーにおいても、ＰＱＱＧＤＨに対する強度の強いスポットが検出されたが、ＣＲＰに対しても結合が見られた。よって、ＰＧａ４、ＰＧａ９ともにＰＱＱＧＤＨに結合するが、特異性はＰＧａ４のほうが高いことが明らかになった。残りの１１種類の配列については、強度の強いスポットは検出されなかったため、ＰＱＱＧＤＨに対する結合能は低いと考えられる。 The detection results of each aptamer for PQQGDH are shown in FIG. In the PGa4 aptamer, a strong spot was detected with respect to PQQGDH, and no DNA binding was observed with the CRP and AFP that were made to compete. In the PGa9 aptamer, a strong spot for PQQGDH was detected, but binding was also observed for CRP. Therefore, it was revealed that PGa4 and PGa9 bind to PQQGDH, but the specificity is higher for PGa4. For the remaining 11 types of sequences, no strong spots were detected, and it is considered that the binding ability to PQQGDH is low.
結合が確認されたＰＧａ４、ＰＧａ９の二次構造をｍｆｏｌｄを用いて予測したところ、図８(A)、(B)で見られるように、いくつかのステムループを形成していることが分かった。また、プライマー配列も構造の形成には必要であることが明らかになった。 When the secondary structure of PGa4 and PGa9 whose binding was confirmed was predicted using mfold, it was found that several stem loops were formed as seen in FIGS. 8 (A) and 8 (B). . It was also revealed that primer sequences are also necessary for structure formation.
実施例２−５ ＳＰＲによるアプタマーの結合能評価
本実施例では、実施例２−４においてＰＱＱＧＤＨに高い結合能を有することが明らかになったＰＧａ４について、ＳＰＲを用いて解離定数の算出を行った。さらに、ＰＧａ４を二つつなげたダイマーアプタマー（Ｄ−ＰＧａ４、配列番号３４）を作製し、結合能がモノマーよりも高くなることを期待して、同様に解離定数の算出を行った。ｍｆｏｌｄを用いて予測したＤ−ＰＧａ４の二次構造を図８(C)に示す。
Example 2-5 Evaluation of Aptamer Binding Ability by SPR In this example, the dissociation constant was calculated using SPR for PGa4 that was found to have a high binding ability to PQQGDH in Example 2-4. . Furthermore, a dimer aptamer (D-PGa4, SEQ ID NO: 34) in which two PGa4s were connected was prepared, and the dissociation constant was calculated in the same manner in the hope that the binding ability would be higher than that of the monomer. The secondary structure of D-PGa4 predicted using mfold is shown in FIG.
以下に詳細な方法を示す。各アプタマーを、ＴＢＳバッファー（20mM Tris-HCl、150mM NaCl、pH 7.4)で 5 pmol/100μLに調製し、95℃で3分間加熱した後、30分間で室温の25℃まで徐冷することにより、フォールディングさせた。調製したアプタマーのうち10μLを流速5μL/minで添加し、Sensor chip SAに固定化した。その後、２μＭ〜２５０ｎＭのＰＱＱＧＤＨを調製し、各々をホロ化した後に１００μｌインジェクトし、アプタマーとＰＱＱＧＤＨの相互作用を観察した。ＳＰＲの測定は、室温、流速１０μｌ／ｍｉｎで行い、アプタマーとＰＱＱＧＤＨの調製及びＳＰＲの固定化buffer、Running bufferは、TBS buffer（20mM Tris-HCl、150mM NaCl、pH 7.4)を、再生化bufferは0.5%SDSを用いた。 The detailed method is shown below. Each aptamer was adjusted to 5 pmol / 100 μL with TBS buffer (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4), heated at 95 ° C. for 3 minutes, and then gradually cooled to 25 ° C. at room temperature for 30 minutes. Folded. 10 μL of the prepared aptamer was added at a flow rate of 5 μL / min and immobilized on Sensor chip SA. Thereafter, 2 μM to 250 nM of PQQGDH was prepared, and after making each holo, 100 μl was injected, and the interaction between the aptamer and PQQGDH was observed. SPR was measured at room temperature and a flow rate of 10 μl / min. Preparation of aptamer and PQQGDH and SPR immobilization buffer and running buffer were TBS buffer (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4), and regeneration buffer was 0.5% SDS was used.
ＰＧａ４を２４０ＲＵ、Ｄ−ＰＧａ４を２９６ＲＵセンサーチップ上に固定化し、その後の評価を行った。各アプタマーの測定結果を図９に示す。ＰＧａ４−６５、Ｄ−ＰＧａ４ともに、ＰＱＱＧＤＨ濃度依存的なシグナルの上昇が観察され、この結果をもとにスキャッチャードプロットから解離定数を算出したところ、ＰＧａ４は１μＭ程度であった。一方、Ｄ-ＰＧａ４については、BIAevaluation 3.1によりグローバルフィッテイングを行い、結合カイネティックパラメーターを算出した（図９参照）。フィッテイングには、１：２（Heteroligand）モードを用いた。Ｄ-ＰＧａ４では２３０〜２８０ｎＭ程度の値となり、ＰＧａ４の解離定数が１μＭ程度であることから、アプタマーをダイマー化することで結合能が上がる可能性が示唆された。 PGa4 was immobilized on 240 RU and D-PGa4 was immobilized on a 296RU sensor chip, and the subsequent evaluation was performed. The measurement results of each aptamer are shown in FIG. For both PGa4-65 and D-PGa4, an increase in PQQGDH concentration-dependent signal was observed, and when the dissociation constant was calculated from the Scatchard plot based on this result, PGa4 was about 1 μM. On the other hand, for D-PGa4, global fitting was performed according to BIAevaluation 3.1, and binding kinetic parameters were calculated (see FIG. 9). For fitting, a 1: 2 (Heteroligand) mode was used. D-PGa4 has a value of about 230 to 280 nM, and the dissociation constant of PGa4 is about 1 μM, suggesting the possibility of increasing the binding ability by dimerizing the aptamer.
実施例２−６ ＰＧａ４、Ｄ-ＰＧａ４、ＰＧａ９のＰＱＱＧＤＨに対する阻害能の評価
本実施例では、実施例２−５で解離定数を算出したＰＧａ４、Ｄ-ＰＧａ４、また実施例２−４でＰＱＱＧＤＨへの結合が確認できているＰＧａ９を用い、ＰＱＱＧＤＨの活性に与える影響について評価を行った。
Example 2-6 Evaluation of inhibitory ability of PGa4, D-PGa4 and PGa9 for PQQGDH In this example, PGa4 and D-PGa4 whose dissociation constants were calculated in Example 2-5, and PQQGDH in Example 2-4 Using PGa9, in which the binding of PQQGDH was confirmed, the effect on the activity of PQQGDH was evaluated.
詳細な実験方法について以下に記載する。酵素活性測定は、ＴＢＳ中においてｍＰＭＳ-ＤＣＩＰ系を用いて行った（終濃度１ ｍＭ ＤＣＩＰ、６ｍＭ ｍ-ＰＭＳ）。ＰＱＱＧＤＨに対して、ＣａＣｌ２、ＰＱＱを終濃度１ｍＭ、１μＭとなるように加え、１０μｌスケールで５分間インキュベートすることによりホロ化を行った。その後、フォールディングした１０μｌのアプタマーを添加し、１５分間インキュベートした。そこに、活性試薬１０μｌを添加し、１分間インキュベートした後に、終濃度６０ｍＭとなるようにグルコースを添加し、攪拌してインキュベートした。１分後、１２５μｌの８Ｍ ｕｒｅａを添加し、攪拌した後に氷中で酵素反応をとめ、６００ｎｍの吸光度を測定することで活性測定を行った。また、アプタマーの代わりにランダムライブラリー（イニシャル）でも同様の実験を行った。 Detailed experimental methods are described below. Enzyme activity was measured using mPMS-DCIP system in TBS (final concentration 1 mM DCIP, 6 mM m-PMS). To PQQGDH, CaCl 2 and PQQ were added so as to have final concentrations of 1 mM and 1 μM, and holoformation was performed by incubating on a 10 μl scale for 5 minutes. Thereafter, 10 μl of folded aptamer was added and incubated for 15 minutes. Thereto was added 10 μl of an active reagent, and after incubation for 1 minute, glucose was added to a final concentration of 60 mM, and the mixture was stirred and incubated. After 1 minute, 125 μl of 8M urea was added, and after stirring, the enzyme reaction was stopped in ice, and the activity was measured by measuring the absorbance at 600 nm. The same experiment was performed using a random library (initial) instead of the aptamer.
各アプタマーの酵素活性に与える影響について図１０に示す。なお、アプタマー非存在下におけるＰＱＱＧＤＨの６０ｍＭグルコースに対する比活性値を１００％とし、各アプタマー存在下における残存活性を示した。結果より、終濃度２．５μＭにおいて、ＰＧａ４では活性値の若干の上昇が見られた。しかし、ランダムラリブラリーにおいても同程度の上昇が見られたことから、ＰＧａ４はＰＱＱＧＤＨの酵素活性に影響を及ぼさないと考えられる。一方、終濃度２．５μＭのＤ-ＰＧａ４については、活性値の５０％前後の低下が見られ、酵素活性を阻害する可能性が示された。 FIG. 10 shows the effect of each aptamer on the enzyme activity. In addition, the specific activity value with respect to 60 mM glucose of PQQGDH in the absence of an aptamer was taken as 100%, and the residual activity in the presence of each aptamer was shown. From the results, a slight increase in the activity value was observed with PGa4 at a final concentration of 2.5 μM. However, since a similar increase was observed in the random library, it is considered that PGa4 does not affect the enzyme activity of PQQGDH. On the other hand, for D-PGa4 with a final concentration of 2.5 μM, a decrease of about 50% in activity value was observed, indicating the possibility of inhibiting enzyme activity.
一方、ＰＧａ９は終濃度１μＭにおいて、活性値の４０％程度の上昇が見られた。ランダムラリブラリーでも活性値の上昇が見られたが、２０％程度の差があることから、ＰＧａ９はＰＱＱＧＤＨの酵素活性を上昇させる作用があることが示唆された。 On the other hand, PGa9 showed an increase of about 40% in the activity value at a final concentration of 1 μM. The activity value was also increased in the random library, but there was a difference of about 20%, suggesting that PGa9 has an effect of increasing the enzyme activity of PQQGDH.
実施例３−１ ＰＱＱＧＤＨ活性を指標にしたＡＥＳセンサーシステムの構築
本願発明者らはトロンビン阻害アプタマーとアデノシンアプタマーを連結させたセンサー素子であるＡＥＳ（aptameric enzyme subunit）のセンサーシステムを報告している（特許文献１）。本研究ではより高感度なセンサーの構築を目指し、トロンビンよりも酵素活性の高いＰＱＱＧＤＨを用いた系でＡＥＳを確立することを試みた。実施例１のスクリーニングの結果得られた、結合能が高く、ＰＱＱＧＤＨ活性を向上させるＭａｇ２をこの新規ＡＥＳの構築に用いることとした。ＰＱＱＧＤＨの活性を指標にしたＡＥＳが構築できた場合、市販のグルコースセンサーへ即応用が可能になると考えられるので、血液を一滴採取するだけで、種々の疾患マーカーの検出が行えると期待される。本研究では、構築したＡＥＳセンサーシステムでモデル標的分子としてアデノシンの検出が行えるかどうか検討した。
Example 3-1 Construction of AES sensor system using PQQGDH activity as an indicator The present inventors have reported a sensor system of AES (aptameric enzyme subunit) which is a sensor element in which a thrombin inhibitor aptamer and an adenosine aptamer are linked ( Patent Document 1). In this study, we tried to establish AES in a system using PQQGDH, which has higher enzyme activity than thrombin. Mag2 having high binding ability and improving PQQGDH activity obtained as a result of the screening in Example 1 was used for the construction of this new AES. If AES using the activity of PQQGDH as an index can be constructed, it can be immediately applied to a commercially available glucose sensor. Therefore, it is expected that various disease markers can be detected by collecting a single drop of blood. In this study, we examined whether the constructed AES sensor system can detect adenosine as a model target molecule.
Ｍａｇ２の全長の二次構造予測結果で、ステムループを形成すると考えられる部位のループ領域（配列番号３中の25nt〜39nt）中の31ntと32ntの間でＭａｇ２を二分割した。この分割部位にそれぞれアデノシンアプタマーとその部分相補鎖を連結させて分離型のＡＥＳを設計することが可能になると考えられる。予想される検出スキームを図１１に示す。 As a result of the secondary structure prediction of the entire length of Mag2, Mag2 was divided into two parts between 31 nt and 32 nt in the loop region (25 nt to 39 nt in SEQ ID NO: 3) at the site considered to form a stem loop. It is considered that a separable AES can be designed by linking an adenosine aptamer and its partially complementary strand to each of the split sites. An expected detection scheme is shown in FIG.
アデノシンアプタマーとその１１ｍｅｒの部分相補鎖を、分割したＭａｇ２にそれぞれ連結したサンプルを等量ずつ混合した溶液（この混合溶液をＡＥＳとする）を、Binding buffer（１０ｍＭ ＭＯＰＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０）中でフォールディングさせた。ＰＱＱＧＤＨ １０μｌ（終濃度 ０．４ｎＭ）とＣａＣｌ２とＰＱＱの混合液１０μｌを混合し、１０分間室温でインキュベートしてＰＱＱＧＤＨをホロ化した。その後、ホロ化したＰＱＱＧＤＨ溶液に、ＡＥＳを１０μｌ（終濃度 １２ｎＭ）を加えて、すぐに、アデノシン溶液を１０μｌ（終濃度 ５００μＭ）加え、混合溶液４０μｌとし、これを１５分間室温でインキュベートした。インキュベート後の溶液に１３１μｌのBinding buffer（１０ｍＭ ＭＯＰＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０）、９μｌの活性試薬（終濃度 ０．６ｍＭ ＰＭＳ、０．０６ｍＭ ＤＣＩＰ）、２０μｌのグルコース（終濃度 ２０ｍＭ）を加え、３０秒間、６００ｎｍの吸光度変化を測定した。なお、アデノシンアプタマーとその部分相補鎖を連結していない、分割したＭａｇ２の混合サンプル（この混合溶液をｄｉｖＭａｇ２とする）に関しても、同様の測定を行った。 A solution in which an equal amount of a sample in which adenosine aptamer and its 11-mer partially complementary strand were respectively linked to the divided Mag2 (this mixed solution is referred to as AES) was mixed with a binding buffer (10 mM MOPS, 1 mM CaCl 2 , pH 7.0). ) Folded inside. 10 μl of PQQGDH (final concentration 0.4 nM) and 10 μl of a mixture of CaCl 2 and PQQ were mixed and incubated at room temperature for 10 minutes to make PQQGDH holo. Thereafter, 10 μl of AES (final concentration 12 nM) was added to the hololated PQQGDH solution, and immediately 10 μl of adenosine solution (final concentration 500 μM) was added to make 40 μl of the mixed solution, which was incubated at room temperature for 15 minutes. 131 μl of Binding buffer (10 mM MOPS, 1 mM CaCl 2 , pH 7.0), 9 μl of active reagent (final concentration 0.6 mM PMS, 0.06 mM DCIP) and 20 μl of glucose (final concentration 20 mM) are added to the solution after incubation. The change in absorbance at 600 nm was measured for 30 seconds. The same measurement was performed on a mixed sample of Mag2 that was not linked to the adenosine aptamer and its partially complementary strand (this mixed solution is referred to as divMag2).
Ｍａｇ２を用いたＡＥＳにアデノシンを加えると、ＰＱＱＧＤＨ活性が低下する傾向を示した。一方で、アデノシンアプタマーとその部分相補鎖を連結していないＭａｇ２の分割体では、ＡＥＳと比較してアデノシン添加時のＰＱＱＧＤＨ活性の減少率が小さかった（図１２）。これより、構築したＡＥＳを用いて、ＰＱＱＧＤＨ活性を指標にしたアデノシンの検出が可能であると考えられる。 When adenosine was added to AES using Mag2, the PQQGDH activity tended to decrease. On the other hand, in the Mag2 fragment in which the adenosine aptamer and its partially complementary strand were not linked, the decrease rate of PQQGDH activity upon addition of adenosine was small compared to AES (FIG. 12). From this, it is considered that detection of adenosine using PQQGDH activity as an index is possible using the constructed AES.
実施例３−２ 構築したＡＥＳセンサーシグナルの濃度依存性の検討
分割したＭａｇ２に、アデノシンアプタマーとその１１ｍｅｒの部分相補鎖をそれぞれ連結したサンプルを等量ずつ混合した溶液（この混合溶液をＡＥＳとする）をフォールディングさせた。アポ型のＰＱＱＧＤＨ溶液をＰＱＱ、ＣａＣｌ２と１０分間室温でインキュベートして４ｎＭのホロ化ＰＱＱＧＤＨ溶液を調製し、氷上に静置した。Protein lo bind tubeに、調製したＰＱＱＧＤＨ 溶液を２０μｌ（終濃度 ０.４ｎＭ）、ＡＥＳｄｉｖ２を１０μｌ（終濃度 １２ｎＭ）、様々な濃度のアデノシンまたはシチジン溶液を１０μｌ（それぞれ終濃度0、0.25、0.35、0.5、1.0、1.25mM）を順次加え、５分間室温でインキュベートした。インキュベート後の溶液に１３１μｌのBinding buffer、９μｌの活性試薬（終濃度 ０．６ｍＭ ＰＭＳ、０．０６ｍＭ ＤＣＩＰ）、２０μｌのグルコース（終濃度 ２０ｍＭ）を加え、２０秒間、６００ｎｍの吸光度変化を測定した。
Example 3-2 Examination of Concentration Dependence of Constructed AES Sensor Signal A solution in which an equal amount of a sample in which adenosine aptamer and its 11-mer partial complementary strand were linked to the divided Mag2 was mixed (this mixture solution is referred to as AES) ) Was folded. An apo-type PQQGDH solution was incubated with PQQ and CaCl 2 for 10 minutes at room temperature to prepare a 4 nM holo-PQQGDH solution and left on ice. In a protein lobin tube, 20 μl of the prepared PQQGDH solution (final concentration 0.4 nM), 10 μl of AESdiv2 (final concentration 12 nM), 10 μl of various concentrations of adenosine or cytidine solution (final concentrations 0, 0.25, 0.35, 0.5, respectively) , 1.0, 1.25 mM) were sequentially added and incubated at room temperature for 5 minutes. 131 μl of Binding buffer, 9 μl of active reagent (final concentration 0.6 mM PMS, 0.06 mM DCIP) and 20 μl of glucose (final concentration 20 mM) were added to the solution after incubation, and the change in absorbance at 600 nm was measured for 20 seconds.
図１３に、アデノシンの添加時のＡＥＳシグナル値を同濃度のシチジン添加時のＡＥＳシグナル値で割ってノーマライズした、ＡＥＳシグナルのアデノシン濃度依存性を示す。値のばらつきが大きく、また、ＡＥＳシグナル強度も小さいが、アデノシン濃度依存的なシグナルが得られていると考えられる。 FIG. 13 shows the dependence of the AES signal on the adenosine concentration, normalized by dividing the AES signal value at the time of addition of adenosine by the AES signal value at the time of adding cytidine at the same concentration. It is considered that a signal dependent on adenosine concentration is obtained although the variation in values is large and the AES signal intensity is also small.
Claims (16)
(a) 配列表の配列番号２、３及び２９のいずれかに示される塩基配列。
(b) (a)の塩基配列のうち１ないし数個の塩基が置換し、欠失し及び／又は挿入された塩基配列であって、その二次構造においてステム部及びループ部の位置関係及びサイズが配列番号２、３及び２９のいずれかに示される塩基配列と等しい塩基配列。
(c) (a)又は(b)の塩基配列を部分配列として含む塩基配列であって、その二次構造においてステム部及びループ部の位置関係及びサイズが配列番号２、３及び２９のいずれかに示される塩基配列と等しい塩基配列。 An aptamer molecule comprising any one of the following base sequences (a) to (c), which has the ability to bind to pyrroloquinoline quinone glucose dehydrogenase (PQQGDH) and increase the enzyme activity of PQQGDH.
(a) The base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 2, 3 and 29 in the sequence listing.
(b) A base sequence in which one to several bases are substituted, deleted and / or inserted in the base sequence of (a), wherein the positional relationship between the stem part and the loop part in the secondary structure and A base sequence whose size is equal to the base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 2, 3, and 29.
(c) A base sequence comprising the base sequence of (a) or (b) as a partial sequence, wherein the positional relationship and size of the stem part and loop part in the secondary structure is any one of SEQ ID NOs: 2, 3 and 29 A base sequence equal to the base sequence shown in.
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