KR20220143324A - 젖산에 의한 종양 관련 대식세포의 m2형 분화 및 종양 성장의 억제를 위한 후각수용체의 용도 - Google Patents

젖산에 의한 종양 관련 대식세포의 m2형 분화 및 종양 성장의 억제를 위한 후각수용체의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 젖산에 의한 종양 관련 대식세포의 M2형 분화 및 종양 성장의 억제를 위한 후각수용체의 용도에 관한 것으로, 구체적으로, 본 발명자들은 젖산-활성화된 OR Olfr78이 대식세포 젖산 센서로서 기능할 것으로 가정하고, 골수 유래 대식세포(bone marrow derived macrophages; BMDMs) 상의 Olfr78이 종양-유래 젖산을 감지하고, 젖산 유도 M2 분극화를 매개하는지 확인하였다. 대식세포 상에서 젖산 센서로서 Olfr78의 역할에 대한 연구를 위해, 본 발명자들은 Olfr78 -/- 마우스를 사용하였다. 또한, 본 발명자들은 종양 조건 배지(tumor conditioned media; TCM)에서 Olfr78에 의해 감지되는 인자들을 확인하고자 하였고, TCM에서 젖산과, 일부 조건에서는 아세트산이 종양 친화적인 M2-TAMs의 Olfr78-매개 생성에 관여하는 주요 인자라는 것을 밝혀냈다. 또한, Olfr78은 TAMs의 젖산-유도 M2 표현형을 매개하는 Gpr132와 이형중합체(heterodimer)를 형성하는 것으로 나타났다. 최종적으로, Olfr78 결핍은 종양 진행 및 전이를 억제시켰고, 생체 내에서(in vivo) 항-종양 면역을 개선한다는 것을 밝혀냈다. 본 발명에 따르면, Olfr78-젖산 상호작용은 종양 진행에 주요 역할을 수행하므로, Olfr78-젖산 축을 표적하는 것은 표적 암 치료에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

젖산에 의한 종양 관련 대식세포의 M2형 분화 및 종양 성장의 억제를 위한 후각수용체의 용도{Use of olfactory receptor for the inhibition of lactate-induced M2 plarization of tumor-associated macrophages and tumor growth}
본 발명은 젖산에 의한 종양 관련 대식세포의 M2형 분화 및 종양 성장의 억제를 위한 후각수용체의 용도에 관한 것이다.
후각수용체(Odorant receptors; ORs)는 G 단백질-결합 수용체(G protein-coupled receptors; GPCRs)의 가장 큰 서브패밀리로서, 785개의 인간 GPCRs 중 388개 및 1,678개의 마우스 GPCRs 중 1,037개를 차지한다. GPCRs은 약물 표적의 주요 타입이고, 광범위하게 연구되었다. 다만, 기존 연구들은 코에서의 ORs 기능에 초점을 맞추고 있으며, 비-후각 조직에서의 이소성 발현 및 기능에 대한 연구는 부족한 실정이다. 벌크(bulk) 및 단일세포 RNA 서열분석과 같은 차세대 서열분석 기술의 발달은 낮게 발현되거나 또는 특정 세포 타입에서 발현되는 유전자들의 검출 및 분석이 가능하도록 만들었다. 이에 따라, 이소성 ORs의 기능에 대한 연구는 급속히 증가하고 있고, 상기 ORs은 잠재적인 약물 표적으로 제안되고 있다. 그럼에도 불구하고, 종양에서 약물 표적으로서 이소성 ORs에 대한 연구는 종양 미세환경(tumor microenvironment; TME)과 같은 생체 내(in vivo) 병태생리학적 조건에 있어서 ORs의 식별 및 특성화의 부족으로 인해 한계가 있다.
종양-관련 대식세포(Tumor-associated macrophages; TAMs)는 TME의 주요 성분 중 하나로서, 종양 진행, 혈관생성, 침습, 전이 및 면역억제를 촉진한다. 대식세포는 TME에서 젖산 및 인터루킨(interleukin; IL)-4, IL-13, IL-10과 같은 자극, 대식세포 콜로니 자극 인자와, 코르티코스테로이트에 반응하여, 종양 친화적인 M2-TAMs로 분화한다. 종양 지형에서 생산된 젖산은 여러 세포 타입에서 발현되는 모노카르복실레이트 수송체에 의해 수송되고, 젓산 탈수소효소(lactate dehydrogenase)에 의해 탄소원으로 사용된다. 또한, 이는 GPCRs에 결합하는 신호 분자로서 작용한다. 젖산은 TME에서 대식세포, 효과 T 세포 및 조절 T 세포(Tregs)를 포함하는 많은 세포 타입에 영향을 미친다. 이들 중, M2-TAMs를 생성하기 위한 대식세포 분극화는 TME에서 면역조절에 중요한 역할을 수행하는데, 이는 차례로 종양 진행 및 전이를 촉진한다. 다만, 종양 진행을 향상시키는 M2-TAMs의 생성을 유도하는데 있어, 젖산 및 대식세포 사이의 상호작용은 아직 명확히 밝혀지지 않았다.
한국공개특허 제10-2020-0087714호 (2020.07.21 공개)
본 발명의 목적은 후각수용체 Olfr78 또는 OR51E2의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 분리된 대식세포에서 후각수용체 Olfr78 또는 OR51E2의 발현 또는 활성 정도가 감소된 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 분리된 대식세포에서 후각수용체 Olfr78 또는 OR51E2와, Gpr132의 결합 정도가 감소된 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 후각수용체 Olfr78 또는 OR51E2를 유효성분으로 포함하는, 시험관(in vitro) 내 젖산 또는 아세트산에 의해 유도되는 대식세포의 M2 분극화 유도용 시약 조성물 및 이를 이용한 젖산 또는 아세트산에 의해 유도되는 대식세포의 M2 분극화 유도 방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 후각수용체 Olfr78 또는 OR51E2의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 분리된 대식세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; (2) 상기 시험물질을 접촉한 대식세포에서 후각수용체 Olfr78 또는 OR51E2의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및 (3) 대조군 시료와 비교하여 상기 Olfr78 또는 OR51E2의 발현 또는 활성 정도가 감소된 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 분리된 대식세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; (2) 상기 시험물질을 접촉한 대식세포에서 후각수용체 Olfr78 또는 OR51E2와, Gpr132의 결합 정도를 측정하는 단계; 및 (3) 대조군 시료와 비교하여 상기 Olfr78 또는 OR51E2와, Gpr132의 결합 정도가 감소된 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 후각수용체 Olfr78 또는 OR51E2를 유효성분으로 포함하는, 시험관(in vitro) 내 젖산 또는 아세트산에 의해 유도되는 대식세포의 M2 분극화 유도용 시약 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 시험관 내에서(in vitro) 후각수용체 Olfr78 또는 OR51E2를 대식세포에 처리하는 단계를 포함하는 젖산 또는 아세트산에 의해 유도되는 대식세포의 M2 분극화 유도 방법을 제공한다.
본 발명은 젖산에 의한 종양 관련 대식세포의 M2형 분화 및 종양 성장의 억제를 위한 후각수용체의 용도에 관한 것으로, 구체적으로, 본 발명자들은 젖산-활성화된 OR Olfr78이 대식세포 젖산 센서로서 기능할 것으로 가정하고, 골수 유래 대식세포(bone marrow derived macrophages; BMDMs) 상의 Olfr78이 종양-유래 젖산을 감지하고, 젖산 유도 M2 분극화를 매개하는지 확인하였다. 대식세포 상에서 젖산 센서로서 Olfr78의 역할에 대한 연구를 위해, 본 발명자들은 Olfr78 -/- 마우스를 사용하였다. 또한, 본 발명자들은 종양 조건 배지(tumor conditioned media; TCM)에서 Olfr78에 의해 감지되는 인자들을 확인하고자 하였고, TCM에서 젖산과, 일부 조건에서는 아세트산이 종양 친화적인 M2-TAMs의 Olfr78-매개 생성에 관여하는 주요 인자라는 것을 밝혀냈다. 또한, Olfr78은 TAMs의 젖산-유도 M2 표현형을 매개하는 Gpr132와 이형중합체(heterodimer)를 형성하는 것으로 나타났다. 최종적으로, Olfr78 결핍은 종양 진행 및 전이를 억제시켰고, 생체 내에서(in vivo) 항-종양 면역을 개선한다는 것을 밝혀냈다. 본 발명에 따르면, Olfr78-젖산 상호작용은 종양 진행에 주요 역할을 수행하므로, Olfr78-젖산 축을 표적하는 것은 표적 암 치료에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 Olfr78이 마우스 BMDMs의 젖산-유도 M2 분극화를 매개한다는 결과를 나타낸다.
도 2는 젖산이 THP-1 인간 단핵구의 M2 분극화를 유도한다는 결과를 나타낸다.
도 3은 OR51E2가 THP-1 인간 단핵구의 젖산-유도 M2 분극화를 매개한다는 결과를 나타낸다.
도 4는 부티르산은 아니지만, 젖산 및 아세트산이 마우스 BMDMs의 TCM-유도 M2 분극화에서 주요 분자라는 결과를 나타낸다.
도 5는 젖산이 THP-1 인간 단핵구의 TCM-유도 M2 분극화에서 주요 분자라는 결과를 나타낸다.
도 6은 Olfr78이 Gpr132와 이형중합체(heterodimer)를 형성하여, 마우스 BMDMs의 젖산-유도 M2 분극화를 매개한다는 결과를 나타낸다.
도 7은 Olfr78의 결핍이 항-종양 면역을 향상시켜 LLC 마우스 폐 종양의 진행 및 전이를 억제한다는 결과를 나타낸다.
도 8은 Olfr78의 결핍이 비장에서 면역세포군을 변화시키고, LLC 마우스 폐 종양을 가진 마우스에서 항-종양 면역을 향상시킨다는 결과를 나타낸다.
도 9는 Olfr78의 결핍이 EO771 마우스 유방 종양의 진행 및 전이를 억제한다는 결과를 나타낸다.
도 10은 클로드로나이트(clodronate) 리포좀을 사용한 대식세포의 결핍이 LLC 동종(syngeneic) 폐 종양을 가진 마우스에서 종양 진행을 억제한다는 결과를 나타낸다.
도 11은 TCGA 분석을 기초로, 높은 OR51E2 발현을 가진 환자들에 비해, 낮은 OR51E2 발현을 가진 환자들이 더 오랜 생존율을 갖는다는 결과를 나타낸다.
본 발명은 후각수용체 Olfr78 또는 OR51E2의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상세하게는, 상기 Olfr78 또는 OR51E2의 발현 억제제는 Olfr78 또는 OR51E2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있고, 상기 Olfr78 또는 OR51E2의 활성 억제제는 Olfr78 또는 OR51E2 단백질에 특이적으로 결합하는 저분자 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 조성물은 젖산 또는 아세트산에 의해 유도되는 대식세포의 M2 분극화를 억제할 수 있다.
바람직하게는, 상기 암은 폐암 또는 유방암일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 포함하여 의약 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다. 본 발명의 의약 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 의약 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
또한, 본 발명은 (1) 분리된 대식세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; (2) 상기 시험물질을 접촉한 대식세포에서 후각수용체 Olfr78 또는 OR51E2의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및 (3) 대조군 시료와 비교하여 상기 Olfr78 또는 OR51E2의 발현 또는 활성 정도가 감소된 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 분리된 대식세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; (2) 상기 시험물질을 접촉한 대식세포에서 후각수용체 Olfr78 또는 OR51E2와, Gpr132의 결합 정도를 측정하는 단계; 및 (3) 대조군 시료와 비교하여 상기 Olfr78 또는 OR51E2와, Gpr132의 결합 정도가 감소된 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 조성물은 젖산 또는 아세트산에 의해 유도되는 대식세포의 M2 분극화를 억제할 수 있다.
바람직하게는, 상기 항암제는 폐암 또는 유방암에 대한 항암제일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 "시험물질"은 유전자의 발현량에 영향을 미치거나, 단백질의 발현 또는 활성에 영향을 미치거나 또는 단백질 사이의 결합에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 후보 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 후각수용체 Olfr78 또는 OR51E2를 유효성분으로 포함하는, 시험관(in vitro) 내 젖산 또는 아세트산에 의해 유도되는 대식세포의 M2 분극화 유도용 시약 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 시험관 내에서(in vitro) 후각수용체 Olfr78 또는 OR51E2를 대식세포에 처리하는 단계를 포함하는 젖산 또는 아세트산에 의해 유도되는 대식세포의 M2 분극화 유도 방법을 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
< 실험예 >
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 세포 배양
LLC 폐 및 B16F10 흑색종 마우스 종양 세포주 및 MDA-MB231 인간 유방 종양 세포주는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM; HyClone, South Logan, UT)에서 배양하였다. 4T1 마우스 유방 종양 세포주 및 MCF7 유방 및 A549 폐 인간 종양 세포주는 RPMI medium (HyClone)에서 배양하였다. 모든 세포 배양은 10% 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS, ThermoFisher, Waltham, MA)이 첨가되었고, 5% CO2 포함 습윤 대기에서 37℃로 유지되었다.
2. BMDMs의 M1 및 M2 분극화
BMDMs는 C57BL6 또는 Balb/c 마우스의 경골 및 대퇴골에서 분리되었고, 10 ng/ml 대식세포-콜로니 자극 인자(Gibco, Carlsbad, CA) 및 10% FBS가 첨가된 DMEM에서 7일 동안 배양되었다. 배양 배지는 격일로 교체하였다. M1 분극화를 위해, BMDMs는 20 ng/ml 재조합 마우스 IFN-γ(R&D Systems, Minneapolis, MN)와 100 ng/ml LPS와 함께, 24-48 시간 동안 배양되었다. M2 분극화를 위해, BMDMs는 20 ng/ml 재조합 마우스 IL-4과 함께, 24-48 시간 동안 배양되었다. 젖산-매개 M2 분극화를 위해, BMDMs는 10 mM 젖산(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)으로, 5% CO2 포함 습윤 대기에서 37℃로 24-48 시간 동안 처리되었다.
3. 유세포 분석
Anti-CD11b, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD86, anti-F4/80, anti-CD206, anti-CD163 및 anti-Gr1 항체는 BioLegend (San Diego, CA)로부터 구입하였다. Anti-Olfr78 항체는 LSBio (Seattle, WA)로부터 구입하였다. Anti-CD206 및 anti-CD86 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX)로부터 구입하였다. 세포들은 4% 파라포름알데히드로 고정시킨 후, 미표지된 1차 항체 또는 염료-표지된 항체로 암소에서 4℃로 30분 동안 반응시켰다. 미표지된 1차 항체(anti-Olfr78, anti-CD206, and anti-CD86)로 처리된 세포들을 씻어냈고, 염료-표지된 2차 항체로 반응시켰다. 유세포 분석기(BD Bioscience, San Jose, CA)를 사용하여, 적어도 10,000개 이상의 이벤트를 분석하였다. CellQuest Pro software (BD Bioscience)를 사용하여, 데이터를 평가하였다. 종양 조직으로부터 세포 현탁물을 제조하기 위해서, 새로 절단된 종양을 여러 조각으로 단편화시켰고, 2-3 mm3 조각으로 잘라서, collagenase D (Roche, Basel, Switzerland) 및 DNase (Sigma-Aldrich)로 37℃에서 40분 동안 반응시켰다. 조직 샘플은 100 μm 세포 스트레이너(Falcon, Corning, NY)를 통해 여과시켜, 절단된 세포들을 수집하였다. 수집된 세포들은 FBS를 포함하는 인산 완충된 식염수에 재현탁시켰고, 유세포 분석에 적용하였다.
4. 정량적 역전사 -중합효소 연쇄반응(Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction; qRT-PCR)
QIAzol lysis reagent (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여, 세포들을 용해시켰다. miRNeasy Mini Kit (Qiagen)를 사용하여, 세포 용해물로부터 RNA를 분리하였고, qRT-PCR에 적용하였다. Arg1 , IL-10, IL-4, TGF -β, IL- 12p40 , IFN -γ 및 β-actin을 표적하는 프라이머들은 Bioneer Inc. (Daejeon, Korea)로부터 얻었다. PrimerScript 1st strand cDNA Synthesis Kit (Takara, Shiga, Japan)를 사용하여, cDNA를 합성하였다. SYBRGreen (Qiagen)을 사용한 qPCR을 real time cycler (Bio-Rad, Hercules, CA) 상에서 수행하였다. β-actin은 내재성 대조군으로 사용되었다. 상대적 발현을 측정하기 위해 사용된 데이터는 Livak method에 따라 분석하였다. 프라이머 서열을 표 1에 기재하였다.
Figure pat00001
5. 면역형광 현미경 분석
세포(4-웰 챔버 내 웰 당 1 × 105 세포)는 4% 파라포름알데히드로 고정시켰고, Olfr78 및 Gpr132 (1:100 희석, Santa Cruz Biotechnology)에 대한 항체로 24℃에서 1시간 동안 또는 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 그 후, 세포는 플루오로포어(fluorophore)-표지된 2차 항체로 24℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 세포는 4’,6-디아미디노-2-페닐인돌(4’,6-diamidino-2-phenylindole; DAPI)로 염색하여 핵을 표지하였고, Prolong Gold® anti-fade mounting reagent (Life Technologies, Eugene, OR)으로 마운팅하였으며, 공초점 현미경 하에서 관측하였다.
6. 젖산 및 아세트산 농도 측정 및 효소-결합 면역흡착 분석(enzyme-linked immunosorbent assays; ELISAs )을 통한 사이토카인 농도 측정
80% 컨플루언시로 배양된 세포의 TCM 내 젖산 및 아세트산의 농도는 젖산 및 아세트산 비색 분석 키트(BioVision, Milpitas, CA)를 사용하여 측정하였다. 간단히 설명하면, 매뉴얼에 따라 50 μl의 TCM을 젖산 또는 아세트산 효소 혼합물 및 프로브와 혼합하였고, 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 대식세포의 조건 배지 내 사이토카인의 농도는 cytokine ELISA kits (R&D Systems)를 사용하여 측정하였다. 간단히 설명하면, 100 μl의 조건 배지를 IL-4, IL-10 및 TGF-β에 대한 항체로 미리 코팅된 플레이트에 첨가하였다. 샘플들은 비오틴으로 접합된 관련 항체로 반응시킨 후, 겨자무 과산화효소 표지된 스트렙타비딘으로 반응시켰다. Microplate reader를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 젖산, 아세트산 및 사이토카인들의 농도는 표준 곡선에 따라 계산하였다.
7. 근접 결합 분석(proximity ligation assay; PLA )
BMDMs는 토끼 anti-Olfr78 항체 (LifeSpan Biosciences, Seattle, WA) 및 생쥐 anti-Gpr132 항체 (Sigma-Aldrich)로 24℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 토끼 IgG 및 생쥐 IgG는 대조군으로 사용되었다. 이후, 세포들은 항-토끼 MINUS PLA 프로브 및 항-생쥐 PLUS PLA 프로브로 37℃에서 60분 동안 반응시켰다. 세척 후, 세포들은 연결 스톡(ligation stocks) 및 리가제 혼합물로 37℃에서 30분 동안 반응시켰고, 이후 증폭 스톡(amplification stocks) 및 폴리머라제 혼합물로 37℃에서 100분 동안 반응시켰다. Duolink® in situ mounting medium (Sigma-Aldrich)으로 샘플들을 마운팅시켰고, 공초점 현미경(Nanoscope, Daejeon, Korea) 하에서 관측하였다.
8. 공동-면역침전 분석 및 웨스턴 블랏 분석
공동-면역침전 분석을 위해, 세포들은 M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)로 용해시켰다. 세포 용해물은 2 μg의 Olfr78 또는 Gpr132에 대한 항체로 4℃에서 밤새도록 반응시켰고, 이후 100 μl의 protein A-agarose beads (ThermoFisher Scientific)로 4℃에서 4시간 동안 교반하여 반응시켰다. 비드를 끓였고, 용출물을 Olfr78 또는 Gpr132에 대한 항체와 함께 웨스턴 블랏팅에 적용하였다. 40 마이크로그램의 단백질을 10% SDS-PAGE 젤에 전기영동시켰고, 멤브레인(MilliPore, Burlington, MA)으로 옮겼다. 상기 멤브레인은 iNOS (Abcam, Cambridge, UK), Arg1 (Abcam) 및 β-actin (Santa Cruz Biotechnology)에 대한 항체로 4℃에서 밤새도록 반응시킨 후, 2차 항체로 상온에서 2시간 동안 반응시켰고, 그 후 화학형광 기질(ThermoFisher Scientific)에 노출시켰다. LAS1000 enhanced chemiluminescence detection system (Fuji Film, Minato, Tokyo)을 사용하여, 신호를 가시화하였다.
9. 루시퍼라제 분석
루시퍼라제 분석은 Dual-Glo™ Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI)을 이용하여 수행하였다. 간단히 설명하면, Mock-, Olfr78-, Gpr132- 또는 Olfr78/Gpr132-일시적으로 형질감염된 Hana3A 세포를 CD293 배지에 희석된 여러 농도의 소듐 락테이트로 37℃에서 4시간 동안 자극하였다. 반딧불이 루시퍼라제의 활성은 레닐라 루시퍼라제에 대해 표준화시켰다. SpectraMax L microplate reader (Molecular Devices, San Jose, CA) 상에서 발광도를 측정하였다.
10. Olfr78의 형질감염 및 발현
lucy-flag-rho-Olfr78-pME18s 발현 벡터를 구축하였고, Olfr78 -/- BMDMs 내로 형질감염시켰다. 형질감염을 위해, 세포 (1 × 105)를 100 μl의 무-항생제 OptiMEM 배지에서 배양하였고, 0.5 μg의 Olfr78 발현 벡터와 2 μl의 Lipofectamine 2000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)을 사용하여 형질감염시켰다. Flag 및 Olfr78에 대한 항체들을 사용하여, 면역형광 염색을 통해 Olfr78의 발현을 확인하였다.
11. siRNA 형질감염
OR51E2 및 마우스 Gpr132에 대한 siRNAs는 각각 Bioneer 및 Dharmacon (Lafayette, CO)에서 구입하였다. BMDMs (1 × 105)은 100 μl의 무-항생제 OptiMEM 배지에서 배양되었고, 25 pmol의 siRNA와 2 μl의 Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher Scientific)를 사용하여 형질감염시켰다. 웨스턴 블랏 분석을 통해 유전자 녹아웃을 확인하였다.
12. 동물 모델
6-8주령 C57BL6 마우스는 Orient Bio (Seongnam, Korea)로부터 구입하였다. Olfr78 -/- C57BL6 마우스는 Dr. Jennifer Pluznick (Johns Hopkins University)로부터 제공받았다. 마우스는 경북대학교(permission No. 2015-0017) 또는 대구경북과학기술원 동물실험윤리위원회의 가이드라인에 따라 사육되었다. LLC 동종(syngeneic) 폐 종양 모델은 수컷 마우스의 오른쪽 아래 옆구리에 1×106 LLC 세포를 피하 주입하여 제작하였다. EO771 동종 유방 종양 모델은 암컷 마우스의 왼쪽 아래 유방 지방 패드에 1×106 EO771 세포를 이식하여 제작하였다. 치료 후, 마우스는 종양 및 비장 내 면역세포 분석을 위해 희생시키거나, 생존율 측정을 위해 유지시켰다.
13. 통계 분석
데이터는 평균 ± 표준 편차로 나타냈다. 모든 통계학적 분석은 GraphPad Prism software (GraphPad Software, San Diego, CA)를 사용하여 수행하였다. 통계적 유의성은 a one-way ANOVA with Tukey’s multiple comparison test 또는 a two-way ANOVA with the Bonferroni multiple comparison test를 통해 결정하였다. P < 0.05는 유의성이 있다고 판단하였다.
< 실시예 1> 젖산을 감지하고, 대식세포의 젖산-유도 M2 분극화를 매개하는 Olfr78
젖산은 용량 의존적 방식으로 Olfr78을 활성화시키고, 4-21 mM의 EC50을 갖는다. 대식세포의 젖산-유도 M2 분극화에 있어 Olfr78과의 관련성을 확인하기 위해서, 본 발명자들은 Olfr78 +/+ (WT) 및 Olfr78 -/- 마우스로부터 분리한 BMDMs에서 Olfr78이 발현되는지 조사하였다. WT 및 Olfr78 -/- 마우스로부터 각각 분리된 BMDMs의 약 41% 및 1%에서 Olfr78이 발현되었다(도 1A). 인간 및 마우스 종양 세포의 TCM에서 젖산 온도는 약 8-20 mM이었다(도 2A). 즉, 종양에서 생산되는 젖산의 농도는 Olfr78을 활성화시키는 젖산의 생리학적 농도 범위와 유사하다. 다음으로, 본 발명자들은 BMDMs을 M1 및 M2 대식세포로 분화시켜, Olfr78의 발현 수준이 대식세포 분극화에 따라 조절되는지를 확인하였다. 젖산, TCM 및 IL-4는 M2 분극화를 자극하기 위해 사용된 반면, 지질다당체(lipopolysaccharide; LPS) 및 인터페론(interferon; IFN)-γ (L+I)는 M1 분극화를 자극하기 위해 사용되었다. 젖산, TCM 및 IL-4에 대한 반응으로 BMDMs에서 M2 대식세포로의 분화에 따라, Olfr78 발현은 상당히 증가되었으나(P < 0.01), L+I-유도 M1 분극화에 의해서는 상당히 감소하였는데(P < 0.05)(도 1B), 이는 Olfr78이 M2 대식세포 마커라는 점을 뒷받침한다. 대식세포 분극화에 있어 Olfr78의 영향을 확인하기 위해서, 본 발명자들은 WT 및 Olfr78 -/- BMDMs가 M1 및 M2 대식세포로 분화될 때, CD206과 같은 M2 대식세포 마커들의 단백질 수준(도 1C)과, IL-4, IL-10 및 TGF -β의 mRNA 수준(도 1E-G)을 측정하였고, CD86과 같은 M1 대식세포 마커(도 1D)와, IL-12 및 IFN -γ의 mRNA 수준(도 1H 및 도 1I)을 측정하였다. 미처리 BMDMs (-)에 비해 젖산-처리 WT BMDMs에서 CD206의 단백질 수준(도 1C)과, IL-4, IL-10 및 TGF -β의 mRNA 수준(도 1E-G)은 더 높아졌고(P < 0.001), CD86의 단백질 수준(도 1D)과, IL-12 및 IFN-γ의 mRNA 수준(도 1H 및 도 1I)은 더 낮아졌다. 유사하게, WT BMDMs에서 TCM 및 IL-4 처리는 CD206를 상향 조절하였고, CD86을 하향조절한 반면, L+I 처리는 반대 효과를 이끌어냈다(도 1C 및 도 1D). 다만, 젖산-처리 Olfr78 -/- BMDMs는 미처리 BMDMs에 비해 M2-특이 마커들의 상향조절 또는 M1-특이 마커들의 하향조절을 나타내지 않았다(도 1C-I). Olfr78 -/- BMDMs에서 IL-4 처리는 여전히 CD206를 상향조절하였고(도 1C), CD86을 하향조절하였는데(도 1D), 이는 Olfr78이 젖산 및 TCM에 의해서 유도되는 대식세포의 M2 분극화에는 필요하지만, IL-4에 의해 유도되는 대식세포의 M2 분극화에는 관련되지 않는다는 점을 시사한다. 다음으로, 본 발명자들은 Flag-tagged Olfr78 발현 벡터로 형질감염시켜, Olfr78 -/- BMDMs에서 Olfr78 발현을 회복시켰다. anti-Flag 및 anti-Olfr78 항체를 사용한 면역 염색 결과, 형질감염된 Olfr78 -/- BMDMs에서 외인성 Olfr78의 발현을 확인하였다(도 1J). Olfr78 -/- BMDMs에서의 외인성 Olfr78 발현은 WT 및 Olfr78 -/- BMDMs에 비해, 사이토카인들의 mRNA 수준에 있어 젖산-유도 변화를 일부 회복시켰다(도 1E-I).
인간 대식세포의 M2 분극화에서 ORs의 영향을 확인하기 위해서, THP-1 인간 불멸화된 단핵구를 포르볼 미리스테이트 아세트산(phorbol myristate acetate; PMA)로 처리한 후, L+I, IL-4, TCM 또는 젖산으로 처리하였다. THP-1 세포에서 마우스 Olfr78의 인간 유사체인 OR51E2의 단백질(도 2B) 및 mRNA(도 2C) 수준은 젖산, TCM 및 IL-4 처리에 따라 상당히 증가하였으나(P < 0.01), L+I 처리에 따라 감소하였는데(P < 0.05), 이는 마우스 Olfr78와 유사하게, OR51E2가 M2-분극화된 인간 대식세포에서 유도된다는 점을 뒷받침한다. IL-4 및 TCM과 유사하게, 젖산 처리는 Arg1, CD206, CD163 및 IL-10과 같은 M2 대식세포 마커의 수준을 증가시켰다(도 2D-H). 한편, CD86, TNF -α 및 IL-12B와 같은 M1 대식세포 마커들의 수준에는 영향을 미치지 않았고(도 2I-K), 미처리 세포에 비해 iNOS의 수준은 감소시켰다(도 2D 및 도 2E).
다음으로, 본 발명자들은 THP-1 세포에서 OR51E2를 결핍시켰다. OR51E2-표적 siRNA의 형질 감염 결과, OR51E2 단백질 수준(도 3A 및 도 3B) 및 OR51E2-발현 세포의 백분율(도 3C)을 감소시켰다. 미처리 세포와 비교시, OR51E2-결핍된 THP1 세포에서 젖산 처리는 Arg-1, CD163, CD206 및 IL-10과 같은 M2 마커들을 상향조절하지 않거나(도 3D-H), iNOS(도 3D 및 도 3E), CD86, TNF -α 및 IL-12B(도 3I-K)와 같은 M1 마커들을 하향조절하지 않았다. OR51E2-결핍된 THP1 세포에서 IL-4 처리는 여전히 M2 마커들을 상향조절하였고(도 3D-H), CD86 및 TNF -α와 같은 M1 마커들을 하향조절하였다(도 3I 및 도 3J). 종합하면, 상기 결과들은 OR51E2가 젖산 및 TCM에 의해서 유도되는 대식세포의 M2 분극화에는 필요하지만, IL-4에 의해 유도되는 대식세포의 M2 분극화에는 관련되지 않는다는 점을 시사한다.
< 실시예 2> TCM에서 Olfr78 -매개 M2 대식세포 분극화를 담당하는 주요 인자인 젖산 및 아세트산
젖산은 M2 대식세포 분극화에 중요한 것으로 알려져 있지만, 젖산이 TCM에서 Olfr78-매개 M2 대식세포 분극화를 담당하는 주요 인자인지 확인하기 위해서, 본 발명자들은 젖산 생산을 억제하는 젖산 탈수소효소의 억제제인 옥살산(oxamic acid; OA)으로 전처리된 마우스 종양세포주의 TCM으로 WT BMDMs을 처리하였다. OA 전처리 결과, TCM에서 젖산은 거의 완전히 결핍되었다(도 4A). 미처리 BMDMs과 비교시, 젖산- 및 TCM-처리 WT BMDMs은 CD206, IL-4, IL-10 및 TGF-β와 같은 M2 분극화 마커들을 상당히 상향조절하는 것으로 나타냈고(P < 0.001)(도 4B-E), 길어진 모양을 가진 세포의 백분율을 증가시켰다(P < 0.001)(도 4F 및 도 4G). 젖산-결핍된 TCM (TCM+OA)으로 처리된 WT BMDMs에서 M2 마커들의 상향조절은 약화되었다(P < 0.05). 상기 M2 마커들의 수준 변화는 Olfr78 -/- BMDMs에서는 관측되지 않았다(도 4B-E). 젖산-결핍된 TCM에 외인성 젖산의 첨가 (TCM+OA+LA)는 WT의 M2 분극화를 회복시켰으나(P < 0.05), Olfr78 -/- BMDMs에서는 그렇지 않았다(도 4B-E). 이상의 실험을 통해 본 발명자들은 젖산이 TCM에서 Olfr78-매개 M2 대식세포 분극화를 담당하는 주요 인자라는 것을 제시하였다. 인간 종양 세포의 젖산-결핍된 TCM 처리 (TCM+OA) 및 TCM에 외인성 젖산의 추가적인 첨가 (TCM+OA+LA)에 따라, Arg1, CD206, CD163, IL-10 및 CD206과 같은 M2 마커들의 수준에 유사한 변화가 모세포 및 OR51E2-결핍 THP-1 불멸화 인간 단핵구에서도 관측되었다(도 5A-G).
또한, 본 발명자들은 대식세포의 M2 분극화에 있어서, Olfr78의 리간드로 작용하는, 다른 짧은 사슬 지방산인 아세트산의 영향을 조사하였다. 젖산과 유사하게, WT BMDMs에서 아세트산 처리는 IL-4, IL-10 및 TGF -β와 같은 M2 마커들의 mRNA 수준을 상당히 증가시켰으나(P < 0.001), Olfr78과 상호작용하지 않는 부티르산은 그렇지 않았다(도 4H-J). 아세트산은 Olfr78 -/- BMDMs의 M2 분극화를 유도하지 않았는데(도 4H-J), 이는 Olfr78이 젖산 및 아세트산-유도되는 대식세포의 M2 분극화 모두를 매개한다는 점을 뒷받침한다.
< 실시예 3> 젖산-유도 대식세포의 M2 분극화를 매개하기 위해 Gpr132와 협력하는 Olfr78
Gpr132는 젖산을 감지하고, 대식세포의 M2 분극화를 매개하는 것으로 보고되었다. 본 발명자들은 Olfr78 및 Gpr132가 함께 기능하여, 젖산-유도 대식세포의 M2 분극화를 매개한다고 가정하였다. 이를 조사하기 위해서, 본 발명자들은 M1 및 M2 대식세포와 BMDMs에서 Olfr78 및 Gpr132의 동시 위치화를 확인하였다. M1 및 M2 대식세포와 BMDMs에서 Gpr132가 발현되었다(도 6A). 한편, Olfr78은 BMDMs 및 M2 대식세포에서 Gpr132와 동시 위치화되어 발현되었으나, M1 대식세포에서는 그렇지 않았다(도 6A). Olfr78 및 Gpr132의 물리적 근접성을 확인하기 위해서, anti-Olfr78 및 anti-Gpr132를 사용한 근접 결합 분석(proximity ligation assay; PLA)을 수행하였다. M1 대식세포는 아니지만, BMDMs 및 M2 대식세포의 멤브레인 상에서 Olfr78 및 Gpr132 간의 직접적인 상호작용을 입증하였다(도 6B). 또한, Olfr78은 anti-Gpr132 항체에 의해 공동-면역침전되었고, Gpr132는 anti-Olfr78 항체에 의해 공동-면역침전되었다(도 6C). 소듐 락테이트의 처리에 따른 상대 루시퍼라제 활성은 Olfr78 또는 Gpr132 단독으로 형질감염된 세포보다 Olfr78 및 Gpr132로 동시-형질감염된 Hana3A 세포에서 상당히 더 높았다(P < 0.05)(도 6D). 종합하면, 상기 결과는 Olfr78 및 Gpr132가 기능적 이형중합체(heterodimer)을 형성한다는 점을 뒷받침한다.
Olfr78 및 Gpr132가 협력하여 젖산-유도 M2 분극화를 매개하는지 확인하기 위해서, 본 발명자들은 WT 및 Olfr78 -/- BMDMs에서 Gpr132를 결핍시켰다(도 6E 및 도 6F). IL-4, IL-10, TGF -β 및 Arg1과 같은 M2 사이토카인들의 젖산-유도된 mRNA 수준의 상향조절은 Gpr132-결핍된 WT BMDMs에서 상당히 감소되었다(P < 0.01)(도 6G-J). IL-4, IL-10 및 TGF -β의 mRNA 수준은 Gpr132-결핍된 Olfr78 -/- BMDMs에서 더욱 감소되었다(도 6G-I). 상기 결과는 Olfr78 및 Gpr132가 협력하여 젖산-유도 대식세포의 M2 분극화를 매개한다는 점을 뒷받침한다.
< 실시예 4> 생체 내에서( in vivo ) 종양 진행을 억제하고, 항-종양 면역을 선호하는 Olfr78의 결핍
생체 내에서(in vivo) 종양 진행에 있어 Olfr78의 관련성을 확인하기 위해서, 본 발명자들은 WT 및 Olfr78 -/- 마우스에서 동종(syngeneic) 폐 종양을 확립하였다. Lewis lung carcinoma (LLC) 세포의 피하 이식에 의해, WT 마우스 보다 Olfr78 -/- 마우스에서 종양 성장은 상당히 느려졌고(P < 0.001)(도 7A), 생존율은 상당히 좋아졌으며(P < 0.001)(도 7B), 폐에서의 전이성 결절의 수는 상당히 낮아졌다(P < 0.001)(도 7C). 전체 대식세포군(도 7D)과, CD45+Ly6C-MHCII- M2-분극화된 TAMs(도 7E), CD45+Gr1+CD11b+ 골수-유래 억제 세포(myeloid-derived suppressor cells; MDSCs)(도 7G) 및 CD3+CD4+Foxp3+ Tregs(도 7H)을 포함하는 면역억제 세포군은 WT 마우스의 종양 조직에서 비해 Olfr78 -/- 마우스의 종양 조직에서 상당히 줄어들었다(P < 0.001). 한편, CD45+Ly6C-MHCII+ M1-분극화된 대식세포(도 7F), CD3+CD4-CD8+ T 세포(도 7I) 및 CD3+CD4+CD8- T 세포(도 7J)를 포함하는 면역자극 세포군은 WT 마우스의 종양 조직에서 비해 Olfr78 -/- 마우스의 종양 조직에서 더 늘어났다. 더구나, 종양을 가진 WT 마우스는 비장이 비대해지는 상태인 비장 비대증이 발생하였다. 다만, 종양을 가진 Olfr78 -/- 마우스의 비장은 건강한 마우스와 유사하였다(도 8A 및 도 8B). WT 마우스의 비장에 비해 Olfr78 -/- 마우스의 비장에서, Tregs(도 8G)를 제외한, 전체 대식세포(도 8C), M2-TAMs(도 8D), M1 대식세포(도 8E) 및 MDSCs(도 8F) 개체군은 줄어든 반면, CD8+ T 세포(도 8H) 및 CD4+ T 세포(도 8I)는 더 늘어났다. LLC 종양과 유사하게, 유방 지방 패드로의 EO771 동종 마우스 유방 종양 세포 이식의 경우, WT 마우스 보다 Olfr78 -/- 마우스에서 종양 성장은 상당히 느려졌고(P < 0.001)(도 9A), 생존율은 상당히 좋아졌으며(P < 0.001)(도 9B), 폐에서의 전이성 결절의 수는 상당히 낮아졌다(P < 0.001)(도 9C). OR51E2는 전립선암 환자, 전립선암 세포 및 여러 정상 세포 타입에서 높게 발현된다. 젖산이 종양 세포 상에서 Olfr78를 통해 종양 성장에 영향을 미칠 가능성을 배제하기 위해서, 본 발명자들은 EO771 종양에서 Olfr78의 발현을 측정하였다. Olfr78 발현은 무시할 정도였다(도 9D). 상기 결과는 생체 내에서(in vivo) Olfr78이 면역억제 TME의 유지에 중요한 역할을 수행하고, 종양 진행 및 전이에 주요 인자라는 점을 뒷받침한다.
종양 진행에 있어서 대식세포의 관련성을 더 확인하기 위해서, 본 발명자들은 LLC 종양을 가진 마우스에서 클로드로나이트(clodronate) 리포좀을 사용하여 대식세포들을 결핍시켰다. Olfr78 -/- 마우스에 비해, 종양을 가진 마우스에서 대식세포의 결핍은 종양 부피(도 10A), 종양 무게(도 10B), 종양에서의 전체 대식세포군(도 10C) 및 비장에서의 전체 대식세포군(도 10D)을 감소시켰다.
침습성 유방암, 교모세포종 및 폐 선암과 같은 여러 암종에서 OR51E2의 임상적 중요성을 확인하기 위해서, 본 발명자들은 The Cancer Genome Atlas (TCGA)의 치료 분석 리포트, 유전자 발현 데이터 및 생존율 데이터를 검색하였다. TCGA의 환자 생존율 데이터를 바탕으로, 낮은 OR51E2 발현이 높은 Kaplan-Meier 생존율과 상당히 관련되어 있다는 것을 확인하였다(도 11A-C). 종합하면, 상기 결과는 Olfr78-젖산 상호작용의 동요가 생체 내에서(in vivo) 전이를 차단할 수 있고, M2 대식세포 활성화를 손상시켜 생존율을 향상시킬 수 있다는 점을 뒷받침한다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (11)

  1. 후각수용체 Olfr78 또는 OR51E2의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 Olfr78 또는 OR51E2의 발현 억제제는 Olfr78 또는 OR51E2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 Olfr78 또는 OR51E2의 활성 억제제는 Olfr78 또는 OR51E2 단백질에 특이적으로 결합하는 저분자 화합물, 펩타이드, 펩타이드 미메틱스, 앱타머, 항체 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 젖산 또는 아세트산에 의해 유도되는 대식세포의 M2 분극화를 억제하는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 암은 폐암 또는 유방암인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. (1) 분리된 대식세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;
    (2) 상기 시험물질을 접촉한 대식세포에서 후각수용체 Olfr78 또는 OR51E2의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및
    (3) 대조군 시료와 비교하여 상기 Olfr78 또는 OR51E2의 발현 또는 활성 정도가 감소된 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법.
  7. (1) 분리된 대식세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;
    (2) 상기 시험물질을 접촉한 대식세포에서 후각수용체 Olfr78 또는 OR51E2와, Gpr132의 결합 정도를 측정하는 단계; 및
    (3) 대조군 시료와 비교하여 상기 Olfr78 또는 OR51E2와, Gpr132의 결합 정도가 감소된 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 시험물질은 젖산 또는 아세트산에 의해 유도되는 대식세포의 M2 분극화를 억제하는 것을 특징으로 하는 항암제 스크리닝 방법.
  9. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 항암제는 폐암 또는 유방암에 대한 항암제인 것을 특징으로 하는 항암제 스크리닝 방법.
  10. 후각수용체 Olfr78 또는 OR51E2를 유효성분으로 포함하는, 시험관(in vitro) 내 젖산 또는 아세트산에 의해 유도되는 대식세포의 M2 분극화 유도용 시약 조성물.
  11. 시험관 내에서(in vitro) 후각수용체 Olfr78 또는 OR51E2를 대식세포에 처리하는 단계를 포함하는 젖산 또는 아세트산에 의해 유도되는 대식세포의 M2 분극화 유도 방법.
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