KR20220137046A - Dna 증폭 방법 - Google Patents

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KR20220137046A
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Abstract

본 발명은 숙주세포에서 CARE 요소에 작동 가능하게 연결된 DNA 분자를 증폭시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은, DNA 분자에 작동 가능하게 연결된 CARE 요소, L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, AAV Rep 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자, 및 선택적으로 하나 이상의 추가 핵산 분자를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한, 이종 프로모터에 작동 가능하게 연결된, L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 핵산 분자; 바이러스 유전자에 작동 가능하게 연결된 CARE 요소를 인코딩하는 핵산 분자; 아데노바이러스 벡터와 숙주세포를 생산하는 방법; 및 숙주세포에서 바이러스 입자, 더욱 바람직하게는 AAV 입자를 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

DNA 증폭 방법
본 발명은 숙주세포에서 CARE 요소에 작동 가능하게 연결된 DNA 분자를 증폭시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은, DNA 분자에 작동 가능하게 연결된 CARE 요소, L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, AAV Rep 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자, 및 선택적으로 하나 이상의 추가 핵산 분자를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한, 이종 프로모터에 작동 가능하게 연결된, L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 핵산 분자; 바이러스 유전자에 작동 가능하게 연결된 CARE 요소를 인코딩하는 핵산 분자; 아데노바이러스 벡터와 숙주세포를 생산하는 방법; 및 숙주세포에서 바이러스 입자, 더욱 바람직하게는 AAV 입자를 생산하는 방법에 관한 것이다.
아데노연관바이러스(AAV: Adeno-associated virus)는 파르보바이러스과(Parvoviridae)에 속하는 단일 가닥 DNA 바이러스이다. 이러한 바이러스는 분열 세포와 비(非)분열 세포를 모두 포함하는 광범위한 숙주세포를 감염시킬 수 있다. 또한, 이는 대부분의 환자에서 제한된 면역 반응만을 일으키는 비(非)병원성 바이러스이다.
지난 몇 년 동안, AAV에서 유도된 벡터는 매우 유용하고 유망한 유전자 전달 방식으로 부상하였다. 이는 이러한 벡터의 하기 특성 때문이다:
- AAV는 작은 외피 미보유(non-enveloped) 바이러스이며, 이는 2개의 고유한 유전자(rep 및 cap)만 갖는다. 따라서, 이는 상이한 유전자 요법을 위한 벡터의 개발을 위해 용이하게 조작될 수 있다. 이는 AAV 게놈에서 rep 및 cap 유전자를 제거하고, 이러한 서열을 환자에게 치료적 유익을 제공할 수 있는 외인성 서열로 대체하는 방식으로 달성된다.
- AAV 입자는 전단력, 효소 또는 용매에 의해 쉽게 분해되지 않는다. 이는 이러한 바이러스 벡터의 용이한 정제 및 최종 제형화를 용이하게 한다.
- AAV는 비병원성이며 면역원성이 낮다. 이러한 벡터의 사용은 나아가 유해한 염증 반응의 위험을 감소시킨다. 렌티바이러스, 헤르페스바이러스 및 아데노바이러스와 같은 다른 바이러스 벡터와 달리, AAV는 무해하며, 임의의 인간 질환의 원인이 되는 것으로 여겨지지 않는다.
- AAV 벡터를 사용하여 최대 약 4500 bp의 유전자 서열을 환자에게 전달할 수 있다.
- 야생형 AAV 벡터는 때때로 유전 물질을 인간 염색체 19에 삽입하는 것으로 알려져 있지만, 이러한 특성은 일반적으로 바이러스 게놈으로부터 rep 및 cap 유전자를 제거하는 방식으로 대부분의 AAV 유전자 요법 벡터에서 제거된다. 이러한 경우, 바이러스는 숙주세포 내에 에피솜 형태로 남아있다. 이러한 에피솜은 비분열 세포에서는 온전히 유지되지만, 분열 세포에서는 세포 분열 동안 소실된다.
고유한 AAV 게놈은 각각 다중 오픈 리딩 프레임(ORF: open reading frame)을 인코딩하는 2개의 유전자를 포함한다: rep 유전자는 AAV 수명 주기와 바이러스 게놈의 부위 특이적 통합에 필요한 비(非)구조 단백질을 인코딩하고; cap 유전자는 구조 캡시드 단백질을 인코딩함.
또한, 이러한 2개의 유전자에는 헤어핀 구조를 형성하는 능력이 있는 145개의 염기로 이루어진 역말단반복(ITR: inverted terminal repeat) 서열이 플랭킹되어 있다. 이러한 헤어핀 서열은 제2 DNA 가닥의 프리마아제(primase) 비(非)의존적 합성과 숙주 세포 게놈에의 바이러스 DNA의 통합에 필요하다.
바이러스의 임의의 통합 능력을 제거하기 위해, 재조합 AAV 벡터는 바이러스 게놈의 DNA로부터 rep 및 cap을 제거한다. 이러한 벡터를 생산하기 위해, 목적하는 전이유전자(들)는 전이유전자(들)의 전사를 구동하는 프로모터(들)와 함께, 역말단반복부(ITR) 사이에 삽입되고; rep 및 cap 유전자는 트랜스(trans)로 제공된다. 아데노바이러스 E4, E2a 및 VA 유전자와 같은 헬퍼 유전자가 또한 제공된다. rep, cap 및 헬퍼 유전자는 세포로 트랜스펙션되는 추가 플라스미드에 제공될 수 있다.
전통적으로, AAV 벡터의 생산은 다수의 상이한 경로를 통해 달성되었다. 초기에, AAV는 rep 및 cap 유전자와 AAV 게놈을 인코딩하는 플라스미드로 세포를 트랜스펙션시키는 동안, 야생형(WT) 아데노바이러스 혈청형 5를 사용하여 생성되었다. 이는, WT 아데노바이러스가 바이러스 복제를 촉진시키는 트랜스 위치에 다수의 인자를 제공할 수 있게 하였다. 하지만, 이러한 접근법에는 다수의 제한사항이 존재한다: 예를 들어 AAV의 각 배치는 순수한 산물을 제공하기 위해 제조 후 Ad5 입자로부터 분리되어야 하며, 모든 Ad5가 제거되었는지를 확인하는 것이 어렵다. 나아가, 생산 동안, 세포가 AAV보다 아데노바이러스 입자의 생산에 막대한 자원을 제공한다는 사실 또한 바람직하지 않다.
다른 시스템에서는, rep 및 cap 유전자를 발현하는 안정한 패킹 세포주가 사용되었다. 이러한 시스템에서, rep 및 cap 유전자는 세포 게놈에 통합되기 때문에, 플라스미드 기반 rep 및 cap 유전자는 필요하지 않다. 하지만, 이러한 유전자는 이의 고유한 독성으로 인해 통상적으로 낮은 빈도(예를 들어, 세포 당 1개 내지 2개 카피)로만 통합된다. 이러한 시스템은 아데노바이러스 벡터를 이용한 감염이 필요하다.
보다 최근에, 아데노바이러스 기반 시스템은 AAV 생산에 필요한 아데노바이러스 게놈의 섹션을 인코딩하는 플라스미드로 대체되었다. 이는 최종 바이러스 제제에 존재하는 아데노바이러스 입자에 대한 우려를 일부 해결했지만, 여러 문제가 남아있다. 이에는, 생산 세포주로의 트랜스펙션에 충분한 플라스미드를 사전 제조해야 하는 요건과, 트랜스펙션 과정 자체가 본질적으로 비효율적이라는 점이 포함된다. 이러한 시스템으로부터의 수율 또한 Ad5 기반 접근법을 사용한 경우의 수율보다 낮다.
rep 및 cap 유전자를 AAV 벡터와 염색체로 통합시킨 HeLa 세포주의 트랜스펙션 및 아데노바이러스 감염이 통합된 rep-cap 서열의 100배 증폭을 유도한다고 이전에 보고된 바 있다(문헌[Tessier, J., et al. J. Virol. 2001; 375-383]; 문헌[Chadeuf, G., et al. J. Gene Med. 2000; 2:260-268]). 이러한 증폭된 서열은 염색체외 형태로 존재하였다. 아데노바이러스 DNA 결합 단백질(DBP)은 이러한 증폭에 필수적인 것으로 알려져 있다.
이러한 현상은, 시스 작용 복제 요소(CARE: cis-acting replication element)가 확인된 US2004/0014031에 추가로 설명되어 있다. 이러한 CARE 요소는 AAV-2 게놈의 190번 내지 361번 뉴클레오타이드에 상응하는 171개 뉴클레오타이드 영역에 위치하는 것으로 알려져 있으며(실시예 12); 이는 AAV p5 프로모터를 포함한다. 이러한 CARE 요소는 "CARE 의존적 복제 유도인자"("CARE-DRI")에 의해 결합되는 것으로 알려져 있다. 이러한 유도인자는 (전체) 아데노바이러스와 헤르페스바이러스를 포함하는 것으로 알려져 있다. 보다 구체적으로, 아데노바이러스 E2a 유전자에 의해 인코딩된 DNA 결합 단백질(DBP)은 rep 및 cap 유전자의 CARE 의존적 증폭의 특정 유도인자로 확인되었다(US2004/0014031, 실시예 4).
또한, US2004/0014031에는, CARE 요소가 인접 이종 유전자의 증폭을 유도할 수 있으며(실시예 11), 즉, CARE 요소가 복제 기점으로 작용할 수 있다고 보고되어 있다.
이제, US2004/0014031의 "CARE 의존적 복제 유도인자(CARE-DRI)"가 CARE 의존적 복제에 필요하고 충분하다는 설명은 잘못된 것으로 밝혀졌다. US2004/0014031에서, 유도인자는 E2a 발현 카세트의 유전자 산물인 아데노바이러스 DNA 결합 단백질(DBP)로 설명되어 있다. 이제, DBP가 CARE 의존적 복제에 관여할 수 있지만, 영향을 미치는 데에는 충분하지 않다고 밝혀졌다. 아데노바이러스 후기 유전자 중 하나의 산물, 즉, L4 22K가 기본적으로 필요하다. 이러한 22K 단백질은 이전에 바이러스 캡시드화에 관여하는 것으로만 공지되어 있었다.
이러한 특정 유도인자 및 이의 정확한 작용 메커니즘을 확인하는 것은, CARE 요소와 병치된 유전자를 증폭시키는 신규한 방법의 생성, 즉, L4 22K 폴리펩타이드의 공급을 용이하게 한다.
따라서, 본 발명의 하나의 목적은, CARE 요소와 병치된 관심 유전자를 증폭시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원인의 이전 특허 공개 중 하나(WO2019/020992, 이의 내용은 그 전체가 본원에 구체적으로 인용됨)에서, 본 출원인은, 후기 아데노바이러스 유전자의 전사가 주요 후기 프로모터에의 억제인자 요소의 삽입에 의해 조절(저해)될 수 있다고 개시하였다. 아데노바이러스 후기 유전자의 발현을 "차단"시켜, 세포의 단백질 제조 능력을 목적하는 재조합 단백질 또는 AAV 입자의 생산으로 전환시킬 수 있다.
아데노바이러스 후기(즉, 구조) 단백질의 생산을 "차단"시키는 능력은, 이러한 과정 동안 아데노바이러스 입자가 생산되지 않거나 본질적으로 생산되지 않는다는 것을 의미한다. 결과적으로, 정제된 산물에서 아데노바이러스 입자를 제거할 필요성이 감소되기 때문에 경제적으로 절약이 될 수 있다.
특히, 상기 발명은 또한, AAV의 Rep 및 Cap 단백질이 통합되고 세포의 게놈 내에서 인코딩되어 아데노바이러스 게놈의 복제를 유지하면서 최종 AAV 제제 내 아데노바이러스 입자의 생성을 방지하는 방식으로 AAV 입자를 제조하는 데 필요한 높은 발현 수준을 제공하는, AAV 입자를 제조하는 간단하고 비용 효율적인 방식을 제공할 가능성이 있었다.
하지만, 본 출원인은 후속으로, WO2019/020992에 기재된 방식으로 주요 후기 프로모터를 억제하여 후기 아데노바이러스 유전자를 저해하면, CARE 의존적 복제 메커니즘의 저해를 통해 숙주세포로부터 rep 및 cap 유전자의 DNA 증폭을 저해하는 바람직하지 않은 효과가 나타난다는 것을 발견하였다. 이는, 아데노바이러스 후기 유전자 산물이 CARE 의존적 복제에 관여한다는 보고가 없었기 때문에 전혀 예상치 못한 결과였다.
따라서, L4 22K 폴리펩타이드를 CARE 요소 유도인자로서 식별하는 것은 WO2019/020992에 기재된 발명을 이용하는 AAV 생산 시스템(여기서 L4 22K 폴리펩타이드는 시스 또는 트랜스로 공급됨)의 사용을 가능하게 한다.
따라서, 본 발명의 추가의 목적은, AAV를 생산하는 방법으로서, 아데노바이러스 입자의 생산을 저해 또는 방지하면서, Rep 및 Cap 폴리펩타이드의 높은 발현 수준을 얻어 AAV 입자를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
하나의 구현예에서, 본 발명은, 숙주세포에서 CARE 요소에 작동 가능하게 연결된 DNA 분자를 증폭시키는 방법으로서,
(a) CARE 요소에 작동 가능하게 연결된 DNA 분자를 포함하는 제1 핵산 분자;
(b) L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터를 포함하는 제2 핵산 분자;
(c) AAV Rep 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3 핵산 분자;
및 선택적으로 추가로
(d) 하나 이상의 아데노바이러스 초기 유전자 산물과 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 프로모터를 포함하는 하나 이상의 추가 핵산 분자를 포함하는 숙주세포를,
제2 및 제3 핵산 분자, 및 선택적으로 추가로 하나 이상의 추가 핵산 분자가 발현되어 DNA 분자의 증폭을 촉진시키도록 하는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 숙주세포에서 DNA 분자를 증폭시키는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 하나 이상의 아데노바이러스 초기 유전자 산물은 E2A, VA RNA 및 E4 유전자 산물에서 선택된다.
제1, 제2, 제3 및 (존재하는 경우) 추가 핵산 분자는 바람직하게는 숙주세포 내
(i) 아데노바이러스 벡터에 존재하거나;
(ii) 숙주세포 게놈에 안정적으로 통합된 형태로 존재하거나; 또는
(iii) 에피솜 벡터 또는 플라스미드에 존재한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기 단계 (a) 내지 (c)를 포함하는, 바이러스 입자를 생산하는 방법을 제공한다:
(a) 하기 (i) 내지 (iii)을 포함하는 아데노바이러스 벡터를 숙주세포에 도입하는 단계로서,
(i) L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터를 포함하는 본 발명의 제2 핵산 분자;
(ii) 전이유전자를 플랭킹하는 5'- 및 3'-바이러스 ITR을 포함하는 전달 플라스미드;
(iii) 바이러스 전달 플라스미드를 패키징하는 데 충분한 헬퍼 유전자,
여기서 숙주세포가
하기 (i) 및 (ii)에 작동 가능하게 연결된 CARE 요소를 포함하는 단계:
(i) AAV cap 유전자; 및
(ii) 바이러스 Rep 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자로서, 여기서 바람직하게는 뉴클레오타이드 서열이 기능성 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있지 않은 핵산 분자;
(b) 바이러스 입자가 숙주세포 내에서 조립되도록 하는 조건 하에서 숙주세포를 배양하는 단계; 및
(c) 세포 또는 배양 배지에서 패키징된 바이러스 입자를 수거하는 단계.
바람직하게는, 숙주세포는 바이러스 패키징 세포이다. 바람직하게는, 바이러스는 AAV이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기 단계 (a) 내지 (c)를 포함하는, 바이러스 입자를 생산하는 방법을 제공한다:
(a) 하기 (i) 내지 (iii)을 포함하는 아데노바이러스 벡터를 숙주세포에 도입하는 단계로서,
(i) L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터를 포함하는 본 발명의 제2 핵산 분자;
(ii) 바이러스 Rep 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자로서, 여기서 바람직하게는 뉴클레오타이드 서열이 기능성 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있지 않은 핵산 분자;
(iii) 바이러스 전달 플라스미드를 패키징하는 데 충분한 헬퍼 유전자,
여기서 숙주세포가 숙주세포 게놈에 안정적으로 통합된 하기 (i) 및 (ii)를 포함하는 단계:
(i) AAV cap 유전자에 작동 가능하게 연결된 CARE 요소, 및
(ii) 전이유전자를 플랭킹하는 5'- 및 3'-바이러스 ITR을 포함하는 전달 플라스미드로서, CARE 요소에 작동 가능하게 연결되거나 연결되지 않을 수 있는 전달 플라스미드;
(b) 바이러스 입자가 숙주세포 내에서 조립되도록 하는 조건 하에서 숙주세포를 배양하는 단계; 및
(c) 숙주세포 또는 배양 배지에서 패키징된 바이러스 입자를 수거하는 단계.
일부 바람직한 구현예에서, AAV cap 유전자는 아데노바이러스 벡터 내에서 인코딩되는 폴리펩타이드에 의해 활성화되는 프로모터의 제어 하에 숙주세포 게놈에 통합된다.
CARE 요소에 작동 가능하게 연결된 DNA 분자는, 일반적으로 증폭시키기에 바람직한 임의의 DNA 분자일 수 있다.
CARE 증폭은 이방향성일 수 있다. 따라서, DNA 분자는 CARE 요소에 대해 5' 또는 3'에 위치할 수 있다. 일부 구현예에서, CARE 요소의 3'-말단에서 DNA 분자의 3'-말단까지의 뉴클레오타이드 서열의 길이는, 1 Kb 내지 5 Kb, 5 Kb 내지 10 Kb, 10 Kb 내지 15 Kb, 15 Kb 내지 50 Kb 또는 50 Kb 내지 100 Kb이다. 다른 구현예에서, CARE 요소의 5'-말단에서 DNA 분자의 5'-말단까지의 뉴클레오타이드 서열의 길이는, 1 Kb 내지 5 Kb, 5 Kb 내지 10 Kb, 10 Kb 내지 15 Kb, 15 Kb 내지 50 Kb 또는 50 Kb 내지 100 Kb이다.
DNA 분자는 코딩 또는 비(非)코딩 서열일 수 있다. 이는 게놈 DNA 또는 cDNA일 수 있다. 바람직하게는, DNA 서열은 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 인코딩한다. 바람직하게는, DNA 분자는 하나 이상의 전사 및/또는 번역 제어 요소(예를 들어, 인핸서, 프로모터, 종결자 서열 등)와 작동 가능하게 연결되어 있다.
일부 구현예에서, DNA 분자는 치료용 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 코딩한다. 바람직한 치료용 폴리펩타이드에는, 항체, CAR-T 분자, scFV, BiTE, DARPin 및 T세포 수용체가 포함된다. 일부 구현예에서, 치료용 폴리펩타이드는 G-단백질 결합 수용체(GPCR), 예를 들어 DRD1이다. 일부 구현예에서, 치료용 폴리펩타이드는 인간 시력 또는 망막 기능에 관여하는 유전자의 기능성 카피, 예를 들어 RPE65 또는 REP이다. 일부 구현예에서, 치료용 폴리펩타이드는 인간 혈액 생성에 관여하는 유전자의 기능성 카피이거나, 혈액 구성요소, 예를 들어 IX 인자, 또는 베타 및 알파 지중해빈혈 또는 겸상적혈구빈혈에 관여하는 것들이다. 일부 구현예에서, 치료용 폴리펩타이드는 중증 복합 면역결핍증(SCID: severe combined immune-deficiency) 또는 아데노신 데아미나아제 결핍증(ADA-SCID: Adenosine deaminase deficiency)에서와 같은 면역 기능에 관여하는 유전자의 기능성 카피이다.
일부 구현예에서, 치료용 폴리펩타이드는 세포의 증식을 증가/감소시키는 단백질, 예를 들어 성장인자 수용체이다. 일부 구현예에서, 치료용 폴리펩타이드는 이온 채널 폴리펩타이드이다. 일부 바람직한 구현예에서, 치료용 폴리펩타이드는 면역 체크포인트 분자이다. 바람직하게는, 면역 체크포인트 분자는 PD1, PDL1, CTLA4, Lag1 또는 GITR이다.
일부 바람직한 구현예에서, DNA 분자는 CRISPR 효소(예를 들어, Cas9, dCas9, Cpf1, 또는 이의 변이체 또는 유도체) 또는 CRISPR sgRNA를 인코딩한다.
일부 구현예에서, DNA 분자는 포유류를 감염시키는 것으로 공지된 바이러스의 유전자를 포함한다. DNA 분자 내에서 인코딩된 유전자는 백신으로 사용되거나 사용되지 않을 수 있는 바이러스 유사 입자로 자가 조립될 수 있는 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있다. 하나의 바람직한 구현예에서, DNA 분자는 노로바이러스 캡시드 단백질을 인코딩한다.
다른 구현예에서, DNA 분자는 다량체성 복합체로 자가 조립될 수 있는 백신으로서 인간에서 면역반응을 유도하는 것으로 공지된 하나 이상의 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있다. 바람직한 구현예는 거대세포바이러스(CMV) 오량체성 복합체에 필요한 5개의 유전자를 인코딩하는 것이며; 이에는 CMV gH/gL/UL128/UL130/UL131이 포함된다.
다른 구현예에서, 유전자는 바이러스 유사 입자로 자가 조립되지 않는 백신으로서 인간에서 면역반응을 유도하는 것으로 공지된 단백질을 인코딩할 수 있다. 바람직한 구현예는 에볼라 F 단백질, 인플루엔자 F 및 H 단백질, 또는 코로나바이러스 S, E 또는 M 단백질을 인코딩하는 것이다.
일부 구현예에서, DNA 분자는 레트로바이러스, 더욱 바람직하게는 렌티바이러스의 유전자를 포함한다. 이러한 유전자에는, 비제한적으로, Gag-Pol 유전자, Rev 유전자 및 Env 유전자가 포함된다.
일부 구현예에서, DNA 분자는 랍도바이러스(rhabdovirus), 더욱 바람직하게는 수포성 구내염바이러스(VSV: vesicular stomatitis virus)의 유전자를 포함한다. 이러한 유전자에는, 비제한적으로, VSV 당단백질 유전자(즉, VSV G 유전자)가 포함된다.
일부 구현예에서, DNA 분자는 유전자요법 바이러스 벡터를 조립하는 데 필요한 유전자를 인코딩하거나 유전자요법 전달 벡터를 인코딩하는 바이러스 패키징 세포주를 제조하는 데 필요한 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, DNA 분자는 유전자요법 벡터를 생산하는 데 필요한 전달 벡터와 모든 유전자를 인코딩하는 바이러스 생산자 세포주를 제조하는 데 필요한 유전자를 포함한다.
또 다른 구현예에서, DNA 분자는 렌티바이러스 벡터에 대한 하나 이상의 유전자(예를 들어, Gag-pol, REV, VSV-G, RD114) 또는 아데노바이러스 벡터에 대한 하나 이상의 유전자(예를 들어, Hexon, Fibre, Penton, pVII 또는 pVI)를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, DNA 분자는 rep 유전자 서열 및/또는 cap 유전자 서열 및/또는 플랭킹 AAV 역말단반복부(ITR)를 포함하는 전달 벡터, 또는 이의 단편을 포함한다. 바람직하게는, rep 및 cap 유전자는 AAV 유전자이다.
다른 구현예에서, DNA 분자는 AAV rep 유전자 서열을 포함하지 않거나, AAV cap 유전자 서열을 포함하지 않거나, AAV 역말단반복부(ITR)의 서열을 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, DNA 분자는 AAV 서열을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, CARE 요소는 AAV rep 또는 cap 유전자에 (인접하게 또는 비인접하게) 연결되어 있지 않다.
일부 구현예에서, AAV Rep 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3 핵산은 필요하지 않다.
본원에 사용된 "rep 유전자"라는 용어는, 하나 이상의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 인코딩하는 유전자로서, 상기 ORF가 각각 AAV Rep 비(非)구조 단백질, 또는 이의 변이체 또는 유도체를 인코딩하는 유전자를 나타낸다. 이러한 AAV Rep 비구조 단백질(또는 이의 변이체 또는 유도체)은 AAV 게놈 복제 및/또는 AAV 게놈 패키징에 관여한다.
야생형 rep 유전자는 3가지 프로모터: p5, p19 및 p40을 포함한다. 상이한 길이를 갖는 2개의 중첩되는 메신저 리보핵산(mRNA)이 p5 및 p19로부터 생산될 수 있다. 이러한 mRNA는 각각 단일 스플라이스 공여체 부위와 2개의 상이한 스플라이스 수용체 부위를 사용하여 스플라이싱되거나 되지 않을 수 있는 인트론을 함유한다. 따라서, 6가지 상이한 mRNA가 형성될 수 있으며, 이들 중 4가지만 기능성이다. 인트론을 제거하는 데 실패한 2가지 mRNA(하나는 p5에서 전사된 것이고, 하나는 p19에서 전사된 것임)는 공유된 폴리아데닐화 종결자(terminator) 서열을 판독하고, 각각, Rep78 및 Rep52를 인코딩한다. 인트론을 제거하고 5'-최대 스플라이스 수용체 부위를 사용하더라도 임의의 기능성 Rep 단백질이 생산되지 않는다: 이는 서열의 나머지 프레임이 이동함에 따라 정확한 Rep68 또는 Rep40 단백질을 생산할 수 없으며, 또한 이의 종결자가 스플라이싱되어 있기 때문에 Rep78 또는 Rep52의 정확한 C-말단을 생성하지 못할 것이다. 반대로, 인트론을 제거하고 3' 스플라이스 수용체를 사용하면, Rep78 및 Rep52의 종결자가 스플라이싱되는 동안 Rep68 및 Rep40에 대한 정확한 C-말단을 포함할 것이다. 따라서, 유일한 기능성 스플라이싱은, 인트론을 완전히 스플라이싱하는 것을 회피하거나(Rep78 및 Rep52의 생성), 3' 스플라이스 수용체를 사용하는 것이다(Rep68 및 Rep40의 생성). 결과적으로, 중첩되는 서열을 갖는 4가지 상이한 기능성 Rep 단백질이 이러한 프로모터로부터 합성될 수 있다.
야생형 rep 유전자에서, p40 프로모터는 3' 말단에 위치한다. Cap 단백질(VP1, VP2 및 VP3)의 전사는 야생형 AAV 게놈에서 이러한 프로모터로부터 개시된다.
4가지 야생형 Rep 단백질은 Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40이다. 따라서, 야생형 rep 유전자는 4가지 Rep 단백질 Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40을 인코딩하는 유전자이다. 본원에 사용된 "rep 유전자"라는 용어는, 야생형 rep 유전자와 이의 유도체; 및 동등한 기능을 가진 인공 rep 유전자를 포함한다.
하나의 구현예에서, rep 유전자는 기능성 Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40 폴리펩타이드를 인코딩한다. 또 다른 구현예에서, rep 유전자는 기능성 Rep78 및 Rep68 폴리펩타이드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, rep 유전자 p19 프로모터는 비(非)기능성이다. 또 다른 구현예에서, rep 유전자는 비기능성 Rep52 및 Rep40 폴리펩타이드를 인코딩한다.
야생형 AAV(혈청형 2) rep 유전자 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1에 제시되어 있다.
하나의 구현예에서, "rep 유전자"라는 용어는, 서열번호 1과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고, 하나 이상의 Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
본원에 사용된 "cap 유전자"라는 용어는, 하나 이상의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 인코딩하는 유전자로서, 상기 ORF가 각각 AAV Cap 구조 단백질, 또는 이의 변이체 또는 유도체를 인코딩하는 유전자를 나타낸다. 이러한 AAV Cap 구조 단백질(또는 이의 변이체 또는 유도체)은 AAV 캡시드를 형성한다.
3가지 Cap 단백질은 적합한 세포를 감염시킬 수 있는 감염성 AAV 바이러스 입자의 생산을 가능하게 하는 기능을 해야 한다.
3가지 Cap 단백질은 VP1, VP2 및 VP3이며, 이의 크기는, 각각, 일반적으로 87 kDa, 72 kDa 및 62 kDa이다. 따라서, cap 유전자는 3가지 Cap 단백질 VP1, VP2 및 VP3을 인코딩하는 유전자이다.
야생형 AAV에서, 이러한 3가지 단백질은 p40 프로모터로부터 번역되어 단일 mRNA를 형성한다. 이러한 mRNA가 합성된 후, 길거나 짧은 인트론이 절단되어, 2.3 kb 또는 2.6 kb mRNA가 형성될 수 있다.
AAV 캡시드는 1:1:10의 비로 정이십면체 대칭으로 배열되어 있는 60개의 캡시드 단백질 서브유닛(VP1, VP2 및 VP3)으로 구성되어 있으며, 추정 크기는 3.9 MDa이다.
본원에 사용된 "cap 유전자"라는 용어는, 야생형 cap 유전자와 이의 유도체, 및 동등한 기능을 가진 인공 cap 유전자를 포함한다. AAV(혈청형 2) cap 유전자 뉴클레오티드 서열 및 Cap 폴리펩타이드 서열은, 각각, 서열번호 2 및 3에 제시되어 있다.
본원에 사용된 "cap 유전자"라는 용어는, 바람직하게는 서열번호 2에 제시된 서열을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 3: 11을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 또는 서열번호 2와 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖거나 서열번호 3을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 99% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖고, VP1, VP2 및 VP3 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
rep 및 cap 유전자는 바람직하게는 바이러스 유전자이거나, 바이러스 유전자에서 유도된다. 더욱 바람직하게는, 이는 AAV 유전자이거나, AAV 유전자에서 유도된다. 일부 구현예에서, AAV는 아데노연관 데펜도파르보바이러스(dependoparvovirus) A이다. 다른 구현예에서, AAV는 아데노연관 데펜도파르보바이러스 B이다.
11가지 상이한 AAV 혈청형이 공지되어 있다. 공지된 혈청형은 모두 여러가지 다양한 조직 유형의 세포를 감염시킬 수 있다. 조직 특이성은 캡시드 혈청형에 의해 결정된다.
AAV는 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11에서 유래할 수 있다. 바람직하게는, AAV는 혈청형 1, 2, 5, 6, 7, 8 또는 9이다. 가장 바람직하게는, AAV는 혈청형 5(즉, AAV5)이다.
rep 및 cap 유전자(및 그 안에 각각의 단백질 인코딩 ORF)는 1종 이상의 상이한 바이러스(예를 들어 2종, 3 또는 4종의 상이한 바이러스)에서 유래할 수 있다. 예를 들어, rep 유전자는 AAV2에서 유래할 수 있는 반면, cap 유전자는 AAV5에서 유래할 수 있다. 당업자는, AAV의 rep 및 cap 유전자가 계통군(clade) 및 단리체(isolate)에 따라 달라진다는 것을 알고 있다. 이러한 모든 계통군 및 단리체로부터의 이들 유전자의 서열뿐 아니라, 이들의 유도체도 본원에 포함된다.
본원에 사용된 "CARE" 요소라는 용어는, 시스 작용 복제 요소를 나타낸다. CARE 요소는 작동 가능하게 연결된 DNA 분자의 복제를 촉진시킬 수 있는 DNA 요소이다. 이러한 복제는 아데노바이러스 L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 및 선택적으로 E2A 폴리펩타이드 또는 이의 변이체의 존재에 따라 달라진다. 이론에 구애됨 없이, L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체가 하나 이상의 tttg 모티프에서 CARE 요소에 결합할 수 있다고 여겨진다.
CARE 요소는 Rep 결합 부위(RBS; gcccgagtgagcacgc 서열번호 4)와 trs 유사 요소를 포함한다.
야생형 AAV CARE 요소는 AAV p5 프로모터를 포함한다. CARE 요소 내 TATA 박스는 CARE 증폭에 필요한 것으로 나타났다. CARE 요소는 바람직하게는 AAV CARE 요소이다.
야생형 AAV 게놈에서, CARE 요소는 AAV p5 프로모터, Rep 결합 부위, trs 요소 및 AAV rep 유전자의 5' 부분을 포함한다. 이러한 CARE 요소의 예는, 이전에 특히, 문헌[Tessier, J., et al. J. Virol. 2001; 375-383]; 문헌[Chadeuf, G., et al. J. Gene Med. 2000; 2:260-268]; 및 US2004/0014031에서 설명되었다. AAV CARE 요소는 야생형 AAV2의 190번 내지 540번 뉴클레오타이드 사이에 위치하는 것으로 보고되어 있다(문헌[Nony, P. et al. J Virol. 2001]).
일부 바람직한 구현예에서, CARE 요소는 AAV-2 게놈의 190번 내지 361번 뉴클레오타이드에 상응하는 171개 뉴클레오타이드 영역이다. 바람직하게는, CARE 요소는 L4 22K 폴리펩타이드, 및 선택적으로 E2A 폴리펩타이드의 존재 하에서 작동 가능하게 연결된 DNA 분자의 증폭을 촉진시킬 수 있는, 서열번호 5에 제시된 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 갖는다.
CARE 요소(또는 이의 변이체)에 대한 L4 22K 폴리펩타이드의 결합 능력은 크로마틴 면역침강법(ChIP: chromatin immunoprecipitation) 검정으로 분석될 수 있다. CARE 요소에 작동 가능하게 연결된 DNA 분자의 증폭을 촉진시키는 L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체의 능력은, 중합효소 연쇄반응(PCR) 또는 정량적 PCR(본원의 실시예 3, 실시예 5 및 실시예 6에 기재된 바와 같음)로 분석될 수 있다. 서열번호 5의 임의의 변이체에서, RBS, TATA 박스 및 trs 요소의 서열은 바람직하게는 유지된다.
본원에 사용된 "AAV 게놈", "AAV 전달 벡터" 및 "전달 플라스미드"라는 용어는, 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 이들은 모두 전이유전자를 플랭킹하는 5'- 및 3'-바이러스(바람직하게는 AAV) 역말단반복부(ITR)를 포함하는 벡터를 나타낸다.
CARE 요소와 DNA 분자는 작동 가능하게 연결되어 있다. 본원에 사용된 (CARE 요소와 DNA 분자의 맥락에서) "작동 가능하게 연결된"이라는 용어는, CARE 요소가 L4 22K 폴리펩타이드, 및 선택적으로 추가로 아데노바이러스 E2A 폴리펩타이드의 존재 하에서 DNA 분자의 증폭을 촉진시키는 방식으로 CARE 요소와 DNA 분자가 연결되어 있는 것을 의미한다. 이는, CARE 요소와 DNA 분자가 동일한 DNA 분자에 존재하며, 즉, 이들이 병치되어 있거나, 인접해 있거나, 인접하게 연결되어 있는 것을 의미한다.
CARE 요소는 증폭시키고자 하는 DNA 분자의 5' 또는 3'에, 바람직하게는 5'에 위치할 수 있다. CARE 요소의 서열 배향은 이의 자연(야생형) 환경에 따라 정의된다. CARE 요소는 정배향 또는 역배향(관심 DNA 분자에 대해 업스트림 또는 다운스트림)으로 기능할 수 있다. CARE 요소의 3'-말단과 DNA 분자의 5'-말단 사이의 거리는 바람직하게는 1개 내지 1000개 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 1개 내지 500개 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 이러한 거리는 1000개 뉴클레오타이드 미만이며, 바람직하게는 50개 뉴클레오타이드 이하이다.
CARE 요소는 숙주세포 내에서 L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 및 선택적으로 추가로 E2A 폴리펩타이드 또는 이의 변이체와 접촉된다.
아데노바이러스 유전자는 초기(E1-4) 및 후기(L1-5) 전사체로 나뉘며, 다양한 스플라이싱 사건에 의해 유도되는 다수의 단백질 아이소형(isoform)이 존재한다.
초기 영역은 E1, E2, E3 및 E4로 나뉜다. E1은 바이러스 복제에 도움이 되는 세포 주기 단계로의 세포의 이행, 세포자멸사 저해 및 세포 분열 촉진에 필수적이다. E2 영역은 주로 DNA 게놈의 복제를 담당한다. 이는, DNA 결합 단백질(DBP)을 인코딩하는 E2A 영역과, 말단 단백질, DNA 중합효소(Pol) 및 IVa2 단백질을 주로 인코딩하는 E2B 영역을 함유한다. E3에는 숙주 반응의 면역 조절에 관여하는 유전자가 포함되어 있고, E4에는 p53 분해를 매개하기 위해 비상동 말단 연결(NHEJ: non-homologous end joining) 및 E1B-55K와의 복합체화와 같은 세포 경로 조절에 관여하는 다양한 유전자가 포함되어 있다.
아데노바이러스 후기 유전자는 모두 주요 후기 프로모터인 동일한 프로모터로부터 전사되며, 모두 3개 부분으로 구분된 리더(tri-partite leader) 서열을 집합적으로 형성하는 3개의 엑손을 함유하는 동일한 5' mRNA 말단을 공유한다. 후기 유전자는 바이러스 입자(예를 들어, Hexon 및 Fibre)의 일부를 형성하거나 이의 조립(예를 들어, 100K 단백질)에 관여하는 대략 13개 단백질의 발현을 가능하게 하는 일련의 스플라이스 사건에 의해 발현된다.
L4 전사체 시리즈는 100K, 33K, 22K, pVII 단백질을 인코딩한다. 이러한 단백질은 다양한 기능에 관여한다. 100K 단백질은 바이러스 헥손 조립과 핵 유입을 돕는 데 관여하지만, 세포 mRNA 번역을 cap 독립적 번역으로 전환시키는 역할도 할 수 있다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 100K 단백질은 바이러스 게놈 내에서가 아니라 세포 내에서 트랜스로 제공될 수 있다. 22K 단백질은 바이러스 캡시드화에 관여하는 것으로 공지되어 있다. L4 유전자는 성공적인 바이러스 조립에 필요하지만, 게놈 DNA 복제에는 필요하지 않다.
이제, L4 22K 폴리펩타이드가 CARE 의존적 방식으로 작동 가능하게 연결된 DNA 분자의 증폭을 촉진시키는 데 관여한다는 것이 밝혀졌다.
본원에 사용된 "L4 22K 폴리펩타이드"라는 용어는, 아데노바이러스 L4 22K 유전자, 또는 이의 변이체 또는 유도체의 유전자 산물을 나타낸다. 가장 바람직하게는, L4 22K 폴리펩타이드는 아데노바이러스 L4 22K 폴리펩타이드이다. 야생형 아데노바이러스 L4 22K 폴리펩타이드의 분자량은 22 kDa이다.
바람직하게는, 아데노바이러스는 그룹 A, B, C, D, E, F 또는 G의 인간 아데노바이러스이다. 더욱 바람직하게는, 아데노바이러스는 그룹 B 또는 C 또는 D의 인간 아데노바이러스이다. 보다 더욱 바람직하게는, 아데노바이러스는 그룹 B 또는 C의 인간 아데노바이러스이다. Ad5 및 Ad2(둘 모두 그룹 C)가 일반적으로 AAV 제조를 위한 헬퍼 바이러스로 사용되기 때문에 그룹 C가 바람직하다. Ad5가 가장 바람직한 아데노바이러스이다.
인간 아데노바이러스 D 혈청형 9(HAdV-9) L4 22K 단백질 서열은 UniProtKB - Q5TJ00에서 입수 가능하다. 이는 본원의 서열번호 6에 제시되어 있다. Ad5 DNA 서열은 본원의 서열번호 7에 제시되어 있다. Ad5 아미노산 서열은 서열번호 8에 제시되어 있다.
L4 22K 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 바람직하게는 서열번호 7에 제시된 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 6 또는 8의 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 또는 서열번호 7과 적어도 80%, 85% 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖거나, 서열번호 6 또는 8의 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 99% 뉴클레오타이드 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 갖고, DNA 결합 단백질을 인코딩하는 이의 변이체이다.
바람직하게는, L4 22K 폴리펩타이드는 서열번호 6 또는 8에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 6 또는 8과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖고, CARE 요소에 작동 가능하게 연결된 DNA 분자의 증폭을 촉진시킬 수 있는 이의 변이체를 갖는다.
일부 구현예에서, 제2 핵산 분자는 벡터 또는 플라스미드의 형태로 제공된다. 벡터 또는 플라스미드는 숙주세포 내에(에피솜 형태로) 존재하거나 숙주세포에 도입될 수 있다. 다른 구현예에서, 제2 핵산 분자는 숙주세포 게놈에 통합되어 있다. 다른 구현예에서, 제2 핵산 분자는 바이러스 벡터, 예를 들어 헤르페스바이러스 또는 렌티바이러스 벡터, 바람직하게는 아데노바이러스 벡터에 존재한다. 바이러스 벡터는 숙주세포 내에 존재하거나 숙주세포에 도입될 수 있다.
가장 바람직하게는, 제2 핵산 분자는 L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체의 발현이 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(MLP)와 본질적으로 독립적인(즉, 이와 연관되지 않는) 아데노바이러스 벡터에 삽입된다. 아데노바이러스 벡터는 숙주세포 내에 존재하거나 숙주세포에 도입될 수 있다.
바람직하게는, L4 22K 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터를 포함하는 본 발명의 제2 핵산 분자는, E1 또는 E3 영역, 또는 E1/E3 결실된 영역의 아데노바이러스 벡터 내에 위치한다. 이는 또한 L5 영역에 삽입될 수 있다.
숙주세포는 (d) 하나 이상의 아데노바이러스 초기 유전자 산물과 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 프로모터를 포함하는 하나 이상의 추가 핵산 분자를 추가로 포함할 수 있다. DNA 분자의 CARE 의존적 증폭을 증강시키기 위해 하나 이상의 아데노바이러스 초기 유전자 산물이 필요할 수 있다.
AAV의 생산과 관련된 본 발명의 구현예에서, AAV의 패키징을 가능하게 하기 위해 하나 이상의 아데노바이러스 초기 유전자 산물이 필요할 수 있다. 바람직하게는, 아데노바이러스 초기 유전자 산물은 아데노바이러스 E1A, E1B, E2A, VA RNA 및 E4에서 선택된다. 이러한 유전자 산물은 바람직하게는 숙주세포 내 아데노바이러스 벡터에 존재한다.
E2A 폴리펩타이드는 바이러스 DNA 결합 단백질(DBP)을 인코딩한다. 가장 바람직하게는, E2A 폴리펩타이드는 아데노바이러스 E2A 폴리펩타이드이다.
바람직하게는, 아데노바이러스는 그룹 A, B, C, D, E, F 또는 G의 인간 아데노바이러스이다. 더욱 바람직하게는, 아데노바이러스는 그룹 B 또는 C 또는 D의 인간 아데노바이러스이다. 보다 더욱 바람직하게는, 아데노바이러스는 그룹 B 또는 C의 인간 아데노바이러스이다. Ad5 및 Ad2(둘 모두 그룹 C)가 일반적으로 AAV 제조를 위한 헬퍼 바이러스로 사용되기 때문에 그룹 C가 바람직하다. Ad5가 가장 바람직한 아데노바이러스이다.
바람직하게는, E2A 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 9에 제시된 서열(아데노바이러스 유형 5)을 갖는다. 바람직하게는, E2A 폴리펩타이드는 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열(아데노바이러스 유형 5)을 갖는다.
E2A 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자는 바람직하게는 서열번호 9에 제시된 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 10을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 또는 서열번호 9와 적어도 80%, 85% 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖거나 서열번호 10을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 99% 뉴클레오타이드 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 갖고, DNA 결합 단백질을 인코딩하는 이의 변이체를 갖는 핵산 분자이다.
바람직하게는, E2A 폴리펩타이드는 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 10과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖고 DNA 결합 단백질인 이의 변이체를 갖는다.
일부 구현예에서, E2A 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자는 벡터 또는 플라스미드의 형태로 제공된다. 벡터 또는 플라스미드는 숙주세포 내에(에피솜 형태로) 존재하거나 숙주세포에 도입될 수 있다. 다른 구현예에서, E2A 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자는 숙주세포 게놈에 안정적으로 통합되어 있다. 다른 구현예에서, E2A 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자는 바이러스 벡터, 예를 들어 헤르페스바이러스 또는 렌티바이러스 벡터, 바람직하게는 아데노바이러스 벡터에 존재한다. 바이러스 벡터는 숙주세포 내에 존재하거나 숙주세포에 도입될 수 있다.
바람직하게는, E2A 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자는 아데노바이러스 벡터에, 더욱 바람직하게는 이의 고유한 위치에 제공된다. 바람직하게는, E2A 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자는 이의 천연 프로모터 또는 이종 구성적 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 제2 핵산 분자와 추가 핵산 분자는 동일한 플라스미드 또는 벡터 상에 제공되거나, 동일한 바이러스 벡터 내에 존재한다.
일부 구현예에서, 제1 핵산 분자와 제3 핵산 분자는, AAV Rep 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 CARE 요소에 작동 가능하게 연결되도록(이에 따라, AAV Rep 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 증폭되도록) 연결되어 있다.
제2 핵산 분자는 L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터를 포함한다. 본원에 사용된 "이종 프로모터"라는 용어는, L4 22K 유전자와 자연적으로 연관되지 않은 프로모터를 나타낸다. 야생형 아데노바이러스에서, L4 22K 유전자의 발현은 주요 후기 프로모터에 의해 구동된다. 따라서, "이종 프로모터"라는 용어는, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터가 아닌 프로모터를 나타낸다.
일부 구현예에서, 이종 프로모터는 아데노바이러스 프로모터가 아니거나, 헤르페스바이러스 프로모터가 아니거나, 바이러스 프로모터가 아니다. 일부 구현예에서, 이종 프로모터는 포유류 프로모터이다. 일부 구현예에서, 이종 프로모터는 야생형 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(MLP), 바람직하게는 서열번호 14의 서열과 90%, 80%, 70%, 60% 또는 50% 미만의 서열 동일성을 갖는다.
야생형 Ad5 MLP의 뉴클레오타이드 서열은 하기 제시된 바와 같다:
cgccctcttcggcatcaaggaaggtgattggtttgtaggtgtaggccacgtgaccgggtgttcctgaaggggggctataaaagggggtgggggcgcgttcgtcctca (서열번호 14)
상기 서열에서 TATA 박스에는 밑줄이 그어져 있으며, 최종 염기(볼드체로 표시됨)는 전사 개시 위치(즉, +1 위치)를 나타낸다.
일부 구현예에서, 프로모터는 구성적 프로모터이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 유도성 또는 억제성이다. 구성적 프로모터의 예에는, CMV, SV40, PGK(인간 또는 마우스), HSV TK, SFFV, 유비퀴틴, 신장 인자 알파, CHEF-1, FerH, Grp78, RSV, 아데노바이러스 E1A, CAG 또는 CMV-베타-글로빈 프로모터, 또는 이들로부터 유도된 프로모터가 포함된다. 바람직하게는, 프로모터는 거대세포바이러스 극초기(CMV) 프로모터, 또는 이로부터 유도된 프로모터, 또는 인간 세포 및 인간 세포주(예를 들어 HEK-293 세포)에서의 CMV 프로모터와 비교하여 동일하거나 증가된 강도를 갖는 프로모터이다.
일부 구현예에서, 프로모터는 유도성 또는 억제성 조절 (프로모터) 요소를 포함하는지에 따라 유도성 또는 억제성이다. 예를 들어, 프로모터는 독시시클린(doxycycline), 테트라시클린(tetracycline), IPTG 또는 락토오스, 바람직하게는 테트라시클린을 이용하여 유도 가능한 것일 수 있다.
일부 바람직한 구현예에서, AAV Rep 폴리펩타이드 또는 rep 유전자를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 기능성 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있지 않다. 이러한 방식으로, 낮은 수준의 Rep 폴리펩타이드 발현이 얻어지며, 여기서 발현 수준은 아데노바이러스 성장을 막지 않고, AAV 생산을 방지할 만큼 세포에 충분히 독성이 없을 정도로 충분히 낮다.
야생형 AAV에서, rep 유전자 산물의 발현은 p5 및 p19 프로모터에 의해 구동된다. 본원에 사용된 "rep 유전자는 기능성 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있지 않다"라는 용어는, rep 유전자가 기능성 p5 또는 기능성 p19 프로모터를 포함하지 않고, rep 유전자가 임의의 다른 기능성 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있지 않아, rep 유전자의 기준선 또는 최소 전사만 얻어지게 된다는 것을 의미한다.
일부 바람직한 구현예에서, AAV cap 유전자는 아데노바이러스 벡터 내에서 인코딩되는 폴리펩타이드(활성화제)에 의해 활성화될 수 있는 프로모터의 제어 하에 숙주세포 게놈에 통합된다.
본 발명의 또 다른 추가 구현예에서, 본 발명의 아데노바이러스 벡터는 (원격) 프로모터, 예를 들어 숙주세포에 존재하는 프로모터를 전사적으로 활성화시킬 수 있는 폴리펩타이드를 인코딩하는 본 발명의 핵산 분자를 포함한다. 바람직하게는, 숙주세포 내 프로모터는 AAV cap 유전자와 작동 가능하게 연결된(즉, AAV cap 유전자의 발현을 구동하는) 프로모터이다.
일부 구현예에서, 아데노바이러스 벡터는 해당 아데노바이러스 벡터에 존재하지 않는 프로모터를 전사적으로 활성화시킬 수 있는 폴리펩타이드를 인코딩한다. 이러한 활성화제의 예에는, 단순헤르페스바이러스의 VP16 전사 활성화제와 p53 단백질의 트랜스작용인자(trans-activator) 도메인이 포함된다. 이러한 활성화제는 cap 유전자 프로모터 내 큐메이트 결합 부위 또는 테트라시클린 결합 부위에 결합하는 것들과 같은 DNA 결합 도메인에 연결될 수 있다. 이는, 아데노바이러스 벡터가 숙주세포 내 존재하는 경우에만 cap 유전자의 전사가 유도되게 하여, 아데노바이러스 동안 AAV cap 유전자를 발현시키는 부담을 줄인다.
숙주세포는 단리된 세포일 수 있으며, 예를 들어 이들은 살아있는 동물 또는 포유류에 존재하지 않는다. 바람직하게는, 숙주세포는 포유류 세포이다. 포유류 세포의 예에는, 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 원숭이, 토끼, 당나귀, 말, 양, 소 및 유인원의 임의의 기관 또는 조직에서 유래된 것들이 포함된다. 바람직하게는, 세포는 인간 세포이다. 세포는 1차 또는 불멸화된(immortalised) 세포일 수 있다.
바람직한 세포에는, HEK-293, HEK 293T, HEK-293E, HEK-293FT, HEK-293S, HEK-293SG, HEK-293FTM, HEK-293SGGD, HEK-293A, MDCK, C127, A549, HeLa, CHO, 마우스 골수종, PerC6, 911 및 Vero 세포주가 포함된다. HEK-293 세포는 E1A 및 E1B 단백질을 함유하도록 변형되었으며, 이는 이러한 단백질을 본 발명에 사용되는 아데노바이러스 벡터 내에 또는 헬퍼 플라스미드에 공급해야 할 필요성을 없앤다. 유사하게, PerC6 및 911 세포는 유사한 변형을 함유하며, 이들 또한 사용될 수 있다. 가장 바람직하게는, 인간 세포는 HEK293, HEK293T, HEK293A, PerC6 또는 911이다. 다른 바람직한 세포에는, HeLa, CHO 및 VERO 세포가 포함된다.
숙주세포는 제2, 제3, 선택적으로 추가 핵산 분자가 발현되도록 하는 조건 하에서 (적절한 배지 중에서) 배양된다. 숙주세포에 적합한 배양 조건은 당업계에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌["Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Fourth Edition), Green, MR and Sambrook, J., (2014년 업데이트됨)]). 일부 구현예에서, 숙주세포는 배양 배지, 바람직하게는 액체 배양 배지 중에서 배양될 것이다.
본 발명의 일부 구현예에서, 제2 핵산 분자는 아데노바이러스 L4 33K 폴리펩타이드, 아데노바이러스 L4 100K 폴리펩타이드 또는 아데노바이러스 pVIII 폴리펩타이드 중 하나 이상을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는다. 본 발명의 일부 구현예에서, 추가 핵산 분자는 E2B 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는다. 본 발명의 일부 구현예에서, 숙주세포는 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스를 포함하지 않는다.
CARE 요소는 작동 가능하게 연결된 DNA 분자의 증폭을 촉진시킬 수 있다. 이와 관련하여, CARE 요소는 복제 기점으로서의 역할을 한다. 본원에 사용된 "증폭시킴"이라는 용어는, 복수의 DNA 분자의 생산을 나타낸다. 복수의 DNA 분자는 상이한 길이의 DNA 분자를 포함할 가능성이 있다. 복수의 DNA 분자 내 각각의 DNA 분자는 CARE 요소의 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부, 바람직하게는 CARE 요소의 뉴클레오타이드 서열의 전부를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 가질 것이다. 복수의 DNA 분자 내 각각의 DNA 분자는 작동 가능하게 연결된 DNA 분자의 전부 또는 일부를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 가질 것이다. 일부 구현예에서, 복수의 (증폭된) DNA 분자는 50개 내지 1000개 이상의 별개의 DNA 분자로 이루어질 수 있다.
복수의 증폭된 DNA 분자는 이중 가닥 DNA 분자이다. 복수의 증폭된 DNA 분자는 선형의 염색체외 분자이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다: 증폭된 DNA 분자 및/또는 이의 유전자 산물을 단리 및/또는 정제하는 단계. 예를 들어, 증폭된 DNA 산물은 에탄올 존재 하에 실리카 수지를 사용하여 DNA 정제를 통해 정제될 수 있다. 증폭된 DNA 산물의 유전자 산물(예를 들어 폴리펩타이드)은 특정 산물의 정제에 적합한 임의의 방법, 예를 들어 친화성 크로마토그래피를 통해 정제될 수 있다.
본 발명의 DNA 분자, 플라스미드 및 벡터는 임의의 적합한 기술에 따라 제조될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자와 패키징 세포를 생산하는 재조합 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌["Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Fourth Edition), Green, MR and Sambrook, J., (2014년 업데이트됨)]). 본 발명의 DNA 분자로부터의 rep 및 cap 유전자와 L4 22K 유전자의 발현은 임의의 적합한 검정으로, 예를 들어 (본원의 실시예에 기재된 바와 같이) qPCR을 통해 1 ml 당 게놈 카피 수를 분석하는 방식으로 분석될 수 있다.
추가의 구현예에서, 본 발명은, 숙주세포에서 CARE 요소에 작동 가능하게 연결된 DNA 분자를 증폭시키는 방법으로서,
(a) CARE 요소에 작동 가능하게 연결된 DNA 분자를 포함하는 제1 핵산 분자로서, 여기서 DNA 분자가 AAV rep 유전자와 AAV cap 유전자를 포함하는 제1 핵산 분자;
(b) L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터를 포함하는 제2 핵산 분자;
및 선택적으로 추가로
(c) 하나 이상의 아데노바이러스 초기 유전자 산물과 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 프로모터를 포함하는 하나 이상의 추가 핵산 분자를 포함하는 숙주세포를,
제2 핵산 분자, 및 선택적으로 추가로 하나 이상의 추가 핵산 분자가 발현되어 DNA 분자의 증폭을 촉진시키도록 하는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 숙주세포에서 DNA 분자를 증폭시키는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 제2 핵산 분자는 숙주세포 내 아데노바이러스 벡터에 존재한다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스 벡터는 AAV 전달 플라스미드를 추가로 포함한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은, 숙주세포에서 CARE 요소에 작동 가능하게 연결된 DNA 분자를 증폭시키는 방법으로서,
(a) CARE 요소에 작동 가능하게 연결된 DNA 분자를 포함하는 제1 핵산 분자로서, 여기서 DNA 분자가 cap 유전자 및 선택적으로 추가로 AAV 전달 플라스미드를 포함하는 제1 핵산 분자;
(b) L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터를 포함하는 제2 핵산 분자;
(c) AAV Rep 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3 핵산 분자;
및 선택적으로 추가로
(d) 하나 이상의 아데노바이러스 초기 유전자 산물과 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 프로모터를 포함하는 하나 이상의 추가 핵산 분자를 포함하는 숙주세포를,
제2 및 제3 핵산 분자, 및 선택적으로 추가로 하나 이상의 추가 핵산 분자가 발현되어 DNA 분자의 증폭을 촉진시키도록 하는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 숙주세포에서 DNA 분자를 증폭시키는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 제2 핵산 분자 및/또는 제3 핵산 분자는 숙주세포 내 아데노바이러스 벡터에 존재한다.
바람직하게는, rep 유전자는 기능성 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있지 않다. 바람직하게는, rep 유전자는 E1/E3 결실된 아데노바이러스 벡터의 E1 영역에 삽입되어 있다. 바람직하게는, rep 유전자 코딩 서열은 E1 영역에 위치할 때 E2B, E2A 및 E4 전사 유닛과 동일한 DNA 가닥에 인코딩된다.
추가의 구현예에서, 변형된 숙주세포를 생산하는 방법으로서,
(a) 본 발명의 제1 핵산 분자를 숙주세포에 도입하는 단계로서,
여기서 제1 핵산 분자가 CARE 요소에 작동 가능하게 연결된 AAV cap 유전자를 인코딩하는 DNA 분자를 포함하는 단계; 및/또는
(b) 본 발명의 제2 핵산 분자를 숙주세포에 도입하는 단계를 포함하고;
선택적으로,
(c) 본 발명의 제3 핵산 분자를 숙주세포에 도입하는 단계를 포함하며;
제1, 제2 및 (존재하는 경우) 제3 핵산 분자가 독립적으로
(i) 숙주세포의 게놈에 안정적으로 통합되거나,
(ii) 숙주세포 내에 에피솜 형태로 존재하도록 하는, 변형된 숙주세포를 생산하는 방법이 제공된다.
일부 구현예에서, 숙주세포는 AAV Rep 폴리펩타이드 및/또는 Cap 폴리펩타이드 및/또는 AAV 게놈을 발현하거나 발현할 수 있는 것이다.
예를 들어, 숙주세포는 AAV Rep 폴리펩타이드 및/또는 Cap 폴리펩타이드 및/또는 AAV 게놈을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 DNA 분자가 안정적으로 통합되어 있는 것일 수 있다. Rep 폴리펩타이드 및/또는 Cap 폴리펩타이드 및/또는 AAV 게놈을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 바람직하게는 적합한 조절 요소, 예를 들어 유도성 또는 구성적 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있다.
예를 들어, 숙주세포는 AAV Rep 폴리펩타이드 및/또는 Cap 폴리펩타이드 및/또는 AAV 게놈을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 DNA 플라스미드 또는 벡터를 포함하는 것일 수 있다. Rep 폴리펩타이드 및/또는 Cap 폴리펩타이드 및/또는 AAV 게놈을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 바람직하게는 적합한 조절 요소, 예를 들어 유도성 또는 구성적 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있다. 숙주세포는 AAV 패키징 세포 또는 AAV 생산자 세포일 수 있다.
또 다른 추가의 구현예에서, 본 발명은 또한 변형된 아데노바이러스 벡터를 생산하는 방법으로서,
(a) L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터를 포함하는 핵산 분자를 아데노바이러스 벡터에 도입하는 단계;
및 선택적으로
(b) AAV Rep 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 아데노바이러스 벡터에 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 아데노바이러스 벡터에서, AAV Rep 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자가 기능성 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있지 않은, 변형된 아데노바이러스 벡터를 생산하는 방법을 제공한다.
또 다른 추가의 구현예에서, 본 발명은 하기 단계 (a) 내지 (c)를 포함하는, 바이러스 입자를 생산하는 방법을 제공한다:
(a) 전이유전자를 플랭킹하는 5'- 및 3'-바이러스 ITR을 포함하는 전달 플라스미드를 숙주세포에 도입하는 단계로서, 여기서 숙주세포가 하기 (i) 내지 (iii)을 포함하는 단계:
(i) L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터를 포함하는 본 발명의 제2 핵산 분자;
(ii) AAV rep 및 cap 유전자로서, 패키징 세포 내 에피솜 플라스미드에 존재하거나 패키징 세포 게놈에 통합되어 있으며, CARE 요소에 작동 가능하게 연결되어 있는 AAV rep 및 cap 유전자;
(iii) 전달 플라스미드를 패키징하는 데 충분한 헬퍼 유전자로서, 세포 내 에피솜 헬퍼 플라스미드, 아데노바이러스 벡터에 존재하거나, 패키징 세포 게놈에 통합되어 있는 헬퍼 유전자;
(b) 바이러스 입자가 숙주세포에 의해 조립되도록 하는 조건 하에서 숙주세포를 배양하는 단계; 및
(c) 숙주세포 또는 배양 배지에서 패키징된 바이러스 입자를 수거하는 단계.
배양 배지는 숙주세포를 둘러싸고 있는 배지이다. 바람직하게는, 바이러스는 AAV이다. 바람직하게는, 숙주세포는 바이러스 패키징 세포이다. 바람직하게는, 수거된 바이러스 입자는 이어서 정제된다.
헬퍼 유전자는 바람직하게는 (아데노바이러스) E1A, E1B, E2A, E4 및 VA 유전자 중 하나 이상에서 선택된다. 본 발명의 일부 구현예에서, 헬퍼 유전자는 E2A 유전자를 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 헬퍼 유전자는 E2A 유전자를 포함하지 않는다.
본원에 사용된, 하나 이상의 플라스미드 또는 벡터를 세포에 "도입함"이라는 용어는, 형질전환, 및 특히 전기천공, 접합, 감염, 형질도입 또는 트랜스펙션 중 임의의 형태를 포함한다. 이러한 도입 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995 Aug 1;92 (16):7297-301]).
일부 바람직한 구현예에서, 전이유전자는 CRISPR 효소(예를 들어 Cas9, Cpf1) 또는 CRISPR sgRNA를 인코딩한다. 다른 구현예에서, 전이유전자는 혈우병과 관련된 유전자(예를 들어, VIII 인자 또는 IX 인자)이다.
WO2019/020992에는, 후기 아데노바이러스 유전자의 전사가 주요 후기 프로모터에의 억제인자 요소의 삽입을 통해 조절(예를 들어, 저해)될 수 있다고 개시되어 있다. 아데노바이러스 후기 유전자의 발현을 "차단"시켜, 세포의 단백질 제조 능력을 목적하는 재조합 단백질 또는 AAV 입자의 생산으로 전환시킬 수 있다. 하지만, 본 출원인은 후속으로, WO2019/020992에 기재된 방식으로 주요 후기 프로모터를 억제하여 후기 아데노바이러스 유전자를 저해하면, 이러한 유전자가 숙주세포 게놈에 통합된 경우, rep 및 cap 유전자의 CARE 의존적 복제를 저해하는 바람직하지 않은 효과가 나타난다는 것을 발견하였다. 따라서, L4 22K 폴리펩타이드를 CARE 요소 유도 폴리펩타이드로서 식별하는 것은 WO2019/020992(이의 내용은 그 전체가 구체적으로 참조로 인용됨)에 기재된 발명을 이용하는 AAV 생산 시스템(여기서 L4 22K 폴리펩타이드는 시스 또는 트랜스로 공급됨)의 사용을 가능하게 한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기 단계 (a) 내지 (c)를 포함하는, 바이러스 입자를 생산하는 방법을 제공한다:
(a) 하기 (i) 내지 (iii)을 포함하는 아데노바이러스 벡터를 숙주세포에 도입하는 단계로서,
(i) L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터를 포함하는 본 발명의 제2 핵산 분자;
(ii) 전이유전자를 플랭킹하는 5'- 및 3'-바이러스 ITR을 포함하는 전달 플라스미드;
(iii) 바이러스 전달 플라스미드를 패키징하는 데 충분한 헬퍼 유전자,
여기서 숙주세포가
하기 (i) 및 (ii)에 작동 가능하게 연결된 CARE 요소를 포함하는 단계:
(i) AAV cap 유전자; 및
(ii) 바이러스 Rep 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자로서, 여기서 바람직하게는 뉴클레오타이드 서열이 기능성 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있지 않은 핵산 분자;
(b) 바이러스 입자가 숙주세포 내에서 조립되도록 하는 조건 하에서 숙주세포를 배양하는 단계; 및
(c) 숙주세포 또는 배양 배지에서 패키징된 바이러스 입자를 수거하는 단계.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기 단계 (a) 내지 (c)를 포함하는, 바이러스 입자를 생산하는 방법을 제공한다:
(a) 하기 (i) 내지 (iii)을 포함하는 아데노바이러스 벡터를 숙주세포에 도입하는 단계로서,
(i) L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터를 포함하는 본 발명의 제2 핵산 분자;
(ii) 바이러스 Rep 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자로서, 여기서 바람직하게는 뉴클레오타이드 서열이 기능성 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있지 않은 핵산 분자;
(iii) 바이러스 전달 플라스미드를 패키징하는 데 충분한 헬퍼 유전자,
여기서 숙주세포가 숙주세포 게놈에 안정적으로 통합된 하기 (i) 및 (ii)를 포함하는 단계:
(i) AAV cap 유전자에 작동 가능하게 연결된 CARE 요소, 및
(ii) 전이유전자를 플랭킹하는 5'- 및 3'-바이러스 ITR을 포함하는 전달 플라스미드로서, CARE 요소에 작동 가능하게 연결되거나 연결되지 않을 수 있는 전달 플라스미드;
(b) 바이러스 입자가 숙주세포 내에서 조립되도록 하는 조건 하에서 숙주세포를 배양하는 단계; 및
(c) 숙주세포 또는 배양 배지에서 패키징된 바이러스 입자를 수거하는 단계.
일부 바람직한 구현예에서, AAV cap 유전자는 아데노바이러스 벡터 내에서 인코딩되는 폴리펩타이드에 의해 활성화되는 프로모터의 제어 하에 숙주세포 게놈에 통합된다. 바람직하게는, 바이러스는 AAV이다. 바람직하게는, 숙주세포는 바이러스 패키징 세포이다.
바람직하게는, 아데노바이러스 벡터는 억제성 주요 후기 프로모터(MLP)를 포함하며, 여기서 더욱 바람직하게는 MLP는 아데노바이러스 후기 유전자의 전사를 조절하거나 제어할 수 있는 하나 이상의 억제인자 요소를 포함하고, 여기서 억제인자 요소 중 하나 이상은 MLP TATA 박스의 다운스트림에 삽입되어 있다.
바람직하게는, CARE 요소, AAV cap 유전자 및 전달 플라스미드는,
(i) 숙주세포 게놈에 안정적으로 통합되어 있거나; 또는
(ii) 숙주세포 내 에피솜 플라스미드 또는 벡터에 존재한다.
바이러스(바람직하게는 AAV) 입자를 생산하는 방법의 바람직한 특징에는, 하기가 포함된다:
- 하나 이상의 억제인자 요소가 MLP TATA 박스와 전사의 +1 위치 사이에 삽입되어 있는 경우.
- 억제인자 요소가 억제인자 단백질에 의해 결합될 수 있는 것인 경우.
- 억제인자 요소에 결합할 수 있는 억제인자 단백질을 인코딩하는 유전자가 아데노바이러스 게놈 내에서 인코딩되는 경우.
- 억제인자 단백질이 MLP의 제어 하에 전사되는 경우.
- 억제인자 단백질이 테트라시클린 억제인자, 락토오스 억제인자 또는 엑디손 억제인자, 바람직하게는 테트라시클린 억제인자(TetR)인 경우.
- 억제인자 요소가 서열번호 11에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 테트라시클린 억제인자 결합 부위인 경우.
- MLP의 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 12 또는 13에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경우.
- 억제인자 요소의 존재가 아데노바이러스 E2B 단백질의 생산에 영향을 미치지 않는 경우.
- 아데노바이러스 벡터가 아데노바이러스 L4 100K 단백질을 인코딩하고, 여기서 L4 100K 단백질은 MLP의 제어 하에 있지 않은 경우.
- 전이유전자가 전달 플라스미드 대신 아데노바이러스 초기 영역 중 하나, 바람직하게는 아데노바이러스 E1 영역 내에 삽입되어 있는 경우.
- 전이유전자가 이의 5'-UTR에 3개 부분으로 구분된 리더(TPL: Tripartite Leader)를 포함하는 경우.
- 전이유전자가 치료용 폴리펩타이드를 인코딩하는 경우.
- 전이유전자가 바이러스 단백질, 바람직하게는 세포 내부 또는 외부에서 조립되어 바이러스 유사 입자를 생산할 수 있는 단백질을 인코딩하고, 바람직하게는 전이유전자가 노로바이러스 VP1 또는 B형 간염 HBsAG를 인코딩하는 경우.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기 (i) 내지 (iv)의 경우 L4 22K 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA 분자를 제공한다:
(i) DNA 분자가 아데노바이러스 주요 후기 프로모터가 아닌 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 경우;
(ii) DNA 분자가 포유류 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 경우;
(iii) DNA 분자가 아데노바이러스 L4 100K, L4 33K 또는 pVII 폴리펩타이드를 추가로 인코딩하지 않는 경우;
(iv) DNA 분자가 CMV, PGK 또는 SV40 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 경우.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기 (a)를 포함하는 숙주세포를 제공한다:
(a) L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터를 포함하는 본 발명의 제2 핵산 분자;
여기서 핵산 분자는 숙주세포의 게놈에 안정적으로 통합되어 있거나,
에피솜 플라스미드 또는 벡터에 존재함.
바람직하게는,
(i) 이종 프로모터는 아데노바이러스 주요 후기 프로모터가 아니거나;
(ii) 프로모터는 포유류 프로모터이거나;
(iii) 핵산 분자는 아데노바이러스 L4 100K, L4 33K 또는 pVII 폴리펩타이드를 추가로 인코딩하지 않거나; 또는
(iv) DNA 분자는 CMV, PGK 또는 SV40 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있다.
바람직하게는, 숙주세포는 본원에 정의된 바와 같은 것이다.
일부 구현예에서, 숙주세포는 하기 (b)를 추가로 포함한다:
(b) AAV rep 및 cap 유전자로서, 숙주세포 내 에피솜 플라스미드에 존재하거나 세포 게놈에 안정적으로 통합되어 있으며, CARE 요소에 작동 가능하게 연결되어 있는 AAV rep 및 cap 유전자.
또 다른 구현예에서, 숙주세포는 하기 (c) 및 (d) 중 하나 또는 둘 모두를 추가로 포함한다:
(c) ITR이 플랭킹된 전이유전자를 포함하는 AAV 전달 플라스미드; 및
(d) E1A, E1B, E2A, E4 및 VA RNA에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하는 AAV 생산용 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드.
이러한 세포는 통상적으로 패키징 세포로 공지되어 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 헬퍼 플라스미드는 E2A 유전자를 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 헬퍼 플라스미드는 E2A 유전자를 포함하지 않는다. 후자의 경우, E2A 유전자의 생략은 헬퍼 플라스미드에 필요한 DNA의 양을 상당히 감소시킨다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기 (a)를 포함하는 숙주세포를 제공한다:
(a) CARE 요소에 작동 가능하게 연결된 DNA 분자를 포함하는 본 발명의 제1 핵산 분자로서, 여기서 DNA 분자가 하기 (i) 내지 (iii) 중 하나 이상을 인코딩하는 제1 핵산 분자:
(i) AAV Cap 폴리펩타이드,
(ii) AAV Rep 폴리펩타이드 및
(iii) AAV 전달 벡터,
여기서 제1 핵산 분자는 숙주세포의 게놈에 안정적으로 통합되어 있거나,
에피솜 플라스미드에 존재함.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 아데노바이러스 L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 아데노바이러스 벡터로서, 여기서 L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체 코딩 서열이 아데노바이러스 MLP와 작동 가능하게 연결되어 있지 않은 아데노바이러스 벡터를 제공한다.
일부 이러한 구현예에서, 고유한 L4 22K 코딩 서열에 더하여, 신규한 L4 22K 코딩 서열을 아데노바이러스 벡터에 삽입하는 것이 바람직할 수 있다.
이러한 구현예에서, 아데노바이러스 벡터는
(i) 아데노바이러스 L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 핵산 분자로서, 여기서 L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체 코딩 서열이 아데노바이러스 MLP와 작동 가능하게 연결되어 있지 않은 핵산 분자, 및
(ii) 아데노바이러스 L4 22K 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하며,
여기서 L4 22K 폴리펩타이드 코딩 서열은 아데노바이러스 MLP와 작동 가능하게 연결되어 있다.
바람직하게는, 아데노바이러스 MLP는 (예를 들어, 본원에 정의된 바와 같은) 억제성 MLP이다.
바람직하게는, 아데노바이러스 벡터는 AAV Rep 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함하며, 더욱 바람직하게는 상기 핵산 분자는 기능성 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있지 않다.
바람직하게는, L4 22K 폴리펩타이드 인코딩 서열은 아데노바이러스 E1 또는 E3 영역에 삽입되어 있다.
본 발명은 또한 하기 (A) 및 (B)를 포함하는 키트를 제공한다:
(A) 하기 (a)를 포함하는 숙주세포:
(a) CARE 요소에 작동 가능하게 연결된 DNA 분자를 포함하는 본 발명의 제1 핵산 분자로서, 여기서 DNA 분자가 하기 (i) 및 (ii) 중 하나 이상을 인코딩하는 제1 핵산 분자:
(i) AAV Cap 폴리펩타이드, 및
(ii) AAV Rep 폴리펩타이드,
여기서 제1 핵산 분자는 숙주세포의 게놈에 안정적으로 통합되어 있거나,
에피솜 플라스미드에 존재함;
및
(B) 하기 (i) 및 (ii)를 포함하는 아데노바이러스 벡터:
(i) 아데노바이러스 L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 핵산 분자로서, 여기서 L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체 코딩 서열이 아데노바이러스 MLP와 작동 가능하게 연결되어 있지 않은 핵산 분자, 및
(ii) AAV 전달 벡터를 인코딩하는 핵산 분자.
본 발명은 또한 하기 (A) 및 (B)를 포함하는 키트를 제공한다:
(A) 하기 (a)를 포함하는 숙주세포:
(a) CARE 요소에 작동 가능하게 연결된 DNA 분자를 포함하는 본 발명의 제1 핵산 분자로서, 여기서 DNA 분자가 하기 (i), 및 선택적으로 (ii) 중 하나 이상을 인코딩하는 제1 핵산 분자:
(i) AAV Cap 폴리펩타이드, 및 선택적으로
(ii) AAV 전달 벡터,
여기서 제1 핵산 분자는 숙주세포의 게놈에 안정적으로 통합되어 있거나,
에피솜 플라스미드에 존재함;
및
(B) 하기 (i) 및 (ii)를 포함하는 아데노바이러스 벡터:
(i) 아데노바이러스 L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 핵산 분자로서, 여기서 L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체 코딩 서열이 아데노바이러스 MLP와 작동 가능하게 연결되어 있지 않은 핵산 분자, 및
(ii) AAV Rep 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자로서,
바람직하게는 기능성 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있지 않은 핵산 분자.
키트는 또한 AAV 입자의 정제를 위한 물질, 예컨대 바이러스 입자의 밀도 밴드 형성 및 정제에 관여하는 것들, 예를 들어 원심분리 튜브, 요오딕사놀(iodixanol), 투석 완충액 및 투석 카세트 중 하나 이상을 함유할 수 있다.
2개의 아미노산 또는 핵산 서열을 정렬하는 데 이용 가능한 다수의 확립된 알고리즘이 존재한다. 전형적으로, 하나의 서열은 테스트 서열과 비교할 수 있는 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘은 설계된 프로그램 매개변수에 기초하여, 참조 서열을 기준으로 한 테스트 서열(들)의 서열 동일성 백분율을 계산한다. 비교를 위한 아미노산 또는 핵산 서열의 정렬은, 예를 들어 컴퓨터 구현 알고리즘(예를 들어 GAP, BESTFIT, FASTA 또는 TFASTA), 또는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘에 의해 수행될 수 있다.
아미노산 서열 동일성 및 뉴클레오티드 서열 동일성 백분율은 BLAST 정렬 방법(문헌[Altschul et al. (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]; 및 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)을 사용하여 얻을 수 있다. 바람직하게는, 표준 또는 디폴트(default) 정렬 매개변수가 사용된다.
표준 단백질-단백질 BLAST(blastp)는 단백질 데이터베이스에서 유사한 서열을 찾는 데 사용될 수 있다. 다른 BLAST 프로그램과 같이, blastp는 유사한 국소 영역을 찾도록 설계되어 있다. 서열 유사성이 전체 서열에 걸쳐 있는 경우, blastp는 또한 전체 정렬을 보고할 것이며, 이는 단백질 식별을 위한 바람직한 결과이다. 바람직하게는, 표준 또는 디폴트 정렬 매개변수가 사용된다. 일부 경우에, "저복잡도 필터(low complexity filter)"가 제거될 수 있다.
BLAST 단백질 검색은 또한 BLASTX 프로그램(스코어=50, 단어길이=3)을 이용하여 수행될 수 있다. 비교 목적으로 갭이 있는 정렬을 얻기 위해, Gapped BLAST(BLAST 2.0)가 문헌[Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389]에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. 대안적으로, PSI-BLAST(BLAST 2.0)는 분자들 사이의 먼 관계를 검출하는 반복 검색을 수행하는 데 사용될 수 있다. (Altschul 등의 상기 문헌(1997) 참조). BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST를 이용할 때, 각각의 프로그램의 디폴트 매개변수가 사용될 수 있다.
뉴클레오티드 서열 비교와 관련하여, 이러한 목적을 달성하기 위해 MEGABLAST, 불연속-megablast 및 blastn이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 표준 또는 디폴트 정렬 매개변수가 사용된다. MEGABLAST는 특히 매우 유사한 서열 사이의 긴 정렬을 효율적으로 찾도록 설계되어 있다. 불연속 MEGABLAST는 본 발명의 핵산과 유사하지만, 동일하지는 않은 뉴클레오티드 서열을 찾는 데 사용될 수 있다.
BLAST 뉴클레오티드 알고리즘은 쿼리(query)를 단어라고 불리는 짧은 하위서열로 분해하는 방식으로 유사한 서열을 찾는다. 이러한 프로그램은 먼저 쿼리 단어에 정확히 일치하는 것(단어 명중(word hit))을 식별한다. 이어서, BLAST 프로그램은 이러한 단어 명중을 다수의 단계로 확장하여, 최종 갭이 있는 정렬을 생성한다. 일부 구현예에서, BLAST 뉴클레오티드 검색은 BLASTN 프로그램(스코어=100, 단어길이=12)을 이용하여 수행될 수 있다.
BLAST 검색의 민감도를 제어하는 중요한 매개변수 중 하나는 단어 크기이다. blastn이 MEGABLAST보다 더 민감한 가장 중요한 이유는, 더 짧은 디폴트 단어 크기(11)를 사용한다는 점이다. 이로 인해, blastn은 다른 유기체로부터의 관련 뉴클레오티드 서열에 대한 정렬을 찾는 데 있어서 MEGABLAST보다 우수하다. 단어 크기는 blastn에서 조정 가능하며, 검색 민감도를 증가시키기 위해 디폴트 값에서 최소 7로 감소시킬 수 있다.
새로 도입된 불연속 megablast 페이지(www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Newsltr/FallWinter02/blastlab.html)를 사용하여 더 민감한 검색을 달성할 수 있다. 이러한 웹 페이지는 Ma 등에 의해 보고된 바(문헌[Bioinformatics. 2002 Mar; 18(3): 440-5])와 유사한 알고리즘을 사용한다. 불연속 megablast는, 정렬 확장을 위한 근원으로서 정확한 단어 일치를 필요로 하는 것이 아니라, 더 긴 범위의 템플릿 내에서 연속되지 않은 단어를 사용한다. 코딩 모드에서, 제3 위치에서의 불일치는 무시하면서, 제1 및 제2 코돈 위치에서 일치를 찾는 것에 초점을 맞추어 제3 베이스 워블링(wobbling)을 고려한다. 동일한 단어 크기를 사용하는 불연속 MEGABLAST에서의 검색은 동일한 단어 크기를 사용하는 표준 blastn보다 더 민감하고 효율적이다. 불연속 megablast에 대한 고유한 매개변수는 하기와 같다: 단어 크기: 11 또는 12; 템플릿: 16, 18 또는 21; 템플릿 유형: 코딩 (0), 비코딩 (1) 또는 둘 모두 (2).
일부 구현예에서, 디폴트 파라미터를 사용하여 BLASTP 2.5.0+ 알고리즘(예컨대, NCBI에서 입수 가능한 것)을 사용할 수 있다.
다른 구현예에서, 존재(Existence) 11 및 연장(Extension) 1의 갭 비용이 있는 2개의 단백질 서열의 니들만-브니쉬(Needleman-Wunsch) 정렬을 사용하여 BLAST 전체 정렬 프로그램(예컨대, NCBI에서 입수 가능한 것)을 사용할 수 있다.
본원에 제공된 각각의 참조문헌의 개시내용은 구체적으로 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
도 1: HeLaRC32 세포주에서 AAV2 벡터를 생산하는 데 필요한 아데노바이러스 L4-22K 발현.
도 2: 안정한 패키징 세포주 HeLaRC32에서 AAV2의 생산을 유도할 수 없는 TERA-E1을 이용한 슈퍼 감염.
도 3: 안정적으로 통합된 AAV Rep 및 Cap 유전자의 DNA 증폭에 필요한 아데노바이러스로부터의 L4-22K의 전사.
도 4: 안정한 패키징 세포주 HeLaRC32에서 AAV2 복제를 저해하는 아데노바이러스 22K를 인코딩하는 아데노바이러스 후기 전사체 L4의 siRNA 녹다운.
도 5: HeLaRC32 세포로부터 AAV Cap 유전자의 CARE 의존적 증폭을 유도하는 아데노바이러스 후기 단백질 L4-22K.
도 6: L4-100K의 부재 하에서 HeLaRC32 세포로부터 AAV Cap 유전자의 CARE 의존적 증폭을 유도하는 아데노바이러스 후기 단백질 L4-22K.
실시예
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 여기서 달리 언급되지 않는 한, 부(part) 및 백분율은 중량 기준이고, 온도는 섭씨 온도이다. 이러한 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내지만, 단지 예시로서 제공된 것이라는 점을 이해해야 한다. 상기 논의 및 하기 실시예로부터, 당업자는 본 발명의 본질적인 특징을 확인할 수 있으며, 본 발명의 사상 및 범위에서 벗어나지 않는 한, 다양한 용도 및 조건에 적합하게 하기 위해 본 발명의 다양한 변경 및 변형을 만들 수 있다. 따라서, 본원에 제시 및 기재된 것에 더하여, 본 발명의 다양한 변형이 또한 상기 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 또한 첨부된 청구범위의 범위에 속하는 것으로 의도된다.
실시예 1: HeLaRC32 세포주에서 AAV2 벡터를 생산하는 데 필요한 아데노바이러스 L4-22K 발현.
L4 22K는 감염의 후기 단계 동안 아데노바이러스 주요 후기 프로모터로부터 발현되고, MLP의 전사 억제는 HeLaRC32 세포로부터 AAV2의 생산을 억제한다. 대조군 아데노바이러스 Ad5-E1 및 TERA-E1(변형된 주요 후기 프로모터가 억제인자 단백질 TetR을 전사하고, 변형된 주요 후기 프로모터로부터의 전사가 TetR에 의해 억제되는 재조합 복제 아데노바이러스)은 분자 클로닝 방법으로 HEK293 세포로부터 생산하였다. HeLaRC32 세포를 48웰 조직 배양 플레이트에 웰 당 9e4개 세포로 24시간 동안 씨딩한 후, 플라스미드 pSF-AAV-EGFP로 트랜스펙션시키고, 독시시클린 0.5 ug/mL 또는 DMSO의 존재 하에서, Ad5-E1 또는 TERA-E1로 감염시켰다. 생산 후 96시간 후에 AAV2 입자를 수거하고, QPCR로 정량화하였다. 결과는 도 1에 제시되어 있다.
실시예 2: 안정한 패키징 세포주 HeLaRC32에서 AAV2의 생산을 유도할 수 없는 TERA-E1을 이용한 슈퍼 감염.
대조군 아데노바이러스 Ad5-E1 및 TERA-E1(변형된 주요 후기 프로모터가 억제인자 단백질 TetR을 전사하고, 변형된 주요 후기 프로모터로부터의 전사가 TetR에 의해 억제되는 재조합 복제 아데노바이러스)은 분자 클로닝 방법으로 HEK293 세포로부터 생산하였다. HeLaRC32 세포를 48웰 조직 배양 플레이트에 웰 당 9e4개 세포로 24시간 동안 씨딩한 후, 플라스미드 pSF-AAV-EGFP로 트랜스펙션시키고, 독시시클린 0.5 ug/mL 또는 DMSO의 부재 하에서, 표시된 감염 다중도로 Ad5-E1 또는 TERA-E1로 감염시켰다. 생산 후 96시간 후에 AAV2 입자를 수거하고, QPCR로 정량화하였다. 결과는 도 2에 제시되어 있다.
실시예 3: 안정적으로 통합된 AAV Rep 및 Cap 유전자의 DNA 증폭에 필요한 아데노바이러스로부터의 L4-22K의 전사.
TERA-E1(변형된 주요 후기 프로모터가 억제인자 단백질 TetR을 전사하고, 변형된 주요 후기 프로모터로부터의 전사가 TetR에 의해 억제되는 재조합 복제 아데노바이러스)은 분자 클로닝 방법으로 HEK293 세포로부터 생산하였다. HeLaRC32 세포를 48웰 조직 배양 플레이트에 웰 당 9e4개 세포로 24시간 동안 씨딩하고, 독시시클린 0.5 ug/mL 또는 DMSO의 존재 하에서 TERA-E1(MOI 50)로 감염시켰다. 감염 96시간 후에 전체 DNA를 추출하고, AAV Rep 및 Cap DNA를 PCR로 증폭시켰다. AAV Rep 및 Cap 앰플리콘 DNA를 아가로오스 겔 전기영동으로 분석하였다. 결과는 도 3에 제시되어 있다.
실시예 4: 안정한 패키징 세포주 HeLaRC32에서 AAV2 복제를 저해하는 아데노바이러스 22K를 인코딩하는 아데노바이러스 후기 전사체 L4의 siRNA 녹다운.
MLP 억제성 아데노바이러스 TERA-E1(변형된 주요 후기 프로모터가 억제인자 단백질 TetR을 전사하고, 변형된 주요 후기 프로모터로부터의 전사가 TetR에 의해 억제되는 재조합 복제 아데노바이러스)은 표준 분자 클로닝 방법으로 HEK293 세포로부터 생산하였다. HeLaRC32 세포를 48웰 조직 배양 플레이트에 웰 당 1.5e4개의 세포로 씨딩하고, 아데노바이러스 1차 mRNA 전사체 L1, L2, L3, L4 또는 L5를 표적으로 하는 siRNA로 24시간 동안 트랜스펙션시켰다. HeLaRC32 세포를 플라스미드 pSF-AAV-EGFP로 트랜스펙션시키고, 독시시클린 0.5 ug/mL 또는 DMSO의 존재 하에서 TERA-E1(MOI 50)로 감염시켰다. 감염 96시간 후 QPCR로 AAV2를 정량화하였다. 결과는 도 4에 도시되어 있다.
실시예 5: HeLaRC32 세포로부터 AAV Cap 유전자의 CARE 의존적 증폭을 유도하는 아데노바이러스 후기 단백질 L4-22K.
MLP 억제성 아데노바이러스 TERA-E1(변형된 주요 후기 프로모터가 억제인자 단백질 TetR을 전사하고, 변형된 주요 후기 프로모터로부터의 전사가 TetR에 의해 억제되는 재조합 복제 아데노바이러스)은 분자 클로닝 방법으로 HEK293 세포로부터 생산하였다. HeLaRC32 세포를 48웰 조직 배양 플레이트에 웰 당 9.0e4개의 세포로 24시간 동안 씨딩한 후, CMV 프로모터의 제어 하에서 아데노바이러스 L4 유전자를 전사하는 플라스미드로 트랜스펙션시키고, TERA-E1(MOI 50)로 감염시켰다. 감염 96시간 후에 전체 DNA를 추출하고, AAV Cap DNA를 QPCR로 정량화하였다. 결과는 도 5에 제시되어 있다.
실시예 6: L4-100K의 부재 하에서 HeLaRC32 세포로부터 AAV Cap 유전자의 CARE 의존적 증폭을 유도하는 아데노바이러스 후기 단백질 L4-22K.
MLP 억제성 아데노바이러스 TERA-E1(변형된 주요 후기 프로모터가 억제인자 단백질 TetR을 전사하고, 변형된 주요 후기 프로모터로부터의 전사가 TetR에 의해 억제되는 재조합 복제 아데노바이러스)은 분자 클로닝 방법으로 HEK293 세포로부터 생산하였다. HeLaRC32 세포를 48웰 조직 배양 플레이트에 웰 당 9.0e4개의 세포로 24시간 동안 씨딩한 후, CMV 구동 L4-100K 또는 스터퍼(stuffer) DNA와 함께 아데노바이러스 L4-22K를 전사하는 CMV 프로모터 플라스미드로 공동 트랜스펙션시키고, TERA-E1(MOI 50)로 감염시켰다. 감염 96시간 후에 전체 DNA를 추출하고, AAV Cap DNA를 QPCR로 정량화하였다. 결과는 도 6에 제시되어 있다.
서열
서열번호 1
Rep 뉴클레오타이드 서열 (AAV 혈청형 2)
atgccggggttttacgagattgtgattaaggtccccagcgaccttgacgagcatctgcccggcatttctgacagctttgtgaactgggtggccgagaaggaatgggagttgccgccagattctgacatggatctgaatctgattgagcaggcacccctgaccgtggccgagaagctgcagcgcgactttctgacggaatggcgccgtgtgagtaaggccccggaggcccttttctttgtgcaatttgagaagggagagagctacttccacatgcacgtgctcgtggaaaccaccggggtgaaatccatggttttgggacgtttcctgagtcagattcgcgaaaaactgattcagagaatttaccgcgggatcgagccgactttgccaaactggttcgcggtcacaaagaccagaaatggcgccggaggcgggaacaaggtggtggatgagtgctacatccccaattacttgctccccaaaacccagcctgagctccagtgggcgtggactaatatggaacagtatttaagcgcctgtttgaatctcacggagcgtaaacggttggtggcgcagcatctgacgcacgtgtcgcagacgcaggagcagaacaaagagaatcagaatcccaattctgatgcgccggtgatcagatcaaaaacttcagccaggtacatggagctggtcgggtggctcgtggacaaggggattacctcggagaagcagtggatccaggaggaccaggcctcatacatctccttcaatgcggcctccaactcgcggtcccaaatcaaggctgccttggacaatgcgggaaagattatgagcctgactaaaaccgcccccgactacctggtgggccagcagcccgtggaggacatttccagcaatcggatttataaaattttggaactaaacgggtacgatccccaatatgcggcttccgtctttctgggatgggccacgaaaaagttcggcaagaggaacaccatctggctgtttgggcctgcaactaccgggaagaccaacatcgcggaggccatagcccacactgtgcccttctacgggtgcgtaaactggaccaatgagaactttcccttcaacgactgtgtcgacaagatggtgatctggtgggaggaggggaagatgaccgccaaggtcgtggagtcggccaaagccattctcggaggaagcaaggtgcgcgtggaccagaaatgcaagtcctcggcccagatagacccgactcccgtgatcgtcacctccaacaccaacatgtgcgccgtgattgacgggaactcaacgaccttcgaacaccagcagccgttgcaagaccggatgttcaaatttgaactcacccgccgtctggatcatgactttgggaaggtcaccaagcaggaagtcaaagactttttccggtgggcaaaggatcacgtggttgaggtggagcatgaattctacgtcaaaaagggtggagccaagaaaagacccgcccccagtgacgcagatataagtgagcccaaacgggtgcgcgagtcagttgcgcagccatcgacgtcagacgcggaagcttcgatcaactacgcagacaggtaccaaaacaaatgttctcgtcacgtgggcatgaatctgatgctgtttccctgcagacaatgcgagagaatgaatcagaattcaaatatctgcttcactcacggacagaaagactgtttagagtgctttcccgtgtcagaatctcaacccgtttctgtcgtcaaaaaggcgtatcagaaactgtgctacattcatcatatcatgggaaaggtgccagacgcttgcactgcctgcgatctggtcaatgtggatttggatgactgcatctttgaacaaTAG
서열번호 2
Cap 뉴클레오타이드 서열 (AAV 혈청형 2)
Cagttgcgcagccatcgacgtcagacgcggaagcttcgatcaactacgcagacaggtaccaaaacaaatgttctcgtcacgtgggcatgaatctgatgctgtttccctgcagacaatgcgagagaatgaatcagaattcaaatatctgcttcactcacggacagaaagactgtttagagtgctttcccgtgtcagaatctcaacccgtttctgtcgtcaaaaaggcgtatcagaaactgtgctacattcatcatatcatgggaaaggtgccagacgcttgcactgcctgcgatctggtcaatgtggatttggatgactgcatctttgaacaataaatgatttaaatcaggt atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacactctctctgaaggaataagacagtggtggaagctcaaacctggcccaccaccaccaaagcccgcagagcggcataaggacgacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctcggacccttcaacggactcgacaagggagagccggtcaacgaggcagacgccgcggccctcgagcacgacaaagcctacgaccggcagctcgacagcggagacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgcggagtttcaggagcgccttaaagaagatacgtcttttgggggcaacctcggacgagcagtcttccaggcgaaaaagagggttcttgaacctctgggcctggttgaggaacctgttaagacggctccgggaaaaaagaggccggtagagcactctcctgtggagccagactcctcctcgggaaccggaaaggcgggccagcagcctgcaagaaaaagattgaattttggtcagactggagacgcagactcagtacctgacccccagcctctcggacagccaccagcagccccctctggtctgggaactaatacgatggctacaggcagtggcgcaccaatggcagacaataacgagggcgccgacggagtgggtaattcctcgggaaattggcattgcgattccacatggatgggcgacagagtcatcaccaccagcacccgaacctgggccctgcccacctacaacaaccacctctacaaacaaatttccagccaatcaggagcctcgaacgacaatcactactttggctacagcaccccttgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcaaagactcatcaacaacaactggggattccgacccaagagactcaacttcaagctctttaacattcaagtcaaagaggtcacgcagaatgacggtacgacgacgattgccaataaccttaccagcacggttcaggtgtttactgactcggagtaccagctcccgtacgtcctcggctcggcgcatcaaggatgcctcccgccgttcccagcagacgtcttcatggtgccacagtatggatacctcaccctgaacaacgggagtcaggcagtaggacgctcttcattttactgcctggagtactttccttctcagatgctgcgtaccggaaacaactttaccttcagctacacttttgaggacgttcctttccacagcagctacgctcacagccagagtctggaccgtctcatgaatcctctcatcgaccagtacctgtattacttgagcagaacaaacactccaagtggaaccaccacgcagtcaaggcttcagttttctcaggccggagcgagtgacattcgggaccagtctaggaactggcttcctggaccctgttaccgccagcagcgagtatcaaagacatctgcggataacaacaacagtgaatactcgtggactggagctaccaagtaccacctcaatggcagagactctctggtgaatccgggcccggccatggcaagccacaaggacgatgaagaaaagttttttcctcagagcggggttctcatctttgggaagcaaggctcagagaaaacaaatgtggacattgaaaaggtcatgattacagacgaagaggaaatcaggacaaccaatcccgtggctacggagcagtatggttctgtatctaccaacctccagagaggcaacagacaagcagctaccgcagatgtcaacacacaaggcgttcttccaggcatggtctggcaggacagagatgtgtaccttcaggggcccatctgggcaaagattccacacacggacggacattttcacccctctcccctcatgggtggattcggacttaaacaccctcctccacagattctcatcaagaacaccccggtacctgcgaatccttcgaccaccttcagtgcggcaaagtttgcttccttcatcacacagtactccacgggacaggtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggaaaacagcaaacgctggaatcccgaaattcagtacacttccaactacaacaagtctgttaatgtggactttactgtggacactaatggcgtgtattcagagcctcgccccattggcaccagatacctgactcgtaatctgtaA
서열번호 3
Cap 아미노산 서열 (AAV 혈청형 2)
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL*
서열번호 4
Rep 결합 부위 (RBS)
gcccgagtgagcacgc
서열번호 5
CARE 요소 AAV2
gtcctgtattagaggtcacgtgagtgttttgcgacattttgcgacaccatgtggtcacgctgggtatttaagcccgagtgagcacgcagggtctccattttgaagcgggaggtttgaacgcgcagccgccatgccggggttttacgagattgtgattaaggtccccagcgaccttgacgagcatctgcccggcatttctgacagctttgtgaactgggtggccgagaaggaatgggagttgccgccagattctgacatggatctgaatctgattgagcaggcacccctgaccgtggccgagaagctgcagcgcgactttctgacggaatggcgccgtgtgagtaaggccc
서열번호 6 (UniProtKB - Q5TJ00)
L4 22K
단백질 명칭: 인간 아데노바이러스 D 혈청형 9 (HAdV-9)
MPRKKQEPLV EEMEEEWDSQ AEEDEWEEET EEEELEEVEE EQATEQPVAA
PSAPAAPAVT DTTSAAPAKP PRRWDRVKGD GKHERQGYRS WRAHKAAIIA
CLQDCGGNIA FARRYLLFHR GVNIPRNVLH YYRHLHS
서열번호 7
Ad 5 L4 22K
atggcacccaaaaagaagctgcagctgccgccgccacccacggacgaggaggaatactgggacagtcaggcagaggaggttttggacgaggaggaggaggacatgatggaagactgggagagcctagacgaggaagcttccgaggtcgaagaggtgtcagacgaaacaccgtcaccctcggtcgcattcccctcgccggcgccccagaaatcggcaaccggttccagcatggctacaacctccgctcctcaggcgccgccggcactgcccgttcgccgacccaaccgtagatgggacaccactggaaccagggccggtaagtccaagcagccgccgccgttagcccaagagcaacaacagcgccaaggctaccgctcatggcgcgggcacaagaacgccatagttgcttgcttgcaagactgtgggggcaacatctccttcgcccgccgctttcttctctaccatcacggcgtggccttcccccgtaacatcctgcattactaccgtcatctctacagcccatactgcaccggcggcagcggcagcaacagcagcggccacacagaagcaaaggcgaccggatag
서열번호 8
Ad 5 L4 22K
MAPKKKLQLPPPPTDEEEYWDSQAEEVLDEEEEDMMEDWESLDEEASEVEEVSDETPSPSVAFPSPAPQKSATGSSMATTSAPQAPPALPVRRPNRRWDTTGTRAGKSKQPPPLAQEQQQRQGYRSWRGHKNAIVACLQDCGGNISFARRFLLYHHGVAFPRNILHYYRHLYSPYCTGGSGSNSSGHTEAKATG*
서열번호 9
E2A 폴리펩타이드 뉴클레오타이드 서열 (아데노바이러스 유형 5)
ATGGCCAGTCGGGAAGAGGagcagcgcgaaaccacccccgagcgcggacgcggtgcggcgcgacgtcccccaaccatggaggacgtgtcgtccccgtccccgtcgccgccgcctccccgggcgcccccaaaaaagcggatgaggcggcgtatcgagtccgaggacgaggaagactcatcacaagacgcgctggtgccgcgcacacccagcccgcggccatcgacctcggcggcggatttggccattgcgcccaagaagaaaaagaagcgcccttctcccaagcccgagcgcccgccatcaccagaggtaatcgtggacagcgaggaagaaagagaagatgtggcgctacaaatggtgggtttcagcaacccaccggtgctaatcaagcatggcaaaggaggtaagcgcacagtgcggcggctgaatgaagacgacccagtggcgcgtggtatgcggacgcaagaggaagaggaagagcccagcgaagcggaaagtgaaattacggtgatgaacccgctgagtgtgccgatcgtgtctgcgtgggagaagggcatggaggctgcgcgcgcgctgatggacaagtaccacgtggataacgatctaaaggcgaacttcaaactactgcctgaccaagtggaagctctggcggccgtatgcaagacctggctgaacgaggagcaccgcgggttgcagctgaccttcaccagcaacaagacctttgtgacgatgatggggcgattcctgcaggcgtacctgcagtcgtttgcagaggtgacctacaagcatcacgagcccacgggctgcgcgttgtggctgcaccgctgcgctgagatcgaaggcgagcttaagtgtctacacggaagcattatgataaataaggagcacgtgattgaaatggatgtgacgagcgaaaacgggcagcgcgcgctgaaggagcagtctagcaaggccaagatcgtgaagaaccggtggggccgaaatgtggtgcagatctccaacaccgacgcaaggtgctgcgtgcacgacgcggcctgtccggccaatcagttttccggcaagtcttgcggcatgttcttctctgaaggcgcaaaggctcaggtggcttttaagcagatcaaggcttttatgcaggcgctgtatcctaacgcccagaccgggcacggtcaccttttgatgccactacggtgcgagtgcaactcaaagcctgggcacgcgccctttttgggaaggcagctaccaaagttgactccgttcgccctgagcaacgcggaggacctggacgcggatctgatctccgacaagagcgtgctggccagcgtgcaccacccggcgctgatagtgttccagtgctgcaaccctgtgtatcgcaactcgcgcgcgcagggcggaggccccaactgcgacttcaagatatcggcgcccgacctgctaaacgcgttggtgatggtgcgcagcctgtggagtgaaaacttcaccgagctgccgcggatggttgtgcctgagtttaagtggagcactaaacaccagtatcgcaacgtgtccctgccagtggcgcatagcgatgcgcggcaGAACCCCTTTGATTTTTAA
서열번호 10
E2A 폴리펩타이드 아미노산 서열(아데노바이러스 유형 5)
MASREEEQRETTPERGRGAARRPPTMEDVSSPSPSPPPPRAPPKKRMRRRIESEDEEDSSQDALVPRTPSPRPSTSAADLAIAPKKKKKRPSPKPERPPSPEVIVDSEEEREDVALQMVGFSNPPVLIKHGKGGKRTVRRLNEDDPVARGMRTQEEEEEPSEAESEITVMNPLSVPIVSAWEKGMEAARALMDKYHVDNDLKANFKLLPDQVEALAAVCKTWLNEEHRGLQLTFTSNKTFVTMMGRFLQAYLQSFAEVTYKHHEPTGCALWLHRCAEIEGELKCLHGSIMINKEHVIEMDVTSENGQRALKEQSSKAKIVKNRWGRNVVQISNTDARCCVHDAACPANQFSGKSCGMFFSEGAKAQVAFKQIKAFMQALYPNAQTGHGHLLMPLRCECNSKPGHAPFLGRQLPKLTPFALSNAEDLDADLISDKSVLASVHHPALIVFQCCNPVYRNSRAQGGGPNCDFKISAPDLLNALVMVRSLWSENFTELPRMVVPEFKWSTKHQYRNVSLPVAHSDARQNPFDF
서열번호 11
TetR 결합 부위
tccctatcag tgatagaga
서열번호 12
변형된 MLP
cgccctcttc ggcatcaagg aaggtgattg gtttgtaggt gtaggccacg tgaccgggtg
ttcctgaagg ggggctataa aaggtcccta tcagtgatag agactca
서열번호 13
변형된 MLP
cgccctcttc ggcatcaagg aaggtgattg gtttgtaggt gtaggccacg tgactcccta
tcagtgatag agaactataa aaggtcccta tcagtgatag agactca
서열번호 14
야생형 Ad5 MLP의 뉴클레오타이드 서열
cgccctcttcggcatcaaggaaggtgattggtttgtaggtgtaggccacgtgaccgggtgttcctgaaggggggctataaaagggggtgggggcgcgttcgtcctca
서열목록 프리텍스트(SEQUENCE LISTING FREE TEXT)
<210> 1
<213> Rep 뉴클레오타이드 서열 (아데노연관바이러스 2)
<210> 2
<213> Cap 뉴클레오타이드 서열 (아데노연관바이러스 2)
<210> 3
<213> Cap 아미노산 서열 (아데노연관바이러스 2)
<210> 4
<223> Rep 결합 부위 (RBS)
<210> 5
<213> CARE 요소 (아데노연관바이러스 2)
<210> 6
<223> L4 22K (인간 아데노바이러스 D 혈청형 9(HAdV-9))
<210> 7
<223> Ad 5 L4 22K
<210> 8
<223> Ad 5 L4 22K
<210> 9
<223> E2A 폴리펩타이드 뉴클레오타이드 서열 (아데노바이러스 유형 5)
<210> 10
<223> E2A 폴리펩타이드 아미노산 서열 (아데노바이러스 유형 5)
<210> 11
<223> TetR 결합 부위
<210> 12
<223> 변형된 MLP
<210> 13
<223> 변형된 MLP
<210> 14
<223> 야생형 Ad5 MLP의 뉴클레오타이드 서열
<110> Oxford Genetic Limited Oxford University Innovation Limited <120> DNA AMPLIFICATION METHOD <130> 489.147163/01 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1866 <212> DNA <213> Rep nucleotide sequence (adeno-associated virus 2) <400> 1 atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga gcatctgccc 60 ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat 120 tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag 180 cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg 240 caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac caccggggtg 300 aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt 360 taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc 420 gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa 480 acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag cgcctgtttg 540 aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag 600 gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact 660 tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag 720 cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc caactcgcgg 780 tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac taaaaccgcc 840 cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg gatttataaa 900 attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct gggatgggcc 960 acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac taccgggaag 1020 accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt aaactggacc 1080 aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggg 1140 aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag caaggtgcgc 1200 gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc 1260 aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca ccagcagccg 1320 ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga ctttgggaag 1380 gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg 1440 gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca 1500 gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg 1560 gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgtgggcatg 1620 aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc aaatatctgc 1680 ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc tcaacccgtt 1740 tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat gggaaaggtg 1800 ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg catctttgaa 1860 caatag 1866 <210> 2 <211> 2559 <212> DNA <213> Cap nucleotide sequence (adeno-associated virus 2) <400> 2 cagttgcgca gccatcgacg tcagacgcgg aagcttcgat caactacgca gacaggtacc 60 aaaacaaatg ttctcgtcac gtgggcatga atctgatgct gtttccctgc agacaatgcg 120 agagaatgaa tcagaattca aatatctgct tcactcacgg acagaaagac tgtttagagt 180 gctttcccgt gtcagaatct caacccgttt ctgtcgtcaa aaaggcgtat cagaaactgt 240 gctacattca tcatatcatg ggaaaggtgc cagacgcttg cactgcctgc gatctggtca 300 atgtggattt ggatgactgc atctttgaac aataaatgat ttaaatcagg tatggctgcc 360 gatggttatc ttccagattg gctcgaggac actctctctg aaggaataag acagtggtgg 420 aagctcaaac ctggcccacc accaccaaag cccgcagagc ggcataagga cgacagcagg 480 ggtcttgtgc ttcctgggta caagtacctc ggacccttca acggactcga caagggagag 540 ccggtcaacg aggcagacgc cgcggccctc gagcacgaca aagcctacga ccggcagctc 600 gacagcggag acaacccgta cctcaagtac aaccacgccg acgcggagtt tcaggagcgc 660 cttaaagaag atacgtcttt tgggggcaac ctcggacgag cagtcttcca ggcgaaaaag 720 agggttcttg aacctctggg cctggttgag gaacctgtta agacggctcc gggaaaaaag 780 aggccggtag agcactctcc tgtggagcca gactcctcct cgggaaccgg aaaggcgggc 840 cagcagcctg caagaaaaag attgaatttt ggtcagactg gagacgcaga ctcagtacct 900 gacccccagc ctctcggaca gccaccagca gccccctctg gtctgggaac taatacgatg 960 gctacaggca gtggcgcacc aatggcagac aataacgagg gcgccgacgg agtgggtaat 1020 tcctcgggaa attggcattg cgattccaca tggatgggcg acagagtcat caccaccagc 1080 acccgaacct gggccctgcc cacctacaac aaccacctct acaaacaaat ttccagccaa 1140 tcaggagcct cgaacgacaa tcactacttt ggctacagca ccccttgggg gtattttgac 1200 ttcaacagat tccactgcca cttttcacca cgtgactggc aaagactcat caacaacaac 1260 tggggattcc gacccaagag actcaacttc aagctcttta acattcaagt caaagaggtc 1320 acgcagaatg acggtacgac gacgattgcc aataacctta ccagcacggt tcaggtgttt 1380 actgactcgg agtaccagct cccgtacgtc ctcggctcgg cgcatcaagg atgcctcccg 1440 ccgttcccag cagacgtctt catggtgcca cagtatggat acctcaccct gaacaacggg 1500 agtcaggcag taggacgctc ttcattttac tgcctggagt actttccttc tcagatgctg 1560 cgtaccggaa acaactttac cttcagctac acttttgagg acgttccttt ccacagcagc 1620 tacgctcaca gccagagtct ggaccgtctc atgaatcctc tcatcgacca gtacctgtat 1680 tacttgagca gaacaaacac tccaagtgga accaccacgc agtcaaggct tcagttttct 1740 caggccggag cgagtgacat tcgggaccag tctaggaact ggcttcctgg accctgttac 1800 cgccagcagc gagtatcaaa gacatctgcg gataacaaca acagtgaata ctcgtggact 1860 ggagctacca agtaccacct caatggcaga gactctctgg tgaatccggg cccggccatg 1920 gcaagccaca aggacgatga agaaaagttt tttcctcaga gcggggttct catctttggg 1980 aagcaaggct cagagaaaac aaatgtggac attgaaaagg tcatgattac agacgaagag 2040 gaaatcagga caaccaatcc cgtggctacg gagcagtatg gttctgtatc taccaacctc 2100 cagagaggca acagacaagc agctaccgca gatgtcaaca cacaaggcgt tcttccaggc 2160 atggtctggc aggacagaga tgtgtacctt caggggccca tctgggcaaa gattccacac 2220 acggacggac attttcaccc ctctcccctc atgggtggat tcggacttaa acaccctcct 2280 ccacagattc tcatcaagaa caccccggta cctgcgaatc cttcgaccac cttcagtgcg 2340 gcaaagtttg cttccttcat cacacagtac tccacgggac aggtcagcgt ggagatcgag 2400 tgggagctgc agaaggaaaa cagcaaacgc tggaatcccg aaattcagta cacttccaac 2460 tacaacaagt ctgttaatgt ggactttact gtggacacta atggcgtgta ttcagagcct 2520 cgccccattg gcaccagata cctgactcgt aatctgtaa 2559 <210> 3 <211> 735 <212> PRT <213> Cap amino acid sequence (adeno-associated virus 2) <400> 3 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro 20 25 30 Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly 145 150 155 160 Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly 195 200 205 Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr 260 265 270 Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His 275 280 285 Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp 290 295 300 Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val 305 310 315 320 Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu 325 330 335 Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr 340 345 350 Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp 355 360 365 Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser 370 375 380 Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser 385 390 395 400 Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu 405 410 415 Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg 420 425 430 Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr 435 440 445 Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln 450 455 460 Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly 465 470 475 480 Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn 485 490 495 Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly 500 505 510 Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp 515 520 525 Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys 530 535 540 Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr 545 550 555 560 Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr 565 570 575 Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Arg Gln Ala Ala Thr 580 585 590 Ala Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp 595 600 605 Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr 610 615 620 Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys 625 630 635 640 His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn 645 650 655 Pro Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln 660 665 670 Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys 675 680 685 Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr 690 695 700 Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr 705 710 715 720 Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rep binding site (RBS) <400> 4 gcccgagtga gcacgc 16 <210> 5 <211> 350 <212> DNA <213> CARE element (adeno-associated virus 2) <400> 5 gtcctgtatt agaggtcacg tgagtgtttt gcgacatttt gcgacaccat gtggtcacgc 60 tgggtattta agcccgagtg agcacgcagg gtctccattt tgaagcggga ggtttgaacg 120 cgcagccgcc atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga 180 gcatctgccc ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt 240 gccgccagat tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga 300 gaagctgcag cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc 350 <210> 6 <211> 137 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L4 22K (Human adenovirus D serotype 9 (HAdV-9)) <400> 6 Met Pro Arg Lys Lys Gln Glu Pro Leu Val Glu Glu Met Glu Glu Glu 1 5 10 15 Trp Asp Ser Gln Ala Glu Glu Asp Glu Trp Glu Glu Glu Thr Glu Glu 20 25 30 Glu Glu Leu Glu Glu Val Glu Glu Glu Gln Ala Thr Glu Gln Pro Val 35 40 45 Ala Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Pro Ala Val Thr Asp Thr Thr Ser 50 55 60 Ala Ala Pro Ala Lys Pro Pro Arg Arg Trp Asp Arg Val Lys Gly Asp 65 70 75 80 Gly Lys His Glu Arg Gln Gly Tyr Arg Ser Trp Arg Ala His Lys Ala 85 90 95 Ala Ile Ile Ala Cys Leu Gln Asp Cys Gly Gly Asn Ile Ala Phe Ala 100 105 110 Arg Arg Tyr Leu Leu Phe His Arg Gly Val Asn Ile Pro Arg Asn Val 115 120 125 Leu His Tyr Tyr Arg His Leu His Ser 130 135 <210> 7 <211> 585 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ad 5 L4 22K <400> 7 atggcaccca aaaagaagct gcagctgccg ccgccaccca cggacgagga ggaatactgg 60 gacagtcagg cagaggaggt tttggacgag gaggaggagg acatgatgga agactgggag 120 agcctagacg aggaagcttc cgaggtcgaa gaggtgtcag acgaaacacc gtcaccctcg 180 gtcgcattcc cctcgccggc gccccagaaa tcggcaaccg gttccagcat ggctacaacc 240 tccgctcctc aggcgccgcc ggcactgccc gttcgccgac ccaaccgtag atgggacacc 300 actggaacca gggccggtaa gtccaagcag ccgccgccgt tagcccaaga gcaacaacag 360 cgccaaggct accgctcatg gcgcgggcac aagaacgcca tagttgcttg cttgcaagac 420 tgtgggggca acatctcctt cgcccgccgc tttcttctct accatcacgg cgtggccttc 480 ccccgtaaca tcctgcatta ctaccgtcat ctctacagcc catactgcac cggcggcagc 540 ggcagcaaca gcagcggcca cacagaagca aaggcgaccg gatag 585 <210> 8 <211> 194 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ad 5 L4 22K <400> 8 Met Ala Pro Lys Lys Lys Leu Gln Leu Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu 1 5 10 15 Glu Glu Tyr Trp Asp Ser Gln Ala Glu Glu Val Leu Asp Glu Glu Glu 20 25 30 Glu Asp Met Met Glu Asp Trp Glu Ser Leu Asp Glu Glu Ala Ser Glu 35 40 45 Val Glu Glu Val Ser Asp Glu Thr Pro Ser Pro Ser Val Ala Phe Pro 50 55 60 Ser Pro Ala Pro Gln Lys Ser Ala Thr Gly Ser Ser Met Ala Thr Thr 65 70 75 80 Ser Ala Pro Gln Ala Pro Pro Ala Leu Pro Val Arg Arg Pro Asn Arg 85 90 95 Arg Trp Asp Thr Thr Gly Thr Arg Ala Gly Lys Ser Lys Gln Pro Pro 100 105 110 Pro Leu Ala Gln Glu Gln Gln Gln Arg Gln Gly Tyr Arg Ser Trp Arg 115 120 125 Gly His Lys Asn Ala Ile Val Ala Cys Leu Gln Asp Cys Gly Gly Asn 130 135 140 Ile Ser Phe Ala Arg Arg Phe Leu Leu Tyr His His Gly Val Ala Phe 145 150 155 160 Pro Arg Asn Ile Leu His Tyr Tyr Arg His Leu Tyr Ser Pro Tyr Cys 165 170 175 Thr Gly Gly Ser Gly Ser Asn Ser Ser Gly His Thr Glu Ala Lys Ala 180 185 190 Thr Gly <210> 9 <211> 1590 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E2A polypeptide nucleotide sequence (Adenovirus type 5) <400> 9 atggccagtc gggaagagga gcagcgcgaa accacccccg agcgcggacg cggtgcggcg 60 cgacgtcccc caaccatgga ggacgtgtcg tccccgtccc cgtcgccgcc gcctccccgg 120 gcgcccccaa aaaagcggat gaggcggcgt atcgagtccg aggacgagga agactcatca 180 caagacgcgc tggtgccgcg cacacccagc ccgcggccat cgacctcggc ggcggatttg 240 gccattgcgc ccaagaagaa aaagaagcgc ccttctccca agcccgagcg cccgccatca 300 ccagaggtaa tcgtggacag cgaggaagaa agagaagatg tggcgctaca aatggtgggt 360 ttcagcaacc caccggtgct aatcaagcat ggcaaaggag gtaagcgcac agtgcggcgg 420 ctgaatgaag acgacccagt ggcgcgtggt atgcggacgc aagaggaaga ggaagagccc 480 agcgaagcgg aaagtgaaat tacggtgatg aacccgctga gtgtgccgat cgtgtctgcg 540 tgggagaagg gcatggaggc tgcgcgcgcg ctgatggaca agtaccacgt ggataacgat 600 ctaaaggcga acttcaaact actgcctgac caagtggaag ctctggcggc cgtatgcaag 660 acctggctga acgaggagca ccgcgggttg cagctgacct tcaccagcaa caagaccttt 720 gtgacgatga tggggcgatt cctgcaggcg tacctgcagt cgtttgcaga ggtgacctac 780 aagcatcacg agcccacggg ctgcgcgttg tggctgcacc gctgcgctga gatcgaaggc 840 gagcttaagt gtctacacgg aagcattatg ataaataagg agcacgtgat tgaaatggat 900 gtgacgagcg aaaacgggca gcgcgcgctg aaggagcagt ctagcaaggc caagatcgtg 960 aagaaccggt ggggccgaaa tgtggtgcag atctccaaca ccgacgcaag gtgctgcgtg 1020 cacgacgcgg cctgtccggc caatcagttt tccggcaagt cttgcggcat gttcttctct 1080 gaaggcgcaa aggctcaggt ggcttttaag cagatcaagg cttttatgca ggcgctgtat 1140 cctaacgccc agaccgggca cggtcacctt ttgatgccac tacggtgcga gtgcaactca 1200 aagcctgggc acgcgccctt tttgggaagg cagctaccaa agttgactcc gttcgccctg 1260 agcaacgcgg aggacctgga cgcggatctg atctccgaca agagcgtgct ggccagcgtg 1320 caccacccgg cgctgatagt gttccagtgc tgcaaccctg tgtatcgcaa ctcgcgcgcg 1380 cagggcggag gccccaactg cgacttcaag atatcggcgc ccgacctgct aaacgcgttg 1440 gtgatggtgc gcagcctgtg gagtgaaaac ttcaccgagc tgccgcggat ggttgtgcct 1500 gagtttaagt ggagcactaa acaccagtat cgcaacgtgt ccctgccagt ggcgcatagc 1560 gatgcgcggc agaacccctt tgatttttaa 1590 <210> 10 <211> 529 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E2A polypeptide amino acid sequence (Adenovirus type 5) <400> 10 Met Ala Ser Arg Glu Glu Glu Gln Arg Glu Thr Thr Pro Glu Arg Gly 1 5 10 15 Arg Gly Ala Ala Arg Arg Pro Pro Thr Met Glu Asp Val Ser Ser Pro 20 25 30 Ser Pro Ser Pro Pro Pro Pro Arg Ala Pro Pro Lys Lys Arg Met Arg 35 40 45 Arg Arg Ile Glu Ser Glu Asp Glu Glu Asp Ser Ser Gln Asp Ala Leu 50 55 60 Val Pro Arg Thr Pro Ser Pro Arg Pro Ser Thr Ser Ala Ala Asp Leu 65 70 75 80 Ala Ile Ala Pro Lys Lys Lys Lys Lys Arg Pro Ser Pro Lys Pro Glu 85 90 95 Arg Pro Pro Ser Pro Glu Val Ile Val Asp Ser Glu Glu Glu Arg Glu 100 105 110 Asp Val Ala Leu Gln Met Val Gly Phe Ser Asn Pro Pro Val Leu Ile 115 120 125 Lys His Gly Lys Gly Gly Lys Arg Thr Val Arg Arg Leu Asn Glu Asp 130 135 140 Asp Pro Val Ala Arg Gly Met Arg Thr Gln Glu Glu Glu Glu Glu Pro 145 150 155 160 Ser Glu Ala Glu Ser Glu Ile Thr Val Met Asn Pro Leu Ser Val Pro 165 170 175 Ile Val Ser Ala Trp Glu Lys Gly Met Glu Ala Ala Arg Ala Leu Met 180 185 190 Asp Lys Tyr His Val Asp Asn Asp Leu Lys Ala Asn Phe Lys Leu Leu 195 200 205 Pro Asp Gln Val Glu Ala Leu Ala Ala Val Cys Lys Thr Trp Leu Asn 210 215 220 Glu Glu His Arg Gly Leu Gln Leu Thr Phe Thr Ser Asn Lys Thr Phe 225 230 235 240 Val Thr Met Met Gly Arg Phe Leu Gln Ala Tyr Leu Gln Ser Phe Ala 245 250 255 Glu Val Thr Tyr Lys His His Glu Pro Thr Gly Cys Ala Leu Trp Leu 260 265 270 His Arg Cys Ala Glu Ile Glu Gly Glu Leu Lys Cys Leu His Gly Ser 275 280 285 Ile Met Ile Asn Lys Glu His Val Ile Glu Met Asp Val Thr Ser Glu 290 295 300 Asn Gly Gln Arg Ala Leu Lys Glu Gln Ser Ser Lys Ala Lys Ile Val 305 310 315 320 Lys Asn Arg Trp Gly Arg Asn Val Val Gln Ile Ser Asn Thr Asp Ala 325 330 335 Arg Cys Cys Val His Asp Ala Ala Cys Pro Ala Asn Gln Phe Ser Gly 340 345 350 Lys Ser Cys Gly Met Phe Phe Ser Glu Gly Ala Lys Ala Gln Val Ala 355 360 365 Phe Lys Gln Ile Lys Ala Phe Met Gln Ala Leu Tyr Pro Asn Ala Gln 370 375 380 Thr Gly His Gly His Leu Leu Met Pro Leu Arg Cys Glu Cys Asn Ser 385 390 395 400 Lys Pro Gly His Ala Pro Phe Leu Gly Arg Gln Leu Pro Lys Leu Thr 405 410 415 Pro Phe Ala Leu Ser Asn Ala Glu Asp Leu Asp Ala Asp Leu Ile Ser 420 425 430 Asp Lys Ser Val Leu Ala Ser Val His His Pro Ala Leu Ile Val Phe 435 440 445 Gln Cys Cys Asn Pro Val Tyr Arg Asn Ser Arg Ala Gln Gly Gly Gly 450 455 460 Pro Asn Cys Asp Phe Lys Ile Ser Ala Pro Asp Leu Leu Asn Ala Leu 465 470 475 480 Val Met Val Arg Ser Leu Trp Ser Glu Asn Phe Thr Glu Leu Pro Arg 485 490 495 Met Val Val Pro Glu Phe Lys Trp Ser Thr Lys His Gln Tyr Arg Asn 500 505 510 Val Ser Leu Pro Val Ala His Ser Asp Ala Arg Gln Asn Pro Phe Asp 515 520 525 Phe <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TetR binding site <400> 11 tccctatcag tgatagaga 19 <210> 12 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified MLP <400> 12 cgccctcttc ggcatcaagg aaggtgattg gtttgtaggt gtaggccacg tgaccgggtg 60 ttcctgaagg ggggctataa aaggtcccta tcagtgatag agactca 107 <210> 13 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified MLP <400> 13 cgccctcttc ggcatcaagg aaggtgattg gtttgtaggt gtaggccacg tgactcccta 60 tcagtgatag agaactataa aaggtcccta tcagtgatag agactca 107 <210> 14 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of the wild-type Ad5 MLP <400> 14 cgccctcttc ggcatcaagg aaggtgattg gtttgtaggt gtaggccacg tgaccgggtg 60 ttcctgaagg ggggctataa aagggggtgg gggcgcgttc gtcctca 107

Claims (19)

  1. 숙주세포에서 CARE 요소에 작동 가능하게 연결된 DNA 분자를 증폭시키는 방법으로서,
    (a) CARE 요소에 작동 가능하게 연결된 DNA 분자를 포함하는 제1 핵산 분자;
    (b) L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터를 포함하는 제2 핵산 분자;
    (c) AAV Rep 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3 핵산 분자;
    및 선택적으로 추가로,
    (d) 하나 이상의 아데노바이러스 초기 유전자 산물과 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 프로모터를 포함하는 하나 이상의 추가 핵산 분자를 포함하는 숙주세포를,
    제2 및 제3 핵산 분자, 및 선택적으로 추가로 하나 이상의 추가 핵산 분자가 발현되어 DNA 분자의 증폭을 촉진시키도록 하는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 숙주세포에서 DNA 분자를 증폭시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 (존재하는 경우) 추가 핵산 분자가 독립적으로 숙주세포 내
    (i) 아데노바이러스 벡터에 존재하거나;
    (ii) 숙주세포 게놈에 안정적으로 통합된 형태로 존재하거나; 또는
    (iii) 에피솜 벡터 또는 플라스미드에 존재하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, DNA 분자가 치료용 폴리펩타이드 또는 바이러스 폴리펩타이드를 인코딩하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, DNA 분자가 rep 유전자 서열 및/또는 cap 유전자 서열 및/또는 플랭킹 AAV 역말단반복부(ITR)를 포함하는 바이러스 전달 벡터, 또는 이의 단편을 인코딩하는, 방법.
  5. 하기 단계 (a) 내지 (c)를 포함하는, 바이러스 입자를 생산하는 방법:
    (a) 숙주세포에,
    하기 (i) 내지 (iii)을 포함하는 아데노바이러스 벡터를 도입하는 단계로서,
    (i) L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터를 포함하는 핵산 분자;
    (ii) 전이유전자를 플랭킹하는 5'- 및 3'-바이러스 ITR을 포함하는 전달 플라스미드;
    (iii) 바이러스 전달 플라스미드를 패키징하는 데 충분한 헬퍼 유전자,
    여기서 숙주세포가
    하기 (i) 및 (ii)에 작동 가능하게 연결된 CARE 요소를 포함하는 단계:
    (i) AAV cap 유전자; 및
    (ii) 바이러스 Rep 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자로서, 여기서 바람직하게는 뉴클레오타이드 서열이 기능성 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있지 않은 핵산 분자;
    (b) 바이러스 입자가 숙주세포 내에서 조립되도록 하는 조건 하에서 숙주세포를 배양하는 단계; 및
    (c) 숙주세포 또는 배양 배지에서 패키징된 바이러스 입자를 수거하는 단계.
  6. 하기 단계 (a) 내지 (c)를 포함하는, 바이러스 입자를 생산하는 방법:
    (a) 숙주세포에,
    하기 (i) 내지 (iii)을 포함하는 아데노바이러스 벡터를 도입하는 단계로서,
    (i) L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터를 포함하는 핵산 분자;
    (ii) 바이러스 Rep 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자로서, 여기서 바람직하게는 뉴클레오타이드 서열이 기능성 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있지 않은 핵산 분자;
    (iii) 바이러스 전달 플라스미드를 패키징하는 데 충분한 헬퍼 유전자,
    여기서 숙주세포가 숙주세포 게놈에 안정적으로 통합된 하기 (i) 및 (ii)를 포함하는 단계:
    (i) AAV cap 유전자에 작동 가능하게 연결된 CARE 요소, 및
    (ii) 전이유전자를 플랭킹하는 5'- 및 3'-바이러스 ITR을 포함하는 전달 플라스미드로서, CARE 요소에 작동 가능하게 연결되거나 연결되지 않을 수 있는 전달 플라스미드;
    (b) 바이러스 입자가 숙주세포 내에서 조립되도록 하는 조건 하에서 숙주세포를 배양하는 단계; 및
    (c) 숙주세포 또는 배양 배지에서 패키징된 바이러스 입자를 수거하는 단계.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, AAV cap 유전자가 아데노바이러스 벡터 내에서 인코딩되는 폴리펩타이드에 의해 활성화되는 프로모터의 제어 하에서 숙주세포 게놈에 통합되는, 방법.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스 벡터가 억제성 주요 후기 프로모터(MLP: Major Late Promoter)를 포함하며, 여기서 바람직하게는 MLP가 아데노바이러스 후기 유전자의 전사를 조절하거나 제어할 수 있는 하나 이상의 억제인자 요소를 포함하고, 여기서 억제인자 요소 중 하나 이상이 MLP TATA 박스의 다운스트림에 삽입되어 있는, 방법.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 Rep 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 E1/E3 결실된 아데노바이러스 벡터의 E1 영역에 삽입되어 있는, 방법.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 Rep 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자가 기능성 p5 또는 기능성 p19 프로모터를 포함하지 않고, 상기 핵산 분자가 임의의 다른 기능성 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있지 않아, 폴리펩타이드 인코딩 서열의 기준선 또는 최소 전사만 얻어지게 되는, 방법.
  11. 변형된 숙주세포를 생산하는 방법으로서,
    (a) CARE 요소에 작동 가능하게 연결된 AAV cap 유전자를 인코딩하는 DNA 분자를 포함하는 제1 핵산 분자를 숙주세포에 도입하는 단계; 및/또는
    (b) L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터를 포함하는 제2 핵산 분자를 숙주세포에 도입하는 단계를 포함하고;
    선택적으로,
    (c) AAV Rep 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3 핵산 분자를 숙주세포에 도입하는 단계를 포함하며;
    제1, 제2 및 (존재하는 경우) 제3 핵산 분자가 독립적으로
    (i) 숙주세포의 게놈에 안정적으로 통합되거나,
    (ii) 숙주세포 내에 에피솜 형태로 존재하도록 하는, 변형된 숙주세포를 생산하는 방법.
  12. 변형된 아데노바이러스 벡터를 생산하는 방법으로서,
    (a) L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터를 포함하는 핵산 분자를 아데노바이러스 벡터에 도입하는 단계;
    및 선택적으로
    (b) AAV Rep 폴리펩타이드를 아데노바이러스 벡터로 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 아데노바이러스 벡터에 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 아데노바이러스 벡터에서, AAV Rep 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자가 기능성 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있지 않은, 변형된 아데노바이러스 벡터를 생산하는 방법.
  13. 아데노바이러스 L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자로서, 여기서 L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체 코딩 서열이 이종 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는, DNA 분자.
  14. 하기 (a)를 포함하는 숙주세포:
    (a) L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터를 포함하는 핵산 분자;
    여기서 핵산 분자는 숙주세포의 게놈에 안정적으로 통합되어 있거나,
    에피솜 플라스미드 또는 벡터에 존재함.
  15. 하기 (a)를 포함하는 숙주세포:
    (a) CARE 요소에 작동 가능하게 연결된 DNA 분자를 포함하는 핵산 분자로서, 여기서 DNA 분자가 하기 (i) 내지 (iii) 중 하나 이상을 인코딩하는 핵산 분자:
    (i) AAV Cap 폴리펩타이드,
    (ii) AAV Rep 폴리펩타이드 및
    (iii) AAV 전달 벡터,
    여기서 핵산 분자는 숙주세포의 게놈에 안정적으로 통합되어 있거나,
    에피솜 플라스미드에 존재함.
  16. 아데노바이러스 L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 아데노바이러스 벡터로서, 여기서 L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체 코딩 서열이 이종 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는, 아데노바이러스 벡터.
  17. 제1항 내지 제14항 또는 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 이종 프로모터가 L4 22K 유전자와 자연적으로 연관되지 않은 프로모터이거나;
    (ii) 이종 프로모터가 아데노바이러스 주요 후기 프로모터가 아닌 프로모터이거나; 또는
    (iii) 이종 프로모터가 포유류 또는 박테리아 프로모터인, 방법, DNA 분자, 숙주세포 또는 아데노바이러스 벡터.
  18. 하기 (A) 및 (B)를 포함하는 키트:
    (A) 하기 (a)를 포함하는 숙주세포:
    (a) CARE 요소에 작동 가능하게 연결된 DNA 분자를 포함하는 제1 핵산 분자로서, 여기서 DNA 분자가 하기 (i) 및 (ii) 중 하나 이상을 인코딩하는 제1 핵산 분자:
    (i) AAV Cap 폴리펩타이드, 및
    (ii) AAV Rep 폴리펩타이드,
    여기서 제1 핵산 분자는 숙주세포의 게놈에 안정적으로 통합되어 있거나,
    에피솜 플라스미드에 존재함;
    및
    (B) 하기 (i) 및 (ii)를 포함하는 아데노바이러스 벡터:
    (i) 아데노바이러스 L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 핵산 분자로서, 여기서 L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체 코딩 서열이 아데노바이러스 MLP와 작동 가능하게 연결되어 있지 않은 핵산 분자, 및
    (ii) AAV 전달 벡터를 인코딩하는 핵산 분자.
  19. 하기 (A) 및 (B)를 포함하는 키트:
    (A) 하기 (a)를 포함하는 숙주세포:
    (a) CARE 요소에 작동 가능하게 연결된 DNA 분자를 포함하는 제1 핵산 분자로서,
    여기서 DNA 분자가 하기 (i), 및 선택적으로 (ii)를 인코딩하는 제1 핵산 분자:
    (i) AAV Cap 폴리펩타이드, 및 선택적으로
    (ii) AAV 전달 벡터,
    여기서 제1 핵산 분자는 숙주세포의 게놈에 안정적으로 통합되어 있거나,
    에피솜 플라스미드에 존재함;
    및
    (B) 하기 (i) 및 (ii)를 포함하는 아데노바이러스 벡터:
    (i) 아데노바이러스 L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 인코딩하는 핵산 분자로서, 여기서 L4 22K 폴리펩타이드 또는 이의 변이체 코딩 서열이 아데노바이러스 MLP와 작동 가능하게 연결되어 있지 않은 핵산 분자, 및
    (ii) AAV Rep 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자로서,
    바람직하게는 기능성 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있지 않은 핵산 분자.
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