KR20220132552A - 알파-히드록실화 지방산의 대사산물, 이의 의학적 용도 및 바이오마커로서의 용도 - Google Patents

알파-히드록실화 지방산의 대사산물, 이의 의학적 용도 및 바이오마커로서의 용도 Download PDF

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Abstract

알파-히드록실화 지방산의 대사산물, 이의 의학적 용도 및 바이오마커로서의 용도
홀수 탄화수소 사슬 및 하나 이상의 불포화를 갖는 지방산이 기재되어 있다. 상기 지방산은 짝수 사슬 단일- 또는 다중불포화 알파-히드록실화 지방산의 치료적 활성 대사산물의 화학 구조를 갖는다. 또한, 상기 지방산을 포함하는 조성물, 이의 의학적 용도, 및 이것이 유도되는 짝수 사슬 단일- 또는 다중불포화 알파-하이드록실화 지방산을 이용한 환자의 치료의 효능 및/또는 그 치료에 대한 반응의 지표로서의 이의 용도가 기재되어 있다.

Description

알파-히드록실화 지방산의 대사산물, 이의 의학적 용도 및 바이오마커로서의 용도
본 발명은 홀수 탄화수소 사슬(odd hydrocarbon chain) 및 하나 이상의 불포화를 갖는 지방산에 관한 것으로, 여기서 상기 지방산의 화학 구조는 단일불포화 또는 다중불포화 알파-히드록실화 지방산의 대사산물의 화학 구조에 해당한다. 또한, 본 발명은 상기 홀수 사슬 지방산을 포함하는 조성물, 이의 의학적 용도, 및 이를 대사산물로서 생성하는 단일불포화 또는 다중불포화 알파-히드록실화 지방산을 이용하여 환자를 치료하기 위한 효능 지표로서의 이의 용도에 관한 것이다.
막의 지질 조성의 변화는 세포 신호에 영향을 미치며, 이는 질환의 발병을 일으키거나 질환을 역전시키고 예방할 수 있는 것으로 알려져 있다. 유사하게, 막 지질 수준 조절에 초점을 맞춘 치료적 개입은 병리학적 과정을 예방 및 역전(치료)할 수 있다.
일반적으로, 그의 화학 구조가 홀수개의 탄소 원자를 나타내는 지방산은 치료적 관련성이 있는 것으로 간주되지 않는데, 인간 및 일반적으로 포유동물에서 존재하는 지방산의 대다수는 짝수 사슬, 일반적으로 14개 및 24개의 탄소 원자를 갖고, 홀수 사슬의 지방산의 존재는 매우 드물고 미량으로 제한되기 때문이다.
현재, 과학 문헌에서 이용 가능한 데이터는 지방산의 작은 구조적 차이가 생물학적 활성에 중요한 영향을 미치고 및 따라서 치료 활성에 중요한 영향을 미친다는 것을 나타낸다. 많은 약물은 알려진 부작용이 있거나 다양한 세포나 조직에 독성이 있다는 것은 잘 알려져 있다. 전구약물은 섭취시에 대사 반응을 받고 환자 또는 대상체의 건강에 영향을 미치는 약물 또는 의약, 이의 대사산물을 생성하는 화합물이다.
따라서, 한편으로는 전구약물 형태의 치료적 활성 화합물의 투여는 시간 경과에 따른 상기 화합물의 분포 및 흡수를 조절할 수 있는데, 이는 그의 대사가 상기 전구약물을 활성 대사물로 변환시키는 대사 반응이 일어나는 세포 또는 조직에서만 약물, 즉 대사산물을 생성할 수 있게 하기 때문이다. 이와 관련하여, 이들 전구약물은 활성 대사산물의 지연 또는 조절된 투여를 가능하게 하여 신체에 유해한 영향을 미칠 수 있는 그의 축적을 피하는 것과 같은 다른 이점을 갖는다. 다른 한편으로, 상기 치료적 활성 대사산물의 확인 및 합성은 더 강력하게 작용하여, 상응하는 전구약물의 자발적 대사 동안 발생하는 것보다 더 높은 치료적 활성 용량을 제어된 시간 프레임에 투여하는 것을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명의 목적은 다른 화합물 또는 전구약물로부터 유도된 치료 활성 화합물(대사산물)로서, 이러한 대사산물은 단독으로, 또는 전구약물에 의해, 또는 각각의 전구약물과 조합하여 투여되어 환자의 상태 및 치료할 병리학적 상태에 따라 치료 효과 및 가능한 부작용을 조절할 수 있도록 하는 것인, 치료 활성 화합물(대사산물)을 제공함에 있다.
발명의 간단한 요약
하기 화학식 (II)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 또는 기능식품적으로(nutraceutically) 허용되는 염 또는 에스테르, 및 하기 화학식 (III)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 또는 기능식품적으로 허용되는 염 또는 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물:
Figure pct00001
Figure pct00002
상기 식에서, a는 1과 14 사이의 정수이고; b는 1과 7 사이의 정수이고; c는 0, 3 또는 6이고, m은 0이고; a+3b+c+3은 짝수 정수이다.
더욱 구체적으로, 본 발명은 화학식 (II)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 또는 기능식품적으로(nutraceutically) 허용되는 염 또는 에스테르, 및 하기 화학식 (III)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 또는 기능식품적으로 허용되는 염 또는 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00003
상기 식에서, a =6, b =1 및 c =6이거나; 또는 a =6, b =2 및 c =3이거나; 또는 a =6, b =3 및 c =0이거나; 또는 a =3, b =3 및 c =3이거나; 또는 a =2, b =4 및 c =3이거나; 또는 a =2, b =5 및 c =0이고;
Figure pct00004
상기 식에서, a =1, b =6, c =0 및 m = 0이다.
또한, 본 발명은 의약으로서 사용 및 특히 신경재생의 유도 및 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 암, 신생물, 염증성 질환, 심혈관 질환, 피부 및 피하 조직 병리(pathology), 대사성 병리, 신경병성 통증, 마비, 수면 장애, 소화기 병리, 근골격 및 결합 조직 질환, 비뇨생식기 병리, 및 대사성 질환으로 이루어진 군에서 선택된 질환 또는 병리의 예방 또는 치료(유지 치료를 포함)에 사용하기 위한 본원에서 기재된 같은 화학식 (II)의 화합물 및 화학식 (III)의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본원에서 기재된 같은 화학식 (II)의 화합물 및 화학식 (III)의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 화합물, 및 선택적으로 화학식 (I)의 화합물을 포함하는 약학적 또는 건강 기능성 식품(nutraceutical) 조성물에 관한 것이다.
끝으로, 본 발명은 대상체에서 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 사용한 질환 또는 병리의 치료적 또는 예방적 치료의 효능을 측정하는 시험관내 방법으로서, 상기 대상체의 생물학적 샘플에서 본원에 기재된 바와 같은 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 화합물, 또는 이의 카르복실레이트 음이온, 또는 이로부터 생체내 또는 시험관내에서 형성된 유도체의 양을 시험관내내서 측정하는 것을 포함하고, 상기 양은 상기 질환 또는 병리의 치료 효능과 관련이 있는 것인, 방법에 관한 것이다.
발명의 설명
본 발명은 하기 화학식 (II)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 또는 기능식품적으로(nutraceutically) 허용되는 염 또는 에스테르, 및 하기 화학식 (III)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 또는 기능식품적으로 허용되는 염 또는 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00005
Figure pct00006
상기 식에서, a는 1과 14 사이의 정수이고; b는 1과 7 사이의 정수이고; c는 0, 3 또는 6이고, m은 0 내지 ( b - 1)의 정수이고; a+3b+c+3은 짝수 정수이다.
본 발명의 b, c 및 m의 모든 값은 0 이상의 정수이다. b의 값이 화학식에서 정의되면, m의 값은 0과 (b - 1) 사이의 정수로 정의되며, 여기서 b의 값은 1과 7 사이에서 이미 정의된 값이다. 본 발명의 목적을 위해, 특정 화학식 또는 조성이 표시되지 않은 경우, b, c 및 m의 값은 본원에 기재된 모든 화학식 및 조성에 적용 가능하다.
본 발명의 일 구현예에서, a는 1과 7 사이의 정수이고; b는 2와 7 사이의 정수이고; c는 0, 3 또는 6이고, m은 0이고, a+3b+c+3은 짝수 정수이다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, a는 1과 14 사이의 정수이고; b는 1이고; c는 0, 3 또는 6이고, m은 0이고; a+3b+c+3은 짝수 정수이다.
가장 바람직하게는, 본 발명의 모든 구현예의 경우 m=0이고, 따라서 본 발명은 하기 화학식 (II)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 또는 기능식품적으로 허용되는 염 또는 에스테르, 및 하기 화학식 (III)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 또는 기능식품적으로 허용되는 염 또는 에스테르으로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00007
Figure pct00008
상기 식에서, a는 1과 14 사이의 정수이고; b는 1과 7 사이의 정수이고; c는 0, 3 또는 6이고; a+3b+c+3은 짝수 정수이다.
본 발명의 바람직한 구현예는 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 화합물의 약학적으로 또는 기능식품적으로 허용되는 염 또는 에스테르에 관한 것이다. 더욱 바람직하게는, 상기 염은 나트륨 염이고, 상기 에스테르는 메틸 또는 에틸 에스테르이다.
본 발명의 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 화합물은 하기 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 또는 기능식품적으로 허용되는 염 또는 에스테르의 대사물의 화학식에 해당한다:
Figure pct00009
상기 식에서, a는 1과 14 사이의 정수이고; b는 1과 7 사이의 정수이고; c는 0과 14 사이의 정수이고; m은 0과 (b-1) 사이의 정수이고; a+3b+c+3은 짝수 정수이다.
따라서, 화학식 (I)의 화합물은 짝수개의 탄소 원자(a+3b+c+3은 짝수 정수임)를 갖는 단일불포화 또는 다중불포화 알파-히드록실화 지방산이다.
한편, 짝수 사슬의 화학식 (I)의 2-히드록시단일불포화 지방산은, 상기 전구약물이 탈카르복실화 과정을 받기 때문에 홀수 사슬의 화학식 II의 다른 단일불포화 지방산의 전구약물이다.
다른 한편으로, 짝수 사슬의 화학식 (I)의 2-히드록시다중불포화 지방산은 홀수 사슬의 다른 단일- 또는 다중불포화 지방산의 전구약물이고, 탈카르복실화가 발생하지만 화학식 (I)의 화합물의 이중 결합 중 하나의 수소화가 일어나지 않는 경우, 화학식 (I)의 전구약물로부터 유도된 화합물은 화학식 (II)의 화합물이 될 것고, 이중 결합 중 하나의 수소화 및 화학식 (I)의 화합물의 탈카르복실화가 일어나는 경우, 화학식 I의 전구약물로부터 유도된 화합물은 화학식 (III)의 화합물일 것이고, 상기 수소화된 이중 결합은 m의 값에 따라 다른 위치에 있을 수 있다.
예시로서, 도 1A 및 도 8F는 화학식 (I)의 화합물인 2-히드록시도코사헥사엔산(DHA-H)가 세포 수준에서 α-산화되어 이의 대사산물(화학식 (IIIi))인 (6Z,9Z,12Z,15Z,18Z)-헤네이코스-6,9,12,15,18-펜타엔산(HPA)을 생성하는 대사의 개략도를 도시한다. 이 경로에 따라, DHA-H 전구약물은 2-히드록실화 다중불포화 지방산이며, 이는 하기의 일련의 대사 단계에 의해 HPA로 전환된다: (1) 조효소 A와의 접합에 의한 DHA-H의 활성화;(2) 2-히드록시아실-CoA 분해효소에 의해 매개되는 절단 및 이에 따른 홀수의 탄소 원자를 가진 알데히드의 생성; (3) 알데히드에 대한 알데히드 탈수소효소의 작용으로 이중 결합 중 하나를 수소화하여 이를 산(HPA)으로 전환시킴.
따라서, 본 발명에 따른 HPA는, HPA가 a=1, b=6, c=0인 화학식 (I)의 전구약물의 대사산물인 경우, m=0인 화학식 (III)의 화합물이고, 이 화합물은 22개의 탄소 원자와 6개의 공액 이중 결합의 오메가-3 다중불포화 알파-히드록실화 지방산(DHA-H)이다. 그러나 HPA가 화학식 (I)의 전구약물의 대사산물인 경우, HPA는 a=4, b=5 및 c=0인 화학식 (II)의 화합물일 수 있으며, 이 화합물은 22개의 탄소 원자 및 5개의 이중 결합의 오메가-3 다중불포화 알파-히드록실화 지방산(2-히드록시-도코사펜타엔산)이다. 본 발명의 일 구현예는 a=1, b=6, c=0 및 m=0인 화학식 III의 화합물에 관한 것이다.
추가로, 도 8은 화학식 (I)의 다른 지방산에 대한 대사 체계를 나타낸다. 구체적으로, 도 8A는 a=6, b=2 및 c=3인 화학식 (I)의 화합물인 2-하이드록시-리놀레산(LA-H)이 탈카르복실화를 거친 후, a=6, b=2 및 c=3인 화학식 (II)의 화합물인 (8Z,11Z)-헵타데카-8,11-디엔산(HDA, C17:2 ω-6)을 생성하는 대사 체계를 보여준다. 도 8B는 a=6, b=3 및 c=0인 화학식 (I)의 화합물인 2-히드록시-알파(α)-리놀렌산(ALA-H)이 탈카르복실화를 겪은 후 a= 6, b=3 및 c=0인 화학식 (II)의 화합물인 (8Z,11Z,14Z)-헵타데카-8,11,14-트리엔산(HTA ω-3, C17:3 ω-3)을 생성하는 데사의 체계를 도시한다. 한편, 도 8C는 a=3, b=3 및 c=3인 화학식 (I)의 화합물인 2-하이드록시-감마(γ)-리놀렌산(GLA-H)이 탈카르복실화를 거친 후 a=3, b=3 및 c=3인 화학식 (II)의 화합물인 (5Z,8Z,11Z)-헵타데카-5,8,11-트리엔산(HTA ω-6, C17:3 ω-6)을 생성하는 대사 체계를 도시한다. 도 8D는 a=2, b=4 및 c=3인 화학식 (I)의 화합물인 2-히드록시-아라키돈산(ARA-H)이 탈카르복실화를 거친 후 a=2, b=4 및 c=3인 화학식 (II)의 화합물인 (4Z,7Z,10Z,13Z)-노나데카-4,7,10,13-테트라엔산(NTA, C:19:4 ω-6)을 생성하는 대사 체계를 도시낸다. 끝으로, 도 8E는 a=2, b=5 및 c=0인 화학식 (I)의 화합물인 2-하이드록시-에이코사펜타엔산(EPA-H)이 탈카르복실화 과정을 거친 후 a=2, b=5 및 c=0인 화학식 (II)의 화합물인 (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z)-노나데카-4,7,10,13,16-펜타엔산(NPA, C19:5-3)을 생성하는 대사 체계를 도시한다.
다른 한편으로, 도 11의 대사 체계에 따르면, 화학식 (I)의 화합물은 또한 짝수의 탄소 원자를 갖는 단일불포화 알파-히드록실화 지방산일 수 있다. 이러한 경로에 따르면, 2-하이드록시올레산(2OHOA)의 전구약물 나트륨 염은 2-히드록실화된 단일불포화 지방산이며, 이는 하기의 일련의 대사 단계를 통해 8Z-헵타데센산(8Z-헵타데센산 또는 C17:1n-9)으로 전환된다: (1) ATP(아데노신 삼인산염) 및 마그네슘(Mg2+)에 의존하는 과정에서 Acyl-CoA 리가아제에 의한 활성화; (2) 2OHOA-CoA는 2-히드록시피타노일-CoA 분해효소(2-하이드록시아실-CoA 리아제 1, HACL1)의 활성에 영향을 받아 중간체인 단일불포화 알데하이드를 형성함; (3) 알데히드 탈수소효소는 NAD+(니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드)에 의존하는 과정에서 상기 중간체 알데히드를 8Z-헵타데센산으로 전환시키는 역할을 함. 따라서, 본 발명에 따른 8Z-헵타데센산은 17개의 탄소 원자의 오메가-9 단일불포화 알파-히드록실화 지방산인 a=6, b=1 및 c=6인 화학식 (II)의 화합물이고, 이 화합물은 화학식 (I)의 전구약물인 2-히드록시올레산, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르의 대사로부터 생성된다.
화학식 (I)의 화합물의 의학적 용도가 알려져 있지만, 본 발명은 그의 전구약물로서 작용하는 상기 화학식 I의 화합물의 대사 후 식후 신체에서 특이적이고 차별화된 치료 작용을 제공하는 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 화합물인 대사산물의 화학식을 설명한다. 따라서, 본 발명은 치료될 환자의 질환 및 예후의 특성에 따라 치료적 치료를 적응시키는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 치료적으로 효과적인 알파-히드록실화된 단일- 또는 다중-불포화 지방산의 대사산물의 구체적인 화학식을 개시한다. 따라서, 본 발명은 투여되는 양을 조절할 수 있도록 하는 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 대사산물 단독의 약제로서의 용도; 또는 화학식 I의 전구약물과 조합하여 약제로서의 그의 용도; 또는 치료 동안 시간 경과에 따라 투여되는 강도 및 용량을 조절하도록 화학식 I의 전구약물을 투여함으로써 의약으로서의 그의 용도를 추가로 기술한다. 또한, 화학식 (I)의 전구약물의 투여에 의한 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 화합물의 투여는 약물의 분포 및 흡수를 조절할 수 있는데, 그 화합물의 대사는 상기 전구약물을 전환하는 대사 반응이 일어나는 세포 또는 조직에서만 상응하는 약물을 생성하는 것을 가능하게 하고, 활성 화합물은 상기 세포에서 얻어지기 때문이다. 어떤 경우든, 본 명세서는 화학적 합성에 의해 수득되거나(실시예 1 참조) 또는 화학식 I의 화합물의 대사 동안 수득되든, 화학식 (II)의 화합물 및 화학식 (III)의 화합물 모두에 관한 것이다.
이와 관련하여, 본 발명의 목적을 위해, 용어 "대사산물"은 이의 기원이 대상체의 신체에서 화학식(I)의 화합물의 대사인지 또는 화학식(II) 또는 화학식(III)의 화합물이 합성으로 얻은 생성물인지 여부에 상관없이 화학식 (II) 또는 화학식(III)의 화합물을 지칭하기 위해 사용된다. 따라서, 본 발명의 목적을 위해, 화학식 (I)의 화합물이라는 용어는 "화학식 (I)의 전구약물"이라는 용어와 상호교환적으로 사용되며, 마찬가지로 용어 "화학식 (II)의 화합물" 및 "화학식 (III)"의 화합물은 은 각각 "화학식(II)의 대사산물" 및 "화학식(III)의 대사산물"이라는 용어와 상호교환적으로 사용되는데, 화학식 (II) 및 화학식 (III)의 화합물은, 화학 합성에 의해 수득되거나 화학식 (I)의 화합물의 자연 대사로부터 생성되는지 여부에 상관없이, 결과적으로 이의 전구약물로 작용하는 화학식 (I)의 화합물의 대사 산물의 화학 구조 또는 화학식을 갖기 때문이다.
본 발명을 설명하기 위해, 본 발명의 실시예는 화학식 (I)의 전구약물에 의해 발휘되는 치료 효과가 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 대사산물이 신체에 미치는 치료 효과와 어떻게 직접적으로 관련되는지를 보여주고, 또한 화학식 (II) 및 화학식 (III)의 화합물에 의해 그 자체로 발휘되는 치료 효과를 보여준다. 따라서, 실시예 7.3에 나타낸 바와 같이, 화학식 (I)의 화합물인 2-히드록시올레산의 나트륨 염(OHOA)의 투여는 화학식 (II)의 대사산물 C17:1n-9의 세포 축적이 클수록 마우스에서 이종이식 종양(xenographic tumor)의 크기를 더욱 크게 감소시켰다. 따라서 2OHOA의 나트륨 염의 치료 작용은 대사 산물인 C17:1n-9로의 전환과 부분적으로 관련이 있다. 다른 한편으로, 본 발명의 실시예 6.2는 2OHOA의 혼입으로부터 대사산물 C17:1n-9(8Z-헵타데센산)의 형성이 종양 세포와 비종양 세포 간에 상이하다는 것을 입증한다. 신경교종 세포는 2OHOA에 비해 C17:1n-9 수준에서 상당한 증가를 보인 반면(도 13B 및 D), 비종양 세포에서는 2OHOA의 검출 수준이 대사산물인 C17:1n-9보다 훨씬 더 높았다. 또한, 실시예 및 도면은 DHA-H로 예시되는 화학식 (I)의 화합물에 의해 매개되는 항증식 효과가 그의 HPA 대사산물(화학식 (III)의 화합물)에 의해 적어도 부분적으로 매개됨을 보여주는데, DHA-H로부터 이 화합물의 형성을 억제하면 DHA-H의 항증식 효과가 낮아지기 때문이다(도 4B). 이들 결과는 화학식 (I)의 화합물의 치료적 가치가 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 대사산물의 생물학적 활성과 부분적으로 연관되어 있음을 나타내며, 상기 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (II)의 화합물의 진정한 전구약물로서 작용한다.
다른 한편으로, 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 화합물, 예컨대 HPA를 DHA-H와 같은 화학식 (I)의 화합물의 투여와 동일한 실험 조건 하에 투여하면 DHA-H에서 유래하는 것보다 훨씬 더 높은 수준으로 HPA가 생성되는데, 이는 HPA의 치료 활성이 DHA-H의 치료 활성보다 높을 수 있음을 의미한다. 이러한 효과는 화학식 (I)의 전구약물(DHA-H)과 화학식 III의 이의 대사산물(HPA) 간의 구조적 차이에 기인한다. 실제로, 본 발명에서는 DHA의 알파-히드록실화된 형태(DHA-H)의 흡수가 비-히드록실화 유사체의 흡수와 비교하여 방지된다는 것이 입증되었다(도 5C). DHA-H 흡수가 비히드록실화 지방산과 비교하여 방지된다면, DHA-H 및 HPA 투여 후 관찰되는 HPA의 상이한 세포내 수준은 세포가 세포외 배지로부터 이들 화합물의 상이한 흡수로 인한 것임에 틀림없다. 또한, 실시예 6.3에 나타낸 바와 같이, 대사산물 C17:1n-9의 IC50 값은 전구약물 2OHOA의 IC50 값보다 낮았고, 이는 더 큰 항증식 효능을 확인시켜주었다. 또한, 도 3B에서 볼 수 있듯이, 종양의 HPA 수준은 이종이식(xenographic) 모델의 종양 크기와 반비례한다. 따라서, 전구약물인 화학식 (I)의 화합물의 치료 작용은 대사산물의 증가된 존재에 의해 향상된다.
한편, 도 5에 도시된 바와 같이, HPA의 나트륨염(실시예 1에 기재된 바와 같이 화학적 합성에 의해 수득된 대사산물) 처리는 동일 조건하에서 DHA-H의 나트륨 염(전구약물) 또는 DHA의 나트륨 염(천연 유사체) 처리에 의해 유도된 것보다 배양물에서 훨씬 더 분명한 정도의 치사율을 유도한다. 따라서, 대사산물의 투여는 전구약물의 투여에 의해 얻어지는 것보다 더 두드러진 치료 작용을 제공할 수 있다.
그러나, 실시예 6.3에 나타낸 바와 같이, C17:1n-9는 그의 전구약물 대신에 직접 투여됨으로써 종양 세포 및 비종양 세포 모두에서 항증식 효과를 나타내었고, 따라서 화학식 (I)의 전구약물인 2OHOA를 통한 화학식 (II)의 대사산물인 C17:1n-9의 투여는 치료 효과를 생성하는 선택적 방법을 제공함으로써, 바람직하지 않은 부작용을 일으키지 않으면서 상기 요법의 더 긴 투여를 가능하게 하고 유지 요법에 동등하게 유용하게 한다. 특히, 홀수 사슬 지방산은 α-산화에 의해 대사되어 프로피오닐-CoA를 생성한다. 대사가 아세틸-CoA의 생산으로 끝나는 짝수 사슬 지방산과 달리, 이는 다시 크렙스 회로를 통해 대사된다. 프로피오닐-CoA는 프로피온산으로 전환될 수 있으며, 이는 축적되면 부작용으로 대사성 산증을 유발한다. 프로피오닐-CoA는 비오틴 및 비타민 B12 의존 과정에서 석시닐-CoA(크렙스 회로를 통해 대사됨)로 대사적으로 전환될 수 있다. 이 과정은 일반적인 지방산 대사 경로가 아닌데, 포유류의 신체에서 대부분의 지방산은 짝수 사슬을 갖기 때문이다. 따라서, 이 대사 경로는 화학식 (II) 및 화학식 (III)의 대사산물과 같은 홀수 사슬 다가불포화 지방산에 선택적으로 영향을 미치며, 이러한 홀수 사슬 대사산물의 세포 내 농도가 너무 높거나 비오틴 또는 비타민 B12 결핍을 초래하는 특정 병리학적 상황이있는 경우 포화될 수 있어 앞서 언급한 프로피온산 산증의 부작용을 초래할 수 있다.
따라서, 세포에 직접 투여되는 대사산물에는 일부 경우에 바람직하지 않은 독소가 있다. 이러한 독성은 화학식 (I)의 전구약물 또는 화합물이 투여될 때 조절될 수 있고, 화학식 (II) 또는 (III)의 대사산물의 효과 및 독성을 조절할 수 있다. 이와 관련하여, 히드록실화되지 않은 지방산과 비교하여 전구약물의 더 느린 흡수는 과도하게 높은 세포내 대사산물 농도를 피하고 및 결과적으로 프로피온산의 가능한 축적을 피하는데 유용할 수 있다.
따라서, 대사 상태, 투여 요법 및 치료할 병리에 따라, 특히 보다 강력한 치료 작용이 필요한 경우 또는 치료 기간이 단축된 경우, 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 대사산물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 사용하는 것이 바람직할 수 있으며; 장기 치료 또는 유지 치료와 같은 다른 경우에는, 화학식 (I)의 전구약물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르, 예컨대 DHA-H의 나트륨 염을 사용하여 시간 조절 투여를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 전구약물로서 짝수 사슬의 화학식 (I)의 화합물을 사용하여 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 대사산물을 투여하면 홀수 시슬을 갖는 화학식 (II) 또는 홀화학식 (III)의 대사산물의 시간 조절 투여(time-regulated administration)가 가능하다.
이러한 모든 이유로, 본 발명은 화학식 (I)의 전구약물의 투여에 의한 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 화합물의 투여가 이들의 홀수 사슬 대사산물의 시간-조절 투여가 어떻게 가능한 지를 보여준다.
따라서, 본 발명은 치료될 환자의 질환 및 예후의 특성에 따라 대사산물 또는 전구약물인 화학식 (I)의 화합물을 의약으로 사용하도록 요법을 조정하는 것을 가능하게 한다. 한편, 단기 급성 치료 활성이 필요한 경우, 신속하고 유의미한 효과를 얻기 위해 대사 산물의 사용이 더 적절하거나 우선시될 것이다. 다른 한편, 장기 치료가 필요한 경우, 예를 들어 만성 질환의 경우 또는 유지 치료가 필요한 경우에는, 질환의 시간 및 상황/심각도에 따라 전구약물 또는 전구약물과 대사산물을 서로 다른 비율로 조합한 조성물의 사용이 권장되거나 우선될 수 있다.
따라서, 일반적으로, 화학식 (II) 및 (III)의 화합물, 및 이의 약학적으로 또는 기능식품적으로 허용되는 염의 사용은 본 출원의 실시예에 나타낸 바와 같이 유기체에 유익하다. 장기간 또는 고용량 투여가 필요한 경우, 대사의 결과로 상기 화학식 (II) 및 (III)의 화합물을 조절된 방식으로 투여하는 경우, 화학식 (I)의 상응하는 전구약물을 투여에 의한 화학식 (II) 및 (III)의 화합물의 작용은 이들의 대사 및 축적으로 인한 부작용을 피하는 것을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, 화학식 (I)을 갖는 전구약물은 부작용의 발생 위험이 더 낮은 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 대사 산물을 투여하고 치료적 유효량의 상기 대사 산물을 시간에 따라 지속적으로 제공하는 방법을 제공하는데, 화학식 (I)을 갖는 전구약물은 일단 투여되면 대사되기 때문이다. 따라서 대사 상태, 투여 요법 및 치료할 병리에 따라, 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르(대사산물)를 직접 사용하는 것이 바람직할 수 있거나, 화학식 (I)의 전구약물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르(전구약물), 또는 이의 조합 (전구약물 + 대사 산물)을 사용함으로써 시간 제어 투여를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 측면은 의약으로서 사용 및 특히 신경재생의 유도 및 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 암, 신생물, 염증성 질환, 심혈관 질환, 피부 및 피하 조직 병리, 대사성 병리, 신경병성 통증, 마비, 수면 장애, 소화기 병리, 근골격 및 결합 조직 질환, 비뇨생식기 병리, 및 대사성 질환으로 이루어진 군에서 선택된 질환 또는 병리의 예방 또는 치료(유지 치료를 포함)에 사용하기 위한 하기 화학식 (II)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르, 및 하기 화학식 (III)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00010
Figure pct00011
상기 식에서, a는 1과 14 사이의 정수이고; b는 1과 7 사이의 정수이고; c는 0과 14 사이의 정수이고; m은 0과 (b-1) 사이의 정수이고; a+3b+c+3은 짝수 정수이다.
본 발명의 목적을 위해 용어 "유지 치료" 또는 "유지 요법"은 1차 치료 또는 요법으로 치료한 후 완전히 또는 부분적으로 완화된 질환의 재발을 예방 또는 지연시키거나, 1차 요법으로 치료가 끝난 후 질환의 진행을 늦추기 위한 목적으로 1차 또는 1차 치료 또는 요법에 대한 보완책으로 투여되는 치료적 치료로 정의된다.
바람직하게는, 본 발명은 질환 또는 병리의 유지의 치료 또는 요법, 보다 바람직하게는 암의 치료 또는 유지 요법에서 사용하기 위한 화학식 (II)의 화합물 또는 화학식 (III)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 일 구현예는 신경재생의 유도 또는 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 암, 신생물, 염증성 질환, 심혈관 질환, 피부 및 피하 조직 병리, 대사성 병리, 신경병성 통증, 마비, 수면 장애, 소화기 병리, 근골격 및 결합 조직 질환, 비뇨생식기 병리, 및 대사성 질환으로 이루어진 군에서 선택된 질환 또는 병리의 예방 또는 치료(유지 치료를 포함)를 위한 의약의 제조에 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 화학식 (II)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르, 및 화학식 (III)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예는 질환 또는 병리를 예방 및/또는 치료하는 방법, 또는 환자에서 신경재생을 유도하는 방법으로서, 하기 화학식 (II)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르, 및 하기 화학식 (III)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물을 상기 환자에게 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다:
Figure pct00012
Figure pct00013
상기 식에서, a는 1과 14 사이의 정수이고; b는 1과 7 사이의 정수이고; c는 0, 3 또는 6이고, m은 0 내지 ( b - 1)의 정수이고; a+3b+c+3은 짝수 정수이다.
본 발명의 목적을 위해, 유효량 또는 치료적 유효량은 환자에게 허용할 수 없는 독성 효과를 일으키지 않으면서 치료 효과를 제공하는 양으로 이해되어야 한다.
약제의 유효량 또는 투여량은 화합물 및 치료되는 상태 또는 질환, 예를 들어 치료되는 환자의 연령, 체중 및 임상 상태, 투여 형태, 환자의 임상 병력, 질환의 심각성, 및 투여된 화합물의 효능에 따라 다르다.
또한, 본 발명의 일 구현예는 질환 또는 병리를 예방 및/또는 치료하거나 신경 재생을 유도하는데 사용하기 위한 하기 화학식 (II)의 화합물 및 하기 화학식 (III)의 화합물로 이루어진 군으로 부터 선택된 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00014
Figure pct00015
여기서, 예방 및/또는 치료 또는 신경재생의 유도는 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 전구약물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 투여하는 것을 특징으로 한다:
Figure pct00016
상기 화학식 (I)의 화합물은 대사되어 치료적 유효량의 하기 화학식 (II)의 화합물 또는 하기 화학식 (III)의 화합물을 생성한다:
Figure pct00017
Figure pct00018
상기 식에서, a는 1과 14 사이의 정수이고; b는 1과 7 사이의 정수이고; c는 0과 14 사이의 정수이고; m은 0과 (b-1) 사이의 정수이고; a+3b+c+3은 짝수 정수이다.
바람직하게, 상기 질환은 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 암, 신생물, 염증성 질환, 심혈관 질환, 피부 및 피하 조직 병리, 대사성 병리, 신경병성 통증, 마비, 수면 장애, 소화기 병리, 근골격 및 결합 조직 질환, 비뇨생식기 병리, 및 대사성 질환으로 이루어진 군에서 선택된다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 질환 또는 병리의 예방 및/또는 치료 또는 신경재생의 유도 및/또는 신경변성의 예방을 위해 본원에 기재된 바와 같은 화학식 (II)의 화합물 또는 화학식 (III)의 화합물을 유효량으로 투여하는 방법으로서, 상기 화학식 (II)의 화합물 또는 상기 화학식 (III)의 화합물은 본원에 기재된 바와 같은 화학식 (I)의 전구약물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르로서 투여되는, 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 질환 또는 병리를 예방 및/또는 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 화학식 (II)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르의 전구약물, 화학식 (III)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르의 전구약물을 유효량으로 투여하는 것을 포함하고, 상기 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 화합물의 전구약물은 본원에 기재된 바와 같은 화학식 (I), 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 갖는다.
또한, 본 발명은 질환 또는 병리의 예방 및/또는 치료하거나, 또는 신경재생 능 유도하고/하거나 신경퇴행을 예방하는 방법으로서, 하기 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 이를 필요로 하는 환자에게 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다:
Figure pct00019
여기서, 상기 화학식 (I)의 화합물은 상기 환자에서 대사되어 하기 화학식 (II) 또는 하기 화학식 (III)을 갖는 치료적 유효량의 대사산물을 생성한다:
Figure pct00020
Figure pct00021
상기 식에서, a는 1과 14 사이의 정수이고; b는 1과 7 사이의 정수이고; c는 0과 14 사이의 정수이고; m은 0과 (b-1) 사이의 정수이고; a+3b+c+3은 짝수 정수이다. 이때, 상기 대사산물은 환자에서 상기 질환 또는 병리의 예방 및/또는 치료, 그리고 환신경재생의 유도 및/또는 신경변성의 예방을 담당한다. 바람직하게는, 화학식 (I)의 화합물의 유효량 투여 시, 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 대사산물이 상기 환자의 신체에 존재한다.
바람직한 구현예에서, 상기 화학식 I의 화합물은 투여시 1% 초과, 10% 초과, 40% 초과, 50% 초과 및 최대 99% 만큼 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 대사산물로 대사된다.
또 다른 구현예는 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 암, 신생물, 염증성 질환, 심혈관 질환, 피부 및 피하 조직 병리, 대사성 병리, 신경병성 통증, 마비, 수면 장애, 소화기 병리, 근골격 및 결합 조직 질환, 비뇨생식기 병리, 및 대사성 질환으로 이루어진 군에서 선택된 질환 또는 병리를 예방 및/또는 치료히고, 신경재생을 유도하고/하거나 신경변성을 예방하는 방법으로서, 하기 화학식 (I)의 구조를 갖는 전구약물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 환자에게 유효향으로 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다:
Figure pct00022
여기서, 상기 전구약물은 생체내에서 전환되어 활성 화합물을 상기 환자의 세포 내로 방출하고, 상기 활성 화합물은 하기 화학식 (II) 또는 하기 화학식 (III)의 구조를 갖는다:
Figure pct00023
Figure pct00024
상기 식에서, a는 1과 14 사이의 정수이고; b는 1과 7 사이의 정수이고; c는 0과 14 사이의 정수이고; m은 0과 (b-1) 사이의 정수이고; a+3b+c+3은 짝수 정수이다.
바람직하게는 상기 전환은 화학적 또는 생리학적 과정이다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "화학적 과정"은 생체내에서 전구약물이 전환되어 화학 반응에 의해 활성 화합물을 방출하는 것을 의미하고, 이때 전구약물은 화학 반응의 시약 또는 기질이고, 활성 화합물은 반응 생성물이다. 또한, 본 발명의 목적을 위해 용어 "생리학적 과정"은 예를 들어 효소의 활성으로 인해 유기체에서 자연적으로 발생하는 사건 또는 과정으로 인한 전환을 의미한다.
또한, 화학식 (I)의 화합물이 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 대사산물을 통해 치료적으로 작용하지만, 상기 화학식 (I)의 화합물은 또한 본 발명의 실시예 6.4에 나타낸 바와 같이 상기 대사 경로와 무관한 생물학적 활성을 나타낸다.
따라서, 본 발명의 또 다른 구현예는 의약으로 사용 및 특히 본 발명에 따라, 특히 신경재생의 유도 및/또는 신경퇴행의 예방에 사용 및/또는 질환 또는 병리 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 화학식 (II)의 화합물 및 화학식 (III)의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르에 관한 것으로, 상기 화합물은 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르의 투여 전, 후 또는 동시에 투여되는 것을 특징으로 한다:
Figure pct00025
상기 식에서, a는 1과 14 사이의 정수이고; b는 1과 7 사이의 정수이고; c는 0과 14 사이의 정수이고, a+3b +c+3은 짝수 정수이고, 여기서, 상기 a, b 및 c의 값은 화학식 (II)의 화합물 또는 화학식 (III)의 화합물의 a, b 및 c의 값과 동일하거나 상이하다.
추가로, 본 발명은 신경재생을 유도하고/하거나 신경변성을 예방하는 방법, 또는 질환 또는 병리를 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 화학식 (II)의 화합물, 또는 화학식 (III)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 환자에게 유효량으로 투여하는 것을 포함하고, 본원에 기재된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 추가로 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하고, 상기 화학식 I의 화합물은 상기 화학식 II 또는 화학식 III의 화합물의 투여 전, 후 또는 동시에 투여된다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "전구약물"은 대상체에 투여시 대사 과정에 의해 제2의 치료적 활성 화합물로 전환되는 화합물을 의미한다.
한편, "대상"이라는 용어는 본 발명의 목적상 인간 또는 동물을 의미한다.
본 발명의 목적을 위해 용어 "약제학적으로 허용되는"은 동물이나 인간에서사용을 위해 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되었거나 유럽, 미국 또는 기타 일반적으로 인정되는 약전에 열거된 화합물 또는 물질을 의미한다. 본 명세서 전반에 걸쳐, 상기 용어는 본 개시에 따라 정의된 화학식 (I), (II) 및 (III)의 화합물의 염 및 에스테르에 주로 적용된다.
따라서, 용어 "약학적으로 허용되는 염"은 이것이 유도되는 모 화합물의 원하는 약리학적 활성을 또한 보유하는 화합물의 염을 의미한다. 바람직하게는, 약학적으로 허용되는 염은 나트륨 염이다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "에스테르"는 카르복실산 부분에 속하는 히드록실 기가 알콕사이드 기로 치환된 임의의 화합물을 의미한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 에스테르는 메틸 또는 에틸 에스테르이다. 더욱 바람직하게는, 에스테르는 에틸 에스테르이다.
"기능식품학으로 허용되는"이라는 용어는 본 발명의 목적상 기능성 식품 제품(nutraceutical product)에 사용되는 모든 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 목적을 위해 용어 "기능성 식품" 또는 "기능성 식품 조성물"은 단독으로 또는 다른 식품과 조합하여 섭취되고 이를 섭취하는 대상체의 건강에 유익한 효과, 특히 질환 예방에유익한 효과를 생성하는 식이 보조제(dietary supplement)를 의미한다. 본 명세서 전반에 걸쳐, 상기 용어는 본 개시에 따라 정의된 화학식 (I), (II) 및 (III)의 화합물의 염 및 에스테르에 주로 적용된다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "입체이성질체"는 동일한 화학식 및 동일한 원자 배열을 갖지만 공간에서 상이한 3차원 배향을 갖는 화합물을 의미하고, 키랄 탄소의 존재로 인한 입체 이성질체 R 및 S((+) 및 (-) 명명법도 사용)뿐만 아니라, 이중 결합을 구성하는 탄소의 치환기 배열로 인한 입체 이성질체 E 및 Z(시스/트랜스 명명법도 사용)를 포함한다. 따라서, 화학식 (I)의 전구약물은 키랄 탄소(카복실 그룹에 대한 알파 탄소)를 포함하기 때문에, 본 발명은 또한 상기 키랄 탄소의 배열과 관련하여 2개의 입체 이성질체 R 및 S 뿐만 아니라 둘 모두의 임의의 혼합물을 포함한다. 다른 한편, 화학식 (I)의 전구약물 및 화학식 (II) 또는 (III)의 대사산물은 모두 C=C 이중 결합을 포함하기 때문에, 본 발명은 또한 이들 이중 결합 각각에 대한 E 및 Z 입체 이성질체를 모두 포함한다. 바람직한 구현예에서, 화학식 (I)의 전구약물, 화학식 (II)의 화합물, 및 화학식 (III)의 화합물의 모든 이중 결합은 전체-시스 배열을 갖는다. 따라서, 화학식 (I)의 전구약물이 이중 결합으로부터 결정된 시스/트랜스(또는 E/Z) 입체화학적 배열을 갖는다면, 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 대사산물도 이에 포함된 이중 결합에 대한 그러한 배열을 가질 것이다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "포함한다"는 특정 특징의 그룹(예를 들어, 특징 A, B 및 C의 그룹)을 포함하는 것을 나타내며, 그러한 특징(A, B, 및 C)을 포함하나 청구를 실행 불가능하게 만들지 않는 한 다른 특징(예: 특징 D 또는 E)의 존재를 배제하지 않는다. 또한, 용어 "함유한다", "포함한다", "가지다" 또는 "포함한다" 및 이들의 복수형은 본 발명의 목적상 용어 "포함한다"의 동의어로 간주되어야 한다. 반면에 "구성된다"라는 용어가 사용되는 경우 해당 용어 뒤에 오는 것 이외의 추가의 특징이 장치/방법/제품에 없다. 이와 관련하여, 본 발명의 목적상, "포함한다"라는 용어는 "구성되는" 또는 "본질적으로 구성되는"이라는 용어로 대체될 수 있다. 따라서 "포함한다"는 특징 A, B 및 C의 그룹을 지칭할 수 있으며, 다른 특징이 청구범위를 실행 불가능하게 만들지 않는 한 E 및 D와 같은 다른 특징을 추가로 포함할 수 있지만, 이러한 용어 "포함한다"는 또한 특징들의 그룹이 A, B 및 C로 "구성"되거나 "본질적으로 구성"되는 경우를 포함한다.
또한, 본 발명은 유지 치료(유지 요법)에서 화학식 (I)의 화합물, 특히 2OHOA, 또는 이의 약학적으로 하용되는 염 또는 에스테르, 더욱 바람직하게는 2OHOA의 투여를 지원할 수 있으며, 이때 상기 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르는 일정 기간에 걸쳐 상이한 간격으로 투여되며, 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 대사산물의 누적 농도는 치료 효과의 척도가 된다. 따라서, 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 제약상 허용되는 염 또는 에스테르를 사용한 치료의 효능을 측정하는 상기 시험관내 방법은 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 화합물, 또는 이의 카르복실레이트 음이온, 또는 이로부터 형성된 유도체의 양을 측정하는 것을 포함한다.
이와 관련하여, 본 발명의 목적상, 용어 "바이오마커"는 제2 화합물 또는 물질을 이용한 치료의 반응 및/또는 효능을 측정하기 위해 사용될 수 있는 제1 화합물 또는 물질, 또는 상기 제1 화합물 또는 물질의 유도체를 의미한다. 따라서, 본 발명의 목적상, 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 대사산물은 화학식 (I)의 화합물을 사용한 치료의 반응 및/또는 효능을 측정하기 위한 바이오마커로서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 대상체에서 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 이용한 질환 또는 병리의 치료적 또는 예방적 치료 또는 신경재생 유도 치료의 효능을 측정하기 위한 시험관내 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 대상체의 생물학적 샘플 내에서 하기 화학식 (II)의 화합물, 또는 하기 화학식 (III)의 화합물, 또는 이의 카르복실레이트 음이온, 또는 생체내 또는 시험관내서 그로부터 형성된 유도체의 양을 시험관내에서 측정하는 것을 포함하고, 상기 양은 치료의 효능과 관련이 있다:
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
상기 식에서, a는 1과 14 사이의 정수이고; b는 1과 7 사이의 정수이고; c는 0과 14 사이의 정수이고; m은 0과 (b-1) 사이의 정수이고; a+3b+c+3은 짝수 정수이다.
따라서, 상기 방법은 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 화합물, 이들 각각의 카르복실레이트 음이온, 또는 이로부터 형성된 유도체의 양을 측정하는 것을 포함한다.
화학식 (II) 또는 (III)의 화합물의 상기 유도체는 시험관내 샘플에 포함된 상기 화학식 (II) 또는 (III)의 화합물을 물질과 반응시켜 그의 유도체를 수득함으로써 시험관내에서 형성될 수 있다. 이 경우, 본 발명의 방법은 시험관내에서 형성된 상기 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 유도체의 양을 측정하는 것을 포함한다. 예를 들어, 지방산 검출을 위한 몇몇 기술은 그의 사전 화학적 변형을 필요로 하므로, 가스 크로마토그래피에 의한 검출의 경우 지방산 샘플(이 경우 화학식 (II) 또는 화학식 (III))은 검출 및 정량화를 위해 각각의 메틸 에스테르로 전환될 필요가 있다.
다른 한편으로, 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 화합물의 상기 유도체는 대사 유도체이거나 상기 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 화합물과 또 다른 지질, 단백질, 효소, 뉴클레오티드, 탄수화물 등의 반응의 결과로서(생체내에서 발생하는 반응의 결과로서) 생체 내에서 형성된 대사 유도체일 수 있다. 따라서, 상기 유도체는 상기 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 화합물의 에스테르, 에를 들어, 특히 글리세로인지질(예: 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 포스파티드산 또는 이의 매끄러운 형태, 예를 들어 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민 등), 플라스마로겐(알킬 또는 알케닐), 콜레스테롤 에스테르, 트리아실글리세리드(트리글리세리드) 또는 디글리세롤글리세롤과 같은 글리세로지질, 카디오리핀, 스핑고지질, 조효소 A(아실-CoA)를 갖는 티오에스테르, 또는 아실카르니틴일 수 있다. 이 경우, 본 발명의 방법은 생물학적 샘플에서 상기 대사 유도체(또는 생체내에서 형성된 유도체)의 양을 시험관내에서 측정하는 것을 포함한다.
따라서, 상기 화학식 (II), 또는 화학식 (III)의 화합물, 또는 이들 각각의 카르복실레이트 음이온, 또는 생체내 또는 시험관내 이로부터 형성된 유도체의 양은 대상체에서 화학식 (I)의 화합물을 이용한 질환 또는 병리의 치료 및/또는 예방 또는 신경재생 유도 치료와 관련이 있고, 대조군과 비교하여 상기 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 화합물, 또는 이의 카르복실레이트 음이온, 또는 이의 유도체의 수준은 상기 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 또는 이의 에스테르를 이용한 질환 또는 병리의 치료 또는 예방적 치료의 효능과 관련이 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상체에서 하기 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 또는 이의 에스테르를 사용한 질환 또는 병리의 치료적 또는 예방적 치료, 또는 신경재생 유도 치료의 효능을 시험관내에서 측정하기 위한, 하기 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물의 용도에 관한 것이다:
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
상기 식에서, a는 1과 14 사이의 정수이고; b는 1과 7 사이의 정수이고; c는 0과 14 사이의 정수이고; m은 0과 (b-1) 사이의 정수이고; a+3b+c+3은 짝수 정수이다.
더욱 바람직하게는, 상기 질환 또는 병리는 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 암, 신생물, 염증성 질환, 심혈관 질환, 피부 및 피하 조직 병리, 대사성 병리, 신경병성 통증, 마비, 수면 장애, 소화기 병리, 근골격 및 결합 조직 질환, 비뇨생식기 병리, 및 대사성 질환으로 이루어진 군에서 선택된다. 더욱 더 바람직하게는, 질환 또는 병리는 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 암, 염증성 질환, 및 대사성 질환으로부터 선택된다.
보다 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 화학식 (I)의 화합물의 약학적으로 허용되는 염, 훨씬 더 바람직하게는 화학식 (I)의 화합물의 나트륨 염을 사용한 치료의 효능을 측정한다.
본 발명의 일 구현예에서, 생물학적 샘플은 혈액 샘플(혈장 또는 혈청 포함), 소변 샘플, 타액 샘플, 조직의 생검, 뇌척수액, 또는 땀 샘플이다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 (II)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르, 및 하기 화학식 (III)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 제1 화합물 및 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하고, 하기 화학식 (I)의 제2 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 선택적으로 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다:
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
상기 식에서, a는 1과 14 사이의 정수이고; b는 1과 7 사이의 정수이고; c는 0과 14 사이의 정수이고; m은 0과 (b-1) 사이의 정수이고; a+3b+c+3은 짝수 정수이다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 (II)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르, 및 하기 화학식 (III)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 제1 화합물 및 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하고, 하기 화학식 (I)의 화합물의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 선택적으로 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다:
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
상기 식에서, a는 1과 14 사이의 정수이고; b는 1과 7 사이의 정수이고; c는 0과 14 사이의 정수이고; m은 0과 (b-1) 사이의 정수이고; a+3b+c+3은 짝수 정수이다.
본 발명의 또 다른 구현예는 의약으로서 사용 및 특히 신경재생 유도 및/또는 신경변성 예방에 사용 및 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 암, 신생물, 염증성 질환, 심혈관 질환, 피부 및 피하 조직 병리, 대사성 병리, 신경병성 통증, 마비, 수면 장애, 소화기 병리, 근골격 및 결합 조직 질환, 비뇨생식기 병리, 및 대사성 질환으로 이루어진 군에서 선택된 질환 또는 병리의 예방 또는 치료하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 화학식 (II)의 화합물 및 화학식 (III)의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제1 화합물 및 적어도 하나의 약학적으로 하용되는 부형제를 포함하고 화학식 (I)의 화합물의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 적어도 하나의 제1 화합물은 화학식 (II)의 화합물 또는 화학식 (III)의 화합물의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르이고/이거나 상기 제2 화합물은 화학식 I의 화합물의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르이다.
본 발명의 일 구현예는 신경재생의 유도 및/또는 신경퇴행의 예방, 및/또는 질환 또는 병리의 예방 및/또는 치료용 의약의 제조에서, 본원에 기재된 바와 같은 화학식 (II)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르, 및 화학식 (III)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 제1 화합물 및 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하고, 본원에 기재된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 선택적으로 포함하는 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예는 질환 또는 병리의 예방 및/또는 치료, 또는 신경재생의 유도 및/또는 신경변성의 예방을 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은 화학식 (II)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르, 및 화학식 (III)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 제1 화합물 및 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하고, 본원에 기재된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 선택적으로 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 유효량으로 투여하는 것을 포함한다.
바람직하게는, 상기 질환 또는 병리는 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 암, 신생물, 염증성 질환, 심혈관 질환, 피부 및 피하 조직 병리, 대사성 병리, 신경병성 통증, 마비, 수면 장애, 소화기 병리, 근골격 및 결합 조직 질환, 비뇨생식기 병리, 및 대사성 질환으로 이루어진 군에서 선택된다.
당업자는 당업계에 알려진 하나 이상의 약학적으로 허용되는 비히클 또는 부형제를 선택하여 약학적 조성물이 인간 대상체 및 동물 모두에 투여하기에 적합하도록 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 부형제는 알부민, 예를 들어, 오브알부민, 락트알부민, 인간, 소, 쥐 또는 토끼 기원의 천연 또는 재조합 알부민, 보다 바람직하게는 인간 혈청 알부민 또는 소 혈청 알부민이다.
본 발명에 개시된 약학적 조성물은 또한 추가 요법 이전 또는 이후에 병용 투여될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 추가 요법은 방사선 요법, 종양 치료를 위한 전기장(Tumor Treatment Fields), 면역 요법 또는 화학요법이다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 개시된 약학적 조성물은 또한 테모졸로미드의 투여를 포함하는 요법 이전 또는 이후에 병용 투여될 수 있다.
이러한 투여는 성인 또는 소아 환자 치료의 일부일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 방사선 치료, 화학 요법 치료, 종양 치료를 위한 전기장 치료(Tumor Treatment Fields), 또는 면역요법 치료 전 또는 후에 병용 투여된다.
본 발명의 일 구현예에서, 본원에 개시된 약학적 조성물은 하나 이상의 추가 치료 성분 또는 활성 화합물을 포함한다. 상기 추가 치료 성분 또는 활성 화합물은 부가적 또는 상승적 생물학적 활성을 제공한다. 본 개시의 목적을 위해, 용어 "활성 화합물" 또는 "치료 성분"은 인간 또는 동물에게 투여될 때 치료 효과를 발휘하는 화학적 또는 생물학적 실체를 의미하는 것으로 간주되어야 한다. 이러한 활성 화합물 또는 추가 치료 성분은 무엇보다도 세포 요법, 소분자 요법, 면역요법, 방사선 요법일 수 있다.
추가 치료 성분 또는 활성 화합물로는 신경퇴행성 질환 치료용 화합물, 항암제, 대사 조절 화합물, 심혈관 제제, 및 비만 및 과체중 조절제가 있다.
또한 치료 성분 또는 추가 활성 화합물로는 신경퇴행성 질환 치료용 화합물, 화학요법제, 대사-조절 화합물, 심혈관 제제, 및 비만 및 과체중 조절제가 있다. 바람직하게는, 상기 활성 화합물 또는 상기 요법은 화학요법제, 세포 요법제 또는 면역요법제이다.
바람직한 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 하기의 것들로 이루어진 군에서 선택된 화학요법제를 포함한다: 백금계 항종양제; 항-유사분열 화학요법제; 폴리아데노신 디포스페이트 리보스 폴리머라제(PARP) 억제제; I형 토포이소머라제 억제제; II형 토포이소머라제 억제제; 에포틸론; 순환 골격 교란기; 알킬화제; 히스톤 데아세틸라제 억제제; 키나제 억제제; 항엽산; 펩티드 항생제; 레티노이드; 빈카 알칼로이드 및 티미딜레이트 합성효소 억제제. 보다 바람직하게는, 화학요법제는 하기의 것들로 이루어진 군으로부터 선택된다: 베바시주맙, 카르무스틴, 시클로포스파미드, 멜팔란, 이포스파미드, 부설판, 테모졸로마이드, 메클로레타민, 클로람부실, 멜팔란, 다카르바진, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미톡산트론, 발루비신, 파클리탁셀, 도세탁셀, 아브락산, 탁소테레, 에포틸론, 보리노스타트, 로미뎁신, 이리노테칸, 토포테칸, 캄프토테신, 엑사테칸, 루르토테칸, 에토포사이드, 테니포사이드, 타플루포사이드, 보르테조밉, 엘로티닙, 게피티닙, 이마티닙, 베무라페닙, 비스모데깁, 아자시티딘, 아자티오프린, 카페시타빈, 시타라빈, 클라드리빈, 플루다라빈, 독시플루리딘, 플루오로우라실, 젬사이토빈, 하이드록시우레아, 머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 페메트렉세드, 아자티오피렌, 티오구아닌, 레티노산, 블레오마이신, 악티노미신, 카보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 트레티노인, 알리트레티노인, 벡사로텐, 토포테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신 및 비노렐빈. 보다 바람직하게는, 추가 화학요법제는 테모졸로미드이다.
이와 관련하여, 세포막을 통합할 때 지질이 세포 신호를 제어할 수 있다는 사실은 지질이 세포의 생리학적 상태를 조절하고, 따라서 일반적인 건강 상태도 조절할 수 있다는 것을 암시한다. 따라서, 본원에 개시된 화합물은 신경재생의 유도 및 특히 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 암, 신생물, 염증성 질환, 심혈관 질환, 피부 및 피하 조직 병리, 대사성 병리, 신경병성 통증, 마비, 수면 장애, 소화기 병리, 근골격 및 결합 조직 질환, 비뇨생식기 병리, 및 대사성 질환으로 이루어진 군에서 선택된 질환 및 병리의 예방 및/또는 치료에 유용하다.
본 발명의 목적상, 신경계의 질환은 신경계(중추 및 말초 둘 다)에 영향을 미치는 모든 질병이다. 본 발명의 목적상, 이 그룹에는 중추 신경계 또는 말초 신경계의 구조 및 기능의 진행성 퇴화를 특징으로 하는 이질적인 장애 그룹인 신경퇴행성 질환이 있다.
바람직하게는, 신경퇴행성 질환은 척수 손상 및 신경학적 기원의 통증으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 목적상, "신경재생의 유도"라는 용어는 신경학적 기능의 재생을 의미한다. 한편, 본 발명의 목적상, "신경변성의 예방"이라는 용어는 치료가 이미 진행 중인 신경변성 과정의 정지를 초래하거나 치료가 신경변성의 발병 또는 진행을 예방함을 의미한다.
이러한 신경퇴행성 과정 중 일부는 환자의 인지 능력의 현저한 감소 또는 운동 장애를 수반한다. 신경 퇴행성 과정, 신경 장애 및 신경 정신 질환은 지질(예: 미엘린) 또는 막 단백질(예: 아드레날린 수용체, 세로토닌 수용체 등)과 같은 구성 요소의 신경 변성 또는 변경에 공통으로 기반한다.
특히, 신경변성 질환은 하기의 것들로 이루어진 군으로부터 선택된다: (i) 세균성 뇌수막염, 비세균성 뇌수막염, 급성 출혈성 괴사성 뇌병증, 기타 뇌염, 척수염 및 뇌척수염, 달리 명시되지 않은 뇌실염(NOS), 두개내 및 척추강내 농양, 육아종, 척수강내 두개내 혈전정맥염, 및 중추신경계의 염증성 질환의 후유증과 같은 중추신경계의 염증성 질환; (ii) 길랑바레(Guillan-Barre), 당뇨병성 신경병증, 월러(Wallerian) 변성, 루이소체 치매, 전두측두엽 치매, 헌팅턴 무도병, 헌팅턴 치매, 유전성 운동실조증과 같은 주로 중추신경계에 영향을 미치는 전신 위축증; Werdnig-Hoffman과 같은 척추 근육 위축 및 관련 증후군; 주로 중추신경계에 영향을 미치는 전신 위축, 소아마비 후 증후군; 근위축성 측삭 경화증 및 진행성 안구 마비와 같은 운동 뉴런 질환; (iii) 파킨슨병, 이차성 파킨슨병, 신경이완제 악성 증후군, 약물 유발 이차성 파킨슨병 뇌염 후 파킨슨병, 혈관성 파킨슨병, 기저핵의 퇴행성 질환, Hallervorden-Spatz, 진행성 핵상 안근마비, 진행성 핵상 마비, 선조체 변성, 본태성 떨림 근긴장이상, 약물 유발성 떨림, 균근증, 약물 유발 무도병, 약물 유발 틱, 기질성 틱, 약물 유발 운동 장애, 정좌불능증, 하지 불안 증후군, 강직 증후군 및 양성 떨림 발작과 같은 추체외로 및 운동 장애; (iv) 알츠하이머병, 조기 또는 후기 발병 알츠하이머병, 픽병과 같은 전두측두엽 치매, 알코올로 인한 신경계 변성, 알퍼스병, 리병, 루이소체 치매, 경도인지장애, 피질기저변성, 알츠하이머 치매를 포함한 원발성 퇴행성 치매, 노인성 치매, 뇌졸중과 같은 신경계의 다른 퇴행성 질환; (v) 수질, 뇌간의 다발성 경화증, 파종성, 일반화 또는 달리 명시되지 않은(NOS); 급성 파종성 탈수초, 미만성 중추신경계 경화증과 같은 중추신경계 탈수초성 질환; (vi) 재발성 간질 및 발작, 특발성 간질 및 발작, 대발작, 비특이성 긴장성 또는 간대성 간질간질, 레녹스-가스토 증후군, 간질 경련, 불특정 유형의 간질, 편두통, 두통, 일과성 뇌허혈 사고 및 관련 증후군, 수면 장애 및 현기증과 같은 에피소드 및 발작 장애; (vii) 삼차신경 장애, 안면신경 장애, 뇌신경 장애, 신경근 및 신경총 장애, 상지 또는 하지 단일신경병증 및 월러 변성과 같은 신경, 신경근 및 신경총 장애; (viii) 루시-레비 증후군, 레프섬병과 같은 유전성 및 특발성 신경병증; 염증성 다발성 신경병증; Guillan-Barre 후유증, 혈청 신경병증과 같은 다발성 신경병증의 후유증; 약물, 알코올, 독성 물질, 방사선 신경병증과 같은 기타 다발성 신경병증; 염증성 및 독성 다발신경병증의 후유증을 비롯한, 말초 신경계의 다발성 신경병증 및 기타 장애; (ix) 중증 근무력증 및 기타 근신경 장애, 근육 및 신경근 접합부 장애와 같은 근육 및 신경근 접합부 질환; (x) 편마비, 하반신마비, 사지마비를 포함하는 뇌성 마비 및 기타 마비 증후군; (xi) 복합 부위 통증 증후군, 신경병증성 통증, 무신경 신경계 장애, 말초 자율 신경병증, 수두증, 뇌 낭종, 라일리-데이 증후군, 다계통 자율 신경계 변성, 해마 경화증, 근심 경화증, 당뇨병성 신경병증 또는 볼프람 증후군, 부신백질이영양증, 백혈이영양증, 및 척수 손상과 같은 기타 신경계 장애; 및 (xii) 혈관성 치매, 상세불명의 치매, 우울증과 같은 생리적 상태로 인한 정신 및 행동 장애; 정신 활성 물질 남용과 관련된 행동 장애; 정신분열증, 정신분열형 장애, 망상 장애 및 기타 기분과 관련되지 않은 정신병적 장애; 조증 삽화, 양극성 장애, 주요 우울 장애, 순환성 장애, 기분 저하 장애와 같은 기분(정동) 장애; 불안 장애, 해리성, 스트레스 관련 및 기타 비정신병적 신체형 정신 장애; 생리적 장애 및 섭식 장애, 수면 장애와 같은 신체적 요인과 관련된 행동 증후군; 성격 장애, 충동 장애, 병적 도박; 지적 장애; 언어 장애, 쓰기, 학습 장애, 정신 활성 물질 사용 장애 및 중독성 행동.
본 발명의 목적상, "신경병증성 통증"은 국제 통증 연구 협회(IASP)에 의해 정의된 체성 감각 신경계의 손상 또는 질병으로 인한 통증으로 정의된다. 체성 감각 신경계는 표면 또는 신체 내부의 변화에 반응하는 감각 뉴런과 신경 경로로 구성된다. "마비"라는 용어는 본 발명의 목적을 위해 중추 또는 말초 신경계의 손상 또는 질병으로 인해 신체의 일부에서 운동성의 부분적 또는 전체적 상실을 의미한다. 한편, "수면 장애"라는 용어는 중추 또는 말초 신경계 문제 또는 병리로 인한 수면 개시 및 유지의 문제를 포함하는 장애를 의미한다. 이러한 수면 장애의 비제한적인 예로는 불면증, 기면증과 같은 과다수면, 수면 무호흡증, 하지불안 증후군, 일주기 리듬 장애 및 사건수면 등이 있다.
특정 신경퇴행성 질환은 실명, 청력 문제, 방향 감각 상실, 기분 장애 등이 발생하는 과정을 초래할 수 있다. 잘 규명된 신경퇴행성 장애의 예는 알츠하이머병으로, 알츠하이머병에서는 플라크의 형성이 관찰되었으며, 이러한 플라크는 주로 변경된 단백질 처리로 인해 생성된 β-아밀로이드 펩티드에 의해 형성된 후 세포 외부에 축적된다. 또한, 과인산화된 타우(tau) 단백질의 신경섬유 얽힘이 세포 내부에 나타난다. 이 과정은 콜레스테롤 대사의 변화 및 도코사헥사엔산과 같은 특정 막 지질 수준의 결과적인 변화와 관련이 있다. 한편, 파킨슨병, 알츠하이머병, 노인성 치매(또는 루이소체 치매)와 같은 여러 신경 퇴행성 병리는 α-시누클레인 단백질의 원섬유 응집체의 병리학적 축적과 관련되어 세포 트리글리세리드의 대사에서 중요한 변화를 초래한다. 실제로, 이들 및 기타 신경퇴행성 질환의 발병은 콜레스테롤, 트리글리세리드, 스핑고미엘린, 포스파티딜에탄올아민 등과 같은 지질의 혈청 또는 세포 수준의 변화와 관련이 있다. 이는 다시 말하지만, 지질이 뉴런, 신경교 세포, 신경, 뇌, 소뇌 및 척수의 적절한 기능에 중요한 역할을 한다는 것을 시사하며, 이는 중추 신경계에 지질이 매우 풍부하다는 점을 고려할 때 논리적이다.
알츠하이머병(AD)은 현재까지 효과적인 치료법이나 치료법이 없고 그의 병태생리가 여전히 상당 부분 알려지지 않은 신경퇴행성 질환이다. 이 질환의 특징적인 신경퇴행성 과정을 멈추거나 늦추기 위해 지난 10년 동안 여러 약물과 치료법이 설계되고 개발되어 왔다. 그러나, 3상 인간 임상 시험을 성공적으로 완료한 치료법은 아직 알려져 있지 않다. 대부분의 치료법은 항아밀로이드/타우 치료법의 임상 시험이 거의 완전히 실패했기 때문에 현재 문제가 되고 있는 아밀로이드 캐스케이드의 가설에서 영감을 받아왔다.
다른 한편으로, 다양한 유형의 경화증 및 기타 신경퇴행성 과정은 "탈수초화"와 관련이 있으며, 그 최종 결과는 신경 축삭의 덮개에 있는 지질의 손실이며, 결과적으로 전기 신호의 전파 과정에 변화가 있음을 의미한다. 미엘린은 많은 뉴런의 축삭을 둘러싸고 있는 지질층으로, 신경교 세포(각각 말초 및 중앙 수준에서 슈반 세포 및 희돌기아교세포) 원형질막의 나선형 접힘에 의해 형성된다. 이러한 모든 이유로, 지질은 신경퇴행성 질환의 발병에 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다. 또한, 천연 다중불포화 지방산은 신경퇴행성 과정의 발생에 적당한 예방 효과가 있는 것으로 확인되었다. 실제로, 중추신경계에서 가장 풍부한 지질은 알츠하이머병과 같은 많은 신경퇴행성 과정에서 그 풍부함이 변경되는 도코사헥사엔산(DHA)이다.
또한, 대사성 질환은 비만, 과체중, 고콜레스테롤혈증, 고중성지방혈증, 당뇨병 및 인슐린 저항성으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하다. 대사성 질환은 특정 분자의 축적 또는 결핍을 특징으로 하는 일련의 병리를 형성한다. 대표적인 예는 포도당, 콜레스테롤 및/또는 중성지방이 정상 수준 이상으로 축적되는 것이다. 전신 수준(예: 혈장 수준 증가) 및 세포 수준(예: 세포막) 모두에서 포도당, 콜레스테롤 및/또는 트리글리세리드 수준의 증가는 다양한 수준에서 기능장애를 유발하는 세포 신호의 변경과 관련이 있고, 일반적으로 특정 효소의 활성이나 그러한 단백질의 조절에 오류가 있기 때문에 발생한다. 가장 중요한 대사 장애로는 고콜레스테롤혈증(높은 콜레스테롤 수치) 및 고중성지방혈증(높은 트리글리세라이드 수치)이 있다. 이러한 질환은 발병률, 이환율 및 사망률이 높기 때문에 이의 치료는 주요 관심사이다. 다른 중요한 대사 장애는 포도당 수준 조절 문제를 특징으로 하는 당뇨병 및 인슐린 저항성이다. 이러한 대사 병리는 암, 고혈압, 비만, 동맥 경화 등과 같은 다른 병리학적 과정의 발생에 관여한다. 위에서 설명한 대사 병리와 관련된 또 다른 병리학적 과정이 확인되어 왔으며 이는 그 자체로, 대사 증후군인 새로운 대사 병리를 구성할 수 있다.
본 발명의 목적상, 신생물은 세포가 적절한 시간에 파괴되어야 하는 것보다 더 많이 증식하거나 파괴되지 않을 때 나타나는 비정상적인 조직 덩어리로 정의된다. 신생물은 양성(비암성) 또는 악성(암성)이다. "신생물"이라는 용어는 "종양"과 동일하다. 예를 들어, 구강암 및 인두암, 기타 소화기관암, 기타 호흡기암, 뼈 및 관절연골암, 흑색종 및 기타 악성 피부종양, 중피 및 연조직의 암, 생식기의 암, 요로의 암, 눈의 암, 뇌 및 신경계의 기타 영역, 갑상선 및 기타 내분비선의 암, 신경내분비 악성종양, 림프구암, 조혈 및 관련 조직, 상피내 암종, 양성 종양, 불확실한 행동의 신생물, 진성 적혈구증가증 및 골수이형성 증후군, 기타 위치의 신생물 및 불특정 거동의 신생물을 비롯한 여러 유형의 암이 있다.
세포막의 지질 변형은 여러 유형의 암을 예방하거나 치료하기 위한 전략으로 사용될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 암은 하기의 것들로 이루어진 군으로부터 선택된다: 결장암, 췌장암, 담관암, 신경모세포종, 결장암, 위암, 간암, 교모세포종, 비호지킨 림프종, 신장암, 식도암, 위암, 자궁경부암 또는 림프종 종양, 결장직장암, 결장직장선암, 전립선암, 전립선선암, 전립선암, 유방암, 유방암, 유방선암, 삼중음성유방암, 뇌암, 뇌선암, 뇌신경모세포종, 폐암, 폐선암, 폐암, 소세포폐암, 대세포폐암, 난소암, 난소암, 난소선암, 자궁암, 위식도암, 신세포암, 투명세포신세포암, 자궁내막암, 자궁내막암, 자궁내막기질육종, 자궁경부암, 갑상선암, 전이성 갑상선 유두암, 여포성 갑상선암, 방광암, 요로 방광암, 방광의 이행세포암, 간암, 전이성 간암, 췌장암, 신경내분비암, 편평세포암, 골육종, 횡문근육종, 배아암, 교모세포종, 신경교종, 신경모세포종, 수모세포종, 망막모세포종, 신모세포종, 간모세포종, 흑색종, 백혈병혈액 악성종양, 림프종 및 골수종.
바람직하게는, 암은 폐암, 뇌암, 신경교종, 교모세포종, 유방암, 백혈병, 간암, 자궁내막암 및 췌장암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 암은 폐암, 뇌암, 유방암, 백혈병, 간암 및 췌장암으로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 목적상, 심혈관 질환은 심장 및 혈관의 질환 또는 장애의 세트로 정의된다. 이러한 심혈관 질환은 하기의 것들로 이루어진 군에서 선택된다: 뇌허혈발작, 급성류마티스열, 만성심장질환, 고혈압성 질환, 허혈성심장질환, 심낭염, 심내막염, 판막질환, 심근병증, 빈맥, 심부전, 아밀로이드 혈관병증, 뇌혈관 질환 및 장애, 뇌출혈 후유증, 뇌경색 후유증, 뇌혈관 질환 후유증, 동맥 및 모세혈관 질환; 정맥, 혈관 및 림프절의 질환.
용어 "피부 및 피하 조직의 병리"는 본 발명의 목적상, 수포성 장애, 피부염, 습진, 구진편평 장애, 피부 부속기의 장애, 수술 후 합병증, 두드러기 및 홍반과 같은 진피 조직의 병리를 의미한다.
염증 과정은 염증의 존재를 특징으로 하는 광범위한 병리를 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 염증 과정은 심혈관 염증; 종양으로 인한 염증; 류마티스 기원의 염증; 호흡기 염증; 급성 및 만성 염증; 염증성 통각과민; 및 외상 또는 화상으로 인한 부종 및 염증으로 이루어진 군에서 선택된다.
소화 병리라는 용어는 본 발명의 목적상, 구강 및 타액선의 질환; 식도, 위 및 십이지장의 질환; 맹장의 질환; 비감염성 장염 및 대장염; 복막 및 후복막의 질환; 간 질환; 담낭, 담관 및 췌장의 질환을 의미한다.
본 발명의 목적상, 근골격 및 결합 조직 질환은 자가면역 기원을 갖거나 갖지 않을 수 있는 근육, 관절 및 뼈의 병리를 의미한다. 상기 근골격 및 결합 조직 질환은 관절병증, 결합 조직 장애, 근육 및 연조직 장애; 활액막 및 건막 장애; 골병증 및 연골병증으로 이루어진 군에서 선택된다.
비뇨생식기 병리라는 용어는 본 발명의 목적상, 사구체 질환; 세뇨관-간질성 신장 질환; 급성 신부전; 만성 신장 질환; 결석; 및 신관의 염증성 및 비염증성 장애를 의미한다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 (I)의 화합물, 또는 이의 기능식품적으로(nutraceutically) 허용되는 염, 또는 이의 에스테르, 및 하기 화학식 (II)의 화합물, 또는 이의 기능식품적으로 허용되는 염 또는 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제1 화합물 및 적어도 하나의 기능식품적으로 허용되는 부형제를 포함하고 하기 화학식 (I)의 제2 화합물, 또는 이의 기능식품적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 선택적으로 포함하는 건강 기능성 식품 조성물에 관한 것이다:
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
상기 식에서, a는 1과 14 사이의 정수이고; b는 1과 7 사이의 정수이고; c는 0과 14 사이의 정수이고; m은 0과 (b-1) 사이의 정수이고; a+3b+c+3은 짝수 정수이다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 (I)의 기능식품적으로 허용되는 염 또는 에스테르, 및 하기 화학식 (II)의 화합물의 건강식품적으로 허용되는 염 또는 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제1 화합물 및 적어도 하나의 기능식품적으로 허용되는 부형제를 포함하고 하기 화학식 (I)의 화합물의 기능식품적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 선택적으로 포함하는 건강 기능성 식품 조성물에 관한 것이다:
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
상기 식에서, a는 1과 14 사이의 정수이고; b는 1과 7 사이의 정수이고; c는 0과 14 사이의 정수이고; m은 0과 (b-1) 사이의 정수이고; a+3b+c+3은 짝수 정수이다.
또한, 본 발명은 질환 또는 병리의 예방에서 사용하기 위한 전술한 바와 같은 화학식 (I) 및 화학식 (II)의 화합물, 또는 이의 기능식품적으로 허용되는 염 또는 에스테르로부터 선택된 적어도 하나의 제1 화합물을 포함하고 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 기능식품적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 선택적으로 포함하는 건강 기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 질환 또는 병리를 치료하는 방법으로서, 전술한 바와 같은 화학식 (I) 및 화학식 (II)의 화합물, 또는 이의 기능식품적으로 허용되는 염 또는 에스테르로부터 선택된 적어도 하나의 제1 화합물을 포함하고 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 기능식품적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 선택적으로 포함하는 건강 기능성 식품 조성물을 대상체에게 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 상기 질환 또는 병리는 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 암, 신생물, 염증성 질환, 심혈관 질환, 피부 및 피하 조직 병리, 대사성 병리, 신경병성 통증, 마비, 수면 장애, 소화기 병리, 근골격 및 결합 조직 질환, 비뇨생식기 병리, 및 대사성 질환으로 이루어진 군에서 선택된다.
바람직하게는 m =0이고, 하기 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 화합물, 이를 포함하는 약학적 및 건강 기능성 식품 조성물, 이의 제1 및 제2 의학적 용도, 신경재생을 유도하고/하거나 신경변성을 예방하는 방법, 또는 질환 또는 병리를 예방 및/또는 치료하는 방법뿐만 아니라 치료의 효능을 측정하는 용도 및 시험관내 방법에 관한 구현예를 포함한, 본 발명의 개시된 구현예 각각은 하기 화학식(II)의 화합물, 또는 이의 약학적 또는 기능식품적으로 허용되는 염 또는 에스테르, 및 하기 화학식(III)의 화합물, 또는 이의 약학적 또는 기능식품적으로 허용되는 염 또는 에스테르로 이루어진 군에서 선택된 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00044
Figure pct00045
상기 식에서, a는 1과 14 사이의 정수이고; b는 1과 7 사이의 정수이고; c는 0, 3 또는 6이고; a+3b+c+3은 짝수 정수이다.
또한 바람직하게는 m =0이고, 하기 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 화합물, 이를 포함하는 약학적 및 건강 기능성 식품 조성물, 이의 제1 및 제2 의학적 용도, 신경재생을 유도하고/하거나 신경변성을 예방하는 방법, 또는 질환 또는 병리를 예방 및/또는 치료하는 방법뿐만 아니라 치료의 효능을 측정하는 용도 및 시험관내 방법에 관한 구현예를 포함한, 본 발명의 개시된 구현예 각각은 하기 화학식(II)의 화합물의 약학적 또는 기능식품적으로 허용되는 염 또는 에스테르, 또는 하기 화학식(III)의 화합물의 약학적 또는 기능식품적으로 허용되는 염 또는 에스테르에 관한 것이다:
Figure pct00046
Figure pct00047
상기 화학식에서, a는 1과 14 사이의 정수이고; b는 1과 7 사이의 정수이고; c는 0, 3 또는 6이고; a+3b+c+3은 짝수 정수이다.
더욱 더 바람직하게는 m =0이고, 하기 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 화합물, 이를 포함하는 약학적 및 건강 기능성 식품 조성물, 이의 제1 및 제2 의학적 용도, 신경재생을 유도하고/하거나 신경변성을 예방하는 방법, 또는 질환 또는 병리를 예방 및/또는 치료하는 방법뿐만 아니라 치료의 효능을 측정하는 용도 및 시험관내 방법에 관한 구현예를 포함한, 본 발명의 개시된 구현예 각각은 하기 화학식(II)의 화합물, 또는 이의 약학적 또는 기능식품적으로 허용되는 염 또는 에스테르, 및 하기 화학식(III)의 화합물, 또는 이의 약학적 또는 기능식품적으로 허용되는 염 또는 에스테르로 이루어진 군에서 선택된 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00048
상기 식에서, a =6, b =1 및 c =6이거나; 또는 a =6, b =2 및 c =3이거나; 또는 a =6, b =3 및 c =0이거나; 또는 a =3, b =3 및 c =3이거나; 또는 a =2, b =4 and c =3 이가거나; 또는 a =2, b =5 및 c =0이고;
Figure pct00049
상기 식에서, a =1, b =6 및 c =0이다.
또한 더욱 바람직하게는 m =0이고, 하기 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 화합물, 이를 포함하는 약학적 및 건강 기능성 식품 조성물, 이의 제1 및 제2 의학적 용도, 신경재생을 유도하고/하거나 신경변성을 예방하는 방법, 또는 질환 또는 병리를 예방 및/또는 치료하는 방법뿐만 아니라 치료의 효능을 측정하는 용도 및 시험관내 방법에 관한 구현예를 포함한, 본 발명의 개시된 구현예 각각은 하기 화학식(II)의 화합물의 약학적 또는 기능식품적으로 허용되는 염 또는 에스테르, 및 하기 화학식(III)의 화합물의 약학적 또는 기능식품학적으로 허용되는 염 또는 에스테르로 이루어진 군에서 선택된 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00050
상기 식에서, a =6, b =1 및 c =6이거나; 또는 a =6, b =2 및 c =3이거나; 또는 a =6, b =3 및 c =0이거나; 또는 a =3, b =3 및 c =3이거나; 또는 a =2, b =4 and c =3 이가거나; 또는 a =2, b =5 및 c =0이고;
Figure pct00051
상기 식에서, a =1, b =6 및 c =0이다.
더욱 더 바람직하게는, 상기 염은 나트륨 염이고, 상기 에스테르는 에틸 에스테르이다.
본 발명의 일 구현예에서, 본원에 기재된 약학적 및 건강 기능성 식품 조성물은 화학식 (II)의 화합물 또는 화학식 (III)의 화합물과 함께 화학식 (I)의 화합물을 0.01% 내지 99.99% w/w, 바람직하게는 10% 내지 80% w/w, 또는 더욱 더 바람직하게는 20% 내지 80% w/w의 농도로 포함한다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 화학식 (II)의 화합물 또는 화학식 (III)의 화합물과 함께 화학식 (I)의 전구약물을 포함하며, 여기서 상기 조합의 비율은 0.01: 100 내지 100:0.01, 바람직하게는 1:5 내지 5:1, 가장 바람직하게는 1:2 내지 2:1의 범위이다.
추가의 측면에서, 본 발명의 약학적 또는 건강 기능성 식품 조성물은 바이알, 앰플, 분말, 캡슐, 정제, 향낭, 용액, 시럽, 연고, 크림, 에멀젼, 겔, 패치, 제어 방출 제제, 좌약, 에그 등으로 제공될 수 있다. 제형은 특히 경구, 설하, 위장, 직장, 비경구(정맥내, 동맥내, 근육내 및 피하), 호흡기, 국소(안과, 귀, 경피) 경로에 의해 투여하기에 유용하다. 투여 경로는 당업자에 의해 간단한 방식으로 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 위 환경의 낮은 pH에 의한 성분의 분해를 방지하기 위해 위-저항성 조성물의 형태일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 희석제, 항산화제, 감미제, 겔화제, 향미제, 충전제 또는 기타 비히클, 예컨대 콜로이드성 무수 실리카 및 글리세릴 모노스테아레이트와 같은 하나 이상의 추가 성분 또는 부형제를 추가로 포함한다. 상기 조성물은 캡슐, 봉투, 페이퍼 또는 기타 포장 형태일 수 있다. 약학적 조성물을 제조하기 위한 통상적인 기술을 사용하여 상기 조성물을 제조할 수 있다. 예를 들어, 상기 본원에 개시된 화합물은 담체와 혼합되거나, 담체에 의해 희석되거나, 앰플, 캡슐, 봉투, 페이퍼 또는 기타 포장 형태일 수 있는 담체 내에 봉입될 수 있다. 담체가 희석제인 경우, 이는 활성 화합물의 비히클, 부형제 또는 매질로 작용하는 고체, 반고체 또는 액체 물질일 수 있다. 적당한 희석제의 일부 예로는 물, 식염수, 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리하이드록시에톡실화 피마자유, 땅콩유, 올리브유, 유당, 테라 알바, 사카로스, 사이클로덱스트린, 아밀로스, 스테아르산마그네슘, 활석, 젤라틴, 한천, 펙틴, 아카시아, 스테아르산, 셀룰로오스 알킬 에테르 , 규산, 지방산, 지방산 아민, 지방산 모노글리세리드 및 디글리세리드, 펜타에리트롤의 지방 에스테르, 폴리에틸렌, 히드록시메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리돈이 있다. 유사하게, 담체 또는 희석제는 단독으로 존재하거나 또는 왁스와 혼합된 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 당업계에 공지된 임의의 지속 방출 물질을 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 습윤제, 항산화제, 유화제 및 현탁제, 보존제, 감미제 및 향미제를 포함할 수도 있다. 본 발명의 조성물은 당업계에 널리 알려진 방법을 사용하여, 환자에게 투여한 후 본원에 개시된 화합물의 신속, 지속 또는 지연 방출을 제공하도록 제형화될 수 있다.
개시된 조성물은 고체 조성물 또는 액체 용액일 수 있다. 본 발명의 하나의 비제한적인 구현예에서, 상기 조성물은 화학식 (I)의 화합물 및/또는 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 화합물 20-80%, 희석제 20-80%, 산화방지제 0.1-20%, 감미료 0.01-10%, 겔화제 0.1-20%, 및 착향료 0.01-10%.을 포함할 수 있는 고체 조성물이다. 본 발명의 또 다른 비제한적인 구현예에서, 상기 조성물은 포함하는 화학식 (I)의 화합물 및/또는 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 화합물 20-80%, 희석제 20-80%, 산화방지제 0.1-20%, 감미료 0.01-10%, 겔화제 0.1-20%, 및 착향료 0.01-10%를 포함하는 경구 투여용 용액이다.
약제학적 조성물은 멸균되고, 필요한 경우 상기 개시된 화합물과 부정적으로 반응하지 않는 보조제, 유화제, 삼투압에 영향을 미치는 염, 완충제 및/또는 착색 물질 등과 혼합될 수 있다.
도 1a~ 도 1c. A α-산화에 의해 (6Z,9Z,12Z,15Z,18Z)-헤네이코스-6,9,12,15,18-펜타에노산(HPA)을 생성하는 2-하이드록시도코사헥사엔산(DHA-H)의 세포 대사를 설명하는 개략도. DHA-H는 ATP(아데노신 삼인산)와 마그네슘(Mg2+)에 의존하는 과정에서 Acyl-CoA 합성효소에 의한 활성화를 필요로 한다. DHA-H-CoA는 2-히드록시피타노일-CoA 리아제(2-하이드록시아실-CoA 리아제 1, HACL1)의 활성에 영향을 받아 5개 또는 6개의 이중 결합을 포함해야 하는 중간 다중불포화 알데하이드를 형성한다. HACL1의 활성은 티아민 피로포스페이트(TPP) 및 Mg2+에 따라 달라지며 경쟁적 길항제(예: 옥시티아민)에 의해 억제될 수 있다. 알데히드 탈수소효소는 NAD+(니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드)에 의존하는 과정에서 중간체 알데히드를 HPA로 전환시키는 역할을 한다. B. DHA-H(B1 및 B3) 및 HPA(B2 및 B4)의 세포내 수준은 세로축(nmoles/mg 단백질)에 표시되고, 24시간 동안 DHA-H 나트륨염(μM) 처리 농도(B1 및 B2), 또는 대조군(C)을 포함하여 30 μM의 일정한 농도의 DHA-H 나트륨 염(B3 및 B4)을 이용한 배양 시간(h)(B3 및 B4)은 가로축에 나타낸다. 검은색 막대는 추가 자극이 없는 세포의 결과를 나타내고, 흰색 막대는 1mM 옥시티아민 동시 처리 후 결과를 나타내고, 줄무늬 막대는 10mM 옥시티아민 처리 후 결과를 나타낸다. DHA-H와 HPA는 모두 농도와 배양 시간에 따라 증가했으며, HPA 수준은 24시간부터 DHA-H 나트륨 염의 30μM 노출에서 DHA-H보다 훨씬 더 높았다. HPA의 이러한 증가는 10mM 옥시티아민(HCLA1 효소를 억제함)의 존재하에서 억제되어, 이 대사 전환에 산화가 관여함을 보여준다. 막대는 평균±표준오차를 나타내며, 통계분석은 일원분산분석(one-way ANOVA)과 Tukey 다중평가시험을 이용하여 수행하였다: *p < 0.05: 동일한 조건에서 HPA 수준과 DHA-H 수준을 비교할 때; # p<0.05: 10mM 옥시티아민의 존재 및 부재하에서의 값을 비교할 때. C. HEK293T에서 DHA(도코사헥사엔산의 비하이드록시 천연 형태)의 내인성 수준은 DHA-H 나트륨 염으로 처리한 후에도 변경되지 않는다. DHA의 세포내 수준은 세로축(nmoles/mg 단백질)에 표시되며, 24시간동안 DHA-H 나트륨염 처리 농도(μM), 또는 무처리 대조군(C)을 포함하여 30 μM의 일정 농도의 DHA-H 나트륨을 이용한 배양 시간(h)(C2)은 가로축에 표시된다. DHA-H 나트륨염 처리는 농도 또는 배양 시간에 따라 DHA 수준에 어떠한 유의미한 영향을 미치지 않았다. 막대는 평균±표준오차를 나타내며, 통계분석은 단방향 ANOVA 및 Tukey 다중평가시험으로 수행하였다. 이러한 결과로부터 DHA-H 또는 이 경우의 나트륨염의 투여가 DHA(docosahexaenoic acid) 또는 연구된 다른 세포 지방산의 내인성 수준을 변경하지 않았지만, DHA-H 처리는 HPA 수치의 독점적인 증가를 초래하고, 따라서 DHA-H, 특히 나트륨염 처리를 통해 얻은 치료 효과는 내인성 기원의 다른 지방산 수준의 조절이 아니라 HPA에 의해 매개된다는 것을 알 수 있다.
도 2a~ 도 2b. A. DHA-H 나트륨염으로 처리된 마우스는 HPA의 용량 의존적 뇌 축적을 나타내며 DHA-H는 뇌에서 검출될 수 없다. DHA-H의 나트륨염(A1) 및 DHA의 나트륨염(A2)의 처리 용량(mg/kg)에 대한 HPA(A1) 또는 DHA(A2)의 뇌 수준(nmoles/단백질 mg)은 세로축에 표시된다.A1: ● 동물 야생형; O 5xFAD. A2: 검은색 막대는 WT 동물을 나타내고 흰색 막대는 5xFAD를 나타낸다. HPA 및 DHA의 수준은 DHA-H 나트륨 염의 만성 투여 후 WT 및 5xFAD 마우스의 뇌에서 측정되었다(4개월, 월-금 5회 용량, 생후 3개월에서 7개월 사이, 7개월째 희생). HPA는 투여된 DHA-H 나트륨 염의 투여량에 따라 유사하게 두 마우스 계통의 뇌에 축적된다(A1: ● r2= 0.9292, p= 0.0002; ○ r2= 0.9704, p<0.0001). DHA 수준은 실험 조건(A2) 간에 크게 다르지 않았다. 데이터는 평균 ± 표준 오차로 표시되며 통계 분석은 일원 ANOVA 및 Tukey 다중 평가 테스트에 의해 수행되었다. * p< 0.05: 대조군(비히클로 처리된 마우스)과 비교하여. 따라서, 전구약물 DHA-H, 특히 이의 나트륨염을 건강한 마우스와 알츠하이머병의 유전자 변형 모델에 투여하면 전구약물(DHA-H)의 검출되지 않을 뿐만 아니라 DHA의 내인성 수준의 변화도 검출되지 않고 뇌 수준에서 HPA의 상당한 축적이 발생한다. B. DHA-H 나트륨 염으로 처리된 5xFAD 마우스는 뇌 HPA 수준과 직접적인 상관관계가 있는 인지 개선을 나타낸다. 커밋된(committed) 전체 오류(B1), 기준 기억 오류(RME)(B2) 또는 작업 기억 오류(WME)(B3)의 수는 HPA의 뇌 수준(nmol/mg 단백질)(가로축)에 대해 세로축에 표시된다. 인지 평가는 도 2A에 도시된 동일한 동물의 치료 마지막 달 동안 8-암 방사형 미로를 테스트함으로써 수행되었다. 전체 연구 동물 집단의 개별 실험 포인트를 플로팅하고 5xFAD 동물의 데이터를 역다항식 회귀 f(x)=y0+(a/x)로 조정했다. 각 매개변수의 회귀에 해당하는 r2 및 p의 값은 다음과 같다. 총 오류, RME 및 WME 대 HPA의 뇌 농도: C1: r2=0.9146 및 p=0.0311; C2: r2=0.9252 및 p=0.0243; C3: r2=0.7785 및 p=0.0346. 얻은 데이터는 HPA의 뇌 수준의 최소 증가가 공간 인지의 개선과 관련이 있음을 시사한다. 그래프의 각 점은 각 병리/치료 조건에 대한 평균 ± 표준 오차를 나타낸다. ● WT + 비히클, ▼ WT + DHA-H 20 mg/kg; ◆ WT + DHA-H 200 mg/kg; ○ 5xFAD + 비히클; △ 5xFAD + DHA-H 5mg/kg; ▽ 5xFAD + DHA-H 20mg/kg; □ 5xFAD + DHA-H 50 mg/kg; ◇ 5xFAD + DHA-H 200mg/kg. 이러한 결과는 뇌 HPA 수준의 적당한 증가가 알츠하이머병에서 가장 영향을 받는 인지 능력 중 하나인 공간 인지의 개선과 유의하게 관련되어 있음을 보여준다.
도 3. A. DHA-H의 나트륨 염으로 처리된 마우스는 U118 세포 이종이식 종양에서 검출할 수 없는 DHA-H인 HPA의 종양 축적을 나타낸다. 종양에서 DHA(검은색 막대) 및 HPA(흰색 막대)(pmoles/조직 mg)의 수준은 세로축에 표시되고, 가로축에는 처리 조건(비히클 및 DHA-H 200mg/kg)이 표시된다. 3개월령의 NUDE(면역 억제) 마우스에 7.5.106 U118 세포(등급 IV 인간 다형 교모세포종)를 피하 주사했다. 경구 치료(비히클 또는 DHA-H 나트륨 염 200mg/kg)를 시작하기 전에 10일 동안 피하 수준에서 종양 성장을 허용했으며, 이는 희생될 때까지 42일 동안 유지되었다. 이종이식(xenographic) 종양의 지질 분석은 DHA-H의 부재(검출할 수 없는 수준)를 나타냈다. 막대는 각 처리 조건에 대한 평균 ± 표준 오차를 나타낸다. B. 종양 HPA 수준은 이종이식 모델에서 종양 크기와 반비례한다. 세로축에는 종양의 크기(cm3)가 표시되고, 가로축에는 두 가지 치료 조건에 대해 종양의 HPA 수준(pmoles/조직 mg)이 표시된다: ○ 비히클 및 나트륨; ● DHA-H 염 200 mg/kg. DHA-H 나트륨 염으로 치료 중인 동물의 종양에서 HPA의 존재는 종양 부피(A2)와 통계적으로 유의한 선형 관계를 가지며, 여기서 r2= 0.4296 및 p= 0.0029이다. 결과는 이종이식 종양에서 HPA 수준이 종양 크기와 통계적으로 유의한 역 선형 관계를 갖는다는 것을 보여주었다. 표적 기관에 DHA-H 모 분자가 없는 경우, 이러한 증거는 표적 기관에 HPA가 존재하면 생체 내 치료 효과가 있음을 보여준다.
도 4. A. DHA-H는 U118 세포에서 α-산화에 의해 HPA로 대사적으로 전환되는 전구약물이다. DHA(검은색 막대), DHA-H(흰색 막대) 및 HPA(줄무늬 막대)의 세포내 수준은 처리 조건에 따라 세로축(nmoles/단백질 mg)에 표시된다. 대조군(C) 및 옥시티아민 1 및 10mM 동시 처리의 유무에 따른 DHA-H 150μM(48시간)의 나트륨 염은 가로축에 표시된다. DHA-H와 HPA는 모두 DHA-H의 나트륨염으로 처리된 세포에서 증가했다. HPA의 이러한 증가는 1mM 및 10mM 옥시티아민의 존재하에서 억제되고, 이는 이러한 대사 전환에 α-산화가 관여함을 보여준다. 막대는 평균±표준오차를 나타내며, 통계분석은 일원분산분석(one-way ANOVA)과 Tukey 다중평가 검정을 이용하여 수행하였다. * HPA 수준만 비교할 때 p < 0.05. B. 항종양 효과가 존재하려면 DHA-H의 HPA로의 대사 전환이 필요하다. 세포 생존율(옥시티아민이 없는 대조군 -C-의 %)은 처리 조건에 따라 세로축에 표시된다. 대조군(C-검정색 막대) 및 1mM 옥시티아민으로 동시 처리의 여부에 따른 DHA-H 150μM의 나트륨 염(48시간)(흰색 막대)는 가로축에 표시된다. U118 세포에 DHA-H를 처리하면 배양의 생존력이 크게 감소하지만 옥시티아민(단독)으로 처리하면 세포 생존력에 영향을 미치지 않는다. 그러나, DHA-H의 나트륨염 처리가 옥시티아민 처리와 동시에 수행되는 경우, 이 화합물의 항증식 효과는 옥시티아민이 없는 효과에 비해 현저히 감소한다. 막대는 평균 ± 표준 오차를 나타내며 통계 분석은 일원 분산 분석 및 Tukey 다중 평가 테스트를 사용하여 수행되었다. # 옥시티아민의 존재와 부재에서 DHA-H의 효과를 비교할 때 p < 0.05.
도 5. A. DHA-H 나트륨 염, DHA 나트륨 염 및 HPA로 처리한 후 배양물에서 U118 세포의 생존율. 세포 생존율(처리하지 않은 대조군의 %)은 세로축에 표시되고 가로축에는 다양한 처리 조건이 표시된다. 대조군(검정색 막대), DHA-H 나트륨 염(150μM, 48 시간 - 흰색 막대), DHA (150 μM, 48 시간 - 줄무늬 막대) 및 HPA(150 μM, 48 시간 - 격자 막대). 동일한 조건에서 HPA를 사용한 처리는 DHA-H(전구약물) 또는 DHA(천연 유사체)에 의해 유도된 것보다 배양물에서 훨씬 더 분명한 정도의 사망률을 유도한다. 이러한 효과는 동일한 실험 조건에서 DHA-H 또는 DHA에 기인할 수 없는 HPA의 전형적인 항증식 효과와 독성 효과의 혼합으로 인한 것일 수 있다. 막대는 평균 ± 표준 오차를 나타내며 통계 분석은 일원 분산 분석 및 Tukey 다중 평가 테스트를 사용하여 수행되었다. * 대조군과 비교하여 p < 0.05. B. DHA-H 및 HPA의 나트륨 염으로 처리된 배양물의 U118 세포에서 HPA의 세포내 수준. HPA 수준(nmoles/단백질 mg)은 세로축에 표시되고 하기의 처리 조건은 가로축에 표시된다: DHA-H의 나트륨염(150μM, 48시간 - 검은색 막대) 및 HPA(5-150μM, 48시간 - 흰색 막대). 150μM의 DHA-H 나트륨 염을 투여하면 5μM에서 HPA 처리 자체에 의해 생성된 것과 동일한 HPA 수준이 생성된다. 150 μM HPA로 처리하면 동일한 농도의 전구약물 투여에 의해 생성된 것보다 훨씬 더 높은 세포내 HPA 수준이 생성된다. 막대는 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
C. 배양 배지의 존재(C1) 또는 부재(C2)에서 HEK293T 세포의 DHA-H 및 DHA 수준. 배양 배지에서 DHA-H(●) 및 DHA(○)의 수준(시간 0에서 초기 수준의 %)은 세로축에 표시되고 배양 시간(h)은 가로축에 표시된다. 배양 배지의 지질 농도는 30 μM이고 배양 플레이트는 최대 72시간 동안 배양되었다. 세포 배양(C1)의 존재하에, 배지의 DHA 수준은 세포에 의한 DHA 흡수의 결과로 48시간 및 72시간에 유의하게 감소한 반면, DHA-H 수준은 72시간까지 변하지 않은 채로 유지되었다. 세포 배양이 없는 경우(C2), DHA와 DHA-H의 수준은 시간이 지남에 따라 일정하게 유지되었다. 막대는 평균 ± 표준 오차를 나타내며 통계 분석은 일원 분산 분석 및 Tukey 다중 평가 테스트를 사용하여 수행되었다. * 대조군과 비교하여 p < 0.05.
도 6. A, B 및 C: HPA 산 또는 이의 전구약물인 DHA-H를 사용한 만성 치료는 쥐 형질전환 모델(5xFAD)에서 알츠하이머병의 전형적인 인지 기능 저하를 예방한다. 인지 평가는 8-암 Radial Labyrinth 테스트에 의해 수행되었다. 동물은 3개월에서 7개월 사이에 치료를 받았고 테스트는 치료 마지막 달에 수행되었다. 이 테스트 동안 테스트 중 발생한 총 오류(A), 참조 메모리 오류(RME)(B) 및 작업 메모리 오류(WME)(C)가 고려되었다. 각 열(column)은 방사형 미로 테스트의 마지막 주 동안 오류의 평균 ± SEM을 나타낸다. 검은색 열은 WT 마우스가 만든 오류를 나타낸다. 빈(blank) 열은 비히클(5% 에탄올)로 처리된 5xFAD 형질전환 마우스가 만든 오류를 나타낸다. 줄무늬 열은 DHA-H(20mg/kg/일)로 처리된 5xFAD 마우스가 만든 오류를 나타낸다. 상자로 표시된 열은 HPA(20mg/kg/일)로 처리된 5xFAD 마우스가 만든 오류를 나타낸다. 결과는 유사한 방식으로 DHA-H 및 HPA로 처리된 5xFAD 마우스의 인지 개선을 보여준다. 막대는 각 처리 조건에 대한 평균 ± 표준 오차를 나타내며 통계 분석은 단방향 ANOVA 및 Tukey 다중 평가 테스트에 의해 수행되었다. * 건강한 대조군(WT)과 비교할 때 p < 0.05, 및 # 5xFAD 대조군 조건(비히클로 처리됨)과 비교할 때 # p < 0.05.
도 7. A: 이종이식 모델에서 HPA 나트륨 염 또는 이의 전구약물인 DHA-H로 처리하면 종양 성장이 생체 내에서 억제된다. 세로축은 종양의 크기(cm3)를, 가로축은 치료 경과일을 나타낸다. 3개월령의 NUDE(면역억제) 마우스에서 이종이식 종양을 유도하기 위해 7.5.106 인간 등급 IV(U-118 MG) 교모세포종 세포를 동물의 등 옆구리 양쪽에 피하 접종했다(8-12주령, 30-35g). 10일 후, 종양은 대략 0.1 cm3의 부피로 가시화되었다. 동물을 유사한 평균 종양 부피를 가진 그룹으로 무작위로 나누고 42일 동안 매일 경구 치료를 받았다: ○ 비히클(미처리 대조군), DHA-H ▲(200 mg/kg/일) 및 ■ HPA(200 mg/kg/일) ). 종양 부피(v)는 ν = A2 × L/2로 계산되었으며, 여기서 A는 종양의 너비이고 L은 길이이다. 각 처리 조건에 대해 얻은 데이터는 지수 성장 곡선으로 조정되었다. B: HPA 및 전구약물인 DHA-H는 무처리 대조군과 비교하여 이종이식 종양의 부피를 상당히 감소시킨다. 세로축은 치료 시작 후 42일에 유도된 종양의 부피를, 가로축은 치료 조건을 나타낸다. 연구에 참여하는 동물의 개별 데이터가 표시된다. ○ 담체(무처리 대조군), DHA-H ▲(200mg/kg/일) 및 ■ HPA(200mg/kg/일). 막대는 각 처리 조건에 대한 평균 ± 표준 오차를 나타내며 통계 분석은 단방향 ANOVA 및 Tukey 다중 평가 테스트로 수행되었다. * 대조군 조건과 비교하여 p < 0.05.
도 8a~ 도8c. 2-히드록실화 다중불포화 지방산(전구약물, PUFA-H)의 세포 대사에 대한 예시적인 체계는 α-산화를 통해 상응하는 비히드록실화 대사산물을 생성하며, 후자는 초기 분자보다 1개의 탄소 원자가 적다. 히드록실화 지방산은 ATP(아데노신 삼인산) 및 마그네슘(Mg2+)에 의존하는 과정에서 Acyl-CoA 합성효소에 의한 활성화를 필요로 한다. 이 PUFA-H-CoA는 2-히드록시아실-CoA 리아제(HACL, 세포 유형에 따라 이소형 1 또는 2)의 활성에 영향을 받아 중간체 다중불포화 알데히드를 형성한다. HACL의 활성은 티아민 피로포스페이트(TPP) 및 Mg2+에 따라 달라지며 옥시티아민과 같은 경쟁적 길항제에 의해 억제될 수 있다. 알데히드 탈수소효소는 NAD+(니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드)에 의존하는 과정에서 중간체 알데히드를 최종 지방산으로 전환시키는 역할을 한다. A. (8Z,11Z)-헵타데카-8,11-디에노이산(HDA)을 생성하는 2-하이드록시-리놀레산(LA-H)의 세포 전환의 체계. B. 2-히드록시-알파(α)-리놀렌산(ALA-H)의 (8Z,11Z,14Z)-헵타데카-8,11,14-트리엔산(HTA ω-3)으로의 세포 전환의 체계. C. (5Z,8Z,11Z)-헵타데카-5,8,11-트리에노산(HTA ω-6)을 생성하는 2-히드록시-감마(γ)-리놀렌산(GLA-H)의 세포 전환의 체계. D. (4Z,7Z,10Z,13Z)-노나데카-4,7,10,13-테트라에노이산(NTA)을 생성하는 2-히드록시-아라키돈산(ARA-H)의 세포 전환의 체계. E. (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z)-노나데카-4,7,10,13,16-펜타에노이산(NPA)을 생성하는 2-히드록시-에이코사펜타엔산(EPA-H)의 세포 전환의 체계. F. (6Z,9Z,12Z,15Z,18Z)-헤네이코사-6,9,12,15,18-펜타에노산(HPA)을 생성하는 2-히드록시도코사헥사엔산(DHA-H)의 세포 전환의 체계.
도 9. HEK293T 세포를 해당 전구약물로 처리하여 화염 이온화 검출기(GC-FID)를 사용한 가스 크로마토그래피로 얻은 다양한 크로마토그램의 증폭된 영역: A. (1) 대조군(비히클) 및 (2) LA-H(100 μM, 24시간). 흰색 화살표는 LA-H 모분자의 크로마토그래피 피크를 나타내고, 검은색 화살표는 HDA 대사산물에 해당하는 크로마토그래피 피크를 나타낸다. HDA의 형성은 10mM 옥시아민의 존재에서 억제된다. B. 대조군(비히클) 및 (2) ALA-H(100 μM, 24시간). 흰색 화살표는 ALA-H 모분자의 크로마토그래피 피크를 나타내고, 검은색 화살표는 대사산물 HTA ω-3에 해당하는 크로마토그래피 피크를 나타낸다. ω-3 HTA의 형성은 10mM 옥시티아민의 존재하에서 억제된다. C. (1) 대조군(비히클) 및 (2) GLA-H(100μM, 24시간). 흰색 화살표는 모분자 GLA-H의 크로마토그래피 피크를 나타내고, 검은색 화살표는 대사산물 HTA ω-6에 해당하는 크로마토그래피 피크를 나타낸다. ω-6 HTA의 형성은 10mM 옥시티아민의 존재하에서 억제된다. D. (1) 대조군(비히클) 및 (2) ARA-H(100μM, 24시간). 흰색 화살표는 ARA-H 모분자의 크로마토그래피 피크를 나타내고, 검은색 화살표는 NTA 대사산물에 해당하는 크로마토그래피 피크를 나타낸다. NTA의 형성은 10mM 옥시티아민의 존재하에서 억제된다. E. 대조군(비히클) 및 (2) EPA-H(100μM, 24시간). 흰색 화살표는 EPA-H 모분자의 크로마토그래피 피크를 나타내고, 검은색 화살표는 NPA 대사산물에 해당하는 크로마토그래피 피크를 나타낸다. NPA 형성은 10mM 옥시아민의 존재하에서 억제된다. F. 대조군(비히클) 및 (2) DHA-H(100μM, 24시간). 흰색 화살표는 HPA 모분자의 크로마토그래피 피크를 나타내고, 검은색 화살표는 HPA 대사산물에 해당하는 크로마토그래피 피크를 나타낸다. HPA의 형성은 10mM 옥시티아민의 존재하에서 억제된다.
도 10. HPA 및 기타 홀수 사슬 다중불포화 지방산으로 치료하면 흥분독성으로 인한 신경 세포 사멸을 예방한다. 신경 세포 배양물은 레티노산 및 BDNF(Brain Derived Neurotrophic Factor)에 의해 인간 SH-SY5Y 신경모세포종으로부터 분화시켜 얻었다. 1시간 동안 배양 배지에 NMDA(10mM) 및 칼슘/글리신(530μM/10mM)을 첨가하여 흥분독성에 의한 신경세포 사멸을 유도하였다. 다양한 연구 화합물(HDA 또는 C17:2 ω-6, HTA ω-3 또는 C17:3 ω-3, HTA ω-6 또는 C17:3 ω-6, NTA 또는 C19:4 ω-6 및 HPA 또는 C21:5 ω-3))의 신경보호 효과를 테스트하기 위해, 비히클(검정색 막대), 1μM(흰색 막대), 3μM(점선 막대) 및 10μM(줄무늬 막대)로 24시간 동안 전처리를 수행했다. 이러한 실험 조건에서 테스트된 처리는 이러한 화합물이 3 μM 농도에서 흥분독성으로 인한 사망을 예방할 수 있음을 보여주었다. 막대는 각 처리 조건에 대한 평균 ± 표준 오차를 나타내며 통계 분석은 단방향 ANOVA 및 Tukey 다중 평가 테스트에 의해 수행되었다. * 대조 조건(비히클 전처리)과 비교할 때 p < 0.05.
도 11. α-산화에 의해 8Z-헵타데센산(C17:1n9)을 생성하는 2-OHOA(LAM561) 세포 대사의 예시적인 체계. 2-OHOA는 ATP(아데노신 삼인산)와 마그네슘(Mg2+)에 의존하는 과정에서 Acyl-CoA 리가아제에 의한 활성화를 필요로 한다. 2OHOA-CoA는 2-히드록시피타노일-CoA 분해효소(2-하이드록시아실-CoA 리아제 1, HACL1)의 활성에 영향을 받아 중간체인 단일불포화 알데히드를 형성한다. HACL1의 활성은 티아민 피로포스페이트(TPP) 및 Mg2+에 따라 달라지며 경쟁적 길항제(예: 옥시티아민)에 의해 억제될 수 있다. 알데히드 탈수소효소는 NAD+(니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드)에 의존하는 과정에서 중간체 알데히드를 8Z-헵타데센산으로 전환시키는 역할을 한다.
도 12. U-118 MG 신경교종 세포의 지방산 조성의 분석. (A) 가스 크로마토그래피에 의해 결정된, 400 μM 2OHOA 나트륨 염의 존재 또는 처리의 부재(대조군)하에서 24시간 동안 배양된 U-118 MG 세포의 지방산 조성을 보여주는 대표적인 크로마토그램. 머무름 시간(분): C17:1n-9(10.12), OA(13.01), 2OHOA(16.87) 및 내부 대조군으로서 C17:0 마가르산(10.81). (B) 크로마토그램에서 확인된 다양한 지방산의 정량화(OA, 2OHOA 및 C17:1n-9). 검은색 막대는 대조군의 각 지방산 농도에 해당하고 흰색 막대는 2OHOA 나트륨염 처리 후 지방산 농도에 해당한다. 열은 nmole로 표현되고 단백질 mg당 정규화된 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SEM을 보여준다. 통계적 유의성은 스튜던트 t 테스트로 결정된다(***p<0.001: 대조군과 비교하여).
도 13a~ 도 13d. 2OHOA 나트륨염 처리 후 다양한 신경교종 및 비종양 세포주에서 지방산 조성의 분석. 신경교종 세포의 크로마토그램(C17:0, OA, 2OHOA 및 C17:1n-9)(오른쪽)에서 확인된 지방산의 조성(왼쪽)과 다양한 지방산의 정량을 보여주는 대표적인 크로마토그램: (A) 및 (B) U-251 MG; (C) 및 (D) SF-295; 및 비종양: (E) 및 (F) MRC-5(인간 섬유아세포); (G) 및 (H) 마우스 성상교세포; 2OHOA 나트륨 염의 부재(대조군) 또는 존재(400 μM, 24시간)하에 처리 후 가스 크로마토그래피 분석에 의해 결정됨. 검은색 막대는 대조군의 각 지방산 농도에 해당하고, 흰색 막대는 2OHOA 나트륨염 처리 후 지방산 농도에 해당한다. C17:0 마가린산은 내부 대조군으로 포함된다. 열은 nmole로 표현되고 단백질 mg당 정규화된 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SEM을 보여준다. 통계적 유의성은 스튜던트 t-검정에 의해 결정된다(**p<0.01, * **p<0.001: 대조군과 비교하여).
도 14a~ 도 14c. 2OHOA 나트륨 염, OA 및 C17:1n-9 나트륨 염이 신경교종 세포의 세포 생존 및 증식에 미치는 영향. 72시간 동안 증가하는 용량의 2OHOA (0-1000 μM) 나트륨 염((A1, B1 및 C1), OA(0-300 μM)(A2, B2 및 C2); 및 C17:1n-9(0-300μM)으로 처리된 상이한 신경교종 세포주(A1-A3) U-118 MG; (B1-B3) U-251 MG; 및 (C1-C3) SF-295의 생존율 곡선. 바이올렛 결정(violet crystal) 염색에 의해 생존력을 결정하였다. 각 값은 비히클(100%)로 처리된 세포에 대한 백분율로 표시되는, 최소 3개의 생물학적 복제를 사용한 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 15a~ 도 15b. 2OHOA 나트륨 염, C17:1n-9 나트륨 염 및 OA가 비종양 세포의 세포 생존 및 증식에 미치는 영향. 72시간 동안 증가하는 용량의 2OHOA 나트륨 염(0-1000 μM)으로 처리된 (A1-A3) MRC-5(인간 섬유아세포) 및 (B1-B3) 마우스 성상세포의 비종양 세포 생존율 곡선. 바이올렛 결정 염색에 의해 생존률을 결정하였다. 각각의 값은 담체(100%)로 처리된 세포에 대한 백분율로 표시되는, 최소 3개의 생물학적 복제를 사용한 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 16a~ 도 16b. 상이한 세포주에서 증식 및 사멸의 마커에 미치는 상이한 지방산의 영향의 분석. 신경교종 세포에서 2OHOA-조절 세포 사멸 및 신호 전달 경로에 관여하는 다양한 단백질에 대한 지방산(200μM OA, 200μM C17:1n-9 나트륨 염 및 400μM 2OHOA 나트륨 염)의 영향을 나타내는 면역블롯: (A) U-118 MG; (B) U-251 MG; 및 (C) SF-295; 및 비종양: (D) MRC-5(인간 섬유아세포); 및 (E) 처리 72시간 후 마우스 성상세포.
도 17. α-산화 억제 후 U-118 MG 신경교종 세포의 지방산 조성 분석 및 U-118 MG 신경교종 세포의 세포 생존에 미치는 옥시티아민의 영향. (A) 90분간 증가하는 용량(1-10 mM)의 옥시티아민(α-산화 억제제)으로 전처리되고(pre-incubated) 24시간 동안 400μM 2OHOA로 처리된 U-118 MG 세포에서 2OHOA 및 C17:1n-9 지방산의 정량화(기체 크로마토그래피로 측정). 결과는 nmole로 표시되고 mg 단백질당 정규화된 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SEM으로 나타낸다. 통계적 유의성은 스튜던트 t 테스트로 결정된다(*p<0.05, ***p<0.001: 2OHOA의 양과 옥시티아민의 부재하에 400μM의 2OHOA 후 검출된 양과 비교하여; $$p<0.01, $$$ p<0.001: C17:1n-9의 양을 옥시티아민의 부재 하에 400μM의 2OHOA 후에 형성된 양과 비교하여). (B) 옥시티아민으로 전처리되고(90분 동안) 2OHOA 나트륨 염의 부재(대조군) 또는 존재(400μM, 72시간)하에서 처리된 U-118 MG 세포의 생존율(트리판 블루로 생체 배제 염색으로 측정됨). 결과는 3개의 독립적인 실험의 평균 세포 수 ± SEM으로 표시된다. 통계적 유의성은 스튜던트 t 테스트로 결정된다(*** p<0.001: 2OHOA 및 옥시티아민의 부재(대조군-0)와 비교하여; 및 $$p<0.01, $$$p<0.001: 옥시티아민을 이용한 전처리(pre-incubation) 없이 2OHOA로 처리한 경우와 비교하여).
도 18. 2OHOA의 작용에 미치는 대사 산물 C17:1n-9의 영향. 다양한 인간 신경교종 세포주의 생존율: (A) U-251 MG 및 (B) SF-295; 및 비-종양 세포: (C) 인간 MRC-5 섬유아세포 및 (D) 마우스 성상세포; 모두 2OHOA 나트륨 염(400μM, 72시간)의 부재 또는 존재하에 처리되고 옥시티아민으로 전처리(90분 동안)되거나 되지않았다. 세포 생존율은 트립판 블루를 사용한 생명 배제 염색(vital exclusion staining)에 의해 결정되었다. 결과는 3개의 독립적인 실험의 평균 세포 수 ± SEM으로 표시된다. 통계적 유의성은 스튜던트 t 테스트를 이용하여 결정된다 (**p<0.01 및 ***p<0.001: 2OHOA 및 옥시아민의 부재와 비교하여; 및 $p<0.05: 2OHOA 단독으로 처리와 비교하여).
도 19a~ 도 19b. 옥시티아민에 의해 그의 형성을 억제함으로써 다양한 세포주에서 증식 및 사멸의 마커에서 2OHOA의 작용에 미치는 대사 산물 C17:1n-9의 영향의 분석. 신경교종 세포에서 2OHOA-조절 세포 사멸 및 신호 전달 경로에 관여하는 다양한 단백질에 미치는 옥시티아민(2mM)과 결합되거나 결합되지 않은 2OHOA(400μM)의 영향을 나타내는 면역블롯: (A) U-118 MG; (B) U-251 MG; 및 (C) SF-295; 및 비종양: (D) MRC-5(인간 섬유아세포); 및 (E) 처리 72시간 후 마우스 성상세포.
도 20a~ 도20b. 2OHOA 나트륨염 처리 24시간 후 쥐 혈장 내의 지방산 조성의 분석. (A) 2OHOA(2mg/Kg, 24시간)로 급성 처리 후 다양한 시간(0, 1, 2, 3, 4, 6, 8 및 24시간)에서 얻은 쥐 혈장 샘플 내의 지방산의 조성을 보여주는 대표적인 크로마토그램(가스 크로마토그래피에 의해 측정됨). C17:0 마가르산은 크로마토그램에서 내부 대조군으로 정량화되었다. (B) 크로마토그램에서 확인된 2OHOA 및 C17:1n-9 지방산의 정량화. 결과는 4마리 동물의 평균 ± SEM으로 표시되며 nmole로 표시되고 혈장 ml당 정규화된다. 통계적 유의성은 Wilcoxon 테스트를 이용하여 결정된다(*p<0.05 및 **p<0.01: 0시간에서의 기준선 수준과 비교하여; $p<0.05 및 $$p<0.01: 2OHOA 지방산 수준과 비교하여).
도 21a~ 도21b. 2OHOA 나트륨염 처리 15일 후 쥐 혈장 내의 지방산 조성의 분석. (A) 2OHOA(2mg/Kg, 15일)로 만성 처리 후 다양한 시간(0, 1, 2, 3, 4, 6, 8 및 24시간)에서 얻은 쥐 혈장 샘플 내의 지방산 조성을 보여주는 대표적인 크로마토그램(가스 크로마토그래피에 의해 결정됨). C17:0 마가르산은 내부 대조군으로 정량화되었다. (B) 크로마토그램에서 확인된 2OHOA 및 C17:1n-9 지방산의 정량화. 결과는 4마리 동물의 평균 ± SEM으로 표시되며, nmole로 표시되고 혈장 ml당 정규화된다. 통계적 유의성은 Wilcoxon 테스트를 이용하여 결정된다(*p<0.05 및 **p<0.01: 0시간에서의 기준선 수준과 비교하여; $p<0.05 및 $$p<0.01: 2OHOA 지방산 수준과 비교하여).
도 22a~ 도22b. 면역억제 마우스의 이종종양의 지방산 조성 분석. (A) 2OHOA 나트륨 염(200 mg/kg, 42일)으로 매일 경구로 매일 처리된 마우스의 U-118 MG 교모세포종 세포에서 유래하는 이종이식 종양 내의 지방산 조성을 보여주는 대표적인 크로마토그램(가스 크로마토그래피에 의해 결정됨). (B) 크로마토그램에서 확인된 OA 및 C17:1n-9 지방산의 정량화. C17:0 마가르산은 내부 대조군으로 정량화되었다. 흰색 막대는 대조군 내의 각 지방산 농도에 해당하고, 검은색 막대는 2OHOA 나트륨염 처리 후 지방산의 농도에 해당한다. 결과는 적어도 7개의 이종이식 종양의 평균 ±SEM으로 표시되며 nmole로 표시되고 조직 g당 정규된다. 통계적 유의성은 Mann-Whitney 검정에 의해 결정된다(* **p<0.01: 대조군과 비교하여).
도 23. 종양 부피와 C17:1n-9 대사물의 양 사이의 역 상관관계. 200mg/kg 2OHOA의 나트륨 염(검은색 박스) 또는 이의 비히클(대조군, 흰색 원)로 처리 42일째에 측정된 종양 부피에 대한 마우스의 이종이식 종양에서 가스 크로마토그래피로 정량화된 대사 산물의 양을 나타냄. Pearson 상관 계수에 의해 결정된 유의성(p = 0.0001, r = -0.825).
도 24a ~ 도 24c. 진행성 신경교종 환자에서 지방산 조성의 분석. (A) 2OHOA 나트륨염 처리(12g/일, 21일)에 반응하는 신경교종 환자의 지방산 조성의 대표적인 크로마토그램(다양한 치료 시간(0, 4 및 360시간, 15일)에서 얻은 혈장 샘플에서 가스 크로마토그래피에 의해 결정됨). (B) 처리 첫 번째 날(0, 1, 2, 4, 6, 8시간) 및 8일(192시간), 15일(360시간), 21일(504시간) 및 두 번째 치료 주기의 첫 번째 날(574시간)에서 상이한 시간에서 얻은 혈장 샘플에서 2OHOA 반응자와 무반응자의 크로마토그램에서 확인된 2OHOA 및 C17:1n-9 지방산의 정량화. (C) 동일한 반응 환자와 무반응 환자의 크로마토그램에서 공동으로 확인된 2OHOA 및 C17:1n-9 지방산의 정량화. 크로마토그램의 C17:0 마가르산은 내부 대조군으로 정량화되었다. 결과는 8명의 환자(4명의 반응자 및 4명의 비반응자)의 평균 ± SEM으로 표시되며 nmole로 표시되고 혈장 ml당 정규화된다. 통계적 유의성은 Mann-Whitney 검정에 의해 결정된다(*p<0.05 및 **p<0.01: 2OHOA 지방산의 양과 비교하여).
실시예
하기 기재된 실시예는 단지 예시를 위한 것이며 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
실시예 1: 지방산, 시약 및 유기 용매
1.1. DHA, DHA-H 및 HPA
DHA(도코사헥사엔산의 나트륨염; C22:6 n-3), DHA-H(2-하이드록시-드로코사헥사엔산의 나트륨염; 2OH-C22:6 n-3), EPA-H(2-하이드록시-에이코사펜타엔산의 나트륨염), ARA-H(2-하이드록시-아라키돈산의 나트륨염), GLA-H(2-히드록시-감마(γ)-리놀렌산의 나트륨염), ALA-H(2-히드록시-알파(α)-리놀렌산의 나트륨염), LA-H(2-하이드록시-리놀레산), HPA((6Z,9Z,12Z,15Z,18Z)-헤네이코사-6,9,12,15,18-펜타엔산의 나트륨염), NTA((4Z,7Z,10Z,13Z)-노나데카-4,7,10,13-테트라엔산의 나트륨염), HTA ω-6((5Z,8Z,11Z)-헵타데카-5,8,11-트리엔산의 나트륨염), HTA ω-3((8Z,11Z,14Z)-헵타데카-8,11,14-트리엔산의 나트륨 염) 및 HDA((8Z,11Z)-헵타데카-8,11-디엔산)은 Lipopharma Therapeutics사(스페인)로부터 구입했다. 마가르산(C17:0)은 Sigma-Aldrich사로부터 구입했고, 헤네이코사펜탄산(HPA 유리산, C21:5 n-3) 및 (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z)-nonadeca-4,7,10,13,16-펜타엔산(NPA 유리산; C19:5 ω-3)은 Cayman Chemicals사(미국 미시간주)로부터 구입했다. D(+)-글루코스(테스트된 세포 배양물), 피루브산 나트륨, L-Gln(테스트된 세포 배양물), 아세틸 클로라이드 및 N,O-비스(트리메틸실릴) 아세트아미드, 염화나트륨, 인산나트륨, EDTA(에틸렌 디아민 테트라아세트산 ) 및 tris-base는 Sigma-Aldrich사로부터 구입했다. 대조적으로, 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 염산 및 헥산은 Scharlab사(스페인)로부터 구입했다. 헤파린(5000 unit/mL)은 Hospira Invicta S.A.사(스페인)에서 구입했고, 케타민(Anesketin 100mg/mL)은 Eurovet Animal Health BV사(네덜란드)에서 구입했고, 자일라진(Xilagesic 20mg/mL)은 Laboratorios Calier S.A.사(스페인)에서 구입했고, 옥시티아민 염산염은 Santa Cruz Biotechnology사(독일)에서 구입했다.
HPA 생산을 위해, 하기 반응식 1에 따라 (5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-에이코사-5,8,11,14,17-펜타엔산(EPA(C20:5, ω-3))로부터 화학적 합성을 수행하였다. HPA의 화학적 합성은 선행 기술(Larsen 등, 1997, Lipids 32(7), 707-714. doi: 10.1007/s11745-997-0090-4)에 개시되어 있다. 반응은 빛의 부재하에서 질소 분위기에서 수행하였다.
Figure pct00052
반응식 1
시약 및 조건: a)(COCl)2/PhH 1.5시간 실온, b)CH2N2/에테르 20분 0℃, c)AgOBz(촉매), Et3N/THF/H2O
본 발명의 HPA의 나트륨 염의 합성은CH3-CH2-(CH=CH-CH2)5-CH2CH2-인 경우 번호 5로 지정된 화합물로부터 이루어지며, 이 화합물은 HPA(C21)에 해당한다. 염은 산 염기 반응에서 얻어지고, MTBE/HCl로 액-액 추출을 수행하고, NaOMe로 pH를 조정하여 HPA의 나트륨 염을 양호한 수율로 얻는다. 출발 기질을 조정하여 HDA, HTA ω-3, HTA ω-6, NTA 및 NPA의 합성을 위한 유사한 절차를 수행할 수 있다.
1.2. OHOA, OA 및 C17:1n-9
지질 화합물 2OHOA의 나트륨 염, OA의 나트륨 염 및 C17:1n-9의 나트륨 염은 Medalchemy, SL사(스페인)에서 구입했다.
C17:1n-9의 화학적 합성은 WO1997049667호에 개시되어 있다. 25℃에서 N2 분위기에서 8Z-헵타데센(66mg, 0.26mmol, 1당량) 및 2-메틸-2-부탄(1.6mL, 15.1mmol, 58당량)의 tBuOH(6.5mL) 중 용액은, 탈이온수 중 NaClO2(80%, 208mg, 2.3mmol, 9당량) 및 NaH2PO4.H2O(250mg, 1.8mmol, 7당량)의 용액2.5mL)을 적가하여 처리한다. 반응 혼합물을 추가 15분 동안 교반한 후 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 물(30 mL)로 처리하고 수성 층을 EtOAc(3 x 30 mL)로 추출하였다. 유기층을 (Na2SO4)로 건조시키고, 여과하고, 진공하에 농축시켰다. 크로마토그래피(SiO2,2 x 13 cm, 10-20% EtOAc-헥산 구배 용리)를 통해 투명한 오일로서 27 mL(66 mg, 95%)를 얻었다. 본 발명의 C17:1n-9의 나트륨 염의 합성은 화합물 C17:1n-9로부터 이루어졌다. 그 염은 산 염기 반응하에서 얻어지고, MTBE/HCl로 액-액 추출을 수행하고, NaOMe로 pH를 조정하여 양호한 수율로 C17:1n-9의 나트륨 염을 얻는다.
실시예 2: DHA-H 및 HPA를 갖는 조성물
본 발명의 범위를 제한하지 않는 조성물의 몇몇 예는 하기에 일반적인 측면에서 설명된다.
[표 1]
국소용 제제의 예
Figure pct00053
[표 2]
경구 제형의 예
Figure pct00054
[표 3]
경구용 연질 캡슐 제형의 예
Figure pct00055
실시예 3: DHA-H 및 HPA를 사용한 세포 분석
DHA-H에서 HPA(C21:5 ω-3)로의 대사 전환 및 LA-H에서 HDA(C17:2 ω-6)로의 전환, ALA-H에서 HTA ω-3(C17 :3 ω-3), GLA-H ~ HTA ω-6(C17:3 ω-6), ARA-H ~ NTA(C19:4 ω-6), EPA-H에서 NPA(C19:5 ω-3)로의 대사전환을 확인하기 위하여, HEK293T(인간 배아 신장 세포 293T) 세포 배양물을 사용하였으며, 이는 생리학적 조건 하에서 인간 대사 연구에 널리 사용되는 배아 비종양 세포주이다.
HEK293T 세포는 10% FBS(Fetal Bovine Serum; Gibco, Thermo-Fisher), 2mM L-Gln, 25mM D(+)-글루코스, 1mM 피루브산나트륨, 및 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Dubelcco's Modified Eagle's Medium, Biowest, 프랑스)에서 배양하였다. 마우스 신경모세포종 N2a 세포는 5% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 및 Opti-Mem(Gibco, Thermo-Fisher)의 1:1(v:v) 혼합물에서 유지했다. 두 세포주 모두 37℃의 5% CO2 분위기에서 배양하였다.
HEK293T 세포를 DHA-H 및 DHA와 함께 10, 30 및 100μM에서 24시간 동안, 30μM에서 6, 48 및 72시간 동안 배양하였다. 또한, 이들 세포는 24시간 동안 100μM에서 LA-H, ALA-H, GLA-H, ARA-H 및 EPA-H와 함께 배양하였다. 또한, HEK293T 세포는 1 및 10mM의 최종 옥시티아민 농도에서 동일한 조건 하에 DHA-H의 존재 하에 옥시티아민과 함께 배양하였다. HEK293T 세포는 차가운 인산염 완충 식염수 용액(PBS)이 있는 피펫을 이용하여 플레이트로부터 분리하였다. 세포를 원심분리(1000 xg, 4℃에서 10분)로 회수하고 차가운 PBS로 두 번 세척하고 -80℃에서 동결했다. 세포 배양 배지에서 DHA-H 및 DHA 수준을 분석하기 위해, 부착된 HEK293T 세포(5.105개 세포/플레이트)의 존재 또는 부재 하에 30μM DHA-H 또는 DHA를 함유하는 완전한 세포 배양 배지 11mL로 90mm 직경 플레이트를 채웠다. 플레이트를 상기 기재된 바와 같이 인큐베이션하고 플레이트의 1 ml 분취량을 0, 6, 24, 48 및 72시간에서 수집하였다. 세포 배양 배지의 분취물을 즉시 4℃에서 10분 동안 1000 xg에서 원심분리하여 임의의 세포 현탁액을 제거하고 무세포 분취물을 -20℃에서 보관했다.
U-118 MG, MIA-PaCa 2 및 A549 세포주는 Sigma-Aldrich Co사(St Louis, MO)를 통해 ECACC(European Collection of Cell Cultures)로부터 얻었고 37℃에서 5% CO2 분위기에서 10% FBS(Gibco, Thermo-Fisher)가 첨가된 RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 배양 배지(U-118 MG 및 A549) 또는 DMEM(MIA-PaCa 2)에서 유지했다. U-118 MG, MIA-PaCa 2 및 A549 세포를 표 4의 결과를 얻기 위해 수행된 분석의 설명에 기재된 조건하에 처리하였고, 즉, 옥시티민(1 또는 10mM)의 존재 또는 부재하에 처리하였다. 트리판 블루 생명 배제 염색(Scharlab) 또는 세포 증식 키트 II(Roche)를 사용하여 Burker 챔버에서 세포 생존을 분석했다. 간단히 말해서, 세포를 처리 24시간 전에 웰당 3 x 103 세포의 밀도로 96-웰 플레이트에 접종한 다음, 관심 화합물의 존재 또는 부재 하에 도면에 표시된 농도 및 시간 동안 배양하였다. 상이한 시간 후, 제조사의 지침에 따라 XTT를 첨가하여 플라크 생존 세포를 측정했다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 일정한 색상이 나타날 때까지 배양하고 참조 파장이 650 nm인 마이크로플레이트 판독기(FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Germany)를 사용하여 495 nm에서 흡광도를 기록했다.
SH-SY5Y 인간 신경모세포종 세포는 10% FBS(Sigma), 페니실린/스트렙토마이신(PAA), 비필수 아미노산(Sigma) 및 2mM L-Gln(Sigma)이 첨가된 DMEM-F12(Invitrogen)에서 유지하였다. 이들 세포를 신경 표현형으로 분화하는 것은 표준 절차에 따라 수행하였다. 간단히 말해서, 세포를 폴리-L-리신으로 전처리한 플레이트에 접종하고 24시간 후, 배지를 10μM 레티노산(Sigma)이 첨가된 새로운 배지로 교체했다. 그런 다음, 세포를 암실에서 5일 동안 배양하고 배지를 무혈청 배지로 교체하고 50ng/ml의 인간 뇌 유래 신경영양 인자(hBDNF; Alomone Labs사; 이스라엘 텔아비브)를 첨가하였다. 마지막으로, 분화를 완료하기 위해 세포를 6일 동안 배양하였다. 신경 세포는 화합물 HDA, HTA ω-3, HTA ω-6, NTA, NPA 및 HPA로 24시간 동안 1.3 및 10μm에서 24시간 동안 처리한 후, 글리신(530μM, Sigma) 및 칼슘(10mM, Sigma사)을 포함하는 배지에서 NMDA(n-메틸-D-아스파르테이트, 10mM, Sigma사)로 흥분독성을 유도하였다.
DHA-H로 처리하면 세포 배양물에서 전구약물 수준과 비교하여 높은 세포 수준의 HPA가 생성된다(도 1B). 도 1B에서, DHA-H 및 HPA의 세포내 수준은 DHA-H로 처리된 HEK293T 세포에서 확인된다. 두 화합물의 축적은 처리 농도 또는 배양 시간에 따라 분명히 확인되지만, HPA 수준은 24시간의 배양 및 30μM 처리 후 전구약물보다 상당히 높다. HPA 수준의 증가는 2-히드록시아실-CoA 리아제의 경쟁적 길항제인 옥시티아민(1mM에서 부분 억제 및 10mM에서 거의 전체 억제)을 동시에 처리하면 억제된다(도 1A 참조). 이와 관련하여, 내인성 수준의 DHA(히드록실화되지 않은 천연 형태)는 DHA-H로 처리해도 변경되지 않는 것으로 확인되었다(도 1C).
유사하게, 도 8은 이러한 동일한 대사 경로가 HDA, HTA ω-3, HTA ω-6, NTA, NPA를 각각 생성하는 LA-H, ALA-H, GLA-H, ARA-H 및 EPA-H와 같은, 전구약물로 사용되는 다른 2-히드록실화 다중불포화 지방산의 경우에 유효하다는 것을 보여준다(도 9에 도시된 크로마토그램). 이러한 모든 대사 산물은 도 10 및 하기 표 4에서 나타낸 바와 같이 치료적 활성을 나타냈다.
[표 4]
인간 교모세포종(U118 MG), 췌장암(MIA-PaCa 2) 및 인간 폐 선암종(A549) 세포주에서의 IC50 값
Figure pct00056
도 8과 도 9에 설명된 다양한 대사산물의 항종양 활성은 종양 세포 배양물에서 이러한 분자(HDA 또는 C17:2 ω-6, HTA ω-3 또는 C17:3 ω-3, HTA ω-6 또는 종양 세포 배양에서 C17:3 ω-6, NTA 또는 C19:4 ω-6, NPA 또는 C19:5 ω-3, HPA 또는 C21:5 ω-3)의 직접 처리를 통해 측정하였고, 여기서 이들 화합물 각각에 대한 IC50 값을 측정하였다(억제 농도 50: 종양 세포 집단의 50%의 사멸을 유도하는 연구 화합물의 농도). 사용된 세포 배양물은 U118-MG(인간 등급 IV 교모세포종), MIA-PaCa 2(췌장 암종) 및 A549(소세포 폐 선암종)와 같은 다양한 유형의 암에 해당한다. 상이한 화합물은 상이한 종양주에서 다양한 IC50 값을 나타내었으므로, 이들 중 몇몇이 특정 유형의 종양 세포의 선택적 사멸을 유도하는 선택성이 있음을 입증하였다.
실시예 4: DHA-H 및 HPA를 사용한 생체 내 시험
알츠하이머병의 5xFAD 모델은 가족성 알츠하이머병(Tg6799 계통)과 관련된 하기의 5가지 인간 돌연변이를 보유하는 이중 형질전환 PS1/APP 마우스이다: APP에서 스웨덴(K670N/M671L), 플로리다 151(I716V) 및 런던(V717I); 및 인간 PS1에서의 임상 돌연변이 M146L 및 L286V. 두 이식유전자는 모두 Thy-1 프로모터의 제어 하에 발현되고 마우스는 4개월령부터 인지 저하를 나타낸다(Oackley 등, 2006, Neurosci 26(40), 10129-10140. doi: 10.1523/jneurosci.1202-06.2006). 5xFAD 형질전환 동물 및 야생형(WT)은 Jackson Laboratories사(미국)에서 얻었고 이형접합 형질전환 마우스를 B6/SJL WT(F1) 번식자(reproducer)와 교배하여 B6/SJL 유전적 배경에서 유지했다. 그 동물은 표준 실험실 식이(Panlab A03, Barcelona, 스페인)에 자유롭게 접근하면서 12h-12h 명암 주기로 22℃(±2℃)의 제어된 온도 및 70% 습도에서 수용되었다.
트랜스제닉 수컷 WT 및 5xFAD 마우스는 5% 에탄올에 용해된 DHA-H(또는 DHA)를 5, 20, 50 및 200 mg/kg의 일일 투여량으로 또는 비히클 단독으로 경구 투여받았다. 다른 한편으로, 독립적인 분석에서, 이 동물들은 또한 이 모델에서 두 화합물의 효과를 비교하기 위해 HPA(20mg/kg) 및 DHA-H(20g/kg)로 처리되었다. 이러한 처리는 마우스가 3개월령에 도달했을 때 시작되었고(주 5일 투여) 7개월령까지 계속되었다. 처리 마지막 달 동안, 모든 동물은 선택된 행동 공간 학습 및 기억 테스트(방사형 팔 미로)를 수행하기 위해 저칼로리 식단을 유지했다. 하기의 총 46마리의 동물이 도 2에 도시된 연구에 사용되었다: 비히클 처리된 WT(n=3), DHA-H로 처리된 WT(20mg/kg, n=3 및 200mg/kg, n=3), DHA로 처리된 WT(20 mg/kg, n=3); DHA-H로 처리된 5xFAD(n=5)(5 mg/kg, n=6; 20 mg/kg, n=5; 50 mg/kg, n=6 및 200 mg/kg, n=7), 및 DHA로 처리된 5xFAD(20 mg/kg, n=5). 하기의 총 20마리의 동물이 도 6의 연구에 사용되었다: 비히클 처리된 WT(n=5), 비히클 처리된 5xFAD(n=5), DHA-H (20mg/kg, n=5) 및 HPA(20 mg/kg, n=5)로 처리된 5xFAD. 행동 테스트 후, 마우스를 추가 1주일 동안 정상적인 식이(및 처리)으로 유지한 후, 케타민/자일라진(100/10mg/kg)의 복강 주사로 마취하고 헤파린 처리된 식염수 50mL를 심장 내 주입했다. 동물의 뇌를 즉시 제거하고 차가운 표면에서 정중선으로 해부했다. 소뇌가 제거되면, 각 소뇌가 없는 반쪽을 액체 질소에서 동결시키고 -80℃에서 보관하였다. NUDE (스위스) Crl:NU (Ico) -Foxn1 nu 마우스(8-12주령, 30-35g, Charles River Laboratories사, 프랑스 파리)를 항온조(28℃, EHRET, Labor-U- Pharmatechnik)에서 상대 습도 40-60%에서 무균 공기 흐름과 12시간 암/광 주기로 유지했다. 이들의 식이는 사료(Labdiet 22% 쥐-마우스 사육, Sodispan)를 이용한 표준 식이로 자유롭게 구성되었다. 이종이식 종양을 유발하기 위해, 7.5 × 106 U-118 MG 세포를 동물의 등 옆구리 양쪽에 피하로 접종하고 1주일 후에 종양이 대략 100 mm3의 부피로 가시화되었다. 동물을 유사한 평균 종양 부피를 갖는 그룹으로 무작위로 나누고 42일 동안 매일 하기의 것들을 경구 투여하였다: 비히클, DHA-H(200mg/kg) 및 HPA(200mg/kg). 도 3의 연구는 비히클(무처리 대조군; n=6)로 처리되고 DHA-H(200mg/kg; n=9)로 처리된 동물을 포함한다. 도 7은 비히클 처리(무처리 대조군; n=6), DHA-H 처리(200 mg/kg; n=8) 및 HPA 처리(200 mg/kg; n=8)된 동물을 나타낸다. 종양 부피(v)는 ν = A2 × L/2로 계산되었으며, 여기서 A는 종양의 너비이고 L은 길이이다. 처리가 완료되면, 마우스를 경추 탈구로 희생시키고 이종이식 종양을 절개하여 액체 질소 및 -80℃에서 동결시켰다. 사용된 모든 프로토콜은 발레아레스 제도 대학 생명윤리위원회의 승인을 받았으며 동물 복지에 대한 국내 및 국제 지침을 준수하였다. 건강한 쥐와 알츠하이머병(5xFAD)의 유전자 변형 모델의 사용에서는, 뇌 수준에서 HPA가 유의하게 축적된 반면, 모분자(DHA-H)는 검출되지 않았으며, DHA(히드록실화되지 않은 천연 형태)내인성 수준의 변화도 없는 것으로 확인되었다(도 2A).
방사형 팔 미로 테스트
공간 거동 테스트는 Fiol-Deroque의 방법을 일부 수정하여 위에서 설명한 대로 수행하였다(Fiol-Deroque 등, 2013, Biogerontology 14(6), 763-775. doi: 10.1007/s10522-013-9461-4). 모든 동물을 분리하여 정상 체중의 80-85%로 칼로리 제한을 가하고, 시험 시작 전과 시험이 끝날 때까지 일주일 동안 이러한 조건에서 유지하였다. 식이 제한 후 및 실험 시작 3일 전에, 동물을 3일 동안 8-암(arm) 방사형 미로 테스트(LE766/8, Panlab SL, 스페인)에서 하루에 두 번 훈련시켰다. 각 마우스를 미로의 중앙에 놓고 각 암 끝에 위치한 45mg 식품 펠릿(Dustless Precision Pellets, Bio-Serv, USA)을 보상으로 찾도록 하였다. 동물이 8개의 준비된 암을 찾거나 10분 안에 모든 암을 완성하지 못했을 때 각 세션이 종료되었다. 각 동물의 움직임은 디지털 비디오 추적 시스템(Sedacomv1.3 소프트웨어가 있는 LE 8300, Panlab, SL, 스페인)으로 기록하였고 훈련 후 실험 패러다임이 시작되었다. 모든 실험 세션(하루에 1회 세션)에서, 훈련 프로토콜에 비해 단 4개의 암만이 프라이밍되었으며 동물이 4개의 프라이밍된 암을 모두 찾거나 10분 후에 실패했을 때 각 세션이 종료되었다. 수행능력은 다음을 고려하여 평가되었다. (1) 테스트를 수행하는 시간; (2) 작업 기억 오류의 수(WME, 이전에 방문한 프라이밍된 암으로의 재진입); (3) 기준 메모리 오류(RME, 프라이밍되지 않은 암으로의 진입)의 수; (4) 총 오류 수(WME+RME). 테스트는 3주 동안 주 5일 반복되었다. 테스트 후, 동물들은 도살 전에 추가로 일주일 동안 자유롭게 먹였다.
이러한 점에서, 알츠하이머 모델 마우스의 뇌 수준에서 HPA의 수준은 공간 및 연상 기억의 평가 테스트(방사형 미로 테스트)에서 행동 매개변수와 통계적으로 유의한 반비례 관계를 가지고 있음을 관찰할 수 있다(도 2B). 이러한 결과는 뇌 HPA 수준의 적당한 증가가 공간 인지의 개선과 유의하게 관련되어 있음을 시사한다. 마찬가지로, HPA의 직접 투여는 분석된 동일한 행동 매개변수의 매개변수에 대한 DHA-H 투여와 유사한 효과가 있다(도 6).
실시예 5: 실시예 3 및 4에 관한 지질 추출 및 지방산 트랜스메틸화
상기 실시예에서 사용된 HEK293T 또는 U-118 MG 세포는 저온 저장성 완충액(1mM EDTA, 20mM Tris-HCl[pH 7.4])을 상하로 파이펫팅하여 용해시켰다. 세포 용해물은 지질 추출 전에 초음파 펄스(4주기, 10초/주기, 10W)를 받았다. 뇌 분석을 위해, 블레이드 균질화기(Polytron PT3100)를 사용하여 프로테아제 억제제(Roche)의 존재 하에 1:10(p:v)의 차가운 PBS에서 각 동물의 조직을 균질화하였다. 균질물을 초음파로 처리하고, 분취물을 만들고 -80℃에서 보관했다. 약 8 mg 단백질/분취물을 함유하는 각 샘플의 단 하나의 분취물을 지질 추출에 적용하였다. 지질 추출 전 단백질 함량은 수정된 Lowry 방법(Bio-rad DC Protein Assay)에 의해 측정되었다.
지질 추출 대상 샘플에 내부 표준물질로 마가르산(C17:0)을 첨가하고 클로로포름:메탄올로 지질을 추출하였다(Eggers and Schwudke, 2016). 간단히 말해서, 0.75부피의 수성상(이미 생물학적 샘플을 함유함)을 2부피의 클로로포름 및 1부피의 메탄올과 혼합했다. 이 혼합물을 1분 동안 볼텍싱하고 1000 xg에서 10분 동안 원심분리했다. 하부 유기상을 모아 PBS:메탄올(1:1,v:v) 1ml로 세척하고, 얻어지는 유기상을 아르곤 기류하에 건조시켰다. 추출된 지질을 포함하는 필름은 아르곤 분위기에서 3 ml의 메탄올:아세틸 클로라이드(10:1, v:v)에서 100℃에서 90분 동안 지질 혼합물을 인큐베이션함으로써 트랜스메틸화하였다(Christie, 1993). 얻어지는 지방산 메틸 에스테르(FAME)를 헥산으로 추출하고, 트랜스메틸화 반응에 H2O 3ml 및 헥산 1ml를 첨가하고 혼합물을 완전히 볼텍싱하였다. 실온(10분 동안 1000 xg)에서 원심분리한 후, FAME를 함유하는 상부 상을 수집하고 나머지 부피를 1 ml의 헥산으로 2회 세척하였다. 헥산 상을 합하고 아르곤 흐름 하에 증발시키고 60㎕의 헥산(세포 샘플, 세포 배양 배지 및 혈장 분석용) 또는 200㎕(뇌 샘플 분석용)에 재현탁시켰다. 지방산 화합물이 히드록실화되었는지 확인하기 위해, 분리된 FAME를 트리메틸실릴로 두 번째 유도체화했다(Alderson 등, 2004, J Biol Chem 279(47), 48562-48568. doi: 10.1074/jbc.M4066.49200). 간단히 말해서, FAME를 아르곤 흐름 하에 건조시키고 지질 필름을 N,O-비스(트리메틸실릴) 아세트아미드(200-400㎕ 트리메틸실릴화 시약에 대해 0.1-5.0mg 지질)에 용해시킨 다음, 이를 다시 100℃에서 캡핑된 바이알에서 가열하였다. 70℃에서 30분간 용매를 증발시키고 지질 필름을 분석을 위해 헥산에 재현탁시켰다. 연구 중인 지방산이 히드록실화되면, 이 두 번째 유도체화의 결과로 FAME의 머무름 시간이 변화한다. 그러나, 연구 중인 지방산이 히드록실화되지 않은 경우, 얻어지는 FAME는 두 번째 유도체화에 관계없이 동일한 머무름 시간을 나타낸다.
이들 세포에서 전구약물 DHA-H로 처리하여 생성된 HPA 수준을 옥시티아민(α-산화의 경쟁적 억제제)의 존재 또는 부재하에 평가하였다(도 4A). 그 결과는 DHA-H를 U-118 MG 세포 배양물에 첨가하면 HPA 수준이 상당히 증가한다는 것을 보여주었다. 이러한 증가는 1 또는 10mM 옥시티아민을 동시에 처리하는 경우 억제되며, 이는 DHA-H에서 HPA로의 전환이 α-산화에 의해 매개됨을 보여준다. 배양된 U-118 MG 세포에 대한 DHA-H 처리는 DHA(히드록실화되지 않은 천연 형태)의 내인성 수준에 영향을 미치지 않았다. 배양된 동일한 세포에 대하여 1mM 옥시티아민의 존재 또는 부재 하에 DHA-H로 생존율 분석을 수행하여(도 4B), 1mM 옥시티아민이 세포 생존율에 영향을 미치지 않음을 확인했다.
한편, DHA-H(150μM, 48h)의 첨가는 U118-MG 세포에 유의미한 항증식 효과를 나타낸다. 그러나, 이러한 효과는 1mM 옥시티아민의 존재하에서는 부분적으로 역전된다(통계적으로 유의미한 방식으로). 이때, 이 옥시티아민 농도는 DHA-H로부터 HPA 수치의 증가를 완전히 억제하기에 충분하다는 것을 기억해야 한다. 이러한 결과는 U-118 MG 세포에 대한 DHA-H에 의해 매개되는 항증식 효과가 적어도 부분적으로 HPA에 의해 매개된다는 것을 보여주는데, DHA-H로부터 이 화합물의 형성의 억제는 DHA-H의 더 낮은 항증식 효과로 해석되기 때문이다(도 4B). HPA가 U-118 MG 세포의 배양물에 미치는 항증식 효과도 DHA-H 전구약물 및 DHA의 천연 형태의 투여와 비교하여 연구되었다. U-118 MG에 대한 항증식 효과는 DHA-H 및 DHA에 비해 HPA의 경우에 훨씬 더 높다(도 5A 참조). DHA-H와 비교할 때, 이러한 효과는 DHA-H와 HPA에 의해 유도되는 세포 내 HPA 수준의 차이로 설명될 수 있다(도 5B 참조). 실제로, 도 5C는 DHA의 히드록실화된 형태의 흡수가 비-히드록실화된 유사체의 흡수와 비교하여 방지됨을 보여준다.
실시예 6: 2OHOA 및 C17:1n-9를 사용한 시험관 내 분석
아래에 설명된 실험에 사용된 2OHOA 나트륨 염의 농도와 처리 기간은 분석 유형에 따라 200μM 또는 400μM 및 24시간 또는 72시간으로 다양했다. 일부 실험 시리즈에서는, C17:1n-9 나트륨 염 용액을 24시간 또는 72시간 동안 200μM의 농도로 사용했다.
이러한 용액을 준비하기 위해, 100mM의 스톡(stock) 분취량에서 시작했다. 이 시작 분취량을 준비하기 위해, 해당 밀리그램의 지질 화합물(분말)을 배양 후드 내의 무수 에탄올과 고압증기멸균된 증류수(vol.1:1, 일반적으로 1ml의 분취량을 준비하여 에탄올 500μl 및 물 500μl를 첨가)에 용해시키고, 그 용액을 37℃의 배양 오븐에 10분간 투입하여 지질 화합물을 용해시킨 후, 교반하였다.
6.1. 2OHOA의 U-118 MG 신경교종 및 비종양 세포에의 혼입 및 대사
2OHOA가 신경교종 세포막에 결합되었는지 확인하고 2OHOA 처리 후 지방산 프로필의 변화가 발생하는지 확인하기 위해, 24시간 동안 400μM 2OHOA 나트륨 염의 부재(대조군) 또는 존재 하에 배양된 U-118 MG 인간 신경교종 세포에서 총 지질을 가스 크로마토그래피로 분석하였다. 신경교종 세포에서 지방산 수준의 분석 결과, 대조군에 비해 2OHOA 나트륨 염으로 처리한 후 OA 수준의 변화가 없는 것으로 확인되었다(도 12). 또한, 2OHOA의 세포 혼입은 처리된 세포에서만 크로마토그램에서 피크(표준에 해당)가 확인되어 처리 24시간 후에 관찰되었다. 다른 한편으로, 처리된 세포의 크로마토그램에서 실질적으로 독점적으로 새로운 피크의 출현에 주목할 가치가 있다. 이 새로운 피크의 상승된 수준은 처리된 세포에서 검출되어 2OHOA(10.81 ± 0.34 nmol/mg 단백질)보다 거의 두 배(19.71 ± 0.39 nmol/mg 단백질)를 축적되었다. 이의 정체를 확인하기 위한 여러 연구 후에, 이 새로운 피크가 시스-8-헵타데센 지방산(C17:1n-9)에 해당한다는 것이 확인되었다. C17:1n-9의 형성은 2OHOA의 α-산화의 결과이다(도 11).
6.2. 2OHOA 나트륨염 처리 후 다양한 신경교종 및 종양 세포 내의 지방산 조성의 분석
2OHOA 나트륨염의 나트륨염(400 μM, 24시간)의 부재 또는 존재하에 배양 후, 다른 신경교종 세포주(U-251 MG 및 SF-295)에서 지질막의 지방산 조성을 비종양 세포, 인간 섬유아세포(MRC-5), 및 마우스 성상교세포의 1차 배양액과 비교하여 가스크로마토그래피로 분석했다. 분석된 모든 세포주에서 2OHOA 나트륨 염으로 처리한 후 OA 양의 유의한 변화가 관찰되지 않았다(도 13). 그러나, 2OHOA로 처리한 지 24시간 후에, 다른 신경교종 세포주와 비종양 세포 모두에서 대사산물 C17:1n-9의 형성뿐만 아니라 2OHOA의 혼입이 관찰되었다(도 13). 2OHOA의 혼입으로 인한 대사 산물 C17:1n-9의 형성은 종양 세포와 비종양 세포 간에 다르다. 신경교종 세포(U-251 MG 및 SF-295)는 C17:1n-9 수준의 상당한 증가를 보였으며, 2OHOA보다 97.42% 및 108.03%(각각 19.16 ± 0.53 대. 9.21 ± 0.41 nmol/mg 및 18.38 ± 1.97 대 9.31 ± 1.44 nmol/mg) 더 많은 축적을 보였다(도 13B 및 도 13d, 표 5). 대조적으로, 비종양 세포에서 검출된 2OHOA 수준은 대사산물인 C17:1n-9의 수준보다 유의하게 높았다. 대사산물 대사체 C17:1n-9에 비해 46% 더 많은 2OHOA가 인간 MRC-5 섬유아세포에 축적되었고(26.31 ± 4.32 대. 14.00 ± 1.92 nmol/mg) 마우스 성상교세포에서 38.27% 더 많이 축적되었다(12.28 ± 0.908 대 7.58 ± 7.7 nmol/mg)(도 13f 및 13H, 표 5).
[표 5]
2OHOA 처리 후 다른 신경교종 및 비종양 세포주에서 지방산 2OHOA 및 C17:1n-9의 수준.
Figure pct00057
Figure pct00058
표 5는 2OHOA(400 μM, 24 시간) 처리 후 가스 크로마토그래피로 측정한 상이한 신경교종 주인 U-118 MG, U-251 MG 및 SF-295(위) 및 비종양, MRC-5 및 성상교세포(아래)에서 2OHOA 및 C17:1n-9 지방산의 정량화 값을 보여준다. 결과는 nmole로 표현되고 단백질 mg당 정규화된 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SEM에 해당한다.
6.3. 신경교종 세포의 세포 생존 및 증식에 미치는 2OHOA, C17:1n-9의 영
C17:1n-9의 항증식 효과를 평가하기 위해, 시험관내에서 세포 생존율을 50% 감소시키는 데 필요한 화합물의 양에 해당하는 IC50과 2OHOA의 작용 메커니즘에 관여하는 단백질의 조절에 미치는 영향을 측정했다. 이를 위해, 신경교종 세포주(U-118 MG, U-251 MG 및 SF-295)와 비종양 세포주(MRC-5 및 성상세포)를 증가하는 농도의 C17:1n-9, OA 및 2OHOA 나트륨 염으로 72 시간 동안 처리했다. 처리 종료 시, IC50은 보라색 결정 염색 기술에 의해 측정되었다. 세포 생존률 분석 결과, 2OHOA, OA 및 C17:1n-9의 3가지 화합물이 72시간의 처리 후 농도 의존적 방식으로, 시험된 모든 신경교종 세포에 대하여 항증식 효과가 있음을 확인하였다. 더욱이, 연구된 비종양 세포, MRC-5 및 성상교세포에서, 2OHOA가 세포 생존율에 미치는 영향은 관찰되지 않았지만, OA 및 C17:1n-9 지방산은 동일한 비종양 세포에 대해 항증식 효과를 나타냈다(도 14 및 도 15). 2OHOA 나트륨 염의 IC50 값은 U-118 MG, U-251 MG 및 SF-295 신경교종 세포에서 각각 432.75 ± 10.77, 429.96 ± 9.67 및 399.14 ± 11.47 μM이었다(표 6).
따라서, C17:1n-9는 신경교종 및 비종양 세포 모두에서 매우 유사한 항증식 효과를 유도했다. 한편, 2OHOA 처리는 비종양 세포의 생존력에는 영향을 미치지 않고 다른 신경교종 세포주의 생존율에만 영향을 미쳤다. 2OHOA의 IC50 값은 U-118 MG, U-251 MG 및 SF-295 신경교종 세포에서 대사 산물 C17:1n-9의 값보다 각각 1.90, 1.95 및 1.60배 더 컸다(표 6). 또한, 2OHOA의 IC50 값은 이의 비히드록시 유사체인 OA보다 1.92, 1.80, 1.56배 더 높았다. C17:1n-9가 더 높은 항증식 효능을 보였다는 사실은 2OHOA보다 세포 내 축적 능력이 더 높다는 사실 때문일 수 있다.
[표 6]
2OHOA, OA 및 C17:1n-9 처리 후 다양한 세포주에 대한 IC50 값
Figure pct00059
표 6은 도 16 및 도 17에서 얻은 결과로부터 계산된, 신경교종 세포주(U-118 MG, U-251 MG 및 SF-295) 및 비종양 세포(MRC-5 및 성상세포)의 IC50의 요약을 보여준다. 얻어진 IC50 값은 3회의 독립적인 실험의 평균에 해당하며 통계 프로그램 GraphPad prism 6.0(S자형 모델)을 사용하여 용량-반응 식을 사용하여 계산되었다.
6.4. 다양한 세포주에서 증식 및 사멸의 마커에 미치는 다양한 지방산의 영향의 분석
2OHOA의 영향에 의해 변경되는 다양한 신호 전달 경로에 미치는 대사산물 C17:1n-9의 영향을 분석했다. 이를 위해, 서로 다른 신경교종 세포주(U-118 MG, U-251 MG 및 SF-295)와 비종양성(MRC-5 및 마우스 성상세포)을 각각의 화합물의 IC50에 가까운 용량(200 μM C17:1n.9, 200 μM OA 또는 400 μM 2OHOA)으로 처리하고, 서로 다른 신호 전달 단백질에 미치는 그의 영향을 웨스턴 블럿으로 분석했다.
그 결과, 2OHOA 처리가 BIP, CHOP 및 cJun 인산화 수준을 증가시키고 Akt 및 cyclin D3 수준의 인산화를 감소시키는 것으로 확인되었다. 대신, C17:1n-9 처리는 이러한 단백질에 변화를 일으키지 않았다(도 16). 이는 대사 산물 C17:1n-9에 의해 유도된 사멸이 2OHOA의 경로가 아닌 다른 경로를 통해 유발됨을 시사한다.
6.5. α-산화 억제 후 U-118 MG 신경교종 세포 내의 지방산 조성의 분석 및 U-118 MG 신경교종 세포의 세포 생존에 미치는 옥시티아민의 영향의 확인
α-산화에 의한 2OHOA로부터 C17:1n-9 산의 형성을 확인하기 위해, 2-히드록시피타노일-CoA 리아제(HACL1, α-산화의 핵심 효소) 효소를 억제하는 옥시티아민 염산염을 사용했다. 이를 위해, U-118 MG 신경교종 세포를 먼저 90분 동안 1 또는 10mM 옥시티아민으로 전처리한 400μM의 2OHOA 나트륨 염으로 24시간 동안 처리하고 지방산을 가스 크로마토그래피로 분석했다. 가스 크로마토그래피에 의해 검출된 특정 지방산의 분석에서, C17:1n-9의 유의한 감소가 옥시티아민이 없이 2OHOA 나트륨 염으로만 처리된 세포에 비해 옥시티아민으로 전처리되고 2OHOA 나트륨 염으로 처리된 U-118 MG 신경교종 세포에서 관찰되었다(도 17A). 이러한 감소는 옥시티아민의 존재 없이 2OHOA 처리된 세포에서 도달된 대사산물의 양에 비해 1mM 옥시티아민을 이용한 전처리 후 51.35%(17.17 ± 1.07 대 8.35 ± 0.36nmol/mg 단백질) 및 10mM 옥시티아민을 이용한 전처리 후 58.45%(7.13 ± 0.39 nmol/단백질)였다. 대조적으로, 2OHOA 나트륨 염만으로 처리된 세포와 비교하여 2OHOA 나트륨 염 및 최대 3mM 옥시티아민으로 처리된 세포 사이의 2OHOA의 양의 유의한 차이가 검출되지 않았다(도 17A). 그러나, 2OHOA 나트륨염과 4mM 옥시티아민으로 처리한 세포에서 12.33%의 2OHOA 양의 유의한 증가(12.41 ± 0.75 대 15.74 ± 0.24 nmol/단백질)가 관찰되었고, 10mM 옥시티아민으로 처리한 세포에서는 52.94%(18.98 ± 0.42 nmol/단백질)의 증가가 관찰되았다. 따라서 옥시티아민은 α-산화 억제로 인해 C17:1n-9의 생성을 억제하고 4mM로부터 2OHOA의 양을 증가시키므로, 2OHOA가 C17:1n-9로 대사되는 경로를 확인하였다.
다음으로, 2OHOA의 α-산화를 통한 2OHOA 대사의 억제가 2OHOA(400mM, 72시간)의 부재 또는 존재 하에 배양 후 U-118 MG 신경교종 세포의 세포 생존율 및 세포 생존에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해, 위에서 설명한 용량의 옥시티아민을 이용한 전처리 후 트립판 블루를 사용한 생명 배제 염색으로 연구했다. 옥시티아민은 U-118 MG 신경교종 세포의 생존을 크게 감소시켰다. 상세하게는, 최대 세포 생존 억제가 10 mM에서 27.13 ± 0.41%에 도달할 때까지 1mM에서는 12.16 ± 0.5% 사멸을 유도했고 2mM에서는 21.17 ± 1.76% 사멸을 유도했다(도 7B). 이러한 결과는 이미 알려진 옥시티아민의 시험관 내 항종양 효과를 확인시켜준다.
반면에, 2OHOA 나트륨 염과 함께 세포를 배양하면 24.71 ± 1.88%의 세포 사멸이 유도되었다. 1mM 옥시아민과의 조합 후 5%의 세포 생존율 회복이 있었디(20.94 ± 1.97% 사멸). 2mM 옥시티아민의 경우 17.26%(11.71 ± 1.14% 사멸)의 사멸이 있었다(도 17B).
도 17A 및 도 17B의 관점에서, C17:1n-9의 수준은 옥시티아민의 최저 농도와 최고 농도 사이에서 크게 변하지 않는 것으로 관찰된다. 이는 낮은 농도(1.2mM)에서는 옥시티아민 자체가 세포 독성이 덜하지만 C17:1n-9 생성을 감소시키는 효과가 매우 분명하다는 사실에 기초하여 해석될 수 있다. 이러한 농도에서, 우리는 C17:1n-9의 수준을 낮추는 효과를 볼 수 있지만 옥시티아민의 더 높은 농도에서는 옥시티아민 자체에 의해 생성되는 더 많은 세포독성아 나타나기 시작한다. 이러한 효과는 고농도의 2OHOA 나트륨 염에 의해 강화되는 것으로 보인다. 고농도에서는 더 많이 축적된 2OHOA가 검출되는데, 이는 2OHOA의 나트륨 염의 투여가 그 자체로 세포독성을 생성하고 이러한 농도에서 옥시티아민의 세포독성 효과를 추가함을 나타낸다.
6.6. 대사 산물 C17:1n-9가 2OHOA의 작용에 미치는 영향
대사 산물 C17:1n-9가 2OHOA의 작용에 참여할 수 있는지 여부를 연구하기 위해, 옥시티아민을 이용한 전처리가 세포 생존 및 2OHOA-조절 단백질에 미치는 영향을 연구했다. 이를 위해, 2OHOA(400μM, 72시간)로 처리하고 2mM 옥시아민(90분)으로 전처리하거나 하지 않은 다양한 신경교종 및 비종양 세포주의 세포 생존을 트리판 블루를 이용한 생체 배제 염색을 통해 세포수를 계수하여 분석했다. 또한 웨스턴 블럿 2OHOA로 조절된 단백질을 연구하였다. 신경교종 세포에서, 72시간 동안 2mM 옥시티아민과 함께 배양한 후 세포 생존의 현저한 감소가 관찰되었다. 옥시티아민은 U-251 MG 및 SF-295 세포에서 각각 18.51 ± 0.58% 및 17.35 ± 0.63% 세포 사멸을 유도했다(도 18A 및 도 18b). 이러한 결과는 신경교종 세포에 대한 옥시티아민의 시험관내 항종양 효과를 뒷받침한다. 2OHOA로 세포의 처리는 U-251 MG 및 SF-295에서 각각 23.22 ± 1.32% 및 23.97 ± 1.25% 세포 사멸을 유도했다. 2mM 옥시티아민과의 조합 후, SF-295 세포에서는 12%(U-251 MG 세포에서 14.07±1.62% 사멸) 및 17.25%(10.85±0.58% 사멸)의 세포 생존율의 유의한 회복이 있었다. 대조적으로, 비종양 세포에서는 시험된 치료들 중 어느 것도 세포 생존에 영향을 미치지 않았다(도 18c 및 도 18d).
신경교종 세포에서 다양한 신호 전달 경로 및 세포 사멸에 관여하는 단백질 연구에서, 옥시티아민은 2OHOA와 동일하게 신경교종 세포에서 BiP, CHOP, c-Jun 인산화, Akt 인산화 및 D3 cyclin의 수준에 영향을 미쳤고, 조합시에는 온화하지만(도 19), 2OHOA에 의해 유도된 조절이 억제되었다. 이러한 사실은 C17:1n-9에서 2OHOA의 대사가 항종양 작용을 강화하는데 필요하다는 것을 확인시켜준다. 반대로, 비종양 세포주에서 이러한 신호전달 단백질의 변화는 어떠한 처리 후에도 관찰되지 않았다(도 19). 2OHOA는 C17:1n-9에서 그의 대사가 억제되면 항증식 활성을 갖지만, 대사산물인 C17:1n-9의 형성은 2OHOA의 작용기전에 큰 영향을 미쳐서 2OHOA의 항증식 효과를 높이고, 2OHOA가 또한 활성 대사 산물 17:1n-9을 생성하는 전구 약물인 것으로 확인된다.
실시예 7: 2OHOA 및 C17:1n-9를 사용한 생체 내 시험
7.1 2OHOA 처리 24시간 후 쥐의 혈장 내 지방산 조성의 분석
동물 혈장에서 2OHOA 및 이의 대사산물인 C17:1n-9의 약동학적 프로파일이 연구되었다. 이 경우 실험 동물 모델로 쥐를 사용하였다. 쥐는 마우스보다 부피가 크고 전임상 연구에서 정의된 2OHOA의 최대 허용 용량(2g/Kg)의 지속적인 투여 효과를 연구하는데 가장 적합한 모델이다.
본 연구를 위해, 12-14주령의 쥐에게 2OHOA/Kg 나트륨염 2g을 15일 동안 경구 투여하였다. 이어서, 1일(급성 처리) 및 15일(만성 처리)에 상이한 시간(0, 1, 2, 3, 4, 6, 8 및 24시간)에서 혈장 샘플을 추출하였다. 마지막으로, 혈장 샘플의 지방산 프로필을 가스 크로마토그래피로 분석했다. 크로마토그램을 분석한 후, 급성 처리(첫 날 투여) 후 수집된 혈장 샘플에서 2OHOA 및 C17:1n-9 지방산의 검출이 두드러졌다(도 20A).
2개의 화합물, 즉 2OHOA 및 C17:1n-9는 급성 처리 후 쥐 혈장에서 매우 유사한 약동학적 프로파일을 나타냈다(도 20B). 2OHOA 및 C17:1n-9 수준의 유의한 증가가 관찰되었으며, 2OHOA 투여 2시간에서 최대 혈장 농도에 도달했다(26.23 ± 5.79 nmol 2OHOA/ml 혈장 및 60.47 ± 6.53 nmol C17:1n-9/ml 혈장). 혈장 2OHOA 및 C17:1n-9 수준이 후속으로 감소하여 24시간에 최저값에 도달했다(각각 2.80 ± 0.69 및 14.03 ± 2.20 nmol/ml 혈장). 그러나, 특히 C17:1n-9의 경우 초기 수준에 도달하지 않았다(각각 1.22 ± 0.33 및 8.45 ± 2.52 nmol/ml 혈장). 만성 처리 후 C17:1n-9 대사산물의 수준은 2OHOA의 수준보다 높았다(도 21B). 두 화합물 간의 차이는 2OHOA 투여 전(0시간; 1.22 ± 0.33 nmol 2OHOA/mL 혈장 대 8.45 ± 2.52 nmol C17:1n-9/혈장 대비), 8시간 후(7.12 ± 1.56 nmol 2OHOA/mL 혈장 대 23.31 ± 5.18 nmol C17:1n-9/혈장) 및 24시간(2.80 ± 0.69 nmol 2OHOA/mL 혈장 대 14.03 ± 2.21 nmol C17:1n-9/혈장 대비)에서 유의적 이었다.
7.2. 면역억제 마우스의 이종이식종양의 지방산 조성의 분석
동물 모델에서 α-산화에 의한 2OHOA 대사의 산물로서 C17:1n-9 의 형성의 영향을 연구하기 위해, 면역억제 마우스의 이종 종양 모델에서 2OHOA의 수준과 비교하여 대사산물 C17:1n-9의 수준을 검출 및 분석하였다. 이를 위해, U-118 MG 교모세포종 세포를 면역억제 마우스에 주입하고, 1주일 후 비히클 또는 2OHOA 나트륨 염(200mg/kg)으로 마우스를 42일 동안 매일 경구 처리하기 시작했다. 처리가 완료되면, 마우스를 안락사시키고, 종양을 제거하고, 지질을 기체 크로마토그래피에 의해 2OHOA 및 C17:1n-9 지방산에 대해 처리하였다. 지방산 2OHOA는 2OHOA에 상응하는 머무름 시간의 피크가 관찰되지 않았기 때문에 이 화합물로 처리된 마우스의 이종이식 종양에서 검출되지 않았다(도 22A). 대조적으로, 2OHOA의 대사산물인 C17:1n-9 지방산(0.25 ± 0.04 nmol C17:1n-9/g 조직)은 2OHOA로 처리된 마우스의 종양에서 검출되었다(도 22B).
7.3. 종양의 부피와 대사산물 C17:1n-9의 양 사이의 상관관계
종양에 존재하는 C17:1n-9 대사산물의 수준과 종양의 부피 사이에 가능한 상관관계를 연구했으며, 이는 2OHOA의 혼입 및 대사와 종양에서 화합물의 효능 간의 관계를 나타낸다. 얻어진 그래프에서, 종양에 존재하는 C17:1n-9의 양과 종양의 부피 사이에 음의 상관관계가 관찰되었다(도 23). C17:1n-9의 양과 종양의 부피 사이에서 2OHOA로 처리된 마우스의 종양의 경우 -0.8248의 결정 계수 r 및 0.0001의 p-값이 얻어졌다. 즉, 종양의 부피가 작을수록 종양에서 더 많은 C17:1n-9 대사산물이 검출되었다. 이러한 결과는 대사산물 C17:1n-9가 현저한 항종양 활성을 갖고 2OHOA가 이 화합물의 효과적인 전구약물임을 보여준다.
7.4. 2OHOA 치료 후 진행된 신경교종을 갖는 인간 환자 내의 지방산 조성의 분석
2OHOA 및 C17:1n-9 지방산은 2OHOA(MIN-001-1203)의 임상 I/IIA에서 최소 1회의 3주 주기 동안 12g/day의 2OHOA 나트륨 치료에 반응하거나 반응하지 않은 8명의 환자의 혈장 샘플에서 검출 및 정량화되었다. 혈장 샘플은 상이한 시간(2OHOA 처리 후 0, 2, 4, 6, 8시간 및 8, 15, 21 및 28일 후)에서 얻었고 이후에 가스 크로마토그래피 기술을 사용한 지방산 분석을 위해 제공되었다.
크로마토그램에서, 2OHOA 및 이의 C17:1n-9 대사산물이 분석된 환자의 모든 혈장 샘플에서 검출되었다(도 24A). 임상 반응을 보인 환자(반응자)와 그렇지 않은 환자(비반응자)를 포함한 모든 환자에서 매우 유사한 약동학적 프로파일이 관찰되었다(도 24B). 두 화합물 모두 2OHOA 투여 4시간에 최고 수준에 도달했다. 모든 환자, 반응자 및 비반응자의 결과를 분석한 결과, 혈장 ml 당 53.08 ± 6.52 nmol 2OHOA 값과 혈장 ml 당 122.80 ± 10.61 nmol C17:1n-9 값이 약물의 첫 번째 흡수 후 4시간에서 얻어졌다(도 24C). 그 후, 2OHOA 및 C17:1n-9의 수준은 처리 후 8시간까지 점차적으로 감소했다(각각 혈장 ml 당 25.39 ± 3.99 및 92.89 ± 9.39 nmol). 처리 8일(192시간)에서, 두 혈장 화합물 양의 상당한 증가가 관찰되었다(혈장 ml 당 25.39 ± 3.99 nmol 2OHOA 및 혈장 ml 당 141.10 ± 16.35 nmol C17:1n-9). 화합물 2OHOA 및 C17:1n-9는 2OHOA 처리 15일(360시간) 후에 관찰된 바와 같이 시간 경과에 따라 환자의 혈장에 축적되었다(각각 184.70 ± 25.60 및 366.9 ± 72.47 nmol/ml 2OHOA 및 C17:1n.9 혈장)(도 24C).
세포와 동물에서 일어난 것과 유사하게, 모든 환자의 혈장에서 대사산물 C17:1n-9의 수준은 2OHOA의 수준보다 높았으며(도 14B) 2OHOA의 투여 8시간 후에 상당히 더 높았다(도 24C). C17:1n-9 수준은 8일 및 15일 동안 2OHOA로 치료받은 환자에서 2OHOA보다 각각 3.66배 및 2.20배 높은 것으로 관찰되었다(각각 25.39 ± 3.99 및 141.10 ± 16.35 nmol 2OHOA/ml 혈장과 비교하여 92.89 ± 9.39 및 311.10 ± 37.38 nmol C17:1n-9/ml 혈장).

Claims (31)

  1. 하기 화학식 (II)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 또는 기능식품적으로 허용되는 염 또는 에스테르, 및 하기 화학식 (III)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 또는 기능식품적으로 허용되는 염 또는 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물:
    Figure pct00060

    Figure pct00061

    상기 식에서, a는 1과 14 사이의 정수이고; b는 1과 7 사이의 정수이고; c는 0과 14 사이의 정수이고; m은 0과 (b-1) 사이의 정수이고; a+3b+c+3은 짝수 정수이다.
  2. 제1항에 있어서, c가 0, 3 또는 6이고 m=0인, 화합물.
  3. a=6, b = 1 및 c = 6 이거나; a=6, b = 2 및 c = 3 이거나; a= 6, b = 3 및 c = 0 이거나; a= 3, b =3 및 c=3 이거나; a= 2, b=4 및 c=3 이거나; 또는 a=2, b=5 및 c=0 인, 제1항에 따른 화학식 (II)의 화합물 또는 이의 약학적으로 또는 기능식품적으로 허용되는 염 또는 에스테르.
  4. a=1, b=6, c=0 및 m=0 인, 제1항에 따른 화학식 (III)의 화합물 또는 이의 약학적으로 또는 기능식품적으로 허용되는 염 또는 에스테르.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적으로 또는 기능식품적으로 허용되는 염이 나트륨 염인, 화합물.
  6. 의약으로 사용하기 위한, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 화합물.
  7. 신경재생을 유도하고 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 암, 신생물, 염증성 질환, 심혈관 질환, 피부 및 피하 조직 병리, 대사성 병리, 신경병성 통증, 마비, 수면 장애, 소화기 병리, 근골격 및 결합 조직 질환, 비뇨생식기 병리, 및 대사성 질환으로 이루어진 군에서 선택된 질환 또는 병리의 예방 및/또는 예방하는데 사용하기 위한, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 화합물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 예방 및/또는 치료 또는 신경재생의 유도는 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 전구 약물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 투여하는 것을 특징으로 하고, 상기 화학식 (I)의 화합물은 대사되어 치료적 유효량의 화학식 (II)의 화합물 또는 화학식 (III)의 화합물을 생성하는 것인, 화합물:
    Figure pct00062

    상기 식에서, a, b 및 c의 값은 화학식 (II)의 화합물 또는 화학식 (III)의 화합물의 a, b 및 c의 값과 동일하다.
  9. 제7항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르의 투여 전, 후 또는 동시에 투여되는, 화합물:
    Figure pct00063

    상기 식에서, a는 1과 14 사이의 정수이고; b는 1과 7 사이의 정수이고; c는 0에서 14 사이의 정수이고 a+3b +c+3은 짝수 정수이고, 상기 a, b 및 c의 값은 화학식 (II)의 화합물 또는 화학식 (III)의 화합물의 a, b 및 c의 값과 동일하거나 상이하다.
  10. 하기 화학식 (II)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르, 및 하기 화학식 (III)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제1 화합물, 및 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물:
    Figure pct00064

    Figure pct00065

    상기 식에서, a는 1과 14 사이의 정수이고; b는 1과 7 사이의 정수이고; c는 0과 14 사이의 정수이고; m은 0과 (b-1) 사이의 정수이고; a+3b+c+3은 짝수 정수이다.
  11. 제10항에 있어서, 하기 화학식 (I)의 제2 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 추가로 포함하는, 약학적 조성물:
    Figure pct00066

    상기 식에서, a는 1과 14 사이의 정수이고; b는 1과 7 사이의 정수이고; c는 0과 14 사이의 정수이고, a+3b +c+3은 짝수 정수이고, 상기 제2 화합물의 a, b 및 c의 값은 상기 적어도 하나의 제1 화합물의 a, b 및 c의 값과 동일하거나 상이하다.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, c 는 0, 3 또는 6 이고 m=0인, 약학적 조성물.
  13. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 적어도 하나의 제1 화합물은 a=6, b=1 및 c=6 이거나; a=6, b=2 및 c=3 이거나; a=6, b=3 및 c=0 이거나; a=3, b=3 및 c=3 이거나; a=2, b=4 및 c=3 이거나; 또는 a=2, b=5 및 c=0인 화학식 (II)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르인, 약학적 조성물.
  14. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 적어도 하나의 제1 화합물은 a=1, b=6, c=0 및 m=0 인 화학식 (II)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르인, 약학적 조성물.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적으로 허용되는 염이 나트륨 염인, 약학적 조성물.
  16. 의약으로 사용하기 위한, 제15항에 따른 약학적 조성물.
  17. 신경재생을 유도하고 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 암, 신생물, 염증성 질환, 심혈관 질환, 피부 및 피하 조직 병리, 대사성 병리, 신경병성 통증, 마비, 수면 장애, 소화기 병리, 근골격 및 결합 조직 질환, 비뇨생식기 병리, 및 대사성 질환으로 이루어진 군에서 선택된 질환 또는 병리를 예방 및/또는 치료하는데 사용하기 위한, 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 질환 또는 병리가 암인, 약학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 종양의 치료를 위한 방사선 치료, 화학요법 치료 또는 전기장 치료 전, 후 또는 동시에 투여되는, 약학적 조성물.
  20. 하기 화학식 (II)의 화합물, 또는 이의 기능식품적으로 허용되는 염 또는 에스테르, 및 하기 화학식 (III)의 화합물, 또는 이의 기능식품적으로 허용되는 염 또는 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제1 화합물, 및 적어도 하나의 기능식품적으로 허용되는 부형제를 포함하는 건강 기능성 식품 조성물:
    Figure pct00067

    Figure pct00068

    상기 식에서, a는 1과 14 사이의 정수이고; b는 1과 7 사이의 정수이고; c는 0과 14 사이의 정수이고; m은 0과 (b-1) 사이의 정수이고; a+3b+c+3은 짝수 정수이다.
  21. 제20항에 있어서, 하기 화학식 (I)의 제2 화합물 또는 이의 기능식품적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 추가로 포함하는 건강 기능성 식품 조성물:
    Figure pct00069

    상기 식에서, a는 1과 14 사이의 정수이고; b는 1과 7 사이의 정수이고; c는 0에서 14 사이의 정수이고; a+3b +c+3은 짝수 정수이고; 상기 제2 화합물의 a, b 및 c의 상기 값은 적어도 하나의 제1 화합물의 a, b 및 c의 값과 동일하거나 상이하다.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, c 는 0, 3 또는 6 이고 m=0인, 건강 기능성 식품 조성물.
  23. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 적어도 하나의 제1 화합물은 a=6, b=1 및 c=6 이거나; a=6, b=2 및 c=3 이거나; a=6, b=3 및 c=0 이거나; a=3, b=3 및 c=3 이거나; a=2, b=4 및 c=3 이거나; 또는 a=2, b=5 및 c=0인 화학식 (II)의 화합물 또는 이의 기능식품적으로 허용되는 염 또는 에스테르인, 건강 기능성 식품 조성물.
  24. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 적어도 하나의 제1 화합물은 a=1, b=6, c=0 및 m=0 인 화학식 (II)의 화합물 또는 이의 기능식품적으로 허용되는 염 또는 에스테르인, 건강 기능성 식품 조성물.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 기능식품적으로 허용되는 염이 나트륨 염인, 건강 기능성 식품 조성물.
  26. 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 암, 신생물, 염증성 질환, 심혈관 질환, 피부 및 피하 조직 병리, 대사성 병리, 신경병성 통증, 마비, 수면 장애, 소화기 병리, 근골격 및 결합 조직 질환, 비뇨생식기 병리, 및 대사성 질환으로 이루어진 군에서 선택된 질환 또는 병리의 예방에 사용하기 위한, 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 건강 기능성 식품 조성물.
  27. 대상체에서 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 이용한 질환 또는 병리의 치료 또는 예방적 치료의 효능을 측정하기 위한 시험관내 방법으로서, 상기 대상체의 생물학적 샘플에서 하기 화학식 (II) 또는 하기 화학식 (III)의 화합물 또는 이의 카르복실레이트 음이온 또는 이로부터 생체내 또는 시험관내에서 형성된 유도체의 양을 시험관내에서 측정하는 것을 포함하고, 상기 양은 상기 질병 또는 병리를 치료하는 효능과 관련이 있는 것인, 방법:
    Figure pct00070

    Figure pct00071

    Figure pct00072

    상기 식에서, a는 1과 14 사이의 정수이고; b는 1과 7 사이의 정수이고; c는 0과 14 사이의 정수이고; m은 0과 (b-1) 사이의 정수이고; a+3b+c+3은 짝수 정수이다.
  28. 제27항에 있어서, c는 0, 3 또는 6 이고 m=0 인, 방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 방법은 상기 대상체의 생물학적 샘플에서 하기 화학식 (II)의 화합물 또는 이의 카르복실레이트 음이온 또는 이로부터 생체내 또는 시험관내에서 형성된 유도체의 양을 측정하는 것을 포함하는, 방법:
    Figure pct00073

    상기 식에서, a=6, b=1 및 c=6 이거나; a=6, b=2 및 c=3 이거나; a=6, b=3 및 c=0 이거나; a=3, b=3 및 c=3 이거나; a=2, b=4 및 c=3 이거나; 또는 a=2, b=5 및 c=0 이다.
  30. 제27항에 있어서, 상기 방법은 상기 대상체의 생물학적 샘플에서 하기 화학식 (III)의 화합물 또는 이의 카르복실레이트 음이온 또는 이로부터 생체내 또는 시험관내에서 형성된 유도체의 양을 측정하는 것을 포함하는, 방법:
    Figure pct00074

    상기 식에서, a=1, b=6, c=0 및 m=0 이다.
  31. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적으로 허용되는 염이 나트륨 염인, 방법.

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