KR20220131620A - 다기능 핵산 운반체, 입자 및 이들의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 목적하는 운반소재를 포함한 올리고(운반-올리고 접합체) 및 상기 올리고에 대한 상보적 단위 염기서열로 이루어진 기본모듈 단위가 1회 이상 반복하는 다기능 핵산으로 구성되며, 상기 올리고와 상기 다기능 핵산은 변형 뉴클레오타이드(nucleotide) 및 뉴클레오사이드(nucleoside) 유사체로 이루어진 군에서 선택되어진 1종 이상과 천연 뉴클레오타이드를 구성성분으로 제조되는 다기능 핵산 운반체, 입자 및 이들의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 제조방법은 간단한 방법으로 1종 이상의 운반소재를 포함하는 기본모듈 단위를 반복적으로 늘리면서 대량으로 운반체를 생산할 수 있게 한다. 상기 제조된 다기능 핵산 운반체는 생체 내 안정성이 향상되며, 다기능 운반소재들 동시에 특이적으로 표적세포 내로 전달하여 높은 치료 효과가 있고, 영상화 검사가 동시에 가능하다. 이를 통해 각종 질병의 영상 검사 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

다기능 핵산 운반체, 입자 및 이들의 제조방법{Multifunctional nucleic acid carriers, particles and methods for their preparation}
본 발명은 천연 뉴클레오타이드, 변형 뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드 유사체를 구성성분으로 하는 다기능 핵산 운반체, 입자 및 이들의 제조방법에 관한 것이다.
약물의 효능과 효율적 전달을 위해, 이종다중의 활성물질이 탑재된 고분자를 특정 세포로 제어 가능하게 운반하고 세포 독성 및 세포 손상을 최소화할 수 있으며 치료와 진단을 동시에 할 수 있는 약물 운반체에 대한 요구가 높다. 약물 운반체를 의학적 치료법에서 유용성에 있어 주요 관심사는 안정성 및 세포에 대한 흡수효율과 치료 가능성이다. 활성물질은 세포에 비특이적이고 낮은 효율로 흡수될 수 있어, 활성물질을 특정 세포에 전달하는 것이 개선되면 흡수효율이 높아지고 효능이 개선될 것이다.
암의 치료에 사용되는 고분자인 핵산은 생체 내 안정성이 낮아 생체 내에서 단시간에 분해되며, 핵산은 음전하를 띄고 있기 때문에 소수성인 세포의 인지질 이중막을 통과하지 못하므로 단순 확산을 통한 세포 내 전달이 어렵다는 문제가 있다. 이와 같은 핵산을 세포 내로 효율적으로 전달하기 위해서는, 분해효소 저항성을 가지며 장시간 생체 내에서 순환하며 임상적으로 가능한 주입경로를 통해 표적 세포에 도달할 수 있고 세포투과 후에는 효과적인 세포질 방출이 가능한 효과적인 새로운 전달 시스템이 필요하다.
상기 핵산은 생체 내 안정성 향상을 위해 핵산 분해효소 저항성 부여 및 비 특이적 면역반응 감소를 위해 다양한 변형(modification)이 이루어진 형태를 가질 수도 있는데, 상기 변형은 하나 이상의 뉴클레오타이드 내 당 구조의 2´ 탄소 위치에서 -OH기의 치환에 의한 변형, 그리고 뉴클레오타이드 내 당(sugar) 구조 내의 산소가 황으로 치환된 변형 뉴클레오타이드결합의 변형 등에서 하나 또는 둘 이상 조합되어 사용될 수 있으며, PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형도 사용이 가능하다.
특히 생체 내(in vivo) 또는 생체 외(in vitro)에서 표적화 리간드, 영상 소재와 다종다중의 약물이 탑재된 핵산의 전달 효율을 높이기 위해 많은 종의 세포전달 물질들을 사용할 수 있다. 예를 들면, 리포좀, 양이온계 계면활성물질 등이 일반적으로 많이 사용되고 있으며 리포좀에 핵산을 융합시키는 방법이나 양이온을 지닌 지질이나 고분자를 이용한 방법 등의 운반체를 이용하기도 하고, 핵산의 결합 기본구조를 메틸포스포네이트 (methylphosphonate)나 PNA(peptide nucleic acid) 등으로 화학구조를 변경시키거나, 접합체(conjugate)를 이용하는 약물 운반체가 알려져 있다.
상기 약물 운반체는 리포좀, 양이온 고분자 구조체 등의 다양한 고분자를 사용하는 방법으로, 입자 형성을 통하여 핵산을 약물 운반체에 포획하여 세포에 핵산을 전달하는 것이다. 약물 운반체 중 주로 활용되는 방법은 고분자 입자(polymeric nanoparticle), 고분자 미셀(polymer micelle), 리포플렉스(lipoplex) 등이 있는데, 이 중에서 리포플렉스를 이용한 방법은 양이온성 지질로 구성되어 세포의 엔도좀(endosome)의 음이온성 지질과 상호작용하여 엔도좀의 탈 안정화 효과를 유발하여 세포 내로 전달하는 역할을 한다.
양이온성 분자 또는 합성 고분자를 이용한 운반체의 경우 세포 내로의 수송 효율이 낮으며 세포 내로의 핵산 전달과정에서 유발될 수 있는 세포 독성에 대한 문제가 지적되었다. 입자화 소재, 양친매성(amphiphilic) 고분자와 독성이 감소된 다양한 신규 양이온성 고분자를 제조하거나 기존의 양이온성 고분자를 변형함으로써 독성이 감소된 양이온성 고분자 표적화 운반체를 개발하고 있으나 여전히 핵산이 지니는 낮은 전하 밀도와 고유의 견고한 구조 때문에 세포 내로의 수송효율이 낮다는 문제점이 있다.
본 발명을 표적화 리간드, 입자화 소재, 영상 소재와 이종다중 활성물질들의 운반소재들을 동시에 탐재할 수 있는 다기능 핵산 및 운반-올리고 접합체를 개발하여 보다 용이하게 치료와 진단이 동시에 가능하고 생체 안정성 및 생체적합성이 확보된 표적화 다기능 핵산 운반체를 제조하여 완성하였다.
본 발명은 목적하는 운반소재 포함하는 올리고(운반-올리고 접합체) 및 상기 올리고에 대한 상보적 단위 염기서열로 구성된 기본모듈 단위가 1회 이상 반복하는 다기능 핵산으로 구성되며, 변형 뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드 유사체로 이루어진 군에서 선택되어진 1종 이상과 천연 뉴클레오타이드를 구성성분으로 제조되는 다기능 핵산 운반체, 입자 및 이들의 제조방법을 제공하여, 표적 세포로 다기능 핵산을 특이적으로 전달하여 동시에 치료 효과가 있고 영상화가 가능하며, 상기 운반체는 각종 분해효소와 같은 외부공격으로부터 안정성을 확보할 수 있는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상술한 바와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 생체 안정성 및 세포 내 전달성을 향상시키기 위한 다기능 핵산 운반체 및 제조방법을 제공하는데 목적이 있다.
단수 형태는 달리 그 내용을 명확하게 지시하지 않는 한 복수의 뜻을 포함하며, "적어도 하나" 및 "하나 또는 그 이상"과 상호교환적으로 사용된다. 따라서, "압타머“에 대한 언급은 압타머의 혼합물 등을 포함한다.
"올리고뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드 화합물의 사슬을 지칭하며, "올리고뉴클레오타이드" 및 "올리고"라는 용어와 상호 교환 가능하게 사용된다. "올리고머"는 출발 올리고에 비례하여 점차적으로 더 짧은 길이의 올리고를 나타낸다. 올리고머는 올리고의 부분적인 분해 또는 절단의 결과로서 시험관내 및 생체 내에서 생성될 수 있다.
"뉴클레오타이드"는 탄소, 수소, 산소 및 질소(피리미딘 또는 퓨린), 펜토오스(데옥시리보스, 리보스, 아라비노스)로 이루어진 고리형 질소 함유 염기(아글리콘으로도 알려짐) , 키실로오스 또는 리독소) 또는 육당 당 부분과 인산기(아인산)를 포함한다.
‘천연 뉴클레오타이드’ 또는 ‘뉴클레오타이드’는 DNA나 RNA를 구성하는 염기인 아데닌, 구아닌, 티민, 우라실, 시토신 중 하나가 오탄당, 인산과 1:1:1의 비율로 제조된 화합물을 말하는데, DNA나 RNA를 구성하는 염기와 오탄당으로 제조된 화합물이다. 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드(예를 들면, 본 발명의 핵산들, 예를 들면, DNA와 RNA 분자)에서, 용어 "천연" A, G, T 또는 C 디옥시리보뉴클레오타이드들와 A, G, U 또는 C 리보뉴클레오타이드들을 말하며 핵산을 구성하는 단위체인 분자이다.
‘뉴클레오사이드(Nucleoside)’ 또는 ‘뉴클레오시드’는 핵염기와 오탄당이 N-글리코사이드결합을 이룬 화합물이다. 인산화효소에 의해 인산기가 결합되면 핵산의 구성성분인 뉴클레오타이드가 된다.
본 발명은 목적하는 운반소재를 포함하는 올리고(운반-올리고 접합체) 및 상기 올리고에 대한 상보적 단위 염기서열로 구성된 기본모듈 단위가 1회 이상 반복하는 다기능 핵산으로 구성되며, 변형 뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드 유사체로 이루어진 군에서 선택되어진 1종 이상과 천연 뉴클레오타이드를 구성성분으로 합성하는 다기능 핵산 운반체 및 입자를 제공한다.
본 발명의 운반-올리고 접합체를 구성하는 운반소재는 표적지향 리간드, 활성물질, 영상소재, 나노입자, 핵산나노구조체 및 입자화 소재를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 1종 이상일 수도 있다. 목적하는 다기능 핵산 운반체의 기능을 최적화에 사용되는 소재를 포함하며 운반소재는 이들에만 국한되는 것은 아니다.
I. 다기능 핵산
본 발명의 다기능 핵산은 1종 이상의 운반소재를 포함할 수 있는 올리고에 대한 상보적 단위 염기서열로 구성되거나, 그 자체가 표적지향 리간드 압타머 염기서열 또는 활성물질 siRNA 염기서열로 이루어진 단위 염기서열로 이루어진 기본모듈 단위 및 상기 기본모듈 단위가 1회 이상 반복적으로 존재하는 핵산이며, 변형 뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드 유사체로 이루어진 군에서 선택되어진 1종 이상과 천연 뉴클레오타이드를 구성성분으로 합성하는 핵산으로 본 발명의 다기능 핵산 운반체의 주요 구성성분이다.
본 발명의 다기능 핵산은 변형 뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드 유사체로 이루어진 군에서 선택되어진 1종 이상을 구성성분으로 포함하여, 단순히 천연 뉴클레오타이드로 제조된 핵산에 비해 보다 더 핵산분해효소에 대한 저항성이 있으며 약제학적 효능을 함유하는 것을 입증하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 다기능 핵산은 단위 염기서열들로 구성된 기본모듈 단위를 1회 이상 반복적으로 늘리면서 길이를 확대하여 다량의 운반소재를 탑재할 수 있으며, 간단한 방법으로 대량으로 생산할 수 있으며, 생체 내 안정성이 향상되며, 다기능 물질들 동시에 특이적으로 표적세포 내로 전달하여 높은 치료 효과가 있고, 영상화 검사가 동시에 가능하다. 이를 통해 각종 질병의 영상 검사 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명은 표적지향 압타머와 RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 기능이 있는 올리고로 이루어진 군에서 선택되어진 1종 이상을 자체 염기서열에 내재한 다기능 핵산을 제공한다.
구체적으로 살펴보면, 본 발명은 변형 뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드 유사체로 이루어진 군에서 선택되어진 1종 이상과 천연 뉴클레오타이드를 구성성분으로 하고,
1종 이상의 리간드가 결합하는 올리고 접합체(제1 올리고 접합체, 올리고-리간드 접합체)가 상보적 결합이 가능하거나 또는, 그 자체가 1종 이상의 압타머를 포함하는 단위 제1 염기서열;
화학치료제, 방사능치료제 및 바이오의약품으로 구성된 활성물질 및 영상소재로 이루어진 군에서 선택되어진 1종 이상이 결합하는 올리고 접합체(제2 올리고 접합체, 활성물질-올리고 접합체)가 상보적 결합이 가능하거나, 1종 이상의 센스 서열, 루프영역 서열과 안티센스 서열로 구성된 siRNA를 포함하는 단위 제2 염기서열; 및
1종 이상의 입자화 소재가 결합하는 올리고 접합체(제3 올리고 접합체, 입자화 소재-올리고 접합체)가 결합이 가능한 단위 제3 염기서열로 이루어진 군에서 선택되어진 2종 이상으로 구성되는 기본모듈 단위이며,
상기 단위 염기서열(제1, 제2 및 제3 염기서열)로 구성된 기본모듈 단위가 1회 이상 반복적으로 존재하는 다기능 핵산, 이의 입자 및 이들의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명 실시례에서 사용하는 단위 염기서열로 구성된 기본모듈 단위가 n회 반복한 다기능 핵산은 구조식 (1)이다.
(단위 제1 염기서열 - 단위 제2 염기서열 -단위 제3 염기서열)n - 구조식 (1)
여기서, n은 1이상의 정수로 반복횟수이다.
본 발명에서 제시하는 다기능 핵산의 구조식 (1)을 세부화하면 다음과 같다.
첫째, 제1 올리고 접합체가 상보적 결합이 가능한 단위 제1 염기서열, 제2 올리고 접합체가 상보적 결합이 가능한 단위 제2 염기서열, 및 제3 올리고 접합체가 상보적 결합이 가능한 단위 제3 염기서열로 이루어진 군에서 선택되어진 어느 2종 이상의 단위 염기서열로 구성된 기본모듈 단위가 1회 이상 반복적으로 존재하는 제1 다기능 핵산이라고 지칭하였다.
둘째, 제1 올리고 접합체가 상보적 결합이 가능한 단위 제1 염기서열, siRNA를 포함한 단위 제2 염기서열, 및 제3 올리고 접합체가 상보적 결합이 가능한 단위 제3 염기서열로 이루어진 군에서 선택되어진 어느 2종 이상의 단위 염기서열로 구성된 기본모듈 단위가 1회 이상 반복적으로 존재하는 제2 다기능 핵산이라고 지칭하였다.
셋째, 표적지향 리간드 압타머를 포함한 단위 제1 염기서열, 제2 올리고 접합체가 상보적 결합이 가능한 단위 제2 염기서열, 및 제3 올리고 접합체가 상보적 결합이 가능한 단위 제3 염기서열로 이루어진 군에서 선택되어진 어느 2종 이상의 단위 염기서열로 구성된 기본모듈 단위가 1회 이상 반복적으로 존재하는 제3 다기능 핵산이라고 지칭하였다.
넷째, 압타머를 포함한 단위 제1 염기서열; siRNA를 포함한 단위 제2 염기서열; 및 제3 올리고 접합체가 상보적 결합이 가능한 단위 제3 염기서열;로 이루어진 군에서 선택되어진 어느 2종 이상의 단위 염기서열로 구성된 기본모듈 단위가 1회 이상 반복적으로 존재하는 제4 다기능 핵산이라고 지칭하였다.
본 발명의 다기능 핵산은 단위 염기서열로 이루어진 기본모듈 단위의 1회 이상 반복으로 제조할 수 있는데, 단위 염기서열, 기본모듈 단위 및 반복횟수를 다양하게 변형하여 다양한 형태로 제조할 수도 있다.
본 발명의 다기능 핵산을 구성하는 기본모듈 단위 사이와 기본모듈 단위를 구성하는 단위 염기서열들 사이에 단일가닥핵산 스페이서(spacer)가 존재할 수 있다. 상기 단일가닥핵산 스페이서는 2~50개의 염기, 바람직하게 5~30개의 염기로 구성될 수 있다.
본 발명의 단일가닥핵산 스페이서는 헤어핀 구조를 형성하는 염기서열일 수도 있다. 상기 헤어핀 구조는 다기능 핵산을 응축시켜 용이하게 입자를 형성할 수 있도록 할 수도 있다.
상기 헤어핀 구조는 단일가닥 DNA 또는 더 일반적으로 RNA에서 생기는 구조로 염기쌍 분자 내의 줄기-루프(stem-loop)이다. 단일가닥핵산의 두 영역, 서로 반대 방향으로 염기서열이 상보적인 경우, 염기쌍을 형성하여 이중 나선을 형성하고, 나머지 염기서열은 쌍을 이루지 않은 루프 염기서열이 있을 때 헤어핀 구조를 형성한다.
본 발명은 표적지향 리간드인 압타머 염기서열로 이루어진 단위 제1 염기서열과 단위 제3 염기서열로 구성된 기본모듈 단위가 1회 이상 반복적으로 있는 다기능 핵산을 제공할 수 있다.
본 발명은 일 말단에 상기 활성물질 및 영상소재로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 핵산나노구조체와 표적지향 리간드를 구성하는 1종 이상으로 구성되는 기본모듈 단위로 하는 다기능 핵산을 제공한다.
본 발명의 핵산나노구조체는 짧은 핵산으로 만들어지는 나노구조체로 활성물질과 영상소재를 포함할 수도 있다,
본 발명에서 다기능 핵산을 구성하는 상기 단위 제1, 제2 및 제3 염기서열은 DNA 또는 RNA일 수 있다.
단위 제1 염기서열을 구성하는 염기서열의 길이는 표적지향성 리간드를 운반하는 제1 올리고 접합체와 상보적 결합을 하는 경우는 5~50개이며 바람직하게 10~30개 염기일 수 있으며 동일하거나 상이한 염기서열 단위로 반복할 수도 있다.
그 자체가 압타머인 경우는 15~100개일 수 있으며 동일하거나 상이한 압타머가 반복할 수도 있다. 일반적으로 압타머는 전통적인 Watson-Crick 염기 쌍형성 이외의 다른 상호작용을 통하여 분자에 대한 특이적 결합 친화력(affinity)을 보유한 핵산 분자들이다.
단위 제2 염기서열을 구성하는 염기서열의 길이는 활성물질 또는 영상 소재를 운반하는 제2 올리고 접합체와 상보적인 결합을 하는 경우는 5~50개이며 바람직하게 10~30개 염기일 수 있으며 동일하거나 상이한 염기서열 단위로 반복할 수도 있다.
그 자체가 siRNA인 경우는 40~100개일 수 있으며 동일하거나 상이한 siRNA 단위로 반복할 수도 있다. 일반적으로 siRNA는 RNAi를 유도하는 물질로서, 약 20 내지 30개의 뉴클레오타이드로 구성된 짧은 RNA 이중나선 가닥을 말한다. 본 발명에서 siRNA는 센스서열, 루프영역 서열과 안티센스 서열로 구성되며, 루프영역 서열은 제1 올리고 접합체 또는 제3접합체와 상보적인 결합을 할 수도 있다.
단위 제3 염기서열을 구성하는 염기서열 길이는 입자화 소재를 운반하는 제3 올리고 접합체가 상보적 결합 가능하게 5~50개이며 바람직하게 10~30개 염기이다.
도1은 단위 제1 염기서열, 제2 염기서열 및 제3 염기서열로 구성된 기본모듈 단위의 배열 모식도이며 제1 염기서열n(핵산 구조체에서 n번째 제1 염기서열)과 제1 염기서열n+1(핵산 구조체에서 n+1번째 제1 염기서열)의 염기서열, 제2 염기서열n(핵산 구조체에서 n번째 제2 염기서열)과 제2 염기서열n+1(핵산 구조체에서 n+1번째 제2 염기서열)의 염기서열 그리고 제3 염기서열n(핵산 구조체에서 n번째 제3 염기서열)과 제3 염기서열n+1(핵산 구조체에서 n+1번째 제3 염기서열)의 염기서열은 서로 동일할 수도 있고, 서로 상이할 수도 있다.
본 발명은 다기능 핵산 또는 운반-올리고 접합체의 올리고는 변형 뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드 유사체로 이루어진 군에서 선택되어진 1종 이상과 천연 뉴클레오타이드를 구성성분으로 제조되는 염기서열 및 제조방법을 제공한다.
당이 D-리보스이면 리보뉴클레오사이드, D-2′-디옥시리보스이면 디옥시리보뉴클레오사이드라고 하며 핵염기가 퓨린계일 때는 퓨린리보뉴클레오사이드라고 하고 핵염기가 피리미딘계일 때는 피리미딘리보뉴클레오사이드라고 한다.
핵산 유사체의 합성은 표적 선택성, 결합 효율, 개선된 대사 안정성 및 감소 된 독성을 나타내는 생물학적 활성 올리고의 발달에 대한 결정적인 단계로서 나타났다. 올리고 화학에서의 진보와 생물학적 모델 시스템에서의 스크리닝은 성공적인 핵산 기반 표적화 전략을 촉진시켰다. 비 변형 핵산은 약동학 특성이 제한적이며 핵산 분해 효소에 의해 급속히 분해된다. 이런 문제의 개선은 하나 또는 여러 개의 뉴클레오타이드 실체에 화학적 변형을 도입함으로써 달성할 수 있다.
본 발명은 다기능 핵산 또는 운반-올리고 접합체는 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 염기서열을 제공한다.
본 발명에서, 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드(예를 들면, 본 발명의 핵산들, 예를 들면, DNA와 RNA 분자)에서, 용어 "변형", "유사체" 또는 적절하게는 "변형된"은 A, G, T 또는 C 디옥시리보뉴클레오타이드(또는 디옥시리보뉴클레오사이드)들와 A, G, U 또는 C 리보뉴클레오타이드(또는 디옥시리보뉴클레오사이드)들에 관한 변형을 말한다. 또한, 뉴클레오타이드들은, 당, 핵염기, 또는 뉴클레오사이드간 연결에 대한(예를 들면, 연결 포스페이트에 대한/포스포디에스테르 연결에 대한/포스포디에스테르 골격에 대한) 임의의 유용한 변형을 포함할 수 있다.
상기 핵산은 생체 내 안정성 향상을 위해 핵산 분해효소 저항성 부여 및 비 특이적 면역반응 감소를 위해 다양한 변형(modification)이 이루어진 형태를 가질 수도 있는데, 상기 변형은 하나 이상의 뉴클레오타이드 내 당 구조의 2´ 탄소 위치에서 -OH기가 -CH3(메틸), -OCH3(methoxy), -NH2, -F(불소), -O-2-메톡시에틸 -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필, -O-N-메틸아세트아미도 또는 -O-디메틸아미도옥시에틸로의 치환에 의한 변형, 그리고 뉴클레오타이드 내 당(sugar) 구조 내의 산소가 황으로 치환된 변형, 뉴클레오타이드결합의 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphophate), 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로의 변형 등에서 하나 또는 둘 이상 조합되어 사용될 수 있으며, PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형도 사용이 가능하다.
본 발명은 다기능 핵산 또는 운반-올리고 접합체는 변형 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 유사체를 포함하는 염기서열을 제공한다.
상기 염기서열은 활성물질 또는 이의 프로드럭을 구성성분으로 하여 제조할 수 있으며, 예를 들면, 상기 다기능 핵산 또는 운반-올리고 접합체는 뉴클레오타이드와 뉴클레오사이드 치료제가 염기서열의 구성성분의 일부로, 하나 이상의 약물이 탑재된 단일가닥 핵산을 갖는 구조체일 수도 있다.
본 발명은 다기능 핵산 또는 운반-올리고 접합체는 뉴클레오사이드 유사체를 포함하는 염기서열을 제공한다.
상기 다기능 핵산 운반체는 뉴클레오사이드 유사체를 표적 세포로 전달하는 기능을 제공할 수 있다.
"뉴클레오사이드"는 펜토스(데옥시리보스, 리보스, 아라비노스, 크실로스 또는 리독소) 또는 헥 소스 설탕 잔기에 연결된 질소 함유 염기 잔기(퓨린 또는 피리미딘 염기)를 포함하는 분자를 의미한다. 뉴클레오사이드를 형성하는 전형적인 퓨린 또는 피리미딘 염기는 아데닌, 구아닌, 시토신, 5-메틸 시토신, 우라실 및 티민을 포함한다. "뉴클레오사이드"는 선택적으로 치환된 뉴클레오사이드, 예를 들어 할로겐, 예를 들어 불소로 치환된 뉴클레오사이드를 포함한다. "뉴클레오사이드"는 할로겐, 예컨대 불소로 치환된 임의로 치환된 헤테로 사이클릭 및 당 잔기를 갖는 분자를 또한 포함한다.
"뉴클레오사이드 유사체"(nucleoside analog)는 상기 정의된 바와 같이 "뉴클레오사이드"의 당 및 염기 부분에 독립적으로 또는 함께 개질된 비천연 분자 또는 합성 화합물을 나타낸다.
"뉴클레오사이드 치료제"는 항바이러스, 항균 또는 항암 활성과 같은 입증된 치료학적 또는 약학적 활성을 갖는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체를 의미한다.
본 발명에서 고려되는 단량체 뉴클레오사이드 치료제는 아데포비어, 시도피비어, 클라드리빈(류스타틴으로도 공지 됨), 시타라빈, 도시플루리딘, 에노시타빈(베노일시토신 아라비 시드로도 공지됨), 플록스우린, 인산 플루다라빈, 젬시타빈 및 펜토스타틴; 바이옥신, 리바비린과 같은 항 바이러스 제제를 포함한다.
상기 다기능 핵산 또는 운반-올리고 접합체는 약제적 활성이 있는 뉴클레오사이드 유사체를 구성성분으로 하여 제조되는 염기서열로 표적화 능력과 약물 운반 기능을 함께 수행할 수 있다. 상기 다기능 핵산 구조체 또는 운반-올리고 접합체를 구성하는 약제적 활성이 있는 뉴클레오사이드 유사체는 활성이 없으나, 상기 분자가 효소에 의해 분해되면서 방출된 약제적 활성이 있는 뉴클레오사이드 유사체는 약제적 활성을 회복될 수 있다.
적합한 뉴클레오사이드 치료제는 하이드록실 그룹과 같은 중합 가능한 잔기를 갖는 것들이다. 예를 들어, 오탄당 부분은 3' 또는 5' 위치에서 히드록실기로 치환될 수 있다.
"헤테로 사이클릭 유도체"는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체의 유도체를 지칭한다. 예시적인 헤테로시 클릭 유도체는 질소 함유 염기 잔기(퓨린 또는 피리미딘)를 포함하는 기본분자인 "뉴클레오사이드 염기"를 포함한다. 이 용어는 임의로 치환된 뉴클레오사이드 염기, 예컨대 할로겐, 예를 들어 불소로 치환된 것들을 포함한다. 치료활성을 갖는 예시적인 헤테로시 클릭 유도체(예를 들어, 퓨린 또는 피리미딘 유도체)는 6-메르캅토퓨린, 아자티오프린, 5-플루오로우라실 및 티오구아닌을 포함한다.
본 발명은 약학적으로 비활성인 결합에 의해 연결된 약학적으로 활성인 분자의 사슬로부터 형성된 중합체성 화합물을 포함할 수도 있다. 한 실시 양태에서, 약학적 활성 분자는 2' O-메틸 리보뉴클레오사이드와 같은 뉴클레아제 내성 잔기에 의해 사슬을 따라 분리된 치료모노머 뉴클레오사이드, 뉴클레오사이드 유사체, 탈핵 뉴클레오사이드 또는 헤테로 사이클릭 유도체이다. 단량체 그룹은 포스포디에스테르(pO), 포스포로티오네이트 또는 알킬 또는 알케닐 포스포네이트(R-pO) 그룹에 의해 사슬을 따라 연결될 수 있다. 바람직한 구체 예에서, 사슬은 2 내지 100(보다 바람직하게는 2 내지 35)의 치료적 모노머 뉴클레오사이드, 뉴클레오사이드 유사체, 탈핵 뉴클레오사이드 또는 이의 헤테로 사이 클릭 유도체를 포함한다.
"포스포디에스테르"는 뉴클레오사이드 단량체를 연결시키는 데 사용되는 결합 -PO4를 의미한다. 발명에서 고려되는 포스포디에스테르 결합("PO")은 자연 발생 DNA에서 발견되는 결합이다.
"포스포로티오에이트"는 뉴클레오사이드 단량체를 연결시키는데 사용되는 결합 -PO3(S)를 나타낸다. 포스포로티오에이트 결합은 화학식 4에 나타낸 바와 같이 포스포 에스테르 결합상의 산소 원자 대신 황 원자를 포함한다.
"H-, 알킬 또는 알케닐 포스포네이트"라는 용어는 뉴클레오사이드, 뉴클레오사이드 유사체 또는 탈핵 뉴클레오 사이드 단량체를 연결시키는데 사용되는 결합 -PO3R-를 말한다. H-포스포네이트 결합은 상술한 포스 포디에스테르 결합과 같이 산소 원자 대신에 인에 결합된 수소 원자를 함유한다. 알킬 포스포네이트 결합(R-pO)은 산소 원자 대신 인 원자에 결합된 탄소 원자를 함유한다. 적합한 알킬기는 C1-35 선형 또는 분 지형 사슬 알킬기, 바람직하게는 C1-20, 보다 바람직하게는 C1-5 선형 또는 분지형 알킬이다. 적합한 알 케닐 그룹은 C2-35 선형 또는 분지형 사슬 알케닐, 바람직하게는 C2-20, 보다 바람직하게는 C1-5 선형 또는 분지형 알케닐이다.
본 발명은 포스포디에스테르(pO), 포스포로티오네이트 또는 H-또는 알킬 또는 알케닐 포스포네이트에 의해 연결된 약학적 활성 또는 치료모노머 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체의 사슬로부터 형성된 폴리 뉴클레오타이드 화합물에 관한 것이다. 바람직한 구체 예에서, 사슬은 2 내지 100(보다 바람직하게는 2 내지 35)의 치료학적 단량체 뉴클레오사이드, 뉴클레오사이드 유사체 또는 무치환 뉴클레오사이드를 포함한다.
혼합 포스포디에스테르 및 포스포로티오네이트 결합을 함유하는 폴리 뉴클레오타이드를 고려한다. 포스포로티오네이트 결합을 갖는 올리고머는 pO 결합을 갖는 올리고머보다 더 안정하며, 결과적으로 PS 올리고머는 pO 결합된 올리고머보다 느린 속도로 분해된다.
본 발명은 치료학적으로 활성인 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체 및 뉴클레아제 내성 부분(예컨대, 탈회 2' O-메틸 뉴클레오사이드)의 교대 체인을 사용하여 뉴클레오사이드 치료제의 방출 속도를 조절할 수 있는 능력을 함유하는 폴리 뉴클레오타이드를 형성하는 것을 고려한다. 치료적 활성 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체 및 뉴클레아제 내성 잔기(예컨대, 무-염기성 2' O-메틸 뉴클레오사이드)의 교대하는 세그먼트의 구조는 치료제의 원하는 방출을 달성하도록 변형될 수 있다.
상기 표적화-치료분자는 약물의 활성 대사물이 도입된 올리고 화합물을 지칭할 수도 있다. 약물의 활성 대사물에는 겜시타빈 트리포스페이트(dFdCTP)와 5-플루오로 우라실(5-FU)와 5-F-2'-UTP 트리 포스페이트(5FdUTP) 등의 단량체 뉴클레오사이드 치료제가 포함될 수 있다.
약물의 활성 대사물인 dFdC 입자와 5FdU 입자는 압타머에 유기합성 또는 효소적으로 도입할 수 있다. 또는 상기 단량체 뉴클레오사이드 치료제를 구성성분으로 제조되는 폴리머가 압타머의 말단에 연결될 수 도 있다.
본 발명은 젬시타빈을 핵산 구조체의 합성 과정에 뉴클레오타이드와 변형 뉴클레오타이드와 함께 첨가하여 약학적 효능이 있는 핵산 구조체를 제조에 관한 것이다.
본 발명의 젬시타빈(gemcitabine, 2′,2′-difluorodeoxycytidine, 2'-데옥시-2',2'-디플루오로시티딘)은 합성 피리미딘 뉴클레오사이드 프로드럭으로 데옥시시티딘(deoxycytidine)의 2' 탄소 상에 있는 수소 원자가 불소(fluorine) 원자로 치환된 데옥시시티딘 유사체(deoxycytidine analoGTe)이다.
젬시타빈은 폐암, 췌장암, 방광암, 유방암을 비롯한 다양한 암종의 화학적 치료에 사용되며, 다양한 엔테로바이러스(enterovirus)의 증식과 상기 바이러스의 레플리콘(replicon) 증식을 억제하는 활성을 가지는 뉴클레오사이드 유사체이다.
젬시타빈은 친수성이며 뉴클레오시드(nucleosides)를 위한 분자 운반자(transporter)를 통해 세포로 운반된다(젬시타빈의 운반자는 SLC29A1 SLC28A1 및 SLC28A3이다). 세포에 이송된 후, 젬시타빈은 인산염이 먼저 부착함으로써 변형되어 gemcitabine monophosphate (dFdCMP)가 되며 효소 deoxycytidine kinase (DCK)가 반응 속도 결정 단계이다. 2 개의 다른 인산염이 다른 효소에 의해 첨가된다. 3종의 인산염이 젬시타빈에 부착된 gemcitabine triphosphate(dFdCTP)로 마침내 약리학적으로 활성화된다.
3회 인산화된 후, 젬시타빈은 사이티딘(cytidine)으로 가장할 수 있으며, 세포 복제시 합성되는 새로운 DNA 가닥에 통합된다.젬시타빈이 DNA에 통합되면 기본 또는 정상적인 뉴클레오사이드 염기가 옆에 추가되나, 젬시타빈은 "결함있는" 염기이기 때문에 "masked chain termination"이 발생하며 인접한 native nucleoside로 인해 세포의 정상적인 수복 시스템(base-excision repair)은 작동하지 못한다. 따라서, 젬시타빈을 세포의 DNA에 혼입시키는 것은 회복 불가능한 에러를 야기하여 더 이상의 DNA 합성을 억제하여 세포 사멸을 유도한다.
2개의 인산염이 부착된 젬시타빈(dFdCDP)의 형태는 또한 활성을 있으며, 새로운 뉴클레오타이드를 생성하는데 필요한 효소 리보뉴클레오타이드 환원 효소(ribonucleotide reductase, RNR)를 억제한다.
젬시타빈은 시티딘 데아미나제(cytidine deaminase, CDA)에 의해 촉매된 탈아민화뿐만 아니라 데옥시시티딜레이트 데아미나제(deoxycytidylate deaminase, DCTD)에 의해 촉매된 젬시타빈 모노포스페이트의 탈아미노화도 젬시타빈을 불활성화시킨다. 젬시타빈 불활성화 효소는 혈액에서 풍부하여 혈액에 투여된 젬시타빈은 혈액에서 대부분 불활성화된다.
II. 운반-올리고 접합체
본 발명의 운반-올리고 접합체는 목적하는 1종 이상의 운반소재를 포함하고 상기 다기능 핵산의 기본모듈 단위를 구성하는 단위 염기서열에 상보적 결합하는 올리고(운반-올리고 접합체)이며 다기능 핵산 운반체의 주요 구성성분이다.
본 발명의 운반소재는 표적지향 리간드, 활성물질, 영상 소재, 나노입자, 핵산나노구조체 및 입자화 소재를 포함하나 이에 국한된 것은 아니다.
본 발명의 운반-올리고 접합체의 올리고는 천연 뉴클레오타이드로 제조된 핵산에 비해 보다 더 핵산분해효소에 대한 저항성이 있으며 약제학적 효능을 함유하기 위해 변형 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 유사체를 구성성분으로 할 수도 있다.
본 발명의 올리고는 변형 뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드 유사체로 이루어진 군에서 선택되어진 1종 이상과 천연 뉴클레오타이드를 구성성분으로 합성할 수 있으며, 다기능 핵산의 단위 염기서열에 상보적인 결합이 가능한 염기서열로 1~100 염기서열, 10~40 염기서열이고 바람직하게는 15~30 염기서열일 수 있다.
상기 운반-올리고 접합체는 표적지향 리간드, 입자화 소재, 활성물질, 영상 소재, 나노입자 및 핵산나노구조체로 이루어진 운반소재에서 선택되어진 어느 하나 이상을 포함하는 올리고 접합체이다.
본 발명의 리간드-올리고 접합체(제1 올리고 접합체), 활성물질-올리고 접합체(제2 올리고 접합체) 및 입자화 소재-올리고 접합체(제3 올리고 접합체)로 이루어진 운반-올리고 접합체에서 선택되어진 어느 1종 운반-올리고 접합체에 추가적으로 상기 운반소재에서 선택되어진 1종 이상을 포함시킬 수 있다. 즉, 선택되어진 운반-올리고 접합체에서 1종의 올리고에 추가적으로 표적지향 리간드, 활성물질, 영상소재, 나노입자, 핵산나노구조체 및 입자화 소재를 포함할 수도 있다.
본 발명은 상기 제1, 제2 및 제3 올리고 접합체를 포함하는 운반-올리고 접합체를 다기능 핵산과 혼합하여 다기능 핵산/운반-올리고 접합체 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 다기능 핵산 운반체 및 이들의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 제한된 하기 운반-올리고 접합체를 기술하지만 이들에 국한된 것은 아니다.
1. 표적지향 리간드
본 발명의 제1 올리고 접합체(리간드-올리고 접합체)는 상기 단위 제1 염기서열에 상보적인 결합이 가능한 올리고와 표적지향 리간드의 접합체로 상기 다기능 핵산 운반체에 포함된(payload) 활성물질을 전달하고자 하는 표적세포에 특이적인 리간드를 포함한다.
본 발명의 리간드-올리고 접합체는 표적지향 리간드에서 선택되어진 1종 이상과 올리고 사이의 결합은 공유 결합 또는 비공유 결합일 수 있다.
본 발명은 제1 올리고 접합체는 표적지향 리간드-링커가 올리고의 일 말단에 결합하는 구조이며, 바람직하게 링커는 rUTP 혹은 dATP 연속 염기서열을 사용할 수 있고 상기 올리고의 염기서열은 다기능 핵산의 제1 염기서열과 상보적 염기서열을 사용한다.
본 발명은 제1 올리고 접합체를 다기능 핵산과 혼합하여 다기능 핵산/제1 올리고 접합체 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 다기능 핵산/제1 올리고 접합체 복합체 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 다기능 핵산 운반체 및 이로부터 형성된 입자에 표적지향 리간드가 구비된다면, 효율적으로 표적 세포로의 전달을 촉진하여, 비교적 낮은 농도의 투여량으로도 표적 세포로 전달되어 높은 목표 세포 활성 조절 기능을 나타낼 수 있으며, 타 장기 및 세포로의 비특이적인 핵산의 전달을 저해할 수 있다.
본 발명의 표적지향 리간드는 표적 세포 특이적으로 세포내재화 (internalization)을 증진시키는 Receptor-mediated endocytosis(RME) 특성을 가진 표적 수용체 특이적 항체나 압타머, Spiegelmers, 펩타이드, 또는 엽산(Folate), N-아세틸 갈락토사민(N-acetyl Galactosamine, NAG) 등의 헥소아민(hexoamine), 포도당(glucose), 만노스(mannose)를 비롯한 당이나 탄수화물(carbohydrate) 등의 화학물질 등에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
따라서 본 발명에 따른 다기능 핵산 운반체 및 이로부터 형성된 입자에 표적지향 리간드가 구비된다면, 효율적으로 표적 세포로의 전달을 촉진하여, 비교적 낮은 농도의 투여량으로도 표적 세포로 전달되어 높은 목표 세포 활성 조절 기능을 나타낼 수 있으며, 타 장기 및 세포로의 비 특이적인 핵산의 전달을 저해할 수 있다.
이에 따라 본 발명은 상기 다기능 핵산 운반체에서 표적지향 리간드, 특히 수용체 매개 내포작용(RME)을 통해 표적 세포 내재화를 증진시키는 수용체와 특이적으로 결합하는 특성을 가진 리간드가 추가적으로 포함된 운반체 제공한다.
상기 표적지향 리간드이 결합하는 물질이 종양 특이 표적분자이기 위해서, 종양세포 표면 항원 및 수용체들은 다음과 같은 특성을 갖추어야 이상적이다.
첫째, 정상세포에서는 발현되지 않고 종양세포에서만 발현되어야 한다. 그러나 실제로는 대부분의 항원들이 정상세포에서도 발현되고 다만 상대적으로 종양세포에서 과발현될 뿐이며 따라서 표적 종양세포 표면에 위치하는 수용체의 밀집도(density)가 중요하다.
둘째, 모든 표적 종양세포에서 균질(homogenous)하게 발현되어야 한다. 그러나 잘 알려진 대로 종양세포들은 조직학적, 유전자적, 분자생물학적으로 이질성(heterogeneity)을 보이기 때문에 같은 종양 내에서도 서로 다른 표현형(phenotype)을 보이는 경우가 많다. 따라서 항원의 발현 역시 균질하지 않다. 마지막으로 혈액 내로 유리되어서는 안 된다. 그런 경우 유리된 항원이 세포표면 항원과 경쟁하여 표적지향 리간드와 결합함으로써 약물의 효과를 떨어뜨리게 된다.
상기 표적분자는 약물을 전달하고자 하는 표적세포에 특이적인 분자이며, 예를 들면 암세포의 경우 상기 표적 분자는 세포, 암 세포, 암 줄기세포, 또는 암 표적분자로 분자로 표적 지향성을 부여하는 암 특이적 성분을 의미한다.
대부분의 세포 기반의 질환에서, 수용체 분자에 대한 표적분자 기반 결합을 통한 질환-관련 세포의 표적화는 좋은 접근법 중 하나이다.
환자의 질환-관련 세포 상의 임상적으로 관련된 표면 수용체의 발현 프로파일을 근거로 하여, 일련의 표적분자를 특별하게 선택하여, 환자 특이적 약물로서 특이적 표적지향 리간드에 조합한다. 그러한 선택된 표적분자는, 예컨대 표면 수용체의 발현 수준을 근거로 하여 각 질환-관련 세포, 예컨대 종양 세포에 따라 특정하게 선택된 것으로, 개별 환자의 필요내용 및 표현형을 반영하게 된다.
표적지향 리간드의 더 높은 선택성 및 특이성은 "오프-표적(off-target)" 결합을 줄여주는 두 개의 리간드들의 조합에 의한 동시적인 결합(결합능)에 기인할 수도 있다.
개체 유래의 각 세포는 발현되는 표면분자, 예컨대 수용체 측면에서 수량 면에서 그리고 종 면에서 상이하다. 이는 특히 암 세포 및 비-암 세포의 경우에 그러하다. 따라서, 세포는 제시되는 표면분자에 의해 특징화할 수 있다.
특정 질환이 특정 세포표면 분자의 갯수 또는 신규 세표표면 분자의 발생과 연관되어 있을 수 있다. 그러한 질환에 의해 영향받는 개체는 특정 범위 내에 질환 및/또는 개체-특이적 세포 표면 마커 패턴을 표시하게 될 것이다. 이는 그러한 개체에게 표적화된 치료제를 구성하는 표적지향 리간드를 제공하기 위해 고려되어야 할 사항이다.
*선별된 환자 특이적 표적분자는 다양한 세포의 시험관내 검정/관련 기준(예를 들어, 최적 결합/결합 파트너)에 대해 분석할 수 있다.
그러한 접근법으로 매우 효율적인 표적분자의 결정이 가능하다. 그러한 표적분자 및 페이로드는 개선된 표적/전달(예를 들어, 종양 세포에 대한 페이로드)에 의해 부작용을 감소시킬 것이며, 표적 세포에 대한 개선된 표적화는 더 높은 특이성 및 표적 구성성분(두 종 이상을 압타머를 포함)의 특이성을 근거로 할 수 있다.
본 발명의 표적지향 리간드를 결정하는 방법은 표적분자를 분석하고자 하는 세포로 이루어진 조직의 절편에 압타머를 접촉시켜 표적-압타머 복합체를 형성하는 단계와 상기 형성된 표적-압타머 복합체의 압타머를 분석하는 단계를 포함하는 방법으로 할 수 있다.
상기 형성된 표적-압타머 복합체의 압타머 분석은 상기 표적-압타머 복합체의 압타머에 포함된 물질을 분석하는 방법 및 상기 표적-압타머 복합체에서 분리된 압타머를 정량하는 방법을 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상의 방법으로 실시할 수 있다.
상기 표적-압타머 복합체의 압타머에 포함된 물질은 염료(dye), 양자점(quantum dot), 방사성 표지(radiolabel), 전기화학적 작용기(electrochemical functional group) 및 효소(enzyme)와 검출가능한 효소 기질(detectable enzyme substrate)로 이루어진 군에서 선택되어진 어느 하나 이상일 수 있다.
많은 검출 방법들이 검출에 앞서 압타머 내로 혼입될 외재적 표지(explicit label)를 필요로 한다. 형광(fluorescent) 또는 화학발광(chemiluminescent) 염료와 같은 표지들은 핵산 합성을 위한 표준 기술을 사용하여 합성하는 동안 또는 합성한 후에 압타머 내로 혼입될 수 있다. 방사성 표지(radioactive labels)는 적절한 시약을 사용하는 표준 효소 반응을 이용하여 합성하는 동안 또는 합성한 후에 혼입될 수 있다. 표지는 또한 캐치-2 분리 및 당업자에게 잘 알려진 다양한 효소적 기술을 사용하는 것에 의한 용출 후에 일어난다.
상기에 언급된 표지와 함께 프라이머를 사용하는 PCR은 표지를 용출된 압타머의 증폭 산물 내로 혼입시킬 것이다. 정량을 위한 겔 기술을 사용할 때, 서로 다른 크기의 질량 표지(mass labels)도 PCR을 사용하여 혼입될 수 있다.
이 질량 표지들은 또한 부가적인 다중화 능력을 위하여 서로 다른 형광 또는 화학발광 염료를 포함한다. 표지들은 합성하는 동안 또는 합성한 후에 압타머 내로 혼입된 특정 태그를 사용함으로써 압타머에 간접적으로 첨가될 수 있고, 그 후 태그와 결합하고 표지를 운반하는 프로브를 첨가한다.
상기 표지들은 비색형 판독을 위한 표준 검정법에서 사용되는 효소뿐만 아니라 상기에 기재된 것들을 포함한다. 이들 효소는 효소 기질과 함께 작용하며, 예를 들어 호스래디쉬 퍼록시다아제(horseradish peroxidase, HRP) 및 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase, AP)와 같은 효소를 포함한다. 표지는 또한 전기화학적 검출을 위한 전기화학적 작용기인 물질 또는 화합물을 포함할 수 있다.
상기 압타머는 시료와 접촉하기에 앞서 32P와 같은 방사성 동위원소로 상기에 기재된 것과 같이 표지될 수 있다. 4개의 기본 검정법 중 임의의 하나와 상기에 기재된 것과 같은 그것들의 변형을 사용하는 압타머 검출은 검정법의 마지막에서 고체 지지체 상의 방사능을 정량함으로써 간단히 달성될 수 있다. 방사능 수치는 원 시료에서의 표적의 양에 직접적으로 비례할 것이다.
시료에 접촉하기 전, 형광 염료로 압타머를 표지하는 것은 고체 지지체 상에서 직접적으로 간단히 형광판독을 할 수 있게 한다. 화학발광 표지 또는 양자점이 압타머 용출을 필요로 하지 않는 고체 지지체로부터의 직접적인 판독을 위해 유사하게 사용될 수 있다.
상기 압타머 정량은 Q-PCR, 질량 분석기(mass spectroscopy), 차세대 시퀀싱(next-generation sequencing) 및 혼성화(hybridizatioin)로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 사용하여 검출되고 선택적으로 할 수 있다.
상기 압타머는 PAGE 겔 상에 넣어질 수 있고, SYBR 골드와 같은 핵산 염색으로 검출되고 선택적으로 정량될 수 있다. 대안적으로, 압타머는 상기에 기재된 것과 같이 압타머 내에 혼입된 형광 표지를 사용하는 모세관 겔 전기영동(capillary gel electrophoresis; CGE)을 사용하여 검출되고 정량될 수 있다. 다른 검출 도식은 SYBR 그린을 사용하여 용출된 압타머를 검출하고 정량하기 위하여 정량적 PCR을 사용한다. 대안적으로, 인베이더® DNA 검정법(Invader® DNA assay)이 용출된 압타머를 검출하고 정량하기 위하여 사용될 수 있다. 다른 대안적인 검출 도식은 차세대 시퀀싱을 사용한다.
표적-압타머 복합체의 양 또는 농도는 복제적인 과정(replicative process) 중에 "분자 비콘(molecular beacon)"을 사용하여 검출된다. 분자 비콘은 헤어핀 루프 안으로 접힌 특정 핵산 프로브이며, 헤어핀이 형성될 때 형광단(fluorophore)에 의해 시그널이 거의 생성되지 않거나 생성되지 않도록, 헤어핀 구조의 하나의 말단에는 플루오르를 함유하고 다른 하나의 말단에는 퀀쳐(quencher)를 함유한다. 상기 루프 서열은 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적이며, 압타머 서열과 혼성화하자마자 헤어핀이 펼쳐지기 때문에 형광 시그널을 생성한다.
2개 또는 3개, 또는 5개 또는 10개 이상의 각각의 압타머를 검출하고 정량하기 위하여, 여전히 고체 지지체에 결합되어 있는 적은 수의 압타머의 다중 검출을 위하여, 서로 다른 여기(excitation)/방출(emission) 스펙트럼을 가지는 형광 염료가 사용될 수 있다. 유사하게는, 서로 다른 크기의 양자점이 다중 판독을 위해 사용될 수 있다.
상기 양자점은 고체 지지체로부터 자유 압타머를 분리시킨 후 도입될 수 있다. 양자점에 부착된 압타머 특이적 혼성화 서열을 사용함으로써, 2, 3, 5 및 10개 이상의 압타머들에 대한 다중화된 판독을 수행할 수 있다. 32P, 125I, 3H, 13C 및 35S와 같은 개별적으로 검출될 수 있는 서로 다른 방사성 동위원소로 서로 다른 압타머를 표지하는 것 또한 제한된 다중 판독을 위해 사용될 수 있다.
압타머의 다중 검출을 위하여, 각각 압타머 내로 혼입된 단일 형광 염료가 압타머 레벨의 정량에 따라 압타머의 서열을 확인할 수 있게 하는 정량 방법으로 사용될 수 있다. 방법은 DNA 칩 혼성화, 마이크로-비드 혼성화, 차세대 시퀀싱 및 CGE 분석을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
압타머 용액은 정량 전에 증폭되고 선택적으로 태깅될 수 있다. 표준 PCR 증폭은 상기 압타머 용액과 함께 사용될 수 있다. 이러한 증폭은 DNA 어레이 혼성화, 마이크로-비드 혼성화 및 CGE 판독에 앞서 사용될 수 있다.
표적-압타머 복합체(또는 표적-압타머 공유결합 복합체)는 Q-PCR을 사용하여 검출되고/되거나 정량화된다. 본 발명에 사용된 것으로서, "Q-PCR"은 검정의 결과가 양으로 계산되는(quantitative), 즉 검정법이 시료 내에 존재하는 압타머의 양 또는 농도를 정량할 수 있는 방법과 제한된 조건 하에서 수행된 PCR 반응을 말한다.
시료 내의 표적-압타머 복합체의 양 또는 농도는 TaqMan® PCR을 사용하여 측정된다. 이 기술은 일반적으로 표적화된 서열로부터 시그널을 발생시키기 위하여 올리고뉴클레오티드 복제 효소의 5'-3' 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성에 의존한다.
폴리머라아제가 압타머 서열을 복제함에 따라, 엑소뉴클레아제 활성이 PCR 프라이머로부터 하부(downstream)에서 어닐링된 프로브로부터 형광단을 유리시킴으로서 시그널을 발생시킨다. 복제 산물(replicative product)로서 증가된 시그널이 생산된다. PCR 산물의 양은 압타머의 시작 농도뿐만 아니라 수행된 복제 주기의 수 모두에 좌우된다.
표적-압타머 복합체(또는 표적-압타머 공유결합 복합체)의 양 또는 농도는 복제 공정 동안 삽입성 형광 염료(intercalating fluorescent dye)를 사용하여 측정된다. 예를 들어, SYBR® 그린(SYBR® green)과 같은 삽입성 염료는 단일가닥 DNA의 존재 하에서 생성된 형광 시그널에 비해 이중가닥 DNA의 존재 하에서 큰 형광 시그널을 생성한다. 이중가닥 DNA 산물이 PCR 동안에 형성되는 것과 같이, 염료에 의해 생성된 시그널도 증가한다. 생성된 시그널의 크기는 PCR 주기 및 압타머의 시작 농도 모두에 의존한다.
표적-압타머 복합체(또는 표적-압타머 공유결합 복합체)는 질량 분석기를 사용하여 검출되고/되거나 정량된다. 고유한 질량 태그는 상기에 기재된 효소적 기술을 사용하여 도입될 수 있다. 질량 분석기의 판독을 위하여 검출 표지는 필요하지 않으며, 그보다는 질량 그 자체가 당업자들에게 일반적으로 사용되는 기술을 사용하여 확인하는 데 사용되며, 질량 분석기를 분석하는 동안에 생성된 질량 피크(mass peak) 아래의 위치와 영역에 기초하여 정량화된다. 질량 분석법을 사용하는 예는 세퀴놈(Sequinom)에 의해 개발된 MassARRAY® 시스템이다.
본 발명의 NGS 기술을 사용한 표적-압타머 복합체의 압타머의 분석 기술은 상기 복합체에서 분리한 압타머에 대해 NGS 라이브러리를 제조하여 NGS 장비에 런닝한다. 생성된 FASTAQ 파일을 압타머 염기서열과 비교하여 압타머 염기서열과 동일한 리드의 종류를 결정하고 그의 출현빈도를 산정하여 압타머 프로파일을 생산하는 방법이다.
상기 다기능 핵산 운반체에 상기 방법으로 결정된 표적지향 리간드를 사용하면, 목표로 하는 세포표면에 결합한 후 세포 내로 유입될 수 있는 장점이 있다.
세포 내로 잘 유입되지 않는 표적지향 리간드를 이용하여 다기능 핵산 운반체를 제조하는 경우 세포표면 또는 바깥 근처에서 약물이 유리되기 때문에 유리된 약물이 세포 내로 유입되지 못하는 경우가 생길 수 있다. 따라서 세포 내로 유입된 후 세포질 내에서 약물이 유리되는 경우에 비하여 세포 내 약물 농도가 낮을 수밖에 없다.
발명에 보고된 특이적 표적분자/표적지향 리간드는 예를 들어 종양학적 질환, 심혈관 질환, 감염 질환, 염증 질환, 자가면역 질환, 대사성(예를 들어, 내분비) 질환, 또는 신경학적(예를 들어, 신경퇴행적) 질환의 치료를 위한 의약 제조에 이용될 수 있다.
수많은 세포 표면 마커 및 그의 리간드가 공지되어 있다. 예를 들어, 암 세포는 하기의 비제한적 예시의 세포 표면 마커 및/또는 리간드 중 하나 이상을 발현하는 것으로 보고된 바 있다.
따라서, 특정 세포표면 수용체 및 그의 리간드가 질환과 관련된 수많은/무리의 세포표면 마커를 특이적으로 그리고 선별적으로 표적화하며 그에 결합하기 위해 사용될 수 있다. 세포표면 마커는 예를 들어 신호전달 이벤트 또는 리간드 결합과 관련된 세포(예를 들어, 질환-관련 세포)의 표면상에 위치된 폴리펩타이드이다.
암/종양 치료를 위해 종양-관련 표적분자를 표적으로 하는 압타머가 사용된다. 압타머는 표적분자와 높은 특이성과 친화도로 결합할 수 있으며, 독특한 3차원 구조를 가진 올리고 핵산를 말한다. 그 자체가 진단 및 치료제로서 쓰여 왔으며, 또한 약물운반체계에서는 선택성을 높이기 위한 특이 리간드로도 사용되었다. 표적지향 리간드, 대표적인 압타머는 표 1과 같다.
압타머의 염기서열과 표적분자
압타머 표적분자 압타머의 염기서열(5’ → 3’)
AMPA receptor GluR2Qflip GGGCGAATTCAACUGCCAUCUAGGCAGTAACCAGGAGTUAGTAGGACAAGTUUCGTCC
CD4 CUCAGACAGAGCAGAAACGACAGTUCAAGCCGAA
CTLA-4 GGGAGAGAGGAAGAGGGAUGGGCCGACGTGCCGCAACUUCAACCCUGCACAACCAAUCCGCCCAUAACCCAGAGGTCGAUAGTACUGGAUCCCCCC
EGFR(E07) UGCCGCUAUAAUGCACGGATTUAAUCGCCGTAGAAAAGCAUGTCAAAGCCG
GCCUUAGTAACGTGCUUUGAUGTCGATTCGACAGGAGGCp3
EGFR(J18) GGCGCUCCGACCUUAGTCUCUGCAAGAUAAACCGTGCUATTGACCACCCUCAACACACUUATTUAAUGTATTGAACGGACCUACGAACCGTGTAGCACAGCAGA
EGFRvIII(E17) ACCAAAAUCAACGCAAAGAGCGCGCCUGCACGTCACCUCA
Erythrocyte membrane protein 1(PfEMP1) GGGAATTCGACCUCGGTACCAACAAUACGACUACACCAUCAAAAGTATTAUCUUGCAUCGAAGGTUGGCGTAGCAAGCUCUGCAGTCG
gp120 GGGAGACAAGACUAGACGGTGAAUGTGGGCCACGCCCGATTUUACGCUUUUACCCGCACGCGATTGGTUUGTUUCCC
HER2 AGCCGCGAGGGGAGGGAAGGGTAGGGCGCGGCT
HER3 GGGAATTCCGCGTGTGCCAGCGAAAGTUGCGTAUGGGTCACAUCGCAGGCACAUGTCAUCUGGGCGGTCCGTUCGGGAUCCUC
Human keratinocyte growth factor CCCAGGACGAUGCGGTGGTCUCCCAATTCUAAACUUUCUCCAUCGTAUCUGGG
GGGAGGACGAUGCGGTGGTCUCCCAATTCUAAACUUUCUCCAUCGTAUCUGGGCAGACGACUCGCCCGA
L-selectin UAACAACAAUCAAGGCGGGTUCACCGCCCCAGTAUGAGTA
Neruotensin-1(NTS-1) ACAGATACGGAACTACAGAGGTCAATTACGGTGGCCACGC
NF-κB CAUACUUGAAACUGTAAGGTUGGCGTAUG
Phosphatidylcholine: cholesterol liposomes GGGAUCUACACGTGACUGACUUACGAGACUGTCUCGCCAATTCCAGTGGGCCUGCGGAUCCU
PSMA(A10) GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGTUUACGTCACUCCUUGTCAAUCCUCAUCGGCAGACUCGCCCGA
Raf-1 GGGAGAUCGAAUAAACGCUCAATTUGCCUCGACGGTCUGCGAAUAGAACGCGAACCGTGATTAGTGTACAAGGATTCGGTUUUCGACAUGAGGCCCCUGCAGGGCG
RET receptor tyrosine kinase GCGCGGGAATAGTATGGAAGGATACGTATACCGTGCAATCCAGGGCAACG
TCF-1 GGGGAGCUCGGTACCGGTGCGAUCCCCUGTUUACATTGCAUGCUAGGACGACGCGCCCGAGCGGGTACCGATTGTGTCGTCGGAAGCUUUGCAGAGGAUC
Tenascin-C GGGAGGACGCGTCGCCGTAAUGGAUGTUUUGCUCCCUG
TGF-β type III receptor GGGCCAGGCAGCGAGAGAUAAGCAGAAGAAGTAUGTGACCAUGCUCCAGAGAGCAACUUCACAUGCGTAGCCAAACCGACCACACGCGTCCGAGA
Tumor necrosis factor superfamily member 4-1BB GGGAAGAGAGGAAGAGGGAUGGGCGACCGAACGTGCCCUUCAAAGCCGTUCACUAACCAGTGGCAUAACCCAGAGGTCGAUAGTACUGGTCCCCCC
Tumor necrosis factor superfamily member OX40 GGGAGGACGATGCGGCAGTCUGCAUCGTAGGAAUCGCCACCGTAUACUUUCCCACCAGACGACUCGCUGAGGAUCCGAGA
VEGF CGGAAUCAGTGAAUGCUUAUACAUCCG
Wilms tumor protein (WT1) GAUAUGGTGACCACCCCGGC
αvβ3 integrin GGGAGACAAGAAUAAACGCUCAATTCAACGCUGTGAAGGGCUUAUACGAGCGGATTACCCUUCGACAGGAGGCUCACAAAAGGC
β-catenin GGACGCGTGGTACCAGGCCGAUCUAUGGACGCUAUAGGCACACCGGAUACUUUAACGATTGGCUAAGCUUCCGCGGGGAUC
MUC1(DNA) GCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG
EpCAM GCGACUGGTUACCCGGTCG
BAFF GGGAGGACGAUGCGGGAGGCUCAACAAUGAUAGAGCCCGCAAUGTUGAUAGTUGTGCCCAGTCUGCAGACGACUCGCCCGA′
Endothelial Integrin Alpha-V Beta-3 UUCAACGCUGTGAAGGGCUUAUACGAGCGGATTACCC
Osteopontin CGGCCACAGAAUGAAAAACCUCAUCGAUGTUGCAUAGTUG
Receptor Tyrosine Kinase(RET) Mutant(D4) GCGCGGGAAUAGTAUGGAAGGAUACGTAUACCGTGCAAUCCAGGGCAACG
PSMA(A10-3) GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGTUUACGTCACUCCUUGTCAAUCCUCAUCGGC
P-Selectin ACGCUCAACGAGCCAGGAACAUCGACGTCAGCAAACGCGAGCGCAACCAGTAACACC'
Carcinoembryonic Antigen GCGGAAGCGTGCUGGGCUAGAAUAAUAAUAAGAAAACCAGTACUUUCGT'
암세포의 경우 상기 표적지향 리간드는 암 세포, 암 줄기세포, 또는 암 표지인자에 특이적으로 반응하는 리간드는 표적지향성을 부여하는 암 특이적 결합성분을 의미한다. 바람직하게는, 상기 표적지향 리간드는 폴레이트 또는 RGD(Arg-Gly-Asp) 펩타이드일 수 있다. 대표적인 표적 지향 펩타이드는 표2와 같다.
표적지향 펩타이드와 표적분자
Peptide ligand motif Tumor receptor In vitro In vivo
RGD-4C, VVISYSMPD αvβ3 &αvβ5 Y Y
TAASGVRSMH, LTLRWVGLMS NG2 Y Y
CTTHWGFTLC MMP-2, MMP-9 Y Y
NGR APN (CD13) Y Y
RPL, CTQYAMHLC, CSQYSFNWC, CGFYWLRSC VEGFR-1, Neuropilin-1 Y Y
CGRRAGGSC IL-11Rα Y Y
CNVSDKSC (peptide epitope), WIFPWIQL, WDLAWMFRLPVG, SNTRVAP GRP78 Y Y
CPRECESIC APA Y Y
CKGGRAKDC Prohibitin (receptor identified in normal adipose tissue) Y Y
CVPELGHEC HSP90 Y N
GFE MDP (metastasis) Y Y
CVRAC EGFR Y N
WXDDG TWEAK Y N
CLFMRLAWC, HDERMFLCKS MUC18 Y Y
YRCTLNSPFFWEDMTHECHA CRKL Y Y
CRTIGPSVC Transferrin Y Y
GNFRYLAPP DNA-PKcs Y N
CWKLGGGPC Human leukocyte proteinase-3 Y N
CSGIGSGGC, CRFESSGGC EphA5 Y Y
GLTFKSL PPP2R1A Y Y
CTFAGSSC Fetuin-A Y N
HSYWLRS, YKHsiSYWLRSGGGC NPTX2/NPTXR Y N
YKWYYRGAA-pen RPL29 Y N
CGIYRLRSC α6 integrin &E-cadherin complex Y N
상기 Spiegelmers는 L- 배열을 갖는 뉴클레오타이드가 포함된 압타머의 일종으로 혈액 핵산 분해 효소에 의해 분해되지 않는다. 대부분의 압타머는 천연 D- 배열을 갖는 뉴클레오타이드가 포함된다. 특히, 본 발명의 표적지향 리간드가 N-아세틸 갈락토사민(N-acetyl Galactosamine, NAG), 만노스(mannose), 글루코오스(glucose)와 같은 당류일 경우, 해당 리간드에 의해 본 발명 구조식 (1)에 따른 구조체로 이루어진 다기능 핵산 운반체의 표적화 역할을 수행할 수 있다.
2. 활성물질
발명은 상기 다기능 핵산 운반체를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 포함한다.
본 발명에서 1종 이상 다중으로 있는 활성물질들을 치료분자라고 지칭한다.
본 발명의 다기능 핵산 운반체는 약학적 활성이 있는 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드를 내재하는 다기능 핵산과 다양한 치료분자를 포함하는 제2 올리고 접합체(활성물질-올리고 접합체)를 설계하여 제조하였다.
상기 제조는 본 발명의 활성물질-올리고 접합체의 올리고를 중심으로 치료분자를 부가하거나 내재시킬 수 있다, 상기 치료분자는 단일 또는 이종 활성물질로 구성할 수 있다.
상기 다기능 핵산 운반체에 관한 사항은 약학 조성물에 동일하게 적용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 바람직하게는 병용 투여용이며, 바람직하게는 활성물질 저항성을 치료하는 것을 특징으로 하여, 활성물질 저항성을 갖는 활성물질과 병용 투여 될 수 있다. 상기 활성물질 저항성은 펌프 타입 저항성 및 비펌프 타입 저항성으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상일 수 있다.
“RNA 간섭-유도 분자(RNA interference inducing molecule)” 또는 “RNAi 분자” 또는 “RNAi 인자”는 RNA-매개된 타겟 전사체 분해 또는 RNA 간섭을 통해 타겟 유전자의 유전자 발현을 억제하는 기능을 하는 이중 가닥 RNA 같은 RNA 분자를 의미한다는 점에서 상호 교환되어 사용된다.
RNA 간섭-유도 분자는 타겟 유전자의 유전자 사일런싱을 유도한다. RNA 간섭-유도 분자의 전체적인 효능은 타겟 유전자의 유전자 사일런싱이다.
상기 활성물질 저항성은 활성분자 siRNA로 저항성 단백질의 발현을 저해하여 치료할 수 있는 것으로 알려진 질환에 대한 활성물질 저항성을 포함할 수 있으며, 바람직하게는, 상기 질환은 암, 노인성 황반병선, 바이러스 감염 질환, 자가면역 질환 및 신경퇴행성 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
구체적으로 상기 암은 유방암, 폐암, 두경부암, 뇌암, 복부암, 결장암, 식도암, 위암, 위장암, 간암, 설암, 신경아세포종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 빌립스 종양, 망막아세포종, 다발성 골수종, 피부암, 림프종 및 혈액암 등을 포함하나 특별히 이에 한정되지 않으며, 바람직하게는 상기 암은 내성 암세포에 의한 것일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 활성물질 저항성을 유발하는 활성물질로서, siRNA에 의해 활성물질저항성 단백질의 발현이 저해되는 활성물질을 추가로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 항암제일 수 있다.
상기 치료분자는 활성물질 치료분자, 표적화 치료분자 및 핵산 치료분자로 나눌 수 있다.
a. 활성물질 치료분자
본 발명의 다기능 핵산 운반체의 제2 올리고 접합체는 활성물질 치료분자로 구성될 수도 있다.
상기 활성물질 치료분자는 적어도 한 종의 활성물질을 포함한다. 상기 활성물질은 치료제, 예방제, 진단제, 또는 영양제일 수 있다. 다양한 활성물질이 당업계에 공지되어 있으며, 치료분자에 사용될 수 있다.
상기 활성물질은 단백질 또는 펩타이드, 뉴클레오사이드 유사체, 소분자, 핵산 분자, 지질, 당, 당지질, 당단백질, 지단백질, 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 활성물질은 항원 또는 보조제, 방사능제 또는 영상 제제(예를 들면, 형광 분자)이다. 상기 활성물질은 유기금속 화합물이다.
상기 활성물질 치료분자는 활성물질일 수 있다. 활성물질은 세포에서 전달 및/또는 편재시키고자 하는 활성을 지닌 임의의 분자 또는 분자들의 조합을 가리킨다. 활성물질에는, 이에 제한되지 않으나, 표지, 싸이토톡신(예를 들어, 슈도모나스 외독소, 리신(ricin), 아브린(abrin), 디프테리아 독소 등), 효소, 성장 인자, 전사인자, 약물, 방사핵종, 리간드, 항체, 항체 Fc-영역, 리포좀, 입자, 바이러스 입자, 싸이토카인 등이 포함된다.
활성물질은 프로드러그를 포함하며, 부모 약물에 비해 종양 세포에 대해 더 세포독성이며, 효소적으로 활성화될 수 있거나 또는 더욱 활성인 부모 형태로 변환될 수 있는 약제학적으로 활성인 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 지칭한다. 활성물질로 사용될 수 있는 프로드러그에는, 이에 제한되지 않으나, 포스페이트-포함 프로드러그, 티오포스페이트-포함 프로드러그, 설페이트-포함 프로드러그, 펩타이드-포함 프로드러그, D-아미노산-개질 프로드러그, 글리코실화된 프로드러그, b-락탐 포함 프로드러그, 임의치환된 페녹시아세트아미드-포함 프로드러그 또는 임의치환된 페닐아세트아미드-포함 프로드러그, 5-플루오로싸이토신 및 더욱 활성인 세포독성 유리 약물로 변환될 수 있는 여타 5-플루오로우리딘 프로드러그가 포함된다. 본 발명에 사용하기 위해 프로드러그 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 발명에 기재된 화학치료제가 포함된다.
활성물질은 세포 기능을 억제 또는 방해하고/하거나 모든 세포 사멸 또는 파괴를 유발하는 세포독성 물질을 포함한다. 세포독성제에는, 이에 제한되지 않으나, 방사성 동위원소(예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu 의 방사활성 동위원소); 화학치료제 또는 약물(예를 들어, 메토트렉 세이트, 아드리아미신, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid)(빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 에토포사이드(etoposide)), 독소루비신(Doxorubicin), 멜팔란(melphalan), 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 여타 인터킬레이트제(intercalating agents)); 성장 억제제; 효소 및 그의 단편, 예컨대 핵산분해 효소; 항산화제; 독소(toxin), 예컨대 소형 분자 독소 또는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 예컨대 그의 단편 및/또는 변이체; 및 발명에 개시된 다양한 항종양제 또는 항암제가 포함된다.
상기 활성물질은 항감염제일 수 있다. 특정 치료제는 종양 또는 감염의 확립 또는 성장(전신 또는 국부)을 억제할 수 있다. 예는 붕소-함유 화합물(예를 들면, 카르보란), 화학치료제 뉴클레오타이드, 약물(예를 들면, 항생제, 항바이러스제, 항진균제), 엔다이인(예를 들면, 칼리키아마이신, 에스페라마이신, 다이네미신, 네오카르지노스타틴 발색단, 및 케다르시딘 발색단), 중금속 착물(예를 들면, 시스플라틴), 호르몬 길항제(예를 들면, 타목시펜), 비특이적(비항체) 단백질(예를 들면, 당 올리고머), 올리고(예를 들면, 표적 염기서열(예를 들면, mRNA 서열)에 결합하는 안티센스 올리고), 펩타이드, 광동력제(photodynamic agent)(예를 들면, 로다민 123), 방사성핵종(예를 들면, I-131, Re-186, Re-188, Y-90, Bi-212, At-211, Sr-89, Ho-166, Sm-153, Cu-67 및 Cu-64), 독소(예를 들면, 리신), 및 전사 기저 약제를 포함한다.
상기 치료제는 소분자, 방사성핵종, 독소, 호르몬 길항제, 중금속 착물, 올리고, 화학치료제 뉴클레오타이드, 펩타이드, 비특이적(비항체) 단백질, 붕소 화합물 또는 엔다이인일 수 있다.
상기 활성물질은 세균 감염의 확립 또는 성장을 치료 또는 예방할 수 있다. 상기 치료제는 항생제, 방사성핵종 또는 올리고일 수 있다. 상기 활성물질은 바이러스 감염의 확립 또는 성장을 치료 또는 예방할 수 있는데, 예를 들면, 상기 활성물질은 항생제 화합물, 방사성핵종 또는 올리고일 수 있다. 상기 활성물질은 진균 감염의 확립 또는 성장을 치료 또는 예방할 수 있는데, 예를 들면, 상기 활성물질은 항진균 화합물, 방사성핵종 또는 올리고일 수 있다.
상기 활성물질은 암 치료제일 수 있다. 상기 암 치료제는 사멸 수용체 작용제, 예를 들면, TNF-관련 아포토시스-유도 압타머(TRAIL) 또는 Fas 압타머, 또는 사멸 수용체를 결합 또는 활성화시키거나, 달리 아포토시스를 유도하는 임의의 압타머 또는 항체를 포함할 수 있다. 적합한 사멸 수용체는 TNFR1, Fas, DR3, DR4, DR5, DR6, LTβR 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
암 치료제, 예를 들면, 화학치료제, 사이토카인, 케모카인 및 방사선 치료제가 활성물질로서 사용될 수 있다. 대부분의 화학요법 약물은 알킬화제, 항대사물, 안트라사이클린, 식물 알칼로이드, 토포이소머라제 억제제, 및 기타 항종양제로 나눌 수 있다. 이들 약물 모두는 몇몇 방식으로 세포 분열 또는 DNA 합성 및 기능에 영향을 미친다.
활성물질로서 사용될 수 있는 추가 치료제는 단클론 항체 및 티로신 키나제 억제제, 예를 들면, 이마티닙 메실레이트를 포함하는데, 이는 특정 유형의 암(만성 골수성 백혈병, 위장관 기질 종양)에서 분자 이상을 직접 표적화한다.　
대표적인 화학치료제는 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 메클로레타민, 사이클로포스파미드, 클로람부실, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈데신, 택솔 및 이들의 유도체, 이리노테칸, 토포테칸, 암사크린, 에토포사이드, 에토포사이드 포스페이트, 테니포시드, 에피포도필로톡신, 트라스투주맙, 세툭시맙, 및 리툭시맙, 베바시주맙, 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이들 중 어느 것이라도 접합체에서 활성물질로서 사용될 수 있다.
바람직한, 상기 활성물질은 DM1, MMAE, MMAF, 독소루비신, 뉴클레오사이드 치료제, 뉴클레오사이드 유사체 폴리머 일 수 있다.
b. 표적화 치료분자
본 발명의 다기능 핵산 운반체의 제2 올리고 접합체는 표적화 치료분자로 구성될 수도 있다.
상기 표적화 치료분자는 뉴클레오사이드 치료제를 포함하는 압타머일 수도 있다. 상기 압타머는 활성물질 또는 이의 프로드럭을 구성성분으로 하여 제조할 수 있으며, 예를 들면, 상기 표적화-치료분자는 표적지향 리간드가 압타머이고, 뉴클레오타이드와 뉴클레오사이드 치료제가 표적지향 리간드 압타머의 구성성분의 일부로, 하나 이상의 약물이 탑재된 단일가닥 핵산을 갖는 구조체일 수도 있다. 상기 표적화-치료분자는 뉴클레오사이드 치료제를 표적 세포로 전달하는 기능을 제공할 수 있다.
상기 표적화 치료분자는 약제적 활성이 있는 뉴클레오사이드 유사체를 구성성분으로 하여 제조되는 압타머 표적지향 리간드로 표적화 능력과 약물 운반 기능을 함께 수행할 수 있다. 상기 분자를 구성하는 약제적 활성이 있는 뉴클레오사이드 유사체는 활성이 없으나, 상기 분자가 효소에 의해 분해되면서 방출된 약제적 활성이 있는 뉴클레오사이드 유사체는 약제적 활성을 회복될 수 있다.
본 발명은 치료학적으로 활성인 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체 및 뉴클레아제 내성 부분(예컨대, 탈회 2' O-메틸 뉴클레오사이드)의 교대 체인을 사용하여 뉴클레오사이드 치료제의 방출 속도를 조절할 수 있는 능력을 함유하는 폴리 뉴클레오타이드를 형성하는 것을 고려한다. 치료적 활성 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체 및 뉴클레아제 내성 잔기(예컨대, 무-염기성 2' O-메틸 뉴클레오사이드)의 교대하는 세그먼트의 구조는 치료제의 원하는 방출을 달성하도록 변형될 수 있다.
상기 표적화-치료분자는 약물의 활성 대사물이 도입된 올리고 화합물을 지칭할 수도 있다. 약물의 활성 대사물에는 겜시타빈 트리포스페이트(dFdCTP)와 5-플루오로 우라실(5-FU)와 5-F-2'-UTP 트리 포스페이트(5FdUTP) 등의 단량체 뉴클레오사이드 치료제가 포함될 수 있다.
약물의 활성 대사물인 dFdC 입자와 5FdU 입자는 압타머에 유기합성 또는 효소적으로 도입할 수 있다. 또는 상기 단량체 뉴클레오사이드 치료제를 구성성분으로 제조되는 폴리머가 압타머의 말단에 연결될 수 도 있다.
c. 핵산 치료분자
<올리고 치료분자>
본 발명의 다기능 핵산 운반체의 제2 올리고 접합체는 올리고 치료분자로 구성될 수도 있다.
“올리고 치료제”는 압타머, siRNA, siRNA, decoy 와 안티센스을 포함하는 핵산 약물은 다양한 방법으로 단량체가 연결되는 형태일 수 있다.
핵산 치료분자는 약학적 효능이 있는 올리고로부터 제조하는, 올리고 치료분자 각각 하나 이상의 관능기가 있어 용이하게 효소합성 또는 화학 합성을 할 수 있다.
본 발명의 올리고 활성물질은 압타머, siRNA, decoy 와 안티센스을 포함하는 핵산 약물로 하기의 다양한 방법으로 연결할 수 있다. 핵산 약물 사이에 스페이서(spacer)가 있을 수 있으며 다양한 방법으로 단량체가 연결되는 형태일 수 있다.
"호모 폴리머"는 뉴클레오타이드 및 링커가 모두 동일한 폴리 뉴클레오타이드 화합물을 지칭한다. 따라서, 본 발명의 단일 중합체 폴리 뉴클레오타이드 전구 약물에서, HO-[dN-PO2X]n-OH는 각 뉴클레오타이드 "dN"및 각 X가 동일하다.
"헤테로 폴리머"는 뉴클레오타이드 또는 링커의 각각이 동일하지 않은 폴리 뉴클레오타이드 화합물을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 헤테로 폴리머 폴리 뉴클레오타이드 전구 약물에서 HO-[dN-PO2X]n-OH는 뉴클레오타이드 "dN"또는 결합 "PO2X"가 사슬을 따라 상이하다.
본 발명은 포스포디에스테르(pO), 포스포로티오네이트 또는 H-또는 알킬 또는 알케닐 포스포네이트에 의해 연결된 약학적 활성 또는 치료모노머 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체의 사슬로부터 형성된 폴리 뉴클레오타이드 화합물에 관한 것이다. 사슬은 2 내지 100(보다 바람직하게는 2 내지 35)의 치료학적 단량체 뉴클레오사이드, 뉴클레오사이드 유사체 또는 무치환 뉴클레오사이드를 포함한다.
혼합 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 결합을 함유하는 폴리 뉴클레오타이드를 고려한다. 포스포로티오네이트 결합을 갖는 올리고머는 pO 결합을 갖는 올리고머보다 더 안정하며, 결과적으로 포스포로티오네이트 올리고머는 pO 결합된 올리고머보다 느린 속도로 분해된다.
“RNA 간섭-유도 분자(RNA interference inducing molecule)” 또는 “RNAi 분자” 또는 “RNAi 인자”는 RNA-매개된 타겟 전사체 분해 또는 RNA 간섭을 통해 타겟 유전자의 유전자 발현을 억제하는 기능을 하는 이중 가닥 RNA 같은 RNA 분자를 의미한다는 점에서 상호 교환되어 사용된다.
RNA 간섭-유도 분자는 타겟 유전자의 유전자 사일런싱을 유도한다. RNA 간섭-유도 분자의 전체적인 효능은 타겟 유전자의 유전자 사일런싱이다.
RNA 간섭-유도 분자는 짧은-일과성 RNA(siort-temporal RNA, stRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), 짧은-헤어핀 RNA(small hairpinRNA, shRNA), 마이크로 RNA(miRNA) 또는 이중-가닥 RNA(dsRNA)을 포함하는 변형되지 않은 이중 가닥 RNA 분자 및 변형된 이중 가닥 RNA 분자를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, dsRNA 분자(예: siRNA)는 3'-오버행을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 3'UU-또는 3'TT-오버행을 포함할 수 있다. siRNA 분자는 약 30-40 염기보다 큰 ssRNA, 약 40-50 염기보다 큰 ssRNA 또는 50 염기보다 큰 ssRNA를 포함하는 RNA 분자를 포함하지 않는다. siRNA 분자는 이중 가닥 구조를 가진다.
RNA 간섭-유도 분자는 천연 또는 변형된 뉴클레오타이드, 천연 리보오스 당 또는 변형된 당, 및 천연 또는 변형된 포스페이트 골격(backbone)을 가지는 RNA 분자를 포함한다.
본 발명의 RNA 간섭은 하나 이상의 비-천연(non-natural) 뉴클레오타이드(즉 아데노신 "A", 구아닌 "G", 우라실 "U" 또는 사이토신 "C"를 제외한 뉴클레오타이드), 변형된 뉴클레오타이드 잔기 또는 천연 뉴클레오타이드의 유도체 또는 유사체를 가지는 RNA 분자를 포함한다. diRNA의 RNAi 활성을 (적어도 50% 이상) 제거하지 않거나 또는 실질적으로 감소시키는 범위에서 어떠한 변형된 잔기, 유도체 또는 유사체가 이용될 수 있다.
이러한 형태는 아미노알릴 UTP, 슈도-UTP, 5-I-UTP, 5-I-CTP, 5-Br-UTP, 알파-S ATP, 알파-S CTP, 알파-S GTP, 알파-S UTP, 4-티오 UTP, 2-티오-CTP, 2'NH2 UTP, 2NH2 CTP 및 2'F UTP를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
모든 다른 유용한 형태의 뉴클레오타이드를 포함하여, 그러한 변형된 뉴클레오타이드는 아미노알릴 우리딘, 슈도 우리딘, 5-I-우리딘, 5-I-사이티딘(cytidine), 5-Br-우리딘, 알파-S 아데노신, 알파-S 사이티딘, 알파-S 구아노신, 알파-S 우리딘, 4-티오 우리딘, 2-티오-사이티딘, 2'NH2 우리딘, 2' NH2 사이티딘 및 2' F 우리딘을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
RNA 간섭 인자는 뉴클레오타이드 체인의 “포스페이트 골격(phosphate backbone)” 상의 변형 뿐 아니라, 리보오스 당의 변형을 포함하는 RNA 분자를 추가적으로 포함한다. 본 발명에 따르면 RNA에서 발견되는 자연적으로 발생하는 α-D-리보뉴클레오사이드를 대신해서 α-아라비노퓨라노실 구조를 포함하는 siRNA 또는 miRNA 분자가 RNA 간섭에 이용될 수 있다.
뉴클레아제 저항성을 수여하는 뉴클레오사이드의 당 및 헤테로사이클릭 염기 간의 o-결합(o-linkage), 및 2'-O-메틸 리보오스, 아라비노오스 및 특히 α-아라비노오스를 포함하는 올리고와 유사한 올리고 분자에 강하게 결합하는 상보적인 가닥을 포함하는 RNA 분자를 포함한다. 또한, siRNA 및 miRNA 분자를 안정화시키기 위해 포스포로티오에이트 결합(phosphorothioate linkages)이 이용될 수 있다. 3'-또는 5'-말단, 또는 양 말단에 공유결합으로 접합(attach)된 다양한 “꼬리(tails)”를 가지는 siRNA 및 miRNA 분자들도 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 발명의 방법을 이용하여 운반된 siRNA 및 miRNA 분자를 안정화시키기 위해 이용될 수 있다. 일반적으로, RNA 분자의 3'-또는 5'-말단에 접합된 인터칼레이팅 군(intercalating groups), 다양한 리포터군 및 친유성 군(lipophilic groups)은 당업자에게 잘 알려져 있다.
다양한 특이적 siRNA 및 miRNA 분자들이 기술되어 왔으며 추가적인 분자를 용이하게 디자인할 수 있다. 예를 들어, 전세계-웹 주소(sanger.ac.uk 내의 /Software/Rfam/mirna/index)에 존재하는 miRNA 데이터 베이스는 본 발명에 따라 유용한 miRNA를 추가적으로 동정하기 위한 유용한 소스를 제공한다.
알려진 siRNA 운반 방법과는 달리, 본 발명의 방법은 siRNA 치료법의 소망하지 않는 잠재적 부작용을 최소화하거나 또는 완전하게 회피하기 위한 특정 세포로의 타겟팅이 가능하다.
또한, 상기 다기능 핵산 운반체 입자는 세포질로 전달된 후 이종 다중 활성물질들 전달될 수 있으며 활성물질 siRNA가 있으며 동시 사일런싱을 일으키므로, 화학요법제와 siRNA의 동시 운반체로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 1종 이상의 siRNA를 포함하는 다기능 핵산 운반체를 병용치료 또는 병용투여용으로 제공하여, 상기 전달효율의 문제점을 개선하였다.
또한, 앞에서 언급했었던 siRNA를 암 조직에 선택적으로 전달하는데 요구되는 다양한 이슈들, 예를 들어, siRNA의 낮은 세포투과문제, 낮은 siRNA 봉입효율, 면역반응 유발 문제, 혈액 내에서의 낮은 안정성, 낮은 암세포 표적 기능들은 2종 siRNA용 다기능 핵산 운반체 개발에서도 역시 해결되어야 하는 문제점들이다.
이에 본 발명은, 세포 투과 및 봉입 효율이 높고 핵산 분해효소 공격으로부터 우수한 안정성을 가질 뿐 아니라, 혈액 내 안정성과 표적 유전자에 동시 사일런싱을 우수하게 할 수 있는 다기능 핵산 운반체를 개발하였다.
본 발명의 제2 올리고 접합체는 다기능 핵산에 있는 단위 제2 염기서열에 상보적 결합이 가능하며, 활성물질에서 선택되어진 1 종 이상을 포함하는 올리고이거나, 1 종 이상의 센스 서열, 루프영역 서열과 안티센스 서열로 구성된 siRNA를 포함하는 염기서열일 수 있다.
<DNA 박스 치료분자>
본 발명의 다기능 핵산 운반체의 제2 올리고 접합체는 DNA 박스로 구성될 수도 있다.
상기 DNA 박스는 이중가닥 핵산 또는 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 단일가닥 DNA와 하나 이상의 약물(chemotherapeutic agent)이 자기 조립으로 특이 구조를 형성할 수 있다.
바람직하게, 상기 DNA 박스는, 5'말단에서 3'말단 방향으로 순차적으로 센스가닥 염기서열, 센스가닥 염기서열과 상보적으로 결합 가능한 안티센스 가닥 염기서열을 포함한다. 상기 센스 가닥 핵산서열은 GC 염기가 풍부한 서열로 이상적으로 GC 단위가 반복적으로 있을 수 있다.
상기 센스가닥 염기서열의 염기 개수는 DNA 박스 제조를 위해 적절히 조절될 수 있으며, 예컨대, 상기 센스 가닥 염기서열은 5 내지 100개, 바람직하게는 10 내지 100개의 염기로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 안티센스 가닥 염기서열의 염기 개수도 DNA 박스 제조를 위해 적절히 조절될 수 있으며, 예컨대, 상기 안티센스 서열 핵산분자는 5 내지 100개, 바람직하게는 10 내지 100개의 염기로 이루어질 수 있다.
DNA는 단백질 및 지질과 같은 많은 다른 생물학적 분자와 상호 작용한다. 이러한 상호작용은 DNA 모양, 주로 DNA 그루브 및 DNA 꼬임의 인식이다.
모든 유형의 핵산은 핵산 염기에 다양한 수소 공여체와 수용체를 가지고 있다. H 결합 공여체와 수용체는 다른 분자가 결합할 수 있는 앵커로 사용된다. 리간드는 그루브(groove) 크기에 기초하여 이들의 결합 부위를 구별한다. 수소 결합 및 형태 인식은 리간드에 의한 결합 부위 인식의 주요 메카니즘이다.
major 그루브는 더 많은 수소 결합 공여체와 수용체를 가지고 있기 때문에, 수소 결합은 major 그루브 결합(Groove Binding) 현상에서 결합 특이성에 더 많은 기여를 한다. minor 그루브에서 소수의 수소 결합 공여체와 수용체로 인해 많은 리간드가 T:A 염기쌍을 A:T 또는 G:C 염기쌍을 C:G와 구별 할 수 없다. 결합 특이성은 수소 결합 공여체와 수용체의 수에 의존할 뿐만 아니라 수소 결합 구조에도 의존한다. 리간드는 상이한 DNA 염기서열은 상이한 수소 결합 패턴을 가지므로 특정 표적과 결합한다. 물은 또한 홈 내에 수소 결합을 형성할 수 있다. 따라서, 수화의 정도를 변화시킴으로써 리간드와 DNA 사이의 수소 결합을 중재하는 것이 가능하다.
상기 DNA 박스에 결합하는 활성물질은 삽입물질(intercalator) 및 그루브 결합물질(Groove binder)로 분류한다.
상기 삽입물질은 DNA의 평면 기저부 사이에 삽입되는 리간드를 의미한다. 알려진 예로 ethidium bromide(EtBr), berberine, proflavine 및 Doxorubicin이 있다. 그들은 암 세포에서 DNA 복제를 억제하기 위해 화학요법 치료에 적용된다. 삽입물질은 염기 쌍 사이에 삽입하기 때문에, DNA 분자는 삽입물질을 위한 공간을 열기 위해 풀림(unwind)과 연장(extend)해야 한다.
이러한 DNA의 구조적 변화는 삽입물질의 크기와 모양에 달려있다. 따라서 삽입물질은 DNA와 결합하여 복제, 전사 및 DNA 복구 과정을 억제한다. 이 메커니즘은 또한 돌연변이 유발 가능성을 증가시킨다. 그것은 또한 삽입물질의 결합으로 DNA의 구조적 변형에 의해 유도된 기능적 변화가 있다.
그루브 결합물질은 major 그루브 결합물질와 minor 그루브 결합물질로 나눌 수 있다. major 그루브의 큰 치수로 인해 대형 단백질은 공통적인 major 그루브 결합물질이다. 그러나 triplex 형성 올리고 뉴클레오타이드(TFO), 펩타이드 핵산(PNA), 플루마이신(pluramycins), 아플라톡신(aflatoxins) 및 아지노마이신(azinomycins)과 같은 작은 DNA 결합물질은 major 그루브에 결합한다. 그루브 바인더는 비공유적으로 DNA와 상호 작용한다. 그루브 결합물질은 아미노글리코시드(aminoglycosides) 와 같은 DNA와 공유 결합을 형성 할 수도 있다. 아미노글리코시드의 친전자성 그룹은 퓨린 염기의 친핵성 N7 위치와 반응한다.
minor 그루브 결합물질은 커다란 단백질의 major 그루브 결합물질보다 작기때문에 DNA에 있는 좁고 깊은 minor그루브에 적합하다. 그러나 distamycin A(Dst.A)와 같은 단순한 초승달 모양에서부터 trabectedin과 같은 복잡한 구조에 이르기까지 그들의 구조와 모양은 매우 다양하다. minor 그루브 결합물질은 공유 또는 비공유의 두 가지 유형의 힘을 통해 DNA와 상호 작용한다. DNA와 공유 결합을 형성하는 한 가지 예는 duocarmycin 계열에 속하는 CC1065이다. 안트라마이신 Anthramycin 은 또한 DNA와 공유 결합을 형성한다. 그것은 디아제핀 diazepine 고리에 탄소-질소 이중 결합을 가지고 있으며, 이는 염기의 아미노기와 반응한다. DAPI와 펜타미딘(pentamidine)과 같은 다른 합성 화합물들도 잘 연구되어 있다.
본 발명의 실시예에서 사용한 약물은 헤어핀 구조 DNA에 삽입(intercalation)되는 성질을 가지는 안트라사이클린계(anthracycline) 약물은 독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신, 및 이다루비신으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상일 수 있고, 바람직하게는 독소루비신(Doxorubicin, Dox, 독소루비신 염산염)이다.
상기 접합체에서 약물, 특히 독소루비신이 DNA를 구성하는 염기 사이에 삽입되는 성질을 이용하여 독소루비신을 삽입할 수 있다. 독소루비신은 암 화학요법에서 가장 광범위하게 사용되는 세포독성 안트라사이클린 항생제 중의 하나이며, 다양한 종양에 대해 활성을 나타낸다고 알려져 있다.
Dox는 토포아이소머라제 I 및 II와 같은 DNA 관련 효소에 결합하기 때문에 토포이소머라제 II 저헤제로 분류되지만 항암 활성에 영향을 미치는 다른 여러 생화학적 과정을 교란시킬 수 있다. 독소루비신은 DNA에 결합되는 성질을 지니고 있으므로 세포 내에 투과된 독소루비신은 핵으로 이동하여 DNA에 결합됨으로써 각종 생합성과정을 저해한다고 알려져 있다.
대표적으로는 DNA 전사과정에서 DNA supercoil 구조를 풀어주는 기능을 하는 topoisomerase II 효소의 작용을 방해함으로써 세포의 증식 혹은 사멸을 유도할 수 있다. topoisomerase II의 억제는 회복되지 않으면 세포 자멸사를 일으킬 수 있다.
DNA는 이중가닥 DNA의 평면 염기쌍과 daunosamine 당단 부분에 의한 minor groove 사이의 tetracene 고리 시스템의 삽입을 통해 DNA와 상호 작용한다. 그러나 DNA에 대한 DNA의 비공유 결합은 쉽게 가역적이며 비공유 결합체는 상대적으로 짧은 반감기(t1/2 ~ 분)를 보인다.
Dox는 또한 더 안정한 DNA와 공유 결합 부가물을 형성하지만 DNA의 daunosamine sugar을 exocyclic에 연결시키는 알데히드 전구체를 필요로 한다. Dox-DNA 공유 결합 부가물은 비공유 결합체보다 세포 독성이 크고 공유 결합 부가물이 합성되어 안트라사이클린 세포 독성 연구에서 많이 사용된다. 공유 결합 Dox 부가물을 형성하며, 세포로의 이러한 병변의 독성은 토포이소머라아제 II 손상에 의해 유도된 것보다 높다. 생성된 Dox 부가물이 병변의 독성을 우세하게 유도한다.
포름 알데히드는 Dox-DNA 부가물의 형성에 사용되며, 외인성 포름알데히드는 Dox 공유 결합 부가물 형성을 게놈 DNA로 촉진시킨다. DNA-포름알데히드 복합체는 게놈 DNA에 공유 결합 부가물 형성을 돕는 Dox의 활성화된 형태의 전달을 위해 사용하고 있다.
포름알데히드는 Dox의 3'-아미노기를 DNA에 있는 dGTo의 2-아미노기에 Schiff 염기 화학(Schiff base chemistry) 을 통해 연결시키는 메틸렌기를 제공하기 때문에 DNA에 의한 Dox 부가 생성에 중심적인 역할을 한다. 이들 부가물의 특이성은 하나의 DNA 가닥에 공유 결합으로 형성하고 DNA의 국소 부위에 대한 안정화로 인해 열 변성에도 저항한다.
d. 영상소재
다기능 핵산 운반체의 운반-올리고 접합체는 영상소재로 구성될 수도 있다.
또한, 본 발명은 상기 다기능 핵산 운반체 또는 이를 기반으로 형성되는 입자를 이용한 영상화 및 검사 방법을 제공한다. 구체적으로 상기 다기능 핵산 운반체로 구성된 입자를 준비하는 단계와 상기 입자를 동물의 체내로 투입하는 단계를 포함하는 영상화 및 검사 방법을 제공한다.
본 발명의 영상소재를 이용한 분자 영상은 비침습적 방법으로 살아있는 세포나 조직 또는 손상을 가하지 않는 물체를 세포적 분자적 수준에서 생화학적 사건을 실시간으로 시각화할 수 있다. 방사능 물질, 자성 나노물질이나 형광소재로 변형된 다기능 핵산 운반체는 표적화 형광 영상화나 magnetic resonance imaging(MRI)에서 좋은 소재로 제공될 수 있다.
대사변화가 보통 해부학적 변화 전에 발생하기 때문에 PET은 분명하게 computed tomography(CT) 와 MRI 같은 해부학적 기술보다 진단에서 유리한 점이 있다. 임상활용에서 PET는 기초 연구와 전임상 분야에서 광범위한 응용이 되고 있다. 예를 들면 PET는 새로운 방사선 치료제 분석, 새로운 치료제의 효능 그리고 약제의 상체분포를 검증하는데 사용될 수 있다. PET이 가지고 있는 강점으로 탐침 깊이, 탁월한 민감도, 정량적 자료 그리고 전임상에서 임상까지의 전환성에 있다.
즉, PET은 대표적인 분자영상기기로 방사선 의약품을 이용하여 살아있는 생체의 표적분자 수준에서의 생화학적 변화를 감지할 수 있고 굉장히 민감도가 높아 기초과학이나 전임상 영역을 비롯한 광범위한 분야에서 이용되고 있다.
본 발명의 영상소재는 어떠한 종래의 방법으로 탐지가능한 표지인자일 수 있으며, 예를 들면 방사성 동위원소, 형광 물질, 적외선 물질, 양자점, 이온 옥사이드 비드(ion oxide bead), PET 프로브 (예를 들어 갈륨), 산화철 (예를 들어 Fe3O4)을 포함하는 T1 MR 프로브 및 T2 MR 프로브 (예를 들어 MnFe2O4 또는 GdFe2O4 나노파티클) 및 기타 등등으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택될 수 있으나, 특별히 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에서는 방사성 동위원소, 예를 18F, 32P, 123I, 89Zr, 67Ga, 201Tl, 111In-111나 형광염료, 예를 들어 시아닌 형광염료인 Cy3, Cy5, Cy7 등으로 표지된 압타머를 이용하여 생체 내 영상화를 위해 활용할 수 있다.
본 발명에서 형광염료, 예를 들어 시아닌 형광염료인 Cy3, Cy5, Cy7 등으로 표지된 다기능 핵산 운반체를 이용하여 생체 내 영상화를 위해 활용할 수 있다.
광자점(Quantum dot)은 cadmium selenide (CdSe), cadmium telluride (CdTe), indium phosphide(InP), indium arsenide (InAs) 등의 여러 가지 다양한 cadmium이나 selenide 화합물로 구성되어 있다. 백색광을 흡수해서 짧은 시간 내에 400-1350 nm에 이르는 특별한 형광파장을 방출하는 결정구조체이며 크기와 구성은 매우 다양하고 크기가 클수록 장파장의 빛을 내는 경향이 있다. 이러한 특징을 이용하면 다양한 여러 색의 광학영상을 얻는데 사용할 수 있는데, 표적화를 위한 작용기나 리간드(항체, 압타머 등),, siRNA 등과 접합도 용이하고 방출하는 빛이 안정적이기 때문에 유전자 발현과 연관된 세포관찰이나 비침습적 생체영상에서도 효과적으로 사용되고 있다.
광자점의 이와 같은 특징에 따라 생체에서 치료와 진단을 겸하게 하는 유용한 테라그노시스 약제로 이용가능성이 기대되고 있으나 특정조건에서 독성을 나타내는 것이 보고되어 이에 관한 보다 자세한 연구가 요구되어지는 실정이다. CdSe 나노입자가 장기간 자외선에 노출되면 독성이 강한 Cd가 나노입자에서 빠져올 가능성이 있고, 오랜 시간 혈관 중에 있을 경우 표면보호물질이 유실되어 활성화 산소를 생성함으로써 이로 인한 DNA의 손상과 세포사멸을 유발한다. 더불어 이러한 부작용을 방지하기 위한 표면처리 방법에 관한 연구가 집중되어 왔는데, 실리카로 코팅처리 하는 것이 한 방편으로 제시되고 있으며 이중 한 예로는 CdSe-ZnS-SiO2 의 경우 형광의 세기가 일정하게 유지되는 효과적인 방법이다.
한편, 표적화를 위한 표면 처리 통하여 16-100 nm 크기의 금 나노입자들이 CT 조영제로서 치료의 목적으로 이용할 수 있다. 기존의 CT 조영제는 체내로부터 배출되는 시간이 너무 짧아 진단에 어려움이 많고 신장 독성이 있어 신장관련 질병을 가진 환지에게는 사용이 제한되어 왔는데 PEG로 표면처리를 한 금 나노입자의 경우 5배 이상 해상도가 증가되었으며 6시간 까지 체내에 머물 수 있다. 또한 2-14 nm의 금 나노입자에 PEG와 메틸아크릴 등을 이용한 새로운 고분자 나노물질로 코팅하여 세포막을 쉽게 가로지를 수 있는 방법도 이다. 별모양의 금 나노입자는 라만분광법에 의해 광학적 신호를 탐지하였을 때 구형 나노입자나 나노막대보다 훨씬 강한 신호를 나타내는 것으로 여러 가지 화학적, 생물학적 센서나 세포 영상용 물질로 이용될 수 있다.
산화철은 주로 자기공명영상(Magnetic Resonance Imaging, MRI)의 조영제로서 사용되어 왔다. 이중 가장 잘 알려진 것으로는 Superparamagnetic iron oxide(SPIO)가 있는데 Fe2+나 Fe3+ core를 가진 4-5 nm 크기의 6각형 형태의 구조물로, 산화철 입자의 응집성, 불안정성, 분해 및 독성을 감소시키기 위해 외각에 친수성 덱스트란이나 PEG 분자로 둘러싸여 있다. 이들은 강한 자성을 띄고 있어 자기장의 분포에 따라 배열될 수 있고, 표적화를 위한 단백질, 항체, 올리고 등과 쉽게 접합시킬 수 있어서 진단용 목적으로 사용하기에 적합하며, 적절한 변형을 통한 약물의 봉입도 가능하므로 치료와 진단을 동시에 할 수 있는 테라그노시스(theragnosis) 나노입자일 수도 있다. 여러 가지 MRI 영상 향상을 위한 망간 등의 도입과 변형이 이루어진 magnetic engineered iron oxide (MEIO) 입자와 광학 영상과 핵 영상을 가능하게 하는 물질들을 부착할 수 있게 된 Mn-MEIO, cross-linked iron oxide (CLIO) 등을 사용할 수 있다.
상기 제2 올리고 접합체를 핵산 구조체와 혼합하여 핵산 구조체-제2 올리고 접합체 하이브리드를 형성하는 단계를 포함하는 핵산 구조체-제2 올리고 접합체 하이브리드 제조방법에 관한 것이다.
3. 입자화 소재
본 발명의 다기능 핵산을 이용한 치료법은 핵산 치료제의 불안정성, 비특이성, 세포독성 등의 한계가 있다. 이러한 한계를 극복하기 위해 다양한 약물운반체가 개발 중이며, 본 발명에서 입자화 소재-올리고 접합체를 이용한 새로운 다기능 핵산 운반체를 개발하였다.
본 발명의 상기 제3 올리고 접합체는 다기능 핵산의 단위 제3 염기서열에 상보적 결합이 가능하고 1종 이상의 입자화 소재를 최소한 포함하는 올리고이다. 상기 제3 올리고 접합체는 올리고의 일 말단에 연결된 입자화 소재를 최소한 포함할 수 있다.
*본 발명의 제3 올리고 접합체는 다기능 핵산 구조체의 방출, 흡수를 제어하거나, 체내의 특정 부위에 약물을 표적화하여 특이적 전달하기 위한 것으로, 약물의 부작용을 줄이면서 효능을 극대화 시켜 필요한 양의 약물을 표적 부위에 일정 시간 동안 효과적으로 머무를 수 있도록 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다기능 핵산 운반체는 체내에 과량 존재하면 독성을 나타내게 되고 반대로 너무 적은 양이 전달되는 경우에는 치료 효과가 나타나지 않기 때문에, 약물이 체내에서 일정한 시간 동안 치료 효과가 나타나는 범위 내에 유지되어야 한다. 본 발명은 장기간 약효를 지속할 수 있도록 약물의 방출 속도를 느리게 만드는 운반체를 제공하고자 한다.
상기 입자화 소재는 소수성물질, 양친매성 물질 및 친수성 물질로 이루어진 군에서 선택되어진 어느 1종일 수 있다.
보다 구체적인 다기능 핵산의 합성과 다기능 핵산로 구성된 입자의 특징, 세포전달 효율 및 효과는 후술하는 실시예에서 더욱 상세히 설명한다.
상기 소수성 물질은 탄화수소, 소수성 고분자(폴리카프로락톤 등), 소수성 펩타이드 및 실란으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
일반적으로 사용되는 소수성 물질은 지질성 물질, 콜레스테롤, 지방산, 콜렌산, 세포투과 단백질 및 세포투과 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 1 이상일 수 있으며, 바람직하게는 콜레스테롤을 사용할 수 있다.
본 발명의 펩타이드-올리고 접합체는 새로운 다기능 핵산 운반체를 제공한다.
펩타이드-올리고 접합체는 양전하를 띈 polyarginine(10R)과 표적지향성 펩타이드가 연결된 bifunctional peptide이다. 다기능 핵산 운반체의 불안정성을 극복하기 위하여 음전하를 띈 다기능 핵산 운반체가 양전하를 띈 polyarginine(10R)과 정전기적 상호작용을 하면서 구 모양의 펩타이드-올리고 접합체(RGD10-10R)/다기능 핵산 운반체 입자를 형성한다. 형성된 구 모양은 입체장애를 가지기 때문에 RNase로부터 핵산치료제, 다기능 핵산 운반체가 파괴되는 것을 막는다.
상기 지질성 물질은 천연지방, 부분 또는 전체가 수소화된 식물성유, C10내지 C22의 지방족 사슬을 갖는 포화 및/또는 불포화 지방산을 함유하는 반-합성 및 합성 모노-, 디- 및 트리-글리세라이드 및 이들의 폴리히드록시에틸화 유도체, 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 카프리네이트, -카프릴레이트, -라우레이트, -팔미테이트, -스테아레이트로부터 선택되는 액체왁스, 에틸올레에이트, 올레일올리에이트로부터 선택되는 지방산 에스테르, 카르나우바 왁스 및 밀납에서 선택되는 고체 왁스, 세틸 알콜, 스테아릴 알콜, 라우릴 알콜, 세틸스테아릴 알콜 및 이들의 폴리히드록시에틸화 유도체로부터 선택되는 지방족 알콜, 데카논산, 라우르산, 팔미트산, 스테아르산, 도코산산, 올레산, 리놀레산 및 이들의 폴리히드록시에틸화 유도체로부터 선택되는 지방족 카르복실산(C10 내지 C22) 등이다.
상기 양친매성 물질은 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜콜린, 포스파타이드산, 글리세릴 모노스테아레이트, 글리세릴 모노올레에이트, 글리세틸 팔미토스테아레이트, 트리글리세라이드 및 폴리히드록실화 트리글리세라이드, 지방산 및 중쇄 지방산(C6 내지 C12)의 에스테르, 폴리에틸렌글리콜, 폴리-(프로필렌옥사이드) 폴리-(에틸렌옥사이드) 코폴리머, 폴록사머, 폴리비닐 알콜, 폴리아크릴레이트, 폴리-(메틸비닐 에테르)-말레산 무수물 코폴리머, 키토산, 히알루론산, 셀룰로오즈, 스타치, 크산탄, 스클레로글루칸, 겔란, 구아검, 로커스트 빈 검, 알기네이트, 덱스트란, 폴리-ε-카프로락톤, 폴리-히드록시부티레이트, 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 코폴리머 등일 수 있다.
본 발명의 다기능 핵산 운반체는 생체 내에서 분해되어(biodegradable) 인체에 해가 없는 여러 가지 친수성 양이온 고분자 물질을 약물에 접합하여 효소에 의한 분해를 저해하며 표적 장기나 세포에 이르기 전 활성이 저해되는 것을 방지하고, 신장과 혈관에서의 흡수를 억제하여 혈중 체류시간을 연장하도록 하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다기능 핵산 운반체는 폴리에틸렌글리콜(polyetheleneglycol, PEG), 폴리락타이드(poly-lactide, PLA), 폴리글리콜리드(polyglycolide, PGA), 폴리락타이드코글리콜리드(poly-lactide-co-glycolide, PLGA), 폴리카프로락톤(poly-ε-carprolactone, PCL), 히알루론산(hyaluronic acid, HA), 키토산(chitosan), 혈청알부민 같은 물질을 사용할 수 있는데, 특히 이들은 단핵구와 대식세포에 의한 면역반응을 일으키지 않기 때문에 장기간 약효를 지속하게 하는 방법을 제공한다.
그러나 약물의 혈중 체류 시간은 치료와 진단의 목적에 따라 조절되어야 하는데, 치료가 목적인 경우 표적화 위치에서 오랫동안 안정적인 상태로 혈중에 머무르면서 효과를 나타내야 하고, 진단의 목적인 경우는 발생할 수 있는 부작용과 간섭을 최소화하도록 표적화한 위치에 필요한 시간 동안에만 머무르게 하는 방향으로 조절되어야 한다.
본 발명의 다기능 핵산 운반체에서 PEG는 페길화(PEGylation)를 통하여 반응기(functional group)를 약물과 접합하여 사용하게 되는데, 카르복실(Carboxyl), 아민(Amine), N말단(N-terminal), 티올(Thio) 등의 페길화를 이용하며 고성능액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)를 이용하여 분리, 정제한다.
본 발명의 다기능 핵산 운반체는 PLA, PGA 및 이들의 중합체인 PLGA을 사용할 수 있는데, PLGA는 그 안정성과 생체 적합성이 우수하며 분자량 및 고분자 중합체의 조성을 바꾸어 분해속도를 조절할 수 있다. PLGA의 분해속도를 1-3개월에 이르도록 자유롭게 조절할 수 있다. PLA나 PLGA를 사용한 경우 콜로이드(colloid)상태에서 안정성이 문제로 대두될 수 있다. PCL이 PLA나 PLGA 보다 더 효과적인데, 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide,PEO)와 접합한 PCL을 이용하여 약물을 성공적으로 표적화할 수 있다.
본 발명의 다기능 핵산 운반체는 생분해성, 생체적합성이 뛰어날 뿐 아니라 면역반응이 거의 없고 체내 분해 효소에 의해 분해되고 생물체에 공통적으로 존재하고 있는 다당류인 히알루론산을 사용할 수 있다.
본 발명의 다기능 핵산 운반체는 키틴(chitin)의 부분적인 탈아세틸화에 의해 형성되는 다당류로서 독성이 없는 생체적합성, 생분해성이 높은 고분자 물질로 친수성이 높고 점막질 부착성(mucoadehesive property)이 높은 키토산을 사용할 수 있다. 이러한 키토산의 장점은 산성 환경에서 용해도가 높고 양전하를 띠는 경향이 있어서 표면이 음전하를 띄는 점막질 같은 곳에 쉽게 부착하는 성질에 기인한다. 특히 뛰어난 점막질 부착성과 극성을 띈 고분자 물질들을 침투하게 할 수 있는 능력이 높이 평가되어 크기에 따른 경구투약의 효과가 높다.
본 발명의 다기능 핵산 운반체는 높은 약물부착 능력이 있는 혈청알부민을 사용할 수도 있다.
본 발명에 따른 다기능 핵산 운반체는 입자를 제공한다.
본 발명의 제3 올리고 접합체가 상보적인 결합을 한 다기능 핵산 운반체는 양친매성 성질을 획득하여 수용액 상에서 자가조립을 통해 고밀도로 응축된 입자를 형성하여 신체 내에 주사할 경우 혈액 안에서의 핵산 분해효소의 공격으로부터 안정성을 높일 수 있다.
본 발명의 다기능 핵산의 단위 제3 염기서열과 제3 올리고 접합체의 올리고의 상보적 결합으로 형성되는 운반체는 소수성 및 친수성 물질을 모두 포함하고 있는 양친매성(amphiphilic)이며, n개의 뉴클레오타이드, 변형 뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드 유사체로 구성되어 핵산분해효소에 저항성이 있는 친수성 물질 블록으로 이루어진 친수성 부분은 체내에 존재하는 물 분자들과 수소결합 등의 상호작용을 통해 친화력을 가지고 있어 바깥쪽으로 향하게 되고, 입자화 소재들은 그들 간의 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)을 통해 안쪽으로 향하게 되어 열역학적으로 안정한 입자를 형성하게 된다.
즉, 입자의 중심에 소수성 입자화 소재가 위치하게 되고, 다기능 핵산/제3 올리고 접합체 바깥쪽 방향에 위치하는 친수성 물질 블록, 뉴클레오타이드, 변형 뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드 유사체로 구성되어 핵산분해효소에 저항성이 있는 다기능 핵산 운반체의 입자를 형성한다. 이렇게 형성된 입자는 다기능 핵산 운반체의 세포 내 전달 향상 및 치료 및 영상화 효능을 향상시키며, 이를 질병의 영상화 및 치료목적으로 응용하는 것이 가능하다.
또한, 다기능 핵산/제3 올리고 접합체 복합체의 친수성 물질 블록 내에 친수성 물질 단량체 및 그 단량체의 개수 조절이 용이하고, 또한 사용될 친수성 물질 블록의 개수 또한 용이하게 조절할 수 있으므로, 모든 다기능 핵산/제3 올리고 접합체 복합체 내의 n개의 친수성 물질 블록으로 이루어진 친수성 물질 부분은 모두 동일하므로, 이러한 친수성 물질 부분을 가진 다기능 핵산은 물질 분석이 용이하다.
본 발명의 표적지향 리간드가 결합된 올리고 특히, 리간드가 N-아세틸갈락토사민, 만노스(mannose), 글루코오스(glucose)와 같은 당류일 경우, 구조식 (1)에 따른 다기능 핵산은 친수성 물질 블록의 반복횟수가 적었을 때 감소하는 친수성을 보완 및 강화하는 역할을 동시에 수행할 수 있어 입자의 형성을 안정화시켜준다. 이렇게 형성된 입자 및 리간드가 결합된 입자는 다기능 핵산 운반체의 세포 내 전달 향상, 영상화능 및 약물의 효능을 향상시키며, 이를 질병의 진단 및 치료 목적으로 응용하는 것이 가능하다.
친수성 물질 블록 및 친수성 물질 블록 내 친수성 물질 단량체의 반복횟수 조절을 통해 다기능 핵산/제3 올리고 접합체 복합체로 이루어진 입자의 크기를 조절할 수 있으므로, 이러한 다기능 핵산을 기반으로 형성된 입자는 매우 재현성있는 세포전달능력을 가질 수 있다.
4. 링커
본 발명의 다기능 핵산 운반체는 표적지향 리간드의 특이성, 이종 및 다중 활성물질로 이루어진 치료분자의 잠재력, 영상 소재 및 입자화 소재를 조합시키는 치료제 부류이다. 다기능 핵산 운반체는 여러 성분의 특성들의 장점을 가지며 생체 안정성을 확보하며 전신적인 노출과 관련된 독성을 최소화하는 동시에 표적 병변으로의 활성물질의 전달을 최대화시키고, 그로써 치료효율을 증가시킴으로써 활성물질들의 치료지수를 상당히 확대시킨다.
생체내 안정성, 표적분자 선택, 종양 세포에 의한 다기능 핵산 운반체 내재화 및 활성물질의 잠재력은 운반체 개발에 대한 매개변수이다. 또한, 다기능 핵산 운반체를 형성하기 위하여 이들 표적지향 리간드, 이종 및 다중 활성물질로 이루어진 치료 분자, 영상 소재 및 입자화 소재를 올리고에 공유적으로 결합시키기 위한 화학적 링커의 디자인 또한 다기능 핵산 운반체의 개발에 커다란 역할을 한다.
본 발명에서 활성물질-올리고 접합체의 링커는 건강한 조직에 대한 손상을 제한하기 위해 혈류 내에서 안정해야 한다. 운반체의 분해 또는 붕괴는 표적 부위들에 활성물질이 전달되기 전에 그것을 방출시킬 수 있다. 그러나 일단 운반체가 표적 부위들에 도달하게 되면, 운반체는 활성물질을 그것의 활성 형태로 효율적으로 방출해야 한다. 표적 세포에서 원형질내 안정성과 효율적인 약물 방출 사이의 균형은 아직 밝혀지지 않았지만, 링커 디자인에 좌우될 수 있다.
적어도 3가지 유형의 링커가 운반-올리고 접합체 디자인에 적용되는데, 즉 화학적-가변성 링커, 효소-가변성 링커 및 비-절단성 링커이다.
링커는 바람직하게는 생물학적 환경에 의해 생체 내에서 분리된다. 분리는 제한없이 임의의 공정, 예를 들면, 효소적, 환원적, pH 등으로부터 이루어질 수 있다. 분리가능한 기는 원하는 작용 자리에서 활성화가 일어나도록 선택되는데, 이 자리는 치료적 작용 또는 마커 활성의 자리와 같은 표적 세포(예컨대, 암종 세포)나 조직 내의 또는 근처의 자리가 될 수 있다. 그러한 분리는 효소적일 수 있으며, 예시적인 효소적으로 분리가능한 기는 천연 뉴클레오타이드로 끝나고 그의 인산기 말단에서 링커에 부착되는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
"링커"는 2개의 관능기 말단을 갖는 분자이고, 일 말단은 표적지향 리간드, 활성물질, 영상 소재 및 입자화 소재 등의 생물학적 분자 또는 이의 단편에 결합하거나 달리는 회합하기 위한 것이고, 다른 말단은 다기능 핵산의 염기서열과 상보적인 결합을 할 수 잇는 올리고에 접합하기 위한 것이다.
표적으로 하는 암세포 또는 암조직에 효율적으로 전달되기 위하여, 상기 표적지향 리간드, 활성물질, 영상 소재, 나노입자, 핵산나노구조체 및 입자화 소재를 포함하는 운반소재는 동일하거나 상이한 올리고 사이에 링커가 연결될 수 있다.
상기 링커는 스페이서(spacer) 부분과 관능기(functional group)를 포함할 수 있다. 상기 스페이서 부분이 너무 긴 경우에는 소수성 성질이 높아 사용될 수 없으므로, C1 내지 C6의 직쇄형 또는 분지형 알킬렌기, 바람직하게는 C1 내지 C6의 직쇄형 알킬렌기가 스페이서 부분으로서 적합하다.
상기 스페이서는 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌, 펜틸렌, 또는 헥실렌일 수 있다. 상기 스페이서 부분은 운반소재와 올리고를 연결시켜 주기 위하여 관능기가 도입되며, 상기 관능기는 운반소재와 올리고를 연결시켜 주는 기로서 구성 성분들을 결합할 수 있는 모든 작용기를 포함한다. 상기 관능기는 아민기(-NH2), 설프히드릴기(-SH) 일수 있으며, 상기 관능기는 운반소재와 올리고 사이에 공유 결합을 할 수 있다.
본 발명의 운반-올리고 접합체는 표적 지향 리간드, 활성물질, 영상 소재 및 입자화 소재를 포함하는 운반소재를 올리고에 부착시키는 하나 이상의 링커를 포함한다. 상기 링커는 운반소재에 결합하여 접합체를 형성할 수 있으며, 여기서, 상기 운반체는 표적 세포로의 전달시 적어도 하나의 활성물질을 방출한다.
상기 활성물질을 표적으로 하는 암세포 또는 암조직에 효율적으로 전달되기 위하여, 상기 운반-올리고 접합체와 다기능 핵산 사이에 상보적 결합으로 연결되여 다기능 핵산 운반체를 형성할 수 있다. 상기 다기능 핵산 운반체는 활성물질을 표적 세포로 전달하는 기능을 제공할 수 있다.
상기 다기능 핵산 운반체는, 운반소재와 올리고 상에서 반응성 커플링 그룹과 반응시켜 운반소재와 올리고에 공유 결합하는 스페이서를 형성할 수 있는 링커로부터 제조될 수 있다.
연결될 수 있는 기타 관능성 그룹은 -CH, -COOH, 알케닐, 포스페이트, 설페이트, 헤테로사이클릭 NH, 알킨 및 케톤을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
상기 커플링 반응은 에스테르화 조건하에, 예를 들면, 활성화제, 예를 들면, 카보디이미드(디이소프로포일카보디이미드(DIPC))의 존재하에 촉매, 디메틸아미노피리딘(DMAP)의 존재하에 또는 부재하에 수행될 수 있다. 이러한 반응은 적절한 용매, 예를 들면, 디클로로메탄, 클로로포름 또는 에틸 아세테이트 중에서, 약 0℃ 내지 용매의 환류 온도(주위 온도)의 온도에서 수행될 수 있다.
상기 커플링 반응은 용매, 예를 들면, 피리딘 중에서 또는 염소화 용매 중에서 촉매, 예를 들면, DMAP 또는 피리딘의 존재하에 약 0 ℃ 내지 용매의 환류 온도(예를 들면, 주위 온도)에서 수행된다. 바람직한 양태에서, 상기 커플링 시약은, 염소화, 에테르화 또는 아미드 용매(예를 들면, N,N-디메틸포름아미드) 중에서 촉매, 예를 들면, DMAP의 존재하에 약 0 ℃ 내지 용매의 환류 온도(예를 들면, 주위 온도)의 온도에서 4-(2-피리딜디티오)-부탄산, 및 카보디이미드 커플링 시약, 예를 들면, DCC로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
상기 운반-올리고 접합체는, 운반소재와 올리고 상에서 반응성 커플링 그룹과 반응시켜 공유 결합을 형성할 수 있는 상보적 반응성 그룹을 갖는 링커에 하나 이상의 반응성 커플링 그룹을 갖는 커플링 운반소재와 올리고를 커플링시킴에 의해 제조될 수 있다.
예를 들면, 1급 아민 그룹을 갖는 운반소재와 올리고를 이소티오시아노에이트 그룹 또는 또 다른 아민-반응성 커플링 그룹을 갖는 링커에 커플링시킬 수 있다.
상기 링커는, 상기 운반소재 상에서 상보적 관능성 그룹과 반응시킬 수 있는 제1 반응성 커플링 그룹과, 상기 올리고 상에서 상보적 관능성 그룹과 반응시킬 수 있는 제1 반응성 커플링 그룹과 상이한 제2 반응성 커플링 그룹을 포함할 수 있다. 링커 상에서 반응성 커플링 그룹 중 하나 또는 둘 다를 합성의 일부 동안 적합한 보호 그룹으로 보호할 수 있다.
III. 다기능 핵산 운반체의 제조방법
본 발명의 다기능 핵산 운반체는 기본모듈 단위로 구성된 다기능 핵산과 운반-올리고 접합체로 구성되며 이들을 각자 따로 제조하고 혼성화 반응으로 제조할 수 있다.
본 발명은 상기 단위 염기서열들로 구성된 기본모듈 단위가 1회 이상 반복적으로 있는 다기능 핵산의 제조단계;
상기 단위 염기서열들에 상보적 결합하는 올리고들를 제조하는 단계;
상기 제조된 올리고들에서 선택되어진 1종 이상의 올리고의 적어도 일 말단에 운반소재에서 선택되어진 1종 이상을 포함하는 운반-올리고 접합체를 제조하는 단계; 및
상기 제조한 다기능 핵산과 상기 제조한 운반-올리고 접합체를 혼합하여 다기능 핵산/운반-올리고 접합체 복합체, 다기능 핵산 운반체를 형성하는 단계를 포함하는 다기능 핵산 운반체 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 다기능 핵산은 DNA 골격 또는 RNA 골격인 호모 폴리머일 수도 있고 다기능 핵산의 단위 염기서열별로 DNA 또는 RNA들이 혼합된 헤테로 폴리머일 수도 있다.
본 발명의 다기능 핵산이 호모 폴리머의 경우, 구조식 (1)을 기준으로 다기능 핵산의 단위 제1 염기서열, 제2 염기서열 및 제3 염기서열을 도 1과 같이 배열한 DNA 주형을 제조하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 다기능 핵산이 DNA인 경우, 본 발명의 기본모듈 단위 DNA를 제조하는 단계; 및 상기 제조한 기본모듈 단위 DNA들을 1회 이상 반복적으로 있는 단일가닥 DNA를 제조하는 단계를 포함하는 다기능 핵산의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 제조된 단일가닥 DNA 주형을 직접 다기능 핵산으로 사용하거나, 유기 합성한 DNA 주형을 Polymerase로 복제한 단일가닥 DNA를 다기능 핵산으로 사용할 수도 있다.
본 발명의 다기능 핵산이 RNA인 경우, 이를 제조하는 프로모터가 있는 기본 모듈 단위 이중가닥 DNA 주형을 제조하는 단계; 및 상기 제조한 DNA 주형 및 RNA 폴리머라제를 이용한 체외전사(in vitro transcription) 반응을 수행하여 RNA 전사체 다기능 핵산을 제조하는 단계를 포함하는 다기능 핵산의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 상기 제조된 DNA 주형을 대상으로 구체적으로 체외전사(IVT, in vitro transcription) 또는 롤링 서클 전사(RCT, Rolling Circle Transcription)을 수행하여 얻은 RNA 전사체를 다기능 핵산으로 사용할 수 있다.
본 발명의 다기능 핵산이 헤테로 폴리머의 경우에 각각 단위 염기서열들을 정해진 종류로 제조하고 연결하여 기본모듈 단위들을 제조하고 이들 기본모듈 단위를 일정한 순서에 따라 연결하여 다기능 핵산을 제조할 수 있다.
본 발명의 다기능 핵산의 단위 염기서열들로 구성된 기본모듈 단위가 1회 이상 반복적으로 있는 다기능 핵산은 상기 단위 염기서열과 기본모듈 단위들을 링커를 이용한 연결법으로 제조할 수도 있다.
본 발명의 다기능 핵산 및 운반-올리고 접합체의 올리고는 천연 뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드와 뉴클레오사이드 유사체를 사용하여 유기합성하거나, 상응하는 DNA 주형을 대상으로 Polymerase 또는 RNA Polymerase에 의한 제조할 수 있다.
본 발명의 다기능 핵산 및 운반-올리고 접합체의 올리고는 포스포디에스테르(pO), 포스포로티오네이트(PS) 또는 H-또는 알킬 또는 알케닐 포스포네이트에 의해 연결된 약학적 활성 또는 치료모노머 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체의 사슬로부터 형성된 폴리 뉴클레오타이드 화합물일 수 있다.
본 발명은 혼합 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 결합을 함유하는 폴리 뉴클레오타이드일 수도 있다. PS 결합을 갖는 올리고머는 pO 결합을 갖는 올리고머보다 더 안정하며, 결과적으로 PS 올리고머는 pO 결합된 올리고머보다 느린 속도로 분해된다.
본 발명의 실시례에서 사용하는 다기능 핵산은 (i) 구조식 (1)처럼 T7 프로모터와 단위 제1 염기서열, 단위 제2 염기서열 및 단위 제3 염기서열로 구성된 기본모듈 단위로 이루어진 단위 구조체를 유기합성하는 단계; (ii) 상기 제조된 단위 구조체에 상기 기본모듈 단위를 일정한 순서에 따라 연결하여 기본모듈 단위가 1회 이상 반복적인 다기능 핵산 DNA 주형을 제조하는 단계; 및 (iii) 상기 다기능 핵산 DNA 주형을 대상으로 변형 뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드 유사체로 이루어진 군에서 1종 이상과 천연 뉴클레오타이드를 사용하여 체외전사 반응을 실시하여 상기 기본모듈 단위의 반복으로 이루언진 RNA 전사체, 또는 증폭하여 상기 기본모듈 단위의 반복으로 이루어진 단일가닥 DNA를 제조하는 단계를 포함하여 제조할 수 있다.
본 발명의 운반-올리고 접합체는 운반소재와 올리고 사이에 스페이서(spacer)를 둘 수도 있다. 이들 사이를 조합/연결하는 스페이서의 길이를 변경시킴으로써 선택성 및/또는 특이성 및/또는 효능에 따라 딱 맞는 유연성 및 거리를 선택할 수 있게 해 준다.
상기 스페이서는 약 1 내지 20개의 연속적인 뉴클레오타이드, 바람직하게는 1 내지 5개의 연속적인 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 2개의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 스페이서인 상기 1차 스페이서 및/또는 2차 스페이서는 하나 이상의 에틸렌 글리콜 부위 또는 이러한 에틸렌 글리콜 부위가 다수인 것을 포함하는 것이다.
표적지향 리간드와 스페이서가 모두 동일한 리간드-올리고 접합체 접합체로 호모 폴리머일 수도 있다. 경우에 따라 표적지향 리간드의 한쪽 말단에 스페이서를 부가할 수도 있다.
다기능 핵산 복합체에서 표적지향 리간드와 스페이서의 각각이 동일하지 않은 운반-올리고 접합체로 헤테로 폴리머일 수도 있다.
또한, 스페이서 부분이 너무 긴 경우에는 소수성 성질이 높아 사용될 수 없으므로, C1 내지 C6의 직쇄형 또는 분지형 알킬렌기, 바람직하게는 C1 내지 C6의 직쇄형 알킬렌기가 스페이서 부분으로서 적합하다. 예컨대, 상기 스페이서는 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌, 펜틸렌, 또는 헥실렌일 수 있다. 상기 스페이서 부분은 활성물질와 압타머를 연결시켜 주기 위하여 관능기가 도입되며, 상기 관능기는 압타머와 활성물질를 연결시켜 주는 기로서 압타머와 활성물질를 결합할 수 있는 모든 작용기를 포함한다. 예컨대 상기 관능기는 아민기(-NH2), 설프히드릴기(-SH) 일수 있으며, 상기 관능기는 압타머와 활성물질 사이에 공유 결합을 할 수 있다.
상기 운반-올리고 접합체는 하나 이상의 표적지향 리간드, 하나 이상의 링커, 하나 이상의 치료분자, 하나 이상의 입자화 소재 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다. 상기 다기능 핵산 운반체는 임의의 수의 표적지향 리간드, 링커, 활성물질 및 입자화 소재를 가질 수 있다.
본 발명의 운반-올리고 접합체는 (i) 1종의 상기 선별된 표면 마커에 특이적으로 결합하는 표적지향 리간드 단위로 최소한 포함하는 표적지향 리간드를 결정하는 단계; (ii) 1종 이상의 활성물질 단위를 포함하는 치료분자를 결정하는 단계; (iii) 변형 뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드 유사체로 이루어진 군에서 1종 이상과 천연 뉴클레오타이드로 다기능 핵산의 단위 염기서열의 상보적 서열로 올리고를 제조하는 단계; 및 (iv) 상기 결정된 운반 소재와 상기 제조한 올리고를 링커를 사용하여 운반-올리고 접합체를 제조하는 단계를 포함하여 제조할 수 있다.
본 발명의 다기능 핵산 운반체는 상기 다기능핵산과 운반-올리고 접합체의 혼성화로 제조할 수 있다.
본 발명의 다기능 핵산 운반체는 (i) 상기 제조한 다기능 핵산과 상기 제조한 운반-올리고 접합체를 혼성화 용액에 넣고 95℃에서 5분간 가열하는 단계; 및 (ii) 상기 가열한 용액을 실온에 1시간 동안 혼성화하는 단계를 포함하여 제조할 수 있다.
본 발명의 다기능 핵산 운반체는 상기 제조된 다기능 핵산과 리간드-올리고 접합체/제1 염기서열 모듈, 활성물질-올리고 접합체/제2 염기서열 모듈 및 입자화 소재-올리고 접합체/제3 염기서열 모듈로 이루어진 군에서 선택되어진 어느 하나 이상의 모듈을 최소한 포함하는 복합체일 수도 있다.
본 발명의 다기능 핵산 운반체는, 표적 세포에 특이적 전달이 가능하도록 하는 최소한 1종 이상의 표적지향 리간드가 있는 제1 올리고 접합체 또는 치료분자가 있는 제2 올리고 접합체가 상보적으로 결합하거나 또는, 상기 제1 올리고 접합체의 올리고가 상보적 결합하는 단위 제1 염기서열 대신에 표적지향 리간드 압타머 단위 제1 염기서열이 내재된 다기능 핵산에 제3 올리고 접합체를 처리하여 제조된 다기능 핵산 운반체로 각종 분해효소와 같은 외부공격으로부터 안정성을 확보하고, 다기능 핵산 운반체를 표적 세포에 특이적으로 전달할 수 있다.
IV. 다기능 핵산 운반체
본 발명의 다기능 핵산 운반체는 다기능 핵산과 운반-올리고 접합체로 구성되며, 본 발명에서 제시하는 다기능 핵산에 대한 구조식 (1)을 세부화하면 다음과 같다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
첫째, 제1 올리고 접합체가 상보적 결합이 가능한 단위 제1 염기서열, 제2 올리고 접합체가 상보적 결합이 가능한 단위 제2 염기서열, 및 제3 올리고 접합체가 상보적 결합이 가능한 단위 제3 염기서열로 이루어진 군에서 선택되어진 어느 2종 이상의 단위 염기서열로 구성된 기본모듈 단위가 1회 이상 반복적으로 존재하는 제1 다기능 핵산이라고 지칭하였다.
둘째, 제1 올리고 접합체가 상보적 결합이 가능한 단위 제1 염기서열, siRNA를 포함한 단위 제2 염기서열, 및 제3 올리고 접합체가 상보적 결합이 가능한 단위 제3 염기서열로 이루어진 군에서 선택되어진 어느 2종 이상의 단위 염기서열로 구성된 기본모듈 단위가 1회 이상 반복적으로 존재하는 제2 다기능 핵산이라고 지칭하였다.
셋째, 표적지향 리간드 압타머를 포함한 단위 제1 염기서열, 제2 올리고 접합체가 상보적 결합이 가능한 단위 제2 염기서열, 및 제3 올리고 접합체가 상보적 결합이 가능한 단위 제3 염기서열로 이루어진 군에서 선택되어진 어느 2종 이상의 단위 염기서열로 구성된 기본모듈 단위가 1회 이상 반복적으로 존재하는 제3 다기능 핵산이라고 지칭하였다.
넷째, 표적지향 압타머를 포함한 단위 제1 염기서열; siRNA를 포함한 단위 제2 염기서열; 및 제3 올리고 접합체가 상보적 결합이 가능한 단위 제3 염기서열;로 이루어진 군에서 선택되어진 어느 2종 이상의 단위 염기서열로 구성된 기본모듈 단위가 1회 이상 반복적으로 존재하는 제4 다기능 핵산이라고 지칭하였다.
본 발명에 따라, 상기 제1과 제3 다기능 핵산은 전체 또는 일부에 내재된 다중의 Gem 항암물질 및 다른 항암물질에 의한 높은 암세포 사멸과 병용치료 효과를 기대할 수 있으며, 제2와 제4 다기능 핵산은 전체 또는 일부에 내재된 다중의 Gem 항암물질에 의한 암세포 사멸과 내재된 siRNA에 의한 활성물질 저항성(예를 들어, 항암 내성)을 유발하는 1종 이상의 유전자를 동시에 사일런싱할 수 있으며, 상기 부가된 리간드에 의해 표적 특이적 전달능을 확보할 수 있다.
상기 다기능 핵산 운반체에 서로 상이한 n종의 표적지향 리간드를 포함하는 경우에는 상기 다기능 핵산의 단위 제1 염기서열은 제1 리간드 내지 제n 리간드의 단위를 포함할 수 있다(n은 1 이상의 정수).
바람직하게는 상기 리간드가 서로 상이 한 2종의 리간드인 경우, 상기 기본모듈 단위의 단위 염기서열들이 각각 제1 리간드와 제2 리간드의 단위로 이루어지거나 동일한 단위 염기서열에 제1 및 제2 리간드가 있을 수 있다.
상기 제1 리간드와 제2 리간드는 서로 상이하며, 상기 제1 리간드와 제2 리간드 사이에 스페이서로 연결될 수도 있다.
본 발명의 활성물질-올리고 접합체는 상기 활성물질 치료분자, 약제학적 활성 성분인 뉴클레오사이드 유사체를 사용하여 제조된 표적화 치료분자, 이중가닥 핵산에 결합하는 활성물질이 있는 DNA 박스(box) 치료분자로 구성된 군에서 선택되어진 1종 이상의 치료분자를 포함할 수 있다.
상기 제2 및 제4 다기능 핵산의 단위 제2 염기서열은 1종 또는 서로 상이한 2종 이상의 siRNA를 포함할 수 있는데, 상기 서로 상이한 2종 이상의 siRNA 반복단위 각각은 siRNA의 센스가닥 서열 및 안티센스가닥 서열이 상이한 것일 수 있으며, 예를 들어 1 내지 1,000,000회, 바람직하게는 10 내지 1,000 반복하여 연결된 것 일 수도 있다.
본 발명의 다기능 핵산에 서로 상이한 n종의 siRNA를 포함하는 경우에는 상기 다기능 핵산의 단위 제2 염기서열은 제1 siRNA 내지 제n siRNA의 제2 염기서열을 포함할 수 있다(n은 1 이상의 정수).
상기 단위 제2 염기서열은 상보적으로 결합된 센스서열과 안티센스서열; 및 상기 센스서열의 3'말단 및 안티센스 서열의 5'말단 각각에 연결된 루프영역 서열이 헤어핀 구조를 이룰 수 있으며, 이때 상기 헤어핀 구조는 하이브리드 내부에 위치할 수 있다.
상기 siRNA가 첫 번째 siRNA 및 두 번째 siRNA로 이루어진 2종의 siRNA일 때, 상기 반복단위는 5'말단에서 3'말단 방향으로 순차적으로 첫 번째 siRNA의 센스서열, 루프영역 서열, 첫 번째 siRNA의 안티센스 서열, 제2 RNA서열, 두 번째 siRNA의 센스서열, 루프 영역 서열, 두 번째 siRNA의 안티센스 서열 및 링커 서열로 이루어진 것일 수 있다.
이와 같이 다기능 핵산 운반체 입자 내부에 위치하는 단위 염기서열 제2 염기서열 내 RNA 헤어핀은 외부와 물리적으로 차단되므로 뉴클레아제(nuclease)와 같은 분해효소로부터 자유로워 안정성이 우수하다.
이와 같은 본 발명의 siRNA를 포함하는 다기능 핵산 운반체는 RNA 헤어핀을 운반체 외부에 노출된 표적지향성 리간드에 의해 효과적으로 표적 세포에 결합한 후 세포 내로 투과되며 세포질에서의 Dicer 효소에 의하여 siRNA로 분해된 후 효과적으로 mRNA의 발현을 억제할 수 있다.
특히 서로 상이한 2종 이상의 siRNA를 포함하는 경우, 2 이상의 항암화학약제 내성 유전자와 같은 유전자를 동시에 발현 억제하고 암세포에서의 항암저항성을 억제함으로써 항암화학약제 내성 암세포의 치료가 가능하게 할 수 있다.
본 발명의 다기능 핵산 운반체는 이종의 활성물질을 다중으로 탑재하는 방법을 채용하기 때문에, 본 발명은 리간드-올리고 접합체와 입자화 소재-올리고 접합체를 상보적 서열을 이용한 다기능 핵산과를 시킴으로써 다기능 핵산 운반체가 암세포 특이적인 표적성 및 세포투과성을 모두 나타낼 수 있어 세포구별 능력 없이 단순히 세포의 투과성만을 구현한 종래 기술의 문제점을 개선하였다.
본 발명의 다기능 핵산 운반체 또는 입자는 30% 혈청 조건하에서의 핵산분해효소 공격으로부터 우수한 안정성을 가지고 있음을 확인하였다. 세포안으로 투과된 후 다기능 핵산은 핵산분해효소에 의해 분해되면서 젬시타민을 방출할 수 있으며, 표적지향 리간드 수용체의 유무에 따라 암세포 선택적으로 다기능 핵산 운반체가 전달될 수 있음을 확인하였다.
본 발명은 상기 다기능 핵산을 구성하는 기본모듈 단위와 입자화 소재-올리고 접합체가 형성하는 복합체의 반복횟수에 의해 입자화를 조절하는 것을 특징으로 하는 다기능 핵산 운반체를 제공한다.
본 발명의 다기능 핵산 운반체 입자는 리포좀(Liposome), 미셀(Micelle), 덴드리머(Dendrimer), 무기 나노입자(Inorganic Nanoparticles), 자가조립 핵산 나노입자(Self-Assembled Nucleic Acid Nanoparticles) 등을 제공할 수 있다. 상기 약물 운반체를 생성하여 생체 내에서 농도 차이에 의한 확산과 생체 내에서 고분자의 분해에 따른 약물 방출로 약물이 체내에 지속적으로 전달되게 하는 방식을 제공하는데, 리포좀과 PEG를 이용하여 비수용성 약물의 용해도를 높이고 천천히 방출되도록 만든 방법을 제공한다.
본 발명의 다기능 핵산 운반체는 입자 형태일 수 있으며, 이는 수용액 상에서 자가조립하여 입자가 형성될 수 있다.
상기 다기능 핵산 운반체 입자는 직경이 1 내지 1,000 nm, 예를 들면 50nm 내지 200nm, 더욱 바람직하게는 50 내지 450nm일 수 있다.
본 발명은 상기 다기능 핵산 운반체로 이루어진 입자를 포함한다. 상기다기능 핵산 운반체에 관한 사항은 상기 입자에 동일하게 적용될 수 있다.
본 발명의 다기능 핵산 운반체의 마이크로미터 크기를 세포투과가 가능한 나노미터 크기로 감소시키고자 입자화 소재-올리고 접합체를 상보적 서열을 이용한 다기능 핵산의 기본모듈 단위와 혼성화를 시켰으며 입자화 소재의 소수성 성질을 이용하여 결과적으로 양친매성 다기능 핵산 운반체(예, 다기능 핵산/입자화 소재-올리고 접합체 복합체)를 제조하였으며 이러한 다기능 핵산 운반체는 나노미터 크기의 입자를 형성할 수 있다.
본 발명의 다기능 핵산 운반체에 대한 양이온성 리포좀은 전하 복합체의 형성에 의해 음으로 대전된 다기능 핵산의 전달을 위한 방법을 제공할 수 있다.
리포좀은 크기가 작아 전신 순환하면서 암 조직 주변의 비정상적인 혈관신생으로 인해 생기는 혈관 결함을 통해 빠져나올 수 있어, 캡슐화된 물질을 종양 부위에 전달할 수 있다. 또한, 종양 부위는 림프 배출이 원활하지 않기 때문에 enhanced permeability and retention(EPR) effect를 초래한다.
PEGylation은 리포좀의 순환 시간을 연장시킨다. 그 메커니즘은 리포좀 표면의 PEG가 수막을 끌어 당겨 옵소닌의 흡착을 감소시키고 단핵 식세포의 세포에 의한 리포좀의 인식을 유발하는 것이다. 따라서, 리포좀을 이용한 다기능 핵산 운반체의 PEGylation은 복합체의 순환시간을 증가시키고, 표적화된 조직에서 다기능 핵산 운반체의 양을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 나노구(Nanosphere)는 구형을 이루는 콜라겐이나 알부민으로 이루어진 수십에서 수백 nm에 이르는 구형체를 지칭한다. 다기능 핵산와 운반-올리고 접합체 복합체는 중합체 내부에 봉합되며, 제조된 방법에 따라 약물의 배출속도가 조절될 수 있고, 리간드-올리고 접합체의 올리고와 연결이 용이하다.
본 발명의 마이셀(Polymeric micelle)은 입자화 소재가 친수성과 소수성의 인지질(phospholipid)로 중합체들로 소수성 부분이 서로 모여 구형을 이루게 되며 보통 50 nm 이하의 크기로 만들어지는 단층(monolayer)구조체이고 소수성 약물의 수송에 용이하다. 본 발명의 Micelle 구조는 한 분자내에서 친수성과 소수성을 모두 띄는 분자가 단일층의 막을 이루어 형성하는데 필요에 따라 막 외부에는 PEGylation처리를 할 수도 있다.
본 발명의 덴드리머(Dendrimers)는 다기능 핵산와 운반-올리고 접합체 복합체가 중심의 core로부터 분지된 거대분자들이 일정한 3차원 구조를 이루면서 형성된 중합체(polymer)인데, 순차적인 중합반응(polymerization)에 의해서 크기가 조절되며 1 nm 정도의 작은 core부터 수십 수백 nm에 이르는 다양한 크기의 덴드리머를 합성할 수 있다.
본 발명의 다기능 핵산 운반체와 같은 핵산 약물운반체로 사용되는 양전하를 띠는 폴리머 중 비교적 새로운 부류에 속하는 dendrimer는 운반체의 양전하 부분이 핵산 분자의 음전하 부분과 정전기적 상호작용을 통해 효과적으로 응축되고, 이렇게 생성된 나노 크기의 복합체가 체내의 효소로부터 핵산의 분해를 방지한다.
무기 나노입자(Inorganic Nanoparticles)는 낮은 독성으로 다기능 핵산 운반체일 수도 있다. 약물 전달 관점에서는 다기능 핵산을 화학적 변환 없이 무기 나노입자 안에 담을 수 있다는 특징이 있다. 다기능 핵산을 전달하는데 쓰이는 무기 나노입자에는 규소, 칼슘, 금, 마그네슘, 스트론튬, 퀀텀 닷 등이 있다. 무기 나노입자는 생체 적합성, 약물의 방출 조절, 표적 약물전달 능력 등 세포 전달에 알맞은 여러 특성을 가질 수 있고 비강(nasal), 비경구(parenteral), 안내(intraocular) 등 다양한 투여경로에 쓰일 수 있다.
금 나노입자(Gold Nanoparticles)는 중심부의 금 원자를 단층의 싸이올을 포함한 작용기가 둘러싼 형태로 다기능 핵산을 나노입자로 제조할 수도 있다. 금 나노입자는 이 작용기들이 있을 때 합성될 수 있다. NaBH4를 이용하여 금/싸이올 비율을 조정할 수 있다. 금 나노입자는 인간 세포수준에서 독성이 없다.
본 발명은 자가조립 다기능 핵산 운반체는 다기능 핵산 구조체 자체의 안정 확보 방법과 캡슐화 단계를 제공할 수도 있다.
자가조립 핵산 나노 구조체(Self-Assembled Nucleic Acid Nanoparticles)를 이용하면 원하는 크기의 입자를 이용해 핵산 치료제를 세포나 표적으로 전달할 수 있다. 정확한 크기와 더불어 공간적 배열, 표면 ligand의 밀도를 정밀하게 조절하여 리간드가 적절한 배향을 이루면 유전자 억제가 이루어진다. 이러한 장점을 이용한 자기조립 핵산 나노구조체는 약물의 체내 반감기를 늘리고, 독성을 낮추어 더 효과적인 치료 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 다기능 핵산 운반체는 선정된 입자화 소재를 변형하여 외부 자극에 반응하여 약물 방출이 조절되어지는 하이드로젤(Hydrogel)을 제조할 수 있는데, PEG와 덱스트란(dextran)을 섞어서 메타크릴레이트(methacrylate)기와 락타이드(lactide)기를 도입한 덱스트란의 하이드로젤이나 히알루론산에 다양한 반응기를 도입한 하이드로젤을 형성할 수 있다.
본 발명의 다기능 핵산 운반체는 이외에도 pH, 온도, 이온, 농도, 전기장 등과 같은 자극에 반응하여 약물 방출이 조절되어지는 다양한 형태의 하이드로젤도 개발할 수 있다.
본 발명의 다기능 핵산 운반체는 약물전달기구의 경우 반도체 칩을 이용한 것과 삼투막(osmotic membrane)이나 나노기공막(nanoPORE membrane) 등을 이용한 임플란트(implant) 시스템, 마이크로니들(microneedle) 등을 이용한 패치 등을 사용할 수 있다.
상기 조성물은 사람을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 목적하는 방법에 따라 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 활성물질형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성물질 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명로 표시되는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다.
비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종, 중증도, 활성물질의 활성, 활성물질에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 활성물질을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 치료용 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 화합물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏당 0.1 내지 100 mg, 바람직하게는 0.5 내지 10 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
바람직하게는 상기 다기능 핵산 운반체 또는 입자를 포함하고, 상기 다기능 핵산 운반체 또는 입자가 제제화된 단위 투여 형태를, 각 단위 투여량으로 투여하고 추가적으로 활성물질을 투여하는 것에 관한 지침서를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 다기능 핵산 운반체를 포함하는 세포기반 활성물질 스크리닝 조성물에 관한 것이며, 스크리닝 조성물에 대하여는 상기 다기능 핵산 운반체 입자에 대한 사항이 동일하게 적용될 수 있다.
또 다른 예로서, 본 발명은 상기 조성물을 투여하여 질병을 치료하는 방법을 포함할 수 있다.
상기 다기능 핵산 운반체, 입자 및 조성물에 대한 사항은 치료 방법에 동일하게 적용될 수 있다.
본 발명의 다양한 운반소재의 동시 전달용 다기능 핵산 운반체/입자는 운반체를 표적분자를 갖고 있는 세포들에 대한 표적화 효과, 이종다중의 활성물질들을 동시 운반에 따른 병용치료 효과, 및 헤어핀 구조의 스페이서와 입자화 소재로 각종 핵산분해효소와 같은 외부공격으로부터 운반체의 안정성을 확보할 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 표적화, 입자화 및 siRNA 치료제를 포함한 병용치료를 동시에 구현하는 다기능 핵산 운반체를 개발하여, 항암치료의 부작용을 최소화하고 암세포의 이질성에 따른 항암치료효과를 극대화하는 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 a는 다기능 핵산과 운반-올리고 접합체의 일차 구조, b는 다기능 핵산 운반체의 이차 구조에 대한 모식도이고,
도 2는 다기능핵산 표준 DNA 주형 5를 PCR하여 얻은 산물, 제한효소 및 T4 DNA 리가아제(ligase)을 사용하여 얻은 산물을 대상으로 T7 프로모터 염기서열과 역방향 프라이머로 PCR 하여 다기능핵산 표준 DNA 주형 10을 제조한 결과이고,
도 3은 압타머를 포함하는 다기능핵산 DNA 주형 5를 PCR하여 얻은 산물, 제한효소 및 T4 DNA 리가아제(ligase)을 사용하여 얻은 산물을 대상으로 T7 프로모터 염기서열과 역방향 프라이머로 PCR 하여 압타머를 포함하는 다기능핵산 DNA 주형 10을 제조한 결과이고,
도 4는 siRNA를 포함하는 다기능핵산 DNA 주형 5를 PCR하여 얻은 산물, 제한효소 및 T4 DNA 리가아제(ligase)을 사용하여 얻은 산물을 대상으로 T7 프로모터 염기서열과 역방향 프라이머로 PCR 하여 siRNA를 포함하는 다기능핵산 DNA 주형 10을 제조한 결과이고,
도 5는 다양한 다기능 핵산 DNA 주형에 대해 IVT 반응을 하고 얻은 산물을 전기영동한 결과이고,
도 6은 다양한 다기능 핵산과 운반-올리고 접합체를 혼성화하여 형성된 다기능 핵산 운반체를 전기 영동한 결과이고,
도 7은 다양한 다기능 핵산(MFN)의 혈액 내 안정성을 조사하기 위하여 30% FBS 조건하에서 시간 별로 FBS 내 nuclease에 의해 다기능 핵산이 분해된 분해산물을 3% 아가로스 겔 전기 영동한 결과이고,
도 8은 제조한 다기능 핵산 운반체의 기본모듈 단위의 반복횟수에 따라 형성된 다기능 핵산 운반체들 MFNC1, MFNC5, MFNC10와 MFNC15를 3% 아가로스 겔 전기 영동한 결과이고,
도 9는 다기능 핵산 운반체 MFNC5, MFNC10와 MFNC1에서 투과 전자 현미경(Transmission electron microscopy)을 이용하여 분석한 결과이고,
도 10은 다양한 다기능 핵산 운반체의 혈액 내 안정성을 조사하기 위하여 30% FBS 조건하에서 시간 별로 FBS 내 nuclease에 의해 다기능 핵산, 다기능 핵산 운반체 등이 분해된 분해산물을 3% 아가로스 겔전기 영동한 결과이고,
도 11은 in vitro에서 siRNA를 포함하는 다기능 핵산 운반체를 대상으로 Dicer 1.5unit을 처리하여 siRNA가 생성되는 것을 조사한 결과이고,
도 12. 젬시타빈만을 처리한 경우, MDR1 및 BCL2 siRNA를 처리한 경우 그리고 siRNA를 포함하는 다기능 핵산 운반체 (최종 농도 20 μg/mL) 처리하고 24시간 후에 qRT-PCR하여 MDR1 및 BCL2 mRNA을 분석한 결과이고,
도 13은 폴레이트 수용체 선택적인 표적성을 조사하기 위하여 폴레이트 수용체-양성(receptor-positive) KB-V1 종양세포 및 폴레이트 수용체-음성(receptor-negative) HepG2 carcinoma cell에 형광 표지된 다기능 핵산 운반체 폴레이트를 갖고 있는 MFNC10를 처리하고 3시간 후에 형광현미경과 유세포 분석기(flow cytometry)로 분석하였으며, 대조군으로 폴레이트가 결합되지 않은 Cy3 형광표지된 다기능 핵산 운반체 또는 폴레이트로 미리 세포를 처리하여 폴레이트 수용체를 포화시킨 후 Cy3 형광표지된 다기능 핵산 운반체 입자를 사용하여 분석한 결과이고,
도 14는 다기능 핵산 표준 운반체 Nucleolin 압타머를 갖고 있는 MFNC10가 암 세포의 세포사멸을 촉진시키는지를 확인하기 위하여 유세포 분석기를 이용하여 세포사멸을 조사하였다. Nucleolin 양성 세포주 Capan-1에 다기능 핵산 운반체 MFNC10를 처리(최종농도 20 μg/mL)하고 72 경과한 후에 annexin-V 및 프로피디움 요오드(propidium iodide)로 염색을 하여 세포사멸과 세포괴사를 유세포 분석기를 이용한 결과이고,
도 15는 다기능 핵산 운반체 Nucleolin 압타머를 갖고 있는 MFNC10에 의한 세포독성의 증가를 정량적으로 측정하기 위하여 다기능 핵산 운반체 MFNC10 처리한 후 암세포에서의 IC50 값을 측정한 결과이고,
도 16은 다기능 핵산 표준 운반체 Nucleolin 압타머를 갖고 있는 MFNC10 실시예 8.2에서 확인한 IC50 값의 감소가 나타내는 세포 선택적 독성의 증가가 실제로 세포 선택적 사멸로 연결되는지 검증하기 위하여 TUNEL 에세이를 수행한 결과이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 다기능 핵산 운반체(MFNC) 제조
1.1 다기능 핵산(MFN) DNA주형 제조
1.1.1. 다기능 핵산 표준 DNA 주형
본 실시례에서 다기능 핵산 표준 DNA 주형은 구조식 (1)의 (제1 염기서열-헤어핀 구조의 스페이서-제2 염기서열-헤어핀 구조의 스페이서-제3 염기서열) 기본모듈 단위가 1, 5 및 10회 반복하는 염기서열을 제작하였다.
상기 단위 제1 염기서열, 제2 염기서열 및 제3 염기서열에 대해 제1 올리고 접합체, 제2 올리고 접합체 및 제3 올리고 접합체의 올리고는 상보적 염기서열이며 이들의 염기서열은 표3에 제시하였다.
다기능 핵산 표준 DNA 주형의 구조식 (1)에 의거 기본모듈 단위를 구성하는 단위 염기서열 및 운반-올리고 접합체의 올리고 염기서열
구분 서열 서열번호
T7 promoter 5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG -3' 1
제1 염기서열 5'-GTT TTC CCA GTC ACG AC-3' 2
제2 염기서열 5'-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3' 3
제3 염기서열 5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3' 4
스페이서 5'-GTG CCA CGA TTC AAC GTG GCA C-3' 5
제1 올리고 접합체의 올리고 5'-GTC GTG ACT GGG AAA AC-3' 6
제2 올리고 접합체의 올리고 5'-GTC ATA GCT GTT TCA TG-3' 7
제3 올리고 접합체의 올리고 5'-ACT GGC CGT CGT TTT AC-3' 8
Nucleolin DNA 압타머 5'-GGT GGT GGT GGT TGT GGT GGT GGT GG-3' 9
PCR 역방향 프라이머 5'-GCT AGT TAT TGC TCA GCG G-3’ 10
본 발명의 기본모듈 단위가 1회인 ‘DNA 주형 1’, 상기 기본모듈 단위가 5회 반복하고 기본모듈 단위 사이에 헤어핀 구조의 스페이서가 있는 ‘DNA 주형 5’, 및 상기 기본모듈 단위가 10회 반복하고 기본모듈 단위 사이에 헤어핀 구조의 스페이서가 있는 ‘DNA 주형 10’을 제조하였다. 상기 DNA 주형 5의 염기서열은 아래와 같다.(585nt)
5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGG TTT TCC CAG TCA CGA CGT GCC ACG ATT CAA CGT GGC ACC AGG AAA CAG CTA TGA CGT GCC ACG ATT CAA CGT GGC ACG TAA AAC GAC GGC CAG TGT GCC ACG ATT CAA CGT GGC ACG TTT TCC CAG TCA CGA CGT GCC ACG ATT CAA CGT GGC ACC AGG AAA CAG CTA TGA CGT GCC ACG ATT CAA CGT GGC ACG TAA AAC GAC GGC CAG TGT GCC ACG ATT CAA CGT GGC ACG TTT TCC CAG TCA CGA CGT GCC ACG ATT CAA CGT GGC ACC AGG AAA CAG CTA TGA CGT GCC ACG ATT CAA CGT GGC ACG TAA AAC GAC GGC CAG TGT GCC ACG ATT CAA CGT GGC ACG TTT TCC CAG TCA CGA CGT GCC ACG ATT CAA CGT GGC ACC AGG AAA CAG CTA TGA CGT GCC ACG ATT CAA CGT GGC ACG TAA AAC GAC GGC CAG TGT GCC ACG ATT CAA CGT GGC ACG TTT TCC CAG TCA CGA CGT GCC ACG ATT CAA CGT GGC ACC AGG AAA CAG CTA TGA CGT GCC ACG ATT CAA CGT GGC ACG TAA AAC GAC GGC CAG TGT GCC ACG ATT CAA CGT GGC ACC CGC TGA GCA ATA ACT GGC -3'
본 실시례에서 다기능 핵산 표준 DNA 주형 5를 주문 제작하였다,
상기 DNA 주형 1은 상기 DNA 주형 5를 주형으로 상기 T7 프로모터 염기서열과 제3 올리고 접합체의 올리고를 프라이머로 PCR 하여 제조하였다.
상기 DNA 주형 10은 상기 DNA 주형 5를 주형으로 T7 프로모터 염기서열 정방향 프라이머와 PCR 역방향 프라이머-EcoRI 링커 역방향 프라이머, 그리고 EcoRI 링커-제1 염기서열 정방향 프라이머와 PCR 역방향 프라이머로 PCR 하여 얻은 두 PCR 산물을 EcoRI으로 절단하였다.
상기 제한효소로 절단된 이중가닥 PCR 산물을 T4 DNA 리가아제(ligase)와 5 mM ATP를 첨가한 후 16에서 12시간 동안 반응시켜서 연결하였고 상기 T7 프로모터 염기서열과 역방향 프라이머로 PCR 하여 다기능핵산 표준 DNA 주형 10을 제조하였다(도 2).
1.1.2. 압타머를 포함하는 다기능 핵산 DNA 주형
또 다른 실시예인 압타머를 포함하는 다기능 핵산 DNA 주형은 상기 다기능 핵산 표준 DNA 주형에서 단위 제2 염기서열이 제외된 (단위 제1 염기서열-단위 제3 염기서열) 기본모듈 단위가 1회 있는 구조이며, 단위 제1 염기서열은 HER2에 대한 2 ' -F-Pyrimidine modified RNA 압타머를 제조할 수 있는 염기서열이고, 단위 제3 염기서열을 제3 올리고 접합체의 올리고와 상보적 염기서열로 구성되었으며 이들의 염기서열은 표4에 제시하였다.
압타머를 포함하는 다기능 핵산 DNA 주형을 구성하는 기본모듈 단위에 대한 구성 성분의 염기서열
구분 서열 서열번호
T7 promoter 5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3' 1
제1 염기서열(ApHER2) 5'-AGC CGC GAG GGG AGG GAT AGG GTA GGG CGC GGC T-3' 10
제3 염기서열 5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3' 4
스페이서 5'-GTG CCA CGA TTC AAC GTG GCA C-3' 5
제3 올리고 접합체의 올리고 5'-ACT GGC CGT CGT TTT AC-3' 7
PCR 역방향 프라이머 5'- GCT AGT TAT TGC TCA GCG G -3' 10
본 압타머를 포함하는 다기능 핵산 DNA 주형은 기본모듈 단위가 5회 반복하고 헤어핀 스페이서로 그 염기서열은 아래와 같다(515 nt).5'- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GCC GCG AGG GGA GGG ATA GGG TAG GGC GCG GCT GTG CCA CGA UUC AAC GTG GCA CGT AAA ACG ACG GCC AGT GTG CCA CGA UUC AAC GTG GCA CAG CCG CGA GGG GAG GGA TAG GGT AGG GCG CGG CTG UGC CAC GAU UCA ACG UGG CAC GTA AAA CGA CGG CCA GTG UGC CAC GAU UCA ACG UGG CAC AGC CGC GAG GGG AGG GAT AGG GTA GGG CGC GGC TGT GCC ACG ATT CAA CGT GGC ACG TAA AAC GAC GGC CAG TGT GCC ACG ATT CAA CGT GGC ACA GCC GCG AGG GGA GGG ATA GGG TAG GGC GCG GCT GTG CCA CGA UUC AAC GTG GCA CGT AAA ACG ACG GCC AGT GTG CCA CGA UUC AAC GTG GCA AGC CGC GAG GGG AGG GAT AGG GTA GGG CGC GGC TGT GCC ACG ATT CAA CGT GGC ACG TAA AAC GAC GGC CAG TGT GCC ACG ATT CAA CGT GGC ACG CTA GTT ATT GCT CAG CGG -3’
압타머를 포함하는 다기능 핵산에 대한 DNA 주형 5를 주문 제작하였다,
상기 DNA 주형 1은 상기 DNA 주형 5를 주형으로 상기 T7 프로모터 염기서열과 제3 올리고 접합체의 올리고를 프라이머로 PCR 하여 제조하였다.
상기 DNA 주형 10은 상기 DNA 주형 5를 주형으로 T7 프로모터 염기서열 정방향 프라이머와 PCR 역방향 프라이머-EcoRI 링커 역방향 프라이머, 그리고 EcoRI 링커-제1 염기서열 정방향 프라이머와 PCR 역방향 프라이머로 PCR 하여 얻은 두 PCR 산물을 EcoRI으로 절단하였다.
상기 제한효소로 절단된 이중가닥 PCR 산물을 T4 DNA 리가아제(ligase)와 5 mM ATP를 첨가한 후 16에서 12시간 동안 반응시켜서 연결하였고 상기 T7 프로모터 염기서열과 역방향 프라이머로 PCR 하여 압타머를 포함하는 다기능핵산 DNA 주형 10을 제조하였다(도 3).
1.1.3. siRNA를 포함하는 다기능 핵산 DNA 주형
또 다른 실시례에서 siRNA를 포함하는 다기능 핵산에 대한 DNA 주형은 단위 제1 염기서열은 Nucleolin DNA 압타머-올리고 접합체의 올리고와 상보적 염기서열이고, 단위 제2 염기서열은 siRNA 염기서열로 구성되고, 단위 제3 염기서열은 입자화 소재-올리고 소재의 올리고와 상보적 염기서열로 구성하였으며 이들의 염기서열은 표5에 제시하였다.
siRNA를 포함하는 다기능 핵산 DNA 주형의 기본모듈 단위를 구성하는 DNA의 염기서열
구분 서열
T7 promoter 5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3'
제1 염기서열 5'-GTT TTC CCA GTC ACG AC-3'
제2 염기서열(siRNA)
(MDR1/BCL2 siRNA)		 5'-ATA TGC CTC TAA GAC AGT TGG TTT CTT TTC CAC CAG GGT TTC CGG GCA AGT AAG GAA AAG AAA CCA ACT GTC TTG TTG GTA CGT TAA TAC GAC AGC TTA TAA TGG ATG TAC ACC AGG GTT TCC GGG CAA GTA AGT ACA TCC ATT ATA AGC TGT CTT GTT GGT ACG T-3'
제3 염기서열 5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3'
스페이서 5'-GTG CCA CGA UUC AAC GTG GCA C-3'
제1 올리고 접합체의 올리고 5'-GTC GTG ACT GGG AAA AC-3'
제3 올리고 접합체의 올리고 5'-ACT GGC CGT CGT TTT AC-3'
PCR 역방향 프라이머 5'- GCT AGT TAT TGC TCA GCG G -3'
본 siRNA를 포함하는 다기능 핵산에 대한 DNA 주형 5는 기본모듈 단위가 5회 반복하고 헤어핀 스페이서로 그 염기서열은 아래와 같다(1,370nt). 5 '-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGG TTT TCC CAG TCA CGA CGT GCC ACG ATT CAA CGT GGC ACA TAT GCC TCT AAG ACA GTT GGT TTC TTT TCC ACCAGG GTT TCC GGG CAA GTA AGG AAA AGA AAC CAA CTG TCT TGT TGG TAC GTT AAT ACG ACA GCT TAT AAT GGA TGT ACA CCA GGG TTT CCG GGC AAG TAA GTA CAT CCA TTA TAA GCT GTC TTG TTG GTA CGT GTG CCA CGA UUC AAC GTG GCA CGT AAA ACG ACG GCC AGT GTG CCA CGA UUC AAC GTG GCA CGT TTT CCC AGT CAC GAC GTG CCA CGA UUC AAC GTG GCA CAT ATG CCT CTA AGA CAG TTG GTT TCT TTT CCA CCA GGG TTT CCG GGC AAG TAA GGA AAA GAA ACC AAC TGT CTT GTT GGT ACG TTA ATA CGA CAG CTT ATA ATG GAT GTA CAC CAG GGT TTC CGG GCA AGT AAG TAC ATC CAT TAT AAG CTG TCT TGT TGG TAC GTG TGC CAC GAU UCA ACG TGG CAC GTA AAA CGA CGG CCA GTG TGC CAC GAU UCA ACG TGG CAC GTT TTC CCA GTC ACG ACG TGC CAC GAU UCA ACG TGG CAC ATA TGC CTC TAA GAC AGT TGG TTT CTT TTC CAC CAG GGT TTC CGG GCA AGT AAG GAA AAG AAA CCA ACT GTC TTG TTG GTA CGT TAA TAC GAC AGC TTA TAA TGG ATG TAC ACC AGG GTT TCC GGG CAA GTA AGT ACA TCC ATT ATA AGC TGT CTT GTT GGT ACG TGT GCC ACG AUU CAA CGT GGC ACG TAA AAC GAC GGC CAG TGT GCC ACG AUU CAA CGT GGC ACG TTT TCC CAG TCA CGA CGT GCC ACG AUU CAA CGT GGC ACA TAT GCC TCT AAG ACA GTT GGT TTC TTT TCC ACC AGG GTT TCC GGG CAA GTA AGG AAA AGA AAC CAA CTG TCT TGT TGG TAC GTT AAT ACG ACA GCT TAT AAT GGA TGT ACA CCA GGG TTT CCG GGC AAG TAA GTA CAT CCA TTA TAA GCT GTC TTG TTG GTA CGT GTG CCA CGA UUC AAC GTG GCA CGT AAA ACG ACG GCC AGT GTG CCA CGA UUC AAC GTG GCA CGT TTT CCC AGT CAC GAC GTG CCA CGA UUC AAC GTG GCA CAT ATG CCT CTA AGA CAG TTG GTT TCT TTT CCA CCA GGG TTT CCG GGC AAG TAA GGA AAA GAA AC CAA CTG TCT TGT TGG TAC GTT AAT ACG ACA GCT TAT AAT GGA TGT ACA CCA GGG TTT CCG GGC AAG TAA GTA CAT CCA TTA TAA GCT GTC TTG TTG GTA CGT GTG CCA CGA UUC AAC GTG GCA CGT AAA ACG ACG GCC AGT GTG CCA CGA UUC AAC GTG GCA CGC TAG TTA TTG CTC AGC GG-3’
상기 siRNA를 포함하는 다기능 핵산 3에 대한 DNA 주형 5를 주문 제작하였다,
상기 DNA 주형 1은 상기 DNA 주형 5를 주형으로 상기 T7 프로모터 염기서열과 제3 올리고 접합체의 올리고를 프라이머로 PCR 하여 제조하였다.
상기 DNA 주형 10은 상기 DNA 주형 5를 주형으로 T7 프로모터 염기서열 정방향 프라이머와 PCR 역방향 프라이머-EcoRI 링커 역방향 프라이머, 그리고 EcoRI 링커-제1 염기서열 정방향 프라이머와 PCR 역방향 프라이머로 PCR 하여 얻은 두 PCR 산물을 EcoRI으로 절단하였다.
상기 제한효소로 절단된 이중가닥 PCR 산물을 T4 DNA 리가아제(ligase)와 5 mM ATP를 첨가한 후 16에서 12시간 동안 반응시켜서 연결상기 제한효소로 절단된 이중가닥 기본모듈 단위를 정해진 순서로 T4 DNA 리가아제(ligase)와 5 mM ATP를 첨가한 후 16에서 12시간 동안 반응시켜서 연결하였고 상기 T7 프로모터 염기서열과 역방향 프라이머로 PCR 하여 siRNA를 포함하는 다기능핵산 DNA 주형 10을 제조하였다(도 4).
1.2 다기능 핵산(MFN) 제조
실시예 1.1에서 제조한 DNA 주형에 T7 RNA 폴리머라제 (5 U/μL), 반응버퍼 (4 mM Tris-HCl, 0.6 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0.2 mM spermidine), ① 천연 뉴클레오타이드인 rNTP (2 mM, ribonucleotide solution mix, NEB), ② 천연 뉴클레오타이드인 ATP와 GTP 그리고 변형 뉴클레오타이드인 2’-deoxy-2’-fluorocytidine 5’-triphosphate(2'-fluoro-dCTP, (2'-F-dCTP)와 2’-deoxy-2’-fluorouridine 5’-triphosphate(2'-fluoro-dUTP, 2'-F-dUTP) 또는 ③ 천연 뉴클레오타이드인 ATP와 GTP, 뉴클레오타이드 유사체인 젬시타민, 변형 뉴클레오타이드인 2'-F-dUTP), 및 RNase inhibitor (1 U/μL)를 첨가한 후 37℃에서 1시간 동안 체외 전사(in vitro transcription, IVT) 반응을 수행하였다.
IVT 반응을 정지시키기 위하여 DNase 1 (2 U/μL)을 15분간 15℃ 에서 반응시키고 난 후, 0.2 M EDTA를 첨가한 후 90℃ 에서 5분간 열처리하였다. 상기 반응이 종결된 IVT 산물을 전기영동하여 다기능 핵산(MFN)을 확인하였다(도 5).
상기 젬시타빈(2'-데옥시-2',2'-디플루오로시티딘)은 합성 피리미딘 뉴클레오사이드 프로드럭으로 데옥시시티딘(deoxycytidine)의 2' 탄소 상에 있는 수소 원자가 불소(fluorine) 원자로 치환된 뉴클레오시드 유도체이다.
상기 단위 제1, 제2 및 제3 염기서열과 스페이서로 구성된 다기능 핵산(MFNn)에서 기본모듈 단위의 반복횟수(n)이 1, 5, 10와 15인 경우를 제작하여 이들을 각각 MFN1, MFN5, MFN10와 MFN15라고 명명하였다.
압타머 염기서열인 단위 제1 염기서열과 상기 단위 제2 및 제3 염기서열과 스페이서로 이루어진 다기능 핵산(AMFNn)에서 기본모듈 단위의 반복횟수(n)이 1, 5, 10와 15인 경우를 제작하여 이들을 각각 AMFN1, AMFN5, AMFN10와 AMFN15라고 명명하였다.
두 종류의 siRNA 염기서열인 단위 제2 염기서열과 상기 단위 제1 및 제3 염기서열과 스페이서로 이루어진 다기능 핵산(SMFNn)에서 기본모듈 단위의 반복횟수(n)이 1, 5, 10와 15인 경우를 제작하여 이들을 각각 SMFN1, SMFN5, SMFN10와 SMFN15라고 명명하였다.
압타머 염기서열인 단위 제1 염기서열, 두 종류의 siRNA 염기서열인 단위 제2 염기서열, 상기 단위 제3 염기서열과 스페이서로 이루어진 다기능 핵산(ASMFNn)에서 기본모듈 단위의 반복횟수(n)이 1, 5, 10와 15인 경우를 제작하여 이들을 각각 ASMFN1, ASMFN5, ASMFN10와 ASMFN15라고 명명하였다.
1.3. 운반-올리고 접합체 제조
1.3.1. 운반-올리고 접합체의 제조
본 실시례에서 운반-올리고 접합체는 표적지향 리간드, 활성물질, 영상 소재와 입자화 소재 등을 다기능 핵산으로 운반할 목적으로 올리고에 접합한 구조체로 리간드-올리고 접합체, 활성물질-올리고 접합체 및 입자화 소재-올리고 접합체 등을 포함하여 다양한 구조체가 있으며 다음과 같이 제조하였다.
제1 올리고 접합체는 염기서열번호 6의 일 말단에 Nucleolin DNA 압타머 염기서열번호 9과 다른 말단에 콜레스테롤이 연결된 올리고이고, 제2 올리고 접합체는 염기서열번호 7의 일 말단에 Cy3 fluorescence과 다른 말단에 콜레스테롤이 연결된 올리고이고, 제3 올리고 접합체는 염기서열번호 8의 일 말단에 콜레스테롤이 연결된 올리고이며 이들은 바이오니아에서 유기합성하여 제조하였다.
제2 올리고 접합체의 올리고를 이용한 항암물질인 DM1-올리고 접합체와 제2 올리고 뉴클레오타이드의 올리고를 이용한 형광물질 Cy3-올리고 접합체(미국, Biosynthesis 사) 그리고 제3 올리고 뉴클레오타이드의 올리고콜레스테롤-올리고 접합체(한국, 바이오니아)는 주문 제작하였다.
표 6에 제시한 표적지향 리간드와 단위 제1 염기서열에 대한 상보적 염기서열 올리고가 연결된 리간드-올리고 접합체는 Nucleolin DNA 압타머-올리고 접합체(한국, 바이오니아 사) 그리고 RGD10-R10-올리고 접합체와 폴레이트-올리고 접합체(미국, Biosynthesis 사)를 주문 제작하였다.
리간드-올리고 접합체에 사용한 표적지향 리간드
리간드 명칭 리간드 내용 비고
Nucleolin DNA 압타머 5'-GGT GGT GGT GGT TGT GGT GGT GGT GG-3'
RGD10-R10: DGARYCRGDCFDGRRRRRRRRRR
폴레이트(Folate) C19H19N7O6
1.3.2. 리간드-올리고-입자화 소재 접합체의 제조제1 올리고 접합체로 폴레이트 리간드, 제1 올리고 접합체의 올리고와 입자화 소재로 콜레스테롤(Chol)로 제조된 ‘폴레이트-올리고-Chol 접합체’롤 제조하였다. 사용되는 리간든 폴레이트에 한정된 것이 아니다.
먼저, 10 mM 5'-amine-modified oligo-콜레스테롤(Bioneer, Korea로부터 구입)를 conjugation 버퍼 (100 mM MES, 500 mM NaCl, pH 6.0)에 녹인 후 Sulfo-NHS (10 mM) 및 EDC (4 mM) 용액과 섞었다. 혼합물에 몰 비 10배 과량의 폴레이트를 첨가한 후 22℃로 3시간 동안 반응시켜서 DNA-콜레스테롤의 5'-아민그룹에 폴레이트의 카복시기가 결합된 폴레이트-DNA-콜레스테롤 접합체를 제조하였다.
반응이 끝나고 반응하지 않고 남아있는 EDC를 비활성화시키기 위하여 머캅토에탄올(mercaptoethanol)을 첨가한 후, 폴레이트-DNA-콜레스테롤 접합체만을 amicon ultracentrifugal filter (3K MWCO, Millipore)를 사용하여 정제하였다.
1.4. 다기능 핵산 운반체(MFNC) 제조
혼성화 버퍼 (30 mM Tris-HCl (pH 7.8), 10mM MgCl2, 10mM DTT)에서 상기 MFN1, MFN5, MFN10와 MFN15로 이루어진 군, 상기 AMFN1, AMFN5, AMFN10와 AMFN15로 이루어진 군, 상기 SMFN1, SMFN5, SMFN10와 SMFN15로 이루어진 군, 및 상기 ASMFN1, ASMFN5, ASMFN10와 ASMFN15로 이루어진 군을 포함하는 다기능 핵산에서 선택되어진 어느 하나 이상을 ① 천연 뉴클레오타이드, ② 천연 뉴클레오타이드와 변형 뉴클레오타이드, 및 ③ 천연 뉴클레오타이드, 변형 뉴클레오타이드 및 뉴클레로사이드 유사체를 사용하여 제조한 다기능 핵산 및 실시예 1.3에서 제조된 운반-올리고 접합체를 무게비율 1:0.2로 섞은 후, 65℃에서 5분간 denature시키고 4℃로 2시간 동안 냉각하면서 다기능 핵산 운반체(MFNC)를 제조하였다(도 6).
실시예 2. 다기능 핵산(MFN)의 안정성
실시례 1.2.항에서 제조된 다양한 다기능 핵산(MFN)의 혈액 내 안정성을 조사하기 위하여 30% FBS 조건하에서 시간 별로 FBS 내 nuclease에 의해 다기능 핵산이 분해된 분해산물을 3% 아가로스 겔 전기 영동하여 분석하였다(도 7).
천연 뉴클레오타이드로만 제조한 다기능 핵산의 경우는 단일 반복 다기능 핵산은 1시간 이내에 분해되었으며 그 반복횟수가 증가할수록 안정성이 있었으며 15회 경우 3일간 유지되었다. 천연 뉴클레오타이드와 변형 뉴클레오타이드, 그리고 천연 뉴클레오타이드, 변형 뉴클레오타이드 및 뉴클레로사이드 유사체로 제조된 다기능 핵산은 7일 정도 안정성을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 다기능 핵산 운반체(MFNC) 형성 확인
실시례 1.4 항 에서 제조한 다기능 핵산 운반체의 기본모듈 단위의 반복횟수에 따라 명명한 MFNC1, MFNC5, MFNC10와 MFNC15를 3% 아가로스 겔 전기 영동하였다(도 8).
다기능 핵산 운반체 MFNC1은 젤에서 일정한 거리에 특정 크기의 밴드 패턴이 관찰되어 상기 다기능 핵산은 입자를 형성하지 못 하여 웰에서 내려온 것이며, 다른 다기능 핵산 운반체(MFNC5, MFNC10와 MFNC15)는 입자가 형성되어 웰에서 내려오지 않았으며, 이로써 MFNC10에서 최적으로 자가조립에 의한 입자가 형성되었음을 확인하였다.
또한, 기본모듈 단위인 다기능 핵산 운반체 MFNC1와 양이온 단백질 프로타민과 혼합하여 자가조립으로 형성된 혼합물을 3% 아가로스 겔 전기 영동하였다. 자가 조립이 될 경우 분자량이 큰 입자가 되므로 젤 전기영동에서 웰에 갇히게 되어 아래로 이동하지 못한다는 점을 고려할 때, MFNC1에서 웰에 갇힌 것이 관찰되어 자가조립에 의한 입자가 형성되었음을 확인하였다.
실시예 4. 물리적 특성 평가
4.1. 입자 모양 및 크기
상기 3.1의 항 최적의 다기능 핵산 운반체 MFNC10의 입자의 모양 및 크기는 동적 광 산란기(dynamic light scatter), 원자간력 현미경(Atomic force microscopy, AFM) 및 투과 전자 현미경(Transmission electron microscopy)을 이용하여 측정하였다(도 9).
다기능 핵산은 1 μm 이상의 마이크로 입자를 형성하였으나 그 결과 MFNC10에서 입자 각각의 직경이 각각 107.3, 109 및 98.6nm인 것으로 측정되어 약 100nm의 직경을 갖는 나노 사이즈임을 확인하였다.
상기 결과로 마이크로미터 사이즈의 다기능 핵산과 운반-올리고 접합체의 혼성화를 통하여 나노미터 사이즈의 입자를 형성함을 알 수 있었다.
4.2. 입자 표면전하
또한, 상기 동적 광 산란기를 이용하여 표면전하를 측정한 결과 , 다기능 핵산의 전하는 약 -22 mV인 반면 다기능 핵산 운반체 MFNC10은 약 -13 mV인 것을 확인하였다.
상기 다기능 핵산 운반체를 동적 광 산란기를 이용하여 표면전하(제타 포텐셜)를 측정한 결과, 다기능 핵산의 전하는 약 -22 mV인 반면 다기능 핵산 운반체는 약 -13 mV인 것을 확인하였다. 이는 용액 내에 남아있는 마그네슘 이온들이 훨씬 밀도가 높게 응축되어있는 다기능 핵산 운반체에 더 많이 결합하여 강한 음이온을 상쇄시키기 것에서 기인한 것으로 보인다.
실시예 5. 혈액 내 안정성 평가
상기 MFN1, MFN5, MFN10와 MFN15로 이루어진 군, 상기 AMFN1, AMFN5, AMFN10와 AMFN15로 이루어진 군, 상기 SMFN1, SMFN5, SMFN10와 SMFN15로 이루어진 군, 및 상기 ASMFN1, ASMFN5, ASMFN10와 ASMFN15로 이루어진 군을 포함하는 다기능 핵산에서 선택되어진 어느 하나 이상을 ① 천연 뉴클레오타이드, ② 천연 뉴클레오타이드와 변형 뉴클레오타이드, 그리고 ③ 천연 뉴클레오타이드, 변형 뉴클레오타이드 및 뉴클레로사이드 유사체를 사용하여 제조한 다기능 핵산과 운반-올리고 접합체를 혼성화하여 다기능핵산 운반체를 제조하였다.
뉴클레오타이드에 따른 다양한 운반 소재들을 동시 전달용 상기 다기능 핵산 운반체의 혈액 내 안정성을 조사하기 위하여 30% FBS 조건하에서 시간 별로 FBS 내 nuclease에 의해 다기능 핵산, 다기능 핵산 운반체 등이 분해된 분해산물을 3% 아가로스 겔 전기 영동하여 분석하였다(도 10).
먼저 대조군으로 천연 뉴클레오타이드로만 구성된 다기능 핵산은 30분 내에서 완전히 분해되었고, 천연 뉴클레오타이드와 변형된 뉴클레오타이드로 구성된 다기능 핵산, 그리고 천연 뉴클레오타이드, 변현 뉴클레오타이드와 뉴클레오사이드 유사체로 구성된 다기능 핵산은 half-life 가 24~36시간 정도 이었다.
상기 후자 두 종류의 다기능 핵산 입자는 6시간 경과 후에도 약 60%가 온전한 상태로 관찰됨으로써 매우 우수한 핵산분해효소 안정성을 보여주었다. 이는 입자화 소재는 외부에 존재하고 핵산은 입자 내부에 위치하여, 내부의 핵산이 분해 효소의 공격으로부터 물리적으로 차단됨을 나타내며, 특히 외부에 노출되어 있는 입자화 소재가 핵산 공격의 접근을 상당 부분 막아주기 때문으로 설명할 수 있었다.
실시예 6. siRNA를 포함하는 다기능 핵산 운반체에 의한 siRNA 효과
*6.1. Dicer 효소에 의한 siRNA 생성 효과
DICER 효소에 의해 siRNA를 포함하는 다기능 핵산 운반체에서 siRNA이 생성되는지 여부를 확인하기 위해, in vitro에서 Dicer 1.5unit을 처리하여 siRNA가 생성되는 것을 조사하였다(도 11).
대조군으로는 표 7의 siRNA dublex를 사용하였다. 5 μg siRNA릎 포함하는 다기능핵산 운반체 입자가 반응 24시간 후에 1.69 μg siRNA를 생성한 것을 확인하였다. 이러한 결과는 다기능 핵산 운반체가 이론적으로 생성할 수 있는 siRNA 양의 약 90.6%를 생성했음을 나타낸다.
MDR1 및 BCL2 유전자의 siRNA
종류 염기서열 서열번호
anti-MDR1 siRNA duplex 5’-GGAAAAGAAACCAACUGTC-3’
3’-CCUUUUCUUUGGTUGACAG-5’ 		12
anti-BCL2 siRNA duplex 5’-GTACAUCCATTAUAAGCUGTC-3’
3’-CAUGTAGGTAAUATTCGACAG-5’ 		13
6.2 qRT-PCR에 의한 mRNA 변화량 평가
KB-V1 암세포에 siRNA를 포함하는 다기능 핵산 운반체 (젬시타빈, MDR1 siRNA 및 BCL2 siRNA)를 처리(최종 농도 20 ng/mL)한 경우, 단독으로 젬시타빈(Gemcitabine)(최종 농도 30 ng/mL)을 처리한 경우, 표 7에 있는 MDR1 및 BCL2 siRNA를 Lipofectamine 2000(Invitrogen, 미국)으로 transfection한 경우에 24시간, 48시간 및 72시간 후에 qRT-PCR를 실시하여 MDR1 및 BCL2 mRNA의 변화량을 측정하였다.
MDR1 mRNA에 매칭될 수 있는 프라이머 (정방향 프라이머 5'-GAAATTTAGAAGATCTGATGTCAAACA-3' (서열번호 14)와 역방향 프라이머 5'- ACTGTAATAATAGGCATACCTGGTCA-3' (서열번호 15), BCL2 mRNA에 매칭될 수 있는 프라이머(정방향 프라이머 5'-AGTACCTGAACCGGCACCT-3' (서열번호 16)와 역방향 프라이머 5'- GCCGTACAGTTCCACAAAGG-3' (서열번호 17), 및 대조군 실험을 위한 β-actin과 매칭되는 프라이머 (정방향 프라이머 5'-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3' (서열번호 18)와 역방향 프라이머 5'-CAATAGTGATGACCTGGCCGT-3' (서열번호 19)를 이용하여 세포 내의 MDR1 및 BCL2 유전자의 mRNA의 양을 정량하기 위한 qRT-PCR을 수행하였다(변성 단계 95℃/30초, 어닐링 단계 51℃/30초, 신장 단계 72℃/30초, 20 사이클).
젬시타빈만을 처리한 경우 24시간 후에 MDR1 및 BCL2 모두의 mRNA이 56% 및 24%만큼 증가하였으나, 표 7의 MDR1 및 BCL2 siRNA를 처리한 경우 24시간 후에 qRT-PCR을 실시하면, MDR1 및 BCL2 mRNA의 증가가 관찰되지 않고 오히려 9% 및 28%씩 감소함을 알 수 있었다. 하지만 KB-V1 암 세포에 siRNA를 포함하는 다기능 핵산 운반체 (최종 농도 20 ng/mL) 처리하고 24시간 후에 qRT-PCR을 실시하면 MDR1 및 BCL2 mRNA이 각각 10%, 40%씩 감소하였다(도 12).
다시 말해, siRNA를 포함하는 다기능 핵산 운반체를 처리하고 24시간이 지난 후에 활성물질저항성과 관련된 MDR1 및 BCL2 유전자의 발현을 더 효과적으로 억제함을 알 수 있다. 또한, MDR1과 BCL2 두 가지 유전자 사일런싱하는 siRNA를 포함하는 다기능 핵산 운반체는 두 유전자 모두를 효과적으로 사일런싱함을 알 수 있었다.
실시예 7. 암세포 표적성 실험
표8에 있는 표적지향 리간드의 암세포 표적성을 실험을 위해 상응하는 리셉터에 대한 양세포주와 음세포주를 배양하여 평가하였다.
일 말단에 표적지향 리간드로 폴레이트, 다른 말단에 콜레스테롤이 결합한 제1 올리고 접합체, 일 말단에 Cy3, 다른 말단에 콜레스테롤이 결합한 제2 올리고 접합체와 일 말단에 콜레스테롤이 결합한 제3 올리고 접합체를 다기능 핵산 표준 DNA 주형으로 천연 뉴클레오타이드, 변형 뉴클레오타이드와 뉴클레오사이드 유사체를 구성성분으로 체외전사된 MFN10과 혼성화하여 MFNC10을 제조하였다.
폴레이트 수용체 선택적인 표적성을 조사하기 위하여 폴레이트 수용체-양성(receptor-positive) KB-V1 종양세포 및 폴레이트 수용체-음성(receptor-negative) HepG2 carcinoma cell에 형광 표지된 다기능 핵산 운반체 폴레이트를 갖고 있는 MFNC10를 처리하고 3시간 후에 형광현미경과 유세포 분석기(flow cytometry)로 분석하였으며, 대조군으로 폴레이트가 결합되지 않은 Cy3 형광표지된 다기능 핵산 운반체 또는 폴레이트로 미리 세포를 처리하여 폴레이트 수용체를 포화시킨 후 Cy3 형광표지된 다기능 핵산 운반체 입자를 사용하여 형광현미경 및 유세포 분석기를 사용하여 분석하였다(도 13).
KB-V1 세포에서는 다량의 다기능 핵산 운반체가 세포투과 되었으나 HepG2 세포에서는 세포투과 되지 않았다. 유세포 분석에서 처리한지 3시간후에 KB-V1 세포에서는 약 96% 다기능 핵산 운반체가 세포투과 되었으나 HepG2 세포에서는 전혀 세포투과가 관찰되지 않았다.
또한 폴레이트를 미리 처리하여 폴레이트 수용체를 포화시켰을 경우 KB-V1 세포에서 단지 약 30% 다기능 핵산 운반체만이 세포투과 되었다. 폴레이트가 없는 다기능 핵산 운반체의 경우 KB-V1 세포와 HepG2 세포 모두에서 세포투과를 관찰할 수 없었다.
KB-V1 세포에는 폴레이트 수용체가 과발현되어 있으나 대조군으로 사용된 HepG2 세포에서는 폴레이트 수용체의 발현량이 매우 낮았다. 상기 결과를 통해, 다기능 핵산 운반체가 폴레이트 선택적으로 세포에 결합되어 투과됨을 확인하였다.
실시예 8. 세포사멸 평가
8.1. 세포 사멸 유도 측정
일 말단에 표적지향 리간드로 Nucleolin 압타머, 다른 말단에 콜레스테롤이 결합한 제1 올리고 접합체, 일 말단에 Cy3, 다른 말단에 콜레스테롤이 결합한 제2 올리고 접합체와 일 말단에 콜레스테롤이 결합한 제3 올리고 접합체를 다기능 핵산 표준 DNA 주형으로 천연 뉴클레오타이드, 변형 뉴클레오타이드와 뉴클레오사이드 유사체를 구성성분으로 체외전사된 MFN10과 혼성화하여 MFNC10을 제조하였다.
다기능 핵산 표준 운반체 Nucleolin 압타머를 갖고 있는 MFNC10가 암 세포의 세포사멸을 촉진시키는지를 확인하기 위하여 유세포 분석기를 이용하여 세포사멸을 조사하였다. Nucleolin 양성 세포주 Capan-1에 다기능 핵산 운반체 MFNC10를 처리(최종농도 20 ng/mL)하고 72 경과한 후에 annexin-V 및 프로피디움 요오드(propidium iodide)로 염색을 하여 세포사멸과 세포괴사를 유세포 분석기를 이용하여 조사하였다(도 14).
대조군으로 젬시타빈만을 처리한 KB-V1 세포에서 세포사멸은 14.9%, 세포괴사는 2.9%에 머물렀으나, 다기능 핵산 운반체를 처리하면 세포사멸은 36.7%, 세포괴사는 6.5%로 급격히 증가함을 알 수 있었다.
8.2. 세포독성 정량적 측정
실시례 8.1에서 사용한 다기능 핵산 운반체 Nucleolin 압타머를 갖고 있는 MFNC10에 의한 세포독성의 증가를 정량적으로 측정하기 위하여 다기능 핵산 운반체 MFNC10 처리한 후 암세포에서의 IC50 값을 측정하였다. 대조군으로는 젬시타빈만을 처리한 것을 사용하였다(도 15).
Capan-1 암세포에 젬시타빈을 농도 별로 처리하여 MTT 에세이를 수행했을 때의 IC50 값은 약 78.49 ng/mL이었다. 하지만, Capan-1 암세포에 다기능 핵산 운반체를 처리(최종 농도 20 ng/mL) 24시간 경과 후에 MTT 에세이를 수행하면 IC50 값은 11.7 ng/mL으로 측정되었으며 약 1/7의 IC50 값의 감소하였다.
이는 다기능 핵산 운반체 Nucleolin 압타머를 갖고 있는 MFNC10가 젬시타빈 단독 만보다 세포독성이 7배 정도 증가했다는 것을 나타내며 암세포의 항암약제 반응성이 7배 증가했음을 보여준다. 그러나 Capan-1 암세포에 다기능 핵산 운반체 (최종농도 20 ng/mL)을 처리하고 48시간 후에 MTT 에세이를 수행한 경우에는 IC50 값은 44.93 ng/mL으로 측정되었으며,
8.3. TUNEL 에세이
실시예 8.2에서 확인한 IC50 값의 감소가 나타내는 세포 선택적 독성의 증가가 실제로 세포 선택적 사멸로 연결되는지 검증하기 위하여 TUNEL 에세이를 수행하였다(도 16)
다기능 핵산 운반체 Nucleolin 압타머를 갖고 있는 MFNC10에서는 세포 선택적 사멸을 관찰할 수 있었고 젬시타빈만을 처리한 모든 암세포에서는 세포사멸의 증가를 관찰할 수 있었다,
다기능 핵산 운반체 Nucleolin 압타머를 갖고 있는 MFNC10 투여 방법으로 처리한 결과에서만 세포 선택적 사멸이 가장 활발히 일어나, 세포 선택적 독성 증가가 세포 선택적 사멸의 유도까지 연결되었음을 확인하였다.

Claims (38)

  1. 목적하는 운반소재를 포함한 올리고(운반-올리고 접합체); 및
    상기 올리고에 대한 상보적 단위 염기서열들로 구성된 기본모듈 단위가 1회 이상 반복하는 다기능 핵산으로 구성되며,
    상기 다기능 핵산 및 상기 올리고는 변형 뉴클레오타이드(nucleotide) 및 뉴클레오사이드(nucleoside) 유사체로 이루어진 군에서 선택되어진 1종 이상과 천연 뉴클레오타이드를 구성성분으로 제조하여 핵산분해효소에 대한 저항성과 약학적 효능을 동시에 갖는 것을 특징으로 하는 다기능 핵산 운반체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 운반소재는
    표적지향 리간드, 활성물질, 영상 소재, 나노입자, 핵산나노구조체 및 입자화 소재로 이루어진 군에서 선택되어진 1종 이상을 특징으로 하는 다기능 핵산 운반체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 운반-올리고 접합체는
    목적으로 하는 상기 운반소재 군에서 선택되어진 1종 이상과 상기 올리고가 링커를 사용하여 공유 결합 또는 비공유 결합하는 것을 특징으로 하는 다기능 핵산 운반체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 다기능 핵산은,
    상기 기본모듈 단위 사이, 및 상기 기본모듈 단위를 구성하는 단위 염기서열들 사이에 스페이서(spacer)가 있는 것을 특징으로 하는 다기능 핵산.
  5. 제4항에 있어서, 상기 스페이서는
    상보적인 염기서열이 반대 방향으로 있는 2개의 염기서열이 서로 상보적 결합을 한 염기쌍으로 형성되는 이중나선 염기서열 및 상기 2개의 염기서열을 연결하는 루프 염기서열로 이루어진 머리핀(hairpin) 구조로 이루어진 단일가닥핵산을 특징으로 하는 다기능 핵산.
  6. 제1항 내지 제5에 있어서, 상기 다기능 핵산은
    일 말단 또는 양쪽 말단에 선택되어진 상기 운반소재를 부착하는 것을 특징으로 하는 다기능 핵산 운반체.
  7. 제1항 내지 제6항에 있어서,
    상기 운반소재 군에 선택되어진 1종 이상을 포함하는 올리고 접합체(제1 올리고 접합체)가 상보적 결합이 가능한 단위 제1 염기서열;
    상기 운반소재 군에 선택되어진 1종 이상을 포함하는 올리고 접합체(제2 올리고 접합체)가 결합이 가능한 단위 제2 염기서열; 및
    상기 운반소재 군에 선택되어진 1종 이상을 포함하는 올리고 접합체(제3 올리고 접합체)가 결합 가능한 단위 제3 염기서열;
    로 이루어진 군에서 선택되어진 2종 이상으로 구성된 기본모듈 단위이며,
    상기 기본모듈 단위가 1회 이상 반복적으로 존재하는 것을 특징으로 하는 다기능 핵산.
  8. 제1항 내지 제7에 있어서,
    상기 표적지향 리간드인 압타머를 내포하는 단위 제1 염기서열 및 활성물질인 RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 기능이 있는 올리고를 내포하는 단위 제2 염기서열로 이루어진 군에서 선택되어진 1종 이상을 자체 염기서열에 포함된 상기 기본모듈 단위 및 상기 기본모듈 단위가 1회 이상 반복적으로 존재하는 것을 특징으로 하는 다기능 핵산.
  9. 제1항 내지 제8항에 있어서,
    상기 변형 뉴클레오타이드 또는 상기 뉴클레오사이드 유사체를 구성성분으로 하는 상기 다기능 핵산의 단위 염기서열 및 상기 운반-올리고 접합체의 올리고로 이루진 군에서 선택되어진 1종 이상에 포함된 것을 특징으로 하는 다기능 핵산.
  10. 제1항 내지 제9항에 있어서,
    DNA 및 RNA로 이루어진 군에서 선택되어진 어느 1종 이상인 것을 특징으로 하는 운반-올리고 접합체 또는 다기능 핵산.
  11. 제1항 내지 제10항에 있어서, 상기 천연 뉴클레오타이드는
    A, G, T 또는 C 디옥시리보뉴클레오타이드들와 A, G, U 또는 C 리보뉴클레오타이드를 특징으로 하는 다기능 핵산 운반체.
  12. 제1항 내지 제10항에 있어서, 상기 변형 뉴클레오타이드는
    천연 뉴클레오타이드들에 관한 변형체로 뉴클레오타이드의 구성성분인, 당, 핵염기, 또는 뉴클레오사이드간 연결에 대한(예를 들면, 연결 포스페이트에 대한/포스포디에스테르 연결에 대한/포스포디에스테르 골격에 대한) 임의의 유용한 변형을 특징으로 하는 다기능 핵산 운반체.
  13. 제1항 내지 제10항에 있어서, 상기 뉴클레오사이드 유사체는
    구성성분인 당 및 염기 부분에 독립적으로 또는 함께 개질된 비천연 분자 또는 합성 화합물을 특징으로 하는 다기능 핵산 운반체.
  14. 제2항에 있어서, 상기 표적지향 리간드는
    단백질, 항체, 압타머, Spiegelmers, 펩타이드, 또는 엽산(Folate), N-아세틸 갈락토사민(N-acetyl Galactosamine, NAG) 등의 헥소아민(hexoamine), 포도당(glucose), 만노스(mannose)를 비롯한 당 및 탄수화물(carbohydrate) 등의 화학물질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 분자를 포함함으로써 특정 세포 표적 기능을 가지는 것을 특징으로 하는 다기능 핵산 운반체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 표적지향 리간드는,
    표적분자를 분석하고자하는 세포를 포함하는 조직의 절편에 압타머를 접촉시켜 표적-압타머 복합체를 형성하는 단계; 및
    상기 형성된 표적-압타머 복합체의 압타머를 분석하는 단계;
    를 포함하는 방법으로 선정하는 것을 특징으로 하는 다기능 핵산 운반체
  16. 제15항에 있어서, 상기 형성된 표적-압타머 복합체의 압타머 분석은,
    상기 표적-압타머 복합체의 압타머에 포함된 물질을 분석하는 방법; 및
    상기 표적-압타머 복합체에서 분리된 압타머를 정량하는 방법;
    을 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상의 방법으로 실시하는 것을 특징으로 하는 다기능 핵산 운반체.
  17. 제16에 있어서, 상기 표적-압타머 복합체의 압타머에 포함된 물질은,
    염료(dye), 양자점(quantum dot), 방사성 표지(radiolabel), 전기화학적 작용기(electrochemical functional group) 및 효소(enzyme)와 검출가능한 효소 기질(detectable enzyme substrate)로 이루어진 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 특징으로 하는 다기능 핵산 운반체.
  18. 제16항에 있어서, 상기 압타머 정량은
    Q-PCR, 질량 분석기(mass spectroscopy), 차세대 시퀀싱(next-generation sequencing) 및 혼성화(hybridizatioin)로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 사용하여 검출되고 선택적으로 정량되는 것을 특징으로 하는 다기능 핵산 운반체.
  19. 제2항에 있어서, 상기 활성물질은
    치료요법적 물질 또는 진단 물질인 것을 특징으로 하는 다기능 핵산 복합체.
  20. 제2항에 있어서, 상기 영상소재는
    방사성 동위원소, 형광 물질, 적외선 물질, 양자점, 이온 옥사이드 비드(ion oxide bead), PET 프로브 (예를 들어 갈륨), 산화철 (예를 들어 Fe3O4)을 포함하는 T1 MR 프로브 및 T2 MR 프로브 (예를 들어 MnFe2O4 또는 GdFe2O4 나노파티클)로 이루어진 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 특징으로 하는 다기능 핵산 운반체.
  21. 제2항에 있어서, 상기 입자화 소재는
    소수성 물질, 양친매성 물질 및 친수성 물질로 이루어진 군에서 선택되어진 어느 1종을 특징으로 하는 다기능 핵산 운반체.
  22. 제21항에 있어서, 상기 소수성 물질은
    소수성 탄화수소, 소수성 고분자, 소수성 펩타이드 및 실란으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 다기능 핵산 운반체.
  23. 제22항에 있어서, 상기 소수성 고분자는
    폴리락트산 (PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트코글리콜산(PLGA), 폴리카프로락톤 (PCL), 디카르복실산계 지방족 폴리에스테르(PBsA), 폴리 에테르아미드 및 폴리 에스테르우레탄으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 다기능 핵산 운반체.
  24. 제21항에 있어서, 상기 양친매성 물질은
    포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜콜린, 포스파타이드산, 글리세릴 모노스테아레이트, 글리세릴 모노올레에이트, 글리세틸 팔미토스테아레이트, 트리글리세라이드 및 폴리히드록실화 트리글리세라이드, 지방산 및 중쇄 지방산(C6내지 C12)의 에스테르, 폴리에틸렌글리콜, 폴리-(프로필렌옥사이드) 폴리-(에틸렌옥사이드) 코폴리머, 폴록사머, 폴리비닐 알콜, 폴리아크릴레이트, 폴리-(메틸비닐 에테르)-말레산 무수물 코폴리머, 키토산, 히알루론산, 셀룰로오즈, 스타치, 크산탄, 스클레로글루칸, 겔란, 구아검, 로커스트 빈 검, 알기네이트, 덱스트란, 폴리-ε-카프로락톤, 폴리-히드록시부티레이트, 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 코폴리머로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 다기능 핵산 운반체.
  25. 제21항에 있어서, 상기 친수성 물질은
    덱스트란 및 그 유도체(dexran and its derivatives), 키토산 및 그 유도체(chitosan and its derivatives), 글라이콜 키토산 및 그 유도체(glycol chitosan and its derivatives), 폴리라이신(poly-L-lysine and poly-D-lysine), 폴리아스파르트산(poly-aspartic acid), 젤라틴 및 그 유도체(gelatin and its derivatives), 알부민 및 그 유도체(albumin and its derivatives), 트렌스페린 또는 그 유도체(transferrin and its derivatives), 콜라겐 또는 그 유도체(collagen and its derivatives), 폴리에틸렌이민 또는 그 유도체(polyethyleneimine and its derivatives), 폴리(디비닐 에테르-코-말레익언하이드라이드) poly(divinyl ether-comaleic anhydride)), 폴리(스틸렌-코-말레익 언하이드라이드) poly(styrene-co-maleic anhydride)) 및 폴리(에틸렌 글라이콜) poly(ethylene glycol))로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 1종을 특징으로 하는 다기능 핵산 운반체.
  26. 제2항에 있어서, 상기 입자화 소재는
    콜레스테롤, 세포투과 단백질 및 세포투과 펩타이드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 분자를 포함함으로써 세포막 투과 기능을 가지는 것을 특징으로 하는 입자화 소재-올리고 접합체.
  27. 제7항에 있어서,
    상기 siRNA의 센스 서열, 루프영역 서열과 안티센스 서열이 상보적으로 결합하여 헤어핀 구조를 형성하는 다기능 핵산.
  28. 제27항에 있어서, 상기 siRNA의 루프영역 서열은
    상기 운반-올리고 접합체 군에서 선택되어진 어느 하나와 상보적 결합하는 서열을 포함하는 특징으로 하는 다기능 핵산.
  29. 제1항에 있어서, 상기 다기능 핵산 및 운반-올리고 접합체의 올리고는
    유기합성, 증폭, 롤링서클전사(rolling circle transcription) 및 체외전사(in vitro transcription)로 이루어진 군에서 선택되어진 어느 한 방법으로 제조하는 것을 특징으로 하는 다기능 핵산.
  30. 제29항에 있어서, 증폭 반응은
    상기 단위 염기서열들로 이루어진 기본모듈 단위를 제조하는 단계;
    상기 기본모듈 단위를 1회 이상 반복적으로 존재하는 이중가닥 DNA를 제조하는 단계; 및
    상기 제조된 이중가닥 DNA를 주형으로 변형 뉴클레오타이드와 뉴클레오사이드 유사체에서 1종 이상과 천연 뉴클레오타이드를 구성성분으로 증폭 반응으로 단일가닥 DNA를 제조하는 단계;
    를 포함하는 특징으로 다기능 핵산의 제조방법.
  31. 제29항에 있어서, 체외전사 반응은
    상기 단위 염기서열들로 이루어진 기본모듈 단위를 제조하는 단계;
    상기 기본모듈 단위를 1회 이상 반복적으로 존재하는 이중가닥 DNA를 제조하는 단계; 및
    상기 제조된 이중가닥 DNA를 주형으로 변형 뉴클레오타이드와 뉴클레오사이드 유사체에서 1종 이상과 천연 뉴클레오타이드를 구성성분으로 체외전사 반응으로 RNA 전사체를 제조하는 단계;
    를 포함하는 특징으로 다기능 핵산의 제조방법.
  32. 제1항에 있어서,
    상기 다기능 핵산의 단위 염기서열에 상보적인 염기서열로 올리고를 유기 합성하는 단계; 및
    상기 제조한 올리고와 상기 운반소재에서 선택되어진 1종 이상을 공유결합 또는 비공유결합으로 연결하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 운반-올리고 접합체의 제조방법
  33. 제1항에 있어서
    상기 다기능 핵산과 상기 운반-올리고 접합체가 수용액 상에서 자가조립으로 형성하는 복합체를 특징으로 하는 다기능 핵산 운반체 및 이의 제조방법.
  34. 제33항에 있어서,
    상기 다기능 핵산과 입자화 소재-올리고 접합체를 포함하는 운반-올리고 접합체는 수용액 상에서 자가조립으로 형성하는 입자를 특징으로 하는 다기능 핵산 운반체 입자 및 이의 제조방법.
  35. 제33항에 있어서,
    상기 다기능 핵산의 헤어핀 구조의 횟수 및 상기 다기능핵산과 상기 입자화 소재-올리고 접합체가 형성하는 복합체의 횟수로 입자화를 조절하는 것을 특징으로 하는 다기능 핵산 운반체 입자 및 이의 제조방법.
  36. 제1항에 있어서,
    상기 입자화 소재-올리고 접합체가 없이 제조한 다기능 핵산 운반체를 상기 입자화 소재를 사용하여 제조하는 입자를 특징으로 하는 다기능 핵산 운반체 입자 및 이의 제조방법.
  37. 제1항에 있어서,
    상기 다기능 핵산 운반체에 생체적합성 무기물로서 산화철(iron oxide) 또는 금(gold)이 결합되어 이루어지는 것을 특징으로 하는 다기능 핵산 운반체 및 이의 제조방법.
  38. 제1항에 있어서,
    Peptide Nucleic Acid(PNA)를 포함하는 단위 염기서열로 구성된 상기 다기능 핵산 및 Peptide Nucleic Acid(PNA)를 포함하는 운반-올리고 접합체로 이루어진 군에서 선택되어진 어느 1종 이상으로 구성되는 것을 특징으로 하는 다기능 핵산.
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