KR20220121816A - 다분할 루시퍼라제 펩타이드 및 폴리펩타이드 - Google Patents

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KR20220121816A
KR20220121816A KR1020227021856A KR20227021856A KR20220121816A KR 20220121816 A KR20220121816 A KR 20220121816A KR 1020227021856 A KR1020227021856 A KR 1020227021856A KR 20227021856 A KR20227021856 A KR 20227021856A KR 20220121816 A KR20220121816 A KR 20220121816A
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랜스 피. 엔셀
메리 홀
마이클 킬로란
키스 우드
멜러니 다트
트리쉬 호앙
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    • C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)

Abstract

본원에는 삼분할 또는 다분할 생물발광 복합체의 조립을 위한 생물발광 폴리펩타이드 및 조성물 및 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 생물발광 복합체는 3개 이상의 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드 성분의 상호작용 시에 형성된다.

Description

다분할 루시퍼라제 펩타이드 및 폴리펩타이드
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 11월 27일자로 출원된 미국 가특허출원 일련번호 제62/941,255호에 대한 우선권을 주장하며, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
기술분야
본원에는 삼분할(tripartite) 또는 다분할(multipartite) 생물발광 복합체의 조립을 위한 생물발광 폴리펩타이드 및 조성물 및 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 생물발광 복합체는 3개 이상의 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드 성분의 상호작용 시에 형성된다.
생물학적 과정과 분석물 검출은 분자, 거대분자 및 분자 복합체 간의 공동국재화(co-localization) 및 상호작용에 의존적이다. 이러한 과정을 이해하고 이를 연구, 임상 및 기타 실제 적용을 위해 조작하는 기술과 화합물을 개발하려면 이러한 공동국재화/상호작용을 검출하고 모니터링하는 데 이용할 수 있는 도구가 필요하다. 특히 생리학적 조건(예를 들어, 단백질 상호작용 모니터링을 위한 정상 발현 수준에서) 하에 또는 복잡한 샘플 매트릭스(예를 들어, 혈액 샘플, 환경 샘플)에서 이들 상호작용에 대한 연구는 높은 감도를 필요로 한다.
본원에는 삼분할 또는 다분할 생물발광 복합체의 조립을 위한 생물발광 폴리펩타이드 및 조성물 및 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 생물발광 복합체는 3개 이상의 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드 성분의 상호작용 시에 형성된다.
본원의 실시양태의 개발 동안 수행된 실험은 적절한 기질(예를 들어, 코엘렌테라진(coelenterazine) 또는 코엘렌테라진 유사체 기질)의 존재 하에, 루시퍼라제 기본 서열의 길이(또는 이 길이의 >75%, 길이의 >80%, 길이의 >85%, 길이의 >90%, 길이의 >95% 이상)에 집합적으로 걸쳐 있는(또는 루시퍼라제 기본 서열에 대해 적어도 40%의 서열 동일성(예를 들어, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95% 이상)을 집합적으로 포함하는 것) 상보적 폴리펩타이드(들) 및 펩타이드(들)로부터 발광을 발생시킬 수 있는 생물발광 복합체의 조립체를 입증한다. 일부 실시형태에서, "상보적" 폴리펩타이드(들) 및 펩타이드(들)는 루시퍼라제 기본 서열의 일부에 각각 상응하는 별도의 분자이다. 이들은 구조적 상보성을 통해 조립되어 생물발광 복합체를 형성한다.
향상된 특성(예를 들어, 안정성, 발광 등)을 갖는 단량체성 생물발광 폴리펩타이드를 개발하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 부가적인 실험을 수행했다.
일부 실시양태에서, 상보적 폴리펩타이드(들) 및 펩타이드(들)은 조립되어 생물발광 복합체를 형성하는 루시퍼라제 기본 서열의 단편이다. 일부 실시양태에서, 단편은 루시퍼라제 기본 서열의 전체 길이를 집합적으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 단편은 루시퍼라제 기본 서열의 전체 길이의 적어도 75%를 집합적으로 포함한다(예를 들어, 길이의 >75%, 길이의 >80%, 길이의 >85%, 길이의 >90% 길이, 길이의 >95% 이상).
일부 실시양태에서, 상보적 폴리펩타이드(들) 및 펩타이드(들)는 루시퍼라제 기본 서열의 상응하는 부분에 대해 적어도 40% 서열 동일성(예를 들어, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75% >80%, >85%, >90%, >95% 이상)을 개별적으로 포함하는 루시퍼라제 기본 서열 일부의 변이체로서, 조립되어 생물발광 복합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 상보적 폴리펩타이드(들) 및 펩타이드(들)는 전체 루시퍼라제 기본 서열에 대해 적어도 40% 서열 동일성(예를 들어, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75% >80%, >85%, >90%, >95% 이상)을 집합적으로 포함하는 루시퍼라제 기본 서열 일부의 변이체로서, 조립되어 생물발광 복합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 단편은 루시퍼라제 기본 서열의 전체 길이를 집합적으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상보적 폴리펩타이드(들) 및 펩타이드(들)는 루시퍼라제 기본 서열의 전체 길이의 적어도 75%(예를 들어, 길이의 >75%, 길이의 >80%, 길이의 >85%, 길이의 >90%, 길이의 >95% 이상)를 집합적으로 포함한다.
루시퍼라제 기본 서열의 예로는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 788, 및 서열번호 789를 포함한다. 본원의 일부 실시양태는 루시퍼라제 기본 서열(예를 들어, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 788, 및 서열번호 789)의 단편 또는 이의 변이체(예를 들어, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75% >80%, >85%, >90%, >95% 서열 동일성)인 폴리펩타이드 성분 및 루시퍼라제 기본 서열에 집합적으로 걸쳐 있는 하나 이상의 상보적 펩타이드(들) 및/또는 폴리펩타이드(들)를 제공한다. 예를 들어, 루시퍼라제 기본 서열의 길이가 170개 아미노산 잔기인 경우, 예시적인 폴리펩타이드 성분은, 예를 들어, 길이가 102, 124, 133 또는 148개 아미노산일 수 있고, 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 상보적 펩타이드는 나머지 68, 46, 37 또는 22개 아미노산에 상응한다. 일부 실시양태에서, 각각의 폴리펩타이드 성분은 루시퍼라제 기본 서열의 상응하는 부분에 대해 개별적으로 적어도 40%의 서열 동일성(예를 들어, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75% >80%, >85%, >90%, >95% 이상)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에는 (a) 서열번호 788 또는 서열번호 789의 폴리펩타이드 단편에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하는 폴리펩타이드 성분; 및 (b) 서열번호 788 또는 서열번호 789의 상보적 부분에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 집합적으로 포함하는 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드를 포함하는 시스템 또는 키트가 제공되고; 여기서, 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질의 존재 하에 폴리펩타이드 성분 및 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드로부터 조립된 생물발광 복합체에 의해 생성된 생물발광 신호는 폴리펩타이드 성분 또는 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드와 코엘렌테라진 기질 단독에 의해 생성된 생물발광 신호와 비교했을 때 실질적으로 증가된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분은 서열번호 790에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하고, 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 집합적으로 서열번호 794에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분은 서열번호 791에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하고, 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 집합적으로 서열번호 795에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분은 서열번호 792에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하고, 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 집합적으로 서열번호 796에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분은 서열번호 793에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하고, 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 집합적으로 서열번호 797에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분은 서열번호 790에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하고, 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 집합적으로 서열번호 798에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분은 서열번호 791에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하고, 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 집합적으로 서열번호 799에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분은 서열번호 792에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하고, 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 집합적으로 서열번호 800에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분은 서열번호 793에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하고, 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 집합적으로 서열번호 801에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생물발광 신호는 폴리펩타이드 성분이 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드와 연합될 때 실질적으로 증가한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 성분 및/또는 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드는 천연 발생 서열 또는 이의 단편이 아닌 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 성분 및/또는 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드는 비천연 아미노산, 아미노산 유사체, 및/또는 펩토이드 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분 및/또는 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드는 하나 이상의 부가적인 아미노산 서열과 융합체로서 존재한다. 일부 실시양태에서, 부가적인 아미노산 서열은 관심 단백질, 상호작용 요소, 공동국재화 요소, 및 결합 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 부가적인 아미노산 서열은 항체(다클론, 단클론 및/또는 재조합), 항체 단편, 단백질 A, 단백질 A의 Ig 결합 도메인, 단백질 G, 단백질 G의 Ig 결합 도메인, 단백질 A/G, 단백질 A/G의 Ig 결합 도메인, 단백질 L, 단백질 L의 Ig 결합 도메인, 단백질 M, 단백질 M의 Ig 결합 도메인, 올리고뉴클레오타이드 프로브, 펩타이드 핵산, DARPin, 압타머(aptamer), 아피머( affimer), 정제된 단백질(분석물 자체 또는 분석물에 결합하는 단백질) 및 단백질의 분석물 결합 도메인(들)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 부가적인 아미노산 서열은 제1 상호작용 폴리펩타이드와 제2 상호작용 폴리펩타이드의 접촉 시, 제2 상호작용 폴리펩타이드와 복합체를 형성하도록 구성된 제1 상호작용 폴리펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 부가적인 아미노산 서열은 제2 공동국재화 폴리펩타이드와 함께 세포 구획, 세포, 조직 또는 유기체 내에 공동국재화하도록 구성된 제1 공동국재화 폴리펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 부가적인 아미노산 서열은 관심 단백질이고 후보 약물 표적이다. 일부 실시양태에서, 본원에는 본원에 기재된 시스템 또는 키트의 폴리펩타이드 성분 및 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드를 포함하는 생물발광 복합체가 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에는 서열번호 788 또는 서열번호 789에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 집합적으로 포함하는 2개 이상의 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드 성분을 포함하는 시스템 또는 키트가 제공되며; 여기서, 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질의 존재 하에 생물발광 복합체에 의해 생성된 생물발광 신호는 폴리펩타이드 또는 하나 이상의 상보적 펩타이드 및 코엘렌테라진 기질 단독에 의해 생성된 생물발광 신호와 비교할 때 실질적으로 증가된다. 일부 실시양태에서, 키트의 시스템은 서열번호 790에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 성분, 및 서열번호 794에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 집합적으로 갖는 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 및/또는 트리펩타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 791에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하고, 하나 이상의 상보적 펩타이드는 서열번호 795에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 집합적으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 792에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하고, 하나 이상의 상보적 펩타이드는 서열번호 796에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 집합적으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 793에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하고, 하나 이상의 상보적 펩타이드는 서열번호 797에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 집합적으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 790에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하고, 하나 이상의 상보적 펩타이드는 서열번호 798에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 집합적으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 791에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하고, 하나 이상의 상보적 펩타이드는 서열번호 799에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 집합적으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 792에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하고, 하나 이상의 상보적 펩타이드는 서열번호 800에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 집합적으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 793에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하고, 하나 이상의 상보적 펩타이드는 서열번호 801에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 집합적으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 생물발광 신호는 폴리펩타이드가 하나 이상의 상보적 펩타이드와 연합될 때 실질적으로 증가한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 및/또는 하나 이상의 상보적 펩타이드는 천연 발생 서열 또는 이의 단편이 아닌 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 및/또는 하나 이상의 상보적 펩타이드는 비천연 아미노산, 아미노산 유사체, 및/또는 펩토이드 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 및/또는 하나 이상의 상보적 펩타이드는 하나 이상의 부가적인 아미노산 서열과 융합체로서 존재한다. 일부 실시양태에서, 부가적인 아미노산 서열은 관심 단백질, 상호작용 요소, 공동국재화 요소, 및 결합 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 부가적인 아미노산 서열은 항체(다클론, 단클론 및/또는 재조합), 항체 단편, 단백질 A, 단백질 A의 Ig 결합 도메인, 단백질 G, 단백질 G의 Ig 결합 도메인, 단백질 A/G, 단백질 A/G의 Ig 결합 도메인, 단백질 L, 단백질 L의 Ig 결합 도메인, 단백질 M, 단백질 M의 Ig 결합 도메인, 올리고뉴클레오타이드 프로브, 펩타이드 핵산, DARPin, 압타머, 아피머, 정제된 단백질(분석물 자체 또는 분석물에 결합하는 단백질), 및 단백질의 분석물 결합 도메인(들)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 부가적인 아미노산 서열은 제1 상호작용 폴리펩타이드와 제2 상호작용 폴리펩타이드의 접촉 시, 제2 상호작용 폴리펩타이드와 복합체를 형성하도록 구성되는 제1 상호작용 폴리펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 부가적인 아미노산 서열은 제2 공동국재화 폴리펩타이드와 함께 세포 구획, 세포, 조직, 또는 유기체 내에 공동국재화하도록 구성된 제1 공동국재화 폴리펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 부가적인 아미노산 서열은 관심 단백질이고 후보 약물 표적이다. 일부 실시양태에서, 본원에는 본원에 기재된 시스템 또는 키트의 2개 이상의 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드 성분을 포함하는 생물발광 복합체가 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에는 (a) (i) 서열번호 788 또는 서열번호 789의 폴리펩타이드 단편에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하는 폴리펩타이드 성분; (ii) 서열번호 788 또는 서열번호 789의 상보적 부분에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 집합적으로 포함하는 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드; 및 (iii) 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질을 조합하는 단계; 및 (b) 발광을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공되며, 여기서 폴리펩타이드 성분과 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 단독에 의해 생성된 발광 수준에 비해 더 큰 발광 수준은 폴리펩타이드 성분과 하나 이상의 상보적 펩타이드의 생물발광 복합체의 형성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 폴리펩타이드 성분과 제1 및 제2 펩타이드는 세포에서 발현되고, 외인성으로 세포에 첨가되고, 및/또는 샘플에 첨가된다. 일부 실시양태에서, (i) 폴리펩타이드 성분은 서열번호 790에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하고, 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 서열번호 794에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 집합적으로 포함하며; (ii) 폴리펩타이드 성분은 서열번호 791에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하고, 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 서열번호 795에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 집합적으로 포함하며; (iii) 폴리펩타이드 성분은 서열번호 792에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하고, 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 서열번호 796에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 집합적으로 포함하며; (iv) 폴리펩타이드 성분은 서열번호 793에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하고, 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 서열번호 797에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 집합적으로 포함하며; (v) 폴리펩타이드 성분은 서열번호 790에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하고, 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 서열번호 798에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 집합적으로 포함하며; (vi) 폴리펩타이드 성분은 서열번호 791에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하고, 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 서열번호 799에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 집합적으로 포함하며; (vii) 폴리펩타이드 성분은 서열번호 792에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하고, 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 서열번호 800에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 집합적으로 포함하며; (viii) 폴리펩타이드 성분은 서열번호 793에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하고, 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 서열번호 801에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 집합적으로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에는 (a) (i) 서열번호 788 또는 서열번호 789의 전체 길이에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 집합적으로 포함하는 2개 이상의 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드 성분; 및 (ii) 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질을 조합하는 단계; 및 (b) 발광을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공되며, 여기서 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드 성분과 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체에 의해 생성된 발광 수준에 비해 더 큰 발광 수준은 펩타이드와 폴리펩타이드 성분의 생물발광 복합체의 형성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 폴리펩타이드 성분과 제1 및 제2 펩타이드는 세포에서 발현될 수 있고, 외인성으로 세포에 첨가될 수 있으며, 및/또는 샘플에 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, (i) 폴리펩타이드 성분은 서열번호 790에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하고, 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 서열번호 794에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 집합적으로 포함하며; (ii) 폴리펩타이드 성분은 서열번호 791에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하고, 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 서열번호 795에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 집합적으로 포함하며; (iii) 폴리펩타이드 성분은 서열번호 792에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하고, 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 서열번호 796에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 집합적으로 포함하며; (iv) 폴리펩타이드 성분은 서열번호 793에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하고, 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 서열번호 797에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 집합적으로 포함하며; (v) 폴리펩타이드 성분은 서열번호 790에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하고, 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 서열번호 798에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 집합적으로 포함하며; (vi) 폴리펩타이드 성분은 서열번호 791에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하고, 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 서열번호 799에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 집합적으로 포함하며; (vii) 폴리펩타이드 성분은 서열번호 792에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하고, 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 서열번호 800에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 집합적으로 포함하며; 또는 (viii) 폴리펩타이드 성분은 서열번호 793에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하고, 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 서열번호 801에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 집합적으로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에는 제1 분자 실체(entity)와 제2 분자 실체 사이의 상호작용을 검출하는 방법이 제공되며, 이 방법은 (a) 제1 분자 실체를 제1 펩타이드, 디펩타이드 또는 트리펩타이드 태그로 태그화(tagging)하는 단계; (b) 제2 분자 실체를 제2 펩타이드, 디펩타이드 또는 트리펩타이드 태그로 태그화하는 단계; (c) 태그화된 제1 분자 실체 및 태그화된 제2 분자 실체를 조합하고/하거나, 태그화된 제1 분자 실체 및 태그화된 제2 분자 실체가 서로 접촉하게 하는 단계; (d) 하나 이상의 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드 성분을 첨가하는 단계로서, 여기서 제1 펩타이드, 디펩타이드, 또는 트리펩타이드 태그, 제2 펩타이드, 디펩타이드 또는 트리펩타이드 태그, 및 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드 성분은 서열번호 788 또는 789의 실체와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 집합적으로 포함하고, 조립되어 생물발광 복합체를 형성할 수 있는 단계; (e) 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질을 첨가하는 단계; 및 (f) 생물발광 복합체에 의해 생성된 발광 신호를 검출하는 단계로서, 발광 신호의 크기는 제1 분자 실체와 제2 분자 실체 사이의 상호작용 강도와 상관관계가 있는, 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 분자 실체 및/또는 제2 분자 실체는 관심 단백질 또는 관심 펩타이드이고, 태그화는 제1 분자 실체 및/또는 제2 분자 실체와 제1 태그 및/또는 제2 태그의 융합체를 생성하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 분자 실체 및/또는 제2 분자 실체는 소분자이고 태그화는 제1 분자 실체 및/또는 제2 분자 실체를 제1 태그 및/또는 제2 태그와 직접 또는 간접적으로 연결하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 분자 실체 및 제2 분자 실체 중 하나는 약물 또는 약물 후보이고 다른 하나는 약물 표적 또는 후보 약물 표적이고, 생물발광 신호는 약물 표적 또는 후보 약물 표적인 다른 하나에 대한 약물 또는 약물 후보의 결합을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 태그화된 제1 분자 실체 및 태그화된 제2 분자 실체를 조합하는 단계는 세포 내에서 하나 또는 둘 모두를 발현시키는 것 및/또는 세포에 하나 또는 둘 모두를 첨가하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에는 세포를 이용하여 제1 단백질 또는 펩타이드 실체 및 제2 단백질 또는 펩타이드 실체 사이의 상호작용을 검출하는 방법이 제공되며, 이 방법은 (a) 세포 내에서 제1 단백질 또는 펩타이드 실체, 및 서열번호 788 또는 789의 제1 부분과 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 펩타이드, 디펩타이드 또는 트리펩타이드 태그를 포함하는 융합체를 발현시키는 단계; (b) 세포 내에서 제2 단백질 또는 펩타이드 실체 및 서열번호 788 또는 789의 제2 부분과 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55% , 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 펩타이드, 디펩타이드, 또는 트리펩타이드 태그를 포함하는 융합체를 발현시키는 단계; (c) 세포 내에서 서열번호 788 또는 789의 제3 부분과 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드 성분을 발현시키는 단계로서, 여기서, 제1 태그, 제2 태그, 및 성분은 서열번호 788 또는 789의 실체와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 집합적으로 포함하고 제1 단백질 또는 펩타이드 실체와 제2 단백질 또는 펩타이드 실체의 상호작용 시, 생물발광 복합체를 생성하도록 구성되는, 단계; (d) 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질을 세포에 첨가하는 단계; 및 (e) 생물발광 복합체에 의해 생성된 발광 신호를 검출하는 단계로서, 여기서 발광 신호의 크기는 제1 단백질 또는 펩타이드 실체와 제2 단백질 또는 펩타이드 실체 사이의 상호작용 강도와 상관관계가 있는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에는 제1 분자 실체 및 제2 분자 실체의 공동국재화를 검출하는 방법이 제공되며, 이 방법은 (a) 서열번호 788 또는 789의 제1 부분과 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 펩타이드, 디펩타이드, 또는 트리펩타이드 태그를 이용하여 제1 분자 실체를 태그화하는 단계; (b) 서열번호 788 또는 789의 제2 부분과 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 펩타이드, 디펩타이드, 또는 트리펩타이드 태그를 이용하여 제2 분자 실체를 태그화하는 단계; (c) 태그화된 제1 분자 실체와 태그화된 제2 분자 실체를 동일한 시스템에서 조합하는 단계; (d) 이 시스템에 하나 이상의 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드 성분을 첨가하는 단계로서, 성분은 서열번호 788 또는 789의 제3 부분과 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 갖고, 성분은 서열번호 788 또는 789의 실체와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 집합적으로 포함하며, 여기서, 제1 펩타이드 태그, 제2 펩타이드 태그, 및 성분은 제1 분자 실체 및 제2 분자 실체의 공동국재화 시에 생물발광 복합체를 생성하도록 구성되는, 단계; (e) 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질을 시스템에 첨가하는 단계; 및 (f) 생물발광 복합체에 의해 생성된 발광 신호를 검출하는 단계로서, 여기서 배경 초과의 발광 신호의 존재는 시스템 내에서 제1 분자 실체와 제2 분자 실체의 공동국재화를 나타내고/내거나, 발광 신호의 크기는 제1 분자 실체와 제2 분자 실체의 시스템 내 공동국재화의 양과 상관관계가 있는, 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 시스템은 세포, 조직, 기관, 전체 유기체, 및/또는 생화학적, 비-세포 샘플을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 분자 실체 및/또는 제2 분자 실체는 관심 단백질 또는 관심 펩타이드이고, 태그화는 제1 분자 실체 및/또는 제2 분자 실체와 제1 태그 및/또는 펩타이드 태그의 융합체를 생성하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 분자 실체 및/또는 제2 분자 실체는 소분자이고 태그화는 제1 분자 실체 및/또는 제2 분자 실체를 제1 태그 및/또는 제2 태그와 직접 또는 간접적으로 연결하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 태그화된 제1 분자 실체와 태그화된 제2 분자 실체를 조합하는 것은 시스템 내에서 하나 또는 둘 모두를 발현하는 것 및/또는 시스템에 하나 또는 둘 모두를 첨가하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에는 세포를 이용하여 제1 단백질 또는 펩타이드 실체, 및 제2 단백질 또는 펩타이드 실체의 공동국재화를 검출하는 방법이 제공되며, 이 방법은 (a) 제1 단백질 또는 펩타이드 실체 및 서열번호 788 또는 789의 제1 부분과 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 펩타이드, 디펩타이드, 또는 트리펩타이드 태그를 포함하는 융합체를 세포 내에서 발현시키는 단계; (b) 제2 단백질 또는 펩타이드 실체 및 서열번호 788 또는 789의 제2 부분과 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 펩타이드, 디펩타이드, 또는 트리펩타이드 태그를 포함하는 융합체를 세포 내에서 발현시키는 단계; (c) 세포를 이용하여 서열번호 788 또는 789의 제3 부분과 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 또는 폴리펩타이드 성분을 발현시키는 단계로서, 여기서 제1 태그, 제2 태그, 및 성분은 서열번호 788 또는 789의 전체와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 집합적으로 포함하고, 여기서 제1 태그, 제2 태그, 및 성분은 제1 단백질 또는 펩타이드 실체와 제2 단백질 또는 펩타이드 실체의 공동국재화 시에 생물발광 복합체를 생산하도록 구성되는 것인 단계; (d) 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질을 세포에 첨가하는 단계; 및 (e) 생물발광 복합체에 의해 생성된 발광 신호를 검출하는 단계로서, 여기서 배경 초과의 발광 신호의 존재는 세포 내에서 제1 단백질 또는 펩타이드 실체와 제2 단백질 또는 펩타이드 실체의 공동국재화를 나타내고/내거나, 발광 신호의 크기는 제1 단백질 또는 펩타이드 실체와 제2 단백질 또는 펩타이드 실체의 시스템 내 공동국재화의 양과 상관관계가 있는, 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에는 제1 항원, 에피토프, 또는 서열 및 별개의 제2 항원, 에피토프, 또는 서열을 표시(display)하는 표적 분자를 검출하는 방법이 제공되며, 이 방법은 (a) 표적 분자를 함유하는 샘플을 (i) 제1 항원, 에피토프, 또는 서열을 인식하는 제1의 1차 결합 모이어티 및 (ii) 제2 항원, 에피토프, 또는 서열을 인식하는 제2의 1차 결합 모이어티와 접촉시키고, 제1 및 제2의 1차 결합 모이어티가 제1 및 제2 항원, 에피토프, 또는 서열에 결합하도록 하는 단계; (b) 샘플을 (i) 제1 태그에 접합된 제1의 2차 결합 모이어티 및 (ii) 제2 태그에 접합된 제2의 2차 결합 모이어티와 접촉시키는 단계로서, 여기서 제1의 2차 결합 모이어티는 제1의 1차 결합 모이어티를 인식하고 제2의 2차 결합 모이어티는 제2의 1차 결합 모이어티를 인식하며, 제1 또는 제2 태그는 서열번호 788 또는 789의 제1 및 제2 부분과 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 단계; (c) 제1 및 제2의 2차 결합 모이어티가 제1 및 제2의 1차 결합 모이어티에 결합하도록 하는 단계; (d) 샘플을 서열번호 788 또는 789의 제3 부분과 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드 성분과 접촉시키는 단계로서, 여기서 제1 태그, 제2 태그, 및 성분은 서열번호 788 또는 789의 전체와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 집합적으로 포함하고, 여기서 제1 태그, 제2 태그, 및 성분은 상호작용 시, 생물발광 복합체를 생성하도록 구성되는 것인 단계; (d) 샘플을 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질과 접촉시키는 단계; 및 (e) 생물발광 복합체에 의해 생성된 발광 신호를 검출하는 단계로서, 여기서 배경 초과의 발광 신호의 존재는 표적 분자의 존재를 나타내고/거나, 발광 신호의 크기는 샘플 내 표적 분자의 양과 상관관계가 있는, 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합 모이어티는 항체(다클론, 단클론 및/또는 재조합), 항체 단편, 단백질 A, 단백질 A의 Ig 결합 도메인, 단백질 G, 단백질 G의 Ig 결합 도메인, 단백질 A/G, 단백질 A/G의 Ig 결합 도메인, 단백질 L, 단백질 L의 Ig 결합 도메인, 단백질 M, 단백질 M의 Ig 결합 도메인, 올리고뉴클레오타이드 프로브, 펩타이드 핵산, DARPin, 압타머, 아피머, 정제된 단백질(분석물 자체 또는 분석물에 결합하는 단백질), 및 단백질의 분석물 결합 도메인(들)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시양태에서, 표적 분자는 단백질, 핵산, 또는 소분자이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 시험관내 또는 생체내이다.
일부 실시양태에서, 본원에는 제1 항원, 에피토프 또는 서열 및 별개의 제2 항원, 에피토프 또는 서열을 표시하는 표적 분자를 검출하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 샘플을 (i) 제1 태그에 접합된 제1 결합 모이어티 및 (ii) 제2 태그에 접합된 제2 결합 모이어티와 접촉시키는 단계로서, 여기서 제1의 2차 결합 모이어티는 제1 항원, 에피토프, 또는 서열을 인식하고, 제2 결합 모이어티는 제2 항원, 에피토프, 또는 서열을 인식하며, 제1 태그는 서열번호 788 또는 789의 제1 부분과 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 제2 태그는 서열번호 788 또는 789의 제1 부분을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 단계; (b) 제1 및 제2 결합 모이어티가 제1 및 제2 항원, 에피토프, 또는 서열에 결합하도록 하는 단계; (c) 샘플을 서열번호 788 또는 789의 제3 부분과 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 갖는 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 또는 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계로서, 여기서 제1 태그, 제2 태그, 및 성분은 서열번호 788 또는 789의 전체와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 집합적으로 포함하고, 제1 태그, 제2 태그, 및 성분은 상호작용 시에 생물발광 복합체를 생성하도록 구성되는 것인 단계; (d) 샘플을 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질과 접촉시키는 단계; 및 (e) 상기 생물발광 복합체에 의해 생성된 발광 신호를 검출하는 단계로서, 여기서 배경 초과의 발광 신호의 존재는 표적 분자의 존재를 나타내고, 및/또는 발광 신호의 크기는 샘플 내 표적 분자의 양과 상관관계가 있는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합 모이어티는 항체(다클론, 단클론 및/또는 재조합), 항체 단편, 단백질 A, 단백질 A의 Ig 결합 도메인, 단백질 G, 단백질 G의 Ig 결합 도메인, 단백질 A/G, 단백질 A/G의 Ig 결합 도메인, 단백질 L, 단백질 L의 Ig 결합 도메인, 단백질 M, 단백질 M의 Ig 결합 도메인, 올리고뉴클레오타이드 프로브, 펩타이드 핵산, DARPin, 압타머, 아피머, 정제된 단백질(분석물 자체 또는 분석물에 결합하는 단백질) 및 단백질의 분석물 결합 도메인(들)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시양태에서, 표적 분자는 단백질, 핵산, 또는 소분자이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 시험관내, 생체내, 또는 생화학적 샘플이다.
일부 실시양태에서, 본원에는 표 1, 표 9 또는 표 10에 열거된 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 표 1, 표 9, 또는 표 10에 열거된 단일 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 또는 폴리펩타이드가 제공된다(예를 들어, 시약, 태그 등으로서). 일부 실시양태에서, 표 1, 표 9, 또는 표 10에 열거된 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드의 쌍(2) 또는 세트(예를 들어, 2, 3, 4, 5개 이상)가 제공된다. 특히, 상보적이며, 서로 상호작용(예를 들어, 촉진 시, 비촉진 시) 시, 생물발광 복합체를 형성할 수 있는 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드의 쌍 또는 세트가 제공된다.
일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분은 서열번호 909, 911, 913, 915, 917, 919, 921, 923, 925, 927, 929, 931, 933, 935, 937, 939, 941, 943, 945, 947, 949, 951, 953, 955, 957, 959, 961, 963, 965, 967, 969, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 596, 598, 600, 602, 604, 606, 608, 610, 612, 614, 616, 618, 620, 622, 624, 626, 628, 630, 632, 634, 636, 638, 640, 642, 644, 646, 648, 650, 652, 654, 656, 658, 660, 662, 664, 666, 668, 670, 672, 674, 676, 678, 680, 682, 684, 686, 688, 690, 692, 694, 696, 698, 700, 702, 704, 706, 708, 710, 712, 714, 716, 718, 720, 722, 724, 726, 728, 730, 732, 734, 736, 738, 740, 742, 744, 746, 748, 750, 752, 754, 756, 758, 760, 762, 764, 766, 768, 770, 772, 774, 776, 778, 780, 782, 784, 786, 802, 804, 806, 808, 813, 815, 또는 829 중 하나에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열번호 909, 911, 913, 915, 917, 919, 921, 923, 925, 927, 929, 931, 933, 935, 937, 939, 941, 943, 945, 947, 949, 951, 953, 955, 957, 959, 961, 963, 965, 967, 969, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 596, 598, 600, 602, 604, 606, 608, 610, 612, 614, 616, 618, 620, 622, 624, 626, 628, 630, 632, 634, 636, 638, 640, 642, 644, 646, 648, 650, 652, 654, 656, 658, 660, 662, 664, 666, 668, 670, 672, 674, 676, 678, 680, 682, 684, 686, 688, 690, 692, 694, 696, 698, 700, 702, 704, 706, 708, 710, 712, 714, 716, 718, 720, 722, 724, 726, 728, 730, 732, 734, 736, 738, 740, 742, 744, 746, 748, 750, 752, 754, 756, 758, 760, 762, 764, 766, 768, 770, 772, 774, 776, 778, 780, 782, 784, 786, 802, 804, 806, 808, 813, 815, 또는 829 중 하나에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하는 폴리펩타이드는 생물발광 복합체를 형성할 수 있는 하나 이상의 펩타이드 또는 디펩타이드와 함께 제공된다. 일부 실시양태에서, 서열번호 909, 911, 913, 915, 917, 919, 921, 923, 925, 927, 929, 931, 933, 935, 937, 939, 941, 943, 945, 947, 949, 951, 953, 955, 957, 959, 961, 963, 965, 967, 969, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 596, 598, 600, 602, 604, 606, 608, 610, 612, 614, 616, 618, 620, 622, 624, 626, 628, 630, 632, 634, 636, 638, 640, 642, 644, 646, 648, 650, 652, 654, 656, 658, 660, 662, 664, 666, 668, 670, 672, 674, 676, 678, 680, 682, 684, 686, 688, 690, 692, 694, 696, 698, 700, 702, 704, 706, 708, 710, 712, 714, 716, 718, 720, 722, 724, 726, 728, 730, 732, 734, 736, 738, 740, 742, 744, 746, 748, 750, 752, 754, 756, 758, 760, 762, 764, 766, 768, 770, 772, 774, 776, 778, 780, 782, 784, 786, 802, 804, 806, 808, 813, 815, 또는 829 중 하나에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 갖는 서열번호 909, 911, 913, 915, 917, 919, 921, 923, 925, 927, 929, 931, 933, 935, 937, 939, 941, 943, 945, 947, 949, 951, 953, 955, 957, 959, 961, 963, 965, 967, 969, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 596, 598, 600, 602, 604, 606, 608, 610, 612, 614, 616, 618, 620, 622, 624, 626, 628, 630, 632, 634, 636, 638, 640, 642, 644, 646, 648, 650, 652, 654, 656, 658, 660, 662, 664, 666, 668, 670, 672, 674, 676, 678, 680, 682, 684, 686, 688, 690, 692, 694, 696, 698, 700, 702, 704, 706, 708, 710, 712, 714, 716, 718, 720, 722, 724, 726, 728, 730, 732, 734, 736, 738, 740, 742, 744, 746, 748, 750, 752, 754, 756, 758, 760, 762, 764, 766, 768, 770, 772, 774, 776, 778, 780, 782, 784, 786, 802, 804, 806, 808, 813, 815, 또는 829 폴리펩타이드의 적합한 단편이 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 단편은 본원에 제공된 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 폴리펩타이드의 적합한 세트와 생물발광 복합체를 형성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 펩타이드 성분은 서열번호 900-907 중 하나에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열번호 900-907 중 하나에 대해 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하는 폴리펩타이드는 생물발광 복합체를 형성할 수 있는 하나 이상의 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 폴리펩타이드 등과 함께 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에는 표 1, 표 9 또는 표 10에 열거된 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드 중 하나 이상과 적어도 40%(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 갖는 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 표 1, 표 9, 또는 표 10에 열거된 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드 중 하나 이상과 적어도 40%(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 갖는 단일 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 또는 폴리펩타이드가 제공된다(예를 들어, 시약, 태그 등으로서). 일부 실시양태에서, 표 1, 표 9 또는 표 10에 열거된 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드 중 하나 이상과 적어도 40%(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 갖는 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드의 쌍(2개) 또는 세트(예를 들어, 2, 3, 4, 5개 이상)가 제공된다. 특히, 상보적이고 서로 상호작용(예를 들어, 촉진 시, 비촉진 시) 시에 생물발광 복합체를 형성할 수 있는 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드의 쌍 또는 세트가 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에는 서열번호 790, 791, 792, 또는 793 중 하나와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 단독으로 또는 생물발광 복합체의 형성을 위해 상보적 펩타이드(들), 디펩타이드(들), 및/또는 트리펩타이드와 쌍/세트로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 관심 단백질, 상호작용 요소, 공동국재화 요소 등과 본원의 폴리펩타이드의 융합체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 및 이의 융합체를 암호화하는 핵산 및 벡터가 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에는 서열번호 817, 818, 819, 13, 15, 23, 또는 25를 포함하는 펩타이드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에는 서열번호 817, 818, 819, 13, 15, 23 또는 25 중 하나와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 포함하는 펩타이드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 펩타이드는 단독으로 또는 생물발광 복합체의 형성을 위해 상보적 폴리펩타이드 및/또는 다른 펩타이드(들), 디펩타이드(들), 및/또는 트리펩타이드와 쌍/세트로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 관심 단백질, 상호작용 요소, 공동국재화 요소 등과 본원의 펩타이드의 융합체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 펩타이드 및 이의 융합체를 암호화하는 핵산 및 벡터가 제공된다. 일부 실시양태에서, 관심 분자 및/또는 관심 단백질은 본원의 펩타이드에 의해 태그화된다.
일부 실시양태에서, 본원에는 서열번호 817 및 818을 포함하는 β6-7-유사 디펩타이드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에는 서열번호 817 및 818과 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 갖는 β6-7-유사 디펩타이드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 디펩타이드는 단독으로 또는 생물발광 복합체의 형성을 위해 상보적 폴리펩타이드 및/또는 다른 펩타이드(들), 디펩타이드(들), 및/또는 트리펩타이드와 쌍/세트로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 디펩타이드 및 이의 융합체를 암호화하는 핵산 및 벡터가 제공된다. 일부 실시양태에서, 관심 분자 및/또는 관심 단백질은 본원의 디펩타이드에 의해 태그화된다.
일부 실시양태에서, 본원에는 서열번호 818 및 819를 포함하는 β7-8-유사 디펩타이드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에는 서열번호 818 및 819와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 갖는 β7-8-유사 디펩타이드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 디펩타이드는 단독으로 또는 생물발광 복합체의 형성을 위해 상보적 폴리펩타이드 및/또는 다른 펩타이드(들), 디펩타이드(들), 및/또는 트리펩타이드와 쌍/세트로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 디펩타이드는 단독으로 또는 생물발광 복합체의 형성을 위해 상보적 폴리펩타이드 및/또는 다른 펩타이드(들), 디펩타이드(들), 및/또는 트리펩타이드와 쌍/세트로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 디펩타이드 및 이의 융합체를 암호화하는 핵산 및 벡터가 제공된다. 일부 실시양태에서, 관심 분자 및/또는 관심 단백질은 본원의 디펩타이드에 의해 태그화된다.
일부 실시양태에서, 본원에는 서열번호 819/23 또는 819/25를 포함하는 β8-9-유사 디펩타이드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에는 서열번호 819/23 또는 819/25와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 갖는 β8-9-유사 디펩타이드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 디펩타이드는 단독으로 또는 생물발광 복합체의 형성을 위해 상보적 폴리펩타이드 및/또는 다른 펩타이드(들), 디펩타이드(들), 및/또는 트리펩타이드와 쌍/세트로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 디펩타이드는 단독으로 또는 생물발광 복합체의 형성을 위해 상보적 폴리펩타이드 및/또는 다른 펩타이드(들), 디펩타이드(들), 및/또는 트리펩타이드와 쌍/세트로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 디펩타이드 및 이의 융합체를 암호화하는 핵산 및 벡터가 제공된다. 일부 실시양태에서, 관심 분자 및/또는 관심 단백질은 본원의 디펩타이드에 의해 태그화된다.
일부 실시양태에서, 본원에는 서열번호 23/13, 23/15, 25/13 또는 25/15를 포함하는 β9-10-유사 디펩타이드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에는 서열번호 23/13, 23/15, 25/13 또는 25/15와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 갖는 β8-9-유사 디펩타이드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 디펩타이드는 단독으로 또는 생물발광 복합체의 형성을 위해 상보적 폴리펩타이드 및/또는 다른 펩타이드(들), 디펩타이드(들), 및/또는 트리펩타이드와 쌍/세트로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 디펩타이드는 단독으로 또는 생물발광 복합체의 형성을 위한 상보적 폴리펩타이드 및/또는 다른 펩타이드(들), 디펩타이드(들), 및/또는 트리펩타이드와 쌍/세트로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 디펩타이드 및 이의 융합체를 암호화하는 핵산 및 벡터가 제공된다. 일부 실시양태에서, 관심 분자 및/또는 관심 단백질은 본원의 디펩타이드에 의해 태그화된다.
일부 실시양태에서, 본원에는 서열번호 817-819를 포함하는 β6-8-유사 트리펩타이드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에는 서열번호 817-819와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 갖는 β6-8-유사 트리펩타이드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 트리펩타이드는 단독으로 또는 생물발광 복합체의 형성을 위한 상보적 폴리펩타이드 및/또는 다른 펩타이드(들), 디펩타이드(들), 및/또는 트리펩타이드와 쌍/세트로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 트리펩타이드는 단독으로 또는 생물발광 복합체의 형성을 위한 상보적 폴리펩타이드 및/또는 다른 펩타이드(들), 디펩타이드(들), 및/또는 트리펩타이드와 쌍/세트로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 트리펩타이드 및 이의 융합체를 암호화하는 핵산 및 벡터가 제공된다. 일부 실시양태에서, 관심 분자 및/또는 관심 단백질은 본원의 트리펩타이드에 의해 태그화된다
일부 실시양태에서, 본원에는 서열번호 818/819/23 또는 818/819/25를 포함하는 β7-9-유사 트리펩타이드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에는 서열번호 818/819/23 또는 818/819/25와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 갖는 β7-9-유사 트리펩타이드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 트리펩타이드는 단독으로 또는 생물발광 복합체의 형성을 위한 상보적 폴리펩타이드 및/또는 다른 펩타이드(들), 디펩타이드(들), 및/또는 트리펩타이드와 쌍/세트로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 트리펩타이드는 단독으로 또는 생물발광 복합체의 형성을 위한 상보적 폴리펩타이드 및/또는 다른 펩타이드(들), 디펩타이드(들), 및/또는 트리펩타이드와 쌍/세트로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 트리펩타이드 및 이의 융합체를 암호화하는 핵산 및 벡터가 제공된다. 일부 실시양태에서, 관심 분자 및/또는 관심 단백질은 본원의 트리펩타이드에 의해 태그화된다.
일부 실시양태에서, 본원에는 서열번호 819/23/13, 819/23/15, 819/25/13, 또는 819/25/15를 포함하는 β8-10-유사 트리펩타이드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에는 서열번호 819/23/13, 819/23/15, 819/25/13, 또는 819/25/15와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성을 갖는 β7-9-유사 트리펩타이드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 트리펩타이드는 단독으로 또는 생물발광 복합체의 형성을 위한 상보적 폴리펩타이드 및/또는 다른 펩타이드(들), 디펩타이드(들), 및/또는 트리펩타이드와 쌍/세트로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 트리펩타이드는 단독으로 또는 생물발광 복합체의 형성을 위한 상보적 폴리펩타이드 및/또는 다른 펩타이드(들), 디펩타이드(들), 및/또는 트리펩타이드와 쌍/세트로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 트리펩타이드는 단독으로 또는 생물발광 복합체의 형성을 위한 상보적 폴리펩타이드 및/또는 다른 펩타이드(들), 디펩타이드(들), 및/또는 트리펩타이드와 쌍/세트로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 트리펩타이드 및 이의 융합체를 암호화하는 핵산 및 벡터가 제공된다. 일부 실시양태에서, 관심 분자 및/또는 관심 단백질은 본원의 트리펩타이드에 의해 태그화된다.
일부 실시양태에서, 본원에는 서열번호 23과 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성 및 서열번호 6 및 서열번호 9와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드가 제공되며, 여기서, 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질의 존재 하에 생성된 생물발광 신호는 펩타이드가 서열번호 25로 이루어진 제2 펩타이드 및 서열번호 17, 서열번호 21, 또는 서열번호 302로 이루어진 폴리펩타이드 보체와 접촉하는 경우, 펩타이드 및 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질 단독에 의해 생성된 생물발광 신호에 비해 실질적으로 증가한다. 일부 실시양태에서, 생물발광 신호는 펩타이드가 제2 펩타이드 및 폴리펩타이드 보체와 연합되는 경우에 실질적으로 증가한다. 일부 실시양태에서, 펩타이드는 서열번호 6 및/또는 서열번호 9의 펩타이드에 비해 하나 이상의 특성의 향상을 나타내며, 여기서 특성은 제2 펩타이드 및 폴리펩타이드 보체에 대한 친화도, 또는 제2 펩타이드 및 폴리펩타이드 보체와 조합되는 경우 향상된 발현, 용해도, 안정성, 및/또는 생물발광 활성으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 천연 발생 단백질이 아니고(예를 들어, 서열번호 1이 아님), 이의 돌연변이체 버전이 아니며(예를 들어, 서열번호 3이 아님), 천연 발생 단백질의 단편이 아니고(예를 들어, 서열번호 5-7이 아님), 및 이의 돌연변이체 버전의 단편이 아니다(예를 들어, 서열번호 8-10 중 하나가 아님). 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 비-천연 아미노산, 아미노산 유사체, 및/또는 펩토이드 아미노산을 함유한다. 일부 실시양태에서, 펩타이드는 링커, 반응성 모이어티, 검출 요소(예를 들어, 형광단), 상호작용/결합 요소 등에 화학적으로 접합된다.
일부 실시양태에서, 본원에는 이전 단락에 기재된 펩타이드 및 부가적인 아미노산 서열 또는 화합물(예를 들어, 소분자 약물)을 포함하는 융합 폴리펩타이드(예를 들어, 유전자 융합체(또는 대안적으로 화학적 접합체 또는 합성적으로 생성됨))가 제공된다. 일부 실시양태에서, 부가적인 아미노산 서열은 관심 단백질, 상호작용 요소, 공동국재화 요소, 및/또는 결합 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 부가적인 아미노산 서열은 항체(예를 들어, 다클론성, 단클론성 및/또는 재조합), 항체 단편, 단백질 A, 단백질 A의 Ig 결합 도메인, 단백질 G, 단백질 G의 Ig 결합 도메인, 단백질 A/G, 단백질 A/G의 Ig 결합 도메인, 단백질 L, 단백질 L의 Ig 결합 도메인, 단백질 M, 단백질 M의 Ig 결합 도메인, 펩타이드 핵산, DARPin, 아피머, 정제된 단백질(예를 들어, 분석물 또는 분석물에 결합하는 단백질), 및 단백질의 분석물 결합 도메인(들)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 부가적인 아미노산 서열은 제1 상호작용 폴리펩타이드와 제2 상호작용 폴리펩타이드의 접촉 시에 제2 상호작용 폴리펩타이드와 복합체를 형성하도록 구성된 제1 상호작용 폴리펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 부가적인 아미노산 서열은 세포 구획, 세포, 조직, 또는 유기체 내에서 제2 공동국재화 폴리펩타이드와 함께 공동국재화하도록 구성된 제1 공동국재화 폴리펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 부가적인 아미노산 서열은 관심 단백질이고 후보 약물 표적이다.
일부 실시양태에서, 본원에는 서열번호 25와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성 및 서열번호 7 및 서열번호 10과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드가 제공되며, 여기서 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질의 존재 하에 생성된 생물발광 신호는 펩타이드가 서열번호 23으로 이루어진 제2 펩타이드 및 서열번호 17, 서열번호 21, 또는 서열번호 302로 이루어진 폴리펩타이드 보체와 접촉하는 경우, 펩타이드와 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질 단독에 의해 생성된 생물발광 신호에 비해 실질적으로 증가된다. 일부 실시양태에서, 생물발광 신호는 펩타이드가 제2 펩타이드 및 폴리펩타이드 보체와 연합된 경우 실질적으로 증가된다. 일부 실시양태에서, 펩타이드는 서열번호 7 및/또는 서열번호 10의 펩타이드에 비해 하나 이상의 특성의 향상을 나타내며, 여기서 특성은 제2 펩타이드 및 폴리펩타이드 보체에 대한 친화도 또는 제2 펩타이드 및 폴리펩타이드 보체와 조합된 경우 향상된 발현, 용해도, 안정성 및/또는 생물발광 활성으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 천연 발생 단백질이 아니고(예를 들어, 서열번호 1이 아님), 돌연변이 버전이 아니며(예를 들어, 서열번호 3이 아님), 천연 발생 단백질의 단편이 아니고(예를 들어, 서열번호 5-7이 아님), 이의 돌연변이 버전의 단편이 아니다(예를 들어, 서열번호 8-10 중 하나가 아님). 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 비천연 아미노산, 아미노산 유사체, 및/또는 펩토이드 아미노산을 함유한다. 일부 실시양태에서, 펩타이드는 링커, 반응성 모이어티, 검출 요소(예를 들어, 형광단), 상호작용/결합 요소 등에 화학적으로 접합된다.
일부 실시양태에서, 본원에는 이전 단락에 기재된 펩타이드 및 부가적인 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩타이드(예를 들어, 유전자 융합체, 합성적으로 생성된 융합체, 화학적 접합체, 효소 접합체 등)가 제공된다. 일부 실시양태에서, 부가적인 아미노산 서열은 관심 단백질, 상호작용 요소, 공동국재화 요소, 및 결합 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 부가적인 아미노산 서열은 항체(다클론, 단클론 및/또는 재조합), 항체 단편, 단백질 A, 단백질 A의 Ig 결합 도메인, 단백질 G, 단백질 G의 Ig 결합 도메인, 단백질 A/G, 단백질 A/G의 Ig 결합 도메인, 단백질 L, 단백질 L의 Ig 결합 도메인, 단백질 M, 단백질 M의 Ig 결합 도메인, 펩타이드 핵산, DARPin, 아피머, 정제된 단백질(분석물 자체 또는 분석물에 결합하는 단백질), 및 단백질의 분석물 결합 도메인(들)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 부가적인 아미노산 서열은 제1 상호작용 폴리펩타이드 및 제2 상호작용 폴리펩타이드의 접촉 시에 제2 상호작용 폴리펩타이드와 복합체를 형성하도록 구성된 제1 상호작용 폴리펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 부가적인 아미노산 서열은 제2 공동국재화 폴리펩타이드와 함께 세포 구획, 세포, 조직 또는 유기체 내에서 공동국재화하도록 구성된 제1 공동국재화 폴리펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 부가적인 아미노산 서열은 관심 단백질이고 후보 약물 표적이다.
일부 실시양태에서, 본원에는 (a) 서열번호 25와 40% 초과(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)지만, 100% 미만인 서열 동일성, 및 서열번호 7 및 서열번호 10과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 펩타이드; 및 (b) 서열번호 23과 40% 초과(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)지만, 100% 미만인 서열 동일성, 및 서열번호 6, 서열번호 9 및 서열번호 29와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 펩타이드를 포함하는 조성물이 제공되며; 여기서 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질의 존재 하에 생성된 생물발광 신호는 제1 펩타이드가 제2 펩타이드 및 서열번호 17, 서열번호 21, 또는 서열번호 302로 이루어진 폴리펩타이드 보체와 접촉하는 경우, 제1 펩타이드 및/또는 제2 펩타이드와 코엘렌테라진 기질 단독에 의해 생성된 생물발광 신호에 비해 실질적으로 증가된다. 일부 실시양태에서, 생물발광 신호는 제1 펩타이드가 제2 펩타이드 및 폴리펩타이드 보체와 연합된 경우 실질적으로 증가된다. 일부 실시양태에서, 제1 펩타이드는 서열번호 7 및/또는 서열번호 10의 펩타이드에 비해 하나 이상의 특성의 향상을 나타내며, 제2 펩타이드는 서열번호 6, 서열번호 9, 및 서열번호 29의 펩타이드에 비해 하나 이상의 특성의 향상을 나타내고, 여기서 특성은 제2 펩타이드 및 폴리펩타이드 보체에 대한 친화도 또는 제2 펩타이드 및 폴리펩타이드 보체와 조합된 경우 향상된 발현, 용해도, 안정성 및/또는 생물발광 활성으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제1 펩타이드 및/또는 제2 펩타이드의 아미노산 서열은 천연 발생 단백질이 아니고, 이의 단편이 아니다. 일부 실시양태에서, 제1 펩타이드 및/또는 제2 펩타이드의 아미노산 서열은 비천연 아미노산, 아미노산 유사체, 및/또는 펩토이드 아미노산을 함유한다.
일부 실시양태에서, 본원에는 이전 단락에 기재된 제1 및 제2 펩타이드 및 부가적인 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 부가적인 아미노산 서열은 관심 단백질, 상호작용 요소, 공동국재화 요소, 및 결합 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 부가적인 아미노산 서열은 항체(다클론, 단클론 및/또는 재조합), 항체 단편, 단백질 A, 단백질 A의 Ig 결합 도메인, 단백질 G, 단백질 G의 Ig 결합 도메인, 단백질 A/G, 단백질 A/G의 Ig 결합 도메인, 단백질 L, 단백질 L의 Ig 결합 도메인, 단백질 M, 단백질 M의 Ig 결합 도메인, 펩타이드 핵산, DARPin, 아피머, 정제된 단백질(분석물 자체 또는 분석물에 결합하는 단백질), 및 단백질의 분석물 결합 도메인(들)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 부가적인 아미노산 서열은 제1 상호작용 폴리펩타이드 및 제2 상호작용 폴리펩타이드의 접촉 시에 제2 상호작용 폴리펩타이드와 복합체를 형성하도록 구성된 제1 상호작용 폴리펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 부가적인 아미노산 서열은 제2 공동국재화 폴리펩타이드와 함께 세포 구획, 세포, 조직 또는 유기체 내에 공동국재화하도록 구성된 제1 공동국재화 폴리펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 부가적인 아미노산 서열은 관심 단백질이고 후보 약물 표적이다.
일부 실시양태에서, 본원에는 서열번호 17, 서열번호 21, 또는 서열번호 302와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성 및 서열번호 5 및 서열번호 8과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질의 존재 하에 생성된 생물발광 신호는 서열번호 23으로 이루어지는 제1 펩타이드 및 서열번호 25로 이루어지는 제2 펩타이드와 접촉하는 경우, 펩타이드와 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질 단독에 의해 생성된 생물발광 신호와 비교하여 실질적으로 증가된다. 일부 실시양태에서, 생물발광 신호는 폴리펩타이드가 제1 및 제2 펩타이드와 연합될 때 실질적으로 증가된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 5 및/또는 서열번호 8의 폴리펩타이드와 비교하여 하나 이상의 특성의 향상을 나타내며, 여기서 특성은 제1 및/또는 제2 펩타이드에 대한 친화도 또는 제1 및 제2 펩타이드와 조합될 때 향상된 발현, 용해도, 안정성 및/또는 생물발광 활성으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 천연 발생 단백질이 아니고(예를 들어, 서열번호 1이 아님), 이의 돌연변이 버전이 아니며(예를 들어, 서열번호 3이 아님), 천연 발생 단백질의 단편이 아니고(예를 들어, 서열번호 5-7이 아님), 그리고 이의 돌연변이 버전의 단편이 아니다(예를 들어, 서열번호 8-10 중 하나가 아님). 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 비천연 아미노산, 아미노산 유사체, 및/또는 펩토이드 아미노산을 함유한다.
일부 실시양태에서, 본원에는 이전 단락에 기재된 폴리펩타이드 및 부가적인 아미노산 서열, 핵산 서열, 또는 다른 융합되거나 첨부된 분자를 포함하는 융합 폴리펩타이드(예를 들어, 유전자 융합체, 합성적으로 생성된 융합체, 화학적 접합체, 효소 접합체 등)가 제공된다. 일부 실시양태에서, 부가적인 서열 또는 다른 분자는 관심 단백질, 상호작용 요소, 공동국재화 요소, 및 결합 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 부가적인 서열 또는 다른 분자는 항체(다클론, 단클론 및/또는 재조합), 항체 단편, 단백질 A, 단백질 A의 Ig 결합 도메인, 단백질 G, 단백질 G의 Ig 결합 도메인, 단백질 A/G, 단백질 A/G의 Ig 결합 도메인, 단백질 L, 단백질 L의 Ig 결합 도메인, 단백질 M, 단백질 M의 Ig 결합 도메인, 펩타이드 핵산, DARPin, 아피머, 정제된 단백질(분석물 자체 또는 분석물에 결합하는 단백질) 및 단백질의 분석물 결합 도메인(들)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 부가적인 서열 또는 다른 융합되거나 첨부된 분자는 제1 상호작용 폴리펩타이드 및 제2 상호작용 폴리펩타이드의 접촉 시에 제2 상호작용 폴리펩타이드와 복합체를 형성하도록 구성된 제1 상호작용 폴리펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 부가적인 서열 또는 다른 융합되거나 첨부된 분자는 세포 구획, 세포, 조직, 또는 유기체 내에서 제2 공동국재화 폴리펩타이드와 공동국재화하도록 구성된 제1 공동국재화 폴리펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 부가적인 서열 또는 다른 융합되거나 첨부된 분자는 관심 단백질이고 후보 약물 표적이다.
일부 실시양태에서, 본원에는 서열번호 17, 서열번호 21, 및/또는 서열번호 302와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성 및 서열번호 5 및 서열번호 8과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질의 존재 하에 생성된 생물발광 신호는 폴리펩타이드가 서열번호 23으로 이루어진 제1 펩타이드 및 서열번호 25로 이루어진 제2 펩타이드와 접촉할 때, 펩타이드 및 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질 단독에 의해 생성된 생물발광 신호와 비교하여 실질적으로 증가된다. 일부 실시양태에서, 생물발광 신호는 폴리펩타이드가 제1 및 제2 펩타이드와 연합될 때 실질적으로 증가된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 5 및/또는 서열번호 8의 폴리펩타이드와 비교하여 하나 이상의 특성의 향상을 나타내며, 여기서 특성은 제1 및/또는 제2 펩타이드에 대한 친화도 또는 제1 및 제2 펩타이드와 조합되는 경우 향상된 발현, 용해도, 안정성 및/또는 생물발광 활성으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 천연 발생 단백질이 아니고(예를 들어, 서열번호 1이 아님), 이의 돌연변이 버전이 아니며(예를 들어, 서열번호 3이 아님), 천연 발생 단백질의 단편이 아니고(예를 들어, 서열번호 5-7이 아님), 이의 돌연변이 버전의 단편이 아니다(예를 들어, 서열번호 8-10 중 하나가 아님). 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 비천연 아미노산, 아미노산 유사체, 및/또는 펩토이드 아미노산을 함유한다.
일부 실시양태에서, 본원에는 이전 단락에 기재된 펩타이드 및 부가적인 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩타이드(예를 들어, 유전자 융합체, 합성적으로 생성된 융합체, 화학적 접합체, 효소 접합체 등)가 제공된다. 일부 실시양태에서, 부가적인 아미노산 서열은 관심 단백질, 상호작용 요소, 공동국재화 요소, 및 결합 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 부가적인 아미노산 서열은 항체(다클론, 단클론 및/또는 재조합), 항체 단편, 단백질 A, 단백질 A의 Ig 결합 도메인, 단백질 G, 단백질 G의 Ig 결합 도메인, 단백질 A/G, 단백질 A/G의 Ig 결합 도메인, 단백질 L, 단백질 L의 Ig 결합 도메인, 단백질 M, 단백질 M의 Ig 결합 도메인, 펩타이드 핵산, DARPin, 아피머, 정제된 단백질(분석물 자체 또는 분석물에 결합하는 단백질) 및 단백질의 분석물 결합 도메인(들)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 부가적인 아미노산 서열은 제1 상호작용 폴리펩타이드 및 제2 상호작용 폴리펩타이드의 접촉 시에 제2 상호작용 폴리펩타이드와 복합체를 형성하도록 구성된 제1 상호작용 폴리펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 부가적인 아미노산 서열은 세포 구획, 세포, 조직, 또는 유기체 내에서 제2 공동국재화 폴리펩타이드와 함께 공동국재화하도록 구성된 제1 공동국재화 폴리펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 부가적인 아미노산 서열은 관심 단백질이고 후보 약물 표적이다.
일부 실시양태에서, 본원에는 서열번호 35와 40% 초과(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)지만, 서열번호 35와 100% 미만의 서열 동일성 및 서열번호 205 및 서열번호 206과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 β9/β10-유사 디펩타이드가 제공되며, 여기서 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질의 존재 하에 생성된 생물발광 신호는 펩타이드가 서열번호 17, 서열번호 21 또는 서열번호 302로 이루어진 폴리펩타이드 보체와 접촉하는 경우, 펩타이드와 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질 단독에 의해 생성된 발광 신호에 비해 실질적으로 증가된다. 일부 실시양태에서, 디펩타이드(예를 들어, β9/β10-유사 디펩타이드)는 촉진 없이(예를 들어, 상호작용 요소로 인한 것), 본원에 기재된 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-8-유사 폴리펩타이드)과 연합된다(예를 들어, 생물발광 복합체를 형성함). 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 디펩타이드(예를 들어, β9/β10-유사 디펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-8-유사 폴리펩타이드)은 촉진 없이(예를 들어, 상호작용 요소로 인한 것) 생물발광 복합체를 형성하지 않을 것이지만, 적절한 상호작용 요소로 인한 촉진에 의해 연합될 것이다(예를 들어, 생물발광 복합체 형성). 일부 실시양태에서, 생물발광 신호는 펩타이드가 폴리펩타이드 보체와 연합될 때 실질적으로 증가된다. 일부 실시양태에서, 펩타이드는 서열번호 205 및/또는 서열번호 206의 펩타이드와 비교하여 하나 이상의 특성의 향상을 나타내며, 여기서 특성은 폴리펩타이드 보체에 대한 친화도 또는 폴리펩타이드 보체와 조합될 때 향상된 발현, 용해도, 안정성 및/또는 생물발광 활성으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 천연 발생 단백질 또는 이의 단편이 아니다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 비천연 아미노산, 아미노산 유사체, 및/또는 펩토이드 아미노산을 함유한다.
일부 실시양태에서, 본원에는, 본원에 기재된 β9/β10-유사 디펩타이드 및 부가적인 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩타이드(예를 들어, 유전자 융합체, 합성적으로 생성된 융합체, 화학적 접합체, 효소 접합체 등)가 제공된다. 일부 실시양태에서, 부가적인 아미노산 서열은 관심 단백질, 상호작용 요소, 공동국재화 요소, 및 결합 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 부가적인 아미노산 서열 또는 다른 융합되거나 첨부된 분자는 항체(다클론, 단클론 및/또는 재조합), 항체 단편, 단백질 A, 단백질 A의 Ig 결합 도메인, 단백질 G, 단백질 G의 Ig 결합 도메인, 단백질 A/G, 단백질 A/G의 Ig 결합 도메인, 단백질 L, 단백질 L의 Ig 결합 도메인, 단백질 M, 단백질 M의 Ig 결합 도메인, 펩타이드 핵산, DARPin, 아피머, 정제된 단백질(분석물 자체 또는 분석물에 결합하는 단백질) 및 단백질의 분석물 결합 도메인(들)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 부가적인 아미노산 서열 또는 다른 융합되거나 첨부된 분자는 제1 상호작용 폴리펩타이드 및 제2 상호작용 폴리펩타이드의 접촉 시에 제2 상호작용 폴리펩타이드와 복합체를 형성하도록 구성된 제1 상호작용 폴리펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 부가적인 아미노산 서열 또는 다른 융합되거나 첨부된 분자는 세포 구획, 세포, 조직, 또는 유기체 내에서 제2 공동국재화 폴리펩타이드와 공동국재화하도록 구성된 제1 공동국재화 폴리펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 부가적인 아미노산 서열 또는 다른 융합되거나 첨부된 분자는 관심 단백질이고 후보 약물 표적이다.
일부 실시양태에서, 본원에는, 본원에 기재된 펩타이드, 폴리펩타이드, 및/또는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및/또는 벡터가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에는, 본원에 기재된 펩타이드, 폴리펩타이드, 및/또는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및/또는 벡터를 발현하는 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 펩타이드, 폴리펩타이드, 및/또는 융합 폴리펩타이드의 합성 생산이 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 펩타이드, 폴리펩타이드, 및/또는 융합 폴리펩타이드는 추가 모이어티(예를 들어, 상호작용 요소, 공동국재화 요소, 관심 단백질, 관심 분자 등)에 화학적으로 접합된다.
일부 실시양태에서, 본원에는 (a) 서열번호 17, 서열번호 21 또는 서열번호 302와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성 및 서열번호 5 및 서열번호 8과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드; (b) 서열번호 23과 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성 및 서열번호 6 및 서열번호 9와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 펩타이드; 및 (c) 서열번호 25와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성 및 서열번호 7 및 서열번호 10과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 펩타이드를 포함하는 생물발광 복합체가 제공되며; 여기서 생물발광 복합체는 폴리펩타이드 단독, 제1 펩타이드 단독, 제2 펩타이드 단독, 및 폴리펩타이드, 제1 펩타이드, 및 제2 펩타이드 중 임의의 2가지의 존재 하의 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질과 비교할 때, 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질의 존재 하에 실질적으로 증가된 생물발광을 생성한다. 일부 실시양태에서, 제1 펩타이드는 제1 펩타이드 태그이고, 여기서 제2 펩타이드는 제2 펩타이드 태그이고, 제1 및 제2 펩타이드 태그는 관심 분자, 관심 펩타이드, 관심 단백질, 상호작용 요소, 공동국재화 요소, 또는 결합 모이어티로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 모이어티에 각각 연결된다. 일부 실시양태에서, 제1 펩타이드 태그 또는 제2 펩타이드 태그는 약물 또는 약물 후보에 연결되고, 다른 펩타이드 태그는 약물 표적 또는 후보 약물 표적에 연결되며, 여기서 생물발광 복합체로부터의 생물발광 강도는 약물 표적 또는 후보 약물 표적에 대한 약물 또는 약물 후보의 친화도와 상관관계가 있다. 일부 실시양태에서, 제1 펩타이드 태그는 제1 상호작용 요소에 연결되고, 제2 펩타이드 태그는 제2 상호작용 요소에 연결되며, 여기서 생물발광 복합체로부터의 생물발광 강도는 상호작용(상호작용 요소 간에)의 부재 하에, 검정되는 조건 하에서 제2 상호작용 요소에 대한 제1 상호작용 요소의 친화도와 상관관계가 있다(예를 들어, 일부 실시양태에서, 제1 펩타이드, 제2 펩타이드, 폴리펩타이드 성분 및 기질의 조합은 상호작용 요소 간에 상호작용이 없으면 생물발광 복합체 형성(및 유의적인 광 출력(예를 들어, 배경 초과) 생성)을 하지 못함). 일부 실시양태에서, 제1 펩타이드 태그는 제1 공동국재화 요소에 연결되고, 제2 펩타이드 태그는 제2 공동국재화 요소에 연결되며, 여기서 실질적으로 증가된 생물발광은 검정된 조건하에서 제1 공동국재화 요소와 제2 공동국재화 요소의 공동국재화를 나타내지만 반드시 상호작용하는 것은 아니다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 펩타이드 및 폴리펩타이드는 더 큰(예를 들어, 기존) 단백질의 단편이 아니다. 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 하나 이상의 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 더 큰(예를 들어, 기존) 단백질의 단편이다.
일부 실시양태에서, 본원에는 (a) (i) 서열번호 23과 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성 및 서열번호 6 및 서열번호 9와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 펩타이드, (ii) 서열번호 25와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성 및 서열번호 7 및 서열번호 10과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 펩타이드, (iii) 서열번호 17, 서열번호 21, 또는 서열번호 302와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성 및 서열번호 5 및 서열번호 8과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 성분, 여기서 제1 펩타이드 태그, 제2 펩타이드 태그, 및 폴리펩타이드 성분은 제1 분자 실체 및 제2 분자 실체의 상호작용 시에 생물발광 복합체를 생성하도록 구성됨, 및 (iv) 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질을 조합하는 단계; 및 (b) 발광을 검출하는 단계로서, 여기서 폴리펩타이드 성분과 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 단독에 의해 생성된 발광 수준과 비교하여 더 큰 발광 수준은 폴리펩타이드 성분과 제1 및 제2 펩타이드의 생물발광 복합체의 형성을 나타내는 것인 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 폴리펩타이드 성분 및 제1 및 제2 펩타이드는 세포에서 발현되고, 외인성으로 세포에 첨가되고/거나, 샘플에 첨가된다.
일부 실시양태에서, 본원에는 제1 분자 실체와 제2 분자 실체 사이의 상호작용을 검출하는 방법이 제공되며, 이 방법은 (a) 서열번호 23과 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성 및 서열번호 6 및 서열번호 9와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 펩타이드 태그에 의해 제1 분자 실체를 태그화하는 단계; (b) 서열번호 25와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성 및 서열번호 7 및 서열번호 10과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 펩타이드 태그에 의해 제2 분자 실체를 태그화하는 단계; (c) 태그화된 제1 분자 실체와 태그화된 제2 분자 실체를 조합하는 단계; (d) 서열번호 17, 서열번호 21, 또는 서열번호 302와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성 및 서열번호 5 및 서열번호 8과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 성분을 첨가하는 단계로서, 여기서 제1 펩타이드 태그, 제2 펩타이드 태그, 및 폴리펩타이드 성분은 제1 분자 실체와 제2 분자 실체의 상호작용 시에 생물발광 복합체를 생성하도록 구성되는 단계; (e) 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질을 첨가하는 단계; 및 (f) 생물발광 복합체에 의해 생성된 발광 신호를 검출하는 단계로서, 여기서 발광 신호의 크기는 제1 분자 실체와 제2 분자 실체 사이의 상호작용(들)의 수, 강도, 선호도, 및/또는 또는 안정성과 상관관계가 있는(예를 들어, 비례하는, 정비례하는 등) 것인 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결과적으로 생성된 생물발광 복합체의 촉매 효율, 기질 전환율 및/또는 비활성은 제1 분자 실체와 제2 분자 실체 사이의 상호작용(들)의 수, 강도, 선호도 및/또는 안정성과 상관관계가 있다(예를 들어, 비례, 정비례 등). 일부 실시양태에서, 제1 분자 실체 및/또는 제2 분자 실체는 관심 단백질 또는 관심 펩타이드이고, 태그화는 제1 분자 실체 및/또는 제2 분자 실체와 제1 펩타이드 태그 및/또는 제2 펩타이드 태그의 융합체(또는 합성 접합체)를 생성하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 분자 실체 및/또는 제2 분자 실체는 소분자이고, 태그화는 제1 분자 실체 및/또는 제2 분자 실체를 제1 펩타이드 태그 및/또는 제2 펩타이드 태그와 직접 또는 간접적으로 연결하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 분자 실체 및 제2 분자 실체 중 하나는 약물 또는 약물 후보이고, 다른 하나는 약물 표적 또는 후보 약물 표적이며, 생물발광 신호는 약물 표적 또는 후보 약물 표적인 다른 하나에 대한 약물 또는 약물 후보의 결합을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 태그화된 제1 분자 실체 및 태그화된 제2 분자 실체의 조합은 세포 내에서 하나 또는 둘 모두를 발현시키는 것 및/또는 세포에 하나 또는 둘 모두를 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 태그화된 제1 분자 실체와 태그화된 제2 분자 실체의 조합은 시험관내, 비-세포 샘플 등에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 약물 표적 또는 후보 약물 표적에 대한 약물 또는 후보 약물의 친화도는 시스템 내로 비표지된 약물 표적 또는 후보 약물 표적을 적정함으로써 본원의 시스템 및 방법을 사용하여 결정한다. 일부 실시양태에서, 단계 (a)-(f) 중 2개 이상은 동시에 수행된다. 일부 실시양태에서, 단계 (a)-(f) 중 2개 이상은 별도로 수행된다.
일부 실시양태에서, 본원에는 제1 분자 실체와 제2 분자 실체 사이의 상호작용을 검출하기 위해 경쟁 검정을 수행하는 방법이 제공되며, 이 방법은 (a) (i) 서열번호 23과 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%)의 서열 동일성 및 서열번호 6 및 서열번호 9와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 펩타이드 태그에 의해 태그화된 제1 분자 실체를 포함하는 트레이서, (ii) 서열번호 25와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성 및 서열번호 7 및 서열번호 10과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 펩타이드 태그에 의해 태그화된 제2 분자 실체, (iii) 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질, (iv) 서열번호 17, 서열번호 21, 또는 서열번호 302와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성 및 서열번호 5 및 서열번호 8과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 성분, 및 (v) 태그화되지 않은 제1 분자 실체를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 조합하는 단계로서, 여기서 제1 펩타이드 태그, 제2 펩타이드 태그, 및 폴리펩타이드 성분은 생물발광 복합체를 생성하고 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질의 존재 하에 생물발광 신호를 생성하도록 구성되는 단계; (b) 생물발광 복합체에 의해 생성된 생물발광 신호를 검출하는 단계; 및 (c) 샘플의 존재 하에 생성된 생물발광 신호를 샘플의 부재 하에 생성된 대조군 생물발광 신호와 비교하는 단계로서, 여기서 생물발광 신호의 감소는 샘플 내 태그화되지 않은 제1 분자 실체의 존재 또는 양을 나타내는 것인 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 분자 실체는 소분자 또는 펩타이드(예를 들어, 약물 또는 후보 약물)이다. 일부 실시양태에서, 제2 분자 실체는 약물 표적 또는 후보 약물 표적(예를 들어, 단백질)이다.
일부 실시양태에서, 본원에는 세포 내에서 제1 단백질, 펩타이드, 또는 분자 실체와 제2 단백질, 펩타이드 또는 분자 실체 사이의 상호작용을 검출하는 방법이 제공되며, 이 방법은 (a) 제1 단백질, 펩타이드, 또는 분자 실체 및 서열번호 23과 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성 및 서열번호 6 및 서열번호 9와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 펩타이드 태그를 포함하는 융합체(예를 들어, 유전자 융합체, 합성 융합체, 화학적 접합체 등)를 세포 내에서 발현시키는(또는 세포 또는 다른 시스템(예를 들어, 비-세포 샘플)에 첨가하는) 단계; (b) 제2 단백질, 펩타이드, 또는 분자 실체 및 서열번호 25와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성 및 서열번호 7 및 서열번호 10과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 펩타이드 태그를 포함하는 융합체(예를 들어, 유전자 융합체, 합성 융합체, 화학적 접합체 등)를 세포 내에서 발현시키는(또는 세포 또는 다른 시스템(예를 들어, 비-세포 샘플)에 첨가하는) 단계; (c) 서열번호 17, 서열번호 21, 또는 서열번호 302와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성 및 서열번호 5 및 서열번호 8과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 성분을 세포 내에서 발현시키는(또는 세포 또는 다른 시스템(예를 들어, 비-세포 샘플)에 첨가하는) 단계로서, 여기서 제1 펩타이드 태그, 제2 펩타이드 태그, 및 폴리펩타이드 성분은 제1 단백질, 펩타이드, 또는 분자 실체와 제2 단백질, 펩타이드, 또는 분자 실체의 상호작용 시에, 생물발광 복합체를 생성하도록 구성되는 단계; (d) 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질을 세포에 첨가하는 단계; 및 (e) 생물발광 복합체에 의해 생성된 발광 신호를 검출하는 단계로서, 발광 신호의 크기는 제1 단백질, 펩타이드 또는 분자 실체와 제2 단백질, 펩타이드 또는 분자 실체 사이의 상호작용 강도와 상관관계가 있는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (a)-(e) 중 2개 이상은 동시에 수행된다. 일부 실시양태에서, 단계 (a)-(e) 중 2개 이상은 별도로 수행된다.
일부 실시양태에서, 본원에는 제1 분자 실체와 제2 분자 실체의 공동국재화를 검출하는 방법이 제공되며, 이 방법은 (a) 서열번호 23과 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성 및 서열번호 6 및 서열번호 9와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 펩타이드 태그를 이용하여 제1 분자 실체를 태그화하는 단계; (b) 서열번호 25와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성 및 서열번호 7 및 서열번호 10과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 펩타이드 태그를 이용하여 제2 분자 실체를 태그화하는 단계; (c) 태그화된 제1 분자 실체와 태그화된 제2 분자 실체를 동일한 시스템에서 조합하는 단계; (d) 이 시스템에 폴리펩타이드 성분을 첨가하는 단계로서, 폴리펩타이드 성분은 서열번호 17, 서열번호 21, 또는 서열번호 302와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성 및 서열번호 5 및 서열번호 8과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 제1 펩타이드 태그, 제2 펩타이드 태그, 및 폴리펩타이드 성분은 제1 분자 실체 및 제2 분자 실체의 공동국재화 시에 생물발광 복합체를 생성하도록 구성되는, 단계; (e) 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질을 시스템에 첨가하는 단계; 및 (f) 생물발광 복합체에 의해 생성된 발광 신호를 검출하는 단계로서, 여기서 배경 초과의 발광 신호의 존재는 시스템 내에서 제1 분자 실체와 제2 분자 실체의 공동국재화를 나타내고/내거나, 발광 신호의 크기는 제1 분자 실체와 제2 분자 실체의 시스템 내 공동국재화의 양과 상관관계가 있는, 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 시스템은 세포, 조직, 기관, 또는 전체 유기체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 분자 실체 및/또는 제2 분자 실체는 관심 단백질 또는 관심 펩타이드이고, 태그화는 제1 분자 실체 및/또는 제2 분자 실체와 제1 펩타이드 태그 및/또는 제2 펩타이드 태그의 융합체(예를 들어, 유전자 융합체, 합성 융합체, 화학적 접합체, 효소 접합체 등)를 생성하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 분자 실체 및/또는 제2 분자 실체는 소분자이고 태그화는 제1 분자 실체 및/또는 제2 분자 실체를 제1 펩타이드 태그 및/또는 제2 펩타이드 태그와 직접 또는 간접적으로 연결하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 태그화된 제1 분자 실체와 태그화된 제2 분자 실체를 조합하는 것은 시험관내, 비세포 샘플 등에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 태그화된 제1 분자 실체 및 태그화된 제2 분자 실체를 조합하는 것은 시스템 내에서 하나 또는 둘 모두를 발현하는 것 및/또는 시스템에 하나 또는 둘 모두를 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (a)-(f) 중 2가지 이상은 동시에 수행된다. 일부 실시양태에서, 단계 (a)-(f) 중 2가지 이상은 별도로 수행된다.
일부 실시양태에서, 본원에는 세포 내에서 제1 단백질, 펩타이드, 또는 분자 실체와 제2 단백질, 펩타이드, 또는 분자 실체의 공동국재화를 검출하는 방법이 제공되며, 이 방법은 (a) 제1 단백질 또는 펩타이드 실체 및 서열번호 23과 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성 및 서열번호 6 및 서열번호 9와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 펩타이드 태그를 포함하는 융합체를 세포 내에서 발현시키는 단계; (b) 제2 단백질 또는 펩타이드 실체 및 서열번호 25와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성 및 서열번호 7 및 서열번호 10과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 펩타이드 태그를 포함하는 융합체를 세포 내에서 발현시키는 단계; (c) 세포를 이용하여 서열번호 17, 서열번호 21, 및/또는 서열번호 302와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성 및 서열번호 5 및 서열번호 8과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 성분을 발현시키는 단계로서, 제1 펩타이드 태그, 제2 펩타이드 태그, 및 폴리펩타이드 성분은 제1 단백질 또는 펩타이드 실체와 제2 단백질 또는 펩타이드 실체의 공동국재화 시에, 생물발광 복합체를 생성하도록 구성되는, 단계; (d) 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질을 세포에 첨가하는 단계; 및 (e) 생물발광 복합체에 의해 생성된 발광 신호를 검출하는 단계로서, 여기서 배경 초과의 발광 신호의 존재는 세포 내에서 제1 단백질 또는 펩타이드 실체와 제2 단백질 또는 펩타이드 실체의 공동국재화를 나타내고/내거나, 발광 신호의 크기는 제1 단백질 또는 펩타이드 실체와 제2 단백질 또는 펩타이드 실체의 시스템 내 공동국재화의 양과 상관관계가 있는, 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (a)-(e) 중 2가지 이상은 동시에 수행된다. 일부 실시양태에서, 단계 (a)-(e)의 2가지 이상은 별도로 수행된다.
일부 실시양태에서, 본원에는 (a) 서열번호 23과 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성 및 서열번호 6 및 서열번호 9와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 펩타이드 태그에 접합된 제1 결합 모이어티; 및 (b) 서열번호 25와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성 및 서열번호 7 및 서열번호 10과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 펩타이드 태그에 접합된 제2 결합 모이어티를 포함하는 키트가 제공된다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 결합 모이어티는 항체(예를 들어, 다클론, 단클론 및/또는 재조합), 항체 단편, 단백질 A, 단백질 A의 Ig 결합 도메인, 단백질 G, 단백질 G의 Ig 결합 도메인, 단백질 A/G, 단백질 A/G의 Ig 결합 도메인, 단백질 L, 단백질 L의 Ig 결합 도메인, 단백질 M, 단백질 M의 Ig 결합 도메인, 올리고뉴클레오타이드 프로브, 펩타이드 핵산, DARPin, 압타머, 아피머, 정제된 단백질(분석물 자체 또는 분석물에 결합하는 단백질) 및 단백질의 분석물 결합 도메인(들)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 결합 모이어티는 동일한 표적 실체 상의 항원, 에피토프 또는 서열에 결합하도록 구성된 1차 결합 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 결합 모이어티는 1차 결합 모이어티 상의 항원, 에피토프 또는 서열에 결합하도록 구성된 2차 결합 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 키트는 서열번호 17, 서열번호 21, 및/또는 서열번호 302와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성 및 서열번호 5 및 서열번호 8과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 시약을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에는 제1 항원, 에피토프 또는 서열 및 별개의 제2 항원, 에피토프 또는 서열을 표시하는 표적 분자를 검출하는 방법이 제공되며, 이 방법은 (a) 표적 분자를 함유하는 샘플을 (i) 제1 항원, 에피토프 또는 서열을 인식하는 제1의 1차 결합 모이어티 및 (ii) 제2 항원, 에피토프 또는 서열을 인식하는 제2의 1차 결합 모이어티와 접촉시키고 제1 및 제2의 1차 결합 모이어티가 제1 및 제2 항원, 에피토프 또는 서열에 결합하도록 하는 단계; (b) 샘플을 (i) 제1 펩타이드 태그에 접합 또는 융합된 제1의 2차 결합 모이어티 및 (ii) 제2 펩타이드 태그에 접합 또는 융합된 제2의 2차 결합 모이어티와 접촉시키되, 여기서 제1의 2차 결합 모이어티는 제1의 1차 결합 모이어티를 인식하고, 제2의 2차 결합 모이어티는 제2의 1차 결합 모이어티를 인식하며, 제1 또는 제2 펩타이드 태그는 서열번호 23과 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성(및 서열번호 6 및 서열번호 9와 100% 미만의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 제1 또는 제2 펩타이드 태그 중 다른 하나는 서열번호 25와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성(및 서열번호 7 및 서열번호 10과 100% 미만의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것이며, 제1 및 제2의 2차 결합 모이어티가 제1 및 제2의 1차 결합 모이어티에 결합하도록 하는 단계; (c) 샘플을 서열번호 17, 서열번호 21, 및/또는 서열번호 302와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성(및 서열번호 5 및 서열번호 8과 100% 미만의 서열 동일성)을 갖는 폴리펩타이드 성분과 접촉시키는 단계로서, 여기서 제1 펩타이드 태그, 제2 펩타이드 태그, 및 폴리펩타이드 성분은 상호작용 시에 생물발광 복합체를 생성하도록 구성되는 단계; (d) 샘플을 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질과 접촉시키는 단계; 및 (e) 생물발광 복합체에 의해 생성된 발광 신호를 검출하는 단계로서, 배경 초과의 발광 신호의 존재는 표적 분자의 존재를 나타내고, 및/또는 발광 신호의 크기는 샘플 내 표적 분자의 양과 상관관계가 있는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합 모이어티는 항체(다클론, 단클론, 및/또는 재조합), 항체 단편, 단백질 A, 단백질 A의 Ig 결합 도메인, 단백질 G, 단백질 G의 Ig 결합 도메인, 단백질 A/G, 단백질 A/G의 Ig 결합 도메인, 단백질 L, 단백질 L의 Ig 결합 도메인, 단백질 M, 단백질 M의 Ig 결합 도메인, 올리고뉴클레오타이드 프로브, 펩타이드 핵산, DARPin, 압타머, 아피머, 정제된 단백질(분석물 자체 또는 분석물에 결합하는 단백질) 및 단백질의 분석물 결합 도메인(들)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시양태에서, 표적 분자는 단백질, 펩타이드, 핵산, 화학물질 또는 약물이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 시험관내 또는 생체내에 있다.
일부 실시양태에서, 본원에는 제1 항원, 에피토프 또는 서열 및 별개의 제2 항원, 에피토프 또는 서열을 표시하는 표적 분자를 검출하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 샘플을 (i) 제1 펩타이드 태그에 접합되거나 융합된 제1 결합 모이어티 및 (ii) 제2 펩타이드 태그에 접합되거나 융합된 제2 결합 모이어티와 접촉시키되, 여기서 제1 결합 모이어티는 제1 항원, 에피토프 또는 서열을 인식하고, 제2 결합 모이어티는 제2 항원, 에피토프, 또는 서열을 인식하며, 제1 또는 제2 펩타이드 태그는 서열번호 23과 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성(및 서열번호 6 및 서열번호 9와 100% 미만의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 제1 또는 제2 펩타이드 태그 중 다른 하나는 서열번호 25와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성(및 서열번호 7 및 서열번호 10과 100% 미만의 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것이며, 제1 및 제2의 결합 모이어티가 제1 및 제2의 항원, 에피토프, 또는 서열에 결합하도록 하는 단계; (c) 샘플을 서열번호 17, 서열번호 21, 및/또는 서열번호 302와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성(및 서열번호 5 및 서열번호 8과 100% 미만의 서열 동일성)을 갖는 폴리펩타이드 성분과 접촉시키는 단계로서, 여기서 제1 펩타이드 태그, 제2 펩타이드 태그, 및 폴리펩타이드 성분은 상호작용 시에 생물발광 복합체를 생성하도록 구성되는 단계; (d) 샘플을 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질과 접촉시키는 단계; 및 (e) 생물발광 복합체에 의해 생성된 발광 신호를 검출하는 단계로서, 배경 초과의 발광 신호의 존재는 표적 분자의 존재를 나타내고, 및/또는 발광 신호의 크기는 샘플 내 표적 분자의 양과 상관관계가 있는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합 모이어티는 항체(다클론, 단클론, 및/또는 재조합), 항체 단편, 단백질 A, 단백질 A의 Ig 결합 도메인, 단백질 G, 단백질 G의 Ig 결합 도메인, 단백질 A/G, 단백질 A/G의 Ig 결합 도메인, 단백질 L, 단백질 L의 Ig 결합 도메인, 단백질 M, 단백질 M의 Ig 결합 도메인, 올리고뉴클레오타이드 프로브, 펩타이드 핵산, DARPin, 압타머, 아피머, 정제된 단백질(분석물 자체 또는 분석물에 결합하는 단백질), 및 단백질의 분석물 결합 도메인(들)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시양태에서, 표적 분자는 단백질, 펩타이드, 핵산, 화학물질 또는 약물이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 시험관내 또는 생체내에 있다.
일부 실시양태에서, 본원에는 (a) (i) 서열번호 35와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성 및 서열번호 205 및 서열번호 206과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 성분, (ii) 서열번호 17, 서열번호 21, 및/또는 서열번호 302와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성 및 서열번호 5 및 서열번호 8과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 성분, 및 (iii) 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질을 조합하는 단계로서, 여기서 펩타이드 성분과 폴리펩타이드 성분은 상호작용 시 생물발광 복합체를 생성하도록 구성되는 단계; 및 (b) 발광을 검출하는 단계로서, 여기서 폴리펩타이드 성분과 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 단독에 의해 생성된 발광 수준과 비교하여 더 큰 발광 수준은 폴리펩타이드 성분과 펩타이드의 생물발광 복합체의 형성을 나타내는 것인 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩타이드는 제1 상호작용 요소와의 융합체(예를 들어, 유전자, 합성, 화학적 접합체, 효소적 접합체 등)이고, 폴리펩타이드 성분은 제2 상호작용 요소와의 융합체(예를 들어, 유전자, 합성, 화학적 접합체, 효소적 접합체 등)이며, 여기서 펩타이드 및 폴리펩타이드 성분은 상호작용 요소의 상호작용 시에 생물발광 복합체를 형성하지만 상호작용 요소 사이의 상호작용의 부재 하에서는 생물발광 복합체를 형성하지 않는다. 일부 실시양태에서, 펩타이드 및 폴리펩타이드 성분은 촉진(예를 들어, 상호작용 요소에 의함)의 부재 하에 생물발광 복합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 펩타이드는 관심 단백질, 펩타이드 또는 분자와의 융합체 또는 접합체(예를 들어, 유전자, 합성, 화학적 접합체, 효소적 접합체 등)이고, 폴리펩타이드 성분은 관심 단백질, 펩타이드 및/또는 분자(예를 들어, 상호작용 요소가 아님)와의 융합체 또는 접합체(예를 들어, 유전자, 합성, 화학적 접합체, 효소 접합체 등)이다. 일부 실시양태에서, 펩타이드 성분 및 폴리펩타이드 성분은 상호작용 요소에 의한 촉진 없이, 공동국재화 시에(예를 들어, 샘플, 세포, 조직, 대상체 등에서) 생물발광 복합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 펩타이드 성분 및 폴리펩타이드 성분은 상호작용 요소에 의한 촉진 시에 생물발광 복합체를 형성하지만, 촉진 없이는 형성하지 못한다.
일부 실시양태에서, 본원에는 서열번호 788 또는 789와 40% 초과(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 또는 그 사이의 범위)이지만, 100% 미만의 서열 동일성 및 서열번호 1 또는 3과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단량체성 폴리펩타이드를 포함하는 조성물이 제공되며; 여기서 폴리펩타이드는 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질의 존재 하에 발광을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 펩타이드는 서열번호 780, 782, 784, 786, 802, 804, 806, 808, 813, 815, 또는 829 중 하나 이상과 40% 초과(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 또는 그 사이의 범위)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 부가적인 아미노산 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩타이드의 융합 단백질이 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에는 서열번호 788 또는 789와 40% 초과(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 또는 그 사이의 범위)이지만, 100% 미만의 서열 동일성 및 서열번호 1 또는 3과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산이 제공되며; 여기서 폴리펩타이드는 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질의 존재 하에 발광을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열번호 780, 782, 784, 786, 802, 804, 806, 808, 813, 815, 또는 829 중 하나 이상과 40% 초과(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 또는 그 사이의 범위)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩타이드의 융합 단백질을 암호화하는 핵산이 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에는, 본원에 기재된 단량체성 생물발광 폴리펩타이드를 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질과 접촉시키는 단계 및 발광을 검출하는 단계를 포함하는, 생물발광을 검출하는 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에는, 서열번호 17, 21, 또는 302 중 하나와 40% 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열의 N-말단 단부에 연결된 서열번호 15와 40% 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공되며; 여기서 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질의 존재 하에 생성된 생물발광 신호는 폴리펩타이드가 서열번호 23으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 접촉하는 경우, 폴리펩타이드와 코엘렌테라진 기질 단독에 의해 생성된 생물발광 신호에 비해 실질적으로 증가된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산이 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩타이드와 부가적인 아미노산 서열의 융합체가 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에는 (a) 서열번호 17, 21 또는 302 중 하나와 40% 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열의 N-말단 단부에 연결된 서열번호 15와 40% 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질 및 서열번호 23과 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 또는 그 사이의 범위)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계; 및 (b) 발광을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에는 (a) 특정 세포 위치에 국재화된 아미노산 서열에 연결된 서열번호 11과 적어도 40%(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 또는 그 사이의 범위)의 서열 동일성을 갖는 제1 아미노산 서열을 포함하는 센서 폴리펩타이드; 및 (b) 서열번호 23에 대해 적어도 40%(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 또는 그 사이의 범위)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 태그에 연결된 관심 단백질을 포함하는 시스템이 제공되며; 여기서 특정 세포 위치 내에 공동국재화 시에, 폴리펩타이드와 펩타이드 태그 사이에는 생물발광 복합체가 형성된다. 일부 실시양태에서, 특정 세포 위치는 원형질막, 핵, 미토콘드리아 및 소포체로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 본원에는 (a) 세포에서 본원에 기재된 시스템을 발현시키는 단계; (b) 세포를 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질과 접촉시키는 단계; 및 (c) 발광을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공되며, 여기서 발광의 증가는 생물발광 복합체의 형성 및 폴리펩타이드와 펩타이드 태그의 공동국재화를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 방법은 펩타이드 태그에 연결된 관심 전위 단백질을 특정 세포 위치로 유도하는 단계를 추가로 포함한다.
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도 1. β9 및 β10 부분이 결여된 폴리펩타이드(LgTrip 2098; 서열번호 17)가 LgBiT(서열번호 11)에 비해 감소된 배경 발광을 나타내고 β9 및 β10에 상응하는 펩타이드에 의한 상보성에 의해 활성화됨을 입증하는 그래프.
도 2. 각각 β9 및 β10에 해당하는 별도의 펩타이드에 의한 LgTrip 2098(서열번호 17)의 활성화를 보여주는 그래프.
도 3. 예시적인 LgTrip 2098 돌연변이체의 상대적 안정성을 나타내는 그래프.
도 4. LgTrip 2098 돌연변이체의 위치 42에서 아미노산 부위-포화의 상대적 발광 활성을 나타내는 그래프.
도 5. LgTrip 2098 돌연변이체의 위치 42에서 아미노산 변화의 상대적 안정성을 나타내는 그래프.
도 6a-c. LgTrip 2098 돌연변이체의 (A) 위치 4, (B) 위치 30 및 (C) 위치 106에서 아미노산 변화의 상대적 발광 활성을 나타내는 그래프.
도 7. LgTrip 3092 돌연변이체의 (A) 위치 101, (B) 위치 117, (C) 위치 127, (D) 위치 120, 및 (E) 위치 126에서 아미노산 변화의 상대적 발광 활성을 나타내는 그래프.
도 8. 37℃에서 LgTrip 2098(WT)(서열번호 31), LgTrip 3092(서열번호 19) 및 LgBiT(서열번호 11)의 상대적 안정성을 나타내는 그래프.
도 9. (A) 42℃ 및 (B) 60℃에서 LgTrip 변이체의 상대적 안정성을 나타내는 그래프.
도 10. (A) SmTrip9 pep286(서열번호 37)을 사용한 다양한 LgTrip 변이체의 적정, (B) SmTrip10 pep86(서열번호 25)을 사용한 다양한 LgTrip 변이체의 적정, 및 (C) SmTrip9 pep286 및 SmTrip10 pep86에 대한 다양한 LgTrip 변이체의 친화도를 나타내는 그래프.
도 11a-b. 60℃에서 다양한 LgTrip 변이체의 (A) 안정성(반감기) 및 (B) 상대적 안정성을 나타내는 그래프.
도 12a-b. SmTrip9 pep286(서열번호 37) 및 SmTrip10 pep86(HiBiT, 서열번호 25)의 존재 하에 LgTrip 변이체의 동역학 프로파일을 (A) TBS+0.01% BSA에서 검정 및 (B) NanoGlo® 검정 완충액을 이용하여 검정한 NanoLuc(서열번호 3) 및 LgBiT(서열번호 11) 및 SmTrip10 pep86(HiBiT; 서열번호 25)과 비교하여 나타낸 그래프.
도 13a-b. FRB/FKBP 복합체의 라파마이신 유도 형성을 통한 다양한 삼분할 시스템의 촉진된 상보성을 나타내는 그래프: (A) SmTrip10 pep86(서열번호 25), SmTrip9 pep245(서열번호 23), 및 LgTrip 2098(서열번호 31); 및 (B) SmBiT(서열번호 13), SmTrip9 pep245(서열번호 23), 및 LgTrip 2098(서열번호 31).
도 14a-b. (A) TBS+0.01% BSA 및 (B) 수동 용해 완충액(PLB)에서 LgBiT(서열번호 11) 및 LgTrip 2098(WT)(서열번호 31)의 37℃에서의 안정성을 비교한 그래프.
도 15a-b. 60℃에서 LgBiT(서열번호 11), LgTrip 3546(서열번호 51) 및 NanoLuc(서열번호 31)의 안정성을 비교한 그래프; (A) 시간 경과 및 (B) 반감기.
도 16a-b. (A) NaCl의 존재 하에, 및 (B) NaCl에 26시간 노출 후에, LgBiT(서열번호 11), NanoLuc(서열번호 3), 및 LgTrip 3546(서열번호 51), 및 LgTrip 2098(WT)(서열번호 31)을 비교하는 그래프.
도 17a-b. (A) 우레아 존재 하에, 및 (B) 우레아에 26시간 노출 후에 LgBiT(서열번호 11), NanoLuc(서열번호 3), 및 LgTrip 3546(서열번호 51) 및 LgTrip 2098(WT)(서열번호 31) 변이체들을 비교하는 그래프.
도 18a-b. (A) 다양한 pH에서, 및 (B) 다양한 pH에 26 시간 노출 후에, LgBiT(서열번호 11), NanoLuc(서열번호 3), 및 LgTrip 3546(서열번호 51) 및 LgTrip 2098(WT)(서열번호 31) 변이체를 비교하는 그래프.
도 19. LgBiT(서열번호 11) 및 LgTrip 3546(서열번호 51)의 자가발광을 비교한 그래프.
도 20a-b. LgBiT(서열번호 11) + SmTrip 10 pep86(HiBiT, 서열번호 25), LgBiT(서열번호 11) + pep263(서열번호 35)(β9/β10 디펩타이드), 및 LgTrip 3546(서열번호 51) + pep263(β9/β10 디펩타이드)(서열번호 35)의 발광을 비교한 그래프: (A) RLU 및 (B) 신호/배경(S/B).
도 21a-c. SmTrip10 pep86(서열번호 25) 및 SmTrip9 pep245(서열번호 23)에 의한 LgTrip 2098(서열번호 31) 및 LgTrip 3546(서열번호 51) 각각의 촉진된 상보성: (A) 검정 시스템의 개략도, (B) RLU 및 (C) 신호/배경(S/B).
도 22. LgTrip 3546(서열번호 51) 및 SmTrip9 pep286(서열번호 37)에 대한 다양한 SmTrip10 서열의 친화도를 비교하는 그래프 및 표.
도 23. 표준 배향(pep263)(서열번호 35) 및 역 배향(pep326)(서열번호 179) 디펩타이드에 의한 LgTrip 2098(서열번호 31) 및 LgTrip 3546(서열번호 51)의 활성화를 비교하는 그래프 및 표.
도 24. HiBiT 또는 SmBiT 서열을 포함하는 디펩타이드에 의한 보체 폴리펩타이드의 활성화를 나타내는 그래프 및 표. HiBiT 서열 pep263을 갖는 디펩타이드(서열번호 35) 또는 SmBiT 서열 pep274를 갖는 디펩타이드(서열번호 147)
도 25a-b. (A) SmTrip9 pep286(서열번호 37) 및 다양한 β10-유사 펩타이드(SmTrip10 펩타이드)에 의한 다양한 폴리펩타이드 성분(LgTrip 3546 대비 첨가 또는 결실을 가짐)의 상보성으로부터 비롯되는 발광을 나타내는 그래프; (B) 다양한 β10-유사 펩타이드(SmTrip10 펩타이드)에 의한 LgTrip 3546(서열번호 51) 및 SmTrip9 pep286(서열번호 37)의 상보성으로부터 비롯되는 발광을 나타내는 그래프.
도 26a-c. (A-C) 폴리펩타이드 성분과 β9 가닥에 상응하는 펩타이드 사이 또는 β9와 β10 유사 펩타이드 사이에 중첩을 갖는(기본 루시퍼라제 서열 대비) 폴리펩타이드/펩타이드 조합에 의해 생성된 발광을 나타내는 그래프.
도 27a-b. (A) 일정한 LgTrip 3546(서열번호 51) 및 SmTrip10 pep86(서열번호 25) 농도의 존재 하에 다양한 β9-유사 펩타이드(SmTrip9 펩타이드)의 적정, 및 (B) 일정한 농도의 LgTrip 3546(서열번호 51) 및 다양한 β9-유사 펩타이드(SmTrip9 펩타이드)의 존재 하에 SmTrip10 pep86(서열번호 25)의 적정에서 비롯되는 발광을 나타내는 도면 및 표.
도 28. 일정한 농도의 LgTrip 3546(서열번호 51) 및 SmTrip9 pep286(서열번호 37)의 존재 하에 다양한 β10-유사 펩타이드(SmTrip 10 펩타이드)의 적정에서 비롯되는 발광을 나타내는 도면 및 표.
도 29a-b. 일정한 농도의 다양한 β10-유사 펩타이드(SmTrip10 펩타이드) 및 LgTrip 3546(서열번호 51) 폴리펩타이드 성분의 존재 하에 β9-유사 펩타이드인 (A) SmTrip9 pep286(서열번호 37) 및 (B) SmTrip9 pep287(서열번호 148)의 적정을 나타내는 도면 및 표.
도 30. HEK293 세포에서 촉진된 상보성에 미치는 작제물 배향(β9-FKBP, FKBP-β9, β10-FKBP, FKBP-β10, β9-FRB, FRB-β9, β10-FRB, 또는 FRB-β10)의 효과를 나타내는 그래프.
도 31. E. 콜라이 세포에서 촉진된 상보성에 미치는 작제물 배향(β9-FKBP, FKBP-β9, β10-FKBP, FKBP-β10, β9-FRB, FRB-β9, β10-FRB 또는 FRB-β10)의 효과를 나타내는 그래프.
도 32. LgTrip 3546(서열번호 51) 및 SmTrip9 pep286(서열번호 37)에 의한 다양한 β10-유사 펩타이드의 계산된 Kd 값을 나타내는 그래프.
도 33. 폴리펩타이드 성분 LgTrip 3546(서열번호 51)과 β9-유사 펩타이드 사이에 다양한 분할 부위를 갖는 성분의 조합으로부터의 발광을 나타내는 그래프 및 표.
도 34. 다양한 LgTrip 폴리펩타이드 성분과 SmTrip9 pep286(서열번호 37) 사이에 서열 갭 및/또는 중첩이 있는 성분의 조합으로부터의 발광을 나타내는 그래프.
도 35. SmTrip10 pep86(HiBiT; 서열번호 25)의 존재 하에 β9-유사 펩타이드(SmTrip9 펩타이드)와 폴리펩타이드 성분 LgTrip 3546(서열번호 51) 사이의 서열에 갭 및/또는 중첩이 있는 NanoTrip 성분 조합으로부터의 발광을 나타내는 그래프.
도 36. LgTrip 3546(서열번호 51) 및 SmTrip10 pep86에 의한 β9-유사 펩타이드 친화도 및 최대 광 출력에 미치는 β9-유사 펩타이드(SmTrip9 펩타이드) 길이 영향의 생화학적 분석을 나타내는 표.
도 37. LgTrip 3546(서열번호 51) 및 SmTrip10 pep86(서열번호 25)에 의한 HiBiT 친화도 및 최대 광 출력에 미치는 β9-유사 펩타이드(SmTrip9 펩타이드) 길이 영향의 생화학적 분석을 나타내는 표.
도 38. LgTrip 3546(서열번호 51) 및 SmTrip10 pep86(서열번호 25)에 의한 β9-유사 SmTrip9 pep286(서열번호 37) 점 돌연변이체의 Kd 및 Bmax를 나타내는 표.
도 39. LgTrip 3546(서열번호 51) 및 SmTrip9 pep86(서열번호 25)에 의한 β9-유사 펩타이드 친화도에 미치는 다양한 용해도 태그의 효과를 나타내는 표.
도 40. β9-유사 또는 β10-유사 펩타이드 친화도 및 최대 광 출력에 미치는 다양한 C-말단 연장 서열의 효과를 나타내는 표. β9-유사 펩타이드 적정(pep286(서열번호 37), pep292(서열번호 153), pep297(서열번호 157), pep302(서열번호 161)) 및 β10-유사 펩타이드 SmTrip10 pep86(HiBiT; 서열번호 25)이 도시되어 있다.
도 41. LgTrip 3546(서열번호 51)에 의한 E. 콜라이 용해액의 촉진 상보성에 미치는 FRB-β10 작제물 링커 길이(15, 10, 또는 5 Gly/Ser 잔기), 링커 조성(Ala-Ile의 존재 또는 부재), 헥사히스티딘 태그 포함, 및 β10 조성(SmTrip10 pep86(서열번호 25) 또는 SmTrip10 pep289(서열번호 150))의 효과를 나타내는 그래프.
도 42. LgTrip 3546(서열번호 51)에 의한 HEK 용해액의 촉진 상보성에 미치는 FRB-β10 작제물 링커 길이(15, 10, 또는 5 Gly/Ser 잔기), 링커 조성(Ala-Ile의 존재 또는 부재), 헥사히스티딘 태그 포함, 및 β10 조성 SmTrip10 pep86(서열번호 25) 또는 SmTrip10 pep289(서열번호 150)의 효과를 나타내는 그래프.
도 43. LgTrip 3546(서열번호 51)과 함께 E. 콜라이 용해액 중 FRB-SmTrip10 pep86(β10)(서열번호 25)에 의한 촉진 상보성에 미치는 β9 서열 절두 및 연장 및 작제물 배향(β9-FKBP 또는 FKBP-β9)의 효과를 나타내는 그래프.
도 44. LgTrip 3546(서열번호 51)과 함께 E. 콜라이 용해액 중 FRB-SmTrip10 pep289(β10)(서열번호 150)에 의한 촉진 상보성에 미치는 β9 서열 절두 및 연장 및 작제물 배향(β9-FKBP 또는 FKBP-β9)의 효과를 나타내는 그래프.
도 45. LgTrip 3546(서열번호 51)과 함께 E. 콜라이 용해액 중 FRB-SmTrip10 pep86(β10)(서열번호 25)에 의한 촉진 상보성에 미치는 β9 서열 절두, 연장 및 작제물 배향(β9-FKBP 또는 FKBP-β9)의 효과를 나타내는 그래프.
도 46. LgTrip 3546(서열번호 51)과 함께 E. 콜라이 용해액 중 FRB-SmTrip10 pep289(β10)(서열번호 150)에 의한 촉진 상보성에 미치는 β9 서열 절두, 연장 및 작제물 배향(β9-FKBP 또는 FKBP-β9)의 효과를 나타내는 그래프.
도 47. LgTrip 3546(서열번호 51)과 함께 E. 콜라이 용해액(도 45 및 46의 요약) 중 FRB-β10(SmTrip10 pep86(서열번호 25) 또는 SmTrip10 pep289(서열번호 150))에 의한 배수 유도(촉진 상보성/자발적 상보성)에 미치는 β9 서열 절두, 연장 및 작제물 배향(β9-FKBP 또는 FKBP-β9)의 효과를 나타내는 그래프.
도 48. LgTrip 3546(서열번호 51)과 함께 HEK293 용해액 중 FRB-SmTrip10 pep86(서열번호 25)에 의한 촉진 상보성에 미치는 β9 서열 절두 및 연장 및 작제물 배향(β9-FKBP 또는 FKBP-β9)의 효과를 나타내는 그래프.
도 49. HEK293 용해액에서 FRB-SmTrip10 pep289(서열번호 150)에 의한 촉진 상보성에 미치는 β9 서열 절두 및 연장 및 작제물 배향(β9-FKBP 또는 FKBP-β9)의 효과를 나타내는 그래프. (LgTrip 3546(서열번호 51)).
도 50. HEK293 용해액에서 FRB-β10(SmTrip10 pep86(서열번호 25) 또는 SmTrip10pep289(서열번호 150))에 의한 유도 배수(촉진 상보성/자발적 상보성)에 미치는 β9 서열 절두, 연장 및 작제물 배향(β9-FKBP 또는 FKBP-β9)의 효과를 나타내는 그래프(도 48 및 49의 요약). (LgTrip 3546(서열번호 51)).
도 51a-d. 펩타이드에 의해 태그화된 결합 모이어티를 사용한 예시적인 단백질-단백질 상호작용 검정 또는 분석물 검출 검정을 나타내는 개략도.
도 51e-h. 본원에 기재된 성분 및 시약을 사용한 예시적인 면역검정을 나타내는 개략도: (A) 직접 면역검정, (B) 간접 면역검정, (C) 경쟁 직접 면역검정, 및 (D) 경쟁 간접 면역검정.
도 52. 예시적인 다중체화된 삼분할 측방 유동 검정의 개략도. 이러한 검정은, 예를 들어, 병원체의 검출에 사용된다.
도 53. 예시적인 다중체화된 삼분할 측방 유동 검정의 개략도. 이러한 검정은, 예를 들어, 항바이러스 항체의 검출에 사용된다.
도 54. 예시적인 항체 검출 검정의 개략도.
도 55. 예시적인 비드 기반 검정의 개략도.
도 56. 예시적인 핵산 검출 검정의 개략도.
도 57. **로 표시된 작제물에서 링커가 없는 AI(Ala-Ile) 디펩타이드에 의한 E. 콜라이 용해액 중 FRB-FKBP 촉진 상보성을 나타내는 그래프. (LgTrip 3546(서열번호 51)).
도 58. **로 표시된 작제물에서 링커가 없는 AI 서열 디펩타이드에 의한 HEK293 용해액 중 FRB-FKBP 촉진 상보성을 나타내는 그래프. (LgTrip 3546(서열번호 51)).
도 59. E. 콜라이 용해액에서 FRB-SmTrip10 pep86 및 C-말단 연장된 FKBP-SmTrip9 펩타이드를 사용한 발광 복합체 형성의 FRB-FKBP 촉진을 나타내는 그래프. (LgTrip 3546(서열번호 51)).
도 60. E. 콜라이 용해액에서 FRB-SmTrip10 pep289 및 C-말단 연장된 FKBP-SmTrip9 펩타이드를 사용한 발광 복합체 형성의 FRB-FKBP 촉진을 나타내는 그래프. (LgTrip 3546(서열번호 51)).
도 61. HEK293 용해액에서 FRB-SmTrip10 pep86 및 C-말단 연장된 FKBP-SmTrip9 펩타이드를 사용한 발광 복합체 형성의 FRB-FKBP 촉진을 나타내는 그래프. (LgTrip 3546(서열번호 51)).
도 62. E. 콜라이 용해액에서 FKBP 융합체 중 FRB-SmTrip10 pep86 및 SmTrip9 펩타이드 서열 절두 및 연장을 사용한 발광 복합체 형성의 FRB-FKBP 촉진을 나타내는 그래프. (LgTrip 3546(서열번호 51)).
도 63. E. 콜라이 용해액에서 FKBP 융합체 중 FRB-SmTrip10 pep289 및 SmTrip9 펩타이드 서열 절두 및 연장을 사용한 발광 복합체 형성의 FRB-FKBP 촉진을 나타내는 그래프. (LgTrip 3546(서열번호 51)).
도 64. HEK293 용해액에서 FKBP 융합체 중 FRB-SmTrip10 pep86 및 SmTrip9 펩타이드 서열 절두 및 연장을 사용한 발광 복합체 형성의 FRB-FKBP 촉진을 나타내는 그래프. (LgTrip 3546(서열번호 51)).
도 65. HEK293 용해액에서 FKBP 융합체 중 FRB-SmTrip10 pep86 및 SmTrip9 펩타이드 서열 절두 및 연장을 사용한 발광 복합체 형성의 FRB-FKBP 촉진을 나타내는 그래프. (LgTrip 3546(서열번호 51)).
도 66. E. 콜라이 용해액에서 FKBP-SmTrip9 용해도 변이체 및 FRB-SmTrip10 pep86을 사용한 발광 복합체 형성의 FRB-FKBP 촉진을 나타내는 그래프. (LgTrip 3546(서열번호 51)).
도 67. E. 콜라이 용해액에서 FKBP-SmTrip9 용해도 변이체 및 FRB-SmTrip10 pep289를 사용한 발광 복합체 형성의 FRB-FKBP 촉진을 나타내는 그래프. (LgTrip 3546(서열번호 51)).
도 68. HEK293 용해액에서 FKBP-SmTrip9 용해도 변이체 및 FRB-SmTrip10 pep86을 사용한 발광 복합체 형성의 FRB-FKBP 촉진을 나타내는 그래프. (LgTrip 3546(서열번호 51)).
도 69. HEK293 용해액에서 FKBP-SmTrip9 용해도 변이체 및 FRB-SmTrip10 pep289를 사용한 발광 복합체 형성의 FRB-FKBP 촉진을 나타내는 그래프. (LgTrip 3546(서열번호 51)).
도 70. E. 콜라이 용해액에서 FKBP-SmTrip9 용해도 변이체 및 FRB-SmTrip pep86을 사용한 발광 복합체 형성의 FRB-FKBP 촉진을 나타내는 그래프. (LgTrip 3546(서열번호 51)).
도 71. E. 콜라이 용해액에서 FKBP-SmTrip9 용해도 변이체 및 FRB-SmTrip pep289를 사용한 발광 복합체 형성의 FRB-FKBP 촉진을 나타내는 그래프. (LgTrip 3546(서열번호 51)).
도 72. HEK293 용해액에서 FKBP-SmTrip9 용해도 변이체 및 FRB-SmTrip pep86을 사용한 발광 복합체 형성의 FRB-FKBP 촉진을 나타내는 그래프. (LgTrip 3546(서열번호 51)).
도 73. HEK293 용해액에서 FKBP-SmTrip9 용해도 변이체 및 FRB-SmTrip pep289를 사용한 발광 복합체 형성의 FRB-FKBP 촉진을 나타내는 그래프. (LgTrip 3546(서열번호 51)).
도 74. C-말단 연장이 있는 합성 SmTrip9 용해도 변이체의 친화도 및 Bmax를 열거한 표. (LgTrip 3546(서열번호 51)).
도 75. C-말단 연장이 있는 합성 SmTrip9 용해도 변이체의 친화도 및 Bmax를 열거한 표. (LgTrip 3546(서열번호 51)).
도 76. 말단이 차등적으로 차단된 합성 SmTrip9 변이체의 Kd 및 Bmax를 열거한 표. (LgTrip 3546(서열번호 51)).
도 77. 합성 SmTrip9 펩타이드의 용해도를 열거한 표.
도 78a-b. (A) SmTrip10 pep86(HiBiT)/LgTrip 융합체(서열번호 210 및 212)에 대한 SmTrip9 pep286(서열번호 37)의 친화도를 나타내는 그래프. (B) 다양한 SmTrip10 pep86(HiBiT)/LgTrip 융합체에 대한 SmTrip9 pep759(서열번호 496)의 친화도를 나타내는 그래프.
도 79. 증가하는 세제 농도에 18시간 노출된 후 생물발광을 나타내는 그래프. NanoLuc(서열번호 3), LgBiT(서열번호 11), (LgTrip 3546(서열번호 51)).
도 80. 증가하는 세제 농도의 존재 하에 효소 활성을 나타내는 그래프. NanoLuc(서열번호 3), LgBiT(서열번호 11), LgTrip 3546(서열번호 51).
도 81. LgBiT(서열번호 11) 및 LgTrip 3546(서열번호 51)을 사용한 FRB-FKBP 촉진된 생물발광 복합체 형성의 가역성을 입증하는 그래프.
도 82. 불변 SmTrip9 pep286(서열번호 37) 및 LgTrip 3546(서열번호 51)의 존재 하에 다양한 SmTrip10 펩타이드의 적정 결과를 열거한 표.
도 83. 불변 SmTrip9 pep286(서열번호 37) 및 LgTrip 3546(서열번호 51) 적정의 존재 하에 다양한 SmTrip10 펩타이드의 적정 결과를 열거한 표
도 84. SmTrip9 pep263(서열번호 35) 및 SmTrip10 pep86(서열번호 25) 또는 SmTrip10 pep86 + SmTrip9 pep286(서열번호 37)을 사용한 안타레스(Antares)형 융합체(LgTrip 3546)로부터의 생물발광을 나타내는 그래프.
도 85a-b. SmTrip9 pep263(서열번호 35) 및 SmTrip pep86(HiBiT, 서열번호 25) 또는 SmTrip10 pep86(HiBiT; 서열번호 25) + SmTrip9 pep286(서열번호 37)을 사용한 안타레스형 융합체(LgTrip 3546)(서열번호 51)로부터의 방출 스펙트럼을 나타내는 그래프.
도 86. 디펩타이드 pep263(서열번호 35)의 존재 하에 "다크(dark)" 디펩타이드 272(서열번호 146)를 사용한 LgBiT(서열번호 11) 및 LgTrip 3546(서열번호 51)의 적정을 나타내는 그래프.
도 87. LgTrip 3546(서열번호 51) 및 LgBiT(서열번호 11)에 의한 다크 디펩타이드 272(서열번호 146) 및 273(서열번호 298)의 저해를 비교하는 그래프.
도 88. 다크 BiT167(서열번호 300)을 사용한 LgBiT(서열번호 11) 및 LgTrip 3546(서열번호 51)의 저해를 나타내는 그래프.
도 89. LgTrip 3546(서열번호 51) 및 FRB-HiBiT(서열번호 25)에 의한 FKBP-SmTrip9 pep434(서열번호 230) 변이체의 상보성을 사용한 E. 콜라이 용해액에서 발광 복합체 형성의 FRB-FKBP 촉진을 나타내는 그래프.
도 90. LgTrip 3546(서열번호 51) 및 FRB-SmTrip10 pep289(VS-HiBiT; 서열번호 150)에 의한 SmTrip9 pep434(서열번호 230) 변이체의 상보성을 사용한 E. 콜라이 용해액에서 발광 복합체 형성의 FRB-FKBP 촉진을 나타내는 그래프.
도 91. (a) LgTrip 3546(서열번호 51) 및 FRB-SmTrip10 pep86(HiBiT; 서열번호 25)에 의한 SmTrip9 pep435(서열번호 231) 및 SmTrip9 pep434(서열번호 230) 변이체의 상보성을 사용한 HEK293 용해액에서 발광 복합체 형성의 FRB-FKBP 촉진을 나타내는 그래프. (b) LgTrip 3546(서열번호 51) 및 FRB-SmTrip10 pep289(서열번호 150)에 의한 SmTrip9 pep435(서열번호 231) 및 SmTrip9 pep434(서열번호 230) 변이체의 상보성을 사용한 HEK293 용해액에서 발광 복합체 형성의 FRB-FKBP 촉진을 나타내는 그래프.
도 92. SmTrip9 823 및 840을 사용한 FRB-FKBP 검정 스크리닝의 결과를 나타내는 표.
도 93. LgTrip 3546(서열번호 51)을 사용한 합성 SmTrip9 pep435(서열번호 231) 및 SmTrip9 pep434(서열번호 230) 변이체의 Kd 및 Bmax를 열거한 표.
도 94. 내인적으로 태그화된(예를 들어, CRISPR/Cas9에 의해) GAPDH를 검출하기 위한 생물발광 시약으로서 pep263(서열번호 35) 또는 pep331(서열번호 301)을 사용한 LgTrip 2098(서열번호 31) 및 LgTrip 3546(서열번호 51)의 입증 그래프.
도 95. 예시적인 SmTrip10 화학적 접합체. (A) 시스테인과 같은 티올과 반응하기 위한 말레이미드 또는 리신과 같은 아민과 반응하기 위한 N-하이드록시숙신이미드 에스테르(NHS-에스테르)를 가지고 제조한 단백질/펩타이드/DNA 및 RNA 올리고뉴클레오타이드/소분자 또는 단백질/펩타이드/DNA 및 RNA 올리고뉴클레오타이드/소분자 상의 용매 노출되거나 보호된 시스테인 표적에 대한 이황화 결합 형성을 위해 N-말단 시스테인 변형된 SmTrip10의 예. (B) 단백질/펩타이드/DNA 및 RNA 올리고뉴클레오타이드/소분자 상에 별도로 설치된 비긴장성(unstrained) 또는 긴장성 알킨 표적과 구리 촉진된 또는 구리 무함유 1,3-쌍극성 고리첨가 반응("클릭")을 위해 N-말단 아지도-리신 변형을 갖는 예시적인 SmTrip10. (C) 단백질/펩타이드/DNA 및 RNA 올리고뉴클레오타이드/소분자 상의 친핵체(예를 들어, 리신, 기타 1차 아민)에 대한 일반적인 접합을 위한 N-말단 N-하이드록실숙신이미드 에스테르(NHS-에스테르)가 있는 예시적인 SmTrip10. 친핵체는 미변형 단백질/올리고/소분자에 존재할 수 있거나 이 접합을 위해 화학적으로 첨가될 수 있다. (D) 단백질/펩타이드/DNA 및 RNA 올리고뉴클레오타이드/소분자 상에 화학적 또는 생물학적으로 별도로 도입된 아지드, 디아조 또는 테트라진 표적과 구리 촉매되거나 또는 구리 없이 1,3-쌍극성 고리첨가 반응("클릭")하기 위한 N-말단 프로파길 글리신 변형이 있는 예시적인 SmTrip10. (E) 구리 촉매되거나 또는 구리 없이 1,3-쌍극성 고리첨가 반응("클릭")하기 위한 N-말단 프로파길 글리신 변형 및 C-말단 형광단(예를 들어, BODIPY 염료)을 갖는 예시적인 SmTrip10.
도 96. 예시적인 SmTrip9 pep286 화학적 접합체. (A) 단백질/펩타이드/DNA 및 RNA 올리고뉴클레오타이드/소분자 상에 화학적 또는 생물학적으로 별도로 도입된 비긴장성 또는 긴장성 알킨 표적과 구리 촉매되거나 구리 없이 1,3-쌍극성 고리첨가 반응("클릭")하기 위해 C-말단 아지도-리신 변형을 갖는 SmTrip9-286의 예. (B) 단백질/펩타이드/DNA 및 RNA 올리고뉴클레오타이드/소분자에 화학적 또는 생물학적으로 별도로 도입된 아지드, 디아조, 테트라진 표적과 구리 촉매되거나 구리 없이 1,3-쌍극성 고리첨가 반응("클릭")을 위해 C-말단 프로파길 글리신 변형을 갖는 SmTrip9 pep286의 예. (C) 말레이미드 핸들 또는 N-하이드록시숙신이미드 에스테르를 가지고 제조한 단백질/펩타이드/DNA 및 RNA 올리고뉴클레오타이드/소분자 또는 단백질/펩타이드/DNA 및 RNA 올리고뉴클레오타이드/소분자 상의 용매 노출되거나 보호된 시스테인 표적에 이황화 결합 형성을 위한 C-말단 시스테인 변형을 갖는 SmTrip9 pep286의 예. (D) C-말단 시스테인 변형 및 N-말단 BODIPY 염료를 갖는 SmTrip9 pep286의 예. 염료는 BODIPY에 제한되지 않으며, 임의의 형광단, BRET 파트너, 또는 FRET 염료/소광제 파트너일 수 있다. 염료는 C-말단에 제조된 접합 핸들의 임의의 다른 조합과 함께 혼입될 수 있다. (E) 단백질/펩타이드/DNA 및 RNA 올리고뉴클레오타이드/소분자 또는 단백질/펩타이드/DNA 및 RNA 올리고뉴클레오타이드/소분자 상의 친핵성 표적(예를 들어, 리신)에 일반적인 접합을 하기 위한 C-말단 N-하이드록시숙신이미드 에스테르(NHS-에스테르)를 갖는 SmTrip9 pep286의 예. (F) 단백질/펩타이드/DNA 및 RNA 올리고뉴클레오타이드/소분자 또는 단백질/펩타이드/DNA 및 RNA 올리고뉴클레오타이드/소분자 상의 친핵성 표적(즉, 리신)에 일반적인 접합을 위해 C-말단 N-하이드록시숙신이미드 에스테르(NHS-에스테르)를 갖는 SmTrip9 pep286의 예.
도 97. 예시적인 SmTrip9 pep521 화학적 접합체. (A) C-말단 아지도-리신 변형 및 N-말단 BODIPY 염료를 갖는 SmTrip9 pep521의 예. 이 염료는 BODIPY에 제한되지 않으며 형광단, BRET 파트너 또는 FRET 염료/소광제 파트너일 수 있다. 염료는 C-말단에 제조된 임의의 다른 조합의 접합 핸들과 함께 혼입될 수 있다. (B) 단백질/펩타이드/DNA 및 RNA 올리고뉴클레오타이드/소분자 상에 화학적 또는 생물학적으로 별도로 도입된 비긴장성 또는 긴장성 알킨 표적과 구리 촉매되거나 구리 없이 1,3-쌍극성 고리첨가 반응("클릭")하기 위해 C-말단 아지도-리신 변형을 갖는 SmTrip9 pep521의 예. (C) 단백질/펩타이드/DNA 및 RNA 올리고뉴클레오타이드/소분자 상에 화학적 또는 생물학적으로 별도로 도입된 아지드, 디아조, 테트라진 표적과 구리 촉진되거나 구리 없이 1,3-쌍극성 고리첨가 반응("클릭")하기 위해 C-말단 프로파길 글리신 변형을 갖는 SmTrip9pep521의 예. (D) 단백질/펩타이드/DNA 및 RNA 올리고뉴클레오타이드/소분자 또는 말레이미드 핸들 또는 NHS-에스테르에 의해 제조된 단백질/펩타이드/DNA 및 RNA 올리고뉴클레오타이드/소분자 상의 용매 노출되거나 보호된 시스테인 표적 상에 이황화 결합 형성을 위해 C-말단 시스테인 변형을 갖는 SmTrip9 pep521의 예. (E) 단백질/펩타이드/DNA 및 RNA 올리고뉴클레오타이드/소분자 상의 친핵성 표적(즉, 리신)에 일반적인 접합을 위해 C-말단 N-하이드록시숙신이미드 에스테르(NHS-에스테르)를 갖는 SmTrip9 pep521의 예. (F) 단백질/펩타이드/DNA 및 RNA 올리고뉴클레오타이드/소분자 상의 친핵성 표적(즉, 리신)에 일반적인 접합을 위해 C-말단 N-하이드록시숙신이미드 에스테르(NHS-에스테르)를 갖는 SmTrip9 pep521의 예.
도 98. 예시적인 SmTrip9 pep524 화학적 접합체. (A) C-말단 아지도-리신 변형 및 N-말단 BODIPY 염료를 갖는 SmTrip9 pep524의 예. 염료는 BODIPY에 제한되지 않으며 임의의 형광단, BRET 파트너 또는 FRET 염료/소광제 파트너일 수 있다. 염료는 C-말단에 있는 임의의 다른 조합의 접합 핸들과 함께 혼입될 수 있다. (B) 단백질/펩타이드/DNA 및 RNA 올리고뉴클레오타이드/소분자 상에 화학적 또는 생물학적으로 별도로 도입된 비긴장성 또는 긴장성 알킨 표적과 구리 촉매되거나 또는 구리 없이 1,3-쌍극성 고리첨가 반응("클릭")하기 위해 C-말단 아지도-리신 변형을 갖는 SmTrip9pep524의 예. (C) 단백질/펩타이드/DNA 및 RNA 올리고뉴클레오타이드/소분자 상에 화학적 또는 생물학적으로 별도로 도입된 아지드, 디아조, 테트라진 표적과 구리 촉매되거나 구리 없이 1,3-쌍극성 고리첨가 반응("클릭")하기 위해 C-말단 프로파길 글리신 변형을 갖는 SmTrip9 pep524의 예. (D) 단백질/펩타이드/DNA 및 RNA 올리고뉴클레오타이드/소분자 또는 말레이미드 핸들 또는 NHS-에스테르에 의해 제조된 단백질/펩타이드/DNA 및 RNA 올리고뉴클레오타이드/소분자 상의 용매 노출되거나 보호된 시스테인 표적 상에 이황화 결합 형성을 위해 C-말단 시스테인 변형을 갖는 SmTrip9 pep524의 예. (E) 단백질/펩타이드/DNA 및 RNA 올리고뉴클레오타이드/소분자 상의 친핵성 표적(즉, 리신)에 대한 일반적인 접합을 위해 C-말단 N-하이드록시숙신이미드 에스테르(NHS-에스테르)를 갖는 SmTrip9 pep524의 예. (F) 단백질/펩타이드/DNA 및 RNA 올리고뉴클레오타이드/소분자 상의 친핵성 표적(즉, 리신)에 대한 일반적인 접합을 위해 C-말단 N-하이드록시숙신이미드 에스테르(NHS-에스테르)를 갖는 SmTrip9 pep524의 예.
도 99a-b. 예시적인 펩타이드-올리고머 프로브. 반응성 아지도기를 표시하는 펩타이드는 반응성 알킨 기를 표시하는 올리고뉴클레오타이드에 접합되어 예시적인 펩타이드-올리고머 프로브를 형성한다. (A) 구리 "클릭" 1,3-고리첨가를 통해 5'-말단 알킨 작용기를 함유하는 DNA 올리고머에 접합되는 SmTrip9 pep286(아지도 기 함유)의 펩타이드 올리고머 접합체. (B) 구리 "클릭" 1,3-고리첨가를 통해 3'-말단 알킨 작용기를 함유하는 DNA 올리고머에 접합되는 SmTrip10 pep86(HiBiT)(아지도 기 함유)의 펩타이드 올리고머 접합체.
도 100. SmTrip9 G147 부위-포화 변이체의 스크리닝을 나타내는 그래프.
도 101. SmTrip9 K148 부위-포화 변이체의 스크리닝을 나타내는 그래프.
도 102. SmTrip9 M149 부위-포화 변이체의 스크리닝을 나타내는 그래프.
도 103. SmTrip9 L150 부위-포화 변이체의 스크리닝을 나타내는 그래프.
도 104. SmTrip9 F151 부위-포화 변이체의 스크리닝을 나타내는 그래프.
도 105. SmTrip9 R152 부위-포화 변이체의 스크리닝을 나타내는 그래프.
도 106. SmTrip9 V153 부위-포화 변이체의 스크리닝을 나타내는 그래프.
도 107. SmTrip9 T154 부위-포화 변이체의 스크리닝을 나타내는 그래프.
도 108. SmTrip9 I155 부위-포화 변이체의 스크리닝을 나타내는 그래프.
도 109. SmTrip9 N156 부위-포화 변이체의 스크리닝을 나타내는 그래프.
도 110. SmTrip9 S157 부위-포화 변이체의 스크리닝을 나타내는 그래프.
도 111. SmTrip9 W158 부위-포화 변이체의 스크리닝을 나타내는 그래프.
도 112. SmTrip9 K149 부위-포화 변이체의 스크리닝을 나타내는 그래프.
도 113. SmTrip9 pep435/434를 사용한 E. 콜라이 용해액 중 FRB-FKBP 촉진 상보성 결과 표.
도 114. SmTrip9 pep435/434를 사용한 E. 콜라이 용해액 중 FRB-FKBP 촉진 상보성 결과 표.
도 115. SmTrip9 pep435/434를 사용한 E. 콜라이 용해액 중 FRB-FKBP 촉진 상보성 결과 표.
도 116. 조합 SmTrip9 변이체를 사용한 FRB-FKBP 촉진 상보성 검정 스크리닝의 결과 표.
도 117. 조합 SmTrip9 변이체를 사용한 FRB-FKBP 촉진 상보성 검정 스크리닝의 결과 표.
도 118. 조합 SmTrip9 변이체를 사용한 FRB-FKBP 촉진 상보성 검정 스크리닝의 결과 표.
도 119. 조합 SmTrip9 변이체를 사용한 FRB-FKBP 촉진 상보성 검정 스크리닝의 결과 표.
도 120. 조합 SmTrip9 변이체를 사용한 FRB-FKBP 촉진 상보성 검정 스크리닝의 결과 표.
도 121. 조합 SmTrip9 변이체를 사용한 FRB-FKBP 촉진 상보성 검정 스크리닝의 결과 표.
도 122. 조합 SmTrip9 변이체를 사용한 FRB-FKBP 촉진 상보성 검정 스크리닝의 결과 표.
도 123. SmTrip9 합성 펩타이드의 Kd 및 Bmax 표.
도 124. SmTrip9 합성 펩타이드의 Kd 및 Bmax 표.
도 125. SmTrip9 합성 펩타이드의 Kd 및 Bmax 표.
도 126. SmTrip9 합성 펩타이드의 Kd 및 Bmax 표.
도 127. SmTrip9 합성 펩타이드의 Kd 및 Bmax 표.
도 128. SmTrip9 합성 펩타이드의 Kd 및 Bmax 표.
도 129. SmTrip9 합성 펩타이드의 Kd 및 Bmax 표.
도 130. SmTrip9 합성 펩타이드의 Kd 및 Bmax 표.
도 131. 합성 SmTrip9 펩타이드의 용해도 표.
도 132. SmTrip9 합성 펩타이드 및 pep289의 생화학적 동시적정 그래프.
도 133. SmTrip9 합성 펩타이드 및 pep289의 생화학적 동시적정 그래프.
도 134. SmTrip9 및 SmTrip 10 합성 펩타이드의 생화학적 동시적정 그래프.
도 135. pep521 및 대안적 SmTrip 10 합성 펩타이드의 생화학적 동시적정 그래프.
도 136. LgTrip 3546 주형으로부터 가닥 제거(정제)의 SDS PAGE 겔.
도 137. 다양한 펩타이드 조합을 갖는 가닥 제거 단백질의 그래프.
도 138. LgTrip 3546 주형으로부터 가닥 6, 7, 8, 9 또는 10 제거(정제)의 그래프.
도 139. 디펩타이드 적정의 Kd 및 Bmax 값 그래프.
도 140. 삼분할 단백질 G 및 TNFa 융합 단백질을 사용하여 항-TNFa 생물학적 제제인 레미케이드(Remicade), 휴미라(Humira) 및 엔브렐(Enbrel)에 대한 용액 기반 균질 정량 검정을 개발하기 위해 취한 접근법을 나타내는 개략도.
도 141. 용액 기반 균질 검정에서 정제된 LgTrip 3546(서열번호 51)과 SmTrip9 pep521-단백질 G(서열번호 268) 및 TNFa-SmTrip10 pep289(VS-HiBiT; 서열번호 150) 융합 단백질에 의한 촉진 상보성을 통해 TNFa 저해제 용량 반응의 정량 분석을 도시한 그래프.
도 142. 용액 기반 균질 검정을 사용하여 인간 혈청 및 소변을 포함하는 복합 샘플 매트릭스의 존재 하에 정제된 LgTrip 3546(서열번호 51)과 SmTrip9 pep521-단백질 G(서열번호 268) 및 TNFa-SmTrip10 pep289(VS-HiBiT; 서열번호 150) 융합 단백질에 의한 촉진 상보성을 통한 10nM 인플릭시맙의 정량 분석을 나타내는 그래프.
도 143. 용액 기반 균질 검정에서 정제된 LgTrip 3546(서열번호 51)과 SmTrip9 pep521-단백질 G(서열번호 268) 및 TNFa-SmTrip10 pep289(VS-HiBiT; 서열번호 150) 융합 단백질에 의한 촉진 상보성을 통해 100pM 인플릭시맙을 측정하는 신호 발생의 결합 동역학을 나타내는 그래프.
도 144. 용액 기반 균질 검정에서 정제된 LgTrip 3546(서열번호 51)과 SmTrip9 pep(X)-단백질 G 및 TNFa-SmTrip10 pep289(VS-HiBiT; 서열번호 150) 융합 단백질에 의한 촉진 상보성을 통해 10nM 인플릭시맙을 측정하는 신호 발생을 나타내는 그래프.
도 145. SmTrip9-단백질 G 융합 단백질 및 SmTrip10 pep289-EGFR(서열번호 150)을 발현하는 HEK293 세포를 사용하여 항-EGFR 생물학적 제제 파니투무맙 및 세툭시맙에 대한 균질한 세포 기반 정량 검정을 개발하기 위해 취한 접근법을 나타내는 개략도.
도 146. 세포 기반 균질 검정에서 정제된 LgTrip 3546(서열번호 51)과 SmTrip9 pep521-단백질 G(서열번호 268) 융합 단백질 및 SmTrip10 pep289-EGFR(VS-HiBiT; 서열번호 150) 발현 세포에 의한 촉진 상보성을 통해 파니투무맙의 정량을 도시한 그래프.
도 147. 세포 기반 균질 검정에서 정제된 LgTrip 3546(서열번호 51)과 SmTrip9 pep521-단백질 G(서열번호 268) 융합 단백질 및 SmTrip10 pep289-EGFR(VS-HiBiT; 서열번호 150) 발현 세포에 의한 촉진 상보성을 통해 세툭시맙을 측정하는 신호 생성의 실시간 결합 동역학을 나타내는 그래프.
도 148. 세포 기반 균질 검정에서 정제된 LgTrip 3546(서열번호 51)과 쌍을 이룬 상이한 SmTrip9 pep(X)-단백질 G 변이체 및 SmTrip10 pep289-EGFR(VS-HiBiT; 서열번호 150) 발현 세포의 촉진 상보성을 통해 1nM의 파니투무맙을 측정하는 신호 발생을 나타내는 그래프.
도 149. 세포 기반 균질 검정에서 정제된 LgTrip 3546(서열번호 51)과 쌍을 이룬 상이한 SmTrip9 pep(X)-단백질 G 변이체 및 SmTrip10 pep289-EGFR(VS-HiBiT; 서열번호 150) 발현 세포의 촉진 상보성을 통해 파니투무맙 용량 반응의 정량을 나타내는 그래프.
도 150. 용액 기반 균질 검정에서 화학적으로 표지된 쌍을 이룬 항체인 HaloTag-SmTrip9 pep521(서열번호 268) 및 HaloTag-SmTrip10 pep289(서열번호 150)를 사용한 인간 IL-1베타의 정량을 나타내는 그래프. NanoTrip 화학적 표지된 쌍을 이룬 항체를 사용한 인간 트로포닌의 실시간 결합 동역학.
도 151. 용액 기반 균질 검정에서 화학적으로 표지된 쌍을 이룬 항체인 HaloTag-SmTrip9 pep521(서열번호 268) 및 HaloTag-SmTrip10 pep289(서열번호 150)를 사용하여 인간 트로포닌을 정량하기 위한 실시간 결합 동역학을 나타내는 그래프.
도 152. 단백질을 특정 세포 구획으로 유도하는 역할을 하는 특수 펩타이드를 LgBiT-HaloTag에 융합시켰다. (A) LgBiT-막 센서: LgBiT는 녹색이고 핵은 청색이다. (B) LgBiT-핵 센서: LgBiT는 녹색이고 핵은 청색이다. (C) LgBiT-미토콘드리아 센서: LgBiT는 녹색, MitoTracker는 적색, 핵은 청색이다. (D) LgBiT-ER 센서: LgBiT는 녹색, ER 마커는 적색, 핵은 청색이다.
도 153. 전위 검정. POI는 HiBiT에 의해 내인성으로 태그화된다. 자극 시, POI는 다른 세포 구획, 예를 들어 핵으로 전위한다. HiBiT는 LgBiT를 만나면 발광 신호를 생성하므로, LgBiT 핵 센서를 사용하여 이 전위 이벤트를 검출할 수 있다.
도 154. 야생형 LgBiT 센서를 사용한 막 전위 검정. PKCα-HiBiT 세포주는 야생형 LgBiT 막 센서로 형질감염시켰다. LgBiT와 HiBiT 사이에 강력한 상호작용으로 인해 자발적인 상보성이 발생하여 PMA 자극에 대해 어떠한 반응도 하지 않는다.
도 155. LgBiT* 센서(서열번호 979)를 사용한 막 전위 검정. PKCα-HiBiT 세포주는 LgBiT*-막 센서를 암호화하는 다른 양의 DNA로 형질감염시켰다. PMA 처리 시, PKCα-HiBiT는 LgBiT*-막 센서가 고정되는 원형질막으로 이동한다. HiBiT와 LgBiT* 사이의 조립은 발광 신호를 생성하며, 신호는 막에 있는 PKCα-HiBiT의 양에 비례한다. 검정은 민감하고 강력하다. PMA의 적정은 센서 입력 양에 관계없이 유사한 EC 50 (EC 50 = 2.0 nM)을 산출했다. 반응 배수는 센서 입력량에 따라 12 내지 19배로 다양하다.
도 156. LgBiT* 센서를 사용한 핵 전위 분석. p65-HiBiT 세포주를 LgBiT*-핵 센서를 암호화하는 DNA로 형질감염시켰다. TNFa의 첨가는 LgBiT*-핵 센서가 위치하는 핵으로 p65를 모집한다. 빛을 생성하기 위해 HiBiT와 LgBiT* 사이에 상보성이 발생한다. 신호 강도는 핵에 있는 p65 농도를 반영한다. TNFa의 적정은 0.7 ng/mL의 EC 50 및 4의 배수 반응을 산출했다. 실시간 측정은 자극 시 핵에 p65의 최대 축적에 도달하는 데 30분이 소요됨을 보여주었다.
도 157a-b. HiBiT와 LgBiT 돌연변이체의 친화도 및 Bmax를 나타내는 (A) 그래프 및 (B) 표.
도 158. HiBiT에 대한 LgBiT 돌연변이체 용해액의 친화도를 나타내는 그래프.
도 159. 절두된 루시퍼라제 폴리펩타이드 및 펩타이드 성분의 다양한 조합이, 기질의 존재 하에 생성하는 상대적 생물발광을 나타내는 그래프 및 표.
도 160. LgTrip은 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨(Tergitol)에 0.2 nM로 희석했고 pep289를 25 uM로 첨가했다. 이 용액은 SmTrip9 펩타이드의 5배 연속 희석 시리즈에 대한 희석제로서 사용했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 평형화하고 검정 플레이트에 3반복으로 분취했다. 20 uM 푸리마진을 함유하는 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨을 샘플에 1:1 부피:부피 비율로 첨가했다. 플레이트를 10분 동안 인큐베이션하고 발광을 판독했다. VS-HiBiT Kd를 결정하기 위해 동일한 프로토콜을 따랐지만 포화 SmTrip9(20x Kd)와 VS-HiBiT 적정을 사용했다.
도 161. LgTrip을 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에서 0.2 nM로 희석하고 pep289를 25 uM로 첨가했다. 이 용액을 SmTrip9 펩타이드의 5배 연속 희석 시리즈의 희석제로 사용했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 평형화하고 검정 플레이트에 3반복으로 분취했다. 20 uM 푸리마진을 함유하는 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨을 샘플에 1:1 부피:부피 비율로 첨가했다. 플레이트를 10분 동안 인큐베이션하고 발광을 판독했다. VS-HiBiT Kd를 결정하기 위해 동일한 프로토콜을 따랐지만, 포화 SmTrip9(20x Kd)와 VS-HiBiT 적정을 사용했다.
도 162. 디펩타이드를 5 uM로 희석하고, 희석제로서 0.2nM의 LgTrip과 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨을 사용하여 연속 5배 희석했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고 검정 플레이트에 삼반복으로 첨가했다. 일대일(one-to-one) 부피:부피의 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨과 20x 희석된 생세포 기질을 샘플에 첨가하고 플레이트를 10분 후에 GloMax® 광도계에서 판독했다.
도 163. LgTrip 변이체는 100 ug/ml 암피실린이 포함된 LB에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 세포를 유도 배지(100 ug/ml 암피실린 및 0.1% 람노스 w/v가 포함된 LB)로 20배 희석하고 진탕하면서 37℃에서 4시간 유도했다. 각 유도액 10 마이크로리터를 250 ul 용해 완충액(0.3X PLB + 25mM HEPES pH 7.5)에 희석했다. 80 마이크로리터의 용해액을 2 ml 용해 완충액에 추가로 희석했다. pep788(서열번호 414)의 10배 연속 희석물은 10μM 펩타이드에서 시작하여 희석제로서 50μM 푸리마진과 함께 Nano-Glo를 사용하여 수행했다. 펩타이드 희석액과 용해액을 1:1 부피:부피로 혼합하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고 발광을 판독했다.
도 164. LgTrip 변이체는 100ug/ml 암피실린이 포함된 LB에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 세포를 유도 배지(100ug/ml 암피실린 및 0.1% 람노스 w/v가 포함된 LB)로 20배 희석하고 진탕하면서 37℃에서 4시간 유도했다. 각 유도액 10 마이크로리터를 250 ul 용해 완충액(0.3X PLB + 25mM HEPES pH 7.5)에 희석했다. 80 마이크로리터의 용해액을 2 ml 용해 완충액에 추가로 희석했다. 50 μM 펩타이드로 시작하여 희석제로서 50 uM 푸리마진 및 50 μM pep289(서열번호 826)를 포함하는 Nano-Glo를 사용하여 pep759(서열번호 496)의 5배 희석 시리즈를 수행했다. 펩타이드 희석액과 용해액을 1:1 부피:부피로 혼합하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고 발광을 판독했다.
도 165. LgTrip 변이체는 100 ug/ml 암피실린이 포함된 LB에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 세포를 유도 배지(100 ug/ml 암피실린 및 0.1% 람노스 w/v가 포함된 LB)로 20배 희석하고 진탕하면서 25℃에서 20시간 유도했다. 각 유도액 20 마이크로리터를 40 ul 용해 완충액(0.3X PLB + 25mM HEPES pH 7.5)에 희석하고 실온에서 15분 동안 용해시켰다. 용해액을 1X TBS + 0.01% BSA로 1,000배 희석했다. 각 샘플 50 마이크로리터를 PCR 플레이트로 옮기고 열순환기에서 80℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션했다. 대조군을 얼음 위에서 인큐베이션했다. 샘플을 실온으로 평형화하고 1X TBS + 0.01% BSA로 1:100 희석했다. 25 마이크로리터의 각 샘플을 검정 플레이트로 옮기고 TBS + 0.01% BSA + 20x 희석된 생세포 기질 중 400 nM pep788(서열번호 414) 25 ul와 혼합했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고 발광을 판독했다.
도 166. LgTrip 변이체는 Promega MagneHis™ 단백질 정제 시스템을 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 정제하고 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 25 uM pep289에서 0.2 nM로 희석했다. 이 용액은 SmTrip9 펩타이드의 5배 연속 희석 시리즈의 희석제로 사용했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 평형화하고 검정 플레이트에 3반복으로 분취했다. 20 uM 푸리마진을 함유하는 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨을 샘플에 1:1 부피:부피 비율로 첨가했다. 플레이트를 10분 동안 인큐베이션하고 발광을 판독했다. VS-HiBiT Kd를 결정하기 위해 동일한 프로토콜을 따랐지만 포화 SmTrip9(25 uM) 및 VS-HiBiT 적정을 사용했다.
도 167. LgTrip 변이체는 Promega MagneHis™ 단백질 정제 시스템을 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 정제하고, TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 25 uM pep289에 0.2 nM로 희석했다. 이 용액은 SmTrip9 펩타이드의 5배 연속 희석 시리즈의 희석제로 사용했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 평형화하고 검정 플레이트에 3반복으로 분취했다. 20 uM 푸리마진을 함유하는 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨을 샘플에 1:1 부피:부피 비율로 첨가했다. 플레이트를 10분 동안 인큐베이션하고 발광을 판독했다. VS-HiBiT Kd를 결정하기 위해 동일한 프로토콜을 따랐으나, 포화 SmTrip9(25 uM) 및 VS-HiBiT 적정을 사용했다.
도 168. LgTrip 변이체는 Promega MagneHis™ 단백질 정제 시스템을 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 정제하고, TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 25 uM pep289에 0.2 nM로 희석했다. 이 용액은 SmTrip9 펩타이드의 5배 연속 희석 시리즈의 희석제로 사용했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 평형화하고 검정 플레이트에 3반복으로 분취했다. 20 uM 푸리마진을 함유하는 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨을 샘플에 1:1 부피:부피 비율로 첨가했다. 플레이트를 10분 동안 인큐베이션하고 발광을 판독했다. VS-HiBiT Kd를 결정하기 위해 동일한 프로토콜을 따랐으나, 포화 SmTrip9(12.5 uM) 및 VS-HiBiT 적정을 사용했다.
도 169. MagneHis 정제된 LgTrip 변이체는 TBS+0.01% BSA에 20nM로 희석했다. 3반복으로, 각 샘플의 100 μl 분취량을 200 μl의 박벽 PCR 튜브에 로딩했다. 샘플을 열 순환기에서 70℃로 인큐베이션했다. 샘플을 다양한 시점에서 제거하고 실온으로 평형화시켰다. 샘플을 TBS + 0.01% BSA에 0.2 nM(495 μl 중 5 μl)로 희석했다. 25 μl의 각각 희석된 샘플을 25 μl의 TBS + 0.01% BSA + 20x 희석된 생세포 기질 푸리마진 + 400nM pep788(서열번호 414)과 조합했다. 샘플을 10분 동안 인큐베이션한 다음, GMM+에서 판독했다. 반감기는 비선형 회귀에 의해 계산했다.
도 170. FKBP_SmTrip9 변이체 및 FRB-SmTrip10의 배양액은 LB + 100 ug/ml 암피실린에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 세포를 0.15% 글루코스, 0.1% 람노스 및 100 ug/ml 암피실린이 포함된 LB에 1:20으로 희석했다. 배양액은 진탕하면서 25℃에서 약 20시간 동안 유도했다. PLB 검정 시약은 444 nM의 MagneHis 정제된 LgTrip 변이체, 90x 희석된 FRB-SmTrip10 배양액, +/- 35 nM 라파마이신으로 제조했다. 90 마이크로리터의 검정 시약을 96-웰 검정 플레이트의 각 웰에 첨가했다. FKBP_SmTrip9 배양액을 PLB에 1:10으로 희석하고 10ul를 검정 플레이트에 첨가했다. 샘플을 실온에서 30분 동안 인큐베이션했다. 50 uM 푸리마진을 함유하는 100 마이크로리터의 Nano-Glo를 검정 플레이트 웰에 첨가하고, 5분 후에 GloMax® 광도계에서 발광을 판독했다.
도 171. FKBP_SmTrip9 변이체 및 FRB-SmTrip10의 배양액은 LB + 100 ug/ml 암피실린에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 세포를 0.15% 글루코스, 0.1% 람노스 및 100 ug/ml 암피실린이 포함된 LB에 1:20으로 희석했다. 배양액은 진탕하면서 25℃에서 약 20시간 동안 유도했다. PLB 검정 시약은 444 nM의 MagneHis 정제된 LgTrip 변이체, 90x 희석된 FRB-SmTrip10 배양액, +/- 35 nM 라파마이신으로 제조했다. 90 마이크로리터의 검정 시약을 96-웰 검정 플레이트의 각 웰에 첨가했다. FKBP_SmTrip9 배양액을 PLB에 1:10으로 희석하고 10ul를 검정 플레이트에 첨가했다. 샘플을 실온에서 30분 동안 인큐베이션했다. 50 uM 푸리마진을 함유하는 100 마이크로리터의 Nano-Glo를 검정 플레이트 웰에 첨가하고, 5분 후에 GloMax® 광도계에서 발광을 판독했다.
도 172. LgTrip 변이체는 100 ug/ml 암피실린이 포함된 LB에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 세포는 유도 배지(100 ug/ml 암피실린 및 0.1% 람노스 w/v가 포함된 LB)로 20배 희석하고 진탕하면서 25℃에서 20시간 유도했다. 각 유도액 20 마이크로리터를 40 ul 용해 완충액(0.3X PLB + 25mM HEPES pH 7.5)에 희석하고 실온에서 15분 동안 용해시켰다. 용해액은 1X TBS + 0.01% BSA에 1,000배 희석했다. 50 마이크로리터의 각 샘플을 PCR 플레이트로 옮기고 열순환기에서 70℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션했다. 대조군은 얼음 상에서 인큐베이션했다. 샘플을 실온으로 평형화하고 1X TBS + 0.01% BSA로 1:100 희석했다. 25 마이크로리터의 각 샘플을 검정 플레이트로 옮기고 TBS + 0.01% BSA + 20x 희석된 생세포 푸리마진 기질 중 25 ul의 400nM pep788(서열번호 414)과 혼합했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고 발광을 판독했다.
도 173. LgTrip 변이체는 100 ug/ml 암피실린이 포함된 LB에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 세포는 유도 배지(100 ug/ml 암피실린 및 0.1% 람노스 w/v가 포함된 LB)로 20배 희석하고 진탕하면서 25℃에서 20시간 유도했다. 각 유도액 20 마이크로리터를 40 ul 용해 완충액(0.3X PLB + 25mM HEPES pH 7.5)에 희석하고 실온에서 15분 동안 용해시켰다. 용해액은 1X TBS + 0.01% BSA에 1,000배 희석했다. 50 마이크로리터의 각 샘플을 PCR 플레이트로 옮기고, Veritas 열순환기에서 2가지 온도 구배, 즉 75 내지 100℃에서 10분 또는 50 내지 75℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션했다. 대조군은 얼음 상에서 인큐베이션했다. 샘플을 실온으로 평형화하고 1X TBS + 0.01% BSA로 1:100 희석했다. 25 마이크로리터의 각 샘플을 검정 플레이트로 옮기고 TBS + 0.01% BSA + 20x 희석된 생세포 푸리마진 기질 중 400nM pep788(서열번호 414) 25 ul와 혼합했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고 발광을 판독했다.
도 174. MagneHis 정제된 LgTrip 변이체는 TBS+0.01% BSA에 20 nM로 희석했다. 3반복으로, 각 샘플의 100 μl 분취량을 200 μl의 박벽 PCR 튜브에 로딩했다. 샘플을 열 순환기에서 70℃로 인큐베이션했다. 샘플을 다양한 시점에서 제거하고 실온으로 평형화시켰다. 샘플을 TBS + 0.01% BSA에 0.2 nM(495 μl 중 5 μl)로 희석했다. 25 μl의 각각 희석된 샘플을 25 μl의 TBS + 0.01% BSA + 20x 희석된 생세포 기질 푸리마진 + 400nM pep788(서열번호 414)과 조합했다. 샘플을 10분 동안 인큐베이션한 다음, GMM+에서 판독했다.
도 175. LgTrip 변이체는 Promega MagneHis™ 단백질 정제 시스템을 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 정제하고, TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 25 uM pep289에 0.2 nM로 희석했다. 이 용액은 SmTrip9 펩타이드의 5배 연속 희석 시리즈의 희석제로 사용했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 평형화하고 검정 플레이트에 3반복으로 분취했다. 20 uM 푸리마진을 함유하는 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨을 샘플에 1:1 부피:부피 비율로 첨가했다. 플레이트를 10분 동안 인큐베이션하고 발광을 판독했다. VS-HiBiT Kd를 결정하기 위해 동일한 프로토콜을 따랐으나, 포화 SmTrip9(12.5 uM) 및 VS-HiBiT 적정을 사용했다.
도 176. LgTrip 변이체는 Promega MagneHis™ 단백질 정제 시스템을 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 정제하고, TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 25 uM pep289에 0.2 nM로 희석했다. 이 용액은 SmTrip9 펩타이드의 5배 연속 희석 시리즈의 희석제로 사용했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 평형화하고 검정 플레이트에 3반복으로 분취했다. 20 uM 푸리마진을 함유하는 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨을 샘플에 1:1 부피:부피 비율로 첨가했다. 플레이트를 10분 동안 인큐베이션하고 발광을 판독했다. VS-HiBiT Kd를 결정하기 위해 동일한 프로토콜을 따랐으나, 포화 SmTrip9(12.5 uM) 및 VS-HiBiT 적정을 사용했다.
도 177. LgTrip 변이체는 Promega MagneHis™ 단백질 정제 시스템을 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 정제하고, TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 25 uM pep289에 0.2 nM로 희석했다. 이 용액은 SmTrip9 펩타이드의 5배 연속 희석 시리즈의 희석제로 사용했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 평형화하고 검정 플레이트에 3반복으로 분취했다. 20 uM 푸리마진을 함유하는 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨을 샘플에 1:1 부피:부피 비율로 첨가했다. 플레이트를 10분 동안 인큐베이션하고 발광을 판독했다. VS-HiBiT Kd를 결정하기 위해 동일한 프로토콜을 따랐으나, 포화 SmTrip9(12.5 uM) 및 VS-HiBiT 적정을 사용했다.
도 178. LgTrip 변이체는 Promega MagnaHisMagneHis™ 단백질 정제 시스템을 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 정제하고, TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 25 uM pep289에 0.2 nM로 희석했다. 이 용액은 SmTrip9 펩타이드의 5배 연속 희석 시리즈의 희석제로 사용했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 평형화하고 검정 플레이트에 3반복으로 분취했다. 20 uM 푸리마진을 함유하는 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨을 샘플에 1:1 부피:부피 비율로 첨가했다. 플레이트를 10분 동안 인큐베이션하고 발광을 판독했다. VS-HiBiT Kd를 결정하기 위해 동일한 프로토콜을 따랐으나, 포화 SmTrip9(25 uM) 및 VS-HiBiT 적정을 사용했다.
도 179. LgTrip 변이체는 Promega MagnaHisMagneHis™ 단백질 정제 시스템을 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 정제하고, TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 25 uM pep289에 0.2 nM로 희석했다. 이 용액은 SmTrip9 펩타이드의 5배 연속 희석 시리즈의 희석제로 사용했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 평형화하고 검정 플레이트에 3반복으로 분취했다. 20 uM 푸리마진을 함유하는 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨을 샘플에 1:1 부피:부피 비율로 첨가했다. 플레이트를 10분 동안 인큐베이션하고 발광을 판독했다. VS-HiBiT Kd를 결정하기 위해 동일한 프로토콜을 따랐으나, 포화 SmTrip9(20x Kd) 및 VS-HiBiT 적정을 사용했다.
도 180. LgTrip 변이체는 Promega MagnaHisMagnaHis™ 단백질 정제 시스템을 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 정제하고, TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 25 uM pep289에 0.2 nM로 희석했다. 이 용액은 SmTrip9 펩타이드의 5배 연속 희석 시리즈의 희석제로 사용했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 평형화하고 검정 플레이트에 3반복으로 분취했다. 20 uM 푸리마진을 함유하는 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨을 샘플에 1:1 부피:부피 비율로 첨가했다. 플레이트를 10분 동안 인큐베이션하고 발광을 판독했다. VS-HiBiT Kd를 결정하기 위해 동일한 프로토콜을 따랐으나, 포화 SmTrip9(20x Kd) 및 VS-HiBiT 적정을 사용했다.
도 181. LgTrip 변이체 배양액은 LB + 100 ug/ml 암피실린에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 세포를 0.15% 글루코스, 0.1% 람노스 및 100 ug/ml 암피실린이 포함된 LB에 1:20으로 희석하고, 진탕하면서 25℃에서 약 20시간 동안 유도했다. 세포를 PLB 검정 시약(0.3X PLB + 25mM HEPES pH 7.5)에 1000x 희석하고 20분 동안 용해시켰다. SmTrip9 pep840의 5배 연속 희석은 Nano-Glo + 50 uM 푸리마진 + 25 uM pep289에서 수행하고 LgTrip 용해액과 1:1 부피:부피로 혼합했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고 GloMax® 광도계에서 판독했다.
도 182. LgTrip 변이체는 Promega MagnaHisMagneHis™ 단백질 정제 시스템을 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 정제하고, TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 25 uM pep289에 0.2 nM로 희석했다. 이 용액은 SmTrip9 펩타이드의 5배 연속 희석 시리즈의 희석제로 사용했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 평형화하고 검정 플레이트에 3반복으로 분취했다. 20 uM 푸리마진을 함유하는 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨을 샘플에 1:1 부피:부피 비율로 첨가했다. 플레이트를 10분 동안 인큐베이션하고 발광을 판독했다. VS-HiBiT Kd를 결정하기 위해 동일한 프로토콜을 따랐으나, 포화 SmTrip9(25 uM) 및 VS-HiBiT 적정을 사용했다.
도 183. MagneHis 정제된 LgTrip 변이체는 TBS + 0.01% BSA에 20 nM로 희석했다. 3반복으로, 각 샘플의 100 μl 분취량을 200 μl의 박벽 PCR 튜브에 로딩했다. 샘플을 열 순환기에서 70℃로 인큐베이션했다. 샘플을 다양한 시점에서 제거하고 실온으로 평형화시켰다. 샘플을 TBS + 0.01% BSA에 0.2 nM(495 μl 중 5 μl)로 희석했다. 25 μl의 각각 희석된 샘플을 25 μl의 TBS + 0.01% BSA + 20x 희석된 생세포 기질 푸리마진 + 200nM pep900(서열번호 907)과 조합했다. 샘플을 10분 동안 인큐베이션한 다음, GMM+에서 판독했다. 반감기는 비선형 회귀로 계산했다.
도 184. FKBP_SmTrip9 변이체 및 FRB-SmTrip10의 배양액은 LB + 100 ug/ml 암피실린에서 37℃ 하에 밤새 성장시켰다. 세포는 0.15% 글루코스, 0.1% 람노스, 및 100 ug/ml 암피실린이 포함된 LB에 1:20으로 희석했다. 배양액은 진탕하면서 25℃에서 약 20시간 동안 유도했다. PLB 검정 시약은 444 nM의 MagneHis 정제된 LgTrip 변이체, 90x 희석된 FRB-SmTrip10 배양액, +/- 35 nM 라파마이신으로 제조했다. 90 마이크로리터의 검정 시약을 96-웰 검정 플레이트의 각 웰에 첨가했다. FKBP_SmTrip9 배양액을 PLB에 1:10으로 희석하고 10 ul를 검정 플레이트에 첨가했다. 샘플을 실온에서 30분 동안 인큐베이션했다. 50 uM 푸리마진을 함유하는 Nano-Glo를 100 마이크로리터로 검정 플레이트 웰에 첨가하고, 5분 후에 GloMax에서 발광을 판독했다.
도 185. LgTrip 변이체는 LB + 100 ug/ml 암피실린에서 37℃ 하에 밤새 성장시켰다. 세포는 0.15% 글루코스, 0.1% 람노스, 및 100 ug/ml 암피실린이 포함된 LB에 1:20으로 희석하고, 진탕 하에 25℃에서 약 20시간 동안 유도했다. 세포를 0.3x PLB 검정 시약에서 5000x 연속 희석하고 20분 동안 용해시켰다. 포화 pep289에 의한 디펩타이드 pep788, pep900 또는 SmTrip9 pep840의 5배 연속 희석은 Nano-Glo + 50 uM 푸리마진으로 수행하고 LgTrip 변이체 용해액과 1:1 부피:부피로 혼합했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고 GloMax® 광도계에서 판독했다. Bmax는 비선형 회귀로 계산했다.
도 186. LgTrip 변이체는 2ml TBS + 0.01% BSA에 20 nM로 희석했고, 각 샘플 100 ul는 96웰 PCR 플레이트(2개 플레이트)의 이반복 줄에 분취했다. 플레이트를 Veritas 열순환기에서 고온(75-100℃) 또는 저온(50-75℃) 온도 구배에서 3시간 동안 인큐베이션했다. 샘플을 70℃에 놓고, 그 다음 분취량을 다양한 시점에서 RT로 옮겼다. 샘플을 RT로 평형화했다. 각 시점의 샘플을 피펫으로 혼합한 다음, TBS + 0.01% BSA(495 ul에 5ul)에 1:100으로 희석했다. 각 샘플 25ul를 흰색 검정 플레이트에 분취하고 TBS + 0.01% BSA + 20x 희석 LCS 중 200nM pep788 또는 pep900 25ul를 첨가했다. 플레이트를 10분 동안 인큐베이션한 다음, GMM+에서 발광을 판독했다.
도 187. FKBP_SmTrip9 변이체 및 FRB-SmTrip10의 배양액은 LB + 100 ug/ml 암피실린에서 37℃ 하에 밤새 성장시켰다. 세포는 0.15% 글루코스, 0.1% 람노스, 및 100 ug/ml 암피실린이 포함된 LB에 1:20으로 희석했다. 배양액은 진탕하면서 25℃에서 약 20시간 동안 유도했다. PLB 검정 시약은 444 nM의 MagneHis 정제된 LgTrip 변이체, 90x 희석된 FRB-SmTrip10 배양액, 및 +/- 35 nM 라파마이신으로 제조했다. 90 마이크로리터의 검정 시약을 96-웰 검정 플레이트의 각 웰에 첨가했다. FKBP_SmTrip9 배양액은 PLB에 1:10으로 희석하고 10 ul를 검정 플레이트에 첨가했다. 샘플을 실온에서 30분 동안 인큐베이션했다. 50 uM 푸리마진을 함유하는 Nano-Glo를 100 마이크로리터로 검정 플레이트 웰에 첨가하고, 5분 후에 GloMax® 광도계에서 발광을 판독했다.
도 188. LgTrip 3546은 OptiMEM+10% FBS에 1nM로 희석했다. 가닥 9 펩타이드 521 및 693의 12μM 용액을 OptiMem+10% FBS에 제조했다. 각 가닥 9 희석액을 사용하여 20μM에서 시작하는 각 가닥 10 펩타이드의 3배 희석 시리즈를 제조했다. (pep86=HiBiT, pep289=VS HiBiT, pep691=HiBiT RR, pep692=VSHiBiT RR). 각 희석 시리즈 90μl를 흰색 검정 플레이트로 옮긴 다음, LgTrip 3546의 1μM 스톡 10μl를 첨가했다. 플레이트를 30분 동안 600RPM로 설정된 궤도 진탕기에 놓았다. 10mM DTT와 50uM 푸리마진으로 이루어진 OptiMEM + 10% FBS의 검출 시약을 준비하고 11μl를 샘플에 첨가했다. 플레이트를 궤도 진탕기에 놓고 실온에서 5분 동안 혼합했다. 플레이트는 GloMax® Multi+ 광도계에서 판독했다. Kd 및 Bmax는 GraphPad Prism 1부위 특이적 결합을 사용하여 계산했다.
도 189. 단백질 정제. 각 샘플에 대한 배양액은 LB + 30 ug/ml KAN 중의 단리된 콜로니로부터 시작하여, 37℃에서 20시간 동안 성장시켰다. 배양액은 30 ug/ml KAN, 0.1% 람노스 및 0.15% 글루코스가 보충된 LB에 1:100(50 ml 중 500 ul)으로 희석했다. 배양액을 25℃에서 20시간 동안 성장시켰다. 세포를 회전시키고 9ml 100mM HEPES pH 7.5 + 1ml FastBreak 용해 완충액 + 200ul RQ DNAse I에 재현탁시키고 궤도 혼합기에 4℃에서 30분 동안 두었다(총 용해액의 분취량을 보관했다). 각 샘플을 회전시켜(7000RPM 15분) 용해액을 제거하고 MagneHis™ 정제 시스템(Promega V8550)을 사용하여 단백질을 정제했다. 1ml의 MagneHis™ 자성 수지를 각각 청징화된 용해액에 첨가하고 10분 동안 궤도 혼합기에 두었다. 각 샘플을 세척 완충액으로 3회 세척한 후 용출 완충액 500 ul를 2회 사용하여 샘플을 회수했다. 샘플은 2시간 동안 10,000 MWCO 투석 단위(Thermo 88404)를 사용하여 1X TBS로 투석했다.
도 190. NanoLuc(ATG-462)와 단량체 LgBiT-SmBiT 단백질의 발광 비교. 정제된 단백질을 TBS + 0.01% BSA에 0.2 nM로 희석했다. 각 샘플 50 ul를 Nano-Glo® 완충액(N113, N112) 중 50 uM Fz 50 ul와 조합하고, 기질 첨가 3분 후에 GMM+ 광도계에서 발광을 측정했다. NanoLuc은 단량체 작제물에 비해 약 2배 더 밝았다.
도 191. Km 결정. 정제된 단백질을 TBS + 0.01% BSA에 0.2 nM로 희석했다. 50 uM(2ml 중 40 ul)에서 시작하는 Nano-Glo® 완충액에 Fz의 2배 희석 시리즈를 제조한 다음 1 ml 대 1 ml로 희석한다. 50 ul의 각 샘플을 이반복으로 50 ul의 적정 시리즈와 합하고, RT에서 3분 동안 인큐베이션한 다음, GMM+에서 발광을 판독한다.
도 192. NanoLuc(ATG-462)와 비교한 단량체 LgBiT-SmBiT 단백질의 안정성. 각 샘플을 TBS + 0.01% BSA에서 2nM로 희석하고, 96웰 PCR 플레이트의 다수 웰에 분취하고, 온도 구배를 사용하여 30분 동안 열순환기 세트에 두었다. 30분 인큐베이션 후, 5 ul의 각 샘플을 45 ul의 TBS + 0.01% BSA와 조합하고, Nano-Glo® 완충액에 희석된 Fz 50 ul를 첨가하고, 3분 동안 인큐베이션하고, GMM+ 광도계에서 발광을 측정했다. 온도 구배 A: 54°, 57°, 60°, 63°, 66° 및 70℃. 온도 구배 B: 55°, 60°, 65°, 70°, 75° 및 80℃. 온도 구배 C: 65°, 70°, 75°, 80°, 85° 및 90℃.
도 193. 열안정성 비교. 각 샘플을 TBS + 0.01% BSA에 2nM로 희석하고, 2개의 96-웰 PCR 플레이트의 다수 웰에 분취하고, 열순환기 세트에 온도 구배를 사용하여 30분 동안 두었다. (75°, 80°, 85°, 90°, 95° 및 100℃). 30분 인큐베이션 후, 각 샘플 5 ul를 TBS + 0.01% BSA 45 ul와 조합하고, Nano-Glo® 완충액에 희석된 Fz 50 ul를 첨가하고, 3분 동안 인큐베이션하고, GMM+ 광도계에서 발광을 판독했다. 위치 159G는 159S에 비해 향상된 안정성을 제공한다.
도 194. NanoLuc를 사용한 LgBiT-SmBiT 변이체의 안정성 비교. 샘플을 2 nM로 희석하고, 96-웰 PCR 플레이트의 웰에 분취하고, 60℃로 설정된 열순환기에 두었다. 다양한 시점에서 분취량을 제거하고 얼음 위에 두었다. 모든 샘플을 인큐베이션한 후, 샘플을 RT로 평형화시키고, 각 샘플 5 ul를 TBS + 0.01% BSA 45 ul와 조합했다. 50 ul의 Nano-Glo® 완충액 + 50 uM Fz를 첨가하고, 플레이트를 3분 동안 인큐베이션한 후, GMM+ 광도계에서 발광을 측정했다. 60℃ 안정성 곡선은 LgBiT-SmBiT가 NanoLuc에 비해 약간 더 안정적이고 LgBiT-HiBiT가 NanoLuc에 비해 훨씬 더 안정적인 온도 구배 곡선과 일치한다.
도 195. 승온에서 단량체 LgBiT-SmBiT의 안정성. 샘플을 TBS + 0.01% BSA에 200 nM로 희석한 다음, 0.2 nM(4 ml 중 4 ul)로 추가로 희석했다. ATG-462 또는 ATG-3564 50 ul를 박벽 PCR 트레이의 웰에 50 ul의 Nano-Glo® 완충액 + 50uM Fz 또는 50 ul의 TBS + 0.01% BSA + 20 uM Fz와 조합하고, 트레이를 55°, 60°, 65°, 70°, 75° 및 80℃ 구배의 Veritas 열순환기 세트에 두었다. 다양한 시점에서 샘플을 제거하고 GMM+ 광도계에서 발광을 측정했다.
도 196. 승온에서 30분 동안 단량체 LgBiT-SmBiT의 안정성. 샘플을 TBS + 0.01% BSA에 200 nM로 희석한 다음, 0.2 nM(4 ml 중 4 ul)으로 추가로 희석했다. ATG-462 또는 ATG-3564 50 ul를 50 ul의 Nano-Glo® 완충액 + 50 uM Fz 또는 50 ul 의 TBS + 0.01% BSA + 20 uM Fz와 박벽 PCR 트레이의 웰에서 조합하고, 트레이를 55°, 60°, 65°, 70°, 75° 및 80℃ 구배의 Veritas 열순환기 세트에 두었다. 30분째에 발광을 측정했다.
도 197. 정제된 NanoLuc® 돌연변이체에 대한 Km 및 Vmax 측정. 정제된 단백질을 TBS + 0.01% BSA에 0.2 nM로 희석했다. Nano-Glo® 완충액 중 Fz의 2배 희석 시리즈는 50 uM(2 ml에 40 ul)에서 시작하고 그 다음 1 ml 대 1 ml로 희석한다. 이반복으로 50 ul의 각 샘플을 50 ul의 적정 시리즈와 조합하고 실온에서 3분 동안 인큐베이션하고, GMM+ 광도계에서 발광을 판독했다.
도 198. 열적 도전.
도 199. 안정적인 변이체를 이용한 열적 도전. 각 샘플을 TBS + 0.01% BSA에서 2 nM로 희석하고, 2개의 96-웰 PCR 플레이트의 다수 웰에 분취하고, 온도 구배를 사용하여 열순환기 세트에 30분 동안 두었다. (70°, 75°, 80°, 85°, 90° 및 95℃). 30분 인큐베이션 후, 5 ul의 각 샘플을 45 ul의 TBS + 0.01% BSA와 조합하고, Nano-Glo® 완충액에 희석된 Fz 50 ul를 첨가하고, 3분 동안 인큐베이션하고, GMM+ 광도계에서 발광을 측정했다.
도 200. 검출기 단백질을 이용한 pep521 및 pep 40의 비교. 각 단백질은 TBS + 0.01% BSA에서 20 nM로 희석했다. pep521 및 pep840의 3X 희석 시리즈는 20uM에서 시작하여 TBS + 0.01% BSA에 제조했다. 이반복으로, 각 효소 희석액 50 ul를 각 펩타이드 적정액 50 ul와 조합하고 예비평형화를 위해 진탕기에서 10분 동안 인큐베이션했다. 검정 완충액은 Nano-Glo 생세포 기질(LCS; Promega N205)를 TBS + 0.01% BSA에 30배 희석하여 제조했고, 100 ul을 각 웰에 첨가했고, 5분 동안 인큐베이션하고, GMM+ 광도계에서 발광을 측정했다. 배경 판독값은 펩타이드를 함유하지 않는 샘플로부터 수득했다.
도 201. 가닥 9 검출기 단백질과 pep840의 비교. 각 단백질은 TBS + 0.01% BSA에 200 nM로 희석했다. pep840의 3배 희석 시리즈는 0.5 uM에서 시작하여 TBS + 0.01% BSA에 제조했다. 4반복으로 각 효소 희석액 50 ul를 각 펩타이드 적정액 50 ul와 조합하고 예비평형화를 위해 진탕기에서 10분 동안 인큐베이션했다. Nano-Glo LCS(Promega N205)를 TBS + 0.01% BSA에 30배 희석하여 검정 완충액을 제조하고, 각 웰에 100 ul를 첨가하고, 5분 동안 인큐베이션하고, GMM+ 광도계에서 발광을 측정했다. 펩타이드가 함유되지 않은 샘플에서 배경 판독값을 수득했다.
도 202. 테스트 링커 시리즈. 각 샘플의 밤샘 배양액은 LB + 100 ug/ml amp에 제조했다. 다음 날, 배양액을 LB + 0.1% 람노스 + 100 ug/ml amp에 1:20(3 ml에 150 ul)으로 희석하고, 37℃에서 4시간 동안 성장시킨 다음, PLB 용해 완충액(0.3X 수동 용해 완충액(Promega) + 25mM HEPES pH 7.5)(4.5 ml의 PLB 용해 완충액에 500 ul의 용해액)으로 용해시켰다. 검정하기 위해, 용해액을 TBS + 0.01% BSA에 1:100으로 희석했다. 10 nM에서 시작하는 가닥 9(pep840)의 3X 희석 시리즈를 제조하고, 50 ul를 각 샘플의 희석된 용해액 50 ul와 혼합하고, 600rpm으로 설정된 궤도 진탕기에서 RT 하에 20분 동안 인큐베이션했다. 100 ul의 NanoGlo® 완충액 + 50 uM 푸리마진(N113)을 첨가했고, GMM+ 광도계에서 발광을 측정했다. ATG-5485, 5AA 링커를 제외한, 각 클론은 ATG-4992와 유사한 RLU 값을 생성했다.
도 203. 링커 비교: 8GS(ATG-4992) 대 11GS(ATG-5490). ATG-4992 및 ATG-5490을 MagneHis™ 정제 시스템을 사용하여 정제하고 CO2 독립 배지 + 10% FBS에 100 nM로 희석했다. 10 nM로 시작하여 Nano-Glo® 완충액 + 50 uM 푸리마진에 pept840의 3배 연속 희석액을 제조했다. 50 ul의 각 효소 희석액을 50 ul의 펩타이드 적정액과 함께 4반복으로 조합했다. GMM+ 광도계에서 시간 경과에 따라 발광을 측정했다. 플로팅된 데이터는 50분 동안의 동역학 판독값에서 유래된 것이다. ATG-5490은 ATG-4992에 비해 약 2배 더 높은 신호를 보였다.
도 204. ATG-4992 및 ATG-5490의 돌연변이체의 Kd. LB+100 ug/ml amp에서 각 샘플의 밤샘 배양액을 준비했다. 다음 날, 배양액을 LB + 0.1% 람노스 + 100 ug/ml amp에 1:20(3ml 중 150ul)으로 희석하고, 37℃에서 4시간 동안 성장시키고, PLB 용해 완충액(4.5ml의 PLB 용액 완충액에 용해액 500 ul)으로 용해시켰다. 검정하기 위해, 용해액을 TBS + 0.01% BSA에 1:100 희석했다. 40 uM에서 시작하는 가닥 9(pep840)의 3X 희석 시리즈를 준비하고, 50 ul을 각 샘플의 희석 용해액 50 ul와 조합하고, 600rpm으로 설정된 궤도 진탕기에서 RT 하에 20분 동안 인큐베이션했다. 100 ul의 Nano-Glo® 완충액 + 50uM 푸리마진(N113)을 첨가하고, GMM+ 광도계에서 발광을 측정했다.
도 205. ATG-4992와 ATG-5490의 돌연변이체 비교. 단백질을 정제하고(MagneHis™ Purification System, Promega), CO2 독립 배지 + 10% FBS에 100 nM로 희석했다. 2nM로 시작하는 pep840을 가지고 3배 희석 시리즈를 Nano-Glo® 완충액 + 50uM 푸리마진에 제조했다. 50ul의 각 효소 희석액을 푸리마진/NanoGlo 용액 중 각 펩타이드 적정액 50 ul와 3반복으로 조합했다. 5분마다 발광을 측정했다. 데이터는 60분 시점부터 플로팅한다. 클론 ATG-5515 및 ATG-5517은 계산된 Kd 값이 더 낮았고 pep840과 쌍을 이룰 때 더 높은 RLU 값을 보여주었고 약간 더 높은 신호 대 배경을 보여주었다.
도 206. 생화학적 분석. 샘플을 MagneHis™ 단백질 정제 시스템(Promega V8500)을 사용하여 정제하고 TBS + 0.01% BSA에 0.2 nM로 희석했다. VS-HiBiT 펩타이드(pep289)의 3X 희석 시리즈는 TBS + 0.01% 터지톨에 제조했다. 400 nM에서 시작하는 하나의 시리즈를 제조했고 다른 시리즈는 20 uM에서 시작했다. 희석된 각 효소(0.2 nM) 50 ul를 각 펩타이드 적정액 50 ul와 조합하고 진탕기에서 10분 동안 인큐베이션했다. TBS + 0.01% BSA에 250배 희석된 Fz 100 ul를 첨가했고, 플레이트를 진탕기에 5분 동안 두었고, GMM+ 광도계에서 발광을 측정했다. Kd 및 Bmax는 GraphPad 프리즘 일 부위 특이적 결합 회귀를 사용하여 계산했다.
도 207. 다양한 pH에서의 활성. 정제된 효소의 각 샘플을 TBS + 0.01% BSA에 0.2 nM로 희석하고, 20 uM VS HiBiT(pep289)를 각 용액에 첨가하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션했다. 각 pH 완충액 990 ul를 심부 웰 플레이트의 웰에 분취하고, 푸리마진(Promega, N113) 10 ul를 첨가하고, pH 완충액/푸리마진 용액 50 ul와 각 효소/펩타이드 희석액 50 ul를 첨가했다. 샘플을 실온에서 12분 동안 인큐베이션하고 GMM+ 광도계에서 발광을 측정했다. 데이터는 pH 8.49 샘플에 대해 정규화했다.
도 208. ATG-5823, ATG-5824, ATG-5825 및 ATG-5146(pep 263)의 생화학적 비교. MageHis™ 정제 시스템(Promega)을 사용하여 단백질(ATG-5823, ATG-5824 및 ATG-5825)을 정제했다. ATG-5146은 니켈 세파로스(Nickel Sepharose) 컬럼을 구비한 AKTA를 사용하여 정제했다. 정제된 단백질은 먼저 TBS + 0.01% BSA에 200 nM로 희석한 다음, TBS + 0.01% BSA에 0.2nM로 추가로 희석했다. 100nM에서 시작하여 pep263의 3배 희석 시리즈는 TBS + 0.01% BSA + 0.02% 터지톨에서 제조했다. 50 ul의 각 효소를 50 ul의 펩타이드 희석 시리즈와 조합했다. 샘플을 궤도 진탕기(600RPM)에서 10분 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 100ul의 LCS(N205 Promega)를 TBS + 0.01% BSA에 1:30으로 희석하고 각 샘플에 첨가했다. 샘플을 실온에서 3분 동안 인큐베이션한 후, 발광을 측정했고 GloMaxMulti+에서 발광을 측정했다.
도 209. pep86을 이용한 ATG-5826 및 ATG-5827의 생화학적 비교. 단백질은 MagneHis™ 정제 시스템(Promega V8500)을 사용하여 정제했다. 정제된 단백질을 먼저 TBS + 0.01% BSA에 200 nM로 희석한 다음, TBS + 0.01% BSA에 0.2nM로 추가로 희석했다. TBS + 0.01% BSA + 0.02% 터지톨에서 1 uM 및 100 nM로 시작하는 2가지 2배 적정 시리즈의 pep86을 제조했다. 50 ul의 ATG-5826 및 ATG-5827을 1 uM에서 시작하는 50 ul의 펩타이드 희석 시리즈와 조합했다. 50 ul의 LgBiT 단백질(Promega N401C)을 100 nM에서 시작하는 펩타이드 적정 시리즈와 조합했다. 샘플을 궤도 진탕기(600RPM)에서 10분 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 100 ul의 LCS(N205 Promega)를 TBS + 0.01% BSA에 1:30으로 희석하여 각 샘플에 첨가했다. 샘플을 실온에서 3분 동안 인큐베이션한 후, 발광을 측정했고, GloMaxMulti+에서 발광을 측정했다.
도 210. pep114를 이용한 ATG-5826 및 ATG-5827의 생화학적 비교. 단백질은 MagneHis™ 정제 시스템(Promega V8500)을 사용하여 정제했다. 정제된 단백질을 먼저 TBS + 0.01% BSA에 200 nM로 희석한 다음, TBS + 0.01% BSA에 0.2nM로 추가로 희석했다. TBS + 0.01% BSA + 0.02% 터지톨에서 1 mM로 시작하는 2가지 2배 적정 시리즈의 pep114를 제조했다. 50 ul의 ATG-5826, ATG-5827 및 LgBiT 단백질(Promega N401C)을 펩타이드 적정 시리즈와 조합했다. 샘플을 궤도 진탕기(600RPM)에서 30분 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 100 ul의 LCS(N205 Promega)를 TBS + 0.01% BSA에 1:30으로 희석하여 각 샘플에 첨가했다. 샘플을 실온에서 3분 동안 인큐베이션한 후, 발광을 측정했고, GloMaxMulti+에서 발광을 측정했다.
도 211. SDS PAGE 분석. 각 단백질은 TBS+1X SDS 로딩 염료 중에 0.1 ug/ml로 희석했다. 샘플은 70℃로 5분 동안 가열했고, 그 후, 3 ul를 SDS PAGE 겔에 로딩했다.
도 212. SARS-COV-2 검출을 위한 예시적인 검정 형식.
도 213. 반응성 펩타이드를 스크리닝하는 데 사용된 예시적인 시약. SulfoSE는 표적 단백질 상의 리신과 반응하며, PEG6 링커 및 피리디늄 설폰산(PSA)은 용해도를 제공하고, PSA는 표지 밀도를 측정하는 데 사용할 수 있는 UV 시그니처를 가지고 있다.
도 214. SARS-COV-2 검출을 위한 대안적 표지화 전략의 항체 적정 급등(spike-in).
도 215. 정제된 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 항원 검출.
도 216. 수동식 검정에서 동결건조된 항원 검정에 의해 테스트된 샘플. 환자의 비강 면봉을 시약 튜브에 넣어 튜브 바닥의 호일 밀봉을 파괴했다. 완충액이 들어있는 시약 캡을 샘플이 들어 있는 시약 튜브 위에 놓고 잠근다. 완충액 캡슐을 깨서 방출시킨 다음, 흔들었다. 시약 튜브를 수동식 광도계에 삽입하고 샘플을 분석했다.
도 217. 플루오로-Fz를 갖는 단량체 NanoBiT. 테스트할 각 효소를 TBS + 0.01% BSA에 희석했다. FZ(N205) 또는 JRW-1677 중 어느 하나에 의한 적정 시리즈는 TBS(20 uM에서 시작) 또는 NanoGlo(25 uM에서 시작)로 제조했다. 각 기질을 TBS + 0.01% BSA 또는 Nano-Glo® 완충액(Promega N112)으로 연속 희석했다. 각 효소 희석액 50 ul를 각 기질 적정액 50 ul와 조합하고, 3분 동안 인큐베이션한 후, GMM+ 광도계에서 발광을 측정했다. Fz 및 JRW-1667에 대한 동역학 매개변수를 계산했다. 기질을 희석할 때 TBS를 사용한 단량체 NanoBiT 작제물과 비교하여, NanoLuc(ATG-462)는 Fz 및 JRW-1667 모두에 의해 더 높은 RLU 값을 생성했다(약 10 내지 20배). NanoLuc 및 단량체 작제물은 Fz/NanoGlo 완충액에 대해 유사한 RLU 값을 나타내었지만 NanoLuc 단독은 JRW-1667에 의해 개선된 발광을 나타내었다. 단량체 NanoBiT 작제물은 Fz 및 JRW-1667 둘 모두에 의해 더 낮은 RLU 값을 나타내었지만, 두 완충액 및 두 기질에서 RLU 값은 유사했다. Km 값은 NanoGlo에 비해 TBS + 0.01% BSA에서 더 낮지만, 일반적으로 Km 값은 테스트된 모든 조건에 대해 더 낮은 계산된 Km을 나타낸 ATG-3562(단량체 LgBiT-SmBiT)를 제외한 각 조건에서 유사했다.
도 218. HaloTag-LgBiT* - 포유동물 세포 발현 및 형광 이미지화. HeLa 세포에서 HaloTag-LgBiT*의 면역형광 이미지는 세포내 편재적인 분포를 보여주었다. 왼쪽: 적색 채널 단독, 중간: 청색 채널 단독, 오른쪽: 중첩.
도 219. 핵 센서 - 포유동물 세포 발현 및 형광 이미지화. HeLa 세포에 있는 핵 센서의 면역형광 이미지는 핵 국재화를 보여주었다. 왼쪽: 적색 채널 단독, 중간: 청색 채널 단독, 오른쪽: 중첩.
도 220. 미토콘드리아 센서 - 포유동물 세포 발현 및 형광 이미지화. HeLa 세포에서 미토콘드리아 센서의 면역형광 이미지는 미토콘드리아 매트릭스 중의 국재화를 보여주었다. DNA는 청색으로 염색된다. 왼쪽: 적색 채널 단독, 중간: 녹색 채널 단독, 오른쪽: 중첩.
도 221. ER 센서 - 포유동물 세포 발현 및 형광 이미지화. Hela 세포에 있는 소포체 센서(ER)의 면역형광 이미지는 ER 국재화를 보여주었다. DNA는 청색으로 염색된다. 왼쪽: 녹색 채널 단독; 중간: 적색 채널 단독; 오른쪽: 중첩.
도 222. 골지 센서 - 포유동물 세포 발현 및 형광 이미지화. Hela 세포에 있는 골지 센서의 면역형광 이미지는 골지 국재화를 보여주었다. 골지-GFP 마커는 시스-골지만을 염색했다. 본 발명자들의 골지체 센서의 일부는 골지-GFP 마커와 공동국재화되지 않았고, 이는 골지 센서가 시스 골지 및 트랜스 골지 둘 모두로 존재할 수 있음을 시사한다. DNA는 청색으로 염색된다. 왼쪽: 적색 채널 단독; 중간: 녹색 채널 단독, 오른쪽: 중첩.
도 223. 리소좀 센서 - 포유동물 세포 발현 및 형광 이미지화. HeLa 세포에 있는 리소좀 센서의 면역형광 이미지는 리소좀으로의 국재화를 보여주었다. DNA는 청색으로 염색된다. 왼쪽: 적색 채널 단독, 중간: 녹색 채널 단독, 오른쪽: 중첩.
도 224. 막 센서 - 포유동물 세포 발현 및 형광 이미지화. HeLa 세포에 있는 막 센서의 면역형광 이미지는 원형질막으로의 국재화를 보여주었다. DNA는 청색으로 염색된다. 왼쪽: 적색 채널 단독, 중간: 녹색 채널 단독, 오른쪽: 중첩.
도 225. 막 센서 - 포유동물 세포 발현 및 발광 검정. PMA 자극 하에서 PKCα의 전위. PKCα-HiBiT 클론(HeLa)은 막 센서에 의해 일시적으로 형질감염되었다. 형질감염된 세포는 포르볼-12-미리스테이트-13 아세테이트(PMA)로 처리했고 동역학적으로 측정했다. 3개의 막 센서는 전부 유사한 EC50을 초래했고, 이는 HiBiT에 대한 LgBiT 변이체의 친화도가 PKCα의 전위 이벤트에 영향을 미치지 않음을 시사한다.
도 226. 막/HaloTag-LgBiT 센서 - 포유동물 세포 발현 및 발광 검정. HiBiT-LgBiT* 복합체의 가역성. 증가된 PMA 농도는 더 많은 PKCα를 원형질막으로 모집하고, 더 많은 PKCα-HiBiT가 LgBiT* 막 센서를 상보성하므로 더 높은 발광 신호를 생성한다. 반대로, 시토졸에는 더 적은 PKCα가 축적하며; 따라서 HaloTag-LgBiT(시토졸 센서)와 쌍을 이루면 발광 신호가 감소한다.
도 227. PKCα의 전위 이벤트. PKCα 전위 이벤트의 동역학적 측정. 원형질막에 대한 PKCα의 축적은 막 센서와 쌍을 이룰 때 동역학적으로 측정될 수 있다. PMA 자극 하에서, PKCα는 t = 16분에 원형질막에 최대 축적에 도달한다.
정의
본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본원에 기재된 실시양태의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 일부 바람직한 방법, 조성물, 장치 및 재료가 본원에 기재된다. 하지만, 본 재료 및 방법을 설명하기에 앞서, 본 발명은 본원에 설명된 특정 분자, 조성물, 방법론 또는 프로토콜에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 하는데, 이는 이들이 일상적인 실험 및 최적화에 따라 달라질 수 있기 때문이다. 또한, 본원에 사용된 용어는 특정 버전 또는 실시양태만을 설명하기 위한 것이며, 본원에 설명된 실시양태의 범위를 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 그러나, 상충되는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선한다. 따라서, 본원에 기술된 실시양태의 문맥에서는 다음 정의가 적용된다.
본원 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 ("a", "an") 및 상기 ("the")는 문맥이 명백하게 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "펩타이드"에 대한 언급은 본 기술분야의 기술자에게 공지된 하나 이상의 펩타이드 및 이의 등가물 등에 대한 언급이다.
본원에 사용된 용어 "및/또는"은 개별적으로 열거된 항목 중 임의의 것을 포함하는 열거된 항목의 임의의 조합 및 모든 조합을 포함한다. 예를 들어, "A, B 및/또는 C"는 A, B, C, AB, AC, BC 및 ABC를 포괄하며, 이들 각각은 "A, B 및/또는 C"라는 표현에 의해 별도로 설명된 것으로 고려되어야 한다.
본원에 사용된 용어 "포함한다" 및 이의 언어적 변형은 추가 특징(들), 요소(들), 방법 단계(들) 등의 존재에 대한 배제없이, 인용된 특징(들), 요소(들), 방법 단계(들) 등의 존재를 나타낸다. 반대로, "이루어지는"이라는 용어 및 이의 언어적 변형은 인용된 특징(들), 요소(들), 방법 단계(들) 등의 존재를 나타내며, 일상적으로 연합된 불순물을 제외한, 인용되지 않은 임의의 특징(들), 요소(들), 방법 단계(들) 등을 배제한다. "본질적으로 이루어지는"이라는 문구는 인용된 특징(들), 요소(들), 방법 단계(들) 등 및 조성물, 시스템, 또는 방법의 기본 특성에 중대한 영향을 미치지 않는 임의의 부가적인 특징(들), 요소(들), 방법 단계(들) 등을 나타낸다. 본원의 많은 실시양태는 개방적인 "포함하는" 언어를 사용하여 설명된다. 이러한 실시양태는 다수의 폐쇄적인 "이루어지는" 및/또는 "본질적으로 이루어지는" 실시양태를 포괄하며, 이는 대안적으로 이러한 언어를 사용하여 청구되거나 설명될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "실질적으로"는 인용된 특성, 매개변수 및/또는 값이 반드시 정확하게 달성되어야 하는 것은 아니지만, 예를 들어, 본 기술분야에 공지된 허용 오차, 측정 오차, 측정 정확도 한계 및 기타 요인을 포함한 편차 또는 변이가 그 특성이 제공하고자 한 효과를 방해하지 않는 양으로 발생할 수 있음을 의미한다. 실질적으로 존재하지 않는 특성 또는 특징(예를 들어, 실질적으로 비발광성)은 잡음 이내이거나, 배경 아래이거나, 사용되는 검정의 검출 역량 미만이거나, 또는 유효 특성(예를 들어, 발광 단백질 또는 발광 복합체의 발광 강도)의 소량 분획(예를 들어, <1%, <0.1%, <0.01%, <0.001%, <0.00001%, <0.000001%, <0.0000001%)인 것일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "생물발광"은 효소, 단백질, 단백질 복합체 또는 기타 생체분자(예를 들어, 생물발광 복합체)에 의해 촉매되거나 이에 의해 가능해진 화학 반응에 의한 빛의 생성 및 방출을 의미한다. 전형적인 실시양태에서, 생물발광 실체(entity)(예를 들어, 생물발광 단백질 또는 생물발광 복합체)에 대한 기질은 생물발광 실체에 의해 불안정한 형태로 전환되고; 기질은 이어서 빛을 방출한다.
본원에 사용된 용어 "상보적"은 서로 혼성화, 이량체화 또는 그렇지 않으면 복합체를 형성할 수 있는 2개 이상의 구조적 요소(예를 들어, 펩타이드, 폴리펩타이드, 핵산, 소분자 등)의 특성을 지칭한다. 예를 들어, "상보적 펩타이드 및 폴리펩타이드"는 복합체를 형성하기 위해 합쳐질 수 있다. 상보적 요소는 복합물을 형성하기 위해(예를 들어, 상호작용 요소로부터), 예를 들어, 요소들을 상보성에 적절한 입체구조로 배치하기 위해, 요소들을 상보성에 적절한 근접성으로 배치하기 위해, 상보적 요소들을 공동국재화하기 위해, 상보성을 위한 상호작용 에너지를 낮추기 위해, 서로 불충분한 친화도를 극복하기 위해, 기타 등등을 위해 보조(촉진)를 필요로 할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "복합체"는 서로 직접 및/또는 간접 접촉하는 분자(예를 들어, 펩타이드, 폴리펩타이드 등)의 집합체 또는 응집체를 지칭한다. 일 측면에서, "접촉", 또는 보다 구체적으로 "직접 접촉"은 2개 이상의 분자가 충분히 가까워서 반데르발 힘, 수소 결합, 이온 및 소수성 상호작용 등과 같은 끌어당기는 비공유 상호작용이 분자의 상호작용을 지배한다는 것을 의미한다. 이러한 측면에서, 분자(예를 들어, 펩타이드 및 폴리펩타이드)의 복합체는 이 복합체가 열역학적으로 유리(예를 들어, 복합체의 구성 분자의 비응집 또는 비복합체화 상태와 비교하여)하도록 하는 검정 조건 하에 형성된다. 본원에 사용된 용어 "복합체"는 달리 기술되지 않는 한, 2개 이상의 분자(예를 들어, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 이들의 조합)의 집합체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "비발광"은 가시광선 스펙트럼(예를 들어, 기질의 존재 하에)에서 검출가능한 빛의 양을 방출하지 않는 특성을 나타내는 실체(예를 들어, 펩타이드, 폴리펩타이드, 복합체, 단백질 등)를 지칭한다. 예를 들어, 실체는 주어진 검정에서 검출가능한 발광을 나타내지 않는다면 비발광인 것으로서 지칭될 수 있다. 본원에 사용된, 용어 "비발광"은 "실질적으로 비발광"과 동의어이다. 일부 실시양태에서, 특정 검정에 대해 간섭 배경을 생성하지 않을 정도로 임의의 발광이 충분히 최소인 경우, 실체는 "비발광"인 것으로 간주한다.
본원에 사용된 용어 "비발광 펩타이드" 및 "비발광 폴리펩타이드"는 실질적으로 발광을 나타내지 않거나(예를 들어, 기질의 존재 하에), 또는 표준 조건(예를 들어, 생리학적 조건, 검정 조건 등) 하에 전형적인 기기(예를 들어, 광도계 등)에 의한 유의적인 신호(예를 들어, 생물발광 복합체)와 비교했을 때, 잡음 미만인 양(예를 들어, 100배, 200배, 500배, 1x103 배, 1x104 배, 1x105 배, 1x106 배, 1x107 배 등)을 나타내는 펩타이드 및 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이러한 비발광 펩타이드 및 폴리펩타이드는 본원에 기재된 기준에 따라 조립되어 생물발광 복합체를 형성한다.
본원에 사용된 용어 "상호작용 요소"는 생물발광 복합체를 형성하기 위해 비발광 요소의 화합을 보조하거나 촉진하는 모이어티를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 한 쌍의 상호작용 요소(일명 "상호작용 쌍")는 한 쌍의 비발광 요소(예를 들어, 비발광 펩타이드)에 부착되고, 두 상호작용 요소 사이의 끌어당기는 상호작용은 생물발광 복합체의 형성을 촉진한다; 하지만, 본 발명은 이러한 메커니즘에 제한되는 것은 아니며, 메커니즘에 대한 이해가 본 발명을 실시하기 위해 요구되는 것은 아니다. 상호작용 요소는 임의의 적절한 메커니즘(예를 들어, 비발광 요소를 아주 근접하게 가져오는 것, 비발광 요소를 안정적인 상호작용에 적절한 입체구조로 배치하는 것, 복합체 형성을 위한 활성화 에너지를 감소시키는 것, 이들의 조합 등)에 의해 생물발광 복합체의 형성을 촉진할 수 있다. 상호작용 요소는 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 소분자, 보조인자, 핵산, 지질, 탄수화물, 항체 등일 수 있다. 상호작용 쌍은 2개의 동일한 상호작용 요소(즉, 동종쌍) 또는 2개의 상이한 상호작용 요소(즉, 이종쌍)로 만들어질 수 있다. 이종쌍의 경우, 상호작용 요소는 동일한 유형의 모이어티(예를 들어, 폴리펩타이드)이거나 2개의 상이한 유형의 모이어티(예를 들어, 폴리펩타이드 및 소분자)일 수 있다. 상호작용 쌍에 의한 복합체 형성이 연구되는 일부 실시양태에서, 상호작용 쌍은 "표적 쌍" 또는 "관심 쌍"으로 지칭될 수 있고, 개별 상호작용 요소는 "표적 요소"(예를 들어 "표적 펩타이드", "표적 폴리펩타이드" 등) 또는 "관심 요소"(예를 들어, "관심 펩타이드", "관심 폴리펩타이드" 등)로 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "저친화도"는 생리학적 또는 검정 조건보다 실질적으로 더 높은(예를 들어, 2배, 5배, 10배, 100배, 1000배 이상) 농도이거나, 또는 부착된 요소(예를 들어, 상호작용 요소)의 제2 복합체 형성으로부터 촉진되는 경우를 제외하고, 실체 사이에 유의적인 복합체 형성을 초래하기에는 너무 약한 2개 이상(예를 들어, 3개) 실체 간의 분자간 상호작용을 설명한다.
본원에 사용된 용어 "고친화도"는 부착된 요소(예를 들어, 상호작용 요소)의 제2 복합체의 형성으로부터 촉진됨이 없이 생리학적 또는 검정 조건 하에 검출가능한 복합체 형성을 생성하기에 충분한 강도인 2개 이상(예를 들어, 3개)의 실체 간의 분자간 상호작용을 설명한다.
본원에 사용된 용어 "공동국재화 요소"는 비발광 요소의 공동국재화를 촉진하는 모이어티를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 비발광 요소의 세트는 비-발광 요소가 충분한 농도로 공동국재화될 때 복합체를 형성하기에 충분한 친화도를 갖는다. 이러한 실시양태에서, 공동국재화 요소의 세트(예를 들어, 쌍)(일명 "공동국재화 쌍")는 한 쌍의 비발광 요소(예를 들어, 비발광 펩타이드)에 부착되고, 2개의 공동국재화 요소의 공동국재화(예를 들어, 세포 구획내, 조직내, 용액내, 고체 매트릭스 지지체 상에 등)는 비발광 요소의 공동국재화를 촉진하여, 생물발광 복합체의 형성을 촉진한다; 하지만, 본 발명은 이러한 메커니즘에 제한되지 않으며, 메커니즘에 대한 이해가 본 발명을 실시하기 위해 필요한 것은 아니다. 일부 실시양태에서, 발광 복합체로 자가조립되는 비발광 요소의 능력으로 인해, 공동국재화 요소는 복합체 형성을 촉진하기 위해 직접 상호작용할 필요는 없다. 공동국재화 요소는 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 소분자, 보조인자, 핵산, 지질, 탄수화물, 항체 등일 수 있다. 공동국재화 쌍은 2개의 동일한 공동국재화 요소(즉, 동종쌍) 또는 2개의 서로 다른 공동국재화 요소(즉, 이종쌍)으로 만들어질 수 있다. 이종쌍의 경우, 공동국재화 요소는 동일한 유형의 모이어티(예를 들어, 폴리펩타이드)이거나, 2개의 상이한 유형의 모이어티(예를 들어, 폴리펩타이드 및 소분자)일 수 있다. 공동국재화 쌍의 국재화가 연구되는 일부 실시양태에서, 공동국재화 쌍은 "표적 쌍" 또는 "관심 쌍"으로 지칭될 수 있고, 개별 공동국재화 요소는 "표적 요소"(예를 들어, "표적 펩타이드", "표적 폴리펩타이드" 등) 또는 "관심 요소"(예를 들어, "관심 펩타이드", "관심 폴리펩타이드" 등)로 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "코엘렌테라진"은 천연 발생("천연") 코엘렌테라진을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "코엘렌테라진 유사체" 또는 "코엘렌테라진 유도체"는 이의 합성(예를 들어, 유도체 또는 변이체) 및 천연 유사체를 지칭하며, 예를 들어, 푸리마진, 코엘렌테라진-n, 코엘렌테라진-f, 코엘렌테라진-h, 코엘렌테라진-hcp, 코엘렌테라진-cp, 코엘렌테라진-c, 코엘렌테라진-e, 코엘렌테라진-fcp, 비스-데옥시코엘렌테라진("코엘렌테라진-hh"), 코엘렌테라진-i, 코엘렌테라진-icp, 코엘렌테라진-v, 및 2-메틸 코엘렌테라진, 및 이 외에도 WO 2003/040100; 미국 출원 일련번호 12/056,073(단락 [0086]); 미국 특허 제8,669,103호; WO 2012/061529, 미국 특허 공개 제2017/0233789호 및 미국 특허 공개 제2018/0030059호에 개시된 것을 포함한다; 이들의 개시내용은 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다. 일부 실시양태에서, 코엘렌테라진 유사체는 예를 들어 미국 출원 일련번호 제12/056,073호; 미국 공개번호 제2012/0707849호; 미국 공개번호 제2014/0099654호에 기재된 것과 같은 전구기질(pro-substrate)을 포함한다; 이들의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
본원에 사용된 용어 "기존 단백질"은 특정 이벤트 또는 날짜 이전에 물리적으로 존재한 아미노산 서열을 지칭한다. "기존 단백질의 단편이 아닌 펩타이드"는 펩타이드의 설계 및/또는 합성 이전에 물리적으로 존재했던 단백질(예를 들어, 합성 또는 천연 발생)의 단편 또는 하위서열이 아닌 짧은 아미노산 사슬이다.
본원에 사용된 용어 "단편"은 더 큰 전체 실체(예를 들어, 단백질, 폴리펩타이드, 효소 등)의 절단 또는 "단편화"로 인해 생성된 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 또는 이와 같은 서열을 갖도록 제조된 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 따라서, 단편은 이것이 제조 및/또는 설계된 전체 실체(예를 들어, 단백질, 폴리펩타이드, 효소 등)의 하위서열(subsequence)이다. 기존 전체 단백질의 하위서열이 아닌 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 단편이 아니다(예를 들어, 기존 단백질의 단편이 아님). "기존 생물발광 단백질의 단편이 아닌" 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 (1) 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 설계 및/또는 합성 전에 신체 존재 중에 있었고; (2) 실질적인 생물발광 활성을 나타내는, 단백질(예를 들어, 천연 또는 합성)의 하위서열이 아닌 아미노산 사슬이다.
본원에 사용된 용어 "하위서열"은 다른 더 큰 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 일부와 100% 서열 동일성을 갖는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 하위서열은 더 큰 아미노산 사슬의 일부에 대해 완벽한 서열 일치인 것이다.
"아미노산"이라는 용어는 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 및 아미노산 유사체를 지칭하며, 이들 모두 달리 표시되지 않는 한, 이들의 구조가 입체이성질체 형태를 허용한다면, D 및 L 입체이성질체이다.
천연 아미노산으로는 알라닌(Ala 또는 A), 아르기닌(Arg 또는 R), 아스파라긴(Asn 또는 N), 아스파르트산(Asp 또는 D), 시스테인(Cys 또는 C), 글루타민(Gln 또는 Q), 글루타민산(Glu 또는 E), 글리신(Gly 또는 G), 히스티딘(His 또는 H), 이소류신(Ile 또는 I), 류신(Leu 또는 L), 리신(Lys 또는 K), 메티오닌(Met 또는 M), 페닐알라닌(Phe 또는 F), 프롤린(Pro 또는 P), 세린(Ser 또는 S), 트레오닌(Thr 또는 T), 트립토판(Trp 또는 W), 티로신(Tyr 또는 Y) 및 발린(Val 또는 V)을 포함한다.
비천연 아미노산은 펜타플루오로페닐알라닌("Z"), 아제티딘카복실산, 2-아미노아디프산, 3-아미노아디프산, 베타-알라닌, 나프틸알라닌("naph"), 아미노프로피온산, 2-아미노부티르산, 4-아미노부티르산, 6-아미노카프로산, 2-아미노헵탄산, 2-아미노이소부티르산, 3-아미노이소부티르산, 2-아미노피멜산, 3차-부틸글리신("tBuG"), 2,4-디아미노이소부티르산, 데스모신, 2,2'-디아미노피멜산, 2,3-디아미노프로피온산, N-에틸글리신, N-에틸아스파라긴, 호모프롤린("hPro" 또는 "homoP"), 하이드록시리신, 알로-하이드록시리신, 3-하이드록시프롤린("3Hyp"), 4-하이드록시프롤린("4Hyp"), 이소데스모신, 알로-이소류신, N-메틸알라닌("MeAla" 또는 "Nime"), N-알킬글리신("NAG"), 예를 들어, N-메틸글리신, N-메틸이소류신, N-알킬펜틸글리신("NAPG"), 예를 들어, N-메틸펜틸글리신, N-메틸발린, 나프틸알라닌, 노르발린("Norval"), 노르류신("Norleu"), 옥틸글리신("OctG"), 오르니틴("Orn"), 펜틸글리신("pG" 또는 "PGly"), 피페콜산, 티오프롤린("ThioP" 또는 "tPro"), 호모리신("hLys") 및 호모아르기닌("hArg")을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 비천연 반응성 아미노산은, 예를 들어, Boutureira, O. 및 G. J. Bernardes(2015) "Advances in chemical protein modification." Chem Rev 115(5): 2174-2195에 설명되어 있다; 전체내용은 본원에 참고로 포함된다.
"아미노산 유사체"라는 용어는 C-말단 카복실기, N-말단 아미노기 및 측쇄 생물활성기 중 하나 이상이 가역적으로 또는 비가역적으로 화학적 차단되거나, 달리 다른 생물활성 기로 변형된, 천연 또는 비천연 아미노산을 지칭한다. 예를 들어, 아스파르트산-(베타-메틸 에스테르)는 아스파르트산의 아미노산 유사체이고; N-에틸글리신은 글리신의 아미노산 유사체이고; 또는 알라닌 카복사미드는 알라닌의 아미노산 유사체이다. 다른 아미노산 유사체로는 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 설폰, S-(카복시메틸)-시스테인, S-(카복시메틸)-시스테인 설폭사이드 및 S-(카복시메틸)-시스테인 설폰을 포함한다. 아미노산 유사체는 다양한 보호기를 갖는 아미노산을 포함할 수 있다(Isidro-Llobet, A., 등 (2009). "Amino Acid-Protecting Groups." Chemical Reviews 109(6): 2455-2504; 전체가 본원에 참고로 포함됨).
본원에 사용된 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한, 용어 "펩타이드" 및 "폴리펩타이드"는 펩타이드 아미드 결합(--C(O)NH--)에 의해 주쇄를 통해 이어진 2개 이상의 아미노산의 중합체 화합물을 지칭한다. 용어 "펩타이드"는 전형적으로 짧은 아미노산 중합체(예를 들어, 30개 미만의 아미노산을 갖는 사슬)를 지칭하는 반면, 용어 "폴리펩타이드"는 전형적으로 더 긴 아미노산 중합체(예를 들어, 30개 초과의 아미노산을 갖는 사슬)를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한, 용어 "디펩타이드"는 2개의 펩타이드 분절(예를 들어, 직접 또는 간접적으로(예를 들어, 링커(예를 들어, 펩타이드 링커(예를 들어, 1 내지 10개의 아미노산(예를 들어, 단일 글리신)))를 통해) 융합/부착된 루시퍼라제의 2개의 베타 가닥(예를 들어, OgLuc 루시퍼라제 폴리펩타이드의 β9 및 β10 가닥에 상응하는 "β9/β10 디펩타이드")에 상응함)을 포함하는 펩타이드 또는 작은 폴리펩타이드(예를 들어, <70개 아미노산, <60개 아미노산, <50개 아미노산 등)를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한, 용어 "트리펩타이드"는 3개의 펩타이드 분절(예를 들어, 직접 또는 간접적으로(예를 들어, 링커(예를 들어, 펩타이드 링커(예를 들어, 1 내지 10개의 아미노산(예를 들어, 단일 글리신)))를 통해) 융합/부착된 루시퍼라제의 3개의 베타 가닥(예를 들어, OgLuc 루시퍼라제 폴리펩타이드의 β8-10 가닥에 상응하는 "β8-10 트리펩타이드")에 상응함)을 포함하는 펩타이드 또는 작은 폴리펩타이드(예를 들어, <100개 아미노산, <90개 아미노산, <80개 아미노산 등)를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "펩티도모방체" 및 "펩타이드 모방체"는 단백질 또는 펩타이드로부터 유래된 서열을 모방하는 펩타이드-유사 또는 폴리펩타이드-유사 분자를 지칭한다. 펩티도모방체는 아미노산 유사체, 펩토이드 아미노산 및/또는 독점적으로 또는 아미노산(예를 들어, 천연 또는 비-천연 아미노산)과 조합으로 비-아미노산 성분을 함유할 수 있다. 펩티도모방체의 예로는 화학적으로 변형된 펩타이드/폴리펩타이드, 펩토이드(측쇄가 α-탄소보다는 펩타이드 골격의 질소 원자에 부착됨), β-펩타이드(아미노기가 α 탄소보다 β 탄소에 결합됨) 등을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "펩토이드"는 측쇄가 α-탄소보다는 펩타이드 골격의 질소 원자 상에서 작용기화된 펩티도모방체의 부류를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "인공"은 인간에 의해 설계되거나 제조되고 천연 발생이 아닌 조성물 및 시스템을 지칭한다. 예를 들어, 인공 펩타이드, 펩토이드, 또는 핵산은 비-천연 서열(예를 들어, 천연 발생 단백질 또는 이의 단편과 100% 동일성이 없는 펩타이드)을 포함하는 것이다.
본원에 사용된 "보존적" 아미노산 치환은 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 아미노산이 크기 또는 전하와 같은 화학적 특성이 유사한 다른 아미노산으로 치환되는 것을 지칭한다. 본 개시내용의 목적을 위해, 다음 8개 그룹은 각각 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 함유한다:
1) 알라닌(A) 및 글리신(G);
2) 아스파르트산(D) 및 글루탐산(E);
3) 아스파라긴(N) 및 글루타민(Q);
4) 아르기닌(R) 및 리신(K);
5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M) 및 발린(V);
6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 및 트립토판(W);
7) 세린(S) 및 트레오닌(T); 및
8) 시스테인(C) 및 메티오닌(M).
천연 발생의 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 기초한 부류로 분류될 수 있다: 예를 들어, 극성 양성(또는 염기성)(히스티딘(H), 리신(K) 및 아르기닌(R)); 극성 음성(또는 산성)(아스파르트산(D), 글루탐산(E)); 극성 중성(세린(S), 트레오닌(T), 아스파라긴(N), 글루타민(Q)); 비극성 지방족(알라닌(A), 발린(V), 류신(L), 이소류신(I), 메티오닌(M)); 비극성 방향족(페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W)); 프롤린 및 글리신; 및 시스테인. 본원에 사용된 "반보존적" 아미노산 치환은 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 아미노산에 대한 동일한 부류 내의 다른 아미노산으로의 치환을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 달리 명시되지 않는 한, 보존적 또는 반-보존적 아미노산 치환은 또한 천연 잔기와 유사한 화학적 특성을 갖는 비-천연 발생의 아미노산 잔기를 포괄할 수 있다. 이러한 비-천연 잔기는 전형적으로 생물학적 시스템에서의 합성보다는 화학적 펩타이드 합성에 의해 혼입된다. 이들로는 펩티도모방체 및 다른 역전된 또는 전도된 아미노산 모이어티의 형태를 포함하지만, 이들에 제한되지는 않는다. 본원의 실시양태는, 일부 실시양태에서, 천연 아미노산, 비천연 아미노산 및/또는 아미노산 유사체에 제한될 수 있다.
비-보존적 치환은 한 클래스의 구성원을 다른 클래스의 구성원으로 교환하는 것을 수반할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "서열 동일성"은 2개의 중합체 서열(예를 들어, 펩타이드, 폴리펩타이드, 핵산 등)이 단량체 서브유닛의 동일한 순차적 조성을 갖는 정도를 지칭한다. "서열 유사성"이라는 용어는 2개의 중합체 서열(예를 들어, 펩타이드, 폴리펩타이드, 핵산 등)이 유사한 중합체 서열을 갖는 정도를 의미한다. 예를 들어, 유사한 아미노산은 동일한 생물물리학적 특성을 공유하고, 패밀리, 예를 들어, 산성(예를 들어, 아스파르테이트, 글루타메이트), 염기성(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 비극성(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판) 및 비하전 극성(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신)으로 그룹화될 수 있는 것이다. "서열 동일성 퍼센트"(또는 "서열 유사성 퍼센트")는 (1) 비교 창(예를 들어, 더 긴 서열의 길이, 더 짧은 서열의 길이, 특정 창) 상에서 최적으로 정렬된 두 서열을 비교하고, (2) 일치하는 위치의 수를 산출하기 위해 동일한(또는 유사한) 단량체를 함유하는 위치(예를 들어, 두 서열에서 동일한 아미노산이 존재, 두 서열에서 유사한 아미노산이 존재)의 수를 결정하고, (3) 일치된 위치 수를 비교 창(예를 들어, 더 긴 서열의 길이, 더 짧은 서열의 길이, 특정 창)의 총 위치 수로 나누고, 그리고 (4) 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 퍼센트 또는 서열 유사성 퍼센트를 산출하여 계산한다. 예를 들어, 펩타이드 A 및 B가 둘 모두 길이가 20개 아미노산이고 1개 위치를 제외한 모든 아미노산이 동일한 경우, 펩타이드 A와 펩타이드 B는 95% 서열 동일성을 갖는다. 동일하지 않은 위치에 있는 아미노산이 동일한 생물물리학적 특성(예를 들어, 둘 모두 산성)을 공유하는 경우, 펩타이드 A와 펩타이드 B는 100% 서열 유사성을 가질 것이다. 다른 예로서, 펩타이드 C가 길이가 20개 아미노산이고 펩타이드 D가 길이가 15개 아미노산이고, 펩타이드 D의 15개 아미노산 중 14개가 펩타이드 C의 일부와 동일한 경우, 펩타이드 C와 D는 70% 서열 동일성을 갖지만, 펩타이드 D는 펩타이드 C의 최적 비교 창에 대해 93.3% 서열 동일성을 갖는다. 본원에서 "서열 동일성 퍼센트"(또는 "서열 유사성 퍼센트")를 계산하기 위해, 정렬된 서열 중 임의의 갭은 그 위치의 불일치(mismatch)로서 처리된다.
기준 서열번호와 특정 서열 동일성 또는 유사성 퍼센트(예를 들어, 적어도 70%)를 갖는 것으로서 본원에 기재된 임의의 펩타이드/폴리펩타이드는 그 기준 서열에 대해 최대 치환 수(또는 말단 결실)를 갖고 있는 것이라고 표현될 수도 있다. 예를 들어, 서열번호 Z(예를 들어, 100개의 아미노산)와 적어도 Y% 서열 동일성(예를 들어, 90%)을 갖는 서열은 서열번호 Z 대비 최대 X 치환(예를 들어, 10개)을 가질 수 있으며, 따라서, "서열번호 Z 대비 X개(예를 들어, 10개) 이하의 치환을 갖는"이라고 표현될 수도 있다.
본원에 사용된 용어 "야생형"은 천연 발생원에서 단리된 유전자 또는 유전자 생성물의 특성(예를 들어, 서열)을 갖고 집단에서 가장 흔히 관찰되는 유전자 또는 유전자 생성물(예를 들어, 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 등)을 지칭한다. 이와 대조적으로, 용어 "돌연변이체" 또는 "변이체"는 야생형 유전자 또는 유전자 생성물과 비교할 때 서열의 변형을 표시하는 유전자 또는 유전자 생성물을 지칭한다. "천연 발생 변이체"는 천연에서 발생하지만, 야생형 유전자 또는 유전자 생성물과 비교할 때 변경된 서열을 갖는 유전자 또는 유전자 생성물이다; 이들은 가장 흔히 발생하는 서열은 아니다. "인공 변이체"는 야생형 유전자 또는 유전자 생성물과 비교할 때 변경된 서열을 갖고 천연에서 발생하지 않는 유전자 또는 유전자 생성물이다. 변이 유전자 또는 유전자 생성물은 천연에 존재하지만, 그 유전자 또는 유전자 생성물의 가장 흔한 변이체 또는 인간 또는 실험적 개입에 의해 생성된 "합성"은 아닌 천연 발생 서열일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "생리학적 조건"은 생세포와 화합성인 임의의 조건, 예를 들어, 생세포와 화합성인 온도, pH, 염도, 화학적 구성 등의 주로 수성 조건을 포괄한다.
본원에 사용된 용어 "샘플"은 가장 넓은 의미로 사용된다. 하나의 의미로, 생물학적 및 환경적 샘플뿐만 아니라 임의의 공급원에서 얻은 표본 또는 배양액을 포함하는 것을 의미한다. 생물학적 샘플은 동물(인간 포함)에서 얻을 수 있으며 유체, 고체, 조직 및 기체를 포괄한다. 생물학적 샘플에는 혈장, 혈청 등과 같은 혈액 생성물을 포함한다. 샘플은 또한 본원에 기재된 효소, 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드의 세포 용해액 또는 정제된 형태를 지칭할 수 있다. 세포 용해액은 용해제에 의해 용해된 세포, 또는 토끼 망상적혈구 또는 밀 배아 용해액과 같은 용해액을 포함할 수 있다. 샘플은 또한 무세포 발현 시스템을 포함할 수 있다. 환경 샘플은 표면 물질, 토양, 물, 결정체 및 산업 샘플과 같은 환경 물질을 포함한다. 하지만, 이러한 예는 본 발명에 적용가능한 샘플 유형을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본원에 사용된 용어 "융합체", "융합 폴리펩타이드" 및 "융합 단백질"은 관심있는 제1 단백질 또는 폴리펩타이드(예를 들어, 실질적으로 비발광 펩타이드)가 제2의 상이한 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질(예를 들어, 상호작용 요소)에 이어진 키메라 단백질을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "접합된" 및 "접합"은 2개 분자 실체의 공유 부착(예를 들어, 합성 후 및/또는 합성 생산 동안)을 지칭한다. 화학적으로(예를 들어, "화학적" 접합) 또는 효소적으로 단백질 또는 소분자에 대한 펩타이드 또는 소분자 태그의 부착은 접합의 일 예이다.
용어 "결합 모이어티"는 다른 에피토프 또는 항원 결합 도메인과 상관없이 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 도메인을 지칭한다. 결합 모이어티는 항체, 항체 단편, 표적 리간드에 결합하는 수용체 도메인, 면역글로불린에 결합하는 단백질(예를 들어, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G, 단백질 L, 단백질 M), 면역글로불린에 결합하는 단백질(예를 들어, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G, 단백질 L, 단백질 M)의 결합 도메인, 올리고뉴클레오타이드 프로브, 펩타이드 핵산, DARPin, 압타머, 아피머, 정제된 단백질(분석물 자체 또는 분석물에 결합하는 단백질) 및 단백질의 분석물 결합 도메인(들) 등일 수 있다. 표 A는 본원의 방법, 시스템 및 검정(예를 들어, 면역검정)에 단독으로 또는 다양한 조합으로 사용될 수 있는 예시적인 결합 모이어티의 목록을 제공한다.
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본원에 사용된 용어 "항체"는 전체 항체 분자 또는 이의 단편(예를 들어, Fab, Fab', 및 F(ab')2, 가변 경쇄, 가변 중쇄, Fv와 같은 단편을 지칭하며, 이는 다클론성 또는 단클론성 또는 재조합 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체 등일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 항체 또는 기타 실체가 항원 또는 에피토프를 "특이적으로 인식"하거나, 항원 또는 에피토프에 "특이적으로 결합"하는 경우, 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물에서 항원을 우선적으로 인식하고, 상기 항원 또는 에피토프를 표시하지 않는 다른 실체에 대해서보다 실질적으로 높은 친화도로 상기 항원 또는 에피토프에 결합한다. 이와 관련하여 "실질적으로 더 높은 친화도"는 원하는 검정 또는 측정 장치를 사용하여 실체와 구별되는 항원 또는 에피토프의 검출을 가능하게 하기에 충분히 높은 친화도를 의미한다. 전형적으로, 이는 결합 상수(Ka)가 적어도 107 M-1(예를 들어, >107 M-1, >108 M-1, >109 M-1, >1010 M-1, >1011 M-1, >1012 M-1, >1013 M-1 등)인 결합 친화도를 의미한다. 이러한 특정 실시양태에서, 항체는 상이한 항원이 특별한 에피토프를 포함하는 한, 상이한 항원에 결합할 수 있다. 특정 예에서, 예를 들어, 상이한 종으로부터의 상동성 단백질은 동일한 에피토프를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항체 단편"은 항원 결합 영역 또는 가변 영역의 적어도 일부를 포함하는 전체 길이의 항체의 일부를 지칭한다. 항체 단편으로는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, Fd, 가변 경쇄, 가변 중쇄, 디아바디, 및 온전한 항체의 가변 영역의 적어도 일부를 보유하는 기타 항체 단편을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, Hudson 등 (2003) Nat. Med. 9:129-134 참조; 이의 전체내용은 본원에 참고로 포함된다. 특정 실시양태에서, 항체 단편은 재조합 DNA 기술, 또는 화학적 폴리펩타이드 합성에 의해 생성된 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 절단(예를 들어, 항체의 파파인 분해 및 펩신 분해)에 의해 생성된다. 예를 들어, "Fab" 단편은 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄의 CH1 및 가변 영역을 포함한다. Fab 분자의 중쇄는 다른 중쇄 분자와 이황화 결합을 형성할 수 없다. "Fab'" 단편은 CH1 및 CH2 도메인 사이에서 연장되는, 추가 불변 영역을 포함하는 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄를 포함한다. 사슬간 이황화 결합은 Fab' 단편의 2개의 중쇄 사이에 형성되어 "F(ab')2" 분자를 형성할 수 있다. "Fv" 단편은 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 가변 영역을 포함하지만, 불변 영역이 없다. 단일쇄 Fv(scFv) 단편은 가요성 링커에 의해 접속된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하여 항원 결합 영역이 있는 단일 폴리펩타이드 사슬을 형성한다. 예시적인 단일 사슬 항체는 WO 88/01649 및 미국 특허 제4,946,778호 및 제5,260,203호에 상세하게 논의된다; 이들의 전체내용은 본원에 참고로 포함된다. 특정 예에서, 단일 가변 영역(예를 들어, 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역)은 항원을 인식하고 결합하는 능력을 가질 수 있다. 다른 항체 단편은 본 기술분야의 기술자에 의해 이해될 것이다.
본원에 사용된 용어 "펩타이드 태그"는 다른 실체(예를 들어, 관심 단백질, 관심 분자, 상호작용 요소, 공동-국재화 요소 등)에 부착(예를 들어, 합성 후 또는 합성 생산 동안)되거나 융합될 수 있는 펩타이드를 지칭한다. 펩타이드 태그는 다른 실체에 부착되거나 부착되지 않을 수 있다. 전형적으로, 본원에 사용된 펩타이드 태그는 적절한 조건하에 또 다른 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드와 생물발광 복합체를 형성할 수 있다. 펩타이드 태그가 다른 실체에 부착되는 실시양태에서, 펩타이드 태그는 다른 분자(예를 들어, 펩타이드, 폴리펩타이드, 핵산, 기타 소분자 또는 거대분자)에 화학적으로 접합되고, 다른 분자의 일부가 되도록 화학적으로 합성되거나, 또는 다른 펩타이드 또는 폴리펩타이드 분자에 유전자 융합되는 것 등이다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩타이드 성분"은 용어 "생물발광 복합체의 폴리펩타이드 성분"과 동의어로 사용된다. 전형적으로, 본원에 사용된 바와 같이, 폴리펩타이드 성분은 적절한 조건 하에서 한 쌍의 펩타이드 태그와 함께 생물발광 복합체를 형성할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "오플로포러스 루시퍼라제"("OgLuc")는 심해 새우 오플로포러스 그라실리로스트리스(Oplophorus gracilirostris)에 의해 생성되고 그로부터 유래된 루시퍼라제의 유의미한 서열 동일성, 구조적 보존 및/또는 기능적 활성을 갖는 발광 폴리펩타이드를 지칭한다. 특히, OgLuc 폴리펩타이드는 10개의 β 가닥(β1, β2, β3, β4, β5, β6, β7, β8, β9, β10)을 포함하고 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유도체와 같은 기질을 활용하여 발광을 생성하는 서열번호 1(WT OgLuc) 및 3(NanoLuc)과 같은 오플로포러스 루시퍼라제 단백질 복합체의 성숙한 19 kDa 서브유닛(예를 들어, 신호 서열 없이)의 유의미한 서열 동일성, 구조적 보존, 및/또는 기능적 활성을 갖는 발광 폴리펩타이드를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "β9-유사 펩타이드"는 OgLuc 폴리펩타이드의 β(베타) 9 가닥의 유의미한 서열 동일성, 구조적 보존 및/또는 기능적 활성을 포함하는 펩타이드(또는 펩타이드 태그)를 지칭한다. 특히, β9-유사 펩타이드는 β9-유사 펩타이드가 없는 OgLuc 폴리펩타이드와 비교하여 복합체의 향상된 발광을 초래하는 β9 가닥이 결여된 OgLuc 폴리펩타이드를 구조적으로 보완할 수 있는 펩타이드이다. 다른 "βX-유사 펩타이드"는 유사하게 명명될 수 있다(예를 들어, β1-유사, β2-유사, β3-유사, β4-유사, β5-유사, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사).
본원에 사용된 용어 "β10-유사 펩타이드"는 OgLuc 폴리펩타이드의 β(베타) 10 가닥의 유의미한 서열 동일성, 구조적 보존 및/또는 기능적 활성을 포함하는 펩타이드(또는 펩타이드 태그)를 지칭한다. 특히, β10-유사 펩타이드는 β10 가닥이 결여된 OgLuc 폴리펩타이드를 구조적으로 보완하여 β10-유사 펩타이드 부재 하의 OgLuc 폴리펩타이드에 비해 복합체의 발광을 향상시킬 수 있는 펩타이드이다. 다른 "βX-유사 펩타이드"는 유사하게 명명될 수 있다(예를 들어, β1-유사, β2-유사, β3-유사, β4-유사, β5-유사, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사).
본원에 사용된 용어 "β1-8-유사 폴리펩타이드"는 OgLuc 폴리펩타이드의 β(베타) 가닥 1-8에 대한 서열 및 구조적 유사성을 보유하지만 β(베타) 가닥 9 및 10이 없는 폴리펩타이드를 지칭한다. 기타 " βY-Z-유사 폴리펩타이드"는 유사하게 명명될 수 있다(예를 들어, β1-4-유사 폴리펩타이드, β2-8-유사 폴리펩타이드, β5-10-유사 폴리펩타이드 등).
본원에 사용된 용어 "NANOLUC"은 Promega Corporation에 의해 상업적으로 생산되고 서열번호 3에 상응하는 인공 루시퍼라제 또는 생물발광 폴리펩타이드를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "LgBiT"는, 예를 들어, 생물발광 복합체를 형성하기 위한 이원적 상보성에 사용되고 서열번호 11에 상응하는 β1-9-유사 폴리펩타이드에 상응하는 폴리펩타이드를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "SmBiT"는, 예를 들어, 생물발광 복합체를 형성하기 위한 이원적 상보성에 사용되지만, LgBiT에 대해 낮은 친화도를 갖고(예를 들어, 복합체 형성을 위해 촉진을 필요로 함), 서열번호 13에 상응하는 β10-유사 펩타이드에 상응하는 펩타이드를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "HiBiT"는, 예를 들어, 생물발광 복합체를 형성하기 위해 이원적 상보성에 사용되지만, LgBiT에 대해 낮은 친화도를 갖고(예를 들어, 복합체 형성을 위해 촉진을 필요로 함), 서열번호 15에 상응하는 β10-유사 펩타이드에 상응하는 펩타이드를 지칭한다. HiBiT는 "SmHiTrip10"(서열번호 25) 및 "pep86"과 동일한 서열을 가지며, 이 용어들은 상호교환적으로 사용될 수 있다(또한, SmTrip10 pep86 등).
본원에 사용된 용어 "LgTrip"은 서열번호 17에 상응하고, 예를 들어, β9-유사 및 β10-유사 펩타이드와 삼분할 상보성에 사용되어 생물발광 복합체를 형성하거나, β9-10-유사 디펩타이드와 이원적 상보성에 사용되어 생물발광 복합체를 형성하는 β1-8-유사 펩타이드에 상응하는 폴리펩타이드를 지칭한다. LgTrip 변이체로는 다음을 포함한다: LgTrip 2098(His 태그 있음; 서열번호 31; His 태그 없음; 서열번호 304) 및 LgTrip 3546(His 태그 있음: 서열번호 51; His 태그 없음: 서열번호 302).
본원에 사용된 용어 "SmTrip10"은, 예를 들어, 삼분할 상보성에 사용되어 생물발광 복합체를 형성하는 β10-유사 펩타이드에 상응하는 펩타이드를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "SmTrip9"는, 예를 들어, 삼분할 상보성에 사용되어 생물발광 복합체를 형성하는 β9-유사 펩타이드에 상응하는 펩타이드를 지칭한다.
상세한 설명
본원에는 삼분할 또는 다분할 생물발광 복합체를 조립하기 위한 생물발광 폴리펩타이드 및 조성물 및 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 생물발광 복합체는 3개 이상의 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드 성분의 상호작용 시에 형성된다.
본원의 실시양태의 개발 동안 수행된 실험은 2개의 작은 펩타이드 요소(예를 들어, β10-유사 펩타이드 및 β9-유사 펩타이드)와 하나의 폴리펩타이드 요소(예를 들어, β1-8-유사 폴리펩타이드)를 포함하는 삼분할 루시퍼라제가 조립되어 발광 복합체를 형성한다는 것을 입증한다. 본원의 실시양태의 개발 동안 수행된 실험은 최대 5개의 루시퍼라제 단편(또는 이러한 단편의 변이체), 예컨대, 폴리펩타이드 단편(또는 이의 변이체)와 하나 이상의 펩타이드, 디펩타이드, 또는 트리펩타이드 단편(또는 이러한 단편의 변이체)으로부터 생물발광 복합체의 형성을 추가로 입증한다.
시판되는 NANOLUC 루시퍼라제(Promega Corporation)로는 10개의 β(베타) 가닥(β1, β2, β3, β4, β5, β6, β7, β8, β9, β10)을 포함한다. 미국 특허 제9,797,889호(본원에 그 전체가 참고로 포함됨)는 β1-9-유사 폴리펩타이드 및 β10-유사 펩타이드를 포함하는 상보성 시스템의 개발 및 사용을 기술하고 있다(미국 특허 제9,797,889호의 실제 폴리펩타이드 및 펩타이드 서열은 NANOLUC 및 야생형 천연 OgLuc의 상응하는 서열과 상이함).
본원의 실시양태의 개발 동안 수행된 실험에서, β1-9-유사 폴리펩타이드는 β9 가닥의 제거에 의해 추가로 분할되었다. 나머지 부분(β1-8-유사 폴리펩타이드)은 본 명세서에서 LgTrip 2098(서열번호 17; 또는 서열번호 31(His 태그 포함))로 지칭된다. LgTrip 및 β9(SmTrip9 pep245; 서열번호 23)와 β10(SmTrip10 pep86; HiBit, 고친화도 이분할 시스템에 사용하기에 최적화된 β10 서열, 서열번호 15) 가닥에 상응하는 2개의 펩타이드로부터 발광 복합체를 재구성하기 위해 실험을 시도했다. 실험은 E.콜라이에서 빈약하게 발현된 LgTrip 2098(서열번호 17; 또는 서열번호 31(His 태그 포함))이 불안정했고, 표면 불활성화에 민감했음을 입증했다. 향상된 안정성, 향상된 발현, 향상된 활성, 향상된 분자 상호작용 등 중 하나 이상(예를 들어, 전부)을 나타내고 β9(예를 들어, β9-유사 펩타이드(예를 들어, SmTrip9 pep245; 서열번호 23)) 및 β10(예를 들어, β10-유사 펩타이드(예를 들어, SmTrip10 pep86; HiBiT; 서열번호 25)) 가닥에 상응하는 펩타이드와 생물발광 복합체를 재구성하기 위한 시스템에 사용될 수 있는 인공 변이체를 개발하기 위한 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다. 본원의 실시양태의 개발 동안 수행된 실험은, 예를 들어, LgTrip 3092(서열번호 19) 또는 LgTrip 3546(서열번호 51)이 적합한 β9-유사(예를 들어, SmTrip9 pep245; 서열번호 23) 및 β10-유사(예를 들어, SmTrip10 pep86; HiBiT; 서열번호 25) 펩타이드와 발광 복합체를 형성할 수 있음을 입증한다. 발광 복합체 재구성을 위해 향상된 특성을 갖는 인공 폴리펩타이드 성분(예를 들어, 서열번호 19, 21, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131 및 이들의 부가적인 변이체) 및 펩타이드 태그(예를 들어, 표 1에 열거된 펩타이드 및 이의 부가적인 변이체)를 개발하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다.
본원의 실시양태의 개발 동안 수행된 추가 실험은 NANOLUC 기반 생물발광 복합체가 본원에 기재된 NANOLUC-기반, NanoBiT-기반, 및 NanoTrip-기반 시스템, 폴리펩타이드, 및 펩타이드로부터 유래된 상보적 펩타이드(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사, β10-유사), 디펩타이드(예를 들어, β6-7-유사, β7-8-유사, β8-9-유사, β9-10-유사), 트리펩타이드(예를 들어, β6-8-유사, β7-9-유사, β8-10-유사), 폴리펩타이드(예를 들어, β6-10-유사, β6-9-유사, β7-10-유사 등)의 상응하는 조합 및 다른 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사 등)을 포함하는 작제물을 사용하여 형성될 수 있음을 입증한다. 본원의 실시양태의 개발 동안 수행된 실험은 루시퍼라제 작제물의 전체 길이(예를 들어, 서열번호 788 또는 789와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 또는 이들 사이의 범위)의 서열 동일성을 포함하는 전체 길이 루시퍼라제 폴리펩타이드)를 집합적으로 포함하는 2개 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5 등)의 펩타이드 및 폴리펩타이드 성분으로부터 생물발광 복합체의 형성을 입증한다.
일부 실시양태에서, 본원에는 2개의 펩타이드 태그(예를 들어, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)으로부터 생물발광 복합체를 조립하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에는 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, 또는 β1-8-유사 폴리펩타이드), 및 상보적 펩타이드(들)(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사, β10-유사), 디펩타이드(들)(예를 들어, β6-7-유사, β7-8-유사, β8-9-유사, β9-10-유사), 트리펩타이드(예를 들어, β6-8-유사, β7-9-유사, β8-10-유사) 및/또는 폴리펩타이드(예를 들어, β6-10-유사, β6-9-유사, β7-10-유사 등)로부터 생물발광 복합체를 조립하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 하나 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개 등)의 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드 성분은 기존 단백질의 단편이 아니다(예를 들어, 공지된 폴리펩타이드 서열의 구조적으로 상보적인 하위서열이 아님). 하지만, 다른 실시양태에서, 하나 이상의 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드 성분은 공지된 또는 존재하는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 단편일 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분(생물발광 복합체의)의 생물발광 활성은 2개의 펩타이드 태그에 의한 구조적 상보성을 통해 향상된다(예를 들어, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 102 배, 103 배, 104 배, 105 배, 106 배 이상). 일부 실시양태에서, 본원에는, 예를 들어, 분자 상호작용(예를 들어, 단백질-단백질, 단백질-DNA, 단백질-RNA 상호작용, RNA-DNA, 단백질-소분자, RNA-소분자, DNA-DNA, RNA-RNA, PNA-DNA, PNA-RNA 등)을 검출 및 모니터링할 목적으로 생물발광 복합체로 조립될 수 있는 펩타이드(펩타이드 태그)/폴리펩타이드 요소가 제공된다. 일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드)는 상호작용 요소에 융합되거나, 또는 달리 연결된다. 특정 실시양태에서, 분자 상호작용을 검출/모니터링하기 위한 목적일 때, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 및 폴리펩타이드 성분은 상호작용 요소 간의 상호작용에 의한 촉진 없이 완전한 생물발광 복합체를 형성하지 않는다. 하지만, 상호작용 요소가 서로(또는 표적 분자 또는 복합체에) 상호작용(예를 들어, 결합) 시에는, 생물발광 복합체의 형성이 촉진된다. 일부 실시양태에서, 생물발광 복합체로부터의 생물발광 신호(또는 기질의 존재 하에 이러한 신호를 생성하는 능력)는 상호작용 요소에 의해 복합체를 형성하기 위한 리포터로서 역할을 한다. 상호작용 복합체가 형성되면 생물발광 복합체가 형성되고 생물발광 신호는 검출/측정/모니터링된다(예를 들어, 기질의 존재 하에). 상호작용 복합체가 형성되지 못하면(예를 들어, 불리한 조건으로 인해, 상호작용 요소 간의 불안정한 상호작용으로 인해, 비화합성인 상호작용 요소로 인해), 생물발광 복합체가 형성되지 않고 생물발광 신호가 생성되지 않는다(예를 들어, 기질의 존재 하에). 일부 실시양태에서, 생물발광 복합체로부터의 생물발광 신호(또는 기질의 존재 하에 이러한 신호를 생성하는 능력)는 표적에 상호작용 요소의 결합을 위한 리포터로서 역할을 한다. 표적 결합이 발생하면 생물발광 복합체가 형성되고 생물발광 신호가 검출/측정/모니터링된다(예를 들어, 기질의 존재 하에). 표적 결합이 일어나지 못하면(예를 들어, 불리한 조건으로 인해, 상호작용 요소와 표적 간의 불안정한 상호작용으로 인해, 표적의 부재로 인해, 기타 등등), 생물발광 복합체가 형성되지 않고 생물발광 신호가 생성되지 않는다
특정 실시양태에서, 상호작용 요소는 2개의 관심 분자(예를 들어, 관심 단백질(들), 관심 소분자(들) 등)이다. 예를 들어, 두 관심 분자의 상호작용을 검출하기 위해서는 각각을 별도의 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9), 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드)에 테더링(tethering)하여 검정을 수행할 수 있다. 관심 분자가 상호작용(예를 들어, 일시적 상호작용, 안정적 상호작용 등)한다면, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그는 적합한 입체구조에서 근접하게 되고, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그와 생물발광 복합체의 폴리펩타이드 성분 간에 생물발광 복합체가 형성(및 생물발광 신호가 생성/검출(예를 들어, 기질의 존재하에))된다. 관심 분자 사이에 상호작용이 없는 경우, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그는 근접해지지 않고, 및/또는 생물발광 복합체의 폴리펩타이드 성분과 복합체 형성을 촉진하는 배향으로 배열되지 않으며, 생물발광 복합체는 형성되지 않고, 생물발광 신호가 생성되지 않는다(기질의 존재하에). 이러한 실시양태는 복합체 형성에 대한 저해제의 효과, 복합체 형성에 대한 돌연변이의 효과, 복합체 형성에 대한 조건(예를 들어, 온도, pH 등)의 효과, 표적 분자와 소분자(예를 들어, 잠재적 치료제)의 상호작용 등을 연구하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 상호작용 요소에 의한 촉진 없이 생물발광 복합체로 조립될 수 있는, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9), 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)이 제공된다. 이러한 실시양태에서, 생물발광 복합체는 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 및 폴리펩타이드 성분이 동일한 샘플, 세포하 구획, 세포, 조직 등에 함께 있을 때(예를 들어, 공동국재화될 때) 형성될 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에는 분자 요소(예를 들어, 단백질(들), 핵산(들), 소분자(들), 지질, 탄수화물, 세포 구조 등)이 공동국재화(예를 들어, 분자 상호작용 없이)를 검출 및 모니터링하는데 사용하기 위한 생물발광 복합체로 조립될 수 있는 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드(태그)/폴리펩타이드 요소가 제공된다. 일부 실시양태에서, 생물발광 복합체는 전체 β1-유사 내지 β10-유사 서열에 집합적으로 걸쳐 있는 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 및 폴리펩타이드 성분으로부터 형성된다. 일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그는 공동국재화 요소에 융합되거나 그렇지 않으면 연결된다. 특정 실시양태에서, 특히 공동국재화를 검출/모니터링하기 위해(예를 들어, 분자 상호작용 없이), 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 및 폴리펩타이드 성분은 촉진 없이(예를 들어, 상호작용 요소 없이) 생물발광 복합체를 형성할 수 있다. 공동국재화 요소(예를 들어, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그에 융합됨)의 공동국재화 시(예를 들어, 동일한 세포 내에, 동일한 표면 상에, 동일한 세포 구획에, 동일한 조직 내에 등), 공동국재화 요소의 상호작용이 있거나 없이 생물발광 복합체의 형성(펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 및 폴리펩타이드 성분으로부터)은 촉진된다. 일부 실시양태에서, 생물발광 복합체로부터의 생물발광 신호(또는 기질의 존재 하에 이러한 신호를 생성하는 능력)는 공동국재화 요소의 공동국재화를 위한 리포터로서 역할을 한다. 공동국재화 요소가 공동국재화하면, 공동국재화 요소에 융합된 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그와 폴리펩타이드 성분의 생물발광 복합체가 형성되고, 생물발광 신호가 검출/측정/모니터링된다(예를 들어, 기질의 존재 하에). 공동국재화 요소가 공동국재화되지 않으면, 생물발광 복합체는 형성되지 않고 생물발광 신호가 생성되지 않는다(예를 들어, 기질의 존재 하에).
특정 실시양태에서, 공동국재화 쌍은 2개의 관심 분자(예를 들어, 관심 단백질(들), 관심 소분자(들) 등)를 포함한다. 예를 들어, 2개의 관심 분자의 공동국재화(예를 들어, 세포내, 세포 구획 내, 조직내 등)를 검출하기 위해, 각각을 별도의 디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9), 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드)에 테더링함으로써 검정을 수행할 수 있다. 관심 분자가 공동국재화되면 펩타이드 태그는 적절한 입체구조로 근접하게 되고, 생물발광 복합체가 폴리펩타이드 성분 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)에 의해 형성되고, 생물발광 신호가 생성/검출된다(예를 들어, 기질의 존재 하에). 관심 분자의 공동국재화가 없으면, 폴리펩타이드 성분과 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 태그는 복합체를 형성하기 위해 상호작용하지 않고 생물발광 신호가 생성되지 않는다(예를 들어, 기질의 존재 하에). 이러한 실시양태는 다양한 조건하에서 관심 분자의 공동국재화를 연구하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 디펩타이드/트리펩타이드 태그 태그, 예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)를 포함하는 시스템, 검정 및 장치는 샘플 내 분석물(예를 들어, 소분자, 펩타이드, 단백질, 항체, 핵산 등)의 검출을 위해 제공된다. 일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그는 표적 분석물, 표적 분석물, 표적 분석물에 의해 결합되는 2차 분석물, 1차 결합제에 결합하는 2차 결합제 등을 인식하는 검출/결합제(예를 들어, 결합 모이어티, 결합 서열 등)에 의해 테더링 또는 융합된다. 일부 실시양태에서, 전술한 검출/결합제에 테더링/융합된 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그의 다양한 조합은 샘플 중 분석물의 검출/정량/식별을 위한 검정 및 장치에 사용된다. 검정 및 장치에 사용되는 예시적인 시스템은, 예를 들어, 도 51 내지 56에 도시되고 본원에 설명된다.
일부 실시양태에서, 본원에는 디펩타이드(예를 들어, β9/β10-유사 디펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)으로부터 생물발광 복합체를 조립하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 디펩타이드 및 폴리펩타이드 성분은 기존 단백질의 단편이 아니다(예를 들어, 공지된 폴리펩타이드 서열의 구조적으로 상보적인 하위서열이 아님). 그러나, 다른 실시양태에서, 디펩타이드 및/또는 폴리펩타이드 성분은 공지된 또는 존재하는 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드의 단편일 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분(생물발광 복합체 중)의 생물발광 활성은 디펩타이드와의 구조적 상보성을 통해 향상된다(예를 들어, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 102 배, 103배, 104배, 105배, 106배 이상). 일부 실시양태에서, β1-8-유사 폴리펩타이드는 β1-9-유사 폴리펩타이드보다 더 낮은 배경 발광을 나타낸다. 일부 실시양태에서, β1-8-유사 폴리펩타이드는 β1-9-유사 폴리펩타이드에 비해 증가된 열적 및 화학적 안정성을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 본원에는 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및 폴리펩타이드 성분의 하기 조합 중 임의의 것을 포함하는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 생물발광 복합체가 제공된다:
● β1-5-유사 폴리펩타이드 + β6-유사 펩타이드 + β7-유사 펩타이드 + β8-유사 펩타이드 + β9-유사 펩타이드 + β10-유사 펩타이드;
● β1-5-유사 폴리펩타이드 + β6-유사 펩타이드 + β7-유사 펩타이드 + β8-유사 펩타이드 + β9/10-유사 디펩타이드;
● β1-5-유사 폴리펩타이드 + β6-유사 펩타이드 + β7/8-유사 디펩타이드 + β9/10-유사 디펩타이드;
● β1-5 유사 폴리펩타이드 + β6/7/8 유사 트리펩타이드 + β9/10 유사 디펩타이드;
● β1-5-유사 폴리펩타이드 + β6-유사 펩타이드 + β7/8/9-유사 트리펩타이드 + β10-유사 펩타이드;
● β1-6-유사 폴리펩타이드 + β7-유사 펩타이드 + β8-유사 펩타이드 + β9-유사 펩타이드 + β10-유사 펩타이드;
● β1-6-유사 폴리펩타이드 + β7-유사 펩타이드 + β8-유사 펩타이드 + β9/10-유사 디펩타이드;
● β1-6-유사 폴리펩타이드 + β7/8-유사 디펩타이드 + β9/10-유사 디펩타이드;
● β1-6-유사 폴리펩타이드 + β6/7/8-유사 디펩타이드 + β9-유사 펩타이드 + β10-유사 펩타이드;
● β1-6-유사 폴리펩타이드 + β7/8/9-유사 트리펩타이드 + β10-유사 펩타이드;
● β1-7-유사 폴리펩타이드 + β8-유사 펩타이드 + β9-유사 펩타이드 + β10-유사 펩타이드;
● β1-7-유사 폴리펩타이드 + β8-유사 펩타이드 + β9/10-유사 디펩타이드;
● β1-7-유사 폴리펩타이드 + 8/9-유사 디펩타이드 + β10-유사 펩타이드;
● β1-7-유사 폴리펩타이드 + β8/9/10-유사 트리펩타이드;
● β1-8-유사 폴리펩타이드 + β9-유사 펩타이드 + β10-유사 펩타이드;
● β1-8-유사 폴리펩타이드 + β9/10-유사 디펩타이드;
● β1-5-유사 폴리펩타이드 + β6-10-유사 폴리펩타이드;
● β1-5-유사 폴리펩타이드 + β6-9-유사 폴리펩타이드 + β10-유사 펩타이드; 및
● β1-5-유사 폴리펩타이드 + β7-10-유사 폴리펩타이드 + β6-유사 펩타이드.
상기 조합은 제한적이지 않으며, 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및 폴리펩타이드 성분의 다른 조합은 본원의 범위 내에 있다.
일부 실시양태에서, β1-5-유사 폴리펩타이드는 서열번호 788의 위치 1-102를 포함한다. 일부 실시양태에서, β1-6-유사 폴리펩타이드는 서열번호 788의 위치 1-124를 포함한다. 일부 실시양태에서, β1-7-유사 폴리펩타이드는 서열번호 788의 위치 1-133을 포함한다. 일부 실시양태에서, β1-8-유사 폴리펩타이드는 서열번호 788의 위치 1-148을 포함한다.
일부 실시양태에서, β5-10-유사 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드/폴리펩타이드의 세트는 서열번호 788 또는 789의 위치 103-170을 집합적으로 포함한다. 일부 실시양태에서, β6-10-유사 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드/폴리펩타이드의 세트는 서열번호 788 또는 789의 위치 125-170을 집합적으로 포함한다. 일부 실시양태에서, β7-10-유사 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드/폴리펩타이드 세트는 서열번호 788 또는 789의 위치 134-170을 집합적으로 포함한다. 일부 실시양태에서, β8-10-유사 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드/폴리펩타이드의 세트는 서열번호 788 또는 789의 위치 149-170을 집합적으로 포함한다.
일부 실시양태에서, 생물발광 복합체의 하나 이상의 성분은 본원에 기재된 기본 루시퍼라제(예를 들어, OgLuc, NANOLUC, 서열번호 788, 서열번호 789 등)의 부분 베타 가닥에 걸쳐 있다. 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및 폴리펩타이드 성분 사이의 분리는 베타 가닥 사이의 분할 지점에 있거나, 또는 본원의 서열에 의해 식별된 분할 지점으로부터 -1, -2, -3, -4, -5, +1, +2, +3, +4, +5 이상의 위치에서 나타날 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 기본 루시퍼라제(예를 들어, OgLuc, NANOLUC, 서열번호 788, 서열번호 789 등)의 전체 서열에 걸쳐 있는 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및 폴리펩타이드 성분은 성분에 대한 분할 지점이 베타 가닥 사이가 아닐지라도, 생물 발광 복합체를 형성할 수 있다.
예를 들어, β5와 β6 사이의 분할 부위는 서열번호 788의 위치 102와 103 사이에서 발생할 수 있고, 또는 일부 실시양태에서, 이러한 분할 부위는 해당 위치 전후 최대 5개 잔기의 위치(예를 들어, 위치 96, 97, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 105, 106, 107 후)에서 발생할 수 있다. 일부 실시양태에서, β6과 β7 사이의 분할 부위는 서열번호 788의 위치 124와 125 사이에 발생할 수 있거나, 또는 일부 실시양태에서 이러한 분할 부위는 해당 위치 전후 최대 5개 잔기의 위치(예를 들어, 위치 118, 119, 120, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 128, 129 후)에서 발생할 수 있다. 일부 실시양태에서, β7과 β8 사이의 분할 부위는 서열번호 788의 위치 133과 134 사이에서 발생할 수 있거나, 또는 일부 실시양태에서 이러한 분할 부위는 해당 위치 전후 최대 5개 잔기의 위치(예를 들어, 위치 127, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 135, 136, 137, 138 후)에서 발생할 수 있다. 일부 실시양태에서, β8과 β9 사이의 분할 부위는 서열번호 788의 위치 148과 149 사이에서 발생할 수 있거나, 또는 일부 실시양태에서 이러한 분할 부위는 해당 위치 전후 최대 5개 잔기의 위치(예를 들어, 위치 142, 143, 144, 145, 146, 147, 149, 150, 151, 152, 153 후)에서 발생할 수 있다.
일부 실시양태에서, 기본 루시퍼라제(예를 들어, OgLuc, NANOLUC, 서열번호 788, 서열번호 789 등) 서열 내에 순차적으로 인접한 2개의 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및 폴리펩타이드 성분은 기본 서열의 해당 상응하는 부분의 아미노산 전부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 기본 서열의 분할 지점에 인접한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상)의 아미노산은 상응하는 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드 성분에 존재하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에는 다음 중 하나와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%)의 서열 동일성을 포함하는 펩타이드가 제공된다:
· β6-유사 - GVTPNKLNYFGRPYEGIAVFDG (서열번호 802);
· β7-유사 - KKITTTGTL (서열번호 803
· β8-유사 - WNGNKIIDERLITPD (서열번호 804
· β9-유사 - GSMLFRVTINS (서열번호 805
· β10-유사 (고친화도) - VSGWRLFKKIS (서열번호 806 및
· β10-유사 (저친화도) - VTGYRLFEEIL (서열번호 807
일부 실시양태에서, 본원에는 다음 중 하나와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%)이 서열 동일성을 포함하는 디펩타이드가 제공된다:
· β6/7-유사 - GVTPNKLNYFGRPYEGIAVFDGKKITTTGTL (서열번호 808
· β7/8-유사 - KKITTTGTLWNGNKIIDERLITPD (서열번호 809);
· β8/9-유사 - WNGNKIIDERLITPDGSMLFRVTINS (서열번호 810);
· β9/10-유사 (고친화도) - GSMLFRVTINSVSGWRLFKKIS (서열번호 811); 및
· β9/10-유사 (저친화도) - GSMLFRVTINSVTGYRLFEEIL (서열번호 812).
일부 실시양태에서, 본원에는 다음 중 하나와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%)의 서열 동일성을 포함하는 트리디펩타이드가 제공된다:
· β6/7/8-유사 - GVTPNKLNYFGRPYEGIAVFDGKKITTTGTLWNGNKIIDERLITPD (서열번호 813);
· β7/8/9-유사 - KKITTTGTLWNGNKIIDERLITPDGSMLFRVTINS (서열번호 814);
· β8/9/10-유사 (고친화도) - WNGNKIIDERLITPDGSMLFRVTINSVSGWRLFKKIS (서열번호 815); 및
· β8/9/10-유사 (저친화도) - WNGNKIIDERLITPDGSMLFRVTINSVTGYRLFEEIL (서열번호 816).
일부 실시양태에서, 본원에는 다음 중 하나와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%)의 서열 동일성을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다:
· β1-5-유사 -
MVFTLDDFVGDWEQTAAYNLDQVLEQGGVSSLLQNLAVSVTPIMRIVRSGENALKIDIHVIIPYEGLSADQMAQIEEVFKVVYPVDDHHFKVILPYGTLVID (서열번호 790);
· β6-10-유사 (고친화도) - GVTPNKLNYFGRPYEGIAVFDGKKITTTGTLWNGNKIIDERLITPDGSMLFRVTINSVSGWRLFKKIS (서열번호 794);
· β6-10-유사 (저친화도) - GVTPNKLNYFGRPYEGIAVFDGKKITTTGTLWNGNKIIDERLITPDGSMLFRVTINSVTGYRLFEEIL (서열번호 798);
· β6-9-유사 - GVTPNKLNYFGRPYEGIAVFDGKKITTTGTLWNGNKIIDERLITPDGSMLFRVTINS (서열번호 829);
· β7-10-유사 (고친화도) - KKITTTGTLWNGNKIIDERLITPDGSMLFRVTINSVSGWRLFKKIS (서열번호 795); 및
· β7-10-유사 (저친화도) - KKITTTTGTLWNGNKIIDERLITPDGSMLFRVTINSVTGYRLFEEIL (서열번호 799).
일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분(예를 들어, 펩타이드/폴리펩타이드의 세트, 또는 생물발광 복합체 등의 성분)은 서열번호 788, 789, 790, 791, 792, 및 793 중 하나와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%)의 서열 동일성을 포함한다.
일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 성분(예를 들어, 태그)(예를 들어, 펩타이드/폴리펩타이드의 세트 또는 생물발광 복합체 등의 성분)은 서열번호 794, 795, 796, 797, 798, 799, 800, 및 801 중 하나와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%)의 서열 동일성을 집합적으로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에는 상기 열거된 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및 폴리펩타이드의 성분의 세트 및 복합체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 기본 루시퍼라제 서열의 베타 가닥 10개 전부에 걸쳐 있는 성분 세트가 선택된다.
일부 실시양태에서, 본원의 2개-펩타이드 태그 시스템(예를 들어, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 펩타이드, β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드 및 폴리펩타이드 성분((예를 들어, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드))에 사용하기 위해 설명된 상호작용, 공동국재화, 검출 및 다른 방법, 검정, 및 기술은 또한 본원에 기재된 디펩타이드 시스템(예를 들어, β9/10-유사 디펩타이드 및 폴리펩타이드 성분)에도 사용된다. 일부 실시양태에서, 디펩타이드는 폴리펩타이드 성분에 대해 높은 친화도를 갖는다; 이러한 실시양태에서, 디펩타이드와 폴리펩타이드 성분이 촉진 없이 접촉하게 되면(예를 들어, 공동국재화하거나, 샘플 샘플에 첨가되는 등), 생물발광 복합체가 형성된다. 일부 실시양태에서, 디펩타이드는 폴리펩타이드 성분에 대해 낮은 친화도를 갖는다; 이러한 실시양태에서, 디펩타이드와 폴리펩타이드 성분은 촉진 없이 접촉하게 되면(예를 들어, 공동국재화하거나, 샘플 샘플에 첨가되는 등), 생물발광 복합체는 형성되지 않을 것이다. 본원의 2개 펩타이드 태그 시스템(예를 들어, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 펩타이드, β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드))과 같이, 다양한 친화도의 디펩타이드/폴리펩타이드 쌍은 상이한 적용예에 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 2-성분 상보성 시스템을 위한 시스템, 방법 및 검정은 미국 특허 제9,797,890호(본원에 그 전체가 참고로 포함됨)에 기재되어 있고, 이러한 시스템, 방법 및 검정 모두에는 본원에 기재된 디펩타이드/폴리펩타이드 시스템이 사용된다.
일부 실시양태에서, 본원의 2개 펩타이드 태그 시스템(예를 들어, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 펩타이드, β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드 및 폴리펩타이드 성분((예를 들어, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드))에 사용하기 위해 기재된 상호작용, 공동국재화, 검출, 및 다른 방법, 검정, 및 기술은, 본원에 기재된 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및 폴리펩타이드의 임의의 적절한 조합을 포함하는 시스템에도 사용된다. 일부 실시양태에서, 성분들은 서로에 대해 고친화도를 갖고 있으며, 이러한 실시양태에서, 생물발광 복합체는 촉진 없이 성분들이 접촉하게 되면(예를 들어, 공동국재화하거나, 샘플 샘플에 첨가되는 것 등), 생물발광 복합체가 형성된다. 일부 실시양태에서, 성분들 중 하나 이상이 다른 성분들의 하나 이상에 대해 저친화도를 갖고 있으며; 이러한 실시양태에서, 성분들이 촉진 없이 접촉하게 되면(예를 들어, 공동국재화하거나, 샘플 샘플에 첨가되는 것 등), 생물발광 복합체는 형성되지 않을 것이다. 본원의 2개 펩타이드 태그 시스템(예를 들어, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 펩타이드, β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드))과 같이, 본원에 기재된 다른 시스템은 상이한 적용예에 다양한 친화도로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 2-성분 상보성 시스템을 위한 시스템, 방법 및 검정은 미국 특허 제9,797,890호(본원에 그 전체가 참고로 포함됨)에 기재되어 있고, 이러한 시스템, 방법 및 검정 모두에는 본원에 기재된 다양한 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및 폴리펩타이드 시스템이 사용된다.
일부 실시양태에서, 본원에는 생물발광 복합체의 형성 시에 다양한 친화도 및 발광을 갖는(예를 들어, 고친화도/고발광, 중간-친화도/고발광, 저친화도/중간-발광 등), 상호교환가능한 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)의 상보적 패널이 제공된다. 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 및 폴리펩타이드 성분의 상이한 조합을 활용하면 저친화도부터 고친화도 범위, 발광, 발현 수준, 안정성, 용해도 및 기타 가변적인 특성에 이르는 다양한 세트를 포함하는 조정가능한 시스템을 제공한다. 이러한 조정가능성은 분석물, 분자 상호작용, 공동국재화 및/또는 다른 특성의 검출/모니터링/식별/정량화가 관심있는 특정 분자(들) 및/또는 연구되는 조건에 대해 미세조정될 수 있게 하고, 매우 높은 친화도 또는 낮은 친화도를 갖는 상호작용을 포함하도록 검출/모니터링/식별/정량될 수 있는 분자 상호작용 및/또는 공동국재화의 범위를 확대한다. 또한, 본원에는 비발광 요소 및 비발광 요소의 패널이 개발 및 테스트되는 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원의 태그(예를 들어, 펩타이드 태그)의 작은 크기로 인하여(예를 들어, 더 큰 폴리펩타이드 및 단백질과 비교하여), 태그는 변성에 저항적이다(기능에 3차 구조가 필요없음).
일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 및 폴리펩타이드 성분은 연구하고자 하는 관심 분자 또는 단백질에 기초하여 선택할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상이한 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 생물발광 복합체 형성을 초래하는 상호작용 복합체(예를 들어, 상호작용 요소의 복합체)의 상이한 강도, 지속 및 /또는 안정성을 필요로 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 생물발광 신호(예를 들어, 기질의 존재 하에)를 생성하기 위해서는 매우 안정한 상호작용 복합체가 필요하다. 다른 실시양태에서, 심지어 약한 또는 일시적인 상호작용 복합체도 생물발광 복합체 형성을 초래한다. 또 다른 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그와 폴리펩타이드 성분이 공동국재화되는 한, 상호작용 복합체의 부재 하에 생물발광 복합체가 형성될 것이다. 일부 실시양태에서, 상호작용 복합체의 강도 또는 정도는 결과적으로 생성된 생물발광 신호의 강도에 정비례한다. 일부 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그/폴리펩타이드 성분 세트는 높은 밀리몰 해리 상수(예를 들어, Kd>100mM)를 갖는 상호작용 복합체로 조합될 때, 검출가능한 신호를 생성한다. 다른 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그/폴리펩타이드 성분 세트는 검출가능한 신호를 갖는 생물발광 복합체를 생성하기 위해 낮은 밀리몰(예를 들어, Kd<100mM), 마이크로몰(예를 들어, Kd<1mM), 나노몰(예를 들어, Kd<1μM) 또는 심지어 피코몰(예를 들어, Kd<1nM) 해리 상수를 갖는 상호작용 쌍을 필요로 한다.
일부 실시양태에서, 본원의 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드 성분은 기존 단백질(예를 들어, 기존 생물발광 단백질)의 단편이 아니다. 일부 실시양태에서, 복합체를 형성하기 위해 사용된 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 및 폴리펩타이드 성분 중 어느 것도 기존 단백질(예를 들어, 동일한 기존 단백질, 기존 생물발광 단백질 등)의 단편이 아니다. 일부 실시양태에서, 생물발광 복합체를 형성하기 위해 함께 조립되는, 펩타이드 태그(예를 들어, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드; β9/β10-유사 디펩타이드 등)도 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip)폴리펩타이드))도 전부 기존 단백질(예를 들어, 동일한 기존 단백질, 기존 생물발광 단백질 등)의 단편이 아니다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 실시양태에 사용하기 위한 생물발광 복합체의 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 또는 폴리펩타이드 성분은 기존 단백질의 하위서열이 아니다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 실시양태에 사용하기 위한 비발광 요소는 기존 단백질의 구조적-상보적인 하위서열을 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원의 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9), 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드)는 단리 시(예를 들어, 기질의 존재 또는 부재 하)에 비발광성 또는 실질적으로 비발광성이다. 일부 실시양태에서, 본원의 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그는 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)(예를 들어, 기질의 존재 또는 부재 하에)의 부재 하에, 함께 연합되면 비발광성 또는 실질적으로 비발광성이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분은 단리 시(예를 들어, 기질의 존재 또는 부재 하)에 비발광성 또는 실질적으로 비발광성이다. 일부 실시양태에서, 단일 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분은 제2 또는 제3 또는 제4 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그의 부재 하에(예를 들어, 기질의 존재 또는 부재 하에) 비발광성 또는 실질적으로 비발광성이다. 특정 실시양태에서, 적합한 조건(예를 들어, 생리학적 조건)에 두었을 때, 다수의 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 및 폴리펩타이드 성분은 상호작용하여 생물발광 복합체를 형성하고 기질의 존재 하에 생물발광 신호를 생성한다.
특정 실시양태에서, 상호작용 요소 및/또는 공동국재화 요소 및 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그는 부착, 융합, 연결, 접속 등이 된다. 전형적인 실시양태에서, 제1 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 및 제1 상호작용 요소(또는 제1 공동국재화 요소)는 서로 부착되고, 제2 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 및 제2 상호작용 요소(또는 제2 공동국재화 요소)는 서로 부착된다. 상호작용 요소(또는 공동국재화 요소)에 대한 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그의 부착은 임의의 적합한 메커니즘, 화학, 링커 등에 의해 달성될 수 있다. 상호작용 요소(또는 공동국재화 요소) 및 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그는 전형적으로 공유 접속을 통해 부착되지만, 두 요소의 비공유 연결도 제공된다. 일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 및 상호작용 요소(또는 공동국재화 요소)는 직접 접속되고, 다른 실시양태에서는 링커에 의해 접속된다. 일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 및 상호작용 요소(또는 공동국재화 요소)는 유전자/재조합 융합체로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원의 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그를 사용한 내인성 태그화(예를 들어, 내인성 조절 제어 하에)는 본원에 기재된 도구를 사용한 정상 세포 기능의 모니터링을 가능하게 한다. 예를 들어, 관심 단백질은 고친화도 β9/β10-유사 디펩타이드에 의해 내인적으로 태그화(예를 들어, CRISPR/Cas9 사용)될 수 있으며, 그 다음 세포, 동물, 용해액 등에서 LgTrip(또는 이의 변이체)을 사용한 자발적 상보성이 모니터링된다. 다른 실시양태에서, 펩타이드 태그 및 상호작용 요소(또는 공동국재화 요소)는 천연 화학적 결찰, 스타우딩거(Staudinger) 결찰, "흔적 없는" 스타우딩거 결찰, 아미드 커플링, 활성화된 에스테르를 이용하는 방법, 리신, 티로신 및 시스테인 잔기를 표적으로 하는 방법, 이민 결합 형성(오르토-보론산 포함 및 미포함), 보론산/디올 상호작용, 이황화 결합 형성, 구리/구리 유리 아지드, 디아조 및 테트라진 "클릭" 화학, UV 촉진 티올렌 접합, 디아지린 광표지화, 디엘스-앨더(Diels-Alder) 고리첨가, 복분해 반응, 스즈키(Suzuki) 교차-커플링, 티아졸리딘(단계 4) 커플링, 스트렙타비딘/비오틴 상보성, HaloTag/클로로알칸 기질 상보성 등과 같은 화학적 변형/접합에 의해 접속된다. 일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 및 상호작용 요소(또는 공동국재화 요소)는 합성적으로 생성된다(예를 들어, 고체상 합성, 용액상 합성 등). 일부 실시양태에서, 상호작용 요소(또는 공동국재화 요소)는 임의의 적합한 수단에 의해 생성(예를 들어, 합성적 또는 재조합적으로) 또는 수득(예를 들어, 미정제 용해액, 추출된 단백질, 정제된 단백질 등으로부터)된다.
상호작용 요소(또는 공동국재화 요소)가 펩타이드 또는 폴리펩타이드인 일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 상호작용 요소(또는 공동국재화 요소)는 단일 아미노산 사슬 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 단일 아미노산 사슬은 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 및 상호작용 요소(또는 공동국재화 요소)를 포함하거나, 이것으로 이루어지거나, 또는 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 단일 아미노산 사슬은 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그, 상호작용 요소(또는 공동국재화 요소), 선택적으로 하나 이상의 N-말단 서열, C-말단 서열, 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 해독 시작 부위 등), 및 링커 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어지거나, 또는 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 및 상호작용 요소(또는 공동국재화 요소)는 융합 폴리펩타이드 내에 함유된다. 일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그와 상호작용 요소(또는 공동국재화 요소)의 제1 융합체 및 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그와 상호작용 요소(또는 공동국재화 요소)의 제2 융합체는 별도로 발현된다; 하지만, 다른 실시양태에서, 상호작용(또는 공동국재화) 및 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 둘 모두를 포함하거나 이들로 이루어지는 융합 단백질이 발현된다.
일부 실시양태에서, 제1 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9), 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드)와 제1 상호작용 요소를 포함하는 제1 융합 단백질, 뿐만 아니라 제2 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9), 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드)와 제2 상호작용 요소를 포함하는 제2 융합 단백질은 동일한 세포 내에서 발현된다. 일부 실시양태에서, 제1 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그와 제1 공동국재화 요소를 포함하는 제1 융합 단백질, 뿐만 아니라 제2 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그와 제2 공동국재화 요소를 포함하는 제2 융합 단백질은 동일한 세포 내에서 발현된다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 융합 단백질은 세포로부터 정제 및/또는 단리된다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질의 상호작용 및/또는 공동국재화는 세포 내에서 검정된다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질의 상호작용 및/또는 공동국재화는 세포의 용해액 내에서 검정된다. 다른 실시양태에서, 제1 및 제2 융합 단백질은 별도의 세포에서 발현되고 신호 검출을 위해 조합된다(예를 들어, 정제 및/또는 단리 후, 세포 또는 세포의 일부의 융합 후, 융합 단백질을 하나의 세포에서 다른 세포로 전달함으로써, 또는 하나 이상의 융합 단백질을 세포외 배지로 분비함으로써). 일부 실시양태에서, 하나 이상의 융합 단백질은 세포 용해액(예를 들어, 토끼 망상적혈구 용해액) 또는 무세포 시스템에서 발현된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 융합 단백질은 바이러스 또는 다른 세포 병원체의 게놈으로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, 복합체 형성(제1 및 제2 융합 단백질과 함께)을 위해 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드) 및 임의의 다른 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 성분(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드)은 동일 세포 또는 세포 용해액에서 하나 또는 둘 모두의 태그 함유 융합 단백질로서 발현된다. 일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그와 복합체를 형성하는 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드/폴리펩타이드 성분(제1 및 제2 융합 단백질 내에서)은 하나 또는 둘 모두의 펩타이드-태그 함유 융합 단백질로서 상이한 세포 또는 세포 용해액에서 발현된다. 일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그와 복합체를 형성하기 위한 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드/폴리펩타이드 성분(제1 및 제2 융합 단백질 내)은 펩타이드-태그 함유 융합 단백질을 포함하는 세포, 세포 용해액, 또는 다른 샘플에 첨가된다.
일부 실시양태에서, 본원의 시스템(예를 들어, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드/폴리펩타이드 성분, 기질, 벡터 등) 및 방법은 샘플의 분석(예를 들어, 공동국재화, 분자 상호작용, 표적 등의 검출/정량화/식별/모니터링)에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원의 시스템 중 하나 이상의 성분은 샘플에 첨가되고, 및/또는 샘플 내에 제공되거나 발현된다. 본원의 실시양태에 사용될 수 있는 적합한 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 타액, 세포, 세포 용해액, 조직, 조직 균질물, 정제된 핵산, 대변, 질 분비물, 뇌척수액, 요막액, 물, 생물막, 토양, 먼지, 식품, 음료, 농산물, 식물 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9), 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드), 융합 폴리펩타이드, 융합 단백질 등을 암호화하는 핵산, DNA, RNA, 벡터 등이 제공된다. 이러한 핵산 및 벡터는 발현, 형질전환, 형질감염, 주입 등에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9), 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 상호작용, 공동국재화 요소, 또는 결합제는 링커에 의해 접속된다. 일부 실시양태에서, 링커는 요소들 사이에 원하는 양의 공간/거리를 제공하면서 신호 및 상호작용 또는 공동국재화 요소를 접속시킨다. 일부 실시양태에서, 링커는 신호 및 상호작용 요소 둘 모두로 하여금 각각의 복합체(예를 들어, 발광 복합체 및 상호작용 복합체)를 동시에 형성하도록 한다. 일부 실시양태에서, 링커는 발광 복합체의 형성을 촉진하는데 있어서 상호작용 요소를 보조한다. 일부 실시양태에서, 상호작용 복합체가 형성될 때, 각각의 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그를 이들 각각의 상호작용 요소에 접속시키는 링커는 펩타이드 태그를 적절한 거리 및 입체구조에 위치시켜 생물발광 복합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 상호작용 또는 공동국재화 요소 및 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그는 링커에 의해 매우 근접하게(예를 들어, <4 단량체 단위) 유지된다. 일부 실시양태에서, 링커는 펩타이드 태그와 상호작용 요소 사이에 원하는 양의 거리(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6…10… 20 이상의 단량체 단위)를 제공한다(예를 들어, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 및 상호작용 또는 공동국재화 요소 간에 원치않는 상호작용을 방지하기 위해, 입체적 고려를 위해, 상호작용 복합체 형성 시 비발광 요소의 적절한 배향을 허용하기 위해, 상호작용 복합체에서부터 발광 복합체까지 복합체 형성의 전파를 허용하기 위해, 기타 등등). 특정 실시양태에서, 링커는 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그와 상호작용 요소 사이에 적절한 부착 화학을 제공한다. 링커는 또한 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 및 상호작용 또는 공동국재화 요소를 만드는 합성 과정을 개선시킬 수도 있다(예를 들어, 이들이 단일 단위로서 합성되도록 하고, 두 요소의 합성 후 접속을 허용하기 위해, 기타 등등).
일부 실시양태에서, 링커는 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9), 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 또는 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)를 상호작용 요소 또는 공동국재화 요소에 연결, 접속, 또는 테더링시킬 수 있는 임의의 적합한 화학적 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 링커는 하나 이상의 반복 또는 비반복 단량체 단위(예를 들어, 핵산, 아미노산, 탄소 함유 중합체, 탄소 사슬 등)의 중합체이다. 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 및 상호작용, 공동국재화 요소 또는 결합제가 융합 단백질의 일부인 경우, 링커(존재하는 경우)는 전형적으로 아미노산 사슬이다. 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 및 상호작용 요소, 공동국재화 요소 또는 결합제가 개별 요소의 발현 후에 함께 테더링되는 경우, 링커는 펩타이드 태그 및 상호작용 또는 공동국재화 요소 상의 작용기와 각각 반응성인 작용기(또는 반응성) 기를 어느 한쪽 말단에 갖는 임의의 화학적 모이어티를 포함할 수 있다. 신호 및 상호작용 요소, 공동국재화 요소, 및/또는 결합제를 테더링할 수 있는 임의의 적합한 모이어티는 링커로서 사용될 수 있다.
다양한 링커가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 단일 공유 결합이다. 일부 실시양태에서, 링커는 1 내지 20개의 비수소 원자(예를 들어, C, N, P, O 및 S)를 갖는 선형 또는 분지형, 시클릭 또는 헤테로시클릭, 포화 또는 불포화 구조를 포함하고, 알킬, 에테르, 티오에테르, 이민, 카복실계, 아민, 에스테르, 카복사미드, 설폰아미드, 하이드라지드 결합 및 방향족 또는 헤테로방향족 결합의 임의의 조합으로 구성된다. 일부 실시양태에서, 링커는 20개보다 긴 비-수소 원자이다(예를 들어, 21개 비-수소 원자, 25개 비-수소 원자, 30개 비-수소 원자, 40개 비-수소 원자, 50개 비-수소 원자, 100개 비-수소 원자 등). 일부 실시양태에서, 링커는 C, N, P, O 및 S의 군으로부터 선택되는 1 내지 50개 비-수소 원자(수소 원자 외에 추가로)(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개의 비수소 원자)를 포함한다.
본원의 실시형태의 범위는 이용가능한 링커의 유형에 의해 제한되지 않는다. 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그, 폴리펩타이드 성분 및 상호작용 요소, 공동국재화 요소, 또는 결합제는 직접 연결되거나(예를 들어, 링커는 단일 공유 결합으로 이루어짐), 또는 적절한 링커를 통해 연결된다. 실시양태는 임의의 특정 링커 기에 제한되지 않는다. 다양한 링커 기가 고려되며, 적합한 링커로는 알킬 기, 메틸렌 탄소 사슬, 에테르, 폴리에테르, 알킬 아미드 링커, 펩타이드 링커, 변형된 펩타이드 링커, 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 링커, 스트렙타비딘-비오틴 또는 아비딘-비오틴 링커, 폴리아미노산(예를 들어, 폴리리신), 작용기화된 PEG, 다당류, 글리코사미노글리칸, 수지상 중합체(WO93/06868 및 Tomalia 등 in Angew. Chem. Int. Ed. Engl 29:138-175 (1990), 전문이 본원에 참고로 포함됨], PEG-킬레이트제 중합체(W94/08629, WO94/09056 및 WO96/26754, 전문이 본원에 참고로 포함됨), 올리고뉴클레오타이드 링커, 인지질 유도체, 알케닐 사슬, 알키닐 사슬, 이황화물, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 링커는 절단가능하다(예를 들어, 효소적으로(예를 들어, TEV 프로테아제 부위), 화학적으로, 광유도되는 것 등이다.
일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9), 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드), 인식 요소, 상호작용 요소, 공동국재화 요소, 결합제, 분석물, 기질 등은 고체 표면 또는 매트릭스에 부착(예를 들어, 임의의 적합한 화학을 통해)되거나 내부에 함유된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 시스템 성분은 고체 표면 또는 매트릭스에 부착(예를 들어, 임의의 적합한 화학을 통해)되거나, 함유되고, 다른 성분은 고체 표면 또는 매트릭스에 첨가된다(예를 들어, 용액에서(예를 들어, 샘플에서)). 적절한 고체 표면으로는 비드(예를 들어, 자성 비드), 칩, 튜브, 플레이트, 입자, 막, 종이 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 고체 표면/매트릭스는 다음과 같은 임의의 적합한 물질로 제조된다: Ahlstrom CytoSep, 질산셀룰로오스, 아세트산셀룰로오스, 셀룰로오스(예를 들어, Whatman FTA-DMPK-A, B, C 카드; Whatman ET 3/Chr, Whatman protein saver 903 카드; Whatman Grade 1 여과지, Whatman FTA Elute, Ahlstrom 226 검체 수집 용지 등), Noviplex Plasma Prep Cards, 폴리프로필렌 막, PVDF, 니트로셀룰로오스 막(Millipore Nitrocellular Hi Flow Plus) 폴리테트라플루오로에틸렌 필름, 혼합 셀룰로오스 에스테르, 유리 섬유 매질(예를 들어, Whatman 유니필터 플레이트 유리 섬유 필터 막, Agilent 건성 매트릭스 스포팅 카드, Ahlstrom 등급 8950 등), 플라스틱(예를 들어, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리테르설펜, 폴리(메타크릴레이트), 아크릴 중합체, 폴리테트라플루오레텐 등), 천연 및 합성 중합체(예를 들어, 중합체 혼합물, 코블록 중합체 등), 당(예를 들어, 풀루란, 트레할로스, 말토스, 자당, 셀룰로오스 등), 폴리아미드(예를 들어, 천연(예를 들어, 양모, 실크 등), 합성(예를 들어, 아라미드, 나일론 등) 등), 금속(예를 들어, 알루미늄, 카드뮴, 크롬, 코발트, 구리, 철, 망간, 니켈, 백금, 팔라듐, 로듐, 은, 금, 주석, 티타늄, 텅스텐, 바나듐, 아연 등), 합금(예를 들어, 알루미늄 합금(예를 들어, Al-Li, 알루멜(alumel), 두랄루민, 매그녹스(magnox), 자막(zamak) 등), 철 합금(예를 들어, 강철, 스테인리스강, 외과용 스테인리스강, 규소강, 공구강, 주철, 경철 등), 코발트 합금(예를 들어, 스텔라이트, 탈로나이트 등), 니켈 합금(예를 들어, 독일 은, 크로멜, 뮤 금속, 모넬 금속, 니크롬, 니크로실, 니실, 니티놀 등), 구리 합금(예를 들어, 베릴륨 구리, 빌론, 황동, 청동, 인청동, 콘스탄탄, 백동, 종청동, 데바르다 합금, 도금 금속, 양은, 노르딕 골드, 프린스 메탈, 툼바가 등), 은 합금(예를 들어, 스털링 실버 등), 주석 합금(예를 들어, 브리탄늄, 백랍, 땜납 등), 금 합금(일렉트럼, 화이트 골드 등), 아말감 등), ELISPot 플레이트, 면역검정 플레이트, 조직 배양 플레이트 등과 같은 임의의 적합한 재료로 제조된다.
일부 실시양태에서, 발광 복합체의 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9), 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 기존 루시퍼라제(예를 들어, 반딧불이 루시퍼라제, 레닐라(Renilla) 루시퍼라제, 오플로포러스(Oplophorus) 루시퍼라제, 강화된 오플로포러스 루시퍼라제로서, 미국 특허 출원 제2010/0281552호 및 미국 특허 출원 제2012/0174242호에 기재되어 있고, 이들의 전체 내용은 본원에 참고로 포함됨)의 임의의 부분에 100% 미만의 서열 동일성 및/또는 유사성으로 제공된다. 특정 실시양태는 서열번호 1(예를 들어, 완전한 야생형 오플로포러스 루시퍼라제 서열) 및/또는 서열번호 3(예를 들어, 완전한 NANOLUC 서열)의 전부 또는 일부(예를 들어, 펩타이드의 8개 이상의 아미노산, 약 25개 미만의 아미노산)와 100% 미만의 서열 동일성이 있는 폴리펩타이드 성분과 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그의 생물발광 복합체의 형성을 수반한다. 특정 실시양태는 서열번호 1(예를 들어, 완전한 야생형 오플로포러스 루시퍼라제 서열) 및/또는 서열번호 3(예를 들어, 완전한 NANOLUC 서열)의 전부 또는 일부(예를 들어, 펩타이드의 8개 이상의 아미노산, 약 25개 미만의 아미노산)와 100% 미만이지만, 40% 초과(예를 들어, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%)의 서열 동일성이 있는 폴리펩타이드 성분과 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그로부터 생물발광 복합체의 형성을 수반한다. 일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 및 폴리펩타이드 성분은 서열번호 1(예를 들어, 완전한 야생형 오플로포러스 루시퍼라제 서열) 및/또는 서열번호 3(예를 들어, 완전한 NANOLUC 서열)의 일부(예를 들어, 펩타이드의 8개 이상의 아미노산, 약 25개 미만의 아미노산)와 100% 미만의 서열 유사성으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 및 폴리펩타이드 성분은 서열번호 1(예를 들어, 완전한 야생형 오플로포러스 루시퍼라제 서열) 및/또는 서열번호 3(예를 들어, 완전한 NANOLUC 서열)의 일부(예를 들어, 펩타이드의 8개 이상의 아미노산, 약 25개 미만의 아미노산)와 100% 미만이지만, 40% 초과(예를 들어, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%)의 서열 유사성으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 서열번호 1(예를 들어, 완전한 야생형 오플로포러스 루시퍼라제 서열) 및/또는 서열번호 3(예를 들어, 완전한 NANOLUC 서열)의 약 25개 아미노산 이하의 일부와 100% 미만의 서열 동일성 및/또는 유사성이 있는 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그가 제공되며, 이러한 펩타이드 2개는 적절한 조건(예를 들어, 상호작용 쌍에 의해 안정화되거나, 공동국재화 요소에 의해 근접해지는 등) 하에 서열번호 1(예를 들어, 완전한 야생형 오플로포러스 루시퍼라제 서열) 및/또는 서열번호 3(예를 들어, 완전한 NANOLUC 서열)의 다른 일부와 100% 미만이지만, 40% 초과(예를 들어, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%)의 서열 동일성 및/또는 유사성으로 조합될 때, 생물발광 복합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 서열번호 1(예를 들어, 완전한 야생형 오플로포러스 루시퍼라제 서열) 및/또는 서열번호 3(예를 들어, 완전한 NANOLUC 서열)의 약 25개 아미노산 이하의 일부와 100% 미만의 서열 동일성 및/또는 유사성이 있는 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그가 제공되며, 이러한 펩타이드 태그의 쌍은 적절한 조건(예를 들어, 상호작용 쌍에 의해 안정화되거나, 공동국재화 요소에 의해 근접해지는 등) 하에 서열번호 1(예를 들어, 완전한 야생형 오플로포러스 루시퍼라제 서열) 및/또는 서열번호 3(예를 들어, 완전한 NANOLUC 서열)의 다른 일부와 100% 미만이지만, 40% 초과(예를 들어, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%)의 서열 동일성 및/또는 유사성으로 조합될 때, 생물발광 복합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 서열번호 1(예를 들어, 완전한 야생형 오플로포러스 루시퍼라제 서열) 및/또는 서열번호 3(예를 들어, 완전한 NANOLUC 서열)의 약 25개 아미노산 이하의 일부와 100% 미만이지만, 40% 초과(예를 들어, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%)의 서열 동일성 및/또는 유사성이 있는 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그가 제공되며, 이러한 펩타이드의 쌍은 적절한 조건(예를 들어, 상호작용 쌍에 의해 안정화되거나, 공동국재화 요소에 의해 근접해지는 등) 하에 서열번호 1(예를 들어, 완전한 야생형 오플로포러스 루시퍼라제 서열) 및/또는 서열번호 3(예를 들어, 완전한 NANOLUC 서열)의 다른 일부와 100% 미만이지만, 40% 초과(예를 들어, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%)의 서열 동일성 및/또는 유사성을 갖는 폴리펩타이드와 조합될 때 생물발광 복합체를 형성한다. 이와 유사하게, 서열번호 1(예를 들어, 완전한 야생형 오플로포러스 루시퍼라제 서열) 및/또는 서열번호 3(예를 들어, 완전한 NANOLUC 서열)의 일부와 100% 미만이지만, 40% 초과(예를 들어, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%)의 서열 동일성 또는 유사성이 있는 폴리펩타이드 성분이 제공되며, 이러한 폴리펩타이드 성분은 적절한 조건 하에 서열번호 1(예를 들어, 완전한 야생형 오플로포러스 루시퍼라제 서열) 및/또는 서열번호 3(예를 들어, 완전한 NANOLUC 서열)의 다른 일부와 100% 미만이지만, 선택적으로 40% 초과(예를 들어, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%)의 서열 동일성 및/또는 유사성을 갖는 한 쌍의 펩타이드 태그와 조합될 때 생물발광 복합체를 형성한다. 일부 실시양태에서는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 9, 및/또는 서열번호 10과 100% 미만의 서열 동일성 또는 유사성이 있는 펩타이드 태그가 제공된다. 일부 실시양태에서는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 9, 및/또는 서열번호 10과 100% 미만이지만, 40% 초과(예를 들어, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%)의 서열 동일성 또는 유사성이 있는 펩타이드 태그가 제공된다. 일부 실시양태에서는 서열번호 23, 서열번호 25, 및또는 서열번호 29와 100% 미만의 서열 동일성 또는 유사성이 있는 펩타이드 태그가 제공된다. 일부 실시양태에서는 서열번호 23, 서열번호 25, 및/또는 서열번호 29와 100% 미만이지만, 40% 초과(예를 들어, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%)의 서열 동일성 또는 유사성이 있는 펩타이드 태그가 제공된다. 일부 실시양태에서는 서열번호 5 및/또는 서열번호 8과 100% 미만의 서열 동일성 또는 유사성이 있는 폴리펩타이드 성분이 제공된다. 일부 실시양태에서는 서열번호 17 및/또는 서열번호 27과 100% 미만의 서열 동일성 또는 유사성이 있는 폴리펩타이드 성분이 제공된다. 일부 실시양태에서는 서열번호 5, 서열번호 8, 및/또는 서열번호 27과 100% 미만이지만, 40% 초과(예를 들어, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%)의 서열 동일성 또는 유사성이 있는 폴리펩타이드 성분이 제공된다. 일부 실시양태에서는 서열번호 17과 100% 미만이지만, 40% 초과(예를 들어, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%)의 서열 동일성 또는 유사성이 있는 폴리펩타이드 성분이 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원의 세트, 키트 또는 시스템 중의 하나 이상(예를 들어, 모든)의 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9), 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 루시퍼라제의 일부(예를 들어, 서열번호 1, 서열번호 3 등)와 100% 서열 동일성을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 실시양태에 사용되는 펩타이드 태그(예를 들어, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드; β9/β10-유사 디펩타이드 등)는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 29로부터 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 갖는 펩타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩타이드 태그는 서열번호 13과 적어도 40%(예를 들어, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75% , >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%) 서열 동일성 또는 유사성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩타이드 태그는 서열번호 13에 비해 6개 이하(예를 들어, 6, 5, 4, 3, 2, 1개 또는 이들 사이의 범위)의 치환(예를 들어, 보존적 치환, 반보존적 치환, 비보존적 변전 등)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩타이드 태그는 서열번호 25와 적어도 40%(예를 들어, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%) 서열 동일성 또는 유사성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩타이드 태그는 서열번호 25에 비해 6개 이하(예를 들어, 6, 5, 4, 3, 2, 1개, 또는 이들 사이의 범위)의 치환(예를 들어, 보존적 치환, 반보존적 치환, 비보존적 변전 등)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩타이드 태그는 서열번호 23과 적어도 40%(예를 들어, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%)의 서열 동일성 또는 유사성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩타이드 태그는 서열번호 23에 비해 6개 이하(예를 들어, 6, 5, 4, 3, 2, 1개, 또는 이들 사이의 범위)의 치환(예를 들어, 보존적 치환, 반보존적 치환, 비보존적 변전 등)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩타이드 태그는 서열번호 25와 적어도 40%(예를 들어, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%)의 서열 동일성 또는 유사성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩타이드 태그는 서열번호 25에 비해 6개 이하(예를 들어, 6, 5, 4, 3, 2, 1개, 또는 이들 사이의 범위)의 치환(예를 들어, 보존적 치환, 반보존적 치환, 비보존적 변전 등)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 실시양태에 사용되는 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9), 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 본원 및 본원에 제공된 표에 개시된 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 실시양태에 사용되는 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9), 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10)) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 본원 및 본원에 제공된 표에 개시된 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및 폴리펩타이드에 비해 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 실시양태에 사용되는 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9), 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 본원 및 본원에 제공된 표에 개시된 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및 폴리펩타이드와 적어도 40%(예를 들어, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%)의 서열 동일성 또는 유사성을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원의 실시양태에 사용되는 디펩타이드 및 트리펩타이드는 본원에 기재된 및/또는 본원의 표에 열거된 펩타이드의 임의의 적합한 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9), 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 또는 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 하나 이상의 부가적인 요소(예를 들어, 인식 요소, 상호작용 요소, 공동국재화 요소, 검출가능한 요소(예를 들어, 형광단(예를 들어, BRET를 촉진하는 것)), 관심 단백질, HALOTAG 등)에 연결(예를 들어, 화학적으로) 또는 융합된다. 일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 또는 폴리펩타이드 성분은 cyOFP(예를 들어, 미국 특허 제9,908,918호에 기재된 것과 같은 안타레스(Antares) 작제물에서; 전문이 본원에 참고로 인용됨) 또는 다른 형광 단백질(예를 들어, BRET를 촉진하기 위해)에 연결되거나 융합된다. 일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 또는 폴리펩타이드 성분은 부가적인 요소와 폴리펩타이드 성분의 화학적 접합을 촉진하기 위해 하나 이상의 화학적 변형 및/또는 비천연 아미노산 또는 아미노산 유사체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에는 수여자(acceptor) 형광 단백질에 융합된 단일 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 또는 폴리펩타이드 성분이 제공된다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드 성분은 수여자 형광 단백질에 융합된다(예를 들어, 샌드위치 융합체). 일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 또는 폴리펩타이드 성분은 2개 이상의 수여자 형광 단백질(예를 들어, 샌드위치 융합체)에 융합된다. 일부 실시양태에서, LgTrip 폴리펩타이드(예를 들어, 본원에 기재된 β1-8-유사 폴리펩타이드)는 단일 형광 단백질(예를 들어, cyOFP)에 융합되거나, 2개의 형광 단백질(예를 들어, cyOFP의 2개 카피) 사이에 샌드위치 융합체로 위치된다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 사용되는 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9), 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드)에는 부가적인 요소(예를 들어, 인식 요소, 상호작용 요소 등)에 대한 화학적 접합에 적합한 반응성 기가 혼입되어 있다. 이들 반응성 기는 N-말단, C-말단 또는 서열 내에 존재할 수 있다. 이들 반응성 기는 선택적으로 링커를 사용하여 펩타이드에 부착될 수 있다. 일부 경우에, 반응성 기를 보유하는 이러한 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드는 표준 합성법을 사용하여 합성될 수 있고 원하는 기를 보유하는 비천연 아미노산에 혼입될 수 있다. 일부 경우에, 반응성 기는 천연 아미노산(예를 들어, 시스테인의 설프하이드릴)에 존재할 수 있다. 반응성 기를 보유하는 펩타이드 태그와 반응하도록 의도된 부가적인 요소는 단백질, 항체, 핵산, 약물 또는 형광단과 같은 소분자 또는 표면일 수 있다. 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그에는 생물직교 또는 클릭 화학을 사용하여 부가적인 요소에 화학적 또는 생물학적으로 도입된 반응성 파트너와 특이적으로 반응하도록 설계된 반응성 기가 혼입될 수 있다. 예시적인 클릭 반응은 구리 촉매된 클릭으로서, 여기서 펩타이드 태그는 알킬 또는 아지드를 보유하고 부가적인 요소는 상보적인 기를 보유한다. 적절한 구리 촉매의 존재하에 이들 두 종을 함께 혼합하면, 펩타이드가 트리아졸을 통해 부가적인 요소에 공유 접합되도록 한다. 다른 많은 생물직교 반응이 보고되었고(예를 들어, Patterson, D. M., 등(2014). "Finding the Right (Bioorthogonal) Chemistry." ACS Chemical Biology 9(3): 592-605.), 상보적 반응성 종이 혼입된 부가적인 요소와 펩타이드 태그는 본 발명의 실시양태이다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및/또는 천연 발생의 아미노산과 반응하는 반응성 기를 보유하는 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)이다. 예시적인 반응성 기는 시스테인과의 반응을 위한 말레이미드 및 리신과의 반응을 위한 숙신이미딜 에스테르를 포함한다. 반응성 기의 보다 포괄적인 목록은 Koniev, O. and A. Wagner (2015). "Developments and recent advancements in the field of endogenous amino acid selective bond forming reactions for bioconjugation." Chem Soc Rev 44: 5495-5551에서 찾아볼 수 있다. 이들 반응성 기는 펩타이드 합성을 통해 또는 펩타이드 태그의 다른 화학적 변형을 통해 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드/폴리펩타이드 상에 화학적으로 또는 생물학적으로 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩타이드 태그는 보호된 형태로 존재하여(Isidro-Llobet, A., 등 (2009). "Amino Acid-Protecting Groups." Chemical Reviews 109(6): 2455-2504; 본원에 전체가 참고로 포함됨), 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드/폴리펩타이드 자체가 반응성 기와 반응하는 것을 방지한다. 이러한 반응성 기는 선택적인 방식으로 또는 무작위 방식으로 단백질과 반응하여 하나의 접합체 또는 접합체의 혼합물을 산출할 수 있다. 일부 실시양태에서, 일정한 단일 접합체 또는 혼합물이 본 발명에 성공적으로 사용될 수 있다.
부가적인 요소(예를 들어, 인식 요소, 상호작용 요소 등)에 화학적 접합하기에 적합한 반응성 기를 보유하는 본원에 기재된 펩타이드의 예(예를 들어, β9-유사(SmTrip9) 및 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드; β9/β10-유사 디펩타이드 등)는 도 95 내지 98에 표시된다. 반응성 기 및 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드/폴리펩타이드의 다른 조합은 본원의 범위 내에 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9), 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 형광단 또는 형광 단백질과 같은 검출가능한 요소에 융합 또는 접합된다. 이러한 실시양태에서, 생물발광 복합체 및 결과적으로 생성되는 생물발광을 형성하는 상보성은 BRET 및 부착된 검출가능한 요소(예를 들어, 형광단 또는 형광 단백질)로부터의 여기/방출을 초래한다. 이러한 실시양태에서, 생물발광 복합체는 BRET 에너지 공여자이고, 복합체의 성분(예를 들어, 펩타이드 태그 또는 폴리펩타이드 성분)에 부착된 검출가능한 요소(예를 들어, 형광단 또는 형광 단백질)는 BRET 에너지 수여자이다.
본원에 설명된 삼분할/다분할 상보성 시스템과 함께 BRET 시스템에 사용하기에 적합한 형광단은 다음을 포함하지만, 여기에 제한되는 것은 아니다: 크산텐 유도체(예를 들어, 플루오레세인, 로다민, 오레곤 그린, 에오신, 텍사스 레드 등), 시아닌 유도체(예를 들어, 시아닌, 인도카보시아닌, 옥사카보시아닌, 티아카보시아닌, 메로시아닌 등), 나프탈렌 유도체(예를 들어, 단실 및 프로단 유도체), 옥사디아졸 유도체(예를 들어, 피리딜옥사졸, 니트로벤족사디아졸, 벤족사디아졸 등), 피렌 유도체(예를 들어, 캐스케이드 블루), 옥사진 유도체(예를 들어, 나일 레드, 나일 블루, 크레실 바이올렛, 옥사진 170 등), 아크리딘 유도체(예를 들어, 프로플라빈, 아크리딘 오렌지, 아크리딘 옐로우 등), 아릴메틴 유도체(예를 들어, 아우라민, 크리스탈 바이올렛, 말라카이트 그린 등), 테트라피롤 유도체(예를 들어, 포르핀, 프탈로시아닌, 빌리루빈 등), CF 염료(Biotium), BODIPY(Invitrogen), ALEXA FLOUR(Invitrogen), DYLIGHT FLUOR(Thermo Scientific, Pierce), ATTO 및 TRACY(Sigma Aldrich), FluoProbes(Interchim), DY 및 MEGASTOKES(Dyomics), SULFO CY 염료(CYANDYE, LLC), SETAU 및 SQUARE DYES(SETA BioMedicals), QUASAR 및 CAL FLUOR 염료(Biosearch Technologies), SURELIGHT DYES(APC, RPE, PerCP, 피코빌리솜(Phycobilisomes))(Columbia Biosciences), APC, APCXL, RPE, BPE(Phyco-Biotech), 자가형광 단백질(예를 들어, YFP, RFP, mCherry, mKate), 양자점 나노결정 등. 일부 실시양태에서, 형광단은 미국 특허 출원 일련번호 제13/682,589호에 기재된 것과 같은 로다민 유사체(예를 들어, 카복시 로다민 유사체)이며, 상기 문헌의 전체내용은 본원에 참고로 포함된다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9), 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 형광단 또는 형광 단백질(예를 들어, 녹색 형광 단백질(GFP), 강화 GFP(EGFP), 청록색 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP) 및 이들의 변이체)과 같은 검출가능한 요소에 융합 또는 접합된다. 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 펩타이드 태그 또는 폴리펩타이드 성분은 전체 내용이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제9,908,918호에 기재된 것과 같은, 청록색-여기성 주황색-적색 형광 단백질(CyOFP)에 융합되거나 접합된다. 일부 실시양태에서, 미국 특허 제9,908,918호에 기재된 CyOFP 및 BRET 시스템은 본원에 기재된 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드 성분(예를 들어, CyOFP-(β9-유사 펩타이드), CyOFP-(β10-유사 펩타이드), CyOFP-(β1-8-유사 폴리펩타이드), CyOFP-(β9-10-유사 펩타이드), CyOFP-(β9-유사 펩타이드)-CyOFP, CyOFP-(β10-유사 펩타이드)-CyOFP, CyOFP-(β1-8-유사 폴리펩타이드)-CyOFP, CyOFP-(β9-10-유사 펩타이드)-CyOFP 등)에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원의 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드 성분에 연결된 CyOFP를 포함하는 이러한 시스템은 본원에서 "안타레스 작제물" 또는 "안타레스 시스템"으로 지칭될 수 있다. 이러한 BRET 시스템은 특정 이미지화 적용예에서 특히 유용하다(Schaub, F. X., 등(2015) "Fluorophore-NanoLuc BRET Reporters Enable Sensitive In Vivo Optical Imaging and Flow Cytometry for Monitoring Tumorigenesis." Cancer Research 75(23): 5023-5033; 전체가 본원에 참고로 포함됨).
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9), 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 구성적 BRET 시스템(예를 들어, 안타레스 유사 시스템)에 사용하기 위해 형광단(예를 들어, 직접 또는 링커를 통해)에 연결된다. 구성적 BRET 시스템에서, 방출 스펙트럼은 생물발광 스펙트럼에서 형광단 스펙트럼으로 이동한다(예를 들어, 더 나은 감도, 더 낮은 산란, 원하는 방출 파장 등을 위해). 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드 성분은 기능적 센서로서 사용된다(예를 들어, 세포/세포내/세포간 과정을 모니터링하기 위해(예를 들어, 칼슘 유동 또는 전압을 검출하기 위해(Suzuki, K., 등 (2016). "Five colour variants of bright luminescent protein for real-time multicolour bioimaging." Nature Communications 7: 13718.; Inagaki, S., 등 (2017). "Genetically encoded bioluminescent voltage indicator for multi-purpose use in wide range of bioimaging." Sci Rep 7: 42398; 전체가 본원에 참고로 포함됨)), 이미지화하기 위해, 광유전학 등을 위해).
일부 실시양태에서, 2개 이상의 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 다수의 입체구조에 접근할 수 있는 단일 상호작용 요소에 부착된다. 하나의 입체구조에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 및 폴리펩타이드는 발광 복합체를 형성할 수 없다. 입체구조가 변경되면, 즉 자극에 반응 시, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그는 생물발광 복합체를 형성할 수 있는 입체구조가 된다. 일 예로서, SmTrip9 펩타이드와 SmTrip10 펩타이드는 LgTrip과 푸리마진의 존재하에서도 발광 복합체를 형성하지 않도록 칼모듈린에 접합될 수 있다. 칼슘에 노출되면, 칼모듈린의 입체구조적 변화는 LgTrip을 첨가하면 푸리마진이 있을 때 생물발광되는 복합체를 만드는 위치로 SmTrip9 펩타이드와 SmTrip10 펩타이드를 가져온다. 칼슘 및 기타 자극(pH, 전압 등)에 대한 많은 다른 바이오센서는 문헌에 알려져 있다.
일부 실시양태에서, 본원의 시스템은 다중체성(multiplexable) 분석물 검출에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9), 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드)는 상호작용 요소 및 리포터 요소 둘 모두에 접합된다. 일부 실시양태에서, 상호작용 요소는 항체 등이고, 리포터 요소는 소분자 형광단이다. 일부 실시양태에서, 상이한 병원체(예를 들어, 지카 바이러스, 뎅기 바이러스 등)에 대한 항체는 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, SmTrip9 펩타이드) 및 상이한 구별가능한 파장을 가진 형광단에 접합된다. 이 실시양태에서, 항체가 이의 항원에 결합 시 형성된 발광 복합체는 생물발광 공명 에너지 전달로 인해 결합된 형광단의 방출 파장에서 빛을 방출한다. 이것은 항체가 모두 동일한 웰, 장치 등에 존재할 수 있도록 하고, 검출된 항원의 정체가 형성된 발광 복합체에 의해 방출되는 빛의 색상에 의해 결정되도록 한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 실시양태에서 사용되는 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 서열번호 5 및/또는 서열번호 8로부터 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분은 서열번호 11과 적어도 40%(예를 들어, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%)의 서열 동일성 또는 유사성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분은 서열번호 11에 비해 100개 이하(예를 들어, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1개 또는 이들 사이의 범위)의 치환(예를 들어, 보존적 치환, 반보존적 치환, 비보존적 변전(substation) 등)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분은 서열번호 17과 적어도 40%(예를 들어, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%)의 서열 동일성 또는 유사성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분은 서열번호 17에 비해 100개 이하(예를 들어, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1개 또는 이들 사이의 범위)의 치환(예를 들어, 보존적 치환, 반보존적 치환, 비보존적 변전 등)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분은 서열번호 17, 서열번호 21, 및/또는 서열번호 302와 적어도 40%(예를 들어, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%) 서열 동일성 또는 유사성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분은 서열번호 17, 서열번호 21, 및/또는 서열번호 302에 비해 100개 이하(예를 들어, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1개 또는 이들 사이의 범위)의 치환(예를 들어, 보존적 치환, 반보존적 치환, 비보존적 변전 등)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분은 서열번호 788과 적어도 40%(예를 들어, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%)의 서열 동일성 또는 유사성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분은 서열번호 788에 비해 100개 이하(예를 들어, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1개 또는 이들 사이의 범위)의 치환(예를 들어, 보존적 치환, 반보존적 치환, 비보존적 변전 등)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분은 서열번호 789와 적어도 40%(예를 들어, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%) 서열 동일성 또는 유사성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분은 서열번호 789에 비해 100개 이하(예를 들어, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1개 또는 이들 사이의 범위)의 치환(예를 들어, 보존적 치환, 반보존적 치환, 비보존적 변전 등)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 하나 이상의 부가적인 요소(예를 들어, 인식 요소, 상호작용 요소, 공동국재화 요소, 검출가능한 요소(예를 들어, 형광단(예를 들어, BRET 촉진용)), 관심 단백질, HALOTAG 등)에 연결(예를 들어, 화학적으로)되거나 융합된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분은 cyOFP(예를 들어, 미국 특허 번호 9,908,918에 기술된 것과 같은 안타레스 작제물에서; 문헌의 전체내용은 본원에 참고로 포함됨) 또는 다른 형광 단백질(예를 들어, BRET 촉진용)에 연결되거나 융합된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분은 부가적인 요소와 폴리펩타이드 성분의 화학적 접합을 촉진하기 위해 하나 이상의 화학적 변형 및/또는 비천연 아미노산 또는 아미노산 유사체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 펩타이드 태그(예를 들어, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드; β9/β10-유사 디펩타이드 등) 및/또는 펩타이드 성분은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 17, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 51, 서열번호 302(또는 이들의 임의의 조합) 중 하나 이상(예를 들어, 전부)과 동일하지 않고, 및/또는 정확한 하위서열이 아니다. 다른 실시양태에서, 펩타이드 태그 및/또는 펩타이드 성분은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 17, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 및/또는 서열번호 29, 서열번호 51, 서열 302(또는 이들의 임의의 조합) 중 하나 이상(예를 들어, 전부)과 동일하고/하거나 정확한 하위서열이다.
일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 서열번호 3의 일부에 상응하고, 이와 실질적인 서열 동일성(예를 들어, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >99%, 100%)을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분은 서열번호 3의 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 내지 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 152, 153(예를 들어, 위치 1 내지 148)에 상응하고, 이와 실질적인 서열 동일성(예를 들어, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >99%, 100%)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 펩타이드 태그(β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드)는 서열번호 3의 일부에 상응하고, 이와 실질적인 서열 동일성(예를 들어, >40%, >50%, >60%, >70%, >80%, >90%, 100%)을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 펩타이드 태그는 서열번호 3의 위치 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 163, 또는 164 내지 166, 167, 168, 169, 170, 또는 171(예를 들어, 위치 160-171)에 상응하고 이와 실질적인 서열 동일성(예를 들어, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >99%, 100%)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 펩타이드 태그(β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 펩타이드)는 서열번호 3의 일부에 상응하고 이와 실질적인 서열 동일성(예를 들어, >40%, >50%, >60%, >70%, >80%, >90 %, 100%)을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 펩타이드 태그는 서열번호 3의 위치 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 152, 153 내지 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 163, 또는 164에 상응하고 이와 실질적인 서열 동일성(예를 들어, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >99%, 100%)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분, 예를 들어 β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드), 제1 펩타이드 태그(β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 펩타이드) 및 제2 펩타이드 태그(β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드)는 함께 서열번호 3의 길이의 적어도 90%에 상응하고 이와 실질적인 서열 동일성(예를 들어, >40%, >50%, >60%, >70%, >80%, >90%, 100%)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9), 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 서열번호 1 및/또는 서열번호 3에 비해 하나 이상의 치환을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분은 서열번호 3 또는 이의 일부(서열번호 11, 서열번호 17 등)와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%)의 서열 동일성을 포함하지만, 서열번호 17에 비해 위치 4, 30, 42, 및/또는 106 중 하나 이상에 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분은 서열번호 17에 비해 E4D 치환을 포함한다. 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분은 서열번호 17에 비해 위치 30에 A, D, E, G, K, L, M, N, Q, S, T, V, 또는 Y를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분은 서열번호 17에 비해 위치 42에 A, C, F, G, I, L, M, S, T, 또는 V를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분은 서열번호 17에 비해 위치 106에 D, K, 또는 Q를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 서열번호 19, 21, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 및 131(또는 이의 rβ1-5-유사, β1-6-유사 또는 β1-7-유사 부분) 중 하나 이상과 70% 이상(예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 또는 이들 사이의 범위)의 서열 동일성 및/또는 서열 유사성을 포함하는 인공 서열이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분은 서열번호 19, 21, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129 및 131(또는 이의 rβ1-5-유사, β1-6-유사 또는 β1-7-유사 부분) 중 하나의 전부 또는 일부(예를 들어, 50개 아미노산, 60개 아미노산, 70개 아미노산, 80개 아미노산, 90개 아미노산, 100개 아미노산, 110개 아미노산, 120개 아미노산, 130개 아미노산, 140개 이상, 또는 이들 사이의 범위)를 포함하는 인공 서열이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 성분은 서열번호 19, 21, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 및 131(또는 이의 rβ1-5-유사, β1-6-유사 또는 β1-7-유사 부분) 중 하나로 이루어지는 서열이다.
일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그((예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드)는 표 1, 표 9, 표 10에 열거된 하나 이상의 펩타이드 서열, 또는 이들의 디펩타이드/트리펩타이드 조합과 70% 이상(예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 또는 이들 사이의 범위)의 서열 동일성 및/또는 서열 유사성을 포함하는 인공 서열이다. 일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 성분은 표 1, 표 9, 표 10에 열거된 펩타이드 서열, 또는 이들의 디펩타이드/트리펩타이드 조합 중 하나의 전부 또는 일부(예를 들어, 5개 아미노산, 6개 아미노산, 7개 아미노산, 8개 아미노산, 9개 아미노산, 10개 아미노산, 11개 아미노산, 12개 아미노산, 13개 아미노산, 14개 이상, 또는 그 사이의 범위)를 포함하는 인공 서열이다. 일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 성분은 표 1, 표 9, 표 10에 열거된 펩타이드 서열, 또는 이의 디펩타이드/트리펩타이드 조합 중 하나로 이루어지는 서열이다.
본원에서 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드, 예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드)로 지칭되지만, 일부 실시양태에서, 본원의 범위에 속하는 생물발광 복합체의 하나 이상의 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 성분은 상호작용 요소, 공동국재화 요소, 결합제, 관심 단백질, 관심 분자, 또는 임의의 다른 모이어티에 부착되지 않는다. 일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 성분 중 하나 또는 둘 모두는 폴리펩타이드 및 다른 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 성분과 상호작용하여 다른 요소에 융합되거나 달리 테더링됨이 없이 발광 복합체를 형성한다.
일부 실시양태에서, 발광 복합체의 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9), 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드), 공동국재화 요소 및/또는 상호작용 요소는 합성 펩타이드/폴리펩타이드, 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 펩타이드/폴리펩타이드, 하나 이상의 아미노산 유사체를 함유하는 펩타이드/폴리펩타이드, 펩타이드/폴리펩타이드 모방체, 접합된 합성 펩타이드(예를 들어, 작용기(예를 들어, 형광단, 발광 기질 등)에 접합됨) 등을 포함한다.
본원에는 기초 연구, 의학 연구, 분자 진단 등을 포함한 다양한 분야에서 유용한 조성물 및 방법이 제공된다. 본원에 기재된 시약 및 검정은 임의의 특정 적용예에 제한되지 않으며, 임의의 유용한 적용예가 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주되어야 할지라도, 다음은 현재 청구된 발명을 사용하는 예시적인 검정, 키트, 분야, 실험 장치 등이다.
본원의 실시양태를 이용하는 전형적인 적용예는 단백질 이량체화(예를 들어, 이종이량체, 동종이량체), 단백질-단백질 상호작용, 단백질-RNA 상호작용, 단백질-DNA 상호작용, 표적에 결합하는 항체(또는 다른 인식 요소) 결합, 핵산 혼성화, 단백질-소분자 상호작용, 분석물 정량 또는 검출, 또는 분자 실체의 임의의 다른 조합의 모니터링/검출을 수반한다. 예시적인 실시양태에서, 제1의 관심 실체는 제1의 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9), 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드)에 부착되고, 제2의 관심 실체는 제2의 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9), 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드)에 부착된다. 특정 검정 조건(예를 들어, 발광 복합체의 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드) 및 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질의 존재 하에) 하에 검출가능한 신호가 생성된다면, 제1 및 제2 실체의 상호작용 및/또는 공동국재화가 추정된다. 이러한 검정은 임의의 적합한 조건(예를 들어, 시험관내, 생체내, 동일계내, 전체 동물 등) 하에서 분자 상호작용 및/또는 국재화를 모니터링하는 데 유용하며, 예를 들어 약물 발견, 분자 경로 해명, 복합 조립체의 평형 또는 동역학 측면의 연구, 고처리량 스크리닝, 근접 센서 등에 사용된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 시스템 및 방법은 분석물, 분석물들, 분석물들의 공동국재화, 및/또는 분석물들의 분자 상호작용에 대한 검출, 정량, 분석, 특성화 등에 유용하다. 일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9), 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이들의 디펩타이드 및 트리펩타이드)는 분석물에 테더링/융합된다. 일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그는 표적 분석물에 결합하는 인식 요소 작용제에 테더링/융합된다.
본원의 실시양태에서 사용(예를 들어, 분석)되는 적합한 분석물로는 핵산(예를 들어, DNA, RNA, miRNA 등), 단백질(예를 들어, 박테리아 항원, 바이러스 항원, 바이오마커, 항체 등), 소분자, 독소, 바이오마커, 환경 또는 식품 오염물질, 계면활성제, 병원체(예를 들어, 바이러스 항원 및 단백질, 박테리아 항원 및 단백질 등), 약물(예를 들어, 치료 약물, 남용 약물 등), 비타민, 사이토카인, 항체(예를 들어, 자가항체, 감염성 질환 노출, 치료 약물 모니터링, 항-HLA 이식 거부 반응 등), 세포, 세포 수용체 단백질, 바이오마커 기반 진단, 무세포 핵산 및 비-세포 유리 핵산(예를 들어, DNA, RNA, mRNA, miRNA 등), 핵산 SNP, 추출된 핵산, 증폭되지 않은 핵산 샘플, 게놈 DNA, ssDNA, 박테리아 내성 유전자, 면역복합체(예를 들어, 항원:항체 복합체, 항원:보체 복합체 등), 혈당, 호르몬, 대사산물, 미생물, 기생충, 효소, 전사인자, 금속 이온/중금속 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원의 실시양태에서 사용(예를 들어, 펩타이드 태그에 융합/테더링, 분석물에 결합 등)되는 적합한 인식 요소 또는 결합 모이어티로는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다: 항체(예를 들어, 단클론, 다클론, 재조합, 동물 유래, 자가항체, 생물치료제 등), 항체 가변 중쇄, 항체 가변 경쇄, 항체 결합 단편(Fab)[F(ab)'2], 낙타류, 단일 사슬 가변 단편(scFv), 단량체 단백질, 수용체 도메인, 아피바디(affibody), 모노바디(monobody), 천연 및 유도체화된 핵산 압타머(예를 들어, RNA 압타머, DNA 압타머, 화학적 변형 압타머 등), 펩타이드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 헥시톨 핵산(HNA), 단백질 A, G, L, M 및/또는 이의 도메인, 서열 특이적 올리고뉴클레오타이드 프로브(예를 들어, DNA 프로브, RNA 프로브 등), 소분자 약물, 항체-올리고뉴클레오타이드 접합체, 다르핀, 나노바디, 아피머, 아디론, 안티칼린, 파지, 자성 입자(예를 들어, 직접 표지 또는 태그화된 인식 요소로 표지됨), 직접 표지되거나 태그화된 인식 요소로 표지된 나노입자(예를 들어, 폴리스티렌 나노스피어 등), 스트렙타비딘, 항원 등. 일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9), 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 올리고뉴클레오타이드 인식 요소 또는 결합 모이어티에 연결된다. 이러한 작제물은 핵산(예를 들어, DNA, RNA 등) 상보성 및/또는 검출에 사용될 수 있다. 예시적인 펩타이드/올리고머 프로브는 도 99에 도시되어 있다. 이러한 예시적인 작제물에서, 반응성 기(예를 들어, 아지도 기(예를 들어, N-말단, C-말단, 내부 등) 또는 본원의 다른 반응성 기)를 포함하는 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드는 상보적 반응성 기(예를 들어, 알킨 기(예를 들어, 5'-말단, 3'-말단, 내부 등) 또는 본원의 다른 반응성 기)를 포함하는 올리고뉴클레오타이드에 접합된다. 예시적인 실시양태에서, 펩타이드 올리고뉴클레오타이드 프로브는 성분 및 시약(예를 들어, 올리고뉴클레오타이드(1 mg, 161 nmol, 수중); 트리에틸암모늄 아세테이트 완충액(40 uL, 수중 1M); 아미노구아니딘 염산염(8 uL, 50 mM, 수중), 펩타이드(2.8 mg, 1.93 umol, DMSO 중); 구리(II) TBTA 용액(1:1 물/DMSO 중 10mM); 아스코르브산 용액(수중 50 mM); 최종 부피는 300uL, 1:1 물:DMSO)을 조합하고; 60℃에서 30분 동안 볼텍싱 및 가열하고; Illustra NAP-5 컬럼을 사용하여 여과하고; 완충액을 RNase 및 DNase가 없는 TE 완충액으로 교환하고; -20℃에서 보관하여 제조한다. 분자 상호작용이 모니터링/검출되는 실시양태에서, 신호의 유의미한 증가가 연합된 제1 및 제2 실체의 상호작용(예를 들어, 결합) 시에 검출가능/측정가능하도록 서로에 대해 친화도를 갖는 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 및 폴리펩타이드 성분이 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 또는 둘 모두(이상)의 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그는 다른 펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드 성분에 대한 친화도가 충분히 낮아서, 연합된 제1 및 제2 실체 사이의 상호작용(예를 들어, 결합)의 부재 하에서 배경 발광만이 검출된다. 다른 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 및 폴리펩타이드 성분은 연합된 제1 실체와 제2 실체 사이의 상호작용의 부재 하에 복합체를 형성하고 신호를 생성할 것이지만, 신호는 연합된 제1 및 제2 실체의 상호작용(예를 들어, 결합) 시에 증가된다(예를 들어, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 102배, 103배, 104배, 105배, 106배 이상 또는 이들 사이의 범위).
공동국재화가 모니터링/검출되는 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 서로 친화도가 있는 것으로 선택되어, 발광 복합체의 신호는 연합된 제1 및 제2 실체의 상호작용(예를 들어, 결합)이 없는 경우에도 검출가능/측정가능하다. 이러한 실시양태에서, 연합된 제1 및 제2 실체가 공동국재화되는 경우(예를 들어, 동일한 조직 내, 동일한 세포 내, 동일한 세포하 구획 내 등), 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그와 폴리펩타이드 성분은, 제1 실체와 제2 실체가 서로 상호작용하는지 여부에 관계없이 복합체화하고 신호를 방출할 것이다(코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체의 존재 하에). 일부 실시양태에서, 2개 이상(예를 들어, 둘 모두, 전부)의 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그는 다른 성분에 대해 충분히 높은 친화도가 있어, 연합된 제1 실체와 제2 실체 사이에 상호작용(예를 들어, 결합) 없이 발광이 검출된다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 실체의 상호작용 시에 신호의 현저한 증가는 검출되지 않는다. 다른 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 및 폴리펩타이드 성분은 연합된 제1 실체와 제2 실체 사이에 상호작용의 부재 하에 복합체를 형성하고 신호를 생성할 것이지만, 신호는 연합된 제1 및 제2 실체의 상호작용(예를 들어, 결합) 시에 증가된다(예를 들어, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 102배, 103배, 104배, 105배, 106배 이상, 또는 이들 사이의 범위).
일부 실시양태에서, 알려진 특성(예를 들어, 스펙트럼 특성, 상호 친화도 등)을 갖는 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9), 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 관심 있는 상호작용 쌍의 친화도를 해명하거나 상호작용을 이해하는 데 사용된다. 다른 실시양태에서, 잘 특성화된 상호작용 쌍은 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 세트의 하나 이상의 요소와 폴리펩타이드 성분의 특성(예를 들어, 스펙트럼 특성, 상호 친화도 등)을 결정하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 공지된 특성(예를 들어, 스펙트럼 특성, 상호 친화성 등)을 갖는 폴리펩타이드 성분 및 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그는 관심 있는 공동국재화 쌍(예를 들어, 원하는 조건에서)의 공동국재화를 특성화/모니터하는데 사용된다.
본원에 기재된 실시양태는 약물 스크리닝 및/또는 약물 개발에 사용될 수 있다. 예를 들어, 소분자 약물 또는 소분자의 전체 라이브러리와 관심 표적 단백질(예를 들어, 치료 표적)의 상호작용은 하나 이상의 관련 조건(예를 들어, 생리학적 상태, 질병 상태 등) 하에서 모니터링된다. 이러한 검정은 약물 후보(또는 후보 라이브러리)에 부착된 제1 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 치료 표적에 부착된 제2 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9), 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드)를 포함할 수 있고; 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드) 및 기질의 존재 하의 발광은 후보와 표적의 상호작용 및/또는 공동국재화를 나타낸다.
본원의 일부 실시양태는 생물학적 샘플에서 환자의 치료 약물 모니터링 뿐만 아니라 약물(예를 들어, 인간의 남용 약물)에 대한 모니터링을 위한 진단 또는 범죄 환경에 사용된다. 예를 들어, 약물 분석물을 인식하는 2개의 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그화된 결합 모이어티(예를 들어, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9), 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드)에 의해 별도로 태그화된 결합 모이어티)는 이러한 실시양태를 촉진한다. 일부 실시양태에서, 샘플 중 태그화되지 않은 표적을 식별하기 위해 본원에 기재된 시스템에 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드-태그화된 표적을 이용하는 경쟁 치환 검정은 본원의 실시양태에 사용된다. 일부 실시양태는 환경 오염, 예를 들어 특정 약물 또는 기타 특정 오염 물질(예를 들어, 소분자 오염 물질)에 의해 오염되어 있는, 토양 샘플, 급수 등을 검출하는데 사용된다.
다른 실시양태에서, 2개의 실체(예를 들어, 수용체 및 리간드, 단백질-단백질 등) 사이에 상호작용을 향상시키거나 또는 저해하는 약물(예를 들어, 소분자 약물) 또는 약물(예를 들어, 소분자)의 전체 라이브러리의 능력이 검정된다(예를 들어, 생물발광 신호의 증감에 의해). 일부 실시양태에서, 약물 스크리닝 적용예는 표적에 대한 수천 또는 수만 개의 상이한 분자의 결합의 검출을 허용하거나, 다른 실체의 결합에 대한 이들 분자의 영향을 테스트하기 위해 고처리량 형식으로 수행된다.
일부 실시양태에서, 본원에는 살아있는 유기체(예를 들어, 박테리아, 효모, 진핵생물, 포유동물, 영장류, 인간 등) 및/또는 세포에서 분자 상호작용의 검출이 제공된다. 일부 실시양태에서, 상호작용(표적) 폴리펩타이드에 융합된 pep 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9), 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드)는 세포 또는 전체 유기체에서 공동발현되고, 신호는 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드) 및 기질(예를 들어, 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체)의 존재 하에 검출되고, 여기서 신호는 상호작용 복합체의 형성과 상관관계가 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 펩타이드 태그 및 상호작용 요소를 포함하는 융합체를 암호화하는 벡터(들)에 의해 일시적으로 및/또는 안정적으로 형질전환 또는 형질감염된다. 일부 실시양태에서, CRISPR은 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 및 상호작용 요소를 포함하는 융합체를 발현하는 세포를 생성하는데 이용된다. 일부 실시양태에서, CRISPR에 의해 생성된 융합체(예를 들어, 세포 표적과 본원에 기재된 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 융합체)는 내인성 단백질(예를 들어, 비융합 세포 표적)을 대체하고 내인성 단백질과 유사한 방식으로 조절된다. 일부 실시양태에서, 이러한 내인성 태그화는 특히 생세포, 전체 유기체 등과 같은 복잡한 시스템에서 내인성 태그화된 단백질의 수준을 모니터링하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 검정을 수행하기 위해 필요한 융합체(예를 들어, 펩타이드 태그 및 상호작용 요소를 포함하는 융합체)를 암호화하는 트랜스제닉 유기체가 생성된다. 다른 실시양태에서, 벡터가 전체 유기체에 주입된다.
일부 실시양태에서, 본원에는 살아있는 유기체(예를 들어, 박테리아, 효모, 진핵생물, 포유동물, 영장류, 인간 등) 및/또는 세포에서 분자 공동국재화의 검출이 제공된다. 일부 실시양태에서, 공동국재화(표적) 폴리펩타이드에 융합된 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9), 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드)는 세포 또는 전체 유기체에서 공동발현되고, 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6- 유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드) 및 기질(예를 들어, 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체)의 존재 하에 신호가 검출되며, 여기서 신호는 공동국재화 요소의 공동국재화와 상관관계가 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 펩타이드 태그 및 공동국재화 요소를 포함하는 융합체를 암호화하는 벡터(들)에 의해 일시적으로 및/또는 안정적으로 형질전환되거나 형질감염된다. 일부 실시양태에서, CRISPR은 펩타이드 태그 및 공동국재화 요소를 포함하는 융합체를 발현하는 세포를 생성하는 데 이용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 검정을 수행하기 위해 필요한 융합체(예를 들어, 펩타이드 태그 및 공동국재화 요소를 포함하는 융합체)를 암호화하는 트랜스제닉 유기체가 생성된다. 다른 실시양태에서, 벡터는 전체 유기체에 주입된다.
특정 실시양태에서, 세포는 하나 이상의 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드), 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드), 또는 이의 융합체(예를 들어, 세포 표적과 함께)를 유전자 전달 기술 또는 기타 조작 기술을 사용하여 발현하도록 조작된다. 예를 들어, 세포는 CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)과 같은 유전자 편집 방법론을 사용하여 하나 이상의 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그, 폴리펩타이드 성분, 또는 이들의 융합체(예를 들어, 세포 표적과 함께)를 발현하도록 유전자 조작될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "CRISPR" 또는 "CRISPR-Cas9"는 게놈의 특정 스트레치를 표적으로 하고 정확한 위치에서 DNA를 편집하도록 프로그래밍될 수 있는 다양한 CRISPR-Cas9 및 -CPF1(및 다른) 시스템을 지칭한다. CRISPR-Cas9 유전자 편집 시스템은 II형 원핵생물 클러스터링된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복체(CRISPR) 적응 면역 시스템으로부터의 RNA 유도 Cas9 뉴클레아제를 기반으로 한다(예를 들어, Jinek 등, Science, 337: 816 (2012) 참조); Gasiunas 등, Proc. Natl. Acad. Set U.S.A., 109, E2579(2012); Garneau 등, Nature, 468:67(2010); Deveau 등, Annu. Rev. Microbiol, 64: 475(2010), Horvath 및 Barrangou, Science, 327: 167(2010); Makarova 등, Nat. Rev. Microbiol., 9, 467(2011); Bhaya 등, Annu. Rev. Genet., 45, 273(2011); 및 Cong 등, Science, 339: 819-823(2013) 참조; 이들의 전체내용은 본원에 참고로 포함됨). CRISPR 유전자 편집 시스템은 진핵 세포에서 관심 있는 특정 유전자에 대한 표적화된 변형이 가능하도록 개발되었다(예를 들어, Cong 등, 상기 문헌 참조; Xiao-Jie 등, J. Med. Genet., 52(5): 289-96(2015); 미국 특허 제8,697,359호; Xie 등, Genome Res., 24(9): 1526-1533(2014); Huang 등, Stem Cells, 33(5): 1470-1479(2015); Smith 등, Molecular Therapy, 23(3): 570-577(2015); 및 미국 특허 출원 공개 제2014/0068797호 참조; 이들의 전체내용은 본원에 참고로 포함됨). 유전자 편집을 위해 CRISPR 기술을 사용하는 방법은, 예를 들어, Barrangou 등, Science 315, 1709-1712(2007); Bolotin 등, Microbiology, 151, 2551-2561(2005); Brouns 등, Science 321, 960-964 (2008); Cong 등, 상기 문헌 참조; Deltcheva 등, Nature 471, 602-607 (2011); Gasiunas 등, 상기 문헌 참조; Hale 등, Cell 139, 945-956(2009); Jinek 등, Science 337, 816-821 (2012); Makarova 등, Biology Direct 2006, 1:7(2006); Mali 등, Science 339, 823-826 (2013); Marraffini 등, Science 322, 1843-1845 (2008); Mojica 등, J Mol Evol 60, 174-182 (2005); Pourcel 등, Microbiology 151, 653-663 (2005); 및 Sapranauskas 등, Nucl. Acids Res. 39, gkr606-gkr9282(2011)에 기재되어 있다; 이들의 전체내용은 본원에 참고로 포함됨.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드)는 단백질 태그(예를 들어, 세포 내, 전체 동물 내에서)로서 사용된다. 이러한 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(들)에 대한 보체 성분(예를 들어, 폴리펩타이드 성분, 다른 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그, 기질)은 태그화된 단백질의 존재를 검출/정량하기 위해 시스템(예를 들어, 세포, 동물 등)(예를 들어, 시약의 일부로서)에 적용된다.
일부 실시양태에서, 본원의 펩타이드 태그(예를 들어, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드)의 작은 크기는 단백질 태그화에 유용하다.
일부 실시양태에서, 본원의 생물발광 복합체의 성분(예를 들어, 본원의 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9), 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드), 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)는 연장된 시간 기간 동안 적합한 완충액에서 존재하기에 충분하게 안정적이다(예를 들어, 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체(예를 들어, 푸리마진) 기질의 존재 하에). 특정 실시양태에서, 본원의 생물발광 복합체의 성분(예를 들어, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그, 폴리펩타이드 성분 등)은 상보성 성분의 부재 하에(예를 들어, 특히 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체(예를 들어, 푸리마진) 기질의 존재하에서도) 최소의 검출가능한 발광을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 최적화된 완충액 조건은 단백질 태그화에 필요한 기준을 충족시키기 위해 활용된다.
본원에 제공된 조성물 및 방법, 뿐만 아니라 이에 기초한 임의의 기술 또는 기술들은 다양한 적용예 및 분야에서 사용된다.
본원에는 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)을 설계 및/또는 최적화하는 방법 및 이로부터 형성되는 생물발광 복합체가 제공된다. 본 명세서에 기재된 실시형태 및/또는 이의 패널과 일치하는 비발광 쌍/기의 설계에 적합한 임의의 방법은 본원의 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 및 폴리펩타이드 성분, 및 이들의 조합의 특성은 치환(예를 들어, 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 아미노산 유사체 등의 치환)에 의해 최적화되며; 이러한 특성으로는 구조적 안정성(예를 들어, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 또는 폴리펩타이드 성분의 안정성, 복합체의 안정성 등), 발현, 점착성(예를 들어, 튜브, 웰 등에 대한), 휘도(또는 이로부터 형성된 복합체), 생물발광 복합체의 다른 성분에 대한 친화도, 용해도, 열 및 화학적 안정성, 낮은 자가발광 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9), 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 개별적으로 발광이 결여되고, 연합 시 발광을 나타내도록 새롭게 설계된다. 이러한 실시양태에서, 비발광 요소 사이의 상호작용의 강도는 생물발광 복합체의 형성을 촉진하는 상호작용 요소의 부재 하에서 생물발광 신호를 생성하기에는 불충분하다. 다른 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 및 폴리펩타이드 성분 및/또는 이의 생물발광 복합체는 예를 들어 생물발광 단백질을 출발점으로 사용하여 합리적으로 설계된다. 예를 들어, 이러한 방법은 (a) 3개 이상의 관련 단백질의 서열을 정렬하는 단계; (b) 관련 단백질에 대한 콘센서스 서열을 결정하는 단계; (c) 콘센서스 서열이 결정된 것과 관련된 생물발광 단백질의 단편(예를 들어, 하나 이상의 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 및 폴리펩타이드)을 제공하는 단계로서, 여기서 단편은 개별적으로는 실질적으로 비발광성이지만, 단편의 상호작용 시에는 발광을 나타내는 것인 단계; 및 (d) 비연합 시에 발광의 부재 및 비발광 쌍의 연합 시에 발광에 대해 단편을 테스트하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단편은 하나 이상의 위치(예를 들어, 시험관내, 인실리코 등에서)에서 돌연변이되며, 상기 돌연변이는 단편의 서열을 변경시켜 특징의 최적화를 초래한다.
일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그는 '다크 펩타이드', 또는 다른 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드 성분과 복합체를 형성하지만(예를 들어, 저친화도 또는 고친화도로), 발광을 최소로 생성하거나 전혀 생성하지 않는 것이다. 일부 실시양태에서, 고친화도 다크 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드는 바이오센서에 대한 또는 저해제 측정을 위한 신호 검정의 역상보성 또는 증가에 사용된다. 일부 실시양태에서, 저친화도 다크 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드는 복합체에 대한 고친화도 브라이트 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그의 결합을 검출하기 위해 복합체의 배경 발광을 낮추기 위해 사용된다.
일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그는 '소광제 펩타이드', 또는 소광제 모이어티(예를 들어, DAB)를 함유하는 것이고, 소광제는 폴리펩타이드 성분(예를 들어, 상보성 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그와 상관없이 생성된 신호) 및/또는 생물발광 복합체 중 어느 하나 또는 둘 모두에 의해 생성된 빛/에너지를 흡수한다.
일부 실시양태에서, 본원의 발광 복합체는 복합체와 형광단(예를 들어, 소분자 형광단, 형광 단백질(예를 들어, cyOFP)) 사이에 BRET를 이용하는 시스템, 방법, 검정, 장치 등에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 형광단(예를 들어, 소분자 형광단, 형광 단백질(예를 들어, cyOFP))은 분석물, 세포 표적 등에 연결되거나 융합된다. 일부 실시양태에서, 형광단(예를 들어, 소분자 형광단, 형광 단백질(예를 들어, cyOFP))은 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 및/또는 폴리펩타이드 성분에 연결되거나 융합된다. 일부 실시양태에서, 에너지는 생물발광 복합체로부터 에너지 수여자로 전달된다. 특정 실시양태에서, 에너지 수여자는 형광단 또는 기타 검출가능한 발색단이다. 적합한 형광단으로는 크산텐 유도체(예를 들어, 플루오레세인, 로다민, 오레곤 그린, 에오신, 텍사스 레드 등), 시아닌 유도체(예를 들어, 시아닌, 인도카보시아닌, 옥사카보시아닌, 티아카보시아닌, 메로시아닌), 나프탈렌 유도체(예를 들어, 단실 및 프로단 유도체), 옥사디아졸 유도체(예를 들어, 피리딜옥사졸, 니트로벤족사디아졸, 벤족사디아졸 등), 피렌 유도체(예를 들어, 캐스케이드 블루), 옥사진 유도체(예를 들어, 나일 레드, 나일 블루, 크레실 바이올렛, 옥사진 170 등), 아크리딘 유도체(예를 들어, 프로플라빈, 아크리딘 오렌지, 아크리딘 옐로우 등), 아릴메틴 유도체(예를 들어, 아우라민, 크리스탈 바이올렛, 말라카이트 그린 등), 테트라피롤 유도체(예를 들어, 포르핀, 프탈로시아닌, 빌리루빈) 등), CF 염료(Biotium), BODIPY(Invitrogen), ALEXA FLOUR(Invitrogen), DYLIGHT FLUOR(Thermo Scientific, Pierce), ATTO 및 TRACY(Sigma Aldrich), FluoProbes(Interchim), DY 및 MEGASTOKES(Dyomics), SULFO CY 염료(CYANDYE, LLC), SETAU 및 SQUARE DYES(SETA BioMedicals), QUASAR 및 CAL FLUOR 염료(Biosearch Technologies), SURELIGHT DYES(APC, RPE, PerCP, Phycobilisomes)(Columbia Biosciences), APC, APCXL, RPE, BPE(Phyco-Biotech), 자가형광 단백질(예를 들어, YFP, RFP, mCherry, mKate), 양자점 나노결정 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 형광단은 본원에 전체내용이 참고로 포함되는 미국 특허 출원 일련번호 제13/682,589호에 기재된 것과 같은 로다민 유사체(예를 들어, 카복시 로다민 유사체)이다. 일부 실시양태에서, 형광단은 소분자 형광단이고; 형광단을 언급하는 본원의 실시양태는 소분자 형광단으로 읽을 수 있거나, 제한될 수 있다. 일부 실시양태에서, 형광단은 형광 단백질(예를 들어, cyOFP, GFP, CFP 등; 형광단을 언급하는 본원의 실시양태는 형광 단백질(예를 들어, cyOFP, GFP, CFP 등)로 읽을 수 있거나, 이에 제한될 수 있음)이다.
다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 생물발광 복합체, 및 이의 성분은 다양한 여러 면역검정 개념에 사용된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드)는 1차 또는 2차 항체에 테더링/융합되어 특정 분석물에 대한 검출 방법을 제공한다. 또 다른 예로서, 펩타이드 태그는 항체-결합 단백질(예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G)에 테더링/융합되고 특정 분석물에 결합된 특정 항체를 검출하는 데 사용된다(예를 들어, 여기서 분석물은 상보적 펩타이드 태그에 결합됨). 또 다른 예로서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그는 스트렙타비딘에 테더링/융합되고 특정 분석물에 결합된 특정 비오틴화된 항체를 검출하는 데 사용된다(예를 들어, 여기서 분석물은 상보적 펩타이드 태그에 결합됨). 또 다른 예로서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그는 1차 및 2차 항체에 테더링/융합되며, 여기서 1차 항체는 특정 분석물을 인식하고, 2차 항체는 1차 항체를 인식한다. 또 다른 예로서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그는 분석물에 테더링/융합되고 경쟁 샌드위치 ELISA 형식에 사용된다. 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그는 분석물에 테더링/융합 접합되어, 또한 분석물에 결합할 수 있는 항체를 검출하는 데에도 사용될 수 있다.
본원의 다양한 실시양태는 면역검정을 통한 소분자 검출에 사용된다. 예시적인 실시양태는 본원에 기재된 제1 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드로 직접 표지된 소분자(예를 들어, 표적 소분자와 동일하거나 유사함) 및 본원에 기재된 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드에 융합되거나 연결된 표적 소분자에 대한 결합 모이어티의 사용을 포함한다. 폴리펩타이드 성분 및 기질(예를 들어, 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체)의 존재 하에 시스템에 의해 생물발광 신호가 생성된다. 시스템이 샘플(예를 들어, 생물학적 샘플, 환경 샘플 등)에 노출되는 경우, 샘플에 소분자 표적이 존재하면 생물발광 신호가 감소될 것이다(표지된 소분자는 복합체로부터 경쟁하여, 몇몇 경우에는 소분자 표적의 정량을 허용함). 이러한 검정에 대한 대안적인 구성도 본원의 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, 표적 소분자는 독소(예를 들어, 진균독 등), 대사산물(예를 들어, 아미노산, 글루코스 분자, 지방산, 뉴클레오타이드, 콜레스테롤, 스테로이드 등), 비타민(예를 들어, 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B5, 비타민 B7, 비타민 B9, 비타민 B12, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 H 또는 비타민 K 등), 조효소 또는 보조인자(예를 들어, 조효소 A, 조효소 B, 조효소 M, 조효소 Q, 시티딘 트리포스페이트, 아세틸 조효소 A, 환원된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(NADH), 니코틴아미드 아데닌(NAD+), 뉴클레오타이드 아데노신 모노포스포에이트, 뉴클레오타이드 아데노신 트리포스페이트, 글루타티온, 헴, 리포아미드, 몰리브도프테린, 3'-포스포아데노신-5'-포스포설페이트, 피롤로퀴놀린 퀴논, 테트라하이드로비오테린 등), 바이오마커 또는 항원(예를 들어, 에리트로포이에틴(EPO), 페리틴, 엽산, 헤모글로빈, 알칼리성 포스파타제, 트랜스페린, 아포지단백 E, CK, CKMB, 부갑상선 호르몬, 인슐린, 콜레스테릴 에스테르 전달 단백질(CETP), 사이토카인, 사이토크롬 c, 아포지단백 AI, 아포지단백 AII, 아포지단백 BI, 아포지단백 B-100, 아포지단백 B48, 아포지단백 CII, 아포지단백 CIII, 아포지단백 E, 트리글리세리드, HD 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤, 레시틴 콜레스테롤 아실트랜스퍼라제, 파락소나제, 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 아스파레이트 트랜스퍼라제(AST), CEA, HER-2, 방광 종양 항원, 티로글로불린, 알파-태아단백, PSA, CA 125, CA 19.9, CA 15.3, 렙틴, 프로락틴, 오스테오포니틴, CD 98, 파신, 트로포닌 I, CD20, HER2, CD33, EGFR, VEGFA 등), 약물(칸나비노이드(예를 들어, 테트라하이드로칸나비놀(THC), 칸나비디올(CBD) 및 칸나비놀(CBN) 등), 아편유사제(예를 들어, 헤로인, 아편, 펜타닐 등), 각성제(예를 들어, 코카인, 암페타민, 메탐페타민 등), 클럽 약물(예를 들어, MDMA, 플루니트라제팜, 가마-하이드록시부티레이트 등), 해리성 약물(예를 들어, 케타민, 펜시클리딘, 샐비어, 덱스트로메토르판 등), 환각제(예를 들어, LSD, 메스칼린, 실로시빈 등) 등), 폭발물(예를 들어, 2,4,6-트리니트로톨루엔(TNT) 및 헥사하이드로-1,3,5-트리니트로-1,3,5-트리아진(RDX), 펜타에리스리톨 테트라니트레이트(PETN) 등), 독성 화학물질(예를 들어, 타분(GA), 사린(GB), 소만(GD), 사이클로사린(GF), 2-(디메틸아미노)에틸 N, N-디메틸포스포아미도플루로이데이트(GV), VE, VG, VM, VP, VR, VS 또는 VX 신경제) 등이다.
본원에 기재된 시스템 및 방법은 다양한 적용예 및 형식에 사용된다. 다음은 본원에 기재된 시스템을 활용하는 방법 및 형식의 비배타적인 예시적인 예이다.
● 일부 실시양태에서, 본원에는 전통적인 형질감염을 통해 융합체로서 발현되거나 또는 CRISPR를 통해 내인성으로 태그화된 단백질로서 발현된 SmTrip 펩타이드-표지된 단백질을 이용하여 동적 단백질-단백질 상호작용을 분석하기 위한 세포내 2개 단백질 시스템이 제공된다; LgTrip은 LgTrip의 공동형질감염에 의해 LgTrip을 발현하는 안정적인 세포주를 제공하거나, 또는 검출 시약에 LgTrip을 제공하고 이를 SmTrip-표지 단백질을 발현하는 용해된 세포에 첨가하여 검출 시약으로 사용할 수 있다(도 51a).
● 일부 실시양태에서, 본원에는 전통적인 형질감염을 통해 융합체로서 발현되거나 또는 CRISPR을 통해 생성된 내인성으로 태그화된 단백질로 발현되는 SmTrip- 및 LgTrip-표지된 단백질을 이용하여 동적 단백질-단백질 상호작용 분석을 위한 세포내 3개 단백질 시스템이 제공된다(도 51b).
● 일부 실시양태에서, 본원에는 신호 검정의 증가를 위해 결합 모이어티 A 및 결합 모이어티 B(표 A 참조: 정제된 유전자 융합체 또는 화학적 접합된 SmTrip9 또는 SmTrip10 펩타이드)를 갖는 분석물 X를 측정하는 표적 특이적 검정이 제공된다(예를 들어, 진단 테스트, 비-세포성 등)(도 51c).
● 일부 실시양태에서, 본원에는 신호 손실을 통해 분석물을 측정하기 위한 표적 특이적 경쟁 검정이 제공된다(예를 들어, 진단 테스트, 비세포성 등)(도 51d). 이러한 시스템은 검출 시약의 일부로서 제공될 수 있는 코엘렌테라진 기질 또는 코엘렌테라진 유사체의 존재 하에 빛을 발생시키는 태그화된 표적 분석물에 결합하는 정제된 결합 모이어티 A(예를 들어, 정제된 유전자 융합체 또는 합성 SmTrip9 또는 SmTrip10 펩타이드를 포함하는 화학적 접합체)를 사용한다. 샘플 분석물 X의 존재 하에, SmTrip9 또는 SmTrip10 펩타이드는 샘플 분석물 X와 경쟁하여 샘플내 샘플 분석물의 존재에 특이적이고 분석물의 농도에 비례하는 신호 손실을 유발할 것이다.
● 일부 실시양태에서, 2개 또는 3개의 펩타이드 태그인 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 동일한 표적 분석물 상의 인접하지만 중첩되지 않는(상호 배타적이거나 별개의) 에피토프에 대한 인식 요소에 연결(또는 융합)된다. 발광 복합체로부터 생성된 신호(예를 들어, 기질의 존재 하에)는 표적 분석물의 존재를 나타낸다.
● 일부 실시양태에서, 본원의 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및 /또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 면역검정 또는 다양한 형식에 사용된다. 본원에서 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 및 폴리펩타이드 성분을 사용하는 면역검정은 전체 길이의 항체에 제한되지 않고, 항체 단편 또는 비항체 결합 모이어티(예를 들어, DARPin, 압타머, 아피머 등)를 사용할 수도 있다. 예시적인 직접 면역검정(예를 들어, 도 51e 참조)에서, 분석물에 대한 2개의 단클론 또는 재조합 항체(mAb 또는 rAb)는 β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드 태그로 표지되고; 발광 복합체의 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 검출 시약(예를 들어, 기질 포함)의 일부로서 포함된다. 예시적인 간접 면역검정(예를 들어, 도 51f 참조)의 경우, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및 β10-유사(SmTrip10) 펩타이드 태그로 표지된 일반 시약이 분석물(예를 들어, mAb 또는 rAb + 비오틴-pAb, 비오틴-mAb 또는 비오틴-rAb 등)에 특이적인 임의의 쌍을 이룬 항체 시스템과 조합으로 사용되고; 발광 복합체의 폴리펩타이드 성분은 검출 시약(예를 들어, 기질 포함)의 일부로서 포함된다. 예시적인 경쟁 직접 면역검정(예를 들어, 도 51g 참조)은 하나의 항체를 제1 펩타이드 태그(β9-(예를 들어, SmTrip9) 또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드)로 표지하고 분석물을 제2 펩타이드 태그(β10-(예를 들어, SmTrip10) 또는 β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 펩타이드)로 표지화하여 제공되고; 발광 복합체의 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 검출 시약(예를 들어, 기질 포함)의 일부로서 포함되며; 신호 손실은 비표지된 표적 분석물의 존재를 나타낸다. 경쟁 간접 면역검정(예를 들어, 도 51h 참조)을 제공하기 위해, 하나의 항체는 제1 펩타이드 태그(β9-(예를 들어, SmTrip9) 또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드)로 표지화하고, 일반 결합 시약(예를 들어, 스트렙타비딘)을 제2 펩타이드 태그(β10-(예를 들어, SmTrip10) 또는 β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 펩타이드)로 표지화하고, 분석물은 일반 결합 시약(예를 들어, 비오틴)에 대한 결합 모이어티로 표지화하며; 발광 복합체의 폴리펩타이드 성분은 검출 시약(예를 들어, 기질 포함)의 일부로서 포함되고; 신호 손실은 비표지된 테스트 분석물의 존재를 나타낸다. 본원에 기재된 다른 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드/폴리펩타이드 조합을 이용하는 대안적 면역검정은 본 발명의 범위 내에 있다.
● 일부 실시양태에서, 본원에는 검출 시약(예를 들어, 발광 복합체에 대한 기질과 함께)의 성분으로서 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 펩타이드)과 함께 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그 표지된(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 인식 요소를 사용하는 균질 검정이 제공된다.
● 일부 실시양태에서, 본원에는 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그-표지(예를 들어, SmTrip9, SmTrip10 등) 및/또는 폴리펩타이드 성분-표지(예를 들어, LgTrip 변이체)된 인식 요소를 활용하는 균질 검정이 제공된다. 일부 실시양태에서, 균질 검정은 단일 분석물 또는 다중 분석물의 검출/정량화를 위해 제공된다.
● 일부 실시양태에서, 본원의 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 샌드위치 혼성화 검정(예를 들어, 비표적 증폭형, 증폭형 등)에 사용된다.
● 일부 실시양태에서, 본원의 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및 /또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 액체/용액상 또는 고체상의 분석물(들)의 검출에 사용된다.
● 일부 실시양태에서, 본원의 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 표면 기반 검정(예를 들어, 플레이트 기반(예를 들어, 미세역가 플레이트), 종이 기반(예를 들어, Whatman protein saver 903 카드), 플라스틱 기반, 면봉 기반, 큐벳 기반, 막 기반(예를 들어, PVDF, 니트로셀룰로오스 등) 등에 사용된다.
● 일부 실시양태에서, 본원에서 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 측방 유동 및 다른 모세관 기반 방법에 사용된다. 일부 실시양태에서, 이러한 측방 유동 검정은 분석물(예를 들어, 병원체)의 다중체화된 검출/식별/특성화를 허용한다. 일부 실시양태에서, 측방 유동 검정은 본원에 기재된 면역검정을 수행하는 데 사용된다.
○ 직접 면역검정에서 삼분할 항체 융합체를 사용하여 병원체를 검출 및 식별하기 위한 다중체화된 삼분할 측방 유동 검정의 예가 도 52에 도시된다. 이 예에서, 각각 펩타이드 태그(예를 들어, β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드)에 융합된 단클론 또는 재조합 항체(mAb 또는 rAb)의 세트가 액체 샘플에 첨가되고, 이 샘플이 각각 펩타이드 태그(예를 들어, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 펩타이드)에 융합된 제2 mAb 또는 rAb 세트를 포함하는 검출 창을 통해 통과되고, 검출 창 내의 레인에 고정되며, 각각 액체 샘플의 mAb 또는 rAb 중 하나와 동일한 표적에 있는 별개의 에피토프를 인식한다. 액체 샘플이 폴리펩타이드 성분 및 기질의 존재 하에 검출 창을 통과하는 경우(예를 들어, 검출 창에 사전 로딩되거나, 샘플과 함께 첨가되거나, 장치에 별도로 첨가되는 등), 특정 레인의 발광은 표적 상의 별도의 에피토프에 대한 mAb 또는 rAb의 결합을 나타내고, 이로써 표적의 검출 및 식별을 제공한다. 상기 기재된 검정, 및 본원의 시스템 및 방법을 활용하는 대안예는 다양한 검출 패널(예를 들어, 호흡기 패널: 스트렙토코커스, 슈도모나스, 마이코박테리움, 스타필로코커스; 요로 패널: E. 콜라이, 크렙시엘라, 엔테로박터, 스트렙토코커스; 식품계 패널: 시겔라, 캄필로박터, 살모넬라, E.콜라이, 리스테리아; 폐수 관리: 콜리형 패널; 박테리아의 1종에 속하는 균주 식별을 위한 패널 등), 뿐만 아니라 기타 적용예(예를 들어, 독소 검출)를 제공하는데 사용될 수 있다.
○ 직접 면역검정에서 삼분할 항체 융합체를 사용하여 항바이러스 항체의 검출 및 식별, 예를 들어 질병 진단을 위한 예시적인 다중체화된 삼분할 측방 유동 검정은 도 53에 도시된다. 이 예에서, 샘플은 측방 유동 장치에 첨가되고 접합 구역(예를 들어, 패드)으로 흐르도록 한다. 접합 구역은 제1 펩타이드 태그(예를 들어, β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드)에 테더링되거나 융합된 일반 항체-결합제(예를 들어, 단백질 L)를 포함한다. 항체가 샘플에 존재하면, 항체는 표지된 항체 결합제에 의해 결합될 것이다. 장치의 검출 창은 별도의 레인을 포함하며, 각각 제2 펩타이드 태그(예를 들어, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 펩타이드)에 테더링되거나 융합된 별개의 고정된 바이러스 항원을 포함한다. 표지된 항체가 접합 구역에서 검출 창으로 흐르면, 항체가 적절한 항원에 결합하여 펩타이드 태그가 근접해지도록 하여 폴리펩타이드 성분 및 기질(예를 들어, 검출 창에 사전 로딩됨되거나, 샘플과 함께 첨가되거나, 장치에 별도로 첨가되는 등)의 존재 하에 발광 신호를 생성한다. 이러한 장치 및 검정은 단일 장치/검정을 사용하여 다수의 바이러스 및 바이러스 감염을 검출 및 구별할 수 있도록 할 것이다. 예를 들어, 지카, 뎅기 및 Chicungkunga는 단일 테스트를 사용하여 모두 독립적으로 검출될 수 있다.
● 일부 실시양태에서, 상기 측방 유동 검정의 세부사항은 용액상 검정의 플레이트 기반 형식으로 수행된다(예를 들어, 맵과 함께 제공된 웰의 결합 모이어티 조합을 이용함). 일부 실시양태에서, 이러한 검정은 다중체화된 도트 블롯/스팟 어레이 검정 형식으로 수행된다. 일부 실시양태에서, 특정 형식(예를 들어, 측방 흐름)으로 본원에 기재된 임의의 다중체화된 검정은 또한 본원에 기재되거나 본 기술분야에서 이해되는 대안적 형식(예를 들어, 도트 블롯, 스폿 어레이 등)으로 수행될 수 있다.
● 일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및 /또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 본원에서 에어로졸 기반 검출(예를 들어, (1) 세포를 용해하는 프로테아제, (2) 검출 시약 분무, (3) 검출/정량화를 위한 가시화)에 사용된다.
● 일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및 /또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 본원에서 핵산의 등온 증폭에 사용된다.
● 일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및 /또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 본원에서 핵산의 신속 순환 PCR 검출에 사용된다.
● 일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및 /또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 본원에서 단백질-단백질 상호작용(예를 들어, 2개 단백질, 3개 단백질 사이 등)의 검출에 사용된다.
● 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 검정 및 방법의 분석은 고정식 또는 휴대용 장치 및 판독기, 광도계 플레이트 판독기 또는 수동식 판독기, 스마트폰 카메라 또는 CCD 카메라 등을 사용하여 수행된다.
● 일부 실시양태에서, 분석물은 광도계 또는 이미지화 기반 기술을 통해 인식 요소를 통한 신호의 증가에 의해 검출/정량화된다.
● 일부 실시양태에서, 분석물은 광도계 또는 이미지화 기반 기술을 통해 경쟁적 치환을 통한 신호 손실에 의해 검출/정량 측정된다.
● 일부 실시양태에서, 본원의 시스템 및 방법은 유전자적으로 또는 화학적 접합을 통해 각각의 인식 요소에 다중 태그를 허용하여 인식 요소당 펩타이드 태그의 증가하는 화학량론을 첨가하여 신호 증폭을 제공한다.
● 일부 실시양태에서, 본원의 시스템 및 방법은 불균질 용액에서 천연 단백질의 검출에 사용된다.
● 일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및 /또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 본원에서 핵산 검출에 사용되며, 예를 들어, 펩타이드-태그화된 상보적 인식 요소는 직렬로 핵산 표적 서열에 혼성화된다.
● 일부 실시양태에서, 항체(예를 들어, 분석물로서의 항체) 검출을 위한 검정이 본원에 제공된다. 이러한 검정 중 하나가 도 54에 도시된다. 제1 펩타이드 태그(예를 들어, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 펩타이드)는 항체 결합 단백질(예를 들어, 단백질 L)에 융합 또는 테더링되고, 제2 펩타이드 태그(예를 들어, β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드)는 항체가 특이적인 분석물에 융합 또는 테더링되며; 발광 복합체의 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 검출 시약(예를 들어, 기질 포함)의 일부로서 포함되고; 샘플에 분석물 특이적 항체의 존재는 복합체 형성 및 발광을 초래한다.
● 일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및 /또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 본원에서 검출/정량화를 위해 생물발광 또는 BRET를 사용하는 FISH-유사 적용예에 사용된다.
● 일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및 /또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 본원에서, 예를 들어, 핵산의 무증폭 검출을 통한, 핵산(예를 들어, 단일 가닥 및/또는 이중 가닥 DNA 및/또는 RNA)의 검출에 사용된다. 예를 들어, 도 56에 도시된 바와 같이, 한 쌍의 펩타이드 태그-표지된 핵산 프로브는 핵산 표적의 위치 근처에 혼성화되는 경우, 핵산 표적과 상보성에 의해 촉진되는 발광 복합체의 형성을 허용할 것이다. 이러한 검정은 고체 표면 상에서, 용액 중에서, 단일 핵산 표적에 대해, 또는 다중체화되어(예를 들어, 어레이 사용) 수행될 수 있다.
● 일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 본원에서 랩-온-칩(lab-on-chip) 및/또는 미세유체공학 적용예에 사용된다.
● 일부 실시양태에서, 본원의 시스템 및 방법은 면역검정과 같은 불균질 검정에 사용된다(예를 들어, 균질한 면역검정 분석과 조합된 PCR 증폭).
일부 실시양태에서, 생물발광 복합체를 형성할 수 있는 펩타이드 태그를 제공하기 위해 화학적(예를 들어, 차단 모이어티의 제거) 또는 효소적(예를 들어, 단백분해적 절단) 이벤트가 필요한, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 기반 센서가 제공된다. 예를 들어, 차단된 디펩타이드(예를 들어, 생물발광 복합체를 형성할 수 없음)를 보완될 수 있는 2개의 비-차단된 펩타이드로 절단하기 위해 프로테아제가 필요하다. 일부 실시양태에서, 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그(예를 들어, β6-유사, β7-유사, β8-유사, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및/또는 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드, 및/또는 또는 이의 디펩타이드 및 트리펩타이드) 및 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-5-유사, β1-6-유사, β1-7-유사, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)은 본원에서 검정 감도 증가를 위해 자성 농축을 활용하는 비드 기반 검정에 사용된다. 이러한 검정 중 하나가 도 55에 도시된다. 이러한 검정에서 자성 입자는 제1 펩타이드 태그(예를 들어, β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 펩타이드) 및 분석물 상의 제1 에피토프에 지향성인 제1 결합제에 접합되고; 비자성 입자(예를 들어, 폴리스티렌 입자)는 제2 펩타이드 태그(예를 들어, β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드) 및 분석물 상의 제1 에피토프 또는 제2 에피토프에 지향성인 제2 결합제에 접합된다. 비드는 발광 복합체의 폴리펩타이드 성분(예를 들어, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드)과 함께 샘플과 조합된다. 자성 분리는 자성 비드 및 여기에 결합된 샘플 또는 다른 시약의 임의의 성분을 포획하는 데 사용된다. 자성적으로-포획된 요소의 발광은 그 다음 발광 복합체에 대한 기질의 존재하에 검출된다. 분석물이 샘플에 있는 경우, 자성 및 비자성 비드 모두가 포획되어 발광 복합체의 포획을 초래할 것이다. 분석물이 없다면, 비자성 비드는 포획되지 않을 것이고, 발광 복합체는 형성되지 않을 것이다. 상기 적용예 및 형식은 예시적이며 비제한적이다. 본원의 설명과 일관되는 다른 실시형태는 본 발명의 범위 내에 있다. NanoLuc® 상업용 루시퍼라제 및/또는 오플로포러스 그라실리로스트리스의 천연 루시퍼라제의 일부에 구조적(반드시 서열 동일성이 아닐지라도) 및 기능적 상관관계를 보유하는 펩타이드, 디펩타이드 및 폴리펩타이드, 및 이의 상보성에 의해 형성된 생물발광 복합체를 포함하는 시스템 및 이들을 이용하는 방법이 본원에 기재된다. 특히, β1-8-유사(예를 들어, LgTrip) 폴리펩타이드와 β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드 또는 β9/10-유사 디펩타이드 간의 상보성에 대한 상세한 설명이 제공된다. 하지만, 본원의 실시양태는 β1-8-유사 폴리펩타이드(예를 들어, LgTrip)와 β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 및 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드 또는 β9/10-유사 디펩타이드 간의 상보성에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시양태에서, NanoLuc® 상업용 루시퍼라제 및/또는 오플로포러스 그라실리로스트리스의 천연 루시퍼라제의 일부에 구조적(반드시 서열 동일성이 아닐지라도) 및 기능적 상관성을 보유하는 펩타이드, 디펩타이드 및 폴리펩타이드가 제공된다. 예를 들어, 본원에는 β1-5-유사 폴리펩타이드 및 β6-10-유사 폴리펩타이드 사이; β1-2-유사 폴리펩타이드 및 β3-10-유사 폴리펩타이드 사이; β1-유사 폴리펩타이드, β2-유사 폴리펩타이드와 β3-10-유사 폴리펩타이드 사이; β7-8-유사 디펩타이드와 β9-10/1-6-유사 폴리펩타이드 융합체 사이; β1-7-유사 폴리펩타이드와 β8-유사, β9-유사, 및 β10-유사 펩타이드 사이 및/또는 β1-6-유사 폴리펩타이드와 β7-유사, β8-유사, β9-유사, 및 β10-유사 펩타이드 사이의 상보성에 대한 시스템 및 방법이 또한 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원의 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 전위 검정에 사용된다. 일부 실시양태에서, 전위 검정은 2가지 성분으로 구성된다: 상보성 폴리펩타이드 센서(예를 들어, LgBiT 기반, LgTrip 기반 등) 및 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드 태그화된 관심 단백질(POI). 원형질막, 핵, 미토콘드리아 및 소포체(ER)와 같은 특정 세포 구획에 국재화하는 다양한 LgBiT 센서가 생성되었다(도 152). 이러한 LgBiT 센서는 형질감염 또는 안정한 세포주의 확립을 통해 세포로 도입될 수 있다. POI는 폴리펩타이드에 상보적인 펩타이드/디펩타이드/트리펩타이드(예를 들어, LgBiT)에 의해 내인적으로 태그화된다. 자극 하에, POI는 폴리펩타이드(예를 들어, LgBiT) 센서가 존재하는 상이한 세포 구획으로 전위하고 상보성이 발생하여 펩타이드/폴리펩타이드 복합체(예를 들어, HiBiT·LgBiT)의 조립이 야기되어 발광 신호를 생성한다(도 153). 따라서, POI의 전위 활성은 발광 출력을 통해 정량적으로 측정된다. 전위 검정의 실시양태의 개발 동안 수행된 실험은 실시예 89에 설명되어 있다.
본원에 추가로 기재된 바와 같이, 전위 검정은, 예를 들어, 하기 성분을 포함하는 모듈 시스템의 일부로서 설계될 수 있다: 1) 내인성 유전자좌로부터 HiBiT-태그화된 단백질을 발현하는 세포주; 및 2) LgBiT 국재화 센서. 이 주요 설계는 특정 세포 국재화에서 표적 단백질의 존재와 발광 신호의 상관관계를 허용한다. 센서는 LgBiT 친화도 변이체에 융합된 국재화-특이적 서열, 뿐만 아니라 표적 구획의 검증 및 이미지화를 위한 HaloTag를 포함할 수 있다. 국재화-특이적 서열은 공지된 단백질 세포 마커에서 유래되는 짧은 펩타이드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 짧은 펩타이드가 LgBiT 센서를, 선택한 세포 구획에 대해 배제하기에 충분히 특이적이지 않은 경우에는 전체 길이의 단백질 마커를 센서에 융합시키기 위해 사용할 수 있다. LgBiT 국재화 센서를 암호화하는 DNA 서열은 HiBiT 세포주로 전달될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 플라스미드에 클로닝될 수 있다. 일부 실시양태에서, 전달 방법은 Fugene HD 형질감염 시약을 사용한 지질 기반 형질감염, 또는 렌티바이러스 입자 또는 BacMam을 사용한 바이러스 형질도입을 통해 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 형질감염/형질도입될 때, 세포는 작동제에 의해 처리되고, HiBiT-태그화된 단백질은 LgBiT 센서가 존재하는 세포 구획으로 전위되고; 상보성이 발생하여 발광을 생성한다. 일부 실시양태에서, 작동제는 표적 단백질의 전위를 자극하는 소분자이다.
실시예
실시예 1
(LgBiT)의 추가 절두된 버전은 펩타이드에 의해 활성화된다
LgBiT(배경 및 상보적 SmTrip10 pep86 존재 하에)(서열번호 15, 25)의 발광을 전체 길이의 루시퍼라제(배경 및 상보적 pep263의 존재 하에(서열번호 35))의 β10 및 β9 가닥이 모두 없는 추가 절두된 폴리펩타이드(LgTrip 2098, 서열번호 17)와 비교했다(도 1).
LgBiT(서열번호 11) 또는 LgTrip 2098(서열번호 17)을 보유하는 E.콜라이 KRX는 LB+amp(50 ug/mL)에서 단일 콜로니로부터 30℃(275rpm)에서 20시간 동안 50 mL의 부피 하에 성장시켰다. 이들 배양액으로부터 100배 희석액을 동일한 배지로 만들고 배양액을 37C (275rpm)에서 3시간 동안 성장시킨 다음, 람노스(단백질 과발현 유도제)를 최종 농도 0.2%로 첨가하기 전에 25℃로 냉각시켰다. 그 다음, 배양액을 25℃(275rpm)에서 22시간 동안 성장(유도)시키고, 이 때 배양액을 수확하고 결과적으로 수득되는 펠릿을 처리할 때까지 -20℃에서 보관했다. 세포를 용해시키기 위해 펠릿을 -20℃에서 꺼내어 50 mL의 PBS pH 7.2에 재현탁시키고, 3회의 순차적 동결 해동 사이클(-70℃에서 22℃로)을 거친 후, 원심분리하여 가용성 분획을 생성한 다음, 검정할 때까지 차갑게 유지시켰다(얼음 상에서). 용해액과 펩타이드(25 nm 최종 농도)는 NanoGlo® 시약을 첨가하기 전에 25℃에서 10분 동안 함께 인큐베이션했다. 시약을 첨가한 후, 플레이트를 35℃에서 추가 5분 동안 인큐베이션하고 Tecan Infinite F500 플레이트 판독기를 사용하여 시간이 지남에 따라 판독하여 발광(RLU)을 측정했다.
본원의 실시양태의 개발 동안 수행된 실험은 LgBiT(서열번호 11) 및 LgTrip 2098(서열번호 17) 둘 모두가 약간의 배경 발광을 생성하지만, 그 수준은 LgBiT가 훨씬 더 높다는 것을 입증한다. 데이터에 따르면, LgBiT 및 LgTrip 2098은 이들 각각의 상보적 펩타이드의 존재 하에 더 많은 발광을 생성한다. 펩타이드의 존재 하에 신호 증가의 크기는 LgTrip 2098이 더 크다. 이 데이터는 추가로 절두된 LgBiT(및 A51G 치환 포함)가 LgTrip 2098에 없는 β10 및 β9 베타 가닥에 상응하는 단일 상보적 펩타이드에 의해 활성화된다는 것을 입증한다.
실시예 2
LgTrip 2098은 별도의 β9 및 β10-유사 펩타이드 쌍에 의해 활성화된다
LgTrip 2098(서열번호 31)의 발광은 전체 길이의 루시퍼라제(SmTrip10 pep86(서열번호 25) 및 SmTrip9 pep245)(서열번호 23)의 β10 및 β9 부분에 상응하는 별도의 펩타이드의 존재 하에 시간 경과에 따라 모니터링했다(도 2). 실시예 1에서와 같이 유사한 실험 프로토콜을 사용했다; 단, 10x 농축 용해액을 사용했고, 펩타이드 SmTrip10 pep86 및 SmTrip9 pep245는 500nM로 사용했고, 0.001% Prionex를 반응에 첨가했다. 본원의 실시양태의 개발 동안 수행된 실험은 LgTrip 2098(서열번호 31)이 SmTrip10 pep86 및 SmTrip9 pep245의 첨가에 의해 활성화됨을 입증한다. 펩타이드가 첨가되지 않았거나 하나의 펩타이드만이 첨가된 대조군은 플레이트 판독기의 배경 근처에서 생성되었다.
실시예 3
LgTrip 돌연변이유발 - 라운드 1(발광)
시퀀싱에 사용된 밤샘 배양액을 사용하여 배양액에 접종했다(3ml의 배지 + 0.1% 람노스 + 0.15% 글루코스 중 세포 30ul). 세포를 25℃에서 20시간 동안 밤새 성장시켰다. 세포를 250 ul의 수동 용해 완충액(PLB)에 10 ul로 희석하고 5분 동안 용해시켰다. 용해액을 혼합한 다음, PLB 용해 완충액(0.3X PLB, 25mM HEPES pH 7.5, 0.001 U/ml RQ DNase 1(990 ul 중 10 ul))에 1:100으로 희석했다. 희석된 용해액 50 ul를 NanoGlo® 완충액 + 2uM pep263(SmTrip9-10 디펩타이드)(서열번호 35) 50ul와 합하여 1uM 최종 농도(포화 디펩타이드 농도)로 만들었다. 샘플을 5분 동안 인큐베이션하고, GloMax® Multi+(GMM+) 광도계에서 판독하고, LgTrip 2098( 서열번호 31)에 대해 정규화했다(표 2).
표 2. LgTrip 2098과 비교한 LgTrip 변이체의 상대적 발광.
Figure pct00002
실시예 4
LgTrip 돌연변이유발 - 라운드 1(안정성)
HisLink 정제된 LgTrip 돌연변이체의 안정성을 결정하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다. LgTrip 2098(서열번호 31), LgTrip 2098(RH)(서열번호 31)(컬럼 정제된 LgTrip 2098), #10, #14, #16, #19, #22, #35, #38, #39 및 #42 폴리펩타이드(표 3)를 PLB 용해 완충액에 1:1000으로 희석했다(2ml에 2ul). 100ul의 각 샘플을 96-웰 PCR 트레이 중 1 컬럼의 웰로 전달했다. 샘플을 37℃에서 인큐베이션하고 다양한 시점에서 분취물을 제거했다. 열처리가 완료되면 샘플을 얼음 위에 놓았다. 모든 샘플이 처리되었을 때 PCR 트레이는 실온과 평형이 되게 했다. 샘플을 혼합한 다음, PLB 용해 완충액(495 ul 완충액에 5 ul)에 1:100으로 희석했다. 50 ul의 각 샘플을 50 ul의 NanoGlo® 완충 시약 + 2 uM pep263과 조합했다. 플레이트를 5분 동안 인큐베이션한 다음, GMM+에서 판독했다. 결과는 도 3에 도시된다. 안정성 연구는 추가 분석에 대한 관심 위치로서 LgTrip 2098(서열번호 31)의 위치 42를 식별했다.
표 3. LgTrip 돌연변이체에 대한 실험 명칭(LgTrip 2098에 대한 돌연변이).
Figure pct00003
실시예 5
위치 42 부위 포화(발광)
LgTrip 2098(서열번호 31)에서 위치 42의 아미노산 정체를 최적화하기 위해 본원의 실시양태를 개발하는 동안 실험을 수행했다(도 4). E. 콜라이 배양액(3ml)을 각 샘플에 대해 준비하고 LB 배지 + 100 ug/ml 암피실린에서 37℃ 하에 밤새 성장시켰다. 그 다음, 배양액을 유도 배지(LB+암피실린+0.1%람노스)에 20X 농도(200μl 중 10μl)로 4반복으로 희석했다. 샘플을 37℃에서 6시간 동안 성장시켰다. 그런 다음 샘플을 0.3X PLB, 25mM HEPES pH 7.5 및 0.001 U/ml RQ1 DNase(세포 10μl 대 용해 완충액 250μl)로 용해시켰다. 그런 다음 50μl의 용해액을 50μl의 NanoGlo® 완충액 + 50μM 푸리마진 + 20nM의 디펩타이드 263(서열번호 35)과 조합했다. 샘플은 BMG Clariostar 광도계에서 측정했다. RLU 값은 LgTrip 2098(서열번호 31)에 대해 정규화했다(도 4).
실시예 6
정제된 LgTrip 위치 42 돌연변이체의 37℃ 안정성
LgTrip 2098 돌연변이체에서 위치 42의 안정성을 결정하기 위해 본원의 실시양태를 개발하는 동안 실험을 수행했다(도 5). 폴리펩타이드는 TBS + 0.01% BSA에 20nM로 희석했다. 3반복으로, 각 샘플의 100μl 분취량을 200μl의 박벽 PCR 튜브에 로딩했다. 샘플을 열 순환기에서 37℃ 하에 인큐베이션했다. 다양한 시점에서 샘플을 제거하고, 얼음 위에 둔 다음, 실온으로 평형에 이르게 했다. 샘플을 PLB 용해 완충액(0.3X PLB + 25mM HEPES pH 7.5)에 0.2nM(495μl 중 5 μl)로 희석했다. 희석된 각 샘플 50μl를 NanoGlo® 완충액 중 50μM 푸리마진 + 6μM pep263(서열번호 35) 50μl와 조합했다. 샘플을 10분 동안 인큐베이션한 다음, GMM+에서 판독했다. 반감기는 비선형 회귀에 의해 계산했다(도 5).
실시예 7
LgTrip의 부위 포화
LgTrip 2098(서열번호 31)의 다양한 위치에서 아미노산의 정체를 최적화하기 위해 본원의 실시양태를 개발하는 동안 실험을 수행했다(도 6). E. 콜라이 배양액(3ml)을 각 샘플에 대해 준비하고 LB 배지 + 100 μg/ml 암피실린에서 37℃ 하에 밤새 성장시켰다. 그런 다음 배양액을 유도 배지(LB+암피실린+0.1% 람노스)에 20X 농도(200μl 중 10μl)로 4반복으로 희석했다. 샘플을 37℃에서 6시간 동안 성장시켰다. 그런 다음, 샘플을 0.3X PLB + 25mM HEPES pH 7.5 + 0.001 U/ml DNase(세포 10μl 대 용해 완충액 250μl)로 용해시켰다. 그런 다음 50μl의 용해액을 50μl의 NanoGlo® 완충액 + 50μM 푸리마진 + 20nM의 디펩타이드 263(서열번호 35)과 조합했다. 샘플은 BMG Clariostar 광도계에서 측정했다. RLU 값은 LgTrip 2098(서열번호 31)에 대해 정규화했다(도 6).
실시예 8
LgTrip 3092 주형에 대한 돌연변이
LgTrip 3092(서열번호 19) 변이체에 상대적인 다양한 아미노산 치환의 효과를 결정하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다(표 4). E. 콜라이 배양액(3ml)을 각 샘플에 대해 준비하고 LB 배지 + 100 ug/ml 암피실린에서 37℃ 하에 밤새 성장시켰다. 그런 다음 배양액을 유도 배지(LB+암피실린+0.1% 람노스)에 20X 농도(200μl 중 10μl)로 4반복으로 희석했다. 샘플을 37℃에서 6시간 동안 성장시켰다. 이어서, 샘플을 0.3X PLB + 25mM HEPES pH 7.5 + 0.001 U/ml DNase로 용해시켰다. (세포 10μl 대 용해 완충액 250μl). 그런 다음 50μl의 용해액을 50μl의 NanoGlo® 완충액 + 50μM 푸리마진 + 2nM의 디펩타이드 263(서열번호 35)과 합했다. 돌연변이 용해액을 PLB에 1:100으로 추가 희석했다(495μl 중 5μl). 희석된 용해액 50μl를 50μl의 NanoGlo® 완충액 50μl + 50μM 푸리마진 + 6μM pep263 또는 50μl의 TBS + 20μM LCS(푸리마진) + 6μM pep263(서열번호 35)에 첨가했다. 샘플은 10분 인큐베이션 후 GMM+에서 측정했다. RLU 값은 LgTrip 3092(서열번호 19)에 대해 정규화했다.
표 4. LgTrip 3092와 비교되는 LgTrip 변이체의 상대적 발광.
Figure pct00004
실시예 9
LgTrip 3092 주형의 부위 포화
LgTrip 3092(서열번호 19)의 다양한 위치에서 아미노산의 정체를 최적화하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다. E.콜라이 배양액(3ml)을 각 샘플에 대해 준비하고 LB 배지 + 100 ug/ml 암피실린에서 37℃ 하에 밤새 성장시켰다. 그런 다음 배양액을 유도 배지(LB+암피실린+0.1% 람노스)에 20X 농도(200μl 중 10μl)로 4반복으로 희석했다. 샘플을 37℃에서 6시간 동안 성장시켰다. 그런 다음, 샘플을 0.3X PLB + 25mM HEPES pH 7.5 + 0.001 U/ml DNase(세포 10μl 대 용해 완충액 250μl)로 용해시켰다. 그런 다음 50μl의 용해액을 50μl의 NanoGlo® 완충액 + 50μM 푸리마진 + 2nM의 디펩타이드 263(최종 1nM)과 합했다. 샘플은 BMG Clariostar 광도계에서 측정했다. RLU 값은 LgTrip 3092에 대해 정규화했다(도 7).
실시예 10
LgBiT와 비교한 LgTrip 2098 및 LgTrip 3092의 안정성
LgTrip 2098(서열번호 31) 및 LgTrip 3092(서열번호 33)의 위치 안정성을 LgBiT(서열번호 11)와 비교하기 위해 본원의 실시형태의 개발 동안 실험을 수행했다(도 8). 정제된 LgTrip 2098, LgTrip 3092 및 LgBiT 샘플을 TBS+0.01% BSA에 20 nM로 희석했다. 각 샘플의 100μl를 200μl의 박벽 PCR 튜브에 분취했다. 샘플을 열 순환기에서 37℃ 하에 인큐베이션했다. 샘플을 다양한 시점에서 제거하고 얼음 위에 두었다. 샘플을 RT로 평형화한 다음, PLB 용해 완충액(0.3X PLB+25mM HEPES pH 7.5)에 0.2nM(495μl 중 5μl)로 희석했다. 각 샘플 50μl를 NanoGlo® 완충액 중 50μM 푸리마진 + 6μM pep263(서열번호 35) 50μl로 희석했다. 샘플을 10분 동안 인큐베이션한 다음, GMM+에서 판독했다(도 8).
실시예 11
42℃ 및 60℃에서 LgTrip 변이체의 안정성
42℃ 및 60℃에서 LgTrip 변이체의 안정성을 비교하기 위해 본원의 실시양태를 개발하는 동안 실험을 수행했다(도 9). LgTrip 변이체 샘플을 TBS + 0.01% BSA에 20nM로 희석했다. 100μl 분취량을 200μl 박벽 PCR 튜브에 첨가했다. 샘플을 열 순환기에서 42℃ 또는 60℃에서 인큐베이션했다. 샘플을 다양한 시점에서 제거하고 얼음 위에 두었다. 샘플을 RT로 평형화한 다음, 각각 PLB 용해 완충액(0.3X PLB+25mM HEPES pH 7.5)에 0.2nM(495μl 중 5μl)으로 희석했다. 각각 희석된 샘플 50μl를 NanoGlo® 완충액 중 50μM 푸리마진 + 6μM pep263(서열번호 35) 50μl와 합했다. 샘플을 10분 동안 인큐베이션한 다음, GMM+에서 판독했다(도 9).
실시예 12
SmTrip9 및 SmTrip10을 사용한 LgTrip 변이체의 친화도
SmTrip9- 및 SmTrip10-유사 펩타이드에 대한 다양한 LgTrip 변이체의 친화도를 결정하기 위해 본원의 실시양태를 개발하는 동안 실험을 수행했다(도 10).
SmTrip9 pep286(서열번호 37) 적정을 위해 정제된 LgTrip 샘플을 TBS + 0.01% BSA + 0.005% IGEPAL에 2nM로 희석했다. TBS + 0.01% BSA + 0.005% IGEPAL + 20μM 푸리마진 + 200μM SmTrip10 pep86(SmHiTrip; 서열번호 25)을 함유하는 검정 시약을 준비했다. 4uM의 SmTrip9 pep286(서열번호 37)을 검정 시약에 첨가한 다음, 푸리마진 + 200μM SmTrip10 pep86(HiBiT; 서열번호 15)을 함유하는 검정 시약에 500μl 대 500μl로 연속 희석했다. 25ul의 각 펩타이드 적정액을 25ul의 희석된 LgTrip 용액에 첨가했다. 10분 및 15분째에 플레이트 판독기에서 발광을 판독했다.
SmTrip10 pep86(SmHiTrip; 서열번호 25) 적정을 위해 정제된 LgTrip 샘플을 TBS + 0.01% BSA + 0.005% IGEPAL에 2nM로 희석했다. TBS + 0.01% BSA + 0.005% IGEPAL + 20μM 푸리마진 + 4μM SmTrip9 pep286(서열번호 37)을 함유하는 검정 시약을 준비했다. 200uM의 SmTrip10 pep86(SmHiTrip; 서열번호 25)을 그 다음 검정 시약에 첨가한 다음, 푸리마진 + 4μM SmTrip9 pep286(서열번호 37)을 함유하는 검정 시약에 500μl 대 500μl로 연속 희석했다. 25ul의 각 펩타이드 적정액을 희석된 LgTrip 용액 25ul에 첨가했다. 10분 및 15분째에 플레이트 판독기에서 발광을 판독했다.
실시예 13
LgTrip 변이체의 안정성(60℃)
60℃에서 LgTrip 변이체의 안정성을 비교하기 위해 본원의 실시양태를 개발하는 동안 실험을 수행했다(도 11). 정제된 LgTrip 돌연변이체를 TBS + 0.01% BSA에서 20nM로 희석했다. 각 샘플의 100μl를 200μl의 박벽 PCR 튜브에 분취했다. 샘플을 열 순환기에서 60℃에서 인큐베이션한 다음, 다양한 시점에서 제거하고 얼음 위에 놓고 실온으로 평형화한 다음 PLB 용해 완충액(0.3X PLB+25mM HEPES pH 7.5)에서 0.2nM(495μl 중 5μl)으로 희석했다. 희석된 각 샘플 50μl를 NanoGlo® 완충액 중 50μM 푸리마진 + 6μM pep263(서열번호 35) 50μl와 조합했다. 샘플을 10분 동안 인큐베이션한 다음, GMM+에서 판독했다. 반감기는 GraphPad Prism 비선형 회귀를 사용하여 계산했다(1상 붕괴 안정기를 0으로 설정함).
실시예 14
LgBiT 및 LgTrip 변이체의 동역학 프로파일 비교
다양한 LgTrip 변이체의 동역학 프로파일을 NanoLuc® 루시퍼라제(서열번호 3) 및 LgBiT(서열번호 11)/HiBiT(SmTrip10 pep86)(서열번호 25) 2성분 시스템과 비교하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다(도 12). NanoLuc, LgBiT, LgTrip 2098(서열번호 31), LgTrip 3092(서열번호 33) 및 LgTrip 3546(서열번호 51)은 TBS + 0.01% BSA + 0.005% IGEPAL에서 20μM로 희석했다. 샘플을 1:100(198μl 중 2μl)으로 희석한 다음, 1:1000(10ml 중 10μl) 또는 10E-5 희석 하여 전체적으로 0.2nM 최종 농도로 만들었다. LgBiT 폴리펩타이드에 200nM의 SmTrip10 pep86(SmHiTrip; 서열번호 25)을 첨가했다. LgTrip 변이체에 200μM SmTrip10 pep86(SmHiTrip; 서열번호 25) 및 20μM SmTrip9 pep286(서열번호 37)을 첨가했다. 샘플을 15분 동안 인큐베이션했다. 각 효소/펩타이드 희석액 50ul를 TBS+0.01% BSA+20μM 생세포 기질(LCS; Promega Cat. No. N205) 또는 NanoGlo® 완충액+50μM 푸리마진과 조합하고, 즉시 GMM+ 광도계에서 판독했다.
실시예 15
3분할 시스템에 의한 단백질-단백질 상호작용 검출
단백질-단백질 상호작용을 검출하는데 있어서 3분할 상보성 시스템의 사용을 입증하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다(도 13). SmTrip9 pep245 및 SmTrip10 pep86(도 13a) 또는 SmTrip9 pep245 및 SmBiT(도 13b) 각각에 융합된 FRB 및 FKBP를 함유하는 용해액을 정제된 LgTrip 2098(서열번호 31)에 첨가했다. FRB/FKBP 복합체의 형성은 라파마이신으로 유도했고 3분할 시스템의 촉진된 상보성은 발광에 의해 모니터링했다.
세포 및 용해액 준비. 각 FRB-FKBP 작제물의 배양액을 LB+100ug/ml 암피실린에서 밤새 성장시켰다. LB+0.1% 람노스+0.15% 글루코스+100ug/ml 암피실린에서 배양액을 유도하고(3ml 배양액 중 30μl), 25℃에서 24시간 동안 성장시켰다. 200μl의 10X Fastbreak 세포 용해 시약(Promega)을 2ml의 배양액 0.001 U/ml RQ1 DNase에 첨가했다. 배양액을 회전 혼합기에서 4℃ 하에 30분 동안 인큐베이션한 다음, 30분 동안 3500rpm으로 4℃에서 회전시켰다. 청징화된 용해액을 제거하고 새 튜브에 넣고 동결하여 -70℃에서 보관했다.
검정 . 용해액을 해동하고, TBS + 0.1% BSA에 1:10으로 희석하고, 적절한 용해액을 합쳤다. 용해액을 나누고, 30nM 라파마이신을 분취물 중 하나에 첨가했다. 25μl의 각 용해액을 25μl의 LgTrip 2098(서열번호 31)과 합하고, TBS + 0.01% BSA에 200nM로 희석하고, 1시간 동안 인큐베이션했다. 50μl의 NanoGlo® 완충액 + 50μM 푸리마진을 첨가하고 GMM+에서 발광을 판독했다.
실시예 16
무작위 라이브러리 제조 및 스크리닝
변이체 LgTrip 폴리펩타이드(주형 LgTrip 2098 사용)(서열번호 31)의 무작위 라이브러리를 생성하고 β9/β10 디펩타이드(서열번호 35)(pep263)를 사용한 상보성에 대해 스크리닝했다.
LgTrip 2098(서열번호 32)로부터의 주형 DNA를 물에 10 ug/ml로 희석했다. Diversify™ PCR 무작위 돌연변이유발 키트(63070-ClonTech)를 사용하여 돌연변이체의 무작위 라이브러리를 제조했다. 라이브러리 증폭 산물을 WIZARD SV Gel 및 PCR Clean-Up System(A9281; Promega)을 사용하여 밴드 단리 및 정제했고, pF4Ag에 클로닝하고, KRX 수용성(competent) 세포(Promega)에 형질전환시키고, LB 아가로스 플레이트에 플레이팅했다. 콜로니를 채취하고 LB+암피실린이 포함된 96웰 플레이트의 웰에 넣고 샘플을 37℃에서 밤새 진탕하면서 성장시켰다. 밤샘 배양액을 유도 배지(LB+0.1% 람노스+0.15% 글루코스+100ug/ml 암피실린)에 1:20 희석하고 배양액을 37℃에서 2-6시간 동안 성장시켰다. 10ul의 세포를 250ul의 PLB 용해 완충액(0.3X PLB, 25mM HEPES pH 7.0, 0.001U/ml DNase)에 첨가했다. 50ul의 세포 용해액을 50ul의 검정 완충액(NanoGlo® 완충액 + 50uM 푸리마진 + 0.2nM의 pep263)과 합했다. 시약 첨가 후 플레이트를 5분 동안 인큐베이션한 다음 ClarioStar 광도계에서 샘플을 판독했다. 추가 스크리닝을 위해 주형 클론에 비해 발광이 개선된 클론을 선택했다.
약 6,000개의 LgTrip 2098 기반 변이체 클론을 추가로 스크리닝하고 유리한 돌연변이 부위를 부위 포화 돌연변이유발로 평가했다. 포화 돌연변이유발 후 유리한 돌연변이를 조합하여 LgTrip 클론 LgTrip 3092(서열번호 19)를 유도해냈다. LgTrip 3092(서열번호 19)를 주형으로 사용하여 스크리닝을 반복하였고, 결과적으로 수득되는 클론은 LgTrip 3546(서열번호 51)이었다.
실시예 17
LgTrip 클론의 정제
LB+0.1% 람노스+0.15% 글루코스+amp에서 LgTrip 돌연변이체의 50ml 배양액을 유도했다. 배양액을 회전시키고 4.5ml의 Hepes pH 7.5 + 0.001U/ml DNase에 재현탁시켰다. FastBreak™ Cell Lysis Reagent(Promega; V8571) 500ul를 첨가하고 샘플을 회전 혼합기에서 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 샘플을 회전시켜 맑은 용해액을 얻고, 상청액을 새 튜브로 옮겼다. HisLink™ 회전 단백질 정제 시스템을 이용하여 500ul의 HisLink™ 단백질 정제 수지(Promega; V8821)를 샘플에 첨가하고 회전 혼합기에서 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, HisLink 세척/결합 완충액으로 세척하고, 용출 완충액으로 용출시켰다. Slide-A-Lyzer 투석 컬럼을 사용하여 완충액을 TBS로 교환했다.
실시예 18
안정성 비교
시간 경과에 따른 LgBiT(서열번호 11) 및 LgTrip 2098(서열번호 31)의 활성 안정성을 비교하기 위해 본원의 실시형태의 개발 동안 실험을 수행했다(도 14). 정제된 LgTrip 2098 및 LgBiT를 TBS+0.01% BSA 또는 0.3X PLB+25mM HEPES pH 7.5에 20nM로 희석했다. 각 샘플 100μl를 200μl의 박벽 PCR 튜브에 분주했다. 열 순환기에서 37℃에서 샘플을 인큐베이션하고 다양한 시점에서 제거하고 얼음 위에 두었다. 샘플을 실온으로 평형화한 다음, PLB 용해 완충액(0.3X PLB + 25mM HEPES pH 7.5)에서 각 샘플을 0.2nM(495μl 중 5μl)로 희석했다. 희석된 각 샘플 50μl를 NanoGlo® 완충액 중 50μM 푸리마진 + 6μM pep263(서열번호 35) 50μl와 조합했다. 샘플을 10분 동안 인큐베이션한 다음, GMM+에서 판독했다. GraphPad Prism 비선형 회귀를 사용하여 반감기를 계산했다(1상 붕괴 안정기를 0으로 설정함).
실시예 19
TBS+최소 BSA 운반체 중 LgTrip의 안정성
TBS 및 최소 BSA 운반체에서 NanoLuc®(서열번호 3), LgBiT(서열번호 11), 및 LgTrip 3546(서열번호 51)의 활성의 안정성을 시간 경과에 따라 결정하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다(도 15). NanoLuc, LgBiT 및 LgTrip 3546은 TBS + 0.01% BSA에서 20nM로 희석했다. 각각 100μl를 200μl의 박벽 PCR 튜브에 분취했다. 샘플을 열 순환기에서 60℃에서 인큐베이션하고 다양한 시점에서 제거하고 얼음 위에 두었다. 샘플을 실온으로 평형화하고 PLB 용해 완충액(0.3X PLB + 25mM HEPES pH 7.5)에 0.2nM(495μl 중 5μl)로 희석했다. 희석된 각 샘플 50μl를 NanoGlo® 완충액에 50μM 푸리마진 + 6μM pep263(서열번호 35) 50μl와 합했다. 샘플을 10분 동안 인큐베이션한 다음, GMM+에서 판독했다. 반감기는 GraphPad Prism 비선형 회귀를 사용하여 계산했다(1상 붕괴 안정기를 0으로 설정).
실시예 20
활성에 미치는 염의 영향
NanoLuc®(서열번호 3), LgBiT(서열번호 11) LgTrip 2098(서열번호 31) 및 LgTrip 3546(서열번호 51)의 활성에 미치는 염 농도의 효과를 결정하기 위해, 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다(도 16).
염 존재 하에 활성을 테스트하기 위해, 각 효소를 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 1uM로 희석하고, TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 2nM로 추가로 희석했다. 4uM의 pep 263(서열번호 35)을 LgBiT, LgTrip 3546(서열번호 51) 및 LgTrip 2098(서열번호 31)에 첨가하고 30분 동안 인큐베이션했다. 25mM Tris pH 7.5 + 0.01% 터지톨 중 5M NaCl로 시작하여 각각에 대해 2배 적정 시리즈를 준비했다. 10uM 푸리마진을 적정 시리즈의 각 샘플에 첨가하고, 5ul의 각 효소 또는 효소+pep263(서열번호 35)을 45ul의 각 기질 첨가제 혼합물과 합했다. 플레이트를 3분 동안 인큐베이션한 다음 GMM+에서 판독했다.
염에 대한 장기간 노출의 효과를 테스트하기 위해 각 효소를 1uM로 희석하고 5M NaCl로 시작하여 25mM Tris pH 7.5 + 0.01% 터지톨에 2배 적정 시리즈를 제조했다. 2ul의 각 효소를 198ul의 NaCl 적정액에 첨가했다(최종 10nM의 각 효소). "무" 첨가제 대조군은 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨이었다. 샘플을 26시간 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 샘플을 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨(990 중 10ul, 2회)에 1:10,000으로 희석했다. 4uM pep263(서열번호 35)을 2차 희석으로 LgTrip 2098(서열번호 31), LgTrip 3546(서열번호 51) 및 LgBiT(서열번호 11)에 첨가했다. 50ul의 각 샘플을 50ul의 NanoGlo® 완충액 + 50uM 푸리마진과 조합했다. 플레이트를 3분 동안 인큐베이션한 다음 GMM+에서 판독했다.
실시예 21
활성에 미치는 우레아의 영향
NanoLuc(서열번호 3), LgBiT(서열번호 11), LgTrip 2098(서열번호 31), 및 LgTrip 3546(서열번호 51)의 활성에 미치는 우레아 농도의 효과를 결정하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다(도 17).
우레아 존재 하에 활성을 테스트하기 위해, 각 효소를 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 1uM로 희석하고 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 2nM로 추가로 희석했다. 4uM의 pep263(서열번호 35)을 LgBiT(서열번호 11), LgTrip 3546(서열번호 51) 및 LgTrip 2098(서열번호 31)에 첨가하고 30분 동안 인큐베이션했다. 각각에 대해 10M 우레아로 시작하여 25mM Tris pH 7.5 + 0.01% 터지톨에 2배 적정 시리즈를 제조했다. 10uM 푸리마진을 적정 시리즈의 각 샘플에 첨가하고, 5ul의 각 효소 또는 효소+pep263(서열번호 35)을 45ul의 각 기질 첨가제 혼합물과 합했다. 플레이트를 3분 동안 인큐베이션한 다음, GMM+에서 판독했다.
우레아에 대한 장기간 노출의 효과를 테스트하기 위해, 각 효소를 1uM로 희석하고, 10M 우레아로 시작하여 25mM Tris pH 7.5 + 0.01% 터지톨에 2배 적정 시리즈를 제조했다. 2ul의 각 효소를 198ul의 우레아 적정액에 첨가했다(각 효소 최종 10nM). "무" 첨가제 대조군은 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨이었다. 샘플을 26시간 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 샘플을 1:10,000으로 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨(990 ul 중 10ul)에 희석했다. 4uM pep263(서열번호 35)을 LgTrip 2098(서열번호 31), LgTrip 3546(서열번호 51) 및 LgBiT(서열번호 11)에 2차 희석으로 첨가했다. 50ul의 각 샘플을 50ul의 NanoGlo® 완충액 + 50uM 푸리마진과 조합했다. 플레이트를 3분 동안 인큐베이션한 다음 GMM+에서 판독했다.
결과는 NanoLuc 및 NanoBiT가 LgTrip 3546에 비해 우레아에 의한 불활성화에 더 민감한 반면, LgTrip 2098은 우레아에 의해 가장 적은 영향을 받는다는 것을 입증한다. 노출 결과는 LgTrip 3546, LgTrip 2098 및 LgBiT가 우레아로 장기간 처리하면 활성을 회복한다는 것을 입증하며, 이는 이들 폴리펩타이드의 활성이 오염 단백질에 의해 부정적인 영향을 받을 수 있으며, 이러한 오염물질의 변성은 활성을 향상시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 22
활성에 대한 pH의 영향
실험은 NanoLuc®(서열번호 3), LgBiT(서열번호 11), LgTrip 2098(WT)(서열번호 31), 및 LgTrip 3546(서열번호 51)의 활성에 미치는 pH의 효과를 결정하기 위해, 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다(도 18).
0.5% 터지톨 중 각각 25mM의 구연산나트륨, MES, PIPES, HEPES, TAPS 및 티오우레아를 함유하는 범용 완충액을 준비했다. 완충액을 20ml의 8개 분취량으로 나누고 NaOH 또는 HCl을 첨가하여 일련의 pH 적정을 생성했다.
활성에 미치는 pH의 효과를 테스트하기 위해, 각 효소를 1uM로 희석한 다음, 3ml의 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 0.4nM로 희석했다. 4uM pep263(서열번호 35)을 LgBiT, LgTrip 2098 및 LgTrip 3546에 첨가했다. 각 pH 완충액에 대한 검정 시약(표 5)(완충액 980 중 푸리마진 20ul)을 테스트했다. 10ul의 각 효소/펩타이드 희석액을 50ul의 검정 시약과 합했다. 플레이트를 3분 동안 인큐베이션하고 GMM+에서 판독했다.
표 5. 완충액
Figure pct00005
다양한 pH의 장기간 노출 효과를 테스트하기 위해 각 효소를 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 1uM로 희석한 다음, 각 완충액에 20nM로 희석했다. T=0 샘플을 혼합한 다음, 200mM HEPES pH 7.5 + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 1:10 희석하고 4℃에서 보관했다. T=8 샘플을 혼합한 다음, 200mM HEPES pH 7.5 + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 1:10으로 희석하고 4℃에서 보관했다. T=24 샘플을 혼합한 다음, 200mM HEPES pH 7.5 + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 1:10으로 희석하고 4℃에서 보관했다. 검정을 수행하기 위해, LgTrip 및 LgBiT를 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 4uM SmTrip10 pep286(서열번호 35)에 1:10으로 희석하고, NanoLuc를 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 희석했다. 40ul의 각 샘플을 40ul의 NanoGlo® 완충액 + 40uM 푸리마진으로 희석하고 3분 동안 인큐베이션한 다음, GMM+에서 판독했다.
결과는 LgTrip이 넓은 pH 범위에 내성이 있음을 나타낸다.
실시예 23
자가발광
LgBiT(서열번호 11) 및 LgTrip 3546(서열번호 51)의 자가발광을 비교하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다. 각각은 DPBS + 0.01% BSA에 3uM로 희석했다. DPBS + 0.01% BSA에 각각 3배 연속 희석액을 제조하고(300ul 대 700ul) 96웰 플레이트의 웰에 넣었다. 플레이트의 마지막 줄은 푸리마진 대조군을 함유했다(n=12). 50ul의 각 적정액(또는 대조군)을 50ul의 NanoGlo® 완충액 + 50uM 푸리마진과 조합하고 3분 동안 인큐베이션한 다음, GMM+에서 판독했다. LgTrip(즉, LgTrip 3546)은 LgBiT에 비해 현저히 감소된 자가발광을 나타냈다(도 19).
실시예 24
β9/β10 디펩타이드에 의한 LgTrip의 상보성
LgTrip 3546(서열번호 51) 또는 LgBiT(서열번호 11)와 생물발광 복합체를 형성하는 β9/β10 디펩타이드(예를 들어, pep263)(서열번호 35)의 능력을 결정하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다. 이러한 복합체의 발광을 β9/β10 디펩타이드와 LgTrip 3546의 복합체 및 SmTrip10 pep86(SmHiTrip; 서열번호 25) 또는 디펩타이드인 pep263(서열번호 35)과 LgBiT의 복합체의 발광과 비교했다(도 20). SmTrip10 pep86(SmHiTrip; 서열번호 25) 및 pep263(서열번호 35)은 H2O에서 2nM로 희석했다. 300nM에서 시작하여 TBS + 0.01% BSA에 각 펩타이드의 3X 희석 시리즈를 제조했다. 200nM LgTrip 3546 및 LgBiT의 용액을 NanoGlo® 완충액 + 50uM 푸리마진(NanoGlo® 시약)에 제조했다. 50ul의 각 적정액을 50ul의 각 NanoGlo® 시약과 조합하고, 5분 인큐베이션 후 발광을 판독했다. 신호/배경은 펩타이드 의존성 RLU의 양을 배경 판독값으로 나누어 계산했다. 결과는 디펩타이드가 낮은 펩타이드 농도에서 낮은 RLU를 차지하는 HiBiT보다 약 2 내지 3배 더 높은 Kd를 갖고 있음을 입증한다. LgBiT의 배경은 배경 신호를 감소시킨다. LgBiT/디펩타이드 및 LgTrip/디펩타이드에 대한 RLU 값은 동일했다.
실시예 25
SmTrip10 및 SmTrip9와 LgTrip 2098 및 LgTrip 3546 상보성의 비교
SmTrip10 pep86-결합된 Frb에 대한 SmTrip9 pep245-결합된 FKBP의 라파마이신 유도 결합에 의해 촉진된, SmTrip10 및 SmTrip9 펩타이드와 각각 LgTrip 2098(서열번호 31) 및 LgTrip 3546(서열번호 51)의 상보성을 입증하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다(도 21). FKBP-SmTrip9 pep245, SmTrip10 pep86-Frb 및 LgTrip 3546 또는 LgTrip 2098을 HEK293 세포(20,000개 세포/웰/96웰 플레이트)에 일시적으로 형질감염시켰다. 샘플을 라파마이신(FKBP/Frb 복합체 형성 유도) 및 10μM 푸리마진의 연속 희석액에 노출시키고 발광을 측정했다. 결과는 SmTrip10 pep86의 친화도가 LgTrip 2098에 비해 LgTrip 3546에 대해 약 10배 더 낮다는 것을 입증한다.
실시예 26
다양한 SmTrip10 서열의 친화도
다양한 SmTrip10 pep286(HiBiT; 서열번호 25) 서열과 LgTrip 3546(서열번호 51)/SmTrip9 pep286(서열번호 37) 사이에 발광 복합체를 형성하는 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다(도 22). 효소를 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 200nM로 희석하고, TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 연속 희석액(900ul에 100ul)을 제조하고(2nM을 만들기 위해 2X), 2nM 샘플을 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 1:10으로 희석했다(4.5ml에 500ul). 100uM에서 시작하여 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 20uM의 SmTrip9 pep286(서열번호 37)에 각 SmTrip10-유사 펩타이드의 2X 희석 시리즈를 제조했다. 50ul의 희석된 LgTrip 3546(서열번호 51)을 50ul의 펩타이드 적정과 합하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션했다. 100ul의 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 20uM 푸리마진을 각 샘플에 첨가하고 샘플을 10분 동안 인큐베이션한 다음, GMM+에서 판독했다.
실시예 27
전도 디펩타이드
보체 폴리펩타이드를 활성화하는 반대 베타 가닥 순서(예를 들어, β9-β10 대 β10-β9)를 갖는 디펩타이드의 능력을 비교하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다(도 23). LgTrip 3546(서열번호 51) 및 LgTrip 2098(서열번호 31)을 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 200nM로 희석하고, TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 각각의 연속 희석액을 제조했다(900ul에 100ul). 2nM 샘플을 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨(4.5ml에 500ul)로 1:10 희석했다. 각 디펩타이드(pep326(서열번호 179) 및 pep263(서열번호 35))의 20uM 스톡을 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 제조했다. 각 펩타이드의 2X 연속 희석액을 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨(250ul 중 250ul)로 제조했다. 50ul 희석된 LgTrip 2098 및 LgTrip 3546을 50ul의 각 펩타이드 시리즈와 조합하고 실온에서 20분 동안 인큐베이션했다. TBS(20uM)에 100ul의 LCS(생세포 기질; Promega Catalog No. N205)를 첨가하고 샘플을 3분 동안 인큐베이션한 다음 GMM+에서 판독했다.
실시예 28
SmTrip10 성분에 대한 SmTrip9(서열번호 23) 및 SmHiTrip(서열번호 25) 또는 SmBiT(서열번호 13)를 포함하는 디펩타이드의 비교
보체 폴리펩타이드를 활성화시키는 SmHiTrip(서열번호 25) 또는 SmBiT(서열번호 13) 서열을 포함하는 디펩타이드의 능력을 비교하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다(도 24). LgBiT, LgTrip 2098, 및 LgTrip 2899(서열번호 364)를 TBS+0.01% BSA에 200nM로 희석했다. 폴리펩타이드를 NanoGlo® 완충액 + 50uM 푸리마진(3ml 중 30ul)에 1:100으로 추가 희석했다. Pep263(서열번호 35) 및 pep274(서열번호 147)를 TBS+0.01% BSA에 5uM로 희석했다. 각 LgBiT/LgTrip 희석액 50ul를 펩타이드 희석액 50ul와 합하고 5분간 인큐베이션한 다음 GMM+에서 판독했다.
실시예 29
LgTrip 3546의 C-말단의 첨가/결실
C-말단 첨가/결실 및/또는 펩타이드 태그에 대한 상응하는 첨가/결실이 상보성 및 발광에 미치는 영향을 결정하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다(도 25). 예시적인 테스트된 펩타이드 및 폴리펩타이드는 표 6에 열거된다.
표 6. 첨가 및 결실을 포함하는 펩타이드 태그 및 폴리펩타이드 성분
Figure pct00006
첨가/결실 폴리펩타이드를 50ml 배양액에서 성장시키고, 펠릿화하고, 100mm HEPES pH 7.5 + 0.001 U/ml DNase 10ml에 재현탁시켰다. Fastbreak Cell Lysis Reagent(Promega Corporation) 1ml 및 HisLink Resin(Promega Corporation) 1ml를 첨가하고 4℃에서 3시간 동안 회전식 진탕기에서 인큐베이션했다. 수지를 침전시키고, 샘플을 100mM HEPES pH 7.5 + 10mM 이미다졸로 4회 세척했다. 폴리펩타이드는 500ul HisLink 용출 완충액으로 2회 용출시켰다. 열투석 튜브를 사용하여 1X TBS에 대해 평형화했다.
효소를 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에서 200nM로 희석하고, TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에서 연속 희석액을 제조했다(900ul에 100ul). 2nM 샘플을 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨(4.5ml에 500ul)로 1:10 희석했다. SmTrip9- 및 SmTrip10-유사 펩타이드를 표 7에 따른 폴리펩타이드 보체와 조합하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션했다. 100ul의 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 20uM 푸리마진을 첨가하고 10분 동안 인큐베이션한 다음 GMM+에서 판독했다.
표 7. 테스트된 폴리펩타이드/펩타이드 조합.
Figure pct00007
실시예 30
폴리펩타이드/펩타이드 및/또는 펩타이드/펩타이드 중첩
폴리펩타이드 성분과 β-가닥에 상응하는 펩타이드 사이 또는 두 펩타이드 사이의 서열 중첩을 결정하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다(도 26). 이러한 실험에서, 폴리펩타이드 성분 및 펩타이드, 또는 2개의 펩타이드는 각각 기본 루시퍼라제의 동일한 아미노산에 상응하는 아미노산을 포함한다.
폴리펩타이드는 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 200nM로 희석했다. TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 연속 희석액(900ul에 100ul)을 제조했다. 각 폴리펩타이드 샘플 2nM을 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨(4.5ml에 500)에 1:10 희석했다. 표 8에 따라 폴리펩타이드 및 펩타이드, 즉 각 LgTrip 돌연변이체 50ul와 펩타이드 50ul를 조합했다. 반응을 실온에서 10분 동안 인큐베이션했다. 다음으로, 100ul의 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 20uM 푸리마진을 첨가하고, 반응물을 GMM+ 광도계에서 판독하기 전에 10분 더 인큐베이션했다.
표 8. 테스트된 폴리펩타이드/펩타이드 조합.
Figure pct00008
실시예 31
β9-펩타이드의 정체는 β10-펩타이드의 친화도를 변경시킨다
폴리펩타이드 성분과 β-가닥에 상응하는 펩타이드 사이 또는 두 펩타이드 사이의 서열 중첩을 결정하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다(도 27). 이러한 결과는 β9 가닥 펩타이드(SmTrip9)의 서열이 β10 가닥 펩타이드(SmTrip10)의 친화도에 영향을 미칠 수 있음을 보여준다.
SmTrip9 적정
LgTrip 3546(서열번호 51)을 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에서 200nM로 희석하고 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 연속 희석액을 제조했다(900ul에 100ul). 2nM 폴리펩타이드 샘플을 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨(4.5ml에 500)에 1:10 희석했다.
20uM에서 시작하여 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 100uM의 SmTrip10 pep86(서열번호 25)에 각 SmTrip9 펩타이드의 2X 희석 시리즈를 제조했다. 희석된 LgTrip 3546(서열번호 51) 50ul를 각 펩타이드 적정 50ul와 합했다. 반응물을 실온에서 10분 동안 인큐베이션했다. 100ul의 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 20uM 푸리마진을 첨가하고, 반응물을 10분 더 인큐베이션하고, GMM+에서 판독했다.
SmTrip10 적정
LgTrip 3546(서열번호 51)을 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 200nM로 희석하고 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 연속 희석액을 제조했다(900ul에 100ul). 2nM 폴리펩타이드 샘플을 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨(4.5ml에 500)에 1:10으로 희석했다.
100 uM으로 시작하여 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 20uM의 SmTrip9-유사 펩타이드에 SmTrip10 pep86(서열번호 25)의 2X 희석 시리즈를 제조했다. 희석된 LgTrip 3546 50ul를 각 펩타이드 적정액 50ul와 합했다. 반응물을 실온에서 10분 동안 인큐베이션했다. 100ul의 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 20uM 푸리마진을 첨가하고, 반응물을 10분 더 인큐베이션한 다음, GMM+에서 판독했다.
결과(도 27)
SmTrip 9 펩타이드 변이체를 불변 SmTrip10 ep86(서열번호 15)의 존재 하에 적정한 다음(도 27a), SmTrip10 pep86을 포화량의 각 SmTrip9 변이체 펩타이드의 존재하에 적정했다(도 27b). 이는 SmTrip10 서열의 친화도가 SmTrip9 서열에 따라 변경될 수 있음을 보여준다. 실험은 β9-유사 펩타이드(예를 들어, SmTrip9)의 정체가 폴리펩타이드 성분에 대한 β10-유사 펩타이드(예를 들어, SmTrip10)의 친화도에 영향을 미칠 수 있음을 입증한다. SmTrip9 pep293(서열번호 154) 및 SmTrip9 pep294(서열번호 155) 서열은 LgTrip 3546(서열번호 51)의 C-말단과 중첩되며, SmTrip9 pep286(서열번호 37)(중첩 없음)에 비해 친화도 감소를 보이지만, LgTrip 3546에 대한 SmTrip10 pep86(SmHiTrip; 서열번호 25)의 친화도도 감소시킨다. SmTrip9 pep298(서열번호 158) 및 SmTrip9 pep299(서열번호 159) 서열은 LgTrip 3546의 C-말단 및 SmTrip10 pep86의 N-말단(SmHiTrip; 서열번호 25)과 중첩되며, LgTrip 3546에 대한 SmTrip10 pep86(HiBiT)의 친화도를 감소시킨다.
실시예 32
폴리펩타이드 및 β9-펩타이드에 대한 β10 펩타이드 성분의 친화도에 미치는 β10-펩타이드 정체의 영향.
폴리펩타이드 성분과 β-가닥에 상응하는 펩타이드 사이 또는 두 펩타이드 사이의 서열 중첩 또는 서열 갭이 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드의 친화도에 어떻게 영향을 미치는지를 결정하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다(도 28). LgTrip 3546(서열번호 51)을 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 200nM로 희석하고 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 연속 희석액을 제조했다(900ul에 100ul). 2nM 폴리펩타이드 샘플을 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨(4.5ml에 500)에 1:10으로 희석했다. 100uM에서 시작하여 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 20uM의 SmTrip9 pep286(서열번호 37)에 각 SmTrip10-유사 펩타이드의 2X 희석 시리즈를 제조했다. 희석된 LgTrip 3546 50ul를 각 펩타이드 적정액 50ul와 합했다. 반응물을 실온에서 10분 동안 인큐베이션했다. 100ul의 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 20uM 푸리마진을 첨가하고, 반응물을 10분 더 인큐베이션한 다음, GMM+에서 판독했다.
실시예 33
다양한 포화 β10-유사 펩타이드의 존재하에 β9-유사 펩타이드의 친화도 측정
β9-유사(예를 들어, SmTrip9) 펩타이드의 친화도가 LgTrip 3546(서열번호 51)과 일정한 농도의 다양한 β10-유사(예를 들어, SmTrip10) 펩타이드의 존재 하에 어떻게 영향을 받는지를 결정하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다(도 29). 폴리펩타이드 성분 LgTrip 3546을 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 200nM로 희석하고, TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 연속 희석액을 제조(900ul에 100ul)하고(2nM을 만들기 위해 2X), 2nM 샘플을 TBS+0.01% BSA+0.01% 터지톨(4.5ml에 500μl)에 1:10으로 희석했다. 20uM으로 시작하여 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 100uM의 각 SmTrip10 유사 펩타이드에 각 β9-유사 펩타이드(SmTrip9 pep286(서열번호 37) 및 SmTrip9 pep287(서열번호 148))의 2X 희석 시리즈를 제조했다. 희석된 LgTrip 3546(서열번호 51) 50ul를 각 펩타이드 적정액 50ul와 합했다. 반응물을 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고, 100ul의 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 20uM 푸리마진을 첨가하고, 반응물을 추가로 10분 더 인큐베이션한 다음 GMM+에서 판독했다.
실시예 34
HEK293 세포에서 촉진된 상보성에 대한 작제물 배향의 효과
LgTrip 3546(서열번호 51)과의 상보성에 대한 펩타이드 태그에 상대적인 상호작용 요소(FRB 및 FKBP)의 배향 효과를 결정하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다(도 30). 100,000 RLU 초과의 미유도 신호는 배경 오염을 나타내며, 이는 명백한 배수 반응(fold-response)을 감소시킨다.
HEK293 세포는 5% CO2와 함께 37℃에서 밤새 성장시켰다. 세포는 FuGENE 프로토콜을 사용하여 웰당 3ug DNA(SmTrip9 pep245-FKBP, FKBP-SmTrip9 pep245, SmTrip10 pep86-FKBP, FKBP-SmTrip10 pep86, SmTrip9 pep245-FRB, FRB-SmTrip9 pep245, SmTrip10 pep86-FRB, 또는 FRB-SmTrip10 pep86 작제물)로 형질감염시켰다. 세포는 DPBS에 세척했다. 1ml DPBS를 첨가했고, 세포를 -80C에서 약 10분 동안 동결시키고, 실온에서 해동시켰다. 용해액을 10분 동안 원심분리하여 청징화하고, TBS+200nM LgTrip(+/- 30nM RAP)에 1:10으로 희석하고, 실온에서 30분 동안 항온처리했다. 각 샘플 50ul을 50ul의 TBS+20uM 푸리마진과 합하고, 5분째에 발광을 판독했다.
실시예 35
E. 콜라이에서 촉진된 상보성에 미치는 작제물 배향의 효과
펩타이드 태그에 상대적인 상호작용 요소(FRB 및 FKBP)의 배향이 LgTrip 3546(서열번호 51)에 의한 상보성에 미치는 효과를 결정하기 위해, 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다(도 31).
각 작제물의 밤샘 배양액을 LB+100ug/ml 암피실린에서 제조했다. 배양액을 유도 배지(LB+amp+0.1% 람노스+0.15% 글루코스)로 1:100으로 희석하고, 세포를 25℃에서 20시간 동안 성장시키고, PLB 용해 완충액(0.3X PLB, 25mM Hepes pH 7.5, 0.001U/ul Rq1 DNase; 250ul 세포, 750ul PLB)으로 15분 동안 용해시켰다. 세포를 200nM LgTrip 3546 및 +/- 30nM RAP을 함유하는 CO2 독립 배지 + 10% FBS로 5X 희석했다. 반응을 실온에서 30분 동안 인큐베이션하고, 동일한 부피의 NanoGlo+50uM 푸리마진(50ul 대 50ul)과 조합하고, 5분 동안 인큐베이션한 다음, GMM+에서 판독했다.
실시예 36
다양한 β10 유사 펩타이드에 대한 Kd 측정
LgTrip 3546(서열번호 51) 및 SmTrip9 pep286(서열번호 37)과 다양한 β10-유사 펩타이드에 대한 Kd 값을 측정하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다(도 32). TBS + 0.005% + 0.01% BSA에 20uM SmTrip9 pep286(서열번호 37)의 용액을 제조했다. SmTrip10 pep86(SmHiTrip; 서열번호 25), SmTrip10 pep288(서열번호 149), SmTrip10 pep289(서열번호 150), 및 SmTrip10 pep290(서열번호 151)의 3X 연속 희석액을 제조했다(100uM에서 시작하여 350ul TBS+0.01% BSA+286 용액에 150ul). 20nM LgTrip 3546 용액은 TBS + 0.01% BSA에 제조한 다음, TBS + 0.01% BSA에 1:10으로 희석했다. 25ul의 각 펩타이드 용액을 2.5ul의 LgTrip 3546 용액과 합했다. 반응을 10분 동안 인큐베이션하고, 28ul의 TBS+20uM LCS(Promega 카탈로그 번호 N205)를 첨가하고, 10분 동안 인큐베이션한 다음, GMM+에서 판독했다. 이 실험은 서열번호 25의 N-말단에 "V" 또는 "VS"의 첨가가 SmTrip10 pep86(HiBiT)에 비해 SmTrip10-유사 펩타이드의 친화도를 증가시킨다는 것을 보여준다.
실시예 37
루시퍼라제 광 출력에 대한 폴리펩타이드/β9 분할 부위의 효과
폴리펩타이드 성분과 SmTrip9-유사 펩타이드 사이의 분할 부위 이동 효과를 분석하기 위해 본원의 실시양태를 개발하는 동안 실험을 수행했다(도 33). 다양한 C-말단 연장 또는 결실을 갖는 폴리펩타이드 성분을 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 0.2 nM로 희석하고, 50 uM SmTrip10 pep86(서열번호 25)을 각각에 첨가했다. SmTrip9 pep286(서열번호 37)을 SmTrip10 pep86+LgTrip 용액에 10 uM로 첨가하고, 샘플을 10분 동안 인큐베이션했다. TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 20uM 푸리마진 검출 시약을 1:1로 첨가하고, 발광을 판독했다. 모든 합성 SmTrip9 펩타이드는 N-말단 용해도 태그 SSWKR을 함유했다.
실시예 38
루시퍼라제 광 출력에 대한 LgTrip C-말단과 SmTrip9 pep286 사이의 서열 갭 및 중첩 효과
폴리펩타이드 성분과 SmTrip9-유사 펩타이드 사이의 갭 및/또는 중첩 효과를 분석하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다(도 34). 다양한 C-말단 연장 또는 결실을 갖는 폴리펩타이드 성분을 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에서 0.2 nM로 희석하고, 50 uM SmTrip10 pep86(서열번호 25)을 각각에 첨가했다. 10 uM의 SmTrip9 pep286을 SmTrip10 pep86+LgTrip 용액에 첨가하고, 반응물을 10분 동안 인큐베이션했다. TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 20uM 푸리마진 검출 시약을 1:1로 첨가하고, 발광을 판독했다.
실시예 39
루시퍼라제 광 출력에 대한 LgTrip 3546 및 SmTrip10 pep 86(HiBiT)과 SmTrip9 서열 갭 및 중첩의 효과
SmTrip9-유사 펩타이드와 폴리펩타이드 성분(예를 들어, LgTrip) 및/또는 SmTrip10-유사 펩타이드 사이의 갭 및/또는 중첩의 효과를 분석하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다(도 35). LgTrip 3546(서열번호 51)을 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에서 0.2 nM로 희석하고, 각각에 50 uM SmTrip10 pep86(서열번호 25)을 첨가했다. SmTrip9 pep286(서열번호 37)을 SmTrip10 pep86+LgTrip 용액에 10 uM로 첨가하고, 샘플을 10분 동안 인큐베이션했다. TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 20uM 푸리마진 검출 시약을 1:1로 첨가하고, 발광을 판독했다. 모든 합성 SmTrip9 펩타이드는 N-말단 용해도 태그인 SSWKR을 함유했다.
실시예 40
SmTrip9 펩타이드 길이 변이체의 생화학적 분석(Kd 및 Bmax)
LgTrip 3546(서열번호 51) 및 SmTrip10 pep86(SmHiTrip; 서열번호 15)과 상이한 길이의 SmTrip9 펩타이드의 상보성을 분석하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다(도 36-37).
SmTrip9 적정(도 36)
LgTrip 3546(서열번호 51) 폴리펩타이드는 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에서 0.2 nM로 희석했다. 100uM SmTrip10 pep86은 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 제조했다. 각 SmTrip9-유사 펩타이드의 20uM 용액을 SmTrip10 pep86 용액에 첨가했다. SmTrip10 pep86 용액을 희석제로 사용하여 각 SmTrip9 펩타이드 용액의 2X 연속 희석액을 제조했다. 펩타이드 희석액과 LgTrip 3546 용액을 1:1로 합하고 10분 동안 인큐베이션했다. TBS+0.01% BSA+0.01% 터지톨+20uM 푸리마진 검출 시약을 첨가(1:1)하고 발광을 검출했다.
HiBiT(SmTrip10) 적정(도 37)
LgTrip 3546(서열번호 51) 폴리펩타이드를 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 0.2 nM로 희석했다. 20 uM SmTrip9-유사 펩타이드 용액은 테스트할 각 SmTrip9-유사 펩타이드에 대해 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 제조했다. SmTrip10 pep86의 100uM 용액은 각 SmTrip9-유사 펩타이드 용액에 첨가했다. 희석제로서 각 SmTrip9-유사 펩타이드 용액을 사용하여 SmTrip10 pep86의 2X 연속 희석액을 제조했다. 펩타이드 희석액과 LgTrip 3546 용액을 1:1로 합하고 10분 동안 인큐베이션했다. TBS+0.01% BSA+0.01% 터지톨+20uM 푸리마진 검출 시약을 첨가하고(1:1), 발광을 검출했다.
실시예 41
SmTrip9 pep286 점 돌연변이의 생화학적 친화도 및 Bmax
LgTrip 3546(서열번호 51) 및 SmTrip10 pep86(SmHiTrip; 서열번호 25)에 대한 SmTrip9 pep286(서열번호 37) 점 돌연변이체의 친화도를 분석하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다. LgTrip 3546 폴리펩타이드를 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 0.2 nM로 희석했다. 100uM SmTrip10 pep86은 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 제조했다. 각 SmTrip9-유사 펩타이드의 20uM 용액을 SmTrip10 pep86 용액에 첨가했다. SmTrip10 pep86 용액을 희석제로 사용하여 각 SmTrip9-유사 펩타이드 용액의 2X 연속 희석액을 제조했다. 동량의 펩타이드 희석액과 LgTrip 용액을 합하고 10분 동안 인큐베이션했다. TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 20uM 푸리마진 검출 시약을 첨가하고(1:1, 부피:부피), 발광을 검출하여(도 38) 각 SmTrip9-유사 펩타이드의 Kd 및 Bmax를 결정했다.
실시예 42
생화학적 친화도 및 Bmax에 미치는 SmTrip9 용해도 태그의 효과
대안적인 용해도 태그와 SmTrip9-유사 펩타이드의 친화도를 분석하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다(도 39). LgTrip 3546(서열번호 51)을 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 0.2 nM로 희석했다. 100uM SmTrip10/pep86 용액을 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 제조했다. SmTrip10 pep86 용액에 각 SmTrip9-유사 펩타이드의 20uM 용액을 제조했다. 희석제로서 SmTrip10 pep86 용액을 사용하여 각 SmTrip9-유사 펩타이드의 2X 연속 희석액을 제조했다. 동량의 펩타이드 희석액을 LgTrip 3546 용액과 합하고 반응물을 10분 동안 인큐베이션했다. TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 20uM 푸리마진 검출 시약을 반응물에 1:1 부피:부피로 첨가하고, 10분간 인큐베이션 후 발광을 판독했다.
실시예 43
C-말단 연장 서열
C-말단 서열 연장을 갖는 SmTrip9-유사 펩타이드의 친화도를 분석하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다(도 40).
SmTrip9 펩타이드 적정
LgTrip 3546(서열번호 51) 폴리펩타이드를 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 0.2 nM로 희석했다. 100uM SmTrip10 pep86은 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 제조했다. 각 SmTrip9-유사 펩타이드의 20uM 용액을 SmTrip10 pep86 용액에 첨가했다. SmTrip10 pep86 용액을 희석제로 사용하여 각 SmTrip9-유사 펩타이드 용액의 2X 연속 희석액을 제조했다. 펩타이드 희석액 및 LgTrip 3546 용액을 1:1로 합하여 10분 동안 인큐베이션했다. TBS+0.01% BSA+0.01% 터지톨+20uM 푸리마진 검출 시약을 첨가(1:1)하고 발광을 검출했다.
SmTrip10 pep 86(HiBiT) 적정
LgTrip 3546(서열번호 51) 폴리펩타이드를 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 0.2 nM로 희석했다. 20 uM SmTrip9-유사 펩타이드 용액은 테스트할 SmTrip9-유사 펩타이드에 대해 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에서 제조했다. SmTrip10 pep86(서열번호 25)의 100uM 용액을 각 SmTrip9-유사 용액에 첨가했다. 희석제로서 각 SmTrip9-유사 펩타이드 용액을 사용하여 SmTrip10 pep86의 2X 연속 희석액을 제조했다. 펩타이드 희석액과 LgTrip 3546 용액을 1:1로 합하고 10분 동안 인큐베이션했다. TBS+0.01% BSA+0.01% 터지톨+20uM 푸리마진 검출 시약을 첨가(1:1)하고, 발광을 검출했다.
실시예 44
FRB-FKBP의 측정은 KRX E. 콜라이 용해액에서 FRB-SmTrip10 변이체 및 FKBP 융합 SmTrip9 pep245를 사용하여 상보성을 촉진시켰다
FRB-SmTrip10 변이체, FKBP-SmTrip9 pep245 및 SmTrip9 pep245-FKBP의 밤샘 배양액은 글리세롤 스톡으로부터 LB+100ug/ml 암피실린에서 성장시켰다. 세포를 LB + 0.15% 글루코스 + 0.1% 람노스 + Amp에 1:100으로 희석하고, 25℃에서 20시간 동안 진탕했다. 배양액을 PLB에 1:4로 희석하고 실온에서 15분 동안 인큐베이션하여 세포를 용해시켰다. SmTrip9/SmTrip10 펩타이드 조합은 1:1(부피:부피)로 혼합했다. 혼합물을 30nM 라파마이신이 있거나 없는 PLB + 200nM LgTrip 3546(서열번호 51)에 1:5로 희석하고, 반응물을 실온에서 30분 동안 인큐베이션했다. 각각의 반응은 50ul의 NanoGlo® 완충액 + 50uM 푸리마진과 합하고, 5분째에 발광을 측정했다. 배수 유도(+rap 신호/-rap 신호)에 대한 결과는 도 41에 도시된다. FRB-SmTrip10 변이체 펩타이드 작제물은 다양한 링커 길이, 링커 함유물(알라닌-이소류신이 있거나 없음)을 보유했고, 헥사히스티딘 태그가 함유되거나 결여되었다.
실시예 45
HEK 용해액에서 FRB-SmTrip10 변이체 및 FKBP 융합된 SmTrip9 pep245를 사용한 FRB-FKBP 촉진된 상보성의 측정
FRB-SmTrip10 변이체, FKBP-SmTrip9 pep245 및 SmTrip9 pep245-FKBP의 밤샘 배양액은 5% CO2와 함께 37℃에서 성장시켰다. FuGENE 프로토콜을 사용하여 웰당 1 ug DNA(FKBP 또는 FRB 작제물)로 세포를 형질감염시켰다. 세포를 1 ml DPBS에서 세척했다. 1ml DPBS를 첨가하고 배양액을 -80℃에서 10분 동안 동결시켰다. 배양액을 실온에서 해동하여 세포를 용해시켰다. 용해액을 10분 동안 원심분리하여 청징화하고 PLB에 2배 희석했다. SmTrip9/SmTrip10 펩타이드 조합은 1:1(부피:부피)로 혼합했다. 혼합물을 30nM 라파마이신이 있거나 없는 PLB + 200nM LgTrip 3546(서열번호 51)으로 1:5로 희석하고, 반응물을 실온에서 30분 동안 인큐베이션했다. 각각의 반응은 50ul의 NanoGlo® 완충액 + 50uM 푸리마진과 합하고 5분째에 발광을 측정했다. 배수 유도(+rap 신호/-rap 신호)에 대한 결과는 도 42에 도시된다. FRB-SmTrip10 변이체 펩타이드 작제물은 다양한 링커 길이, 링커 함유물(알라닌-이소류신이 있거나 없음)을 보유했고, 헥사히스티딘 태그가 함유되거나 결여되었다.
실시예 46
KRX E. 콜라이 용해액에서 양쪽 배향으로 FKBP에 융합된 FRB-SmTrip10 pep86(HiBiT)/SmTrip10 pep289(VS-HiBiT) 및 SmTrip9 서열을 사용한 FRB-FKBP 촉진 상보성의 측정
FKBP에 융합된 FRB-SmTrip10 pep86(HiBiT; 서열번호 25) 또는 FRB-SmTrip10 pep289(VS-HiBiT; 서열번호 150) 및 SmTrip9-유사 펩타이드 서열에 대한 밤샘 배양액은 글리세롤 스톡으로부터 LB+100ug/ml 암피실린에서 성장시켰다. 세포를 LB + 0.15% 글루코스 + 0.1% 람노스 + Amp에서 1:100으로 희석하고 25℃에서 20시간 동안 진탕시켰다. 배양액을 PLB에 1:4로 희석하고 실온에서 15분 동안 인큐베이션하여 용해시켰다. SmTrip9/SmTrip10 펩타이드 조합은 1:1(부피:부피)로 혼합했다. 혼합물은 30nM 라파마이신이 있거나 없는 PLB + 200nM LgTrip 3546(서열번호 51)에 1:5로 희석하고, 반응물은 실온에서 30분 동안 인큐베이션했다. 각각의 반응은 50ul의 NanoGlo® 완충액 + 50uM 푸리마진과 조합했고, 발광은 5분째에 측정했다. 결과는 도 43 내지 47에 도시된다.
실시예 47
HEK 용해액에서 2가지 배향으로 FKBP에 융합된 FRB-SmTrip10 pep86(HiBiT)/SmTrip10 pep289(VS-HiBiT) 및 SmTrip9 서열을 사용한 FRB-FKBP 촉진 상보성의 측정
FKBP에 융합된 FRB-SmTrip10 pep86(HiBiT; 서열번호 25) 또는 FRB-SmTrip10 pep289(VS-HiBiT; 서열번호 150) 및 SmTrip9 유사 펩타이드 서열의 밤샘 배양액은 37℃, 5% CO2 하에 성장시켰다. FuGENE 프로토콜을 사용하여 웰당 1 ug DNA(FKBP 또는 FRB 작제물)로 세포를 형질감염시켰다. 세포를 1 ml DPBS에서 세척했다. 1ml의 DPBS를 첨가하고 배양액을 -80℃에서 10분 동안 동결시켰다. 배양액을 실온에서 해동하여 세포를 용해시켰다. 10분 동안 원심분리하여 용해액을 청징화하고 PLB에서 2배 희석했다. SmTrip9/SmTrip10 펩타이드 조합은 1:1(부피:부피)로 혼합했다. 혼합물을 30nM 라파마이신이 있거나 없는 PLB + 200nM LgTrip 3546(서열번호 51)에 1:5로 희석하고, 반응물을 실온에서 30분 동안 인큐베이션했다. 각각의 반응을 50ul의 NanoGlo® 완충액 + 50uM 푸리마진과 합했고, 발광은 5분째에 측정했다. 결과는 도 48 내지 50에 도시된다.
실시예 48
E. 콜라이 용해액에서 FKBP에 융합된 FRB-SmTrip10 pep86(HiBiT)/SmTrip10 pep289(VS-HiBiT) 및 SmTrip9 서열을 사용한 FRB-FKBP 촉진 상보성의 측정
FRB-SmTrip10 pep86(HiBiT; 서열번호 25) 또는 FRB-SmTrip10 pep289(VS-HiBiT; 서열번호 150) 및 FKBP에 융합된 SmTrip9-유사 펩타이드 서열에 대한 밤샘 배양액은 글리세롤 스톡으로부터 LB+100ug/ml 암피실린에서 성장시켰다. 세포를 LB + 0.15% 글루코스 + 0.1% 람노스 + Amp에 1:100으로 희석하고 25℃에서 20시간 동안 진탕시켰다. 배양액을 PLB에 1:4로 희석하고 실온에서 15분 동안 인큐베이션하여 용해시켰다. SmTrip9/SmTrip10 펩타이드 조합은 1:1(부피:부피)로 혼합했다. 혼합물을 30nM 라파마이신이 있거나 없는 PLB + 200nM LgTrip 3546(서열번호 51)에 1:5로 희석하고, 반응물을 실온에서 30분 동안 인큐베이션했다. 각각의 반응을 50ul의 NanoGlo® 완충액 + 50uM 푸리마진과 합했고, 발광은 5분째에 측정했다. 결과는 도 57, 59, 60, 62-63, 66-67 및 70-71에 도시된다. 도 57에서, **는 SmTrip9 펩타이드 또는 SmTrip10 펩타이드의 바로 상류에 있는 링커에서 알라닌-이소류신(AI)이 제거되었음을 나타낸다. 모든 후속 도면에서 각각 SmTrip9 펩타이드 또는 SmTrip10 펩타이드와의 C-말단 FKBP 또는 FRB 융합체에서 알라닌-이소류신은 없다.
실시예 49
HEK293 용해액에서 FKBP에 융합된 FRB-SmTrip10 pep86(HiBiT)/SmTrip10 pep289(VS-HiBiT) 및 SmTrip9 서열을 사용한 FRB-FKBP 촉진 상보성의 측정
FKBP에 융합된 FRB-SmTrip10 pep86(HiBiT; 서열번호 25) 또는 FRB SmTrip10 pep289(VS-HiBiT; 서열번호 150) 및 SmTrip9-유사 펩타이드 서열의 밤샘 배양액은 5% CO2와 함께 37℃에서 성장시켰다. FuGENE 프로토콜을 사용하여 웰당 3 ug DNA(FKBP 또는 FRB 작제물)로 세포를 형질감염시켰다. 세포는 1 ml DPBS에서 세척했다. 1ml의 DPBS를 첨가하고 배양액을 -80℃에서 10분 동안 동결시켰다. 배양액을 실온에서 해동하여 세포를 용해시켰다. 용해액을 10분 동안 원심분리하여 청징화하고 PLB에 2배 희석했다. SmTrip9/SmTrip10 펩타이드 조합은 1:1(부피:부피)로 혼합했다. 혼합물을 30nM 라파마이신이 있거나 없는 PLB + 200nM LgTrip 3546(서열번호 51)으로 1:5로 희석하고, 반응물을 실온에서 30분 동안 인큐베이션했다. 각각의 반응은 50ul의 NanoGlo® 완충액 + 50uM 푸리마진과 합했고, 발광은 5분째에 측정했다. 결과는 도 58, 61, 64-65, 68-69 및 72-73에 도시된다. 도 58에서 **는 SmTrip9 펩타이드 또는 SmTrip10 펩타이드의 바로 상류에 있는 링커에서 알라닌-이소류신(AI)이 제거되었음을 나타낸다. 모든 후속 도면에서 각각 SmTrip9 펩타이드 또는 SmTrip10 펩타이드와의 C-말단 FKBP 또는 FRB 융합체에 알라닌-이소류신은 없다.
실시예 50
다양한 SmTrip9 서열의 생화학적 분석(Kd 및 Bmax)
결과는 도 74 내지 76에 도시된다.
SmTrip9 유사 펩타이드 적정
LgTrip 3546(서열번호 51)을 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 0.2 nM로 희석했다. 100 uM SmTrip10 pep86(SmHiTrip; 서열번호 25)을 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 제조했다. SmTrip10 pep86 용액에서 각 SmTrip9-유사 펩타이드의 20uM 용액을 제조했다. SmTrip10 pep86 용액을 희석제로 사용하여 각 SmTrip9-유사 펩타이드의 2X 연속 희석액을 제조했다. 펩타이드 희석액을 LgTrip 3546(서열번호 51) 용액과 1:1로 합하고, 10분 동안 인큐베이션했다. TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 20uM 푸리마진(Fz) 검출 시약을 1:1로 첨가했다. 10분째에 발광을 판독했다.
SmTrip10 pep86(HiBiT) 적정
LgTrip 3546(서열번호 51)을 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에서 0.2 nM로 희석했다. 20μM SmTrip9-유사 펩타이드 용액은 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 제조했다. SmTrip10 pep86을 각 SmTrip9-유사 펩타이드 용액에 100 uM로 첨가했다. 희석제로서 SmTrip9-유사 펩타이드 용액을 사용하여 각 SmTrip10 pep86(서열번호 25)의 2X 연속 희석액을 제조했다. 펩타이드 희석액을 LgTrip 3546(서열번호 51) 용액과 1:1로 합하고 10분 동안 인큐베이션했다. TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 20uM 푸리마진(Fz) 검출 시약을 1:1로 첨가했다. 10분째에 발광을 판독했다.
실시예 51
합성 SmTrip9 펩타이드의 용해도
합성 펩타이드는 달리 언급되지 않는 한, 말단을 차단시키고(N-말단 아세틸화 및 C-말단 아미드화) Peptide2.0으로 합성시켰다. 펩타이드를 뉴클레아제가 없는 물에 약 1mM까지 용해시키고 4℃에서 30분 동안 회전기에서 혼합시켰다. 최고 속도로 10분 동안 원심분리한 후, 펩타이드를 물에 1:50으로 희석하고 NanoDrop에서 정량화했다. 펩타이드는 사용할 때까지 -20℃에서 보관했다. 펩타이드는 22℃ 수조에서 해동하고 4℃로 유지하고 -20℃에서 동결하는 동결/해동 사이클 3회 후에 용액에 남아 있으면 가용성으로 간주했다. 합성 펩타이드의 용해도는 도 77에 도시된다.
실시예 52
원형 치환된 LgBiT
SmTrip10 pep 86(HiBiT)-LgTrip 3546 융합체에 대한 SmTrip9/pep286 친화도 및 Bmax
LgTrip 3546(서열번호 51)의 전방에 융합된 SmTrip10 pep86(SmHiTrip; 서열번호 25) 서열을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 생성했고, SmTrip10 pep86 HiBiT-LgTrip 융합체와 SmTrip9 pep286(서열번호 37)의 복합체 형성 및 발광을 모니터링하기 위해 실험을 수행했다(도 78).
글리세롤 스톡으로부터 LB+100ug/ml 암피실린에서 밤샘 배양액을 성장시켰다. 세포를 LB + 0.15% 글루코스 + 0.1% 람노스 + Amp에 1:100으로 희석하고 25℃에서 20시간 동안 진탕시켰다. 800μl 배양액을 FastBreak에서 용해하고 각 SmTrip10 pep86-LgTrip 융합체를 HisLink 프로토콜을 사용하여 정제했다. 10uM에서 시작하는 2배 SmTrip9 pep286(서열번호 37) 연속 희석액은 0.2nM SmTrip10 pep86-LgTrip 융합체(ATG 3745(서열번호 211)) 또는 ATG3746(서열번호 213))을 함유하는 TBS + 0.01% 터지톨 + 0.01% BSA에서 만들었다. 반응물은 실온에서 10분 동안 사전 인큐베이션했다. TBS + 0.01% 터지톨 + 0.01% BSA와 20 uM 푸리마진(Fz)을 샘플에 1:1(부피:부피)로 첨가했다. 10분째에 GloMax® 광도계에서 발광을 판독했다.
다양한 SmTrip10 pep 86(HiBiT)-LgTrip 3546 융합체에 대한 SmTrip9/pep759 친화도
유도된 세포 배양액의 펠릿으로부터, 펠릿을 1X TBS + 0.01% BSA를 사용하여 원래 배양 부피의 1/10에 재현탁시켰다(예를 들어, 50mL 배양액은 5mL에 재현탁될 것임). 용해 완충액은 Fast Break® 완충액 100부, RQ1 RNAse 없는 DNAse 10부, 및 1M DTT 1부(예를 들어, Fast Break® 완충액 650μL + RQ1 RNAse 없는 DNAse 65μL, 및 1M DTT 또는 등가 스케일링제 6.5μL)를 사용하여 제조했다. 15mL 튜브에서 1부의 용해 완충액을 9부의 세포 현탁액(예를 들어, 33.3μL 용해 완충액 + 300uL 현탁액)에 첨가했다. 혼합하면서(회전 진탕기를 사용함) 4℃에서 30분 동안 인큐베이션했다. pep 759의 4μM 용액은 1X TBS + 0.01% BSA에 제조했다. 4μM pep759 50μL를 96웰 플레이트의 각 용해액 50μL에 3반복으로 첨가했다. 50 μL의 각 용해액을 50 μL의 1X TBS + 0.01% BSA 완충액과 3반복으로 별도로 혼합했다. NanoGlo® 시약은 100부의 NanoGlo® 완충액과 1부의 푸리마진(예를 들어, 10mL 완충액 + 100uL 푸리마진)을 혼합하여 제조했다. 100 uL의 NanoGlo® 시약을 각 웰에 첨가했다. Glomax® 멀티 기기 동역학 사이클을 사용하여 발광을 측정했다. 발광 측정은 약 29분 후에 비교했다. pep759가 있는 샘플에 대한 발광 판독값을 pep759가 없는 동일한 용해액의 상응하는 측정값으로 나누었다. 결과는 도 78b에 도시된다. 데이터를 생성하기 위해 2개의 배양액 배취(batch)를 사용했다: 하나는 50mL 배양액의 유도로부터 유래했고(오른쪽, ATG-4632를 포함하여 ATG-4808까지), 다른 하나는 3mL 배양액의 유도로부터 유래했다(왼쪽, ATG-4815로 시작하여 ATG-3746까지). 일부 작제물은 두 테스트 모두에 존재했다(ATG-2623, ATG-3745, ATG-3746, ATG-4632).
실시예 53
세제 적정
다양한 세제가 디펩타이드, pep263(서열번호 35)과 함께 NanoLuc(서열번호 3), LgBiT(서열번호 11), 및 LgTrip 3546(서열번호 51) 복합체에 미치는 영향을 결정하기 위해 본원의 실시양태를 개발하는 동안 실험을 수행했다.
노출 실험
500ul의 20mM SDS 또는 2mM CDTA 또는 5% 터지톨을 심부 웰 플레이트에 첨가했다. TBS + 0.01% BSA에 각 세제의 3X 연속 희석액을 제조했다(350ul 중 150ul). 100ul의 각 희석액을 100ul의 2nM NanoLuc, LgBiT 또는 LgTrip과 조합하고 샘플을 18시간 동안 인큐베이션했다. 샘플을 TBS + 0.01% BSA에서 1:100으로 희석했다(495ul 중 5ul). 50ul의 각 샘플을 50ul의 NanoLuc용 TBS + 0.01% BSA + 20uM 푸리마진(Fz) 또는 LgBiT 및 LgTrip용 TBS+0.01% BSA+20uM 푸리마진(Fz)+2uM pep263과 3반복으로 조합했다. 시약 첨가 3분 후에 샘플의 발광을 GMM+에서 판독했다. LgBiT, LgTrip 3546 및 NanoLuc에 대한 세제의 장기간 노출 결과는 도 79에 도시된다.
활성 실험
20ml의 20uM Fz를 TBS + 0.01% BSA에 제조했다. 2ml의 20mM SDS 및 2mM의 CDTA 및 5% 터지톨을 심부 웰 플레이트에 첨가했다. 20uM Fz를 각 샘플(8ul)에 첨가했다. 20uM Fz 용액에 각 세제의 2X 연속 희석액을 제조했다(1ml 대 1ml). TBS + 0.01% BSA 중 400pM NanoLuc의 용액을 제조했다. TBS + 0.01% BSA 중 400pM LgBiT + 1uM pep263(서열번호 35)의 용액을 제조했다. TBS + 0.01% BSA 중 400pM LgTrip 3546(서열번호 51) + 1uM pep263(서열번호 35)의 용액을 제조했다. 각 효소 용액 50ul를 세제 적정액 50ul와 합하고 광도계에 넣고 실온에서 3분간 인큐베이션한 후 판독했다. 세제 존재 하에 LgBiT, LgTrip 및 NanoLuc 활성의 결과는 도 80에 도시된다.
실시예 54
FRB-FKBP 촉진 복합체 형성의 가역성
생물발광 복합체 형성의 가역성을 입증하기 위해 본원의 실시양태를 개발하는 동안 실험을 수행했다. HEK293 세포의 T75 성장 플라스크로부터 배지를 흡인시켰다. 세포를 10ml의 DPBS로 세척하고 3ml의 Tryple Express Trypsin을 첨가하여 트립신 처리했다. 37℃에서 3분간 인큐베이션한 후, 10ml의 성장 배지(DMDM+10% FBS)를 플라스크에 첨가하고 세포를 피펫으로 혼합했다. 세포를 5분 동안 200rpm에서 펠릿화했다. 배지를 흡인시키고 새 배지로 교체했다. 세포를 T20 세포 계수기에서 계수하고 200,000개 세포/ml로 희석했다. 3ml의 세포 현탁액을 6웰 플레이트의 각 웰에 첨가했다. 세포는 5% CO2와 함께 37℃에서 밤새 성장시켰다. 세포를 형질감염시키기 위해 각 작제물마다 DNA를 100 ng/ul의 농도로 희석하고 각 작제물(FKBP-SmBiT, FRB-LgBiT, FRB-SmTrip10 pep86(HiBiT), FKBP-SmTrip9 pep245)마다 3.3ug의 DNA를 최종 부피 155ul의 OptiMEM에 첨가했다. 9.9ul의 FugeneHd를 희석된 DNA에 첨가하고 15분 동안 인큐베이션했다. 그 다음 150ul의 각 DNA 복합체를 6웰 플레이트에 플레이팅된 세포에 첨가했다. 세포는 5% CO2와 함께 37℃에서 밤새 성장시켰다. 배지를 흡인한 후, 세포를 DPBS(Life Technologies 카탈로그 번호 14190)로 한 번 세척한 다음, -80℃에서 신선한 1ml의 DPBS에 동결시켰다. 그 다음 샘플을 해동시켜 세포를 용해시켰다. NanoBiT(FKBP-SmBiT+FRB-LgBiT) 및 NanoTrip(FRB-SmTrip10 pep86(HiBiT)+FKBP-SmTrip9 pep245+200nM 정제된 LgTrip 3546(서열번호 51))에 대한 FRB 및 FKBP 작제물을 합하여 30nM 라파마이신과 함께 30분 동안 인큐베이션했다. FK506의 희석 시리즈는 10mM에서 시작하여 DMSO에 제조했다. 3배 연속 희석은 DMSO에서 수행했다(70ul에 30ul). 각 FRB-FKBP 조합 200ul를 96웰 PCR 트레이의 8웰에 분취했다. 2ul의 FK506 희석 시리즈를 첨가한 후, 각 샘플을 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션했다. 각 샘플 50ul를 TBS + 0.01% BSA + 20uM 푸리마진(Fz) 50ul와 조합하고, 3분 동안 인큐베이션하고, GMM+에서 판독했다. 결과는 도 81에 도시되어 있다.
실시예 55
SmTrip10 펩타이드를 사용한 LgTrip/SmTrip9 적정
다양한 SmTrip10 펩타이드를 사용한 LgTrip 3546(서열번호 51) 및 SmTrip9 pep286(서열번호 37)의 적정을 분석하기 위해 본원의 실시양태를 개발하는 동안 실험을 수행했다. 데이터는 SmTrip10 pep86(HiBiT) 값에 대해 정규화했다. SmTrip10 pep86(HiBiT)은 SmHiTrip10(서열번호 25)이다.
펩타이드 스톡을 물에서 250uM로 희석했다. SmTrip9 pep286(서열번호 37) 용액(최종 반응물에 10uM)은 OptiMEM + 10% FBS에 제조했다. SmTrip9 pep286을 함유하는 OptiMEM 용액에서 각 SmTrip10 펩타이드의 2배 연속 희석을 수행했다. SmTrip10 펩타이드의 최고 농도는 15uM(반응물 중 최종)이었다. LgTrip 3546(서열번호 51)의 10X 스톡(1nM)은 OptiMEM + 10% FBS에 제조하고, 10ul를 각각의 SmTrip10 펩타이드 적정액 90ul에 첨가했다. 샘플을 500rpm으로 설정된 궤도 진탕기에서 30분 동안 인큐베이션했다. 2ml의 검출 시약(OptiMEM + 10% FBS + 1M DTT 20ul + 5mM 푸리마진 80ul)을 제조했다. 각 LgTrip3546:펩타이드 용액에 10ul의 검출 시약을 첨가하고, 플레이트를 궤도 진탕기에 놓았다. 플레이트는 5분 및 10분째에 판독했다. SmTrip10 pep86(SmHiTrip; 서열번호 25) 및 SmTrip10 pep289(서열번호 150)는 4개의 플레이트 각각에서 대조군으로 사용했다. 결과는 도 82 및 83의 표에 제시되어 있다.
실시예 56
안타레스 작제물
본원에 기술된 시스템의 성분에 연결된 하나 이상의 CyOFP 형광 단백질을 포함하는 안타레스 BRET 시스템의 문맥에서 본원에 기재된 상보성 시스템을 입증하기 위해 본원의 실시양태를 개발하는 동안 실험을 수행했다.
샘플은 HisLink 수지를 사용하여 정제했다: 100mM HEPES pH 7.5 10ml, FastBreak Cell Lysis Reagent 1ml 및 DNase 50u를 첨가하고 샘플을 45분 동안 회전 혼합기에 놓은 다음, 7,000rpm에서 20분 동안 회전시켰다. 다음으로, 각 샘플에 HisLink 수지 1ml를 첨가하고, 샘플을 결합 세척 완충액 5ml로 3회 세척하고, 용출 완충액 300ul로 용출시킨 후, TBS에 대해 투석(2시간, TBS 교체, 2시간 추가)했다. 샘플을 TBS + 0.01% BSA에서 100nM로 희석한 다음, 996ul의 TBS + 0.01% BSA에 4ul을 첨가하여 0.4nM로 추가로 희석했다. 300ul을 700ul로 전달하여 3X 연속 희석액을 제조했다. 10ml의 2uM 디펩타이드 pep263(서열번호 35)은 TBS+0.01% BSA에서 제조했다. 10ml의 400pM SmTrip10 pep86(서열번호 25)은 TBS + 0.01% BSA에서 제조했다. 10ml의 1uM SmTrip9 pep286(서열번호 37) 및 10uM SmTrip10 pep86을 제조했다. 50ul의 각 효소를 TBS 또는 디펩타이드 용액과 합했다(모든 샘플은 2개의 플레이트에서 3반복으로). LgBiT 및 LgTrip 3546 샘플이 있는 안타레스 융합체를 SmTrip9 pep286+SmTrip10 pep86과 합했다. 샘플을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 100ul의 20um 푸리마진을 TBS + 0.01% BSA + 2mM ATT에 첨가했다. 플레이트를 3분 동안 인큐베이션한 다음 GMM+에서 판독했다. 결과는 도 84 및 85의 그래프에 도시되어 있다.
실시예 57
"다크" 디펩타이드 272
0.1nM pep263의 존재 하에 LgBiT(서열번호 11) 및 LgTrip 3546(서열번호 51)과 "Dark" 디펩타이드 272(서열번호 146)를 이용한 적정 시리즈를 비교하기 위해 본원의 실시양태를 개발하는 동안 실험을 수행했다. LgBiT 및 LgTrip 3456은 TBS+0.01% BSA 및 +/- 0.4nM의 디펩타이드 pep263(서열번호 35)에서 200nM로 희석하고 10분 동안 인큐베이션했다. 디펩타이드 pep272의 3X 희석 시리즈는 40nM에서 시작하여 제조했다(이 농도에서 LgBiT는 고농도에서의 저해를 보여주었고, 따라서 Kd 값을 계산할 수 없었다; Kd 값을 얻기 위해 LgBiT의 경우에는 4nM pep272에서 시작하는 새로운 적정 시리즈를 생성했다). 50ul의 펩타이드 희석 시리즈를 검정 플레이트에 첨가한 다음, 50ul의 LgBiT 및 LgTrip 3546 희석액을 첨가했다. 샘플을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 100ul의 NanoGlo + 50uM 푸리마진(Fz)을 첨가한 후, 플레이트를 5분 동안 인큐베이션하고 GMM+에서 발광을 판독했다. 결과는 도 86에 도시된다.
실시예 58
다크 디펩타이드 pep272 및 pep273의 비교
LgBiT(서열번호 11) 및 LgTrip 3546(서열번호 51)은 +/- 0.4nM의 디펩타이드 pep263(서열번호 35) 또는 +/- 0.4nM 디펩타이드 pep264(서열번호 299)가 포함된 TBS + 0.01% BSA에서 200nM로 희석하고 10분 동안 인큐베이션했다. 디펩타이드 pep272(서열번호 146) 및 디펩타이드 pep273(서열번호 298)의 3X 희석 시리즈는 40nM에서 시작하여 pep272에 대한 희석제로서 디펩타이드 pep263 희석액을 사용하고 pep273에 대한 희석제로서 디펩타이드 pep264 희석액을 사용하여 제조했다. LgBiT 및 LgTrip 3546 희석액 50ul를 pep272/273 적정 시리즈 50ul와 합하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션했다. 100ul의 NanoGlo® 완충액 + 50uM Fz를 첨가한 후, 플레이트를 실온에서 5분 동안 인큐베이션하고 GMM+에서 발광을 판독했다. 결과는 도 87에 도시된다.
실시예 59
다크 BiT pep167
200nM LgBiT(서열번호 11) 및 LgTrip 3546(서열번호 51)을 포함하는 용액을 제조했다. 0.2nM SmTrip10 pep86(SmHiTrip; 서열번호 25)은 LgBiT 용액에 첨가하고, 1uM의 SmTrip9 pep286(서열번호 37)은 200nM의 SmTrip10 pep86과 함께 LgTrip 3546 용액에 첨가했다. 다크 bit(pep167)(서열번호 300) 적정은 TBS + 0.01% BSA에서 12uM로 시작하여 제조했다. 다크 bit 적정액 50ul를 LgBiT 또는 LgTrip 3546/pep167 희석액 50ul와 조합하고 1시간 동안 인큐베이션했다. 100ul의 NanoGlo® 완충액 + 50uM 푸리마진(Fz)을 첨가한 후, 플레이트를 10분 동안 인큐베이션하고 GMM+에서 발광을 판독했다. 결과는 도 88에 도시되어 있다.
실시예 60
SmTrip9 pep435/434 변이체를 이용한 E.콜라이 용해액 중 FRB-FKBP 촉진 상보성
배양액은 글리세롤 스톡으로부터 LB + 100ug/ml 암피실린에서 밤새 성장시키고, 세포를 LB + 0.15% 글루코스 + 0.1% 람노스 + Amp에 1:100으로 희석했다. 25℃에서 20시간 동안 진탕한 후, 세포를 PLB에 1:4로 희석하고 실온에서 15분 동안 인큐베이션하여 용해시켰다. 관심 있는 SmTrip9/SmTrip10 펩타이드 조합의 용해액을 1:1 부피:부피로 혼합하고 30 nM 라파마이신을 포함하거나 포함하지 않는 PLB+ 200 nM LgTrip 3546(서열번호 51)에 1:5로 희석했다. 샘플을 실온에서 30분 동안 인큐베이션하고 50uM 푸리마진을 함유하는 NanoGlo® 완충액과 1:1(부피:부피)로 조합했다. 5분째에 발광을 판독했다. 결과는 도 89 및 90에 도시되어 있다.
실시예 61
FRB-FKBP 촉진 상보성
SmTrip9 pep435 및 pep434 변이체를 사용한 HEK 용해액에서 FRB-FKBP 촉진 상보성
600,000개의 세포를 DMEM+1% FBS에서 6웰 플레이트의 각 웰에 첨가했다. 세포를 5% CO2 하에 37℃에서 밤새 성장시키고 FuGENE 프로토콜을 사용하여 웰당 3μg DNA(FKBP 또는 FRB 작제물)로 형질감염시켰다. 37℃에서 5% CO2 하에 밤새 인큐베이션한 후 세포를 DPBS로 세척했다. 흡인 후, 1ml의 신선한 DPBS를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 -80℃에서 약 10분 동안 동결시켰다. 플레이트를 실온에서 해동시켜 세포를 용해시키고 10분 동안 원심분리하여 용해액을 청징화하고 상청액을 제거했다. 용해액을 PLB에서 2배 희석하고 관심 있는 SmTrip9/SmTrip10 펩타이드 조합을 1:1(부피:부피)로 혼합했다. 이어서, 혼합물을 30nM 라파마이신의 존재 또는 부재하에 PLB + 200nM LgTrip 3546(서열번호 51)에 1:5로 희석했다. 샘플을 실온에서 30분 동안 인큐베이션하고 50uM 푸리마진을 함유하는 NanoGlo® 완충액과 1:1 부피:부피로 합했다. 5분째에 발광을 판독했다. 결과는 도 91에 도시되어 있다.
SmTrip9 823 및 840을 사용한 FRB-FKBP 검정 스크리닝
FKBP_SmTrip9 변이체 및 FRB-SmTrip10의 배양액은 37℃, LB + 100ug/ml 암피실린에서 밤새 성장시켰다. 세포를 0.15% 글루코스, 0.1% 람노스 및 100ug/ml 암피실린이 포함된 LB에 1:20으로 희석했다. 진탕하면서 배양액을 25℃에서 약 20시간 동안 유도했다. PLB 검정 시약은 444 nM LgTrip 3546, 90x 희석된 FRB-SmTrip10 배양액, +/- 35 nM 라파마이신으로 제조했다. 90 마이크로리터의 검정 시약을 96-웰 검정 플레이트의 각 웰에 첨가했다. FKBP_SmTrip9 배양액을 PLB에 1:10으로 희석하고 10ul를 검정 플레이트에 첨가했다. 샘플은 실온에서 30분간 인큐베이션했다. 50 uM 푸리마진을 함유하는 100 마이크로리터의 NanoGlo를 검정 플레이트 웰에 첨가하고 5분 후에 GloMax에서 발광을 판독했다. 결과는 도 92에 도시되어 있다.
실시예 62
pep434 및 pep435 변이체의 Kd 결정
LgTrip 3546(서열번호 51)을 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 0.2 nM로 희석했다. 각 SmTrip9-유사 펩타이드의 20uM 용액은 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 중 100uM SmTrip10 pep86(서열번호 25)으로 제조했다. 100 uM SmTrip10 pep86 용액을 희석제로 사용하여 각 SmTrip9 유사 펩타이드의 2배 연속 희석을 수행했다. 펩타이드 희석액을 LgTrip 3546 용액과 1:1(부피:부피)로 합하고 10분 동안 인큐베이션했다. TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 20uM 푸리마진(Fz) 검출 시약을 LgTrip/펩타이드 용액에 1:1 부피:부피로 첨가하고 10분째에 발광을 판독했다. 결과는 도 93에 도시되어 있다.
실시예 63
LgTrip 3546을 사용한 CRISPR 태그화된 디펩타이드-GAPDH 검출
LgTrip 2098(서열번호 31) 및 LgTrip 3546(서열번호 51) 둘 모두가 내인적으로 태그화된 GAPDH(SmTrip10 pep86(SmHiTrip; 서열번호 25)으로 태그화됨))를 검출하기 위한 생물발광 시약으로서 사용됨을 입증하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다.
HeLa 세포는 표시된 펩타이드에 대한 내인성 GAPDH C-말단 융합체를 발현시키기 위해 CRISPR/Cas9를 사용하여 편집했다. 편집된 HeLa 세포는 100μl의 DMEM/10% FBS에서 고체 흰색 검정 플레이트의 웰당 약 20,000개 세포의 밀도로 플레이팅했다. 그 다음, 세포를 NanoGlo® HiBiT 용해 완충액 및 200nM의 LgTrip을 함유하는 100 μl의 NanoGlo® HiBiT 용해 완충액(Promega)의 존재하에 10분 동안 인큐베이션했다. 0.5초 적분 시간을 갖고 GloMax® Discover를 사용하여 발광을 기록했다. 상대적 세포 수는 CellTiter® Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)를 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 결정했다. 데이터는 표준 편차로 표현된 가변성과 함께 세포 수에 대해 정규화된 평균 상대 광 단위로 표현된다.
결과는 도 94에 도시되어 있다.
실시예 64
SmTrip9의 부위-포화 스크리닝
SmTrip9에서 유익한 아미노산 치환을 식별하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다.
유전자 부위-포화 라이브러리는 SmTrip9의 표시된 위치에 무작위 코돈이 있는 프라이머를 사용하여 생성시켰다. 풀링된(pooled) 유전자 변이체로 KRX E. 콜라이를 형질전환시키고, LB + 암피실린 한천 상에 플레이팅하고, 37℃에서 밤새 성장시켰다. 개별 콜로니를 취해 LB + 100ug/ml 암피실린을 함유하는 96웰 배양 플레이트에 놓았다. 배양액을 진탕하면서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 세포를 0.15% 글루코스, 0.1% 람노스 및 100ug/ml 암피실린이 포함된 LB에 1:20으로 희석했다. 진탕하면서 배양액을 25℃에서 약 20시간 동안 유도했다. 검정 시약은 444 nM LgTrip(서열번호 51), 90x 희석된 FRB-VS-HiBiT 배양액, 및 +/- 35 nM 라파마이신을 0.3x 수동 용해 완충액(PLB) 및 DNase를 포함한 25mM HEPES에 첨가하여 제조했다. 90 마이크로리터의 검정 시약을 96웰 검정 플레이트의 각 웰에 첨가했다. FKBP_SmTrip9 배양액을 PLB에 1:10으로 희석하고 10ul를 검정 플레이트에 첨가했다. 샘플을 실온에서 30분 동안 인큐베이션했다. 50 uM 푸리마진을 함유하는 100 마이크로리터의 NanoGlo® 완충액을 검정 플레이트 웰에 첨가하고, 5분 후에 GloMax® 광도계에서 발광을 판독했다.
결과는 도 100 내지 112에 도시되어 있다.
실시예 65
SmTrip9 pep435/434 변이체를 이용한 E. 콜라이 용해액에서 FRB-FKBP 촉진 상보성
FKBP_SmTrip9 변이체 및 FRB-SmTrip10의 배양액을 37℃에서 LB + 100ug/ml 암피실린에서 밤새 성장시켰다. 세포를 0.15% 글루코스, 0.1% 람노스 및 100ug/ml 암피실린이 포함된 LB에 1:20으로 희석했다. 진탕하면서 배양액을 25℃에서 약 20시간 동안 유도했다. 배양액을 PLB에서 1:4로 희석하고 실온에서 15분 동안 인큐베이션하여 세포를 용해시켰다. SmTrip9 및 SmTrip10 희석액은 관심 있는 조합물에 대해 1:1(부피:부피)로 혼합했다. 혼합물을 30nM 라파마이신이 있거나 없는 PLB + 200nM LgTrip에 1:5로 희석했다. 샘플을 실온에서 30분 동안 인큐베이션했다. 50 uM 푸리마진을 함유하는 50 마이크로리터의 NanoGlo® 완충액을 검정 플레이트 웰에 첨가하고, 5분 후에 GloMax® 광도계에서 발광을 판독했다. 결과는 도 113 내지 115에 도시되어 있다.
실시예 66
조합 SmTrip9 변이체를 이용한 FRB-FKBP 촉진 상보성 검정 스크리닝
FKBP_SmTrip9 변이체 및 FRB-SmTrip10의 배양액을 37℃에서 LB + 100 ug/ml 암피실린에서 밤새 성장시켰다. 세포를 0.15% 글루코스, 0.1% 람노스 및 100 ug/ml 암피실린이 포함된 LB에 1:20으로 희석했다. 진탕하면서 배양액을 25℃에서 약 20시간 동안 유도했다. PLB 검정 시약은 444 nM LgTrip, 90x 희석된 FRB-SmTrip10 배양액, +/- 35 nM 라파마이신으로 제조했다. 90 마이크로리터의 검정 시약을 96-웰 검정 플레이트의 각 웰에 첨가했다. FKBP_SmTrip9 배양액을 PLB에서 1:10으로 희석하고 10ul를 검정 플레이트에 첨가했다. 샘플을 실온에서 30분 동안 인큐베이션했다. 50 uM 푸리마진을 함유하는 100 마이크로리터의 NanoGlo® 완충액을 검정 플레이트 웰에 첨가하고, 5분 후에 GloMax® 광도계에서 발광을 판독했다. 결과는 도 116 내지 122에 도시되어 있다.
실시예 67
SmTrip9 합성 펩타이드의 Kd 및 Bmax의 결정
LgTrip은 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에 0.2 nM로 희석했고 pep289를 25 uM로 첨가했다. 이 용액은 SmTrip9 펩타이드의 5배 연속 희석 시리즈의 희석제로 사용했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 평형화하고 검정 플레이트에 3반복으로 분주했다. 20 uM 푸리마진을 함유하는 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨을 샘플에 1:1 부피:부피 비율로 첨가했다. 플레이트를 10분 동안 인큐베이션하고 발광을 판독했다. VS-HiBiT Kd를 결정하기 위해 동일한 프로토콜을 따랐지만, 포화 SmTrip9(25 uM) 및 VS-HiBiT의 적정을 사용했다. 결과는 도 123 내지 130에 도시되어 있다.
실시예 68
합성 SmTrip9 펩타이드의 용해도 결정
합성 펩타이드는 달리 언급되지 않는 한, 말단이 차단된(N-말단 아세틸화 및 C-말단 아미드화) 것으로서, Peptide2.0에서 주문했다. 펩타이드를 뉴클레아제가 없는 물에 용해시키고 -20℃에서 보관했다. 스톡을 22℃ 수조에서 해동하고 원심분리하고 사용할 때까지 4℃에서 보관했다. 결과는 도 131에 도시되어 있다.
실시예 69
SmTrip9 합성 펩타이드 및 pep289의 생화학적 동시적정
LgTrip은 0.3x 수동 용해 완충액(PLB) 및 DNase가 포함된 25mM HEPES에서 200nM로 희석했다. SmTrip9 펩타이드 및 pep289를 100uM로 희석하고 PLB에서 연속적으로 6배 동시적정했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 인큐베이션했다. 가장 농축된 샘플을 PLB에서 50 내지 100배로 희석했다. 샘플을 검정 플레이트에 3반복으로 분취하고 NanoGlo® 완충액 + 50uM 푸리마진과 1:1 부피:부피로 혼합했다. ClarioStar 또는 GloMax® 기기에서 10분 후에 발광을 판독했다. 결과는 도 132-133에 도시되어 있다.
실시예 70
SmTrip9 및 SmTrip 10 합성 펩타이드의 생화학적 동시적정
LgTrip은 0.3x 수동 용해 완충액(PLB) 및 DNase가 포함된 25mM HEPES에서 200nM로 희석했다. SmTrip9 및 SmTrip10 펩타이드를 100uM로 희석하고 PLB에 연속적으로 6배 동시적정했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 인큐베이션했다. 가장 농축된 샘플을 PLB에 50 내지 100배 희석했다. 샘플을 3반복으로 검정 플레이트에 분취하고 NanoGlo® 완충액 + 50uM 푸리마진과 1:1 부피:부피로 혼합했다. ClarioStar 또는 GloMax® 기기에서 10분 후에 발광을 판독했다. 결과는 도 134에 도시되어 있다.
실시예 71
pep521 및 대안적 SmTrip 10 합성 펩타이드의 생화학적 동시적정
LgTrip은 0.3x 수동 용해 완충액(PLB) 및 DNase가 포함된 25mM HEPES에 200nM로 희석했다. SmTrip10 펩타이드 및 pep521은 100uM로 희석하고 PLB에 연속적으로 6배 동시적정했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 인큐베이션했다. 가장 농축된 샘플은 PLB에 50 내지 100배 희석했다. 샘플을 검정 플레이트에 3반복으로 분취하고 NanoGlo® 완충액 + 50uM 푸리마진과 1:1 부피:부피로 혼합했다. ClarioStar 또는 GloMax® 기기에서 10분 후에 발광을 판독했다. 결과는 도 135에 도시되어 있다.
실시예 72
LgTrip 3546 주형으로부터 가닥 제거(정제)
각 클론의 단일 콜로니는 LB+100ug/ml 암피실린에서 37℃에서 18시간 동안 성장시켰다. 밤샘 배양액을 50ml의 Terrific Broth + 0.1% 람노스 + 100ug/ml 암피실린에 1:100으로 희석했다. 15℃에서 48시간 동안 성장시킨 후, 세포를 펠릿화하고 100mM HEPES pH 7.5 + 0.001U/ml DNase 10ml에 재현탁시켰다. FastBreak® 용해 완충액 1ml를 각 샘플에 첨가한 다음, 샘플을 회전 혼합기에서 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 10분 동안 7,000RPM의 원심분리에 의해 청징화된 용해액을 제조했다.
MagneHis 정제 시스템을 사용한 가닥 정제: 각 샘플에 MagneHis 수지(Promega) 300ul를 첨가한 후, 샘플을 20회 혼합하고 자성 스탠드에 놓았다. 상청액을 제거하고, 수지를 컬럼 세척 완충액으로 2회 세척했다. 샘플은 600ul의 용출 완충액으로 용출시켰다. 그 다음, 샘플을 투석 장치에 넣어 TBS와 교환했다. 가닥 제거 단백질의 식별은 도 136에 도시된 바와 같이 SDS PAGE를 통해 관찰했다.
실시예 73
다양한 펩타이드 조합을 갖는 가닥 제거 단백질
200μl의 OptiMEM+10% FBS를 다중 웰 플레이트의 다수의 웰에 첨가했다. 펩타이드 조합을 각 가닥 제거 단백질과 별도로 분석되도록 각각 10μM의 최종 농도로 첨가했다. 각 가닥 제거 단백질은 OptiMEM + 10% FBS에 20nM(LgTrip 3546의 경우 2nM)로 희석했다. 각 가닥 제거 펩타이드 20μl를 표시된 펩타이드 조합에 첨가하고, 샘플을 혼합하고, 45μl를 흰색 검정 플레이트(Costar 3600)의 웰에 3반복으로 분취했다. 실온에서 15분간 인큐베이션한 후, 5μl의 검출 시약(100uM Fz(Promega LCS N205))을 각 샘플에 첨가했다. 샘플을 궤도 진탕기에 30초 동안 놓고 1시간 동안 2분마다 발광을 측정했다. 발광은 동역학 판독의 피크 높이로서 기록한다. 배경은 OptiMEM+10% FBS+검출 시약이다.
도 137에 입증된 바와 같이, 별도의 펩타이드로 첨가했을 때 가닥 제거 단백질 7, 8, 9, 10에서는 배경 초과 신호가 없었다. 3개 펩타이드 조합 중 2가지는 배경에 비해 약 2X 신호를 제공했다((8+9) 디펩타이드+7+10) 또는 ((7+8) 디펩타이드+9+10). 3개 펩타이드 조합 중 하나는 배경에 비해 약 10X 신호를 제공했다(((9+10) 디펩타이드+7+8). (10+9)+(7+8)의 2가지 디펩타이드의 조합은 배경에 비해 약 4.5 로그(log)의 신호를 제공했다. 가장 큰 신호를 제공하는 펩타이드 조합이 가장 높은 친화도를 가질 가능성이 있다. 낮은 친화도 조합은 촉진된 상보성 검정에서 빛을 생성할 수 있다. 도 137d는 대안적 분할 부위(예를 들어, 중간 베타 가닥)가 있는 펩타이드가 생물발광 복합체를 형성할 수 있음을 입증한다.
실시예 74
LgTrip 3546 주형으로부터 가닥 6, 7, 8, 9 또는 10 제거(정제)
400μl의 OptiMEM+10% FBS를 심부 웰 96웰 플레이트의 다수 웰에 첨가했다. ATG-3929 또는 LgTrip으로 개별적으로 검정될 10μM의 각 펩타이드의 최종 농도에 펩타이드 조합을 첨가했다. 이어서, 펩타이드 용액을 나누었다. 펩타이드 분취액 중 하나에 20nM ATG-3929 또는 2nM LgTrip 중 하나의 20 ul를 표시된 펩타이드 조합에 첨가하고 샘플을 혼합하고 45μl의 +/- 펩타이드 샘플을 흰색 검정 플레이트(Costar 3600)의 웰에 3반복으로 분주했다. 실온에서 15분간 인큐베이션한 후, 5μl의 검출 시약(OptiMEM + 10% FBS(Promega LCS N205) 중 100uM Fz)을 각 샘플에 첨가했다. 샘플을 궤도 진탕기에 5분 동안 두었다. 각 샘플의 배경은 OptiMEM+10% FBS+펩타이드 희석액+검출 시약이다.
도 138에서 입증되는 바와 같이, 가닥(9+10)+(7+8)+6을 갖는 샘플 ATG-3929는 배경에 비해 약 2X 신호를 보여준다. 반면에 2가지 펩타이드(6+7+8)+(9+10)을 갖는 샘플은 배경에 비해 약 300X를 보여주었다.
3개 초과의 펩타이드를 갖는 샘플에서는 자발적인 상보성이 가시화되지 않는다는 점에 유의한다. 친화도가 충분히 높지 않아, 펩타이드의 친화도가 빛을 생성하기에는 충분히 높지 않을 수 있다. 융합 파트너에 의한 촉진 상보성을 통해 펩타이드가 함께 모인다면 신호를 수득할 가능성이 있을 수 있다.
실시예 75
디펩타이드 적정
디펩타이드를 5 uM로 희석하고 희석제로서 0.2 nM의 LgTrip과 함께 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨을 사용하여 연속적으로 5배 희석했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고 검정 플레이트의 웰에 3반복으로 첨가했다. 1:1 부피:부피의 20x 희석된 생세포 기질과 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨을 샘플에 첨가하고 플레이트를 10분 후에 GloMax 광도계에서 판독했다. 도 139a-b는 디펩타이드 적정으로부터 얻은 Kd 및 Bmax 값을 입증한다.
포유동물 세포에서 이원성 NanoTrip의 배수 반응
세포의 응집성 플라스크로부터 성장 배지를 제거했다. (HEK293 및 Hela). 세포를 10ml의 DPBS로 세척한 다음, 3ml의 TrypLE Express 트립신을 세포에 첨가했다. 세포를 37℃에서 3분 동안 인큐베이션했다. 10ml의 성장 배지를 첨가한 다음 세포를 200RCF에서 5분 동안 회전시켰다. 배지를 교체하고 세포를 10ml의 성장 배지에 재현탁시켰다. 세포를 계수하고 200,000/ml로 희석했다. 100ul의 세포를 흰색 검정 플레이트의 각 웰에 플레이팅하고 CO2와 함께 37℃에서 밤새 성장시켰다. 다음날, LgTrip(3546)의 FRB 및 FKBP 융합체로부터의 100 ng/ul DNA와 각 배향의 다양한 디펩타이드를 조합했다. 263개 샘플은 운반체 DNA에 1:10 희석으로 또는 10ng/ul로 시작했다. 그 다음, DNA 샘플을 운반체 DNA에 연속적으로 희석했다(100ng/ul 운반체 DNA에 10 μl 대 90 μl). 다음으로, 20ul의 각 DNA 희석액을 83ul의 OptiMEM에 첨가했다. 샘플을 혼합한 다음, Viafect 형질감염 시약 6.6 ul를 각 샘플에 첨가했다. 샘플을 실온에서 20분 동안 인큐베이션한 다음, 각 FRB-FKBP 배향에 대해 세포의 6개 웰에 5ul의 형질감염 복합체를 첨가했다. 그 다음, 플레이트를 CO2와 함께 37℃에서 밤새 성장시켰다. 다음날 라파마이신(RAP)을 100nM의 최종 농도로 각 샘플에 대한 3개의 웰에 첨가했다. 샘플을 1분 동안 궤도 진탕기에 놓고, 그 다음 37C에서 30분 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 100ul의 NanoGlo+50uM Fz를 각 샘플(+RAP 및 -RAP)에 첨가한 다음, 샘플을 5분 동안 궤도 진탕기에 두었다. Glomax Discover 광도계를 사용하여 발광 측정값을 획득했다. 배수 반응은 +RAP 샘플의 RLU 값을 -RAP 샘플의 RLU 값으로 나누어 계산했다. 결과는 I 도 139c-e에 도시되어 있다. LgTrip에 대한 친화도가 낮은 디펩타이드 융합체는 친화도가 높은 샘플에 비해 더 큰 배수 반응을 생성한다.
실시예 76
삼분할 융합 단백질을 이용한 항-TNFa 생물학적 제제에 대한 삼분할 정량 검정의 개발
인플릭시맙(Remicade), 아달리무맙(Humira) 및 에타너셉트(Enbrel)는 모두 인간 TNFa에 결합하고, 또한 모두 인간 IgG1 Fc를 함유하는 TNFa 저해제이다. TNFa 저해제에 대한 결합 성분으로서 역할을 하는 SmTrip9- 또는 SmTrip10-단백질 G 및 TNFa 융합 단백질을 발현 및 정제하여 3가지 TNFa 저해제 모두에 대한 정량 검정을 개발했다(도 140). 단백질 G 융합 단백질은 TNFa 저해제의 보존된 IgG1 Fc 영역에 결합할 것이다. 저해제는 TNFa 융합 단백질에 결합하여 SmTrip9 및 SmTrip10을 근접하게 만든다. LgTrip의 존재 하에, 존재하는 TNFa 저해제의 양에 비례하는 신호를 생성하는 생물발광 복합체가 형성될 것이다. 모든 리포터 태그 구성은 4gly-ser 또는 15gly-ser 링커를 갖고 단백질 G 및 TNFa의 N- 또는 C-말단에서 발현되는 SmTrip9 또는 SmTrip10으로 테스트했다. 모든 배향을 스크리닝한 결과 최적의 쌍은 SmTrip9-15gly/ser-단백질 G와 TNFa-15gly/ser-SmTrip10이었다.
융합 단백질의 제조 방법
SmTrip9 pep521(서열번호 268) 서열에 이어 15개의 글리신-세린 반복체의 링커를 포함하는 융합 단백질을 단백질 G의 N-말단에 융합시키고, 발현 및 정제했다. 15개의 글리신-세린 반복체의 링커에 의해 분리된 인간 TNFa의 C 말단에 융합된 SmTrip10 pep289(서열번호 150) 서열을 포함하는 제2 융합 단백질도 발현 및 정제했다. KRX 형질전환된 E. 콜라이 세포의 글리세롤 스톡으로부터의 선조형 플레이트를 암피실린(100ug/ml)이 포함된 LB 플레이트 상에 생성시키고, 37℃에서 밤새 인큐베이션했다. 단일 콜로니를 3ml의 SOC 배지 + AMP에 접종하고 37℃에서 밤새 진탕(275rpm) 인큐베이션했다. 세포를 용해시키고 플라스미드 DNA를 수집했다. 셔플 수용성 E. 콜라이 세포를 100ng의 플라스미드 DNA로 형질전환시키고, 사전가온된 선택 플레이트 상에 도말하고, 30℃에서 밤새 인큐베이션했다. 콜로니를 선택하여 암피실린을 함유하는 50ml 부피의 LB에 접종했다. 배양액을 37℃ 진탕 하에 밤새 인큐베이션한 후, 암피실린을 함유하는 LB 배지 500mL에 1:100으로 희석했다. 이들 플라스크를 OD600이 0.6-0.8에 도달할 때까지 진탕하면서 37℃에서 인큐베이션했다. 1mM의 최종 농도로 IPTG를 첨가하여 세포를 유도하고 진탕하면서 25℃에서 밤새 인큐베이션했다. 세포를 수확하고, 원심분리하고, 50mL 추출 및 용해 완충액에 혼합하면서 4℃에서 재현탁시켰다. 3회의 동결/해동 사이클을 수행한 후 RQI DNase를 첨가했다. 총 용해액을 띵크(think) 50mL 원심분리 튜브로 옮기고 4℃에서 30분 동안 10,000xg로 회전시켰다. 니켈 컬럼에 로딩하기 전에 20mM 이미다졸/350mM NaCl을 첨가했다. 융합 단백질을 세척하고 이미다졸을 증가시키면서 5단계 용출 공정으로 컬럼으로부터 용출시켰다. 샘플을 TBS에 대해 투석하고 최종 스톡 단백질을 -20℃에서 TBS 중 50% 글리세롤에 저장했다.
실시예 77
SmTrip9 pep521-단백질 G 및 TNFa-SmTrip10 pep289 융합 단백질을 사용한 TNFa 저해제 인플릭시맙, 아달리무맙 및 에타너셉트의 균질 정량 분석
균질 검정에서 TNFa 저해제를 정량하는 NanoTrip 융합 단백질의 능력을 결정하기 위해 본원의 실시양태를 개발하는 동안 실험을 수행했다. 결과는 LgTrip과 함께 단백질 G와 TNFa NanoTrip 융합 단백질이 인플릭시맙, 아달리무맙, 및 에타너셉트를 정량화하는 데 있어서 뛰어난 감도 및 범위를 표시한다는 것을 보여준다.
TNFa 저해제의 2X 스톡을 검정 완충액에서 생성했고 1:2로 연속 희석하여 용량 반응을 생성했고 50ul/웰을 비결합 표면 처리된 96웰 고체-흰색 플레이트(Costar 3600)에 첨가했다. 정제된 LgTrip 3546(서열번호 51)(최종 농도 1uM) + SmTrip9 pep521-단백질 G(서열번호 268)(최종 10nM) + TNFa-SmTrip10 pep289(서열번호 150)의 2X 마스터 혼합물(최종 10nM)을 검정 완충액에 생성하고, 50ul/웰을 첨가했다. 플레이트를 실온에서 90분 동안 인큐베이션시켰다. 검정 완충액 중 Nano-Glo® 생 세포 기질의 5X 스톡 25ul/웰을 최종 농도 10uM을 위해 플레이트에 첨가했고, 약 5분 동안 인큐베이션했고, GloMax® Discover를 사용하여 발광을 측정했다. 검정 완충액은 PBS에 최종 0.01% BSA로 PBS(pH 7.0)에 희석된 블로커 BSA(10%)(Thermo)로 구성되었다. 샘플을 3반복/플레이트에서 테스트했고, n=3개의 독립적인 실험을 실행했다. 도 141에 입증된 바와 같은 데이터는 검출 한계(LOD), 정량 한계(LOQ), 및 정량 상한(ULOQ)에 대해 분석했다.
실시예 78
인간 혈청 및 소변과 같은 복합 샘플 매트릭스에서 인플릭시맙의 균질 정량 분석
균질 검정에서 정상 인간 IgG 결핍 혈청, 정상 풀링된 인간 AB 혈청 및 풀링된 정상 인간 소변의 복합 샘플 매트릭스의 존재 하에 인플릭시맙을 정량하는 NanoTrip 융합 단백질의 능력을 결정하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다. 결과는 예상대로 내인성 IgG를 제외하고, NanoTrip 시스템이 소변의 존재 또는 혈청 단백질의 존재에 의해 크게 영향을 받지 않았음을 나타낸다.
테스트할 인간 샘플 매트릭스의 존재 하에 20nM 인플릭시맙을 함유하는 2X 스톡을 검정 완충액으로 희석하여 생성하고 50ul/웰을 비결합 표면 처리된 96웰 고체-흰색 플레이트(Costar 3600)에 첨가했다. 정제된 LgTrip 3546(서열번호 51)(최종 농도 1uM) + SmTrip9 pep521-단백질 G(서열번호 268)(최종 10nM) + TNFa-SmTrip10 pep289(서열번호 150)의 2X 마스터 혼합물(최종 10nM)을 검정 완충액에서 생성하였고, 50ul/웰을 첨가했다. 플레이트를 실온에서 90분 동안 인큐베이션시켰다. 검정 완충액 중 Nano-Glo® 생세포 기질의 5X 스톡 25 ul/웰을 10uM의 최종 농도를 위해 플레이트에 첨가했고, 약 5분 동안 인큐베이션하고 GloMax® Discover를 사용하여 발광을 측정했다. 검정 완충액은 PBS에 최종 0.01% BSA로 PBS(pH 7.0)에 희석된 블로커 BSA(10%)(Thermo)로 구성되었다. 샘플은 3반복으로 테스트했다. 도 142에 입증된 바와 같은 데이터는 신호/배경으로 표시된다.
실시예 79
용액상 균질 검정에서 100pM 인플릭시맙의 존재 하에 정제된 LgTrip3546(서열번호 51)과 SmTrip9 pep521-단백질 G(서열번호 268) 및 TNFa-SmTrip10 pep289(VS-HiBiT; 서열번호 150) 융합 단백질의 촉진 상보성을 통한 신호 생성의 동역학 분석
용액상 균질 검정에서 100pM의 인플릭시맙을 정량하기 위해 단백질 G/TNFa NanoTrip 시스템의 결합 동역학을 결정하기 위해 본원의 실시양태를 개발하는 동안 실험을 수행했다. 결과는 신호 생성이 즉각적이고 지속적이어서, SmTrip9 및 SmTrip10 융합 단백질에 대한 LgTrip뿐만 아니라 인플릭시맙에 대한 융합 단백질의 신속한 결합 동역학을 나타낸다.
인플릭시맙의 2X 스톡(최종 100pM)을 검정 완충액에서 생성했고, 50ul/웰을 비결합 표면 처리된 96웰 고체-흰색 플레이트(Costar 3600)에 첨가했다. 정제된 LgTrip 3546(서열번호 51)(최종 농도 1uM) + SmTrip9 pep521-단백질 G(서열번호 268)(최종 10nM) + TNFa-SmTrip10 pep289(서열번호 150)(최종 10nM)의 2X 마스터 혼합물을 검정 완충액에서 생성하고 50ul/웰을 첨가했다. 검정 완충액에 Nano-Glo® 생세포 기질의 5X 스톡 및 25ul/웰을 10uM의 최종 농도를 위해 플레이트에 첨가했다. 모든 시약을 첨가하고 플레이트를 즉시 GloMax® Discover에 올려 시간 경과에 따른 발광을 판독했다. 검정 완충액은 PBS에 최종 0.01% BSA까지 PBS(pH 7.0)에 희석된 블로커 BSA(10%)(Thermo)로 구성되었다. 샘플을 3반복으로 테스트했다.
결과는 도 143에 도시되어 있다.
실시예 80
용액상 균질 검정에서 TNFa-SmTrip10 pep289(VS-HiBiT; 서열번호 150) 융합 단백질 정제된 LgTrip3546(서열번호 51)에 의한 촉진 상보성을 통해 인플릭시맙을 측정하는 능력에 대한 SmTrip9-단백질 G 변이체의 테스트
용액 상 균질 검정에서 TNFa-SmTrip10 pep289(VS-HiBiT; 서열번호 150) 융합 단백질 정제된 LgTrip3546(서열번호 51)에 의한 촉진 상보성을 통해 인플릭시맙을 측정하기 위해 단백질 G에 대한 융합 단백질로서 표현된 다른 SmTrip9 변이체의 능력을 결정하기 위한 본원의 실시양태의 개발 중에 실험을 수행했다. 결과는 테스트된 모든 SmTrip9 pep(x)-단백질 G 변이체가 신호를 생성할 수 있음을 보여준다.
인플릭시맙의 2X 스톡(최종 10nM)을 검정 완충액에서 생성했고, 50ul/웰을 비결합 표면 처리된 96웰 고체-흰색 플레이트(Costar 3600)에 첨가했다. 정제된 LgTrip 3546(서열번호 51)(최종 농도 1uM) + SmTrip9 pep(x)-단백질 G(최종 10nM) + TNFa-SmTrip10 pep289(서열번호 150)(최종 10nM)의 2X 마스터 혼합물을 검정 완충액에서 생성하고 50ul/웰을 첨가했다. 플레이트를 실온에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 검정 완충액 중 Nano-Glo® 생세포 기질의 5X 스톡, 25ul/웰을 10uM의 최종 농도를 위해 플레이트에 첨가하고, 약 5분 동안 인큐베이션하고, GloMax® Discover를 사용하여 발광을 측정했다. 검정 완충액은 PBS에 최종 0.01% BSA까지 PBS(pH 7.0)에 희석된 블로커 BSA(10%)(Thermo)로 구성되었다. 샘플을 3반복으로 테스트했다. 결과는 도 144에 도시되어 있다.
실시예 81
SmTrip9 pep(X)-단백질 G 변이체 및 TNFa-SmTrip10 pep289 융합 단백질을 테스트하는 균질 정량 인플릭시맙
용액상 균질 검정에서 정제된 LgTrip 3546(서열번호 51)과 함께 TNFa-SmTrip10 pep289(VS-HiBiT; 서열번호 150) 융합 단백질에 의한 촉진 상보성을 통해 인플릭시맙을 정량하는 상이한 SmTrip9 pep(X)-단백질 G 변이체의 능력을 입증하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다. 결과는 모든 SmTrip9 변이체가 인플릭시맙을 정량할 수 있었음을 보여준다.
인플릭시맙의 2X 스톡(최종 10nM)을 검정 완충액에서 생성하고, 50ul/웰을 비결합 표면 처리된 96웰 고체-흰색 플레이트(Costar 3600)에 첨가했다. 정제된 LgTrip 3546(서열번호 51)(최종 농도 1uM) + SmTrip9 pep(x)-단백질 G(최종 10nM) + TNFa-SmTrip10 pep289(서열번호 150)(최종 10nM)의 2X 마스터 혼합물을 검정 완충액에서 생성하고 50ul/웰을 첨가했다. 플레이트를 실온에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 검정 완충액 중 Nano-Glo® 생세포 기질의 5X 스톡, 25ul/웰을 10uM의 최종 농도를 위해 플레이트에 첨가하고, 약 5분 동안 인큐베이션하고, GloMax® Discover를 사용하여 발광을 판독했다. 검정 완충액은 PBS에 최종 0.01% BSA까지 PBS(pH 7.0)에 희석된 블로커 BSA(10%)(Thermo)로 구성되었다. 샘플을 3반복으로 테스트했다.
실시예 82
세포 기반 검정에서 삼분할 융합 단백질을 사용한 항-EGFR 생물학적 제제에 대한 삼분할 정량 검정의 개발.
본 발명자들은 검정과 같이 상 분리 또는 표면 화학을 나타내는 파니투무맙 및 세툭시맙에 대한 정량적 세포 기반 검정을 개발했다. EGFR 저해제의 보존적 인간 IgG Fc 영역에 결합하는 정제된 SmTrip9-단백질 G 융합 단백질을 사용하면, 저해제는 세포 표면에 발현되는 SmTrip10-EGFR 융합 단백질에 결합하여 SmTrip9 및 SmTrip10이 근접해지게 한다. LgTrip의 존재 하에, 존재하는 EGFR 저해제의 양에 비례하는 신호를 생성하는 생물발광 복합체가 형성될 것이다. 4gly-ser 또는 15gly-ser 링커를 사용하여 단백질 G의 N 또는 C 말단 또는 EGFR의 N 말단에서 SmTrip9 또는 SmTrip10이 발현되는 모든 리포터 태그 구성이 테스트되었다. 모든 배향을 스크리닝하여 얻은 최적의 쌍은 SmTrip9-4gly/ser-단백질 G와 EGFR-15gly/ser-SmTrip10이었다.
결과는 도 145에 도시되어 있다.
실시예 83
세포 기반 균질 검정에서 정제된 LgTrip 3546(서열번호 51)과 함께 SmTrip9 pep521-단백질 G(서열번호 268) 융합 단백질 및 SmTrip10 pep289-EGFR(VS-HiBiT; 서열번호 150) 발현 세포에 의한 촉진 상보성을 통한 파니투무맙의 정량
세포 기반 균질 검정에서 EGFR 저해제 파니투무맙을 정량하는 NanoTrip 융합 단백질의 능력을 결정하기 위해 본원의 실시양태를 개발하는 동안 실험을 수행했다. 결과는 SmTrip9 pep521-단백질 G(서열번호 268) 정제된 단백질, SmTrip10 pep289-EGFR(서열번호 150) 발현 세포 및 LgTrip 3546(서열번호 51)이 파니투무맙을 정량하는 데 있어서 뛰어난 감도 및 범위를 표시한다는 것을 보여준다.
HEK293 세포는 가습 조직 배양 인큐베이터에서 37℃/5% CO2 하에 10% 소 태아 혈청(FBS, Hyclone)이 보충된 성장 배지(DMEM)에서 유지시켰다. SmTrip10 pep289-EGFR(VS-HiBiT; 서열번호 150)에 대한 발현 작제물을 먼저 운반체 DNA(PGEM-3ZF(-))를 함유하는 Opti-MEM에 1:10의 질량 비율로 희석하여 일시적 역형질감염을 수행했다. 형질감염 시약:DNA 복합체는 FuGENE HD 형질감염 시약을 1:3(FuGENE HD mL당 DNA mg)의 비율로 첨가한 후, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하여 제조했다. 생성된 형질감염:DNA 복합체는 그 다음 성장 배지에서 HEK293 세포 현탁액(2 x 10^5 세포/ml)과 1:20(부피/부피)의 비율로 혼합한 다음, 37℃/5% CO2의 가습 조직 배양 인큐베이터에서 18 내지 20시간 동안 인큐베이션했다.
SmTrip10 pep289-EGFR(서열번호 150) 융합 단백질을 발현하는 HEK293 세포를 트립신-EDTA를 사용하여 수확하고, 성장 배지에서 세척하고, Opti-MEM에 4.5 x 105 세포/ml의 농도로 재현탁시켰다. 50ul의 세포/웰(20,000개 세포/웰)는 비결합 표면 고체 흰색 96웰 플레이트(Costar 3600)에 첨가한다. 파니투무맙의 4X 스톡은 Opti-MEM에서 생성하고, Opti-MEM에 연속 희석하여 용량 반응을 생성하고, 25ul/웰을 첨가했다. 정제된 LgTrip 3546(서열번호 51)(최종 농도 1uM) + SmTrip9 pep521-단백질 G(서열번호 268)(최종 5nM)의 4X 마스터 혼합물을 Opti-MEM에서 생성하고 25ul/웰을 첨가했다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 검정 완충액에 5X Nano-Glo® 생세포 기질 스톡, 25ul/웰을 최종 농도 10uM로 플레이트에 첨가하고, GloMax® Discover에서 발광을 측정했다. 샘플을 3반복으로 테스트했다. N=3 독립적 실험.
결과는 도 146에 도시되어 있다.
실시예 84
세포 기반 균질 검정에서 세툭시맙의 증가 용량의 존재 하에, 정제된 LgTrip 3546(서열번호 51)과 쌍을 이룬 SmTrip9 pep521-단백질 G(서열번호 268) 정제된 융합 단백질 및 SmTrip10 pep289-EGFR(VS-HiBiT; 서열번호 150) 발현 HEK293 세포의 촉진 상보성을 통한 신호 생성의 실시간 결합 동역학 분석
세포 기반 균질 검정에서 세툭시맙을 정량하기 위해 단백질 G/EGFR NanoTrip 시스템의 결합 동역학을 결정하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다. 결과는 루시퍼라제 복합체의 형성에 따라 발광 신호가 시간이 지남에 따라 증가함을 보여준다. 신호 생성도 용량 의존적이다.
HEK293 세포는 가습 조직 배양 인큐베이터에서 37℃/5% CO2에서 10% 소 태아 혈청(FBS, Hyclone)이 보충된 성장 배지(DMEM)에서 유지시켰다. SmTrip10 pep289-EGFR(VS-HiBiT; 서열번호 150)에 대한 발현 작제물을 운반체 DNA(PGEM-3ZF(-))를 함유하는 Opti-MEM에 1:10의 질량 비율로 먼저 희석하여 일시적 역형질감염을 수행했다. 형질감염 시약:DNA 복합체는 FuGENE HD 형질감염 시약을 1:3(FuGENE HD mL당 DNA mg)의 비율로 첨가한 후, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하여 제조했다. 생성된 형질감염:DNA 복합체는 그 다음 성장 배지에서 HEK293 세포 현탁액(2 x 105 세포/ml)과 1:20(부피/부피)의 비율로 혼합한 다음, 37℃/5% CO2의 가습 조직 배양 인큐베이터에서 18 내지 20시간 동안 인큐베이션했다.
SmTrip10 pep289-EGFR 융합 단백질을 발현하는 HEK293 세포를 트립신-EDTA를 사용하여 수확하고, 성장 배지에서 세척하고, Opti-MEM에 4.5 x 105 세포/ml의 농도로 재현탁시켰다. 50ul의 세포/웰(20,000개 세포/웰)는 비결합 표면 고체 흰색 96웰 플레이트(Costar 3600)에 첨가했다. 세툭시맙의 4X 스톡은 Opti-MEM에서 생성하고, 25ul/웰을 첨가했다. 정제된 LgTrip 3546(서열번호 51)(최종 농도 10uM) + SmTrip9 pep521-단백질 G(서열번호 268)(최종 780pM)의 4X 마스터 혼합물을 Opti-MEM에서 생성하고 25ul/웰을 첨가했다. 검정 완충액에 Nano-Glo® 생세포 기질 5X 스톡, 및 25ul/well을 최종 농도 10uM로 플레이트에 첨가했다. 모든 시약을 첨가했고, 플레이트를 즉시 GloMax® Discover에 놓고 경시적으로 발광을 판독했다. 샘플을 3반복으로 테스트했다.
결과는 도 147에 도시되어 있다.
실시예 85
세포 기반 균질 검정에서 정제된 LgTrip 3546(서열번호 51)과 쌍을 이룬 SmTrip10 pep289-EGFR(VS-HiBiT; 서열번호 150) 발현 세포에 의한 촉진 상보성을 통해 파니투무맙을 측정하는 능력에 대한 SmTrip9-단백질 G 변이체의 테스트
세포 기반 균질 검정에서 정제된 LgTrip 3546(서열번호 51)과 쌍을 이룬 SmTrip10 pep289-EGFR(VS-HiBiT; 서열번호 150)에 의한 촉진 상보성을 통해 파니투무맙을 측정하는 단백질 G에 대한 융합 단백질로서 발현된 다른 SmTrip9 변이체의 능력을 결정하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다. 결과는 테스트된 모든 SmTrip9 pep(x)-단백질 G 변이체가 신호를 생성할 수 있었음을 보여준다.
HEK293 세포는 가습 조직 배양 인큐베이터에서 37℃/5% CO2 하에 10% 소 태아 혈청(FBS, Hyclone)이 보충된 성장 배지(DMEM)에서 유지시켰다. SmTrip10 pep289-EGFR(VS-HiBiT; 서열번호 150)에 대한 발현 작제물을 운반체 DNA(PGEM-3ZF(-))를 함유하는 Opti-MEM에 1:10의 질량 비율로 먼저 희석하여 일시적 역형질감염을 수행했다. 형질감염 시약:DNA 복합체는 FuGENE HD 형질감염 시약을 1:3(FuGENE HD mL당 DNA mg)의 비율로 첨가한 후, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하여 제조했다. 생성된 형질감염:DNA 복합체는 그 다음 성장 배지에서 HEK293 세포 현탁액(2 x 10^5 세포/ml)과 1:20(부피/부피)의 비율로 혼합한 다음, 37℃/5% CO2의 가습 조직 배양 인큐베이터에서 18 내지 20시간 동안 인큐베이션했다.
SmTrip10 pep289-EGFR(서열번호 150) 융합 단백질을 발현하는 HEK293 세포를 트립신-EDTA를 사용하여 수확하고, 성장 배지에서 세척하고, Opti-MEM에 4.5 x 105 세포/ml의 농도로 재현탁시켰다. 50ul의 세포/웰(20,000개 세포/웰)는 비결합 표면 고체 흰색 96웰 플레이트(Costar 3600)에 첨가했다. 파니투무맙의 4X 스톡(최종 1nM)은 Opti-MEM에서 생성하고, 25ul/웰을 첨가했다. 정제된 LgTrip 3546(서열번호 51)(최종 농도 1uM) + SmTrip9 pep(X)-단백질 G(최종 10nM)의 4X 마스터 혼합물을 Opti-MEM에서 생성하고 25ul/웰을 첨가했다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 검정 완충액에 Nano-Glo® 생세포 기질 5X 스톡, 25ul/웰을 최종 농도 10uM로 플레이트에 첨가했고, GloMax® Discover에서 발광을 측정했다. 샘플을 3반복으로 테스트했다. N=3 독립 실험. 결과는 도 148에 도시되어 있다.
실시예 86
세포 기반 균질 검정에서 정제된 LgTrip 3546(서열번호 51)과 쌍을 이룬 SmTrip10 pep289-EGFR(VS-HiBiT; 서열번호 150) 발현 세포에 의한 촉진 상보성을 통해 파니투무맙을 측정하는 능력에 대한 SmTrip9-단백질 G 변이체의 테스트
세포 기반 균질 검정에서 정제된 LgTrip 3546(서열번호 51)과 쌍을 이룬 SmTrip10 pep289-EGFR(VS-HiBiT; 서열번호 150)에 의한 촉진 상보성을 통해 파니투무맙을 측정하는 단백질 G에 대한 융합 단백질로서 발현된 다른 SmTrip9 변이체의 능력을 결정하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다. 결과는 테스트된 모든 SmTrip9 pep(x)-단백질 G 변이체가 용량 반응 분석에서 파니투무맙을 정량할 수 있었음을 보여준다.
HEK293 세포는 가습 조직 배양 인큐베이터에서 37℃/5% CO2에서 10% 소 태아 혈청(FBS, Hyclone)이 보충된 성장 배지(DMEM)에서 유지시켰다. SmTrip10 pep289-EGFR(VS-HiBiT; 서열번호 150)에 대한 발현 작제물을 운반체 DNA(PGEM-3ZF(-))를 함유하는 Opti-MEM에 1:10의 질량 비율로 먼저 희석하여 일시적 역형질감염을 수행했다. 형질감염 시약:DNA 복합체는 FuGENE HD 형질감염 시약을 1:3(FuGENE HD mL당 DNA mg)의 비율로 첨가한 후, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하여 제조했다. 생성된 형질감염:DNA 복합체는 그 다음 성장 배지에서 HEK293 세포 현탁액(2 x 105 세포/ml)과 1:20(부피/부피)의 비율로 혼합한 다음, 37℃/5% CO2의 가습 조직 배양 인큐베이터에서 18 내지 20시간 동안 인큐베이션했다.
SmTrip10 pep289-EGFR(서열번호 150) 융합 단백질을 발현하는 HEK293 세포를 트립신-EDTA를 사용하여 수확하고, 성장 배지에서 세척하고, Opti-MEM에 4.5 x 105 세포/ml의 농도로 재현탁시켰다. 50ul의 세포/웰(20,000개 세포/웰)는 비결합 표면 고체 흰색 96웰 플레이트(Costar 3600)에 첨가했다. 파니투무맙의 4X 스톡(최종 1nM)은 Opti-MEM에서 생성시켰고, 25ul/웰을 첨가했다. 정제된 LgTrip 3546(서열번호 51)(최종 농도 1uM) + SmTrip9 pep(X)-단백질 G(최종 10nM)의 4X 마스터 혼합물을 Opti-MEM에서 생성하고 25ul/웰을 첨가했다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 검정 완충액에 Nano-Glo® 생세포 기질 5X 스톡, 25ul/웰을 최종 농도 10uM로 플레이트에 첨가했고, GloMax® Discover에서 발광을 측정했다. 샘플을 3반복으로 테스트했다. 결과는 도 149에 도시되어 있다.
실시예 87
NanoTrip 화학적 표지된-쌍을 이룬 항체를 사용한 인간 IL-1베타의 정량
인간 IL-1베타를 정량하기 위해 NanoTrip 펩타이드와 화학적으로 접합된 쌍을 이룬 단클론 항체의 사용을 입증하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다. 이 모델 시스템은 서로 다른 에피토프에서 IL-1베타를 인식하는 2개의 단클론 마우스 항체로 이루어진다. HaloTag-SmTrip9 pep521(서열번호 268)은 항체 중 하나에 화학적으로 접합되었고, HaloTag-SmTrip10 pep289(서열번호 150)는 다른 항체에 화학적으로 접합되었다. IL-1베타의 존재 하에, 두 항체는 IL-1베타에 결합하여 두 태그를 근접하게 만든다. LgTrip 3546(서열번호 51)의 첨가는 상보성을 완성하고 발광 신호가 생성된다.
HaloTag-SmTrip9 및 HaloTag-SmTrip10 융합 단백질이 발현되고 정제된다. 항-IL-1베타 마우스 단클론 항체 클론 508A 4A2(Thermo)는 HaloTag-SmTrip9 pep521(서열번호 268)로 표지화되고 항-IL-1베타 마우스 단클론 항체 클론 508A 7G8(Thermo)은 HaloTag- SmTrip10 pep289(서열번호 150)에 의해 표지화된다. 표지되지 않은 항체는 먼저 Zeba 컬럼을 사용하여 10mM NaHCO3(pH 8.5)로 완충액 교환을 수행하여 제조한다. 그 다음, 항체를 20배 과량의 HaloTag® 숙신이미딜 에스테르(04) 리간드(Promega)로 프라이밍하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한다. 완충액 교환은 유리의 링커를 제거하기 위해 Zeba 컬럼을 사용하여 2회 수행한다. 프라이밍된 항체는 혼합하면서 4C에서 밤새 4배 과량의 HaloTag-SmTrip9 또는 HaloTag-SmTrip10과 함께 인큐베이션한다. HaloLink® 수지는 임의의 유리의 HaloTag® 융합 단백질을 제거하는 데 사용된다.
재조합 인간 IL-1베타의 2X 스톡을 검정 완충액에서 생성하고 1:2로 연속 희석하여 용량 반응을 생성하고, 50ul/웰을 비결합 표면 처리된 96웰 고체-흰색 플레이트(Costar 3600)에 첨가했다. 정제된 LgTrip 3546(서열번호 51)(최종 농도 1uM) + SmTrip9 pep521 표지된 4A2 클론(서열번호 268)(최종 100ng/ml) + SmTrip10 pep289 표지된 7G8 클론(서열번호 150)(최종 100 ng/ml)의 2X 마스터 혼합물을 검정 완충액에서 생성하고, 50ul/웰을 첨가했다. 검정 완충액에 Nano-Glo® 생세포 기질의 5X 스톡, 25ul/웰을 10uM의 최종 농도를 위해 플레이트에 첨가하고, GloMax® Discover를 사용하여 실시간으로 발광을 측정했다. 검정 완충액은 PBS(pH 7.0)에 BSA에 최종 0.01% BSA로 PBS(pH 7.0)에 희석된 블로커 BSA(10%)(Thermo)로 이루어졌다. 샘플은 3반복으로 테스트했다. 표시된 데이터는 20분 시점에서 판독한 신호이다.
결과는 도 150에 도시되어 있다.
실시예 88
NanoTrip 화학적으로 표지된 쌍을 이룬 항체를 사용한 인간 트로포닌에 대한 실시간 결합 동역학
인간 트로포닌을 정량하는 NanoTrip 펩타이드와 화학적으로 접합된 쌍을 이룬 단클론 항체의 사용을 입증하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다. 이 모델 시스템은 서로 다른 에피토프에서 트로포닌을 인식하는 2개의 단클론 마우스 항체로 이루어진다. HaloTag-SmTrip9 pep521(서열번호 268)은 항체 중 하나에 화학적으로 접합되었고, HaloTag-SmTrip10 pep289(서열번호 150)는 다른 항체에 화학적으로 접합되었다. 트로포닌의 존재 하에, 2개의 항체는 트로포닌에 결합하여 두 태그를 근접하게 만든다. LgTrip 3546(서열번호 51)의 첨가는 상보성을 완성하여, 발광 신호가 생성된다.
HaloTag-SmTrip9 및 HaloTag-SmTrip10 융합 단백질이 발현되고 정제된다. 항트로포닌 마우스 단클론 항체 10-T79C(Fitzgerald)는 HaloTag-SmTrip10 pep289(서열번호 150)로 표지화되고, 항트로포닌 마우스 단클론 항체 10-T79F(Fitzgerald)는 HaloTag-SmTrip9 pep521(서열번호 268)로 표지화된다. 표지되지 않은 항체는 먼저 Zeba 컬럼을 사용하여 10mM NaHCO3(pH 8.5)으로 완충액 교환을 수행하여 제조한다. 그 다음, 항체를 20배 과량의 HaloTag® 숙신이미딜 에스테르(04) 리간드(Promega)로 프라이밍하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한다. 완충액 교환은 유리의 링커를 제거하기 위해 Zeba 컬럼을 사용하여 2회 수행한다. 프라이밍된 항체는 혼합하면서 4℃에서 밤새 4배 과량의 HaloTag-SmTrip9 또는 HaloTag-SmTrip10과 함께 인큐베이션한다. HaloLink® 수지는 임의의 유리 HaloTag® 융합 단백질을 제거하는 데 사용된다.
재조합 인간 트로포닌의 2X 스톡(최종 1ug/ml)을 검정 완충액에서 생성하고, 50ul/웰을 비결합 표면 처리된 96웰 고체-흰색 플레이트(Costar 3600)에 첨가했다. 정제된 LgTrip 3546(서열번호 51)(최종 농도 1uM) + SmTrip9 pep521 표지된 10-T79F 클론(서열번호 268)(최종 1ug/ml) + SmTrip10 pep289 표지된 10-T79C 클론(서열번호 150)(최종 1ug/ml)의 2X 마스터 혼합물을 검정 완충액에서 생성하고, 50ul/웰을 첨가했다. 검정 완충액 중 Nano-Glo® 생세포 기질의 5X 스톡, 25ul/웰을 최종 농도 10uM로 플레이트에 첨가하고 GloMax® Discover를 사용하여 실시간으로 발광을 측정했다. 검정 완충액은 PBS에 최종 0.01% BSA까지 PBS(pH 7.0)에 희석된 블로커 BSA(10%)(Thermo)로 이루어졌다. 샘플은 3반복으로 테스트했다.
결과는 도 151에 도시되어 있다.
실시예 89
전위 검정
HiBiT는 LgBiT 폴리펩타이드(K D = 1nM) 및 기타 유사한 상보적 폴리펩타이드에 대해 매우 높은 친화도를 나타낸다. 2개의 단편 사이의 강한 상호작용은 임의의 자극 없이 상보성을 유도할 것이며(도 154), 이는 전위 검정에 적합하지 않을 것이다. 전위 검정의 두 성분(예를 들어, 펩타이드 및 폴리펩타이드) 간에 최적 친화도를 결정하기 위해 연구를 수행했다. 최적의 친화도는 280 nM 내지 1300 nM 범위인 것으로 발견되었다. LgBiT*라고 하는 LgBiT의 4중 돌연변이(E11K/I44M/N135V/L150S)는 HiBiT와의 상호작용을 약 1000배(K D = 1296nM) 정도 감소시켜, HiBiT/LgBiT* 쌍이 전위 검정에 매우 적합해지도록 한다. 2가지 다른 전위 검정을 설계하고 테스트했다.
PMA 자극 하에 시토졸로부터 원형질막으로 PKCα 전위를 측정하는 막 전위 검정을 개발했다. PKCα는 HeLa 세포에서 C 말단에 HiBiT에 의해 내인적으로 태그화되었다. 편집된 세포의 클론을 단리하고 가장 높은 발광 신호를 갖는 최고의 클론을 선택하여 검정을 수행했다. LgBiT*-막 센서는 형질감염 방법을 사용하여 클론에 도입시켰다. PMA의 첨가는 PKCα-HiBiT를 원형질막에 모집하고, 여기서 HiBiT는 LgBiT*를 만나 빛을 생성한다. PMA의 적정은 형질감염된 LgBiT*의 양에 따라 반응의 12배 내지 19배 증가를 산출했다(도 155).
핵 전위 검정은 TNFa 자극 하에서 시토졸로부터 핵으로의 p65 이동을 측정하여 개발했다. 핵 전위 검정은 막 전위 검정과 유사하게 설정했다. 구체적으로, p65는 HeLa 세포에서 C-말단에 내인적으로 태그화되었고, LgBiT*-핵 센서는 형질감염 방법을 통해 p65-HiBiT 세포주로 도입되었다. TNFa의 처리는 p65-HiBiT의 핵으로의 전위를 촉진하고, 여기서 HiBiT와 LgBiT* 사이에 상보성이 일어나 발광 신호를 생성한다. TNFa의 적정은 반응의 4배 증가를 초래했다(도 156a). 이 검정은 실시간으로 단백질 전위를 측정할 수 있다. 도 156b에 도시된 바와 같이, p65는 TNFa의 자극 시 핵으로 이동하는 데 약 30분이 소요되며, 이는 문헌에서의 발견과 일치한다.
실시예 90
HiBiT를 이용한 LgBiT 돌연변이체의 Kd 및 Bmax 값 비교
HiBiT 펩타이드 용액은 OptiMEM + 10% FBS에서 1.22uM로 시작하여 제조했다. 펩타이드 희석액을 OptiMEM+10% FBS에 3배 연속 희석했다. (700ul에 300ul). 정제된 LgBiT 또는 LgBiT 돌연변이체를 OptiMEM+10% FBS에 2nM의 농도로 희석했다. 90ul의 펩타이드 용액을 10ul의 LgBiT 희석액과 합했다(0.2nM LgBiT 최종). 샘플을 궤도 진탕기에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, OptiMEM + 10% FBS 중 100uM 푸리마진 11ul를 첨가했다. 샘플을 궤도 진탕기에 5분 동안 둔 다음, GloMax Multi+ 광도계를 사용하여 발광을 판독했다. Bmax 및 Kd는 1부위 특이적 결합 비선형 회귀를 사용하여 GraphPad Prism으로 계산했다(도 157a-b).
실시예 91
HiBiT에 대한 LgBiT 돌연변이체 용해액의 친화도
LgBiT 및 각 LgBiT 돌연변이체의 37℃ 밤샘 배양액을 성장시켰다. 각 배양액을 LB+0.1% 람노스 및 0.15% 글루코스에 1:100으로 희석했다. 25℃에서 20시간 동안 성장시켰다. 동일한 부피의 유도 배양액을 PLB 용해 완충액으로 희석하여 각 배양액의 용해액을 제조했다. (PLB 용해 완충액은 0.3X PLB+25mM HEPES pH 7.5임). 그 다음, 각 용해액을 PLB 용해 완충액에 10,000X 희석했다. 300nM에서 시작하는 합성 HiBiT 펩타이드의 희석 시리즈를 NanoGlo® 검정 완충액 + 50uM 푸리마진에 제조했다. 50ul의 각 희석된 용해액을 50ul의 펩타이드/NanoGlo® 적정과 합했다. 샘플을 3분 동안 인큐베이션한 다음, GloMax® multi+ 광도계에서 샘플의 발광을 판독했다(도 158).
실시예 92
상보적 폴리펩타이드와 절두된 LgTrip3546의 복합체로부터의 생물발광
495ul의 OptiMEM + 10% FBS를 심부 웰 플레이트에 분주했다. 펩타이드 846 및 847을 OptiMEM + 10% FBS 500ul에서 20uM로 희석했다. 각 펩타이드에 대해 2배 연속 희석액을 준비했다. 그 다음, 각 희석 시리즈의 200ul를 새로운 줄로 옮기고, 그 다음 ATG-3929를 846 적정 시리즈에 첨가(최종 2nM)하고, ATG-4794를 847 적정액에 첨가했다. 대조군으로서, 250nM pep 263을 0.2nM의 LgTrip 3546에 첨가했다. 각 샘플 50ul를 흰색 검정 플레이트에 3반복으로 분취한 다음, 플레이트를 10분 동안 진탕하면서 인큐베이션했다. 인큐베이션 후 6ul의 10X FZ LCS(833ul의 OptiMEM+10% FBS에 167ul의 LCS), 샘플을 궤도 진탕기에서 30초 동안 혼합한 다음 즉시 판독하고 수 시간 후 각 조건에 대한 피크 발광을 얻었다. 846+ATG-3929 및 847+ATG-4794의 혼합물은 1.25uM 펩타이드 농도에서 피크를 나타냈다. 결과는 도 159에 도시되어 있다.
실시예 93
B9 적정
LgTrip을 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에서 0.2 nM로 희석하고 pep289를 25 uM에 첨가했다. 이 용액은 SmTrip9 펩타이드의 5배 연속 희석 시리즈를 위한 희석제로 사용했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 평형화하고 검정 플레이트에 3반복으로 분주했다. 20 uM 푸리마진을 함유하는 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨을 1:1 부피:부피 비율로 샘플에 첨가했다. 플레이트를 10분 동안 인큐베이션하고 발광을 판독했다. VS-HiBiT Kd를 결정하기 위해 동일한 프로토콜을 따르되, 포화 SmTrip9(20x Kd) 및 VS-HiBiT 적정을 사용했다. 결과는 도 160에 도시되어 있다.
실시예 94
Pep289 적정
LgTrip을 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨에서 0.2 nM로 희석하고 pep289를 25 uM로 첨가했다. 이 용액은 SmTrip9 펩타이드의 5배 연속 희석 시리즈의 희석제로 사용했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 평형화하고 검정 플레이트에 3반복으로 분주했다. 20 uM 푸리마진을 함유하는 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨을 1:1 부피:부피 비율로 샘플에 첨가했다. 플레이트를 10분 동안 인큐베이션하고 발광을 판독했다. VS-HiBiT Kd를 결정하기 위해 동일한 프로토콜을 따르되, 포화 SmTrip9(20x Kd)와 VS-HiBiT 적정을 사용했다. 결과는 도 161에 도시되어 있다.
실시예 95
디펩타이드 친화도 결정
디펩타이드 pep263, pep788 및 pep900을 5uM로 희석하고 희석제로서 0.2nM의 LgTrip과 함께 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨을 사용하여 연속적으로 5배 희석했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고 검정 플레이트에 3반복으로 첨가했다. 1:1 부피:부피의 TBS + 0.01% BSA+ 0.01% 터지톨과 20x 희석된 생세포 푸리마진 기질을 샘플에 첨가하고, 10분 후에 GloMax® 광도계에서 플레이트를 판독했다. 결과는 도 162에 도시되어 있다.
실시예 96
LgTrip 변이체 및 Pep788을 사용한 Bmax 결정
LgTrip 변이체는 100ug/ml 암피실린이 포함된 LB에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 세포를 유도 배지(100ug/ml 암피실린 및 0.1% 람노스 w/v가 포함된 LB)에 20배 희석하고 진탕하면서 37℃에서 4시간 유도했다. 각 유도 샘플 10 마이크로리터를 250 ul 용해 완충액(0.3X PLB + 25mM HEPES pH 7.5)에 희석했다. 80 마이크로리터의 용해액을 2 ml 용해 완충액에 추가로 희석했다. pep788(서열번호 414)의 10배 희석 시리즈는 10μM 펩타이드에서 시작하여 희석제로서 50μM 푸리마진과 함께 Nano-Glo를 사용하여 수행했다. 펩타이드 희석액과 용해액은 1:1 부피:부피로 혼합하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고 발광을 판독했다. 결과는 도 163에 도시되어 있다.
실시예 97
LgTrip 변이체 및 Pep759를 사용한 Bmax 결정
LgTrip 변이체는 100ug/ml 암피실린이 포함된 LB에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 세포를 유도 배지(100ug/ml 암피실린 및 0.1% 람노스 w/v가 포함된 LB)로 20배 희석하고 진탕하면서 37℃에서 4시간 유도했다. 각 유도 샘플 10 마이크로리터를 250 ul 용해 완충액(0.3X PLB + 25mM HEPES pH 7.5)에 희석했다. 80 마이크로리터의 용해액을 2 ml 용해 완충액에 추가로 희석했다. 희석제로서 50uM 푸리마진 및 50μM pep289(서열번호 826)를 포함하는 Nano-Glo를 사용하여 50μM 펩타이드에서 시작하는 pep759(서열번호 496)의 5배 희석 시리즈를 수행했다. 펩타이드 희석액과 용해액을 1:1 부피:부피로 혼합하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고 발광을 판독했다. 결과는 도 164에 도시되어 있다.
실시예 98
LgTrip 변이체의 열 안정성
LgTrip 변이체는 100 ug/ml 암피실린이 포함된 LB에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 세포를 유도 배지(100ug/ml 암피실린 및 0.1% 람노스 w/v가 포함된 LB)로 20배 희석하고 진탕하면서 25℃에서 20시간 유도했다. 각 유도액 20마이크로리터를 40ul 용해 완충액(0.3X PLB + 25mM HEPES pH 7.5)에 희석하고 실온에서 15분 동안 용해시켰다. 용해액을 1X TBS + 0.01% BSA로 1,000배 희석했다. 각 샘플 50마이크로리터를 PCR 플레이트로 옮기고 열순환기에서 80℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션했다. 대조군을 얼음 위에서 인큐베이션했다. 샘플을 실온으로 평형화하고 1X TBS + 0.01% BSA에 1:100으로 희석했다. 25 마이크로리터의 각 샘플을 검정 플레이트로 옮기고 TBS + 0.01% BSA + 20x 희석된 생세포 푸리마진 기질 중 400nM pep788(서열번호 414) 25 ul와 혼합했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고 발광을 판독했다. 결과는 도 165에 도시되어 있다.
실시예 99
Pep788을 사용한 LgTrip 변이체의 Kd 및 Bmax 결정
LgTrip 변이체는 Promega MagneHis™ 단백질 정제 시스템을 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 정제했고 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 25 uM pep788에서 0.2 nM로 희석했다. 이 용액은 SmTrip9 펩타이드의 5배 연속 희석 시리즈를 위한 희석제로 사용했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 평형화하고 검정 플레이트에 3반복으로 분주했다. 20 uM 푸리마진을 함유하는 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨을 1:1 부피:부피 비율로 샘플에 첨가했다. 플레이트를 10분 동안 인큐베이션하고 발광을 판독했다. VS-HiBiT Kd를 결정하기 위해 동일한 프로토콜을 따르되, 포화 SmTrip9(25 uM) 및 VS-HiBiT 적정을 사용했다. 결과는 도 166에 도시되어 있다.
실시예 100
Pep840을 사용한 LgTrip 변이체의 Kd 및 Bmax 결정
제조사의 프로토콜에 따라 Promega MagneHis™ 단백질 정제 시스템을 사용하여 LgTrips 변이체를 정제하고 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 25 uM pep840에 0.2 nM로 희석했다. 이 용액은 SmTrip9 펩타이드의 5배 연속 희석 시리즈를 위한 희석제로 사용했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 평형화하고 검정 플레이트에 3반복으로 분주했다. 20 uM 푸리마진을 함유하는 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨을 1:1 부피:부피 비율로 샘플에 첨가했다. 플레이트를 10분 동안 인큐베이션하고 발광을 판독했다. VS-HiBiT Kd를 결정하기 위해 동일한 프로토콜을 따르되, 포화 SmTrip9(25 uM) 및 VS-HiBiT 적정을 사용했다. 결과는 도 167에 도시되어 있다.
실시예 101
Pep289 및 포화 Pep840을 사용한 LgTrip 변이체의 Kd 및 Bmax 결정
LgTrip 변이체는 Promega MagneHis™ 단백질 정제 시스템을 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 정제했고, TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 25 uM pep289 + 12.5 uM Pep840에 0.2 nM로 희석했다. 이 용액은 SmTrip9 펩타이드의 5배 연속 희석 시리즈의 희석제로 사용했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 평형화하고 검정 플레이트에 3반복으로 분주했다. 20 uM 푸리마진을 함유하는 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨을 1:1 부피:부피 비율로 샘플에 첨가했다. 플레이트를 10분 동안 인큐베이션하고 발광을 판독했다. VS-HiBiT Kd를 결정하기 위해 동일한 프로토콜을 따르되, 포화 SmTrip9(25 uM) 및 VS-HiBiT 적정을 사용했다. 결과는 도 168에 도시되어 있다.
실시예 102
LgTrip 변이체의 반감기 결정
MagneHis 정제된 LgTrip 변이체는 TBS + 0.01% BSA에 20nM로 희석했다. 3반복으로, 각 샘플의 100μl 분취량을 200μl 박벽 PCR 튜브에 로딩했다. 샘플을 열 순환기에서 70℃에서 인큐베이션했다. 샘플을 다양한 시점에서 제거하고 실온으로 평형화시켰다. 샘플을 TBS + 0.01% BSA에 0.2nM(495μl 중 5)로 희석했다. 25μl의 각각 희석된 샘플을 25μl의 TBS + 0.01% BSA + 20x 희석된 생세포 기질 푸리마진 + 400nM pep788(서열번호 414)과 조합했다. 샘플을 10분 동안 인큐베이션한 다음, GMM+에서 판독했다. 반감기는 비선형 회귀에 의해 계산했다. 결과는 도 169에 도시되어 있다.
실시예 103
LgTrip 변이체를 사용한 라파마이신 검정
FKBP_SmTrip9 변이체 및 FRB-SmTrip10의 배양액을 37℃에서 LB + 100ug/ml 암피실린에서 밤새 성장시켰다. 세포를 0.15% 글루코스, 0.1% 람노스 및 100 ug/ml 암피실린이 포함된 LB에 1:20으로 희석했다. 진탕하면서 배양액을 25℃에서 약 20시간 동안 유도했다. PLB 검정 시약은 444 nM의 MagneHis 정제된 LgTrip 변이체, 90x 희석된 FRB-SmTrip10 배양액, +/- 35 nM 라파마이신으로 제조했다. 90 마이크로리터의 검정 시약을 96-웰 검정 플레이트의 각 웰에 첨가했다. FKBP_SmTrip9 배양액을 PLB에 1:10으로 희석하고 10ul를 검정 플레이트에 첨가했다. 샘플을 실온에서 30분 동안 인큐베이션했다. 50 uM 푸리마진을 함유하는 100 마이크로리터의 Nano-Glo를 검정 플레이트 웰에 첨가하고 5분 후에 GloMax® 광도계에서 발광을 판독했다. 결과는 도 170 및 171에 도시되어 있다.
실시예 104
LgTrip 변이체 용해액의 열 안정성
LgTrip 변이체는 100 ug/ml 암피실린이 포함된 LB에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 세포를 유도 배지(100 ug/ml 암피실린 및 0.1% 람노스 w/v가 포함된 LB)로 20배 희석하고 진탕하면서 25℃에서 20시간 유도했다. 각 유도액 20 마이크로리터를 40ul 용해 완충액(0.3X PLB + 25mM HEPES pH 7.5)에 희석하고 실온에서 15분 동안 용해시켰다. 용해액을 1X TBS + 0.01% BSA로 1,000배 희석했다. 50 마이크로리터의 각 샘플을 PCR 플레이트로 옮기고 열순환기에서 70℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션했다. 대조군을 얼음 위에서 인큐베이션했다. 샘플을 실온으로 평형화하고 1X TBS + 0.01% BSA로 1:100 희석했다. 25 마이크로리터의 각 샘플을 검정 플레이트로 옮기고 TBS + 0.01% BSA + 20x 희석된 생세포 기질 중 400nM pep788(서열번호 414) 25 ul와 혼합했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고 발광을 판독했다. 결과는 도 172에 도시되어 있다.
실시예 105
다양한 온도 구배에서 LgTrip 변이체 용해액의 열 안정성
LgTrip 변이체는 100ug/ml 암피실린이 포함된 LB에서 37℃ 하에 밤새 성장시켰다. 세포를 유도 배지(100ug/ml 암피실린 및 0.1% 람노스 w/v가 포함된 LB)로 20배 희석하고 진탕하면서 25℃에서 20시간 유도했다. 각 유도액 20 마이크로리터를 40ul 용해 완충액(0.3X PLB + 25mM HEPES pH 7.5)에 희석하고 실온에서 15분 동안 용해시켰다. 용해액을 1X TBS + 0.01% BSA로 1,000배 희석했다. 각 샘플 50 마이크로리터를 PCR 플레이트로 옮기고 Veritas 열순환기에서 2가지 온도 구배, 즉 75 내지 100℃에서 10분 또는 50 내지 75℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션했다. 대조군은 얼음 위에서 인큐베이션했다. 샘플은 실온으로 평형화하고 1X TBS + 0.01% BSA로 1:100 희석했다. 25 마이크로리터의 각 샘플을 검정 플레이트로 옮기고 TBS + 0.01% BSA + 20x 희석된 생세포 푸리마진 기질 중 400nM pep788(서열번호 414) 25 ul와 혼합했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고 발광을 판독했다. 결과는 도 173에 도시되어 있다.
실시예 106
정제된 LgTrip 변이체의 열 안정성
MagneHis 정제된 LgTrip 변이체는 TBS + 0.01% BSA에 20nM로 희석했다. 3반복으로, 각 샘플의 100μl 분취량을 200μl의 박벽 PCR 튜브에 로딩했다. 샘플을 열 순환기에서 70℃ 하에 인큐베이션했다. 샘플을 다양한 시점에서 제거하고 실온으로 평형화시켰다. 샘플을 TBS + 0.01% BSA에 0.2nM(495μl 중 5)로 희석했다. 25 ul의 각각 희석된 샘플을 25 ul의 TBS + 0.01% BSA + 20x 희석된 생세포 기질 푸리마진 + 400nM pep788(서열번호 414)과 조합했다. 샘플을 10분 동안 인큐베이션한 다음, GMM+에서 판독했다. 결과는 도 174에 도시되어 있다.
실시예 107
Pep521 및 포화 VS-HiBiT를 사용한 LgTrip 변이체의 Kd 및 Bmax 결정
LgTrip 변이체는 Promega MagneHis™ 단백질 정제 시스템을 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 정제했고 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 25 uM pep521에 0.2 nM로 희석했다. 이 용액은 SmTrip9 펩타이드의 5배 연속 희석 시리즈에 대한 희석제로 사용했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 평형화하고 검정 플레이트에 3반복으로 분주했다. 20 uM 푸리마진을 함유하는 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨을 1:1 부피:부피 비율로 샘플에 첨가했다. 플레이트를 10분 동안 인큐베이션하고 발광을 판독했다. 결과는 도 175에 도시되어 있다.
실시예 108
Pep840 및 포화 VS-HiBiT를 사용한 LgTrip 변이체의 Kd 및 Bmax 결정
LgTrip 변이체는 Promega MagneHis™ 단백질 정제 시스템을 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 정제했고 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 25 uM pep840에 0.2 nM로 희석했다. 이 용액은 SmTrip9 펩타이드의 5배 연속 희석 시리즈를 위한 희석제로 사용했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 평형화하고 검정 플레이트에 3반복으로 분주했다. 20 uM 푸리마진을 함유하는 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨을 1:1 부피:부피 비율로 샘플에 첨가했다. 플레이트를 10분 동안 인큐베이션하고 발광을 판독했다. 결과는 도 176에 도시되어 있다.
실시예 109
LgTrip 변이 ATG-3546 또는 ATG-5146 및 포화 Pep289를 사용한 SmTrip9 변이체의 Kd 및 Bmax 결정
LgTrip ATG-3546 및 ATG-5146은 Promega MagneHis™ 단백질 정제 시스템을 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 정제하고 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 25 uM pep289에 0.2 nM로 희석했다. 이 용액은 SmTrip9 펩타이드의 5배 연속 희석 시리즈를 위한 희석제로 사용했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 평형화하고 검정 플레이트에 3반복으로 분주했다. 20 uM 푸리마진을 함유하는 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨을 샘플에 1:1 부피:부피 비율로 첨가했다. 플레이트를 10분 동안 인큐베이션하고 발광을 판독했다. 결과는 도 177 및 178에 도시되어 있다.
실시예 109
LgTrip 변이 ATG-3546 또는 ATG-5146 및 포화 SmTrip9를 사용한 Pep289의 Kd 및 Bmax 결정
LgTrip ATG-3546 및 ATG-5146은 Promega MagneHis™ 단백질 정제 시스템을 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 정제하고 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 25 uM pep289에 0.2 nM로 희석했다. 이 용액은 SmTrip9 펩타이드의 5배 연속 희석 시리즈를 위한 희석제로 사용했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 평형화하고 검정 플레이트에 3반복으로 분주했다. 20 uM 푸리마진을 함유하는 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨을 1:1 부피:부피 비율로 샘플에 첨가했다. 플레이트를 10분 동안 인큐베이션하고 발광을 판독했다. VS-HiBiT Kd를 결정하기 위해 동일한 프로토콜을 따르되, 포화 SmTrip9(25 uM) 및 VS-HiBiT 적정을 사용했다. 결과는 도 179 및 180에 도시되어 있다.
실시예 110
Pep840 적정을 사용한 LgTrip 변이체 용해액의 Kd 및 Bmax 결정
LgTrip 배양액을 37℃에서 LB + 100ug/ml 암피실린에서 밤새 성장시켰다. 세포를 0.15% 글루코스, 0.1% 람노스 및 100 ug/ml 암피실린이 포함된 LB에 1:20으로 희석하고, 진탕 하에 25℃에서 약 20시간 동안 유도했다. 세포를 PLB 검정 시약(0.3X PLB + 25mM HEPES pH 7.5)에 1000x 희석하고 20분 동안 용해시켰다. NanoGlo + 50 uM 푸리마진 + 25 uM pep289에서 SmTrip9 pep840의 5배 연속 희석을 수행하고 LgTrip 용해액과 1:1 부피:부피로 혼합했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고 GloMax® 광도계에서 판독했다. 결과는 도 181에 도시되어 있다.
실시예 111
Pep840 적정을 사용한 정제된 LgTrip 변이체의 Kd 및 Bmax 결정
LgTrip 변이체는 제조사의 프로토콜에 따라 Promega MagneHis™ 단백질 정제 시스템을 사용하여 정제했고 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨 + 25 uM pep289에 0.2 nM로 희석했다. 이 용액은 SmTrip9 펩타이드의 5배 연속 희석 시리즈의 희석제로 사용했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 평형화하고 검정 플레이트에 3반복으로 분취했다. 20 uM 푸리마진을 함유하는 TBS + 0.01% BSA + 0.01% 터지톨을 1:1 부피:부피 비율로 샘플에 첨가했다. 플레이트를 10분 동안 인큐베이션하고 발광을 판독했다. 결과는 도 182에 도시되어 있다.
실시예 112
정제된 LgTrip 변이체의 반감기 결정
MagneHis 정제된 LgTrip 변이체는 TBS + 0.01% BSA에 20nM로 희석했다. 3반복으로 각 샘플의 100μl 분취량을 200μl의 박벽 PCR 튜브에 로딩했다. 샘플을 열 순환기에서 70℃ 하에 인큐베이션했다. 샘플을 다양한 시점에서 제거하고 실온으로 평형화시켰다. 샘플을 TBS + 0.01% BSA에 0.2nM(495μl 중 5)로 희석했다. 25 μl의 각각 희석된 샘플을 25μl의 TBS + 0.01% BSA + 20x 희석된 생세포 기질 푸리마진 + 200nM pep900(서열번호 907)과 조합했다. 샘플을 10분 동안 인큐베이션한 다음, GMM+에서 판독했다. 반감기는 비선형 회귀에 의해 계산했다. 결과는 도 183에 도시되어 있다.
실시예 113
LgTrip 변이체 ATG-3546 및 ATG-5146을 사용한 라파마이신 검정
FKBP_SmTrip9 변이체 및 FRB-SmTrip10의 배양액을 37℃에서 LB + 100 ug/ml 암피실린에서 밤새 성장시켰다. 세포를 0.15% 글루코스, 0.1% 람노스 및 100ug/ml 암피실린이 포함된 LB에서 1:20으로 희석했다. 배양액은 진탕하면서 25℃에서 약 20시간 동안 유도했다. PLB 검정 시약은 444 nM의 MagneHis 정제된 LgTrip 변이체, 90x 희석된 FRB-SmTrip10 배양액, +/- 35 nM 라파마이신으로 제조했다. 90 마이크로리터의 검정 시약을 96-웰 검정 플레이트의 각 웰에 첨가했다. FKBP_SmTrip9 배양액을 PLB에 1:10으로 희석하고 10ul를 검정 플레이트에 첨가했다. 샘플을 실온에서 30분 동안 인큐베이션했다. 50 uM 푸리마진을 함유하는 100 마이크로리터의 Nano-Glo를 검정 플레이트 웰에 첨가하고 5분 후에 GloMax® 광도계에서 발광을 판독했다. 결과는 도 184에 도시되어 있다.
실시예 114
Pep788, Pep900 또는 Pep840을 사용한 LegTrip 변이체 용해액의 Bmax 결정
LgTrip 변이체 배양액을 37℃에서 LB + 100ug/ml 암피실린에서 밤새 성장시켰다. 세포를 0.15% 글루코스, 0.1% 람노스 및 100ug/ml 암피실린이 포함된 LB에 1:20으로 희석하고 진탕하면서 25℃에서 약 20시간 동안 유도했다. 세포를 0.3x PLB 검정 시약에 5000x 희석하고 20분 동안 용해시켰다. 포화 pep289와 함께 디펩타이드 pep788, pep900 또는 SmTrip9 pep840의 5배 연속 희석을 Nano-Glo + 50 uM 푸리마진으로 수행하고 LgTrip 용해액과 1:1 부피:부피로 혼합했다. 샘플을 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고 GloMax® 광도계에서 판독했다. Bmax는 비선형 회귀에 의해 계산했다. 결과는 도 185에 도시되어 있다.
실시예 115
다양한 온도 구배에서 LgTrip 변이체의 열 안정성
LgTrip 변이체는 2ml TBS + 0.01% BSA에 20nM로 희석했다. 100ul의 각 샘플을 96-웰 PCR 플레이트의 이반복 줄에 분주했다(2개 플레이트를 만듦). 플레이트를 Veritas 열순환기에서 높은(75-100℃) 또는 낮은(50-75℃) 온도 구배에서 3시간 동안 인큐베이션했다. 샘플을 70℃에 놓은 다음, 분취량을 다양한 시점에서 실온으로 옮겼다. 샘플을 각 시점에서 피펫으로 혼합한 다음, TBS + 0.01% BSA로 1:100 희석했다. (495ul에 5ul). 그 다음, 각 샘플 25ul를 흰색 검정 플레이트에 분주했다. TBS + 0.01% BSA + 20x 희석된 생세포 푸리마이진 기질 중 200nM pep788 또는 pep900 25ul를 첨가했다. 플레이트를 10분 동안 인큐베이션한 다음 GMM+에서 판독했다. 결과는 도 186에 도시되어 있다.
실시예 116
LgTrip 변이체를 사용한 라파마이신 검정
FKBP_SmTrip9 변이체 및 FRB-SmTrip10의 배양액을 37℃에서 LB + 100ug/ml 암피실린에서 밤새 성장시켰다. 세포를 0.15% 글루코스, 0.1% 람노스 및 100ug/ml 암피실린이 포함된 LB에서 1:20으로 희석했다. 진탕하면서 배양액을 25℃에서 약 20시간 동안 유도했다. PLB 검정 시약은 444 nM의 MagneHis 정제된 LgTrip 변이체, 90x 희석된 FRB-SmTrip10 배양액, +/- 35 nM 라파마이신으로 제조했다. 90 마이크로리터의 검정 시약을 96-웰 검정 플레이트의 각 웰에 첨가했다. FKBP_SmTrip9 배양액을 PLB에 1:10으로 희석하고 10ul를 검정 플레이트에 첨가했다. 샘플을 실온에서 30분 동안 인큐베이션했다. 50 uM 푸리마진을 함유하는 100 마이크로리터의 Nano-Glo를 검정 플레이트 웰에 첨가하고 5분 후에 GloMax® 광도계에서 발광을 판독했다. 결과는 도 187에 도시되어 있다.
실시예 117
Pep691 및 Pep692의 Kd 및 Bmax 결정
LgTrip 3546을 OptiMEM + 10% FBS에 1nM로 희석했다. 가닥 9 펩타이드 521 및 693의 12μM 용액을 OptiMem+10% FBS에 제조했다. 각 가닥 9 희석액을 사용하여 20μM에서 시작하는 각 가닥 10 펩타이드의 3배 희석 시리즈를 제조했다. (pep86=HiBiT, pep289=VS HiBiT, pep691=HiBiT RR, pep692=VSHiBiT RR). 각 희석 시리즈 90μl를 흰색 검정 플레이트로 옮긴 다음, LgTrip 3546의 1μM 스톡 10μl를 첨가했다. 플레이트를 30분 동안 600RPM으로 설정된 궤도 진탕기에 놓았다. 10mM DTT 및 50uM 푸리마진으로 이루어진 OptiMEM+10% FBS의 검출 시약을 제조하고 11μl를 샘플에 첨가했다. 플레이트를 궤도 진탕기에 놓고 실온에서 5분 동안 혼합했다. 플레이트는 GloMax® Multi+ 광도계에서 판독했다. Kd 및 Bmax는 GraphPad Prism 1 부위 특이적 결합을 사용하여 계산했다. 결과는 도 188에 도시되어 있다.
실시예 118
단량체 LgBiT-SmBiT 클론의 정제
각 단량체 LgBiT-SmBiT 클론의 단리된 콜로니의 50ml 배양액을 LB+30ug/ml 카나마이신에서 37℃ 하에 20시간 동안 성장시켰다. 그 다음, 배양액을 30ug/ml 카나마이신, 0.1% 람노스 및 0.15% 글루코스가 보충된 LB에 1:100(50ml 중 500ul)으로 희석하고 25℃에서 20시간 동안 성장시켰다. 배양액을 회전시키고 9ml의 100mM Hepes pH 7.5 + 1ml FastBreak™ 세포 용해 시약(Promega; V8571) + 200ul RQ DNase 1(Promega)에 재현탁했다. 샘플을 궤도 혼합기에서 30분 동안 4℃에서 인큐베이션했다. "전체 용해액" 샘플을 위해 분취량을 저장했다. 샘플을 회전시켜 용해액을 청징화하고(15분 동안 7000RPM), 상청액을 새 튜브로 옮겼다. HisLink™ 회전 단백질 정제 시스템(Promega; V8550)을 사용하여, HisLink™ 단백질 정제 수지 1ml을 각각 청징화된 용해액에 첨가하고, 궤도 혼합기에서 4℃ 하에 10분간 인큐베이션하고 HisLink 세척/결합 완충액으로 3회 세척하고, 500ul 용출 완충액으로 2회 용출시켜 샘플을 회수한다.
도 189는 각 단량체 LgBiT-SmBiT 클론으로부터 수득되는 가용성 및 정제된 단백질의 양을 보여주고, 표 12는 사용된 작제물을 열거한다.
표 12. 작제물
Figure pct00009
실시예 119
단량체 LgBiT-SmBiT 클론의 발광 결정
실시예 118로부터 정제된 단량체성 LgBiT-SmBiT 단백질은 TBS + 0.01% BSA에 0.2nM로 희석했다. 그 다음, 희석된 단백질을 NanoGlo® 완충액(Promega; N112) 중 푸리마진(Promega; N113) 50ul과 합했다. 기질 첨가 3분 후에 GMM+에서 발광을 판독했다.
도 190은 NanoLuc(ATG-462)가 단량체 LgBiT-SmBiT 단백질보다 2배 더 밝음을 입증한다.
실시예 120
단량체 LgBiT-SmBiT 클론에 의한 기질 활용
실시예 118로부터 정제된 단량체 LgBiT-SmBiT 단백질을 TBS + 0.01% BSA에 0.2nM로 희석했다. NanoGlo® 완충액(Promega; N112) 중 푸리마진(Promega; N113)을 50uM(2ml 중 40ul)에서 시작하여 1ml 대 1ml로 희석한 2배 희석 시리즈를 제조했다. 각각 정제된 LgBiT-SmBiT 단량체 50ul를 적정된 기질 시리즈 50ul와 이반복으로 합했다. 샘플을 실온에서 3분 동안 인큐베이션하고, GMM에서 발광을 판독했다.
도 191은 각 단량체 LgBiT-SmBiT 단백질이 푸리마진을 유사하게 활용함을 입증한다.
실시예 121
온도 구배
단량체 LgBiT-SmBiT 변이체에 대한 온도의 영향을 결정하기 위해 본원의 실시양태를 개발하는 동안 실험을 수행했다.
실시예 118로부터 정제된 단량체성 LgBiT-SmBiT 단백질을 TBS + 0.01% BSA에 2nM로 희석했다. 그 다음, 각 희석된 샘플을 96-웰 PCR 플레이트의 다수 웰에 분주했다. 플레이트를 온도 구배를 갖는 열순환기 세트에 30분 동안 두었다:
온도 구배 A: 54, 57, 60, 63, 66, 70℃,
온도 구배 B: 55, 60, 65, 70, 75, 80℃, 또는
온도 구배 C: 65, 70, 75, 80, 85, 90℃.
30분 인큐베이션 후, 각 샘플 5ul를 TBS + 0.01% BSA 45ul와 합하고, NanoGlo® 완충액 중 푸리마진 50ul를 첨가하고, 실온에서 3분 동안 인큐베이션하고, GMM+에서 발광을 검출했다.
도 192는 단량체 LgBiT-SmBiT 단백질이 NanoLuc(ATG-462)에 비해 훨씬 더 안정적임을 입증한다.
실시예 122
온도 도전
단량체 LgBiT-SmBiT 변이체에 대한 고온의 영향을 결정하기 위해 본원의 실시양태를 개발하는 동안 실험을 수행했다.
실시예 118로부터 정제된 단량체성 LgBiT-SmBiT 단백질을 TBS + 0.01% BSA에서 2nM로 희석했다. 그 다음, 각각 희석된 샘플을 96웰 PCR 플레이트의 다수 웰에 분주했다. 이 플레이트는 75, 80, 85, 90, 95, 100℃의 온도 구배를 갖는 열순환기 세트에 30분 동안 두었다.
30분 인큐베이션 후, 각 샘플 5ul를 TBS + 0.01% BSA 45ul와 합하고, NanoGlo® 완충액 중 푸리마진 50ul를 첨가하고, 실온에서 3분 동안 인큐베이션하고, GMM+에서 발광을 검출했다.
도 193은 단량체 LgBiT-SmBiT 단백질에서 159S 아미노산 변화(ATG-3564)보다 향상된 열안정성을 제공하는 159G 아미노산 변화(ATG-3563)가 NanoLuc(ATG-462)에 비해 유의적으로 더욱 안정적임을 입증한다.
실시예 123
60℃에서 단량체 LgBiT-SmBiT의 안정성
60℃에서 단량체성 LgBiT-SmBiT 변이체의 안정성을 결정하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다.
실시예 118로부터 정제된 단량체성 LgBiT-SmBiT 단백질을 TBS + 0.01% BSA에서 2nM로 희석했다. 그 다음, 각 희석된 샘플을 96-웰 PCR 플레이트의 다수 웰에 분주하고 60℃로 설정된 열순환기에 플레이트를 두었다. 다양한 시점에서 분취량을 제거하고 얼음 위에 보관했다. 모든 샘플이 수집된 시점 후, 샘플은 RT로 평형화했다.
일단 평형화되면, 각 샘플 5ul를 TBS + 0.01% BSA 45ul와 합하고, NanoGlo® 완충액 중 푸리마진 50ul를 첨가하고, 실온에서 3분 동안 인큐베이션하고, GMM+에서 발광을 검출했다.
도 194는 온도 구배 검정과 일관된 결과를 입증한다. 단량체 LgBiT-SmBiT 변이체는 NanoLuc보다 더 안정적이다.
실시예 124
승온에서 시약을 사용한 단량체 LgBiT-SmBiT의 안정성
승온에서 시약을 사용하여 단량체 LgBiT-SmBiT 변이체의 안정성을 결정하기 위해 본원의 실시양태를 개발하는 동안 실험을 수행했다.
실시예 118로부터 정제된 단량체성 LgBiT-SmBiT 단백질을 TBS + 0.01% BSA에 200nM로 희석한 다음, 0.2nM(4ml 중 4ul)로 추가로 희석했다. 50ul의 ATG-462 또는 ATG-3564를 NanoGlo™ 완충액 중 50uM 푸리마진 50ul 또는 TBS + 0.01% BSA 중 20uM 푸리마진 50ul와 혼합하고 박벽의 96웰 PCR 플레이트의 웰에 넣었다. 트레이를 55, 60, 65, 70, 75, 80℃의 온도 구배로 설정된 Veritas 열순환기에 넣었다. 다양한 시점(도 195)에서 또는 30분 후(도 196), 분취물을 제거하고 GMM+에서 발광을 검출했다.
실시예 125
NanoLuc 변이체의 Kd 및 Vmax 결정
정제된 NanoLuc 변이체를 TBS + 0.01% BSA에서 0.2nM로 희석했다. NanoLuc® 완충액 중 푸리마진의 2배 희석 시리즈는 50uM(2ml 중 40ul)에서 시작하고, 그 다음 1ml 대 1ml로 희석한다. 샘플 50ul를 이반복으로 적정 시리즈 50ul와 혼합했다. 샘플을 실온에서 3분 동안 인큐베이션하고 GMM+에서 발광을 검출했다(도 197).
실시예 126
NanoLuc 변이체의 온도 도전
NanoLuc 변이체에 대한 고온의 영향을 결정하기 위해 본원의 실시양태를 개발하는 동안 실험을 수행했다.
정제된 NanoLuc 변이체 단백질을 TBS + 0.01% BSA에 2nM로 희석했다. 그 다음, 각 희석된 샘플을 2개의 96-웰 PCR 플레이트의 다수 웰에 분주했다. 플레이트를 60, 65, 70, 75, 80, 85℃의 온도 구배를 갖는 열순환기 세트에 30분 동안 두었다.
30분 인큐베이션 후, 각 샘플 5ul를 TBS + 0.01% BSA 45ul와 합하고, NanoGlo® 완충액 중 푸리마진 50ul를 첨가하고, 실온에서 3분 동안 인큐베이션하고, GMM+에서 발광을 검출했다(도 198).
온도 도전은 상기 온도 도전에서 식별된 가장 안정적인 클론을 사용하여 더 높은 온도 구배 70, 75, 80, 85, 90, 95℃에서 반복했다(도 199).
실시예 127
세포 기반 전위 검정을 위한 융합체의 문맥에서 ATG-5333 및 ATG-5344에 대한 변이체 스크리닝
a) 발광 검출
각 변이체의 배양액은 200ul LB + 암피실린 배지에 채취한 단일 콜로니로부터 96웰 플레이트의 웰로 시작하고, 진탕하면서 37℃에서 20시간 동안 성장시켰다. 다음날 유도 배양액은 배양액 10ul를 LB + 100ug/ml 암피실린 + 0.1% 람노스 200ul에 희석하여 제조하고 37℃에서 3시간 동안 성장시켰다. 유도된 배양액로부터 용해액을 다음과 같이 제조했다: 10ul의 세포를 190ul의 수동 용해 완충액(PLB)(0.3X PLB+25mM HEPES pH 7.5)으로 옮기고 5분 동안 인큐베이션했다. 50ul의 용해액을 2개의 검정 플레이트로 옮기고 6uM 또는 0.2uM(최종 3uM 또는 0.1uM)의 Pep289와 함께 50ul의 PLB 검정 완충액 + 20uM 푸리마진을 첨가했다. 검정 플레이트를 5분 동안 인큐베이션한 후, 발광을 측정했다. 비율은 3uM 샘플의 RLU를 0.1uM 샘플의 RLU 값으로 나누어 계산했다.
표 13. ATG-5333에 대한 변이체
Figure pct00010
표 14. ATG-5344에 대한 변이체
Figure pct00011
b) Pep289를 사용한 Kd 및 Bmax 계산
2ml의 유도 배지(LB+100ug/ml AMP+0.1% 람노스)에 각 변이체의 밤샘 배양 100ul를 접종했다. 세포를 37℃에서 3시간 동안 성장시켰다. 250ul의 세포를 5ml의 PLB에 희석하고 실온에서 약 10분 동안 인큐베이션했다. PLB(80ul) 중 20uM Fz 20ml를 제조하고, Pep289의 3가지 3X 적정 시리즈를 Fz 시약에 제조했다(2ml 중 50 uM)(990ul에 5mM 샘플 10ul, 그 다음 700ul에 300ul, 그 다음 3-희석 시리즈를 합했다. 50ul의 세포 용해액을 50ul의 Pep289 적정액과 합하고, 5분 동안 인큐베이션한 다음, GMM+에서 발광을 판독했다.
표 15. LgBiT 돌연변이에 대한 계산된 Bmax 및 Kd
Figure pct00012
실시예 128
ATG-5534 주형의 부위 포화
ATG-5534(서열번호 978)의 다양한 위치에서 아미노산의 정체를 최적화하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다.
a) E.콜라이 배양액은 200ul LB + 암피실린 배지에 채취된 단일 콜로니로부터 96웰 플레이트의 웰로 시작하여 진탕하면서 37℃에서 20시간 동안 성장시켰다. 다음 날, 10ul의 배양액을 200ul의 LB+100ug/ml 암피실린+0.1% 람노스에 희석하여 유도 배양액을 제조하고 37℃에서 3시간 동안 성장시켰다. 유도된 배양액로부터 용해액을 다음과 같이 제조했다: 10ul의 세포를 190ul의 PLB 용해 완충액(0.3X PLB + 25mM HEPES pH 7.5)으로 옮기고 5분 동안 인큐베이션했다. 50ul의 용해액을 2개의 검정 플레이트로 옮기고 6uM 또는 0.2uM(최종 3uM 또는 0.1uM)의 pep289와 함께 50ul의 PLB 검정 완충액 + 20uM 푸리마진을 첨가했다. 검정 플레이트를 5분 동안 인큐베이션한 후, 발광을 측정했다. Bmax 및 Kd 값은 각 돌연변이체에 대해 결정했다.
표 16. LgBiT 돌연변이체 ATG-5810의 위치 44에서 부위 포화에 대해 계산된 Bmax 및 Kd
Figure pct00013
b) E. 콜라이 및 포유동물 세포에서의 비교
i) E. 콜라이(Kd 및 Bmax)
2ml의 유도 배지(LB+100ug/ml AMP+0.1% 람노스)에 각 돌연변이체에 대한 밤샘 배양액 100ul를 접종했다. 세포를 튜브에서 37℃ 하에 3시간 동안 성장시켰다. 250ul의 세포를 5ml의 PLB 용해 완충액에 희석하고 실온에서 약 10분 동안 인큐베이션했다. PLB 용해 완충액(80ul) 중 20uM 푸리마진 20ml를 제조하고, 푸리마진 시약에 pep289의 3X 적정 시리즈(2ml에 50uM)(990ul에 5mM 샘플 10ul, 그 다음 700ul에 300ul, 3-희석 시리즈를 합함)를 제조했다. 50ul의 세포 용해액을 50ul의 pep289 적정액과 혼합하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션한 다음, GMM+에서 발광을 판독했다.
ii) 포유동물 세포 발현
a) 형질감염 프로토콜: T-150 플라스크에서 융합성일 때까지 성장한 HeLa 세포(PKCα-HiBiT 클론)의 배지를 흡인하고, 세포를 10ml DPBS로 세척했다. (Life Technologies 14190). DPBS를 흡인하고 4ml의 TryPLE Express Trypsin(Life Technologies 12604)을 첨가했다. 세포를 37℃에서 2 내지 3분 동안 인큐베이션한 다음, 16ml의 성장 배지(DMEM Life Technologies 11995) + 10% FBS(VWR 89510-194)에 재현탁시켰다. 세포를 5분 동안 200RPM에서 회전시키고, 상청액을 흡인하고, 20ml의 DMEM+10% FBS를 첨가했다. 세포를 계수한 다음, ml당 1,000,000개 세포로 희석했다. 3mL의 DMEM + 10% FBS와 1mL의 세포를 6cm 접시에 플레이팅하고 24시간 동안 인큐베이션했다.
b) 형질감염 복합체: 테스트할 각 DNA 샘플에 대해 10ug의 DNA(1ug의 DNA 암호화 막 센서 및 9ug의 운반체 DNA)(Promega E4882)를 400ul의 OptiMem(Life Technologies 11058)과 합쳐서 혼합하고, 30ul의 FugeneHD 형질감염 시약(Promega E2311)을 첨가하고, 주변 온도에서 10분 동안 인큐베이션했다. 형질감염 복합체를 플레이팅된 세포에 첨가하고 24시간 동안 인큐베이션했다.
c) 세포 기반 발광 검정: 형질감염된 세포 HeLa 세포로부터 배지를 흡인한 후, 세포를 5ml DPBS로 세척했다. (Life Technologies 14190). DPBS를 흡인시키고 0.75ml의 TryPLE Express Trypsin(Life Technologies 12604)을 첨가했다. 세포를 37℃에서 2-3분 동안 인큐베이션한 다음, 4ml의 성장 배지(DMEM Life Technologies 11995) + 10% FBS(VWR 89510-194)에 재현탁시켰다. 100μl의 각 샘플을 흰색 96웰 검정 플레이트(Corning 3917)의 각 웰에 첨가했다. 각 샘플에 대해 총 30개 웰을 사용했고, 3줄에 줄마다 10개의 웰이 있다. 세포를 추가 16 내지 24시간 동안 인큐베이션했다.
다음날 아침, 성장 배지를 흡인시키고 90μl의 CO2 독립 배지(Life Technologies 18045) + 1.1x NanoGlo® 생세포 기질(Promega N2012)를 함유하는 10% FBS로 교체하고 10분 동안 인큐베이션하고 적정된 PMA 화합물 10μl를 각 웰에 첨가했다. (예를 들어, 도 225 내지 227 참조). 37℃로 설정된 GlomaxMulti+ 광도계에서 발광을 검출했고, 1시간 동안 동역학을 실행했다. 달리 명시되지 않는 한, 기록된 발광은 동역학 실행의 피크 높이이다.
표 17. ATG-5534에 대해 정규화된 RLU, S/B, Bmax 및 Kd 값
Figure pct00014
실시예 129
가닥 9 검출기 폴리펩타이드
LgTrip 폴리펩타이드의 N-말단에 가닥 10 서열을 배치하여 폴리펩타이드 작제물을 제조했다. 이 구성은 가닥 9 서열의 존재 하에 증가된 발광을 생성한다. 테스트되는 가닥 9 펩타이드(pep521 및 pep840)에 대한 검출 한계를 결정하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다.
a) pep521 및 pep840을 이용한 가닥 9 검출기 단백질
각 가닥 9 검출기 단백질은 TBS + 0.01% BSA에 20nM로 희석했다. pep521 및 pep840의 3X 희석 시리즈는 20μM에서 시작하여 TBS + 0.01% BSA에 희석했다. 이반복으로 각 효소 희석액 50ul를 각 펩타이드 적정액 50ul와 합하고 사전 평형을 위해 진탕기에서 10분 동안 인큐베이션했다. Nano-Glo 생세포 기질(푸리마진; Promega; N205)를 TBS+0.01% BSA에 30배 희석하여 검정 완충액을 제조하고, 각 웰에 100ul를 첨가하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션한 다음, 발광을 GMM+에서 판독했다. 펩타이드가 함유되지 않은 샘플에서 배경 판독값을 얻었다.
도 200은 3개의 가닥 9 검출기 단백질이 전부 521보다 pep840에 더 단단하게 결합되었음을 보여준다.
b) pep840을 이용한 가닥 9 검출기 단백질
각 가닥 9 검출기 단백질은 TBS + 0.01% BSA에서 200nM로 희석했다. pep840의 3X 희석 시리즈는 0.5uM에서 시작하여 TBS + 0.01% BSA에 희석했다. 50ul의 각 효소 희석액을 4반복으로 각 펩타이드 적정액 50ul와 합하고 사전 평형을 위해 진탕기에서 10분 동안 인큐베이션했다. Nano-Glo 생세포 기질(푸리마진; Promega; N205)을 TBS+0.01% BSA에 30배 희석하여 검정 완충액을 제조하고, 각 웰에 100ul를 첨가하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션한 다음, 발광을 GMM+에서 판독했다. 펩타이드가 함유되지 않은 샘플에서 배경 판독값을 얻었다.
도 20에서, 왼쪽 패널은 50nM의 3개의 가닥 9 검출기 작제물의 존재하에 가닥 9 펩타이드 840의 적정을 보여준다. 오른쪽 패널은 각 가닥 9 검출기에 대한 배경(펩타이드 840 없음)과 각 가닥 9 검출기에 대해 0.1nM 펩타이드 840에서 신호 대 배경 비율을 보여준다.
실시예 130
링커 테스트 시리즈
a) 원형 치환된 가닥 9 검출기 변이체의 밤샘 배양액을 LB + 0.1% 람노스 + 100ug/ml 암피실린에서 1:20(3ml에 150ul)으로 희석하고, 37℃에서 4시간 동안 성장시킨 다음, PLB 용해 완충액(0.3X PLB+25mM HEPES pH 7.5)(PLB 용해 완충액 4.5ml에 용해액 500ul)에 용해시켰다. 검정을 위해, 용해액을 TBS + 0.01% BSA에 1:100으로 희석했다. 10nM에서 시작하여 pep840(가닥 9)의 3배 희석 시리즈를 제조했다. 50ul의 각 희석 용해액을 50ul의 펩타이드 적정액과 합하고 600rpm으로 설정된 진탕기에서 실온에서 20분 동안 인큐베이션했다. 100ul Nano-Glo® 완충액 + 50uM 푸리마진을 각 웰에 첨가하고 발광을 GMM+에서 판독했다. 테스트된 각 작제물에 사용된 링커는 ATG-4992, 8GS; ATG-5485, 5GS; ATG-5486, 6GS; ATG-5487, 7GS; ATG-5488, 9GS; ATG-5489, 10GS; 및 ATG-5490, 11GS였다.
도 202는 5AA 링커를 갖는 ATG-5485를 제외한 각 클론이 ATG-4992와 유사한 발광을 생성하였음을 보여준다. 실험은 가닥 10과 LgTrip 사이의 링커 길이가 가닥 9 서열의 검출에 유의미한 역할을 하지 않았음을 입증한다.
b) 8GS 링커(ATG-4992) 대 11GS(ATG-5490) 링커
ATG-4992 및 ATG-5490 단백질은 MagneHis 정제 시스템을 사용하여 정제했다. (Promega). 4992 및 5490에 대한 정제된 단백질은 CO2 독립 배지 + 10% FBS에서 100nM로 희석했다. 10nM에서 시작하여 pep840의 3배 연속 희석액은 Nano-Glo® 완충액 + 50uM 푸리마진(Promega N113)에서 제조했다. 50ul의 각 효소 희석액을 50ul의 펩타이드 적정액과 함께 4반복으로 합했다. GMM+ 광도계에서 시간 경과에 따라 발광을 측정했다.
도 203은 플로팅된 데이터가 50분 동역학 판독값에서 나온 것이며 더 긴 링커를 갖는 5490이 4992에 비해 2배 더 큰 발광을 제공했음을 보여준다.
실시예 131
ATG-4992 및 ATG-5490 변이체의 Kd 결정
각 변이체의 밤샘 배양액은 LB+100ug/ml 암피실린에서 제조했다. 다음 날, 배양액은 LB + 0.1% 람노스 + 100 ug/ml 암피실린에 1:20(3ml에 150ul)으로 희석했다. 배양액을 37℃에서 4시간 동안 성장시킨 다음, PLB 용해 완충액(0.3X PLB(Promega) + 25mM HEPES pH 7.5)으로 용해시켰다(PLB 용해 완충액 4.5ml에 용해액 500ul). 검정을 위해, 용해액을 TBS + 0.01% BSA에 1:100으로 희석했다. 40uM에서 시작하는 가닥 9(pep840)의 3X 희석 시리즈를 제조했다. 50ul의 적정 시리즈는 각각 희석된 용해액 50ul와 합하고, 600rpm으로 설정된 궤도 진탕기에서 RT에서 20분 동안 인큐베이션하고, 100ul의 Nano-Glo® 완충액 + 50uM 푸리마진(Promega; N113)을 첨가하고, GMM+에서 발광을 판독했다. 결과는 도 204에 도시되어 있다.
실시예 132
ATG-4992 및 ATG-5490 변이체의 비교
ATG-4992 및 ATG-5490 변이체 단백질은 MagneHis 정제 시스템을 사용하여 정제했다.(Promega). 그 다음, 정제된 단백질을 CO2 독립 배지 + 10% FBS에 100nM로 희석했다. 2nM에서 시작하여 pep840의 3배 연속 희석액을 Nano-Glo® 완충액 + 50uM 푸리마진(Promega N113)에서 제조했다. 50ul의 각 효소 희석액을 50ul의 펩타이드 적정액과 3반복으로 합했다. GMM+ 광도계에서 5분마다 발광을 측정했다. 결과는 60분 시점부터 데이터가 플로팅된 도 205에 도시되며, 변이체 5515 및 5517이 더 낮은 계산된 Kd 값을 갖고 있음을 보여주고(실시예 131), pep840과 쌍을 이룰 때 더 높은 RLU 신호 대 배경 값을 보여준다.
실시예 133
ATG-4166 변이체 스크리닝
표 18. 상이한 골격에서의 LgBiT 서열. (단백질 정제 또는 센서 융합체를 위한 C-말단 His 태그(pH 도메인-GSSG-HaloTag-GSSG-LgBiT 돌연변이체).
Figure pct00015
i) Bmax 및 Kd 결정
ATG-4166 변이체 단백질은 MagneHis 정제 시스템(Promega)을 사용하여 정제했다. 이어서 정제된 단백질을 TBS + 0.01% BSA에서 0.2nM로 희석했다. pep289(VS-HiBiT)의 3배 연속 희석액은 400nM에서 시작하는 하나의 시리즈와 20uM에서 시작하는 다른 시리즈로서 TBS+0.01% 터지톨에서 제조했다. 50ul의 각 효소 희석액(0.2nM)을 50ul의 펩타이드 적정액과 합하고 10분 동안 진탕기에서 인큐베이션했다. TBS + 0.01% 터지톨에 250배 희석된 푸리마진(N113) 100ul를 첨가하고 샘플을 다시 5분 동안 진탕기에 두었다. 발광은 GMM+ 광도계에서 측정했다. Bmax 및 Kd를 계산했고, 그 결과를 도 206에 제시했다.
ii) 다양한 pH에서의 활성
ATG-4166 변이체 단백질을 TBS + 0.01% BSA에서 0.2nM로 희석했다. 각 변이체 단백질 샘플에 20uM pep289(VS-HiBiT)를 첨가하고 실온에서 20분 동안 인큐베이션한다. 990ul의 각 pH 완충액을 심부 웰 플레이트의 웰에 첨가했다. 10ul의 푸리마진(N113)을 각 웰에 첨가하고, 50ul의 각 변이 단백질/펩타이드 샘플을 각 웰에 첨가했다. 플레이트를 실온에서 12분 동안 인큐베이션하고, GMM+ 광도계에서 발광을 측정했다. 활성을 계산했고, 그 결과를 도 207에 나타냈다.
pH 완충액 시리즈 제조: 이하 표에 열거된 성분을 400ml의 물에 혼합했다. 30ml의 완충액을 12개의 50ml 튜브에 첨가하고 NaOH 또는 HCl을 사용하여 필요한 pH를 생성했다.
표 19. 범용 pH 완충액을 위한 제형
Figure pct00016
실시예 134
ATG-5823, ATG-5824 및 ATG-5825 변이체 스크리닝
변이체 단백질(ATG-5823, ATG-5824 및 ATG-5825)을 Magne His 정제 시스템(Promega)을 사용하여 정제했다. ATG-5146은 Nickel Sepharose 컬럼이 있는 AKTA를 사용하여 정제했다. 정제된 단백질은 먼저 TBS + 0.01% BSA에 200nM로 희석한 다음, TBS + 0.01% BSA에 0.2nM로 추가로 희석했다. pep263의 3배 희석 시리즈는 TBS + 0.01% BSA + 0.02% 터지톨에서 100nM부터 시작하여 제조했다. 50ul의 각 효소를 50ul의 펩타이드 희석 시리즈와 합했다. 샘플을 궤도 진탕기(600RPM)에서 10분 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 100ul의 LCS(N205; Promega)를 TBS + 0.01% BSA에 1:30으로 희석하고 각 샘플에 첨가했다. 샘플을 실온에서 3분 동안 인큐베이션한 다음, GloMaxMulti+에서 발광을 측정했다. Bmax 및 Kd를 계산했고, 도 208에 도시된 결과는 이러한 변이체에 대해 유사한 Bmax 및 Kd를 보여준다.
실시예 135
ATG-5826 및 ATG-5827 변이체 스크리닝
i. pep86
변이체 단백질(ATG-5826 및 ATG-5827)은 MagneHis 정제 시스템(Promega V8500)을 사용하여 정제했다. 정제된 단백질을 먼저 TBS + 0.01% BSA에서 200nM로 희석한 다음, TBS + 0.01% BSA에 0.2nM로 추가로 희석했다. 1uM 및 100nM에서 시작하여 TBS + 0.01% BSA + 0.02% 터지톨에 pep86의 2가지 2배 적정 시리즈를 제조했다. 50ul의 ATG-5826 및 ATG-5827을 1uM에서 시작하는 50ul의 펩타이드 희석 시리즈와 합했다. 50ul의 LgBiT 단백질(Promega; N401C)을 100nM에서 시작하는 펩타이드 적정 시리즈와 합했다. 샘플을 궤도 진탕기(600RPM)에서 10분 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후 100ul의 LCS(N205; Promega)를 TBS + 0.01% BSA에 1:30으로 희석하고 각 샘플에 첨가했다. 샘플을 실온에서 3분 동안 인큐베이션한 다음, GloMaxMulti+에서 발광을 측정했다. Bmax 및 Kd를 계산하였고, 도 209에 도시된 결과는 이들 변이체에 대해 유사한 Bmax 및 Kd를 보여준다. 가닥 9에 대한 760 서열을 갖는 클론이 유의미하게 더 높은 Kd를 보여주었다. 이것은 760 서열을 함유하는 이들 2개와 같은 변이체가 더 높은 Kd 값을 갖는다는 것을 보여준다.
ii. pep114
변이체 단백질(ATG-5826 및 ATG-5827)은 MageHis 정제 시스템(Promega V8500)을 사용하여 정제했다. 정제된 단백질은 먼저 TBS + 0.01% BSA에 200nM로 희석하고, 그 다음 TBS + 0.01% BSA에 0.2nM로 추가로 희석했다. 1mM에서 시작하는 pep114의 2가지 2배 적정 시리즈를 TBS + 0.01% BSA + 0.02% 터지톨에 제조했다. 50ul의 ATG-5826, ATG-5827 및 LgBiT 단백질(Promega N401C)은 펩타이드 적정 시리즈와 합했다. 샘플을 궤도 진탕기(600RPM)에서 30분 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 100ul의 LCS(N205 Promega)를 TBS + 0.01% BSA에 1:30으로 희석하고 각 샘플에 첨가했다. 샘플을 실온에서 3분 동안 인큐베이션한 다음, GloMaxMulti+에서 발광을 측정했다. Bmax 및 Kd를 계산했고, 도 210에 도시된 결과는 pep86과 비교되는 Bmax 값에 대한 유사한 경향을 보여준다(ATG-5826>LgBiT>ATG-5827). ATG-5826과 ATG-5827은 둘 모두 LgBiT/pep114에 비해 약간 낮은 계산된 Kd 값을 갖지만, LgBiT/HiBiT(pep86)에 비해서는 유의적으로 높은 Kd 값을 갖는다.
실시예 136
ATG-5823, ATG-5824, ATG-5825, ATG-5826 및 ATG-5827 변이체의 SDS-PAGE
각 변이체 단백질은 TBS+1X SDS 로딩 염료에서 0.1ug/ml로 희석했다. 샘플은 70℃로 5분 동안 가열한 다음, 3ul(0.3ug)를 SDS PAGE 겔(BioRad Criterion)에 로딩했다. 결과는 도 211에 도시된다.
실시예 137
3가지 표지화 방법을 사용한 스파이크-인 항체 적정:
NanoTrip, 설프하이드릴-Trip 표지화 및 NHS-CA-HaloTag-Trip 표지화
도 212는 각 표지화 방법의 증거를 제공한다.
i) NanoTrip-유전자 융합
4ug/mL에서 시작하는 2배 항체 적정은 "무 항체" 대조군으로서 24번째 웰을 놔둔 채, PBS+0.01% BSA 또는 PBS+20% 인간 혈청에서 제조했다. (동량의 Sino 항체 D1-D5를 풀링함). 각각의 항체 적정액 50ul를 흰색 검정 플레이트의 웰에 3반복으로 첨가했다. 각 가닥 9 및 10 단백질 및 2μM의 LgTrip과 함께 각 조합에 대한 마스터 혼합물을 제조했다. ATG-5547 및 ATG-5546에 대해서는 125ng/ml을 사용했고, ATG-5541에 대해서는 500ng/ml을 사용했다. 각 조합(ATG-5546+ATG-5541 또는 ATG5547+ATG-5541)에 대한 마스터 혼합물 50ul를 항체 적정액에 첨가하고 실온에서 60분 동안 인큐베이션했다. NanoGlo® 생세포 기질(N205)을 PBS + 0.01% BSA에 1:30으로 희석하여 검출 시약을 만들고 각 샘플에 100ul를 첨가했다. 플레이트를 3분 동안 인큐베이션한 다음, GloMax Discover에서 발광을 측정했다. RLU 판독값을 "무 항체" 대조군으로 나누어 신호/배경 판독값을 얻었다.
ii) 설프하이드릴-Trip 및 NHS-CA-HaloTag-Trip 표지화
도 214는 3가지 다른 NanoTrip 검출 방법이 SARS-COV/COV2 항체를 검출할 수 있음을 보여준다.
Sino 생물학적제제(SARS-CoV/SARS-CoV2 스파이크) 항체:
Figure pct00017
약 50ul의 0.01% PBSA에 제조된 2X RBD 시약 + 2X LgTrip을, 플레이팅된 96웰 검정의 웰에 첨가했다. NHS-CA-HaloTag-Trip 표지화를 위해, RBD 시약은 8ng/ml RBD-HaloTag-HiBiT + 16ng/ml RBD-HaloTag-SmTrip9(pep840) + 1uM LgTrip ATG-5146의 최종 농도/웰로 제조했다. 설프하이드릴-Trip 표지화를 위해, RBD 시약은 15ng/ml RBD-HiBiT + 15ng/ml 설포SE-PEG6-RBD-SmTrip9(pep840)-PSA(도 213) + 1uM LgTrip ATG-5146의 최종 농도/웰로서 제조했다. 0.01% PBSA 또는 0.01% PBSA에 희석된 20% 혈청에 제조된 2X 풀링된 항체 50ul를 각 샘플에 첨가하고 45분 동안 인큐베이션했다. 20uM NanoGlo® 생세포 기질은 0.01% PBSA에서 제조하고, 각 웰에 100ul를 첨가하고, 광도계에서 전체 발광을 판독했다.
실시예 138
SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 적정
항-뉴클레오캡시드 Ab 클론 9547(Meridian Biosciences) 및 항-뉴클레오캡시드 Ab 클론 9548(Meridian Biosciences)은 각각 HaloTag-SmTrip9(pep840) 및 HaloTag-VSHiBiT로 표지화했다. 25ul/웰의 Ab + LgTrip ATG-5146의 4x 칵테일을 비결합 표면 고체 흰색 96웰 미세역가 플레이트(Costar 3600)의 웰에 30ng/ml Ab-SmTrip9 + 60ng/ml Ab-HiBiT + 1uM LgTrip ATG-5146의 최종 농도/웰로 첨가했다. 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(Meridian Biosciences Cat # 9560)의 4x 용액 25ul/웰을 각 웰에 첨가한 다음, 10uM 기질의 최종 농도/웰을 위해 NanoGlo® 생세포 기질의 2x 용액 50ul/웰을 첨가했다. 플레이트를 15분 동안 인큐베이션하고 GlowMax 광도계에서 총 발광을 측정했다.
도 215는 삼원 NanoLuc 표지된 항체가 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질을 검출한다는 것을 입증한다.
실시예 139
비인두 면봉 샘플 중 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 현장 진단 면봉
120ng/ml 항뉴클레오캡시드 항체 HaloTag-SmTrip9, 240ng/ml 항뉴클레오캡시드 항체 HaloTag-HiBiT, 4uM LgTrip ATG-5146, 에탄올 중 40uM 푸리마진, 1.2mM 아조-티오티민(ATT), 1.2mM 아스코르브산, 0.6% 풀루란 w/v, 4.8mM HEPES 완충액 pH 8.0, 21.6mM 글리신, 4.8mM 히스티딘, 6mg/ml 수크로스 및 0.0024% 폴리소르베이트 80을 함유하는 스톡 용액을 생성했다. 100ul의 스톡 용액을 플라스틱 면봉 재킷에 분배하고 4.0℃로 미리 설정된 선반을 갖는 동결건조기(Virtis Genesis 12EL)에 로딩했다. 시스템을 배기시킨 후, -25℃와 +25℃의 선반 온도 사이에서 동결건조 공정을 수행했다. 얼음 승화 단계를 8시간 지속했고 결합수 탈착 단계를 16시간 지속했다. 동결건조 공정이 끝나면, 면봉에 N°를 다시 채우고 두 번째 플라스틱 면봉 재킷을 수동으로 삽입하여 밀봉했다.
동결건조된 검정 시약을 함유하는 면봉은 그 다음 비인두 면봉 샘플 100ul + 0.01% BSA를 함유하는 PBS 300ul로 재수화시켰다. 총 발광은 수동식 광도계(Prom4ega)에서 15분, 30분, 45분 및 60분째에 측정하고, 플로팅했다.
도 216은 음성으로 확인된 3개의 PCR(NS46, NS47 및 NS52) 및 양성 샘플로 확인된 3개의 PCR(PS46, PS49 및 PS56)의 결과를 보여준다.
실시예 140
플루오로-Fz가 포함된 단량체 NanoBiT
테스트되는 각 효소는 TBS + 0.01% BSA에 희석했다. 푸리마진(N205) 또는 JRW-1677을 이용한 적정 시리즈는 TBS(20uM에서 시작) 또는 NanoGlo® 완충액(25uM에서 시작; Promega N112)으로 만들었다. 각 기질을 TBS+0.01% BSA 또는 NanoGlo® 완충액으로 연속 희석했다. 각 효소 희석액 50ul를 각 기질 적정액 50ul와 합했다. 플레이트를 3분 동안 인큐베이션한 다음, GMM+ 광도계에서 발광을 측정했다. GraphPad Prism을 사용하여 Michaelis-Menten 최소 자승법을 사용하여 비선형 회귀를 생성했다.
도 217은 푸리마진 및 JRW-1667에 대한 동역학 매개변수(Vmax 및 Km)를 제공한다. NanoLuc(ATG-462)은 TBS를 기질 희석에 사용할 때 단량체성 NanoBiT 작제물에 비해 푸리마진 및 JRW-1667 둘 모두에 의해 더 높은 RLU 값을 생성했다(약 10 내지 20배). NanoLuc 및 단량체성 작제물은 푸리마진/NanoGlo® 완충액에서 유사한 RLU 값을 보였지만, NanoLuc만은 JRW-1667에 의해 개선된 발광을 보여주었다. 단량체성 NanoBiT 작제물은 푸리마진 및 JRW-1667 둘 모두에 의해 더 낮은 RLU 값을 보여주었지만, RLU 값은 두 완충액 및 두 기질에 대해 유사했다.
Km 값은 NanoGlo와 비교하여 TBS+0.01% BSA에서 더 낮았지만, 일반적으로 Km 값은 테스트된 모든 조건에 대해 더 낮은 계산된 Km을 보여주는 ATG-3562(단량체 LgBiT-SmBiT)를 제외하고 각 조건에 대해 유사했다.
실시예 141
포유동물 세포 발현 및 형광 이미지화
형질감염 프로토콜: 세포 제조: T-75 플라스크에서 융합성일 때까지 성장시킨 HeLa 세포로부터 배지를 흡인시키고, 10ml DPBS(Life Technologies 14190)로 세포를 세척했다. DPBS를 흡인시키고 TryPLE Express Trypsin(Life Technologies 12604) 2ml를 첨가했다. 37℃에서 2-3분 동안 세포를 인큐베이션한 다음, 8ml의 성장 배지(DMEM Life Technologies 11995) + 10% FBS(VWR 89510-194)에 세포를 재현탁시켰다. 5분 동안 200RPM에서 세포를 회전시켰다. 상청액을 흡인시키고, 10ml의 DMEM+10% FBS를 첨가했다. 세포를 계수한 다음, ml당 100,000개 세포로 희석했다. 6웰 플레이트의 각 웰에 3mL의 세포를 플레이팅했다. 24시간 동안 세포를 인큐베이션했다.
형질감염 복합체: 테스트되는 각 DNA 샘플을 위해, 2.5μg의 DNA(0.25μg의 DNA 암호화 센서 및 2.25μg의 운반체 DNA)(Promega E4882)와 100ul의 OptiMem(Life Technologies 11058)을 조합하여 혼합했다. 다음으로, Fugene HD 형질감염 시약(Promega E2311) 7.5μl를 첨가하고 형질감염 복합체를 주위 온도에서 10분 동안 인큐베이션했다. 플레이팅된 세포를 함유하는 각 웰에 형질감염 복합체를 첨가했다. 24시간 동안 세포를 인큐베이션했다.
형광 이미지화: 형질감염된 세포를 8웰 챔버 슬라이드(MatTek 유리 바닥)에 재플레이팅했다. 형질감염된 세포 HeLa 세포로부터 배지를 흡인시키고 3ml DPBS로 세포를 세척했다. (Life Technologies 14190). DPBS를 흡입시키고 TryPLE Express Trypsin(Life Technologies 12604) 0.5ml를 첨가했다. 37℃에서 2-3분 동안 세포를 인큐베이션한 다음, 3ml의 성장 배지(DMEM Life Technologies 11995) + 10% FBS(VWR 89510-194)에 세포를 재현탁시켰다. 세포를 계수한 다음, mL당 50,000개 세포로 희석했다. 각 웰당 500μl를 플레이팅했다. BacMam 형질도입에 의해 전달되는 세포 마커를 위해 플레이팅 3시간 후, 10%(v/v)의 CellLight 원형질막-GFP(Thermo Fisher C10607) 또는 CellLight 골지-GFP(Thermo Fisher C10592) 또는 CellLight 리소좀-GFP(Thermo Fisher C10507)를 첨가한다. 추가 16 내지 24시간 동안 세포를 인큐베이션했다.
다음날 아침, 성장 배지를 흡인시키고 400μl의 FluoroBrite DMEM+10%FBS(Life Technologies A1896701)+10% FBS로 교체했다. FluoroBrite DMEM+10%FBS에 Janelia Fluor 549 HaloTag(Promega GA1110)의 5X 희석액을 제조하고, 각 웰에 100μl를 첨가한다. 30분 동안 인큐베이션했다. 500μl FluoroBrite DMEM+10%FBS로 30분 동안 세포를 세척했다. 세포를 적절한 세포 마커로 염색했다. 염색 절차는 제조업체의 권고에 따랐다. 미토콘드리아는 MitoTracker Green FM(Thermo Fisher M7514)으로 염색했다. 소포체는 ER-Tracker Red(Thermo Fisher E34250)를 이용하여 염색한다. 세포는 핵 프로브 NucBlue Live ReadyProbes 시약(Thermo Fisher R37605)으로 대조염색한다. C2 레이저 스캐닝 공초점 현미경(Nikon)으로 세포를 이미지화한다.
결과는 도 218 내지 224에 이미지로 제시되어 있다.
실시예 142
포유동물 세포 발현 및 발광 검정
형질감염 프로토콜: 세포 제조: T-150 플라스크에서 융합성일 때까지 성장시키고 10ml DPBS(Life Technologies 14190)로 세포를 세척한 HeLa 세포(PKCα-HiBiT 클론)로부터 배지를 흡인시켰다. DPBS를 흡인시키고 TryPLE Express Trypsin(Life Technologies 12604) 4ml를 첨가했다. 37℃에서 2-3분 동안 세포를 인큐베이션한 다음, 16ml의 성장 배지(DMEM Life Technologies 11995) + 10% FBS(VWR 89510-194)에 세포를 재현탁시켰다. 5분 동안 200RPM에서 세포를 회전시켰다. 상청액을 흡인시키고, 20ml의 DMEM+10% FBS를 첨가했다. 세포를 계수한 다음, ml당 1,000,000개 세포로 희석했다. 6cm 접시에 세포 1mL와 DMEM+10%FBS 3mL을 플레이팅했다. 24시간 동안 세포를 인큐베이션했다.
형질감염 복합체: 테스트되는 각 DNA 샘플을 위해, 10μg의 DNA(1μg의 DNA 암호화 막 센서 및 9μg의 운반체 DNA)(Promega E4882)와 400ul의 OptiMem(Life Technologies 11058)을 조합하여 혼합했다. 다음으로, FugeneHD 형질감염 시약(Promega E2311) 30μl를 첨가하고 형질감염 복합체를 주위 온도에서 10분 동안 인큐베이션했다. 플레이팅된 세포를 함유하는 6cm 접시에 형질감염 복합체를 첨가했다. 24시간 동안 세포를 인큐베이션했다.
세포 기반 발광 검정: 형질감염된 세포를 96웰 검정 플레이트에 재플레이팅했다. 6cm 접시에서 형질감염된 세포 HeLa 세포로부터 배지를 흡인시키고 5ml DPBS(Life Technologies 14190)로 세포를 세척했다. DPBS를 흡인시키고 TryPLE Express Trypsin(Life Technologies 12604) 0.75ml를 첨가했다. 37℃에서 2-3분 동안 세포를 인큐베이션한 다음, 4ml의 성장 배지(DMEM Life Technologies 11995) + 10% FBS(VWR 89510-194)에 세포를 재현탁시켰다. 흰색 96웰 검정 플레이트의 30개 웰에 각 샘플 100μl를 플레이팅했다. 추가 16 내지 24시간 동안 세포를 인큐베이션했다.
다음날 아침, 성장 배지를 흡인시키고 90μl의 CO2 독립 배지(Life Technologies 18045)+1.1X NanoGlo 생세포 기질(Promega N2012)을 함유하는 10% FBS로 교체했다. 10분 동안 인큐베이션했다. 각 웰에 적정된 PMA 화합물 10μl를 첨가했다. (최종 PMA 농도는 그래프에 제시됨). 37℃로 설정된 GlomaxMulti+ 광도계에 플레이트를 놓고, 1시간 동안 동역학을 실행했다. 다른 언급이 없는 한, 기록된 발광은 동역학 실행의 피크 높이이다.
결과는 도 225 내지 227에 도시된다.
실시예 143
LgTrip 3546 최적화
하기 표 20에 나타낸 바와 같이, LgTrip 3546(서열번호 51)의 다양한 위치에서 아미노산의 정체를 최적화하기 위해 본원의 실시양태의 개발 동안 실험을 수행했다. 각각의 샘플에 대해 E. 콜라이 배양액(200μl)을 제조하고, LB 배지 + 100μg/ml 암피실린에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 그 다음, 배양액을 유도 배지(LB+암피실린+0.1% 람노스)에 20X 농도(200μl에 10μl)로 4반복으로 희석했다. 샘플은 37℃에서 3시간 동안 성장시켰다. 그 다음, 샘플을 0.3X PLB + 25mM HEPES pH 7.5 + 0.001U/ml DNase로 용해시켰다(용해 완충액 250μl에 세포 10μl). 그 다음. 50μl의 용해액을 50μl의 NanoGlo® 완충액 + 50μM 푸리마진 + 50nM의 디펩타이드 788(서열번호 51)과 조합했다. 샘플은 BMG Clariostar 광도계에서 측정했다. RLU 값은 LgTrip 3546(서열번호 51)에 대해 정규화했다.
표 20. LgTrip 3546 최적화를 위한 아미노산 치환
Figure pct00018
Figure pct00019
서열
하기 폴리펩타이드 서열은 각각 N-말단 메티오닌 잔기 또는 상응하는 ATG 코돈을 포함하며; N-말단 메티오닌 잔기 또는 상응하는 ATG 코돈이 결여된 폴리펩타이드 서열은 또한 본원의 범위 내에 있고 참고로 본원에 포함된다.
하기 펩타이드 서열(및 표 1의 펩타이드 서열)에는 각각 N-말단 메티오닌 잔기가 결여되어 있고; N-말단 메티오닌 잔기를 포함하는 펩타이드 서열 역시 본원의 범위 내에 있으며, 본원에 참고로 포함된다.
본원에 기재된 일부 실시양태는 표 1 내의 His-태그화된(또는 His-태그화되지 않은) 서열을 언급하며; 표 1에 나타나거나 열거되지 않은 서열의 비-His-태그화된(또는 His-태그화된) 버전을 활용하는 대안적 실시양태는 본원의 범위에 속하는 것이다.
표 1. 예시적인 펩타이드, 디펩타이드 및 폴리펩타이드 서열.
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
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Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
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Figure pct00037
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Figure pct00040
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Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
Figure pct00061
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
Figure pct00067
Figure pct00068
표 9. 예시적인 펩타이드 서열
Figure pct00069
Figure pct00070
Figure pct00071
Figure pct00072
Figure pct00073
Figure pct00074
Figure pct00075
Figure pct00076
Figure pct00077
Figure pct00078
Figure pct00079
표 10. 예시적인 루시퍼라제 기본 서열
Figure pct00080
Figure pct00081
Figure pct00082
표 11. 예시적인 폴리펩타이드
Figure pct00083
Figure pct00084
5333에 대한 돌연변이
ATG-5538 (I41T) 뉴클레오타이드 (서열번호 934)
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ATG-5538 (I41T) 아미노산 (서열번호 935)
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ATG-5339 (K11N) 뉴클레오타이드 (서열번호 936)
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ATG-5339 (K11N) 아미노산 (서열번호 937)
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ATG-5340 (R152Q) 뉴클레오타이드 (서열번호 938)
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ATG-5340 아미노산 (서열번호 939)
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ATG-5407 V135A 뉴클레오타이드 (서열번호 940)
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ATG-5407 V135A 아미노산 (서열번호 941)
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ATG-5408 D156N 뉴클레오타이드 (서열번호 942)
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ATG-5411 N33K+I155V 뉴클레오타이드 (서열번호 946)
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ATG-5411 N33K+I155V 아미노산 (서열번호 947)
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ATG-5412 I54V+L127A 뉴클레오타이드 (서열번호 948)
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ATG-5412 I54V+L127A 아미노산 (서열번호 949)
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ATG-5413 M44L+V135A 뉴클레오타이드 (서열번호 950)
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ATG-5413 M44L+V135A 아미노산 (서열번호 951)
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ATG-5414 V119A 뉴클레오타이드 (서열번호 952)
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ATG-5416 D9A+H57Q 뉴클레오타이드 (서열번호 954)
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ATG-5419 D19V+M106T+V120L 뉴클레오타이드 (서열번호 960)
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ATG-5420 I41N+E63G 뉴클레오타이드 (서열번호 962)
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ATG-5432 L3H 뉴클레오타이드 (서열번호 966)
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ATG-5434 P93H 뉴클레오타이드 (서열번호 970)
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ATG-5437 S157R 뉴클레오타이드 (서열번호 120)
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ATG-5437 S157R 아미노산 (서열번호 121)
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ATG-5438 H86L 뉴클레오타이드 (서열번호 122)
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ATG-5438 H86L 아미노산 (서열번호 123)
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ATG-5439 M149V 뉴클레오타이드 (서열번호 124)
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ATG-5510 P93H+V135A+R152Q 아미노산 (서열번호 626)
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ATG-5511 P93H+V135G+R152Q 뉴클레오타이드 (서열번호 627)
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ATG-5511 P93H+V135G+R152Q 아미노산 (서열번호 628)
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5344에 대한 돌연변이
ATG-5534 P93H+V135A+R152Q (코돈 최적화된 5510) 뉴클레오타이드 (서열번호 629)
TTCACTTTGGAAGATTTCGTGGGTGACTGGAAACAGACTGCAGCATACAACTTAGACCAAGTGTTGGAACAGGGTGGAGTTAGTTCGCTTTTACAGAATTTGGCAGTTAGTGTTACGCCTATACAACGTATGGTGAGATCGGGAGAAAATGCATTAAAAATAGACATACATGTGATAATACCTTATGAAGGATTATCGGCAGACCAAATGGCACAGATAGAAGAGGTTTTTAAAGTTGTTTACCCAGTTGATGATCATCACTTTAAAGTTATATTACACTATGGAACTTTAGTTATAGACGGTGTGACTCCTAACATGTTAAACTATTTCGGTAGACCTTATGAAGGAATAGCAGTTTTCGACGGAAAGAAAATAACGGTTACTGGTACGTTATGGAACGGAGCCAAGATAATAGACGAGAGATTAATAACGCCAGACGGAAGTATGAGTTTCCAGGTTACGAtaaactcg
ATG-5534 P93H+V135A+R152Q (코돈 최적화된 5510) 아미노산 (서열번호 630)
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ATG-5535 P93H+V135A+R152Q+N156D 뉴클레오타이드 (서열번호 631)
TTCACTTTGGAAGATTTCGTGGGTGACTGGAAACAGACTGCAGCATACAACTTAGACCAAGTGTTGGAACAGGGTGGAGTTAGTTCGCTTTTACAGAATTTGGCAGTTAGTGTTACGCCTATACAACGTATGGTGAGATCGGGAGAAAATGCATTAAAAATAGACATACATGTGATAATACCTTATGAAGGATTATCGGCAGACCAAATGGCACAGATAGAAGAGGTTTTTAAAGTTGTTTACCCAGTTGATGATCATCACTTTAAAGTTATATTACACTATGGAACTTTAGTTATAGACGGTGTGACTCCTAACATGTTAAACTATTTCGGTAGACCTTATGAAGGAATAGCAGTTTTCGACGGAAAGAAAATAACGGTTACTGGTACGTTATGGAACGGAGCCAAGATAATAGACGAGAGATTAATAACGCCAGACGGAAGTATGAGTTTCCAGGTTACGATAGACTCG
ATG-5535 P93H+V135A+R152Q+N156D 아미노산 (서열번호 632)
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ATG-5536 E4D+V135A+R152Q 뉴클레오타이드 (서열번호 633)
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ATG-5536 E4D+V135A+R152Q 아미노산 (서열번호 634)
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ATG-5537 E4D+Q42M+P93H+V135A+R152Q 뉴클레오타이드 (서열번호 635)
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ATG-5537 E4D+Q42M+P93H+V135A+R152Q 아미노산 (서열번호 636)
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5534에 대한 돌연변이
ATG-5652 5534+Y16F Q20P Q152H 뉴클레오타이드 (서열번호 637)
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ATG-5652 5534+Y16F Q20P Q152H 아미노산 (서열번호 638)
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ATG-5653 5534+M106R,Y114F,E4E 뉴클레오타이드 (서열번호 639)
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ATG-5653 5534+M106R,Y114F,E4E 아미노산 (서열번호 640)
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ATG-5654 5534+M44V 뉴클레오타이드 (서열번호 641)
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ATG-5654 5534+M44V (아미노산) (서열번호 642)
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ATG-5655 5534+M44I 뉴클레오타이드 (서열번호 643)
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ATG-5655 5534+M44I 아미노산 (서열번호 644)
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ATG-5656 5534+A35A,P40P,M106R 뉴클레오타이드 (서열번호 645)
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ATG-5656 5534+A35A,P40P,M106R 아미노산 (서열번호 646)
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ATG-5657 5534+M106T 뉴클레오타이드 (서열번호 647)
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ATG-5657 5534+M106T 아미노산 (서열번호 648)
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ATG-5659 5534+M106K+L30L+K136E 뉴클레오타이드 (서열번호 649)
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ATG-5659 5534+M106K+L30L+K136E 아미노산 (서열번호 650)
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ATG-5660 5534+V36G,N50N,A14A 뉴클레오타이드 (서열번호 651)
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ATG-5660 5534+V36G,N50N,A14A 아미노산 (서열번호 652)
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ATG-5661 5534+A15A,A67A,M106L,L107L,I138K 뉴클레오타이드 (서열번호 653)
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ATG-5661 5534+A15A,A67A,M106L,L107L,I138K 아미노산 (서열번호 654)
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ATG-5662 5534+D5G, A35T, L92F, D100V, R141G, L1142S 뉴클레오타이드 (서열번호 655)
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ATG-5662 5534+D5G, A35T, L92F, D100V, R141G, L1142S 아미노산 (서열번호 656)
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ATG-5676 5534+M44K 뉴클레오타이드 (서열번호 657)
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ATG-5676 5534+M44K 아미노산 (서열번호 658)
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ATG-5677 5534+M44E 뉴클레오타이드 (서열번호 659)
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ATG-5677 5534+M44E 아미노산 (서열번호 660)
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ATG-5678 5534+M44A 뉴클레오타이드 (서열번호 661)
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ATG-5678 5534+M44A 아미노산 (서열번호 662)
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ATG-5679 M44C 뉴클레오타이드 (서열번호 663)
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ATG-5679 M44C 아미노산 (서열번호 664)
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실시예 52- 원형 치환된 LgBiT
ATG-4992 PEP78-8GS-LGTRIP3546-6HIS 뉴클레오타이드 (서열번호 721)
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ATG-4993 PEP79-8GS-LGTRIP3546-6HIS 아미노산 (서열번호 724)
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ATG-5490 PEP78-11GS-LGTRIP3546-6HIS 아미노산 (서열번호 758)
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ATG-5513 4992+R112H+K123E 아미노산 (서열번호 760)
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ATG-5546 IL6-3xFlag-optRBD-15GS-SmTrip9 (840) 뉴클레오타이드 (서열번호 971)
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ATG-5546 아미노산 (서열번호 972)
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ATG-5541 뉴클레오타이드 IL6-VSHiBiT-optRBD-3xFlag (서열번호 973)
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ATG-5541 아미노산 (서열번호 974)
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ATG-5547 뉴클레오타이드 IL6-SmTrip9 (840)-optRBD-3xFlag (서열번호 975)
atgaactccttctccacaagcgccttcggtccagttgccttctccctgggcctgctcctggtgttgcctgctgccttccctgccccaggcaagctcctgttcacggtaaccatcgagaagtataaggggagctccggtggtggcgggagcggaggtggaggctcgagcggtagagtccaacctactgaatctattgttagatttcctaatattactaatctttgtccttttggcgaggtgttcaatgccaccagattcgcctctgtgtacgcctggaaccggaagcggatcagcaattgcgtggccgactactccgtgctgtacaactccgccagcttcagcaccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaacgacctgtgcttcacaaacgtgtacgccgacagcttcgtgatccggggagatgaagtgcggcagattgcccctggacagacaggcaagatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttcaccggctgtgtgattgcctggaacagcaacaacctggactccaaagtcggcggcaactacaattacctgtaccggctgttccggaagtccaatctgaagcccttcgagcgggacatctccaccgagatctatcaggccggcagcaccccttgtaacggcgtggaaggcttcaactgctacttcccactgcagtcctacggctttcagcccacaaatggcgtgggctatcagccctacagagtggtggtgctgagcttcgaactgctgcatgcccctgccacagtgtgcggccctaagaaaagcaccaatctcgtgaagaacaaatgcgtgaacttcgactacaaagaccatgacggtgattataaagatcatgacatcgattacaaggatgacgatgacaag
ATG-5547 아미노산 (서열번호 976)
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ATG-5534 뉴클레오타이드 (서열번호 977)
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ATG-5534 아미노산 (서열번호 978)
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LgBiT* 아미노산 (서열번호 979)
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HaloTag-LgBiT* 아미노산 (서열번호 980)
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LgBiT*-막 센서 아미노산 (서열번호 981)
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LgBiT*-핵 센서 아미노산 (서열번호 982)
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LgBiT*-미토콘드리아 센서 아미노산 (서열번호 983)
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LgBiT*-소포체 센서 아미노산 (서열번호 984)
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LgBiT*-골지 센서 아미노산 (서열번호 985)
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LgBiT*-리소좀 센서 아미노산 (서열번호 986)
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tggaaacaga cagccgccta caacctggac 60 caagtccttg aacagggagg tgtgtccagt ttgctgcaga atctcgccgt gtccgtaact 120 ccgatccaaa ggatggtccg gagcggtgaa aatgccctga agatcgacat ccatgtcatc 180 atcccgtatg aaggtctgag cgccgaccaa atggcccaga tcgaagaggt gtttaaggtg 240 gtgtaccctg tggatgatca tcactttaag gtgatcctgc cctatggcac actggtaatc 300 gacggggtta cgccgaacat gctgaactat ttcggacggc cgtatgaagg catcgccgtg 360 ttcgacggca aaaagatcac tgtaacaggg accctgtgga acggcgtcaa aattatcgac 420 gagcgcctga tcacccccga cggctccatg tccttccgag taaccatcaa ccgc 474 <210> 121 <211> 158 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 121 Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Lys Gln Thr Ala Ala 1 5 10 15 Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser Leu Leu 20 25 30 Gln Asn Leu Ala Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Met Val Arg Ser 35 40 45 Gly Glu Asn Ala Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr Glu 50 55 60 Gly Leu Ser Ala Asp Gln Met Ala Gln Ile Glu Glu Val Phe Lys Val 65 70 75 80 Val Tyr Pro Val Asp Asp 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sequence <220> <223> Synthetic <400> 211 Met Val Ser Gly Trp Arg Leu Phe Lys Lys Ile Ser His His His His 1 5 10 15 His His His His Phe Thr Leu Asp Asp Phe Val Gly Asp Trp Glu Gln 20 25 30 Thr Ala Ala Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser 35 40 45 Ser Leu Leu Gln Asn Leu Ala Val Ser Val Thr Pro Ile Met Arg Ile 50 55 60 Val Arg Ser Gly Glu Asn Ala Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile 65 70 75 80 Pro Tyr Glu Gly Leu Ser Ala Asp Gln Met Ala Gln Ile Glu Glu Val 85 90 95 Phe Lys Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu 100 105 110 Pro Tyr Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Lys Leu Asn 115 120 125 Tyr Phe Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys 130 135 140 Ile Thr Thr Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu 145 150 155 160 Arg Leu Ile Thr Pro Asp 165 <210> 212 <211> 510 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 212 atgaaacatc accatcacca tcatgtgagc ggctggcggc tgttcaagaa gattagcggc 60 agctccggtt tcacactcga cgatttcgtt ggggactggg aacagacagc cgcctacaac 120 ctggaccaag tccttgaaca gggaggtgtg tccagtttgc tgcagaatct cgccgtgtcc 180 gtaactccga tcatgaggat tgtccggagc ggtgaaaatg ccctgaagat cgacatccat 240 gtcatcatcc cgtatgaagg tctgagcgcc gaccaaatgg cccagatcga agaggtgttt 300 aaggtggtgt accctgtgga tgatcatcac tttaaggtga tcctgcccta tggcacactg 360 gtaatcgacg gggttacgcc gaacaagctg aactatttcg gacggccgta tgaaggcatc 420 gccgtgttcg acggcaaaaa gatcactacc acagggaccc tgtggaacgg caacaaaatt 480 atcgacgagc gcctgatcac ccccgactaa 510 <210> 213 <211> 169 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 213 Met Lys His His His His His His Val Ser Gly Trp Arg Leu Phe Lys 1 5 10 15 Lys Ile Ser Gly Ser Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asp Phe Val Gly Asp 20 25 30 Trp Glu Gln Thr Ala Ala Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly 35 40 45 Gly Val Ser Ser Leu Leu Gln Asn Leu Ala Val Ser Val Thr Pro Ile 50 55 60 Met Arg Ile Val Arg Ser Gly Glu Asn Ala Leu Lys Ile Asp Ile His 65 70 75 80 Val Ile Ile Pro Tyr Glu Gly Leu Ser 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agctcgttgg aggtggtcat 540 ttgcacgtaa atttcaagac aacttacaag agcaaaaaac ccgtaaaaat gcccggggtt 600 cattacgttg acagaaggct tgaacgcata aaggaagctg ataacgagac atacgtggag 660 cagtacgagc acgccgttgc ccggtactca aacctggggg gtggctttac actggaggat 720 tttgtgggag attggagaca gacagccggc tacaatctgg atcaggtgct ggaacaagga 780 ggagtgtctt ctctgtttca gaatctggga gtgagcgtga cacctatcca gaggatcgtg 840 ctgtctggcg agaatggact gaagatcgat attcacgtga tcatccccta cgaaggcctg 900 tctggagacc agatgggcca gattgagaag atcttcaaag tggtgtatcc tgtggacgat 960 caccacttca aggtgatcct gcactacggc accctggtga ttgatggagt gacacctaac 1020 atgatcgact acttcggaag accttacgag ggaatcgccg tgttcgacgg aaagaagatc 1080 accgtgacag gaacactgtg gaatggaaac aagatcatcg acgagcggct gatcaaccct 1140 gatggatctc tgctgttcag agtgaccatc aacggagtga caggatggag actgtgcgag 1200 agaattctgg ctagacatga gctaatcaag gaaaatatga gaagtaagct atacttagag 1260 gggtccgtca acggtcacca gtttaaatgc actcatgaag gtgaggggaa accttatgaa 1320 ggtaagcaga ctaatcgaat aaaagtggtc gagggcggtc ctctgccatt cgctttcgat 1380 attctggcca ctcactttat gtatgggtct aaggtcttta ttaaataccc cgctgatttg 1440 ccagactact ttaaacagtc cttccctgaa ggattcacat gggagcgggt gatggtgttc 1500 gaggatggag gcgttcttac tgcaactcag gatacttcct tgcaagacgg ggaactgatc 1560 tacaacgtta aggtccgcgg cgtcaatttc ccagccaatg gtccagtgat gcagaagaaa 1620 accttggggt gggagccctc aacggagaca atgtaccctg cggacggcgg gcttgagggt 1680 agatgtgata aggcattgaa actcgtcggg ggcggccacc ttcatgtgaa tttcaagact 1740 acatataaaa gtaaaaaacc agtcaagatg cctggagtgc actacgtgga tcgtaggttg 1800 gagaggataa aagaagccga caacgaaact tatgtagagc aatatgagca cgccgtggct 1860 cgttattcca acttgggcgg aggaatggat gaactgtaca ag 1902 <210> 352 <211> 622 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 352 Met Lys His His His His His His Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Ile 1 5 10 15 Lys Glu Asn Met Arg Ser Lys Leu Tyr Leu Glu Gly Ser Val Asn Gly 20 25 30 His Gln Phe Lys Cys Thr His Glu Gly Glu Gly Lys Pro Tyr Glu Gly 35 40 45 Lys Gln Thr Asn Arg Ile Lys Val Val Glu Gly Gly Pro Leu 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120 cagaatctcg ccgtgtccgt aactccgatc ctaaggattg tccggagcgg tgaaaatgcc 180 ctgaagatcg acatccatgt catcatcccg tatgaaggtc tgagcgccga ccaaatggcc 240 cagatcgaag aggtgtttaa ggtggtgtac cctgtggatg atcatcactt taaggtgatc 300 ctgccctatg gcacactggt aatcgacggg gttacgccga acatgctgaa ctatttcgga 360 cggccgtatg aaggcatcgc cgtgttcgac ggcaaaaaga tcactgtaac agggaccctg 420 tggaacggca acaaaattat cgacgagcgc ctgatcaccc ccgac 465 <210> 366 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 366 Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg Leu Ile Thr Pro Asp 1 5 10 15 <210> 367 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 367 Lys Lys Ile Thr Thr Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Arg 1 5 10 <210> 368 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 368 Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys 1 5 10 <210> 369 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 369 Gly Lys Met Leu Phe Arg Val Thr Ile Trp Lys Val Ser Val Ser 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agatcgacat ccatgtcatc 180 atcccgtatg aaggtctgag cgccgaccaa atggcccaga tcgaagaggt gtttaaggtg 240 gtgtaccctg tggatgatca tcactttaag gtgatcctgc cctatggcac actggtaatc 300 gacggggtta cgccgaacac gctgaactat ttcggacggc cgtatgaagg catcgccgtg 360 ctcgacggca aaaagatcac tgtaacaggg accctgtgga acggcgtcaa aattatcgac 420 gagcgcctga tcacccccga cggctccatg tccttccgag taaccatcaa cagc 474 <210> 961 <211> 158 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 961 Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Lys Gln Thr Ala Ala 1 5 10 15 Tyr Asn Leu Val Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser Leu Leu 20 25 30 Gln Asn Leu Ala Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Met Val Arg Ser 35 40 45 Gly Glu Asn Ala Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr Glu 50 55 60 Gly Leu Ser Ala Asp Gln Met Ala Gln Ile Glu Glu Val Phe Lys Val 65 70 75 80 Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu Pro Tyr Gly 85 90 95 Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Thr Leu Asn Tyr Phe Gly 100 105 110 Arg Pro Tyr Glu Gly Ile 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cggcagattg cccctggaca gacaggcaag atcgccgact acaactacaa gctgcccgac 480 gacttcaccg gctgtgtgat tgcctggaac agcaacaacc tggactccaa agtcggcggc 540 aactacaatt acctgtaccg gctgttccgg aagtccaatc tgaagccctt cgagcgggac 600 atctccaccg agatctatca ggccggcagc accccttgta acggcgtgga aggcttcaac 660 tgctacttcc cactgcagtc ctacggcttt cagcccacaa atggcgtggg ctatcagccc 720 tacagagtgg tggtgctgag cttcgaactg ctgcatgccc ctgccacagt gtgcggccct 780 aagaaaagca ccaatctcgt gaagaacaaa tgcgtgaact tcgggagctc cggtggtggc 840 gggagcggag gtggaggctc gagcggtggc aagctcctgt tcacggtaac catcgagaag 900 tataag 906 <210> 972 <211> 302 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 972 Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu 1 5 10 15 Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Asp Tyr Lys 20 25 30 Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp 35 40 45 Asp Asp Lys Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn 50 55 60 Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn 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Lys Gly Ile Ala 260 265 270 Phe Met Glu Phe Ile Arg Pro Ile Pro Thr Trp Asp Glu Trp Pro Glu 275 280 285 Phe Ala Arg Glu Thr Phe Gln Ala Phe Arg Thr Thr Asp Val Gly Arg 290 295 300 Lys Leu Ile Ile Asp Gln Asn Val Phe Ile Glu Gly Thr Leu Pro Met 305 310 315 320 Gly Val Val Arg Pro Leu Thr Glu Val Glu Met Asp His Tyr Arg Glu 325 330 335 Pro Phe Leu Asn Pro Val Asp Arg Glu Pro Leu Trp Arg Phe Pro Asn 340 345 350 Glu Leu Pro Ile Ala Gly Glu Pro Ala Asn Ile Val Ala Leu Val Glu 355 360 365 Glu Tyr Met Asp Trp Leu His Gln Ser Pro Val Pro Lys Leu Leu Phe 370 375 380 Trp Gly Thr Pro Gly Val Leu Ile Pro Pro Ala Glu Ala Ala Arg Leu 385 390 395 400 Ala Lys Ser Leu Pro Asn Cys Lys Ala Val Asp Ile Gly Pro Gly Leu 405 410 415 Asn Leu Leu Gln Glu Asp Asn Pro Asp Leu Ile Gly Ser Glu Ile Ala 420 425 430 Arg Trp Leu Ser Thr Leu Glu Ile Ser Gly Gly Ser Ser Gly Val Phe 435 440 445 Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Lys Gln Thr Ala Ala Tyr Asn 450 455 460 Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser Leu Leu Gln Asn 465 470 475 480 Leu Ala Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Met Val Arg Ser Gly Glu 485 490 495 Asn Ala Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr Glu Gly Leu 500 505 510 Ser Ala Asp Gln Met Ala Gln Ile Glu Glu Val Phe Lys Val Val Tyr 515 520 525 Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu His Tyr Gly Thr Leu 530 535 540 Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Leu Asn Tyr Phe Gly Arg Pro 545 550 555 560 Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile Thr Val Thr Gly 565 570 575 Thr Leu Trp Asn Gly Ala Lys Ile Ile Asp Glu Arg Leu Ile Thr Pro 580 585 590 Asp Gly Ser Met Ser Phe Gln Val Thr Ile Asn Ser 595 600 <210> 984 <211> 480 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 984 Met Leu Leu Ser Val Pro Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Leu Ala Val 1 5 10 15 Ala Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Glu Gln Thr Ala 20 25 30 Ala Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser Leu 35 40 45 Leu Gln Asn Leu Ala Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val Arg 50 55 60 Ser Gly Glu Asn Ala Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr 65 70 75 80 Glu Gly Leu Ser Ala Asp Gln Met Ala Gln Ile Glu Glu Val Phe Lys 85 90 95 Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu Pro Tyr 100 105 110 Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Leu Asn Tyr Phe 115 120 125 Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile Thr 130 135 140 Val Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg Leu 145 150 155 160 Ile Thr Pro Asp Gly Ser Met Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Ser Gly 165 170 175 Ser Ser Gly Met Ala Glu Ile Gly Thr Gly Phe Pro Phe Asp Pro His 180 185 190 Tyr Val Glu Val Leu Gly Glu Arg Met His Tyr Val Asp Val Gly Pro 195 200 205 Arg Asp Gly Thr Pro Val Leu Phe Leu His Gly Asn Pro Thr Ser Ser 210 215 220 Tyr Val Trp Arg Asn Ile Ile Pro His Val Ala Pro Thr His Arg Cys 225 230 235 240 Ile Ala Pro Asp Leu Ile Gly Met Gly Lys Ser Asp Lys Pro Asp Leu 245 250 255 Gly Tyr Phe Phe Asp Asp His Val Arg Phe Met Asp Ala Phe Ile Glu 260 265 270 Ala Leu Gly Leu Glu Glu Val Val Leu Val Ile His Asp Trp Gly Ser 275 280 285 Ala Leu Gly Phe His Trp Ala Lys Arg Asn Pro Glu Arg Val Lys Gly 290 295 300 Ile Ala Phe Met Glu Phe Ile Arg Pro Ile Pro Thr Trp Asp Glu Trp 305 310 315 320 Pro Glu Phe Ala Arg Glu Thr Phe Gln Ala Phe Arg Thr Thr Asp Val 325 330 335 Gly Arg Lys Leu Ile Ile Asp Gln Asn Val Phe Ile Glu Gly Thr Leu 340 345 350 Pro Met Gly Val Val Arg Pro Leu Thr Glu Val Glu Met Asp His Tyr 355 360 365 Arg Glu Pro Phe Leu Asn Pro Val Asp Arg Glu Pro Leu Trp Arg Phe 370 375 380 Pro Asn Glu Leu Pro Ile Ala Gly Glu Pro Ala Asn Ile Val Ala Leu 385 390 395 400 Val Glu Glu Tyr Met Asp Trp Leu His Gln Ser Pro Val Pro Lys Leu 405 410 415 Leu Phe Trp Gly Thr Pro Gly Val Leu Ile Pro Pro Ala Glu Ala Ala 420 425 430 Arg Leu Ala Lys Ser Leu Pro Asn Cys Lys Ala Val Asp Ile Gly Pro 435 440 445 Gly Leu Asn Leu Leu Gln Glu Asp Asn Pro Asp Leu Ile Gly Ser Glu 450 455 460 Ile Ala Arg Trp Leu Ser Thr Leu Glu Ile Ser Gly Lys Asp Glu Leu 465 470 475 480 <210> 985 <211> 595 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 985 Met Ala Glu Ile Gly Thr Gly Phe Pro Phe Asp Pro His Tyr Val Glu 1 5 10 15 Val Leu Gly Glu Arg Met His Tyr Val Asp Val Gly Pro Arg Asp Gly 20 25 30 Thr Pro Val Leu Phe Leu His Gly Asn Pro Thr Ser Ser Tyr Val Trp 35 40 45 Arg Asn Ile Ile Pro His Val Ala Pro Thr His Arg Cys Ile Ala Pro 50 55 60 Asp Leu Ile Gly Met Gly Lys Ser Asp Lys Pro Asp Leu Gly Tyr Phe 65 70 75 80 Phe Asp Asp His Val Arg Phe Met Asp Ala Phe Ile Glu Ala Leu Gly 85 90 95 Leu Glu Glu Val Val Leu Val Ile His Asp Trp Gly Ser Ala Leu Gly 100 105 110 Phe His Trp Ala Lys Arg Asn Pro Glu Arg Val Lys Gly Ile Ala Phe 115 120 125 Met Glu Phe Ile Arg Pro Ile Pro Thr Trp Asp Glu Trp Pro Glu Phe 130 135 140 Ala Arg Glu Thr Phe Gln Ala Phe Arg Thr Thr Asp Val Gly Arg Lys 145 150 155 160 Leu Ile Ile Asp Gln Asn Val Phe Ile Glu Gly Thr Leu Pro Met Gly 165 170 175 Val Val Arg Pro Leu Thr Glu Val Glu Met Asp His Tyr Arg Glu Pro 180 185 190 Phe Leu Asn Pro Val Asp Arg Glu Pro Leu Trp Arg Phe Pro Asn Glu 195 200 205 Leu Pro Ile Ala Gly Glu Pro Ala Asn Ile Val Ala Leu Val Glu Glu 210 215 220 Tyr Met Asp Trp Leu His Gln Ser Pro Val Pro Lys Leu Leu Phe Trp 225 230 235 240 Gly Thr Pro Gly Val Leu Ile Pro Pro Ala Glu Ala Ala Arg Leu Ala 245 250 255 Lys Ser Leu Pro Asn Cys Lys Ala Val Asp Ile Gly Pro Gly Leu Asn 260 265 270 Leu Leu Gln Glu Asp Asn Pro Asp Leu Ile Gly Ser Glu Ile Ala Arg 275 280 285 Trp Leu Ser Thr Leu Glu Ile Ser Gly Gly Ser Ser Gly Val Phe Thr 290 295 300 Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Lys Gln Thr Ala Ala Tyr Asn Leu 305 310 315 320 Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser Leu Leu Gln Asn Leu 325 330 335 Ala Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Met Val Arg Ser Gly Glu Asn 340 345 350 Ala Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr Glu Gly Leu Ser 355 360 365 Ala Asp Gln Met Ala Gln Ile Glu Glu Val Phe Lys Val Val Tyr Pro 370 375 380 Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu His Tyr Gly Thr Leu Val 385 390 395 400 Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Leu Asn Tyr Phe Gly Arg Pro Tyr 405 410 415 Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile Thr Val Thr Gly Thr 420 425 430 Leu Trp Asn Gly Ala Lys Ile Ile Asp Glu Arg Leu Ile Thr Pro Asp 435 440 445 Gly Ser Met Ser Phe Gln Val Thr Ile Asn Ser Ser Gly Leu Arg Ser 450 455 460 Arg Gly Glu Pro Gln Gln Ser Phe Ser Glu Ala Gln Gln Gln Leu Cys 465 470 475 480 Asn Thr Arg Gln Glu Val Asn Glu Leu Arg Lys Leu Leu Glu Glu Glu 485 490 495 Arg Asp Gln Arg Val Ala Ala Glu Asn Ala Leu Ser Val Ala Glu Glu 500 505 510 Gln Ile Arg Arg Leu Glu His Ser Glu Trp Asp Ser Ser Arg Thr Pro 515 520 525 Ile Ile Gly Ser Cys Gly Thr Gln Glu Gln Ala Leu Leu Ile Asp Leu 530 535 540 Thr Ser Asn Ser Cys Arg Arg Thr Arg Ser Gly Val Gly Trp Lys Arg 545 550 555 560 Val Leu Arg Ser Leu Cys His Ser Arg Thr Arg Val Pro Leu Leu Ala 565 570 575 Ala Ile Tyr Phe Leu Met Ile His Val Leu Leu Ile Leu Cys Phe Thr 580 585 590 Gly His Leu 595 <210> 986 <211> 883 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 986 Met Ala Ala Pro Gly Ser Ala Arg Arg Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Gly Leu Met His Cys Ala Ser Ala Ala Met Phe Met 20 25 30 Val Lys Asn Gly Asn Gly Thr Ala Cys Ile Met Ala Asn Phe Ser Ala 35 40 45 Ala Phe Ser Val Asn Tyr Asp Thr Lys Ser Gly Pro Lys Asn Met Thr 50 55 60 Phe Asp Leu Pro Ser Asp Ala Thr Val Val Leu Asn Arg Ser Ser Cys 65 70 75 80 Gly Lys Glu Asn Thr Ser Asp Pro Ser Leu Val Ile Ala Phe Gly Arg 85 90 95 Gly His Thr Leu Thr Leu Asn Phe Thr Arg Asn Ala Thr Arg Tyr Ser 100 105 110 Val Gln Leu Met Ser Phe Val Tyr Asn Leu Ser Asp Thr His Leu Phe 115 120 125 Pro Asn Ala Ser Ser Lys Glu Ile Lys Thr Val Glu Ser Ile Thr Asp 130 135 140 Ile Arg Ala Asp Ile Asp Lys Lys Tyr Arg Cys Val Ser Gly Thr Gln 145 150 155 160 Val His Met Asn Asn Val Thr Val Thr Leu His Asp Ala Thr Ile Gln 165 170 175 Ala Tyr Leu Ser Asn Ser Ser Phe Ser Arg Gly Glu Thr Arg Cys Glu 180 185 190 Gln Asp Arg Pro Ser Pro Thr Thr Ala Pro Pro Ala Pro Pro Ser Pro 195 200 205 Ser Pro Ser Pro Val Pro Lys Ser Pro Ser Val Asp Lys Tyr Asn Val 210 215 220 Ser Gly Thr Asn Gly Thr Cys Leu Leu Ala Ser Met Gly Leu Gln Leu 225 230 235 240 Asn Leu Thr Tyr Glu Arg Lys Asp Asn Thr Thr Val Thr Arg Leu Leu 245 250 255 Asn Ile Asn Pro Asn Lys Thr Ser Ala Ser Gly Ser Cys Gly Ala His 260 265 270 Leu Val Thr Leu Glu Leu His Ser Glu Gly Thr Thr Val Leu Leu Phe 275 280 285 Gln Phe Gly Met Asn Ala Ser Ser Ser Arg Phe Phe Leu Gln Gly Ile 290 295 300 Gln Leu Asn Thr Ile Leu Pro Asp Ala Arg Asp Pro Ala Phe Lys Ala 305 310 315 320 Ala Asn Gly Ser Leu Arg Ala Leu Gln Ala Thr Val Gly Asn Ser Tyr 325 330 335 Lys Cys Asn Ala Glu Glu His Val Arg Val Thr Lys Ala Phe Ser Val 340 345 350 Asn Ile Phe Lys Val Trp Val Gln Ala Phe Lys Val Glu Gly Gly Gln 355 360 365 Phe Gly Ser Val Glu Glu Cys Leu Leu Asp Glu Asn Ser Met Leu Ile 370 375 380 Pro Ile Ala Val Gly Gly Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ile Val Leu 385 390 395 400 Ile Ala Tyr Leu Val Gly Arg Lys Arg Ser His Ala Gly Tyr Gln Thr 405 410 415 Ile Lys Asp Pro Pro Val Ala Thr Met Ala Glu Ile Gly Thr Gly Phe 420 425 430 Pro Phe Asp Pro His Tyr Val Glu Val Leu Gly Glu Arg Met His Tyr 435 440 445 Val Asp Val Gly Pro Arg Asp Gly Thr Pro Val Leu Phe Leu His Gly 450 455 460 Asn Pro Thr Ser Ser Tyr Val Trp Arg Asn Ile Ile Pro His Val Ala 465 470 475 480 Pro Thr His Arg Cys Ile Ala Pro Asp Leu Ile Gly Met Gly Lys Ser 485 490 495 Asp Lys Pro Asp Leu Gly Tyr Phe Phe Asp Asp His Val Arg Phe Met 500 505 510 Asp Ala Phe Ile Glu Ala Leu Gly Leu Glu Glu Val Val Leu Val Ile 515 520 525 His Asp Trp Gly Ser Ala Leu Gly Phe His Trp Ala Lys Arg Asn Pro 530 535 540 Glu Arg Val Lys Gly Ile Ala Phe Met Glu Phe Ile Arg Pro Ile Pro 545 550 555 560 Thr Trp Asp Glu Trp Pro Glu Phe Ala Arg Glu Thr Phe Gln Ala Phe 565 570 575 Arg Thr Thr Asp Val Gly Arg Lys Leu Ile Ile Asp Gln Asn Val Phe 580 585 590 Ile Glu Gly Thr Leu Pro Met Gly Val Val Arg Pro Leu Thr Glu Val 595 600 605 Glu Met Asp His Tyr Arg Glu Pro Phe Leu Asn Pro Val Asp Arg Glu 610 615 620 Pro Leu Trp Arg Phe Pro Asn Glu Leu Pro Ile Ala Gly Glu Pro Ala 625 630 635 640 Asn Ile Val Ala Leu Val Glu Glu Tyr Met Asp Trp Leu His Gln Ser 645 650 655 Pro Val Pro Lys Leu Leu Phe Trp Gly Thr Pro Gly Val Leu Ile Pro 660 665 670 Pro Ala Glu Ala Ala Arg Leu Ala Lys Ser Leu Pro Asn Cys Lys Ala 675 680 685 Val Asp Ile Gly Pro Gly Leu Asn Leu Leu Gln Glu Asp Asn Pro Asp 690 695 700 Leu Ile Gly Ser Glu Ile Ala Arg Trp Leu Ser Thr Leu Glu Ile Ser 705 710 715 720 Gly Gly Ser Ser Gly Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp 725 730 735 Lys Gln Thr Ala Ala Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly 740 745 750 Val Ser Ser Leu Leu Gln Asn Leu Ala Val Ser Val Thr Pro Ile Gln 755 760 765 Arg Met Val Arg Ser Gly Glu Asn Ala Leu Lys Ile Asp Ile His Val 770 775 780 Ile Ile Pro Tyr Glu Gly Leu Ser Ala Asp Gln Met Ala Gln Ile Glu 785 790 795 800 Glu Val Phe Lys Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val 805 810 815 Ile Leu His Tyr Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met 820 825 830 Leu Asn Tyr Phe Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly 835 840 845 Lys Lys Ile Thr Val Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Ala Lys Ile Ile 850 855 860 Asp Glu Arg Leu Ile Thr Pro Asp Gly Ser Met Ser Phe Gln Val Thr 865 870 875 880 Ile Asn Ser

Claims (192)

  1. 서열번호 23과 40% 초과, 100% 미만의 서열 동일성을 갖고 서열번호 6, 서열번호 9 및/또는 서열번호 29와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드로서, 여기서 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질의 존재 하에 생성된 생물발광 신호는 펩타이드가 서열번호 25로 이루어진 제2 펩타이드 및 서열번호 17로 이루어진 폴리펩타이드 보체와 접촉할 때, 펩타이드 및 코엘렌테라진 기질 단독에 의해 생성된 생물발광 신호에 비해 실질적으로 증가되는, 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 생물발광 신호는 펩타이드가 제2 펩타이드 및 상기 폴리펩타이드 보체와 연합될 때, 실질적으로 증가되는, 펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 6 및/또는 서열번호 9의 펩타이드와 비교하여 하나 이상의 특성의 향상을 나타내며, 상기 특성은 제2 펩타이드 및 폴리펩타이드 보체와 조합되는 경우 제2 펩타이드 및 폴리펩타이드 보체에 대한 친화도, 발현, 용해도, 안정성, 및 생물발광 활성으로부터 선택되는, 펩타이드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 천연 발생 단백질 또는 이의 단편이 아닌, 펩타이드.
  5. 제4항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 비천연 아미노산, 아미노산 유사체 및/또는 펩토이드 아미노산을 함유하는, 펩타이드.
  6. 제1항의 펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는, 핵산.
  7. 제1항의 펩타이드 및 부가적인 아미노산 서열을 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
  8. 제7항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 관심 단백질, 상호작용 요소, 공동국재화 요소, 및 결합 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되는, 융합 폴리펩타이드.
  9. 제8항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 항체(다클론, 단클론 및/또는 재조합), 항체 단편, 단백질 A, 단백질 A의 Ig 결합 도메인, 단백질 G, 단백질 G의 Ig 결합 도메인, 단백질 A/G, 단백질 A/G의 Ig 결합 도메인, 단백질 L, 단백질 L의 Ig 결합 도메인, 단백질 M, 단백질 M의 Ig 결합 도메인, 올리고뉴클레오타이드 프로브, 펩타이드 핵산, DARPin, 압타머(aptamer), 아피머(affimer), 정제된 단백질(분석물 자체 또는 분석물에 결합하는 단백질) 및 단백질의 분석물 결합 도메인(들)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합 모이어티인, 융합 폴리펩타이드.
  10. 제8항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 제1 상호작용 폴리펩타이드와 제2 상호작용 폴리펩타이드의 접촉 시에 제2 상호작용 폴리펩타이드와 복합체를 형성하도록 구성되는 제1 상호작용 폴리펩타이드인, 융합 폴리펩타이드.
  11. 제8항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 세포 구획, 세포, 조직, 또는 유기체 내에서 제2 공동국재화 폴리펩타이드와 함께 공동국재화되도록 구성된 제1 공동국재화 폴리펩타이드인, 융합 폴리펩타이드.
  12. 제8항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 관심 단백질이고 후보 약물 표적인, 융합 폴리펩타이드.
  13. 제7항의 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는, 핵산.
  14. 서열번호 25와 40% 초과, 100% 미만의 서열 동일성을 갖고 서열번호 7 및/또는 서열번호 10과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드로서, 여기서 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질의 존재 하에 생성된 생물발광 신호는 펩타이드가 서열번호 23으로 이루어지는 제2 펩타이드 및 서열번호 17로 이루어지는 폴리펩타이드 보체와 접촉할 때, 펩타이드 및 코엘렌테라진 기질 단독에 의해 생성되는 생물발광 신호에 비해 실질적으로 증가되는, 펩타이드.
  15. 제14항에 있어서, 상기 생물발광 신호는 펩타이드가 제2 펩타이드 및 폴리펩타이드 보체와 연합될 때 실질적으로 증가되는, 펩타이드.
  16. 제14항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 7 및/또는 서열번호 10의 펩타이드와 비교하여 하나 이상의 특성의 향상을 나타내며, 상기 특성은 제2 펩타이드 및 폴리펩타이드 보체와 조합되는 경우 제2 펩타이드 및 폴리펩타이드 보체에 대한 친화도, 발현, 용해도, 안정성, 및 생물발광 활성으로부터 선택되는, 펩타이드.
  17. 제14항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 천연 발생 단백질 또는 이의 단편이 아닌, 펩타이드.
  18. 제17항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 비천연 아미노산, 아미노산 유사체 및/또는 펩토이드 아미노산을 함유하는, 펩타이드.
  19. 제14항의 펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는, 핵산.
  20. 제14항의 펩타이드 및 부가적인 아미노산 서열을 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
  21. 제20항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 관심 단백질, 상호작용 요소, 공동국재화 요소, 및 결합 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되는, 융합 폴리펩타이드.
  22. 제21항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 항체(다클론, 단클론 및/또는 재조합), 항체 단편, 단백질 A, 단백질 A의 Ig 결합 도메인, 단백질 G, 단백질 G의 Ig 결합 도메인, 단백질 A/G, 단백질 A/G의 Ig 결합 도메인, 단백질 L, 단백질 L의 Ig 결합 도메인, 단백질 M, 단백질 M의 Ig 결합 도메인, 올리고뉴클레오타이드 프로브, 펩타이드 핵산, DARPin, 압타머, 아피머, 정제된 단백질(분석물 자체 또는 분석물에 결합하는 단백질) 및 단백질의 분석물 결합 도메인(들)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합 모이어티인, 융합 폴리펩타이드.
  23. 제21항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 제1 상호작용 폴리펩타이드와 제2 상호작용 폴리펩타이드의 접촉 시, 제2 상호작용 폴리펩타이드와 복합체를 형성하도록 구성되는 제1 상호작용 폴리펩타이드인, 융합 폴리펩타이드.
  24. 제21항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 세포 구획, 세포, 조직, 또는 유기체 내에서 제2 공동국재화 폴리펩타이드와 함께 공동국재화되도록 구성된 제1 공동국재화 폴리펩타이드인, 융합 폴리펩타이드.
  25. 제21항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 관심 단백질이고 후보 약물 표적인, 융합 폴리펩타이드.
  26. 제20항의 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는, 핵산.
  27. (a) 서열번호 25와 40% 초과, 100% 미만의 서열 동일성을 갖고 서열번호 7 및/또는 서열번호 10과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 펩타이드; 및
    (b) 서열번호 23과 40% 초과, 100% 미만의 서열 동일성을 갖고 서열번호 6, 서열번호 9, 및 서열번호 29와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 펩타이드;
    를 포함하는 조성물로서,
    여기서 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질의 존재 하에 생성된 생물발광 신호는 제1 펩타이드가 제2 펩타이드 및 서열번호 17로 이루어지는 폴리펩타이드 보체와 접촉할 때, 제1 펩타이드 및/또는 제2 펩타이드 및 코엘렌테라진 기질 단독에 의해 생성되는 생물발광 신호에 비해 실질적으로 증가되는, 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 생물발광 신호는 제1 펩타이드가 제2 펩타이드 및 상기 폴리펩타이드 보체와 연합될 때 실질적으로 증가되는, 조성물.
  29. 제27항에 있어서, 상기 제1 펩타이드는 서열번호 7 및/또는 서열번호 10의 펩타이드와 비교하여 하나 이상의 특성의 향상을 나타내고, 상기 제2 펩타이드는 서열번호 6, 서열번호 9, 및 서열번호 29의 펩타이드와 비교하여 하나 이상의 특성의 향상을 나타내며, 상기 특성은 상기 제2 펩타이드 및 상기 폴리펩타이드 보체와 조합되는 경우 제2 펩타이드 및 폴리펩타이드 보체에 대한 친화도, 발현, 용해도, 안정성, 및 생물발광 활성으로부터 선택되는, 조성물.
  30. 제27항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 펩타이드의 아미노산 서열은 천연 발생 단백질 또는 이의 단편이 아닌, 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 펩타이드의 아미노산 서열은 비천연 아미노산, 아미노산 유사체 및/또는 펩토이드 아미노산을 함유하는, 조성물.
  32. 제27항의 제1 펩타이드 및 제2 펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산을 포함하는, 조성물.
  33. 제27항의 제1 및 제2 펩타이드 및 부가적인 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 포함하는, 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 관심 단백질, 상호작용 요소, 공동국재화 요소, 및 결합 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 항체(다클론, 단클론 및/또는 재조합), 항체 단편, 단백질 A, 단백질 A의 Ig 결합 도메인, 단백질 G, 단백질 G의 Ig 결합 도메인, 단백질 A/G, 단백질 A/G의 Ig 결합 도메인, 단백질 L, 단백질 L의 Ig 결합 도메인, 단백질 M, 단백질 M의 Ig 결합 도메인, 올리고뉴클레오타이드 프로브, 펩타이드 핵산, DARPin, 압타머, 아피머, 정제된 단백질(분석물 자체 또는 분석물에 결합하는 단백질) 및 단백질의 분석물 결합 도메인(들)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합 모이어티인, 조성물.
  36. 제34항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 제1 상호작용 폴리펩타이드와 제2 상호작용 폴리펩타이드의 접촉 시, 제2 상호작용 폴리펩타이드와 복합체를 형성하도록 구성되는 상기 제1 상호작용 폴리펩타이드인, 조성물.
  37. 제34항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 세포 구획, 세포, 조직, 또는 유기체 내에서 제2 공동국재화 폴리펩타이드와 함께 공동국재화되도록 구성된 제1 공동국재화 폴리펩타이드인, 조성물.
  38. 제34항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 관심 단백질이고 후보 약물 표적인, 조성물.
  39. 제33항의 조성물을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산을 포함하는, 조성물.
  40. 서열번호 17과 40% 초과, 100% 미만의 서열 동일성을 갖고 서열번호 5, 서열번호 8, 및/또는 서열번호 27과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드로서, 여기서 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질의 존재 하에 생성된 생물발광 신호는 폴리펩타이드가 서열번호 23으로 이루어지는 제1 펩타이드 및 서열번호 25로 이루어지는 제2 펩타이드와 접촉할 때, 폴리펩타이드 및 코엘렌테라진 기질 단독에 의해 생성되는 생물발광 신호에 비해 실질적으로 증가되는, 폴리펩타이드.
  41. 제40항에 있어서, 상기 생물발광 신호는 폴리펩타이드가 제1 및 제2 펩타이드와 연합될 때 실질적으로 증가되는, 폴리펩타이드.
  42. 제40항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 5 및/또는 서열번호 8의 폴리펩타이드와 비교하여 하나 이상의 특성의 향상을 나타내며, 상기 특성은 제1 및 제2 펩타이드와 조합되는 경우 제1 및/또는 제2 펩타이드에 대한 친화도, 발현, 용해도, 안정성, 및 생물발광 활성으로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
  43. 제40항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 천연 발생 단백질 또는 이의 단편이 아닌, 폴리펩타이드.
  44. 제43항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 비천연 아미노산, 아미노산 유사체 및/또는 펩토이드 아미노산을 함유하는, 폴리펩타이드.
  45. 제40항의 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는, 핵산.
  46. 제40항의 폴리펩타이드 및 부가적인 아미노산 서열을 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
  47. 제46항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 관심 단백질, 상호작용 요소, 공동국재화 요소, 및 결합 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되는, 융합 폴리펩타이드.
  48. 제47항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 항체(다클론, 단클론 및/또는 재조합), 항체 단편, 단백질 A, 단백질 A의 Ig 결합 도메인, 단백질 G, 단백질 G의 Ig 결합 도메인, 단백질 A/G, 단백질 A/G의 Ig 결합 도메인, 단백질 L, 단백질 L의 Ig 결합 도메인, 단백질 M, 단백질 M의 Ig 결합 도메인, 올리고뉴클레오타이드 프로브, 펩타이드 핵산, DARPin, 압타머, 아피머, 정제된 단백질(분석물 자체 또는 분석물에 결합하는 단백질) 및 단백질의 분석물 결합 도메인(들)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합 모이어티인, 융합 폴리펩타이드.
  49. 제47항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 제1 상호작용 폴리펩타이드와 제2 상호작용 폴리펩타이드의 접촉 시에 제2 상호작용 폴리펩타이드와 복합체를 형성하도록 구성되는 제1 상호작용 폴리펩타이드인, 융합 폴리펩타이드.
  50. 제47항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 세포 구획, 세포, 조직, 또는 유기체 내에서 제2 공동국재화 폴리펩타이드와 함께 공동국재화되도록 구성된 제1 공동국재화 폴리펩타이드인, 융합 폴리펩타이드.
  51. 제47항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 관심 단백질이고 후보 약물 표적인, 융합 폴리펩타이드.
  52. 제46항의 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는, 핵산.
  53. 서열번호 51 및/또는 302와 40% 이상의 서열 동일성을 갖고 서열번호 5, 서열번호 8, 및 서열번호 27과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드로서, 여기서 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질의 존재 하에 생성된 생물발광 신호는 폴리펩타이드가 서열번호 23으로 이루어지는 제1 펩타이드 및 서열번호 25로 이루어지는 제2 펩타이드와 접촉할 때, 펩타이드 및 코엘렌테라진 기질 단독에 의해 생성되는 생물발광 신호에 비해 실질적으로 증가되는, 폴리펩타이드.
  54. 제53항에 있어서, 상기 생물발광 신호는 폴리펩타이드가 제1 및 제2 펩타이드와 연합될 때 실질적으로 증가되는, 폴리펩타이드.
  55. 제53항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 5 및/또는 서열번호 8의 폴리펩타이드와 비교하여 하나 이상의 특성의 향상을 나타내며, 상기 특성은 제1 및 제2 펩타이드와 조합되는 경우 제1 및/또는 제2 펩타이드에 대한 친화도, 발현, 용해도, 안정성, 및 생물발광 활성으로부터 선택되는 것인, 폴리펩타이드.
  56. 제53항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 천연 발생 단백질 또는 이의 단편이 아닌, 폴리펩타이드.
  57. 제56항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 비천연 아미노산, 아미노산 유사체 및/또는 펩토이드 아미노산을 함유하는, 폴리펩타이드.
  58. 제53항의 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는, 핵산.
  59. 제53항의 폴리펩타이드 및 부가적인 아미노산 서열을 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
  60. 제59항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 관심 단백질, 상호작용 요소, 공동국재화 요소, 및 결합 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되는, 융합 폴리펩타이드.
  61. 제60항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 항체(다클론, 단클론 및/또는 재조합), 항체 단편, 단백질 A, 단백질 A의 Ig 결합 도메인, 단백질 G, 단백질 G의 Ig 결합 도메인, 단백질 A/G, 단백질 A/G의 Ig 결합 도메인, 단백질 L, 단백질 L의 Ig 결합 도메인, 단백질 M, 단백질 M의 Ig 결합 도메인, 올리고뉴클레오타이드 프로브, 펩타이드 핵산, DARPin, 압타머, 아피머, 정제된 단백질(분석물 자체 또는 분석물에 결합하는 단백질) 및 단백질의 분석물 결합 도메인(들)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합 모이어티인, 융합 폴리펩타이드.
  62. 제60항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 제1 상호작용 폴리펩타이드와 제2 상호작용 폴리펩타이드의 접촉 시에 제2 상호작용 폴리펩타이드와 복합체를 형성하도록 구성되는 제1 상호작용 폴리펩타이드인, 융합 폴리펩타이드.
  63. 제60항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 세포 구획, 세포, 조직, 또는 유기체 내에서 제2 공동국재화 폴리펩타이드와 함께 공동국재화되도록 구성된 제1 공동국재화 폴리펩타이드인, 융합 폴리펩타이드.
  64. 제60항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 관심 단백질이고 후보 약물 표적인, 융합 폴리펩타이드.
  65. 제59항의 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는, 핵산.
  66. (a) 서열번호 17, 21, 또는 302와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성 및 서열번호 5 및/또는 서열번호 8과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
    (b) 서열번호 23과 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성 및 서열번호 6 및/또는 서열번호 9와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 펩타이드; 및
    (c) 서열번호 25와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성 및 서열번호 7 및/또는 서열번호 10과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 펩타이드;
    를 포함하는 생물발광 복합체로서,
    상기 생물발광 복합체는 폴리펩타이드 단독, 제1 펩타이드 단독, 제2 펩타이드 단독, 및 폴리펩타이드, 제1 펩타이드 및 제2 펩타이드 중 임의의 2개의 존재 하의 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질과 비교하여, 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질의 존재 하에 실질적으로 증가된 생물발광을 생성하는, 생물발광 복합체.
  67. 제66항에 있어서, 상기 제1 펩타이드는 제1 펩타이드 태그이고, 상기 제2 펩타이드는 제2 펩타이드 태그이며, 상기 제1 및 제2 펩타이드 태그는 관심 분자, 관심 펩타이드, 관심 단백질, 상호작용 요소, 공동국재화 요소, 또는 결합 모이어티로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 모이어티에 각각 연결되는, 생물발광 복합체.
  68. 제67항에 있어서, 상기 제1 펩타이드 태그 또는 상기 제2 펩타이드 태그는 약물 또는 약물 후보에 연결되고, 다른 펩타이드 태그는 약물 표적 또는 후보 약물 표적에 연결되고, 생물발광 복합체로부터 생물발광의 강도는 약물 표적 또는 후보 약물 표적에 대한 약물 또는 약물 후보의 친화도와 상관관계가 있는, 생물발광 복합체.
  69. 제67항에 있어서, 상기 제1 펩타이드 태그는 제1 상호작용 요소에 연결되고 상기 제2 펩타이드 태그는 제2 상호작용 요소에 연결되며, 상기 생물발광 복합체로부터 생물발광의 강도는 검정된 조건 하에서 제2 상호작용 요소에 대한 상기 제1 상호작용 요소의 친화도와 상관관계가 있는, 생물발광 복합체.
  70. 제67항에 있어서, 상기 제1 펩타이드 태그는 제1 공동국재화 요소에 연결되고 상기 제2 펩타이드 태그는 제2 공동국재화 요소에 연결되며, 여기서 실질적으로 증가된 생물발광은 검정된 조건하에서 제1 공동국재화 요소와 제2 공동국재화 요소의 공동국재화를 나타내지만 반드시 상호작용을 나타내는 것은 아닌, 생물발광 복합체.
  71. (a) (i) 서열번호 23과 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성 및 서열번호 6 및 서열번호 9와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 펩타이드,
    (ii) 서열번호 25와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성 및 서열번호 7 및 서열번호 10과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 펩타이드,
    (iii) 서열번호 17, 21, 및/또는 302와 40% 이상(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상)의 서열 동일성 및 서열번호 5 및/또는 서열번호 8과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 성분으로서, 상기 제1 펩타이드 태그, 상기 제2 펩타이드 태그, 및 상기 폴리펩타이드 성분은 제1 분자 실체와 제2 분자 실체의 상호작용 시, 생물발광 복합체를 생성하도록 구성되는 폴리펩타이드 성분, 및
    (iv) 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질
    을 조합하는 단계; 및
    (b) 발광을 검출하는 단계로서, 상기 폴리펩타이드 성분 및 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 단독에 의해 생성된 발광 수준과 비교하여 더 큰 발광 수준은 상기 폴리펩타이드 성분과 제1 및 제2 펩타이드의 생물발광 복합체의 형성을 나타내는 단계
    를 포함하는, 방법.
  72. 제71항에 있어서, 여기서 폴리펩타이드 성분 및 제1 및 제2 펩타이드 중 하나 이상은 세포에서 발현되고, 외인성으로 세포에 첨가되고/되거나 샘플에 첨가되는, 방법.
  73. 제1 분자 실체와 제2 분자 실체 사이의 상호작용을 검출하는 방법으로서,
    (a) 서열번호 23과 40% 이상의 서열 동일성을 갖고 서열번호 6 및/또는 서열번호 9와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 펩타이드 태그로 제1 분자 실체를 태그화하는 단계;
    (b) 서열번호 25와 40% 이상의 서열 동일성을 갖고 서열번호 7 및/또는 서열번호 10과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 펩타이드 태그로 제2 분자 실체를 태그화하는 단계;
    (c) 상기 태그화된 제1 분자 실체와 상기 태그화된 제2 분자 실체를 조합하는 단계;
    (d) 서열번호 17, 21 및/또는 302와 40% 이상의 서열 동일성을 갖고 서열번호 5 및/또는 서열번호 8과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 성분을 첨가하는 단계로서, 상기 제1 펩타이드 태그, 상기 제2 펩타이드 태그, 및 상기 폴리펩타이드 성분은 상기 제1 분자 실체와 상기 제2 분자 실체의 상호작용 시 생물발광 복합체를 생성하도록 구성되는 단계;
    (e) 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질을 첨가하는 단계; 및
    (f) 상기 생물발광 복합체에 의해 생성된 발광 신호를 검출하는 단계로서, 상기 발광 신호의 크기가 상기 제1 분자 실체와 상기 제2 분자 실체 사이의 상호작용 강도와 상관관계가 있는 단계
    를 포함하는, 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 제1 분자 실체 및/또는 상기 제2 분자 실체는 관심 단백질 또는 관심 펩타이드이고, 태그화는 제1 펩타이드 태그 및/또는 제2 펩타이드 태그와 제1 분자 실체 및/또는 제2 분자 실체의 융합체를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  75. 제73항에 있어서, 상기 제1 분자 실체 및/또는 상기 제2 분자 실체는 소분자이고, 태그화는 제1 펩타이드 태그 및/또는 제2 펩타이드 태그와 제1 분자 실체 및/또는 제2 분자 실체를 직접 또는 간접적으로 연결하는 단계를 포함하는, 방법.
  76. 제73항에 있어서, 상기 제1 분자 실체 및 제2 분자 실체 중 하나는 약물 또는 약물 후보이고, 다른 하나는 약물 표적 또는 후보 약물 표적이며, 생물발광 신호는 약물 표적 또는 후보 약물 표적인 다른 하나에 대한 약물 또는 약물 후보의 결합을 나타내는, 방법.
  77. 제73항에 있어서, 상기 태그화된 제1 분자 실체와 상기 태그화된 제2 분자 실체를 조합하는 단계가 세포 내에서 하나 또는 둘 모두를 발현하는 단계 및/또는 하나 또는 둘 모두를 세포에 첨가하는 단계를 포함하는, 방법.
  78. 세포를 이용하여 제1 단백질 또는 펩타이드 실체와 제2 단백질 또는 펩타이드 실체 사이의 상호작용을 검출하는 방법으로서,
    (a) 상기 제1 단백질 또는 펩타이드 실체 및 서열번호 23과 40% 이상의 서열 동일성을 갖고 서열번호 6 및 서열번호 9와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 펩타이드 태그를 포함하는 융합체를 상기 세포 내에서 발현시키는 단계;
    (b) 상기 제2 단백질 또는 펩타이드 실체 및 서열번호 25와 40% 이상의 서열 동일성을 갖고 서열번호 7 및/또는 서열번호 10과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 펩타이드 태그를 포함하는 융합체를 상기 세포 내에서 발현시키는 단계;
    (c) 서열번호 17, 21 및/또는 302와 40% 이상의 서열 동일성을 갖고 서열번호 5 및/또는 서열번호 8과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 성분을 상기 세포에 의해 발현시키는 단계로서, 상기 제1 펩타이드 태그, 상기 제2 펩타이드 태그, 및 상기 폴리펩타이드 성분은 상기 제1 단백질 또는 펩타이드 실체와 상기 제2 단백질 또는 펩타이드 실체의 상호작용 시에 생물발광 복합체를 생성하도록 구성되는 단계;
    (d) 상기 세포에 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질을 첨가하는 단계; 및
    (e) 상기 생물발광 복합체에 의해 생성된 발광 신호를 검출하는 단계로서, 상기 발광 신호의 크기가 상기 제1 단백질 또는 펩타이드 실체와 상기 제2 단백질 또는 펩타이드 실체 사이의 상호작용 강도와 상관관계가 있는 단계
    를 포함하는, 방법.
  79. 제1 분자 실체와 제2 분자 실체의 공동국재화를 검출하는 방법으로서,
    (a) 서열번호 23과 40% 이상의 서열 동일성을 갖고 서열번호 6 및/또는 서열번호 9와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 펩타이드 태그로 상기 제1 분자 실체를 태그화하는 단계;
    (b) 서열번호 25와 40% 이상의 서열 동일성을 갖고 서열번호 7 및/또는 서열번호 10과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 펩타이드 태그로 상기 제2 분자 실체를 태그화하는 단계;
    (c) 상기 태그화된 제1 분자 실체와 상기 태그화된 제2 분자 실체를 동일 시스템에서 조합하는 단계;
    (d) 서열번호 17, 21 및/또는 302와 40% 이상의 서열 동일성을 갖고 서열번호 5 및 서열번호 8과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 성분을 상기 시스템에 첨가하는 단계로서, 상기 제1 펩타이드 태그, 상기 제2 펩타이드 태그, 및 상기 폴리펩타이드 성분은 상기 제1 분자 실체와 상기 제2 분자 실체의 공동국재화 시에 생물발광 복합체를 생성하도록 구성되는 것인 단계;
    (e) 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질을 상기 시스템에 첨가하는 단계; 및
    (f) 상기 생물발광 복합체에 의해 생성된 발광 신호를 검출하는 단계로서, 배경을 초과하는 상기 발광 신호의 존재는 상기 시스템 내에 상기 제1 분자 실체와 상기 제2 분자 실체의 공동국재화를 나타내고, 및/또는 상기 발광 신호의 크기는 상기 제1 분자 실체와 상기 제2 분자 실체가 상기 시스템 내에서 공동국재화하는 양과 상관관계가 있는 단계
    를 포함하는, 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 시스템은 세포, 조직, 기관, 전체 유기체, 생화학적, 비세포 샘플을 포함하는, 방법.
  81. 제79항에 있어서, 상기 제1 분자 실체 및/또는 상기 제2 분자 실체는 관심 단백질 또는 관심 펩타이드이고, 태그화는 제1 펩타이드 태그 및/또는 제2 펩타이드 태그와 제1 분자 실체 및/또는 제2 분자 실체의 융합체를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  82. 제79항에 있어서, 상기 제1 분자 실체 및/또는 상기 제2 분자 실체는 소분자이고, 태그화는 제1 펩타이드 태그 및/또는 제2 펩타이드 태그와 제1 분자 실체 및/또는 제2 분자 실체를 직접 또는 간접적으로 연결하는 단계를 포함하는, 방법.
  83. 제79항에 있어서, 상기 태그화된 제1 분자 실체와 상기 태그화된 제2 분자 실체를 조합하는 단계는 시스템 내에서 하나 또는 둘 모두를 발현시키는 단계 및/또는 시스템에 하나 또는 둘 모두를 첨가하는 단계를 포함하는, 방법.
  84. 세포를 이용하여 제1 단백질 또는 펩타이드 실체와 제2 단백질 또는 펩타이드 실체의 공동국재화를 검출하는 방법으로서,
    (a) 상기 제1 단백질 또는 펩타이드 실체 및 서열번호 23과 40% 이상의 서열 동일성을 갖고 서열번호 6 및/또는 서열번호 9와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 펩타이드 태그를 포함하는 융합체를 상기 세포 내에서 발현시키는 단계;
    (b) 상기 제2 단백질 또는 펩타이드 실체 및 서열번호 25와 40% 이상의 서열 동일성을 갖고 서열번호 7 및/또는 서열번호 10과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 펩타이드 태그를 포함하는 융합체를 상기 세포 내에서 발현시키는 단계;
    (c) 상기 세포를 이용하여 서열번호 17, 21 및/또는 302와 40% 이상의 서열 동일성을 갖고 서열번호 5 및/또는 서열번호 8과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 성분을 발현시키는 단계로서, 상기 제1 펩타이드 태그, 상기 제2 펩타이드 태그, 및 상기 폴리펩타이드 성분은 상기 제1 단백질 또는 펩타이드 실체와 상기 제2 단백질 또는 펩타이드 실체의 공동국재화 시에 생물발광 복합체를 생성하도록 구성되는 것인 단계;
    (d) 상기 세포에 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질을 첨가하는 단계; 및
    (d) 상기 생물발광 복합체에 의해 생성된 발광 신호를 검출하는 단계로서, 배경을 초과하는 상기 발광 신호의 존재는 상기 세포 내에 상기 제1 단백질 또는 펩타이드 실체와 상기 제2 단백질 또는 펩타이드 실체의 공동국재화를 나타내고, 및/또는 상기 발광 신호의 크기는 상기 제1 단백질 또는 펩타이드 실체와 상기 제2 단백질 또는 펩타이드 실체가 상기 시스템 내에서 공동국재화하는 양과 상관관계가 있는 단계
    를 포함하는, 방법.
  85. (a) 서열번호 23과 40% 이상의 서열 동일성을 갖고 서열번호 6 및/또는 서열번호 9와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 펩타이드 태그에 접합된 제1 결합 모이어티; 및
    (b) 서열번호 25와 40% 이상의 서열 동일성을 갖고 서열번호 7 및/또는 서열번호 10과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 펩타이드 태그에 접합된 제2 결합 모이어티
    를 포함하는, 키트.
  86. 제85항에 있어서, 상기 제1 결합 모이어티는 항체(다클론, 단클론 및/또는 재조합), 항체 단편, 단백질 A, 단백질 A의 Ig 결합 도메인, 단백질 G, 단백질 G의 Ig 결합 도메인, 단백질 A/G, 단백질 A/G의 Ig 결합 도메인, 단백질 L, 단백질 L의 Ig 결합 도메인, 단백질 M, 단백질 M의 Ig 결합 도메인, 올리고뉴클레오타이드 프로브, 펩타이드 핵산, DARPin, 압타머, 아피머, 정제된 단백질(분석물 자체 또는 분석물에 결합하는 단백질), 및 단백질의 분석물 결합 도메인(들)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 키트.
  87. 제86항에 있어서, 상기 제1 및 제2 결합 모이어티는 동일한 표적 실체 상의 항원, 에피토프 또는 서열에 결합하도록 구성된 1차 결합 모이어티인, 키트.
  88. 제86항에 있어서, 상기 제1 및 제2 결합 모이어티는 1차 결합 모이어티 상의 항원, 에피토프 또는 서열에 결합하도록 구성된 2차 결합 모이어티인, 키트.
  89. 제86항에 있어서, 서열번호 17, 21, 및/또는 302와 40% 이상의 서열 동일성 및 서열번호 5 및/또는 서열번호 8과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 시약을 추가로 포함하는, 키트.
  90. 제89항에 있어서, 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체를 추가로 포함하는, 키트.
  91. 제1 항원, 에피토프, 또는 서열 및 별개의 제2 항원, 에피토프, 또는 서열을 표시(display)하는 표적 분자를 검출하는 방법으로서,
    (a) 상기 표적 분자를 함유하는 샘플을 (i) 상기 제1 항원, 에피토프 또는 서열을 인식하는 제1의 1차 결합 모이어티 및 (ii) 상기 제2 항원, 에피토프 또는 서열을 인식하는 제2의 1차 결합 모이어티와 접촉시키고, 상기 제1 및 제2의 1차 결합 모이어티가 상기 제1 및 제2 항원, 에피토프 또는 서열에 결합하도록 하는 단계;
    (b) 상기 샘플을 (i) 제1 펩타이드 태그에 접합된 제1의 2차 결합 모이어티 및 (ii) 제2 펩타이드 태그에 접합된 제2의 2차 결합 모이어티와 접촉시키고, 상기 제1 및 제2의 2차 결합 모이어티가 상기 제1 및 제2의 1차 결합 모이어티에 결합하도록 하는 단계로서, 상기 제1의 2차 결합 모이어티는 상기 제1의 1차 결합 모이어티를 인식하고, 상기 제2의 2차 결합 모이어티는 상기 제2의 1차 결합 모이어티를 인식하며, 상기 제1 또는 제2 펩타이드 태그는 서열번호 23과 40% 이상의 서열 동일성을 갖고 서열번호 6 및/또는 서열번호 9와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 또는 제2 펩타이드 태그 중 다른 하나는 서열번호 25와 40% 이상의 서열 동일성을 갖고 서열번호 7 및/또는 서열번호 10과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단계;
    (c) 상기 샘플을 서열번호 17, 21, 및/또는 302와 40% 이상의 서열 동일성을 갖고 서열번호 5 및/또는 서열번호 8과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 성분과 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 펩타이드 태그, 상기 제2 펩타이드 태그, 및 상기 폴리펩타이드 성분은 상호작용 시 생물발광 복합체를 생성하도록 구성되는 단계;
    (d) 상기 샘플을 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질과 접촉시키는 단계; 및
    (e) 상기 생물발광 복합체에 의해 생성된 발광 신호를 검출하는 단계로서, 배경을 초과하는 상기 발광 신호의 존재는 상기 표적 분자의 존재를 나타내고 및/또는 상기 발광 신호의 크기는 상기 샘플 내 표적 분자의 양과 상관관계가 있는 단계
    를 포함하는, 방법.
  92. 제91항에 있어서, 상기 결합 모이어티는 항체(다클론, 단클론 및/또는 재조합), 항체 단편, 단백질 A, 단백질 A의 Ig 결합 도메인, 단백질 G, 단백질 G의 Ig 결합 도메인, 단백질 A/G, 단백질 A/G의 Ig 결합 도메인, 단백질 L, 단백질 L의 Ig 결합 도메인, 단백질 M, 단백질 M의 Ig 결합 도메인, 올리고뉴클레오타이드 프로브, 펩타이드 핵산, DARPin, 압타머, 아피머, 정제된 단백질(분석물 자체 또는 분석물에 결합하는 단백질), 및 단백질의 분석물 결합 도메인(들)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 방법.
  93. 제91항에 있어서, 상기 표적 분자는 단백질, 핵산, 또는 소분자인, 방법.
  94. 제91항에 있어서, 상기 샘플은 시험관내 또는 생체내에 있는, 방법.
  95. 표적 분자를 검출하는 방법으로서, 상기 표적 분자는 제1 항원, 에피토프, 또는 서열 및 별개의 제2 항원, 에피토프, 또는 서열을 표시하고,
    (a) 상기 샘플을 (i) 제1 펩타이드 태그에 접합된 제1 결합 모이어티 및 (ii) 제2 펩타이드 태그에 접합된 제2 결합 모이어티와 접촉시키고, 상기 제1 및 제2 결합 모이어티가 상기 제1 및 제2 항원, 에피토프, 또는 서열에 결합하도록 하는 단계로서, 상기 제1의 2차 결합 모이어티는 상기 제1 항원, 에피토프, 또는 서열을 인식하고, 상기 제2 결합 모이어티는 상기 제2 항원, 에피토프, 또는 서열을 인식하며, 상기 제1 또는 제2 펩타이드 태그는 서열번호 23과 40% 이상의 서열 동일성을 갖고 서열번호 6 및/또는 서열번호 9와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 또는 제2 펩타이드 태그 중 다른 하나는 서열번호 25와 40% 이상의 서열 동일성을 갖고 서열번호 7 및/또는 서열번호 10과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단계;
    (c) 상기 샘플을 서열번호 17, 21, 및/또는 302와 40% 이상의 서열 동일성 및 서열번호 5 및/또는 서열번호 8과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 성분과 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 펩타이드 태그, 상기 제2 펩타이드 태그, 및 상기 폴리펩타이드 성분은 상호작용 시 생물발광 복합체를 생성하도록 구성되는 단계;
    (d) 상기 샘플을 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질과 접촉시키는 단계; 및
    (e) 상기 생물발광 복합체에 의해 생성된 발광 신호를 검출하는 단계로서, 배경을 초과하는 상기 발광 신호의 존재는 상기 표적 분자의 존재를 나타내고 및/또는 상기 발광 신호의 크기는 상기 샘플 내 표적 분자의 양과 상관관계가 있는 단계
    를 포함하는, 방법.
  96. 제95항에 있어서, 상기 결합 모이어티가 항체(다클론, 단클론 및/또는 재조합), 항체 단편, 단백질 A, 단백질 A의 Ig 결합 도메인, 단백질 G, 단백질 G의 Ig 결합 도메인, 단백질 A/G, 단백질 A/G의 Ig 결합 도메인, 단백질 L, 단백질 L의 Ig 결합 도메인, 단백질 M, 단백질 M의 Ig 결합 도메인, 올리고뉴클레오타이드 프로브, 펩타이드 핵산, DARPin, 압타머, 아피머, 정제된 단백질(분석물 자체 또는 분석물에 결합하는 단백질) 및 단백질의 분석물 결합 도메인(들)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 방법.
  97. 제95항에 있어서, 상기 표적 분자가 단백질, 핵산 또는 소분자인, 방법.
  98. 제95항에 있어서, 상기 샘플이 시험관내, 생체내에 있거나, 생화학적 샘플인, 방법.
  99. 서열번호 35와 40% 초과, 100% 미만의 서열 동일성 및 서열번호 205 및 서열번호 206과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 β9/β10-유사 디펩타이드로서, 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질의 존재 하에 생성된 생물발광 신호는 펩타이드가 서열번호 17, 21, 및/또는 302로 이루어진 폴리펩타이드 보체와 접촉할 때, 펩타이드 및 코엘렌테라진 기질 단독에 의해 생성된 생물발광 신호에 비해 실질적으로 증가되는, β9/β10-유사 디펩타이드.
  100. 제99항에 있어서, 상기 생물발광 신호는 펩타이드가 폴리펩타이드 보체와 연합될 때 실질적으로 증가되는, β9/β10-유사 디펩타이드.
  101. 제99항에 있어서, 상기 펩타이드가 서열번호 205 및/또는 서열번호 206의 펩타이드와 비교하여 하나 이상의 특성의 향상을 나타내고, 상기 특성은 폴리펩타이드 보체와 조합될 때 폴리펩타이드 보체에 대한 친화도, 발현, 용해도, 안정성 및 생물발광 활성으로부터 선택되는, β9/β10-유사 디펩타이드.
  102. 제99항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 천연 발생 단백질 또는 이의 단편이 아닌, β9/β10-유사 디펩타이드.
  103. 제102항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 비천연 아미노산, 아미노산 유사체 및/또는 펩토이드 아미노산을 함유하는, β9/β10-유사 디펩타이드.
  104. 제99항의 β9/β10-유사 디펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는, 핵산.
  105. 제99항의 β9/β10-유사 디펩타이드 및 부가적인 아미노산 서열을 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
  106. 제105항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 관심 단백질, 상호작용 요소, 공동국재화 요소, 및 결합 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되는, 융합 폴리펩타이드.
  107. 제106항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 항체(다클론, 단클론 및/또는 재조합), 항체 단편, 단백질 A, 단백질 A의 Ig 결합 도메인, 단백질 G, 단백질 G의 Ig 결합 도메인, 단백질 A/G, 단백질 A/G의 Ig 결합 도메인, 단백질 L, 단백질 L의 Ig 결합 도메인, 단백질 M, 단백질 M의 Ig 결합 도메인, 올리고뉴클레오타이드 프로브, 펩타이드 핵산, DARPin, 압타머, 아피머, 정제된 단백질(분석물 자체 또는 분석물에 결합하는 단백질) 및 단백질의 분석물 결합 도메인(들)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합 모이어티인, 융합 폴리펩타이드.
  108. 제106항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 제1 상호작용 폴리펩타이드 및 제2 상호작용 폴리펩타이드의 접촉 시, 제2 상호작용 폴리펩타이드와 복합체를 형성하도록 구성된 제1 상호작용 폴리펩타이드인, 융합 폴리펩타이드.
  109. 제106항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 세포 구획, 세포, 조직, 또는 유기체 내에서 제2 공동국재화 폴리펩타이드와 함께 공동국재화하도록 구성된 제1 공동국재화 폴리펩타이드인, 융합 폴리펩타이드.
  110. 제106항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 관심 단백질이고 후보 약물 표적인, 융합 폴리펩타이드.
  111. 제105항의 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는, 핵산.
  112. 경쟁 검정을 수행하여 제1 분자 실체와 제2 분자 실체 사이의 상호작용을 검출하는 방법으로서,
    (a) (i) 서열번호 23과 40% 이상의 서열 동일성 및 서열번호 6 및 서열번호 9와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 펩타이드 태그에 의해 태그화된 상기 제1 분자 실체를 포함하는 트레이서(tracer),
    (ii) 서열번호 25와 40% 이상의 서열 동일성 및 서열번호 7 및 서열번호 10과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 펩타이드 태그에 의해 태그화된 상기 제2 분자 실체,
    (iii) 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질,
    (iv) 서열번호 17, 21, 및/또는 302와 40% 이상의 서열 동일성 및 서열번호 5 및/또는 서열번호 8과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 성분, 및
    (v) 비태그화된 제1 분자 실체를 함유할 것으로 의심되는 샘플
    을 조합하는 단계로서, 상기 제1 펩타이드 태그, 상기 제2 펩타이드 태그, 및 상기 폴리펩타이드 성분은 생물발광 복합체를 생성하도록 구성되고 상기 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질의 존재 하에 생물발광 신호를 생성하는 단계;
    (b) 상기 생물발광 복합체에 의해 생성된 상기 생물발광 신호를 검출하는 단계;
    (c) 상기 샘플의 존재 하에 생성된 상기 생물발광 신호를 상기 샘플의 부재 하에 생성된 대조군 생물발광 신호와 비교하는 단계로서, 상기 생물발광 신호의 감소가 상기 샘플 내 비태그화된 제1 분자 실체의 존재 또는 양을 나타내는 단계
    를 포함하는, 방법.
  113. 제112항에 있어서, 상기 제1 분자 실체가 소분자 또는 펩타이드인, 방법.
  114. 제112항에 있어서, 상기 제2 분자 실체가 약물 표적 또는 후보 약물 표적인, 방법.
  115. 시스템 또는 키트로서,
    (a) 서열번호 788 또는 서열번호 789의 폴리펩타이드 단편에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 포함하는 폴리펩타이드 성분; 및
    (b) 서열번호 788 또는 서열번호 789의 상보적인 부분에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하는 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드
    를 포함하고, 여기서 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질의 존재 하에 상기 폴리펩타이드 성분 및 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드로부터 조립된 생물발광 복합체에 의해 생성된 생물발광 신호는, 상기 폴리펩타이드 성분 또는 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드 및 상기 코엘렌테라진 기질 단독에 의해 생성된 생물발광 신호와 비교할 때 실질적으로 증가되는, 시스템 또는 키트.
  116. 제115항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 성분은 서열번호 790에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 포함하고, 상기 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드가 서열번호 794에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하는, 시스템 또는 키트.
  117. 제115항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 성분은 서열번호 791에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 포함하고, 상기 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드가 서열번호 795에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하는, 시스템 또는 키트.
  118. 제115항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 성분은 서열번호 792에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 포함하고, 상기 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드가 서열번호 796에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하는 시스템 또는 키트.
  119. 제115항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 성분은 서열번호 793에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 포함하고, 상기 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드가 서열번호 797에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하는, 시스템 또는 키트.
  120. 제115항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 성분은 서열번호 790에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 포함하고, 상기 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드가 서열번호 798에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하는, 시스템 또는 키트.
  121. 제115항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 성분은 서열번호 791에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 포함하고, 상기 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드가 서열번호 799에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하는, 시스템 또는 키트.
  122. 제115항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 성분은 서열번호 792에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 포함하고, 상기 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드가 서열번호 800에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하는, 시스템 또는 키트.
  123. 제115항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 성분은 서열번호 793에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 포함하고, 상기 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드가 서열번호 801에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하는, 시스템 또는 키트.
  124. 제115항에 있어서, 상기 생물발광 신호는 상기 폴리펩타이드 성분이 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드와 연합될 때 실질적으로 증가되는, 시스템 또는 키트.
  125. 제115항에 있어서, 여기서 폴리펩타이드 성분 및/또는 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드는 천연 발생 서열 또는 이의 단편이 아닌 아미노산 서열을 포함하는, 시스템 또는 키트.
  126. 제125항에 있어서, 여기서 폴리펩타이드 성분 및/또는 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드는 비천연 아미노산, 아미노산 유사체, 및/또는 펩토이드 아미노산을 포함하는, 시스템 또는 키트.
  127. 제115항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 성분 및/또는 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드는 하나 이상의 부가적인 아미노산 서열과 융합체로서 존재하는, 시스템 또는 키트.
  128. 제127항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 관심 단백질, 상호작용 요소, 공동국재화 요소, 및 결합 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되는, 시스템 또는 키트.
  129. 제127항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 항체(다클론, 단클론 및/또는 재조합), 항체 단편, 단백질 A, 단백질 A의 Ig 결합 도메인, 단백질 G, 단백질 G의 Ig 결합 도메인, 단백질 A/G, 단백질 A/G의 Ig 결합 도메인, 단백질 L, 단백질 L의 Ig 결합 도메인, 단백질 M, 단백질 M의 Ig 결합 도메인, 올리고뉴클레오타이드 프로브, 펩타이드 핵산, DARPin, 압타머, 아피머, 정제된 단백질(분석물 자체 또는 분석물에 결합하는 단백질), 및 단백질의 분석물 결합 도메인(들)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합 모이어티인, 시스템 또는 키트.
  130. 제127항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 제1 상호작용 폴리펩타이드와 제2 상호작용 폴리펩타이드의 접촉 시, 제2 상호작용 폴리펩타이드와 복합체를 형성하도록 구성된 제1 상호작용 폴리펩타이드인, 시스템 또는 키트.
  131. 제127항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 세포 구획, 세포, 조직, 또는 유기체 내에서 제2 공동국재화 폴리펩타이드와 함께 공동국재화하도록 구성된 제1 공동국재화 폴리펩타이드인, 시스템 또는 키트.
  132. 제127항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 관심 단백질이고 후보 약물 표적인, 시스템 또는 키트.
  133. 제115항 내지 제132항 중 어느 한 항의 시스템 또는 키트의 폴리펩타이드 성분 및 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드를 포함하는, 생물발광 복합체.
  134. 서열번호 788 또는 서열번호 789에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하는 2개 이상의 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드 성분을 포함하는 시스템 또는 키트로서; 여기서 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질의 존재 하에 생물발광 복합체에 의해 생성된 생물발광 신호는 상기 폴리펩타이드 또는 하나 이상의 상보적 펩타이드 및 상기 코엘렌테라진 기질 단독에 의해 생성된 생물발광 신호와 비교할 때 실질적으로 증가되는, 시스템 또는 키트.
  135. 제134항에 있어서, 서열번호 790에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 성분 및 서열번호 794에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 갖는 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 및/또는 트리펩타이드를 포함하는, 시스템 또는 키트.
  136. 제134항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 791에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 포함하고, 상기 하나 이상의 상보적 펩타이드가 서열번호 795에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하는, 시스템 또는 키트.
  137. 제134항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 792에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 포함하고, 상기 하나 이상의 상보성 펩타이드가 서열번호 796에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하는, 시스템 또는 키트.
  138. 제134항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 793에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 포함하고, 상기 하나 이상의 상보적 펩타이드가 서열번호 797에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하는, 시스템 또는 키트.
  139. 제134항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 790에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 포함하고, 상기 하나 이상의 상보적 펩타이드가 서열번호 798에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하는, 시스템 또는 키트.
  140. 제134항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 791에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 포함하고, 상기 하나 이상의 상보적 펩타이드가 서열번호 799에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하는, 시스템 또는 키트.
  141. 제134항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 792에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 포함하고, 상기 하나 이상의 상보적 펩타이드가 서열번호 800에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하는, 시스템 또는 키트.
  142. 제134항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 793에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 포함하고, 상기 하나 이상의 상보적 펩타이드가 서열번호 801에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하는, 시스템 또는 키트.
  143. 제134항에 있어서, 상기 생물발광 신호는 폴리펩타이드가 하나 이상의 상보적 펩타이드와 연합될 때 실질적으로 증가되는, 시스템 또는 키트.
  144. 제134항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 및/또는 하나 이상의 상보적 펩타이드는 천연 발생 서열 또는 이의 단편이 아닌 아미노산 서열을 포함하는, 시스템 또는 키트.
  145. 제144항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 및/또는 하나 이상의 상보적 펩타이드는 비천연 아미노산, 아미노산 유사체, 및/또는 펩토이드 아미노산을 포함하는, 시스템 또는 키트.
  146. 제134항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 및/또는 하나 이상의 상보적 펩타이드는 하나 이상의 부가적인 아미노산 서열과 융합체로서 존재하는, 시스템 또는 키트.
  147. 제146항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 관심 단백질, 상호작용 요소, 공동국재화 요소, 및 결합 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되는, 시스템 또는 키트.
  148. 제146항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 항체(다클론, 단클론 및/또는 재조합), 항체 단편, 단백질 A, 단백질 A의 Ig 결합 도메인, 단백질 G, 단백질 G의 Ig 결합 도메인, 단백질 A/G, 단백질 A/G의 Ig 결합 도메인, 단백질 L, 단백질 L의 Ig 결합 도메인, 단백질 M, 단백질 M의 Ig 결합 도메인, 올리고뉴클레오타이드 프로브, 펩타이드 핵산, DARPin, 압타머, 아피머, 정제된 단백질(분석물 자체 또는 분석물에 결합하는 단백질), 및 단백질의 분석물 결합 도메인(들)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합 모이어티인, 시스템 또는 키트.
  149. 제146항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 제1 상호작용 폴리펩타이드 및 제2 상호작용 폴리펩타이드의 접촉 시에 제2 상호작용 폴리펩타이드와 복합체를 형성하도록 구성된 제1 상호작용 폴리펩타이드인, 시스템 또는 키트.
  150. 제146항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 세포 구획, 세포, 조직 또는 유기체 내에서 제2 공동국재화 폴리펩타이드와 함께 공동국재화하도록 구성된 제1 공동국재화 폴리펩타이드인, 시스템 또는 키트.
  151. 제146항에 있어서, 상기 부가적인 아미노산 서열은 관심 단백질이고 후보 약물 표적인, 시스템 또는 키트.
  152. 방법으로서,
    (a) (i) 서열번호 788 또는 서열번호 789의 폴리펩타이드 단편에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 포함하는 폴리펩타이드 성분;
    (ii) 서열번호 788 또는 서열번호 789의 상보적 부분에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하는 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드; 및
    (iii) 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질
    을 조합하는 단계; 및
    (b) 발광을 검출하는 단계로서, 상기 폴리펩타이드 성분 및 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 단독에 의해 생성된 발광 수준과 비교하여 더 큰 발광 수준은 상기 폴리펩타이드 성분과 상기 하나 이상의 상보적 펩타이드의 생물발광 복합체의 형성을 나타내는 단계
    를 포함하는, 방법.
  153. 제152항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 성분 및 상기 제1 및 제2 펩타이드 중 하나 이상이 세포에서 발현되고, 외인성으로 세포에 첨가되고/되거나 샘플에 첨가되는, 방법.
  154. 제152항에 있어서,
    (i) 상기 폴리펩타이드 성분은 서열번호 790에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 포함하고, 상기 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 서열번호 794에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하고;
    (ii) 상기 폴리펩타이드 성분은 서열번호 791에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 포함하고, 상기 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 서열번호 795에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하고;
    (iii) 상기 폴리펩타이드 성분은 서열번호 792에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 포함하고, 상기 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 서열번호 796에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하고;
    (iv) 상기 폴리펩타이드 성분은 서열번호 793에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 포함하고, 상기 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 서열번호 797에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하고;
    (v) 상기 폴리펩타이드 성분은 서열번호 790에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 포함하고, 상기 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 서열번호 798에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하고;
    (vi) 상기 폴리펩타이드 성분은 서열번호 791에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 포함하고, 상기 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 서열번호 799에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하고;
    (vii) 상기 폴리펩타이드 성분은 서열번호 792에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 포함하고, 상기 하나 이상의 상보적인 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 서열번호 800에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하고; 또는
    (viii) 상기 폴리펩타이드 성분은 서열번호 793에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 포함하고, 상기 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 서열번호 801에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하는, 방법.
  155. 방법으로서,
    (a) (i) 서열번호 788 또는 서열번호 789의 전체 길이에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하는 2개 이상의 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드 성분; 및
    (ii) 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질
    을 조합하는 단계; 및
    (b) 발광을 검출하는 단계로서, 상기 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드 성분과 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체에 의해 생성된 발광 수준과 비교하여 더 큰 발광 수준은 상기 펩타이드 및 폴리펩타이드 성분의 생물발광 복합체의 형성을 나타내는 단계
    를 포함하는, 방법.
  156. 제155항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 성분 및 상기 제1 및 제2 펩타이드 중 하나 이상이 세포에서 발현되고, 외인성으로 세포에 첨가되고/되거나 샘플에 첨가되는, 방법.
  157. 제155항에 있어서,
    (i) 상기 폴리펩타이드 성분은 서열번호 790에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 포함하고, 상기 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 서열번호 794에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하고;
    (ii) 상기 폴리펩타이드 성분은 서열번호 791에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 포함하고, 상기 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 서열번호 795에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하고;
    (iii) 상기 폴리펩타이드 성분은 서열번호 792에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 포함하고, 상기 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 서열번호 796에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하고;
    (iv) 상기 폴리펩타이드 성분은 서열번호 793에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 포함하고, 상기 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 서열번호 797에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하고;
    (v) 상기 폴리펩타이드 성분은 서열번호 790에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 포함하고, 상기 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 서열번호 798에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하고;
    (vi) 상기 폴리펩타이드 성분은 서열번호 791에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 포함하고, 상기 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 서열번호 799에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하고;
    (vii) 상기 폴리펩타이드 성분은 서열번호 792에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 포함하고, 상기 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 서열번호 800에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하고; 또는
    (viii) 상기 폴리펩타이드 성분은 서열번호 793에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 포함하고, 상기 하나 이상의 상보적 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드는 서열번호 801에 대해 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하는, 방법.
  158. 제1 분자 실체와 제2 분자 실체 사이에 상호작용을 검출하는 방법으로서,
    (a) 상기 제1 분자 실체를 제1 펩타이드, 디펩타이드 또는 트리펩타이드 태그로 태그화하는 단계;
    (b) 상기 제2 분자 실체를 제2 펩타이드, 디펩타이드 또는 트리펩타이드 태그로 태그화하는 단계;
    (c) 상기 태그화된 제1 분자 실체 및 상기 태그화된 제2 분자 실체를 조합하고, 및/또는 상기 태그화된 제1 분자 실체 및 상기 태그화된 제2 분자 실체가 서로 접촉하도록 하는 단계;
    (d) 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드 성분을 첨가하는 단계로서, 상기 제1 펩타이드, 디펩타이드 또는 트리펩타이드 태그, 상기 제2 펩타이드, 디펩타이드 또는 트리펩타이드 태그, 및 상기 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드 성분은 서열번호 788 또는 789 전체와 40% 이상의 서열 동일성을 갖고 조립하여 생물발광 복합체를 형성할 수 있는 아미노산 서열을 집합적으로 포함하는 단계;
    (e) 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질을 첨가하는 단계; 및
    (f) 상기 생물발광 복합체에 의해 생성된 발광 신호를 검출하는 단계로서, 상기 발광 신호의 크기는 상기 제1 분자 실체와 상기 제2 분자 실체 사이의 상호작용 강도와 상관관계가 있는 단계
    를 포함하는, 방법.
  159. 제158항에 있어서, 상기 제1 분자 실체 및/또는 상기 제2 분자 실체가 관심 단백질 또는 관심 펩타이드이고, 태그화가 상기 제1 태그 및/또는 제2 태그와 상기 제1 분자 실체 및/또는 상기 제2 분자 실체의 융합체를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  160. 제158항에 있어서, 상기 제1 분자 실체 및/또는 상기 제2 분자 실체가 소분자이고, 태그화가 상기 제1 분자 실체 및/또는 제2 분자 실체를 상기 제1 태그 및/또는 제2 태그에 직접 또는 간접적으로 연결하는 단계를 포함하는, 방법.
  161. 제158항에 있어서, 상기 제1 분자 실체 및 상기 제2 분자 실체 중 하나는 약물 또는 약물 후보이고 다른 하나는 약물 표적 또는 후보 약물 표적이고, 상기 생물발광 신호는 다른 약물 표적 또는 후보 약물 표적인 다른 하나에 대한 약물 또는 약물 후보의 결합을 나타내는, 방법.
  162. 제158항에 있어서, 상기 태그화된 제1 분자 실체와 상기 태그화된 제2 분자 실체를 조합하는 단계는 세포 내에서 하나 또는 둘 모두를 발현하고, 및/또는 세포에 하나 또는 둘 모두를 첨가하는 것을 포함하는, 방법.
  163. 세포를 이용하여 제1 단백질 또는 펩타이드 실체와 제2 단백질 또는 펩타이드 실체 사이의 상호작용을 검출하는 방법으로서,
    (a) 상기 제1 단백질 또는 펩타이드 실체 및 서열번호 788 또는 789의 제1 부분과 40% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 펩타이드, 디펩타이드, 또는 트리펩타이드 태그를 포함하는 융합체를 상기 세포 내에서 발현시키는 단계;
    (b) 상기 제2 단백질 또는 펩타이드 실체 및 서열번호 788 또는 789의 제2 부분과 40% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 펩타이드, 디펩타이드 또는 트리펩타이드 태그를 포함하는 융합체를 상기 세포 내에서 발현시키는 단계;
    (c) 서열번호 788 또는 789의 제3 부분과 40% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드 성분을 상기 세포에 의해 발현시키는 단계로서, 상기 제1 태그, 상기 제2 태그 및 상기 성분은 서열번호 788 또는 789의 전체와 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하고, 상기 제1 단백질 또는 펩타이드 실체와 상기 제2 단백질 또는 펩타이드 실체의 상호작용 시에 생물발광 복합체를 생성하도록 구성되는 단계;
    (d) 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질을 상기 세포에 첨가하는 단계; 및
    (e) 상기 생물발광 복합체에 의해 생성된 발광 신호를 검출하는 단계로서, 상기 발광 신호의 크기는 상기 제1 단백질 또는 펩타이드 실체와 상기 제2 단백질 또는 펩타이드 실체 사이의 상호작용 강도와 상관관계가 있는 단계
    를 포함하는, 방법.
  164. 제1 분자 실체 및 제2 분자 실체의 공동국재화를 검출하는 방법으로서,
    (a) 서열번호 788 또는 789의 제1 부분과 40% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 펩타이드, 디펩타이드 또는 트리펩타이드 태그로 상기 제1 분자 실체를 태그화하는 단계;
    (b) 서열번호 788 또는 789의 제2 부분과 40% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 펩타이드, 디펩타이드 또는 트리펩타이드 태그로 상기 제2 분자 실체를 태그화하는 단계;
    (c) 상기 태그화된 제1 분자 실체와 상기 태그화된 제2 분자 실체를 동일 시스템 내에서 조합하는 단계;
    (d) 상기 시스템에 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드 성분을 첨가하는 단계로서, 상기 성분은 서열번호 788 또는 789의 제3 부분과 40% 이상의 서열 동일성을 가지며, 상기 제1 태그, 제2 태그, 및 상기 성분은 서열번호 788 또는 789의 전체와 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하며, 상기 제1 펩타이드 태그, 상기 제2 펩타이드 태그, 및 상기 성분은 상기 제1 분자 실체와 상기 제2 분자 실체의 공동국재화 시에 생물발광 복합체를 생성하도록 구성되는 단계;
    (e) 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질을 상기 시스템에 첨가하는 단계; 및
    (f) 상기 생물발광 복합체에 의해 생성된 발광 신호를 검출하는 단계로서, 배경을 초과하는 상기 발광 신호의 존재는 상기 시스템 내에 상기 제1 분자 실체 및 상기 제2 분자 실체의 공동국재화를 나타내고, 및/또는 상기 발광 신호의 크기는 상기 시스템 내에 상기 제1 분자 실체와 상기 제2 분자 실체의 공동국재화의 양과 상관관계가 있는 단계
    를 포함하는, 방법.
  165. 제164항에 있어서, 상기 시스템이 세포, 조직, 기관, 전체 유기체, 생화학적, 비-세포 샘플을 포함하는, 방법.
  166. 제164항에 있어서, 상기 제1 분자 실체 및/또는 상기 제2 분자 실체가 관심 단백질 또는 관심 펩타이드이고, 태그화가 상기 제1 태그 및/또는 펩타이드 태그와 상기 제1 분자 실체 및/또는 상기 제2 분자 실체의 융합체를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  167. 제164항에 있어서, 상기 제1 분자 실체 및/또는 상기 제2 분자 실체가 소분자이고, 태그화가 상기 제1 태그 및/또는 제2 태그와 상기 제1 분자 실체 및/또는 상기 제2 분자 실체를 직접 또는 간접적으로 연결하는 단계를 포함하는, 방법.
  168. 제164항에 있어서, 상기 태그화된 제1 분자 실체와 상기 태그화된 제2 분자 실체를 조합하는 단계는 상기 시스템 내에서 하나 또는 둘 모두를 발현하고, 및/또는 상기 시스템에 하나 또는 둘 모두를 첨가하는 단계를 포함하는, 방법.
  169. 세포를 이용하여 제1 단백질 또는 펩타이드 실체, 및 제2 단백질 또는 펩타이드 실체의 공동국재화를 검출하는 방법으로서,
    (a) 상기 제1 단백질 또는 펩타이드 실체 및 서열번호 788 또는 789의 제1 부분과 40% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제1 펩타이드, 디펩타이드, 또는 트리펩타이드 태그를 포함하는 융합체를 상기 세포 내에서 발현시키는 단계;
    (b) 상기 세포 내에서 상기 제2 단백질 또는 펩타이드 실체 및 서열번호 788 또는 789의 제2 부분과 40% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 제2 펩타이드, 디펩타이드, 또는 트리펩타이드 태그를 포함하는 융합체를 발현시키는 단계;
    (c) 상기 세포를 이용하여 서열번호 788 또는 789의 제3 부분과 40% 이상의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 또는 폴리펩타이드 성분을 발현시키는 단계로서, 상기 제1 태그, 상기 제2 태그, 및 상기 성분은 상기 서열번호 788 또는 789의 실체와 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하고, 상기 제1 태그, 상기 제2 태그, 및 상기 성분은 상기 제1 단백질 또는 펩타이드 실체와 상기 제2 단백질 또는 펩타이드 실체의 공동국재화 시에 생물발광 복합체를 생성하도록 구성되는 단계;
    (d) 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질을 상기 세포에 첨가하는 단계; 및
    (f) 상기 생물발광 복합체에 의해 생성된 발광 신호를 검출하는 단계로서, 여기서 배경 초과의 발광 신호의 존재는 상기 세포 내에서 상기 제1 단백질 또는 펩타이드 실체와 상기 제2 단백질 또는 펩타이드 실체의 공동국재화를 나타내고, 및/또는 상기 발광 신호의 크기는 상기 제1 단백질 또는 펩타이드 실체와 상기 제2 단백질 또는 펩타이드 실체의 시스템 내 공동국재화의 양과 상관관계가 있는, 단계
    를 포함하는, 방법.
  170. 제1 항원, 에피토프, 또는 서열 및 별개의 제2 항원, 에피토프, 또는 서열을 표시하는 표적 분자를 검출하는 방법으로서,
    (a) 상기 표적 분자를 함유하는 샘플을 (i) 제1 항원, 에피토프, 또는 서열을 인식하는 제1의 1차 결합 모이어티 및 (ii) 제2 항원, 에피토프, 또는 서열을 인식하는 제2의 1차 결합 모이어티와 접촉시키고, 상기 제1 및 제2의 1차 결합 모이어티가 상기 제1 및 제2 항원, 에피토프, 또는 서열에 결합하도록 하는 단계;
    (b) 상기 샘플을 (i) 제1 태그에 접합된 제1의 2차 결합 모이어티 및 (ii) 제2 태그에 접합된 제2의 2차 결합 모이어티와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1의 2차 결합 모이어티는 상기 제1의 1차 결합 모이어티를 인식하고, 상기 제2의 2차 결합 모이어티는 상기 제2의 1차 결합 모이어티를 인식하며, 상기 제1 또는 제2 태그는 서열번호 788 또는 789의 제1 및 제2 부분과 40% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단계;
    (c) 상기 제1 및 제2의 2차 결합 모이어티가 상기 제1 및 제2의 1차 결합 모이어티에 결합하도록 하는 단계;
    (d) 상기 샘플을 서열번호 788 또는 789의 제3 부분과 40% 이상의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 및/또는 폴리펩타이드 성분과 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 태그, 상기 제2 태그, 및 상기 성분은 서열번호 788 또는 789의 전체와 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하고, 여기서, 상기 제1 태그, 상기 제2 태그, 및 상기 성분은 상호작용 시, 생물발광 복합체를 생성하도록 구성되는 단계;
    (d) 상기 샘플을 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질과 접촉시키는 단계; 및
    (e) 상기 생물발광 복합체에 의해 생성된 발광 신호를 검출하는 단계로서, 여기서 배경 초과의 발광 신호의 존재는 상기 표적 분자의 존재를 나타내고, 및/또는 상기 발광 신호의 크기는 상기 샘플 내 표적 분자의 양과 상관관계가 있는, 단계
    를 포함하는, 방법.
  171. 제170항에 있어서, 상기 결합 모이어티는 항체(다클론, 단클론 및/또는 재조합), 항체 단편, 단백질 A, 단백질 A의 Ig 결합 도메인, 단백질 G, 단백질 G의 Ig 결합 도메인, 단백질 A/G, 단백질 A/G의 Ig 결합 도메인, 단백질 L, 단백질 L의 Ig 결합 도메인, 단백질 M, 단백질 M의 Ig 결합 도메인, 올리고뉴클레오타이드 프로브, 펩타이드 핵산, DARPin, 압타머, 아피머, 정제된 단백질(분석물 자체 또는 분석물에 결합하는 단백질), 및 단백질의 분석물 결합 도메인(들)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 방법.
  172. 제170항에 있어서, 상기 표적 분자는 단백질, 핵산, 또는 소분자인, 방법.
  173. 제170항에 있어서, 상기 샘플은 시험관내 또는 생체내에 있는, 방법.
  174. 제1 항원, 에피토프 또는 서열 및 별개의 제2 항원, 에피토프 또는 서열을 표시하는 표적 분자를 검출하는 방법으로서,
    (a) 상기 샘플을 (i) 제1 태그에 접합된 제1 결합 모이어티 및 (ii) 제2 태그에 접합된 제2 결합 모이어티와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1의 2차 결합 모이어티는 상기 제1 항원, 에피토프, 또는 서열을 인식하고, 상기 제2 결합 모이어티는 상기 제2 항원, 에피토프, 또는 서열을 인식하며, 상기 제1 태그는 서열번호 788 또는 789의 제1 부분과 40% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 태그는 서열번호 788 또는 789의 제1 부분을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단계;
    (b) 상기 제1 및 제2 결합 모이어티가 상기 제1 및 제2 항원, 에피토프, 또는 서열에 결합하도록 하는 단계;
    (c) 상기 샘플을 서열번호 788 또는 789의 제3 부분과 40% 이상의 서열 동일성을 갖는 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 또는 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 태그, 상기 제2 태그, 및 상기 성분은 서열번호 788 또는 789의 전체와 40% 이상의 서열 동일성을 집합적으로 포함하고, 상기 제1 태그, 상기 제2 태그, 및 상기 성분은 상호작용 시에 생물발광 복합체를 생성하도록 구성되는 단계;
    (d) 상기 샘플을 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질과 접촉시키는 단계; 및
    (e) 상기 생물발광 복합체에 의해 생성된 발광 신호를 검출하는 단계로서, 여기서 배경 초과의 발광 신호의 존재는 상기 표적 분자의 존재를 나타내고, 및/또는 상기 발광 신호의 크기는 상기 샘플 내 표적 분자의 양과 상관관계가 있는 단계
    를 포함하는, 방법.
  175. 제174항에 있어서, 상기 결합 모이어티는 항체(다클론, 단클론 및/또는 재조합), 항체 단편, 단백질 A, 단백질 A의 Ig 결합 도메인, 단백질 G, 단백질 G의 Ig 결합 도메인, 단백질 A/G, 단백질 A/G의 Ig 결합 도메인, 단백질 L, 단백질 L의 Ig 결합 도메인, 단백질 M, 단백질 M의 Ig 결합 도메인, 올리고뉴클레오타이드 프로브, 펩타이드 핵산, DARPin, 압타머, 아피머, 정제된 단백질(분석물 자체 또는 분석물에 결합하는 단백질) 및 단백질의 분석물 결합 도메인(들)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 방법.
  176. 제174항에 있어서, 상기 표적 분자는 단백질, 핵산, 또는 소분자인, 방법.
  177. 제174항에 있어서, 상기 샘플은 시험관내, 생체내에 있거나, 또는 생화학적 샘플인, 방법.
  178. 서열번호 788 또는 789와 40% 초과, 100% 미만의 서열 동일성 및 서열번호 1 또는 3과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 조성물로서, 상기 폴리펩타이드는 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질의 존재 하에 발광을 나타내는, 조성물.
  179. 제178항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 780, 782, 784, 786, 802, 804, 806, 808, 813, 815, 또는 829 중 하나 이상과 40% 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
  180. 제178항의 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는, 핵산.
  181. 제178항의 폴리펩타이드 및 부가적인 아미노산 서열을 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
  182. 제181항의 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는, 핵산.
  183. (a) 제178항의 조성물을 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질과 접촉시키는 단계; 및 (b) 발광을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  184. 서열번호 17, 21, 또는 302 중 하나와 40% 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열의 N-말단에 연결된 서열번호 15와 40% 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드로서; 여기서 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질의 존재 하에 생성된 생물발광 신호는 폴리펩타이드가 서열번호 23으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 접촉할 때, 폴리펩타이드 및 코엘렌테라진 기질 단독에 의해 생성된 생물발광 신호와 비교하여 실질적으로 증가하는, 폴리펩타이드.
  185. 제184항의 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는, 핵산.
  186. 제184항의 폴리펩타이드 및 부가적인 아미노산 서열을 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
  187. 제181항의 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는, 핵산.
  188. (a) 제184항의 폴리펩타이드를 코엘렌테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질 및 서열번호 23과 40% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계; 및 (b) 발광을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  189. (a) 특정 세포 위치에 국재화된 아미노산 서열에 연결된 서열번호 11과 적어도 40%의 서열 동일성을 갖는 제1 아미노산 서열을 포함하는 센서 폴리펩타이드; 및
    (b) 서열번호 23에 대해 적어도 40% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 태그에 연결된 관심 단백질
    을 포함하는 시스템으로서,
    여기서 특정 세포 위치 내에 공동국재화될 때 상기 폴리펩타이드와 상기 펩타이드 태그 사이에 생물발광 복합체가 형성되는, 시스템.
  190. 제189항에 있어서, 상기 특정 세포 위치는 원형질막, 핵, 미토콘드리아 및 소포체로부터 선택되는, 시스템.
  191. (a) 세포에서 제189항의 시스템을 발현시키는 단계; (b) 상기 세포를 엔테라진 또는 코엘렌테라진 유사체 기질과 접촉시키는 단계; 및 (c) 발광을 검출하는 단계를 포함하는 방법으로서, 여기서 발광의 증가는 생물발광 복합체의 형성 및 폴리펩타이드 및 펩타이드 태그의 공동국재화를 나타내는, 방법.
  192. 제191항에 있어서, 상기 특정 세포 위치로 펩타이드 태그에 연결된 관심 전위 단백질을 유도하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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