KR20220121028A - 철 이온을 처리하는 단계를 포함하는 약물 대사능이 증진된 간 오가노이드의 제조 방법 및 상기 방법으로 제조된 간 오가노이드 - Google Patents

철 이온을 처리하는 단계를 포함하는 약물 대사능이 증진된 간 오가노이드의 제조 방법 및 상기 방법으로 제조된 간 오가노이드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 구연산 철을 처리하는 단계를 포함하는 약물 대사능이 증진된 간 오가노이드의 제조 방법 및 상기 방법으로 제조된 간 오가노이드에 관한 것으로, 본 발명의 방법에 의해 제조한 간 오가노이드는 CYP450 약물 대사 효소의 발현과 기능이 우수하고, 약물 독성, 약물 대사 능력 및 약물에 의한 심장 독성을 나타내므로 간 질환의 발병 기전 탐색 및 약물 안전성 평가 용도의 간 모델로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

철 이온을 처리하는 단계를 포함하는 약물 대사능이 증진된 간 오가노이드의 제조 방법 및 상기 방법으로 제조된 간 오가노이드{Manufacturing method of liver organoids with enhanced drug metabolic competence comprising a step of treating iron ion and liver organoids using the same}
본 발명은 철 이온을 처리하는 단계를 포함하는 약물 대사능이 증진된 간 오가노이드의 제조 방법 및 상기 방법으로 제조된 간 오가노이드에 관한 것이다.
간은 대사, 단백질 합성, 담즙 생성, 적혈구 제거와 같은 다양한 기능을 가진 대사 및 생리적 항상성의 중심 기관이다. 간 실질 세포인 간세포(hepatocyte)는 주로 간의 항상성을 유지하는 역할을 담당하므로 많은 질병의 표적이 된다. 간 부전의 질병 모델링에 대한 최근의 기술적인 발전에도 불구하고, 간 부전의 말기 단계로 이어질 수 있는 선천성 및 진행성 대사 질환의 모델이 필요한 실정이다. 더욱이, 간은 의약품의 해독에 특유한 기능을 가지고 있기 때문에, 약물 개발에서 약물 대사 및 독성 평가를 위한 도구로서 인간 간세포를 모사 하는 모델이 요구되고 있다. 현재의 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 간 모델은 간 질환의 발병 기전을 밝히고 약물 안전성을 평가하는 데 크게 기여했지만 여전히 인간의 간 생리를 완전히 반영하지 못하는 제한이 있다. 동물 모델은 종간 차이로 인해 약물 독성을 예측하는 데 한계가 있다. 또한, 초대 배양 인간 간세포(primary human hepatocyte, PHH)는 체외 간 모델의 표준이지만, 인간 간 조직에 대한 접근성이 제한되고 기능이 불안정하여 사용이 제한되고 있고, 간압 세포는 정상세포가 아니므로 약물 대사 효소가 완전하게 발현되지 않거나 기능이 감소되어 있어 약물 독성 평가에 적합하지 않다. 따라서, 인간의 간 대사를 모사할 수 있으면서도 약물 대사능을 보유한 간 모델을 만드는 것이 필요하다.
오가노이드란 줄기세포를 3차원적으로 배양하거나 응집 또는 재조합하여 만든 장기 특이적 세포 집합체로 자기 재생(self-renewal)이 가능하며 '미니 장기' 또는 '유사 장기'라고도 불린다. 오가노이드는 실제 장기와 유사한 형태로 분자 신호 조절 등과 같은 동물 모델에서는 구현하기 힘든 연구를 in vitro 상에서 구현할 수 있어 기초 연구에 매우 유용함은 물론, 인간의 발생과정, 질환 모델 확립, 의약품 유효성 평가 스크리닝, 의약품 독성 평가 플랫폼 개발, 세포치료제 개발 등 다양한 분야에 매우 유용하게 사용될 수 있는 기술이다.
인간 간 오가노이드는 R-Spondin 1 함유 배양 배지를 사용하여 성인 인간 간 조직에서 처음 개발되었다. 초대 배양 인간 간세포(HPP)도 3D 오가노이드 배양에 적용되었고, 인간 전분화능 줄기세포(human pluripotent stem cell, hPSC)에서 간 씨앗(liver bud) 및 간 오가노이드의 생성을 보고했다. 인간 전분화능 줄기세포로부터 유래한 간 오가노이드(hHO)는 유전 및 대사 장애, 세포 치료 및 약물 독성 테스트와 같은 질병 모델링을 위한 시험관 내 모델로 제시되었다.
현재 다양한 오가노이드 확립을 위한 연구가 진행되어 오고 있으며, 간 오가노이드도 개발되어 있다. 간 오가노이드 제조 방법 관련 종래기술로는 최종 내배엽(definitive endoderm) 및 간 내배엽(hepatic endoderm)에서 파생된 확장 단계로 간 오가노이드를 생성하고, 생성한 간 오가노이드가 증식 능력이 있음을 입증하고, citrullinemia type 1 및 알코올성 간 손상 모델링 및 재생 능력을 가짐을 확인한 문헌(Akbari et al. (2019). Robust, Long-Term Culture of Endoderm-Derived Hepatic Organoids for Disease Modeling. Stem Cell Reports 13, 627-641., Wang et al. (2019). Human ESC-derived expandable hepatic organoids enable therapeutic liver repopulation and pathophysiological modeling of alcoholic liver injury. Cell Res 29, 1009-1026.) 및 3D 구형 hPSC 유래 성숙 Holocarboxylase synthetase(HLC)에서 파생된 확장 단계로 간 오가노이드를 생산하고 약물 유발성 간 지방증을 평가하기 위한 모델로 간 오가노이드를 제안한 문헌(Mun et al. (2019). Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids. J Hepatol 71, 970-985.), 인간의 간세포를 채취하고 그로부터 줄기세포를 분리하여 오가노이드를 생성하는 방법을 개시하고 있는 미국 등록특허 US8642339B2가 있다.
그러나 현재까지 알려진 간 오가노이드는 약물 대사 및 수송 기능을 재현하는데에 한계가 존재한다. 약물 독성 및 효능 테스트를 위한 시험관 내 모델로서 간 오가노이드는 재현 가능하게 생산되어야 하며 성인 간 및 초대 배양 간 세포(PHH)와 유사한 약물 대사 및 수송 기능을 보여야 한다. 이를 위해서는 대부분의 의약품 및 외부 화합물(xenobiotics)의 생체 변환을 주로 담당하는 수퍼 패밀리 효소인 간 사이토크롬 P450(CYP450) 단백질을 발현하는 간 오가노이드를 제작하는 것이 필요하다. 약물 대사 및 수송과 같은 상세한 기능 분석을 통해 독성 스크리닝 플랫폼으로 기능할 수 있는 간 오가노이드의 개발이 필요하다.
이에, 본 발명자들은 철 이온이 포함된 배지에서 배양하여 간 오가노이드를 제조하는 경우 약물 대사 효소의 발현과 기능이 우수하고 약물에 의한 독성을 나타냄을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 철 이온을 처리하는 단계를 포함하는 약물 대사능이 증진된 간 오가노이드의 제조 방법 및 상기 방법으로 제조된 간 오가노이드를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은
1) 인간 전분화능 줄기세포(human pluripotent stem cell, hPSC)를 완전 내배엽 세포(definitive endoderm, DE)로 분화시키는 단계;
2) 상기 단계 1)의 완전 내배엽 세포를 간 내배엽 세포(hepatic endoderm, HE)로 분화시키는 단계;
3) 상기 단계 2)의 간 내배엽 세포를 간 내배엽 오가노이드(hepatic endoderm organoid, hHEO)로 분화시키는 단계;
4) 상기 단계 3)의 간 내배엽 오가노이드를 철 이온을 포함하는 배지에서 간 오가노이드(hepatic organoid, hHO)로 분화시키는 단계; 를 포함하는, 간 오가노이드의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 간 오가노이드의 제조방법에 의해 제조된 약물 대사 능력이 증진된 간 오가노이드를 제공한다.
본 발명은 철 이온을 처리하는 단계를 포함하는 약물 대사능이 증진된 간 오가노이드의 제조 방법 및 상기 방법으로 제조된 간 오가노이드에 관한 것으로, 본 발명의 방법에 의해 제조한 간 오가노이드는 CYP450 약물 대사 효소의 발현과 기능이 우수하고, 약물 독성, 약물 대사 능력 및 약물에 의한 심장 독성을 나타내므로 간 질환의 발병 기전 탐색 및 약물 안전성 평가 용도의 간 모델로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 인간 유도 만능줄기세포로부터 분화 기간에 따른 간 오가노이드의 제조방법 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 물방울(Droplet) 모양의 간 내배엽 오가노이드(D-HEO)를 나타낸 도이다.
도 3은 현탁(Suspension) 상태의 간 내배엽 오가노이드(S-HEO)를 나타낸 도이다.
도 4는 간 내배엽 세포(hepatic endoderm, HE) 및 간 내배엽 세포로부터 분화시킨 물방울 모양의 간 내배엽 오가노이드(D-HEO)를 나타낸 도이다.
도 5는 간 내배엽 세포(HE) 및 물방울 모양의 간 내배엽 오가노이드(D-HEO)에서 간 전구세포(hepatic progenitor cell)/줄기세포(stem cell)의 마커인 EpCAM 및 R-spondin 1에 결합하는 Wnt의 표적 단백질인 LGR5을 발현하는 세포의 수를 유세포 분석으로 나타내고, 표적 유전자 AXIN2 및 EPHB2의 발현을 RT-qPCR로 측정한 것으로, 간 내배엽 세포에 비해 간 내배엽 오가노이드에서 Wnt 신호 전달 과정이 필요하지 않음을 나타낸 도이다.
도 6은 물방울 모양으로 간 내배엽 오가노이드를 분화시킨 경우 R-Spondin 1, Noggin 및 EGF(RNE)를 제외한 간 내배엽 오가노이드 생산 배지에서 제조된 오가노이드의 수는 RNE가 포함된 간 내배엽 오가노이드 생산 배지에서 제조된 오가노이드와 유사함을 나타낸 도이다.
도 7은 현탁 상태로 간 내배엽 오가노이드를 분화시킨 경우 R-Spondin 1, Noggin 및 EGF(RNE)를 제외한 간 내배엽 오가노이드 생산 배지에서 제조된 오가노이드의 수는 RNE가 포함된 간 내배엽 오가노이드 생산 배지에서 제조된 오가노이드에 비해 오가노이드 수가 현저하게 증가함을 나타낸 도이다.
도 8은 현탁 상태로 제조한 간 내배엽 오가노이드(S-HEO)의 형성 속도는 RNE가 있는 배지에서 배양한 경우에 비해 RNE가 없는 배지에서 배양한 경우의 3.5배 이상임을 나타낸 도이다.
도 9는 D(+)-HEO, D(-)-HEO, S(+)-HEO 및 S(-)-HEO의 네 가지 조건에서 배양한 간 내배엽 오가노이드의 구조를 bright-field 현미경 이미지 및 헤마톡실린&에오신(Hematoxlin&Eosin,H&E) 염색으로 확인한 도이다.
도 10은 D(+)-HEO, D(-)-HEO, S(+)-HEO 및 S(-)-HEO의 네 가지 조건에서 배양한 간 내배엽 오가노이드에서 간 전구 세포 마커인 SOX9, CK19 및 EpCAM이 발현하고 있는 것을 확인한 도이다.
도 11은 D(+)-HEO, D(-)-HEO, S(+)-HEO 및 S(-)-HEO의 네 가지 조건에서 배양한 간 내배엽 오가노이드에서 차등적으로 발현하는 유전자를 나타낸 도이다.
도 12는 간 내배엽 오가노이드로부터 간 오가노이드를 분화시키는 과정을 나타낸 개략도이다.
도 13은 간 오가노이드로의 분화 동안 EGF가 없는 배양 배지 조건에서 간 오가노이드를 분화시켰을 때, 주요 간 유전자의 발현이 증가함을 나타낸 도이다.
도 14는 D(+)-HO, D(-)-HO, S(+)-HO 및 S(-)-HO의 네 가지 조건에서 배양한 간 오가노이드의 구조를 bright-field 현미경 이미지 및 헤마톡실린&에오신(Hematoxlin&Eosin,H&E) 염색으로 확인한 도이다.
도 15는 D(+)-HO, D(-)-HO, S(+)-HO 및 S(-)-HO의 네 가지 조건에서 배양한 간 오가노이드에서 간 마커인 ALB, AAT, CYP3A4이 발현하고 있는 것을 확인한 도이다.
도 16은 D(+)-HO, D(-)-HO, S(+)-HO 및 S(-)-HO의 네 가지 조건에서 배양한 간 오가노이드에서 간 마커인 ALB, AAT, TDO2, HNF4A, G6P, CYP3A4의 발현 수준을 확인한 것으로, D(-)-HO 및 S(-)-HO에서 간 마커의 발현이 높음을 확인한 도이다.
도 17은 D(+)-HO, D(-)-HO, S(+)-HO 및 S(-)-HO의 네 가지 조건에서 배양한 간 오가노이드에서 ALB(알부민)을 발현하는 세포 수를 계수한 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 D(-)-HO 및 S(-)-HO에서 D(+)-HO 및 S(+)-HO보다 ALB(알부민), AAT(Alpha 1-antitrypsin), 및 ApoA1(Apolipoprotein A1) 단백질의 발현이 증가함을 확인한 도이다.
도 19는 D(-)-HO 및 S(-)-HO 조건에서 배양한 간 오가노이드가 미세 융모 구조(MV)와 밀착 연접 구조(TJ)를 나타냄을 확인한 도이다.
도 20은 D(-)-HO, S(-)-HO, 초대 배양 인간 간세포(PHH), 간암 세포주(HepG2) 및 2D 간세포 유사 세포(2D HLC) 사이에서 약물 수송체 관련 유전자의 전사 발현 분석 결과, 2D HLC와 비교하여 D(-)-HO 및 S(-)-HO 모두 MRP2, BSEP, MDR1 및 BCRP와 같은 정단부 약물 수송체(apical transporter) 유전자의 발현이 높음을 확인한 도이다.
도 21은 D(-)-HO 및 S(-)-HO의 정단층 막에서 정단부 약물 수송체(apical drug transporter) 관련 유전자인 MRP2(CDFDA로 염색)의 발현의 확인과, MRP2 억제제인 프로베네시드를 처리한 결과 각 약물 수송체 특이적 형광은 간 오가노이드 내강에 축적됨을 확인한 도이다.
도 22는 D(-)-HO 및 S(-)-HO의 정단층 막에서 정단부 약물 수송체(apical drug transporter) 관련 유전자인 MDR1(로다민 123으로 염색)의 발현의 확인과, MDR1 억제제인 케토코나졸을 처리한 결과 각 약물 수송체 특이적 형광은 간 오가노이드 내강에 축적됨을 확인한 도이다.
도 23은 D(-)-HO 및 S(-)-HO의 정단층 막에서 정단부 약물 수송체(apical drug transporter) 관련 유전자인 BSEP(CLF로 염색)의 발현의 확인과, BSEP 억제제인 케토코나졸을 처리한 결과 각 약물 수송체 특이적 형광은 간 오가노이드 내강에 축적됨을 확인한 도이다.
도 24는 간 오가노이드에서 19개의 서로 다른 세포 클러스터가 존재하는 것을 확인한 도이다.
도 25는 간 오가노이드가 3개의 세포 그룹으로 구성되어 있으며, 첫 번째 그룹은 담도 유사 세포(biliary-like cell)가 포함되어 있고, 두 번째 그룹은 담낭 유사 세포(gallbladder-like cell)가 포함되어 있으며, 세 번째 그룹에는 간 세포 유사 세포(hepatocyte-like cell)가 포함되어 있음을 확인한 도이다.
도 26은 각 그룹의 대표적인 마커(간세포 계통의 경우 ALB, ASGR1 및 SERPINA1, 담즙 계통의 경우 KRT19, EPCAM 및 ITGB4, 담낭 계통의 경우 REG4, TFF3 및 FCGBP)가 발현되는 것을 확인한 도이다.
도 27은 각 그룹의 특정 마커는 각 클러스터에서 독점적으로 발현됨을 확인한 도이다.
도 28은 D(-)-HO 및 S(-)-HO에서 4개의 CYP450 유전자는 D(+)-HO 및 S(+)-HO보다 높은 발현 수준을 나타냄을 확인한 것으로, D(-)-HO 및 S(-)-HO 조건에서 배양된 간 오가노이드가 약물 대사 능력이 증진된 것을 나타낸 도이다.
도 29는 주요 CYP450의 활성도를 D(-)-HO, S(-)-HO, 초대 배양 인간 간세포(PHH), 간암 세포주(HepG2) 및 2D 간세포 유사 세포(2D HLC)에서 나타낸 도이다.
도 30은 간 내배엽 오가노이드를 20μM 구연산 철(FC)을 포함하는 간 오가노이드 분화 배지를 사용하여 간 오가노이드로 분화시킨 과정의 개략도이다.
도 31은 20μM 구연산 철(FC)을 포함하는 간 오가노이드 분화 배지를 사용하여 간 오가노이드로 분화시킨 경우 세포 독성이 없음을 나타낸 도이다.
도 32는 20μM 구연산 철(FC)을 포함하는 간 오가노이드 분화 배지를 사용하여 간 오가노이드로 분화시킨 경우 세포가 살아있음을 나타낸 도이다.
도 33은 24시간 동안 CYP450 효소의 활성을 측정한 것으로, 구연산 철을 포함하는 간 오가노이드 분화 배지를 사용하여 현탁 상태의 간 오가노이드로 분화시킨 경우 약물 대사 효소인 CYP450의 활성이 증가한 결과를 나타낸 도이다.
도 34는 7일 동안 CYP450 효소의 활성을 측정한 것으로, 구연산 철을 포함하는 간 오가노이드 분화 배지를 사용하여 현탁 상태의 간 오가노이드로 분화시킨 경우 약물 대사 효소인 CYP450의 활성이 유지되는 결과를 나타낸 도이다.
도 35는 대부분의 약물에서 D-HO FC는 다른 세포 모델보다 낮은 농도에서 세포 독성을 갖는 것을 나타낸 도이다.
도 36은 구연산 철을 포함하는 간 오가노이드 분화 배지를 사용하여 분화시킨 간 오가노이드는 아미트립틸린(CYP2D6 및 CYP2C19), 클로르프로마진(CYP2D6) 및 디클로페낙(CYP2C9 및 UGT2B7)을 포함한 약물의 대사 능력을 가짐을 나타낸 도이다.
도 37은 간에서의 아세트아미노펜의 대사 경로를 나타낸 도이다.
도 38은 간 오가노이드, 초대 배양 인간 간세포(PHH), 간암 세포주(HepG2) 및 2D 간 세포 유사 세포(hepatocyte like cell)에서 간에서의 아세트아미노펜의 CYP450 매개 되지 않은 대사 산물인 APAP-글루쿠로나이드(APAP-Glu) 및 APAP-설페이트(APAP-Sul)의 농도를 나타낸 도이다.
도 39는 간 오가노이드, 초대 배양 인간 간세포(PHH), 간암 세포주(HepG2) 및 2D 간 세포 유사 세포(hepatocyte like cell)에서 간에서의 아세트아미노펜의 CYP450 매개 대사 산물인 APAP-글루타치온(APAP-GSH) 및 APAP-시스테인(APAP-Cys)의 농도를 나타낸 도이다.
도 40은 간에서의 피마사르탄의 대사 경로를 나타낸 도이다.
도 41은 간 오가노이드, 초대 배양 인간 간세포(PHH), 간암 세포주(HepG2) 및 2D 간 세포 유사 세포(hepatocyte like cell)에서 간에서의 피마사르탄의 CYP3A4 매개 대사 산물인 FMS S-옥사이드, BR-A-557 및 BR-A-535의 농도를 나타낸 도이다.
도 42는 간 오가노이드, 초대 배양 인간 간세포(PHH), 간암 세포주(HepG2) 및 2D 간 세포 유사 세포(hepatocyte like cell)에서 간에서의 피마사르탄의 CYP2C9 매개 대사 산물인 1-OH 부틸 FMS, 2- 또는 3-OH 부틸 FMS 및 4-OH 부틸 FMS의 농도를 나타낸 도이다.
도 43은 사이클로포스파마이드(CP)가 간에서 대사되어 심장 독성을 미치는 대사 경로를 나타낸 도이다.
도 44는 24시간 및 72시간 동안 250 및 500μM의 농도로 사이클로포스파마이드를 처리한 후, 간 오가노이드를 포함하거나 포함하지 않은 hiPCS-CM의 박동률을 나타낸 도이다.
도 45는 24시간 및 72시간 동안 250 및 500μM의 농도로 사이클로포스파마이드를 처리한 후, 간 오가노이드를 포함하거나 포함하지 않은 hiPCS-CM의 정규화된 필드 전위 지속 시간을 나타낸 도이다.
도 46은 테르비나핀(Terfenadine, TER)이 심장 독성을 미치는 대사 경로를 나타낸 도이다.
도 47은 24시간 및 72시간 동안 1 및 10μM의 농도로 테르비나핀을 처리한 후, 간 오가노이드를 포함하거나 포함하지 않은 hiPCS-CM의 박동률을 나타낸 도이다.
도 48은 24시간 및 72시간 동안 1 및 10μM의 농도로 테르비나핀을 처리한 후, 간 오가노이드를 포함하거나 포함하지 않은 hiPCS-CM의 정규화된 필드 전위 지속 시간을 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 1) 인간 전분화능 줄기세포(human pluripotent stem cell, hPSC)를 완전 내배엽 세포(definitive endoderm, DE)로 분화시키는 단계;
2) 상기 단계 1)의 완전 내배엽 세포를 간 내배엽 세포(hepatic endoderm, HE)로 분화시키는 단계;
3) 상기 단계 2)의 간 내배엽 세포를 간 내배엽 오가노이드(hepatic endoderm organoid, hHEO)로 분화시키는 단계;
4) 상기 단계 3)의 간 내배엽 오가노이드를 철 이온을 포함하는 배지에서 간 오가노이드(hepatic organoid, hHO)로 분화시키는 단계; 를 포함하는, 간 오가노이드의 제조방법을 제공한다.
상기 철 이온을 포함하는 배지는 구연산 철(ferric citrate, FC), 염화철(FeCl3), 황산철(Fe2SO4), 황산제이철(Fe2(SO4)3), 질산철(Fe(NO3)3) 및 펜타카보닐철(Fe(CO)5)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 배지일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인간 전분화능 줄기세포는 인간 배아줄기세포(human embryonic stem cell, hESC) 또는 인간 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)일 수 있고, 인간 유래인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단계 2)의 간 내배엽 세포는 전체 세포 중 95% 이상 함유되고, 유세포 분석을 통하여 간 내배엽 세포가 95% 이상 함유되는 것이 확인될 경우 단계 3)으로 진행한다.
상기 구연산 철은 10 내지 30μM의 농도로 포함될 수 있고, 바람직하게는 15 내지 25μM의 농도로 포함될 수 있다.
상기 분화는 세포의 미세환경 모사를 위해 마트리겔이 코팅된 배양용기에서 줄기세포를 분화시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 피브로넥틴(fibronectin) 또는 라미닌(laminin)이 코팅된 배양용기가 사용될 수 있다.
상기 간 내배엽 오가노이드는 물방울 형태(droplet) 또는 현탁 상태(suspension)로 제조될 수 있다.
상기 단계 3)의 간 내배엽 오가노이드는 동결 보존 및 해동이 가능하다.
상기 물방울 형태의 간 내배엽 오가노이드는 간 내배엽 세포와 Matrigel GFR(growth factor reduced) 원액을 혼합하여 웰 플라이트에 돔 구조로 분주하고 굳혀서 제조할 수 있다.
상기 현탁 상태의 간 내배엽 오가노이드는 Matrigel GFR(growth factor reduced)가 포함된 배지가 분주된 웰 플레이트에 간 내배엽 세포를 첨가하여 제조할 수 있다.
상기 단계 3)의 분화는 발생 단계(generation stage) 및 확장 단계(expansion stage)로 이루어진다.
발생 단계는 간 내배엽 오가노이드 생산 배지(GE medium, GM)에서 이루어진다.
상기 간 내배엽 오가노이드 생산 배지는 섬유아세포 성장 인자 10(fibroblast growth factor, FGF10), 간 세포 성장 인자(hepatocyte growth factor, HGF), 니코틴아마이드(nicotinamide), [Leu15]-Gastrin I human, N-acetyl-L-cysteine, A83-01, Forskolin, CHIR 99021을 포함하고, 현탁 상태의 간 내배엽 오가노이드를 제조하고자 하는 경우 선택적으로 Matrigel GFR(growth factor reduced)를 포함할 수 있다.
상기 FGF10는 상기 배지에 30 내지 70ng/㎖, 바람직하게는 40 내지 60ng/㎖ 또는 더 바람직하게는 45 내지 55ng/㎖로 포함될 수 있다.
상기 HGF는 상기 배지에 5 내지 45ng/㎖, 바람직하게는 15 내지 35ng/㎖ 또는 더 바람직하게는 20 내지 30ng/㎖로 포함될 수 있다.
상기 니코틴아마이드는 상기 배지에 1 내지 20mM, 바람직하게는 5 내지 15mM 또는 더 바람직하게는 7 내지 13mM로 포함될 수 있다.
상기 [Leu15]-Gastrin I human는 상기 배지에 1 내지 20nM, 바람직하게는 5 내지 15nM 또는 더 바람직하게는 7 내지 13nM로 포함될 수 있다.
상기 N-acetyl-L-cysteine는 상기 배지에 0.25 내지 2.25mM, 바람직하게는 0.5 내지 2mM 또는 더 바람직하게는 1 내지 1.5mM로 포함될 수 있다.
상기 A83-01는 상기 배지에 1 내지 9μM, 바람직하게는 3 내지 7μM 또는 더 바람직하게는 4 내지 6μM로 포함될 수 있다.
상기 Forskolin은 상기 배지에 5 내지 15μM, 바람직하게는 7 내지 13μM 또는 더 바람직하게는 8 내지 12μM로 포함될 수 있다.
상기 CHIR 99021은 상기 배지에 1 내지 5μM, 바람직하게는 2 내지 4μM 또는 더 바람직하게는 2.5 내지 3.5μM로 포함될 수 있다.
상기 Matrigal GFR은 상기 배지에 0.2 내지 0.8mg/㎖, 바람직하게는 0.3 내지 0.7mg/㎖ 또는 더 바람직하게는 0.4 내지 0.6mg/㎖로 포함될 수 있다.
상기 발생 단계는 10일 내지 18일 동안 수행될 수 있고, 바람직하게는 12 내지 16일 동안 수행될 수 있으며 더 바람직하게는 13 내지 15일 동안 수행될 수 있다.
상기 확장 단계는 상기 발생 단계에서 사용한 간 내배엽 오가노이드 생산 배지와 동일한 조성을 가진 배지에서 이루어진다.
상기 확장 단계는 3일 내지 7일 동안 수행될 수 있고, 바람직하게는 4일 내지 6일 동안 수행될 수 있다.
기존의 간 오가노이드 배양 방법에서의 배지 조성(Hugh et al., Long-Term Culture of Genome-Stable Bipotent Stem Cells from Adult Human Liver, Cell (2015))과 비교하여, 간 내배엽 세포를 간 내배엽 오가노이드로 분화시키는 단계 중 발생 단계(generation stage)에서 사용되는 배지에서 R spondin-1, Noggin 및 EGF가 없고, 확장 단계(expansion stage)에서 R spondin-1 및 EGF가 포함되지 않는다.
상기 간 내배엽 세포를 간 내배엽 오가노이드로 분화시키는 단계는 13일 내지 25일 동안 수행될 수 있고, 바람직하게는 15일 내지 23일 동안 수행될 수 있으며, 더 바람직하게는 17일 내지 21일 동안 수행될 수 있다.
상기 단계 4)의 간 오가노이드는 물방울 형태(droplet) 또는 현탁 상태(suspension)로 제조될 수 있다.
상기 간 오가노이드는 담도 유사 세포(biliary-like cell), 담낭 유사 세포(gallbladder-like cell) 및 간 세포 유사 세포(hepatocyte-like cell)를 포함한다.
상기 단계 4)의 분화는 간 내배엽 오가노이드를 계대 배양하는 단계 및 간 내배엽 오가노이드를 간 오가노이드로 분화시키는 단계로 구성된다.
물방울 형태의 간 오가노이드는 물방울 형태의 간 내배엽 오가노이드를 계대 배양하는 단계 및 간 오가노이드로 분화시키는 단계를 수행하여 제조된다.
현탁 상태의 간 오가노이드는 현탁 상태의 간 내배엽 오가노이드를 계대 배양하는 단계 및 간 오가노이드로 분화시키는 단계를 수행하여 제조된다.
상기 간 내배엽 오가노이드를 계대 배양하는 단계는 간 내배엽 오가노이드 유지 배지(EM)에서 수행된다.
상기 간 내배엽 오가노이드 유지 배지는 골형성 단백질(bone morphogenetic protein 7, BMP7), 섬유아세포 성장 인자 10(fibroblast growth factor, FGF10), 간 세포 성장 인자(hepatocyte growth factor, HGF), 니코틴아마이드(nicotinamide), [Leu15]-Gastrin I human, N-acetyl-L-cysteine, A83-01, Forskolin, CHIR 99021을 포함하고, 현탁 상태의 간 오가노이드를 제조하고자 하는 경우 선택적으로 Matrigel GFR(growth factor reduced)를 포함할 수 있다.
상기 BMP7은 상기 배지에 5 내지 45ng/㎖, 바람직하게는 15 내지 35ng/㎖ 또는 더 바람직하게는 20 내지 30ng/㎖로 포함될 수 있다.
상기 FGF10는 상기 배지에 30 내지 70ng/㎖, 바람직하게는 40 내지 60ng/㎖ 또는 더 바람직하게는 45 내지 55ng/㎖로 포함될 수 있다.
상기 HGF는 상기 배지에 5 내지 45ng/㎖, 바람직하게는 15 내지 35ng/㎖ 또는 더 바람직하게는 20 내지 30ng/㎖로 포함될 수 있다.
상기 니코틴아마이드는 상기 배지에 1 내지 20mM, 바람직하게는 5 내지 15mM 또는 더 바람직하게는 7 내지 13mM로 포함될 수 있다.
상기 [Leu15]-Gastrin I human는 상기 배지에 1 내지 20nM, 바람직하게는 5 내지 15nM 또는 더 바람직하게는 7 내지 13nM로 포함될 수 있다.
상기 N-acetyl-L-cysteine는 상기 배지에 0.25 내지 2.25mM, 바람직하게는 0.5 내지 2mM 또는 더 바람직하게는 1 내지 1.5mM로 포함될 수 있다.
상기 A83-01는 상기 배지에 1 내지 9μM, 바람직하게는 3 내지 7μM 또는 더 바람직하게는 4 내지 6μM로 포함될 수 있다.
상기 Forskolin은 상기 배지에 5 내지 15μM, 바람직하게는 7 내지 13μM 또는 더 바람직하게는 8 내지 12μM로 포함될 수 있다.
상기 CHIR 99021은 상기 배지에 1 내지 5μM, 바람직하게는 2 내지 4μM 또는 더 바람직하게는 2.5 내지 3.5μM로 포함될 수 있다.
상기 Matrigal GFR은 상기 배지에 0.2 내지 0.8mg/㎖, 바람직하게는 0.3 내지 0.7mg/㎖ 또는 더 바람직하게는 0.4 내지 0.6mg/㎖로 포함될 수 있다.
상기 간 내배엽 오가노이드를 계대 배양하는 단계는 2일 내지 8일 동안 수행될 수 있고, 바람직하게는 3 내지 7일 동안 수행될 수 있으며 더 바람직하게는 4 내지 6일 동안 수행될 수 있다.
상기 간 내배엽 오가노이드를 간 오가노이드로 분화시키는 단계는 간 오가노이드 분화 배지(DM)에서 수행된다.
상기 간 오가노이드 분화 배지는 골형성단백질(bone morphogenetic protein 7, BMP7), 섬유아세포 성장 인자 19(fibroblast growth factor, FGF19), 간 세포 성장 인자(hepatocyte growth factor, HGF), [Leu15]-Gastrin I human, N-acetyl-L-cysteine, A83-01, DAPT, 덱사메타손(dexamethasone)을 포함하고, 현탁 상태의 간 오가노이드를 제조하고자 하는 경우 선택적으로 Matrigel GFR(growth factor reduced)를 포함할 수 있으며, 약물 대사 능력을 추가로 증진시키기 위하여 구연산 철(ferric citrate, FC)를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 BMP7은 상기 배지에 5 내지 45ng/㎖, 바람직하게는 15 내지 35ng/㎖ 또는 더 바람직하게는 20 내지 30ng/㎖로 포함될 수 있다.
상기 FGF19는 상기 배지에 50 내지 150ng/㎖, 바람직하게는 70 내지 130ng/㎖ 또는 더 바람직하게는 90 내지 110ng/㎖로 포함될 수 있다.
상기 HGF는 상기 배지에 5 내지 45ng/㎖, 바람직하게는 15 내지 35ng/㎖ 또는 더 바람직하게는 20 내지 30ng/㎖로 포함될 수 있다.
상기 [Leu15]-Gastrin I human는 상기 배지에 1 내지 20nM, 바람직하게는 5 내지 15nM 또는 더 바람직하게는 7 내지 13nM로 포함될 수 있다.
상기 N-acetyl-L-cysteine는 상기 배지에 0.25 내지 2.25mM, 바람직하게는 0.5 내지 2mM 또는 더 바람직하게는 1 내지 1.5mM로 포함될 수 있다.
상기 A83-01는 상기 배지에 0.1 내지 0.9μM, 바람직하게는 0.2 내지 0.8μM 또는 더 바람직하게는 0.4 내지 0.6μM로 포함될 수 있다.
상기 DAPT는 상기 배지에 0.2 내지 1.8㎕, 바람직하게는 0.5 내지 1.5㎕ 또는 더 바람직하게는 0.8 내지 1.2㎕로 포함될 수 있다.
상기 덱사메타손은 상기 배지에 1 내지 5μM, 바람직하게는 2 내지 4μM 또는 더 바람직하게는 2.5 내지 3.5μM로 포함될 수 있다.
상기 Matrigal GFR은 상기 배지에 0.2 내지 0.8mg/㎖, 바람직하게는 0.3 내지 0.7mg/㎖ 또는 더 바람직하게는 0.4 내지 0.6mg/㎖로 포함될 수 있다.
상기 구연산 철은 10 내지 30μM의 농도로 포함될 수 있고, 바람직하게는 15 내지 25μM의 농도로 포함될 수 있다.
상기 간 내배엽 오가노이드를 간 오가노이드로 분화시키는 단계는 10일 내지 20일 동안 수행될 수 있고, 바람직하게는 12 내지 18일 동안 수행될 수 있으며 더 바람직하게는 13 내지 17일 동안 수행될 수 있다.
또한, 간 내배엽 오가노이드를 간 오가노이드로 분화시키는 단계 중 간 내배엽 오가노이드를 계대 배양하는 단계에서 기존의 배양 방법과 비교하여 R spondin-1 및 EGF가 포함되지 않고, 간 내배엽 오가노이드를 간 오가노이드로 분화시키는 단계에서 EGF가 포함되지 않는다.
결론적으로, 간 내배엽 오가노이드로의 분화 단계에서 R-spondin 1, Noggin 및 EGF를 포함하지 않는 배양 배지에서 배양하는 것이 오가노이드 성숙 단계에서 영향을 미치며, 간 오가노이드로의 분화 단계에서 배양 배지에서 R-spondin 1, EGF의 제거가 간 및 약물 대사에 관련된 유전자의 발현 수준을 증가시켜 간 오가노이드의 성숙을 촉진시킨다.
상기 단계 4)의 분화는 10일 내지 30일 동안 수행될 수 있고, 바람직하게는 13일 내지 27일 동안 수행될 수 있으며 더 바람직하게는 15 내지 25일 동안 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 간 오가노이드의 제조방법에 의해 제조된 약물 대사 능력이 증진된 간 오가노이드를 제공한다.
상기 간 오가노이드는 시토크롬 P450(cytochrome P450, CYP450)을 높은 수준으로 발현한다.
시토크롬 P450(Cytochrome P450, CYP450)은 헴(heme)을 보결원자단으로 가지는 superfamily 효소군으로 대부분의 약물이나 환경물질 등의 다양한 외인성 물질 또는 스테로이드나 지질 등의 내인성 물질에 대해 산화적 대사 작용을 수행하는 대표적인 촉매효소로 알려져있다. CYP450 효소들은 헴에 포함되어 있는 철 이온이 환원상태에서 일산화탄소 결합 시 450㎚에서 특이적인 흡광 스펙트럼을 보임으로써 그 이름이 유래되었다.
CYP450 효소의 주요 기능은 다양한 기질들에 대한 단일 산화반응(mono- oxygenation 또는 mixed-function oxidase 반응)이라고 할 수 있으며, 이에는 산소분자와 NADPH의 환원 물질들이 필요하다. 산소분자의 한 원자는 산화되는 기질과 결합하며 다른 한 원자는 물로 환원된다. 간세포 등에 많이 포함되어 있는 마이크로솜 CYP450 시스템은 CYP450 효소들이 소포체의 막에 위치하여 막에 함께 존재하는 NADPH-P450 환원효소로부터 전자를 전달받아 산화반응을 수행한다.
상기 시토크롬 P450은 CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 및 CYP3A4로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이다.
상기 CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 및 CYP3A4은 시토크롬 P450의 일종이며, 사용되고 있는 약물의 95%를 일차적으로 대사하는 기능을 가지고 있다.
또한, 상기 간 오가노이드는 약물에 의한 독성 평가에 사용될 수 있다.
또한, 상기 간 오가노이드는 약물에 의한 심장 독성 평가에 사용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 간 내배엽 세포로부터 간 내배엽 오가노이드를 분화시키는 단계에서 Wnt 신호 전달과정이 필요하지 않음을 확인하고(도 5), 간 내배엽 세포로부터 간 내배엽 오가노이드를 분화시키는 단계의 배지 조성 중 R-Spondin 1, Noggin 및 EGF(RNE)를 제외한 배지에서 배양한 경우에 RNE를 포함하는 배지에서 배양한 경우에 비해 오가노이드의 수가 동등 또는 그 이상이고(도 6 및 도 7), 오가노이드 형성 속도가 증가하며(도 8), 간 전구 세포 마커인 SOX9, CK19 및 EpCAM이 잘 발현하고 있음을 확인하였다(도 10). 또한, EGF가 없는 배양 배지 조건에서 간 내배엽 오가노이드로부터 간 오가노이드를 분화시켰을 때, 주요 간 유전자의 발현이 증가하였으며(도 13), 간 마커인 ALB, AAT, CYP3A4이 발현되며(도 15), D(-)-HO 및 S(-)-HO에서 간 마커의 발현 수준이 높고(도 16), D(-)-HO 및 S(-)-HO에서 D(+)-HO 및 S(+)-HO보다 간 마커인 ALB(알부민), AAT(Alpha 1-antitrypsin), 및 ApoA1(Apolipoprotein A1) 단백질의 발현이 증가함을 확인하였다(도 18). 또한, 간 오가노이드에서 정단부 약물 수송체(apical transporter)의 발현이 높으며(도 20), 담도 유사 세포(biliary-like cell), 담낭 유사 세포(gallbladder-like cell), 간 세포 유사 세포(hepatocyte-like cell)가 포함되어 있고(도 25 내지 도 27), 약물 대사 효소인 CYP450 유전자의 발현 수준이 D(-)-HO 및 S(-)-HO에서 D(+)-HO 및 S(+)-HO보다 높음을 확인하였다(도 28 및 도 29). 또한, 표 8 또는 표 9의 조성을 가지는 간 오가노이드 분화 배지에 구연산 철을 첨가하여 간 오가노이드를 분화시키는 경우(도 30), CYP450 활성이 크게 증가하였고(도 33), 장기간 동안 효소 활성이 유지되었다(도 34). 또한, 구연산 철을 첨가하여 분화시킨 간 오가노이드는 8종의 약물에서 세포 독성을 나타냈고(도 35), CYP450 매개 약물 대사 능력을 나타냈으며(도 36), 아세트아미노펜 및 피마사르탄 대사 능력이 있음과(도 37 내지 도 42), 사이클로포스파마이드 및 테르비나핀에 의한 심장 독성을 나타냄을 확인하였다(도 43 내지 도 48).
따라서, 본 발명의 방법으로 제조된 간 오가노이드는 간 질환의 발병 기전 탐색 및 약물 안전성 평가 용도의 간 모델로 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 인간 유도 만능줄기세포(human induced pluripotent stem cells, iPSCs)로부터 유래된 간 내배엽 오가노이드 (human hepatic endoderm organoids , hHEOs)의 제조
<1-1> 플레이트의 코팅 및 인간 전분화능 줄기세포의 배양(- 10일차 )
먼저, 세포 배양용 플레이트에 비트로넥틴 XF(Vitronectin XF, Cat#.07180, Stem cell technologies)를 첨가하여, 플레이트의 웰을 코팅하였다. 코팅된 플레이트에 OCT4, SOX2, KLF4 및 c-MYC의 이소성 발현을 통해 인간 진피 섬유 아세포에서 유래한 인간 유도 만능 줄기세포(iPSCs)(한용만 박사 제공, KAIST)를 mTeSR™-E8™ 배지(Cat#.05940, Stem cell technologies)를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 Dulbecco's phosphate-buffered saline(DPBS)에서 0.5mM EDTA를 사용하여 3일 또는 4일마다 계대 배양하여 준비하였다. 이때, 계대 배양 기간 동안에 배지를 매일 교체하였다.
12 웰 플레이트에 웰 당 희석한 Matrigel(hESC qualified Matrigel, Corning, Cat No. 354277) 0.5㎖를 첨가하여 37℃에서 30분간 플레이트를 마트리겔로 코팅하였다. 그 후 배양된 인간 유도 만능 줄기세포를 꺼내 배지를 제거한 후, 0.5 mM EDTA가 첨가된 Ca2 + 및 Mg2 +가 없는 DPBS 1㎖를 첨가하고 37℃에서 4 내지 5분간 배양하였다. 배양한 세포를 배양기에서 꺼내 플레이트를 기울여 EDTA를 제거하고 2μM의 Y27632가 함유된 mTeSR™-E8™ 배지 12㎖ 중 1㎖를 이용하여 세포를 회수하였다. 회수한 세포는 11㎖의 2μM Y27632가 함유된 mTeSR™-E8™ 배지가 포함된 코니컬 튜브에 넣고 부드럽게 피펫팅하여 섞어준 후, 마트리겔이 코팅된 플레이트에 회수한 세포를 웰 당 1㎖ 씩 분주하고 37℃, 5% CO2 환경에서 하루 동안 배양하여 인간 유도 만능 줄기세포를 마트리겔이 코팅된 플레이트에 씨딩(seeding) 하였다.
<1-2> 인간 전분화능 줄기세포를 완전 내배엽 세포(definitive endoderm, DE)로 분화(- 9일차 내지 - 4일차 )
상기 실시예 1-1에서 배양한 인간 유도 만능 줄기세포를 완전 내배엽 세포로 분화시키기 위해 하기 과정을 수행하였다.
구체적으로, 하기 표 1의 조성을 가진 내배엽 분화 배지 1(DE medium 1) 12㎖를 37℃로 만든 후, 배지를 제거한 상기 실시예 1-1에서 배양한 인간 유도 만능 줄기세포에 준비된 내배엽 분화 배지 1를 웰 당 1㎖씩 첨가 후 24시간 동안 37℃, 5% CO2 환경에서 배양하였다. 그 후, 하기 표 2의 조성을 가진 내배엽 분화 배지 2(DE medium 2)로 교체하여 4일 동안 37℃, 5% CO2 환경에서 배양하였다. 배양 기간 동안 매일 24시간 간격으로 배지를 교체하였다.
내배엽 분화배지 1(DE medium 1)의 조성(12㎖)
0.1% BSA 및 1% B27 supplement를 함유한 RPMI-1640
50ng/㎖ Activin A(ActA)
0.5mM sodium butyrate
3μM CHIR99021
내배엽 분화배지 2(DE medium 2)의 조성
0.1% BSA 및 1% B27 supplement를 함유한 RPMI-1640
50ng/㎖ Activin A(ActA)
0.1M sodium butyrate
<1-3> 완전 내배엽 세포(definitive endoderm, DE)를 간 내배엽 세포(hepatic endoderm, HE)로 분화(- 4일차 내지 0일차 )
상기 실시예 1-2에서 분화시킨 완전 내배엽 세포를 간 내배엽 세포로 분화시키기 위해 하기 과정을 수행하였다.
구체적으로, 하기 표 3의 조성을 가진 간 내배엽 분화 배지(HE medium) 12㎖를 37℃로 만든 후, 배지를 제거한 상기 실시예 1-2에서 분화시킨 완전 내배엽 세포에 준비된 간 내배엽 분화 배지를 웰 당 1㎖씩 첨가 후 4일 동안 37℃, 5% CO2 환경에서 배양하였다. 배양 기간 동안 매일 24시간 간격으로 배지를 교체하였다. 분화 완료 후 일부 세포에서 EpCAM 양성 세포를 하기 실험예 1에 개시된 유세포 분석 방법과 동일한 조건 및 방법으로 분석하여 EpCAM 양성 세포가 95% 이상이면 다음 단계인 간 내배엽 오가노이드 생산 단계로 진행했다.
간 내배엽 분화배지(HE medium)의 조성(12㎖)
0.1% BSA 및 1% B27 supplement를 함유한 RPMI-1640
50ng/㎖ BMP4
10μM SB431542
<1-4> 간 내배엽 세포로부터 간 내배엽 오가노이드의 생산( 0일차 내지 14일차 )
분화가 완료된 상기 실시예 1-3에서 제조한 간 내배엽 세포에서 배지를 제거하고 Ca2 + 및 Mg2 +가 없는 DPBS로 1회 세척하고, 웰 당 500㎕의 Accutase를 첨가하여 37℃에서 10분간 배양하였다. 단일 세포 단위로 분리된 세포를 10㎖ organoid basal medium(10 mM HEPES, 1% GlutaMAX, 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신, 0.1% BSA를 함유한 Advanced DMEM/F12)이 첨가된 15㎖ 코니컬 튜브로 옮겨 1200 rpm에서 3분간 원심분리를 수행하고 상등액을 제거하였다. 1㎖의 차가운 D-HEO 또는 S-HEO용 간 내배엽 생산 배지(하기 표 4 또는 표 5)로 세포 펠렛을 재현탁 하여 1.5㎖ 튜브에 옮겨 세포 계수를 하고, 하기와 같이 물방울 모양 또는 현탁 상태로 간 내배엽 오가노이드를 생산하였다.
<1-4-1> 물방울(Droplet) 모양의 간 내배엽 오가노이드(D-HEO)의 생산(발생 단계, generation stage)
100㎕의 차가운 하기 표 4의 조성을 가진 간 내배엽 오가노이드 생산 배지에 15,000개의 간 내배엽 세포를 1.5㎖ 튜브에 준비하여 얼음에 꽂아 두었다. 준비된 세포에 200㎕ Matrigel GFR(growth factor reduced) 원액을 넣고 거품이 생기지 않도록 피펫팅으로 혼합하였다. 24 웰 또는 4 웰 플레이트에 100㎕의 마트리겔과 간 내배엽 세포를 섞은 혼합액을 5000 세포/droplet의 세포 밀도로 만들고 정중앙에 분주하여 돔 구조로 만들어 굳힌 후, 37℃에서 10분간 굳혔다. 그 후 37℃의 간 내배엽 오가노이드 생산 배지를 웰 당 700 내지 1000㎕씩 넣고 37℃, 5% CO2의 환경에서 14일간 배양하였다. 배지는 배양 3일 간격으로 교체하였다.
D- HEO 용 간 내배엽 오가노이드 생산 배지(GE medium)의 조성
10 mM HEPES, 1% GlutaMAX, 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신, 0.1% BSA, 1% B27 supplement minus vitamin A, 1% N2 supplement를 함유한 Advanced DMEM/F12
50ng/㎖ FGF 10(fibroblast growth factor 10)
25ng/㎖ HGF(hepatocyte growth factor)
10 mM Nicotinamide
10 nM [Leu15]-Gastrin I human
1.25 mM N-acetyl-L-cysteine
5 μM A83-01
10 μM Forskolin
3 μM CHIR99021
<1-4-2> 현탁 (Suspension) 상태의 간 내배엽 오가노이드(S-HEO)의 생산(발생 단계, generation stage)
하기 표 5의 조성을 가진 간 내배엽 오가노이드 생산 배지를 24-웰 ultra low attachment 플레이트에 웰 당 0.5㎖씩 미리 분주하고, 배지는 마트리겔이 굳는 것을 방지하기 위해 항상 얼음에 보관하였다. 웰 당 10,000개의 간 내배엽 세포를 첨가한 후, 37℃, 5% CO2의 환경에서 14일간 배양하였다. 이때 오가노이드가 뭉쳐서 자라지 않도록 조각들을 골고루 퍼트린 후 배양하였다. 배지는 배양 3일 간격으로 교체하였다. 배지 교체는 1000P 파이펫을 이용하여 현탁 상태로 배양 중인 오가노이드가 포함된 배지를 모두 1.5㎖ 튜브에 회수하여 1200 rpm의 최고 속도로 3분 동안 원심 분리기에 넣어 상등액을 제거하고, 새로운 하기 표 5의 조성을 가진 간 내배엽 유지 배지 0.5㎖에 재현탁 후 다시 플레이트에 뿌려주고 3일 동안 37℃, 5% CO2의 환경에서 배양하였다.
S- HEO 용간 내배엽 오가노이드 생산 배지(GE medium)의 조성
10 mM HEPES, 1% GlutaMAX, 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신, 0.1% BSA, 1% B27 supplement minus vitamin A, 1% N2 supplement를 함유한 Advanced DMEM/F12
50ng/㎖ FGF 10(fibroblast growth factor 10)
25ng/㎖ HGF(hepatocyte growth factor)
10 mM Nicotinamide
10 nM [Leu15]-Gastrin I human
1.25 mM N-acetyl-L-cysteine
5 μM A83-01
10 μM Forskolin
3 μM CHIR99021
*0.5 mg/㎖ Matrigel GFR (growth factor reduced)
*: 현탁 배양으로 제조되는 간 내배엽 오가노이드 (S- HEO ) 생산시 추가됨
<1-5> 간 내배엽 오가노이드의 확장 단계(expansion stage)( 14일차 내지 19일차 )
상기 실시예 1-4-1 및 1-4-2에서 제조한 간 내배엽 오가노이드를 각각 상기 표 4 또는 표 5의 조성을 가진 배지에서 5일 동안 추가 배양하여, 최종적으로 물방울(Droplet) 모양의 간 내배엽 오가노이드(D-HEO)(도 2) 및 현탁(Suspension) 상태의 간 내배엽 오가노이드(S-HEO)(도 3)를 제조하였다.
<1-6> 간 내배엽 오가노이드의 동결 및 해동
<1-6-1> 간 내배엽 오가노이드의 동결
물방울(Droplet) 모양의 간 내배엽 오가노이드(D-HEO)의 경우, 배양기에서 D-HEO를 꺼내어 1000P의 파이펫으로 피펫팅하여 오가노이드가 들어있는 돔 형태의 마트리겔을 파괴시킨 후, 1.5㎖ 튜브에 회수하였다.
현탁(Suspension) 상태의 간 내배엽 오가노이드(S-HEO)의 경우, 배양기에서 S-HEO를 꺼내어 1000P의 파이펫으로 피펫팅하여 웰 안의 배지를 포함한 오가노이드를 모두 1.5㎖ 튜브에 회수하였다.
간 내배엽 오가노이드와 마트리겔을 분리하기 위해 얼음에 30분간 방치하고, 최고 속도 5000rpm으로 원심분리를 수행하여 상등액을 제거하였다. 200㎕의 차가운 D-HEO 또는 S-HEO 용간 내배엽 오가노이드 유지 배지를 넣고 200P의 파이펫으로 피펫팅하여 오가노이드를 조각내었다. 그 후 최고 속도 5000rpm으로 원심분리를 수행하여 상등액을 제거하고, Ca2 + 및 Mg2 +가 없는 차가운 DPBS 1㎖ 첨가 후 최고 속도 5000 rpm으로 원심분리를 수행하여 상등액을 제거하였다. 동결보존액인 CryoStor CS10(Stem cell Technologies) 1 내지 1.5㎖를 넣어 재현탁 시킨 후 0.5㎖씩 cryotube에 분주하여 freezing container에 넣어 deep freezer에 하루 동안 보관하고 다음날 LN2 탱크(질소 탱크)에 옮겨 보관하였다.
<1-6-2> 간 내배엽 오가노이드의 해동
LN2 탱크에서 cryotube 1개를 꺼내어 37℃의 수조에서 녹인 후, 반 정도 녹았을 때 수조에서 꺼내어 미리 준비해둔 10㎖의 organoid basal medium(10 mM HEPES, 1% GlutaMAX, 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신, 0.1% BSA를 함유한 Advanced DMEM/F12) 이 담긴 15㎖의 코니컬 튜브로 옮겨 1000 rpm에서 3분 동안 원심 분리하여 상등액을 제거하였다.
물방울(Droplet) 모양의 간 내배엽 오가노이드(D-HEO)의 경우, 오가노이드 펠렛을 100㎕의 차가운 간 내배엽 오가노이드 유지 배지(하기 표 6의 배지)에 재현탁 시킨 후, 200㎕의 Matrigel GFR 원액을 넣어 혼합하였다. 그 후 새로운 24 웰 플레이트에 간 내배엽 오가노이드와 Matrigel의 혼합액 100㎕를 웰 정중앙에 분주하여 돔 형태를 만들고 37℃에서 10분간 굳혔다. 37℃의 20μM Y27632를 함유한 간 내배엽 오가노이드 유지 배지(하기 표 6의 배지)를 웰 당 700 내지 1000㎕ 넣고 37℃, 5% CO2에서 3 내지 4일간 배양하였다.
현탁(Suspension) 상태의 간 내배엽 오가노이드(S-HEO)의 경우, 오가노이드 펠렛에 1 내지 1.5㎖의 차가운 간 내배엽 오가노이드 유지 배지(하기 표 7의 배지)에 재현탁 시킨 후, 새로운 24-웰 ultra-low attachment 플레이트에 웰 당 0.5㎖ 씩 분주하고, 37℃, 5% CO2에서 3 내지 4일간 배양하였다. 이때 오가노이드가 뭉쳐서 자라지 않도록 조각들을 골고루 퍼트린 후 배양하였다. 배지는 배양 3일 간격으로 교체하였다.
< 비교예 1> 시험관 내(in vitro) 간 세포 모델의 제조
초대 배양 인간 간세포(primary human hepatocyte, PHH), HepG2(간암 세포주) 및 2D 간 유사 세포(hepatocyte like cell, HLC)를 하기와 같이 배양하였다.
초대 배양 인간 간세포(primary human hepatocyte, PHH)는 BD Gentest ™ Cryo Human Hepatocytes(BD Biosciences, Donor No. HFC 476)를 제조업체의 지침에 따라 BD ™ 간세포 배양 배지에서 배양하고 24시간 후에 실험을 수행했다.
인간 간세포 암 세포주 HepG2는 10% 소 태아 혈청(Lonza), 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신(Gibco)이 보충된 MEM(HyClone)에서 유지되었다.
2D 간 유사 세포(hepatocyte-like cell, HLC)의 경우, 인간 배아줄기세포(hepatocyte embryonic cell, HE)를 0.5 mg/㎖ BSA, 1X B27, 10ng/㎖ FGF4, 10 ng/㎖ HGF, 10ng/㎖ OSM 및 0.1μM 덱사메타손이 보충된 RPMI-1640으로 7일 동안 추가로 배양하여 실험을 수행하였다.
< 실시예 2> 간 오가노이드 (human hepatic organoids , hHO )의 제조
상기 실시예 1-5에서 제조한 간 내배엽 오가노이드를 계대 배양하고 분화 배지에서 분화시켜 간 오가노이드(human hepatic organoids, hHOs)를 하기와 같은 방법으로 제조하였다.
<2-1> 간 내배엽 오가노이드의 계대 배양( 19일차 내지 24일차 )
<2-1-1> 물방울(Droplet) 모양의 간 내배엽 오가노이드(D-HEO)의 계대 배양
상기 실시예 1-5에서 제조한 물방울 모양의 간 내배엽 오가노이드(D-HEO)를 1000P 파이펫을 이용하여 오가노이드가 들어있는 돔 형태의 마트리겔을 파괴시킨 후 1.5㎖ 튜브에 회수하고, 마트리겔과 간 내배엽 오가노이드를 분리하기 위해 튜브를 얼음에 30분간 방치하였다. 튜브를 5000 rpm의 최고 속도로 원심 분리기에 넣어 상등액을 제거하고, 200㎕의 차가운 하기 표 6의 조성을 가진 간 내배엽 오가노이드 유지 배지(hepatic endodermal organoid expansion mediun, EM)을 넣고 200P의 파이펫으로 여러번 피펫팅을 수행하여 오가노이드를 조각내었다. 그 후 튜브를 5000 rpm의 최고 속도로 원심 분리기에 넣어 상등액을 제거하고, 140㎕의 차가운 간 내배엽 오가노이드 유지 배지를 첨가하고 280㎕의 Matrigel GFR 원액을 넣어 혼합하였다. 새로운 24 웰 플레이트에 마트리겔과 오가노이드의 혼합액 100㎕를 정중앙에 분주하여 돔 형태를 만들고 37℃에서 10분간 굳힌 후 37℃의 간 내배엽 오가노이드 유지 배지를 웰 당 700 내지 1000㎕씩 넣고 37℃, 5% CO2의 배양기에서 5일간 배양하였다.
D- HEO 용 간 내배엽 오가노이드 유지 배지( EM )의 조성
10 mM HEPES, 1% GlutaMAX, 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신, 0.1% BSA, 1% B27 supplement minus vitamin A, 1% N2 supplement를 함유한 Advanced DMEM/F12
25ng/㎖ BMP7
50ng/㎖ FGF 10(fibroblast growth factor 10)
25ng/㎖ HGF(hepatocyte growth factor)
10 mM Nicotinamide
10 nM [Leu15]-Gastrin I human
1.25 mM N-acetyl-L-cysteine
5 μM A83-01
10 μM Forskolin
3 μM CHIR99021
<2-1-2> 현탁 (Suspension) 상태의 간 내배엽 오가노이드(S-HEO)의 계대 배양
상기 실시예 1-5에서 제조한 현탁(Suspension) 상태의 간 내배엽 오가노이드(S-HEO)를 25ng/㎖의 BMP7이 첨가된 하기 표 7의 조성을 가진 간 내배엽 오가노이드 생산 배지에 5일간 배양하였다. 이때 배양 3일 후에 배지를 1회 교체하였다.
상기 실시예 1-5에서 제조한 현탁(Suspension) 상태의 간 내배엽 오가노이드(S-HEO)를 1000P 파이펫을 이용하여 1.5㎖ 튜브에 회수하고, 마트리겔과 간 내배엽 오가노이드를 분리하기 위해 튜브를 얼음에 30분간 방치하였다. 튜브를 5000rpm의 최고 속도로 원심 분리기에 넣어 상등액을 제거하고, 200㎕의 차가운 하기 표 7의 조성을 가진 간 내배엽 오가노이드 유지 배지(hepatic endodermal organoid expansion mediun, EM)을 넣고 200P의 파이펫으로 여러 번 피펫팅을 수행하여 오가노이드를 조각내었다. 새로운 24-웰의 ultra-low attatchment 플레이트에 하기 표 7의 간 내배엽 유지 배지 0.5㎖를 미리 분주하고, 웰 당 조각낸 현탁 상태의 간 내배엽 오가노이드(S-HEO)를 66㎕를 분주하고 37℃, 5% CO2의 환경에서 5일간 배양하였다. 이때 오가노이드가 뭉쳐서 자라지 않도록 조각들을 골고루 퍼트린 후 배양하였다. 배지는 배양 3일 간격으로 교체하였다. 배지 교체는 1000P 파이펫을 이용하여 현탁 상태로 배양 중인 오가노이드가 포함된 배지를 모두 1.5㎖ 튜브에 회수하여 5000 rpm의 최고 속도로 원심 분리기에 넣어 상등액을 제거하고, 간 내배엽 유지 배지 0.5㎖에 재현탁 후 다시 플레이트에 뿌려주었다.
S- HEO 용 간 내배엽 오가노이드 유지 배지( EM )의 조성
10 mM HEPES, 1% GlutaMAX, 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신, 0.1% BSA, 1% B27 supplement minus vitamin A, 1% N2 supplement를 함유한 Advanced DMEM/F12
25ng/㎖ BMP7
50ng/㎖ FGF 10(fibroblast growth factor 10)
25ng/㎖ HGF(hepatocyte growth factor)
10 mM Nicotinamide
10 nM [Leu15]-Gastrin I human
1.25 mM N-acetyl-L-cysteine
5 μM A83-01
10 μM Forskolin
3 μM CHIR99021
*0.5 mg/㎖ Matrigel GFR (growth factor reduced)
*: 현탁 배양으로 제조되는 간 내배엽 오가노이드 (S- HEO ) 생산시 추가됨
<2-2> 간 내배엽 오가노이드로부터 간 오가노이드로의 분화( 24일차 내지 39일차 )
<2-2-1> 물방울(Droplet) 모양의 간 오가노이드(D-HO)의 제조
상기 실시예 2-1-1의 계대 배양한 물방울 모양의 간 내배엽 오가노이드를 하기 표 8의 조성을 가진 간 오가노이드 분화 배지를 사용하여 3일 간격으로 배지를 교체하며 15일 동안 배양하였다.
간 오가노이드 분화 배지(DM)의 조성
10 mM HEPES, 1% GlutaMAX, 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신, 0.1% BSA, 1% B27 supplement minus vitamin t를 함유한 Advanced DMEM/F12
25 ng/㎖ BMP7
100 ng/㎖ FGF19
25 ng/㎖ HGF
10 nM [Leu15]-G astrin I human
1.25 mM N-acetyl-L-cysteine
0.5 μM A83-01
1㎕ DAPT
3 μM Dexamethasone
<2-2-2> 현탁 (Suspension) 상태의 간 오가노이드(S-HO)의 제조
상기 실시예 2-1-2의 계대 배양한 현탁 상태의 간 내배엽 오가노이드를 하기 표 9의 조성을 가진 간 오가노이드 분화 배지를 사용하여 3일 간격으로 배지를 교체하며 15일 동안 배양하였다.
배지 교체는 1000P 파이펫을 이용하여 현탁 상태로 배양 중인 간 오가노이드가 포함된 배지를 모두 1.5㎖ 튜브에 회수하여 5000rpm의 최고 속도로 원심 분리기에 넣어 상등액을 제거하고, 간 오가노이드 분화 배지 0.5㎖에 재현탁 후 다시 플레이트에 뿌려주었다.
간 오가노이드 분화 배지(DM)의 조성
10 mM HEPES, 1% GlutaMAX, 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신, 0.1% BSA, 1% B27 supplement minus vitamin t를 함유한 Advanced DMEM/F12
25 ng/㎖ BMP7
100 ng/㎖ FGF19
25 ng/㎖ HGF
10 nM [Leu15]-G astrin I human
1.25 mM N-acetyl-L-cysteine
0.5 μM A83-01
1㎕ DAPT
3 μM Dexamethasone
*0.5 mg/㎖ Matrigel GFR (growth factor reduced)
*: 현탁 배양으로 제조되는 간 내배엽 오가노이드 (S- HEO ) 생산시 추가됨
< 실험예 1> 배지 조성의 결정
간 내배엽 오가노이드 생산 배지의 조성을 결정하기 위해, 하기의 실험을 수행하였다.
구체적으로, 표 4의 배지 조성에서 R-Spondin 1, EGF, Noggin을 더 포함한 배지에서 배양한 것을 제외하고는 상기 실시예 1-4-1과 동일한 방법 및 조건으로 간 내배엽 오가노이드로 분화시키고, 표 6의 조성을 가진 간 내배엽 오가노이드 유지 배지(EM)로 간 내배엽 오가노이드를 발생시켰다. 간 내배엽 세포 및 간 내배엽 오가노이드에서 EpCAM을 발현하는 세포의 수를 유세포 분석(Flow cytometry)로 분석하고, Wnt의 표적 단백질인 LGR5 및 표적 유전자인 AXIN2 및 EPHB2의 발현 정도를 RT-qPCR로 측정하였다.
유세포 분석은 세포 또는 오가노이드를 TypLETM Express Enzyme (Thermo)에 의해 해리, 4% 포름알데히드로 고정되고 DPBS (HyCloneTM)에서 0.1% Triton X-100으로 투과시키는 과정을 통해 수행되었다. 샘플을 형광 표지된 1차 항체와 함께 얼음에서 10분 동안 배양하고 DPBS에서 0.5% BSA (Sigma)로 두 번 세척했다. CytoFLEX (Beckman Coulter)를 사용하여 유세포 분석을 수행하고 Kaluza 분석 소프트웨어 (Beckman Coulter)를 사용하여 데이터를 처리했다.
정량적 역전사 효소 중합효소 연쇄반응(RT-qPCR)은 NucleoZOL Reagent (Macherey-Nagel, Duren, Germany)를 사용하여 각 샘플에서 총 RNA를 분리하고 GoScript ™ Reverse Transcription Mix(Promega)를 사용하여 역전사 시켰다. qPCR은 StepOnePlus Real-Time PCR 시스템 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)에서 GoTaq® qPCR Master Mix (Promega)를 이용하고, 각 샘플에 대해 삼중 PCR 증폭을 수행했다. PCR 결과는 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소 효소 (GAPDH)로 정규화한 후 대조군 세포에 비해 상대적인 배수 변화로 표현했다. △Ct (S△Ct) 값은 GAPDH에 대해 얻은 Ct 값과 표적 유전자의 차이로 계산되었다. 제어 셀의 △Ct 값은 제어 △Ct (S△Ct) 값으로 사용되었다. 상대 유전자 발현 수준은 공식 2-(S△Ct-C△Ct)를 사용하여 결정되었다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 간 내배엽 오가노이드는 14일 후 형성되어 35일 이상 유지되는 것을 확인하였다. 또한, 도 5에 나타난 바와 같이, 간 전구세포(hepatic progenitor cell)/줄기세포(stem cell)의 마커인 EpCAM은 간 내배엽 세포 및 물방울 모양의 간 내배엽 오가노이드에서 높은 수준으로 발현되었다. 반면에, R-spondin 1에 결합하는 Wnt의 표적 단백질인 LGR5는 세포 표면에서 검출되지 않았고, Wnt 표적 유전자 AXIN2 및 EPHB2는 간 내배엽 세포에 비해 물방울 모양의 간 내배엽 오가노이드에서 유의하게 감소하였다.
상기 결과는 Wnt 신호 전달 과정은 간 내배엽 오가노이드 발생에 필요하지 않음을 제시한다. 또한, R-Spondin 1, EGF 및 Noggin은 장관 오가노이드 생산 및 확장에 주요한 요소로 알려져 있고, BMP 길항제인 Noggin은 간 사양을 억제한다고 알려져 있으므로, R-Spondin 1, EGF 및 Noggin을 제외한 배지 조성으로 간 내배엽 오가노이드를 분화시켰다.(설명 필요)
< 실험예 2> R- Spondin 1, EGF 및 Noggin을 제외한 배지 조성으로 간 내배엽 오가노이드를 분화시킨 경우의 간 내배엽 오가노이드의 특성
<2-1> 간 내배엽 세포를 R- Spondin 1, EGF 및 Noggin을 제외한 배지 조성으로 간 내배엽 오가노이드로 분화시킨 경우 오가노이드의 수 및 오가노이드 형성 속도 측정
상기 표 4의 배지 조성에서 R-Spondin 1, EGF, Noggin을 더 포함한 배지에서 배양하여 간 내배엽 오가노이드로 분화시킨 경우 및 상기 실시예 1-4-1과 동일한 방법 및 조건으로 간 내배엽 오가노이드로 분화시킨 경우에, 오가노이드의 수 및 오가노이드 형성 속도를 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 물방울 모양으로 간 내배엽 오가노이드를 분화시킨 경우 R-Spondin 1, Noggin 및 EGF(RNE)를 제외한 간 내배엽 오가노이드 생산 배지에서 제조된 오가노이드의 수는 RNE가 포함된 간 내배엽 오가노이드 생산 배지에서 제조된 오가노이드와 유사했고, 도 7에 나타난 바와 같이, 현탁 상태로 간 내배엽 오가노이드를 분화시킨 경우 R-Spondin 1, Noggin 및 EGF(RNE)를 제외한 간 내배엽 오가노이드 생산 배지에서 제조된 오가노이드의 수는 RNE가 포함된 간 내배엽 오가노이드 생산 배지에서 제조된 오가노이드에 비해 오가노이드 수가 현저하게 증가하였다. 또한, 도 8에 나타난 바와 같이, 현탁 상태로 제조한 간 내배엽 오가노이드(S-HEO)의 형성 속도는 RNE가 있는 배지에서 배양한 경우에 비해 RNE가 없는 배지에서 배양한 경우의 3.5배 이상이었다.
<2-2> 분화한 간 내배엽 오가노이드를 확장 단계에서 R- Spondin 1 및 EGF를 제외한 배지 조성으로 간 내배엽 오가노이드를 배양한 경우
R-Spondin 1 및 EGF(RE)가 포함된 간 내배엽 오가노이드 생산 배지에서 간 내배엽 오가노이드를 물방울 형태로 배양한 경우(D(+)-HEO), R-Spondin 1 및 EGF(RE)가 포함되지 않은 간 내배엽 오가노이드 생산 배지에서 간 내배엽 오가노이드를 물방울 형태로 배양한 경우(D(-)-HEO), R-Spondin 1 및 EGF(RE)가 포함된 간 내배엽 오가노이드 생산 배지에서 간 내배엽 오가노이드를 현탁 상태로 배양한 경우(S(+)-HEO), R-Spondin 1 및 EGF(RNE)가 포함되지 않은 간 내배엽 오가노이드 생산 배지에서 간 내배엽 오가노이드를 현탁 상태로 배양한 경우(S(-)-HEO)에서 간 내배엽 오가노이드의 증식능, 간 전구 세포 마커 발현 정도를 측정하고 전사체 분석을 하였다.
<2-3> 다양한 조건에서 분화시킨 간 내배엽 오가노이드의 증식능 및 간 전구세포 마커의 발현 정도 확인
D(+)-HEO, D(-)-HEO, S(+)-HEO 및 S(-)-HEO의 네 가지 조건에서 배양한 간 내배엽 오가노이드의 구조, 증식 세포 포함 여부 및 간 내배엽 세포의 마커인 SOX9, EpCAM를 발현 하는지 여부를 하기와 같이 측정하였다.
구체적으로, 네 가지 조건에서 분화시킨 간 내배엽 오가노이드를 bright-field 현미경 이미지로 촬영하고, 각 조건에서 분화시킨 간 내배엽 오가노이드의 파라핀 포매된 절편을 헤마톡실린&에오신(Hematoxlin&Eosin,H&E) 염색하였다.
BradU 염색을 위해 간 내배엽 오가노이드(hHEO)를 10μM BrdU(브로모-데옥시 우리딘) 라벨링 용액 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)으로 처리하고 37℃에서 5% CO2에서 48시간 동안 배양했다. hHEO를 분리, 고정, 투과, 1.2M HCl로 변성시키고 BrdU 단일 클론 항체, Alexa Flour 488(Invitrogen)로 염색한 다음 DAPI 염색을 수행했다. Olympus FV3000 공초점 현미경을 사용하여 이미지를 관찰했다.
면역 염색은 파라핀이 포매된 절편의 면역 형광을 위해 마트리겔에서 제거하기 위해 세포 회수 용액 (Corning)을 사용하여 오가노이드를 분리하고, 4℃에서 밤새 4% 포름알데히드에 고정한 후 파라핀 블록에 포매시켰다. 절편을 절단 및 수화하고, 항원 회수를 위해 구연산 나트륨 완충액 pH 6.0으로 끓였다. 샘플을 투과시키고 5% 정상 혈청(Jackson ImmunoResearch)으로 차단하고 각 1차 항체로 4℃에서 밤새 배양하고 플루오레세인 결합 2차 항체로 1시간 동안 표지했다. 핵은 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Sigma-Aldrich)로 염색한 다음 ProLongTM Glass Antifade Mountant (Thermo)로 장착했다. Zeiss LSM 800 및 Olympus FV3000 공초점 현미경으로 이미지를 촬영했다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, D(+)-HEO 및 S(+)-HEO는 다중-층 낭성 구조(multi-layer cystic structure)을 가지고 있었고, D(-)-HEO 및 S(-)-HEO에서는 단일 층의 낭성 구조(single-layer cystic structure)가 관찰되었다. 또한, 도 10에 나타난 바와 같이, BradU 염색 사진에서 모든 조건의 간 내배엽 오가노이드에서 증식하고 있는 세포 집단이 관찰되었고, 간 전구 세포 마커인 SOX9, CK19 및 EpCAM도 발현되는 것을 확인하였다.
<2-4> 다양한 조건에서 분화시킨 간 내배엽 오가노이드의 전사체 분석
D(+)-HEO, D(-)-HEO, S(+)-HEO 및 S(-)-HEO의 네 가지 조건에서 배양한 간 내배엽 오가노이드의 전사체 분석을 하기와 같이 수행하였다.
구체적으로, TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit를 사용하여 mRNA 라이브러리를 생성한 다음 Illumina NovaSeq 6000 플랫폼을 사용하여 시퀀싱했다. 읽기(Read)는 HISAT2 (v2.1.0) (Kim et al., 2019)를 사용하여 정렬되고 StringTie (v1.3.4)를 사용하여 어셈블 되었다. 읽기 수는 edgeR (v3.26.8) R 패키지를 사용하여 M- 값(TMM)의 트림된 평균으로 정규화되었다. stats (v3.6.1) R 패키지에서 각각 var 및 prcomp 함수를 사용하여 차별적으로 발현된 유전자(highly variable genes)와 주요 성분을 계산했다. 유전자 온톨로지 및 KEGG 경로 분석은 DAVID를 사용하여 수행되었다 (Huang da et al., 2009a, b). Gene set enrichment analysis(GSEA)는 MSigDB(v7.0)의 특징 유전자 세트와 함께 GSEA 소프트웨어(v4.0.3)를 사용하여 수행되었다(Mootha et al., 2003).
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 배양 조건(물방울 형태 또는 현탁 상태)의 차이가 R-spondin 1 및 EGF의 처리 여부보다 차등적으로 발현하는 유전자에서 더 큰 차이를 보이는 조건이었다. 물방울 형태의 간 내배엽 오가노이드를 배양하는 경우에는 오가노이드의 증식에 관여하는 유전자의 발현이 높게 나타나고, 현탁 상태의 간 내배엽 오가노이드를 배양하는 경우에는 오가노이드의 분화에 관여하는 유전자의 발현이 높게 나타남을 확인할 수 있었다.
상기 결과를 종합하면, 인간 유도 만능 줄기세포로부터 분화된 간 내배엽 세포는 RNE가 포함되지 않은 배지에서 배양하여 간 내배엽 오가노이드를 생산할 수 있고, 간 내배엽 오가노이드는 R-Spondin 1 및 EGF 없이 확장 단계에서 간 내배엽 세포로 유지될 수 있음을 제시한다.
< 실험예 3> 다양한 조건에서 간 오가노이드의 분화 후 간 마커 유전자의 발현 확인
<3-1> EGF이 포함되거나 포함되지 않은 배양 배지에서 간 내배엽 오가노이 드를 간 오가노이드로 분화시켰을 경우의 주요 간 유전자의 발현 변화 확인
D(+)-HEO, D(-)-HEO, S(+)-HEO 및 S(-)-HEO의 네 가지 조건에서 배양한 간 내배엽 오가노이드를 상기 표 8 또는 표 9의 배지에서 EGF를 포함하거나 포함하지 않는 두 가지의 배양 배지 조성 조건에서 상기 실시예 2-2와 동일한 방법 및 조건으로 간 오가노이드로 분화시킨 후(도 12), 주요 간 유전자의 발현을 측정하였다.
구체적으로, 상기 실험예 1에 개시된 RT-qPCR과 동일한 방법 및 조건으로, ALB, AAT, HNF4A, TDO2, G6P, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4 및 FXR을 포함한 주요 간 유전자, 핵 수용체 및 CYP450 유전자의 발현 변화를 확인하였다.
그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 간 오가노이드로의 분화 동안 EGF가 없는 배양 배지 조건에서 간 오가노이드를 분화시켰을 때, 주요 간 유전자의 발현이 증가하였다. 따라서, EGF가 포함되지 않은 간 오가노이드 분화 배지를 사용하여 각 배양 조건에서 간 내배엽 오가노이드를 간 오가노이드로 분화시켰다.
<3-2> 다양한 조건에서 분화시킨 간 오가노이드의 구조 확인 및 간 마커 유전자 발현 정도 확인
S(+)-HO, S(-)-HO, D(+)-HO, D(-)-HO 에서 S(+) 및 D(+) 조건은 발생 단계에서 RNE 포함, 확장단계에서 RE 포함, 간 오가노이드로의 분화 단계에서 EGF 포함하여 분화시킨 간 오가노이드를 지칭하는 것인지 확인 요청드립니다.
네 가지 조건에서 분화시킨 간 오가노이드를 상기 실험예 2-3에 기재된 방법과 동일한 방법 및 조건으로 bright-field 이미지, H&E 염색, 면역 염색을 수행하여 간 오가노이드의 구조를 확인하고, 상기 실험예 1에 기재된 방법과 동일한 방법과 조건으로 간 마커의 유전자 발현 정도를 전사 수준에서 RT-qPCR을 수행하고, 유세포 분석을 수행하여 ALB(알부민)의 발현 세포 수를 확인하였다.
그 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, 간 내배엽 오가노이드는 분화 후 수축된 구형 형태로 자가 조직화되었으며 네 조건 모두 오가노이드 내부에 내강(lumen)을 나타냈다. S(+)-HO 및 S(-)-HO는 D(+)-HO 및 D(-)-HO보다 더 균일하게 간 오가노이드를 형성하였다. D(-)-HO 및 S(-)-HO가 단백질 수준(도 15) 및 전사 수준(도 16)에서 D(+)- 및 S(+)-HO에 비해 간 마커 수준의 발현보다 우수하다는 것을 확인했다.
또한, 도 17에 나타난 바와 같이, 유세포 분석을 수행하여 ALB(알부민)을 발현하는 세포 수를 계수한 결과, R-Spondin 1과 Noggin이 ALB 발현에 부정적인 영향을 미친다는 것을 확인했고, 도 18에 나타난 바와 같이, D(-)-HO 및 S(-)-HO에서 D(+)-HO 및 S(+)-HO보다 ALB(알부민), AAT(Alpha 1-antitrypsin), 및 ApoA1(Apolipoprotein A1) 단백질의 발현이 증가함을 확인하였다.
따라서, 이러한 결과는 확장 단계에서 R-Spondin 1과 EGF의 부재가 간 내배엽 오가노이드로의 분화 과정에서 간 성숙에 영향을 미쳤음과 간 오가노이드로의 분화 중 배양 배지에서 EGF를 제거한 경우 간 및 약물 대사 관련 유전자의 발현 수준이 증가하여 간 오가노이드의 성숙 과정이 증가되었음을 제시한다.
< 실험예 4> 간 오가노이드에서 약물 대사 효소와 약물 수송체의 발현 확인
<4-1> 간 오가노이드의 구조 확인 및 약물 수송체 관련 유전자의 발현 확인
간에서 ATP-결합 카세트 트랜스포터(ABC 트랜스포터)는 CYP450 효소와 phase II 접합에 의한 내인성 및 외인성 물질의 유출에 중요한 역할을 한다. 따라서, 간 내배엽 오가노이드로부터 분화시킨 간 오가노이드의 구조를 투과 전자 현미경으로 관찰하고, 상기 실시예 2에서 제조한 물방울 형태로 분화시킨 간 오가노이드(D-HOs), 현탁 상태로 분화시킨 간 오가노이드(S-HO), 상기 비교예 1에서 제조한 초대 배양 인간 간세포(primary human hepatocyte, PHH), HepG2(간암 세포주) 및 2D 간 유사 세포(hepatocyte like cell, 2D HLC)에서 정단부 및 기저측부(apical and basolateral) 약물 수송체(drug transporter)와 관련된 유전자 발현을 상기 실험예 1에 기재된 방법과 동일한 방법과 조건으로 확인하였다.
구체적으로, 투과 전자 현미경 관찰 과정은 하기와 같다. 간 오가노이드를 0.1M 인산염 완충액(PB), pH 7.4의 2% 글루타르 알데히드-파라 포름알데히드에서 12시간 동안 고정하고 0.1M 인산염 완충액에서 세척하였다. 0.1M PB에 용해된 1% OsO4로 2시간 동안 후 고정한 후 농도 구배 에탄올(50 내지 100%)로 탈수하고 프로필렌 옥사이드로 침투시켰다. 표본은 Poly/Bed 812 키트(Polysciences)에 내장되었다. 순수한 신선한 레진에 포매 및 65℃ 전자 현미경 오븐(TD-700, DOSAKA, 일본)에서 24시간 동안 중합시켰다. 약 200 내지 250nm 두께의 단면을 처음에 절단하고 광학 현미경을 위해 톨루이딘 블루(Sigma-Aldrich)로 염색했다. 70nm 얇은 섹션은 대조 염색을 위해 6% 우라닐 아세테이트(EMS, 22400, 20분) 및 납 시트레이트(피셔, 10분)로 이중 염색되었다. 다이아몬드 나이프(Diatome)를 사용하여 LEICA EM UC-7 (오스트리아 라이카 마이크로 시스템즈)에 의해 절단된 섹션을 구리 및 니켈 그리드에 옮기고, 모든 얇은 부분은 80kV의 가속 전압에서 투과 전자 현미경 (JEM-1011, JEOL, Japan)으로 관찰되었다.
그 결과, 도 19에 나타난 바와 같이, 간 오가노이드에서 내강 측 막의 미세 융모 구조와 밀착 연접 구조를 관찰할 수 있었다. 또한, 도 20에 나타난 바와 같이, D(-)-HO, S(-)-HO, PHH, HepG2 및 2D HLC 사이에서 약물 수송체 관련 유전자의 전사 발현 분석 결과, 2D HLC와 비교하여 D(-)-HO 및 S(-)-HO 모두 MRP2, BSEP, MDR1 및 BCRP와 같은 정단부 약물 수송체(apical transporter) 유전자의 발현이 높았다. 한편, D(-)-HO 및 S(-)-HO는 각각의 기저측 부 약물 수송체 유전자인 MRP3 및 NTCP 각각의 발현이 유의하게 높았다.
상기 결과는 미세 융모를 가진 정단부 측 막은 내강 측막에 위치한 간 오가노이드에서 집중적으로 발달한다는 것을 제시한다.
<4-2> 정단부 약물 수송체 유전자가 간 오가노이드에서 발현하는지 여부 확인
정단부 약물 수송체(apical drug transporter) 관련 유전자인 MRP2, BSEP 및 MDR1이 간 오가노이드에서 발현하는지와, 각 유전자의 억제제를 투여하였을 때의 발현 변화를 형광염색으로 확인하였다.
구체적으로, 간 오가노이드는 Matrigel에서 회수되었고 DPBS로 3회 세척되었다. CDFDA((5(6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein diacetate) 염색의 경우, 3 시간 동안 2mM 프로베네시드(probenecid)를 처리하거나 처리하지 않은 간 오가노이드를 37℃, 5% CO2에서 15분 동안 10μM CDFDA(Sigma-Aldrich)로 염색했다. CLF(Choyl-Lysyl-Fluorescein) 및 로다민 123 염색의 경우, 10μM 케토코나졸ketokonazole)을 사용하거나 사용하지 않고 24시간 동안 4μM CLF(Corning) 또는 10μM 로다민 123(Invitrogen)으로 각각 15분 동안 처리한 간 오가노이드를 1시간 동안 배양하고, 모든 샘플을 DPBS로 3회 세척하고 Hoechst 33342로 염색하고 Olympus FV3000 공초점 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 21에 나타난 바와 같이, D(-)-HO 및 S(-)-HO의 정단층 막에서 MRP2(CDFDA로 염색)의 발현이 확인되었고, 도 22에 나타난 바와 같이, MDR1(로다민 123으로 염색)의 발현이 확인되었으며, 도 23에 나타난 바와 같이, BSEP(CLF로 염색)가 간 오가노이드의 정단층 막에서 특이적으로 검출되었음을 확인하였다(초록색 형광). 흡수된 각 형광의 방출은 정상 상태에서 관찰되었으며, D(-)-HO 및 S(-)-HO에서 수송체의 활동을 확인하는 각 수송체의 억제제(MRP2의 억제제는 프로베네시드, MDR1 및 BSEP의 억제제는 케토코나졸)에 의해 차단되었을 때, 각 약물 수송체 특이적 형광은 간 오가노이드 내강에 축적되었다. 도 23에 나타난 바와 같이, 로다민 123은 MDR1 억제에 의한 세포질 축적으로 인해 세포 밖으로 방출되지 않았다.
상기 결과는 간 오가노이드가 기저측이 아닌 내강에 존재하는 정단부 막의 발달로 인해 정단부 유출 약물 수송체의 높은 발현으로 인해 제조한 간 오가노이드가 약물 방출 기능을 가지고 있음을 제시한다.
< 실험예 5> 간 오가노이드의 세포 구성 및 간 세포 특이적 마커 발현 확인
간 오가노이드의 세포 구성을 조사하기 위해 단일 세포 RNA 시퀀싱에 의해 S (-)-HO의 단일 세포 전사체 분석을 수행하였다.
구체적으로, scRNA-seq용 라이브러리는 Chromium Single Cell 3’Reagent Kit v3, Chromium Chip B Single Cell Kit 및 Chromium i7 Multiplex Kit (10X Genomics)를 사용하였다. 간 오가노이드는 Embryoid body dissociation kit (Miltenyi Biotec)를 사용하여 분리한 다음 35㎛ 스트레이너를 통해 여과하고 Chromium microfluidic 플랫폼에 로드하여 7,000개의 개별 세포를 포획했다. 라이브러리는 Illumina HiSeq X Ten 플랫폼에서 paired-end로 시퀀싱되었다. Single Cell 3’라이브러리를 시퀀싱하면 paired-end Read 1 (16bp 10x ™ 바코드 및 12bp UMI 포함) 및 Read 2, i7 인덱스 읽기의 샘플 인덱스가 포함된 FASTQ 파일이 생성되었다. 이러한 파일은 기본 인수를 사용하여 Cell Ranger ™ (v3.1.0)로 처리되었다. 판독은 인간 참조 게놈 (GRCh38)에 맞춰 정렬되었다. Seurat (v3.0.4) R 패키지를 사용하여 검출된 유전자가 2,000개 미만이고 UMI가 10% 이상인 세포를 Seurat (v3.0.4) R 패키지를 사용하여 추가로 필터링하고 최종적으로 20,125 × 1,859 유전자 별 매트릭스를 얻었다. 표현식 매트릭스는 scanpy (v1.4.5.1) Python 패키지를 사용하여 가져오고 분석되었다. 세포는 tl.draw_graph 함수를 사용하여 2차원 ForceAtlas2 플롯으로 시각화한 다음 PAGA-초기화로 재계산했다. 클러스터링은"n_neighbors = 4", "n_pcs = 20" 및 "resolution = 1"과 함께 tl.leiden 함수를 사용하여 수행되었다. Wilcoxon rank-sum 테스트 옵션 및 tl.rank_genes_groups 함수를 사용하여 클러스터 및 셀 그룹의 마커 유전자를 발견했다. 간세포 유사, 담도 유사, 담낭 유사 및 세포주기를 포함한 유전자 세트 발현 점수는 tl.score_genes 함수를 사용하여 계산되었다. 유전자 온톨로지 및 KEGG 경로 분석은 DAVID를 사용하여 수행되었다.
그 결과, 도 24에 나타난 바와 같이, 간 오가노이드에서 19개의 서로 다른 세포 클러스터가 존재하는 것을 확인하였다.
또한, 도 25에 나타난 바와 같이, 유전자 발현 패턴과 GO-term 분석을 기반으로 세포를 3개의 그룹으로 분류하여, 첫 번째 그룹은 클러스터 2와 15로 구성되고 담도 유사 세포(biliary-like cell)가 포함되어 있고, 두 번째 그룹은 클러스터 18로 구성되고 담낭 유사 세포(gallbladder-like cell)가 포함되어 있으며, 세 번째 그룹에는 나머지 클러스터가 포함되어 있고 간 세포 유사 세포(hepatocyte-like cell)가 포함되어 있음을 확인하였다.
또한, 도 26에 나타난 바와 같이, 각 그룹의 대표적인 마커(간세포 계통의 경우 ALB, ASGR1 및 SERPINA1, 담즙 계통의 경우 KRT19, EPCAM 및 ITGB4, 담낭 계통의 경우 REG4, TFF3 및 FCGBP)가 발현되는 것을 확인하고, 도 27에 나타난 바와같이, 각 그룹의 특정 마커는 각 클러스터에서 독점적으로 발현되었다. 간 오가노이드가 88.44%의 간세포 유사 세포를 포함하고 있으며 이는 ALB-발현 세포와 유사한 비율이고, 담도 유사 세포는 10.38% 및 담낭 유사 세포는 1.18%의 비율을 차지하는 것을 확인하였다.
상기 결과는 간 오가노이드가 세포 특이적인 마커를 발현하는 전구 세포 유사 세포를 포함하는 간 유사 세포, 담낭 유사 세포 및 담도 유사 세포로 구성되어,간을 유사하게 모사할 수 있음을 제시한다.
< 실험예 6> 간 오가노이드의 약물 대사 능력 측정
약물의 대사 제거는 간 조직의 주요 기능 중 하나이므로, 간 오가노이드 모델에서 약물 효능 및 독성 테스트에서 재현 가능한 고 기능성 약물 대사 능력이 필요하다. 따라서 간 오가노이드가 적절한 약물 대사 능력을 나타내는지 여부를 확인하기 위해 CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 및 CYP3A4를 포함한 주요 CYP450의 발현 정도를 상기 실험예 1에 기재된 방법과 동일한 방법과 조건으로 RT-qPCR을 수행하여 다른 시험관 내(in vitro) 모델(간암 세포주(HepG2), 초대 배양 인간 간세포(PHH), 간 세포 유사 세포(2D HLC))과 비교했다. 주요 CYP450의 활성은 LC-MS/MS 분석을 통하여 측정하였다.
구체적으로, 기초 CYP450 활성을 측정하기 위해, 기질 반응은 5% CO2, 37℃에서 24시간 동안 물방울 형태의 간 오가노이드(D(-)HO), 현탁 상태에서 배양한 간 오가노이드(S(-)HO), 초대 배양 인간 간세포(PHH), 간암 세포주(HepG2) 및 2D 간 세포 유사 세포(2D HLC)에서 수행되었다. CYP450 이소폼 특정 기질 칵테일 세트 (세트 A, CYP1A2에 대해 50μM phenacetin, CYP2A6에 5μM coumarin, CYP2C8에 5μM amodiaquine, CYP2C19에 100μM S-mephenytoin, CYP2D6에 대해 5μM midazolamthorphan, CYP3A4에 대해 20μM dextromethorphan을 사용했다. ; 세트 B, CYP2B6의 경우 50μM bupropion, CYP2C9의 경우 90μM diclofenac, CYP2E1의 경우 90μM chlorzoxazone). 각 CYP450 이소폼 특이적 기질 칵테일 세트는 웰 당 최종 부피가 0.6㎖인 24 웰 배양 플레이트에서 배양되었다. 80㎕의 배지를 2, 4, 6 및 24시간에 각각 회수하고, 100nM carbamazepine(CBZ) 및 300 nM 4-methylumbelliferone(4-MUF)을 포함하는 80㎕의 빙냉 아세토니트릴(ACN)을 첨가하여 반응을 켄칭했다. 샘플을 4℃에서 10분 동안 16,000g에서 원심 분리하고 상청액을 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법 (LC-MS/MS)에 적용했다. 데이터는 단백질 농도로 정규화되었다.
그 결과, 도 28에 나타난 바와 같이, CYP1A2 유전자를 제외하고 D(-)-HO 및 S(-)-HO의 4개의 CYP450 유전자는 D(+)-HO 및 S(+)-HO보다 높은 발현 수준을 나타냈다. 또한, 도 29에 나타난 바와 같이, 주요 CYP450의 활성도는 물방울(droplet) 형태의 배양에서만 R Spondin-1 및 EGF 첨가에 따라 대사 산물 생산량이 다르지만 현탁 배양에는 차이가 없음을 확인하였고, D(-)-HO 및 S(-)-HO에서 CYP2C9 및 CYP2C19 활성은 초대 배양 인간 간세포(PHH)와 유사했다. 간 오가노이드는 HepG2 및 2D HLC보다 높은 수준의 CYP450 발현 및 활성을 가진 반면, CYP1A2, CYP2D6 및 CYP3A4에 의해 매개 되는 대사 산물 생산은 PHH에 비해 낮았다.
상기 결과는 확장 단계에서 R-Spondin 1 및 EGF가 포함되지 않는 배지에서 간 오가노이드를 분화 시키는 경우 약물 대사 효소인 CYP450의 발현 및 활성이 증가하는 것을 나타낸다.
< 실험예 7> 구연산 철(Ferric Citrate, FC )이 첨가된 배지에서 간 오가노이 드를 분화시키는 경우의 CYP450의 활성에 미치는 영향 확인
헴(철(III) 프로토포르피린-IX)는 CYP450에 결합할 때 산소 활성화에 중요한 보조 인자이다. 구연산 철(Ferric Citrate, FC)은 대식세포와 간세포에서 간 철분 축적을 증가시킨다(Chang et al., 2018; Lim et al., 2019). 따라서 간 오가노이드의 분화 단계 중 철(III) 보충제가 CYP450 활성을 향상시킬 수 있는지 여부를 확인하였다(도 30).
구체적으로, 간 내배엽 오가노이드는 20 또는 50μM 구연산 철(FC)을 포함하는 간 오가노이드 분화 배지를 사용하여 상기 실시예 2와 동일한 방법 및 조건으로 15일 동안 간 오가노이드로 분화되었다. live and dead cell 분석의 경우 FC를 사용하거나 사용하지 않고 처리한 간 오가노이드를 live/dead Viability/ Cytotoxicity 키트(Thermo)로 염색했다. Olympus FV3000 공초점 현미경을 사용하여 이미지를 관찰했다. 간 오가노이드의 생존율은 CCK-8(Dojindo) 분석을 사용하여 측정되었다. 이러한 값은 CellTiter-Glo® 3D 세포 생존력 분석(Promega)에서 얻은 값으로 정규화되었다. 대조군 간 오가노이드의 생존율(%)은 100%로 정규화하였다.
CYP450의 대사 산물 검출 및 정량화를 위해 병렬 LC-20ADXR 펌프, 자동 시료 주입기 및 컬럼 오븐(Shimadzu)이 있는 Prominence UFLC 시스템을 사용하여 시료를 분석했다. 시료 주입량은 10㎕이었고, 30℃에서 유지된 SecurityGuard C18 가드 컬럼(2.0mm×4.0mm id; Phenomenex, Torrence, CA)이 있는 Atlantis dC18 컬럼(2.1mm x 50mm id, 3μm, Waters, Milford, MA)에서 분리를 수행했다. HPLC 유속은 0.4 ㎖/분으로 설정되었다. HPLC 이동상은 A[0.1%(v/v) 포름산을 포함하는 탈 이온수] 및 B [0.1%(v/v) 포름산을 포함하는 아세토니트릴)]로 구성되었다. LC-MS/MS 데이터는 포지티브 또는 네거티브(CYP2E1의 경우) ESI 모드에서 작동하는 TurboIonSpray 인터페이스가 장착된 Applied Biosystems SCIEX 3200 QTRAP 하이브리드 삼중 사중 극자-선형 이온 트랩 질량 분석기로 수집되었다. 또한, 4- 하이드록시 디클로페낙은 양성 모드에서 m/z 312 → 230으로 설정되었다. 데이터 수집 및 분석은 AnalystTM 소프트웨어(ver. 1.6.2; Applied Biosystems, Foster city, CA)로 수행되었다.
그 결과, 도 31에 나타난 바와 같이, 구연산 철(FC)은 상기 표 8 및 표 9의 배지의 조성에서 20μM 용량으로 처리되는 경우 세포 독성을 나타내지 않았다. 또한, 도 32에 나타난 바와 같이, 50μM의 구연산 철을 배지에 포함시킨 경우 죽은 세포에서 나타나는 EthD-1의 붉은 형광만 나타났으나, 20μM의 구연산 철을 배지에 포함시킨 경우 살아 있는 세포에서 나타나는 Calcein AM의 녹색 형광이 나타나, 구연산 철의 처리 용량을 20μM로 결정하였다.
또한, 도 33에 나타난 바와 같이, CYP450 활성은 현탁 상태로 배양한 간 오가노이드(S-HO FC)에서 CYP1A2를 제외하고 구연산 철의 처리에 의해 크게 증가했다. 장기간 동안 CYP450 효소 활성의 유지를 관찰하기 위해 7일 동안 D-HO 및 S-HO FC의 CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 및 CYP3A4의 활성을 측정한 결과, 도 34에 나타난 바와 같이 CYP1A2, CYP2C9, CYP2D6의 활성은 7일 동안 유지되었으나, CYP2C19 및 CYP3A4는 4일부터 감소하는 경향을 나타냈다.
상기 결과는 간 오가노이드에서 CYP450 활성을 증가시키기 위해 철이 필요하다는 것을 제시한다.
< 실험예 8> 간 오가노이드의 약물 독성 실험
<8-1> 간 오가노이드의 약물 독성 평가
약물 독성 평가를 위한 세포 모델로서 간 오가노이드의 유용성을 확인하기 위해 간 오가노이드, 간암 세포주(HepG2) 및 2D 간 세포 유사 세포(hepatocyte-like cell)에서 약물 독성 평가를 수행하였다.
구체적으로, 구연산 철이 있는 배양 배지에서 배양되어 제조된 D-HO, S-HO, HepG2 및 2D HLC를 96 웰 플레이트에서 배양했다. 1-, 5-, 10-, 20-, 40-fold Cmax 농도의 화합물(티클로피딘, 플루타마이드, 을 각 기본 배지에서 준비했으며 최종 DMSO 농도는 0.1 %이다. 간 오가노이드 또는 세포를 화합물로 24시간 동안 처리하고, CellTiter-Glo® 3D Cell Viability Assay(Promega)를 사용하여 생존력을 측정했다. 얻은 값은 대조군에 대해 정규화되었다. 정규화된 값은 선량-반응 관계를 비선형 회귀 곡선으로 시각화하고 IC50 값을 계산하는 데 사용되었다(GraphPad Prism, GraphPad Software, San Diego, CA). 또한 테스트 된 각 화합물에 대한 다양한 세포 유형의 민감도는 IC50 값 (GraphPad Prism)의 히트맵으로 표시되었다.
그 결과, 도 35에 나타난 바와 같이, 대부분의 약물에서 D-HO FC는 다른 세포 모델보다 낮은 농도에서 세포 독성을 갖는 것으로 관찰되었다
<8-2> 간 오가노이드의 CYP450 매개 약물 대사 능력 평가
약물 대사 능력 평가를 위한 세포 모델로서 간 오가노이드의 유용성을 확인하기 위해 간 오가노이드(D-HO FC 및 S-HO FC), 초대 배양 인간 간 세포(PHH)에서 CYP450 매개 약물 대사 능력을 비교하였다.
구체적으로, 간 오가노이드와 PHH의 배지에서 전구 약물의 양을 측정하기 위해 CYP2D6 및 CYP2C19의 경우 아미트립틸린(amitriptyline), CYP2D6의 경우 클로르프로마진(chlorpromazine), CYP2C9 및 UGT2B7의 경우 디클로페낙(diclofenac)을 포함한 화합물을 사용했다. 화합물은 5% CO2에서 37℃에서 24시간 동안 1μM의 농도로 처리되었다. 이들은 각각의 24 웰 배양 플레이트에서 웰 당 0.7㎖의 최종 부피로 배양되었다. 60㎕의 배지를 각각 1.5, 3, 6, 12 및 24시간에 회수하고, 100nM CBZ 및 300nM 4-MUF를 포함하는 빙냉 ACN 60㎕를 첨가하여 반응을 급랭시켰다. 샘플을 4℃에서 10분 동안 16,000g에서 원심 분리하고 상청액을 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법 (LC-MS / MS)에 적용했다. 화합물만(유기농 또는 무 세포)의 값을 대조군으로 사용했다. 데이터는 단백질 농도로 정규화되었다.
그 결과, 도 36에 나타난 바와 같이, CYP450 매개 약물 대사 능력은 D-HO FC 및 S-HO FC에서 아미트립틸린(CYP2D6 및 CYP2C19), 클로르프로마진(CYP2D6) 및 디클로페낙(CYP2C9 및 UGT2B7)을 포함한 약물의 소실을 사용하여 결정되었고, 간 오가노이드에서 PHH와 유사한 간 오가노이드에서 약물 대사 기능을 나타내었다.
<8-3> 간 오가노이드의 아세트아미노펜 (Acetaminophen) 대사 능력 평가
안전하고 효과적인 진통제 및 해열제인 아세트아미노펜(Acetaminophen, APAP)은 해독(glucuronidation 및 sulfation과 같은 접합)과 bioactivation (CYP450 매개 산화)과 같은 두 가지 경로를 통해 광범위한 간 대사를 겪는 것으로 알려져 있다(Hodgman and Garrard, 2012). D-HO, S-HO, PHH, HepG2 및 2D HLC에서 비 세포 독성 농도하에서 아세트아미노펜 대사를 테스트했다. UGT(UDP-글루쿠로 노실 트랜스퍼라제) 및 SULT(설포트랜스퍼라제)에 의한 접합체 반응은 APAP 대사를 위한 주요 대사 경로이다(도 37).
구체적으로, APAP의 대사 산물을 측정하기 위해 5% CO2에서 37℃에서 24시간 동안 10mM APAP로 처리된 PHH, D-HO, S-HO, HepG2 및 2D HLC에서 반응을 수행했다. APAP는 각 24 웰 배양 플레이트에서 최종 부피가 웰당 0.7㎖가 되도록 처리되었다. 70㎕의 배지를 각각 3, 6, 12 및 24시간에 회수하고 내부 표준 물질로 100 nM BR-A-563을 포함하는 얼음처럼 차가운 ACN 70㎕를 첨가하여 반응을 켄칭했다. 샘플을 4℃에서 10분 동안 16,000g에서 원심 분리하고 상청액을 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법 (LC-MS/MS)에 적용했다. 데이터는 단백질 농도로 정규화되었다.
그 결과, 도 38에 나타난 바와 같이, APAP-글루쿠로나이드(APAP-Glu)는 HepG2 및 2D HLC보다 D-HO, S-HO 및 PHH에서 더 많은 양으로 생성되었다. 또한, 도 39에 나타난 바와 같이, APAP-GSH의 경우, 대사 산물의 양은 D-HO, S-HO 및 PHH에서 12시간 후에 감소하는 경향이 있는 반면 HepG2 및 2D HLC에서는 대사 산물이 검출되지 않았다. 상기 결과는 간 오가노이드가 아세트아미노펜의 대사 능력이 있음을 제시한다.
<8-4> 간 오가노이드의 피마사르탄 ( fimasartan ) 대사 능력 평가
안지오텐신 II 수용체 차단제인 피마사르탄(FMS)은 고혈압 치료에 사용되며 CYP2C9, CYP3A4 및 CYP3A5에 의해 대사되는 것으로 알려져 있다. 세포 독성을 나타내지 않는 농도에서 D-HO, S-HO, PHH, HepG2 및 2D HLC를 사용하여 FMS 대사를 테스트했다. CYP3A4/5에 의해 BR-A-557로, CYP3A4에 의해 BR-A-535로 추가 대사되어 CYP2C9, CYP3A4 및 CYP3A5는 FMS S-옥사이드의 형성에 관여한다(도 40).
구체적으로, 피마사르탄(FMS)의 대사 산물을 측정하기 위해 5% CO2에서 37℃에서 24시간 동안 50μM FMS로 처리된 PHH, D-HO, S-HO, HepG2 및 2D HLC에서 반응을 수행했다. FMS는 각 24 웰 배양 플레이트에서 최종 부피가 웰 당 0.7㎖가 되도록 처리되었다. 70㎕의 배지를 각각 3, 6, 12 및 24시간에 회수하고 내부 표준 물질로 100 nM BR-A-563을 포함하는 얼음처럼 차가운 ACN 70㎕를 첨가하여 반응을 켄칭했다. 샘플을 4℃에서 10분 동안 16,000g에서 원심 분리하고 상청액을 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS / MS)에 적용했다. 데이터는 단백질 농도로 정규화되었다.
그 결과, 도 41에 나타난 바와 같이, FMS의 순차 대사 산물 생산은 PHH 및 hHO와 2D HLC에서 나타났으나, CYP3A4에 의한 FMS의 3단계 대사인 BR-A-535의 생산은 HepG2에서 관찰되지 않았다. 또한, 도 42에 나타난 바와 같이, CYP2C9는 FMS의 n-부틸 하이드록실화에 독점적인 역할을 했다. D-HO 및 S-HO가 HepG2 및 2D HLC보다 1-OH, 2- 또는 3-OH 및 4-OH 부틸 FMS를 포함한 더 많은 대사 산물을 생성한다는 것을 확인하였다.
상기 결과는 간 오가노이드가 CYP450 매개 약물 대사를 연구하고 테스트하기 위한 시험관 내 모델로 기능할 수 있음을 제시한다.
< 실험예 9> 간 오가노이드의 심장 독성 평가
간 오가노이드가 약물 대사 산물에 의해 유도된 심장 독성 평가에 사용될 수 있는지 여부를 간 오가노이드에 사이클로포스파마이드 및 테르비나핀을 처리하여 확인하였다.
<9-1> 사이클로포스파마이드( cyclophosphamide , CP)의 심장 독성 평가
사이클로포스파마이드(CP)는 항암 화학 요법 약물에 사용되는 알킬화제이며 심장 독성을 유발하는 것으로 알려져 있다. CP는 CYP2B6, CYP2C9/C19 및 CYP3A4/ A5를 포함하는 약물 대사 효소인 간 CYP450에 의해 활성화되어 4-하이드록시-CP를 형성하고 토토머인 AldoCP와 공존한다. 심장에서 AldoCP는 아크롤레인(acrolein)과 포스포마이드 머스타드(phsophormide mustard, PM)로 분해된다(도 43). 아크롤레인은 심근, 심근 세포 및 내피세포에 독성을 유발하는 독성 대사 산물이다. 따라서, FC 처리 S(-)-HO를 포함하거나 포함지 않는 조건에서 공동 배양된 hiPSC 유래 심근 세포 (hiPSC-CMs)에서 CP의 전기 생리학적 효과를 테스트했다.
구체적으로, hiPSC-CM 인 Cardiosight®-S (NEXEL Co., South Korea)의 전기적 활동은 37℃로 설정된 MEA 시스템 (Axion BioSystems, Maestro, US)을 사용하여 측정되었으며 5% CO2, 20% O2, 및 75% N2로 관류되었다. hiPSC-CM은 먼저 웰당 4× 104 세포의 밀도로 12-웰 MEA 플레이트에 씨딩되었고, 2일마다 수행되는 절반-중간 변화로 안정화되도록 NEXEL Co.에서 제공하는 심근 세포 배양 배지에서 7일 동안 유지되었다. 일주일 후, 배양 배지를 간 오가노이드 분화 배지(DM)으로 교체했다. 그런 다음 Transwell 삽입물 (Corning)을 각 웰에 배치하고 FC 처리된 S(-)-HO를 삽입물에 씨딩하고, 3일 동안 배양하였다. 화합물 적용 당일, 배양 배지를 웰 및 삽입물에서 완전히 제거하고 웰 당 정확한 부피(총 2㎖/웰)를 보장하기 위해 새로운 배지를 추가했다. 세포는 4시간 동안 평형을 이루도록 허용되었고, 온라인 매개 변수는> 40분 동안 안정적인 기준선을 보장하기 위해 모니터링 되었다. 세포는 웰 당 단일 용량으로 사이클로포스파마이드 약물에 노출되었다. 약물 또는 대조군(0.1% DMSO)를 적용한 후, 72시간 동안 30초 동안 5분 마다 필드 전위를 측정했다. 필드 전위 신호는 Axion BioSystems의 통합 스튜디오(AxIS) 소프트웨어로 기록 및 분석되어 박동 주파수(beating frequency)와 필드 전위 지속 시간을 측정했다. 일반적으로 Fredericia의 속도 보정 알고리즘(FPDcF)은 속도 의존 효과를 보정하는 데 사용된다. 여기서 FPDcF = FPD / Beat Period0.33이다. 데이터는 전처리 된 대조군 값으로 정규화되었다.
그 결과, 도 44에 나타난 바와 같이, 24시간 및 72시간 동안 250 및 500μM의 농도로 CP를 처리한 후, 간 오가노이드가 있는 hiPCS-CM의 박동률이 hiPSC-CM 단독에 비해 현저히 감소하여 CP의 심장 독성을 유발했다.
또한, 도 45에 나타난 바와 같이, Fridericia의 공식 (FPDcF)을 사용하여 비트 주파수에 의해 보정된 필드 전위 지속 시간은 간 오가노이드가 있는 hiPSC-CM에서 250μM의 CP를 처리한 경우 24시간 및 72시간 후에 증가하여 심장 독성을 나타내었다.
<9-2> 테르비나핀(terbinafine)의 심장 독성 평가
테르비나핀(Terfenadine, TER)은 생명을 위협하는 심실 부정맥을 유발할 수 있다. 테르비나핀은 간에서 CYP3A4에 의해 대사되며, 주요 활성 대사 산물은 테르비나핀에 비해 독성 효과가 낮은 것으로 알려진 펙소페나딘(FEX)이다(도 46).
사이클로포스포마이드 대신 테르비나핀을 처리한 것을 제외하고 상기 실험예 9-1와 동일한 방법 및 조건으로 간 오가노이드에서 테르비나핀의 심장 독성을 측정하였다.
그 결과, 도 47에 나타난 바와 같이, 간 오가노이드와 함께 배양하지 않은 hiPSC-CM에서 테르비나핀 첨가 30분 이내에 자발적인 박동의 중단을 유도함을 확인하였다. 또한, 도 48에 나타난 바와 같이, 간 오가노이드와 함께 배양된 hiPSC-CM은 1 및 10 μM TER의 처리에 의해 박동 빈도의 증가를 유도했으며, FPDcF가 변화하지 않았음을 확인하였다. 상기 결과는 hiPSC-CM에서 박동률 및 필드 잠재력과 관련된 테르비나핀의 심장 독성이 간 오가노이드를 통한 대사(독성이 없는 펙소페나딘)에 의해 완화되었음을 나타낸다.
상기 결과를 종합하면, 본 발명의 간 오가노이드는 간 CYP450 매개 약물 대사에 의해 유도된 표적 장기 독성을 연구하고 테스트하기 위한 시험관 내 모델 역할을 수행할 수 있음을 제시한다.

Claims (23)

1) 인간 전분화능 줄기세포(human pluripotent stem cell, hPSC)를 완전 내배엽 세포(definitive endoderm, DE)로 분화시키는 단계;
2) 상기 단계 1)의 완전 내배엽 세포를 간 내배엽 세포(hepatic endoderm, HE)로 분화시키는 단계;
3) 상기 단계 2)의 간 내배엽 세포를 간 내배엽 오가노이드(hepatic endoderm organoid, hHEO)로 분화시키는 단계;
4) 상기 단계 3)의 간 내배엽 오가노이드를 철 이온을 포함하는 배지에서 간 오가노이드(hepatic organoid, hHO)로 분화시키는 단계; 를 포함하는, 간 오가노이드의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 철 이온을 포함하는 배지는 구연산 철(ferric citrate, FC), 염화철(FeCl3), 황산철(Fe2SO4), 황산제이철(Fe2(SO4)3), 질산철(Fe(NO3)3) 및 펜타카보닐철(Fe(CO)5)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 배지인 것인, 간 오가노이드의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 인간 전분화능 줄기세포는 인간 배아줄기세포(human embryonic stem cell, hESC) 또는 인간 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)인, 간 오가노이드의 제조방법.
제2항에 있어서, 상기 구연산 철은 10 내지 30μM의 농도로 포함되는 것인, 간 오가노이드의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 3)의 간 내배엽 오가노이드는 물방울 형태(droplet) 또는 현탁 상태(suspension)인 것인, 간 오가노이드의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 3)의 분화는 발생 단계(generation stage) 및 확장 단계(expansion stage)로 이루어지는 것인, 간 오가노이드의 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 발생 단계는 R spondin-1, Noggin 및 EGF가 포함되지 않은 배지에서 배양되는 것인, 간 오가노이드의 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 발생 단계는 10일 내지 18일 동안 수행되는 것인, 간 오가노이드의 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 확장 단계는 R spondin-1 및 EGF가 포함되지 않은 배지에서 배양되는 것인, 간 오가노이드의 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 확장 단계는 3일 내지 7일 동안 수행되는 것인, 간 오가노이드의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 3)의 분화는 13 내지 25일 동안 수행되는 것인, 간 오가노이드의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 4)의 간 오가노이드는 물방울 형태(droplet) 또는 현탁 상태(suspension)인 것인, 간 오가노이드의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 4)의 분화는 간 내배엽 오가노이드를 계대 배양하는 단계 및 간 내배엽 오가노이드를 간 오가노이드로 분화시키는 단계로 구성되는 것인, 간 오가노이드의 제조방법.
제13항에 있어서, 상기 간 내배엽 오가노이드를 계대 배양하는 단계는 R spondin-1 및 EGF가 포함되지 않은 배지에서 배양되는 것인, 간 오가노이드의 제조방법.
제13항에 있어서, 상기 간 내배엽 오가노이드를 간 오가노이드로 분화시키는 단계는 EGF가 포함되지 않은 배지에서 배양되는 것인, 간 오가노이드의 제조방법.
제13항에 있어서, 상기 간 내배엽 오가노이드를 계대 배양하는 단계는 3일 내지 7일 동안 수행되는 것인, 간 오가노이드의 제조방법.
제13항에 있어서, 상기 간 내배엽 오가노이드를 간 오가노이드로 분화시키는 단계는 10일 내지 20일 동안 수행되는 것인, 간 오가노이드의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 4)의 분화는 13일 내지 27일 동안 수행되는 것인, 간 오가노이드의 제조방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 간 오가노이드의 제조방법에 의해 제조된 약물 대사 능력이 증진된 간 오가노이드.
제19항에 있어서, 상기 간 오가노이드는 시토크롬 P450(cytochrome P450, CYP450)을 발현하는 것인, 간 오가노이드.
제20항에 있어서, 상기 시토크롬 P4560은 CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 및 CYP3A4로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 간 오가노이드.
제19항에 있어서, 상기 간 오가노이드는 약물에 의한 독성 평가에 사용되는것인, 간 오가노이드.
제19항에 있어서, 상기 간 오가노이드는 약물에 의한 심장 독성 평가에 사용되는 것인, 간 오가노이드.





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