KR20220117844A - mTOR 신호경로를 억제하는 화합물을 유효성분으로 포함하는 신경계 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

mTOR 신호경로를 억제하는 화합물을 유효성분으로 포함하는 신경계 질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 mTOR 신호경로를 억제하는 신규 화합물, 이의 제조 방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 화합물은 mTORC1과 mTORC2 활성을 억제하고, 오토파지를 활성화하며, 치매모델 동물에서 알츠하이머형 치매와 연관된 일련의 병증들을 완화함을 발견하여, 알츠하이머형 치매, 퇴행성 뇌질환 및 mTOR병증을 포함하는 신경계 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

mTOR 신호경로를 억제하는 화합물을 유효성분으로 포함하는 신경계 질환 예방 또는 치료용 조성물{Compounds inhibiting mTOR signaling and composition for preventing or treating neurological diseases comprising the same as an active ingredient}
본 발명은 mTOR 신호경로를 억제하는 신규 화합물, 이의 제조 방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
대표적인 퇴행성 뇌질환인 알츠하이머형 치매는 점진적인 뇌 신경세포 감소로 인해 생기는 진행성 뇌질환이며, 신경세포 주변에 Aβ가 축적되어 생기는 노인성 반(senile plaques) 및 신경세포 내부에서 tau의 과인산화에 의한 엉킴으로 축적되는 neurofibrillary tangles(NFT)가 주요 비정상적인 병변으로 관찰된다.
상기 Aβ는 Amyloid Precusor Protein(APP)나 presenillin-I(PS-I), Presenillin-II (PS-II)에 생기는 돌연변이에 의해 β와 γ-secretase가 APP를 잘라서 생성되는데, 그 이상 구조(β때문에 제거되지 않고 축적되고, 상기 APP, PS-I, PS-II, tau 등의 돌연변이는 알츠하이머형 치매 발병의 유전적(Familial Alzheimer's disease, FAD) 요인이 된다. 상기 노인성 반과 NFT는 모두 비정상적 단백질 항상성에 의해 생성되어 축적되며 주변에 있는 신경세포의 사멸을 유도하고, Aβoligomer와 과인산화된 tau oligomer는 시냅스를 통해 주변 신경세포로 전달되어 점차 더 많은 세포를 죽게 한다.
지금까지 알츠하이머형 치매 치료제는 증상을 완화하는 약물 이외에 병인을 치료하는 치료제는 개발되지 않았다. 노인성 반을 제거하는 약물로 β저해제, γ-secretase 저해제, 그리고 Aβ를 인식하여 노인성 반의 해체를 돕는 단항체 등 100 가지 이상 후보약물이 임상 실험에 들어갔으나, 노인성 반을 후보약물이 제거해도 인지 기능이 회복되지 않는다는 임상 결과를 얻어 2018년 및 2019년에 걸쳐 거의 모두 실패를 선언하고 중단되었다. 미국 식품의약국(FDA)이 Aβ응집체에 결합하여 노인성 반의 해체를 유도하는 단항체인 아두카누맙(Aducanumab, Biogen)을 초기 알츠하이머형 치매 치료제로 2021년 가속승인하였으나, 치료 효능에 대한 논란이 지속되고 있다. 현재 사용 중인 치매 치료제는 병의 원인을 치료하는 약물이 아닌 정신 기능의 감소를 지연시키는 아세틸콜린 분해효소 억제제(Ach esterase inhibitor)가 주요 약물로 사용되고 있다.
mTOR(mammalian Target of rapamycin) 복합체는 세포 내 단백질 합성과 오토파지(autophagy)를 조절하고 세포 성장을 일으키는 역할을 한다. 구체적으로, 상기 mTOR는 세린/트레오닌 키나아제(serine/threonine kinase)로 세포 내부와 외부 신호를 연합하고, 세포 대사, 성장, 증식과 생존을 조절하는 신호전달 허브(signaling hub)의 중심으로 작용한다. 따라서, 많은 질환에서 mTOR 신호전달의 이상이 발견되며, 특히 신경계 질환과 암 등에서 mTOR 과잉 신호전달이 문제된다 (Lipton & Sahin (2014) Neuron 84: 275-291).
예를 들면, 상기 mTOR 신호의 증가 또는 mTORC1(mammalian Target of rapamycin complex1)의 하위 신호전달자인 S6K의 인산화는 알츠하이머형 치매 환자의 뇌조직에서 Aβ와 NFT 축적과 비례하여 증가하고, 과인산화된 tau의 병리적인 축적은 S2481 인산화에 따른 mTOR 단백질의 활성화와 관련 있음이 밝혀진 바 있다 (Li et al. (2005) FEBS J. 272: 4211-4220). 또한, mTORC1을 활성화하는 AKT는 알츠하이머형 치매 환자의 측두엽 뇌에서 증가하며, mTOR 신호의 억제는 Aβ를 축적하는 동물모델에서 생리학적인, 행동학적인 완화를 보인다. 약물이나 유전자 조작에 의한 Aβ양 감소는 mTOR 경로의 활성 감소를 동반하고, 퇴행성 뇌질환의 한 종류인 파킨슨병(Parkinson's disease, PD)와 헌팅턴병(Huntington's disease, HD)에서도 mTOR 경로의 억제가 병증을 완화하는 것이 밝혀졌다 (Lipton & Sahin (2014) Neuron 84: 275-291).
한편, mTOR 복합체는 mTOR, mLST8, DEPTOR, Tti1/Tel2, RAPTOR, PRAS40을 구성 단백질로 하는 mTORC1과 mTOR, mLST8, DEPTOR, Tti1/Tel2, RICTOR, mSIN1, PROTOR1/2를 구성단백질로 하는 mTORC2(mammalian target of rapamycin complex 2)로 존재하며, 둘 다 뇌질환과 자폐증 등과 연관된 것으로 제안되나 두 복합체는 서로 다른 기능을 가진다 (Saxton & Sabatini (2017) Cell 168: 960-976). 예를 들면, 상기 mTORC1은 세포 내 영양과 에너지 수준을 감지하고 여유가 있는 경우에만 동화작용이 일어나게 한다. 그 예로 eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1(4E-BP1)을 인산화하여 cap-의존적 mRNA 번역을 활성화하고 de novo 지방 합성도 증진한다. 반면, 상기 mTORC2는 외부신호에 따라 세포의 생존과 증식을 유도하고 적합한 시간과 장소에서 상호작용하도록 기능한다. 예로 mTORC2는 인슐린 등 성장인자에 의한 PI3K 자극에 반응하여 활성화되며, AKT, SGK, PKC와 같은 AGC kinases를 인산화하여 액틴(actin) 세포골격을 재분포하고 세포생존과 증식을 증진한다. 또한 metabotropic glutamate receptor-mediated long-term depression (mGluR-LTD)와 같은 신경 가소성도 mTORC2에 의해 조절된다.
신경발생과정에서 신경전구세포의 mTOR 신호는 줄기세포능(stemness) 유지와 신경 및 신경 아교 세포(glia) 분화의 주요 조절인자이다. mTORC1 경로의 상위유전자인 Phosphatase and tensin homolog(PTEN)이나 Tuberous sclerosis 1/2(TSC1/2) 변이에 의한 mTOR 신호 증가는 신경 구조와 분화에 큰 영향을 준다 (Lipton & Sahin (2014) Neuron 84: 275-291). TSC1/2 결실된 신경세포는 축삭 숫자가 많아지고 해마 신경세포에서는 세포체(soma)가 커지고 수상 돌기 분지(dendritic arbor)의 크기가 커지나 수지상 가시(dendritic spine) 숫자는 감소한다 (Tavazoie et al. (2005) Nat. Neurosci. 8: 1727-1734). Tsc1이 결실된 동물모델에서도 커다란 신경세포와 가소성이 적은 신경과 신경 아교 세포가 발견된다 (Uhlmann et al. (2002) Ann. Neurol. 52: 285-296).
상술한 mTORC1과 mTORC2의 기능 구분은 raptor와 rictor knockout(KO) 쥐 발생에서 보고되었다. 뇌 특이적 raptor KO 형질전환 쥐는 소뇌증(microcephaly), 신경세포 크기 감소, 세포 사멸과 생후 초기 높은 치사율을 보였다 (Cloetta et al. (2013) J. Neurosci. 33: 7799-7810). 또, 척수의 희소 돌기 아교 세포(oligodendrocyte)에서는 mTORC1이 수초화(myelination)의 시작과 두께를 촉진하였다.
mTORC2의 rictor KO 쥐에서는 소뇌증, 신경세포의 세포체(soma) 크기 감소와 함께 수상돌기 길이 감소를 보이나 (Thomanetz et al. (2013) J. Cell Biol. 201: 293-308), S6K1, 4EBP1 인산화에는 변화가 없으므로 이는 mTORC2와 관계없는 현상으로 보인다. mTORC2는 Rho, Rac을 활성화하여 세포골격을 조직화하고 시냅스 형성과 기능에 작용하나 너무 활성화되면 수지상 가시 숫자는 많아지나 성숙되지 않는다.
mTOR의 대표적인 저해제인 라파마이신(Rapamycin)을 치매모델 동물에 장기로 투여하면, 치매와 연관된 기억력과 인지기능 소실이 회복되고, Aβ가 감소할 뿐만 아니라 오토파지가 증가하여 치매 병증의 진전을 지연 또는 억제한다 (Spilman et al. (2010) PLoS One 4: e9979). 그러나 라파마이신은 면역억제 기능을 가지고 있고 부작용이 심해 장기 투약이 요구되는 치매 치료제로는 사용되지 못하고 있다. 라파마이신은 mTORC1을 억제하나 오래 투여하면 mTORC2도 억제된다 (Sarbassov et al. (2006) Mol. Cell 22: 159-168). 이에 따라 라파마이신에 의한 치매 치료 효과가 mTORC1 억제에 의한 것인지 아니면 mTORC2 억제에 의한 것인지 확실하지 않다.
Arc(activity-regulated cytoskeleton-associated protein)은 시냅스 활성화에 의해 빠르게 발현이 유도되는 immediate early gene 중 하나로, Arc mRNA는 번역(translation)이 억제된 상태로 빠르게 최근 활성화되었던 수지상 가시로 운반되어 위치한다. 그 후, 시냅스 활성화에 의해 Arc mRNA가 위치한 시냅스가 상대적으로 낮은 빈도(<10Hz)로 활성화되면 mGluR1/5의 활성화 신호를 전달받아 Arc mRNA가 번역되고, 생성된 Arc 단백질은 AMPA(α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid) 수용체의 세포내이입(endocytosis)를 촉진하여 시냅스 활성을 감소시키는 long term depression (LTD)을 일으킨다 (Wilkerson et al. (2018) Semin. Cell Dev. Biol. 77: 51-62). 해마에서 발생하는 상기 mGluR-의존적 LTD는 시냅스 가소성에 기여하여 새로운 기억 형성 및 인지 기능에 핵심적인 역할을 수행한다.
상기 APP가 α-secretase와 γ-secretase에 의해 차례로 잘리면 sAPPα, P3, AICD50이 생성되어 신경세포의 사멸을 촉진하는 Aβ가 생성되지 않는다. 반면 APP가 β-secretase와 γ에 의해 차례로 잘리면 sAPPβ, AICD50과 함께 Aβ가 생성된다. 그리고 APP로부터 Aβ가 생성되지 않는 nonamyloidogenic 경로는 세포막에서 일어나는 반면, Aβ가 생성되는 amyloidogenic 경로는 세포막이 아니라 엔도솜(endosome)에서 일어난다 (Rajendran & Annaert (2012) Traffic 13: 759-770). Arc 단백질은 APP와 β-secretase가 위치하는 엔도솜에 γ-secretase를 결합하게 하여 APP의 아밀로이드 생성 과정을 통한 Aβ 생산을 촉진한다 (Wu et al. (2011) Cell 147: 615-628). 따라서 Arc 단백질은 신경세포가 활성화함에 따라 증가하는 활성 의존적 Aβ 생성을 결정하는 주요 조절자이다. 최근 해마에서 Arc 단백질을 합성하게 하는 mGluR 신호에 의해 LTD가 발생하기 위해서는 mTORC2가 필요함이 밝혀졌다 (Zhu et al. (2018) Nat. Neurosci. 21: 799-802). Aβ oligomer도 mTOR 신호경로를 활성화하고 Arc 단백질 생성을 증가시키는데 (Caccamo et al. (2011) J. Biol. Chem. 286: 8924-8932; Lancor et al. (2004) J. Neurosci. 24: 10191-10200), Aβ oligomer에 의한 신호전달은 PrPc와 mGluR5에 의해 매개된다 (Um et al. (2013) Neuron 79: 887-902). mGluR-의존적 LTD 형성이 Arc 단백질에 의한 AMPA 수용체를 포함하는 엔도솜의 internalization에 의해 매개됨을 고려할 때, Aβ가 활성 의존적으로 생성되는 과정 또한 mTORC2가 필요할 것으로 예측된다. 따라서 mTORC2은 Aβ 생성을 억제하는 알츠하이머형 치매 치료제를 개발하기 위한 표적 단백질이 된다.
퇴행성 뇌질환에서 알츠하이머형 치매의 Aβ와 tau 엉킴 NFT, 헌팅턴병의 huntingtin, 파킨슨병의 synuclein 등 비정상적 단백질 항상성에 의해 생성되어 축적되는 단백질들은 오토파지에 의해 제거된다. 오토파지 또는 자가소화작용(autophagocytosis)는 세포가 불필요하거나 기능하지 않는 세포 구성성분을 자가 분해하는 조절 기전으로, 세포 독성을 가지는 단백질 응축이나 엉킴, 손상된 세포소기관 등을 제거하여 단백질 항상성(proteostasis) 유지에 중요한 기능을 한다 (Levine et al. (2011) Nature 469: 323-335).
오토파지의 한 유형인 macroautophagy에서는 이중막 autophagosome이 형성되며 비정상 단백질과 손상된 세포소기관이 내부로 들어가고, 리소좀(lysosome)과 융합하여 오토리소좀(autolysosome)을 만들어 가수분해효소에 의한 내용물의 분해가 일어난다. 2중막 자가포식소체(autophagosome) 형성은 autophagy-related (ATG) protein 중의 하나인 Unc-51-like kinases, ULK1 and ULK2 (mammalian homologues of Atg1)에 의해 촉진된다.
포유동물에서 아미노산 수준이 높아지거나 성장인자 신호가 감지되면 mTORC1이 활성화되고, mTORC1은 ULK1과 ULK2를 인산화하여 오토파지를 억제한다 (Kim et al. (2011) Nature Cell Biol. 13: 132-141). ULK는 Beclin-1 (mammalian homologue of Atg6)을 인산화하여 활성화하고 ULK/Beclin-1 복합체는 자가포식소체가 생성되는 부위인 식세포(phagophore)로 이동하여 오토파지를 활성화한다.
라파마이신과 라파마이신 유도체인 라파로그(rapalog)는 mTORC1 활성을 억제하므로, 오토파지 촉진제로 기대를 많이 받았으나, 특이하게도 오토파지에 연관된 mTORC1 기질인 ULK1 Ser758과 TFEB Ser142 인산화는 잘 억제하지 못한다 (Choo et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105: 17414-17419). 따라서 오토파지를 촉진하기 위한 용도로 mTORC1 저해제를 사용하기 위해서는, 라파마이신과는 상이한 저해 기전을 갖는 새로운 mTORC1 저해제 개발이 요구되고 있다.
오토파지에서 ubiquitin-like complex가, ubiquitin-like yeast protein ATG8의 포유동물 동족체(homolog)인 LC3 단백질에 자가포식소체 표면에 있는 lipid phosphatidylethanolamine (PE)을 공유결합으로 붙인다 (Dooley et al. (2014) Mol. Cell 55: 238-252). 지방화된 LC3는 자가포식소체를 닫아서 화물(cargo)와 p62가 결합하게 하고, 완성된 자가포식소체는 리소좀과 융합하게 된다. LC3은 LC3-I이라고 명명되며, PE-conjugation 된 형태의 LC3는 LC3-II라고 명명된다.
mTOR병증(mTORopathy)은 생식세포나 신경세포에서 mTOR 신호전달 경로에 있는 유전자의 체세포 돌연변이(somatic mutations)에 의해 신경계 이상이 발생하는 유전 질환이다 (Karalis & Bateup (2021) Dev. Neurosci. 43: 143-158). 뇌전증, 자폐증(Autism spectrum disorder), 복합결절성경화증(Tuberous sclerosis, TSC), 취약 X 증후군(Fragile X syndrome) 등이 속하며 주로 mTOR 신호의 과잉 활성화가 mTOR병증을 일으킨다. PI3K/mTOR 신호의 억제자인 phosphatase and tensin homolog(PTEN) 유전자의 돌연변이는 mTOR병증의 전형적인 예로 mTOR 과잉신호가 대뇌증(macrocephaly), 자폐증, 간질, 정신 지체 등을 일으킨다 (Nguyen et al. (2015) Epilepsia 56: 636-646).
본 발명에서는 O-알킬화 노라티리올(norathyriol) 유도체가 mTORC1과 mTORC2 활성을 저해하고 오토파지를 유도함을 발견하였으며, 치매모델 동물에서 알츠하이머형 치매와 연관된 일련의 병증들을 완화함을 발견하였으며, 알츠하이머형 치매, 퇴행성 뇌질환 및 mTOR병증을 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료에 효과적인 저분자 화합물을 합성하였다.
Lipton & Sahin (2014) Neuron 84: 275-291 Li et al. (2005) FEBS J. 272: 4211-4220 Saxton & Sabatini (2017) Cell 168: 960-976 Tavazoie et al. (2005) Nat. Neurosci. 8: 1727-1734 Uhlmann et al. (2002) Ann. Neurol. 52: 285-296 Cloetta et al. (2013) J. Neurosci. 33: 7799-7810 Thomanetz et al. (2013) J. Cell Biol. 201: 293-308 Spilman et al. (2010) PLoS One 4: e9979 Sarbassov et al. (2006) Mol. Cell 22: 159-168 Wilkerson et al. (2018) Semin. Cell Dev. Biol. 77: 51-62 Rajendran & Annaert (2012) Traffic 13: 759-770 Wu et al. (2011) Cell 147: 615-628 Zhu et al. (2018) Nat. Neurosci. 21: 799-802 Caccamo et al. (2011) J. Biol. Chem. 286: 8924-8932; Lancor et al. (2004) J. Neurosci. 24: 10191-10200 Um et al. (2013) Neuron 79: 887-902 Levine et al. (2011) Nature 469: 323-335 Choo et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105: 17414-17419 Dooley et al. (2014) Mol. Cell 55: 238-252 Karalis & Bateup (2021) Dev. Neurosci. 43: 143-158 Nguyen et al. (2015) Epilepsia 56: 636-646
본 발명자들은 mTORC1 및 mTORC2 활성을 저해하고, 오토파지를 우수하게 유도하여 신경계 질환에 대한 예방 또는 치료효과를 나타낼 수 있는 신규 화합물을 발견하기 위해 예의 노력을 기울인 결과, 본 명세서에서 화학식 A로 표시되는 천연물질에서 유래되는 저분자 화합물에 의해 mTOR 경로가 억제되고, 오토파지를 유도하여 1 차 배양된 뇌신경세포에 축적된 Aβ를 제거하는 활성이 우수하며, 치매모델 동물에서 치매 연관 병증인 기억력 및 인지기능 장애를 회복시키고, 노인성 반, NFT 축적, 뇌염증 반응을 완화하는 활성이 우수하고, 신경전구세포의 분화에 의한 신경재생을 증진하여, 신경계 질환 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 일 목적은 하기 화학식 A로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하는 것이다:
[화학식 A]
Figure pat00001
(상기 화학식에서
R1 및 R2는 각각 수소, 하이드록시, 할로젠, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 및 C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이고,
R3 및 R4는 각각 수소, 하이드록시, 할로젠, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시, 피리디닐 메톡시 및 벤질 옥시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이다.)
본 발명의 다른 일 목적은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 목적은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 mTOR병증(mTORopathy)의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 목적은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 신경재생(neurogenesis) 촉진을 특징으로하는 신경 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 목적은 하기 반응식 1에 나타난 바와 같이, 유기 용매 및 염기 촉매 존재 하에 하기 화학식 1로 표시되는 노라티리올 및 하기 화학식 B1으로 표시되는 화합물을 반응 시키는 단계(단계 1);를 포함하는 하기 화학식 A2로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공하는 것이다:
[반응식 1]
Figure pat00002
(상기 반응식에서,
X1 및 X2는 각각 클로로, 브로모, 아이오도, 토실레이트 및 메질레이트 중 어느 하나이고,
R1 및 R2는 각각 수소, 하이드록시, 할로젠, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 및 C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이다.)
본 발명의 다른 일 목적은 하기 반응식 2에 나타난 바와 같이, 유기 용매 및 염기 촉매 존재 하에 하기 화학식 A2로 표시되는 화합물 및 화학식 B2로 표시되는 화합물을 반응 시키는 단계(단계 1);를 포함하는 하기 화학식 A3로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공하는 것이다:
[반응식 2]
Figure pat00003
(상기 반응식에서,
X3는 각각 클로로, 브로모, 아이오도, 토실레이트 및 메질레이트 중 어느 하나이고,
R1 및 R2는 각각 수소, 하이드록시, 할로젠, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 및 C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이고,
R5는 수소, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 피리디닐 및 벤질기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이다.)
본 발명의 다른 일 목적은 하기 반응식 3에 나타난 바와 같이, 유기 용매 및 염기 촉매 존재 하에 하기 화학식 A2로 표시되는 화합물 및 화학식 B3로 표시되는 화합물을 반응 시키는 단계(단계 1);를 포함하는 하기 화학식 A4로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공하는 것이다:
[반응식 3]
Figure pat00004
(상기 반응식에서,
X4는 각각 클로로, 브로모, 아이오도, 토실레이트 및 메질레이트 중 어느 하나이고,
R1 및 R2는 각각 수소, 하이드록시, 할로젠, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 및 C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이고,
R6는 수소, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 피리디닐 및 벤질기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이다.)
본 발명의 다른 일 목적은 하기 반응식 4에 나타난 바와 같이, 유기 용매 및 염기 촉매 존재 하에 하기 화학식 A3로 표시되는 화합물 및 화학식 B4로 표시되는 화합물을 반응 시키는 단계(단계 1);를 포함하는 하기 화학식 A6로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공하는 것이다:
[반응식 4]
Figure pat00005
(상기 반응식에서,
X5는 각각 클로로, 브로모, 아이오도, 토실레이트 및 메질레이트 중 어느 하나이고,
R1 및 R2는 각각 수소, 하이드록시, 할로젠, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 및 C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이고,
R5 및 R7은 각각 수소, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 피리디닐 및 벤질기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이다.)
본 발명의 다른 일 목적은 하기 반응식 5에 나타난 바와 같이, 유기 용매 및 Pd/C 촉매 하에 하기 화학식 A6로 표시되는 화합물 및 수소 기체를 반응 시키는 단계(단계 1);를 포함하는 하기 화학식 A7로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공하는 것이다:
[반응식 5]
Figure pat00006
(상기 반응식에서,
R1 및 R2는 각각 수소, 하이드록시, 할로젠, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 및 C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이고,
R5 및 R7은 각각 수소, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 피리디닐 및 벤질기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이다.)
본 발명의 다른 일 목적은 하기 반응식 6에 나타난 바와 같이,
유기 용매 및 염기 촉매 존재 하에 하기 화학식 A18로 표시되는 화합물 및 화학식 B5로 표시되는 화합물과 반응 시켜 하기 화학식 A18-1로 표시되는 화합물을 합성하는 단계(단계 1);
유기 용매 하에 화학식 A18-1로 표시되는 화합물 및 인산염을 반응 시켜 하기 화학식 A18-2로 표시되는 화합물을 합성하는 단계(단계 2); 및
유기 용매 하에 하기 화학식 A18-2로 표시되는 화합물 및 염화 포스포릴(Phosphorus oxychloride, POCl3)를 반응시키는 단계(단계 3);를 포함하는 하기 화학식 A20으로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공하는 것이다:
[반응식 6]
Figure pat00007
(상기 반응식에서,
R8, R9, R10 및 R11은 각각 수소, 하이드록시, 할로젠, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬 및 C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이다.)
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 하기 화학식 A로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
[화학식 A]
Figure pat00008
(상기 화학식에서
R1 및 R2는 각각 수소, 하이드록시, 할로젠, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 및 C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이고,
R3 및 R4는 각각 수소, 하이드록시, 할로젠, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시, 피리디닐 메톡시 및 벤질 옥시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이다.)
또한, 본 발명은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 mTOR병증(mTORopathy)의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 신경재생(neurogenesis) 촉진을 특징으로하는 신경 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 반응식 1에 나타난 바와 같이, 유기 용매 및 염기 촉매 존재 하에 하기 화학식 1로 표시되는 노라티리올 및 하기 화학식 B1으로 표시되는 화합물을 반응 시키는 단계(단계 1);를 포함하는 하기 화학식 A2로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다:
[반응식 1]
Figure pat00009
(상기 반응식에서,
X1 및 X2는 각각 클로로, 브로모, 아이오도, 토실레이트 및 메질레이트 중 어느 하나이고,
R1 및 R2는 각각 수소, 하이드록시, 할로젠, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 및 C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이다.)
또한, 본 발명은 하기 반응식 2에 나타난 바와 같이, 유기 용매 및 염기 촉매 존재 하에 하기 화학식 A2로 표시되는 화합물 및 화학식 B2로 표시되는 화합물을 반응 시키는 단계(단계 1);를 포함하는 하기 화학식 A3로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다:
[반응식 2]
Figure pat00010
(상기 반응식에서,
X3는 각각 클로로, 브로모, 아이오도, 토실레이트 및 메질레이트 중 어느 하나이고,
R1 및 R2는 각각 수소, 하이드록시, 할로젠, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 및 C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이고,
R5는 수소, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 피리디닐 및 벤질기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이다.)
또한, 본 발명은 하기 반응식 3에 나타난 바와 같이, 유기 용매 및 염기 촉매 존재 하에 하기 화학식 A2로 표시되는 화합물 및 화학식 B3로 표시되는 화합물을 반응 시키는 단계(단계 1);를 포함하는 하기 화학식 A4로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다:
[반응식 3]
Figure pat00011
(상기 반응식에서,
X4는 각각 클로로, 브로모, 아이오도, 토실레이트 및 메질레이트 중 어느 하나이고,
R1 및 R2는 각각 수소, 하이드록시, 할로젠, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 및 C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이고,
R6는 수소, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 피리디닐 및 벤질기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이다.)
또한, 본 발명은 하기 반응식 4에 나타난 바와 같이, 유기 용매 및 염기 촉매 존재 하에 하기 화학식 A3로 표시되는 화합물 및 화학식 B4로 표시되는 화합물을 반응 시키는 단계(단계 1);를 포함하는 하기 화학식 A6로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다:
[반응식 4]
Figure pat00012
(상기 반응식에서,
X5는 각각 클로로, 브로모, 아이오도, 토실레이트 및 메질레이트 중 어느 하나이고,
R1 및 R2는 각각 수소, 하이드록시, 할로젠, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 및 C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이고,
R5 및 R7은 각각 수소, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 피리디닐 및 벤질기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이다.)
또한, 본 발명은 하기 반응식 5에 나타난 바와 같이, 유기 용매 및 Pd/C 촉매 하에 하기 화학식 A6로 표시되는 화합물 및 수소 기체를 반응 시키는 단계(단계 1);를 포함하는 하기 화학식 A7로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다:
[반응식 5]
Figure pat00013
(상기 반응식에서,
R1 및 R2는 각각 수소, 하이드록시, 할로젠, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 및 C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이고,
R5 및 R7은 각각 수소, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 피리디닐 및 벤질기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이다.)
또한, 본 발명은 하기 반응식 6에 나타난 바와 같이, 유기 용매 및 염기 촉매 존재 하에 하기 화학식 A18로 표시되는 화합물 및 화학식 B5로 표시되는 화합물과 반응 시켜 하기 화학식 A18-1로 표시되는 화합물을 합성하는 단계(단계 1); 유기 용매 하에 화학식 A18-1로 표시되는 화합물 및 인산염을 반응 시켜 하기 화학식 A18-2로 표시되는 화합물을 합성하는 단계(단계 2); 및 유기 용매 하에 하기 화학식 A18-2로 표시되는 화합물 및 염화 포스포릴(Phosphorus oxychloride, POCl3)를 반응시키는 단계(단계 3);를 포함하는 하기 화학식 A20으로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다:
[반응식 6]
Figure pat00014
(상기 반응식에서,
R8, R9, R10 및 R11은 각각 수소, 하이드록시, 할로젠, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬 및 C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이다.)
본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은, mTORC1 활성과 mTORC2 활성을 억제할 수 있다.
또한, 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 종래 알려진 mTORC1 억제제인 라파마이신에 비교하여 오토파지를 더 우수하게 유도할 수 있어 신경세포에 축적된 Aβ를 효과적으로 제거할 수 있다.
또한, 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 치매모델 동물에서 기억력과 인지기능 장애를 회복시킬 수 있다.
또한, 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 치매모델 동물에서 노인성 반과 NFT를 효과적으로 감소시킬 수 있다.
또한, 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 치매모델 동물의 뇌에서 발생하는 염증반응을 완화할 수 있다.
또한, 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 치매모델 동물의 해마에서 신경재생(neurogenesis)를 촉진할 수 있다.
따라서, 본 발명의 신규한 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 퇴행성 뇌질환, 예를 들면, 알츠하이머형 치매 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물, mTOR병증 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물 및/또는 신경재생 촉진용 약학적 조성물로 이용될 수 있다.
도 1은 mTORC1과 mTORC2로 구성된 mTOR 신호전달계 경로의 요약 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예의 화합물이 사람세포주인 HeLa 세포에서 mTORC1 활성과 mTORC2 활성을 억제함을 보여주는 immunoblot 분석 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예의 화합물이 1차 배양한 해마 신경세포에서 기존의 Rapamycin보다 오토파지를 더 촉진함을 보여주는 (A) LC3-eGFP 염색과 puncta 수를 도시한 결과이고, (b) LC3 immunoblot을 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예의 화합물이 1차 배양한 대뇌신경세포 내에 축적된 Aβ를 제거하고 동시에 LC3-II puncta를 증가시킴을 Aβ 염색 강도와 LC3 염색 면적으로 도시한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예의 화합물이 Aβ 세포독성으로부터 1차 배양한 해마신경세포를 보호하여 세포 생존을 증진함을 세포수를 세서 생존율로 도시한 분석 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예의 화합물이 치매동물모델 5xFAD 형질전환 쥐에 투여 시, 저하되었던 인지기능을 회복시키는 효능을 갖고 있음을 보여주는 Y형 미로, 수동회피시험, 그리고 수중미로시험 분석 결과이다.
도 7은 뇌절편의 노인성 반을 Thioflavin-S로 염색한 후, 해마 dentate gyrus, 대뇌 entorhinal cortex, 그리고 측뇌 temporal lobe 부위를 공초점 주사 현미경으로 스캔한 사진이다.
도 8은 노인성반이 가장 많이 발견되는 해마 dentate gyrus와 subiculum에서 Thioflavin-S로 염색된 노인성 반의 전체 면적과 염색 강도를 정량화하고, 노인성반을 크기에 따라 10μm 이상, 20 μm이하 크기와 20 μm 이상 큰 크기로 나누어 뇌 부위별로 개수를 세고 도시한 것이다.
도 9는 뇌절편을 과인산화된 Tau-NFT를 인식하는 AT8 항체와 신경세포의 dendrite를 주로 염색하는 MAP2 항체로 이중 염색한 후, 해마의 dentate gyrus, CA1, CA3 부위 그리고 대뇌 부위를 공초점 주사 현미경으로 스캔한 사진이다.
도 10은 MAP2 항체와 AT8 항체로 이중 염색한 후, 공초점 주사 현미경으로 고배율로 스캔한 사진 및 dentate gyrus에서 관찰된 AT8 염색된(AT8+) 세포의 개수와 AT8 염색된 신경세포(MAP2+)의 개수를 정량화하여 도시한 것이다.
도 11은 활성화된 소교세포(microglia)를 염색하는 Iba-1 항체와 세포 핵을 염색하는 DAPI로 이중 염색한 해마의 dentate gyrus 부위를 공초점 주사 현미경으로 스캔한 사진 및 Iba-1 염색된 면적을 정량화하여 도시한 것이다.
도 12는 오토파지 표지자인 LC3 항체, 성상세포를 표지하는 GFAP 항체 그리고 세포 핵을 염색하는 DAPI로 삼중 염색하였으며, 해마 dentate gyrus 부위를 공초점 주사 현미경으로 스캔한 사진 및 LC3 염색된 세포 수와 GFAP 염색된 면적 을 정량화하여 도시한 것이다.
도 13은 신경세포 표지자인 MAP2 항체와 LC3 항체로 이중 염색하여, 해마의 pyramidal cell을 공초점 주사 현미경으로 스캔한 사진이다.
도 14는 MAP2 항체와 LC3 항체로 이중 염색하여, 해마 dentate gyrus의 granule cell layer를 공초점 주사 현미경으로 고배율로 스캔한 사진이다.
도 15는 뇌를 적출하여 단백질 추출물을 획득하고 LC3-II 형성을 측정한 immunoblot 분석 결과 및 LC3-I에 비교한 LC3-II의 형성 비율을 도시한 것이다.
도 16은 Iba-1 항체, MAP2 항체, 그리고 LC3 항체로 삼중 염색한 후, 해마 dentate gyrus 부위를 공초점 주사 현미경으로 스캔한 사진 및 LC3 염색된 신경세포 개수, LC3 염색된 microglia 개수, MAP2 염색된 신경세포 개수, 그리고 Iba-1 염색된 세포 개수를 차례대로 정량화하여 도시한 것이다.
도 17은 신경세포 표지자 NeuN 항체, type1 신경전구세포 표지자 Sox2 항체, 분화하며 이동하는 type3 신경전구세포 표지자 DCX 항체로 삼중 염색한 후, 해마 dentate gyrus의 subgranular zone 부위를 공초점 주사 현미경으로 스캔한 사진 및 Sox2 염색된 type1 세포 개수와 DCX 염색된 type3 세포 개수를 정량화하여 도시한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 양태는 하기 화학식 A로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
[화학식 A]
Figure pat00015
(상기 화학식에서
R1 및 R2는 각각 수소, 하이드록시, 할로젠, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 및 C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이고,
R3 및 R4는 각각 수소, 하이드록시, 할로젠, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시, 피리디닐 메톡시 및 벤질 옥시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이다.)
본 발명의 일 실시예에서, 상기 R1 및 R2는 각각 수소이고,
상기 R3 및 R4는 각각 수소, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시, 피리디닐 메톡시 및 벤질 옥시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 화학식 A로 표시되는 화합물은 하기 화합물군으로부터 선택되는 1 종일 수 있다:
1) 7,9-다이하이드록시-10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온;
2) 9-하이드록시-7-메톡시-10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온;
3) 7,9-다이메톡시-10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온;
4) 7-(벤질옥시)-9-하이드록시-10H-[1,3]다옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온;
5) 7-(벤질옥시)-9-메톡시-10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온;
6) 7-하이드록시-9-메톡시-10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온;
7) 9-에톡시-7- 메톡시-10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온;
8) 9-(벤질옥시)-7-메톡시-10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온;
9) 9-하이드록시-7-(피리딘-4-닐메톡시)-10H-[1,3] 다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온;
10) 10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온;
11) 7-클로로-10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온; 및
12) 7-브로모-10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 화학식 A로 표시되는 화합물은 하기의 화학식 1로 표시되는 노라티리올(norathyriol, 1,3,6,7-tetrahydroxy-9H-xanthen-9-one)로부터 순차적인 알킬화 반응을 통하여 합성될 수 있다:
[화학식 1]
Figure pat00016
자세한 합성 메커니즘은 하기의 양태에서 후술하기로 한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 화학식 A로 표시되는 화합물은 mTORC1(mammalian target of rapamycin complex 1) 또는 mTORC2(mammalian target of rapamycin complex 2) 활성을 억제할 수 있다.
도 1은 mTORC1 및 mTORC2 신호전달계 경로의 요약 도면이다.
도 1을 참조하면, mTORC2의 하위 신호전달자인 AKT는 mTORC2에의해 Ser473에 인산화되어 활성화되며, mTORC1의 하위 신호전달자인 S6K는 mTORC1에의해 Thr389에 인산화되어 활성화되어 cap-의존적인 단백질 합성을 촉진하고 오토파지를 비활성화함을 알 수 있다. 따라서 mTORC2 활성이 억제되면, AKT 활성이 감소하게 되고, 이에 따라 mTORC1이 억제되어 cap-의존적 단백질 합성이 저하되는 반면 오토파지가 활성화된다.
본 발명의 화합물은 인간세포에서 AKT Ser473 인산화를 억제하는 동시에 S6K Thr389 인산화를 억제할 수 있고, 이러한 결과로, mTORC1 및/또는 mTORC2 활성을 억제할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 상기 양태의 화학식 A로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 퇴행성 뇌질환은 치매, 파킨슨병, 알츠하이머형 치매, 피크병, 헌팅턴병, 간질, 중풍, 뇌졸중, 허혈성 뇌질환, 기억력 감퇴로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상, 예를 들면, 알츠하이머형 치매일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료 효과는 하기의 실시예에서 후술하기로 한다.
본 발명의 다른 양태는 상기 양태의 화학식 A로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 mTOR병증(mTORopathy)의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 mTOR병증은 간질(epilepsy), 자폐(autism spectrum disorder, ASD), 대두증(macrocephaly), 복합결절성경화증(tuberous sclerosis complex, TSC), 발작(seizure), 취약 X 증후군(Fragile X syndrome), 또는 지적 장애로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 mTOR병증의 예방 또는 치료 효과는 하기의 실시예에서 후술하기로 한다.
본 발명의 다른 양태는 상기 양태의 화학식 A로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 신경재생(neurogenesis) 촉진을 특징으로하는 신경 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 신경재생 촉진은 신경 줄기 세포 또는 신경 전구 세포의 분열, 분화, 이동 또는 생존을 촉진하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 신경 질환은 외상성 중추 신경계 질환, 척수 손상 질환, 말초신경 손상, 근위축성 축색 경화증 및 말초신경질환으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 신경재생 촉진 효과는 하기의 실시예에서 후술하기로 한다.
본 발명의 다른 양태는 하기 반응식 1에 나타난 바와 같이, 유기 용매 및 염기 촉매 존재 하에 하기 화학식 1로 표시되는 노라티리올 및 하기 화학식 B1으로 표시되는 화합물을 반응 시키는 단계(단계 1);를 포함하는 하기 화학식 A2로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다:
[반응식 1]
Figure pat00017
(상기 반응식에서,
X1 및 X2는 각각 클로로, 브로모, 아이오도, 토실레이트 및 메질레이트 중 어느 하나이고,
R1 및 R2는 각각 수소, 하이드록시, 할로젠, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 및 C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이다.)
본 발명의 일 실시예에서, 상기 유기 용매는 다이메틸 설폭사이드, 다이메틸 포름아마이드, 아세톤, 테트라하이드로퓨란, 벤젠, 톨루엔, 에테르, 메탄올, 헥산, 시클로 헥산, 피리딘, 아세트산, 사염화탄소, 클로로포름, 디클로로 메탄, 디클로로 에탄 및 물로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 상기 염기 촉매는 KOH, NaOH, K2CO3, Na2CO3, KHCO3, NaHCO3 및 NaH로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 반응식 1을 통하여 제조되는 화학식 A2로 표시되는 화합물은 7,9-다이하이드록시-10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온(7,9-dihydroxy-10H-[1,3]dioxolo[4,5-b]xanthen-10-one)일 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 하기 반응식 2에 나타난 바와 같이, 유기 용매 및 염기 촉매 존재 하에 하기 화학식 A2로 표시되는 화합물 및 화학식 B2로 표시되는 화합물을 반응 시키는 단계(단계 1);를 포함하는 하기 화학식 A3로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다:
[반응식 2]
Figure pat00018
(상기 반응식에서,
X3는 각각 클로로, 브로모, 아이오도, 토실레이트 및 메질레이트 중 어느 하나이고,
R1 및 R2는 각각 수소, 하이드록시, 할로젠, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 및 C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이고,
R5는 수소, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 피리디닐 및 벤질기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이다.)
본 발명의 일 실시예에서, 상기 유기 용매는 다이메틸 설폭사이드, 다이메틸 포름아마이드, 아세톤, 테트라하이드로퓨란, 벤젠, 톨루엔, 에테르, 메탄올, 헥산, 시클로 헥산, 피리딘, 아세트산, 사염화탄소, 클로로포름, 디클로로 메탄, 디클로로 에탄 및 물로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 상기 염기 촉매는 KOH, NaOH, K2CO3, Na2CO3, KHCO3, NaHCO3 및 NaH로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 반응식 2를 통하여 제조되는 화학식 A3로 표시되는 화합물은 9-하이드록시-7-메톡시-10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온(9-hydroxy-7-methoxy-10H-[1,3]dioxolo[4,5-b]xanthen-10-one), 7-(벤질옥시)-9-하이드록시-10H-[1,3]다옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온 (7-(benzyloxy)-9-hydroxy-10H-[1,3]dioxolo[4,5-b]xanthen-10-one) 또는 9-하이드록시-7-(피리딘-4-닐메톡시)-10H-[1,3] 다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온 (9-hydroxy-7-(pyridin-4-ylmethoxy)-10H-[1,3]dioxolo[4,5-b]xanthen-10-one)일 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 하기 반응식 3에 나타난 바와 같이, 유기 용매 및 염기 촉매 존재 하에 하기 화학식 A2로 표시되는 화합물 및 화학식 B3로 표시되는 화합물을 반응 시키는 단계(단계 1);를 포함하는 하기 화학식 A4로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다:
[반응식 3]
Figure pat00019
(상기 반응식에서,
X4는 각각 클로로, 브로모, 아이오도, 토실레이트 및 메질레이트 중 어느 하나이고,
R1 및 R2는 각각 수소, 하이드록시, 할로젠, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 및 C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이고,
R6는 수소, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 피리디닐 및 벤질기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이다.)
본 발명의 일 실시예에서, 상기 유기 용매는 다이메틸 설폭사이드, 다이메틸 포름아마이드, 아세톤, 테트라하이드로퓨란, 벤젠, 톨루엔, 에테르, 메탄올, 헥산, 시클로 헥산, 피리딘, 아세트산, 사염화탄소, 클로로포름, 디클로로 메탄, 디클로로 에탄 및 물로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 상기 염기 촉매는 KOH, NaOH, K2CO3, Na2CO3, KHCO3, NaHCO3 및 NaH로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 반응식 3을 통하여 제조되는 화학식 A4로 표시되는 화합물은 7,9-다이메톡시-10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온(7,9-dimethoxy-10H-[1,3]dioxolo[4,5-b]xanthen-10-one)일 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 하기 반응식 4에 나타난 바와 같이, 유기 용매 및 염기 촉매 존재 하에 하기 화학식 A3로 표시되는 화합물 및 화학식 B4로 표시되는 화합물을 반응 시키는 단계(단계 1);를 포함하는 하기 화학식 A6로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다:
[반응식 4]
Figure pat00020
(상기 반응식에서,
X5는 각각 클로로, 브로모, 아이오도, 토실레이트 및 메질레이트 중 어느 하나이고,
R1 및 R2는 각각 수소, 하이드록시, 할로젠, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 및 C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이고,
R5 및 R7은 각각 수소, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 피리디닐 및 벤질기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이다.)
본 발명의 일 실시예에서, 상기 유기 용매는 다이메틸 설폭사이드, 다이메틸 포름아마이드, 아세톤, 테트라하이드로퓨란, 벤젠, 톨루엔, 에테르, 메탄올, 헥산, 시클로 헥산, 피리딘, 아세트산, 사염화탄소, 클로로포름, 디클로로 메탄, 디클로로 에탄 및 물로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 상기 염기 촉매는 KOH, NaOH, K2CO3, Na2CO3, KHCO3, NaHCO3 및 NaH로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 반응식 4를 통하여 제조되는 화학식 A6로 표시되는 화합물은 7-(벤질옥시)-9-메톡시-10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온 ((7-(benzyloxy)-9-methoxy-10H-[1,3]dioxolo[4,5-b]xanthen-10-one), 9-에톡시-7-메톡시-10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온 (9-ethoxy-7-methoxy-10H-[1,3]dioxolo[4,5-b]xanthen-10-one) 또는 9-(벤질옥시)-7-메톡시-10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온 (9-(benzyloxy)-7-methoxy-10H-[1,3]dioxolo[4,5-b]xanthen-10-one)일 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 하기 반응식 5에 나타난 바와 같이, 유기 용매 및 Pd/C 촉매 하에 하기 화학식 A6로 표시되는 화합물 및 수소 기체를 반응 시키는 단계(단계 1);를 포함하는 하기 화학식 A7로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다:
[반응식 5]
Figure pat00021
(상기 반응식에서,
R1 및 R2는 각각 수소, 하이드록시, 할로젠, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 및 C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이고,
R5 및 R7은 각각 수소, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 피리디닐 및 벤질기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이다.)
본 발명의 일 실시예에서, 상기 유기 용매는 다이메틸 설폭사이드, 다이메틸 포름아마이드, 아세톤, 테트라하이드로퓨란, 벤젠, 톨루엔, 에테르, 메탄올, 헥산, 시클로 헥산, 피리딘, 아세트산, 사염화탄소, 클로로포름, 디클로로 메탄, 디클로로 에탄 및 물로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 상기 염기 촉매는 KOH, NaOH, K2CO3, Na2CO3, KHCO3, NaHCO3 및 NaH로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 반응식 5를 통해 제조되는 화학식 A7으로 표시되는 화합물은 7-하이드록시-9-메톡시-10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온 (7-hydroxy-9-methoxy-10H-[1,3]dioxolo[4,5-b]xanthen-10-one)일 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 하기 반응식 6에 나타난 바와 같이, 유기 용매 및 염기 촉매 존재 하에 하기 화학식 A18로 표시되는 화합물 및 화학식 B5로 표시되는 화합물과 반응 시켜 하기 화학식 A18-1로 표시되는 화합물을 합성하는 단계(단계 1);
유기 용매 하에 화학식 A18-1로 표시되는 화합물 및 인산염을 반응 시켜 하기 화학식 A18-2로 표시되는 화합물을 합성하는 단계(단계 2); 및
유기 용매 하에 하기 화학식 A18-2로 표시되는 화합물 및 염화 포스포릴(Phosphorus oxychloride, POCl3)를 반응시키는 단계(단계 3);를 포함하는 하기 화학식 A20으로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다:
[반응식 6]
Figure pat00022
(상기 반응식에서,
R8, R9, R10 및 R11은 각각 수소, 하이드록시, 할로젠, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬 및 C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이다.)
본 발명의 일 실시예에서, 상기 유기 용매는 다이메틸 설폭사이드, 다이메틸 포름아마이드, 아세톤, 테트라하이드로퓨란, 벤젠, 톨루엔, 에테르, 메탄올, 헥산, 시클로 헥산, 피리딘, 아세트산, 사염화탄소, 클로로포름, 디클로로 메탄, 디클로로 에탄 및 물로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 상기 염기 촉매는 KOH, NaOH, K2CO3, Na2CO3, KHCO3, NaHCO3 및 NaH로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 상기 인산염은 K4P2O7, KH2PO4, NaH2PO4 및 Na4P2O7로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 반응식 6을 통하여 제조되는 화학식 A20으로 표시되는 화합물은 10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온 (10H-[1,3]dioxolo[4,5-b]xanthen-10-one), 7-클로로-10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온 (7-chloro-10H-[1,3]dioxolo[4,5-b]xanthen-10-one) 또는 7-브로모-10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온 (7-bromo-10H-[1,3]dioxolo[4,5-b]xanthen-10-one)일 수 있다.
본 발명자들은 상기와 같은 방법으로 수득한 본 발명의 화합물이 인간세포에서 mTORC1과 mTORC2 활성을 억제하고, 1차 배양 신경세포에서 오토파지를 촉진하며, 치매동물모델인 5xFAD 형질전환 쥐에서 노인성 반과 NFT 축적을 억제하고 뇌면역반응을 억제하는 효과가 있어, 알츠하이머형 치매, mTOR 경로의 과활성화가 원인인 mTOR병증, 그리고 단백질 항상성 이상에 의해 발생하는 퇴행성 뇌질환을 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 사용하기 적합함을 규명하였다.
정의
본 발명에서 상기 “신경계 질환”은 mTOR 신호경로의 과활성화 또는 단백질들의 단백질 항상성 비정상화(abnormal proteostasis)에 의해 발생하는 신경계 질환을 뜻한다.
본 발명에서 상기 “신경계 질환”은 mTOR 신호경로가 과활성화되어 있고 단백질 항상성 비정상화에 의해 형성되는 노인성 반과 NFT가 주요 병인인 알츠하이머형 치매(Alzheimer's disease)를 포함한다.
본 발명에서 상기 “신경계 질환”은 신경세포에서의 생식선 또는 체세포 돌연변이에 의해 mTOR 신호전달경로가 과활성화되어 신경학적 이상이 유발되는 유전 질환인 mTOR병증을 포함하는 개념으로, 간질(epilepsy) (Moloney et al. (2021) Brain Comm. 3: 1-21), 자폐(autism spectrum disorder, ASD) (Winden et al. (2018) Ann. Rev. Neurosci. 41: 1-23), 대두증(macrocephaly) (Butler et al., (2005) J. Med. Genet. 42: 318-321), 복합결절성경화증(tuberous sclerosis complex, TSC) (Crino (2015) Cold Spring Harb. Perspect. Med. 5: a022442), 발작(seizure) (Harvey et al. (2008) Epilepsia 49: 146-155), 취약 X 증후군 (Fragile X syndrome) (Sharma et al. (2010) J. Neurosci. 30: 694-702), 또는 지적 장애 (Dentel et al. (2019) Neuron 104: 1032-1033)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명에서 상기 "신경계 질환"은 단백질 항상성을 증진하는 것이 원인적 치료 방법이 될 수 있는 퇴행성 뇌질환(degenerative brain disease)을 포함하는 개념으로, 치매 (Sancesario & Bernardini (2018) Ann. Transl. Med. 6: 340), 파킨슨병 (Hague et al. (2005) J. Neural Neurosurg. Psychiatry 76: 1058-1063), 알츠하이머형 치매 (Wenk (2003) J. Clinic. Psychiatry 64: 7-10), 피크병 (Dickson (1998) Brain Pathol. 8: 339-354), 또는 헌팅턴병 (Hague et al. (2005) J. Neural Neurosurg. Psychiatry 76: 1058-1063)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
기억력 감퇴, 외상성 중추 신경계 질환, 척수 손상 질환, 말초신경 손상, 근위축성 축색 경화증, 또는 말초신경질환 등도 신경세포의 퇴화와 사멸을 동반하는 점에서 새로운 신경재생이 촉진되면 치료 효과를 기대할 수 있은 바, 이에 상기 “신경계 질환”에 포함될 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 염
본 발명의 유효물질은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 약학적으로 허용가능한 염이란 표현은 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 유효물질의 염기 화합물의 이로운 효능을 떨어뜨리지 않는 유효물질의 염기 화합물의 어떠한 유기 또는 무기 부가염을 의미한다. 이들 염은 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 질산, 황산, 과염소산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 젖산, 말레산, 푸마린산, 글루콘산, 메탄설폰산, 글리콘산, 숙신산, 타타르산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산, 아스파르트산, 옥살산, (D) 또는 (L) 말산, 말레산, 메테인설폰산, 에테인설폰산, 4-톨루엔술폰산, 살리실산, 시트르산, 벤조산 또는 말론산 등을 사용할 수 있다. 또한, 이들 염은 알칼리 금속염(나트륨염, 칼륨염 등) 및 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염 등) 등을 포함한다. 예를 들면, 산부가염으로는 아세테이트, 아스파테이트, 벤즈에이트, 베실레이트, 바이카보네이트/카보네이트, 바이설페이트/설페이트, 보레이트, 캄실레이트, 시트레이트, 에디실레이트, 에실레이트, 포메이트, 퓨마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루큐로네이트, 헥사플루오로포스페이트, 하이벤제이트, 하이드로클로라이드/클로라이드, 하이드로브로마이드/브로마이드, 하이드로요오디드/요오디드, 이세티오네이트, 락테이트, 말레이트, 말리에이트, 말로네이트, 메실레이트, 메틸설페이트, 나프틸레이트, 2-나프실레이트, 니코티네이트, 나이트레이트, 오로테이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 포스페이트/수소 포스페이트/이수소 포스페이트, 사카레이트, 스테아레이트, 석시네이트, 타르트레이트, 토실레이트, 트리플루오로아세테이트, 알루미늄, 알기닌, 벤자틴, 칼슘, 콜린, 디에틸아민, 디올아민, 글라이신, 라이신, 마그네슘, 메글루민, 올아민, 칼륨, 나트륨, 트로메타민, 아연염 등이 포함될 수 있으며, 이들 중 하이드로클로라이드 또는 트리플루오로아세테이트가 바람직하다.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 유효물질을 유기용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴 등에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조하여 제조되거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조하거나 유기용매 하에서 결정화시켜셔 제조할 수 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은 염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
나아가, 본 발명은 유효물질 및 이의 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물, 이성질체, 광학 이성질체 등을 모두 포함한다.
약학적 조성물
본 발명의 유효물질은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 유효물질에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 유효물질의 인체에 대한 효과적인 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 약 0.001-100 mg/kg/일이며, 바람직하게는 0.01-35 mg/kg/일이다. 몸무게가 70㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.07-7000 mg/일이며, 바람직하게는 0.7-2500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
실시예
화합물의 합성 및 NMR 분석
- 분석기기
본 발명의 실시예에서 합성된 화합물의 구조 확인을 위하여, 핵자기공명 스펙트럼(1H NMR)은 ADVANCE digital 500, 용매는 CD3OD 또는 DMSO-d6를 사용하였다. 질량(Mass) 스펙트럼을 사용하였으며 m/z 형태로 표시하였다.
- TLC 및 관 크로마토그래피
TLC (Thin layer chromatography)는 Merk 사 제품인 실리카겔(Merck F254)을 사용하였으며 관 크로마토그래피(Column chromatography)를 위해서는 실리카(Merck EM9385, 230-400 mesh)를 사용하였다. 또한 TLC 상에서 분리된 물질을 확인하기 위해서 UV 램프(254 nm)를 이용하거나 아니스알데히드(anisaldehyde) 발색시약에 담근 후, 플레이트를 가열하여 확인하였다.
- 시약
본 발명의 실시예에서 사용된 시약 및 용매는 시그마-알드리치(sigma-aldrich) 및 티시아이(TCI) 제품을 구입하여 사용하였다. 유도체 합성에 사용된 노라티리올은 선행특허 KR 10-2004245(환경친화적 탄소-탈당반응을 이용한 노라티리올의 제조방법)의 방법을 통해 합성하였다.
실시예 1. 7,9-다이하이드록시-10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온(7,9-dihydroxy-10H-[1,3]dioxolo[4,5-b]xanthen-10-one, HN-1701(2))의 합성
500 mg (1.92 mmol, 1당량)의 노라티리올(norathyriol;1)의 DMF (7 mL) 용액에 694 mg (8.26 mmol, 4.3 당량)의 NaHCO3과 0.28 mL (4.03 mmol, 2.1 당량)의 dibromomethane을 상온에서 가한 후 80 ℃에서 4 시간 교반하였다. 상온으로 냉각 후, 물과 ethyl acetate를 가하여 반응을 종결하고, 유기층을 분리하여 1 N 염산수용액으로 세척한 후, 무수 MgSO4로 건조하였다. 진공하에 용매들을 제거한 후에, 반응혼합물을 디클로로메탄 중 20 % 메탄올 용매를 이용한 컬럼크로마토그래피법(실리카겔)으로 정제하여 401 mg (1.47 mmol, 77 %)의 HN-1701(2)을 수득하였고, 하기의 반응식 1-1에 반응과정을 도시하였다:
[반응식 1-1]
Figure pat00023
MS m/z 273 (M+H+)
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ12.95 (s, 1H), 7.41 (s, 1H), 7.24 (s, 1H), 6.32 (s, 1H), 6.23 (s, 2H), 6.15 (s, 1H)
실시예 2. 9-하이드록시-7-메톡시-10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온(9-hydroxy-7-methoxy-10H-[1,3]dioxolo[4,5-b]xanthen-10-one, HN-1702(3))의 합성
상기 실시예 1에서 합성된 HN-1701(2)의 167 mg (0.61 mmol, 1당량)의 아세톤 (30 mL) 용액에 106 mg (0.72 mmol, 1.3 당량)의 K2CO3과 0.06 mL (0.92 mmol, 1.5 당량)의 iodomethane을 상온에서 가한 후, 1 시간동안 교반하였다. 반응액을 여과하고 진공하에 용매들을 제거하였다. 자사를 n-헥산 중 10 % ethyl acetate 용매를 이용한 컬럼크로마토그래피법(실리카겔)으로 정제하여 58 mg (0.20 mmol, 33 %)의 HN-1702(3)을 수득하였고, 하기의 반응식 2-1에 반응과정을 도시하였다:
[반응식 2-1]
Figure pat00024
MS m/z 287 (M+H+)
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 7.48 (s, 1H), 7.02 (s, 1H), 6.53 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 6.34 (d, 1H, J = 2.9 Hz), 6.16 (s, 2H), 3.90 (s, 3H)
실시예 3. 7-(벤질옥시)-9-하이드록시-10H-[1,3]다옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온 (7-(benzyloxy)-9-hydroxy-10H-[1,3]dioxolo[4,5-b]xanthen-10-one, HN-2101(5))의 합성법
상기 실시예 1에서 제조한 HN-1701(2)의 20 mg (0.073 mmol, 1당량)과 18.9 mg (0.110mmol, 1.5당량)의 benzyl bromide 및 12.7 mg (0.091 mmol, 1.25당량)의 K2CO3를 2.3 mL의 DMF에 녹인 후 상온에서 24시간 교반하였다. 이후 반응액을 여과하여 여액을 진공하에서 용매를 제거한 후 반응물을 n-hexane 중 25% ethyl acetate 용매를 이용한 컬럼크로마토그래피법(실리카겔)으로 정제하여 16 mg (0.049 mmol, 68%)의 목적 화합물 HN-2101(5)을 수득하였고 하기의 반응식 2-2에 반응과정을 도시하였다.
[반응식 2-2]
Figure pat00025
MS m/z 363 (M+H+)
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 12.94 (s, 1H), 7.40-7.48 (m, 5H), 7.37 (s, 1H), 7.26 (s, 1H), 6.67 (s, 1H), 6.47 (s, 1H), 6.25 (s, 2H), 5.25 (s, 2H)
실시예 4. 9-하이드록시-7-(피리딘-4-닐메톡시)-10H-[1,3] 다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온 (9-hydroxy-7-(pyridin-4-ylmethoxy)-10H-[1,3]dioxolo[4,5-b]xanthen-10-one, HN-2108(10))의 합성법
상기 실시예 1에서 제조한 30 mg(0.110 mmol, 1당량)의 HN-1701(2)를 4 mL의 DMF에 녹인 후, ice bath에서 45.6 mg(0.330mmol, 3당량)의 K2CO3와 1.8 mg(0.011 mmol, 0.1당량)의 KI를 넣고 교반하였다. 1시간 후 23.5 mg(0.143 mmol, 1.3당량)의 4-(chloromethyl)pyridine을 첨가하여 상온에서 18시간 교반하였다. 반응을 H2O를 가하여 종결하고 ethyl acetate로 추출하였다. 유기층을 물과 brine으로 세척 후 무수 MgSO4로 건조하고 진공하에 농축하였다. 반응 혼합물을 dichloromethane 중 50% ethyl acetate 용매를 이용한 컬럼크로마토그래피법(실리카겔)으로 정제하여 13.8 mg (0.038 mmol, 35%)의 목적 화합물 HN-2108(10)을 수득하였고 하기의 반응식 2-3에 반응과정을 도시하였다.
[반응식 2-3]
Figure pat00026
MS m/z 364 (M+H+)
1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 8.58 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 8.57 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.44 (s, 1H), 7.42 (s, 2H), 7.26 (s, 1H), 6.67 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.48 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.23 (s, 2H), 5.33 (s, 2H)
실시예 5. 7,9-다이메톡시-10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온(7,9-dimethoxy-10H-[1,3]dioxolo[4,5-b]xanthen-10-one, HN-1703(4))의 합성
상기 실시예 1에서 제조한 HN-1701(2)의 140 mg (0.51 mmol, 1당량)의 DMF (3 mL) 용액에 61 mg (1.53 mmol, 3 당량)의 60 % NaH in mineral oil을 0 ℃에서 가한 후 30 분간 교반하였다. 30 분 후, 0.13 mL (2.04 mmol, 4 당량)의 iodomethane을 가하여 상온에서 1 시간 동안 교반한 후, 포화 염화암모니아수를 가하여 반응을 종결하고, 물과 ethyl acetate를 가하였다. 유기층을 분리하여 함수 (brine)으로 세척한 후, 무수 MgSO4로 건조하였다. 진공하에 용매들을 제거한 후에, 반응혼합물을 디클로로메탄 중 50 % ethylacetate 용매를 이용한 컬럼크로마토그래피법 (실리카겔)으로 정제하여 50 mg (0.17 mmol, 33 %)의 HN-1703(4)을 수득하였고, 하기의 반응식 3-1에 반응과정을 도시하였다:
[반응식 3-1]
Figure pat00027
MS m/z 301 (M+H+)
1H NMR (500 MHz, CD3OD) 7.49 (s, 1H), 6.96 (s, 1H), 6.65 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 6.51 (d, 1H, J = 2.9 Hz), 6.13 (s, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.94 (s, 3H).
실시예 6. 7-(벤질옥시)-9-메톡시-10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온 ((7-(benzyloxy)-9-methoxy-10H-[1,3]dioxolo[4,5-b]xanthen-10-one,HN-2102(6))의 합성법
상기 실시예 3에서 제조한 HN-2101(5)의 150 mg (0.414 mmol, 1당량)과 49.7 mg (1.242 mmol, 3당량)의 60% NaH in mineral oil을 20 mL의 DMF에 녹인 후 ice bath에서 교반하였다. 1시간 후 0.1 mL (1.656 mmol, 4당량)의 iodomethane을 넣고 상온에서 16시간 교반하였다. 반응을 H2O를 가하여 종결하고 ethyl acetate로 추출하였다. 유기층을 물과 brine으로 세척 후 무수 MgSO4로 건조하고 이후 반응액을 여과하여 여액을 진공하에서 용매를 제거하였다. 반응혼합물을 dichloromethane 중 5 % ethyl acetate 용매를 이용한 컬럼크로마토그래피법 (실리카겔)으로 정제하여 135 mg (0.360 mmol, 87 %)의 목적 화합물 HN-2102(6) 을 수득하였고 하기의 반응식 4-1에 반응과정을 도시하였다.
[반응식 4-1]
Figure pat00028
MS m/z 377 (M+H+)
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.36-7.52 (m, 5H), 7.35 (s, 1H), 7.14 (s, 1H), 6.72 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.58 (d, J = 2.3, 1H), 6.19 (s, 2H), 5.26 (s, 2H), 3.85 (s, 3H)
실시예 7. 9-에톡시-7- 메톡시-10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온 (9-ethoxy-7-methoxy-10H-[1,3]dioxolo[4,5-b]xanthen-10-one, HN-2104(8))의 합성법
상기 실시예 2에서 제조한 HN-1702(3)의 25.4 mg (0.088 mmol, 1당량)의 DMF (4 mL) 용액에 0.6 mg(0.265 mmol, 3당량)의 60 % NaH in mineral oil을 가하였다. 1 시간 교반 한 후 55.3 mg (0.354 mmol, 4당량)의 iodoethane을 넣고 상온에서 16 시간 교반 하였다. 반응을 H2O를 가하여 종결하고 ethyl acetate로 추출하였다. 유기층을 물과 brine으로 세척 후 무수 MgSO4로 건조하고 이후 반응액을 여과하여 여액을 진공하에서 용매를 제거하였다. 반응혼합물을 n-hexane 중 25% ethyl acetate 용매를 이용한 컬럼크로마토그래피법(실리카겔)으로 정제하여 23.9 mg (0.076 mmol, 86%)의 목적 화합물 HN-2104(8)을 수득하였고 하기의 반응식 4-2에 반응과정을 도시하였다.
[반응식 4-2]
Figure pat00029
MS m/z 315 (M+H+)
1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 7.34 (s, 1H), 7.09 (s, 1H), 6.59 (s, 1H), 6.44 (s, 1H), 6.16 (s, 2H), 4.07 (q, 2H), 3.85 (s, 3H), 2.47 (s, 3H),
실시예 8. 9-(벤질옥시)-7-메톡시-10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온 (9-(benzyloxy)-7-methoxy-10H-[1,3]dioxolo[4,5-b]xanthen-10-one, HN-2105(9))의 합성법
상기 실시예 2에서 제조한 HN-1702(3)의 21 mg (0.073 mmol, 1당량)의 DMF (4mL) 용액에 8.8 mg(0.220 mmol, 3당량)의 60% NaH in mineral oil을 가하였다. 1시간 교반 한 후 43.2 mg (0.293 mmol, 4당량)의 benzyl bromide를 넣고 상온에서 16시간 교반 하였다. 반응을 H2O를 가하여 종결하고 ethyl acetate로 추출하였다. 유기층을 물과 brine으로 세척 후 무수 MgSO4로 건조하고 이후 반응액을 여과하여 여액을 진공하에서 용매를 제거하였다. 반응 혼합물을 dichloromethane 용매를 이용한 컬럼크로마토그래피법(실리카겔)으로 정제하여 26.6 mg (0.071 mmol, 97 %)의 목적 화합물 HN-2105(9)를 수득하였고 하기의 반응식 4-3에 반응과정을 도시하였다.
[반응식 4-3]
Figure pat00030
MS m/z 377 (M+H+)
1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 7.38-7.68 (m, 5H), 7.28 (s, 1H), 7.11 (s, 1H), 6.64(d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.59 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.17 (s, 2H), 5.22 (s, 2H), 3.87 (s, 3H)
실시예 9. 7-하이드록시-9-메톡시-10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온 (7-hydroxy-9-methoxy-10H-[1,3]dioxolo[4,5-b]xanthen-10-one, HN-2103(7))의 합성법
상기 실시예 6에서 제조한 HN-2102(6)의 125 mg (0.332 mmol, 1당량)을 30 mL의 MeOH에 녹인 후 촉매량의 10 % Pd/C를 넣은 후 수소대기 하에서 24시간 교반하였다. 반응액을 celite로 여과하여 촉매를 제거한 후, 여액을 진공하에서 용매를 제거하였다. 전사를 ethyl acetate 용매를 이용한 컬럼크로마토그래피법 (실리카겔)으로 정제하여 20 mg(0.069 mmol, 19%)의 목적 화합물 HN-2103(7)을 수득하였고 하기의 반응식 5-1에 반응과정을 도시하였다.
[반응식 5-1]
Figure pat00031
MS m/z 287 (M+H+)
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.33 (s, 1H), 7.12 (s, 1H), 6.38 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 6.17 (s, 2H), 3.81 (s, 3H)
실시예 10 내지 12.
일반 합성법
하기의 반응식 6A에 제시된 바와 같이, 1당량의 fluorobenzaldehyde(A18), 1.2 당량의 phenol(B5)의 DMF 용액에 1.3 당량의 K2CO3를 가한 후 100 °C에서 16 시간 교반하였다. 1 N HCl 용액으로 반응을 종결하고 ethyl acetate로 추출하였다. 유기층을 물과 brine으로 세척 후 무수 MgSO4로 건조하고 여액을 진공하에서 농축하였다. 반응 혼합물을 컬럼크로마토그래피법 (실리카겔)으로 정제하여 biaryl화합물(A18-1)을 얻었다.
1 당량의 biaryl화합물(A18-1)과 1.1당량의 NaH2PO4의 DMSO 용액에 1.5당량의 NaClO2 수용액을 30 분간 천천히 적가하였다. 2 시간 후 NaHCO3 용액을 가하여 반응을 종결하고 1 N HCl 용액으로 산성화한 후 eathyl acetate로 추출하였다. 유기층을 물과 1 N HCl 용액으로 세척 후 무수 MgSO4로 건조 및 여과하였다. 여액을 진공하에서 용매를 제거한 후 반응 혼합물을 컬럼크로마토그래피법(실리카겔)으로 정제하여 benzoic acid(A18-2)를 수득하였다.
상기 1 당량의 benzoic acid(A18-2)의 1,2-dichloroehtane용액에 3 당량의 POCl3를 가한 후 가열 환류 하였다. 24 시간 후 NaHCO3 용액을 상온에서 가하여 반응을 종결하고 dichloromethane으로 추출하였다. 유기층을 물로 세척, 무수 MgSO4로 건조 및 여과하고 여액을 진공하에서 용매를 제거하였다. 반응 혼합물을 컬럼크로마토그래피법(실리카겔)으로 정제하여 목적 xanthone(A20) 화합물을 수득하였다.
[반응식 6A]
Figure pat00032
(상기 반응식에서,
R8, R9, R10 및 R11은 각각 수소, 하이드록시, 할로젠, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬 및 C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이다.)
실시예 10. 10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온 (10H-[1,3]dioxolo[4,5-b]xanthen-10-one, HN-2110(20))의 합성법
2-Fluorobenzaldehyde(18)과 sesamol(19)로부터 상기의 일반합성법을 이용하여 목적 화합물 HN-2110(20)을 수득하였고 하기의 반응식 6A-1에 반응과정을 도시하였다:
[반응식 6A-1]
Figure pat00033
MS m/z 241 (M+H+)
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.31 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.74-7.62 (m, 2H), 7.44 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.36 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 6.89 (s, 1H), 6.10 (s, 2 H)
실시예 11. 7-클로로-10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온 (7-chloro-10H-[1,3]dioxolo[4,5-b]xanthen-10-one, HN-2117(28))의 합성법
4-Chloro-2-fluorobenzaldehyde(26)과 sesamol(27)로부터 상기의 일반합성법을 이용하여 목적 화합물 HN-2117(28)을 수득하였고 하기의 반응식 6A-2에 반응과정을 도시하였다.
[반응식 6A-2]
Figure pat00034
MS m/z 275 (M+H+)
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.25 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.63 (s, 1H), 7.48 (s, 1H), 7.34 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.89 (s, 1H), 6.12 (s, 2H)
실시예 12. 7-브로모-10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온 (7-bromo-10H-[1,3]dioxolo[4,5-b]xanthen-10-one, HN-2122(30))의 합성법
4-Bromo-2-fluorobenzaldehyde(29)과 sesamol(27)로부터 상기의 일반합성법을 이용하여 목적 화합물 HN-2122(30)을 수득하였고 하기의 반응식 6A-3에 반응과정을 도시하였다.
[반응식 6A-3]
Figure pat00035
MS m/z 320 (M+H+)
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.17 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.66 (s, 1H), 7.63 (s, 1H), 7.49 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.89 (s, 1H), 6.12 (s, 2H).
상기 실시예 1 내지 12에서 합성한 화합물을 하기 표 1에 도시하였다:
[표 1]
Figure pat00036
Figure pat00037
실험예
화합물의 in vitro 효능 평가
실험예 1. mTORC1 저해능 및 mTORC2 저해능 평가
- 방법
HeLa 세포는 10 % FBS, penicillin(100 unit/ml), streptomycin(100 μg/ml)이 포함된 DMEM(Dulbesco's Modified Eagles Media) 배지를 사용하여 37 ℃, 5 % CO2 incubator에서 배양하였다. 100 mm 배양접시에 4X105 세포를 심어 배양을 시작했으며, 3 일마다 계대배양 하였다.
Immunoblot 분석은 다음 방법으로 수행하였다. SDS-PAGE로 전개한 단백질을 electroblotting하여 옮긴 PVDF membrane를 5 % skim milk가 포함된 TBS-T buffer (20 mM Tris, 137 mM Nacl, 0.1 % Tween 20)에서 1 시간동안 진탕하여 블로킹하였다. Membrane을 TBS-T buffer로 5 분간 3 번 반복하여 세척한 후, 5 % skim milk 또는 5 % BSA가 포함된 TBS-T buffer에 희석된 1 차 항체와 4 ℃에서 overnight 반응시켰다. 그 다음, membrane을 TBS-T buffer로 5 분간 3 번을 반복하여 세척한 후, 5 % skim milk가 포함된 TBS-T buffer에 희석된 2 차 항체와 상온에서 30 분간 반응시켰다. Membrane을 5 % skim milk가 포함된 TBS-T buffer로 5 분간 5 번 반복하여 세척한 후, chemiluminescence 방법으로 2 차 항체가 결합된 단백질 밴드를 검출하였다. 1 차 항체는 Akt (Cell signalling, #4691), pAkt(S473) (Cell signalling, #4060), p70S6K (Cell signalling, #S6198), pp70S6K(T389) (Cell signalling, #9205S)를 사용하였으며, 2 차 항체는 HRP conjugated anti-rabbit(#711-035-152, Jackson immunoresearch laboratory)과 HRP conjugated anti-mouse IgG (#515-035-072, Jackson immunoresearch laboratory)를 사용하였다.
- 결과
사람세포주 HeLa를 사용하여 상기 실시예 3에서 합성한 HN-1703을 처리한 후, mTORC1 활성의 표지자인 S6K Thr389 인산화 변화와 mTORC2 활성의 표지자인 AKT Ser473 인산화 변화를 immunoblot 분석으로 조사하고, 도 2의 a)에 도시하였다.
도 2의 a)를 참조하면, HN-1703은 40 μM에서 mTORC1 활성은 대조군 대비 48 % 그리고 mTORC2 활성은 대조군 대비 55 % 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
도 2의 b)를 참조하면, 상기 실시예 1 내지 12에서 합성한 화합물 중 HN-1701, HN-1702, HN-1703, HN-2103, HN-2105, 그리고 HN-2108은 mTORC2 활성을 대조군 대비 25 % 내지 40 % 억제하였고, HN-1701, HN-1702, HN-1703, HN-2103, 그리고 HN-2110은 mTORC1 활성을 대조군 대비 15 % 내지 50 % 억제함을 확인할 수 있었다.
실험예 2. 일차배양 신경세포에서 오토파지 촉진 효능 평가
- 방법
흰쥐(SD, 오리엔트바이오) 임신 주령 16 일(Embryonic day, E16) 배아의 해마(hippocampus)로부터 1차 신경세포 배양(primary neurons culture)을 진행하였다. 해부현미경 아래에서 무균상태의 핀셋을 사용하여 적출한 뇌의 좌우 반구를 분리하고, 수막(meninges)을 벗겨낸 뒤 해마융기를 55 호 핀셋으로 잘라내고 Ca2+/Mg2+-free HBSS(Invitrogen) 용액에서 pasteur pipette(Falcon, 354647)으로 pipetting하여 신경 전구세포를 기계적으로 해체하였다. 풀어지지 않은 조직이나 혈관세포 등은 가라앉힌 후 상층액을 취하여 세포 수를 측정하고, 분리된 세포를 poly-L-ornithine(sigma, P3655)과 fibronectin(sigma, F4759)으로 코팅된 35 mm 배양 접시에 19,000 세포/cm2로 심었다. 세포들은 5 % CO2의 배양기에서 10 ng/mL bFGF (Invitrogen)이 첨가된 혈청이 없는 N2 배지(증식용 배지)를 사용하여 배양하고, 6 시간 후와 24 시간 후에 배양액을 갈아주었다. 2 일 후 세포가 2 배 이상 증식하면 계대 배양을 진행하였다.
1 차 신경전구세포 배양 후 3일 뒤에 0.05 % trypsin으로 계대배양하는 과정을 을 2 번 반복하고 심기 전에 DNA electroporation 또는 transfection을 실시했다. pEGFP-LC3 플라즈미드는 2 X 106 개의 세포에 1.5 μg DNA 비율로 첨가하고 Amaxa Rat Neuronal Stem Cell Nucleofector Kit(Lonza, VPG-1005)에 들어 있는 neucleofector solution(Lonza, S-06387) 82 μl와 Supplement1(Lonza, S-06372) 18 μl를 섞은 후, 4D-Nucleofector X Unit(Lonza, AAF-1001X) electroporator를 사용하여 플라즈미드 DNA를 세포 내로 도입하였다. 도입한 세포를 24-well 배양접시 내에 위치시킨 coverslip 위에 심고, 증식용 N2(+bFGF) 배지에서 24 시간 배양하였다. 그 후, FGF를 첨가하지 않은 분화용 N2(-FGF) 배지로 키우면서 이틀마다 50 % 배지를 바꾸어 주며 신경세포 분화를 유도하였다. 분화 2 일 후에 0.1 μM rapamycin과 0.1 μM 내지 0.5 μM 농도의 HN-1703를 처리하였다.
DAPI로 표지된 세포 핵 수와 LC3-eGFP 발현과 DAPI 표지가 겹쳐 초록 형광을 발현하는 세포 수를 측정하였다. eGFP-LC3 puncta 수는 각 세포 당 개수를 측정하였고 puncta의 신호 강도는 confocal laser microscope program을 사용하여 측정하였다. 데이터분석은 일원배치 분산분석(Anova)을 통하여 대조군과 실험군을 비교하였다. 자료의 통계학적 의의는 p<0.05로 하였다.
- 결과
흰쥐 배아(E16)에서 해마 신경전구세포를 배양하여 분화시킨 신경세포에서 HN-1703의 오토파지 촉진 효능을 LC3-eGFP puncta 형성 분석을 수행하여 평가하였다. LC3-eGFP 재조합 유전자를 electroporation으로 도입한 신경 전구세포를 신경세포로 분화시킨 다음, 라파마이신(rapamycin)과 HN-1703을 각각 0.1 μM 및 0.5 μM 농도로 12 시간 처리하고, LC3-GFP의 puncta를 confocal laser microscope(Zeiss, LSM800)으로 스캔하여 LC3-eGFP의 형광 강도 및 puncta의 개수를 측정하고, 그 결과를 도 3에 도시하였다. 구체적으로, 도 3의 a)는 LC3-eGFP 융합 단백질을 과 발현시킨 1 차 배양 해마 신경세포에 HN-1703을 처리한 후, LC3-eGFP puncta 형성을 공초점 주사 현미경으로 스캔한 사진 및 세포 당 LC3-eGFP puncta의 개수와 형광 강도를 정량화 하여 도시한 것이고, b)는 LC3-II turnover 분석결과이다.
도 3의 a)를 참조하면, HN-1703은 LC3-eGFP puncta의 개수를 대조군 대비 85% 이상 증가시켰고 puncta의 신호 강도는 대조군 대비 45 % 이상 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. 병행한 실험에서 라파마이신의 경우, LC3-eGFP puncta의 개수는 49 % 그리고 puncta의 신호 강도는 15 % 증가시키는데 그쳐, HN-1703이 rapamycin에 비교하여 사용한 농도에서 오토파지를 더 효율적으로 촉진할 수 있음을 확인할 수 있었다.
도 3의 b)를 참조하면, 일차 배양한 신경세포에서 HN-1703은 오토파지 활성화 표지자인 LC3-II를 대조군에 비교하여 화합물 처리 후 36 시간까지 현저히 증가시키는 것을 확인할 수 있었고, 또한, lysosome 성숙 억제제인 bafilomycin A1 존재 하에서도 HN-1703은 LC3-II 형성을 대조군에 비교하여 크게 증가시켰으며, 이에 따라 HN-1703은 오토파지의 시작 단계를 촉진하는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 3. Aβ 축적 억제 효능 평가
- 방법
흰쥐(SD, 오리엔트바이오) 임신 주령 16 일에 E16 배아의 대뇌로부터 1 차 신경세포 배양을 진행하였다. 흰쥐(SD, 오리엔트바이오) 임신 주령 16 일(Embryonic day, E16) 배아의 대뇌(cerebral cortex)로부터 1 차 신경세포 배양(cortical neurons culture)을 진행하였다. 해부현미경 아래에서 무균상태의 핀셋을 사용하여 적출한 뇌의 좌우 반구를 분리하고, 수막(meninges)을 벗겨낸 뒤 5 호 핀셋으로 대뇌 부위를 잘라 Ca2+/Mg2+-free HBSS(Invitrogen) 용액에 모으고, 15 ml tube에 0.25 % trypsin을 동량 섞어 37 °C 수조에서 10 분 내지 15 분 처리한 후, trypsin을 일부 제거하고 1 ml 내지 2ml 남긴 다음 동량의 20 % FBS-DMEM을 넣어서 trypsin을 불활성화 하였다. 세포를 700 rpm에서 15 분 원심분리하고 상층액을 제거한 후 neurobasal media를 2 ml 넣고 pasteur pipette(Falcon, 354647)을 사용하여 끝을 좁게 만든 pasteur pipette 으로 바꾸어가면서 천천히 trituration하여 해체하였다. 남아있는 덩어리는 40 μm nylon mesh를 50 ml tube에 끼워서 걸러내고 20 ml neurobasal media로 mesh에 남은 세포를 씻어내서 세포를 추가 획득하였다. 세포 수를 측정한 후, 분리된 세포를 50 μg/ml poly-D-Lysine(sigma, P0899)과 1 μg/ml laminin(Invitrogen, 23017-015)으로 코팅된 35 mm 배양 접시에 19,000 세포/cm2로 심었다. 세포들은 5 % CO2의 배양기에서 B27(Gibco, 17504-044)을 첨가한 neurobasal complete media를 사용하여 배양하였다.
1 차 배양한 대뇌 신경세포에 0.5 μM 또는 1 μM 농도의 Aβ와 0.1 μM 또는 0.5 μM 농도의 HN-1703을 12 시간 또는 24 시간 처리하였으며, 축적된 Aβ는 6E10 항체로, 오토파지 형성은 LC3 항체로 동시 이중 염색하고, 세포 핵은 DAPI로 표지 하였다.
상기 신경세포는 배양액을 모두 제거한 후 PBS로 한번 세척한 후 4 % PFA in PBS로 15 분간 고정한 뒤 다시 PBS로 두 번 세척하였다. 세포가 붙어있는 coverslip을 PBST로 씻어낸 후 0.5 % Triton X-100-PBST를 넣어 10 분간 반응하였다. 다시 2 % BSA-PBST 또는 5 % 정상 혈청(Normal donkey serum: Jackson lab, 017-000-121, Normal horse serum: Sigma, H0146)으로 blocking하고, 1 차 항체를 2 % BSA -PBS에 넣고 4 ℃에서 하루 밤 동안 반응시키고, 다음날 PBST로 씻어낸 후 2 차 항체를 PBST에 넣고 상온에서 1 시간 동안 반응시킨 후 DAPI(1 μg/mL, Sigma)로 세포 핵을 염색하고 slide glass에 올려서 confocal laser microscope로 스캔하고 사진을 찍었다. 사용한 1 차 항체로는 LC3-II (MBL, PM036), 6E10 (Biolegend, 803001), 2 차 항체로는 Alexa 488 (Invitrogen, A21202), Cy3 (Jackson lab, 715-165-151), Alexa 488 (Jackson lab, 711-546-152) 등을 사용하였다.
- 결과
상기 실험예 2에서 HN-1703이 오토파지를 효과적으로 촉진할 수 있음을 확인한 바, HN-1703이 세포 내에 축적되는 Aβ oligomer를 제거할 수 있는지 평가하였다. 흰쥐 배아(E16) 대뇌 부위에서 1 차 배양한 신경세포에 0.5 μM 또는 1 μM 농도의 Aβ와 0.1 μM 또는 0.5 μM 농도의 HN-1703을 12 시간 또는 24 시간 처리하였으며, 축적된 Aβ는 6E10 항체로, 오토파지 형성은 LC3 항체로 동시 이중 염색하여 측정하였으며, 세포 핵은 DAPI로 표지 하였다. confocal laser microscope(Zeiss, LSM800)으로 스캔한 후 Aβ 염색은 염색 신호 강도로, LC3 염색은 puncta의 면적을 측정하여 정량화 하고, 결과를 도 4에 도시하였다.
도 4를 참조하면, HN-1703을 처리했을 때 오토파지 표지자인 LC3 puncta 면적은 농도 의존적으로 증가하여 4 배 이상 증가하였고, 동시에 같은 농도에서 세포 내에 축적된 Aβ를 50 % 이상 제거하는 것을 확인할 수 있었다.
상기 실험을 통하여, HN-1703이 1차 배양 대뇌신경세포 내에 축적된 Aβ를 제거하고 동시에 LC3-II puncta를 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 4. Aβ 독성에 대한 신경세포 보호 효능 in vitro 평가
- 방법
흰쥐 배아(E16) 대뇌에서 1 차 배양한 신경세포에 0.5 μM 또는 1 μM 농도의 Aβ, 그리고 0.1 μM 또는 0.5 μM 농도의 HN-1703을 12 시간 또는 24 시간 처리하였다. 세포 생존율은 DAPI로 염색되는 세포의 수를 측정하여 평가하였다.
- 결과
Aβ는 신경세포에 대해 강한 독성을 가지며, 뇌에 축적된 Aβ에 기인한 신경세포의 사멸이 알츠하이머형 치매의 주요 원인이 된다. mTOR 신호경로를 억제하고 오토파지를 촉진하는 HN-1703이 Aβ 독성으로부터 신경세포를 직접 보호할 수 있는지 평가하기 위하여, Aβ에 의해 유발되는 1 차 배양 대뇌 신경세포의 세포 사멸에 대한 HN-1703의 억제 효능을 평가하고, 도 5에 DAPI로 염색된 살아 있는 세포 수를 정량화하여 도시하였다.
도 5를 참조하면, 세포 생존율은 Aβ에의해 50 % 이상 감소하였고 HN-1703 처리에 의해 생존율이 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
HN-1703의 치매동물모델인 5xFAD 형질전환 쥐에 대한 in vivo 효능 평가
- 실험목적
본 실험은, 1) 알츠하이머형 치매 관련 병증에 대한 HN-1703의 영향, 특히 구체적으로는, i) 뇌에서 노인성반 축적에 대한 영향, ii) 뇌에서 tau-인산화에 대한 영향 및 iii) 뇌에서 염증반응에 대한 영향을 확인하고, 2) 작동 기전, 특히 구체적으로는, i) 뇌에서 오토파지에 대한 영향 ii) 해마에서 신경재생(neurogenesis)에 대한 영향을 확인하고, 3) 기억력 및 인지기능 향상 효능을 평가하기 위하여 수행하였다.
- 방법
5xFAD 마우스에 대한 HN-1703 투여
5xFAD 동물은 만 6 개월된(모두 3 일 사이에 태어남) male heterozygotes 동물에게 14 일간 HN-1703을 3 가지 용량으로 투여하였다. 마우스는 사육실 챔버에서 12 시간 주기로 빛과 어둠을 교체하면서 쥐가 활동하는 암 주기에서 행동 측정하였고 먹이와 물은 자유로 접근 가능하였으며 경희대학교 동물실험윤리 규정을 지켜서 사육하였다. 각 군은 모두 정상군(wild type littermate) 12 마리, 5xFAD에 vehicle (DMSO 투여) 9 마리, 5xFAD에 5 mg/kg투여군 8 마리, 10 mg/kg 투여군 9 마리, 20 mg/kg 투여군 9 마리에 하루 한번 같은 시간에 100 μl 부피로 복강주사 하였다. 5 일간 행동측정자의 손과 냄새에 익숙해지도록 손바닥 위에 올려놓고 2 분간 손바닥을 탈출하지 않을 때까지 매일 10 분씩 습관화한 뒤(habituation) 인지 기능을 측정하였다. 행동측정실은 습도 (40-60 %), 온도 (22-26 °C)를 유지하고 소리와 빛 영향이 없도록 반사광을 유지하였다. 행동 측정은 Y형 미로(Y-maze), 수중 미로(Morris Water Maze), 수동회피시험(Passive Avoidance test) 을 차례로 18 일간 측정하였다.
Y형 미로 시험
Y형 미로에 쥐를 넣어주고 쥐가 미로를 탐색할 때 중앙에서 각 미로를 번갈아 가며 새로운 미로를 선택하는지 또는 거쳐온 미로를 잊고 같은 미로를 다시 선택하는지를 측정하고 alteration 횟수를 %로 계산하였다. 자세한 측정 방법은 Heo H et al.(J Ethnopharmacol, 2009)에 기재된 내용을 참조하고, 마우스의 공간 기억력과 단기기억을 검사하였다. Y형 미로에서 마우스가 각 arm에 들어가는 것을 8 분, 10 분 및 20 분간 촬영하고, 성공 확률을 수식화하는 식은 3 개씩 각기 다른 arm에 들어간 횟수를 총 arm에 들어간 횟수-2로 나누어 (%) 데이터화 하였다. 모든 결과들은 ANOVA test를 이용해서 통계처리 하였다.
수동 회피 시험
수동 회피 시험은 Y자형 미로 시험 다음 순서로 Heo et al. (J Ethnopharmacol, 2009)에 기술한 것과 같이 수행하였다. 강한 빛에 의한 회피 작용으로 마우스가 밝은 방에서 어두운 방으로 회피하는 연습을 매일 3 회씩 4 일간 훈련하면서 환경에 익숙하게 하고 30 초 이내에 회피하게 되면(Acquisition time) 다음날 같은 시간에 어두운 방에서 electric foot shock (0.5 mA, 30 g기준)을 3 초간 가한 후 정확히 24 시간 이후 다시 밝은 방에 마우스를 놓이고 빛에 의한 회피 반응, 즉 밝은 방에서 어두운 방으로 넘어가는데 걸리는 기억력 유지 기간(retention time)을 720 초 동안 측정하여(감금 실험) 대기 시간을(latency time) 각 그룹별로 데이터화 하였다.
수중 미로 시험
Richard Morris가 고안한 공간기억능력을 시험하는 수중미로 시험으로, 둥글고 녹슬지 않고 내부 표면이 하얀 풀(지름 120 cm; 높이 60 cm)에서 수행하였다 풀은 50 cm 깊이로 물(25.0 ± 1.0 ℃유지)이 들어 있는 수조를 균등하게 4 등분하고 그 중 한 구역 중간에 물 수면으로부터 3 mm 깊이에 플랫폼(지름 12 cm 정도)을 위치시켰다. 첫날은 플랫폼 발판 없이 1 분씩 자유수영 연습을 시키고 두번째 날부터 물에 물감을 타서 발판이 보이지 않게 하고 쥐가 수조 위의 공간 단서를 이용하여 플랫폼을 찾아가게 1 분씩 훈련하면서 6 마리 이상을 한 조로 하여 충분한 휴식 후 사분면에 한번씩 넣어주고 비디오 카메라로 측정하였다. 4 일간 하루 4 회씩 수조의 발판을 찾는 훈련 시험을 수행하고 마지막 6 일째 최종 실험은 수조의 발판을 제거한 후 실험 동물이 발판이 있었던 곳에서 머무는 시간을 측정하였다(프로브 시험 : probe trial). 캡쳐된 비디오사진은 비디오 추적 시스템 (Ethovision 수중 미로 프로그램, Noldus 정보 기술, 워게닌겐, 네덜란드)으로 분석하였다. 분석된 정보는 타겟 사분면에서 수영한 시간과 제거된 플랫폼을 찾기 위해 가상의 플랫폼을 건너는 횟수를 포함하였다.
면역 조직 화학 분석 염색
뇌 절편 면역염색 방법은 Heo H et al.(J Ethnopharmacol, 2009)에 기술한 것을 수정하여 사용하였다. 쥐를 4 % PFA로 경심 관류하였다. 4 시간 동안 4 % PFA에 담가 고정한 후, 뇌 조직을 30 % 수크로오스에서 비냉동화하여 최적의 절단 온도(OCT) 혼합물에 얼려 -80 ℃에서 보관하였다. 뇌 조직 조각은 35 μm 두께로 관상면(coronal) 방향으로 절편화 하였다. 뇌 조직 절편은 저장 용액 (30 % 글리세롤, 30 % 에틸렌글리콜, PBS)에 담가 4 ℃에서 보관하였다. 보관된 뇌 조각은 0.5 % 트리톤 X-I00에서 20 분 동안 투과하고, 37 ℃에서 30 분 동안 2 N HCl에서 진탕했다. 그 후, 15 % 표준 혈청과 3 % 소 혈청 알부민(BSA,bio-WORLD, 더블린, OH, USA) 그리고 0.1 % 트리톤 X-100에서 2 시간 동안 자유롭게 떠있는 상태로 블로킹하였다. 상기 절편을 16 시간 동안 4 ℃에서 1 차 항체와 함께 진탕하였다. 이후 1 차 항체에 상보적인 2 차 항체를 실온 (22±1 ℃)에서 45 분간 부착하였다. 그 다음, 핵은 1 μg/ml PI(propidiumiodide, 시그마) 또는 DAPI(1:4000)를 포함한 생리식염수(PBS)로 세척한 후, 슬라이드 글라스 위에 올려 수성 마운트를 이용하여 봉입하였으며, 조직관찰용 공초점 주사 현미경(LSM 810 칼자이스, 오버코헨, 독일)으로 관찰하였다.
1 차 항체로는 LC3-II(MBL, PM036),　MAP2(sigma, m4403) [LC3/MAP2 2중염색용], 6E10(biolegend, 803001) [LC3/6E10 ; ICC 2중염색용], GFAP(abcam, ab53554) [LC3/GFAP 2중염색용],　Iba-1(wako, 011-27991) [LC3/IBA1 2중염색용], Iba-1(Wako, 019-19741) [ThioS/Iba1/PI 3중염색용],　Sox2(R&D system, MAB2018) [SOX2/DCX/NeuN 3중염색용],　DCX(Santa Cruz, sc8066) [SOX2/DCX/NeuN 3중염색용],　AT8(Invitrogen, MN1020) [AT8/MAP2 2중염색용], MAP2(abcam, ab32454) [AT8/MAP2 2중염색용], NeuN(Millipore, MAB377B), Tuj1(Sigma, T8660), Nestin(Millipore, MAB353), GFAP(Chemicon) 등 항체를 사용하였으며, 2 차 항체로는 Alexa 488, Cy3, Alexa 488(Invitrogen, A21202), Cy3(Jackson lab, 715-165-151), Alexa 488(Jackson lab, 711-546-152)을 사용하였다.
실험예 5. 5xFAD 쥐의 기억력 및 인지기능 향상 평가
도 6은 HN-1703이, 치매동물모델 5xFAD 형질전환 쥐에 투여 시, 저하되었던 인지기능을 회복시키는 효능을 갖고 있음을 보여주는 Y형 미로, 수동 회피 시험, 그리고 수중 미로 시험 분석 결과이다.
도 6을 참조하면, Y형 미로 시험에서 DMSO만 투여한 5xFAD 마우스(5xFAD-DMSO)는 측정 8 분, 10 분 및 12 분에 모두 약 55.6 % 내지 56 %의 alteration을(정상군 대비 P<0.001) 보였으나, 5xFAD에 HN-1703을 투여한 5 mg/kg 투여군에서는 68 % 내지 73 %, 10 mg/kg 투여군에서 67 % 내지 69.5 %, 20 mg/kg 투여군에서 71.3 % 내지 77.4 %의 alteration을 보였으며(유의성 P<0.001-0.01), 이는 거의 정상군(72.0 % 내지 75.5 %)과 유사한 수치로 회복되었음을 확인할 수 있었다.
수동 회피 시험에서 5xFAD-DMSO군(약 122.3 초)은 정상군(약 519.9 초)에 비해 76.5 %의 latency 시간이 감소했으나, HN-1703을 5 mg/kg, 10 mg/kg 및 20 mg/kg 투여한 쥐는 latency 시간이 418.4 초 내지 447.3 초 정도로 현저히 회복됨을 확인할 수 있었다.
수중 미로 시험에서 5xFAD-DMSO군은 훈련기간 내내 정상쥐에 비교하여 10 초 정도 latency 시간이 증가한 반면, HN-1703을 5 mg/kg, 10 mg/kg 및 20 mg/kg 투여한 투여군은 첫날은 정상군보다 발판을 찾는데 오래 결렸으나 정상군보다 학습 속도가 빨라, 4 일 훈련 후에는 latency 시간이 35 초 정도로 감소하여 정상군과 유사해지는 것을 확인할 수 있었다. 수영한 거리는 모든 실험군에서 유사했으나, 타겟 사분면 (1 사분면)에서 수영한 시간은 5xFAD-DMSO군은 9 초로 정상군 16.6 초의 54 %이였으며, HN-1703 투여군은 17.5 초 내지 18.4 초로 모두 정상군보다 많은 시간을 수영하였다. 타겟이 있던 장소를 지나간 숫자는 5xFAD-DMSO군은 0.44 회로 정상군 1.47 회의 30 %수준이었으며, HN-1703 투여군은 2 회 내지 2.4 회로 농도 의존적으로 증가하였다. 따라서 5xFAD 마우스에서 정상군에 비교하여 저하되었던 공간 지각력이 HN-1703 투여에 의하여 정상군 수준으로 회복되었음을 확인할 수 있었다.
실험예 6. 5xFAD 쥐 뇌에서 노인성 반 제거 효능 평가
관상면(coronal) 방향으로 절편화한 뇌절편을 뇌 앞부분부터 뒤까지 5 장마다 한 장씩 선택하여 각 동물 뇌마다 5 장 내지 11 장씩 thioflavin-S와 DAPI로 동시 염색하였다. 노인성 반과 NFT(neurofibrillary tangle)이 많이 침착되는 해마의 dentate gyrus, 대뇌의 entorhinal cortex, subiculum, temporal lobe 부위를 공초점 주사 현미경 (confocal laser microscope)로 관찰하였다.
도 7은 뇌절편에 Thioflavin-S를 처리하여 노인성 반을 염색한 후, 해마 dentate gyrus, 대뇌 entorhinal cortex, 그리고 temporal lobe 부위를 공초점 주사 현미경으로 스캔한 사진이고, 도 8은 Thioflavin-S로 염색된 노인성 반의 전체 면적과 염색 강도를 정량화하여 도시한 것이다.
도 7을 참조하면, thioflavin-S로 염색된 노인성 반은 5xFAD-DMSO군에서 해마의 dentate gyrus, entorhinal cortex, temporal lobe에서 가장 많이 발견되었으며, HN-1703 투여에 의해 5-20 mg/kg까지 용량 의존적으로 감소하였고, HN-1703을 20 mg/kg로 투여한 5xFAD 마우스의 dentate gyrus에서는 5xFAD-DMSO군에 비해 70% 이상 감소한 것을 확인할 수 있었다.
도 8을 참조하면, HN-1703 투여군에서 노인성 반의 전체 면적과 염색 강도 모두 5xFAD-DMSO 대조군에 비교하여 용량 의존적으로 감소하였고, 조사한 모든 뇌 부위에서 HN-1703 투여군에서 5xFAD-DMSO 대조군에 비교하여 10~20 μm와 20 μm 이상 크기의 노인성 반의 수가 모두 용량 의존적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다.
상기 실험 결과로, HN-1703이, 치매동물모델 5xFAD 형질전환 쥐에 투여 시, 노인성 반을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 7. 5xFAD 쥐 뇌에서 NFT 제거 효능 평가
AT8 항체는 과인산화된 Tau 단백질을 염색한다. 따라서 5xFAD 쥐 뇌의 해마와 대뇌에서 형성된 NTF는 AT8 항체를 사용한 면역 염색으로 관찰할 수 있다. 뇌 절편을 AT8 항체, 신경세포 표지자인 MAP2, 그리고 세포핵을 염색하는 DAPI로 3중 염색하였다.
도 9는 뇌절편을 과인산화된 Tau-NFT를 인식하는 AT8 항체와 신경세포의 dendrite를 주로 염색하는 MAP2 항체로 2중 염색한 후, 해마의 dentate gyrus, CA1, CA3 부위 그리고 대뇌 부위를 공초점 주사 현미경으로 스캔한 사진이고, 도 10은 MAP2 항체와 AT8 항체로 이중 염색한 후, 공초점 주사 현미경으로 고배율로 스캔한 사진 및 dentate gyrus에서 관찰된 AT8+ 세포의 개수와 AT8+/MAP2+ 세포의 개수를 정량화 하여 도시한 것이다.
도 9를 참조하면, 5xFAD 쥐의 뇌에서 NFT는 dentate gyrus에서 가장 많이 관찰되었고 CA1, CA2 해마 부위에서 그 다음으로 많이 관찰되었으며 대뇌에서는 비교적 적게 관찰되었다. NFT는 조사한 3 가지 뇌 부위 모두에서 HN-1703 투여에 의해 5 mg/kg 내지 20 mg/kg까지 용량 의존적으로 감소하는 것을 확인 할 수 있었다. HN-1703을 20 mg/kg로 투여한 5xFAD 투여군의 dentate gyrus에서는 5xFAD-DMSO군에 비해 NFT가 70 % 이상 감소하였다.
도 10을 참조하면, NFT 염색은 주로 신경세포와 이중 염색되었으며, NFT로 염색되는 신경세포의 수 또한 HN-1703 투여에 의해 용량 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
상기 실험 결과로, HN-1703이, 치매동물모델 5xFAD 형질전환 쥐에 투여 시, NFT를 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 8. 5xFAD　쥐에서　뇌 염증반응(Neuroinflammation) 억제 효능 평가
소교세포(microglia)는 뇌에서 염증반응을 담당하는 면역세포이다. 5xFAD 쥐에서는 정상군에 비해 활성화된 소교세포(microglia)가 현저히 증가한다. 활성화된 소교세포는 Iba-1으로 염색되므로, 뇌절편을 Iba-1으로 염색하여 NH-1703 투여가 뇌염증반응에 미치는 영향을 평가하였다.
도 11은 활성화된 소교세포(microglia)를 염색하는 Iba-1 항체와 세포핵을 염색하는 DAPI로 2 중 염색한 해마의 dentate gyrus 부위를 공초점 주사 현미경으로 스캔한 사진 및 Iba-1+ 면적을 도시한 것이다.
도11를 참조하면, HN-1703 투여군에서 Iba-1 염색이 5xFAD-DMSO 대조군에 비교하여 현저히 감소함을 확인할 수 있었다.
상기 실험 결과로, HN-1703이, 치매동물모델 5xFAD 형질전환 쥐에 투여 시, 뇌염증 반응을 억제함을 확인할 수 있었다.
실험예 9. 5xFAD 쥐에서 오토파지 지표 평가
5xFAD　형질전환　쥐에　HN-1703을 투여하면 노인성 반과 NFT가 현저히 감소하는 바, 오토파지 활성화 지표를 조사하였다. PS1이 KO되면 리소좀의 산성화(lysosome acidification)이 약화되어 오토파지가 억제되나(Lee et al. (2010) Cell 141: 1146-1158), PS1에 돌연변이가 있는 5xFAD 쥐에서는 오토파지 생성이 다소 약해진 상태이고 endogenous WT PS1이 존재하면 활성화될 수 있다. 즉, 아미노산 부족 같은 mTOR를 억제하는 세포 상태나 염증 억제는 오토파지를 활성화하며, cAMP나 β-adrenergic 작용제 처리는 PS1 돌연변이 세포에서 리소좀의 산성화가 회복하는 등의 예가 있다(Coffey et al. (2014) Neuroscience 263: 111-124). 노인성 반과 NFT의 현저한 감소와 오토파지 활성화와의 연관성을 조사하기 위해 오토파지 활성화 지표인 LC3 항체와 성상세포를 표지하는 GFAP 항체로 뇌절편을 이중 염색하였다.
도 12는 오토파지 표지자인 LC3 항체, 성상세포를 표지하는 GFAP 항체 그리고 세포 핵을 염색하는 DAPI로 3 중 염색하였으며, 해마 dentate gyrus 부위를 공초점 주사 현미경으로 스캔한 사진 및 LC3+ 세포 수와 GFAP+ 세포 수를 정량화하여 도시한 것이고, 도 13은 신경세포 표지자인 MAP2 항체와 LC3 항체로 2 중 염색하여, 해마의 pyramidal cell을 공초점 주사 현미경으로 스캔한 사진이고, 도 14는 MAP2 항체와 LC3 항체로 2중 염색하여, 해마 dentate gyrus의 granule cell layer을 공초점 주사 현미경으로 고배율로 스캔한 사진이고, 도 15는 적출된 뇌로부터 뇌 추출물을 획득하여 LC3-II 형성을 측정한 immunoblot 분석 결과이다.
도 12를 참조하면, HN-1703 투여군에서의 LC3-II 염색이 5xFAD-DMSO 대조군에 비해 용량 의존적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다. 5 mg/kg 내지 10 mg/kg HN-1703 투여군에서는 WT 정상군 수준으로 LC3-II가 염색되었으며, 20 mg/kg HN-1703 투여군에서는 5xFAD-DMSO 대조군에 비해서는 2.5 배, 그리고 WT 정상군에 비해서는 1.4 배 증가하였다. HN-1703 투여군에서 LC3-II 염색은 해마의 pyramidal cell과 dentate gyrus의 granule cell의 soma와 axon에 염색되었는데, GFAP 항체로 염색된 성상세포는 5xFAD-DMSO군에서는 WT 정상군에 비해 크게 증가하였으며, HN-1703 투여에 의해 정상 수준으로 감소한 것을 확인할 수 있었다. GFAP 항체과 LC3 항체로 이중 염색되는 세포는 많지 않았다.
도 13을 참조하면, WT 뇌절편을 MAP2 항체와 LC3 항체로 이중 염색한 결과, 해마 pyramidal neuron의 soma 뿐 아니라 축색에서 LC3-II 염색이 관찰되었다. 해마 pyramidal neuron 축색에서의 LC3-II 염색은 5xFAD-DMSO 대조군에서는 WT 정상군에 비교하여 현저히 감소하였으나, 20 mg/kg HN-1703 투여군에서는 WT 정상군 수준으로 회복되었다. 이 결과로부터 5xFAD 쥐에서 HN-1703 투여에 의해 해마 pyramidal neuron에서의 오토파지가 활성화됨을 확인할 수 있었다.
도 14를 참조하면, 고배율 사진에서 해마 subgranular cell layer의 큰 신경세포들의 핵 근처에서 autophagic vacuole을 관찰할 수 있었으며, HN-1703 투여군에서 이러한 autophagic vacuole이 현저히 증가함을 관찰할 수 있었다.
도 15를 참조하면, WT 정상쥐, 5xFAD 쥐, 그리고 5xFAD 쥐에 HN-1703을 투여한 쥐의 뇌를 추출하여 immunoblot으로 분석한 결과, 오토파지 활성화 표지자인 LC3-II/LC3-I 비율이 HN-1703 투여에 의해 증가함을 확인할 수 있었다.
실험예 10. 5xFAD 쥐의 신경세포와 microglia에서의 오토파지 활성화 평가
오토파지가 활성화되는 세포 종류를 조사하기 위해 MAP2 항체, GFAP 항체, 그리고 Iba-1 항체를 각각 LC3 항체와 이중 염색하였다.
도 16은 Iba-1 항체, MAP2 항체, 그리고 LC3 항체로 3중 염색한 후, 해마 dentate gyrus 부위를 공초점 주사 현미경으로 스캔한 사진이고, LC3+/MAP2+ 세포 개수, LC3+/Iba-1+ 세포 개수, MAP2+ 세포 개수, 그리고 Iba-1+ 세포 개수를 정량화하여 도시한 것이다.
도 16을 참조하면, Dentate gyrus에서의 MAP2+ 신경세포의 수는 5xFAD-DMSO 대조군에서 크게 감소하였으며, HN-1703 투여군에서는 용량 의존적으로 증가하여 WT 정상군에 근접하였다. MAP2와 LC3-II가 이중 염색되는 신경세포의 수도 5xFAD-DMSO 대조군에서 현저히 감소하였고, HN-1703 투여에 의해 용량 의존적으로 증가하였다.
한편, 활성화된 microglia인 Iba-1+ 세포는 5xFAD-DMSO 대조군에서는 WT 정상군에 비교하여 2 배 이상 증가하였으며, 5-20mg/kg HN-1703 투여군에서는 WT 정상군 보다는 다수 관찰되었으나 5xFAD-DMSO 대조군과 비교해서는 모두 크게 감소하였다. LC3-II와 이중 염색되는 오토파지가 활성화된 microglia 세포는 WT 정상군에서는 거의 관찰되지 않았으나 5xFAD-DMSO군에서는 다수 관찰되었다. 그리고 5xFAD 쥐에 HN-1703을 투여함에 따라 용량 의존적으로 증가하여 5xFAD-DMSO 대조군 대비 2 배 이상 증가하였다. 이러한 실험결과로부터, HN-1703 투여한 5xFAD 치매동물모델에서 오토파지가 신경세포와 microglia에서 활성화됨을 확인할 수 있었다.
실험예 11. 5xFAD　쥐에서　신경 재생 평가　
HN-1703이 5xFAD 쥐의 신경 재생(neurogenesis)에 미치는 영향을 평가하기 위하여 뇌 절편을 Sox2 항체 또는 DCX 항체로 염색하였다. 신경 전구 세포는 Sox2를 발현하며, 분화를 시작한 신경전구세포는 DCX를 발현한다.
도 17은 신경세포 표지자 NeuN 항체, type1 신경전구세포 표지자 Sox2 항체, 분화하며 이동하는 type3 신경전구세포 표지자 DCX 항체로 3 중 염색한 후, 해마 dentate gyrus의 subgranular zone 부위를 공초점 주사 현미경으로 스캔한 사진 및 Sox2+/NeuN+ 세포 개수와 DCX+/NeuN+ 세포 개수를 정량화하여 도시한 것이다.
도 17을 참조하면, 5xFAD-DMSO 대조군에서는 Sox2로 염색되는 신경 전구세포가 WT 정상군보다 60 % 이상 감소하였다. 이와는 대조적으로 10~20mg/kg HN-1703 투여군에서는 WT 정상군보다 더 많은 Sox2+ 신경 전구세포가 관찰되었다. 세포이동과 분화를 시작하는 DCX+ 신경 전구세포 또한 10~20mg/kg HN-1703 투여군에서는 WT 정상군보다 2 배 이상이 관찰되었다. 이 결과로부터 HN-1703은 5xFAD 쥐에서 신경 전구세포의 분열과 함께 분화를 촉진하는 것을 확인할 수 있었다.
약제의 제조예
본 발명에 따른 유효물질은 목적에 따라 여러 형태로 제제화가 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 유효물질을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 제제화 방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
<약제 제조예 1> 산제의 제조
유효물질 2 g
유당 1 g
상기의 성분을 혼합한 후, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<약제 제조예 2> 정제의 제조
유효물질 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<약제 제조예 3> 캡슐제의 제조
유효물질 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<약제 제조예 4> 주사제의 제조
유효물질 10 ㎍/㎖
묽은 염산 BP pH 3.5로 될 때까지
주사용 염화나트륨 BP 최대 1 ㎖
적당한 용적의 주사용 염화나트륨 BP 중에 본 발명에 따른 유효물질을 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 사용하여 pH 3.5로 조절하고, 주사용 염화나트륨 BP를 사용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120 ℃에서 15 분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.
<약제 제조예 5> 경비흡수제 (Nasal spray)의 제조
유효물질 1.0 g
아세트산나트륨 0.3 g
메틸파라벤 0.1 g
프로필파라벤 0.02 g
염화나트륨 적량
HCl 또는 NaOH pH 조정 적량
정제수 적량
통상의 경비흡수제의 제조방법에 따라, 염수 (0.9% NaCl, w/v, 용매는 정제수) 1 mL당 유효물질 3 mg이 포함되도록 제조하고, 이를 불투명한 스프레이 용기에 충진하고 멸균시켜 경비흡수제를 제조하였다.
<약제 제조예 6> 액제의 제조
유효물질 100 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라, 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬 향을 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체 100 mL로 조절한 후 갈색 병에 충진하고 멸균시켜 액제를 제조하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특히 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (30)

  1. 하기 화학식 A로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    [화학식 A]
    Figure pat00038

    (상기 화학식에서,
    상기 R1 및 R2는 각각 수소, 하이드록시, 할로젠, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 및 C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이고,
    R3 및 R4는 각각 수소, 하이드록시, 할로젠, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시, 피리디닐 메톡시 및 벤질 옥시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이다.)
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 R1 및 R2는 각각 수소이고,
    상기 R3 및 R4는 각각 수소, 하이드록시, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시, 피리디닐 메톡시 및 벤질 옥시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기인 것을 특징으로 하는, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 화학식 A로 표시되는 화합물은 하기 화합물군으로부터 선택되는 1 종인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    1) 7,9-다이하이드록시-10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온;
    2) 9-하이드록시-7-메톡시-10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온;
    3) 7,9-다이메톡시-10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온;
    4) 7-(벤질옥시)-9-하이드록시-10H-[1,3]다옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온;
    5) 7-(벤질옥시)-9-메톡시-10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온;
    6) 7-하이드록시-9-메톡시-10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온;
    7) 9-에톡시-7- 메톡시-10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온;
    8) 9-(벤질옥시)-7-메톡시-10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온;
    9) 9-하이드록시-7-(피리딘-4-닐메톡시)-10H-[1,3] 다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온;
    10) 10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온;
    11) 7-클로로-10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온; 및
    12) 7-브로모-10H-[1,3]다이옥솔로[4,5-b]잔텐-10-온.
  4. 제 1 항에 있어서,
    mTORC1(mammalian target of rapamycin complex 1) 또는 mTORC2(mammalian target of rapamycin complex 2) 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  5. 제 1 항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 퇴행성 뇌질환은 치매, 파킨슨병, 알츠하이머형 치매, 피크병, 헌팅턴병, 간질, 중풍, 뇌졸중, 허혈성 뇌질환, 기억력 감퇴로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머형 치매(Alzheimer's disease)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  8. 제 1 항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 mTOR병증(mTORopathy)의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 mTOR병증은 간질(epilepsy), 자폐(autism spectrum disorder, ASD), 대두증(macrocephaly), 복합결절성경화증(tuberous sclerosis complex, TSC), 발작(seizure), 취약 X 증후군(Fragile X syndrome), 또는 지적 장애로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  10. 제 1 항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 신경재생(neurogenesis) 촉진을 특징으로하는 신경 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 신경재생 촉진은 신경 줄기 세포 또는 신경 전구 세포의 분열, 분화, 이동 또는 생존을 촉진하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  12. 제 10 항에 있어서,
    상기 신경 질환은 외상성 중추 신경계 질환, 척수 손상 질환, 말초신경 손상, 근위축성 축색 경화증 및 말초신경질환으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  13. 하기 반응식 1에 나타난 바와 같이,
    유기 용매 및 염기 촉매 존재 하에 하기 화학식 1로 표시되는 노라티리올 및 하기 화학식 B1으로 표시되는 화합물을 반응 시키는 단계(단계 1);를 포함하는 하기 화학식 A2로 표시되는 화합물의 제조방법:
    [반응식 1]
    Figure pat00039

    (상기 반응식에서,
    X1 및 X2는 각각 클로로, 브로모, 아이오도, 토실레이트 및 메질레이트 중 어느 하나이고,
    R1 및 R2는 각각 수소, 하이드록시, 할로젠, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 및 C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이다.)
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 유기 용매는 다이메틸 설폭사이드, 다이메틸 포름아마이드, 아세톤, 테트라하이드로퓨란, 벤젠, 톨루엔, 에테르, 메탄올, 헥산, 시클로 헥산, 피리딘, 아세트산, 사염화탄소, 클로로포름, 디클로로 메탄, 디클로로 에탄 및 물로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 화합물의 제조방법.
  15. 제 13 항에 있어서,
    상기 염기 촉매는 KOH, NaOH, K2CO3, Na2CO3, KHCO3, NaHCO3 및 NaH로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 화합물의 제조방법.
  16. 하기 반응식 2에 나타난 바와 같이,
    유기 용매 및 염기 촉매 존재 하에 하기 화학식 A2로 표시되는 화합물 및 화학식 B2로 표시되는 화합물을 반응 시키는 단계(단계 1);를 포함하는 하기 화학식 A3로 표시되는 화합물의 제조방법:
    [반응식 2]
    Figure pat00040

    (상기 반응식에서,
    X3는 각각 클로로, 브로모, 아이오도, 토실레이트 및 메질레이트 중 어느 하나이고,
    R1 및 R2는 각각 수소, 하이드록시, 할로젠, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 및 C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이고,
    R5는 수소, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 피리디닐 및 벤질기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이다.)
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 유기 용매는 다이메틸 설폭사이드, 다이메틸 포름아마이드, 아세톤, 테트라하이드로퓨란, 벤젠, 톨루엔, 에테르, 메탄올, 헥산, 시클로 헥산, 피리딘, 아세트산, 사염화탄소, 클로로포름, 디클로로 메탄, 디클로로 에탄 및 물로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 화합물의 제조방법.
  18. 제 16 항에 있어서,
    상기 염기 촉매는 KOH, NaOH, K2CO3, Na2CO3, KHCO3, NaHCO3 및 NaH로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 화합물의 제조방법.
  19. 하기 반응식 3에 나타난 바와 같이,
    유기 용매 및 염기 촉매 존재 하에 하기 화학식 A2로 표시되는 화합물 및 화학식 B3로 표시되는 화합물을 반응 시키는 단계(단계 1);를 포함하는 하기 화학식 A4로 표시되는 화합물의 제조방법:
    [반응식 3]
    Figure pat00041

    (상기 반응식에서,
    X4는 각각 클로로, 브로모, 아이오도, 토실레이트 및 메질레이트 중 어느 하나이고,
    R1 및 R2는 각각 수소, 하이드록시, 할로젠, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 및 C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이고,
    R6는 수소, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 피리디닐 및 벤질기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이다.)
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 유기 용매는 다이메틸 설폭사이드, 다이메틸 포름아마이드, 아세톤, 테트라하이드로퓨란, 벤젠, 톨루엔, 에테르, 메탄올, 헥산, 시클로 헥산, 피리딘, 아세트산, 사염화탄소, 클로로포름, 디클로로 메탄, 디클로로 에탄 및 물로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 화합물의 제조방법.
  21. 제 19 항에 있어서,
    상기 염기 촉매는 KOH, NaOH, K2CO3, Na2CO3, KHCO3, NaHCO3 및 NaH로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 화합물의 제조방법.
  22. 하기 반응식 4에 나타난 바와 같이,
    유기 용매 및 염기 촉매 존재 하에 하기 화학식 A3로 표시되는 화합물 및 화학식 B4로 표시되는 화합물을 반응 시키는 단계(단계 1);를 포함하는 하기 화학식 A6로 표시되는 화합물의 제조방법:
    [반응식 4]
    Figure pat00042

    (상기 반응식에서,
    X5는 각각 클로로, 브로모, 아이오도, 토실레이트 및 메질레이트 중 어느 하나이고,
    R1 및 R2는 각각 수소, 하이드록시, 할로젠, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 및 C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이고,
    R5 및 R7은 각각 수소, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 피리디닐 및 벤질기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이다.)
  23. 제 22 항에 있어서,
    상기 유기 용매는 다이메틸 설폭사이드, 다이메틸 포름아마이드, 아세톤, 테트라하이드로퓨란, 벤젠, 톨루엔, 에테르, 메탄올, 헥산, 시클로 헥산, 피리딘, 아세트산, 사염화탄소, 클로로포름, 디클로로 메탄, 디클로로 에탄 및 물로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 화합물의 제조방법.
  24. 제 22 항에 있어서,
    상기 염기 촉매는 KOH, NaOH, K2CO3, Na2CO3, KHCO3, NaHCO3 및 NaH로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 화합물의 제조방법.
  25. 하기 반응식 5에 나타난 바와 같이,
    유기 용매 및 Pd/C 촉매 하에 하기 화학식 A6로 표시되는 화합물 및 수소 기체를 반응 시키는 단계(단계 1);를 포함하는 하기 화학식 A7로 표시되는 화합물의 제조방법:
    [반응식 5]
    Figure pat00043

    (상기 반응식에서,
    R1 및 R2는 각각 수소, 하이드록시, 할로젠, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 및 C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이고,
    R5 및 R7은 각각 수소, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 피리디닐 및 벤질기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이다.)
  26. 제 25 항에 있어서,
    상기 유기 용매는 다이메틸 설폭사이드, 다이메틸 포름아마이드, 아세톤, 테트라하이드로퓨란, 벤젠, 톨루엔, 에테르, 메탄올, 헥산, 시클로 헥산, 피리딘, 아세트산, 사염화탄소, 클로로포름, 디클로로 메탄, 디클로로 에탄 및 물로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 화합물의 제조방법.
  27. 하기 반응식 6에 나타난 바와 같이,
    유기 용매 및 염기 촉매 존재 하에 하기 화학식 A18로 표시되는 화합물 및 화학식 B5로 표시되는 화합물과 반응 시켜 하기 화학식 A18-1로 표시되는 화합물을 합성하는 단계(단계 1);
    유기 용매 하에 화학식 A18-1로 표시되는 화합물 및 인산염을 반응 시켜 하기 화학식 A18-2로 표시되는 화합물을 합성하는 단계(단계 2); 및
    유기 용매 하에 하기 화학식 A18-2로 표시되는 화합물 및 염화 포스포릴(Phosphorus oxychloride, POCl3)를 반응시키는 단계(단계 3);를 포함하는 하기 화학식 A20으로 표시되는 화합물의 제조방법:
    [반응식 6]
    Figure pat00044

    (상기 반응식에서,
    R8, R9, R10 및 R11은 각각 수소, 하이드록시, 할로젠, C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬 및 C1 내지 C10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 치환기이다.)
  28. 제 27 항에 있어서,
    상기 유기 용매는 다이메틸 설폭사이드, 다이메틸 포름아마이드, 아세톤, 테트라하이드로퓨란, 벤젠, 톨루엔, 에테르, 메탄올, 헥산, 시클로 헥산, 피리딘, 아세트산, 사염화탄소, 클로로포름, 디클로로 메탄, 디클로로 에탄 및 물로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 화합물의 제조방법.
  29. 제 27 항에 있어서,
    상기 염기 촉매는 KOH, NaOH, K2CO3, Na2CO3, KHCO3, NaHCO3 및 NaH로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 화합물의 제조방법.
  30. 제 27 항에 있어서,
    상기 인산염은 K4P2O7, KH2PO4, NaH2PO4 및 Na4P2O7로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 화합물의 제조방법.
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