KR20220117318A - 마크로사이클릭 펩타이드 - Google Patents

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KR20220117318A
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헨리 후투넨
아납 브하타카리
나탈리아 쿨레스카야
리차드 죤슨
마리아 볼코바
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헤란티스 파마 오와이제이
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Abstract

본원의 개시내용은 비통상적 신경영양 인자 분야 및 변성, 만성 또는 진행성 질환 및 장애, 및 병원성 요소로서 ER 스트레스를 갖는 단일유전자 유전성 질환을 치료하는 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 본원의 개시내용은 변형된 펩타이드, 특히, 마크로사이클릭 펩타이드에 관한 것이다. 개시내용은 또한 상기 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 추가로, 본원 개시내용은 또한 약물로서 및 변성, 만성 또는 진행성 질환 및 장애, 및 병원성 요소로서 ER 스트레스를 갖는 단일유전자 유전성 질환을 치료하는데 사용하기 위한 상기 펩타이드 및 약제학적 조성물 및 상기 질환 및 장애를 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

마크로사이클릭 펩타이드
본원의 개시내용은 비통상적 신경영양 인자 및 소포체(ER) 위치한 단백질 분야 및 변성, 만성 또는 진행성 질환 및 장애, 및 병원성 화합물로서 ER 스트레스를 갖는 단일유전자 유전성 질환을 치료하는 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 본원의 개시내용은 마크로사이클릭 펩타이드에 관한 것이다. 개시내용은 또한 상기 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 추가로, 개시내용은 또한 약물로서 및 변성, 만성 또는 진행성 질환 및 장애, 및 병원성 요소로서 ER 스트레스를 갖는 단일유전자 유전성 질환을 치료하는데 사용하기 위한 상기 펩타이드 및 약제학적 조성물 및 상기 질환 및 장애를 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.
신경영양 인자 (NTF)는 뉴런의 생존 및 분화를 촉진시키고 신경보호 및 신경회복 성질을 갖는 성장 인자의 서브그룹이다(문헌참조: Hefti, 1994). NTF는 발달하고 성숙한 뉴런의 성장, 생존 및 분화를 지원하고 이들을 손상과 독소로부터 보호하는 소형 단백질이다. 대뇌 도파민 신경영양성(CDNF)은 가장 가까운 상대적 중뇌성상교세포 유래 신경영양 인자(MANF)와 함께 구조적으로나 기계적으로 다른 성장 인자와 구별되는 비통상적인 NTF의 새로운 계열을 형성한다(문헌참조: Lindholm and Saarma, 2010; Huttunen and Saarma, 2019). CDNF 및 MANF는 중추 신경계에서 뿐만 아니라 비-뉴런 조직에서 발현되는, 각각 161개 및 158개 아미노산의 성숙한 단백질이고 분자량이 대략 18kDa인 소형 단량체 단백질이다. CDNF 및 MANF는 주로 소포체(ER)의 루멘에 국소화된다. 이들은 이들을 ER로 지시하는 N-말단 신호 펩타이드를 함유한다. CDNF 및 MANF 둘다는 또한 C-말단 KDEL (서열번호 37)-유사 ER-체류 신호를 함유하고, 이는 전형적으로 분비될 예정인 성장 인자에서 부재이다. 이들은 BiP/GRP78과 같은 ER 단백질과 상호작용하여, 폴딩되지 않은 단백질 반응 (UPR) 신호전달을 조절하고 ER 스트레스-유도된 세포사로부터 보호한다. CDNF 및 MANF 둘다는 건강한 세포에서 ER 루멘에 축적되고 C-말단 ER-체류 신호의 붕괴는 이들의 분비를 유도한다. 검출가능한 수준의 CDNF 및 MANF는 정상 사람 혈청에서 발견되고, MANF는 또한 뇌척수액(CSF)에서 발견된다. 이들 특징을 기준으로 CDNF와 MANF는 고도로 특이적인 신경영양 인자라기 보다는 일반적인 스트레스 보호 단백질로 여겨진다 (문헌참조: Huttunen and Saarma, 2019). MANF는 또한 카디오미오킨으로 기재되었다(문헌참조: Glembotski, 2011).
CDNF 및 MANF는 현재 파킨슨 질환의 래트 6-OHDA 모델에서 변성 도파민 뉴런의 치료를 위한 가장 효율적인 단백질이다(문헌참조: Lindholm and Saarma, 2010). 인자 둘다는 6-OHDA 유도된 도파민 뉴런의 손실과 독소를 투여하기 전에 적용되는 경우 파킨슨 질환 유사 운동 증상을 예방한다(문헌참조: Lindholm et al., 2007; Voutilainen et al., 2009). 보다 중요하게, 두 인자 중 하나의 병변 후 투여가 파킨슨 질환의 6-OHDA 유도 증상이 이미 광범위하게 영향을 미치는 단계에서 적용될 때 선조체의 정상적인 운동 행동과 도파민성 신경 분포를 효율적으로 회복했다는 것이다(문헌참조: Lindholm et al., 2007; Voutilainen et al., 2011). CDNF는 파킨슨 질환의 마우스 MPTP 모델에서 (문헌참조: Airavaara et al., 2012), 및 신경교 세포주 유래된 신경영양 인자 (GDNF) 보다 더 효율적인 중증의 6-OHDA 모델에서(문헌참조: Airavaara et al., 2012; Voutilainen et al 2011) 도파민 뉴런을 보호하고 복구시킨다. 이들 인자에 대한 뉴런 보호 이면의 기전은 완전히 명확하지 않지만 산화 및 ER 스트레스를 완화하고 아폽토시스 세포 사멸을 억제하는 것을 겨냥한 경로를 활성화시키는 것으로 시사되었다. 당뇨병, 및 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환(AD) 및 근위축성 측삭 경화증(ALS)과 같은 신경변성 질환을 포함하는 많은 병리생리학적 병태는 ER 스트레스와 관련된다. 따라서, CDNF 및 MANF의 효과는 다양한 중추신경계에서 나타났다(문헌참조: WO2009133247; WO2007068803; 및 Airavaara et al, 2009). 면역 및 신경교 세포의 반응 조절을 포함한 비세포 자율 기전은 CDNF 및 MANF의 세포 보호 효과에 기여하는 것으로 나타났다(문헌참조: Sousa-Victor et al, 2018). 구체적으로, CDNF와 MANF는 모든 CNS 질환 및 상해에 대해서는 아닐지라도 대부분의 병태생리학에 관여하는 신경염증을 억제하는 것으로 나타났다(문헌참조: Nadella et al, 2014; Zhao et al, 2013).
CDNF 및 MANF는 약 60% 아미노산 서열 상동성을 공유하지만 이들은 고도로 유사한 3차원 구조를 갖는다. CDNF 및 MANF 둘다는 가요성 루프 영역에 의해 연결된 2개의 독립적으로 폴딩된 도메인으로 구성된다(문헌참조: Lindholm and Saarma, 2010). 2차 구조는 주로 α-나선형이고, N-말단 도메인에는 5개의 α-나선형이 있고 C-말단 도메인에는 3개의 α-나선형이 있다. 3개의 디설파이드 브릿지는 N-말단 도메인을 안정화시키고 CDNF에서 C-말단 CRAC (서열번호 38) 서열, MANF에서 CKGC (서열번호 39)은 내부 디설파이드 브릿지를 형성한다. 상기 CXXC (서열번호 40) 디설파이드 브릿지는 CDNF 및 MANF 둘다에서 발견되고 이들 단백질의 세포보호 활성에 중추 역할을 수행한다.
CDNF는 뇌에서 발현될 뿐만 아니라, 예를 들어, 골격근, 간, 심장, 폐, 췌장, 고환, 침샘 및 장신경계를 포함하는 다수의 다른 조직에서 발현된다(문헌참조: Lindholm et al, 2007). MANF는 뇌에서 발현될 뿐만 아니라 췌장 및 심장과 같은 말초 조직에서 발현된다.
공개 공보 WO 2013/3034805 및 WO 2018/202957에 기재된 것들과 같은 천연 펩타이드는 약제학적 제품으로서 거의 사용될 수 없다.
문헌(WO 2013/3034805 A1)은 MANF 및 CDNF 단편을 기재하고, 서열 CKGC (서열번호 39) 또는 CRAC (서열번호 38)을 포함하는 4 내지 40개 아미노산 길이를 갖는다. 문헌(WO 2018/202957 A1)은 적어도 50개 아미노산의 길이를 갖는 CDNF 단편을 기재한다. 문헌(Hellmann et al., 2011)은 잔기 96 내지 158을 포함하는 MANF의 활성 C-말단 단편 작제물을 기재한다. 문헌(Fletcher and Hughes 2006)은 CRAC (서열번호 38)-함유 뇌-유래된 신경영양성 인자 (BDNF)-유래된 펩타이드를 기재하고 이는 루프 생성을 위해 가공된 시스테인을 갖는다. 따라서, 개선된 대사 안정성 및 분포 성질을 갖는 치료제가 당업계에 여전히 필요하다.
발명의 개요
본 개시내용의 목적은 신규한 변형된 마크로사이클릭 펩타이드를 제공하는 것이다. 본원 개시내용의 또 다른 목적은 상기 신규 펩타이드의 용도를 제공하는 것이다.
본원 개시내용은 특히 마크로사이클릭 펩타이드를 신규하고 진보성 방식으로 활용함으로써 상기 언급된 성질을 갖는 도구를 제공한다.
본원 발명자들은 선형의 본래의 CDNF 및 MANF 펩타이드가 사람 또는 동물에게 투여되는 경우, 특히 비경구로 투여 시 신속한 대사 및 불량한 분포로 인해 불량한 약물 분자임을 발견하였다. 따라서, 선행 기술 분야에 개시된 것들과 같은 천연의 미변형 펩타이드는 약제학적 제품으로서 거의 사용될 수 없다. 본원 발명자들은 CDNF 및 MANF의 세포보호 효과를 주로 수행하지만 비침습성 말초 투여에 매우 적합한, CDNF 및 MANF로부터 유래된 신규 안정화된 펩타이드를 개발하였다. 본원 발명자들은 본 개시내용의 데이터에 의해 나타난 바와 같이, CDNF 및 MANF 펩타이드의 마크로사이클화(macrocyclization)가 세포 보호 활성의 상실 없이 대사 안정성 및 분포 성질을 유의하게 개선함을 발견하였다. 또한, 본 변형된 펩타이드는 선행 기술에 기재된 것들보다 더 짧다.
CDNF/MANF의 생물학적 활성은 단백질의 C-말단 도메인에 위치한다. 본원의 개시내용은 특히 마크로사이클릭 형태로 CDNF 및 MANF의 C-말단 도메인으로부터 유래된 8 내지 32개 아미노산 펩타이드를 기재한다. CXXC(서열번호 40) 모티프 주위의 짧은 선형 옥타펩타이드는 전장 단백질에 필적하는 세포 보호 활성 및 본원에 개시된 바와 같은 시험관내 모델에서 세포막 및 실험적 혈뇌 장벽을 침투하는 능력을 보여주었다.
본원 발명자들은 CXXC(서열번호 40) 모티프 또는 특정 유형의 CXXXC(서열번호 27) 모티프를 갖는 헤드-대-테일 (head-to-tail) 폐환된 CDNF/MANF 마크로사이클릭 펩타이드와 같은 짧은 마크로사이클릭 펩타이드가 예를 들어 대사 안정성, 혈뇌 장벽(BBB) 침투 및 생체내 약동학을 가짐을 처음으로 보여준다. 이들 짧은 및 반-짧은 마크로사이클릭 펩타이드는 병원성 요소로서 ER 스트레스를 갖는 변성, 만성 및/또는 진행성 질환 및 장애 또는 단일 유전자 유전성 질환에 대한 의약 개발에 사용될 수 있다.
본원의 개시내용은 8 내지 32개 아미노산 길이를 갖는 마크로사이클릭 펩타이드, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공하고, 이는 C-X1-X2-X3-C의 아미노산 서열 (서열번호 27)을 포함하고,
상기 서열에서
X1은 R, K, I, G, A 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X2는 부재이거나 G, A, R, K, I 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X3은 A, G 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 마크로사이클릭 펩타이드는 펩타이드의 N-말단이 펩타이드의 C-말단에 연결된 (즉, “헤드-대-테일 연결”) 펩타이드이다. 일부 경우에, 펩타이드는 슈도펩타이드이다. 일부 경우에, 펩타이드는 하기의 성질들 중 적어도 하나 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개)를 갖는다: (i) 상기 펩타이드는 TH-양성 뉴런을 MPP+ 독성으로부터 용량-의존적으로 보호할 수 있거나; (ii) 상기 펩타이드는 TH-양성 뉴런에서 알파-시누클레인 내포물 수를 감소시키거나; (iii) 상기 펩타이드는 이의 선형 대응물과 비교하여 혈장 내 개선된 안정성을 갖거나; (iv) 상기 펩타이드는 이의 선형 대응물과 비교하여 간 세포에서 개선된 안정성을 갖거나; (v) 상기 펩타이드는 이의 선형 대응물과 비교하여 혈뇌 장벽을 통과하는 개선된 능력을 갖는다.
본원 개시내용은 추가로 약물로서 사용하기 위한 상기 마크로사이클릭 펩타이드를 제공한다.
본원 개시내용은 변성, 만성 및/또는 진행성 질환 및 장애, 예를 들어, 신경변성 질환 또는 장애, 또는 병원성 요소로서 ER 스트레스를 갖는 단일유전자 유전성 질환의 치료에 사용하기 위한 상기 마크로사이클릭 펩타이드를 추가로 제공한다.
본원의 개시내용은 추가로 상기 마크로사이클릭 펩타이드 및 하기 중 적어도 하나를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다: 약제학적으로 허용되는 담체, 약제학적으로 허용되는 부형제, 보존제, 안정화제 및/또는 희석제.
본원의 개시내용은 추가로 약물로서 사용하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.
본원 개시내용은 추가로 변성, 만성 및/또는 진행성 질환 및 장애, 예를 들어, 신경변성 질환 또는 장애, 또는 병원성 요소로서 ER 스트레스를 갖는 단일유전자 유전성 질환의 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.
본원 개시내용은 이를 필요로 하는 대상체에서 신경변성 질환 또는 장애, 또는 병원성 요소로서 ER 스트레스를 갖는 단일유전자 유전성 질환과 같은 변성, 만성 또는 진행성 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 추가로 제공하고, 상기 방법은 상기 언급된 마크로사이클릭 펩타이드(들)를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
하기에서 본 발명은 바람직한 구현예에 의해 보다 상세하게 기재된다.
도 1은 연구된 화합물 목록을 보여준다. 화합물 번호, 서열번호, 폐환 계획 및 Cys-Cys 디설파이드 결합을 지적하는 아미노산 서열, 서열의 길이, 변형에 대한 설명 및 단일 동위원소 질량(Da)이 제공된다. 컬럼 5는 MS 스펙트럼에 나타낸 세부적인 하전된 질량 피크를 보여주고, 컬럼 6은 화합물의 단일 동위원소 질량을 제공한다. 동일한 펩타이드의 선형 및 사이클릭 형태 사이의 단일 동위원소 질량에서 ~18 Da(물 분자의 질량)의 차이는 성공적인 헤드-대-테일 폐환을 확증한다.
도 2a-2p는 마크로사이클릭 화합물 2 (서열번호 2), 화합물 4 (서열번호 4), 화합물 6 (서열번호 6), 화합물 8 (서열번호 8), 화합물 10 (서열번호 10), 화합물 12 (서열번호 12), 화합물 14 (서열번호 14), 화합물 24 (서열번호 24) 및 화합물 26 (서열번호 26)의 생물리학적 특징 분석을 보여준다.
도 2a는 상응하는 아미노-말단 (헤드; Val1) 및 카복실-말단 (테일; Glu27) 잔기 사이의 화살표에 의해 폐환 영역을 보여주는 화합물 2(서열번호 2)를 제공한다. 디설파이드 브릿지-형성 시스테인은 막대 표시와 함께 회색으로 나타내고, 상응하게 표지시킨다.
도 2b는 화합물 2(서열번호 2)에 대한 2D 1H NMR TOCSY 아미드 핑거프린트에서 관찰된 아미드 양성자 수의 등고선 플롯을 보여준다. 가로 축은 직접 치수(F2, ppm으로 표시)이고 세로 축은 간접 치수(F1, ppm으로 표시)이다. TOCSY 데이터에서 관찰된 아미드 양성자의 수는 27개 아미노산 길이의 사이클릭 펩타이드와 일치하고, 즉, Val1 아미드 양성자는 N-말단의 예상되는 아미드화와 일치하는 것으로 관찰되고 이는 N-말단 아미드 양성자가 관찰되지 않는 이의 선형 유사체와 반대이다. Val1 및 Val8 양성자는 각각 HN 7.9 ppm 및 8.05에 상응하는 직선에 의해 할당되고 지적된다.
도 2c는 상응하는 아미노-말단 (Val1)과 카복실-말단 (Glu27) 잔기 사이의 화살표에 의해 폐환 영역을 보여주는 화합물 4(서열번호 4)를 제공한다. 디설파이드 브릿지-형성 시스테인은 막대 표시와 함께 회색으로 나타내고, 상응하게 표지시킨다.
도 2d는 화합물 4(서열번호 4)에 대한 2D 1H NMR TOCSY 아미드 핑거프린트(좌측 패널)에서 관찰된 아미드 양성자 수의 등고선 플롯을 보여준다. 가로 축은 직접 치수(F2, ppm으로 표시)이고 세로 축은 간접 치수(F1, ppm으로 표시)이다. TOCSY 데이터에서 관찰된 아미드 양성자의 수는 27개 아미노산 길이의 사이클릭 펩타이드와 일치하고, 즉, Val1 아미드 양성자는 N-말단의 예상되는 아미드화와 일치하는 것으로 관찰되고 이는 N-말단 아미드 양성자가 관찰되지 않는 이의 선형 유사체와 반대이다. 첫번째 (Val1) 및 마지막 (Glu27) 잔기에 대한 1H 화학적 전환은 각각 HN 8.0 ppm 및 8.35에 상응하는 직선에 의해 할당되고 지적된다. 이들 잔기 둘다에 대해, 선행 아미노산 잔기의 아미드 양성자와 알파 양성자 HN(i)-Hα(i_-1)사이의 강한 ROE는 2D 1H ROESY 핑거프린트 영역 (우측 패널)의 확장에서 나타낸 바와 같이 관찰된다. 8.02/4.25 ppm에서 Val1:HN-Glu27:Hα 상관관계의 확립은 펩타이드가 이의 폐환 형태로 존재하고 양성자가 5Å 미만에 의해 분리되어 있음을 강하게 시사한다.
도 2e는 상응하는 아미노-말단 (Met1)과 카복실-말단 (Lys23) 잔기 사이의 화살표에 의해 폐환 영역을 보여주는 화합물 6(서열번호 6)을 제공한다. 디설파이드 브릿지-형성 시스테인은 막대 표시와 함께 회색으로 나타내고, 상응하게 표지시킨다.
도 2f는 화합물 6(서열번호 6)에 대한 2D 1H NMR TOCSY 아미드 핑거프린트(좌측 패널)에서 관찰된 아미드 양성자 수의 등고선 플롯을 보여준다. 가로 축은 직접 치수(F2, ppm으로 표시)이고 세로 축은 간접 치수(F1, ppm으로 표시)이다. TOCSY 데이터에서 관찰된 아미드 양성자의 수는 23개 아미노산 길이의 사이클릭 펩타이드와 일치하고, 즉, Met1 아미드 양성자는 N-말단의 예상되는 아미드화와 일치하는 것으로 관찰되고 이는 N-말단 아미드 양성자가 관찰되지 않는 이의 선형 유사체와 반대이다. Met1 아미드 양성자는 HN 7.98 ppm에 상응하는 직선에 의해 할당되고 지적된다.
도 2g는 상응하는 아미노-말단 (Leu1)과 카복실-말단 (Lys23) 잔기 사이의 화살표에 의해 폐환 영역을 보여주는 화합물 8(서열번호 8)을 제공한다. 디설파이드 브릿지-형성 시스테인은 막대 표시와 함께 회색으로 나타내고, 상응하게 표지시킨다.
도 2h는 화합물 8(서열번호 8)에 대한 2D 1H NMR TOCSY 아미드 핑거프린트(좌측 패널)에서 관찰된 아미드 양성자 수의 등고선 플롯을 보여준다. 가로 축은 직접 치수(F2, ppm으로 표시)이고 세로 축은 간접 치수(F1, ppm으로 표시)이다. TOCSY 데이터에서 관찰된 아미드 양성자의 수는 23개 아미노산 길이의 사이클릭 펩타이드와 일치하고, 즉, 5개 라이신 아미드 양성자는 N-말단의 예상되는 아미드화와 일치하는 것으로 관찰되고 이는 N-말단 Lys1 아미드 양성자가 관찰되지 않는 이의 선형 유사체와 반대이다. 모든 Lys 아미드 양성자에 대한 1H 화학적 전환은 각각 HN 7.51, 8.05, 8.09, 8.11 및 8.21 ppm에 상응하는 직선에 의해 할당되고 지적된다.
도 2i는 상응하는 아미노-말단 (Lys1)과 카복실-말단 (Glu16) 잔기 사이의 화살표에 의해 폐환 영역을 보여주는 화합물 10(서열번호 10)을 제공한다. 디설파이드 브릿지-형성 시스테인은 막대 표시와 함께 회색으로 나타내고, 상응하게 표지시킨다.
도 2j는 화합물 10(서열번호 10)에 대한 2D 1H NMR TOCSY 아미드 핑거프린트(좌측 패널)에서 관찰된 아미드 양성자 수의 등고선 플롯을 보여준다. 가로 축은 직접 치수(F2, ppm으로 표시)이고 세로 축은 간접 치수(F1, ppm으로 표시)이다. TOCSY 데이터에서 관찰된 아미드 양성자의 수는 16개 아미노산 길이의 사이클릭 펩타이드와 일치하고, 즉, 서열 중 모든 아미노산은 하나의 아미드 양성자를 갖고, 이는 N-말단이 산 양성자 (펩타이드 산)을 갖거나 2개의 아미드 양성자 (펩타이드 아미드)가 관찰되지 않는 이의 선형 유사체와 반대이다. 첫번째 (Lys1) 및 마지막 (Glu16) 잔기에 대한 1H 화학적 전환은 각각 HN 8.18 및 8.3 ppm에 상응하게 할당된다. 이들 잔기 둘다에 대해, 선행 아미노산 잔기의 아미드 양성자와 알파 양성자 HN(i)-Hα(i_-1)사이의 강한 ROE는 2D 1H ROESY 핑거프린트 영역 (좌측 패널)의 확장에서 나타낸 바와 같이 관찰된다. 8.19/4.24 ppm에서 Lys1:HN-Glu16:Hα 상관관계의 확립은 펩타이드가 이의 폐환 형태로 존재하고 양성자가 5
Figure pct00001
미만에 의해 분리되어 있음을 강하게 시사한다.
도 2k는 상응하는 아미노-말단 (Trp1)과 카복실-말단 (Thr12) 잔기 사이의 화살표에 의해 폐환 영역을 보여주는 화합물 12(서열번호 12)를 제공한다. 디설파이드 브릿지-형성 시스테인은 막대 표시와 함께 회색으로 나타내고, 상응하게 표지시킨다.
도 2l은 화합물 12(서열번호 12)에 대한 2D 1H NMR TOCSY 아미드 핑거프린트(좌측 패널)에서 관찰된 아미드 양성자 수의 등고선 플롯을 보여준다. 가로 축은 직접 치수(F2, ppm으로 표시)이고 세로 축은 간접 치수(F1, ppm으로 표시)이다. TOCSY 데이터에서 관찰된 아미드 양성자의 수는 12개 아미노산 길이의 사이클릭 펩타이드와 일치하고, 즉, Trp1 아미드 양성자는 N-말단의 예상되는 아미드화와 일치하는 것으로 관찰되고 이는 N-말단 아미드 양성자가 관찰되지 않는 이의 선형 유사체와 반대이다. 첫번째 (Trp1) 및 마지막 (Thr12) 잔기에 대한 1H 화학적 전환은 각각 HN 8.21 ppm 및 8.06에 상응하는 직선에 의해 할당되고 지적된다. 이들 잔기 둘다에 대해, 선행 아미노산 잔기의 아미드 양성자와 알파 양성자 HN(i)-Hα(i_-1)사이의 강한 ROE는 2D 1H ROESY 핑거프린트 영역 (좌측 패널)의 확장에서 나타낸 바와 같이 관찰된다. 8.21/4.30 ppm에서 Trp1:HN-Thr12:Hα 상관관계의 확립은 펩타이드가 이의 폐환 형태로 존재하고 양성자가 5
Figure pct00002
미만에 의해 분리되어 있음을 강하게 시사한다.
도 2m은 상응하는 아미노-말단 (Trp1)과 카복실-말단 (Ser12) 잔기 사이의 화살표에 의해 폐환 영역을 보여주는 화합물 14(서열번호 14)를 제공한다. 디설파이드 브릿지-형성 시스테인은 막대 표시와 함께 회색으로 나타내고, 상응하게 표지시킨다.
도 2n은 화합물 14(서열번호 14)에 대한 2D 1H NMR TOCSY 아미드 핑거프린트(좌측 패널)에서 관찰된 아미드 양성자 수의 등고선 플롯을 보여준다. 가로 축은 직접 치수(F2, ppm으로 표시)이고 세로 축은 간접 치수(F1, ppm으로 표시)이다. TOCSY 데이터에서 관찰된 아미드 양성자의 수는 12개 아미노산 길이의 사이클릭 펩타이드와 일치하고, 즉, Trp1 아미드 양성자는 N-말단의 예상되는 아미드화와 일치하는 것으로 관찰되고 이는 N-말단 아미드 양성자가 관찰되지 않는 이의 선형 유사체와 반대이다. 첫번째 (Trp1) 및 마지막 (Ser12) 잔기에 대한 1H 화학적 전환은 각각 HN 7.98 ppm 및 8.24에 상응하는 직선에 의해 할당되고 지적된다. 이들 잔기 둘다에 대해, 선행 아미노산 잔기의 아미드 양성자와 알파 양성자 HN(i)-Hα(i_-1)사이의 강한 ROE는 2D 1H ROESY 핑거프린트 영역 (우측 패널)의 확장에서 나타낸 바와 같이 관찰된다. 7.99/4.4 ppm에서 Trp1:HN-Ser12:Hα 상관관계의 확립은 펩타이드가 이의 폐환 형태로 존재하고 양성자가 5
Figure pct00003
미만에 의해 분리되어 있음을 강하게 시사한다.
도 2o는 상응하는 아미노-말단 (Trp1)과 카복실-말단 (Thr13) 잔기 사이의 화살표에 의해 폐환 영역을 보여주는 화합물 24(서열번호 24)를 제공한다. 디설파이드 브릿지-형성 시스테인은 막대 표시와 함께 회색으로 나타내고, 상응하게 표지시킨다. 화합물 24(서열 번호 24)에서 CXXC 모티프의 Cys 잔기 사이에 삽입된 글라이신 잔기도 회색 막대 표시로 나타낸다.
도 2p는 화합물 24(서열번호 24)에 대한 2D 1H NMR TOCSY 아미드 핑거프린트(좌측 패널)에서 관찰된 아미드 양성자 수의 등고선 플롯을 보여준다. 가로 축은 직접 치수(F2, ppm으로 표시)이고 세로 축은 간접 치수(F1, ppm으로 표시)이다. TOCSY 데이터에서 관찰된 아미드 양성자의 수는 13개 아미노산 길이의 사이클릭 펩타이드와 일치하고, 즉, Trp1 아미드 양성자는 N-말단의 예상되는 아미드화와 일치하는 것으로 관찰되고 이는 N-말단 아미드 양성자가 관찰되지 않는 이의 선형 유사체와 반대이다. 첫번째 (Trp1) 및 마지막 (Thr13) 잔기에 대한 1H 화학적 전환은 각각 HN 7.96 ppm 및 8.26에 상응하는 직선에 의해 할당되고 지적된다. 이들 잔기 둘다에 대해, 선행 아미노산 잔기의 아미드 양성자와 알파 양성자 HN(i)-Hα(i_-1)사이의 강한 ROE는 2D 1H ROESY 핑거프린트 영역 (우측 패널)의 확장에서 나타낸 바와 같이 관찰된다. 8.26/4.35 ppm에서 Trp1:HN-Thr13:Hα 상관관계의 확립은 펩타이드가 이의 폐환 형태로 존재하고 양성자가 5
Figure pct00004
미만에 의해 분리되어 있음을 강하게 시사한다.
도 2q는 상응하는 아미노-말단 (Trp1)과 카복실-말단 (Ser13) 잔기 사이의 화살표에 의해 폐환 영역을 보여주는 화합물 26(서열번호 26)을 제공한다. 디설파이드 브릿지-형성 시스테인은 막대 표시와 함께 회색으로 나타내고, 상응하게 표지시킨다. 화합물 26 (서열번호 26)에서 삽입된 글라이신 잔기는 또한 회색 막대 표시로 나타낸다.
도 2r은 화합물 26(서열번호 26)에 대한 2D 1H NMR TOCSY 아미드 핑거프린트(좌측 패널)에서 관찰된 아미드 양성자 수의 등고선 플롯을 보여준다. 가로 축은 직접 치수(F2, ppm으로 표시)이고 세로 축은 간접 치수(F1, ppm으로 표시)이다. TOCSY 데이터에서 관찰된 아미드 양성자의 수는 13개 아미노산 길이의 사이클릭 펩타이드와 일치하고, 즉, Trp1 아미드 양성자는 N-말단의 예상되는 아미드화와 일치하는 것으로 관찰되고 이는 N-말단 아미드 양성자가 관찰되지 않는 이의 선형 유사체와 반대이다. 첫번째 (Trp1) 및 마지막 (Ser13) 잔기에 대한 1H 화학적 전환은 각각 HN 8.13 ppm 및 8.1에 상응하는 직선에 의해 할당되고 지적된다. 이들 잔기 둘다에 대해, 선행 아미노산 잔기의 아미드 양성자와 알파 양성자 HN(i)-Hα(i_-1)사이의 강한 ROE는 2D 1H ROESY 핑거프린트 영역 (우측 패널)의 확장에서 나타낸 바와 같이 관찰된다. 8.13/4.45 ppm에서 Trp1:HN-Ser13:Hα 상관관계의 확립은 펩타이드가 이의 폐환 형태로 존재하고 양성자가 5
Figure pct00005
미만에 의해 분리되어 있음을 강하게 시사한다.
도 3a-3l은 MPP+(1-메틸-4-페닐피리디늄)로 손상된 도파민성 TH(티로신 하이드록실라제)-양성 뉴런에 대한 rhCDNF 및 선형 및 마크로사이클릭 화합물(각각 서열번호 1 - 10을 갖는 화합물 1 - 10)의 신경보호 효과 및 TH-양성 뉴런에서 알파-시누클레인 응집에 대한 효과를 보여준다. 데이터는 평균 +/- SEM(n=4-6; MPP+ 음성 대조군 n=122-127이 여러 연구에 걸쳐 수집됨)으로서 대조군 비손상 병태의 퍼센트로서 나타낸다. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001 브라운-포르시테(Brown-Forsythe) 및 웰치 ANOVA 시험과 웰치 상관관계 쌍별 비교 대 MPP+ 음성 대조군과 함께 사후 비대응 t-시험. # p<0.05, ## p<0.01, ### p<0.001, #### p<0.0001 브라운-포르시테(Brown-Forsythe) 및 웰치 ANOVA 시험과 동일한 농도에서 선형 및 상응하는 마크로사이클릭 화합물간의 웰치 상관관계 쌍별 비교.
도 3a는 증가하는 농도의 rhCDNF의 존재하에 MPP+ 손상 후 중뇌 세포의 1차 배양에서 TH 신경돌기 상에 TH 뉴런 수, TH 뉴런의 총 신경돌기 네트워크 및 시냅스의 수를 보여준다. 상부 점선은 손상되지 않은 세포로부터 수득된 파라미터(100%)의 대조군 수준을 나타내고; 하부 점선은 화합물로 추가 처리하지 않고 MPP+로 손상된 세포로부터 수득된 파라미터의 음성 대조군 수준을 나타낸다.
도 3b는 증가하는 농도의 rhCDNF의 존재하에 MPP+ 손상 후 중뇌 세포의 1차 배양물의 TH 뉴런에서 알파-시누클레인 응집을 보여준다. 상부 점선은 시험 화합물을 사용한 추가 처리 없이 MPP+로 손상된 세포에서 알파-시누클레인 응집의 음성 대조군 수준을 나타내고; 하부 점선은 손상되지 않은 세포로부터 수득된 파라미터(100%)의 음성 대조군 수준을 나타낸다.
도 3c는 화합물 1 (서열번호 1) 및 화합물 2 (서열번호 2)의 존재하에 MPP+ 손상 후 중뇌 세포의 1차 배양에서 TH 신경돌기 상에 TH 뉴런의 수, TH 뉴런의 총 신경돌기 네트워크 및 시냅스의 수를 보여준다.
도 3d는 화합물 1 (서열번호 1) 및 화합물 2(서열번호 2)의 존재하에 MPP+ 손상 후 중뇌 세포의 1차 배양물의 TH 뉴런에서 알파-시누클레인 응집을 보여준다.
도 3e는 화합물 3 (서열번호 3) 및 화합물 4 (서열번호 4)의 존재하에 MPP+ 손상 후 중뇌 세포의 1차 배양에서 TH 신경돌기 상에 TH 뉴런의 수, TH 뉴런의 총 신경돌기 네트워크 및 시냅스의 수를 보여준다.
도 3f는 화합물 3(서열번호 3) 및 화합물 4(서열번호 4)의 존재하에 MPP+ 손상 후 중뇌 세포의 1차 배양물의 TH 뉴런에서 알파-시누클레인 응집을 보여준다.
도 3g는 화합물 5 (서열번호 5) 및 화합물 6 (서열번호 6)의 존재하에 MPP+ 손상 후 중뇌 세포의 1차 배양에서 TH 신경돌기 상에 TH 뉴런의 수, TH 뉴런의 총 신경돌기 네트워크 및 시냅스의 수를 보여준다.
도 3h는 화합물 5 (서열번호 5) 및 화합물 6(서열번호 6)의 존재하에 MPP+ 손상 후 중뇌 세포의 1차 배양물의 TH 뉴런에서 알파-시누클레인 응집을 보여준다.
도 3i는 화합물 7 (서열번호 7) 및 화합물 8 (서열번호 8)의 존재하에 MPP+ 손상 후 중뇌 세포의 1차 배양에서 TH 신경돌기 상에 TH 뉴런의 수, TH 뉴런의 총 신경돌기 네트워크 및 시냅스의 수를 보여준다.
도 3j는 화합물 7(서열번호 7) 및 화합물 8(서열번호 8)의 존재하에 MPP+ 손상 후 중뇌 세포의 1차 배양물의 TH 뉴런에서 알파-시누클레인 응집을 보여준다.
도 3k는 화합물 9 (서열번호 9) 및 화합물 10 (서열번호 10)의 존재하에 MPP+ 손상 후 중뇌 세포의 1차 배양에서 TH 신경돌기 상에 TH 뉴런의 수, TH 뉴런의 총 신경돌기 네트워크 및 시냅스의 수를 보여준다.
도 3l은 화합물 9 (서열번호 9) 및 화합물 10(서열번호 10)의 존재하에 MPP+ 손상 후 중뇌 세포의 1차 배양물의 TH 뉴런에서 알파-시누클레인 응집을 보여준다.
도 4a-4l은 MPP+로 손상된 도파민성 TH-양성 뉴런에 대한 선형 및 마크로사이클릭 화합물(각각 서열번호 11 - 26을 갖는 화합물 11 - 26)의 신경보호 효과 및 TH-양성 뉴런에서 알파-시누클레인 응집에 대한 효과를 보여준다. 데이터는 평균 +/- SEM(n=4-6; MPP+ 음성 대조군 n=122-127이 여러 연구에 걸쳐 수집됨)으로서 대조군 비손상 병태의 퍼센트로서 나타낸다. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001 브라운-포르시테(Brown-Forsythe) 및 웰치 ANOVA 시험과 웰치 상관관계 쌍별 비교 대 MPP+ 음성 대조군과 함께 사후 비대응 t-시험. # p<0.05, ## p<0.01, ### p<0.001, #### p<0.0001 브라운-포르시테(Brown-Forsythe) 및 웰치 ANOVA 시험과 동일한 농도에서 선형 및 상응하는 마크로사이클릭 화합물간의 웰치 상관관계 쌍별 비교.
도 4a는 화합물 11 (서열번호 11) 및 화합물 12 (서열번호 12)의 존재하에 MPP+ 손상 후 중뇌 세포의 1차 배양에서 TH 신경돌기 상에 TH 뉴런의 수, TH 뉴런의 총 신경돌기 네트워크 및 시냅스의 수를 보여준다. 상부 점선은 손상되지 않은 세포로부터 수득된 파라미터(100%)의 대조군 수준을 나타내고; 하부 점선은 화합물로 추가 처리하지 않고 MPP+로 손상된 세포로부터 수득된 파라미터의 음성 대조군 수준을 나타낸다.
도 4b는 화합물 11(서열번호 11) 및 화합물 12(서열번호 12)의 존재하에 MPP+ 손상 후 중뇌 세포의 1차 배양물의 TH 뉴런에서 알파-시누클레인 응집을 보여준다. 상부 점선은 시험 화합물을 사용한 추가 처리 없이 MPP+로 손상된 세포에서 알파-시누클레인 응집의 음성 대조군 수준을 나타내고; 하부 점선은 손상되지 않은 세포로부터 수득된 파라미터(100%)의 음성 대조군 수준을 나타낸다.
도 4c는 화합물 13(서열번호 13) 및 화합물 14(서열번호 14)의 존재하에 MPP+ 손상 후 중뇌 세포의 1차 배양물에서 TH 뉴런의 수를 보여준다.
도 4d는 화합물 13 (서열번호 13) 및 화합물 14(서열번호 14)의 존재하에 MPP+ 손상 후 중뇌 세포의 1차 배양물의 TH 뉴런에서 알파-시누클레인 응집을 보여준다.
도 4e는 화합물 15 (서열번호 15), 화합물 16 (서열번호 16), 화합물 17 (서열번호 17) 및 화합물 18 (서열번호 18)의 존재하에 MPP+ 손상 후 중뇌 세포의 1차 배양에서 TH 신경돌기 상에 TH 뉴런의 수, TH 뉴런의 총 신경돌기 네트워크 및 시냅스의 수를 보여준다.
도 4f는 화합물 15(서열번호 15), 화합물 16 (서열번호 16), 화합물 17 (서열번호 17) 및 화합물 18(서열번호 18)의 존재하에 MPP+ 손상 후 중뇌 세포의 1차 배양물의 TH 뉴런에서 알파-시누클레인 응집을 보여준다.
도 4g는 화합물 19(서열번호 19), 화합물 20 (서열번호 20), 화합물 21 (서열번호 21) 및 화합물 22(서열번호 22)의 존재하에 MPP+ 손상 후 중뇌 세포의 1차 배양물에서 TH 뉴런의 수를 보여준다.
도 4h는 화합물 19(서열번호 19), 화합물 20 (서열번호 20), 화합물 21 (서열번호 21) 및 화합물 22(서열번호 22)의 존재하에 MPP+ 손상 후 중뇌 세포의 1차 배양물의 TH 뉴런에서 알파-시누클레인 응집을 보여준다.
도 4i는 화합물 23 (서열번호 23) 및 화합물 24 (서열번호 24)의 존재하에 MPP+ 손상 후 중뇌 세포의 1차 배양에서 TH 신경돌기 상에 TH 뉴런의 수, TH 뉴런의 총 신경돌기 네트워크 및 시냅스의 수를 보여준다.
도 4j는 화합물 23(서열번호 23) 및 화합물 24(서열번호 24)의 존재하에 MPP+ 손상 후 중뇌 세포의 1차 배양물의 TH 뉴런에서 알파-시누클레인 응집을 보여준다.
도 4k는 화합물 25 (서열번호 25) 및 화합물 26 (서열번호 26)의 존재하에 MPP+ 손상 후 중뇌 세포의 1차 배양에서 TH 신경돌기 상에 TH 뉴런의 수, TH 뉴런의 총 신경돌기 네트워크 및 시냅스의 수를 보여준다.
도 4l은 화합물 25 (서열번호 25) 및 화합물 26(서열번호 26)의 존재하에 MPP+ 손상 후 중뇌 세포의 1차 배양물의 TH 뉴런에서 알파-시누클레인 응집을 보여준다.
도 5a는 화합물 12와 복합체화된 GRP78의 뉴클레오타이드-결합 도메인(GRP78-NBD)의 컴퓨터 분자 모델을 보여준다. GRP78-NBD는 카툰 트레이스와 함께 반투명 표면 모델로 나타낸다. 화합물 12 (서열번호 12)에서 Cys-Cys 결합은 스틱으로 나타낸다.
도 5b는 표로 나타내는 방식으로 대표적인 세트의 화합물의 GRP78-NB에 대한 결합 친화성(Kd, μM)을 보여준다. 결합 친화성은 마이크로스케일 열영동 기반 무세포 검정에 의해 수득된다.
도 5c는 언폴딩된 단백질 반응 (UPR) 경로 신호전달 활성에 대한 화합물 10 (서열번호 10) 및 14 (서열번호 14)의 신경보호 활성의 의존성을 보여준다. GSK2606414를 사용하여 PERK 신호전달을 억제하고 KIRA6을 사용하여 IRE1 알파 신호 전달을 억제하였다. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001 일원 ANOVA 시험과 쌍별 비교 대 MPP+ 음성 대조군에 대한 사후 피셔 LSD 시험. # p<0.05, ## p<0.01, ### p<0.001, #### p<0.0001 일원 ANOVA 시험과 단독의 화합물 및 UPR 신호 억제제와의 조합의 효과 간에 쌍별 비교를 위한 사후 피셔 LSD 시험.
도 6a-6b는 래트 (각각 서열번호 1-14 및 23-26을 갖는 화합물 1 -14 및 화합물 23-26) 및 사람 혈장(각각 서열번호 1 - 8, 11 - 14, 및 23-26을 갖는 화합물 1-8, 11-14 및 화합물 23-26)에서 선형 및 마크로사이클릭 화합물의 시험관내 대사 안정성을 보여준다.
도 6a는 래트 혈장에서 화합물 소실을 기반으로 계산된 반감기를 보여준다.
도 6b는 사람 혈장에서 화합물 소실을 기반으로 계산된 반감기를 보여준다. 컬럼 위의 아크(Ark)와 숫자는 상응하는 선형 화합물의 퍼센트로서 마크로사이클릭 화합물의 반감기 변화를 반영한다. 789 min에서 계산된 최대 반감기는 실험 컷오프 시간 제한을 반영한다.
도 7a-7b는 래트 (각각 서열번호 1-14 및 23-26을 갖는 화합물 1 -14 및 화합물 23-26) 및 사람 간세포(각각 서열번호 1 - 8, 11 - 14, 및 23-26을 갖는 화합물 1-8, 11-14 및 화합물 23-26)에서 선형 및 마크로사이클릭 화합물의 시험관내 대사 안정성을 보여준다.
도 7a는 래트 간 간세포에서 화합물 소실을 기반으로 계산된 반감기를 보여준다. 도 7b는 사람 간세포에서 화합물 소실을 기반으로 계산된 반감기를 보여준다. 컬럼 위의 아크(Ark)와 숫자는 상응하는 선형 화합물의 퍼센트로서 간세포 내 마크로사이클릭 화합물의 반감기 변화를 반영한다. 395 min에서 계산된 최대 반감기는 실험 컷오프 시간 제한을 반영한다.
도 8은 혈뇌 장벽의 3D 시험관내 모델을 통해 선형 및 마크로사이클릭 화합물 (각각 서열번호 1-8, 11-14 및 23-26을 갖는 화합물 1 - 8, 11 - 14 및 화합물 23-26)의 투과를 보여준다. 화합물의 양은 본래에 적용된 화합물 농도의 퍼센트로서 표현되는 인공 혈뇌 장벽을 통과하였다. 데이터는 평균 +/- SEM (n=3-4) * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001, n.s. 유의적이지 않음, 브라운-포르시테(Brown-Forsythe) 및 웰치 ANOVA 시험과 선형 및 상응하는 마크로사이클릭 화합물간의 웰치 상관관계 쌍별 비교.
도 9a는 용량 5 mg/kg에서 래트로의 정맥내 투여 후 2 min, 5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 2 h 및 4 h에서 측정된 마크로사이클릭 2, 10 및 14 (서열번호 2, 10 및 14) 및 선형 화합물 3 및 9 (서열번호 3 및 9)의 혈장 농도를 보여준다. 데이터는 평균 +/- SEM (n=3)으로서 나타낸다. 도 9b는 10 mg/kg 정맥내 볼러스 주사 후 화합물 14 (서열번호 14) 의 뇌 간질 유체 (ISF; 선조체) 분포 동력학을 보여준다. ISF 농도는 미세투석 필터 회수-%에 의해 정규화되었다(시험관 내 실험에 의해 결정됨). 화합물은 LC-MS/MS를 사용하여 ISF 및 혈장으로부터 검출하였다.
도 10은 사람 CDNF 및 MANF C-말단 도메인 (61-63 aa)의 쌍형성 정렬을 보여준다. 상기 정렬은 하기 Genbank-구제 서열을 사용하여 수행하였다: 사람 CDNF 승인 # NP_001025125.2에 대해 및 사람 MANF 승인 # NP_006001.5에 대해. CXXC 모티프는 지정된 회색 배경이고 3개 α-나선형의 위치를 나타낸다.
도 11은 10개의 상이한 종(각각 서열 번호 53-72)로부터의 CDNF 및 MANF(61-63 aa)의 C-말단 도메인의 ClustalW 다중 서열 정렬을 보여준다. Genbank 승인 번호는 서열 정렬에서 나타낸다. CXXC 모티프는 지정된 회색 배경이고 3개 α-나선형의 위치를 나타낸다. 이들 대표적인 서열(CDNF 및 MANF 둘다에서) 사이에 보존된 잔기는 굵게 나타낸다. 서열 정렬 아래에, 각각의 위치 당 대표적인 10개 종에서 발견되는 천연 변이체를 나타낸다. 서열 및 종의 제공된 목록을 사용하여 보존되고 가변적 위치를 동정하고 단지 제한된 변형이 대부분의 비-필수 아미노산 잔기에 대해 가능함을 보여준다.
서열 목록
서열번호 1 VDLRKMRVAELKQILHSWGEECRACAE
서열번호 2 VDLRKMRVAELKQILHSWGEECRACAE, 헤드-대-테일 사이클릭
서열번호 3 VDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAE
서열번호 4 VDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAE, 헤드-대-테일 사이클릭
서열번호 5 MRVAELKQILHSWGEECRACAEK
서열번호 6 MRVAELKQILHSWGEECRACAEK, 헤드-대-테일 사이클릭
서열번호 7 LRVKELKKILDDWGETCKGCAEK
서열번호 8 LRVKELKKILDDWGETCKGCAEK, 헤드-대-테일 사이클릭
서열번호 9 KSILDDWGETCKGCAE
서열번호 10 KSILDDWGETCKGCAE, 헤드-대-테일 사이클릭
서열번호 11 WGEECRACAEKT
서열번호 12 WGEECRACAEKT, 헤드-대-테일 사이클릭
서열번호 13 WGETCKGCAEKS
서열번호 14 WGETCKGCAEKS, 헤드-대-테일 사이클릭
서열번호 15 GEECRACAEKT
서열번호 16 GEECRGACAEKT
서열번호 17 GEECRAACAEKT
서열번호 18 GEECRSACAEKT
서열번호 19 GETCKGCAEKS
서열번호 20 GETCKGGCAEKS
서열번호 21 GETCKAGCAEKS
서열번호 22 GETCKSGCAEKS
서열번호 23 WGEECRGACAEKT
서열번호 24 WGEECRGACAEKT, 헤드-대-테일 사이클릭
서열번호 25 WGETCKGGCAEKS
서열번호 26 WGETCKGGCAEKS, 헤드-대-테일 사이클릭
서열번호 27 C-X1-X2-X3-C
서열번호 28 E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E
서열번호 29 X5-X6-X7-X8-E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E-X9-X10-X11
서열번호 30 X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-V-X24-E-L-K-X25-X26-L- X5 X6-X7-X8-E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E-X9-X10-X11
서열번호 31 RVAELKQILHSWGEECRACAEKTDYVNLIQELAPKYA, 본래의 사람 CDNF 펩타이드
서열번호 32 RVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYA, 본래의 사람 MANF 펩타이드
서열번호 33 X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-V-X24-E-L-K-X25-X26-L-X5-X6-X7-X8-E- X4-C-X1-X2-X3-C-A-E-X9-X10-X11
서열번호 34 X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-V-X24-E-L-K-X25-X26-L-X5-X6-X7- X8-E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E-X9-X10
서열번호 35 X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-V-X24-E-L-K-X25-X26-L-X5-X6- X7-X8-E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E-X9
서열번호 36 X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-V-X24-E-L-K-X25-X26-L-X5- X6-X7-X8-E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E
서열번호 37 KDEL
서열번호 38 CRAC
서열번호 39 CKGC
서열번호 40 CXXC
서열번호 41 ETCKGCAE
서열번호 42 TCKGCA
서열번호 43 MWCASPVAVV AFCAGLLVSH PVLTQGQEAG GRPGADCEVC KEFLNRFYKS LIDRGVNFSL DTIEKELISF CLDTKGKENR LCYYLGATKD AATKILSEVT RPMSVHMPAM KICEKLKKLD SQICELKYEK TLDLASVDLR KMRVAELKQI LHSWGEECRA CAEKTDYVNL IQELAPKYAA THPKTEL, 전징 CDNF (NCBI 참조 서열: NP_001025125.2)
서열번호 44 MRRMWATQGL AVALALSVLP GSRALRPGDC EVCISYLGRF YQDLKDRDVT FSPATIENEL IKFCREARGK ENRLCYYIGA TDDAATKIIN EVSKPLAHHI PVEKICEKLK KKDSQICELK YDKQIDLSTV DLKKLRVKEL KKILDDWGET CKGCAEKSDY IRKINELMPK YAPKAASART DL, 전장 MANF (NCBI 참조 서열: NP_006001.5)
서열번호 45 TLDLASVDLRKMRVAELKQILHSWGEECRACAEKTDYVNLIQELAPKYA (49 aa CDNF)
서열번호 46 RVAELKQILHSWGEECRACAEKTDYVNLIQELAPKYA (37 aa CDNF)
서열번호 47 TLDLASVDLRKMRVAELKQILHSWGEECRACAEKT (35 aa CDNF)
서열번호 48 LASVDLRKMRVAELKQILHSWGEECRACAEKT (32 CDNF)
서열번호 49 QIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYA (49 aa MANF)
서열번호 50 RVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYA (37 aa MANF)
서열번호 51 QIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKS (35 aa MANF)
서열번호 52 LSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKS (32 aa MANF)
서열번호 53 KYEKTLDLASVDLRKMRVAELKQILHSWGEECRACAEKTDYVNLIQELAPKYA ATHPKTEL, 사람 CDNF (NP_001025125.2)
서열번호 54 KYEKKLDLASVDLLKMRVAELKQILNSWGEECRACAEKSDYVNLIKELAPKYA AMHPKTEL, 말 CDNF (XP_001498617.2)
서열번호 55 KYEKKLDLASVDLSKMRVAELKQILHGWGEECRACAEKTDYVNLIKELAPKYA ATHPQTEL, 들소 CDNF (XP_010858254.1)
서열번호 56 KYEKKLDLASVDLSKMRVAELQILYSWGEECRACAEKTDYVNLIKELAPKYTE TPPQTEL, 돼지 CDNF (XP_003130787.1)
서열번호 57 KYEKKLDLASVDLSKMRVAELKQILHSWGEECIACAEKTDYVNLITELAPKYAA AHPKTEL, 개 CDNF (XP_848954.2)
서열번호 58 KYGKKLDLASVDLWKMRVAELKQILQRWGEECRACAEKSDYVNLIRELAPKY VEIYPQTEL, 마우스 CDNF (NP_808315.1)
서열번호 59 NYEKKLDLASVDLWKMRDAELKQILHSWGEECRACAEKNDYVNLIKELAPKY VEIHPQIEL, 햄스터 CDNF (XP_027261009.1)
서열번호 60 KYERKLDLTSVDLSKMRVAELRKILDSWGEVCKACIEKTEFVNLIKELAPKYA PPNSRADL, 악어 CDNF (XP_019343086.1)
서열번호 61 KYEKKLDLASVDLSKMRVAELKQILYSWGEECRACVEKTDYVNLIKELAPKYT ATYPKTEL, 돌고래 CDNF (XP_026977721.1)
서열번호 62 RYERLVLDWSTDALSKMRALELKRVLASWGEECRACLEKSEFIALIQEVAPKH SASEHRAHTEEF, 제브라피시 CDNF (NP_001116753.1)
서열번호 63 KYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAP KAASARTDL, 사람 MANF (NP_006001.5)
서열번호 64 KYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAP KAASSRTDL, 말 MANF (NP_001184244.1)
서열번호 65 KYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAP KAASSRTDL, 들소 MANF (XP_010850093.1)
서열번호 66 KYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAP KAASSRTDL, 돼지 MANF (NP_001231584.1)
서열번호 67 KYDKQIDLRTVDLKKLRVRELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAP KAASSRTDL, 개 MANF (XP_003639808.2)
서열번호 68 KYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGEMCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAP KAASARTDL, 마우스 MANF (NP_083379.2)
서열번호 69 KYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGEMCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAP KAASARTDL, 햄스터 MANF (RLQ67668)
서열번호 70 KYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAP KAASSRTDL, 악어 MANF (XP_014455597.1)
서열번호 71 KYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAP KAASSRTDL, 돌고래 MANF (XP_026976745.1)
서열번호 72 KYDKQVDLSSVDLKKLKVKDLKKILEEWGESCKGCVEKSDFIRKINELMPKYA PSAAKARTDL, 제브라피시 MANF (NP_001070097.1)
"변형된 펩타이드" 용어는 변형된 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 펩타이드 변형 또는 합성 옵션은 예를 들어, 마크로사이클릭 펩타이드, 펩타이드모사체, N-말단 변형, C-말단 변형, 동위원소 표지된 펩타이드, 비오티닐화된 및 태그된 펩타이드, 형광 염료 표지된 펩타이드, 펩타이드 이량체, 해독 후 변형, 내부적으로 켄칭된 /FRET 펩타이드, 링커/스페이서/PEG화, 펩타이드 풀링, 단백질 접합, 면역원성 펩타이드 및 비천연적으로 암호화된 아미노산의 혼입을 포함한다. “비-천연적으로 암호화된 아미노산”은 20개 통상의 아미노산 또는 피롤라이신 또는 셀레노시스테인 중 하나가 아닌 아미노산을 지칭한다. "비-천연적으로 암호화된 아미노산"이라는 용어와 동의어로 사용될 수 있는 다른 용어는 "비-천연 아미노산", "비천연 아미노산", "비-천연적으로-존재하는 아미노산" 및 다양한 하이픈 연결 및 비-하이픈 연결 버전이다. 용어 "비-천연적으로 암호화된 아미노산"은 또한 [천연적으로 암호화된 아미노산(20개의 통상의 아미노산 또는 피롤라이신 및 셀레노시스테인을 포함하나 이에 제한되지 않음)의 변형(예를 들어, 해독 후 변형)에 의해 발생하지만 그 자체는 해독 복합체에 의해 성장하는 폴리펩타이드 쇄에 천연적으로 통합되지 않는 아미노산]을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 상기 비-천연적으로-존재하는 아미노산의 예는 N-아세틸글루코사미닐-L-세린, N-아세틸글루코사미닐-L-트레오닌, 및 O-포스포티로신을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 “마크로사이클릭 펩타이드”는 사이클릭 환 구조를 갖는 폴리펩타이드 쇄를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, CX1X2X3C 모티프에서 2개의 시스테인 잔기가 디설파이드 브릿지 형태로 존재하는 경우, 마크로사이클릭 펩타이드는 디설파이드 브릿지에 의해 형성되는 환 구조에 추가로 환 구조를 포함한다. 특정 구현예에서, 마크로사이클릭 펩타이드는 5개 초과의 아미노산 잔기에 의해 형성되는 환 구조를 포함한다. 환 구조는 N-말단-대-C-말단 (헤드-대-테일), 헤드-대-측-쇄, 측-쇄-대-테일, 및 측-쇄-대-측-쇄 연결을 포함하는 연결을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 출원은 헤드-대-테일 연결을 갖는 펩타이드를 제공한다. 연결은 펩타이드의 하나의 아미노산을 펩타이드의 또 다른 아미노산에 연결함으로써 형성될 수 있고(예를 들어, 말단-대-말단, 측-쇄-대-말단) 아미드 결합 또는 락톤, 에테르, 티오에테르, 디설파이드 등과 같은 화학적으로 안정한 다른 결합을 갖는다. 하나의 구현예에서, 바이 및 모노사이클릭 펩타이드는 2개의 시스테인 사이의 디설파이드 결합을 통해 폐환될 수 있다. 폐환을 위한 옵션은 예를 들어, 다음을 포함한다: Cys-Cys (하나의 펩타이드에서 최대 4개의 디설파이드 결합, 부위-특이적 또는 열역학적 폐환), 아미드를 통해 폐환된 펩타이드(헤드-대-테일 또는 측-쇄-대-측-쇄), 티오에테르 (Cys-브로모아세테이트).
용어 “슈도펩타이드”는 천연 펩타이드 또는 단백질에 존재하지 않는 아미노산, 특히 폴리펩타이드 쇄에 도입되는 아미노산의 아미드를 지칭한다. 슈도펩타이드 또는 아미노 결합 대용물은 골격-변형된 펩타이드를 기재하기 위해 사용될 수 있는 다양한 용어 중에 하나이다. 이들 펩타이드의 합성 유사체는 다양한 잠재적 용도를 가지고 있지만, 이러한 분야에서 확장된 관심의 대부분은 생물학적 효능이 증진된 대사적으로 안정화되고 아마도 경구 활성인 펩타이드 호르몬 유사체 또는 효소 억제제를 개발할 가능성에 초점을 두고 있다. 상기 용어는 구체적으로 당업자에게 공지된 펩타이드 골격 변형(즉, 아미드 결합 모사체)를 포함한다. 상기 변형은 아미드 질소, α-탄소, 아미드 카보닐의 변형, 아미드 결합의 완전한 대체, 연장, 결실 또는 골격 가교연결을 포함한다. 여러 펩타이드 골격 변형은 공지되어 있고, ψ[CH2S], ψ[CH2NH], ψ[CSNH2], ψ[NHCO], ψ[COCH2], 및 ψ[(E) 또는 (Z) CH=CH]을 포함한다. 상기 사용된 명명법에서, ψ는 아미드 결합의 부재를 지적한다. 아미드 그룹을 대체하는 구조는 괄호 안에 특정된다.
본원에 사용된 바와 같이, 2개의 실체가 서로 “접합되는” 경우, 이들은 직접적이거나 간접적인 공유 또는 비-공유 상호작용에 의해 연결된다. 특정 양상에서, 결합은 공유이다. 다른 양상에서, 결합은 비-공유이다. 비-공유 상호작용은 수소 결합, 반 데르 발스 상호작용, 소수성 상호작용, 자기 상호 작용, 정전기 상호작용 등을 포함한다. 간접적인 공유 상호작용은 2개의 실체가 임의로 링커 그룹을 통해 공유적으로 연결되는 경우이다. “접합”은 본원에서 펩타이드가 혈장 반감기를 연장하기 위해 사용되는 검출가능한 화학적 또는 생화학적 모이어티, 또는 PEG 또는 다른 모이어티에 접합되거나 커플링됨을 의미한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 하나 이상의 폴리펩타이드는 예를 들어, 캐리어 단백질에 접합될 수 있다. 상기 접합된 조성물은 1가 또는 다가일 수 있다. 예를 들어, 접합된 조성물은 본원에서 캐리어 단백질에 접합되는 하나의 펩타이드를 포함할 수 있다. 대안적으로, 접합된 조성물은 본원에서 캐리어에 접합된 것으로 기재된 2개 이상의 펩타이드를 포함할 수 있다.
“혈뇌 장벽” 또는 “BBB”는 순환 혈액을 뇌로부터 및 중추 신경계에서 세포외 유체로부터 분리하는 고도의 선택적 반투과성 막 장벽이다. BBB는 모세혈관 벽의 내피세포, 모세혈관을 감싸고 있는 성상교세포 말단-피트(end-feet), 및 모세혈관 기저막에 매립된 혈관주위세포에 의해 형성된다. 상기 시스템은 신경 기능에 중요한 글루코스, 물 및 아미노산과 같은 분자의 선택적 수송뿐만 아니라 수동 확산에 의한 일부 분자의 통과를 허용한다. 단백질과 같은 대형 분자는 전형적으로 BBB를 통과할 수 없다. 그러나, 일부 펩타이드는 다양한 기전을 통해 BBB를 통과할 수 있고, 뇌 혈관 내피 세포 표면에 존재하는 수송체 단백질에 대한 특정 인지 모티프를 포함하는 일부 단백질은 BBB를 통해 수송될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "약제학적으로 허용되는 담체"는 사람에게 투여하기 위해 적합한 약제와 같은 약제를 제형화하는데 사용하기 위해 허용되는, 하나 이상의 용매, 완충제, 용액, 분산 매질, 코팅, 항세균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함할 수 있다. 약제학적 활성 물질에 대한 상기 매질 및 제제의 사용은 당업계에 널리 공지되어 있다. 보충 활성 성분은 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
CDNF 및 MANF는 약 60% 아미노산 서열 상동성(도 10 및 11)을 공유하지만 이들은 고도로 유사한 3차원 구조를 갖는다. CDNF 및 MANF 둘다는 가요성 루프 영역에 의해 연결된 2개의 독립적으로 폴딩된 도메인으로 구성된다. 2차 구조는 주로 α-나선형이고, 5개의 α-나선형이 N-말단 도메인에 있고 3개의 α-나선형이 C-말단 도메인에 있다. 3개의 디설파이드 브릿지는 N-말단 도메인을 안정화시키고 CDNF에서 C-말단 CRAC (서열번호 38) 서열, MANF에서 CKGC (서열번호 39)은 내부 디설파이드 브릿지를 형성한다. 상기 CXXC (서열번호 40) 디설파이드 브릿지는 CDNF 및 MANF 둘다에서 발견된다. CXXC (서열번호 40) 모티프는 MANF 및 CDNF의 신경보호 활성을 위해 이롭다. 그러나 여기에 제공된 데이터는 CXXC(서열번호 40) 모티프가 소형 아미노산(예를 들어, 글라이신 및 세린)의 추가와 같은 일부 변형을 수용할 수 있음을 보여주고, 즉, 특정 유형의 CXXXC 모티프도 사용될 수 있다. 일부 양상에서, CDNF는 NP_001025125.2 (서열번호 43)로부터 유래된 서열을 갖는다. 일부 양상에서, MANF는 NP_006001.5 (서열번호 44)로부터 유래된 서열을 갖는다.
MANF 및 CDNF 펩타이드에서 유래된 천연적으로 존재하는 대립유전자 변이체에 추가로, 암호화된 MANF/CDNF 펩타이드의 아미노산 서열에 변경을 초래하는 MANF/CDNF 서열로의 돌연변이에 의해 변화가 도입될 수 있다. "비-필수" 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 유도하는 뉴클레오타이드 치환은 MANF/CDNF 펩타이드의 서열에서 이루어질 수 있다. 하나 이상의 "비-필수" 치환을 포함하는 MANF/CDNF 펩타이드 또는 이의 기능적 단편은 본원에 기재된 야생형 MANF/CDNF 펩티드와 등가물로 나타낼 수 있다.
각각의 아미노산은 천연 또는 비-천연 아미노산일 수 있다. "비-천연 아미노산"이라는 용어는 천연 아미노산의 구조 및 반응성을 모방하여 천연 아미노산과 유사한 구조를 갖는다는 점에서 천연 아미노산의 동족체인 유기 화합물을 지칭한다. 비-천연 아미노산은 20개의 공통된 천연적으로 존재하는 아미노산 또는 희귀 천연 아미노산 셀레노시스테인 또는 피롤리신 중 하나가 아닌 변형된 아미노산 및/또는 아미노산 유사체일 수 있다.
적합한 아미노산의 예는 알라닌, 알로이소류신, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 사이클로헥실알라닌, 2,3-디아미노프로피온산, 4-플루오로페닐알라닌, 글루타민, 글루탐산, 글라이신, 히스티딘, 호모프롤린, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 나프틸알라닌, 노르류신, 페닐알라닌, 페닐글라이신, 피페콜산, 프롤린, 피로글루탐산, 사르코신, 세린, 셀레노시스테인, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린, 유도체 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용되는" 이란, 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없이, 합리적인 유익/위험 비율에 적합한, 사람 및 동물의 조직과의 접촉에 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭한다.
"약제학적으로 허용되는 염"은 무독성이거나, 생물학적으로 관용성이거나, 그렇지 않으면 대상체에 투여하기에 생물학적으로 적합한, 본원에 나타낸 화합물의 유리 산 또는 염기의 염을 의미하는 것으로 의도된다. 일반적으로 문헌(S.M. Berge, et al., “Pharmaceutical Salts,” J. Pharm. Sci., 1977, 66, 1-19)을 참조한다. 바람직한 약제학적으로 허용되는 염은 약리학적으로 효과적이고, 과도한 독성, 자극 또는 알레르기 반응 없이 대상체의 조직과의 접촉을 위해 적합한 것들이다. 본원에 기재된 화합물은 충분히 산성 그룹, 충분히 염기성 그룹, 두 가지 기능성 그룹의 유형 또는 각 유형 중 하나 초과를 가질 수 있고, 따라서 다수의 무기 또는 유기 염기, 무기 및 유기 산과 반응하여 약제학적으로 허용되는 염을 형성할 수 있다.
아민과 같은 염기성 그룹을 함유하는 본원에 기재된 화합물의 경우, 약제학적으로 허용되는 염은 당업계에서 가용한 임의의 적합한 방법, 예를 들어 염산, 브롬화수소산, 황산, 설팜산, 질산, 붕산, 인산 등과 같은 무기산으로, 또는 아세트산, 페닐아세트산, 프로피온산, 스테아르산, 락트산, 아스코르브산, 말레산, 하이드록시말레산, 이세티온산, 숙신산, 발레르산, 푸마르산, 말론산, 피루브산, 옥살산, 글리콜산, 살리실산, 올레산, 팔미트산, 라우르산, 글루쿠론산 또는 갈락투론산과 같은 피라노시딜산, 만델산, 시트르산 또는 타르타르산과 같은 알파-하이드록시산, 아스파르트산 또는 글루탐산과 같은 아미노산, 벤조산, 2-아세톡시벤조산, 나프토산 또는 신남산과 같은 방향족산, 설폰산, 예를 들어 라우릴 설폰산, p-톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 또는 에탄설폰산, 또는 본원에서 예로서 제공된 것과 같은 산의 임의의 상용성 혼합물, 및 이 기술의 일반적인 기술 수준의 관점에서 등가물 또는 허용되는 치환체로서 간주되는 임의의 다른 산 및 이의 혼합물과 같은 유기산으로 유리 염기의 처리에 의해 제조될 수 있다.
카복실산 그룹과 같은 산성 그룹을 함유하는 본원에 기재된 화합물의 경우, 염기 부가 염은 당업계에서 가용한 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 이러한 화합물을 목적하는 염기의 충분한 양으로 순수 또는 적합한 불활성 용매 중에서 처리하여 제조할 수 있다. . 약제학적으로 허용되는 염기 부가 염의 예는 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모늄, 아연, 또는 마그네슘 염, 또는 다른 금속 염; 유기 아미노 염, 예를 들어, 알킬, 디알킬, 트리알킬, 또는 테트라-알킬 암모늄 염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
약제학적으로 허용되는 염의 다른 예는 캄실레이트, 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 포스페이트, 인산일수소, 인산이수소, 메타포스페이트, 피로포스페이트, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포르메이트, 이소부티레이트, 카프로에이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 숙시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말레에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥신-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 설포네이트, 메틸설포네이트, 프로필설포네이트, 베실레이트, 크실렌설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, γ-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 타르트레이트 및 만델레이트를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 적합한 약제학적으로 허용되는 염의 목록은 문헌(참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th Edition, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985)에 기재되어 있다.
화합물의 중성 형태는 바람직하게 염을 염기 또는 산과 접촉시키고 통상적인 방식으로 모 화합물을 단리함으로써 재생된다. 화합물의 모 형태는 극성 용매에서의 용해도와 같은 특정 물리적 특성에서 다양한 염 형태와 상이하지만, 그렇지 않으면 염은 본 출원의 목적을 위한 화합물의 모 형태와 동등하다.
본원 개시내용의 구현예에서, 마크로사이클릭 펩타이드 또는 단편의 길이는 8 - 32개의 아미노산 범위에 있고, 여기서, 상기 마크로사이클릭 펩타이드 또는 이의 단편은 본원에 기재된 바와 같이 CX1X2X3C (서열번호 27)를 포함한다. 특정 구현예에서, 바람직한 펩타이드 또는 단편은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 또는 32개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 특정 구현예에서, 펩타이드 또는 단편의 길이는 8-31, 8-29, 8-27, 8-25, 8-23, 8-21, 8-19, 8-17, 8-15, 11-27, 11-25, 11-23, 11-21, 11-19, 11-17, 11-15, 13-25, 13-23, 13-21, 13-19, 13-17, 13-15, 23-27, 24-27, 또는 25-27개의 아미노산 범위에 있다. 특정 구현예에서, 펩타이드 또는 단편의 길이는 12 - 27, 13 - 27, 12 - 23, 13 - 23 또는 23 - 27개의 아미노산 범위에 있다. 펩타이드 또는 이의 단편은 임의의 천연적으로 존재하는 아미노산, 예를 들어, 알라닌[Ala (A)], 아르기닌[Arg (R)], 아스파라긴 [Asn (N)], 아스파르트산[Asp (D)], 시스테인[Cys (C)], 글루타민[Gln (Q)], 글루탐산[Glu (E))], 글라이신[Gly (G)], 히스티딘[His (H)], 이소류신[Ile (I)], 류신[Leu (L)], 라이신 (Lys (K)], 메티오닌[Met (M)], 페닐알라닌 Phe (F)], 프롤린[Pro (P)], 세린[Ser (S)], 트레오닌[Thr (T)], 트립토판 [Trp (W)], 티로신 [Tyr (Y)], 및 발린[Val (V)] 및 비-천연 또는 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
사이클로타이드는 식물로부터 단리된 소형 디설파이드 풍부 펩타이드이다. 사이클로타이드는 전형적으로 28 내지 37개 아미노산을 함유하고, 이들은 헤드-대-테일 폐환된 펩타이드 골격 및 디설파이드 결합의 상호잠금 정렬을 갖는다. 식물 사이클로타이드 계열은 잠재적인 CXXC 및 CXXXC 모티프를 갖는 마크로사이클릭 펩타이드를 포함할 수 있지만, 이들은 포유동물 세포에서 CDNF 및 MANF와 같은 유사한 세포보호 특성을 갖는 것으로 알려져 있지 않고, 즉, ER 스트레스로부터의 보호는 아폽토시스와 같은 세포 기능부전 또는 세포사를 유도하였다.
하나의 구현예에서, 본원 개시내용에서 청구된 마크로사이클릭 펩타이드는 식물 사이클로타이드 또는 식물 시클로타이드의 계열과 관련이 없다.
바람직하게, 본원 개시내용에 기재된 펩타이드는 티오레독신 및/또는 단백질의 단백질 디설파이드 이소머라제 계열로부터 기원하지 않는다.
본원의 개시내용은 8 내지 32개 아미노산 길이로 이루어진 마크로사이클릭 펩타이드, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공하고, 이는 C-X1-X2-X3-C(서열번호 27)의 아미노산 서열을 포함하고,
상기 서열에서,
X1은 R, K, I, G, A 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X2는 부재이거나 G, A, R, K, I 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X3은 A, G 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 마크로사이클릭 펩타이드는 펩타이드의 N-말단과 C-말단 사이에 연결을 갖는 펩타이드이다.
바람직한 구현예에서 마크로사이클릭 펩타이드는 E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E (서열번호 28)의 아미노산 서열을 포함하고,
상기 서열에서,
X1은 R, K, I, G, A 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X2는 부재이거나 G, A, R, K, I 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X3은 A, G 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X4는 E, T, V, D, M 및 G로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 마크로사이클릭 펩타이드는 펩타이드의 N-말단과 C-말단 사이에 연결을 갖는 펩타이드이다.
다른 종(사람, 말, 들소, 돼지, 개, 마우스, 햄스터, 악어, 돌고래 및 제브라피쉬 CDNF 및 MANF가 도 10의 예시 서열로서 사용된다)에서 CDNF 및 MANF 서열의 천연 변이에 기초하여, 사람 서열과 비교하여 X-그룹에 관한 펩타이드 서열에서 제한된 변화는 생물학적 활성의 손실 없이 수용될 수 있다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 마크로사이클릭 펩타이드는 X5-X6-X7-X8-E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E-X9-X10-X11 (서열번호 29)의 아미노산 서열을 포함하고,
상기 서열에서,
X1은 R, K, I, G, A, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X2는 부재이거나 G, A, R, K, I 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X3은 A, G 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X4는 E, T, V, D, M 및 G로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X5는 부재이거나, H, D, Q, R, Y, N 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X6은 부재이거나 S, D, G, N 및 R로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X7은 부재이거나 W이고;
X8은 부재이거나 G이고;
X9은 부재이거나 K이고;
X10은 부재이거나 T, S, A, I 및 N으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X11은 부재이거나 D 및 E로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 마크로사이클릭 펩타이드는 펩타이드의 N-말단과 C-말단 사이에 연결을 갖는 펩타이드이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 마크로사이클릭 펩타이드는 X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-V-X24-E-L-K-X25-X26-L-X5-X6-X7-X8-E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E-X9-X10-X11 (서열번호 30)의 아미노산 서열내에 있는 아미노산 서열을 포함하고,
상기 서열에서,
X1은 R, K, I, G, A 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X2는 부재이거나 G, A, R, K, I 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X3은 A, G 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X4는 E, T, V, D, M 및 G로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X5는 부재이거나, H, D, Q, R, Y, N 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X6은 부재이거나 S, D, G, N 및 R로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X7은 부재이거나 W이고;
X8은 부재이거나 G이고;
X9은 부재이거나 K이고;
X10은 부재이거나 T, S, A, I 및 N으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X11은 부재이거나 D 및 E로부터 선택되고,
X12는 부재이거나 L, I 및 V로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X13은 부재이거나 D이고;
X14는 부재이거나 L 및 W로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X15는 부재이거나 A, S, T, E 및 N으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X16은 부재이거나 S 및 T로부터 선택되고;
X17은 부재이거나 V 및 D로부터 선택되고;
X18은 부재이거나 D 및 A로부터 선택되고;
X19는 부재이거나 L이고;
X20은 부재이거나 R, K, S 및 W로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X21은 부재이거나 K이고;
X22는 부재이거나 M, L, I 및 V로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X23은 부재이거나 R이고;
X24는 A, K, T, L 및 V로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X25는 Q, K 및 R로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X26은 I 및 V로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 마크로사이클릭 펩타이드는 펩타이드의 N-말단과 C-말단 사이에 연결을 갖는 펩타이드이다.
일부 구현예에서, 마크로사이클릭 펩타이드는 서열번호 28 내 8 내지 27개 아미노산 길이의 펩타이드를 포함하고, 여기서, 상기 마크로사이클릭 펩타이드는 CX1X2X3C (서열번호 27) 모티프를 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 마크로사이클릭 펩타이드는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열 내에 있는 아미노산 서열을 포함한다:
X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-V-X24-E-L-K-X25-X26-L-X5-X6-X7-X8-E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E-X9-X10-X11 (서열번호 33),
X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-V-X24-E-L-K-X25-X26-L-X5-X6-X7-X8-E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E-X9-X10 (서열번호 34),
X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-V-X24-E-L-K-X25-X26-L-X5-X6-X7-X8-E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E-X9 (서열번호 35), 및
X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-V-X24-E-L-K-X25-X26-L-X5-X6-X7-X8-E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E (서열번호 36).
일부 구현예에서, 마크로사이클릭 펩타이드는 서열번호 33 내지 36 중 어느 하나에 8 내지 27개 아미노산 길이의 펩타이드를 포함하고, 여기서, 상기 펩타이드는 CX1X2X3C (서열번호 27) 모티프를 포함한다.
특정 경우에, 마크로사이클릭 펩타이드는 아미노산 서열 서열번호 45 또는 아미노산 서열 서열번호 49 내에 있을 수 있는 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게, 마크로사이클릭 펩타이드는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다: VDLRKMRVAELKQILHSWGEECRACAE (서열번호 2), VDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAE (서열번호 4), MRVAELKQILHSWGEECRACAEK (서열번호 6), LRVKELKKILDDWGETCKGCAEK (서열번호 8), KSILDDWGETCKGCAE (서열번호 10), WGEECRACAEKT (서열번호 12), WGETCKGCAEKS (서열번호 14), WGEECRGACAEKT (서열번호 24), 및 WGETCKGGCAEKS (서열번호 26).
하나의 구현예에서, 마크로사이클릭 펩타이드는 소포체 (ER) 스트레스 유도된 세포 기능부전 또는 세포사, 예를 들어, 아폽토시스로부터 보호한다.
하나의 구현예에서, 마크로사이클릭 펩타이드는 펩타이드의 N-말단과 C-말단 사이에 연결을 갖는 펩타이드이다.
특정 경우에, 마크로사이클릭 펩타이드는 11 내지 32개 아미노산 길이이다. 특정 경우에, 펩타이드는 12-32개 아미노산 길이이다. 특정 경우에, 펩타이드는 12-27개 아미노산 길이이다. 특정 경우에, 펩타이드는 8-27개 아미노산 길이이다. 특정 경우에, 펩타이드는 8-13개 아미노산 길이이다. 특정 경우에, 펩타이드는 8-12개 아미노산 길이이다.
바람직한 구현예에서, 마크로사이클릭 펩타이드 (C)는 환원된 형태이거나 디설파이드 브릿지된 형태이다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 마크로사이클릭 펩타이드는 GRP78에 결합한다.
일부 양상에서, 본원에 기재된 마크로사이클릭 펩타이드는 이의 선형 대응물 보다 적어도 1.5배 더 안정하다. 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 펩타이드는 이의 선형 대응물 보다 적어도 2-배, 3-배 또는 4-배 더 안정하다.
일부 양상에서, 기재된 마크로사이클릭 펩타이드는 이의 선형 대응물 보다 적어도 1.5-배 더 높은 반감기를 갖는다. 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 펩타이드는 이의 선형 대응물 보다 적어도 2-배, 3-배 또는 4-배 더 높은 반감기를 갖는다.
일부 양상에서, 마크로사이클릭 펩타이드는 펩타이드의 N-말단을 C-말단에 연결시키는 연결을 포함할 수 있다.
일부 양상에서, 펩타이드의 N-말단은 아세틸화될 수 있다.
일부 양상에서, 펩타이드의 C-말단은 아미드화된다.
일부 양상에서, 펩타이드의 N-말단은 아세틸화될 수 있고, 펩타이드의 C-말단은 아미드화될 수 있다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 마크로사이클릭 펩타이드는 검출가능한 모이어티, 화학적 모이어티, 생화학적 모이어티 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 접합된다.
마크로사이클릭 펩타이드는 검출가능한 화학적 또는 생화학적 모이어티, 예를 들어, 형광단 (예를 들어, 플루오레세인 또는 로다민)에 접합될 수 있다. 펩타이드의 방사선표지화는 예를 들어, SPECT 또는 PEG 이미지화에 사용하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 사용된 "검출가능한 화학적 또는 생화학적 모이어티"는 펩타이드의 검출을 용이하게 할 목적으로 아미노산 서열 또는 검출가능한 화학적 또는 생화학적 모이어티를 나타내는 화학적 태그를 의미하고; 예를 들어, 가시, 형광, 화학발광, 또는 기타 검출 가능한 화학 태그 중에서 선택되는 검출 가능한 분자; 기질의 존재 하에 검출가능한 효소, 예를 들어, NBT + BCIP를 갖는 알칼린 포스파타제 또는 적합한 기질을 갖는 퍼옥시다제; 검출 가능한 단백질, 예를 들어 녹색 형광 단백질이 있다. 바람직하게, 태그는 단편이 표적 세포로 침투하는 것을 방지하거나 방해하지 않거나, 그렇지 않으면 화합물의 생물학적 활성을 변경하지 않는다.
펩타이드 또는 단편의 안정성 및/또는 세포 투과성을 추가로 증가시키기 위한 C-말단 CDNF 단편 또는 C-말단 MANF 단편의 N- 및/또는 C-말단 변형이 또한 바람직하다. CDNF 단편 또는 MANF 단편의 말단의 아세틸화-아미드화 (즉, N-말단 아세틸화 및 C-말단 아미드화)는 당업계에 공지된 옵션 중 하나이다(문헌참조: 예를 들어, Marino et al. 2015, ACS Chem. Biol. 10: 1754-1764). 측-쇄-대-측-쇄 폐환된 펩타이드에 대해, 펩타이드의 아세틸화-아미드화(즉, N-말단 아세틸화 및 C-말단 아미드화)는 펩타이드의 안정성 및 세포 투과성을 증가시킨다.
일부 경우에, 마크로사이클릭 펩타이드는 하기의 성질들 중 적어도 하나(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개)를 갖는다: (i) 상기 펩타이드는 TH-양성 뉴런을 MPP+ 독성으로부터 용량-의존적으로 보호할 수 있거나; (ii) 상기 펩타이드는 TH-양성 뉴런에서 알파-시누클레인 내포물 수를 감소시키거나; (iii) 상기 펩타이드는 이의 선형 대응물과 비교하여 혈장 내 개선된 안정성을 갖거나; (iv) 상기 펩타이드는 이의 선형 대응물과 비교하여 간 세포에서 개선된 안정성을 갖거나; (v) 상기 펩타이드는 이의 선형 대응물과 비교하여 혈뇌 장벽을 통과하는 개선된 능력을 갖는다.
하나의 구현예는 약물로서 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 마크로사이클릭 펩타이드를 제공한다.
CDNF/MANF 펩타이드는 도파민 뉴런을 사멸로부터 강력하게 보호하기 때문에, WO2009133247 및 EP 1969003과 같은 선행 문헌은 펩타이드가 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환(PD)과 같은 중추신경계(CNS) 질환, 다계통 위축, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 전두측두엽 변성, 루이소체 치매, 경미한 인지 장애, 헌팅턴 질환(HD), 외상성 뇌 손상, 약물 중독 및 뇌졸중의 치료에 사용될 수 있음을 보여준다.
CDNF 및 MANF는 폴딩되지 않은 단백질 반응 (UPR) 경로의 신호전달을 조절하고 ER 스트레스-관련 세포사로부터 세포를 보호한다. ER 스트레스는 신경변성 및 대사성 질환 및 급성 손상과 같은 다양한 만성 질환에서 중요한 병리생리학적 역할을 하는 것으로 공지되어 있다(문헌참조: Wang and Kaufman, 2016). GRP78(BiP 및 HSPA5라고도 함)은 주요 ER 루멘 샤페론이고, UPR의 마스터 조절제이다(문헌참조: Bertolotti et al, 2000; Wang and Kaufman, 2016). UPR 수용체 IRE1, PERK 및 ATF6와 GRP78의 역학적 결합 및 해리는 ER 스트레스 하에 UPR 수용체의 신호전달 활성을 조절하는 주요 단계이다. MANF와 GRP78의 상호작용은 이의 세포 활성을 조절한다(문헌참조: Yan et al, 2019).
따라서, 본원 개시내용은 변성, 만성, 또는 진행성 질환 또는 장애, 예를 들어, CNS 질환 또는 장애, 또는 단일유전자 유전성 질환 (병원성 요소로서 ER 스트레스를 갖는)의 치료를 위한 방법에 관한 것이고, 여기서, 서열 C-X1-X2-X3-C (서열번호 27), E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E (서열번호 28), X5-X6-X7-X8-E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E-X9-X10-X11 (서열번호 29) 또는 X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-V-X24-E-L-K-X25-X26-L-X5 X6-X7-X8-E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E-X9-X10-X11 (서열번호 30)을 포함하는 8 내지 32개 아미노산 길이를 갖는 치료학적 유효량의 마크로사이클릭 펩타이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염은 환자에게 투여된다.
또 다른 구현예는 변성, 만성, 또는 진행성 질환 또는 장애, 예를 들어, 신경변성 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 마크로사이클릭 펩타이드를 제공한다.
상기 신경변성 질환 또는 장애는 바람직하게 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중추 신경계 질환이다: 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 다계통 위축증, 근위축성 측삭 경화증, 전두측두엽 변성, 루이소체 치매, 경미한 인지 장애, 헌팅턴 질환, 외상성 뇌 손상, 외상성 척수 손상, 진행성 핵상 마비, 픽 질환, 순수 자율신경계 부전증, 피질기저 변성, 만성 외상성 뇌병증, 척수소뇌 운동실조, 양극성 장애, 및 말초 신경병증, 및 이의 질환 및 장애의 스펙트럼.
신경변성 질환은 광범위한 뇌 단백질병증 사이에 존재하는 부분적으로 중첩되고 역학적이고 비선형적인 진행성 "차원"일 수 있다. 중추 신경계 내에서 다중 단백질병증의 여러 조합의 발현에서 가변성이 발생할 수 있다. 따라서 환자에서 혼합된 신경병리학의 공존이 관찰될 수 있다. 신경변성 질환의 유전학적 스펙트럼은 다양할 수 있고, 예를 들어, 동일한 유전자형을 가진 일란성 쌍둥이에서 다른 질환이 나타날 수 있다.
또 다른 구현예는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 단일유전자 유전성 질환의 치료에 사용하기 위한 마크로사이클릭 펩타이드 제공한다: 월콧-랄리손(Wolcott-Rallison) 증후군, 월프람(Wolfram) 증후군, 마리네스코 쇼그렌(Marinesco-Sjφgren) 증후군, 마차도-요셉(Machado-Joseph) 질환, 및 색소성 망막염과 같은 변성 망막 질환 및 원발성 신증후군 및 상염색체 우성 다낭성 콩팥 질환과 같은 유전성 신증후군. 상기 단일유전자성 유전성 질환은 병원성 요소로서 ER 스트레스를 갖는 질환이다.
하나의 구현예는 본원 개시내용에 따라 사용하기 위한 마크로사이클릭 펩타이드를 제공하고, 여기서 상기 펩타이드는 정맥내, 동맥내, 피하, 비강내, 안내, 고막내, 또는 국소 투여와 같은 말초 투여, 장내, 비경구 또는 경구, 직장, 설하 또는 협측 투여을 비롯한 국소 경로, 복막내, 근육내, 관절내, 경피, 와우내, 국소 안구 또는 흡입 투여, 또는 두개내, 척추강내, 경막외 또는 병변내 투여에 의해 투여된다.
하나의 구현예에서, 마크로사이클릭 펩타이드는 피하 투여에 의해 투여된다.
약제학적 조성물
본원에 기재된 하나 이상의 마크로사이클릭 펩타이드는 약제학적 조성물로서 또는 약제학적 조성물에 사용하기 위해 제형화될 수 있다. 이러한 조성물은 임의의 경로, 예를 들어 적절한 당국에 의해 승인된 임의의 경로를 통해 대상체에 투여하기 위해 제형화되거나 개조될 수 있다.
하나의 구현예는 본원에 기재된 바와 같은 상기 마크로사이클릭 펩타이드 및 하기 중 적어도 하나를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다: 약제학적으로 허용되는 담체, 약제학적으로 허용되는 부형제, 보존제, 안정화제 및/또는 희석제.
하나의 구현예에서, 본원의 개시내용은 추가로 서열 C-X1-X2-X3-C (서열번호 27), E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E (서열번호 28), X5-X6-X7-X8-E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E-X9-X10-X11 (서열번호 29) 또는 X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-V-X24-E-L-K-X25-X26-L-X5-X6-X7-X8-E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E-X9-X10-X11 (서열번호 30)을 포함하는, 8 내지 32개 아미노산 길이를 갖는 마크로사이클릭 펩타이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
일부 경우에, 약제학적 조성물은 유효량의 하나 이상의 마크로사이클릭 펩타이드를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "유효량" 및 "치료하기에 효과적인"은 의도된 효과 또는 생리학적 결과를 유발하기 위한 이의 투여와 관련하여 효과적인 시기 동안 (급성 또는 만성 투여 및 주기적 또는 연속 투여를 포함하는) 본원에 사용된 기재된 하나 이상의 화합물 또는 약제학적 조성물의 양 또는 농도를 지칭한다.
본원 개시내용의 하나의 구현예에서, 마크로사이클릭 펩타이드는 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 본원 개시내용의 상기 조성물은 목적하는 정도의 순도를 갖는 펩타이드를 임의의 생리학적으로 허용되는 담체 (예를 들어, 나노담체), 부형제, 완충제 또는 안정화제와 혼합함에 의해 동결건조된 케이크 또는 수용액 형태의 저장용으로 제조된다(문헌참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 22nd edition, Allen, Loyd V., Jr, Ed., (2012)). 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 겔라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알콜; 나트륨과 같은 염 형성 반대 이온; 및/또는 Tween, Pluronics, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 코에서 뇌로의 전달을 증진시키기 위해 사용되는 부형제, 예를 들어, 키토산, 메틸화된 펙틴, 알킬사카라이드 기반 점막 흡수 증진제, 및 PEG의 하이드록시 지방-아실 에스테르와 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
환자에게 투여되는 펩타이드의 실제 투여량 (예를 들어, 유효량)은 신체 및 생리학적 인자들, 예를 들어, 체중, 병태의 중증도, 치료될 질환의 유형, 이전 또는 동시 치료 개입, 환자의 특발증 및 투여 경로에 의해 결정될 수 있다. 투여를 담당하는 개업의는 개별 대상체에 대한 적절한 용량(들) 및 조성물 중 활성 성분(들)의 농도를 결정할 수 있다.
펩타이드는 또한 예를 들어, 각각 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합(예를 들어, 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 겔라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐)에 의해 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 중에서 또는 마크로에멀젼 중에서 제조된 마이크로캡슐 중에 포집될 수 있다. 상기 기술은 문헌(참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 22nd edition, Allen, Loyd V., Jr, Ed., (2012))에 기재되어 있다. 또한 제어 방출 겔 제형이 적용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 약제학적 조성물은 예를 들어, 적어도 약 0.1%의 활성 화합물을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 활성 화합물은, 예를 들어, 유닛 중량의 약 2% 내지 약 75%, 또는 약 25% 내지 약 60% 및 이들로부터 유도가능한 임의의 범위를 차지할 수 있다.
다른 비제한적인 예에서, 약제학적 조성물 또는 제형의 용량은 약 1 ng/kg/체중의 마크로사이클릭 펩타이드, 약 5 ng/kg/체중, 약 10 ng/kg/체중, 약 50 ng/kg/체중, 약 100 ng/kg/체중, 약 200 ng/kg/체중, 약 350 ng/kg/체중, 약 500 ng/kg/체중, 1 μg/kg/체중, 약 5 μg/kg/체중, 약 10 μg/kg/체중, 약 50 μg/kg/체중, 약 100 μg/kg/체중, 약 200 μg/kg/체중, 약 350 μg/kg/체중, 약 500 μg/kg/체중, 약 1 mg/kg/체중, 약 5 mg/kg/체중, 약 10 mg/kg/체중, 약 50 mg/kg/체중, 약 100 mg/kg/체중, 약 200 mg/kg/체중, 약 350 mg/kg/체중, 약 500 mg/kg/체중, 내지 약 1000 mg/kg/체중 이상의 펩타이드 및 여기에서 유도가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본원에 열거된 수로부터 유도가능한 범위의 비제한적인 예에서, 상기에서 기재된 수에 기초하여, 약 5 mg/kg/체중 내지 약 100 mg/kg/체중, 약 5 μg/kg/체중 내지 약 500 mg/kg/체중 등의 범위로 투여될 수 있다.
본원의 방법은 목적한 효과 또는 명시된 효과를 달성하기 위하여 유효량의 화합물 또는 화합물 조성물의 투여를 고려한다. 전형적으로, 본원 개시내용의 약제학적 조성물은 하루 약 1 내지 약 6회, 예를 들어, 하루 1 - 2, 1 - 3, 1 - 4, 1 - 5, 2 - 3, 2 - 4, 또는 2 - 5회 또는, 대안적으로, 연속 주입으로서 투여된다. 약제학적 조성물은 예를 들어, 하루 1, 2, 3, 4, 5 또는 6회 투여될 수 있다. 이러한 투여는 만성 또는 급성 요법으로서 사용될 수 있다. 단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료받을 숙주 및 특정 투여 방식에 의존하여 다양하다. 통상적인 제제는 약 5% 내지 약 95%의 활성 화합물(w/w)을 함유할 것이다. 대안적으로, 이러한 제제는 약 20% 내지 약 80%의 활성 화합물을 함유한다.
용량은 다양한 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 선택된 용량 수준은 다양한 인자에 의존하고, 상기 인자는 사용되는 특정 화합물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 분비율 또는 대사율, 치료 지속 시간, 사용되는 특정 화합물과 조합하여 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 재료, 치료받는 환자의 연령, 성별, 체중, 조건, 일반 건강 및 사전 의학적 병력 및 의학 분야에서 널리 공지된 인자를 포함한다. 용량 값은 또한 완화될 병태의 중증도함께 다양할 수 있다. 임의의 특정 대상체에 대해, 특정 투여 용법은 개별 필요 및 조성물을 투여하거나 투여를 감독하는 사람의 전문적 판단에 따라 시간 경과에서 조정될 수 있다.
일부 양상에서, 본원 개시내용의 화합물의 적합한 하루 용량은 치료학적 효과를 생성하기에 효과적인 최저 용량인 화합물의 양일 수 있다. 이러한 유효량은 일반적으로 상기된 인자에 의존한다. 소정의 환자에서 가장 효과적인 치료를 생성하는 임의의 특정 화합물의 정확한 투여 시간 및 양은 특정 화합물의 활성, 약동학 및 생물유용성, 환자의 생리학적 상태(연령, 성별, 질환 유형 및 단계, 일반적인 신체 상태, 주어진 약물의 용량 및 유형에 대한 반응성), 투여 경로 등에 의존한다.
의사 또는 수의사는 필요한 약제학적 조성물의 유효량을 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 목적하는 치료학적 효과를 달성하고 목적하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시키기 위해 필요한 것보다 낮은 수준에서 약제학적 조성물에 사용되는 본원 개시내용의 투여를 개시할 수 있다.
본원에 기재된 약제학적 조성물은 정확한 용량의 단일 투여에 적합한 단위 투여 형태일 수 있다. 유닛 투여 형태에서, 상기 제형은 적절한 양의 하나 이상의 화합물을 함유하는 유닛 용량으로 나누어진다. 유닛 용량은 제형의 개별적인 양을 포함하는 패키지 형태일 수 있다. 비제한적인 예는 바이알 또는 앰푸울 중에 액체이다. 수성 현탁액 조성물은 단일 용량 재폐쇄 가능하지 않은 컨테이너에 팩키징될 수 있다. 다중 용량의 재폐쇄 가능한 컨테이너는 예를 들어, 보존제와 조합하여 사용될 수 있다. 비경구 주사용 제형은 유닛 투여 형태, 예를 들어, 앰푸울 또는 보존제를 갖는 다중 용량 컨테이너에 존재할 수 있다.
용어 "약제학적으로 허용되는 담체 또는 보조제"는 본원 발명의 화합물과 함께 환자에게 투여될 수 있고 약리학적 활성을 파괴하지 않고 충분한 화합물의 치료학적 양을 전달하기에 충분한 용량으로 투여될 때 무독성인 담체 또는 보조제를 지칭한다.
본원 개시내용의 약제학적 조성물에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제 및 비히클은 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 렉시틴, 자가-유화 약물 전달 시스템(SEDDS), 예를 들어, d-.알파.-토코페롤 폴리에틸렌 글리콜 1000 숙시네이트, 약제학적 투여 형태로 사용되는 계면활성제, 예를 들어, Tweens 또는 다른 유사 중합체 전달 매트릭스, 혈청 단백질, 예를 들어, 사람 혈청 알부민, 완충 물질, 예를 들어, 포스페이트, 글라이신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분 글리세리드 혼합물, 물, 염 또는 전해물, 예를 들어, 프로타민 설페이트, 수소인산이나트륨, 인산 수소 칼륨, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스-기반 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 울(wool) 지방을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원 개시내용의 약제학적 조성물은 임의의 통상적인 비독성의 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제 또는 비히클을 함유할 수 있다. 일부의 경우, 제형의 pH는 제형화된 화합물 또는 이의 전달 형태의 안정성을 증진시키기 위하여 약제학적으로 허용되는 산, 염기 또는 완충제를 사용하여 조정될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 비경구는 비경구, 경막외, 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 동맥내, 활막내, 흉골내, 경막내, 병변내 및 두개 내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.
본원 개시내용의 유효량의 화합물은 단일 또는 다중 용량, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 임의의 적합한 양의 용량으로 허용되는 임의의 투여 방식으로 투여될 수 있다. 투여 횟수는 상기 값의 임의의 2개에 의해 정의되는 범위내에 있을 수 있다. 선택된 투여 경로와 상관없이, 본원 개시내용의 화합물 및/또는 본원 개시내용의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 투여 형태로 제형화된다. 본원 개시내용에 따른 화합물은 다른 약제와의 유사성에 의해 사람 또는 수의학에서 사용하기 위한 임의의 간편한 방식으로 투여를 위해 제형화될 수 있다.
하나의 양상에서, 본원 개시내용은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 (첨가제) 및/또는 희석제와 함께 제형화된 치료학적 유효량의 상기 기재된 화합물 중 하나 이상을 포함하는 약제학적 제형을 제공한다. 하나의 양상에서, 본원에 기재된 하나 이상의 화합물은 비경구 투여를 위한 비경구 투여용으로 제형화되고, 본원에 기재된 하나 이상의 화합물은 수성 또는 비-수성 용액, 분산액, 현탁액, 또는 에멀젼 또는 멸균 분말로서 제형화될 수 있고 이는 사용 직전에 멸균 주사 용액 또는 분산액으로 재구성될 수 있다. 이러한 제형은 당, 알콜, 항산화제, 완충제, 정균제, 제형을 의도된 수용자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질 또는 현탁제 또는 증점제를 포함할 수 있다. 이들 조성물은 또한, 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 본원의 화합물에 대한 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등을 포함시켜 보장될 수 있다. 이것은 또한 등장성 제제, 예를 들어, 슈가, 염화나트륨 등을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 추가로, 주사가능한 약제 형태의 장기 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및 겔라틴과 같은 흡수를 지연시키는 제제를 포함시켜 수행될 수 있다. 목적하는 경우, 제형은 사용 전에 예를 들어 등장 식염수 또는 덱스트로스 용액으로 희석될 수 있다. 일부 예에서, 상기 화합물은 수용액으로서 제형화되고 정맥내 투여된다.
약제학적 조성물은 주사용 용액 또는 분말 형태일 수 있다. 상기 조성물은 적합한 분산제 또는 습윤제 (예를 들어, Tween 80과 같은) 및 현탁제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다. 멸균 주사가능한 제제는 또한 비독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중에 멸균 주사가능한 용액 또는 현탁액, 예를 들어, 1,3-부탄디올 중에 용액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용되는 비히클과 용매는, 만니톨, 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 고정유도 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 이용된다. 상기 목적을 위해, 임의의 블랜드의 고정유가 사용될 수 있고, 합성 모노- 또는 디글리세리드를 포함한다. 지방산, 예를 들어, 올레산 및 이의 글리세리드 유도체는 특히 이들의 폴리옥시에틸화된 버전에서 올리브유 또는 피마자유와 같은 천연 약제학적으로 허용되는 오일로서 주사가능한 제제의 제조에 유용하다. 이들 오일 용액 또는 현탁액은 또한 장쇄 알콜 희석제 또는 분산제, 또는 카복시메틸 셀룰로스 또는 에멀젼 및/또는 현탁액과 같은 약제학적으로 허용되는 투여 형태의 제형화에 통상적으로 사용되는 유사한 분산제를 함유할 수 있다. Tweens 또는 Spans와 같은 일반적으로 사용되는 다른 계면활성제 및/또는 약학적으로 허용되는 고체, 액체 또는 기타 투여 형태의 제조에 일반적으로 사용되는 기타 유사한 유화제 또는 생물유용성 증진제도 제형화 목적으로 사용될 수 있다.
약제학적 조성물은 캡슐, 정제, 에멀젼 및 수성 현탁액, 분산액 및 용액을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 경구 허용되는 투여 형태로 경구 투여될 수 있다. 경구용을 위한 정제의 경우에, 통상적으로 사용되는 담체는 락토스 및 옥수수 전분을 포함한다. 윤활제, 예를 들어, 마그네슘 스테아레이트는 또한 전형적으로 첨가된다. 캡슐 형태의 경구 투여를 위해, 유용한 희석제는 락토스 및 건조된 옥수수 전분을 포함한다. 수성 현탁액 및/또는 에멀젼이 경구 투여되는 경우, 활성 성분은 유화제 및/또는 현탁제와 조합되어 오일상에 현탁되거나 용해될 수 있다. 경우에 따라, 특정 감미제 및/또는 향제 및/또는 착색제가 첨가될 수 있다.
본원 개시내용의 약제학적 조성물은 또한 직장 투여용 좌제 형태로 투여될 수 있다. 이들 조성물은 본원 개시내용의 화합물을, 실온에서 고체이지만 직장 온도에서는 액체여서 직장에서 용융되어 활성 성분을 방출하는 적합한 비-자극 부형제와 혼합함에 의해 제조될 수 있다. 상기 재료는 코코아 버터, 밀랍 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
대안적으로 또는 추가로, 약제학적 조성물은 비강 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 상기 조성물은 약제학적 제형의 기술분야에 널리 공지된 기술에 따라 제조되고, 당업계에 공지된 생체이용률, 플루오로카본 및/또는 기타 가용화제 또는 분산제를 증진시키기 위해 벤질 알콜 또는 다른 적합한 보존제, 흡수 촉진제를 사용한, 식염수 중 용액으로서 제조될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 하나 이상의 펩타이드는 예를 들어, 캐리어 단백질에 접합될 수 있다. 상기 접합된 조성물은 1가 또는 다가일 수 있다. 예를 들어, 접합된 조성물은 본원에서 캐리어 단백질에 접합되는 하나의 펩타이드를 포함할 수 있다. 대안적으로, 접합된 조성물은 본원에서 캐리어에 접합된 것으로 기재된 2개 이상의 펩타이드를 포함할 수 있다.
본원에서는 본원에 기재된 펩타이드를 사용하는 방법이 제공된다. 예를 들어, 본원에 제공된 방법은 본원에 기재된 바와 같은 펩타이드를 환자에게 투여하는 것을 포함할 수 있다.　환자는 포유류 및 비-포유류 둘다를 포함할 수 있다.　
약제학적으로 허용되는 담체는 선택된 투여 경로 및 표준 약제학적 관행에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 경구 투여를 위한 용액, 현탁액, 정제, 분산성 정제, 환제, 캡슐, 분말, 지속 방출 제형 또는 엘릭시르와 같은 적합한 약제학적 제제로, 또는 비경구 투여 및 복막내 주사를 위한 멸균 용액 또는 현탁액, 및 경피 패치 제제, 건조 분말 흡입기 및 연고로 제형화될 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Ansel, Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition 1985, 126). 펩타이드 및/또는 면역글로불린은 약제학적 제제 분야의 표준 관행에 따라 투여 형태로 제형화될 수 있다. 문헌(Alphonso Gennaro, ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (1990), Mack Publishing Co., Easton, Pa.)을 참조한다.
비경구 투여를 위해, 약제학적 조성물은 적합한 담체 또는 희석제, 예를 들어 물, 오일(특히 식물성 오일), 에탄올, 식염수, 수성 덱스트로스(글루코스) 및 관련 당 용액, 글리세롤, 또는 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜을 포함할 수 있다. 비경구 투여용 용액은 바람직하게는 펩타이드 및/또는 활성제의 수용성 염을 함유한다. 안정화제, 항산화제 및 보존제가 또한 첨가될 수 있다. 적합한 항산화제는 설파이트, 아스코르브산, 시트르산 및 이의 염, 및 나트륨 EDTA를 포함한다. 적합한 보존제는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤, 및 클로로부탄올을 포함한다. 비경구 투여용 조성물은 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼의 형태를 취할 수 있다.
경구 투여를 위해, 약제학적 조성물은 정제, 캡슐, 환제, 분말, 과립 또는 기타 적합한 경구 투여 형태의 제조를 위한 하나 이상의 고체 불활성 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 충전제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 용액 지연제, 흡수 촉진제, 습윤제 흡수제 또는 윤활제와 같은 하나 이상의 부형제를 포함할 수 있다.
본원 개시내용은 또한 신경 세포를 추가로 포함할 수 있는 약제학적 조성물을 특징으로 한다. 신경 세포는 예를 들어, 뉴런, 신경 줄기 세포 또는 뉴런 전구체 세포일 수 있다.
본원의 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 마크로사이클릭 펩타이드 및 하기 중 적어도 하나를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다: 의약으로서 사용하기 위한 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 보존제, 안정화제 및/또는 희석제.
치료 방법에서, 약제학적 유효량의 마크로사이클릭 펩타이드가 환자에게 투여된다. 다른 말로, 본원 개시내용에 따른 마크로사이클릭 펩타이드는 변성, 만성 및/또는 진행성 질환 및 장애, 예를 들어, CNS 질환 또는 장애, 또는 병원성 요소로서 ER 스트레스를 갖는 단일유전자 유전성 질환의 치료에 사용하기 위한 것이다.
약제학적 조성물은 변성, 만성 또는 진행성 질환 또는 장애, 예를 들어, 신경변성 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 것이다.
상기 신경변성 질환 또는 장애는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중추 신경계 질환이다: 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 다계통 위축증, 근위축성 측삭 경화증, 전두측두엽 변성, 루이소체 치매, 경미한 인지 장애, 헌팅턴 질환, 외상성 뇌 손상, 외상성 척수 손상, 진행성 핵상 마비, 픽 질환, 순수 자율신경계 부전증, 피질기저 변성, 만성 외상성 뇌병증, 척수소뇌 운동실조, 양극성 장애, 및 말초 신경병증.
하나의 구현예에서, 약제학적 조성물은 피하 투여에 의해 투여된다.
마크로사이클릭 펩타이드 투여 경로는 공지된 방법 및 정맥내, 동맥내, 피하, 비강내, 안내, 고막내 또는 국소 투여에 의한 주사 또는 주입의 일반적인 경로, 경구, 직장, 설하 또는 협측 투여를 포함한 경장, 비경구 또는 국소 경로, 두개내, 척수강내 또는 경막외, 복막내, 근육내, 관절내, 경피, 와우내, 국소 안구, 병변내 또는 흡입 투여 또는 하기에 언급된 지속적 방출 시스템에 따른다.
지속적 방출 제제의 적합한 예는 펩타이드를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 상기 매트릭스는 성형된 제품 형태, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태로 있다. 지속적 방출 매트릭스의 예는 문헌(참조: Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981) and Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982))에 기재된 바와 같은 폴리에스테르, 하이드로겔 또는 폴리비닐 알콜, 폴리락티드(미국 특허 제3,773,919호, EP 58,481), 또는 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트(문헌참조: Langer et al., supra)를 포함한다.
본원 개시내용은 또한 CNS 질환 또는 장애, 단일유전자 유전성 질환(병원성 요소로서 ER 스트레스를 가짐)과 같은 변성, 만성 또는 진행성 질환 또는 장애의 치료 방법에 관한 것으로, 여기서 약제학적 유효량의 본원에 정의된 마크로사이클릭 펩타이드는 환자에게 투여된다. 바람직하게, 상기 단편은 말초로 투여된다.
본원 개시내용은 또한 변성, 만성 또는 진행성 질환 및 장애, 예를 들어, CNS 질환 또는 장애, 또는 병원성 요소로서 ER 스트레스를 갖는 단일유전자 유전성 질환의 치료를 위한 의약의 제조를 위해 본원에 정의된 바와 같은 상기 마크로사이클릭 펩타이드의 용도에 관한 것이다.
본원 개시내용은 이를 필요로 하는 대상체에서 신경변성 질환 또는 장애와 같은 변성, 만성 또는 진행성 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은 마크로사이클릭 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
하나의 구현예에서, 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 다계통 위축증, 근위축성 측삭 경화증, 전두측두엽 변성, 루이소체 치매, 경미한 인지 장애, 헌팅턴 질환, 외상성 뇌 손상, 외상성 척수 손상, 진행성 핵상 마비, 픽 질환, 순수 자율신경계 부전증, 피질기저 변성, 만성 외상성 뇌병증, 척수소뇌 운동실조, 양극성 장애, 및 말초 신경병증으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중추신경계 질환과 같은 신경변성 질환 또는 장애를 치료하기 위한 방법은 본원에 기재된 바와 같은 마크로사이클릭 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본원의 개시내용은 월콧-랄리손(Wolcott-Rallison) 증후군, 월프람(Wolfram) 증후군, 마리네스코 쇼그렌(Marinesco-Sjφgren) 증후군, 마차도-요셉(Machado-Joseph) 질환, 및 색소성 망막염과 같은 변성 망막 질환 및 원발성 신증후군 및 상염색체 우성 다낭성 콩팥 질환과 같은 유전성 신증후군으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단일유전자 유전성 질환을 치료하기 위한 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은 마크로사이클릭 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 단일유전자 유전성 질환은 병원성 요소로서 ER 스트레스를 갖는다.
이를 필요로 하는 대상체는 사람일 수 있다.
본원 개시내용의 마크로사이클릭 펩타이드 또는 상기 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 주입 또는 볼러스 주사에 의해 연속적으로 투여될 수 있다. 일반적으로 장애가 허용되는 경우, 부위 특이적 전달을 위해 단편을 제형화하고 투여해야한다. 투여는 연속 또는 주기적일 수 있다. 투여는 일정 유량 또는 프로그램 가능 유량 이식형 펌프 또는 주기적인 주사에 의해 성취될 수 있다. 말초 또는 전신 투여는 본원의 개시내용에서 마크로사이클릭 펩타이드가 뉴런 세포 막을 그리고 시험관내 및 생체내 혈뇌 장벽을 효과적으로 투과할 수 있음으로 바람직하다(각각 도 8 및 9B를 참조한다). 다른 바람직한 투여 경로는 피하, 척수강내, 뇌실내, 비강내 또는 경피 투여이다.
또 다른 구현예에서, 본원 개시내용은 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29 또는 서열번호 30의 서열을 포함하는 8-32개 아미노산의 마크로사이클릭 펩타이드와 도파민성 뉴런을 접촉시키는 단계를 포함하는 도파민성 뉴런의 생존을 촉진시키기 위한 방법을 제공한다. 바람직하게, 상기 방법은 실험 섹션에서 하기에 나타낸 바와 같이 시험관내 수행된다. 상기 도파민성 뉴런은 바람직하게는 마우스 또는 래트 교감 뉴런 또는 유도 만능 세포(iPSC)로부터 유래된 사람 뉴런과 같은 배양된 비-사람 뉴런이다.
본원 개시내용에 의해 제공된 결과에 기초하여, 본원 개시내용은 또한 CNS 질환 또는 장애와 같은 변성, 만성 또는 진행성 질환 또는 장애, 또는 단일 유전자 유전성 질환(병원성 요소로서 ER 스트레스를 가짐)의 치료에 사용하기 위한, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29 또는 서열번호 30의 서열을 포함하는 8 내지 32개의 아미노산 길이를 갖는 마크로사이클릭 펩타이드에 관한 것이다. .
마크로사이클릭 펩타이드를 제조하는 방법
본원 개시내용의 화합물을 합성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 하기의 예시적인 방법이 사용될 수 있다. 목적하는 화합물을 제공하기 위해 다양한 단계를 대안적인 순서로 수행될 수 있음을 이해할 것이다. 본원에 기재된 화합물을 합성하는데 유용한 합성 화학 변환법 및 보호 그룹 방법론(보호 및 탈보호)은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers(1989)]; T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3d Ed., John Wiley and Sons (1999)]; L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); and L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995) 및 이들의 후속 판]에 기재된 것들을 포함한다.
본원 개시내용의 펩타이드는 당업자에게 널리 공지된 화학적 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌(Fields et al., Chapter 3 in Synthetic Peptides: A User's Guide, ed. Grant, W. H. Freeman & Co., New York, N.Y., 1992, p. 77)을 참조한다. 본원에 기재된 펩타이드를 제조하는 하나의 방식은 고형 상 펩타이드 합성 (SPPS)을 사용한다. C-말단 아미노산은 링커 분자와의 산 불안정 결합을 통해 가교 결합된 폴리스티렌 수지에 부착된다. 상기 수지는 합성에 사용되는 용매에 불용성이므로 이는 잉여 시약 및 부산물이 비교적 간단하고 신속하게 세척될 수 있게 한다. N-말단은 산에 안정하지만 염기에 의해 제거될 수 있는 Fmoc 그룹으로 보호호된다. 임의의 측쇄 작용기는 염기에 안정하고 산에 불안정한 그룹으로 보호된다.
본 발명의 배경을 설명하고, 특히 본 발명의 실시에 관한 추가 세부사항을 제공하기 위해 본원에 사용된 간행물 및 기타 자료는 본원에 참조로 인용된다.
기술이 발전함에 따라 본원 개시내용의 기본 사상이 다양하게 구현될 수 있음은 당업자에게 자명하다. 본원의 개시내용 및 이의 구현예는 따라서 하기 실시예에 제한되지 않고 이들은 청구항의 범위 내에서 다양할 수 있다.
실시예
실시예 1
MPP+로 손상된 도파민성 TH 양성 뉴런에 대한 선형 및 마크로사이클릭 화합물의 신경보호 효과
화합물 1-26 (서열번호 1-26)의 신경보호 효과는 래트 배아 중뇌 뉴런의 1차 배양물이 신경독소 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(MPTP)의 활성 대사산물인 MPP+로 스트레스를 받은 시험관 내 모델에서 시험하였다. MPP+는 미토콘드리아 기능부전, 과산화질산염 생성, 산화 스트레스, ER 스트레스 및 아폽토시스 유도를 포함한 다양한 독성 기전을 통해 도파민성(TH-양성) 뉴런을 사멸시킨다. CDNF 및 MANF의 C-말단 도메인으로부터 유래된 펩타이드가 슈도펩타이드로 변형되었기 때문에 전장 CDNF 단백질이 TH+ 도파민 뉴런, 이들의 시냅스 및 신경돌기 네트워크를 MPP+ 유도된 손상(도 3a)으로부터 보호하고 TH+ 뉴런에서 알파-시누클레인 응집물의 축적을 감소(도 3b)시키는 신경보호인 것으로 나타난 모델에서 신경보호 활성을 시험하였다.
CDNF 및 MANF의 헤드-대-테일 사이클릭 유도체 및 선형 펩타이드의 합성 및 특징 분석의 재료 및 방법
일반 프로토콜-수지 부하
보조 모이어티(크립토-티오에스테르 Gly-Cys(Hnb)-NH)가 있는 수지는 모든 합성을 위해 제조되었다. 이를 위해 Fmoc-Gly-OH 및 Fmoc-Cys(StBu)-OH는 4당량의 해당 아미노산과 등몰량의 DIC(DMF 중 0.5M) 및 OxymaPure(DMF 중 0.5M)를 커플링 시약으로 사용하여 TentaGel R RAM 수지(0.19-0.26mmol/g)에 커플링시켰다. DMF에서 20% 피페리딘으로 처리하여 Fmoc-그룹을 제거한 후, 원래 절차에 따라 2-하이드록시-5-니트로벤즈알데히드 및 나트륨 시아노보로하이드라이드를 사용하여 환원성 아민화를 수행하였다(문헌참조: Terrier et al, 2016). 제1 아미노산(Ala 또는 Gly)의 커플링은 이어서 10 당량의 Fmoc-AA-OH, 9.5당량의 HCTU 또는 10당량의 PyBOP/HOBt 및 20당량의 DIPEA을 사용하여 수행하고 이어서 아세트산 무수물/DIPEA로 캡핑하였다. 보조제가 있는 상기 수지는 추가의 고형 상 펩타이드 합성을 위해 사용하였다.
일반 프로토콜 - SPPS
고형 상 펩타이드 합성은 자동 펩타이드 합성기(Biotage 개시제+ Alstra 또는 Activotec Activo-P11)상에서 수행하였다. 표준 Fmoc 보호된 아미노산은 펩타이드 연장을 위해 사용하였다: Ala, Arg(Pbf), Asp(tBu), Gln(Trt), Glu(OtBu), Gly, His(Trt), Ile, Lys(Boc), Leu, Met, Ser(tBu), Thr(tBu), Trp(Boc), Val, Cys(Trt) 및 Cys(StBu). Fmoc 그룹의 제거는 DMF 중 20% 피페리딘을 사용하여 수행하고, 커플링은 마이크로파 조사 또는 실온에서 상응하는 아미노산 4당량, HBTU 3.9당량, HOBt 4당량 및 DIPEA 8당량을 사용하여 수행하였다. 조 펩타이드를 탈보호하고 TFA/H2O/iPr3SiH로 2시간 동안 처리하여 수지로부터 절단시킨 후 차가운 Et2O에서 침전시키고 동결건조시킨다.
일반 프로토콜 - 고유 화학적 연결 (NCL) 및 S-S 산화
헤드-대-테일 폐환은 N-말단 Cys와 C-말단 크립토-티오에스테르 Gly-Cys(Hnb) 사이에 NCL을 사용하여 수행하였다. NCL 완충액(6M Gn*HCl, 25mM MPAA, 50mM TCEP*HCl, pH 6.4을 포함하는 0.2M 인산염 완충액)은 공개된 프로토콜(Terrier et al. 2016)에 따라 제조하였다. 선형 펩타이드를 완충액에 1mM 농도로 용해시키고 반응물을 38℃에서 밤새 교반하였다. 적절한 농도 구배를 사용하여 RP-HPLC에 의해 사이클릭 펩타이드를 단리하였다. 정제된 펩타이드를 동결건조시킨 다음 아세트산에 용해시키고 디설파이드 브릿지가 형성될 때까지 MeOH 중 20mM 요오드로 처리하였다. 표적 펩타이드는 이어서 RP-HPLC로 정제하였다.
펩타이드의 순도는 표준 HPLC 방법에 의해 평가되었고 동일성은 표준 LC-MS 절차를 사용하여 확인되었다. 상기 절차에서 펩타이드로부터 수득된 하전된 이온의 질량은 도 1에서 찾을 수 있다.
CDNF 및 MANF의 선형 유도체 합성 재료 및 방법.
선형 펩타이드는 이전에 기재된 바와 같은 일반 SPPS 프로토콜을 사용하여 합성하였다. 상기 순도 및 동일성은 동일한 방식으로 결정하였다. 펩타이드의 질은 LC-MS 절차를 사용하여 확인하였다. 상기 절차에서 수득된 하전된 이온의 질량은 도 1에 나타낸다.
NMR을 사용한 CDNF 및 MANF의 헤드-대-테일 사이클릭 유도체의 폐환 확인.
모든 헤드-대-테일 사이클릭 펩타이드는 25℃에서 20 mM 인산나트륨 pH 6.0, 10 vol% D2O, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 3 μM NaN3, 0.5 mM DSS 완충액 중에 용해시켰다. 이들의 1H/13C 1D 및 2D NMR 스펙트럼은 500 MHz 분광측정기 상에 기록하였다.
헤드-대-테일 사이클릭 펩타이드 화합물은 1차적으로 1D 1H, 2D 1H TOCSY, 2D 1H ROESY 및 2D 1H-13C HSQC NMR로 분석하였다(도 2a-2p). 1D 1H 및 2D 1H TOCSY NMR 데이터는 화합물 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 24 및 26에 대해 기록하여 헤드-대-테일 폐환을 확인하였다. 모든 골격 아미드는 각각 하나의 양성자를 가져야 하고, 이는 N-말단에 하나의 산 양성자(펩타이드 산) 또는 2개의 아미드 양성자(펩타이드 아미드)가 있는 상응하는 선형 펩타이드에는 해당되지 않는다. N-말단 아미드 양성자의 피크 윤곽은 화합물 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 24 및 26에 대해 할당되고, 각각 도 2b, 2d, 2f, 2h, 2j, 2l, 2n, 2p 및 2r에 지적된다. 모든 경우에, 관찰된 아미드 양성자의 수는 특정 아미노산의 헤드-대-테일 펩타이드의 예상되는 아미드 양성자의 수와 일치한다(N-말단이 포함되지 않은 상응하는 선형 유사체와 대조적임). 이 자체는 화합물이 폐환됨을 지적한다. 그러나 화합물의 LC-MS 데이터(도 1에 제공됨)에 비추어 데이터를 해석하는 경우, 화합물은 폐환된 화합물임을 이중으로 확인하였다.
NH와 Hα 둘다에서 스펙트럼 중첩으로 인해 i1-i23/27 ROE 상관 관계 중 일부를 명확하게 확인할 수 없었다(화합물 2, 6 및 8의 경우). 나머지 펩티드(화합물 4, 10, 12, 14, 24 및 26)에 대해 i1:HN과 i(12/13/23):_Hα, 즉 순차적 HN(i)-H_α(i_-1) 상관관계간에 공간을 통한 ROE 상관관계를 독립적으로 입증하기에 충분한 2D 1H ROESY 데이터도 수집하였고 이는 폐환된 구조를 지지한다(이들 커플링된 양성자는 5 Å 미만으로 떨어져 있음). 이들 화합물(화합물 4, 10, 12, 14, 24 및 26)의 2D 1H ROESY 아미드 핑거프린트 영역의 확장은 각각 도 2d, 2j, 2l, 2n, 2p 및 2r에 나타내고, 상응하는 HN 주파수에서 주요 순차적 ROE 교차 피크 플래깅된다.
화합물의 신경보호 활성 시험과 관련된 재료 및 방법
중뇌 뉴런의 배양. 래트 도파민성 뉴런은 문헌(참조: Visanji et al., 2008)에 기재된 바와 같이 배양하였다. 간략하게, 15일령 래트 배아(Janvier, France)로부터 수득된 중뇌를 해부하고 도파민성 뉴런이 풍부한 발달 중인 뇌 영역인 중뇌 굴곡의 복부 부분을 세포 제조를 위해 사용하였다. 중뇌 세포는 37°C에서 20분 동안 트립신 처리에 의해 해리시켰다(최종 농도 0.05% 트립신 및 0.02% EDTA의 용액). DNAase I 등급 II(0.5 mg/mL)와 10%의 소 태아 혈청(FCS)을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)를 추가하여 반응을 중단시켰다. 이어서, 세포를 10 ml 피펫을 통한 3회 계대에 의해 기계적으로 해리시켰다. 이어서 세포를 L15 배지에서 BSA(3.5%) 층에서 +4°C에서 10분 동안 180 x g에서 원심분리하였다. 세포 펠렛은 B27 (2%), L-글루타민 (2 mM) 및 2%의 PS 용액 및 10ng/ml의 뇌-유래된 신경영양 인자 (BDNF) 및 1 ng/mL의 신경교-유래된 신경영양 인자 (GDNF)가 보충된 Neurobasal (Invitrogen)로 이루어진 합성 배양 무혈청 배지에 재현탁시켰다. 생존 세포는 트립판 블루 배제 시험을 사용하여 Neubauer 세포측정기에서 계수하였다. 세포는 96개 웰 플레이트(폴리-L-라이신으로 사전 코팅됨)에 40,000개 세포/웰의 밀도로 씨딩하고 5% CO2/95% 공기 분위기에서 37°C의 가습 항온처리기에서 유지하였다. 배지의 절반을 2일마다 새로운 배지로 교체하였다. 96웰 플레이트상에서, 60웰만 사용하였다. 임의의 엣지 효과를 피하기 위해, 첫 번째와 마지막 줄과 열은 배양에 사용하지 않고 멸균수로 채웠다.
시험 화합물 및 MPP+ 노출.
CDNF 및 선형 및 마크로사이클릭 화합물 1-24 (서열번호 1-26)을 시험하였다. 배양 6일째, 상기 화합물은 배양 배지에 용해시키고, 이어서 MPP+ 적용 전 4시간 동안 중뇌 뉴런으로 예비 항온처리하였다. 화합물의 예비 항온처리 4시간 후, MPP+를 4μM의 최종 농도로 첨가하고, 48시간 동안 화합물의 존재 하에 여전히 대조군 배지에서 희석하였다.
면역염색: TH 뉴런 생존, 신경돌기 네트워크 및 TH 뉴런에서의 α-syn 응집.
중독 48시간 후, 세포를 PBS 중 4% 파라포름알데히드 용액, pH 7.3으로 실온에서 20분 동안 고정시켰다. 세포를 PBS로 2회 세척하고 이어서 투과시키고, 0.1% 사포닌과 1% FCS를 함유하는 PBS 용액으로 실온에서 15분 동안 비특이적 부위를 차단하였다. 이어서, 세포를 (a) 1:10000의 희석으로 마우스에서 생성된 모노클로날 항체 항-티로신 하이드록실라제(TH) 및 (b) 1% FCS, 0.1% 사포닌을 함유하는 PBS에서 1:400으로 희석한 토끼에서 생성된 폴리클로날 항체 항-알파-시누클레인(α-syn) 항체와 함께 실온에서 2시간 동안 항온처리하였다. 이들 항체는 1% FCS, 0.1% 사포닌을 포함하는 PBS 중에 희석 1:800의 2차 항체 Alexa Fluor 488-접합된 염소 항-마우스 IgG와 희석 1:400의 Alexa 568-접합된 염소 항-토끼 IgG로 실온에서 1시간 동안 밝혔다.
시냅스 면역염색: TH 뉴런 및 PSD-95(TH/PSD-95 뉴런간 중첩).
중독 48시간 후, 세포 배양 상등액을 제거하고, 세포를 PBS 중 4% 파라포름알데히드 용액, pH 7.3으로 실온에서 20분 동안 고정시켰다. 세포를 PBS로 2회 세척하고 이어서 투과시키고, 0.1% 사포닌과 1% FCS를 함유하는 PBS 용액으로 실온에서 15분 동안 비특이적 부위를 차단하였다. 이어서 세포는 a) 2시간 동안 실온에서 1% FCS, 0.1% 사포닌을 함유하는 PBS 중의 1:10000 희석으로 마우스에서 생성된 모노클로날 항-티로신 하이드록실라제 (TH) 항체 , 및 b) 2시간 동안 실온에서 1% FCS, 0.1% 사포닌을 함유하는 PBS 중에 1:200의 희석으로 토끼에서 생성된 폴리클로날 항-시냅스후 밀도 단백질-95 (PSD-95)로 항온처리하였다. 상기 항체는 시냅스를 특이적으로 염색시킨다. 이들 항체는 1% FCS, 0.1% 사포닌을 함유하는 PBS 중에 희석 1:800의 Alexa Fluor 488-접합된 염소 항-마우스 IgG와 희석 1:400의 Alexa Fluor 568-접합된 염소 항-토끼 IgG로 실온에서 1시간 동안 밝혔다.
각 조건에 대해 전체 웰 영역을 나타내는 사진은 10x(TH 및 α-syn의 경우 20개의 사진) 또는 40x 배율(TH 및 PSD-95의 경우 60개의 사진)에서 ImageXpress(Molecular Devices)를 사용하여 자동으로 획득되었다. 하기의 판독값은 커스텀 모듈 에디터(Custom Module Editor)(Molecular Devices)를 사용하여 자동으로 결정되었다.
- TH 뉴런(TH 양성 뉴런)의 총 수 분석
- TH 양성 뉴런의 총 신경돌기 네트워크(μm)
- TH 양성 뉴런의 α-syn 내포물의 수(TH와 α-syn 염색이 중첩)
- TH-양성 뉴런에서 시냅스의 수 (TH 및 PSD-95의 중첩(μm²)).
TH+ 뉴런의 총 수, TH+ 뉴런의 총 신경돌기 네트워크 및 TH+ 뉴런의 시냅스 수는 도 3a(CDNF), 도 3c(화합물 1 및 2), 도 3d(화합물 3 및 4), 도 3g(화합물 5 및 6), 도 3i(화합물 7 및 8), 도 3k(화합물 9 및 10), 도 4a(화합물 11 및 12), 도 4c(화합물 23 및 24), 4I(화합물 23 및 24) 및 도 4k(화합물 25 및 26)에 나타낸다.
TH+ 뉴런의 총 수는 도 4e(화합물 15, 16, 17 및 18), 도 4g(화합물 19, 20, 21 및 22)에 나타낸다.
MPP+ 손상 후 중뇌 세포의 1차 배양물의 TH-양성 뉴런에서의 α-시누클레인 응집은 도 3b(CDNF), 도 3d(화합물 1 및 2), 도 3f(화합물 3 및 4), 3h(화합물 5 및 6), 도 3j(화합물 7 및 8), 도 3l(화합물 9 및 10), 도 4b(화합물 11 및 12), 도 4d(화합물 13 및 14), 도f(화합물 15, 16, 17 및 18), 도 4h(화합물 19, 20, 21 및 22), 도 4j(화합물 23 및 24) 및 도 4l(화합물 25 및 26)에 나타낸다.
데이터는 많은 마크로사이클릭 펩타이드가 MPP+ 독성으로부터 TH 양성 뉴런과 이들의 신경돌기 및 시냅스를 용량 의존적으로 보호함을 보여준다. 또한, 이들 마크로사이클릭 화합물은 TH 양성 뉴런에서 MPP+에 의해 축적이 강력하게 유도되는 α-Syn 내포물의 수를 효과적으로 감소시켰다. 대부분의 경우, 마크로사이클릭 펩타이드(화합물 2, 6, 8, 10, 12, 14, 24 및 26)의 효능은 이들의 선형 대응물(각각 화합물 1, 5, 7, 9, 11,13, 23 및 25)에 상응할 수 있다.
실시예 2
ER 스트레스 반응 경로와의 상호작용
CDNF 및 MANF는 ER 스트레스에 대한 세포 반응을 조절함으로써 아폽토시스와 같은 ER 스트레스 유도 세포 기능부전 또는 세포 사멸로부터 세포를 보호한다. 문헌(Yan et al (2019))은 MANF의 C-말단이 GRP78의 뉴클레오타이드 결합 도메인 (NBD)에 결합하고 이의 세포 활성을 조절함을 보여주었다. 상기 데이터는 MANF(및 CDNF)가 ER 루멘에서 가장 풍부한 샤페론 단백질인 GRP78과 기질 유사 상호작용보다는 조절 상호작용을 가지고 있음을 시사한다. GRP78-NBD에 대한 화합물의 결합은 정제된 재조합 GRP78-NBD 및 합성된 펩타이드를 사용하는 무세포 결합 검정에서 평가되었다. GRP78가 또한 폴딩되지 않은 단백질 반응 (UPR) 경로인 IRE1, PERK 및 ATF6의 3개의 수용체의 중요한 리간드로서 작용하기 때문에, UPR 신호전달에 대한 화합물의 신경보호 효과의 의존성이 또한 시험되었다. 도 5a는 GRP78-NBD의 MANF-결합 포켓에 화합물 12의 분자 모델링을 보여준다. 도 5b는 무세포 결합 검정에서 선택된 화합물의 GRP78-NBD에 대한 결합 친화성을 보여준다. 도 5c는 화합물 10 및 14의 신경보호 효과가 PERK(GSK2606414) 및 IRE1알파(KIRA6)의 약리학적 억제제의 존재 하에 폐지됨을 보여준다.
재료 및 방법
분자 모델링.
여기에 언급된 다양한 화합물과 복합체화된 GRP78-NBD(도 2a-2p)는 MAESTRO 인터페이스를 통해 Schrodinger 제품군 버전 2018-4(Schrodinger Llc , USA)의 PRIME 모듈을 사용하여 GRP78-NBD:MANF 복합체의 이전에 해결된 구조를 기준으로 모델링하였다. 생성된 모델은 주형 구조를 사용하여 수동으로 조사하였다(PDB: 6HAB, Yan et al, 2019). 상기 모델은 또한 라마찬드란 다이아그램을 통해 확인되었다.
무세포 결합 검정.
His 태그된 GRP78-NBD는 재조합으로 과발현되고 이. 콜라이 세포로부터 정제하고 NHS-Red 염료(Nanotemper Technologies GmbH)를 사용하여 표지화시켰다. His-tag는 TEV 프로테아제를 사용하여 단백질로부터 절단 제거하였다. 표지된 태그 없는 GRP78-NBD에 대한 상이한 펩타이드의 결합(연속 희석)은 PBS 환경에서 고전력에서 Monolith N.A. 장치(Nanotemper Technologies GmbH)를 사용하여 Monolith N.T 표준 모세관에서 측정하였다. 도 5b는 MST 결합 실험으로부터 수득된 표로 나타낸 데이터를 보여준다.
중뇌 뉴런의 배양.
신경 세포 배양, MPP+ 중독, 면역염색 및 화합물의 신경보호 효과 분석을 실시예 1에서와 같이 수행하였다. PERK 억제제 GSK2606414 (2 μM, Sigma) 또는 IRE1알파 억제제 KIRA6 (2 μM, Sigma)는 시험 화합물의 첨가 전 배양물 1에 첨가하였다.
상기 데이터는 마크로사이클릭 화합물이 주요 ER 스트레스 조절 표적 분자 GRP78에 결합하고 마크로사이클릭 화합물의 신경보호 효과가 의존적 UPR 신호전달 활성임을 보여준다.
실시예 3
래트 혈장에서 선형 및 마크로사이클릭 화합물의 시험관 내 대사 안정성.
상기 실시예에서, 마크로사이클릭 화합물의 대사 안정성을 시험하였다. 대사 안정성은 생체내 비경구 투여할 계획인 화합물과 관련이 있으므로 마크로사이클릭 화합물과 선형 화합물 둘다에 대해 래트 혈장 안정성 연구를 수행하였다.
재료 및 방법
선형 및 마크로사이클릭 화합물 1 - 14 및 23-26(서열 번호 1 - 14 및 23-26)을 상이한 시점(0, 20, 40, 60 또는 120분) 동안 37°C에서 농도 1 μM로 래트 혈장 (Sprague-Dawley, 수컷; 400μl)으로 항온처리하였다. 항온처리는 아세토니트릴에 의해 종료하였다. 수집된 샘플을 2272 x g에서 20분 동안 원심분리하고 분석하였다. 스톡 용액은 50% DMSO를 사용하여 제조되었고, 화합물은 0.5%의 최종 DMSO 함량을 갖도록 항온처리에 1/100 스파이킹되었다. 화합물의 소멸을 모니터링하기 위해 샘플을 고해상도 질량 분광측정(DDI 모드의 QE-Orbitrap-MS)으로 UHPLC/PDA에 의해 분석하였다. 에날라프릴 1 μM은 소멸율 대조군으로서 사용하였다. 화합물 9, 10, 13 및 14의 분석을 위해 PBS로 스톡 용액을 제조하였고, 샘플을 UHPLC-ToF 질량 분광측정으로 분석하였다. 분석 방법은 최적의 크로마토그래피 성질(피크 모양 및 체류시간) 및 질량 분광측정 이온화를 위해 모 화합물을 사용하여 최적화되었다. 이온 크로마토그램은 5mDa 윈도우와 함께 계산된 단일 동위원소 정확한 질량을 사용하여 총 이온 크로마토그램으로부터 추출되었다. 소멸은 LC/MS 피크 면적을 기초로하고, 0 min을 100%로서 표시한다. 대사의 1차 속도 상수 k(min-1)는 Excel 소프트웨어를 사용하여 시간 대 로그(잔여 화합물의 %) 플롯의 기울기로부터 수득하였다. 연구 화합물의 시험관내 반감기 (t1/2)는 하기와 같이 정의된다: t1/2 = ln2/k. 계산된 반감기는 래트 혈장으로부터 화합물 소멸을 기초로 한다.
도 6a에서, 각각의 쌍의 막대는 변형되지 않은 펩타이드 (선형) 및 상응하는 변형된 펩타이드(사이클릭)에 대한 데이터를 보여준다. 시험관내 혈장 대사 안정성은 <30 분에서 >789 분으로 증가하였다. 많은 마크로사이클릭 화합물(화합물 2, 4, 8, 10, 14 및 26)은 이들의 선형 대응물 (각각 화합물 1, 3, 7, 9, 13 및 25)과 비교하여 래트 혈장에서 개선된 안정성을 보여주었다.
실시예 4
사람 혈장에서 선형 및 마크로사이클릭 화합물의 시험관 내 대사 안정성.
대사 안정성은 1μM의 초기 시험 농도로 120분의 시간 동안 사람 혈장을 사용하여 연구하였다. 샘플은 LC/QE-오비트랩(orbitrap)-MS을 사용하여 분석하였다. 계산된 반감기는 사람 혈장에서 화합물 소멸을 기초로 한다.
재료 및 방법
선형 및 마크로사이클릭 화합물 1-8, 11-14 및 23-24(서열 번호 1-8, 11-14 및 23-26)을 상이한 시점(0 , 20, 40, 60 또는 120분) 동안 37°C에서 농도 1 μM로 사람 혈장 (혼합 분쇄기, 400μl)으로 항온처리하였다. 항온처리는 아세토니트릴에 의해 종료하였다. 수집된 샘플을 2272 x g에서 20분 동안 원심분리하고 분석하였다. 화합물의 소멸을 모니터링하기 위해 샘플을 고해상도 질량 분광측정(DDI 모드의 QE-Orbitrap-MS)으로 UHPLC/PDA에 의해 분석하였다. 프로판텔린 브로마이드 1 μM은 소멸율 대조군으로서 사용하였다. 분석 방법은 최적의 크로마토그래피 성질(피크 모양 및 체류시간) 및 질량 분광측정 이온화를 위해 모 화합물을 사용하여 최적화되었다. 이온 크로마토그램은 5mDa 윈도우와 함께 계산된 단일 동위원소 정확한 질량을 사용하여 총 이온 크로마토그램으로부터 추출되었다. 소멸은 LC/MS 피크 면적을 기초로하고, 0 min을 100%로서 표시한다. 대사의 1차 속도 상수 k(min-1)는 Excel 소프트웨어를 사용하여 시간 대 로그(잔여 화합물의 %) 플롯의 기울기로부터 수득하였다. 연구 화합물의 시험관내 반감기 (t1/2)는 하기와 같이 정의된다: t1/2 = ln2 / k. 도 6b에서, 각각의 쌍의 막대는 변형되지 않은 펩타이드 (선형) 및 상응하는 변형된 펩타이드(사이클릭)에 대한 데이터를 보여준다.
사람 혈장에서 펩타이드 안정성은 사람 혈장에서 보고된 최대 반감기(시험별 최대 반감기는 795 min이었다)에 의해 나타난 바와 같이 래트 혈장에서의 이들의 안정성과 비교하여 선형 및 마크로사이클릭 화합물 둘다에서 보다 우수하였다. 2개의 마크로사이클릭 화합물(화합물 2 및 26)은 이들의 선형 대응물 (각각 화합물 1 및 25)과 비교하여 사람 혈장에서 개선된 안정성을 보여주었다.
실시예 5
래트 간세포에서 선형 및 마크로사이클릭 화합물의 시험관 내 대사 안정성.
간 대사는 화합물 제거에서 중추 역할을 하기 때문에 마크로사이클릭 및 선형 화합물의 대사 안정성은 배양된 래트 간세포에서 시험하였다.
재료 및 방법
선형 또는 마크로사이클릭 화합물 1-14 및 23-26 (서열번호 1-14 및 21-26)은 상이한 시점 동안(0, 10, 20, 40 또는 60 min) 37°C에서 농도 1μM로 풀링된 냉동보존된 간 세포 (스프라그-돌리, 수컷; 화합물 1-8, 11-12 및 23-26에 대해 400 μl, 100만 생존 세포/ml 또는 화합물 9-10 및 13-14에 대해 100 μl,10만 생존 세포/ml)로 항온처리하였다. 세포 밀도 및 생존력은 트립판 블루 배제 방법에 의해 결정되었다. 항온처리는 아세토니트릴에 의해 종료하였다. 수집된 샘플을 2272 x g에서 20분 동안 원심분리하고 분석하였다. 샘플은 고해상도 질량 분광측정(DDI 모드의 QE-오비트랩-MS)(화합물 1-8, 11-12 및 23-26) 또는 HHPLC-ToF 질량 분광측정(화합물 9-10 및 13-14에 대해)을 사용한 UHPLC/PDA로 분석하여 화합물의 소멸을 모니터링하였다. 베라프라밀 1μM은 소멸율 대조군으로서 사용하였다. 분석 방법은 최적의 크로마토그래피 성질(피크 모양 및 체류시간) 및 질량 분광측정 이온화를 위해 모 화합물을 사용하여 최적화되었다. 이온 크로마토그램은 5mDa 윈도우와 함께 계산된 단일 동위원소 정확한 질량을 사용하여 총 이온 크로마토그램으로부터 추출되었다. 소멸은 LC/MS 피크 면적을 기초로하고, 0 min을 100%로서 표시한다. 대사의 1차 속도 상수 k(min-1)는 Excel 소프트웨어를 사용하여 시간 대 로그(잔여 화합물의 %) 플롯의 기울기로부터 수득하였다. 연구 화합물의 시험관내 반감기 (t1/2)는 하기와 같이 정의된다: t1/2 = ln2/k. 계산된 반감기는 래트 간세포에서 화합물 소멸을 기초로 한다.
도 7a에서, 각각의 쌍의 막대는 변형되지 않은 펩타이드 (선형) 및 상응하는 변형된 펩타이드(사이클릭)에 대한 데이터를 보여준다. 시험관내 간세포 대사 안정성은 >10 분에서 >395 분으로 증가하였다.
모든 마크로사이클릭 화합물 (화합물 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 24 및 26)은 이들의 선형 대응물 (각각 화합물 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 23 및 25)과 비교하여 래트 간세포에서 유의적으로 개선된 안정성을 보여주었다.
실시예 6
사람 간세포에서 선형 및 마크로사이클릭 화합물의 시험관 내 대사 안정성.
재료 및 방법
선형 및 마크로사이클릭 화합물 1-8, 11-14 및 23-26(서열 번호 1-8, 11-14 및 23-26)을 상이한 시점(0, 10, 20, 40 또는 60분) 동안 37°C에서 농도 1 μM로 풀링된 냉동보존된 사람 간세포 (혼합 분쇄기, 400μl, 100만 생존 세포/ml)로 항온처리하였다. 세포 밀도 및 생존력은 트립판 블루 배제 방법에 의해 결정되었다. 항온처리는 아세토니트릴에 의해 종료하였다. 수집된 샘플을 2272 x g에서 20분 동안 원심분리하고 분석하였다. 화합물의 소멸을 모니터링하기 위해 샘플을 고해상도 질량 분광측정(DDI 모드의 QE-Orbitrap-MS)으로 UPLC/PDA에 의해 분석하였다. 베라프라밀 1 μM은 소멸율 대조군으로서 사용하였다. 분석 방법은 최적의 크로마토그래피 성질(피크 모양 및 체류시간) 및 질량 분광측정 이온화를 위해 모 화합물을 사용하여 최적화되었다. 이온 크로마토그램은 5mDa 윈도우와 함께 계산된 단일 동위원소 정확한 질량을 사용하여 총 이온 크로마토그램으로부터 추출되었다. 소멸은 LC/MS 피크 면적을 기초로하고, 0 min을 100%로서 표시한다. 대사의 1차 속도 상수 k(min-1)는 Excel 소프트웨어를 사용하여 시간 대 로그(잔여 화합물의 %) 플롯의 기울기로부터 수득하였다. 연구 화합물의 시험관내 반감기 (t1/2)는 하기와 같이 정의된다: t1/2 = ln2 / k. 계산된 반감기는 사람 간세포에서 화합물 소멸을 기초로 한다.
도 7b에서, 각각의 쌍의 막대는 변형되지 않은 펩타이드 (선형) 및 상응하는 변형된 펩타이드(사이클릭)에 대한 데이터를 보여준다.
거의 모든 마크로사이클릭 화합물 (화합물 2, 4, 6, 12, 14, 24 및 26)은 이들의 선형 대응물 (각각 화합물 1, 3, 5, 11, 13, 23 및 25)과 비교하여 사람 간세포에서 유의적으로 개선된 안정성을 보여주었다.
실시예 7
혈뇌 장벽의 3D 시험관내 모델에서 선형 및 마크로사이클릭 화합물의 투과 성질
말초 투여 경로를 사용한 CNS 질환 치료를 위한 CDNF- 및 MANF-유래 펩타이드 개발에 대한 관심과 마크로사이클화가 펩타이드의 세포 침투 및 분포 성질을 개선할 수 있다는 사실로 인해, 화합물이 혈뇌 장벽을 통과하는 능력이 혈뇌 장벽의 확립된 시험관 내 모델에서 시험되었다. 상기 목적을 위해, 마크로사이클릭 및 선형 화합물을 2구획 시험관내 혈뇌 장벽 모델(n=4)에서 2시간 동안 500nM에서 항온처리하고 이어서 샘플 수집 및 LC-MS/MS 분석을 수행하였다.
도 8은 상기 결과를 나타내고; 인공 혈뇌 장벽을 통과하는 화합물의 양은 본래에 적용된 화합물 농도의 퍼센트로서 표현한다. 선형 화합물에 비해 마크로사이클릭 화합물에서 보다 양호한 BBB 통과가 관찰되었다. BBB 침투는 <3% (비변형된 >30 aa 펩타이드)에서 >15% (변형된)로 증가하였다.
모든 마크로사이클릭 화합물(화합물 2, 4, 6, 8, 12, 14, 24 및 26)은 이들의 선형 대응물 (각각, 화합물 1, 3, 5, 7, 11, 13, 23 및 25)과 비교하여 시험관내 혈뇌 장벽을 통과하는 개선된 능력을 보여주었다.
재료 및 방법
성상교세포의 1차 배양 래트 성상교세포는 E15 배아로부터 제조하였다. 간략하게, 임신 15일의 임신한 암컷 래트(Wistar, Janvier Labs)를 (CO2 챔버)에서 깊게 마취시킨 다음 경추 탈구로 죽였다. 태아를 수집하고 즉시 2% 페니실린(10,000U/mL) 및 스트렙토마이신(10mg/mL) 용액(PS) 및 1% 소 혈청 알부민(BSA)이 포함된 빙냉 L15 Leibovitz 배지에 넣었다. 전체 뇌는 0.05% 트립신 및 0.02% EDTA의 최종 농도에서 트립신-EDTA 용액으로 37°C에서 20분 동안 처리하였다. 해리된 세포는 DMEM 10% 태아 소 혈청에서 배양하였다. 정제된 성상교세포는 계대 4 (P4)에서 사용하였다.
사람 내피 세포의 배양. HBMEC(1차 사람 뇌 미세혈관 내피 세포, ACBRI 376)의 바이알을 특정 계대 8(P8)에서 사용하였다.
피질 뉴런의 1차 배양. 래트 피질 뉴런은 변형과 함께 문헌(참조: Callizot et al., 2013)에 기재된 바와 같이 배양하였다. 간략하게, 임신 15일의 임신한 암컷 래트(Wistar, Janvier Labs)를 CO2 챔버에서 깊게 마취시킨 다음 경추 탈구로 죽였다. 태아를 수집하고 즉시 2% 페니실린(10,000U/mL) 및 스트렙토마이신(10mg/mL) 용액(PS) 및 1% 소 혈청 알부민(BSA)이 포함된 빙냉 L15 Leibovitz 배지에 넣었다. 피질은 0.05% 트립신 및 0.02% EDTA의 최종 농도에서 트립신-EDTA 용액으로 37°C에서 20분 동안 처리하였다. DNAse I 등급 II(최종 농도 0.5mg/mL) 및 10% 태아 소 혈청(FCS)을 포함하는 4.5g/L의 글루코스를 갖는 둘베코 변형된 이글 배지(DMEM)를 첨가하여 해리를 중단하였다. 세포는 10ml 피펫의 끝 부분을 통해 3회 강제 통과에 의해 기계적으로 해리시켰다. 이어서 세포는 4°C에서 10분동안 515 x g에서 원심분리하였다. 펠렛은 2%의 B27 보충제 용액, 2 mmol/L의 L-글루타민, 2%의 PS 용액, 10ng/mL의 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF)가 있는 Neurobasal 배지로 이루어진 정의된 배양 배지에 재현탁시켰다. 생존 세포는 트립판 블루 배제 시험을 사용하여 Neubauer 세포측정기에서 계수하였다. 피질 뉴런은 삽입물이 있는 24-웰 플레이트에 웰당 255,000의 밀도로 폴리-L-라이신으로 미리 코팅된 웰의 바닥에 씨딩하고, 공기(95%)-CO2(5%) 항온처리기에서 37°C에서 배양하였다. 배양 배지는 격일로 갈아주었다.
내피 세포, 성상교세포 및 1차 피질 뉴런의 공동 배양. 절차는 이전에 공개된 대로 수행되었다(문헌참조: Xue et al., 2013 수정, Callizot et al., 2017). 간략하게, 0일째에 정제된 성상교세포(P4)를 37°C의 수조에서 신속하게 해동시켰다. 세포를 즉시 10%의 FCS를 함유하는 DMEM에 넣었다. 세포 현탁액을 4℃에서 5분 동안 515 x g에서 원심분리하고 펠렛을 10%의 FCS를 함유하는 DMEM F12에 현탁시켰다. 세포를 삽입막(PET, 1μm)의 외부 측면에 삽입물당 45,000개 세포의 밀도로 씨딩하고 공기(95%)-CO2(5%) 항온처리기에서 37°C에서 배양하였다. 성상교세포를 씨딩한 지 36시간 후, HBMEC(P8)를 37°C의 수조에서 신속하게 해동시키고 즉시 10% FCS를 함유하는 DMEM에 넣었다. 세포 현탁액을 4°C에서 5분 동안 515 x g에서 원심분리하고, 펠렛을 5%의 FCS, 1%의 PS 용액, 1.4μM의 하이드로코르티손, 5㎍/mL의 아스코르브산, 1%의 지질 혼합물, 10mM의 HEPES, 1ng/mL의 bFGF를 함유하는 EGM-2 불렛 키트에 현탁시켰다. 세포를 삽입막(PET, 1μm)의 내부 측면에 삽입물당 50,000개 세포의 밀도로 씨딩하고 공기(95%)-CO2(5%) 항온처리기에서 37°C에서 배양하였다. HBMEC 씨딩 후 36시간(성상교세포 씨딩 후 72시간)에, 피질 뉴런을 웰당 170,000의 밀도로 폴리-L-라이신 사전 코팅된 웰 바닥에 씨딩하고 공기(95%)-CO2(5%) 항온처리기에서 37°C에서 배양하였다.
선형 또는 마크로사이클릭 화합물의 적용. HBMEC 씨딩 후 5일째, 내피 세포층의 무결성의 첫 번째 시험 후, 시험 화합물(화합물 1-8, 11-14 및 23-26, 서열 번호: 1-8, 11-14 및 21-26)을 루멘 구획에 첨가하고 500nM 농도에서 2시간 동안 항온처리하였다.
시험 화합물의 정량. 기저측부 상등액에서 각 화합물의 검출 및 정량화는 질량 분광측정(MS) 분석에 의해 추가로 수행하였다. 샘플 해동 후, 각각의 세포 배양 샘플의 100 μL 분취량을 질량 분광측정으로 펩타이드를 정량함에 의해 분석하였다. 계산된 통과 퍼센트는 적용 종료 시 기저 측부 구획에서 측정된 기저측부 구획에 적용된 화합물의 퍼센트를 나타낸다.
실시예 8
래트에게 말초 투여 후 마크로사이클릭 화합물의 생체 내 약동학 프로필
펩타이드의 소거 및 제거는 대사 및 신장 제거를 포함하는 생체 내 여러 과정에 의해 매개될 수 있다. 시험관 내 연구는 마크로사이클릭 펩타이드에 대해 개선된 대사 안정성을 시사하였기 때문에, 단일 용량 수준의 화합물을 말초(피하 및 정맥)에 투여하여 생체 내에서 예비 약동학 성질을 시험한 다음 말초 투여 후 다양한 시점에서 혈장 내 화합물의 존재를 결정하였다.
도 9a는 정맥내 투여 후 상이한 시점에서 마크로사이클릭 화합물 2, 10 및 14 (서열번호 2, 10 및 14) 및 선형 화합물 3 및 9 (서열번호 3 및 9)의 혈장 농도를 보여준다. 화합물 14는 개선된 혈액 체류 작용을 나타내었고 투여 후 적어도 2시간 동안 혈장에서 검출되었다.
표 1은 래트에 말초 투여 후 상이한 시점에서 측정된 선형 및 고리형 화합물의 혈장 농도로부터 계산된 생체내 약동학적 성질을 개시한다.
[표 1]
수컷 스프라그 돌리 래트에게 5 mg/kg 정맥내 볼러스 주사 후 선형 및 마크로사이클릭 화합물의 생체 내 약동학적 성질.
Figure pct00006
도 9b는 수컷 스프라그-돌리 래트에서 화합물 14의 뇌 분포 동역학을 보여준다. 미세투석 프로브는 이식된 가이드 캐뉼라를 통해 래트의 복부 선조체에 삽입되었고 aCSF로 관류하였다. 화합물 14는 단일 10 mg/kg 정맥내 볼러스 주사로 투여되었고 미세투석 샘플은 4시간 동안 20분 간격으로 수집되었다. 화합물의 뇌 간질액(ISF) 농도를 LC-MS/MS에 의해 결정하고 미세투석 막의 회수율(%)로 정규화하였다(시험관 내 실험에 의해 결정됨).
저분자량의 천연 선형 펩타이드는 대사 분해 및 제거 기전으로 인해 혈장에서 수분 내에 제거되기 때문에 전형적으로 순환 수명이 짧다(문헌참조: Li et al, 2015; Lin et al, 2009). 선택된 선형 및 마크로사이클릭 화합물의 혈장 농도는 래트에게 정맥내 투여 후 상이한 시점에서 측정하였다. 더욱이, 뇌 미세투석 연구는 단일 정맥내 볼러스 주사 후 뇌 실질에 대한 화합물 14의 침투를 보여주었다.
재료 및 방법
시험 화합물을 수컷 스프라그 돌리 래트(약 6주령, 화합물당 n=3)에 5 mg/kg으로 정맥내(i.v.) 투여하였다. 화합물 투여 후 2분, 5분, 15분, 30분, 1시간, 2시간 및 4시간에 항응고제(헤파린)를 함유하는 표지된 폴리프로필렌 튜브에 이식된 카테터를 통해 경정맥에서 혈액 샘플(250㎕ 혈액)을 수거하였고, 최대 30분 동안 젖은 빙상에서 유지하였다. 혈액 샘플은 혈장 분리를 위해 원심분리하였다(4℃, 21100 G, 5 min). 아세토니트릴 또는 MeCN 중에 10% TFA가 포함된 톨부타미드 500ng/ml를 내부 표준 용액으로 사용하였다. 표준 샘플은 매트릭스를 각각 2 - 10,000ng/ml의 분석 물질 농도로 스파이킹하여 래트 혈장으로 준비하고, 그렇지 않으면 샘플로 처리하였다. 50 μl의 샘플 혈장의 분취액에 200 μl의 내부 표준물을 첨가하였다. 샘플을 혼합(150 rpm, 15 min)하고 원심분리(3000 rpm, 15min)하였다. 분석 방법은 반응 모니터링 크로마토그래피(피크 모양 및 체류) 이동 및 질량 분광측정 성질(이온화 효율, MS/MS 검출)을 위해 최적화되었다. 상등액은 전기분무 이온화를 사용하여 UHPLC - TOF 질량 분광측정에 의해 분석하였다.
뇌 미세투석 연구는 화합물 14로 정맥내 처리된 깨어 있는 동물의 별도 그룹에 대해 수행되었다. 미세투석 실험 1주일 전에 스프라그-돌리 래트에게 다음 좌표의 선조체에 가이드 캐뉼라를 이식하였다: AP +0.6mm; L -3.0mm; V -2.8 mm, 미세투석 프로브 팁에 대한 최종 V -6.8 mm를 제공함. 실험 당일 미세투석 프로브(Eicom A-I: 0.22 mm O.D., 컷오프 50 kDa의 4 mm 막 길이)를 가이드 캐뉼라에 삽입하고 인공 뇌척수 유체 (aCSF) 용액을 사용하여 0.1 μL/min의 일정한 유속으로 관류하였다. 120-150분의 안정화 기간 후 화합물 18을 단일 10 mg/kg 정맥내 볼러스 주사로 투여하고 샘플을 4시간 동안 20분 간격으로 수집하였다. 화합물의 뇌 간질 유체 농도를 UHPLC-MS/MS로 분석하였다. 생체내 시험과 유사한 조건에서 aCSF로 관류할 때 튜브, 커넥터 및 미세투석 프로브로부터 시험 화합물의 회수를 결정하기 위해 추가 시험관내 시험을 수행하였다. 결정된 회수 퍼센트 (29.3%)는 미세투석 연구에서 수득된 데이터의 보정을 위해 사용하였다.
인용 목록
특허문헌
Figure pct00007
비특허문헌
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
SEQUENCE LISTING <110> Herantis Pharma Oyj <120> Macrocyclic peptides <130> P4701EP00 <150> EP19218576.7 <151> 2019-12-20 <160> 72 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> disulphide bridge <220> <221> DISULFID <222> join(22..25) <400> 1 Val Asp Leu Arg Lys Met Arg Val Ala Glu Leu Lys Gln Ile Leu His 1 5 10 15 Ser Trp Gly Glu Glu Cys Arg Ala Cys Ala Glu 20 25 <210> 2 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> head-to-tail cyclic, disulphide bridge <220> <221> DISULFID <222> join(22..25) <400> 2 Val Asp Leu Arg Lys Met Arg Val Ala Glu Leu Lys Gln Ile Leu His 1 5 10 15 Ser Trp Gly Glu Glu Cys Arg Ala Cys Ala Glu 20 25 <210> 3 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> disulphide bridge <220> <221> DISULFID <222> join(22..25) <400> 3 Val Asp Leu Lys Lys Leu Arg Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu Asp 1 5 10 15 Asp Trp Gly Glu Thr Cys Lys Gly Cys Ala Glu 20 25 <210> 4 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> head-to-tail cyclic,disulphide bridge <220> <221> DISULFID <222> join(22..25) <400> 4 Val Asp Leu Lys Lys Leu Arg Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu Asp 1 5 10 15 Asp Trp Gly Glu Thr Cys Lys Gly Cys Ala Glu 20 25 <210> 5 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> disulphide bridge <220> <221> DISULFID <222> join(17..20) <400> 5 Met Arg Val Ala Glu Leu Lys Gln Ile Leu His Ser Trp Gly Glu Glu 1 5 10 15 Cys Arg Ala Cys Ala Glu Lys 20 <210> 6 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> head-to-tail cyclic, disulphide bridge <220> <221> DISULFID <222> join(17..20) <400> 6 Met Arg Val Ala Glu Leu Lys Gln Ile Leu His Ser Trp Gly Glu Glu 1 5 10 15 Cys Arg Ala Cys Ala Glu Lys 20 <210> 7 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> disulphide bridge <220> <221> DISULFID <222> join(17..20) <400> 7 Leu Arg Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr 1 5 10 15 Cys Lys Gly Cys Ala Glu Lys 20 <210> 8 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> head-to-tail cyclic, disulphide bridge <220> <221> DISULFID <222> join(17..20) <400> 8 Leu Arg Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr 1 5 10 15 Cys Lys Gly Cys Ala Glu Lys 20 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> disulphide bridge <220> <221> DISULFID <222> join(11..14) <400> 9 Lys Ser Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys Lys Gly Cys Ala Glu 1 5 10 15 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> head-to-tail cyclic, disulphide bridge <220> <221> DISULFID <222> join(11..14) <400> 10 Lys Ser Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys Lys Gly Cys Ala Glu 1 5 10 15 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> disulphide bridge <220> <221> DISULFID <222> join(5..8) <400> 11 Trp Gly Glu Glu Cys Arg Ala Cys Ala Glu Lys Thr 1 5 10 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> head-to-tail cyclic, disulphide bridge <220> <221> DISULFID <222> join(5..8) <400> 12 Trp Gly Glu Glu Cys Arg Ala Cys Ala Glu Lys Thr 1 5 10 <210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> disulphide bridge <220> <221> DISULFID <222> join(5..8) <400> 13 Trp Gly Glu Thr Cys Lys Gly Cys Ala Glu Lys Ser 1 5 10 <210> 14 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> head-to-tail cyclic, disulphide bridge <220> <221> DISULFID <222> join(5..8) <400> 14 Trp Gly Glu Thr Cys Lys Gly Cys Ala Glu Lys Ser 1 5 10 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> disulphide bridge <220> <221> DISULFID <222> join(4..7) <400> 15 Gly Glu Glu Cys Arg Ala Cys Ala Glu Lys Thr 1 5 10 <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> disulphide bridge <220> <221> DISULFID <222> join(4..8) <400> 16 Gly Glu Glu Cys Arg Gly Ala Cys Ala Glu Lys Thr 1 5 10 <210> 17 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> disulphide bridge <220> <221> DISULFID <222> join(4..8) <400> 17 Gly Glu Glu Cys Arg Ala Ala Cys Ala Glu Lys Thr 1 5 10 <210> 18 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> disulphide bridge <220> <221> DISULFID <222> join(4..8) <400> 18 Gly Glu Glu Cys Arg Ser Ala Cys Ala Glu Lys Thr 1 5 10 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> disulphide bridge <220> <221> DISULFID <222> join(4..7) <400> 19 Gly Glu Thr Cys Lys Gly Cys Ala Glu Lys Ser 1 5 10 <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> disulphide bridge <220> <221> DISULFID <222> join(4..8) <400> 20 Gly Glu Thr Cys Lys Gly Gly Cys Ala Glu Lys Ser 1 5 10 <210> 21 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> disulphide bridge <220> <221> DISULFID <222> join(4..8) <400> 21 Gly Glu Thr Cys Lys Ala Gly Cys Ala Glu Lys Ser 1 5 10 <210> 22 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> disulphide bridge <220> <221> DISULFID <222> join(4..8) <400> 22 Gly Glu Thr Cys Lys Ser Gly Cys Ala Glu Lys Ser 1 5 10 <210> 23 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> disulphide bridge <220> <221> DISULFID <222> join(5..9) <400> 23 Trp Gly Glu Glu Cys Arg Gly Ala Cys Ala Glu Lys Thr 1 5 10 <210> 24 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> head-to-tail cyclic, disulphide bridge <220> <221> DISULFID <222> join(5..9) <400> 24 Trp Gly Glu Glu Cys Arg Gly Ala Cys Ala Glu Lys Thr 1 5 10 <210> 25 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> disulphide bridge <220> <221> DISULFID <222> join(5..9) <400> 25 Trp Gly Glu Thr Cys Lys Gly Gly Cys Ala Glu Lys Ser 1 5 10 <210> 26 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> head-to-tail cyclic, disulphide bridge <220> <221> DISULFID <222> join(5..9) <400> 26 Trp Gly Glu Thr Cys Lys Gly Gly Cys Ala Glu Lys Ser 1 5 10 <210> 27 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> X1 = absent, R, K, I, G, A or S <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> X2 = G, A, R, K, I or S <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> X3 = A, G or S <400> 27 Cys Xaa Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> X4 = E, T, V, D, M or G <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> X1 = R, K, I, G, A or S <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> X2 = absent, G, A, R, K, I or S <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> X3 = A, G or S <400> 28 Glu Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Ala Glu 1 5 <210> 29 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> X5 = absent, H, D, Q, R, Y, N or S <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> X6 = absent, S, D, G, N or R <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> X7 = absent or W <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> X8 = absent or G <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> X4 = E, T, V, D, M or G <220> <221> VARIANT <222> 8 <223> X1 = R, K, I, G, A or S <220> <221> VARIANT <222> 9 <223> X2 = absent, G, A, R, K, I or S <220> <221> VARIANT <222> 10 <223> X3 = A, G or S <220> <221> VARIANT <222> 14 <223> X9 = absent or K <220> <221> VARIANT <222> 15 <223> X10 = absent, T, S, A, I or N <220> <221> VARIANT <222> 16 <223> X11 = absent, D or E <400> 29 Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Ala Glu Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 <210> 30 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> X12 = absent, L, I or V <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> X13 = absent or D <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> X14 = absent, L or W <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> X15 = absent, A, S, T, E or N <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> X16 = absent, S or T <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> X17 = absent, V or D <220> <221> VARIANT <222> 7 <223> X18 = absent, D or A <220> <221> VARIANT <222> 8 <223> X19 = absent or L <220> <221> VARIANT <222> 9 <223> X20 = absent, R, K, S or W <220> <221> VARIANT <222> 10 <223> X21 = absent or K <220> <221> VARIANT <222> 11 <223> X22 = absent, M, L, I or V <220> <221> VARIANT <222> 12 <223> X23 = absent or R <220> <221> VARIANT <222> 14 <223> X24 = A, K, T, L or V <220> <221> VARIANT <222> 18 <223> X25 = Q, K or R <220> <221> VARIANT <222> 19 <223> X26 = I or V <220> <221> VARIANT <222> 21 <223> X5 = absent, H, D, Q, R, Y, N or S <220> <221> VARIANT <222> 22 <223> X6 = absent, S, D, G, N or R <220> <221> VARIANT <222> 23 <223> X7 = absent or W <220> <221> VARIANT <222> 24 <223> X8 = absent or G <220> <221> VARIANT <222> 26 <223> X4 = E, T, V, D, M or G <220> <221> VARIANT <222> 28 <223> X1 = R, K, I, G, A or S <220> <221> VARIANT <222> 29 <223> X2 = absent, G, A, R, K, I or S <220> <221> VARIANT <222> 30 <223> X3 = A, G or S <220> <221> VARIANT <222> 34 <223> X9 = absent or K <220> <221> VARIANT <222> 35 <223> X10 = absent, T, S, A, I or N <220> <221> VARIANT <222> 36 <223> X11 = absent, D or E <400> 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Glu Leu 1 5 10 15 Lys Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Ala 20 25 30 Glu Xaa Xaa Xaa 35 <210> 31 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> native human CDNF peptide <400> 31 Arg Val Ala Glu Leu Lys Gln Ile Leu His Ser Trp Gly Glu Glu Cys 1 5 10 15 Arg Ala Cys Ala Glu Lys Thr Asp Tyr Val Asn Leu Ile Gln Glu Leu 20 25 30 Ala Pro Lys Tyr Ala 35 <210> 32 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> native human MANF peptide <400> 32 Arg Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys 1 5 10 15 Lys Gly Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu 20 25 30 Met Pro Lys Tyr Ala 35 <210> 33 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> X16 = absent, S or T <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> X17 = absent, V or D <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> X18 = absent, D or A <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> X19 = absent or L <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> X20 = absent, R, K, S or W <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> X21 = absent or K <220> <221> VARIANT <222> 7 <223> X22 = absent, M, L, I or V <220> <221> VARIANT <222> 8 <223> X23 = absent or R <220> <221> VARIANT <222> 10 <223> X24 = A, K, T, L or V <220> <221> VARIANT <222> 14 <223> X25 = Q, K or R <220> <221> VARIANT <222> 15 <223> X26 = I or V <220> <221> VARIANT <222> 17 <223> X5 = absent, H, D, Q, R, Y, N or S <220> <221> VARIANT <222> 18 <223> X6 = absent, S, D, G, N or R <220> <221> VARIANT <222> 19 <223> X7 = absent or W <220> <221> VARIANT <222> 20 <223> X8 = absent or G <220> <221> VARIANT <222> 22 <223> X4 = E, T, V, D, M or G <220> <221> VARIANT <222> 24 <223> X1 = R, K, I, G, A or S <220> <221> VARIANT <222> 25 <223> X2 = absent, G, A, R, K, I or S <220> <221> VARIANT <222> 26 <223> X3 = A, G or S <220> <221> VARIANT <222> 30 <223> X9 = absent or K <220> <221> VARIANT <222> 31 <223> X10 = absent, T, S, A, I or N <220> <221> VARIANT <222> 32 <223> X11 = absent, D or E <400> 33 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Glu Leu Lys Xaa Xaa Leu 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Ala Glu Xaa Xaa Xaa 20 25 30 <210> 34 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> X15 = absent, A, S, T, E or N <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> X16 = absent, S or T <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> X17 = absent, V or D <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> X18 = absent, D or A <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> X19 = absent or L <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> X20 = absent, R, K, S or W <220> <221> VARIANT <222> 7 <223> X21 = absent or K <220> <221> VARIANT <222> 8 <223> X22 = absent, M, L, I or V <220> <221> VARIANT <222> 9 <223> X23 = absent or R <220> <221> VARIANT <222> 9 <223> X23 = absent or R <220> <221> VARIANT <222> 11 <223> X24 = A, K, T, L or V <220> <221> VARIANT <222> 15 <223> X25 = Q, K or R <220> <221> VARIANT <222> 16 <223> X26 = I or V <220> <221> VARIANT <222> 18 <223> X5 = absent, H, D, Q, R, Y, N or S <220> <221> VARIANT <222> 19 <223> X6 = absent, S, D, G, N or R <220> <221> VARIANT <222> 20 <223> X7 = absent or W <220> <221> VARIANT <222> 21 <223> X8 = absent or G <220> <221> VARIANT <222> 23 <223> X4 = E, T, V, D, M or G <220> <221> VARIANT <222> 25 <223> X1 = R, K, I, G, A or S <220> <221> VARIANT <222> 26 <223> X2 = absent, G, A, R, K, I or S <220> <221> VARIANT <222> 27 <223> X3 = A, G or S <220> <221> VARIANT <222> 31 <223> X9 = absent or K <400> 34 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Glu Leu Lys Xaa Xaa 1 5 10 15 Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Ala Glu Xaa Xaa 20 25 30 <210> 35 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> X14 = absent, L or W <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> X15 = absent, A, S, T, E or N <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> X16 = absent, S or T <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> X17 = absent, V or D <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> X18 = absent, D or A <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> X19 = absent or L <220> <221> VARIANT <222> 7 <223> X20 = absent, R, K, S or W <220> <221> VARIANT <222> 8 <223> X21 = absent or K <220> <221> VARIANT <222> 9 <223> X22 = absent, M, L, I or V <220> <221> VARIANT <222> 10 <223> X23 = absent or R <220> <221> VARIANT <222> 12 <223> X24 = A, K, T, L or V <220> <221> VARIANT <222> 16 <223> X25 = Q, K or R <220> <221> VARIANT <222> 17 <223> X26 = I or V <220> <221> VARIANT <222> 19 <223> X5 = absent, H, D, Q, R, Y, N or S <220> <221> VARIANT <222> 20 <223> X6 = absent, S, D, G, N or R <220> <221> VARIANT <222> 21 <223> X7 = absent or W <220> <221> VARIANT <222> 22 <223> X8 = absent or G <220> <221> VARIANT <222> 24 <223> X4 = E, T, V, D, M or G <220> <221> VARIANT <222> 26 <223> X1 = R, K, I, G, A or S <220> <221> VARIANT <222> 27 <223> X2 = absent, G, A, R, K, I or S <220> <221> VARIANT <222> 28 <223> X3 = A, G or S <220> <221> VARIANT <222> 32 <223> X9 = absent or K <400> 35 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Glu Leu Lys Xaa 1 5 10 15 Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Ala Glu Xaa 20 25 30 <210> 36 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> X13 = absent or D <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> X14 = absent, L or W <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> X15 = absent, A, S, T, E or N <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> X16 = absent, S or T <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> X17 = absent, V or D <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> X18 = absent, D or A <220> <221> VARIANT <222> 7 <223> X19 = absent or L <220> <221> VARIANT <222> 8 <223> X20 = absent, R, K, S or W <220> <221> VARIANT <222> 9 <223> X21 = absent or K <220> <221> VARIANT <222> 10 <223> X22 = absent, M, L, I or V <220> <221> VARIANT <222> 11 <223> X23 = absent or R <220> <221> VARIANT <222> 13 <223> X24 = A, K, T, L or V <220> <221> VARIANT <222> 17 <223> X25 = Q, K or R <220> <221> VARIANT <222> 18 <223> X26 = I or V <220> <221> VARIANT <222> 20 <223> X5 = absent, H, D, Q, R, Y, N or S <220> <221> VARIANT <222> 21 <223> X6 = absent, S, D, G, N or R <220> <221> VARIANT <222> 22 <223> X7 = absent or W <220> <221> VARIANT <222> 23 <223> X8 = absent or G <220> <221> VARIANT <222> 25 <223> X4 = E, T, V, D, M or G <220> <221> VARIANT <222> 27 <223> X1 = R, K, I, G, A or S <220> <221> VARIANT <222> 28 <223> X2 = absent, G, A, R, K, I or S <220> <221> VARIANT <222> 29 <223> X3 = A, G or S <400> 36 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Glu Leu Lys 1 5 10 15 Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Ala Glu 20 25 30 <210> 37 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 37 Lys Asp Glu Leu 1 <210> 38 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 38 Cys Arg Ala Cys 1 <210> 39 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 39 Cys Lys Gly Cys 1 <210> 40 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> X1 = K or R <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> X2 = G or A <400> 40 Cys Xaa Xaa Cys 1 <210> 41 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 41 Glu Thr Cys Lys Gly Cys Ala Glu 1 5 <210> 42 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 42 Thr Cys Lys Gly Cys Ala 1 5 <210> 43 <211> 187 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> NCBI Reference Sequence: NP_001025125.2 <400> 43 Met Trp Cys Ala Ser Pro Val Ala Val Val Ala Phe Cys Ala Gly Leu 1 5 10 15 Leu Val Ser His Pro Val Leu Thr Gln Gly Gln Glu Ala Gly Gly Arg 20 25 30 Pro Gly Ala Asp Cys Glu Val Cys Lys Glu Phe Leu Asn Arg Phe Tyr 35 40 45 Lys Ser Leu Ile Asp Arg Gly Val Asn Phe Ser Leu Asp Thr Ile Glu 50 55 60 Lys Glu Leu Ile Ser Phe Cys Leu Asp Thr Lys Gly Lys Glu Asn Arg 65 70 75 80 Leu Cys Tyr Tyr Leu Gly Ala Thr Lys Asp Ala Ala Thr Lys Ile Leu 85 90 95 Ser Glu Val Thr Arg Pro Met Ser Val His Met Pro Ala Met Lys Ile 100 105 110 Cys Glu Lys Leu Lys Lys Leu Asp Ser Gln Ile Cys Glu Leu Lys Tyr 115 120 125 Glu Lys Thr Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp Leu Arg Lys Met Arg Val 130 135 140 Ala Glu Leu Lys Gln Ile Leu His Ser Trp Gly Glu Glu Cys Arg Ala 145 150 155 160 Cys Ala Glu Lys Thr Asp Tyr Val Asn Leu Ile Gln Glu Leu Ala Pro 165 170 175 Lys Tyr Ala Ala Thr His Pro Lys Thr Glu Leu 180 185 <210> 44 <211> 182 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> NCBI Reference Sequence: NP_006001.5 <400> 44 Met Arg Arg Met Trp Ala Thr Gln Gly Leu Ala Val Ala Leu Ala Leu 1 5 10 15 Ser Val Leu Pro Gly Ser Arg Ala Leu Arg Pro Gly Asp Cys Glu Val 20 25 30 Cys Ile Ser Tyr Leu Gly Arg Phe Tyr Gln Asp Leu Lys Asp Arg Asp 35 40 45 Val Thr Phe Ser Pro Ala Thr Ile Glu Asn Glu Leu Ile Lys Phe Cys 50 55 60 Arg Glu Ala Arg Gly Lys Glu Asn Arg Leu Cys Tyr Tyr Ile Gly Ala 65 70 75 80 Thr Asp Asp Ala Ala Thr Lys Ile Ile Asn Glu Val Ser Lys Pro Leu 85 90 95 Ala His His Ile Pro Val Glu Lys Ile Cys Glu Lys Leu Lys Lys Lys 100 105 110 Asp Ser Gln Ile Cys Glu Leu Lys Tyr Asp Lys Gln Ile Asp Leu Ser 115 120 125 Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu Arg Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu 130 135 140 Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys Lys Gly Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr 145 150 155 160 Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu Met Pro Lys Tyr Ala Pro Lys Ala Ala 165 170 175 Ser Ala Arg Thr Asp Leu 180 <210> 45 <211> 49 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Thr Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp Leu Arg Lys Met Arg Val Ala Glu 1 5 10 15 Leu Lys Gln Ile Leu His Ser Trp Gly Glu Glu Cys Arg Ala Cys Ala 20 25 30 Glu Lys Thr Asp Tyr Val Asn Leu Ile Gln Glu Leu Ala Pro Lys Tyr 35 40 45 Ala <210> 46 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Arg Val Ala Glu Leu Lys Gln Ile Leu His Ser Trp Gly Glu Glu Cys 1 5 10 15 Arg Ala Cys Ala Glu Lys Thr Asp Tyr Val Asn Leu Ile Gln Glu Leu 20 25 30 Ala Pro Lys Tyr Ala 35 <210> 47 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Thr Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp Leu Arg Lys Met Arg Val Ala Glu 1 5 10 15 Leu Lys Gln Ile Leu His Ser Trp Gly Glu Glu Cys Arg Ala Cys Ala 20 25 30 Glu Lys Thr 35 <210> 48 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Leu Ala Ser Val Asp Leu Arg Lys Met Arg Val Ala Glu Leu Lys Gln 1 5 10 15 Ile Leu His Ser Trp Gly Glu Glu Cys Arg Ala Cys Ala Glu Lys Thr 20 25 30 <210> 49 <211> 49 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Gln Ile Asp Leu Ser Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu Arg Val Lys Glu 1 5 10 15 Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys Lys Gly Cys Ala 20 25 30 Glu Lys Ser Asp Tyr Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu Met Pro Lys Tyr 35 40 45 Ala <210> 50 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Arg Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys 1 5 10 15 Lys Gly Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu 20 25 30 Met Pro Lys Tyr Ala 35 <210> 51 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Gln Ile Asp Leu Ser Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu Arg Val Lys Glu 1 5 10 15 Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys Lys Gly Cys Ala 20 25 30 Glu Lys Ser 35 <210> 52 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Leu Ser Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu Arg Val Lys Glu Leu Lys Lys 1 5 10 15 Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys Lys Gly Cys Ala Glu Lys Ser 20 25 30 <210> 53 <211> 61 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Human CDNF (NP_001025125.2) <400> 53 Lys Tyr Glu Lys Thr Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp Leu Arg Lys Met 1 5 10 15 Arg Val Ala Glu Leu Lys Gln Ile Leu His Ser Trp Gly Glu Glu Cys 20 25 30 Arg Ala Cys Ala Glu Lys Thr Asp Tyr Val Asn Leu Ile Gln Glu Leu 35 40 45 Ala Pro Lys Tyr Ala Ala Thr His Pro Lys Thr Glu Leu 50 55 60 <210> 54 <211> 61 <212> PRT <213> Equus <220> <223> Horse CDNF (XP_001498617.2) <400> 54 Lys Tyr Glu Lys Lys Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp Leu Leu Lys Met 1 5 10 15 Arg Val Ala Glu Leu Lys Gln Ile Leu Asn Ser Trp Gly Glu Glu Cys 20 25 30 Arg Ala Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr Val Asn Leu Ile Lys Glu Leu 35 40 45 Ala Pro Lys Tyr Ala Ala Met His Pro Lys Thr Glu Leu 50 55 60 <210> 55 <211> 61 <212> PRT <213> Bos <220> <223> Bison CDNF (XP_010858254.1) <400> 55 Lys Tyr Glu Lys Lys Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp Leu Ser Lys Met 1 5 10 15 Arg Val Ala Glu Leu Lys Gln Ile Leu His Gly Trp Gly Glu Glu Cys 20 25 30 Arg Ala Cys Ala Glu Lys Thr Asp Tyr Val Asn Leu Ile Lys Glu Leu 35 40 45 Ala Pro Lys Tyr Ala Ala Thr His Pro Gln Thr Glu Leu 50 55 60 <210> 56 <211> 61 <212> PRT <213> Sus <220> <223> Pig CDNF (XP_003130787.1) <400> 56 Lys Tyr Glu Lys Lys Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp Leu Ser Lys Met 1 5 10 15 Arg Val Ala Glu Leu Lys Gln Ile Leu Tyr Ser Trp Gly Glu Glu Cys 20 25 30 Arg Ala Cys Ala Glu Lys Thr Asp Tyr Val Asn Leu Ile Lys Glu Leu 35 40 45 Ala Pro Lys Tyr Thr Glu Thr Pro Pro Gln Thr Glu Leu 50 55 60 <210> 57 <211> 61 <212> PRT <213> Canis <220> <223> Dog CDNF (XP_848954.2) <400> 57 Lys Tyr Glu Lys Lys Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp Leu Ser Lys Met 1 5 10 15 Arg Val Ala Glu Leu Lys Gln Ile Leu His Ser Trp Gly Glu Glu Cys 20 25 30 Ile Ala Cys Ala Glu Lys Thr Asp Tyr Val Asn Leu Ile Thr Glu Leu 35 40 45 Ala Pro Lys Tyr Ala Ala Ala His Pro Lys Thr Glu Leu 50 55 60 <210> 58 <211> 61 <212> PRT <213> Musculus <220> <223> Mouse CDNF (NP_808315.1) <400> 58 Lys Tyr Gly Lys Lys Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp Leu Trp Lys Met 1 5 10 15 Arg Val Ala Glu Leu Lys Gln Ile Leu Gln Arg Trp Gly Glu Glu Cys 20 25 30 Arg Ala Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr Val Asn Leu Ile Arg Glu Leu 35 40 45 Ala Pro Lys Tyr Val Glu Ile Tyr Pro Gln Thr Glu Leu 50 55 60 <210> 59 <211> 61 <212> PRT <213> Cricetus <220> <223> Hamster CDNF (XP_027261009.1) <400> 59 Asn Tyr Glu Lys Lys Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp Leu Trp Lys Met 1 5 10 15 Arg Asp Ala Glu Leu Lys Gln Ile Leu His Ser Trp Gly Glu Glu Cys 20 25 30 Arg Ala Cys Ala Glu Lys Asn Asp Tyr Val Asn Leu Ile Lys Glu Leu 35 40 45 Ala Pro Lys Tyr Val Glu Ile His Pro Gln Ile Glu Leu 50 55 60 <210> 60 <211> 61 <212> PRT <213> Alligator <220> <223> Alligator CDNF (XP_019343086.1) <400> 60 Lys Tyr Glu Arg Lys Leu Asp Leu Thr Ser Val Asp Leu Ser Lys Met 1 5 10 15 Arg Val Ala Glu Leu Arg Lys Ile Leu Asp Ser Trp Gly Glu Val Cys 20 25 30 Lys Ala Cys Ile Glu Lys Thr Glu Phe Val Asn Leu Ile Lys Glu Leu 35 40 45 Ala Pro Lys Tyr Ala Pro Pro Asn Ser Arg Ala Asp Leu 50 55 60 <210> 61 <211> 61 <212> PRT <213> Delphinus <220> <223> Dolphin CDNF (XP_026977721.1) <400> 61 Lys Tyr Glu Lys Lys Leu Asp Leu Ala Ser Val Asp Leu Ser Lys Met 1 5 10 15 Arg Val Ala Glu Leu Lys Gln Ile Leu Tyr Ser Trp Gly Glu Glu Cys 20 25 30 Arg Ala Cys Val Glu Lys Thr Asp Tyr Val Asn Leu Ile Lys Glu Leu 35 40 45 Ala Pro Lys Tyr Thr Ala Thr Tyr Pro Lys Thr Glu Leu 50 55 60 <210> 62 <211> 65 <212> PRT <213> Danio rerio <220> <223> Zebrafish CDNF (NP_001116753.1) <400> 62 Arg Tyr Glu Arg Leu Val Leu Asp Trp Ser Thr Asp Ala Leu Ser Lys 1 5 10 15 Met Arg Ala Leu Glu Leu Lys Arg Val Leu Ala Ser Trp Gly Glu Glu 20 25 30 Cys Arg Ala Cys Leu Glu Lys Ser Glu Phe Ile Ala Leu Ile Gln Glu 35 40 45 Val Ala Pro Lys His Ser Ala Ser Glu His Arg Ala His Thr Glu Glu 50 55 60 Phe 65 <210> 63 <211> 63 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Human MANF (NP_006001.5) <400> 63 Lys Tyr Asp Lys Gln Ile Asp Leu Ser Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu 1 5 10 15 Arg Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys 20 25 30 Lys Gly Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu 35 40 45 Met Pro Lys Tyr Ala Pro Lys Ala Ala Ser Ala Arg Thr Asp Leu 50 55 60 <210> 64 <211> 63 <212> PRT <213> Equus <220> <223> Horse MANF (NP_001184244.1) <400> 64 Lys Tyr Asp Lys Gln Ile Asp Leu Ser Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu 1 5 10 15 Arg Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys 20 25 30 Lys Gly Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu 35 40 45 Met Pro Lys Tyr Ala Pro Lys Ala Ala Ser Ser Arg Thr Asp Leu 50 55 60 <210> 65 <211> 63 <212> PRT <213> Bison <220> <223> Bison MANF (XP_010850093.1) <400> 65 Lys Tyr Asp Lys Gln Ile Asp Leu Ser Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu 1 5 10 15 Arg Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys 20 25 30 Lys Gly Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu 35 40 45 Met Pro Lys Tyr Ala Pro Lys Ala Ala Ser Ser Arg Thr Asp Leu 50 55 60 <210> 66 <211> 63 <212> PRT <213> Sus <220> <223> Pig MANF (NP_001231584.1) <400> 66 Lys Tyr Asp Lys Gln Ile Asp Leu Ser Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu 1 5 10 15 Arg Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys 20 25 30 Lys Gly Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu 35 40 45 Met Pro Lys Tyr Ala Pro Lys Ala Ala Ser Ser Arg Thr Asp Leu 50 55 60 <210> 67 <211> 63 <212> PRT <213> Canis <220> <223> Dog MANF (XP_003639808.2) <400> 67 Lys Tyr Asp Lys Gln Ile Asp Leu Arg Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu 1 5 10 15 Arg Val Arg Glu Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys 20 25 30 Lys Gly Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu 35 40 45 Met Pro Lys Tyr Ala Pro Lys Ala Ala Ser Ser Arg Thr Asp Leu 50 55 60 <210> 68 <211> 63 <212> PRT <213> Musculus <220> <223> Mouse MANF (NP_083379.2) <400> 68 Lys Tyr Asp Lys Gln Ile Asp Leu Ser Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu 1 5 10 15 Arg Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Met Cys 20 25 30 Lys Gly Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu 35 40 45 Met Pro Lys Tyr Ala Pro Lys Ala Ala Ser Ala Arg Thr Asp Leu 50 55 60 <210> 69 <211> 63 <212> PRT <213> Cricetus <220> <223> Hamster MANF (RLQ67668) <400> 69 Lys Tyr Asp Lys Gln Ile Asp Leu Ser Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu 1 5 10 15 Arg Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Met Cys 20 25 30 Lys Gly Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu 35 40 45 Met Pro Lys Tyr Ala Pro Lys Ala Ala Ser Ala Arg Thr Asp Leu 50 55 60 <210> 70 <211> 63 <212> PRT <213> Alligator <220> <223> Alligator MANF (XP_014455597.1) <400> 70 Lys Tyr Asp Lys Gln Ile Asp Leu Ser Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu 1 5 10 15 Arg Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys 20 25 30 Lys Gly Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu 35 40 45 Met Pro Lys Tyr Ala Pro Lys Ala Ala Ser Ser Arg Thr Asp Leu 50 55 60 <210> 71 <211> 63 <212> PRT <213> Delphinus <220> <223> Dolphin MANF (XP_026976745.1) <400> 71 Lys Tyr Asp Lys Gln Ile Asp Leu Ser Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu 1 5 10 15 Arg Val Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys 20 25 30 Lys Gly Cys Ala Glu Lys Ser Asp Tyr Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu 35 40 45 Met Pro Lys Tyr Ala Pro Lys Ala Ala Ser Ser Arg Thr Asp Leu 50 55 60 <210> 72 <211> 63 <212> PRT <213> Danio rerio <220> <223> Zebrafish MANF (NP_001070097.1) <400> 72 Lys Tyr Asp Lys Gln Val Asp Leu Ser Ser Val Asp Leu Lys Lys Leu 1 5 10 15 Lys Val Lys Asp Leu Lys Lys Ile Leu Glu Glu Trp Gly Glu Ser Cys 20 25 30 Lys Gly Cys Val Glu Lys Ser Asp Phe Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu 35 40 45 Met Pro Lys Tyr Ala Pro Ser Ala Ala Lys Ala Arg Thr Asp Leu 50 55 60

Claims (24)

  1. C-X1-X2-X3-C(서열번호 27)의 아미노산 서열을 포함하는, 8 내지 32개 아미노산 길이로 이루어진 마크로사이클릭 펩타이드, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
    상기 서열에서
    X1은 R, K, I, G, A 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    X2는 부재이거나 G, A, R, K, I 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    X3은 A, G 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
  2. 제1항에 있어서, E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E (서열번호 28)의 아미노산 서열을 포함하는, 마크로사이클릭 펩타이드.
    상기 서열에서
    X1은 R, K, I, G, A 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    X2는 부재이거나 G, A, R, K, I 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    X3은 A, G 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    X4는 E, T, V, D, M 및 G로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, X5-X6-X7-X8-E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E-X9-X10-X11 (서열번호 29)의 아미노산 서열을 포함하는, 마크로사이클릭 펩타이드.
    상기 서열에서
    X1은 R, K, I, G, A, 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    X2는 부재이거나 G, A, R, K, I 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    X3은 A, G 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    X4는 E, T, V, D, M 및 G로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    X5는 부재이거나, H, D, Q, R, Y, N 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    X6은 부재이거나 S, D, G, N 및 R로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    X7은 부재이거나 W이고;
    X8은 부재이거나 G이고;
    X9은 부재이거나 K이고;
    X10은 부재이거나 T, S, A, I 및 N으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    X11은 부재이거나 D 및 E로부터 선택된다.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-V-X24-E-L-K-X25-X26-L-X5-X6-X7-X8-E-X4-C-X1-X2-X3-C-A-E-X9-X10-X11 (서열번호 30)의 아미노산 서열내에 있는 아미노산 서열을 포함하는, 마크로사이클릭 펩타이드.
    상기 서열에서,
    X1은 R, K, I, G, A 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    X2는 부재이거나 G, A, R, K, I 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    X3은 A, G 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    X4는 E, T, V, D, M 및 G로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    X5는 부재이거나, H, D, Q, R, Y, N 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    X6은 부재이거나 S, D, G, N 및 R로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    X7은 부재이거나 W이고;
    X8은 부재이거나 G이고;
    X9은 부재이거나 K이고;
    X10은 부재이거나 T, S, A, I 및 N으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    X11은 부재이거나 D 및 E로부터 선택되고,
    X12는 부재이거나 L, I 및 V로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    X13은 부재이거나 D이고;
    X14는 부재이거나 L 및 W로부터 선택되고;
    X15는 부재이거나 A, S, T, E 및 N으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    X16은 부재이거나 S 및 T로부터 선택되고;
    X17은 부재이거나 V 및 D로부터 선택되고;
    X18은 부재이거나 D 및 A로부터 선택되고;
    X19는 부재이거나 L이고;
    X20은 부재이거나 R, K, S 및 W로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    X21은 부재이거나 K이고;
    X22는 부재이거나 M, L, I 및 V로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    X23은 부재이거나 R이고;
    X24는 A, K, T, L 및 V로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    X25는 Q, K 및 R로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    X26은 I 및 V로부터 선택된다.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    VDLRKMRVAELKQILHSWGEECRACAE (서열번호 2),
    VDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAE (서열번호 4),
    MRVAELKQILHSWGEECRACAEK (서열번호 6),
    LRVKELKKILDDWGETCKGCAEK (서열번호 8),
    KSILDDWGETCKGCAE (서열번호 10),
    WGEECRACAEKT (서열번호 12),
    WGETCKGCAEKS (서열번호 14),
    WGEECRGACAEKT (서열번호 24), 및
    WGETCKGGCAEKS (서열번호 26)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열로 이루어진 마크로사이클릭 펩타이드.
  6. 제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마크로사이클릭 펩타이드가 소포체 (ER) 스트레스 유도된 세포 기능부전 또는 세포사로부터 보호하는, 마크로사이클릭 펩타이드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마크로사이클릭 펩타이드가 GRP78에 결합하는, 마크로사이클릭 펩타이드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 시스테인이 환원된 형태로 또는 디설파이드 브릿지된 형태로 있는, 마크로사이클릭 펩타이드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마크로사이클릭 펩타이드가 슈도펩타이드인, 마크로사이클릭 펩타이드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 검출가능한 화학적 모이어티, 생화학적 모이어티, 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)에 접합된 마크로사이클릭 펩타이드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드가 하기의 성질 중 적어도 하나를 갖는, 마크로사이클릭 펩타이드:
    (i) MPP+ 독성으로부터 TH-양성 뉴런을 용량 의존적으로 보호할 수 있음;
    (ii) TH-양성 뉴런에서 알파-시누클레인 내포물의 수를 감소시킴;
    (iii) 이의 선형 대응물과 비교하여 혈장에서 개선된 안정성을 가짐;
    (iv) 이의 선형 대응물과 비교하여 간세포에서 개선된 안정성을 가짐; 또는
    (v) 이의 선형 대응물과 비교하여 혈뇌 장벽을 통과하는 개선된 능력을 가짐.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 약물로서 사용하기 위한 마크로사이클릭 펩타이드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 변성 질환 또는 장애, 만성 질환 또는 장애, 또는 진행성 질환 또는 장애, 예를 들어, 신경변성 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 마크로사이클릭 펩타이드.
  14. 제13항에 있어서, 상기 신경변성 질환 또는 장애가 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 다계통 위축증, 근위축성 측삭 경화증, 전두측두엽 변성, 루이소체 치매, 경미한 인지 장애, 헌팅턴 질환, 외상성 뇌 손상, 외상성 척수 손상, 진행성 핵상 마비, 픽 질환, 순수 자율신경계 부전증, 피질기저 변성, 만성 외상성 뇌병증, 척수소뇌 운동실조, 및 말초 신경병증, 및 이의 질환 및 장애의 스펙트럼으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중추 신경계 질환인, 마크로사이클릭 펩타이드.
  15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 월콧-랄리손(Wolcott-Rallison) 증후군, 월프람(Wolfram) 증후군, 마리네스코 쇼그렌(Marinesco-Sjоgren) 증후군, 마차도-요셉(Machado-Joseph) 질환, 및 색소성 망막염과 같은 변성 망막 질환 및 원발성 신증후군 및 상염색체 우성 다낭성 콩팥 질환과 같은 유전성 신증후군으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 병원성 요소로서 소포체 (ER) 스트레스를 갖는 단일유전자 유전성 질환의 치료에 사용하기 위한 마크로사이클릭 펩타이드.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드가 정맥내, 동맥내, 피하, 비강내, 안내, 고막내, 또는 국소 투여와 같은 말초 투여, 장내, 비경구 또는 경구, 직장, 설하 또는 협측 투여을 비롯한 국소 경로, 복막내, 근육내, 관절내, 경피, 와우내, 국소 안구 또는 흡입 투여, 또는 두개내, 척추강내, 경막외 또는 병변내 투여에 의해 투여되는, 마크로사이클릭 펩타이드.
  17. 제16항에 있어서, 상기 펩타이드가 피하 투여에 의해 투여되는, 마크로사이클릭 펩타이드.
  18. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 마크로사이클릭 펩타이드, 및 약제학적으로 허용되는 담체, 약제학적으로 허용되는 부형제, 보존제, 안정화제 및/또는 희석제 중 적어도 하나를 포함하는 약제학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 약물로서 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  20. 제18항에 있어서, 변성 질환 또는 장애, 만성 질환 또는 장애, 또는 진행성 질환 또는 장애, 예를 들어, 신경변성 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 신경변성 질환 또는 장애가 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 다계통 위축증, 근위축성 측삭 경화증, 전두측두엽 변성, 루이소체 치매, 경미한 인지 장애, 헌팅턴 질환, 외상성 뇌 손상, 외상성 척수 손상, 진행성 핵상 마비, 픽 질환, 순수 자율신경계 부전증, 피질기저 변성, 만성 외상성 뇌병증, 척수소뇌 운동실조, 및 말초 신경병증, 및 이의 질환 및 장애의 스펙트럼으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중추 신경계 질환인, 약제학적 조성물.
  22. 제18항에 있어서, 월콧-랄리손 증후군, 월프람 증후군, 마리네스코 쇼그렌 증후군, 마차도-요셉 질환, 및 색소성 망막염과 같은 변성 망막 질환 및 원발성 신증후군 및 상염색체 우성 다낭성 콩팥 질환과 같은 유전성 신증후군으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 병원성 요소로서 소포체 (ER) 스트레스를 갖는 단일유전자 유전성 질환의 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  23. 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 정맥내, 동맥내, 피하, 비강내, 안내, 고막내, 또는 국소 투여와 같은 말초 투여, 장내, 비경구 또는 경구, 직장, 설하 또는 협측 투여를 비롯한 국소 경로, 복막내, 근육내, 관절내, 경피, 와우내, 국소 안구 또는 흡입 투여, 또는 두개내, 척추강내, 경막외 또는 병변내 투여에 의해 투여되는, 약제학적 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 조성물이 피하 투여에 의해 투여되는, 약제학적 조성물.
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