KR20220115556A - 백신 및 치료 도구로서의 네오글리코컨쥬게이트 - Google Patents
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Abstract
면역원 및 치료/진단 도구로서의 신생 당접합체가 본원에 기재된다. 신생 당접합체는 탄수화물 항원 중간체를 운반체 물질(예를 들어, 운반체 단백질)의 유리 아민 기에 접합시켜 생성된다. 중간체는 제1 말단 및 제2 말단을 갖는 링커를 포함하고, 제1 말단은 티오 에테르 결합을 통해 탄수화물 항원에 접합되고 제2 말단은 유리 아민 기와 반응할 수 있는 작용기를 포함한다. 커플링 후 탄수화물 항원은 아미드, 카바메이트, 설폰아미드, 우레아 또는 티오우레아 결합을 통해 운반체 물질에 공유 결합되어 신생 당접합체를 생성한다. 항원, 면역원, 백신 및 진단에서의 신생 당접합체의 응용도 기재된다. 구체적으로, 암, SARS-CoV-2와 같은 바이러스 및 비정상적인 글리코실화의 발현을 특징으로 하는 기타 질환에 대한 백신 후보 및 기타 치료 도구로서의 (신생) 당접합체의 용도도 기재된다.
Description
본 설명은 면역원 및 치료/진단 도구로서 유용한 신생 당접합체(neoglycoconjugate)에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 설명은 탄수화물 항원과 운반체 물질(예를 들어, 면역원성 및 항원성 운반체 펩티드 및 단백질)의 유리 아민 기 사이의 접합에 관한 것이다. 본 설명은 또한 항원, 면역원, 백신 및 진단 분야에 적용하기 위한 개선된 신생 당접합체 생산 방법에 관한 것이다. 또한, 본 설명은 비정상적인 글리코실화와 관련된 암 및 바이러스, 예컨대 SARS-CoV-2에 대한 백신 후보 및 기타 치료 도구로서의 당접합체에 관한 것이다.
본 설명은 다수의 문헌을 참조하며, 그 내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
면역요법의 궁극적인 목적은 면역계의 선천적 및 적응적 반응을 조절하여 외래 물질, 예컨대, 박테리아, 바이러스 및 암 세포와 싸울 수 있는 능력을 개선하여 감염이나 암과 같은 질환을 치료하는 것이다. 선천적 면역은 병원체에 노출된 초기 단계에서 유발되는 면역 방어의 제1 선으로 간주된다. 세포 참가자에는 자연 살해(NK) 세포, 수지상 세포(DC), 대식세포, 단핵구, γδ T 세포 및 자연 살해 T(NKT) 세포가 포함된다. 선천적 면역계와 달리, 적응적(adaptive) 면역은 외래 항원에 처음 노출되었을 때 발달 속도가 느리지만 고도로 특이적인 반응을 일으키고 장기간 보호를 위한 면역학적 기억을 생성한다. 이는 T 세포와 B 세포와 이들의 체액 및 세포 매개체, 사이토카인 및 항체의 클론 확장을 수반한다. 선천적 면역 반응과 적응적 면역 반응 사이의 주요 계면은 전문적인 항원 제시 세포(pAPC); 대식세포, B 세포 및 특히 수지상 세포(DC)이다. pAPC는 내인성 및 외인성 공급원에서 T 세포로 항원을 처리하고 제시할 수 있다. 이들은 톨 유사 수용체(Toll-like receptor, TLR)와 같은 패턴 인식 수용체(PRR)를 통해 미생물을 인식한다. 미생물 표면 결정인자 또는 비정상 및 비천연 항원의 인식 시, 미생물 또는 종양 및 이들의 관련 항원 마커는 일반적으로 펩티드 단편으로 분해되고 방출된 항원이 세포내 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자(pMHC)에 결합되는 세포내 이입 경로를 통해 pAPC에 의해 포식될 수 있다. pAPC는 성숙 및 활성화를 거쳐 세포내 구획에서 세포 표면으로의 pMHC 복합체의 재분배, 사이토카인 및 케모카인의 분비를 초래한다. pAPC 외에도 모든 유핵 세포 유형은 세포막에 내인성 펩티드만을 제시한다. pAPC와 대조적으로, 바이러스 및 세포내 병원체를 포함하여 세포 자체 내에서 기원하는 이러한 펩티드는 b2-마이크로글로불린에 결합된 MHC 클래스 I 분자에 의해 제시된다. APC는 일반적으로 MHC 클래스 II를 발현하지 않는다.
MHC 클래스 II 분자에 제시된 펩티드는 일반적으로 CD4+ T 헬퍼 세포의 T 세포 항원 수용체(TCR)에 의해 인식되며, 이는 차례로 pAPC로부터 받은 공동 자극 신호에 따라 Th1 또는 Th2 세포와 같은 상이한 하위 집합으로의 기능적 성숙을 겪는다. Th1 세포는 IFN-γ 및 TNF-α의 분비와 함께 대부분 전염증(pro-inflammatory) 반응을 일으키는 반면, Th2 세포는 전형적인 사이토카인을 분비한다. Th1 세포는 주로 세포 매개 반응과 관련이 있지만, 두 유형의 Th 세포는 B 세포에 의한 항체 생산을 지지하며, 이는 차례로 항체 동형 및 기능에 영향을 미친다. 예를 들어, IL-12 및 TNF-α는 Th1 세포의 분화 및 유형 1 IgG 하위 클래스의 생성과 관련이 있는 반면, IL-6 및 기타 Th2 사이토카인은 유형 2 IgG 하위 클래스(IgG1) 생성에 기여한다.
MHC 클래스 I 분자에 펩티드를 제시하는 APC는 CD8+ 세포독성 T 세포의 TCR에 의해 인식된다. 두 가지 세포 유형에 의해 발현되는 공동 자극 분자 사이의 몇몇 추가적인 상호작용은 세포 독성 T 세포를 효과기 세포로 활성화시키는 반면, 강하고 오래 지속되는 기억 T 세포는 수지상 세포가 활성화된 T 헬퍼 세포 및 T 세포독성 세포와 상호작용할 때 생성된다. 일단 활성화되면 T 세포는 사이토카인의 도움으로 클론 선택 및 확장을 거친다. 이는 역기능 항원 양성 체세포를 찾아 신체 전체에 걸쳐 이동할 수 있는 역기능 표적 항원에 특이적인 세포의 수를 증가시킨다. 표적 세포에 도킹되면 활성화된 세포독성 T 세포는 퍼포린(perforin) 및 그랜자임(granzyme)과 같은 세포독소의 페이로드를 방출한다. 퍼포린의 작용을 통해 그랜자임은 표적 세포에 침투하고 이의 프로테아제는 세포 사멸을 유발한다. 세포독성 T 세포는 또한 FAS 신호전달 경로에 의해 표적 세포 사멸을 유발할 수 있다.
따라서, 관심 병원체 또는 종양 항원을 처리하기 위해 적절한 반응에 대한 백신 유도성 면역을 조정할 수 있는 것이 바람직하다.
탄수화물은 단백질 및 펩티드와 달리 Th 세포의 참여를 유발하기에 적절하게 장착되지 않은 T 세포 독립적 항원이므로, 면역 세포 증식, 항체 클래스 전환 및 친화도/특이성 성숙을 유도할 수 없다. 탄수화물 기반 백신이 처음에 접한 주요 초기 진전은 T 세포 의존성 에피토프 역할을 하는 운반체 단백질에 적절하게 접합될 때 박테리아 협막 다당류가 옵소닌 식세포 항체를 생성하는 데 필요한 면역화학적 능력을 획득할 수 있다는 발견에 의해 뒷받침되었다.
전통적으로, 탄수화물 항원을 운반체 단백질에 접합시키기 위한 전략은 알데히드 유래 당의 리신 잔기의 ε-아미노 기에 대한 환원성 아민화 또는 단순히 아미드 커플링 반응에 의존했다. 두 경우 모두, 부분 및 무작위 탄수화물 항원 접합이 일반적으로 발생한다. 또한, 모든 아미드 파트너(리신의 아민 또는 글루탐산/아스파르트산의 산)가 탄수화물 접합에 사용되는 경우 너무 많은 탄수화물 항원이 운반체 단백질에 부착되어 면역원성의 고유한 감소/제거로 잠재적으로 필수적인 T 세포 펩티드 에피토프를 마스킹하게 된다. 따라서, 당접합체 백신을 제조하기 위한 현재의 전략은, 탄수화물 분포 및 재현성 측면에서 필수적인 균질성이 제제에 부족하기 때문에(즉, 단백질에 대한 당의 부착점이 무작위로 분포되어 있고 배치마다 다양한 밀도를 나타내므로), 불충분하고 상당한 규제 및/또는 상업적 장애물에 직면한다. 따라서, 더 큰 탄수화물 항원 균질성, 보다 정확하게 특성화될 수 있는 구조 및 배치간 재현성을 갖는 당접합체 백신이 매우 바람직할 것이다.
2019년 말에 시작된 COVID-19 대유행의 원인 물질인 SARS-CoV-2는 전 세계 인간 건강에 대한 지속적인 위협을 나타내고, 또한 전 세계 경제를 마비시켰다. 초기 백신 개발 노력은 SARS-CoV-2의 숙주 세포로의 세포 진입 및 막 융합을 매개하는 스파이크(S) 당단백질에 존재하는 단백질 항원 및 에피토프에 주로 초점을 맞추었다. 그러나 세계 보건 전문가들은 과학자들이 단일 전략에 대해 발생할 수 있는 잠재적 실패 또는 합병증을 완화하기 위해 SARS-CoV-2에 대한 치료적 개입을 개발하는 여러 전략을 동시에 모색할 것을 강력히 권장했다. 따라서, SARS-CoV-2의 S 단백질에 존재하는 단백질 항원에 초점을 맞춘 것과 병행하여 SARS-CoV-2에 대한 백신 및 기타 치료 도구를 개발할 필요성이 남아 있다.
제1 양태에서, 신생 당접합체를 생산하는 방법이 본원에 기재되어 있으며, 방법은 다음을 포함한다: (a) 제1 말단 및 제2 말단을 갖는 링커를 포함하는 신생 탄수화물 항원 또는 신생 탄수화물 항원 중간체를 제공하는 단계(여기서 제1 말단은 티오 에테르 결합을 통해 탄수화물 항원에 접합되고 제2 말단은 유리 아민 기와 반응할 수 있는 작용기를 포함하고, 작용기는 -COX, -SO2X, -O-C(O)-X, -N=C=O, 또는 -N=C=S이고, X는 이탈기임); (b) 하나 이상의 유리 아민 기를 갖는 운반체 물질(예를 들어, 운반체 단백질 또는 펩티드)을 제공하는 단계; 및 (c) 커플링 반응을 수행하여 하나 이상의 정제된 신생 탄수화물 항원 또는 신생 탄수화물 항원 중간체를 아미드, 카바메이트, 설폰아미드, 우레아 또는 티오우레아 결합을 통해 하나 이상의 유리 아민 기에서 운반체 물질(예를 들어, 운반체 단백질 또는 펩티드)에 접합시켜, 신생 당접합체를 생성하는 단계.
일부 구현예에서, 단계 (a) 전에, (a)의 신생 탄수화물 항원 또는 신생 탄수화물 항원 중간체는 다음을 포함하는 방법에 의해 제조된다: (i) 말단 알켄에 공유적으로 연결된 탄수화물 항원(알케닐 탄수화물 항원)을 제공하는 단계(말단 알켄은 티올-엔 반응을 통해 티올 기에 직접 접합될 수 있음); (ii) 제1 말단에 제1 작용기 및 제2 말단에 제2 작용기를 포함하는 티오-링커를 제공하는 단계(제1 작용기는 유리 티올 기이고 제2 작용기는 카르복실 기, 설핀산 기, 탄산 기, 이소시아네이트 기 또는 티오시아네이트 기임); (iii) 광촉매 티올-엔 반응을 수행하여 알케닐 탄수화물 항원을 제1 말단의 티오-링커에 직접 접합시켜, 제1 말단에 탄수화물 항원 및 제2 말단에 제2 작용기를 포함하는 신생 탄수화물 항원을 생성하는 단계; (iv) 제2 작용기가 카르복실 기, 설핀산 기 또는 탄산 기인 경우, 카르복실 기, 설핀산 기 또는 탄산 기의 말단 하이드록실 기를 폴리펩티드의 유리 아민 기에 대한 접합을 위한 더 나은 이탈기로 대체하여 신생 탄수화물 항원을 신생 탄수화물 항원 중간체로 전환시키는 단계; 및 (v) 신생 탄수화물 항원 또는 신생 탄수화물 항원 중간체를 정제하는 단계.
추가 양태에서, 제1 말단 및 제2 말단을 갖는 링커를 포함하는 신생 탄수화물 항원 또는 신생 탄수화물 항원 중간체가 본원에 기재되며, 여기서 제1 말단은 티오 에테르 결합을 통해 탄수화물 항원에 접합되고 제2 말단은 유리 아민 기와 반응할 수 있는 작용기를 포함하고, 작용기는 -COX, -SO2X, -O-C(O)-X, -N=C=O, 또는 -N=C=S이고, X는 이탈기이다.
추가 양태에서, 제1 말단 및 제2 말단을 갖는 링커를 포함하는 합성 신생 당접합체가 본원에 기재되며, 여기서 제1 말단은 티오 에테르 결합을 통해 탄수화물 항원에 접합되고 제2 말단은 아미드, 카바메이트, 설폰아미드, 우레아 또는 티오우레아 결합을 통해 내부의 하나 이상의 유리 아민 기에서 운반체 단백질 또는 펩티드에 접합된다.
추가 양태에서, 링커를 통해 운반체 단백질 또는 펩티드(CP-NH)의 하나 이상의 아민 기에 접합된 하나 이상의 탄수화물 항원(CA)을 포함하는 합성 신생 당접합체가 본원에 기재되어 있으며, 합성 신생 당접합체는 다음의 구조를 갖는다:
(화학식에서, X는 O, S, NR1, 또는 CH2이고; R1은 H, COH(포름아미드), COMe, 또는 COEt이고; m은 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; Y는 -(CH2)n- 또는 -(OCH2CH2O)n-이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; o는 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이거나; 또는 o는 0이고 Z는 -CO-이고 Y는 -(OCH2CH2O)n-이거나; 또는 o는 0이고 Z는 -SO2-이고 Y는 -(OCH2CH2O)n-이고; Z는 -CO-, -NR2SO2-, -OCO-, -NR2CO-, 또는 -NR2CS-이고, R2는 H, Me, 또는 Et이고; p는 상기 하나 이상의 아민 기에서 운반체 단백질 또는 펩티드에 접합된 탄수화물 항원의 총 수에 상응하는 정수(예를 들어, p = 1 내지 50)임). 구현예에서, 합성 신생 당접합체 내의 운반체 단백질 또는 펩티드는 천연 또는 비변성 형태를 가지며, 운반체 단백질 또는 펩티드에 대한 탄수화물 항원의 접합은 대상체에게 투여 시 비접합 탄수화물 항원의 상응하는 투여와 비교하여 탄수화물 항원의 면역원성을 증가시킨다.
추가 양태에서, 신생 당접합체 백신 또는 면역 반응 유발 조성물을 생산하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 방법은 본원에 기재된 바와 같은 신생 당접합체 또는 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 제조된 신생 당접합체를 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 보조제와 함께 제형화하는 단계를 포함할 수 있다.
추가 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 신생 당접합체 및 본원에 기재된 바와 같은 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 보조제를 포함하는 및/또는 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 신생 당접합체 백신 또는 적응적 면역 반응 유발 조성물이 본원에 기재된다.
일부 양태에서, 대상체를 면역화, 백신 접종, 또는 치료하는 방법이 본원에 기재되어 있으며, 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생산된 신생 당접합체, 본원에 기재된 바와 같은 합성 신생 당접합체, 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생산된 신생 당접합체 백신 또는 적응적 면역 반응 유발 조성물, 또는 본원에 기재된 바와 같은 신생 당접합체 백신을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 질환을 앓는 대상체를 면역화, 백신 접종, 또는 치료하는 데 사용하거나, 또는 신생 당접합체에 특이적으로 결합하는 항체의 존재를 검출하는 데 사용하거나, 또는 (예를 들어, 대상체로부터의 생물학적 샘플에서) 상기 면역화, 백신 접종, 또는 치료를 검출하는 데 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생산된 신생 당접합체, 본원에 기재된 바와 같은 합성 신생 당접합체, 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생산된 신생 당접합체 백신 또는 적응적 면역 반응 유발 조성물, 또는 본원에 기재된 바와 같은 신생 당접합체 백신이 본원에 기재된다.
일부 구현예에서, 질환을 앓는 대상체의 면역화 또는 치료용, 또는 신생 당접합체에 특이적으로 결합하는 항체의 존재의 검출용, 또는 (예를 들어, 대상체로부터의 생물학적 샘플에서) 상기 면역화 또는 치료의 검출용 백신의 제조를 위한, 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생산된 신생 당접합체, 본원에 기재된 바와 같은 합성 신생 당접합체, 또는 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생산된 적응적 면역 반응 유발 조성물이 본원에 기재된다.
일부 구현예에서, 상기 탄수화물 항원의 증가된 발현과 관련된 질환을 앓는 대상체의 치료에 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생산된 신생 당접합체, 본원에 기재된 바와 같은 합성 신생 당접합체, 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생산된 신생 당접합체 백신 또는 적응적 면역 반응 유발 조성물, 또는 본원에 기재된 바와 같은 신생 당접합체 백신이 본원에 기재된다.
일부 구현예에서, 탄수화물 항원 또는 탄수화물 항원을 포함하는 종양 순환 세포에 특이적으로 결합하는 항체의 존재를 검출 또는 스크리닝하기 위한, 또는 탄수화물 항원을 이용한 면역화 또는 백신 접종으로 인한 항체의 존재를 검출하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생산된 신생 당접합체, 본원에 기재된 바와 같은 합성 신생 당접합체, 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생산된 신생 당접합체 백신 또는 적응적 면역 반응 유발 조성물, 또는 본원에 기재된 바와 같은 신생 당접합체 백신이 본원에 기재된다.
추가 양태에서, 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되며, 방법은 상기 대상체에서 탄수화물 항원에 대한 면역 반응을 생성하기 위하여, 본원에 정의된 바와 같은 또는 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생산된 신생 당접합체 또는 신생 당접합체 면역원을 투여하는 단계 및 선택적으로 탄수화물 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 존재에 대해 상기 대상체로부터의 생물학적 샘플을 스크리닝하는 단계를 포함한다.
추가 양태에서, SARS-CoV-2에 대해 대상체를 면역화하는 데 사용하기 위한, 대상체에서 항-SARS-CoV-2 항체의 생산을 유발하는 데 사용하기 위한, 또는 대상체로부터의 샘플 내의 항-SARS-CoV-2 항체의 존재를 검출하는 데 사용하기 위한 당접합체가 본원에 기재되며, 당접합체는 적절한 운반체 물질(예를 들어, 운반체 단백질 또는 펩티드)에 접합된 탄수화물 항원을 포함하고, 탄수화물 항원은 시알릴화 Thomsen-Friedenreich(TF) 항원, 비시알릴화 TF 항원, 시알릴화 Tn 항원, 비시알릴화 Tn 항원, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하거나 이로 구성된다.
추가 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 당접합체 및 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 보조제를 포함하는 SARS-CoV-2 백신이 본원에 기재된다.
추가 양태에서, SARS-CoV-2에 대해 대상체에게 백신을 접종하거나 대상체에서 항-SARS-CoV-2 항체의 생산을 유발하는 방법이 본원에 기재되며, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 당접합체 또는 SARS-CoV-2 백신을 투여하는 단계를 포함한다.
추가 양태에서, SARS-CoV-2 바이러스에 의한 감염으로부터 대상체를 보호하기 위한, 또는 COVID-19를 치료하기 위한 조성물이 본원에 기재되어 있으며, 조성물은 SARS-CoV-2 S 단백질에 발현된 O-연결 글리칸에 결합하는 하나 이상의 리간드(예를 들어, 항체, 항체 단편, 또는 렉틴)를 포함하고, O-연결 글리칸은 시알릴화 TF 항원(모노- 또는 디-시알릴화 TF 항원), 비시알릴화 TF 항원, 시알릴화 Tn 항원, 비시알릴화 Tn 항원, 또는 이들의 조합을 포함한다.
추가 양태에서, 다음을 포함하는 복합체가 본원에 기재된다: (a) 시알릴화 TF 항원(모노- 또는 디-시알릴화 TF 항원), 비시알릴화 TF 항원, 시알릴화 Tn 항원, 비시알릴화 Tn 항원 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 O-연결 글리칸을 발현하는 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 단편; 및 (b) O-연결 글리칸에서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 단편에 결합된 본원에 기재된 리간드.
일반 정의
표제 및 기타 식별자, 예컨대, (a), (b), (i), (ii) 등은 단지 명세서 및 청구범위를 용이하게 읽을 수 있도록 제공된다. 명세서 또는 청구범위에서 표제 또는 기타 식별자의 사용은 단계 또는 요소가 반드시 알파벳 순서 또는 숫자 순서 또는 제시된 순서로 수행될 것을 요구하지 않는다.
청구범위 및/또는 명세서에서 "포함하는"이라는 용어와 함께 사용될 때 단수형 단어의 사용은 "하나"를 의미할 수 있지만 "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 초과"의 의미와도 일치한다.
용어 "약"은 값을 결정하기 위해 사용되는 장치 또는 방법에 대한 오차의 표준 편차를 값이 포함함을 나타내는 데 사용된다. 일반적으로, "약"이라는 용어는 최대 10%의 가능한 변동을 지정하는 것을 의미한다. 그러므로, "약"이라는 용어에는 값의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10%의 변동이 포함된다. 달리 명시되지 않는 한, 범위 앞에 "약"이라는 용어를 사용하면 범위의 양쪽 끝에 적용된다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 "포함하는(comprising)" (및 단복수형 "포함하다"와 같은 임의의 형태의 포함하는), "갖는" (및 단복수형 "갖다"와 같은 임의의 형태의 갖는), "포함하는(including)" (및 단복수형 "포함하다"와 같은 임의의 형태의 포함하는) 또는 "함유하는" (및 단복수형 "함유하다"와 같은 임의의 형태의 함유하는)은 포괄적이거나 개방형이며 추가, 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
본원에 사용된 "단백질"이라는 용어(예컨대, "운반체 단백질"이라는 표현에서)는 변형이 본원에 기재된 신생 당접합체 면역원 및 신생 당접합체 백신의 면역원성을 파괴하지 않는 한 임의의 유형의 변형(예컨대, 아세틸화, 인산화, 글리코실화, 황화, 스모일화, 프레닐화, 유비퀴틴화 등과 같은 화학적 또는 번역 후 변형)을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있는 아미노산의 펩티드 연결된 사슬을 의미한다. 더 명확하게 하기 위해, 본원에 사용된 용어 "단백질" 및 "운반체 단백질"은 "운반체 단백질(들) 또는 펩티드(들)"이라는 표현에서와 같이 두 구현예가 함께 언급될 수 있지만 펩티드 및 폴리펩티드를 포함한다.
본원에 사용된 "신생 당접합체"라는 용어는 관심의 대상인 대상체에서 탄수화물 항원의 면역원성을 향상시키기 위해 운반체 단백질 또는 펩티드에 커플링된 탄수화물 항원(예컨대, 항원성 단당류, 이당류, 올리고당류 또는 다당류, 바람직하게는 천연 항원)을 지칭한다. "탄수화물 항원" 및 "당 항원"이라는 표현은 본원에 사용된 것과 동일한 의미를 갖는다. "면역원"이라는 용어는 관심의 대상인 대상체에서 (예컨대, 항체 및/또는 림프구에 의해) 면역계의 성분에 의해 특이적으로 결합될 수 있고 체액성 및/또는 세포 매개 면역 반응을 생성할 수 있는 작용제를 지칭한다. 본원에 사용된 "신생 당접합체 면역원"과 같은 표현에서 "면역원"이라는 용어는 신생 당접합체 자체를 특정한 용도(예컨대, 대상체에서 면역 반응을 생성하기 위한 면역원으로서)로 한정하지 않으면서 신생 당접합체의 능력(즉, 물리적 특성 또는 성질)을 지칭한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 신생 당접합체 면역원은 (예컨대, 대상체로부터) 생물학적 샘플에서 신생 당접합체 면역원에 결합하는 항체의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 진단 분석 또는 방법(예를 들어, 시험관 내 방법)에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 신생 당접합체 면역원은 신생 당접합체 면역원에 특이적으로 결합하는 항체(예컨대, 진단적으로 또는 치료적으로 적용 가능한 단클론 항체)를 스크리닝, 확인 또는 평가하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "합성"이라는 용어는 인간 개입에 의해 생성되는 자연의 생성물이 아닌 화합물을 지칭한다.
본원에 사용된 "접합 가능한"이라는 용어는 분자가 실제로 서로 공유적으로 결합하는지에 관계 없이 화학 반응을 통해 서로 공유적으로 결합되는 적어도 2개의 분자(예컨대, 탄수화물 항원 및 티오-링커; 또는 신생 탄수화물 항원 및 운반체 단백질 또는 펩티드)의 능력 또는 역량을 지칭한다. 이에 반하여, "접합된"이라는 용어는 서로 공유적으로 결합된 적어도 2개의 분자(예컨대, 탄수화물 항원 및 티오-링커, 또는 신생 탄수화물 항원 및 운반체 단백질 또는 펩티드)를 지칭한다.
본원에 사용된 "투여"라는 용어는 투여 경로가 대상체에서 면역 반응을 생성하게 하는 한, 비경구(예컨대, 피하, 피내, 근육 내 또는 정맥 내), 경구, 경피, 비강 내 등과 같은 투여 경로를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "대상체"라는 용어는 일반적으로 본원에 기재된 바와 같이 신생 당접합체에 대한 면역 반응을 개시할 수 있어서, 바람직하게는 신생 당접합체와 특이적으로 결합하는 항체 및/또는 림프구, 및/또는 신생 당접합체를 제시하는 세포의 생산으로 이어지는 살아 있는 존재(예컨대, 동물 또는 인간)를 지칭한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 대상체는 치료적으로(예컨대, 본원에 기재된 신생 당접합체 면역원으로 백신 접종을 통해) 치료될 환자일 수 있거나, 연구, 진단 및/또는 치료 목적용 도구(예컨대, 항체)를 생성하기 위한 수단으로 사용될 수 있다.
본 명세서의 다른 목적, 장점 및 특징은 첨부된 도면을 참조하여 단지 예로서 주어진 특정 구현예에 대한 다음의 비 제한적인 설명을 숙독 시 더욱 명백해질 것이다.
서열 목록
본 출원은 2020년 9월 17일자로 생성된 약 12 Kb 크기의 컴퓨터 판독 가능 형태의 서열 목록을 포함한다. 컴퓨터 판독 가능한 형태는 본원에 참조로 포함된다.
상세한 설명
본 설명은 진단에서, 또는 분석 또는 치료 도구를 생성하기 위한(예를 들어, 신규한 항-신생 당접합체 항체 생성) 면역원, 백신과 같은 사용에 적합한 신생 당접합체뿐만 아니라 이를 생산하기 위한 개선된 방법에 관한 것이다.
말단 산 작용기로 끝나는 탄수화물 항원을 운반체 단백질의 아민 기에 접합시키는 것은 전통적으로 숙신이미드 또는 카보디이미드 시약을 사용한 무작위 활성화를 통해 이루어진다. 이러한 탄수화물 항원-운반체 단백질 접합 방법의 주요 단점 중 하나는 운반체 단백질 자체 내에서 발생하는 제어되지 않은/원하지 않는 자가 가교형성으로, 운반체 단백질 자신의 아스파르트산/글루탐산 잔기의 측쇄가 운반체 단백질 자신의 리신 잔기의 ε-아민 기에 커플링된다. 이 접근법은 운반체 단백질의 고유 구조의 교란 또는 파괴를 초래하고, 이는 종종 다르게는 매우 면역원성이었을 주요 펩티드 서열의 실질적인 손실 및 운반체 단백질의 잠재적인 바람직하지 않은 가교를 초래한다. 또한, 당해 분야에 기재된 탄수화물 항원-운반체 단백질 접합 방법은 종종 스쿠아르산(squaric acid) 등과 같은 링커를 사용하는데, 이는 링커가 커플링되는 탄수화물 항원만이 아니라 링커 자체에 대한 면역 반응을 유발할 수 있다. 더욱이, 당해 분야에 기재된 탄수화물 항원-운반체 단백질 접합 방법은 운반체 단백질이 글리코실화되는 범위에 대한 적절한 제어를 허용하지 않으며, 이는 종종 인간 치료제를 위한 생산에 대한 상당한 장벽인 이질적인 당접합체 종을 초래한다.
대조적으로, 본원에 기재된 탄수화물 항원-운반체 단백질 접합 전략은 이전에 기술된 것과 상이하다. 첫째, 일부 구현예에서, 알케닐 작용기를 보유하는 탄수화물 항원은 시약이 없는 광분해 티올-엔 반응에 의해 비면역원성 링커에 커플링되어 본원에 기재된 신생 탄수화물 항원을 생산하며, 이 상류 단계는 운반체 단백질 및 펩티드의 구조에 영향을 미치지 않는다. 둘째, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 신생 탄수화물 항원 또는 신생 탄수화물 항원 중간체는 활성 에스테르 기와 같은 더 나은 이탈기로 끝나도록 만들어지고, 운반체 단백질 또는 펩티드에 대한 접합 전에 정제되어, 접합 효능을 개선하고 동시에 운반체 단백질 또는 펩티드 내에서 자가 가교형성을 피한다. 셋째, 본원에 기재된 탄수화물 항원-운반체 단백질 접합 전략에서 반응 파트너의 효능 및 화학량론은 운반체 단백질 또는 펩티드에 접합된 탄수화물 항원의 수를 보다 정확하게 제어할 수 있게 하여, 주요 면역원성 펩티드 서열을 잠재적으로 마스킹하는 것을 방지한다.
제1 양태에서, 본 설명은 신생 당접합체를 생산하는 개선된 방법에 관한 것이다. 방법은 일반적으로 말단 알켄에 공유 연결된 탄수화물 항원(알케닐 탄수화물 항원)을 제공하는 단계를 포함하며, 말단 알켄은 티올-엔 반응을 통해 티올 기에 직접 접합될 수 있다. 방법은 제1 말단에 제1 작용기 및 제2 말단에 제2 작용기를 포함하는 티오-링커를 제공하는 단계를 추가로 포함하며, 제1 작용기는 유리 티올 기이고 제2 작용기는 카르복실 기, 설핀산 기, 탄산 기, 이소시아네이트 기, 또는 티오시아네이트 기와 같은 기이다. 그 후, 광촉매 티올-엔 반응을 수행하여 알케닐 탄수화물 항원을 제1 말단의 티오-링커에 직접 접합시킴으로써, 제1 말단에 탄수화물 항원 및 제2 말단에 제2 작용기를 포함하는 신생 탄수화물 항원을 생성한다. 제2 작용기가 카르복실 기, 설핀산 기 또는 탄산 기인 경우, 본원에 기재된 방법은 카르복실 기, 설핀산 기 또는 탄산 기의 말단 하이드록실 기를 폴리펩티드의 유리 아민 기에 대한 접합을 위한 더 나은 이탈기로 대체하여 신생 탄수화물 항원을 신생 탄수화물 항원 중간체로 전환시키는 단계를 추가로 포함한다. 신생 탄수화물 항원 또는 신생 탄수화물 항원 중간체는 그 후 정제되고 후속적으로 하나 이상의 유리 아민 기를 갖는 운반체 물질(예를 들어, 운반체 단백질 또는 펩티드)과의 커플링 반응에 사용될 수 있다. 커플링 반응은 하나 이상의 정제된 신생 탄수화물 항원 또는 신생 탄수화물 항원 중간체를 (예를 들어, 아미드, 카바메이트, 설폰아미드, 우레아 또는 티오우레아 결합을 통해) 하나 이상의 유리 아민 기에서 운반체 물질에 접합시켜, 신생 당접합체를 생성한다.
추가 양태에서, 신생 당접합체를 생산하는 방법이 본원에 기재되며, 방법은 제1 말단 및 제2 말단을 갖는 링커를 포함하는 신생 탄수화물 항원 또는 신생 탄수화물 항원 중간체를 제공하는 단계를 포함하고, 제1 말단은 티오 에테르 결합을 통해 탄수화물 항원에 접합되고 제2 말단은 유리 아민 기와 반응할 수 있는 작용기를 포함하고, 작용기는 -COX, -SO2X, -O-C(O)-X, -N=C=O, 또는 -N=C=S이고, X는 이탈기이다. 방법은 추가로 하나 이상의 유리 아민 기를 갖는 운반체 물질(예를 들어, 운반체 단백질 또는 펩티드)을 제공하는 단계; 및 커플링 반응을 수행하여 하나 이상의 정제된 신생 탄수화물 항원 또는 신생 탄수화물 항원 중간체를 아미드, 카바메이트, 설폰아미드, 우레아 또는 티오우레아 결합을 통해 하나 이상의 유리 아민 기에서 운반체 물질에 접합시켜, 신생 당접합체를 생성하는 단계를 포함한다.
추가 양태에서, 신규한 신생 탄수화물 항원 또는 신생 탄수화물 항원 중간체가 본원에 기재된다. 일부 구현예에서, 신생 탄수화물 항원 또는 신생 탄수화물 항원 중간체는 제1 말단 및 제2 말단을 갖는 링커를 포함하고, 제1 말단은 티오 에테르 결합을 통해 탄수화물 항원에 접합되고 제2 말단은 유리 아민 기와 반응할 수 있는 작용기를 포함하고, 작용기는 -COX, -SO2X, -O-C(O)-X, -N=C=O, 또는 -N=C=S이고, X는 이탈기이다.
추가 양태에서, 제1 말단 및 제2 말단을 갖는 링커를 포함하는 신규한 합성 신생 당접합체가 본원에 기재되며, 여기서 제1 말단은 티오 에테르 결합을 통해 탄수화물 항원에 접합되고 제2 말단은 아미드, 카바메이트, 설폰아미드, 우레아 또는 티오우레아 결합을 통해 내부의 하나 이상의 유리 아민 기에서 운반체 물질(예를 들어, 운반체 단백질 또는 펩티드)에 접합된다.
추가 양태에서, 링커를 통해 운반체 단백질 또는 펩티드(CP-NH)의 하나 이상의 아민 기에 접합된 하나 이상의 탄수화물 항원(CA)을 포함하는 신규한 합성 신생 당접합체가 본원에 기재되어 있으며, 합성 신생 당접합체는 다음의 구조를 갖는다:
(화학식에서, X는 O, S, NR1, 또는 CH2이고; R1은 H, COH(포름아미드), COMe, 또는 COEt이고; m은 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; Y는 -(CH2)n- 또는 -(OCH2CH2O)n-이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; o는 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이거나; 또는 o는 0이고 Z는 -CO-이고 Y는 -(OCH2CH2O)n-이거나 o는 0이고 Z는 -SO2-이고 Y는 -(OCH2CH2O)n-이고; Z는 -CO-, -NR2SO2-, -OCO-, -NR2CO-, 또는 -NR2CS-이고; R2는 H, Me, 또는 Et이고; p는 상기 하나 이상의 아민 기에서 운반체 단백질 또는 펩티드에 접합된 탄수화물 항원의 총 수에 상응하는 정수임).
추가 양태에서, 링커를 통해 운반체 단백질 또는 펩티드(CP-NH)의 하나 이상의 아민 기에 접합된 하나 이상의 탄수화물 항원(CA)을 포함하는 신규한 합성 신생 당접합체가 본원에 기재되어 있으며, 합성 신생 당접합체는 다음의 구조를 갖는다:
(화학식에서, p는 상기 하나 이상의 아민 기에서 운반체 단백질 또는 펩티드에 접합된 탄수화물 항원의 총 수에 상응하는 정수임).
일부 구현예에서, p는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50, 최대 주어진 운반체 단백질 또는 펩티드에 대한 접합에 이용 가능한 아민 기의 총 수(예를 들어, 용매가 접근할 수 있는 리신 잔기와 같은 리신 잔기의 총 수)의 정수이다.
일부 구현예에서, 합성 신생 당접합체 내의 운반체 단백질 또는 펩티드는 천연 또는 비변성 형태를 가지며, 운반체 단백질 또는 펩티드에 대한 탄수화물 항원의 접합은 대상체에게 투여 시 비접합 탄수화물 항원의 상응하는 투여와 비교하여 탄수화물 항원의 면역원성을 증가시킨다.
일부 구현예에서, 알케닐 탄수화물 항원을 티오-링커에 직접 접합시키기 위해 본원에 기재된 티올-엔 반응은 탄수화물 항원의 구조 및/또는 항원성의 파괴 또는 교란(예를 들어, 원하지 않는 면역 반응 및/또는 교란된 구조를 갖는 바람직하지 않은 탄수화물 항원에 대한 항체를 잠재적으로 유도함)을 최소화하거나 회피하는 반응 조건 하에 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 티올-엔 반응은 자외선 하의 조사를 포함하는 광촉매 티올-엔 반응일 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 광촉매 티올-엔 반응은 단파 자외선 광(예를 들어, 약 254 nm) 하, 또는 장파 자외선 광(예를 들어, 약 355 nm 또는 365 nm) 하의 조사를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 티올-엔 접합 반응은 단파 및 장파 자외선 광에서 접합을 가능하게 하는 다용성(versatility)을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 티올-엔 반응은 촉매의 존재 하에 수행될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 광촉매 티올-엔 반응은 촉매의 존재 하에 장파 자외선 광 하에 또는 촉매의 부재 하에 단파 자외선 광 하에 수행되어, 공정을 추가로 단순화할 수 있다. 본원에 사용된 티올-엔 반응의 맥락에서, "촉매", "광개시제" 및 "활성화제"라는 용어는 광촉매 티올-엔 반응을 통해 유리 티올 기에서 티오-링커에 대한 탄수화물 항원의 접합을 가속화하는 물질을 지칭하는 데 상호교환적으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 촉매는 수용성 촉매, 예컨대, 수용성 유리 라디칼 생성 아조 화합물; 2,2'-아조비스[2-(2-이미다졸린-2-일)프로판]디하이드로클로라이드(Vazo 44 또는 VA-044); 2,2'-아조비스(2-아미디노프로판) 디하이드로클로라이드(AAPH); 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(LAP); 광개시제 활성을 갖는 금속 또는 금속 이온; 과산화물; tert-부틸 하이드로퍼옥사이드; 벤조일퍼옥사이드; 암모늄 퍼설페이트; 또는 광개시제 활성을 갖는 이의 임의의 유도체일 수 있다. 일부 구현예에서, 촉매는 수불용성 촉매, 예컨대 수불용성 유리 라디칼 생성 아조 화합물, 2,2-디메톡시-2-페닐아세토페논(DMPA), 아조비스이소부티로니트릴(AIBN), 2,2'-아조비스(2-메틸프로피오니트릴), 4,4'-아조비스(4-시아노펜탄산)(ACVA), 1,1'-아조비스(시아노시클로헥산)(ACHN), 디아젠디카르복실산 비스(N,N-디메틸아미드)(TMAD); 아조디카르복실산 디피페리디드(ADD), 또는 광개시제 활성을 갖는 이의 임의의 유도체일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 광촉매 티올-엔 반응은 티오-링커의 유리 티올 기당 알케닐 탄수화물 항원의 1 내지 200 또는 1 내지 100 몰 당량 사이의 반응을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 광촉매 티올-엔 반응은 10 내지 300, 10 내지 270, 10 내지 240, 10 내지 210, 10 내지 180, 10 내지 150, 10 내지 120, 10 내지 90, 10 내지 60, 또는 10 내지 30분 동안 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 광촉매 티올-엔 반응은 약 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 또는 4.0, 내지 약 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 또는 10의 pH에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 광촉매 티올-엔 반응은 탄수화물 항원 교란 또는 파괴를 최소화하거나 회피하는 pH에서 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 탄수화물 항원은 (예를 들어, 바람직하게는 NaBH4 및/또는 NaBH3CN을 사용하여, 알릴 또는 알케닐 아민 및 환원당 사이에서와 같이, 글리코시드 결합 또는 환원성 아민화에 의해 수득된 결합을 통해) 말단 알켄에 (직접적으로 또는 링커 또는 스페이서를 통해 간접적으로) 연결되도록 화학적으로 변형될 수 있고, 여기서 알케닐 탄수화물 항원의 말단 알켄 기는 티올-엔 반응(예를 들어, 광촉매 티올-엔 반응)을 통해 유리 티오-링커에 접합될 수 있다. 알케닐 탄수화물 항원의 말단 알켄 기는 일치환된 알켄, 비닐 기 또는 알릴 기일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 탄수화물 항원은 O-글리코시드 결합, S-글리코시드 결합, N-글리코시드 결합 또는 C-글리코시드 결합과 같은 글리코시드 결합, 또는 알릴 아민과 환원당(박테리아 CPS 포함) 사이에서와 같은 환원성 아민화에 의해 수득된 결합을 통해 말단 알켄에 공유적으로 연결될 수 있다. 본원에 사용된 "글리코시드 결합"은 S-글리코시드 결합, N-글리코시드 결합, O-글리코시드 결합, 또는 C-글리코시드 결합, 또는 (예를 들어, NaBH4 또는 바람직하게는 NaBH3CN을 사용하는) 환원 당의 환원성 아민화에 의해 수득된 결합 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 글리코시드 결합은 투여되는 대상체의 내인성 효소(예를 들어, 글리코하이드롤라제)에 의해 절단될 수 없는 것일 수 있다. 이러한 절단불가능한 글리코시드 결합은 대상체에 투여된 후 더 긴 반감기를 갖는 신생 당접합체 면역원을 생성할 수 있고, 이는 차례로 치료 및/또는 항체 생성 목적을 위해 보다 유리한 면역 반응을 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 글리코시드 결합은 S-글리코시드 결합, N-글리코시드 결합, 또는 C-글리코시드 결합, 또는 알릴 아민과 환원당 사이에서와 같은 환원성 아민화에 의해 수득된 결합일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 티오-링커는 다음의 구조를 포함할 수 있다:
(화학식에서 Y는 -(CH2)n- 또는 -(OCH2CH2O)n-; Z는 -CO2H, -SO2H, -O-C(O)-H, -N=C=O, 또는 -N=C=S; O는 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5; O는 0이고 Z는 -CO-이고 Y는 -(OCH2CH2O)n-이거나; O는 0이고 Z는 -SO2-이고 Y는 -(OCH2CH2O)n-이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 신생 당접합체는 바람직하게는 탄수화물 항원 자체의 수용해도를 개선할 뿐만 아니라 이후에 탄수화물 항원 보호기를 제거하는 단계를 회피하는, 보호되지 않은 탄수화물 항원을 사용한다. 따라서, 일부 구현예에서, 탄수화물 항원, 알케닐 탄수화물 항원, 신생 탄수화물 항원, 신생 탄수화물 항원 중간체, 및/또는 신생 당접합체의 탄수화물 부분은 본원에 기재된 방법 전반에 걸쳐 보호되지 않은 채로 남아 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 신생 탄수화물 항원의 제2 작용기가 카르복실 기, 설핀산 기 또는 탄산 기와 같은 기인 경우, 본원에 기재된 방법은 카르복실 기, 설핀산 기 또는 탄산 기의 말단 하이드록실 기를 폴리펩티드의 유리 아민 기에 대한 접합을 위한 더 나은 이탈기로 대체하여 신생 탄수화물 항원을 신생 탄수화물 항원 중간체로 전환시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "더 나은 이탈기"라는 표현은 이탈기로 대체되기 전의 상응하는 작용기와 비교하여 개선된 반응 효율 및/또는 특이성(즉, 폴리펩티드의 유리 아민 기에 대한 개선된 접합)을 제공하는 이탈기를 지칭한다. 일부 구현예에서, 본원에 사용된 이탈기는 활성 에스테르 기(예를 들어, 플루오로페닐 기(예를 들어, OPhF5, OPhF4(파라 SO3Na)), 또는 숙신이미딜 기)일 수 있다. 신생 탄수화물 항원 중간체는 그 후 정제되고 후속적으로 하나 이상의 유리 아민 기를 갖는 운반체 단백질 또는 펩티드와의 커플링 반응에 사용될 수 있다. 커플링 반응은 하나 이상의 정제된 신생 탄수화물 항원 중간체를 (예를 들어, 아미드, 카바메이트, 설폰아미드, 우레아 또는 티오우레아 결합을 통해) 하나 이상의 유리 아민 기에서 운반체 단백질 또는 펩티드에 접합시켜, 본원에 기재된 신생 당접합체를 생성한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 신생 탄수화물 항원-운반체 단백질 커플링 반응은 운반체 단백질 또는 펩티드 자체에 존재하는 아스파르트산/글루탐산 잔기 및 ε-리신 아민의 측쇄 사이의 운반체 단백질 또는 펩티드 자가 가교형성을 유리하게 최소화하거나 회피할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 신생 탄수화물 항원-운반체 단백질 커플링 반응은 운반체 단백질 또는 펩티드에 접합된 신생 탄수화물 항원의 수가 반응물의 효능 및/또는 화학량론(예를 들어, 운반체 단백질 또는 펩티드 대 신생 탄수화물 항원 또는 신생 탄수화물 항원 중간체의 몰비)에 의해 제어될 수 있게 한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 신생 탄수화물 항원-운반체 단백질 커플링 반응은 운반체 단백질 또는 펩티드당 신생 탄수화물 항원 또는 신생 탄수화물 항원 중간체의 1 내지 500, 1 내지 400, 1 내지 300, 1 내지 200, 5 내지 500, 5 내지 400, 5 내지 300, 또는 5 내지 200의 몰 당량 사이의 반응을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 설명은 탄수화물 접합 종의 관점에서 약 또는 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 균질성을 갖는 신생 당접합체 면역원을 포함하는 조성물에 관한 것이다(예를 들어, 조성물 중 적어도 90%의 신생 당접합체 종/분자는 운반체 단백질에 접합된 동일한 수의 탄수화물 항원을 갖는다).
일부 구현예에서, 본원에 기재된 (신생) 탄수화물 항원은 B 세포 에피토프를 포함할 수 있고/있거나, 대상체에서 체액성 면역 반응을 유도한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 (신생) 탄수화물 항원은 T 세포 에피토프를 포함할 수 있고/있거나, 대상체에서 세포 매개 면역 반응을 유도한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 (신생) 탄수화물 항원은 B 세포 에피토프 및 T 세포 에피토프를 포함할 수 있고/있거나, 대상체에서 체액성 및 세포 매개 면역 반응을 유도한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 탄수화물 항원은 종양 관련 탄수화물 항원(TACA), 예컨대, Tn, S-Tn, 톰슨 프라이덴리히(Thomsen-Friedenreich)(TF), (2,3)-S-TF, (2,6)-S-TF(도 1), Globo H, PSA, GD2, GD3, GM2, GM3, N-글리콜릴-GM3, 푸코실 GM1, Lea, sLea, Lex, sLex, Ley, 또는 이들의 임의의 조합이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 탄수화물 항원은 바이러스 다당류 항원, 또는 박테리아 협막 다당류(CPS)(예를 들어, 폐렴구균 및/또는 연쇄상구균 다당류 혈청형, 수막구균 CPS; 인플루엔자(예를 들어, 인플루엔자 유형 a 또는 b) CPS)를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 신생 탄수화물 항원-운반체 단백질 커플링 반응은 하나 이상의 유형의 티오-링커를 통해 동일한 탄수화물 항원 중 적어도 2개, 또는 1개 초과 유형의 탄수화물 항원을 운반체 단백질 또는 펩티드에 접합시켜, 다가의 신생 당접합체를 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 다가의 신생 당접합체는 운반체 단백질 또는 펩티드에 접합된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15종 이상의 동일하거나 상이한 유형의 탄수화물 항원을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 신생 당접합체 면역원은 Tn, S-Tn, 톰슨 프라이덴리히(TF), (2,3)-S-TF, (2,6)-S-TF, Globo H, PSA, GD2, GD3, GM2, GM3, N-글리콜릴-GM3, 푸코실 GM1, Lea, sLea, Lex, sLex 및 Ley로부터 선택되는 TACA의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 시알릴화 또는 비시알릴화 Tn 및 TF 항원(및 이들의 유사체)은 본원에 기재된 바와 같이 또는 예를 들어 문헌[Ress et al., 2005]; 문헌[Wu et al., 2019]; 문헌[Thompson et al., 2015]; 및 문헌[Yang et al., 2010]에 기재된 바와 같이 합성될 수 있다.
일부 구현예에서, 각각의 TACA의 조합에서의 비율은 표적화된 종양에 따라 다를 수 있고 1 내지 20 몰비를 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, 본원에 기재된 신생 당접합체 면역원은 예를 들어, 하기 표에 기재된 바와 같이 다중 TACA의 특정 조합의 증가된 발현과 관련된 특정 형태의 암에 따라 조정될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 다가의 신생 당접합체 면역원은 (예를 들어, 분지형 링커를 통해) 운반체 단백질 상의 단일 유리 아민 기에 접합된 1개 초과의 (신생) 탄수화물 항원을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 다가의 신생 당접합체 면역원은 (예를 들어, 광범위한 분지를 갖는 링커를 통해) 덴드리머로서 운반체 단백질 또는 펩티드에 부착되기 전에 티오-링커에 접합되는 복수(예를 들어, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상)의 (신생) 탄수화물 항원을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 운반체 단백질 또는 펩티드는 1개 이상의 유리 아민 기를 포함한다. 본원에 사용된 "유리 아민" 또는 "유리 아민 기"는 화학적 변형 및/또는 (예를 들어, 운반체 단백질의 주변에 노출되는 경향이 있는 용매 접근 가능한 리신 잔기와 같은, 본원에 기재된 바와 같은 탄수화물 항원에 대한) 접합에 이용 가능한 1개 이상의 아미노 기를 갖는 운반체 단백질 또는 펩티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 운반체 단백질 상의 인접 위치에 접합되는 다중 (신생) 탄수화물 항원을 너무 많이 갖는 것을 피하는 것이 유리할 수 있다. 일부 구현예에서, 운반체 단백질 또는 펩티드는 바람직하게는 리신이 풍부한 도메인(예를 들어, 리신 잔기의 적어도 50%를 포함하는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 연속 아미노산의 분절)이 결여될 수 있다.
일부 구현예에서, 운반체 단백질은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100개의 총 리신 잔기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 운반체 단백질은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 총 유리 아민 잔기를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 운반체 단백질 또는 펩티드는 1개 이상의 유리 아민 기를 갖는 1개 이상의 리신 잔기를 포함하거나, 선택적으로 예를 들어 운반체 단백질 또는 펩티드의 아미노 말단, 카르복시 말단 또는 용매 접근 가능 위치에, 1개 이상의 추가 리신 잔기를 부가하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 운반체 단백질은 T 세포 에피토프를 포함하고/하거나, 대상체에서 세포 매개 면역 반응을 유도한다. 일부 구현예에서, 운반체 단백질 또는 펩티드는 B 세포 에피토프를 포함하고/하거나, 대상체에서 체액성 면역 반응을 유도한다. 일부 구현예에서, 운반체 단백질은 B 세포 에피토프 및 T 세포 에피토프를 포함하고/하거나, 대상체에서 체액성 및 세포-매개 면역 반응을 유도한다.
바람직하게는, 본원에 기재된 운반체 단백질은 (예를 들어, 승인된 백신에서) 인간 대상체에게 투여하기 위한 규제(예를 들어, FDA) 승인을 이미 받은 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 운반체 단백질은 파상풍 톡소이드(TT), 디프테리아 톡소이드(DT), 교차 반응 물질 197(CRM197), 수막구균 외막 단백질 복합체(OMPC), H. 인플루엔자 단백질 D(HiD), 바이러스 유사 입자(VLP), 사이토카인, 면역원성 펩티드, 예컨대, 파상풍 독소 831-844(서열번호 1 또는 2), 알부민(예컨대, 소 혈청 알부민 또는 인간 혈청 알부민), 열쇠구멍삿갓조개헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin, KLH), 또는 이의 면역원성 단편이거나, 이로부터 유래하거나, 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 운반체 단백질 또는 펩티드는 바람직하게는 대상체에서 (가까운) 오르소로그를 갖지 않는, 투여될 대상체에 대해 외인성이다. 인간 백신 제조의 맥락에서, 본원에 기재된 운반체 단백질은 운반체 단백질이 인간에서 "자가 항원"으로 간주되지 않도록 인간 단백질과 항원적으로 구별되는 운반체 단백질을 의미하는 "인간 사용에 적합한 운반체 단백질" 또는 단순히 "적합한 운반체 단백질"을 지칭한다. 상응하는 인간 단백질과 항원적으로 너무 유사한 운반체 단백질을 사용하면 인간 백신에서 이상적이지 않을 수 있는 "자가 항원"으로 간주되는 운반체 단백질이 될 수 있다. 예를 들어, 소 혈청 알부민(BSA)의 리신 잔기의 ε-아미노 기에 무작위로 접합된 TF 항원으로 구성된 신생 당접합체 면역원은 이전에 기재되었고 특성화되었다(예컨대, 문헌[Demian et al., 2014]; 문헌[Rittenhouse-Diakun et al., 1998]; 문헌[Heimburg et al., 2006]; 문헌[Tati et al., 2017]). 그러나 BSA의 59개 리신 잔기 상에서 탄수화물의 수준이 무작위적이고 비효율적이었을 뿐만 아니라(BSA 분자당 4 내지 6개 이하의 TF 항원이 접합되었음), BSA는 인간 알부민과 항원적으로 너무 유사하기 때문에 인간 백신에서 운반체 단백질로서 적합하지 않을 것이다. 일부 구현예에서, 운반체 단백질은 알부민(예컨대, 소 혈청 알부민)이 아니다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 신생 당접합체는 신생 당접합체 면역원일 수 있으며, 운반체 단백질 또는 펩티드는 대상체에게 투여 시 면역원성이고, 티오-링커를 통한 운반체 단백질 또는 펩티드에 대한 탄수화물 항원의 접합은 대상체에게 투여 시 비접합 탄수화물 항원의 상응하는 투여와 비교하여 탄수화물 항원의 면역원성을 증가시킨다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 티오-링커는 신생 당접합체가 투여될 대상체에 대해 비-면역원성이어서, 대상체에 대한 신생 당접합체 면역원의 투여가 신생 당접합체 면역원에 포함된 티오-링커에 대한 항체를 유발시키지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 티오-링커에는 합성 화학/작용기(즉, 대상체에서 자연적으로 발견되지 않는 화학/작용기)가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 티오-링커는 천연 화학/작용기, 즉 대상체에서 천연적으로 발견되는 작용기만을 포함한다. 이와 관련하여, 당해 분야에서 사용되는 일부 탄수화물 항원-단백질 링커, 예컨대, 스쿠아르산 등은 링커가 커플링되는 탄수화물 항원만이 아니라 링커 자체에 대한 면역 반응을 유발할 수 있으며, 이들의 화학/작용기의 "외래적" 성질 및/또는 항원성과 관련이 있을 수 있다.
일부 구현예에서, 탄수화물 항원 또는 신생 탄수화물 항원은 운반체 단백질 또는 펩티드에 커플링된 후 대상체의 내인성 효소에 의해 운반체 단백질 또는 펩티드로부터 절단될 수 없다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 운반체 단백질 또는 펩티드는 T 세포 에피토프를 포함할 수 있고/있거나, 투여 시 대상체에서 세포 매개 면역 반응을 유도할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 합성 신생 당접합체 면역원은 대상체에게 투여 시 (신생) 탄수화물 항원에 대한 세포 매개 면역 반응을 유도할 수 있다.
추가 양태에서, 신생 당접합체 백신 또는 면역 반응 유발 조성물을 생산하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 방법은 본원에 기재된 바와 같은 신생 당접합체 또는 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 제조된 신생 당접합체를 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 보조제와 함께 제형화하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 보조제는 무기 화합물, 미네랄 오일, 미생물 유도체, 식물 유도체, 사이토카인, 스쿠알렌, 명반, 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄, 수산화 인산 칼슘, 톨 유사 수용체 효능제, 면역자극성 폴리뉴클레오티드(예컨대, CPG), 면역자극성 지질, 프로인트 보조제, RIBI의 보조제, QS-21, 무라밀 디펩티드, TiterMaxTM, SteviuneTM, StimuneTM 또는 이들의 임의의 조합이거나 이를 포함한다.
백신 조성물은 수용 동물의 연령, 성별, 체중, 종 및 상태, 및 투여 경로와 같은 인자를 고려하여 의학 또는 수의학 분야의 당업자에게 잘 알려진 투여량 및 기술로 투여될 수 있다. 투여 경로는 경피, 점막 투여(예를 들어, 경구, 비강, 안구) 또는 비경구 경로(예를 들어, 피내, 근육 내, 피하)일 수 있다. 백신 조성물은 단독으로 투여될 수 있거나, 다른 치료 또는 요법과 공동 투여되거나 순차적으로 투여될 수 있다. 투여 형태는 멸균 현탁액 또는 에멀젼과 같은 비경구, 피하, 피내 또는 근육 내 투여(예를 들어, 주사가능한 투여)를 위한 현탁액 및 제제를 포함할 수 있다. 백신은 스프레이로 투여하거나 식품 및/또는 물과 혼합하여 투여하거나 멸균수, 생리식염수, 글루코스 등과 같은 적합한 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합하여 전달할 수 있다. 조성물은 투여 경로 및 원하는 제제에 따라 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 보조제, 겔화 또는 점도 향상 첨가제, 방부제, 향미제, 착색제 등과 같은 보조 물질을 함유할 수 있다. 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences," 1990]과 같은 표준 제약 교재를 참조하여 과도한 실험 없이 적합한 제제를 제조할 수 있다.
추가 양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 신생 당접합체 백신 또는 적응적 면역 반응 유발 조성물 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 신생 당접합체 및 본원에 기재된 바와 같은 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 보조제를 포함하는 신생 당접합체 백신 또는 적응적 면역 반응 유발 조성물이 본원에 기재된다. 구현예에서, 신생 당접합체 백신은 예방 백신 또는 치료 백신일 수 있다. 구현예에서, 본원에 기재된 백신 조성물은 하나 이상의 TACA를 포함할 수 있고, 백신 조성물은 TACA를 발현하는 암에 대한 항암 백신일 수 있다. 구현예에서, 암은 B 세포 림프종(B-cell lymphoma), 유방암(breast cancer), 결장암(colon cancer), 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 흑색종(melanoma), 신경모세포종(neuroblastoma), 난소암, 전립선암, 육종(sarcoma), 소세포 폐암(small cell lung cancer) 또는 위암(stomach cancer)일 수 있다.
일부 양태에서, 대상체를 면역화, 백신 접종, 또는 치료하는 방법이 본원에 기재되어 있으며, 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생산된 신생 당접합체, 본원에 기재된 바와 같은 합성 신생 당접합체, 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생산된 신생 당접합체 백신 또는 적응적 면역 반응 유발 조성물, 또는 본원에 기재된 바와 같은 신생 당접합체 백신을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 질환을 앓는 대상체를 면역화, 백신 접종, 또는 치료하는 데 사용하거나, 또는 신생 당접합체에 특이적으로 결합하는 항체의 존재를 검출하는 데 사용하거나, 또는 (예를 들어, 대상체로부터의 생물학적 샘플에서) 상기 면역화, 백신 접종, 또는 치료를 검출하는 데 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생산된 신생 당접합체, 본원에 기재된 바와 같은 합성 신생 당접합체, 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생산된 신생 당접합체 백신 또는 적응적 면역 반응 유발 조성물, 또는 본원에 기재된 바와 같은 신생 당접합체 백신이 본원에 기재된다.
일부 구현예에서, 질환을 앓는 대상체의 면역화 또는 치료용, 또는 신생 당접합체에 특이적으로 결합하는 항체의 존재의 검출용, 또는 (예를 들어, 대상체로부터의 생물학적 샘플에서) 상기 면역화 또는 치료의 검출용 백신의 제조를 위한, 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생산된 신생 당접합체, 본원에 기재된 바와 같은 합성 신생 당접합체, 또는 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생산된 적응적 면역 반응 유발 조성물이 본원에 기재된다.
일부 구현예에서, 상기 탄수화물 항원의 증가된 발현과 관련된 질환을 앓는 대상체의 치료에 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생산된 신생 당접합체, 본원에 기재된 바와 같은 합성 신생 당접합체, 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생산된 신생 당접합체 백신 또는 적응적 면역 반응 유발 조성물, 또는 본원에 기재된 바와 같은 신생 당접합체 백신이 본원에 기재된다.
일부 구현예에서, 탄수화물 항원 또는 탄수화물 항원을 포함하는 종양 순환 세포에 특이적으로 결합하는 항체의 존재를 검출 또는 스크리닝하기 위한, 또는 탄수화물 항원을 이용한 면역화 또는 백신 접종으로 인한 항체의 존재를 검출하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생산된 신생 당접합체, 본원에 기재된 바와 같은 합성 신생 당접합체, 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생산된 신생 당접합체 백신 또는 적응적 면역 반응 유발 조성물, 또는 본원에 기재된 바와 같은 신생 당접합체 백신이 본원에 기재된다. 일부 구현예에서, 검출 또는 스크리닝은 면역흡착 분석, ELISA, 마이크로어레이, 또는 면역블롯 분석과 같은 임의의 적합한 검출 방법을 통해 수행될 수 있다.
추가 양태에서, 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재되며, 방법은 상기 대상체에서 탄수화물 항원에 대한 면역 반응을 생성하기 위하여, 본원에 정의된 바와 같은 또는 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생산된 신생 당접합체 또는 신생 당접합체 면역원을 투여하는 단계 및 선택적으로 탄수화물 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 존재에 대해 상기 대상체로부터의 생물학적 샘플을 스크리닝하는 단계를 포함한다.
추가 양태에서, SARS-CoV-2와 관련된 치료 및/또는 진단 도구로서 사용하기 위한 당접합체가 본원에 기재된다. 더욱 구체적으로, SARS-CoV-2에 대해 대상체를 면역화하는 데 사용하거나, 대상체에서 항-SARS-CoV-2 항체의 생산을 유발하는 데 사용하거나, SARS-CoV-2에 대해 대상체에서 세포 매개 면역 반응을 유도하는 데 사용하거나, 또는 이들의 임의의 조합에 대해 사용하기 위한 당접합체가 본원에 기재된다. 또한, SARS-CoV-2와 관련된 검출/진단 도구에 사용하기 위한 당접합체가 본원에 기재된다. 예를 들어, 대상체로부터의 샘플에서 항-SARS-CoV-2 항체의 존재를 검출하는 데 사용하기 위한 당접합체가 본원에 기재된다.
본원에 사용된 표현 "항-SARS-CoV-2 항체"는 천연 재조합 단백질 상에서 발현되고/되거나 조립된 비리온 입자 상에 존재하는 것과 같은 천연 형태로 항원(예를 들어, 탄수화물 항원)에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 대조적으로, 변성된 항원(예를 들어, SDS-PAGE를 따르는 것과 같은 변성 조건 하에서)에만 결합하고 천연 형태의 동일한 항원에는 결합하지 않는 항체는 표현 "항-SARS-CoV-2 항체"에서 제외된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 당접합체 또는 백신은 중화 활성을 갖는 항체의 생산을 유도할 수 있다. 본원에 사용된 "중화 활성"이라는 표현은 SARS-CoV-2 비리온 입자에 결합하고 취약한 숙주 세포를 감염시키는 능력을 억제하는 리간드(예를 들어, 항체)를 지칭한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 당접합체는 적합한 운반체 물질(예를 들어, 운반체 단백질 또는 펩티드, 또는 비단백질성 중합체 물질)에 접합된 탄수화물 항원을 포함할 수 있으며, 여기서 탄수화물 항원은 시알릴화 톰슨 프라이덴리히(TF) 항원, 비시알릴화 TF 항원, 시알릴화 Tn 항원, 비시알릴화 Tn 항원, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 탄수화물 항원은 (2,3)-S-TF와 같은 모노시알릴화 TF 항원 및/또는 디시알릴 코어 1과 같은 디시알릴화 TF 항원을 포함한다. 이들 탄수화물 항원은 재조합적으로 발현된 SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질 및/또는 이의 S1 단편에서 정량적 고해상도 질량 분석법(실시예 16; 도 20 및 21)에 의해 펩티드 단편 VQPTESIVR(서열번호 3)의 위치 4 및/또는 6에 상응하는 위치에서 검출되었다. 나아가, 실시예 17 및 도 22 및 도 23에 제시된 결과는 이들 탄수화물 항원의 적어도 일부가 (예를 들어, 렉틴 및/또는 항체와) 리간드 결합에 이용 가능함을 증명하고, 실시예 18 및 도 24에 제시된 결과는 이러한 탄수화물 항원에 결합하는 리간드가 SARS-CoV-2의 S 단백질을 발현하는 위형 바이러스 입자가 인간 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2, S가 숙주 세포로 진입하기 위해 결합하는 수용체)를 발현하는 숙주 세포를 감염시키는 능력을 억제함을 증명한다. SARS-CoV-2 S 단백질이 주로 N-연결 글리칸에 의해 과하게 보호되고 O-연결 글리칸(검출된 경우, 보고서가 상충됨)은 병원성 비리온 입자의 맥락에서 리간드 결합에 접근할 수 없는 SARS-CoV-2의 S 단백질의 전체 글리코실화 프로파일의 미미한 성분이라는 다수의 보고서를 고려할 때(Watanabe et al., 2020; Shajahan et al., 2020; Grant et al., 2020), 이러한 결과는 예상할 수 없었다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 탄수화물 항원은 예를 들어 체액성 및 세포 매개 면역 반응을 유발하는 것이 바람직한지에 따라 B 세포 에피토프 또는 T 세포 에피토프를 포함하는 운반체 물질에 접합될 수 있다. 일부 구현예에서, 탄수화물 항원은 서열번호 3 또는 4의 SARS-CoV-2 S 단백질 단편에, 예를 들어 서열번호 3의 위치 4 및/또는 6 또는 서열번호 4의 위치 323, 325, 및/또는 678에서 공유 접합될 수 있다. 특히, 서열번호 4의 위치 678(R682에서 스파이크 단백질의 푸린 절단 부위에 가까움)은 코어-1 및 코어-2 구조에 의해 O-글리코실화되는 것으로 보고되었다.
일부 구현예에서, 운반체 단백질 또는 펩티드는 서열번호 4의 SARS-CoV-2 S 단백질 서열의 면역원성 단편을 포함할 수 있고, 단편은 서열번호 4의 위치 323, 325, 및/또는 678에 접합된 하나 이상의 탄수화물 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 탄수화물 항원은 서열번호 3의 SARS-CoV-2 S 단백질 단편의 변이체, 예를 들어 위치 4 및/또는 6의 잔기가 탄수화물 항원에 대한 화학적 접합을 촉진할 수 있는 리신 및/또는 시스테인 잔기로 대체될 수 있는 변이체에 공유 접합될 수 있다. 일부 구현예에서, 운반체 단백질 또는 펩티드는 위치 323, 325, 및/또는 678에 리신 또는 시스테인을 갖는 서열번호 4의 SARS-CoV-2 S 단백질 서열의 변이체의 면역원성 단편을 포함할 수 있고, 단편은 서열번호 4의 위치 323, 325, 및/또는 678의 리신 또는 시스테인 잔기에 접합된 하나 이상의 탄수화물 항원을 포함한다. 리신 잔기의 경우, 탄수화물 항원은 본원에 기재된 접합 방법을 통해, 또는 당해 분야에 공지된 다른 접합 방법을 통해 운반체 단백질에 접합될 수 있다. 시스테인 잔기의 경우, 탄수화물 항원은 예를 들어 WO/2019/178699 또는 US 10,610,576에 기재된 접합 방법을 통해, 또는 당해 분야에 공지된 다른 접합 방법을 통해 운반체 단백질에 접합될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 운반체 물질은 서열번호 3의 펩티드, 또는 위치 4 및/또는 6에 시스테인 또는 리신을 포함하는 서열번호 3의 펩티드의 변이체를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호 3의 펩티드 또는 펩티드 변이체는 운반체 물질에 포함될 수 있거나(예를 들어, 아미노산 서열로 재조합에 의해 조작됨), (예를 들어, 융합 단백질로서) 운반체 물질에 융합될 수 있다.
일부 구현예에서, 운반체 물질은 파상풍 톡소이드(TT), 디프테리아 톡소이드(DT), 교차 반응 물질 197(CRM197), 수막구균 외막 단백질 복합체(OMPC), H. 인플루엔자 단백질 D(HiD), 바이러스 유사 입자(VLP), 사이토카인, 면역원성 펩티드, 예컨대, 파상풍 독소 831-844(서열번호 1 또는 2), 알부민(예컨대, 소 혈청 알부민 또는 인간 혈청 알부민), 열쇠구멍삿갓조개헤모시아닌(KLH), 또는 이의 면역원성 단편이거나, 이로부터 유래하거나, 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 당접합체는 (i) 본원에 기재된 방법에 의해 생성되거나 정의된 바와 같은 신생 당접합체; (ii) 본원에 기재된 신생 탄수화물 항원; (iii) 본원에 기재된 합성 신생 당접합체; 또는 (iv) 본원에 기재된 신생 당접합체 백신 또는 적응적 면역 반응 유발 조성물일 수 있다.
일부 구현예에서, 당접합체는 WO/2019/178699 또는 US 10,610,576에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생성될 수 있다. 간략하게, 일부 구현예에서, 방법은 다음을 포함할 수 있다: (a) 말단 알켄에 공유 연결된 수용성 탄수화물 항원(알케닐 탄수화물 항원)을 제공하는 단계(말단 알켄은 티올-엔 반응을 통해 티올 기에 직접 접합될 수 있고, 알케닐 탄수화물 항원은 보호되지 않은 수용성 알케닐 탄수화물 항원임); (b) 하나 이상의 유리 티올 기를 갖는 운반체 물질을 제공하는 단계; 및 (c) 광촉매 티올-엔 반응을 수행하여 탄수화물 항원을 하나 이상의 유리 티올 기에서 물질에 직접 접합시켜 당접합체를 생성하는 단계를 포함한다. 추가 구현예에서, 방법은 아래에 나열된 항목 51 내지 53에 기재된 바와 같은 하나 이상의 특징을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본원에 정의된 하나 이상의 당접합체 및 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 보조제를 포함하는 SARS-CoV-2 또는 COVID-19 백신 또는 적응적 면역 반응 유도 조성물이 본원에 기재된다. 당접합체는 일반적으로 SARS-CoV-2 비리온에서 발현되는 하나 이상의 탄수화물 항원, 예를 들어 SARS-CoV-2의 S(또는 S1) 단백질에서 발현되는 탄수화물 항원을 포함한다. 본원에 기재된 SARS-CoV-2 백신에 적합한 탄수화물 항원은 백신을 투여 받는 대상체에서 자가면역 반응을 유발시킬 위험을 감소시키기 위해 비정상적인 글리코실화 패턴 - 즉, 대상체의 정상 또는 건강한 세포 및 조직에서 발현되지 않는 것들 -의 탄수화물 항원이다. SARS-CoV-2 S 단백질의 N-연결 및 O-연결 글리코실화 프로파일을 분석한 후, SARS-CoV-2 S 단백질에서 발현된 N-연결 글리칸의 대부분이 인간 대상체의 정상 또는 건강한 세포 및 조직에 존재하는 탄수화물 항원과의 잠재적인 유사성으로 인해 당접합체 백신 개발의 이상적인 후보가 아닐 수 있음이 밝혀졌다. 대조적으로, SARS-CoV-2 S 단백질에 대한 O-연결 글리코실화 프로파일의 분석은 당접합체 백신 개발에 잠재적으로 적합한 몇 가지 비정상적인 O-연결 글리칸을 밝혀냈다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 탄수화물 항원은 실시예 16 및 도 20 및 21에서 확인된 O-연결 글리칸 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 당접합체 또는 본원에 기재된 SARS-CoV-2 백신은 SARS-CoV-2 비리온 입자에 결합하고 바람직하게는 중화 활성을 갖는(예를 들어, 감염에 취약한 숙주 세포로부터 SARS-CoV-2 비리온 입자의 능력을 억제하는) 항체의 생산을 유도한다.
일부 양태에서, SARS-CoV-2에 대해 대상체에게 백신을 접종하거나 대상체에서 항-SARS-CoV-2 항체의 생산을 유발하는 방법이 본원에 기재되며, 방법은 본원에 기재된 당접합체 또는 SARS-CoV-2 백신 중 하나 이상을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, SARS-CoV-2 바이러스에 의한 감염으로부터 대상체를 보호하기 위한(또는 중증도를 감소시키기 위한), 또는 COVID-19를 치료하기 위한(또는 COVID-19로부터 발생하는 합병증을 감소시키기 위한) 조성물이 본원에 기재되며, 조성물은 SARS-CoV-2 S 단백질 상에서 발현되는 O-연결 글리칸에 결합하는 하나 이상의 리간드(예를 들어, 항체, 항체 단편 또는 렉틴)를 포함한다. 일부 구현예에서, O-연결 글리칸은 시알릴화 TF 항원(모노- 또는 디-시알릴화 TF 항원), 비시알릴화 TF 항원, 시알릴화 Tn 항원, 비시알릴화 Tn 항원, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 리간드는 재조합 단클론 항체(예를 들어, JAA-F11 또는 인간화 JAA-F11)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 리간드는 시알릴화 TF 및/또는 비시알릴화 Tn에 대한 결합 친화성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 리간드는 시알릴화 및 비시알릴화 TF 둘 모두에 대해 결합 친화성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 리간드는 자칼린(Jacalin)과 같은 렉틴일 수 있거나 자칼린 관련 렉틴이다. 이와 관련하여, 실시예 18 및 도 24는 SARS-CoV-2의 S 단백질을 발현하는 위형 바이러스 입자가 숙주 세포를 감염시키는 능력에 대한 가장 강력한 억제 효과를 갖는 리간드가 렉틴 자칼린임을 보여준다. 아르토카르푸스 인테그리폴리아(Artocarpus integrifolia) 렉틴(AIA)은 잭푸르트(jackfruit) 종자에서 분리된다(Sankaranarayanan et al., 1996). 흥미롭게도, 자칼린은 시알릴화 또는 비시알릴화 형태의 TF 및 Tn 항원 둘 다에 대해 결합 특이성을 갖는 것으로 알려져 있다(Jeyaprakash et al., 2002). 슈도바이러스 감염성의 억제는 또한 렉틴 PNA 및 항-TF 단클론 항체 JAA-F11과 같은 비-시알릴 TF 항원에만 결합하는 리간드에 대해 본원에서 제시된다(도 24). 일부 구현예에서, 전술한 조성물은 비강 내 조성물로서 제형화될 수 있다.
일부 양태에서, 다음을 포함하는 복합체가 본원에 기재된다: (a) 시알릴화 TF 항원(모노- 또는 디-시알릴화 TF 항원), 비시알릴화 TF 항원, 시알릴화 Tn 항원, 비시알릴화 Tn 항원 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 O-연결 글리칸을 발현하는 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 단편; 및 (b) O-연결 글리칸에서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 단편에 결합된 본원에 정의된 리간드. 일부 구현예에서, 복합체는 온전한 SARS-CoV-2 비리온 입자에 SARS-CoV-2 S 단백질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 복합체는 시험관 내 또는 생체 내에서 형성될 수 있다.
항목
다음 항목 중 하나 이상이 본원에 기재된다.
1.
다음을 포함하는 신생 당접합체의 생산 방법: (a) 제1 말단 및 제2 말단을 갖는 링커를 포함하는 신생 탄수화물 항원 또는 신생 탄수화물 항원 중간체를 제공하는 단계(여기서 제1 말단은 티오 에테르 결합을 통해 탄수화물 항원에 접합되고 제2 말단은 유리 아민 기와 반응할 수 있는 작용기를 포함하고, 작용기는 -COX, -SO2X, -O-C(O)-X, -N=C=O, 또는 -N=C=S이고, X는 이탈기임); (b) 하나 이상의 유리 아민 기를 갖는 운반체 단백질 또는 펩티드를 제공하는 단계; 및 (c) 커플링 반응을 수행하여 하나 이상의 정제된 신생 탄수화물 항원 또는 신생 탄수화물 항원 중간체를 아미드, 카바메이트, 설폰아미드, 우레아 또는 티오우레아 결합을 통해 하나 이상의 유리 아민 기에서 운반체 단백질 또는 펩티드에 접합시켜, 신생 당접합체를 생산하는 단계.
2.
항목 1에 있어서, 단계 (a) 전에, (a)의 신생 탄수화물 항원 또는 신생 탄수화물 항원 중간체는 다음을 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인 방법: (i) 말단 알켄에 공유적으로 연결된 탄수화물 항원(알케닐 탄수화물 항원)을 제공하는 단계(말단 알켄은 티올-엔 반응을 통해 티올 기에 직접 접합될 수 있음); (ii) 제1 말단에 제1 작용기 및 제2 말단에 제2 작용기를 포함하는 티오-링커를 제공하는 단계(제1 작용기는 유리 티올 기이고 제2 작용기는 카르복실 기, 설핀산 기, 탄산 기, 이소시아네이트 기 또는 티오시아네이트 기임); (iii) 광촉매 티올-엔 반응을 수행하여 알케닐 탄수화물 항원을 제1 말단의 티오-링커에 직접 접합시켜, 제1 말단에 탄수화물 항원 및 제2 말단에 제2 작용기를 포함하는 신생 탄수화물 항원을 생산하는 단계; (iv) 제2 작용기가 카르복실 기, 설핀산 기 또는 탄산 기인 경우, 카르복실 기, 설핀산 기 또는 탄산 기의 말단 하이드록실 기를 폴리펩티드의 유리 아민 기에 대한 접합을 위한 더 나은 이탈기로 대체하여 신생 탄수화물 항원을 신생 탄수화물 항원 중간체로 전환시키는 단계; 및 (v) 신생 탄수화물 항원 또는 신생 탄수화물 항원 중간체를 정제하는 단계.
3.
항목 2에 있어서, (iii)의 광촉매 티올-엔 반응은 탄수화물 항원의 항원성 및/또는 구조를 유지하는 반응 조건 하에서 수행되는 것인 방법.
4.
항목 2 또는 3에 있어서, 상기 광촉매 티올-엔 반응은 촉매의 존재 하에 수행되고, 촉매는 수용성 촉매, 예컨대, 수용성 유리 라디칼 생성 아조 화합물; 2,2'-아조비스[2-(2-이미다졸린-2-일)프로판]디하이드로클로라이드(Vazo 44 또는 VA-044); 2,2'-아조비스(2-아미디노프로판) 디하이드로클로라이드(AAPH); 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(LAP); 광개시제 활성을 갖는 금속 또는 금속 이온; 과산화물; tert-부틸 하이드로퍼옥사이드; 벤조일퍼옥사이드; 암모늄 퍼설페이트; 또는 광개시제 활성을 갖는 이의 임의의 유도체; 또는 수불용성 촉매, 예컨대 수불용성 유리 라디칼 생성 아조 화합물, 2,2-디메톡시-2-페닐아세토페논(DMPA), 아조비스이소부티로니트릴(AIBN), 2,2'-아조비스(2-메틸프로피오니트릴), 4,4'-아조비스(4-시아노펜탄산)(ACVA), 1,1'-아조비스(시아노시클로헥산)(ACHN), 디아젠디카르복실산 비스(N,N-디메틸아미드)(TMAD); 아조디카르복실산 디피페리디드(ADD), 또는 광개시제 활성을 갖는 이의 임의의 유도체인 방법.
5.
항목 2 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 광촉매 티올-엔 반응은 자외선 광(예를 들어, 단파 자외선 광, 예컨대 약 254 nm, 또는 장파 자외선 광, 예컨대, 약 355 nm 또는 365 nm) 하의 조사를 포함하는 것인 방법.
6.
항목 2 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 광촉매 티올-엔 반응은 티오-링커의 유리 티올 기당 알케닐 탄수화물 항원의 1 내지 200 또는 1 내지 100 몰 당량 사이의 반응을 포함하거나; 상기 광촉매 티올-엔 반응은 10 내지 300, 10 내지 270, 10 내지 240, 10 내지 210, 10 내지 180, 10 내지 150, 10 내지 120, 10 내지 90, 10 내지 60, 또는 10 내지 30분 동안 수행되거나; 약 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 또는 4.0, 내지 약 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 또는 10의 pH에서 수행되거나; 또는 이들의 임의의 조합인 방법.
7.
항목 2 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 탄수화물 항원은 O-글리코시드 결합, S-글리코시드 결합, N-글리코시드 결합 또는 C-글리코시드 결합과 같은 글리코시드 결합, 또는 알릴 아민과 환원당 사이에서와 같은 환원성 아민화에 의해 수득된 결합을 통해, 바람직하게는 링커를 이용하여, 말단 알켄에 연결되는 것인 방법.
8.
항목 2 내지 7 중 어느 하나에 있어서, (ii)의 티오-링커는 다음의 구조를 포함하는 것인 방법:
(화학식에서 Y는 -(CH2)n- 또는 -(OCH2CH2O)n-; Z는 -CO2H, -SO2H, -O-C(O)-H, -N=C=O, 또는 -N=C=S; O는 1, 2, 3, 4, 또는 5; O는 0이고 Z는 -CO-이고 Y는 -(OCH2CH2O)n-이거나; O는 0이고 Z는 -SO2-이고 Y는 -(OCH2CH2O)n-임).
9.
항목 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 탄수화물 항원, 알케닐 탄수화물 항원, 신생 탄수화물 항원, 신생 탄수화물 항원 중간체, 및/또는 신생 당접합체의 탄수화물 부분은 방법 전반에 걸쳐 보호되지 않은 채로 남아 있는 것인 방법.
10.
항목 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 이탈기는 활성 에스테르 기(예를 들어, 플루오로페닐 기(예를 들어, OPhF5, OPhF4(파라 SO3Na)), 또는 숙신이미딜 기)인 것인 방법.
11.
항목 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 동일한 운반체 단백질 또는 펩티드에 존재하는 아스파르트산/글루탐산 잔기 및 ε-리신 아민 사이의 운반체 단백질 또는 펩티드 자가 가교형성을 회피하는 것인 방법.
12.
항목 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 운반체 단백질 또는 펩티드에 접합된 신생 탄수화물 항원의 수가 반응물의 효능 및/또는 화학량론(예를 들어, 운반체 단백질 또는 펩티드 대 신생 탄수화물 항원 또는 신생 탄수화물 항원 중간체의 몰비)에 의해 제어되는 것인 방법.
13.
항목 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 탄수화물 항원은 종양 관련 탄수화물 항원(TACA)(예를 들어, Tn, S-Tn, 톰슨 프라이덴리히(TF), (2,3)-S-TF, (2,6)-S-TF, Globo H, PSA, GD2, GD3, GM2, GM3, N-글리콜릴-GM3, 푸코실 GM1, Lea, sLea, Lex, sLex, Ley, 또는 이들의 임의의 조합); 바이러스 다당류 항원; 또는 박테리아 협막 다당류(CPS)(예를 들어, 폐렴구균 및/또는 연쇄상구균 다당류 혈청형, 수막구균 CPS, 또는 인플루엔자 CPS(예컨대, 인플루엔자 유형 a 또는 b CPS)이거나, 이로부터 유래되거나, 이를 포함하는 CPS)이거나 이를 포함하는 것인 방법.
14.
항목 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, (c)의 커플링 반응은 적어도 2개의 동일한 신생 탄수화물 항원, 또는 1개 초과 유형의 신생 탄수화물 항원을 운반체 단백질 또는 펩티드에 접합시켜, 다가의 신생 당접합체(예를 들어, 운반체 단백질 또는 펩티드에 접합된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 동일하거나 상이한 유형의 신생 탄수화물 항원을 포함하는 다가의 신생 당접합체)를 생산하는 것인 방법.
15.
항목 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 운반체 단백질 또는 펩티드는 예를 들어, 운반체 단백질 또는 펩티드의 아미노 말단, 카르복시 말단 또는 용매 접근 가능 위치에, 1개 이상의 추가 리신 잔기를 부가하도록 조작된 단백질 또는 펩티드인 것인 방법.
16.
항목 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 운반체 단백질 또는 펩티드는 파상풍 톡소이드(TT), 디프테리아 톡소이드(DT), 교차 반응 물질 197(CRM197), 수막구균 외막 단백질 복합체(OMPC), H. 인플루엔자 단백질 D(HiD), 사이토카인, 면역원성 펩티드, 예컨대, 파상풍 독소 831-844(서열번호 1 또는 2), 알부민(예컨대, 소 혈청 알부민 또는 인간 혈청 알부민), 열쇠구멍삿갓조개헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin, KLH), 또는 이의 면역원성 단편이거나, 이로부터 유래하거나, 또는 이를 포함하는 것인 방법.
17.
항목 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 신생 당접합체는 다음의 구조를 갖는 것인 방법:
(화학식에서 CA는 탄수화물 항원이거나 이를 포함하고; CP-NH는 하나 이상의 아민 기를 갖는 운반체 단백질 또는 펩티드이고; X는 O, S, NR1, 또는 CH2이고; R1은 H, COH(포름아미드), COMe, 또는 COEt이고; m은 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; Y는 -(CH2)n- 또는 -(OCH2CH2O)n-이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; o는 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이거나; 또는 o는 0이고 Z는 -CO-이고 Y는 -(OCH2CH2O)n-이거나; 또는 o는 0이고 Z는 -SO2-이고 Y는 -(OCH2CH2O)n-이고; Z는 -CO-, -NR2SO2-, -OCO-, -NR2CO-, 또는 -NR2CS-이고, R2는 H, Me, 또는 Et이고; 그리고 p는 1 내지 50임).
18.
항목 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 신생 당접합체는 신생 당접합체 면역원이고, 운반체 단백질 또는 펩티드는 대상체에게 투여 시 면역원성이고, 티오-링커를 통한 운반체 단백질 또는 펩티드에 대한 탄수화물 항원의 접합은 대상체에게 투여 시 비접합 탄수화물 항원의 상응하는 투여와 비교하여 탄수화물 항원의 면역원성을 증가시키는 것인 방법.
19.
항목 18에 있어서, 티오-링커는 대상체에 대해 비-면역원성이어서, 대상체에 대한 신생 당접합체 면역원의 투여가 신생 당접합체 면역원에 포함된 티오-링커에 대한 항체를 유발시키지 않는 것인 방법.
20.
항목 18 또는 19에 있어서, 상기 신생 탄수화물 항원은 운반체 단백질 또는 펩티드에 접합 후 대상체의 내인성 효소에 의해 운반체 단백질 또는 펩티드로부터 절단될 수 없는 것인 방법.
21.
항목 18 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 신생 탄수화물 항원은 B 세포 에피토프를 포함하고/하거나, 대상체에서 체액성 면역 반응을 유도하고/하거나; T 세포 에피토프를 포함하고/하거나, 대상체에서 세포 매개 면역 반응을 유도하는 것인 방법.
22.
항목 18 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 운반체 단백질 또는 펩티드는 인간 T 세포 에피토프를 포함하고/하거나, 대상체에서 세포 매개 면역 반응을 유도하는 것인 방법.
23.
항목 18 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 신생 당접합체 면역원은 대상체에게 투여 시 탄수화물 항원에 대한 세포 매개 면역 반응을 유도하는 것인 방법.
24.
제1 말단 및 제2 말단을 갖는 링커를 포함하는 신생 탄수화물 항원 또는 신생 탄수화물 항원 중간체로서, 제1 말단은 티오 에테르 결합을 통해 탄수화물 항원에 접합되고 제2 말단은 유리 아민 기와 반응할 수 있는 작용기를 포함하고, 작용기는 -COX, -SO2X, -O-C(O)-X, -N=C=O, 또는 -N=C=S이고, X는 이탈기인 신생 탄수화물 항원 또는 신생 탄수화물 항원 중간체.
25.
항목 24에 있어서, 탄수화물 항원은 보호되지 않은 것이거나; 이탈기는 항목 10에 정의된 바와 같은 것이거나; 탄수화물 항원은 항목 13에 정의된 바와 같은 것이거나; 또는 이의 임의의 조합인 것인, 신생 탄수화물 항원 또는 신생 탄수화물 항원 중간체.
26.
제1 말단 및 제2 말단을 갖는 링커를 포함하는 합성 신생 당접합체로서, 제1 말단은 티오 에테르 결합을 통해 탄수화물 항원에 접합되고 제2 말단은 아미드, 카바메이트, 설폰아미드, 우레아 또는 티오우레아 결합을 통해 내부의 하나 이상의 유리 아민 기에서 운반체 단백질 또는 펩티드에 접합되는 것인 합성 신생 당접합체.
27.
링커를 통해 운반체 단백질 또는 펩티드(CP-NH)의 하나 이상의 아민 기에 접합된 하나 이상의 탄수화물 항원(CA)을 포함하는 합성 신생 당접합체로서, 다음의 구조를 갖는 합성 신생 당접합체:
(화학식에서 X는 O, S, NR1, 또는 CH2이고; R1은 H, COH(포름아미드), COMe, 또는 COEt이고; m은 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; Y는 -(CH2)n- 또는 -(OCH2CH2O)n-이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; o는 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이거나; 또는 o는 0이고 Z는 -CO-이고 Y는 -(OCH2CH2O)n-이거나; 또는 o는 0이고 Z는 -SO2-이고 Y는 -(OCH2CH2O)n-이고; Z는 -CO-, -NR2SO2-, -OCO-, -NR2CO-, 또는 -NR2CS-이고; R2는 H, Me, 또는 Et이고; 그리고 p는 1 내지 50임).
28.
항목 26 또는 27에 있어서, 탄수화물 항원은 보호되지 않은 것이거나; 탄수화물 항원은 항목 13에 정의된 바와 같은 것이거나; 신생 당접합체는 항목 14에 정의된 바와 같은 다가의 신생 당접합체이거나; 운반체 단백질 또는 펩티드는 항목 15, 16, 18, 또는 22에 정의된 바와 같은 것이거나; 신생 당접합체는 항목 17에 정의된 바와 같은 구조를 갖거나; 링커는 항목 19에 정의된 바와 같거나; 신생 탄수화물 항원은 항목 20 또는 21에 정의된 바와 같거나; 합성 신생 탄수화물은 항목 1 내지 25 중 어느 하나의 방법에 의해 생산되거나; 또는 이들의 임의의 조합인 것인 합성 신생 당접합체.
29.
신생 당접합체 백신 또는 적응적 면역 반응 유발 조성물을 생산하는 방법으로서, 항목 1 내지 23 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된 신생 당접합체 또는 항목 24 내지 28 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 신생 당접합체를 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 보조제와 제형화하는 단계를 포함하는 방법.
30.
항목 29에 있어서, 보조제는 무기 화합물, 미네랄 오일, 미생물 유도체, 식물 유도체, 사이토카인, 스쿠알렌, 명반, 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄, 수산화 인산 칼슘, 톨 유사 수용체 효능제, 면역자극성 폴리뉴클레오티드(예컨대, CPG), 면역자극성 지질, 프로인트 보조제(Freund's adjuvant), RIBI의 보조제, QS-21, 무라밀 디펩티드, TiterMax, Steviune, Stimune 또는 이들의 임의의 조합이거나 이를 포함하는 것인 방법.
31.
항목 29 또는 30의 방법에 의해 생산되고/되거나, 항목 1 내지 28 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 신생 당접합체 및 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 보조제를 포함하는 신생 당접합체 백신 또는 적응적 면역 반응 유발 조성물.
32.
항목 31에 있어서, (예를 들어, 종양 관련 탄수화물 항원을 발현하는 암, 예컨대, 유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer), 위암(stomach cancer), B 세포 림프종(B-cell lymphoma), 결장암(colon cancer), 폐암(lung cancer), 흑색종(melanoma), 신경모세포종(neuroblastoma), 난소암(ovarian cancer), 육종(sarcoma), 소세포 폐암(small cell lung cancer); 또는 탄수화물 항원을 발현하는 바이러스 또는 박테리아에 대한) 예방적 백신 또는 치료적 백신인 것인 신생 당접합체 백신.
33.
대상체를 면역화, 백신 접종 또는 치료하는 방법으로서, 대상체에게 항목 1 내지 23 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 신생 당접합체, 항목 26 내지 28 중 어느 하나의 합성 신생 당접합체, 항목 29 또는 30의 방법에 의해 생산된 신생 당접합체 백신 또는 적응적 면역 반응 유발 조성물, 또는 항목 31 또는 32의 신생 당접합체 백신을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
34.
질환(예를 들어, 종양 관련 탄수화물 항원을 발현하는 암, 예컨대, 유방암, 전립선암, 위암, B 세포 림프종, 결장암, 폐암, 흑색종, 신경모세포종, 난소암, 육종, 소세포 폐암; 또는 탄수화물 항원을 발현하는 바이러스 또는 박테리아)를 갖는 대상체를 면역화, 백신 접종, 또는 치료하는 데 사용하기 위한, 또는 (예를 들어, 대상체로부터의 생물학적 샘플 내에서) 신생 당접합체에 특이적으로 결합하는 항체의 존재를 검출하기 위한, 또는 상기 면역화, 백신 접종 또는 치료를 검출하기 위한, 항목 1 내지 23 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 신생 당접합체, 항목 26 내지 28 중 어느 하나의 합성 신생 당접합체, 항목 29 또는 30의 방법에 의해 생산된 신생 당접합체 백신 또는 적응적 면역 반응 유발 조성물, 또는 항목 31 또는 32의 신생 당접합체 백신.
35.
질환(예를 들어, 종양 관련 탄수화물 항원을 발현하는 암, 예컨대, 유방암, 전립선암, 위암, B 세포 림프종, 결장암, 폐암, 흑색종, 신경모세포종, 난소암, 육종, 소세포 폐암; 또는 탄수화물 항원을 발현하는 바이러스 또는 박테리아)를 갖는 대상체를 면역화, 백신 접종, 또는 치료하기 위한, 또는 (예를 들어, 대상체로부터의 생물학적 샘플 내에서) 신생 당접합체에 특이적으로 결합하는 항체의 존재를 검출하기 위한, 또는 상기 면역화, 백신 접종 또는 치료를 검출하기 위한, 항목 1 내지 23 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 신생 당접합체, 항목 26 내지 28 중 어느 하나의 합성 신생 당접합체, 항목 29 또는 30의 방법에 의해 생산된 신생 당접합체 백신 또는 적응적 면역 반응 유발 조성물, 또는 항목 31 또는 32의 신생 당접합체 백신의 용도.
36.
질환(예를 들어, 종양 관련 탄수화물 항원을 발현하는 암, 예컨대, 유방암, 전립선암, 위암, B 세포 림프종, 결장암, 폐암, 흑색종, 신경모세포종, 난소암, 육종, 소세포 폐암; 또는 탄수화물 항원을 발현하는 바이러스 또는 박테리아)를 갖는 대상체의 면역화 또는 치료용, 또는 (예를 들어, 대상체로부터의 생물학적 샘플 내에서) 신생 당접합체에 특이적으로 결합하는 항체의 존재 검출용, 또는 상기 면역화 또는 치료 검출용 백신의 제조를 위한, 항목 1 내지 23 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 신생 당접합체, 항목 26 내지 28 중 어느 하나의 합성 신생 당접합체, 항목 29 또는 30의 방법에 의해 생산된 적응적 면역 반응 유발 조성물의 용도.
37.
탄수화물 항원의 증가된 발현과 관련된 질환(예를 들어, 암, 예컨대, 유방암, 전립선암, 위암, B 세포 림프종, 결장암, 폐암, 흑색종, 신경모세포종, 난소암, 육종, 소세포 폐암; 또는 탄수화물 항원을 발현하는 바이러스 또는 박테리아)을 갖는 대상체의 치료를 위한 항목 1 내지 23 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 신생 당접합체, 항목 26 내지 28 중 어느 하나의 합성 신생 당접합체, 항목 29 또는 30의 방법에 의해 생산된 신생 당접합체 백신 또는 적응적 면역 반응 유발 조성물, 또는 항목 31 또는 32의 신생 당접합체 백신의 용도.
38.
신생 당접합체에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하기 위한, 또는 신생 당접합체 면역원에 특이적으로 결합하는 항체를 검출하기 위한, 항목 1 내지 23 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 신생 당접합체, 항목 26 내지 28 중 어느 하나의 합성 신생 당접합체, 항목 29 또는 30의 방법에 의해 생산된 신생 당접합체 백신 또는 적응적 면역 반응 유발 조성물, 또는 항목 31 또는 32의 신생 당접합체 백신의 용도.
39.
탄수화물 항원 또는 탄수화물 항원을 포함하는 종양 순환 세포에 특이적으로 결합하는 항체의 존재를 검출 또는 스크리닝하기 위한, 또는 탄수화물 항원을 이용한 면역화 또는 백신 접종으로 인한 항체의 존재를 검출하기 위한, 항목 1 내지 23 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 신생 당접합체, 항목 26 내지 28 중 어느 하나의 합성 신생 당접합체, 항목 29 또는 30의 방법에 의해 생산된 신생 당접합체 백신 또는 적응적 면역 반응 유발 조성물, 또는 항목 31 또는 32의 신생 당접합체 백신의 용도.
40.
항목 39에 있어서, 검출 또는 스크리닝은 면역흡착 분석, ELISA, 마이크로어레이, 또는 면역블롯 분석과 같은 임의의 적합한 검출 방법을 통해 수행되는 것인 용도.
41.
대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에서 탄수화물 항원에 대한 면역 반응을 생성하기 위하여, 임의의 선행하는 항목에 정의된 바와 같은 또는 임의의 선행하는 항목에 의해 정의된 바와 같은 방법에 의해 생산된 신생 당접합체 또는 신생 당접합체 면역원을 투여하는 단계 및 선택적으로 탄수화물 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 존재에 대해 상기 대상체로부터의 생물학적 샘플을 스크리닝하는 단계를 포함하는 방법.
42.
SARS-CoV-2에 대해 대상체를 면역화하는 데 사용하기 위한, 대상체에서 항-SARS-CoV-2 항체의 생산을 유발하는 데 사용하기 위한, 또는 대상체로부터의 샘플 내의 항-SARS-CoV-2 항체의 존재를 검출하는 데 사용하기 위한 당접합체로서, 적합한 운반체 물질(예를 들어, 운반체 단백질 또는 펩티드)에 접합된 탄수화물 항원을 포함하고, 탄수화물 항원은 시알릴화 Thomsen-Friedenreich(TF) 항원, 비시알릴화 TF 항원, 시알릴화 Tn 항원, 비시알릴화 Tn 항원, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하거나 이로 구성되는 것인 당접합체.
43.
항목 42에 있어서, 탄수화물 항원은 시알릴화 TF 항원(예를 들어, (2,3)-S-TF 및/또는 디시알릴 코어 1)을 포함하거나 이로 구성되는 것인, 당접합체.
44.
항목 42 또는 43에 있어서, 탄수화물 항원은 Tn(예를 들어, 시알릴화 및/또는 비시알릴화 Tn)을 포함하거나 이로 구성되는 것인, 당접합체.
45.
항목 42 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 운반체 물질은 B 세포 에피토프 또는 T 세포 에피토프인 펩티드를 포함하는 것인, 당접합체.
46.
항목 42 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 탄수화물 항원은 서열번호 3의 펩티드의 위치 4 및/또는 6, 또는 위치 4 및/또는 6에 시스테인 또는 리신을 포함하는 서열번호 3의 펩티드의 변이체에 공유적으로 접합되는 것인, 당접합체.
47.
항목 46에 있어서, 서열번호 3의 펩티드 또는 펩티드 변이체는 운반체 물질에 포함되거나 이에 융합되는 것인, 당접합체.
48.
항목 42 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 운반체 물질은 파상풍 톡소이드(TT), 디프테리아 톡소이드(DT), 교차 반응 물질 197(CRM197), 수막구균 외막 단백질 복합체(OMPC), H. 인플루엔자 단백질 D(HiD), 바이러스 유사 입자(VLP), 사이토카인, 면역원성 펩티드, 예컨대, 파상풍 독소 831-844(서열번호 1 또는 2), 알부민(예컨대, 소 혈청 알부민 또는 인간 혈청 알부민), 열쇠구멍삿갓조개헤모시아닌(KLH), 또는 이의 면역원성 단편이거나, 이로부터 유래하거나, 또는 이를 포함하는 것인, 당접합체.
49.
항목 42 내지 48 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 당접합체로서, (i) 항목 1 내지 23 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 신생 당접합체 또는 이러한 방법에서 정의된 바와 같은 신생 당접합체; (ii) 항목 24 또는 25의 신생 탄수화물 항원; (iii) 항목 27 또는 28의 합성 신생 당접합체; 또는 (iv) 항목 29 또는 30의 방법에 정의된 바와 같거나 이에 의해 생산된, 또는 항목 31 또는 32에 정의된 바와 같은, 신생 당접합체 백신 또는 적응적 면역 반응 유발 조성물인 당접합체.
50.
항목 42 내지 48 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 당접합체로서, 다음을 포함하는 방법에 의해 생산된 당접합체: (a) 말단 알켄에 공유 연결된 수용성 탄수화물 항원(알케닐 탄수화물 항원)을 제공하는 단계(말단 알켄은 티올-엔 반응을 통해 티올 기에 직접 접합될 수 있고, 알케닐 탄수화물 항원은 보호되지 않은 수용성 알케닐 탄수화물 항원임); (b) 하나 이상의 유리 티올 기를 갖는 운반체 물질을 제공하는 단계; 및 (c) 광촉매 티올-엔 반응을 수행하여 탄수화물 항원을 하나 이상의 유리 티올 기에서 물질에 직접 접합시켜 당접합체를 생산하는 단계.
51.
항목 50에 있어서, 광촉매 티올-엔 반응은 운반체 물질 변성을 회피하고/하거나 운반체 물질의 활성, 항원성 및/또는 구조를 유지하는 반응 조건 하에서 수행되고/되거나; 광촉매 티올-엔 반응은 임의의 유기 용매의 부재 하에 수행되거나, 또는 상기 광촉매 티올-엔 반응은 운반체 물질 변성을 회피하기에 충분히 낮은 농도의 유기 용매의 존재 하에 수행되고/되거나; 광촉매 티올-엔 반응은 촉매의 존재 하에 수행되고, 촉매는 수용성 촉매, 예컨대, 수용성 유리 라디칼 생성 아조 화합물; 2,2'-아조비스[2-(2-이미다졸린-2-일)프로판]디하이드로클로라이드(Vazo 44 또는 VA-044); 2,2'-아조비스(2-아미디노프로판) 디하이드로클로라이드(AAPH); 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(LAP); 광개시제 활성을 갖는 금속 또는 금속 이온; 과산화물; tert-부틸 하이드로퍼옥사이드; 벤조일퍼옥사이드; 암모늄 퍼설페이트; 또는 광개시제 활성을 갖는 이의 임의의 유도체; 또는
수불용성 촉매, 예컨대 수불용성 유리 라디칼 생성 아조 화합물, 2,2-디메톡시-2-페닐아세토페논(DMPA), 아조비스이소부티로니트릴(AIBN), 2,2'-아조비스(2-메틸프로피오니트릴), 4,4'-아조비스(4-시아노펜탄산)(ACVA), 1,1'-아조비스(시아노시클로헥산)(ACHN), 디아젠디카르복실산 비스(N,N-디메틸아미드)(TMAD); 아조디카르복실산 디피페리디드(ADD), 또는 광개시제 활성을 갖는 이의 임의의 유도체이고/이거나; 광촉매 티올-엔 반응은 자외선 광 하의 조사를 포함하고/하거나; 광촉매 티올-엔 반응은 운반체 물질의 유리 티올 기당 알케닐 탄수화물 항원의 1 내지 200 몰 당량 사이의 반응을 포함하고/하거나; 상기 광촉매 티올-엔 반응은 10 내지 300, 10 내지 270, 10 내지 240, 10 내지 210, 10 내지 180, 10 내지 150, 10 내지 120, 10 내지 90, 10 내지 60, 또는 10 내지 30분 동안, 및/또는 운반체 물질의 총 유리 티올 농도의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50배의 감소를 달성하는 데 충분한 시간 동안 수행되고/되거나;광촉매 티올-엔 반응은 운반체 물질 변성을 회피하는 pH에서 수행되고/되거나; 광촉매 티올-엔 반응은 운반체 물질에 접합 후 대상체의 내인성 효소에 의해 운반체 물질로부터 절단될 수 없는 탄수화물 항원을 생산하고/하거나; 알케닐 탄수화물 항원은 말단 알켄에 공유적으로 연결되고/되거나, 탄수화물 항원은 O-글리코시드 결합, S-글리코시드 결합, N-글리코시드 결합 또는 C-글리코시드 결합, 또는 알릴 아민과 환원당 사이에서의 환원성 아민화에 의해 수득된 결합을 통해, 운반체 물질에 접합되고/되거나; 광촉매 티올-엔 반응은 1개 초과 유형의 탄수화물 항원을 운반체 물질에 접합시키고/시키거나; (a)의 탄수화물 항원은 링커를 통해 말단 알켄에 연결되고/되거나; 단계 (b)에 제공된 운반체 물질은 (i) 하나 이상의 유리 티올 기를 갖는 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 운반체 물질, (ii) 운반체 물질의 용매 접근가능 위치에 하나 이상의 추가 시스테인 잔기를 부가하도록 조작된 운반체 물질; (iii) 티올화제로 처리된 운반체 물질; (iv) 환원제로 처리된 운반체 물질; 또는 (v) (i) 내지 (iv)의 임의의 조합인 것인 당접합체.
52.
항목 42 내지 48 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 당접합체로서,
(a)
다음의 구조를 갖는 합성 당접합체:
(화학식에서 CA는 탄수화물 항원이고; S-CM은 접합에 이용가능한 z 황 원자를 갖는 운반체 물질(z는 적어도 1임)이고; X는 O, S, NR1, 또는 CH2이고; R1은 -H, -COH, -COCH3, 또는 -COEt이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; R 2 는 H 또는 Me임); 또는 이의 입체이성질체; 또는
(b)
다음의 구조를 갖는 합성 당접합체:
(화학식에서 CA는 탄수화물 항원이고; S-CM은 접합에 이용가능한 z 황 원자를 갖는 운반체 물질(z는 적어도 1임)이고; X는 S, NR1, CH2 또는 O이고; R 1 은 -H, -COH, -COMe, 또는 -COEt이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; R 2 는 H 또는 Me이고; q는 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; R 3 및 R 4 는 각각 수소 원자이고 m은 1, 2, 3, 4 또는 5이거나, 또는 R 3 및 R 4 는 함께 질소 원자에 연결된 카르보닐과 라디칼 -CO-CH2- 또는 라디칼 -CO-CH2-CH2-를 형성하고, m은 1임); 또는 이의 입체이성질체; 또는
(c)
다음의 구조를 갖는 합성 당접합체:
(화학식에서 CA는 탄수화물 항원이고; y는 적어도 1이고; y가 1 초과인 경우, CA는 동일하거나 상이하고; [S] z -CM은 접합에 이용가능한 z 황 원자를 갖는 운반체 물질(z는 적어도 y와 동일함)이고; L은 다음 구조를 갖는 링커로 구성된 군으로부터 선택되는 링커:
화학식에서 X는 O, S, NR1, 또는 CH2이고; R 1 은 -H, -COH, -COCH3, 또는 -COEt이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; R 2 는 H 또는 Me이고; y가 1 초과인 경우, L은 동일하거나 상이함); 또는 이의 입체이성질체; 또는
(d)
다음의 구조를 갖는 합성 당접합체:
(화학식에서 CA는 탄수화물 항원이고; y는 적어도 1이고; y가 1 초과인 경우, CA는 동일하거나 상이하고; S-CM은 접합에 이용가능한 z 황 원자를 갖는 운반체 물질(z는 적어도 1이고 적어도 y와 동일함)이고; L은 다음 구조를 갖는 링커로 구성된 군으로부터 선택되는 링커:
화학식에서 X는 S, NR1, CH2 또는 O이고; R 1 은 -H, -COH, -COMe, 또는 -COEt이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; R 2 는 H 또는 Me이고; q는 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; R 3 및 R 4 는 각각 수소 원자이고 m은 1, 2, 3, 4 또는 5이거나, 또는 R 3 및 R 4 는 함께 질소 원자에 연결된 카르보닐과 라디칼 -CO-CH2- 또는 라디칼 -CO-CH2-CH2-를 형성하고, m은 1이고; y가 1 초과인 경우, L은 동일하거나 상이함); 또는 이의 입체이성질체; 또는
(e)
다음의 구조를 갖는 합성 당접합체:
(화학식에서 CA는 탄수화물 항원이고; y는 적어도 1이고; y가 1 초과인 경우, CA는 동일하거나 상이하고; [S] z -CM은 접합에 이용가능한 z 황 원자를 갖는 운반체 물질(z는 적어도 y와 동일함)이고; L은 다음 구조를 갖는 링커로 구성된 군으로부터 선택되는 링커:
화학식에서 X는 S, NR1, CH2 또는 O이고; R 1 은 -H, -COH, -COMe, 또는 -COEt이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; R 2 는 H 또는 Me이고; q는 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; r은 1, 2, 3, 4 또는 5이고; R 5 는 S-CM, 공유 결합, 또는 다음 구조의 라디칼:
화학식에서 R 3 및 R 4 는 각각 수소 원자이고 m은 1, 2, 3, 4 또는 5이거나, 또는 R 3 및 R 4 는 함께 질소 원자에 연결된 카르보닐과 라디칼 -CO-CH2- 또는 라디칼 -CO-CH2-CH2-를 형성하고, m은 1이고; y가 1 초과인 경우, L은 동일하거나 상이함); 또는 이의 입체이성질체인 당접합체.
53.
항목 52에 있어서,
-
(e)에 정의된 바와 같은 구조를 갖고, 링커는 다음의 구조:
(화학식에서 X는 S, NR1, CH2 또는 O이고; R 1 은 -H, -COH, -COMe, 또는 -COEt이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; R 2 는 H 또는 Me이고; q는 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; r은 1, 2, 3, 4 또는 5임)를 갖거나;
-
(e)에 정의된 바와 같은 구조를 갖고, 링커는 다음의 구조:
또는
(화학식에서 X는 S, NR1, CH2 또는 O이고; R 1 은 -H, -COH, -COMe, 또는 -COEt이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; R 2 는 H 또는 Me이고; q는 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; r은 1 또는 2임)를 갖거나;
-
운반체 물질은 중합체, 폴리펩티드, 운반체 단백질, 고체 지지체, 입자, 또는 광촉매 티올-엔 반응을 통해 탄수화물 항원에 접합시키기에 적합한 적어도 1개 이상의 유리 티올 기를 갖는 임의의 기타 물질이거나 이를 포함하거나;
-
접합체 물질은 적어도 2개의 동일한 탄수화물 항원 또는 1개 초과 유형의 탄수화물 항원에 커플링되어, 다가의 합성 당접합체를 생산하거나;
-
탄수화물 항원은 대상체의 내인성 효소에 의해 운반체 단백질로부터 절단될 수 없거나; 또는
-
이들의 임의의 조합인 당접합체.
54.
항목 42 내지 53 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 1개 이상의 당접합체 및 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 보조제를 포함하는 SARS-CoV-2 백신.
55.
항목 54에 있어서, 적어도 2개의 상이한 당접합체를 포함하고, 각각의 당접합체는 시알릴화 TF 항원(모노- 또는 디-시알릴화 TF 항원), 비시알릴화 TF 항원, 시알릴화 Tn 항원 및 비시알릴화 Tn 항원으로부터 선택되는 적어도 2개의 상이한 탄수화물 항원에 접합된 운반체 물질을 포함하는 것인 SARS-CoV-2 백신.
56.
항목 42 내지 53 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 당접합체 또는 항목 54 또는 55의 SARS-CoV-2 백신으로서, 당접합체 또는 백신은 SARS-CoV-2 비리온 입자에 결합하고 바람직하게는 중화 활성을 갖는 항체의 생산을 유도하는 것인 당접합체 또는 SARS-CoV-2 백신.
57.
SARS-CoV-2에 대해 대상체에게 백신을 접종하거나 또는 대상체에서 항-SARS-CoV-2 항체의 생산을 유발하는 방법으로서, 항목 42 내지 53 또는 56 중 어느 하나의 당접합체 또는 항목 54 내지 56 중 어느 하나의 SARS-CoV-2 백신을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
58.
SARS-CoV-2 바이러스에 의한 감염으로부터 대상체를 보호하기 위한, 또는 COVID-19를 치료하기 위한 조성물로서, SARS-CoV-2 S 단백질에 발현된 O-연결 글리칸에 결합하는 하나 이상의 리간드(예를 들어, 항체, 항체 단편, 또는 렉틴)를 포함하고, O-연결 글리칸은 시알릴화 TF 항원(모노- 또는 디-시알릴화 TF 항원), 비시알릴화 TF 항원, 시알릴화 Tn 항원, 비시알릴화 Tn 항원, 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물.
59.
항목 58에 있어서, 하나 이상의 리간드는 재조합 단클론 항체(예를 들어, JAA-F11 또는 인간화 JAA-F11)를 포함하는 것인, 조성물.
60.
항목 58에 있어서, 하나 이상의 리간드는 (예를 들어, 시알릴화 및 비시알릴화 TF 항원 형태 둘 다에 결합하는) 렉틴을 포함하는 것인, 조성물.
61.
항목 58 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 렉틴은 자칼린이거나 자칼린 관련 렉틴인, 조성물.
62.
항목 58 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 비강 내 조성물로서 제형화되는, 조성물.
63.
다음을 포함하는 복합체: (a) 시알릴화 TF 항원(모노- 또는 디-시알릴화 TF 항원), 비시알릴화 TF 항원, 시알릴화 Tn 항원, 비시알릴화 Tn 항원 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 O-연결 글리칸을 발현하는 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 단편; 및 (b) O-연결 글리칸에서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 단편에 결합된 항목 58 내지 61 중 어느 하나에 정의된 리간드.
64.
항목 63에 있어서, SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 단편은 온전한 SARS-CoV-2 비리온 입자에 포함되는 것인 복합체.
첨부된 도면에서,
도 1은 예컨대, 인간 뮤신 당단백질(MUC)로부터의, 주요 종양 관련 탄수화물 항원(tumor-associated carbohydrate antigen, TACA)의 전형적인 화학 구조의 예를 보여준다.
도 2는 실시예 2 내지 6에 기재된 바와 같은, 알릴 Tn 항원 및 알릴 TF 항원 중간체의 합성을 위한 반응식을 보여준다.
도 3은 알릴 2-아세트아미도-3,6-디-O-피발로일-2-데옥시-α-D-글루코피라노사이드(화합물 2)에 대한 1H-NMR(도 3a) 및 13C-NMR(도 3b) 스펙트럼과 질량 분석 결과(도 3c 및 3d)를 보여준다.
도 4a 내지 4d는 알릴 2-아세트아미도-2-데옥시-α-D-갈락토피라노사이드(알릴 Tn)에 대한 1H-NMR(도 4a) 및 13C-NMR(도 4b) 스펙트럼과 질량 분석 결과(도 4c 및 4d)를 보여준다.
도 5a 내지 5c는 알릴 2-아세트아미도-4,6-O-벤질리덴-2-데옥시-α-D-갈락토피라노사이드(화합물 4)에 대한 1H-NMR(도 5a) 스펙트럼과 질량 분석 결과(도 5b 및 5c)를 보여준다.
도 6a 내지 6d는 알릴(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-갈락토피라노실)-(1→3)-2-아세트아미도-4,6-O-벤질리덴-2-데옥시-α-D-갈락토피라노사이드(화합물 6)에 대한 1H-NMR(도 6a) 및 13C-NMR(도 6b) 스펙트럼과 질량 분석 결과(도 6c 및 6d)를 보여준다.
도 7a 내지 7d는 화합물 7에 대한 1H-NMR(도 7a) 및 13C-NMR(도 7b) 스펙트럼과 질량 분석 결과(도 7c 및 7d)를 보여준다.
도 8a 내지 8d는 알릴 (β-D-갈락토피라노실)-(1→3)-2-아세트아미도-2-데옥시-α-D-갈락토피라노사이드(알릴 TF)에 대한 1H-NMR(도 8a) 및 13C-NMR(도 8b) 스펙트럼과 질량 분석 결과(도 8c 및 8d)를 보여준다.
도 9는 알릴 Tn으로부터 신생 당접합체 면역원의 생산을 위한 반응식을 보여준다.
도 10은 화합물 8에 대한 1H-NMR 및 13C-NMR 스펙트럼 결과를 보여준다.
도 11a 및 도 11b는 화합물 9에 대한 1H-NMR 및 13C-NMR(도 11a) 스펙트럼과 질량 분석(LC-MS) 결과(도 11b)를 보여준다.
도 12는 알릴 Tn으로부터 신생 당접합체 면역원의 생산을 위한 반응식을 보여준다.
도 13은 화합물 12에 대한 1H-NMR 및 13C-NMR 스펙트럼을 보여준다.
도 14는 화합물 13에 대한 1H-NMR 및 13C-NMR 스펙트럼을 보여준다.
도 15a 내지 15e는 BSA-Tn 접합체(도 15a 내지 15d) 및 CRM197-Tn 접합체(도 15e)에 대한 Tn 인식 렉틴 비시아 빌로사(Vicia Villosa)(VVA)의 반응성을 보여준다. 도 15a는 pH 6 내지 10 범위의 완충액에서 생산된 상이한 BSA-Tn 접합체를 나타내는 웨스턴 블롯을 보여준다. 상응하는 ELISA 분석이 도 15b에 도시되어 있다. 도 15c는 최적 pH 8에서 BSA에 접합 시 PFP-Tn(화합물 9)의 적정을 보여주는 웨스턴 블롯이다. 상응하는 ELISA 분석이 도 15d에 도시되어 있다. 도 15e는 CRM197-Tn의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. 블롯은 테스트한 PFP-Tn의 3가지 접합 비율(즉, 3.4, 9.7 및 15)에 대해 CRM197의 분자량 범위(약 58.4 kDa)에서 단일 VVA 반응성 밴드를 나타내었으며, 3가지 중 가장 반응성 있는 종은 15당량의 가장 높은 PFP-Tn 비율에서 생성되었다.
도 16a 및 16b는 TF-특이적 렉틴 땅콩 응집소(Peanut Agglutinin, PNA)에 대한 BSA-TF 접합체의 반응성 및 접합된 이당류 TF 항원으로부터의 갈락토스 당의 투여량을 나타낸다. 도 16a는 BSA에 대한 TF의 커플링을 나타내는 BSA 단량체의 예상 분자량 범위에서 PNA에 반응하는 우세한 밴드를 나타내는 웨스턴 블롯을 보여준다. PNA-hrp를 사용하는 상응하는 ELISA 분석이 도 16b에 도시되어 있다. BSA에 대한 TF의 접합은 또한 Dubois의 방법에 의해 BSA와 관련된 갈락토스를 측정함으로써 입증되었다(도 16b의 막대 그래프).
도 17a 내지 17c는 운반체 단백질 CRM197 및 dTT에 대한 COOH-Tn 및 COOH-TF의 접합을 보여준다. 도 17a는 접합된 단백질("-Tn" 및 "-TF")이 상응하는 접합되지 않은 단백질("crm" 및 "dTT")에 비해 약간 증가된 분자량을 갖는 것으로 나타남을 보여주는 쿠마시 염색 SDS-PAGE 겔을 도시한다. 도 17b에 도시된 상응하는 웨스턴 블롯은 각각 VVA 및 PNA 렉틴에 대한 각각의 -Tn 및 -TF 단백질 접합체의 특이적 반응성을 보여준다. 렉틴에 대한 특이적 반응성의 동일한 패턴이 또한 ELISA에 의해 관찰되었다(도 17c).
도 18은 ELISA에 의한 다양한 TF 및 Tn 스크리닝 항원에 대한, dTT-TF로 3회 면역화한 마우스의 혈청의 정규화된 반응성을 보여준다.
도 19a 및 19b는 dTT-TF로 5회 면역화한 마우스 및 5차 면역화 후 6주 후의 혈청 적정의 스크리닝 항원 BSA-TF에 대한 반응성을 보여준다. 도 19a는 마우스 "A1"의 결과를 나타내고, 도 19b는 마우스 "A2"의 결과를 나타낸다.
도 20은 75 kDA 이상의 단백질에 대한 고해상도 LC-MS/MS로 분석한 SARS-CoV-2의 재조합 S1 단백질에 대한 펩티드 VQPTESIVR(서열번호 3)의 모든 O-글리코실화 형태의 상대적 존재비를 보여준다.
도 21은 75~100 kDA 사이의 단백질에 대한 고해상도 LC-MS/MS로 분석한 SARS-CoV-2의 재조합 S1 단백질에 대한 펩티드 VQPTESIVR(서열번호 3)의 모든 O-글리코실화 형태의 상대적 존재비를 보여준다.
도 22는 SARS-CoV-2 S1 단백질 또는 전장 S 단백질로 형질감염된 포유동물 세포로부터의 배양 상청액에 대한 항-TF(JAA-F11 IgG 및 SPM320 IgM) 및 항-Tn(Tn218 IgM) 단클론 항체의 ELISA에 의한 반응성을 보여준다. 결과는 빈 벡터로 형질감염된 상응하는 포유동물 세포의 배양 상청액에 노출된 동일한 단클론 항체에 대한 배수 증가로서 도시된다.
도 23은 SARS-CoV-2 S1 단백질 또는 전장 S 단백질로 형질감염된 포유동물 세포로부터의 배양 상청액에 대한 렉틴 패널의 반응성을 보여준다. 결과는 빈 벡터로 형질감염된 상응하는 포유동물 세포의 배양 상청액에 노출된 동일한 단클론 항체에 대한 배수 증가로서 도시된다.
도 24는 인간 안지오텐신 전환 효소 2를 발현하는 숙주 세포에 대한 위형(pseudotyped) lenti-luc-SARS-CoV-2-S 바이러스의 감염성을 억제하는 상이한 항탄수화물 리간드의 효과를 보여준다. "PNA" 및 "AIA(jac)"는 상이한 탄수화물 항원 결합 특이성을 갖는 렉틴이며, 후자는 시알릴화 또는 비시알릴화 형태의 TF 항원 및 Tn 항원 둘 다에 대한 결합 특이성을 갖는 것으로 알려져 있다. "JAA-F11"은 비시알릴화 형태의 TF 항원에만 결합하는 단클론 항체이다.
도 1은 예컨대, 인간 뮤신 당단백질(MUC)로부터의, 주요 종양 관련 탄수화물 항원(tumor-associated carbohydrate antigen, TACA)의 전형적인 화학 구조의 예를 보여준다.
도 2는 실시예 2 내지 6에 기재된 바와 같은, 알릴 Tn 항원 및 알릴 TF 항원 중간체의 합성을 위한 반응식을 보여준다.
도 3은 알릴 2-아세트아미도-3,6-디-O-피발로일-2-데옥시-α-D-글루코피라노사이드(화합물 2)에 대한 1H-NMR(도 3a) 및 13C-NMR(도 3b) 스펙트럼과 질량 분석 결과(도 3c 및 3d)를 보여준다.
도 4a 내지 4d는 알릴 2-아세트아미도-2-데옥시-α-D-갈락토피라노사이드(알릴 Tn)에 대한 1H-NMR(도 4a) 및 13C-NMR(도 4b) 스펙트럼과 질량 분석 결과(도 4c 및 4d)를 보여준다.
도 5a 내지 5c는 알릴 2-아세트아미도-4,6-O-벤질리덴-2-데옥시-α-D-갈락토피라노사이드(화합물 4)에 대한 1H-NMR(도 5a) 스펙트럼과 질량 분석 결과(도 5b 및 5c)를 보여준다.
도 6a 내지 6d는 알릴(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-갈락토피라노실)-(1→3)-2-아세트아미도-4,6-O-벤질리덴-2-데옥시-α-D-갈락토피라노사이드(화합물 6)에 대한 1H-NMR(도 6a) 및 13C-NMR(도 6b) 스펙트럼과 질량 분석 결과(도 6c 및 6d)를 보여준다.
도 7a 내지 7d는 화합물 7에 대한 1H-NMR(도 7a) 및 13C-NMR(도 7b) 스펙트럼과 질량 분석 결과(도 7c 및 7d)를 보여준다.
도 8a 내지 8d는 알릴 (β-D-갈락토피라노실)-(1→3)-2-아세트아미도-2-데옥시-α-D-갈락토피라노사이드(알릴 TF)에 대한 1H-NMR(도 8a) 및 13C-NMR(도 8b) 스펙트럼과 질량 분석 결과(도 8c 및 8d)를 보여준다.
도 9는 알릴 Tn으로부터 신생 당접합체 면역원의 생산을 위한 반응식을 보여준다.
도 10은 화합물 8에 대한 1H-NMR 및 13C-NMR 스펙트럼 결과를 보여준다.
도 11a 및 도 11b는 화합물 9에 대한 1H-NMR 및 13C-NMR(도 11a) 스펙트럼과 질량 분석(LC-MS) 결과(도 11b)를 보여준다.
도 12는 알릴 Tn으로부터 신생 당접합체 면역원의 생산을 위한 반응식을 보여준다.
도 13은 화합물 12에 대한 1H-NMR 및 13C-NMR 스펙트럼을 보여준다.
도 14는 화합물 13에 대한 1H-NMR 및 13C-NMR 스펙트럼을 보여준다.
도 15a 내지 15e는 BSA-Tn 접합체(도 15a 내지 15d) 및 CRM197-Tn 접합체(도 15e)에 대한 Tn 인식 렉틴 비시아 빌로사(Vicia Villosa)(VVA)의 반응성을 보여준다. 도 15a는 pH 6 내지 10 범위의 완충액에서 생산된 상이한 BSA-Tn 접합체를 나타내는 웨스턴 블롯을 보여준다. 상응하는 ELISA 분석이 도 15b에 도시되어 있다. 도 15c는 최적 pH 8에서 BSA에 접합 시 PFP-Tn(화합물 9)의 적정을 보여주는 웨스턴 블롯이다. 상응하는 ELISA 분석이 도 15d에 도시되어 있다. 도 15e는 CRM197-Tn의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. 블롯은 테스트한 PFP-Tn의 3가지 접합 비율(즉, 3.4, 9.7 및 15)에 대해 CRM197의 분자량 범위(약 58.4 kDa)에서 단일 VVA 반응성 밴드를 나타내었으며, 3가지 중 가장 반응성 있는 종은 15당량의 가장 높은 PFP-Tn 비율에서 생성되었다.
도 16a 및 16b는 TF-특이적 렉틴 땅콩 응집소(Peanut Agglutinin, PNA)에 대한 BSA-TF 접합체의 반응성 및 접합된 이당류 TF 항원으로부터의 갈락토스 당의 투여량을 나타낸다. 도 16a는 BSA에 대한 TF의 커플링을 나타내는 BSA 단량체의 예상 분자량 범위에서 PNA에 반응하는 우세한 밴드를 나타내는 웨스턴 블롯을 보여준다. PNA-hrp를 사용하는 상응하는 ELISA 분석이 도 16b에 도시되어 있다. BSA에 대한 TF의 접합은 또한 Dubois의 방법에 의해 BSA와 관련된 갈락토스를 측정함으로써 입증되었다(도 16b의 막대 그래프).
도 17a 내지 17c는 운반체 단백질 CRM197 및 dTT에 대한 COOH-Tn 및 COOH-TF의 접합을 보여준다. 도 17a는 접합된 단백질("-Tn" 및 "-TF")이 상응하는 접합되지 않은 단백질("crm" 및 "dTT")에 비해 약간 증가된 분자량을 갖는 것으로 나타남을 보여주는 쿠마시 염색 SDS-PAGE 겔을 도시한다. 도 17b에 도시된 상응하는 웨스턴 블롯은 각각 VVA 및 PNA 렉틴에 대한 각각의 -Tn 및 -TF 단백질 접합체의 특이적 반응성을 보여준다. 렉틴에 대한 특이적 반응성의 동일한 패턴이 또한 ELISA에 의해 관찰되었다(도 17c).
도 18은 ELISA에 의한 다양한 TF 및 Tn 스크리닝 항원에 대한, dTT-TF로 3회 면역화한 마우스의 혈청의 정규화된 반응성을 보여준다.
도 19a 및 19b는 dTT-TF로 5회 면역화한 마우스 및 5차 면역화 후 6주 후의 혈청 적정의 스크리닝 항원 BSA-TF에 대한 반응성을 보여준다. 도 19a는 마우스 "A1"의 결과를 나타내고, 도 19b는 마우스 "A2"의 결과를 나타낸다.
도 20은 75 kDA 이상의 단백질에 대한 고해상도 LC-MS/MS로 분석한 SARS-CoV-2의 재조합 S1 단백질에 대한 펩티드 VQPTESIVR(서열번호 3)의 모든 O-글리코실화 형태의 상대적 존재비를 보여준다.
도 21은 75~100 kDA 사이의 단백질에 대한 고해상도 LC-MS/MS로 분석한 SARS-CoV-2의 재조합 S1 단백질에 대한 펩티드 VQPTESIVR(서열번호 3)의 모든 O-글리코실화 형태의 상대적 존재비를 보여준다.
도 22는 SARS-CoV-2 S1 단백질 또는 전장 S 단백질로 형질감염된 포유동물 세포로부터의 배양 상청액에 대한 항-TF(JAA-F11 IgG 및 SPM320 IgM) 및 항-Tn(Tn218 IgM) 단클론 항체의 ELISA에 의한 반응성을 보여준다. 결과는 빈 벡터로 형질감염된 상응하는 포유동물 세포의 배양 상청액에 노출된 동일한 단클론 항체에 대한 배수 증가로서 도시된다.
도 23은 SARS-CoV-2 S1 단백질 또는 전장 S 단백질로 형질감염된 포유동물 세포로부터의 배양 상청액에 대한 렉틴 패널의 반응성을 보여준다. 결과는 빈 벡터로 형질감염된 상응하는 포유동물 세포의 배양 상청액에 노출된 동일한 단클론 항체에 대한 배수 증가로서 도시된다.
도 24는 인간 안지오텐신 전환 효소 2를 발현하는 숙주 세포에 대한 위형(pseudotyped) lenti-luc-SARS-CoV-2-S 바이러스의 감염성을 억제하는 상이한 항탄수화물 리간드의 효과를 보여준다. "PNA" 및 "AIA(jac)"는 상이한 탄수화물 항원 결합 특이성을 갖는 렉틴이며, 후자는 시알릴화 또는 비시알릴화 형태의 TF 항원 및 Tn 항원 둘 다에 대한 결합 특이성을 갖는 것으로 알려져 있다. "JAA-F11"은 비시알릴화 형태의 TF 항원에만 결합하는 단클론 항체이다.
실시예
실시예 1: 일반 방법
반응을 상업적으로 이용 가능한 HPLC 등급 시약을 사용하여 아르곤 분위기 하에서 수행하였다. 상업적으로 이용 가능한 시약(Sigma Aldrich)을 추가 정제 없이 사용하였다. N-아세틸-D-갈락토사민 및 N-아세틸뉴라민산은 캐나다 앨버타 소재 Rose Scientific Ltd.에서 제공되었다. Fmoc-β-Ala-Wang 수지 및 Fmoc 아미노산은 캐나다 퀘벡 주 삐에흐퐁 소재 Peptide Technologies Ltd로부터 상업적으로 이용할 수 있었다. 반응의 진행을 실리카겔 60 F254 코팅된 플레이트(E. Merck)를 사용하는 박층 크로마토그래피로 모니터링하였다. 클릭 티올-엔 광반응에 의한 접합을 2개의 휴대용 UV 365 nm 램프(UV-AC Hand Lamp, Dual 254/365 nm UV; 115V-60 Hz, 0.16 amps, VWR 캐나다, 카탈로그 번호 89131-492) 사이의 석영 큐벳(10x10 mm 경로 길이, Fisher Scientific Canada, 카탈로그 번호 14-958-130) 플레이스(place)에서 수행하였다. 플래시 크로마토그래피를 Canadian Life Science의 ZEOprepTM 실리카겔 60(40 내지 63 μm)을 사용하여 수행하였다. 검출을 자외선 광 하에서 또는 20% 에탄올 황산 또는 몰리브데이트 또는 KMnO4 용액을 분무한 후 가열함으로써 수행하였다. NMR 스펙트럼을 Bruker ULTRASHIELDTM 300 MHz 및 Bruker Avance™ III HD 600 MHz 분광계에서 기록하였다. 양성자 및 탄소 화학적 이동(δ)은 7.26 ppm(1H) 및 77.16 ppm(13C)에서 설정되었던 잔류 CHCl3의 화학적 이동에 대해 ppm 단위로 보고된다. 결합 상수(J)는 헤르츠(Hz)로 보고되며 피크 다중도에는 다음과 같은 약어가 사용된다: 단일항(s), 이중항(d), 이중항의 이중항(dd), 동일한 커플링 상수를 갖는 이중항의 이중항(tap), 삼중항(t), 다중항(m). 상관 분광법(COSY: Correlated SpectroscopY) 및 이종핵 단일 양자 결맞음(HSQC: Heteronuclear Single Quantum Coherence) 실험을 사용하여 분석 및 할당을 수행하였다. 고분해능 질량 스펙트럼(HRMS)을 UQAM의 분석 플랫폼에 의해 양극 및/또는 음극 전기분무 모드에서 Agilent technologies의 LC-MS-TOF(액체 크로마토그래피 질량 분석 비행시간) 기기로 측정하였다. 양성자 이온(M+H)+ 또는 나트륨 부가물(M+Na)+ 중 하나를 실험식 확인에 사용하였다. 천연 TT 및 TT-접합체를 2000 KDa 벤조일화된 투석 튜빙(Sigma-Aldrich(캐나다 온타리오 소재))를 사용하여 투석하였다. 천연 및 접합된 TT 양쪽 모두의 티올 함량을 412 nm에서 Ellman 테스트에 의해 결정하였다(문헌[Ellman, G. L. Arch. Biochem. Biophys. 1959, 82, 70-77]). UV/VIS 분광계를 사용하여 TT-접합체의 총 당 함량을 492 nm에서 측정한 비색 DuBois 테스트에 의해 결정하였다(문헌[Dubois, M.; Gilles, K. A.; Hamilton, J. K.; Rebers, P. A.; Smith, F. Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances. Anal. Chem., 1956, 28, 350-356]). 동적 광 산란(DLS), 입자 크기 분포를 Malvern의 Zetasizer Nano S90을 사용하여 PBS에서 측정하였다. 마우스 단클론 IgG3 항체 JAA-F11을 문헌[Rittenhouse-Diakun et al., 1998]에서 이전에 설명된 바와 같이 제조하였다.
일반 고체상 펩티드 합성(SPPS) 절차
고체상 펩티드 합성(SPPS)의 절차를 문헌의 절차(문헌[Papadopoulos et al., 2012)] 하에 따르고 Fmoc-β-Ala-Wang 수지(650 mg, 0.34 mmol, 1.0당량; 100 내지 200 메쉬, 로딩 = 0.52 mmol/g)으로 관찰하였다. 반응을 Econo-Pac 일회용 컬럼 1.5 x 14 cm(20 mL)(Bio-Rad Laboratories, 캐나다 온타리오 주 소재)에서 회전 교반에 의해 수행하였다. 수지를 CH2Cl2에서 1시간 동안 팽윤시킨 다음 여과하고 DMF에서 i 1 동안 재조정하였다. 시판 수지 또는 아미노산의 Fmoc-보호기를 DMF 중 20%의 피페리딘 용액으로 제거하였다(5 mL, 2 x 5분 후 1 x 10분). 용매와 시약을 여과에 의해 제거하고, 수지를 DMF, CH2Cl2 및 MeOH로 세척하였다(각 용매로 3X). 유리 아미노 기의 존재는 Kaiser 테스트 또는 TNBS 테스트로 검증하였다. 수지 상의 유리 아민을 DMF 중의 사전활성화된 Fmoc 아미노산: 3당량의 아미노산, 3당량의 HBTU(N,N,N',N'-테트라메틸-O-(1H-벤조트리아졸-1-일)우로늄 헥사플루오로포스페이트) 및 촉매량의 HOBt(1-하이드록시벤조트리아졸)의 용액으로 4℃에서 (10분) 처리하였다. 이후, DIPEA(디이소프로필아민, 9당량)를 혼합물에 첨가하고 실온에서 1시간 30분 동안 교반하였다. 커플링의 완료를 Kaiser 또는 TNBS 비색 테스트를 사용하여 결정하였다. 여과 후 수지를 세척하고 Fmoc 제거 절차를 다시 반복하였다. 합성 순서의 끝에서 최종 유리 아민을 아세틸화에 의해 캡핑하였다(Ac2O/DIPEA/DMF 1:1:8, 1시간). 여과 후, 용액을 배수하고, 수지를 진공 하에 건조시키고 트리플루오로아세트산/물/에탄디티올/트리이소프로필실란(94.0/2.5/2.5/1.0)을 사용하여 3시간 동안 절단을 수행하였다. 생성된 펩티드를 메틸 tert-부틸 에테르로 침전시키고 원심분리(20분, 2000 rpm, 3X)에 의해 수지 비드로부터 단리하였다. 침전물을 공기 분사 흐름으로 조심스럽게 건조시켰다. 미정제 펩티드를 H2O에 용해시켜 수지로부터 분리하였다. 이후, 용액을 동결건조하여 원하는 펩티드를 얻었다.
파상풍 톡소이드 단량체의 정제
파상풍 톡소이드(TT) 단량체를 접합 전에 겔 여과 크로마토그래피로 수득하였다. 4.5 mg/ml 단백질(변형된 Lowry 단백질 분석에 의해 결정됨)을 함유하는 1 ml의 액체 제제를 PBS(20 mM NaHPO4 [pH 7.2], 150 mM NaCl)에서 평형화된 Superdex®200 Prep Grade(GE Healthcare Life Sciences, 스웨덴 웁살라 시 소재)로 충전된 XK16-100 컬럼에 로딩하고 동일한 완충액으로 용리하였다. 2개의 피크에서 컬럼으로부터 용리된 단백질: 전반부에 용리하는 피크는 올리고머화된 톡소이드를 함유하고, 150,000의 Mr에 해당하는 후반부에 용리하는 피크는 TT 단량체를 함유하였다. 후반부(단량체) 피크에 해당하는 분획을 모으고, 탈이온수에 대하여 탈염하고 Centricon® Plus-70 원심분리 필터 장치(30K Ultracel PL 막; Millipore, 미국 매사추세츠 주 빌레리카 소재)를 사용하여 농축한 다음 동결건조하였다.
접합체의 HPLC 분석
알릴 신생 당접합체 제제의 HPLC 분석을 크기 배제 크로마토그래피에 의해 수행하였다. 크로마토그래피 분리를 SB-807G 가드 컬럼(Showa Denko)에 이어 직렬로 연결된 3개의 8 x 300-mm Shodex OHpak 겔 여과 컬럼(2개의 SB-804 및 1개의 SB-803)으로 수행하였다. 신생 당접합체 면역원을 280 nm의 파장에서 차등 굴절계(RI) 검출기 모델 2300 및 UV 검출기 모델 2600이 구비된 Knauer Smartline 시스템을 사용하여 0.4 mL/분의 유량으로 0.1 M NaNO3로 용리시켰다. 접합체 제제(이동상에서 8 mg/mL 용액)를 50-μΛ 주입 루프를 사용하여 주입하였다. 선택된 실험에서, 접합체 분획에 해당하는 공극 부피에서 용리되는 분획을 모으고, 물 Spectra/Por; 분자량 컷오프(MWCO), 12,000 내지 14,000[Spectrum Laboratories])에 대해 투석하였으며 동결건조하였다. 이는 2:1 분획된 접합체에 해당한다.
실시예 2: 알릴 2-아세트아미도-3,6-디-O-피발로일-2-데옥시-α-D-글루코피라노사이드(화합물 2)
화합물 2
도 2를 참조하여, 아세틸 클로라이드(2.76 mL, 38.80 mmol, 3.43당량)를 아르곤 분위기 하에서 0℃에서 알릴 알코올(20.8 mL)에 적가하였다. 실온에서, N-아세틸-D-글루코사민(화합물 1)(2.50 g, 11.3 mmol, 1.00당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 70℃에서 3시간 동안 교반한 다음 pH 7까지 고체 NaHCO3를 첨가하여 ??칭시켰다. 현탁액을 MeOH로 수회 세척하면서 Celite 패드를 통해 여과하였다. 용매를 감압 하에 제거하고, 미정제 알릴 2-아세트아미도-2-데옥시-D-글루코사민을 Et2O/에탄올로 트리튜레이션(trituration)하여 침전시켰다. 이후, 용매를 트리튜레이션 후 감압 하에서 수회 제거하였다. 이후, -15℃에서 질소 분위기 하에 건조 디클로로메탄-피리딘(45 mL, v/v, 1:2) 혼합물 중의 미정제 알릴 2-아세트아미도-2-데옥시-α-D- 글루코피라노사이드 중간체의 현탁액에, 피발로일 클로라이드(3.90 mL, 31.64 mmol, 2.80당량)을 적가하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안 교반하고, 실온으로 가온하여 일부 β-아노머(Rf = 0.18); 헥산/EtOAc 1:1)과 함께 원하는 α-아노머(화합물 2)(Rf = 0.32)를 수득하였다. 이후, 혼합물을 CH2Cl2로 희석하고 유기상을 HCl(1 M)로 수회, KHSO4의 포화 수용액, NaHCO3의 포화 용액 및 염수로 연속적으로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고 감압 하에 증발시켰다. 황색을 띠는 오일을 실리카겔 상의 플래쉬 크로마토그래피(헥산-EtOAc 6:4 내지 1:1)로 정제하여 원하는 화합물 알릴 2-아세트아미도-3,6-디-O-피발로일-2-데옥시-α-D-글루코피라노사이드(화합물 2)를 백색 고체(4.85 g, 6.78 mmol, 60%)로서 수득하였다. Rf = 0.32; 헥산/EtOAc 1:1; 도 3a & 3b: 1H NMR (CDCl3, 600 MHz): δ 5.87 (dddd, 1H, J H,H = 16.8, 10.5, 6.2, 5.3 Hz, OCH2CH=CH2), 5.77 (d, 1H, J NH,H2 = 9.7 Hz, NH), 5.31-5.25 (m, 1H, OCH2CH=CH 2), 5.22 (dd, 1H, J H,H = 10.4, 1.3 Hz, OCH2CH=CH 2), 5.09 (dd, 1H, J 3,4 = 10.7, J 2,3 = 9.3 Hz, H-3), 4.83 (d, 1H, J 1,2 = 3.7 Hz, H-1), 4.39 (m, 1H, H-6a), 4.35-4.25 (m, 2H, H-6b 및 H-2), 4.19 (m, 1H, OCH 2), 4.02-3.93 (m, 1H, OCH 2), 3.85 (m, 1H, H-5), 3.59-3.48 (m, 1H, H-4), 3.03 (d, 1H, J 4,OH = 5.1 Hz, OH-4), 1.93 (s, 3H, NHCOCH 3), 1.23 (s, 9H, tert-부틸) 및 1.19 ppm (s, 9H, tert-부틸); 13C NMR (CDCl3, 150 MHz): δ 179.8, 179.1 (tert-BuCO), 169.7 (NHCO), 133.2 (OCH2 CH=CH2), 118.1 (OCH2CH=CH2), 96.4 (C-1), 73.4 (C-3), 70.5 (C-5), 69.1 (C-4). 68.2 (OCH2), 63.1 (C-6), 51.4 (C-2), 39.0, 38.9 (2 x C(CH3)3), 27.2, 27.0 (2 x C(CH3)3) 및 23.2 ppm (CH3). 도 3c & 3d: ESI+-HRMS: [M+H]+ C21H36O8N에 대한 계산치, 430.2435; 실측치, 430.2445. β-아노머를 백색 고체(971 mg, 2.26 mmol, 20%)로서 단리하였다. Rf = 0.18; 헥산/EtOAc 1:1; 1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 6.00 (d, 1H, J NH,H2 = 9.3 Hz, NH), 5.95-5.75 (m, 1H, OCH2CH=CH2), 5.35-5.03 (m, 3H, OCH2CH=CH 2 및 H-3), 4.55 (d, 1H, J 1,2 = 8.4 Hz, H-1), 4.47-425 (m, 3H, H-6a, 6b 및 OCH 2), 4.14-3.90 (m, 2H, OCH 2 및 H-2), 3.65-3.43 (m, 2H, H-5 및 H-4), 3.23 (sb, 1H, OH-4), 1.92 (s, 3H, NHCOCH 3), 1.23 (s, 9H, tert-부틸) 및 1.20 ppm (s, 9H, tert-부틸).
실시예 3: 알릴 2-아세트아미도-2-데옥시-α-D-갈락토피라노사이드(알릴 Tn)
알릴 Tn
도 2를 참조하여, 건조 디클로로메탄-피리딘(126 mL, v/v 20:1)의 혼합물 중의 디-O-피발로일 화합물(화합물 2)(5.50 g, 12.80 mmol, 1.0당량)을 아르곤 분위기 하에서 -35℃까지 냉각시켰다. 이후, 트리플루오로메탄설폰산 무수물(2.58 mL, 15.36 mmol, 1.2당량)을 첨가하고 혼합물을 이 온도에서 교반하였다. 온도를 실온까지 2시간 동안 가온하였다. 이후, 물(12 mL)을 용액에 첨가하였다. 혼합물을 가열하고 밤새(12시간) 환류 (대략 50℃) 교반하였다. 실온에 도달한 후, 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고 1 M의 수성 HCl로 수회 세척하였다. 유기층을 H2O, 포화 NaHCO3 및 염수로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고 감압 하에 증발시켰다. 미정제 생성물을 젬플렌(Zemplen) 조건(메탄올 중의 1 M 나트륨 메톡사이드 용액, 40 mL, pH 9) 하에서 처리하였다. 용액을 50℃에서 밤새 교반하였다. 실온까지 냉각시킨 후, 용액을 이온 교환 수지(Amberlite® IR 120, H+) 상에 첨가하여 중화시키고, 여과하고, MeOH로 세척하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 알릴 T N 을 동결건조 후 백색 고체로서 MeOH/EtOAc/헥산에 침전시켜 단리하였다(2.36 g, 9.10 mmol, 71%). Rf = 0.32; EtOAc/MeOH 4:1; 도 4a & 4b: 1H NMR (CD3OD, 600 MHz): δ 5.99-5.88 (m, 1H, OCH2CH=CH2), 5.31 (dd, 1H, J trans = 17.3, J gem = 1.3 Hz, OCH2CH=CH 2), 5.17 (dd, 1H, J cis = 10.5 Hz, OCH2CH=CH 2), 4.86 (d, 1H, J 1,2 = 3.8 Hz, H-1), 4.27 (dd, 1H, J 2,3 = 11.0 Hz, H-2), 4.20 (m, 1H, OCH 2), 4.00 (m, 1H, OCH 2), 3.89 (dd, J 3,4 = J 4,5 = 2.6 Hz, H-4), 3.85-3.77 (m, 2H, H-3 및 H-5), 3.72 (m, 2H, H-6a 및 H-6b) 및 1.99 ppm (s, 3H, CH 3); 13C NMR (CD3OD, 150 MHz): δ 172.5 (NHCO), 134.2 (OCH2 CH=CH2), 116.1 (OCH2CH=CH2), 96.6 (C-1), 71.2 (C-3), 69.0 (C-4), 68.3 (C-5). 67.8 (OCH2), 61.4 (C-6), 50.2 (C-2) 및 21.2 ppm (CH3). 도 4c & 4d: ESI+-HRMS: [M+H]+ C11H20O6N에 대한 계산치, 262.1285; 실측치, 262.1294.
절차 B: 알릴 2-아세트아미도-2-데옥시-α-D-갈락토피라노사이드를 문헌 절차(문헌[Feng et al., 2004])에 따라 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)으로부터 직접 제조할 수도 있다: 실온에서 알릴 알코올(8 mL) 중의 N-아세틸갈락토사민(442 mg, 2 mmol, 1.0당량) 용액에 BF3.Et2O(250 μL, 2 mmol, 1.0당량)를 첨가하고 혼합물을 70℃에서 2시간 동안 교반하였다. 용액을 실온까지 냉각시키고 용매를 감압 하에서 제거하였다. 건조 미정제 생성물을 최소 EtOH(5 mL)에 용해시켰다. 원하는 알릴 T N 생성물을 디이소프로필 에테르에 침전시키고 백색 고체(417 mg, 1.60 mmol, 80%)로서 단리하였다.
C-알릴 GalNAc 유사체(도 2)[1-(2'-아세트아미도-2'-데옥시-α-D-갈락토피라노실)-2-프로펜]를 문헌 절차(문헌[Cipolla, et al., 2000])에 따라 제조하였다: 3-(2-아세트아미도-3,4,6-트리-O-아세틸-2-데옥시-α-D-갈락토피라노실)-1-프로펜(문헌[Cui et al., 1998])(371 mg, 1.00 mmol, 1.0당량)을 Zemplen 조건(메탄올 중의 1 M 나트륨 메톡사이드 용액, 5 mL, pH 8 내지 9) 하에서 처리하였다. 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 이온 교환 수지(Amberlite® IR 120, H+) 상에 첨가하여 중화시키고, 여과하고, MeOH로 세척하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. C-알릴 T N 을 실리카겔 상에서 크로마토그래피(EtOAc/MeOH 9:1 내지 4:1)로 정제한 다음 EtOH에서 백색 고체(213 mg, 0.87 mmol, 87%)로서 결정화시켰다. Rf = 0.28; EtOH 4:1; mp 230℃ (Litt. 215~217℃, EtOAc/EtOH); 문헌 NMR 데이터에 따라: 1H NMR (CD3OD, 600 MHz): δ 5.81 (m, 1H, 1CH2CH=CH2), 5.08 (dd, 1H, J trans = 17.2, J gem = 1.7 Hz, 1CH2CH=CH 2), 5.02 (dd, 1H, J cis = 10.2 Hz, 1CH2CH=CH 2), 4.22 (dd, 1H, J = 9.3, 5.0 Hz, H-2’), 4.14 (dt, 1H, J = 10.0, 5.0 Hz, H-1’), 3.91 (dd, 1H, J = 3.0 Hz, H-4’), 3.82-3.64 (m, 4H, H-3’, H-5’ 및 H-6’ab), 2.45 (m, 1H, H-1a), 3.17 (m, 1H, H-1b) 및 1.97 ppm (s, CH 3); 13C NMR (CD3OD, 150 MHz): δ 173.6 (NHCO), 136.2 (1CH2 CH=CH2), 117.1 (1CH2CH=CH2), 72.9 (C-1’), 69.7 (C-4’), 69.5 (C-3’ 및 C-5’), 61.8 (C-6’), 52.0 (C-2’), 32.4 (1 CH2) 및 22.5 ppm (CH3). ESI+-LCMS: [M+H]+ C11H20O5N에 대한 계산치, 246.1336; 실측치, 246.1332; CAN/H2O 5 내지 95% 1.4분.
S-알릴 GalNAc 유사체(도 2)를 문헌에 따라 제조하였다: 문헌[Knapp et al., 2002].
실시예 4: 알릴 2-아세트아미도-4,6-O-벤질리덴-2-데옥시-α-D-갈락토피라노사이드(화합물 4)
화합물 4
도 2를 참조하여, 건조 DMF(20 mL) 중의 알릴 GalNAc(Tn)(2.35 g, 9.0 mmol, 1.0당량) 및 벤즈알데히드 디메틸아세탈(6.75 mL, 45.0 mmol, 5.0당량)의 용액에 촉매량의 p-톨루엔설폰산 일수화물을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 교반하였다. 5시간 후, 혼합물을 CHCl3로 희석하였고 NaHCO3의 포화 수용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고 물로 세척하고 Na2SO4 상에서 건조시키며 농축하여 백색 고체를 수득하였다. 벤질리덴 아세탈(화합물 4)을 백색 고체로서 EtOAc/헥산에 침전시켜 단리하였다(2.64 g, 7.56, 84%). Rf = 0.21; DCM/MeOH 9.0:0.5; 도 5a: 1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 7.59-7.46 (m, 2H, H-ar), 7.43-7.31 (m, 3H, H-ar), 5.91 (m, 1H, OCH2CH=CH2), 5.75 (d, 1H, J NH,H2 = 9.0 Hz, NH), 5.58 (s, 1H, PhCH), 5.34-5.17 (m, 2H, OCH2CH=CH 2), 5.01 (d, 1H, J 1,2 = 3.5 Hz, H-1), 4.56-4.42 (ddd, 1H, J 2,3 = 10.9 Hz, J 2,OH = 9.1 Hz, H-2), 4.34 (dd, 1H, J 5,6a = 1.5 Hz, J 6a,6b = 12.5 Hz, H-6a), 4.19 (m, 2H, H-4 및 OCH 2), 4.04 (m, 1H, dd, 1H, J 5,6b = 1.6 Hz, J 6a,6b = 12.5 Hz, H-6b), 4.01 (m, OCH 2), 3.86 (dd, 1H, J 3,4 = 10.9 Hz, H-3), 3.71 (sb, 1H, H-5), 2.80 (d, 1H, J 3,OH = 10.7 Hz, OH-3) 및 2.05 ppm (s, 3H, CH 3); 도 5b & 5c: ESI+-HRMS: [M+H]+ C18H24O6N에 대한 계산치, 350.1598; 실측치, 350.1608.
실시예 5: 알릴 (2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-갈락토피라노실)-(1→3)-2-아세트아미도-4,6-O-벤질리덴-2-데옥시-α-D-갈락토피라노사이드(화합물 6)
화합물 6
도 2를 참조하여, 화합물 4(2.0 g, 5.72 mmol, 1.0당량) 및 수은 시안화물(2.17 g, 8.60 mmol, 1.5당량)을 아르곤 분위기 하에서 4Å 분자체를 함유하는 무수 니트로메탄-톨루엔(100 mL, 3:2, v/v)의 혼합물에 용해시켰다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 2,3,4,6-테트라-O-벤조일-α-D-갈락토피라노실 브로마이드(화합물 5)(5.66 g, 8.58 mmol, 1.5당량)를 혼합물에 첨가하였다. 용액을 70℃에서 5시간 동안 교반한 이후, 실온에서 밤새(8시간) 계속 교반하였다. TLC(DCM/MeOH 9.0:0.5)에 의해 지시된 바와 같이 출발 물질(화합물 4)을 모두 소모한 후, 용매를 감압 하에 제거하였다. 잔기를 EtOAc에 용해시킨 후 셀라이트 패드로 여과하였다. 여액을 10% 요오드화 칼륨 수용액, 포화 탄산 수소 나트륨 용액 및 물로 연속하여 세척한 다음 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에서 증발시켜 백색 발포체를 수득하였다. 미정제 생성물을 100% 헥산 대 헥산/EtOAc 1:2의 구배를 사용하여 실리카겔 상에서 크로마토그래피로 정제하여 원하는 이당류(화합물 6)를 백색 고체(4.98, 5.38 mmol, 94%)로서 수득하였다. mp : 110~111℃, Rf = 0.20; 헥산/EtOAc 1:2; 도 6a & 6b: 1H NMR (CDCl3, 600 MHz): δ 8.06-7.19 (m, 5H, H-ar), 5.98 (dd, 1H, J 3,4’ = 3.3 Hz, J 4,5’ = 1.0 Hz, H-4II), 5.85-5.78 (m, 2H, OCH2CH=CH2 및 H-2II), 5.60 (dd, 1H, J 2,3’ = 10.2 Hz, J 3,4’ = 3.4 Hz, H-3II), 5.48 (sb, 1H, NH), 5.23 (m, 3H, OCH2CH=CH 2 및 H-1), 4.68 (dd, 1H, J 5’,6a’ = 6.9 Hz, J 6a’,6b’ = 11.4 Hz, H-6aI), 4.63-4.58 (m, 1H, H-2), 4.46-4.36 (m, 3H, H-4. H-5 및 H-6bII), 4.14-4.07 (m, 3H, H-6a, OCH 2 및 H-3), 3.96 (m, 1H, OCH 2), 3.75 (m, 1H, H-6b), 3.51 (m, 1H, H-5) 및 1.40 ppm (s, 3H, CH3); 13C NMR (CDC13, 150 MHz): δ 170.0 (NHCO), 166.0, 165.5, 165.4, 165.2 (CO), 137.6-126.2 (다중, 30 C-arom), 133.2 (OCH2 CH=CH2), 117.8 (OCH2CH=CH2), 102.0 (C-1II), 100.9 (CPhCH), 97,3 (C-1I), 76.1 (C-3), 75.4 (C-4), 71.7 (C-3II 및 C-5II), 70.2 (C-2II), 69.1 (C-6), 68.6 (OCH2), 68.1 (C-4II), 62.9 (C-5), 62.6 (C-6I), 48.2 (C-2) 및 22.5 ppm (CH3). 도 6c & 6d: ESI+-HRMS: [M+H]+ C52H50O15N에 대한 계산치, 928.3175; 실측치, 928.3133.
실시예 6: 알릴 (β-D-갈락토피라노실)-(1→3)-2-아세트아미도-2-데옥시-α-D-갈락토피라노사이드(알릴 TF)
알릴 TF
도 2를 참조하여, 메탄올(12 mL, pH 8 내지 9) 중 1 M 나트륨 메톡사이드 중의 화합물 6(1.12 g, 1.20 mmol, 1.0당량)의 용액을 출발 물질이 소모될 때까지 실온에서 교반하였다. 1시간 30분 후, 용액을 이온 교환 수지(Amberlite IR 120, H+) 상에 첨가하여 중화시키고, 여과하고, MeOH로 세척하고, 용액을 실리카겔로 현탁시켰고 여과하였으며, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 실리카겔을 100% EtOAc로 수회 세척한 이후 제2 용액(EtOAc/MeOH/H2O 1:1:0.1)으로 세척하였다. 합한 여액을 감압 하에서 증발시켜 중간체(화합물 7)을 백색 고체로서 수득하였다. Rf = 0.20; CHCl3/MeOH/H2O 11:6:1; 도 7a & 7b: 1H NMR (D2O, 600 MHz): δ 7.47-7.39 (m, 2H, H-ar), 7.37-7.26 (m, 3H, H-ar), 5.82 (m, 1H, OCH2CH=CH2), 5.61 (s, 1H, PhCH), 5.20-5.09 (m, 2H, OCH2CH=CH 2), 4.88 (d, 1H, J 1,2 = 3.4 Hz, H-1), 4.47 (dd, H-4), 4.37-4.25 (m, 2H, H-2 및 H-1II), 4.13-3.98 (m, 4H, H-3, H-6a, H-6b, OCH 2), 3.96-3.88 (m, 1H, H-5), 4.56-4.42 (ddd, 1H, J 2,3 = 10.9 Hz, J 2,OH = 9.1 Hz, H-2), 4.34 (dd, 1H, J 5,6a = 1.5 Hz, J 6a,6b = 12.5 Hz, H-6a), 4.19 (m, 2H, H-4 및 OCH 2), 4.04 (m, 1H, dd, 1H, J 5,6b = 1.6 Hz, J 6a,6b = 12.5 Hz, H-6b), 4.01 (m, OCH 2), 3.86 (dd, 1H, J 3,4 = 10.9 Hz, H-3), 3.71 (sb, 1H, H-5), 2.80 (d, 1H, J 3,OH = 10.7 Hz, OH-3) 및 2.05 ppm (s, 3H, CH 3); 3.83 (s, 1H, OCH 2), 3.72 (d, 1H, J 3’,4’ = J 4’,5’ = 3.2 Hz, H-4II), 3.65-3.55 (m, 2H, H-6a,b), 3.49, (m, 1H, H-5II), 3.43 (dd, 1H, J 2’,3’ = 10.0 Hz, J 3’,4’ = 3.3 Hz, H-3II), 3.33-3.24 (m, 1H, H-2II) 및 1.86 ppm (s, 3H, CH 3); 13C NMR (D2O, 150 MHz): δ 174.6 (NHCO), 136.8 (C-arom), 133.6 (OCH2 CH=CH2), 129.9, 128.7, 126.5 (C-arom), 118.0 (OCH2CH=CH2), 104.9 (C-1II), 101.3 (CHPh), 97.0 (C-1), 76.0 (C-4), 75.0 (C-3), 75.0 (C-5II), 72.4 (C-3II), 70.4 (C-2II), 69.0 (C-6), 68.7 (OCH2CH=CH2), 68.6 (C-4II), 63.0 (C-5), 61.0 (C-6II), 48.6 (C-2) 및 22.0 ppm (CH3). Rf = 0.38; EtOAc/MeOH/H2O 7:3:0.1; Rf = 0.46; ACN/MeOH/H2O 7:2:1. 도 7c & 7d: ESI+-HRMS: [M+H]+ C24H34O11N에 대한 계산치, 512.2126; 실측치, 512.2119.
이후, 백색 고체 중간체를 10 mL의 60% 수성 아세트산에 용해시키고 생성된 용액을 60℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 제거하였으며, 잔기를 동결건조시켜 최종 알릴 TF를 백색 고체(427 mg, 1.0 mmol, 84%)로서 수득하였다. mp = 230~232℃; Rf = 0.53; CHCl3/MeOH/H2O 11:6:1; 도 8a & 8b: 1H NMR (D2O, 600 MHz): δ 5.80 (m, 1H, OCH2CH=CH2), 5.19 (dd, 1H, J trans = 17.3 Hz, OCH2CH=CH 2), 5.09 (dd, 1H, J cis = 10.4 Hz, OCH2CH=CH 2), 4.77 (d, 1H, J 1,2 = 3.7 Hz, H-1), 4.29 (d, 1H, J 1,2 = 3.7 Hz, H-1), 4.29 (d, 1H, J 1,2 = 7.8 Hz, H-1II), 4.16 (dd, 1H, J 2,3 = 11.2 Hz, J 1,2 = 3.7 Hz, H-2), 4.08-4.01 (m, 2H, H-4 및 OCH 2), 3.92-3.82 (m, 3H, H-3, H-5 및 OCH 2), 3.73 (dd, 1H, H-4II), 3.63-3.52 (m, 4H, H-6a,b 및 H-6’a,b), 3.47 (m, 2H, H-3II 및 H-5II), 3.39 (dd, 1H, J 2’,3’ = 10.0 Hz, J 1’,2’ = 7.7 Hz, H-2II) 및 1.85 ppm (s, 3H, CH3); 13C NMR (150 MHz, CDC13): δ 174.6 (NHCO), 133.7 (OCH2 CH=CH2), 117.9 (OCH2CH=CH2), 104.7 (C-1II), 96.4 (C-1), 77.2 (C-3), 75.0 (C-5II), 72.5 (C-3II), 70.7 (C-5), 70.6 (C-2II), 68.8 (C-4), 68.6 (C-4II), 68.4 (OCH2), 61.2 (C-6II), 61.0 (C-6), 48.6 (C-2) 및 22.0 ppm (CH3). 도 8c & 8d: ESI+-HRMS: [M+Na]+ C17H29O11NNa에 대한 계산치, 446.1633; 실측치, 446.1613.
실시예 7: 3-{[3-(2-아세트아미도-2-데옥시-α-D-갈락토피라노실)옥시프로필]티오}프로판산(화합물 8)
화합물 8
도 9를 참조하여, 탈기된 H2O/MeOH(3 mL, 1:1, v/v) 중 알릴 Tn(392 mg, 1.50 mmol, 1.0당량) 및 3-메르캅토프로피온산(392 μL, 4.50 mmol, 3.0당량)의 용액을 (A) 실온에서 254 nm의 조사 하에 밤새, 또는 (B) 365 nm 하에서 15분 동안 DMPAP(23 mg, 0.03 mmol, 0.06당량)와 함께, 교반하였다. 이어서, 혼합물을 실리카겔을 사용하여 감압 하에 농축한 다음, 구배(EtOAc 100% 내지 EtOAc/MeOH/AcOH 3:1:0.01)에 의해 실리카겔 상에서 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 원하는 화합물 8을 백색 발포체로서 수득하였다(A로부터: 536 mg, 1.46 mmol, 97%); (B로부터: 82%). Rf = 0.34; EtOAc/MeOH/AcOH 3:1:0.01; 1H NMR (CD3OD, 600 MHz): δ 4.82 (d, 1H, J = 3.7 Hz, H-1), 4.25 (dd, 1H, J = 11.0, 3.7 Hz, H-2), 3.89 (d, 1H, J = 3.2 Hz, H-4), 3.85-3.72 (m, 5H, H-3, H-5, H-6a, H-6b, OCH2), 3.49 (dt, 1H, J = 10.0, 6.0 Hz, OCH2), 2.77 (t, 2H, J = 7.1 Hz, CH2), 2.68 (t, 2H, J = 7.2 Hz, CH2), 2.58 (t, 2H, J = 7.1 Hz, CH2), 2.00 (s, 3H, CH3), 1.95-1.83 (m, 2H, CH2); 13C NMR (CD3OD, 150 MHz): δ 174.6 (NHCO), 172.5 (CO), 97.5 (C-1), 71.1 (C-3), 69.0 (C-4), 68.3 (C-5), 66.1 (OCH2), 61.4 (C-6), 50.3 (C-2), 34.5, 29.1, 28.3, 26.6 (4xCH2) 및 21.3 ppm (CH3). ESI+-HRMS: [M+H]+ C14H26O8NS에 대한 계산치, 368.1374; 실측치, 368.1377. (도 10).
실시예 8: 펜타플루오로페닐 3-{[3-(2-아세트아미도-2-데옥시-α-D-갈락토피라노실)옥시프로필티오}프로파노에이트(화합물 9)
화합물 9
도 9를 참조하여, 화합물 8(522.54 mg, 2.0 mmol, 1.0당량), 3-메르캅토프로피온산(522 μL, 6.0 mmol, 3.0당량) 및 DMPAP(31 mg, 0.12 mmol, 0.06당량)의 미정제 반응물로부터, 임의의 정제 없이, 에스테르화를 THF/H2O(10 mL, 4:1, v/v) 중 펜타플루오로페놀(2.210 g 12.0 mmol, 6.0당량) 및 EDC.HCl(1.725 g, 9.0 mmol, 4.5당량)으로 실온에서 1시간 동안 처리하였다. 혼합물을 감압 하에 농축시켰다. 조 물질을 실리카겔 상에서 플래쉬 크로마토그래피(EtOAc/MeOH 9:1)로 정제하여 에스테르 화합물 9를 백색 고체로서 수득하였다(320 mg, 0.60 mmol, 30%).
물(1.0 mL) 중 화합물 8(100 mg, 0.27 mmol, 1.0당량)의 정제된 산을 THF(4 mL) 중 펜타플루오로페놀(200 mg, 1.09 mmol, 2.0당량) 및 EDC.HCl(104 mg, 0.55 mmol, 2.0당량)로 실온에서 1시간 동안 처리하였다. 혼합물을 감압 하에 농축시켰다. 조 물질을 실리카겔 상에서 플래쉬 크로마토그래피(EtOAc/MeOH 9:1)로 정제하여 에스테르 화합물 9를 백색 고체로서 수득하였다(49 mg, 0.09 mmol, 34%). Rf = 0.18; EtOAc/MeOH 9:1; 1H NMR (CD3OD, 600 MHz): δ 4.73 (d, 1H, J = 3.7 Hz, H-1), 4.25 (dd, 1H, J = 11.0, 3.7 Hz, H-2), 3.79 (d, 1H, J = 3.2 Hz, H-4), 3.74-3.54 (m, 5H, H-3, H-5, H-6a, H-6b, OCH2), 3.41 (dt, 1H, J = 10.0, 6.0 Hz, OCH2), 2.95 (t, 2H, J = 6.9 Hz, CH2), 2.81 (t, 2H, J = 6.9 Hz, CH2), 2.64 (t, 2H, J = 7.2 Hz, CH2), 1.89 (s, 3H, CH3), 1.80 (q, 2H, J = 6.7 Hz, CH2); 13C NMR (CD3OD, 150 MHz): δ 172.5 (NHCO), 168.1 (CO), 97.5 (C-1), 71.1 (C-3), 69.0 (C-4), 68.3 (C-5), 66.0 (OCH2), 61.4 (C-6), 50.3 (C-2), 33.6, 29.0, 28.3, 26.0 (4xCH2) 및 21.2 ppm (CH3); 19F NMR (CD3OD, 564 MHz): δ -(154.86-156.03, m), -(160.90-161.58, m), -(165.33-166.16, m); ESI+-LC-MS: [M+H]+ C20H25O8NSF5에 대한 계산치, 534.1216; 실측치, 534.1222, 6.69분. (도 11a 및 11b).
실시예 9: 3-{[3-(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-갈락토피라노실)-(1→3)-2-아세트아미도-4,6-
O
-벤질리덴-2-데옥시-α-D-갈락토피라노실)옥시프로필]티오}프로판산(화합물 10)
화합물 10
도 12를 참조하여, 탈기된 THF(3 mL) 중 보호된 알릴 TF(화합물 6)(659 mg, 0.71 mmol, 1.0당량) 및 3-메르캅토프로피온산(186 μL, 2.13 mmol, 3.0당량)의 용액을 DMPAP(11 mg, 0.43 mmol, 0.06당량)와 함께 365 nm에서 조사 하에 실온에서 15분 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 감압 하에 농축시킨 다음, 실리카겔 상에서 플래시 크로마토그래피(DCM/MeOH/AcOH 98:2:0.01)로 정제하여 원하는 화합물 10을 백색 발포체로서 수득하였다(712 mg, 0.69 mmol, 97%); Rf = 0.25; MeOH/MeOH/AcOH 98:2:0.01; 1H NMR(CDCl3, 600 MHz): δ 8.05-7.14 (m, 25H), 5.92 (t, 1H, J = 7.2 Hz, 1H), 5.85-5.76 (m, 1H), 5.75-5.65 (m, 1H), 5.53-5.47 (m, 1H), 5.45 (d, 1H, J = 9.5 Hz), 5.16 (dd, 1H, J = 19.2, 11.5 Hz), 5.10-5.02 (m, 1H), 4.71 (d, 1H, J = 3.5 Hz), 4.69-4.65 (m, 1H), 4.65-4.60 (m, 1H), 4.50 (m, 1H), 4.43-4.29 (m, 1H), 4.12-3.97 (m, 1H), 3.88 (td, 1H, J = 10.7, 3.3 Hz), 3.67 (ddd, 1H, J = 19.3, 12.1, 5.3 Hz), 3.40-3.38 (m, 1H), 3.25 (td, 1H, J = 9.5, 2.7 Hz), 2.91-2.82 (m, 1H), 2.73-2.45 (m, 1H) 및 1.64 ppm (s, 1H); 13C NMR (CDC13, 150 MHz): δ 177.07, 175.59, 170.46, 137.73, 133.51, 133.47, 133.41, 133.21, 133.17, 129.90, 129.64, 129.61, 128.57, 128.50, 128.19, 128.03, 125.99, 102.57, 100.45, 98.87, 76.44, 75.58, 72.02, 71.38, 69.41, 69.01, 68.17, 66.82, 63.15, 62.45, 52.49, 36.62, 31.48, 29.54, 28.68, 25.96, 22.55, 20.05 및 14.03 ppm; ESI+-HRMS: [M+Na]+ C55H55O17NSNa에 대한 계산치, 1056.3083; 실측치, 1056.3116.
실시예 10: 3-{[3-(β-D-갈락토피라노실)-(1→3)-2-아세트아미도-2-데옥시-α-D-갈락토피라노실)옥시프로필]티오}프로판산(화합물 12)
화합물 12
도 12를 참조하여, 탈기된 H2O/MeOH(3 mL, 1:2, v/v) 중 알릴 TF(화합물 11)(85 mg, 0.2 mmol, 1.0당량) 및 3-메르캅토프로피온산(52 μL, 0.6 mmol, 3.0당량)의 용액을 실온에서 254 nm의 조사 하에 밤새 교반하였다. 이어서, 혼합물을 실리카겔을 사용하여 감압 하에 농축한 다음, 구배(EtOAc 100% 내지 EtOAc/MeOH/H2O 7:2:1)에 의해 실리카겔 상에서 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 원하는 화합물 12를 백색 발포체로서 수득하였다(87 mg, 0.16 mmol, 82%).
메탄올(6 mL, pH 8 내지 9) 중 1 M 나트륨 메톡사이드 중의 화합물 10(672 mg, 0.65 mmol, 1.0당량)의 용액을 출발 물질이 소모될 때까지 실온에서 교반하였다. 1시간 30분 후, 이온 교환 수지(Amberlite IR 120, H+)를 pH 4가 될 때까지 첨가하여 용액을 중화시키고, 메탄올로 세척하고, 용액을 감압 하에 농축하였다. 그 다음, 백색 발포체의 중간체 조 물질을 60%의 수성 아세트산 6 mL에서 60℃에서 1.5시간 동안 처리하였다. 용매를 감압 하에 제거하고, 잔류물을 구배(EtOAc 100% 내지 EtOAc/MeOH/H2O 7:2:1)에 의해 실리카겔 상에서 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 원하는 화합물 13을 백색 발포체로서 수득하였다(306 mg, 0.58 mmol, 89%). Rf = 0.34; EtOAc/MeOH/AcOH 3:1:0.01; 1H NMR (CD3OD, 600 MHz): δ 4.83 (d, 1H, J = 3.7 Hz, H-1), 4.43 (d, 1H, J = 7.6 Hz, H-1’), 4.41 (dd, 1H, J = 11.0, 3.7 Hz, H-2), 4.18 (d, 1H, J = 2.0 Hz, H-4’), 3.91 (dd, 1H, J = 11.1, 3.1 Hz, H-3), 3.87-3.67 및 3.58-3.43 (m, 11H, H-2’, H-3’, H-4, H-5, H-5’, H-6a, H-6a’, H-6b, H-6b’, OCH2), 2.92 (t, 2H, J = 7.2 Hz, CH2), 2.77 (t, 2H, J = 7.4 Hz, CH2), 2.68 (t, 2H, J = 7.2 Hz, CH2), 2.53 (t, 2H, J = 7.4 Hz, CH2), 1.98 (s, 3H, CH3), 1.89 (m, 2H, CH2); 13C NMR (CD3OD, 150 MHz): δ 174.0 (CO), 106.2 (C-1’), 98.9 (C-1), 78.9, 76.7, 74.7, 72.49, 72.0 (C-3), 70.2 (C-4), 70.0, 67.4 (C-5), 62.7 (OCH2), 62.5 (C-6), 50.3 (C-2), 37.4, 35.1, 30.5, 29.5, 28.6 (CH2) 및 22.8 ppm (CH3). ESI+-HRMS: [M+H]+ C20H36O13NS에 대한 계산치, 530.1902; 실측치, 530.1909. (도 13).
실시예 11: 펜타플루오로페닐 3-{[3-(β-D-갈락토피라노실)-(1→3)-2-아세트아미도-2-데옥시-α-D-갈락토피라노실)옥시프로필]티오}프로파노에이트(화합물 13)
화합물 13
물(1.0 mL) 중 정제된 산 화합물 12(159 mg, 0.30 mmol, 1.0당량)를 아세토니트릴(4 mL) 중 펜타플루오로페놀(331 mg, 1.80 mmol, 6.0당량) 및 EDC.HCl(259 mg, 1.35 mmol, 4.5당량)로 실온에서 1시간 동안 처리하였다. 혼합물을 감압 하에 실리카겔로 농축시켰다. 조 물질을 구배(EtOAc 100% 내지 EtOAc/MeOH 6:4)에 의한 실리카겔 상의 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 에스테르 화합물 13을 백색 고체로서 수득하였다(62 mg, 0.09 mmol, 30%). Rf = 0.50; EtOAc/MeOH 6:4; 1H NMR (CD3OD, 600 MHz): δ 4.45 (d, 1H, J = 7.5 Hz, H-1’), 4.41 (ddd, 1H, J = 12.6, 6.1, 2.8 Hz), 4.19 (d, 1H, J = 3.0 Hz), 3.92 (dd, 1H, J = 11.0, 3.1 Hz), 3.89-3.77 (m, 3H), 3.74 (m, 4H), 3.68 (s, 1H), 3.52 (m, 4H), 3.06 (t,1H, J = 6.9 Hz), 2.91 (t, 1H, J = 6.9 Hz), 2.77 (dt, 2H, J = 15.0, 7.1 Hz), 2.68 (t, 1H, J = 7.1 Hz), 2.63 (t, 1H, J = 7.0 Hz), 1.99 (s, 1H) 및 1.95~1.84 ppm (m, 2H); 13C NMR (CD3OD, 150 MHz): δ 172.7 (NHCO), 168.1 (CO), 104.7 (C-1’), 97.6 (C-1), 77.5, 75.3, 73.3, 71.1, 70.6, 69.0, 68.7, 66.0, 61.4, 61.2, 50.9, 48.9, 34.2, 33.6, 29.0, 28.2, 28.2, 26.4, 26.1, 21.5 및 21.5 ppm; 19F NMR (CD3OD, 564 MHz): δ -155.12 (m), -161.21 (m), -165.63 (m); ESI+-HRMS: [M+H]+ C26H35O13NSF5에 대한 계산치, 696.1744; 실측치, 696.1739. (도 14).
실시예 12: BSA 및 CRM197에 대한 PFP-Tn 접합
도 9를 참조하여, 단백질에 대한 PFP-Tn(화합물 9)의 접합을 BSA 및 CRM197을 사용하여 입증하였다. BSA(무 지방산, 저 내독소; Sigma)를 다음의 각각 증가된 pH를 갖는 5개의 완충액 각각에 1 mg/mL의 농도로 가용화하였다: (1) 0.1M MES 및 150 mM NaCl pH 6; (2) 인산염 완충 식염수(PBS) pH 7; (3) PBS pH 8; (4) 150 mM의 NaCl을 포함하는 0.1 M 탄산나트륨 pH 9; 및 (5) 150 mM의 NaCl을 포함하는 0.1 M 탄산나트륨 pH 10. BSA에 대한 Tn의 접합은 400 μL(6 nmol)의 BSA 용액을 BSA에 대해 5, 15, 50 또는 200당량의 PFP-Tn(화합물 9)(물 중 20 mM)을 포함하는 각 완충액 60 μL와 합하고, 90분 동안 부드럽게 볼텍싱하여 교반하여 개시하였다. 이어서, 생성된 BSA-Tn 접합체를 원심분리 여과(MWCO 10 KDa, Amicon)에 의해 PBS pH 7.4로 세척하였다. 단백질 농도를 Bradford 분석으로 측정하였다. 접합체 CRM197-Tn을 2시간 동안 0.4 M 인산나트륨 완충액 pH 7.2에서 4 mg/mL의 정제된 CRM197과 함께 최대 15몰 당량의 PFP-Tn(화합물 9)을 인큐베이션하여 유사한 조건에서 얻었다.
단백질-Tn 접합체를 웨스턴 블롯 및/또는 ELISA에 의해 Tn-특이적 렉틴 비시아 빌로사(Vicia Villosa, VVA)에 대한 반응성에 대해 분석하였다.
도 15는 pH 6 내지 10의 완충액 및 50Eq PFP-Tn 대 BSA의 비율에서 생성된 BSA-Tn 접합체의 VVA에 대한 반응성을 도시한다. 도 15a의 웨스턴 블롯은 BSA의 분자량(약 66.5 kDa) 영역에서 우세한 반응성 밴드를 보여주며, 이는 pH 6 내지 10 범위의 5개 완충액 모두에서 Tn 접합이 발생했음을 나타낸다. 더 높은 강도의 밴드와 약간 느린 이동이 pH 8 조건에서 검출되었으며, 이는 테스트한 다른 pH보다 pH 8에서 더 효과적인 반응으로 인해 BSA에 대한 Tn의 더 높은 수준의 접합을 시사한다. VVA에 대한 BSA-TF pH8의 더 높은 반응성은 또한 ELISA에 의해 확인되었다(도 15b).
도 15c는 최적 pH 8에서 BSA에 접합 시 PFP-Tn(화합물 9)의 적정을 보여준다. 웨스턴 블롯에 의해, BSA에 대한 PFP-Tn의 최소 15몰 당량으로 생성된 VVA 반응성 BSA-Tn 종이 검출되었다. BSA에 대한 PFP-Tn의 비율을 50 및 200몰 당량으로 증가시키자 BSA에 대한 더 높은 수준의 접합된 Tn으로 인해 밴드 강도가 상응하여 증가하였고 겔에서 더 느린 이동이 발생하였다. PFP-Tn의 양과 생성된 BSA-Tn 접합체의 반응성 사이의 상관관계는 또한 ELISA에 의해 관찰되었다(도 15d). ELISA는 상관관계가 5에서 200당량 PFP-Tn까지 선형임을 추가로 보여주었으며, 이는 BSA의 PFP-Tn 접합 부위가 포화되지 않았음을 시사한다.
도 15e는 CRM197-Tn의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. 블롯은 테스트한 PFP-Tn의 3가지 접합 비율(즉, 3.4, 9.7 및 15)에 대해 CRM197의 분자량 범위(약 58.4 kDa)에서 단일 VVA 반응성 밴드를 나타내었으며, 3가지 중 가장 반응성 있는 종은 15당량의 가장 높은 PFP-Tn 비율에서 생성되었다.
15당량의 PFP-Tn과 접합된 CRM197의 질량 분석을 질량 분석법으로 추가 분석하고 접합을 확인하였다(데이터는 제시되지 않음).
실시예 13: BSA에 대한 PFP-TF 접합
단백질에 대한 PFP-TF(화합물 13)의 접합은 BSA를 사용하여 입증하였다. BSA(무 지방산, 저 내독소; Sigma)를 PBS pH 8 중에 1 mg/mL의 농도로 용해시키고, 400 μL(6 nmol)을 5, 15, 50 또는 200당량의 PFP-TF(물 중 20 mM)를 함유하는 PBS pH 8 60 μL와 혼합한 다음, 90분 동안 부드럽게 볼텍싱하여 교반하였다. 생성된 BSA-TF 접합체를 원심분리 여과(MWCO 10 kDa, Amicon)에 의해 PBS pH 7.4로 세척하였다. 단백질 농도를 Bradford 분석으로 측정하였다.
도 16은 TF-특이적 렉틴 땅콩 응집소(PNA)에 대한 생성된 BSA-TF 접합체의 반응성 및 접합된 이당류 TF 항원으로부터의 갈락토스 당의 투여량을 나타낸다. 도 16a에 도시된 웨스턴 블롯은 BSA에 대한 TF의 커플링을 나타내는 BSA 단량체의 예상 분자량 범위에서 PNA에 반응성인 우세한 밴드를 보여주었다. 겔은 또한 BSA에 대한 PFP-TF의 비율을 50 및 200몰 당량으로 증가시키자 BSA에 대한 더 높은 수준의 접합된 TF로 인해 밴드 강도가 상응하여 증가하였고 겔에서 더 느린 이동이 발생하였음을 보여주었다. 15 내지 200당량의 PFP-TF와 생성된 BSA-Tn 접합체의 반응성 사이의 선형 상관관계가 ELISA에 의해 또한 관찰되었으며(도 16b), 이는 BSA 상의 PFP-TF 접합 부위가 이러한 조건 하에서 포화되지 않았음을 시사한다. BSA에 대한 TF의 접합은 또한 Dubois의 방법에 의해 BSA와 관련된 갈락토스를 측정함으로써 입증되었다. 도 16b의 막대 그래프는 BSA-TF의 PNA 반응성에 상응하여 갈락토스의 양이 증가하고, 200당량의 PFP-TF로 접합을 수행할 때 BSA당 45의 비율에 도달함을 보여준다.
실시예 14: CRM197 및 dTT에 대한 COOH-Tn 및 COOH-TF 접합
단백질에 대한 COOH-Tn 및 COOH-TF의 접합은 CRM197 및 dTT로 입증하였다. COOH-Tn(화합물 8) 및 COOH-TF(화합물 12)를 먼저 0.1 M의 물에 용해된 당류 항원을 각각의 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸-카보디이미드(EDC, Sigma-Aldrich) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS, Sigma-Aldrich)의 0.1 M 수용액 2당량과 합하고, 실온에서 최소 30분 동안 볼텍싱하여 숙신이미드화하였다. 이어서, 생성된 화학적 반응성 항원을 PBS pH 8로 4배까지 희석하고, 10 mg/mL 농도의 PBS pH 8 중 단백질 용액에 50당량을 첨가함으로써 단백질에 대한 커플링을 개시하였다. 용액을 30 내지 120분 동안 볼텍싱한 후, 생성된 단백질-항원 접합체를 PBS pH 7.4로 막 여과(Amicon, MWCO 30,000 Da)에 의해 세척하였다. 단백질 농도를 Bradford 분석으로 측정하였다.
도 17은 겔 전기영동에 의한 단백질 단독 및 생성된 접합체의 이동 및 웨스턴 블롯 및 ELISA에 의한 렉틴 VVA(Tn-특이적) 및 PNA(TF-특이적)에 대한 반응성을 보여준다. 접합체의 쿠마시 염색 SDS-PAGE 겔(도 17a)은 접합된 단백질이 천연의 접합되지 않은 단백질과 유사하게 이동함을 보여주며, 이는 Tn 또는 TF에 대한 단백질 접합의 결과로서 응집 또는 분해가 없음을 나타낸다. 웨스턴 블롯(도 17b)은 VVA 또는 PNA 렉틴에 대한 단백질 접합체의 특이적 반응성을 보여주며, 이는 Tn 또는 TF의 커플링을 나타낸다. 렉틴에 대한 특이적 반응성의 동일한 패턴이 또한 ELISA에 의해 관찰되었다(도 17c).
실시예 15: 신생 당접합체 dTT-TF로 면역화된 마우스로부터의 혈청의 면역반응성의 특성화
신생 당접합체 dTT-TF를 실시예 14에 기재된 바와 같이 제조하고, PBS pH 7.4로 1 mg/mL로 희석하고, 동량의 TiterMax™ Gold(SigmaAldrich)로 유화시켰다. 25 μL의 제형을 8주령 암컷 BALB/c 마우스의 왼쪽 및 오른쪽 넓적다리에 2주마다 근육 내 주사하여 총 12마리의 마우스에 5회 면역화시켰다. 마우스를 사전 채혈하여 면역 전 혈청 샘플을 수집한 다음, 각 면역화 후 1주일 후에 채혈하였다.
혈청을 ELISA로 테스트하여 항-TF 또는 항-Tn 항체의 역가를 평가하였다. 96-웰 플레이트(Nunc, Maxisorp™)를 지시된 스크리닝 항원으로 코팅하였다: PBS pH 7.4에 1 μg/100 μL 농도의 BSA-Tn 및 BSA-TF(실시예 14에 기재된 바와 같음), 또는 폴리아크릴아미드[PAA]-Tn 및 PAA-TF(GlycoTech, 미국). 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 코팅된 웰을 PBS-Tween(PBS-T) 0.05%로 세척하고 PBS-T 0.05% + 1% BSA로 30분 동안 차단하였다. PBS-Tween 0.05%로 세척한 후, 웰을 PBS-Tween 0.05% 중 1/200 희석도의 혈청으로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 웰을 세척하고 PBS-Tween 0.05% 중 1/1000 희석도의 염소 항-마우스 IgG-HRP와 30분 동안 인큐베이션하였다. 뮤린 항체의 결합을 HRP 비색 기질 울트라-TMB(Thermo)를 첨가한 후, 동일한 부피의 0.5 M의 황산을 첨가하여 반응을 중지시켜 측정하였다. 플레이트를 OD450에서 플레이트 판독기에서 판독하였다. dTT-TF로 적어도 5회 면역화를 받은 12마리 마우스 중, ELISA에 의해 6마리 마우스의 혈청에서 유의한 수준의 항-TF 항체가 검출되었다.
표 1 및 도 18은 dTT-TF로 3회 면역화한 후 2마리의 마우스(A1 및 A2)로부터의 혈청의 ELISA 결과 및 각각의 면역 전 혈청에 따른 정규화된 데이터를 보여준다. 결과는 마우스 A1의 혈청이 모든 TF 및 Tn 스크리닝 항원과 반응했으며(상응하는 면역 전 혈청에 비해 6.5배 내지 32.5배 증가 범위), BSA-TF에서 가장 높은 반응성이 관찰되었음을 보여준다(상응하는 면역 전 혈청보다 32.5배 증가). 마우스 A2의 혈청은 TF 스크리닝 항원 둘 다(BSA-TF 및 PAA-TF)와 반응성을 나타내었지만, 운반체 단백질에 접합된 Tn 항원과는 하나(Tn-BSA)만 반응성을 나타내었다. 이러한 결과는 신생 당접합체 dTT-TF를 이용한 면역화가 운반체와 관계 없이, TF 탄수화물 항원에 대한 항체 생성을 성공적으로 유도했음을 보여준다. 더욱이, 이러한 결과는 생성된 항-TF 항체 중 적어도 일부가 TF 항원 내의 잠재적(cryptic) 에피토프인 Tn 항원과 교차 반응성임을 시사한다(도 1).
도 19a 및 19b는 BSA-TF를 스크리닝 항원으로 사용하여 dTT-TF로 5차 면역화한 후 및 5차 면역화 후 6주에 취한 2마리의 마우스로부터의 연속 희석된 혈청(1:100 내지 1:1,000,000)의 ELISA를 보여준다. 곡선은 연장된 항체 반감기를 나타내는 마지막 면역화 후 6주 후에 항체 역가가 감소되지 않음을 보여준다. PAA-TF를 스크리닝 항원으로 사용하여 유사한 결과가 관찰되었다(데이터는 제시되지 않음).
실시예 16: 고분해능 질량 분석을 특징으로 하는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 서브유닛 S1의 정량적 O-글리코실화 프로파일
S1 단백질 준비
환원성 샘플 완충액에서 형질감염된 HEK293 세포(RayBiotech, 미국)의 무혈청 세포 배양 상청액으로부터 C-말단 His-태그가 있는 재조합 SARS-CoV-2 S1 서브유닛 27 μL를 10% SDS-PAGE에서 전기영동으로 분리하였다. 젤을 쿠마시 블루 G-250으로 염색하였다. 75 kDa 이상에 해당하는 레인의 섹션을 클린 벤치 하에서 10조각으로 절단하고, 각 조각을 1 mm3 조각으로 더 절단하였다.
겔 조각 준비
겔 조각을 먼저 5분 동안 물로 세척하고 탈색 완충액(100 mM 티오황산나트륨, 30 mM 페리시안화칼륨)으로 15분 동안 2회 탈색시켰다. 중탄산암모늄 완충액(50 mM)으로 탈색시킨 후 5분의 추가 세척을 수행하였다. 그런 다음, 겔 조각을 아세토니트릴(ACN)로 탈수시켰다. 단백질 시스테인 이황화 기를 환원 완충액(10 mM 디티오트레이톨(DTT), 100 mM 중탄산 암모늄)을 40℃에서 30분 동안 첨가하여 환원시켰다. 이어서, 생성된 유리 설프하이드릴 기를 40℃의 암소에서 20분 동안 알킬화 완충액(55 mM 요오도아세트아미드, 100 mM 중탄산 암모늄)을 첨가하여 S-카르복시아미도메틸로 알킬화시켰다. 그런 다음, 겔 조각을 탈수시키고 모든 시약을 버리기 전에 아세토니트릴을 5분 동안 첨가하여 40℃에서 세척하였다.
단백질 가수분해 소화 및 펩티드 추출 단계
겔 조각을 40℃에서 5분 동안 건조시킨 다음, 트립신 용액(6 ng/μL의 Promega의 트립신[시퀀싱 등급], 25 mM 중탄산 암모늄)으로 4℃에서 40분 동안 재수화하였다. 단백질 분해를 58℃에서 1시간 동안 수행하였고, 1% 포름산/2% 아세토니트릴 15 μL를 첨가하여 중지시켰다. 그런 다음, 상청액을 96-웰 플레이트로 옮기고, 추출 완충액(1% 포름산/50% ACN)을 사용하여 실온에서 2회의 30분 추출 단계로 펩티드 추출을 수행하였다. 모든 펩티드 추출물을 진공 원심분리기에서 완전히 건조시켰다.
LC-MS/MS 분석
LC-MS/MS 이전에, 단백질 소화물을 1% ACN/0.5% 포름산 10 μL에서 15분 동안 교반하면서 재용해시켰다. 길이 15 cm, 내경 75 μm Self-Pack PicoFrit™ 융합 실리카 모세관 컬럼(New Objective, 미국 매사추세츠 주 워본 소재)을 C18 Jupiter™(5 μm, 300Å) 역상 물질(Phenomenex, 미국 캘리포니아 주 토런스 소재)로 패킹하였다. 이 컬럼을 Easy-nLC™ II 시스템(Proxeon Biosystems, 덴마크 오덴세 소재)에 설치하고, Nanospray Flex™ 이온 소스(Thermo-Fisher Scientific)가 장착된 Orbitrap Fusion™(Thermo-Fisher Scientific, 독일 브레멘 소재)에 커플링시켰다. 크로마토그래피에 사용된 완충액은 0.2% 포름산(완충액 A) 및 100% 아세토니트릴/0.2% 포름산(완충액 B)이었다. 펩티드를 250 nL/분의 유량으로 2-기울기 구배로 용리시켰다. 용매 B를 먼저 75분 동안 1부터 35%까지 증가시킨 다음, 15분 동안 35에서 86%로 증가시켰다. Nanospray 및 S-lens 전압을 각각 1.3~1.7 kV 및 50 V로 설정하였다. 모세관 온도를 225℃로 설정하였다. 프로파일 모드의 전체 스캔 MS 조사 스펙트럼(360~1560 m/z)은 목표 값이 8e5로 설정된 120 000의 해상도로 Orbitrap에서 획득되었다. 데이터 의존적 MS/MS 분석에 3초의 주기 시간이 사용되었으며, 여기서 선택된 전구체 이온은 HCD(고에너지 C-트랩 해리) 충돌 셀에서 단편화되고, 30 000으로 설정된 분해능, 7e4로 설정된 목표 값 및 28 V에서 정규화된 충돌 에너지로 Orbitrap에서 분석되었다. CID(충돌 유도 해리)를 사용한 후속 MS/MS 분석은 옥소늄 이온 검출 시 Orbitrap에서 수행되었다. 포함 목록은 SARS-Cov-2의 알려진 모든 형태의 펩티드 320-328에도 사용되었다. SIM(단일 이온 모니터링) 및 표적화된 MS2 방법을 사용하여 이러한 펩티드에 대한 제2의 일련의 분석을 수행하였다.
데이터 분석
단백질 데이터베이스 검색을 Uniprot 단백질 데이터베이스(2017-04-11)에 대해 Mascot 2.6(Matrix Science)으로 수행하였다. 전구체 및 단편 이온에 대한 질량 허용 오차는 각각 10 ppm 및 0.6 Da로 설정되었다. 지정된 효소는 트립신이었고 하나의 누락된 절단이 허용되었다. 시스테인 카르바미도메틸화는 고정 변형으로, 메티오닌 산화는 가변 변형으로 지정하였다. 제2의 일련의 검색을 Mascot 2.6 및 Byos 3.8(Protein Metrics)을 사용하여 SARS-CoV-2 서열에 대해 수행하였다. 지정된 효소는 세미 트립신이었고 하나의 누락된 절단이 허용되었다. 시스테인 카르바미도메틸화는 고정 변형으로 지정하였다. 메티오닌 산화 및 모든 알려진 O-글리코실화된 형태의 펩티드 320-328을 가변 변형으로 사용하였다.
도 20은 75 kDa이 넘는 단백질의 고해상도 LC-MS/MS를 특징으로 하는 SARS-CoV-2 S1 단백질로부터의 펩티드 VQPTESIVR(서열번호 3)의 정량적 O-글리코실화 프로파일을 보여준다. 도 21은 75~100 kDa 사이의 단백질의 고해상도 LC-MS/MS로 수행한 동일한 분석을 보여준다. 개별 글리칸의 그래프 표현에 대한 기호 명명법은 다음과 같다(문헌[Varki et al., 2015]): 황색 사각형 = GalNAc, 황색 원형 = Gal, 자색 다이아몬드 = Neu5Ac(시알산). TF는 이당류 Gal-GalNAc에 의해 형성된다. 도면은 디-시알릴-TF가 우세한 종이고 두 번째로 풍부한 종이 TF인 글리코실화 펩티드의 상이한 패턴을 보여준다.
실시예 17: ELISA 및 웨스턴 블롯에 의한 재조합 SARS-CoV-2 S1 및 S 단백질에 대한 항-Tn 및 항-TF 리간드의 반응성
96웰 플레이트의 웰을 빈 벡터 또는 재조합 SARS-CoV-2 S1(스파이크 단백질의 S1 서브도메인; RayBiotech, 미국, 카탈로그 번호 230-20407) 또는 C-말단 His-태그가 있는 S(전장 스파이크 단백질; NRC, 캐나다)를 암호화하는 DNA로 형질감염된 포유류 세포의 무 혈청 배양 상청액 10 μL를 함유하는 PBS pH 7.4 100 μL로 1시간 동안 코팅하였다. 웰을 PBS-Tween 0.05%로 세척하고 PBS-T 0.05% + 1% BSA로 30분 동안 차단하였다. 그런 다음 웰을 PBS-T 0.05%로 세척하고, PBS-T 0.01% 중 지시된 항-TF(JAA-F11 IgG, 1 μg/mL; SPM320 IgM, Abnova, 카탈로그 번호 MAB13207, 0.2 mg/mL, 1 :100 희석도) 또는 항-Tn(Tn218 IgM, Abnova, 카탈로그 번호 MAB6198, 1:100 희석도) 항체와 함께 1시간 동안 추가로 인큐베이션한 후, PBS-T 중 적절한 HRP-접합 이차 항체(염소 항-마우스 IgG-HRP 또는 염소 항-마우스 IgM-HRP, Jackson Immuno, 1/1000)와 30분 동안 인큐베이션하였다. 리간드의 결합은 HRP 비색 기질 울트라-TMB(Thermo)로 밝혀졌다. 동일한 부피의 0.5 M 황산을 첨가하여 반응을 중지시키고, 플레이트 판독기(Biotek)에서 450 nm에서 광학 밀도를 측정하였다. 도 22에 도시된 결과는 각각의 항체에 대해, 빈 벡터로 형질감염된 HEK 세포로부터의 상청액의 OD450에 비해 재조합 S1 또는 S 단백질을 발현하는 HEK 세포로부터의 상청액을 사용한 OD450의 배수 증가이다. 제시된 배수 증가는 적어도 6개의 개별 실험의 평균을 나타내고, 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다. 또한, 곤충(Sf9) 세포(S1-His, SinoBiological, 카탈로그 번호 40591-V08B1)에서 발현된 재조합 S1 단백질을 사용하여 실험을 반복했으며, 그 결과 JAA-F11의 경우 평균 배수 증가가 3.32 ± 1.35, SPM320의 경우, 5.50 ± 1.80, Tn218의 경우 1.77 ± 0.64였다(3회 실험의 평균 ± SEM).
빈 벡터, S1 단백질을 암호화하는 DNA 또는 SARS-CoV-2의 전장 S 단백질을 암호화하는 DNA로 형질감염된 HEK293 세포의 무 혈청 배양 상청액을 사용하여 HRP-접합된 렉틴 패널로 위와 유사한 ELISA 실험을 수행하였다(위 참조). 렉틴 패널에는 다음으로부터의 렉틴이 포함되었다: 아라키스 하이포가에아(Arachis hypogaea, PNA; 카탈로그 번호: H-2301-1), 비시아 빌로사(VVA, 카탈로그 번호: H-4601-1), 샐비어 스클라레아(Salvia sclarea, SSA, 카탈로그 번호: H-3501-1), 마아키아 아무렌시스(Maackia amurensis, MAA; 카탈로그 번호: H-7801-1), 마클루라 포미페라(Maclura pomifera, MPA; 카탈로그 번호: H-3901-1). 모든 렉틴은 EY Laboratories(미국 캘리포니아 주 소재; 1 mg/mL, HRP-접합)에서 구입했으며 PBS-Tween 0.01%에서 10 μg/mL로 사용하였다. 도 23에 도시된 결과는 각각의 렉틴에 대해, 빈 벡터로 형질감염된 HEK 세포로부터의 상청액의 OD450에 비해 재조합 S1 또는 S 단백질을 발현하는 HEK 세포로부터의 상청액을 사용한 OD450의 배수 증가이다. 제시된 배수 증가는 적어도 7개의 개별 실험의 평균을 나타내고, 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다. 또한, 곤충(Sf9) 세포(S1-His, SinoBiological, 카탈로그 번호 40591-V08B1)에서 발현된 재조합 S1 단백질을 사용하여 실험을 반복했으며, 그 결과 PNA의 경우 평균 배수 증가가 22.67 ± 12.52, VVA의 경우, 22.51 ± 9.71, SSA의 경우 3.97 ± 1.09, MAA의 경우 4.30 ± 1.23, MPA의 경우 7.51 ± 3.64였다.
웨스턴 블롯팅을 위해, 환원성 샘플 완충액에서 C-말단 His-태그가 있는 SARS-CoV-2 S1을 암호화하는 DNA로 형질감염된 HEK293 세포의 무 혈청 배양 상청액 2 μL를 10% 폴리아크릴아미드 겔에서 SDS-PAGE로 분리하였다. 그런 다음, 단백질을 항-글리칸 렉틴, 항체 및 혈청을 사용한 웨스턴 블롯 분석을 위해 PVDF 막으로 옮겼다. 항-글리칸의 반응성을 대조군으로서 상응하는 조건에서 항-His 태그 항체의 반응성과 비교하였다. PNA, VVA 및 JAA-F11 mAb로 검출된 밴드는 대조군 항-His-태그 Ab로 검출된 밴드와 유사하여 동일한 S1 단백질을 인식함을 시사한다(데이터는 제시되지 않음). 마우스 A1 면역 혈청(실시예 15)은 또한 면역 전 혈청의 풀(pool)과 비교하여 S1을 강하게 검출하였다.
종합적으로, 이 실시예의 결과는 탄수화물 항원 Tn 및 TF가 상이한 발현 시스템에 의해 생성된 재조합 SARS-CoV-2 S1 및 S 단백질에 존재하고, 이들 항원이 항-Tn 및 항-TF 리간드에 의한 결합에 대해 접근 가능함을 보여준다.
실시예 18: O-글리칸 리간드에 의한 SARS-CoV-2 S를 발현하는 위형 바이러스의 감염성의 세포 억제
도 24는 S가 결합하는 수용체인 인간 안지오텐신 전환 효소 2를 발현하는 293T 세포(293T-ACE2)에 대한 위형 lenti-luc-SARS-CoV-2-S 바이러스의 상대적 감염성을 나타낸다. 바이러스를 먼저 항-글리칸 렉틴 PNA, AIA(jac)[자칼린 렉틴(아르토카르푸스 인테그리폴리아) 및 단클론 항-TF 항체 JAA-F11로 연속 희석하여 37℃에서 1시간 동안 사전 인큐베이션하였다. 이어서, 혼합물을 96-웰 플레이트에 시딩한 293T 세포에 첨가하고 2시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 배지를 새로운 배지로 교체하고, 2일 동안 추가로 인큐베이션하였다. 그런 다음, 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 도 24는 렉틴 PNA와 AIA가 293T-ACE2 세포를 감염시키는 위형 lenti-luc-SARS-CoV-2-S 바이러스의 능력을 - 농도 의존적 방식으로 - 억제했음을 보여준다. 가장 높은 농도의 JAA-F11만이 약간의 감염성 억제를 보였다.
흥미롭게도, AIA(자칼린) 렉틴은 시알릴화 또는 비시알릴화 형태의 TF 및 Tn 항원 모두에 대해 결합 특이성을 갖는 것으로 알려져 있는 반면, PNA 렉틴(말단 베타-갈락토스에 대한 결합 친화도를 가짐)은 오로지 비시알릴화 형태의 TF 항원에 결합하는 것으로 알려져 있다(문헌[Li et al., 2010]). 유사하게, JAA-F11 항체는 비시알릴화 형태의 TF 항원에만 결합하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 도 23에 제시된 PNA 및 JAA-F11에 비해 AIA의 보다 강력한 억제 효과는 도 20 및 도 21에 제시된 SARS-CoV-2 S1 단백질에서 검출된 O-글리코실화된 형태의 분포 및 도 22 및 도 23에 도시된 상이한 항-Tn 및 항-TF 리간드의 상대적 반응성과 일치한다.
이 실시예의 결과는 위형 바이러스 입자의 맥락에서 발현된 SARS-CoV-2-S 단백질이 실제로 항-TF 및/또는 항-Tn 리간드에 의해 결합에 접근 가능한 표면 TF 및 Tn 탄수화물 항원을 함유함을 시사한다. 이 실시예의 결과는 생존 가능한 슈도바이러스 입자의 맥락에서 발현된 S 단백질 표면에 있는 O-글리칸의 리간드 결합, 특히 렉틴 PNA 및 AIA에 의한 결합이 COVID-19에 대한 예방 및/또는 치료적 개입을 위한 유망한 전략일 수 있음을 추가로 시사한다.
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SEQUENCE LISTING
<110> KORANEX CAPITAL
<120> NEOGLYCOCONJUGATES AS VACCINES AND THERAPEUTIC TOOLS
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<141> 2020-09-18
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<151> 2020-08-03
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<170> PatentIn version 3.5
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1 5 10 15
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50 55 60
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100 105 110
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210 215 220
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Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
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275 280 285
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
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Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
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595 600 605
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His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
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740 745 750
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Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
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820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
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Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
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Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
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Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn
1010 1015 1020
Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys
1025 1030 1035
Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
1040 1045 1050
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val
1055 1060 1065
Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His
1070 1075 1080
Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn
1085 1090 1095
Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln
1100 1105 1110
Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val
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Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro
1130 1135 1140
Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn
1145 1150 1155
His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn
1160 1165 1170
Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu
1175 1180 1185
Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu
1190 1195 1200
Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu
1205 1210 1215
Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met
1220 1225 1230
Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro
1250 1255 1260
Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270
Claims (64)
- 다음을 포함하는 신생 당접합체의 생산 방법:
(a) 제1 말단 및 제2 말단을 갖는 링커를 포함하는 신생 탄수화물 항원 또는 신생 탄수화물 항원 중간체를 제공하는 단계(제1 말단은 티오 에테르 결합을 통해 탄수화물 항원에 접합되고 제2 말단은 유리 아민 기와 반응할 수 있는 작용기를 포함하고, 작용기는 -COX, -SO2X, -O-C(O)-X, -N=C=O, 또는 -N=C=S이고, X는 이탈기임);
(b) 하나 이상의 유리 아민 기를 갖는 운반체 단백질 또는 펩티드를 제공하는 단계; 및
(c) 커플링 반응을 수행하여 하나 이상의 정제된 신생 탄수화물 항원 또는 신생 탄수화물 항원 중간체를 아미드, 카바메이트, 설폰아미드, 우레아 또는 티오우레아 결합을 통해 하나 이상의 유리 아민 기에서 운반체 단백질 또는 펩티드에 접합시켜, 신생 당접합체를 생산하는 단계. - 제1항에 있어서, 단계 (a) 전에, (a)의 신생 탄수화물 항원 또는 신생 탄수화물 항원 중간체는 다음을 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인 방법:
(i) 말단 알켄에 공유 연결된 탄수화물 항원(알케닐 탄수화물 항원)을 제공하는 단계(말단 알켄은 티올-엔 반응을 통해 티올 기에 직접 접합될 수 있음);
(ii) 제1 말단에 제1 작용기 및 제2 말단에 제2 작용기를 포함하는 티오-링커를 제공하는 단계(제1 작용기는 유리 티올 기이고 제2 작용기는 카르복실 기, 설핀산 기, 탄산 기, 이소시아네이트 기, 또는 티오시아네이트 기임);
(iii) 광촉매 티올-엔 반응을 수행하여 알케닐 탄수화물 항원을 제1 말단의 티오-링커에 직접 접합시킴으로써, 제1 말단에 탄수화물 항원 및 제2 말단에 제2 작용기를 포함하는 신생 탄수화물 항원을 생산하는 단계;
(iv) 제2 작용기가 카르복실 기, 설핀산 기 또는 탄산 기인 경우, 카르복실 기, 설핀산 기 또는 탄산 기의 말단 하이드록실 기를 폴리펩티드의 유리 아민 기에 대한 접합을 위한 더 나은 이탈기로 대체하여 신생 탄수화물 항원을 신생 탄수화물 항원 중간체로 전환시키는 단계; 및
(v) 신생 탄수화물 항원 또는 신생 탄수화물 항원 중간체를 정제하는 단계. - 제2항에 있어서, (iii)의 광촉매 티올-엔 반응은 탄수화물 항원의 항원성 및/또는 구조를 유지하는 반응 조건 하에서 수행되는 것인 방법.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 광촉매 티올-엔 반응은 촉매의 존재 하에 수행되고, 촉매는
- 수용성 촉매, 예컨대, 수용성 유리 라디칼 생성 아조 화합물; 2,2'-아조비스[2-(2-이미다졸린-2-일)프로판]디하이드로클로라이드(Vazo 44 또는 VA-044); 2,2'-아조비스(2-아미디노프로판) 디하이드로클로라이드(AAPH); 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(LAP); 광개시제 활성을 갖는 금속 또는 금속 이온; 과산화물; tert-부틸 하이드로퍼옥사이드; 벤조일퍼옥사이드; 암모늄 퍼설페이트; 또는 광개시제 활성을 갖는 이의 임의의 유도체; 또는
- 수불용성 촉매, 예컨대 수불용성 유리 라디칼 생성 아조 화합물, 2,2-디메톡시-2-페닐아세토페논(DMPA), 아조비스이소부티로니트릴(AIBN), 2,2'-아조비스(2-메틸프로피오니트릴), 4,4'-아조비스(4-시아노펜탄산)(ACVA), 1,1'-아조비스(시아노시클로헥산)(ACHN), 디아젠디카르복실산 비스(N,N-디메틸아미드)(TMAD); 아조디카르복실산 디피페리디드(ADD), 또는 광개시제 활성을 갖는 이의 임의의 유도체인 방법. - 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광촉매 티올-엔 반응은 자외선 광(예를 들어, 단파 자외선 광, 예컨대 약 254 nm, 또는 장파 자외선 광, 예컨대, 약 355 nm 또는 365 nm) 하의 조사를 포함하는 것인 방법.
- 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
- 상기 광촉매 티올-엔 반응은 티오-링커의 유리 티올 기당 알케닐 탄수화물 항원의 1 내지 200 또는 1 내지 100 몰 당량 사이의 반응을 포함하거나;
- 상기 광촉매 티올-엔 반응은 10 내지 300, 10 내지 270, 10 내지 240, 10 내지 210, 10 내지 180, 10 내지 150, 10 내지 120, 10 내지 90, 10 내지 60, 또는 10 내지 30분 동안 수행되거나;
- 약 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 또는 4.0, 내지 약 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 또는 10의 pH에서 수행되거나; 또는
- 이들의 임의의 조합인 방법. - 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탄수화물 항원은 O-글리코시드 결합, S-글리코시드 결합, N-글리코시드 결합 또는 C-글리코시드 결합과 같은 글리코시드 결합, 또는 알릴 아민과 환원당 사이에서와 같은 환원성 아민화에 의해 수득된 결합을 통해, 바람직하게는 링커를 이용하여, 말단 알켄에 연결되는 것인 방법.
- 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, (ii)의 티오-링커는 다음의 구조를 포함하는 것인 방법:
(화학식에서
- Y는 -(CH2)n- 또는 -(OCH2CH2O)n-이고;
- Z는 -CO2H, -SO2H, -O-C(O)-H, -N=C=O, 또는 -N=C=S이고;
- O는 1, 2, 3, 4, 또는 5이거나; O는 0이고 Z는 -CO-이고 Y는 -(OCH2CH2O)n-이거나; 또는 O는 0이고 Z는 -SO2-이고 Y는 -(OCH2CH2O)n-임). - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 탄수화물 항원, 알케닐 탄수화물 항원, 신생 탄수화물 항원, 신생 탄수화물 항원 중간체, 및/또는 신생 당접합체의 탄수화물 부분은 방법 전반에 걸쳐 보호되지 않은 채로 남아 있는 것인 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 이탈기는 활성 에스테르 기(예를 들어, 플루오로페닐 기(예를 들어, OPhF5, OPhF4(파라 SO3Na)), 또는 숙신이미딜 기)인 것인 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 동일한 운반체 단백질 또는 펩티드에 존재하는 아스파르트산/글루탐산 잔기 및 ε-리신 아민 사이의 운반체 단백질 또는 펩티드 자가 가교형성을 회피하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 운반체 단백질 또는 펩티드에 접합된 신생 탄수화물 항원의 수가 반응물의 효능 및/또는 화학량론(예를 들어, 운반체 단백질 또는 펩티드 대 신생 탄수화물 항원 또는 신생 탄수화물 항원 중간체의 몰비)에 의해 제어되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 탄수화물 항원은
- 종양 관련 탄수화물 항원(TACA)(예컨대, Tn, S-Tn, 톰슨 프라이덴리히(Thomsen-Friedenreich)(TF), (2,3)-S-TF, (2,6)-S-TF, Globo H, PSA, GD2, GD3, GM2, GM3, N-글리콜릴-GM3, 푸코실 GM1, Lea, sLea, Lex, sLex, Ley, 또는 이들의 임의의 조합);
- 바이러스 다당류 항원; 또는
- 박테리아 협막 다당류(CPS)(예를 들어, 폐렴구균 및/또는 연쇄상구균 다당류 혈청형, 수막구균 CPS, 또는 인플루엔자 CPS(예컨대, 인플루엔자 유형 a 또는 b CPS)이거나, 이로부터 유래되거나, 이를 포함하는 CPS)이거나 이를 포함하는 것인 방법. - 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, (c)의 커플링 반응은 적어도 2개의 동일한 신생 탄수화물 항원 또는 1개 초과 유형의 신생 탄수화물 항원을 운반체 단백질 또는 펩티드에 접합시켜, 다가의 신생 당접합체(예를 들어, 운반체 단백질 또는 펩티드에 접합된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 동일하거나 상이한 유형의 신생 탄수화물 항원을 포함하는 다가의 신생 당접합체)를 생산하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 운반체 단백질 또는 펩티드는 예를 들어, 운반체 단백질 또는 펩티드의 아미노 말단, 카르복시 말단 또는 용매 접근 가능 위치에, 1개 이상의 추가 리신 잔기를 부가하도록 조작된 단백질 또는 펩티드인 것인 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 운반체 단백질 또는 펩티드는 파상풍 톡소이드(TT), 디프테리아 톡소이드(DT), 교차 반응 물질 197(CRM197), 수막구균 외막 단백질 복합체(OMPC), H. 인플루엔자 단백질 D(HiD), 사이토카인, 면역원성 펩티드, 예컨대, 파상풍 독소 831-844(서열번호 1 또는 2), 알부민(예컨대, 소 혈청 알부민 또는 인간 혈청 알부민), 열쇠구멍삿갓조개헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin, KLH), 또는 이의 면역원성 단편이거나, 이로부터 유래하거나, 또는 이를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 신생 당접합체는 다음의 구조를 갖는 것인 방법:
(화학식에서
- CA는 탄수화물 항원이거나 이를 포함하고;
- CP-NH는 하나 이상의 아민 기를 갖는 운반체 단백질 또는 펩티드이고;
- X는 O, S, NR1, 또는 CH2이고;
- R1은 H, COH(포름아미드), COMe, 또는 COEt이고;
- m은 1, 2, 3, 4, 또는 5이고;
- Y는 -(CH2)n- 또는 -(OCH2CH2O)n-이고;
- n은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고;
- o는 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이거나; o는 0이고 Z는 -CO-이고 Y는 -(OCH2CH2O)n-이거나; 또는 o는 0이고 Z는 -SO2-이고 Y는 -(OCH2CH2O)n-이고;
- Z는 -CO-, -NR2SO2-, -OCO-, -NR2CO-, 또는 -NR2CS-이고,
- R2는 H, Me, 또는 Et이고; 그리고
- p는 1 내지 50임). - 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 신생 당접합체는 신생 당접합체 면역원이고, 운반체 단백질 또는 펩티드는 대상체에게 투여 시 면역원성이고, 티오-링커를 통한 운반체 단백질 또는 펩티드에 대한 탄수화물 항원의 접합은 대상체에게 투여 시 비접합 탄수화물 항원의 상응하는 투여와 비교하여 탄수화물 항원의 면역원성을 증가시키는 것인 방법.
- 제18항에 있어서, 티오-링커는 대상체에 대해 비-면역원성이어서, 대상체에 대한 신생 당접합체 면역원의 투여가 신생 당접합체 면역원에 포함된 티오-링커에 대한 항체를 유발시키지 않는 것인 방법.
- 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 신생 탄수화물 항원은 운반체 단백질 또는 펩티드에 접합 후 대상체의 내인성 효소에 의해 운반체 단백질 또는 펩티드로부터 절단될 수 없는 것인 방법.
- 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 신생 탄수화물 항원은 B 세포 에피토프를 포함하고/하거나, 대상체에서 체액성 면역 반응을 유도하고/하거나; T 세포 에피토프를 포함하고/하거나, 대상체에서 세포 매개 면역 반응을 유도하는 것인 방법.
- 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 운반체 단백질 또는 펩티드는 인간 T 세포 에피토프를 포함하고/하거나, 대상체에서 세포 매개 면역 반응을 유도하는 것인 방법.
- 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 신생 당접합체 면역원은 대상체에게 투여 시 탄수화물 항원에 대한 세포 매개 면역 반응을 유도하는 것인 방법.
- 제1 말단 및 제2 말단을 갖는 링커를 포함하는 신생 탄수화물 항원 또는 신생 탄수화물 항원 중간체로서, 제1 말단은 티오 에테르 결합을 통해 탄수화물 항원에 접합되고 제2 말단은 유리 아민 기와 반응할 수 있는 작용기를 포함하고, 작용기는 -COX, -SO2X, -O-C(O)-X, -N=C=O, 또는 -N=C=S이고, X는 이탈기인 신생 탄수화물 항원 또는 신생 탄수화물 항원 중간체.
- 제24항에 있어서,
- 탄수화물 항원은 보호되지 않은 것이거나;
- 이탈기는 제10항에 정의된 바와 같은 것이거나;
- 탄수화물 항원은 제13항에 정의된 바와 같은 것이거나; 또는
- 이들의 임의의 조합인 것인,
신생 탄수화물 항원 또는 신생 탄수화물 항원 중간체. - 제1 말단 및 제2 말단을 갖는 링커를 포함하는 합성 신생 당접합체로서, 제1 말단은 티오 에테르 결합을 통해 탄수화물 항원에 접합되고 제2 말단은 아미드, 카바메이트, 설폰아미드, 우레아 또는 티오우레아 결합을 통해 내부의 하나 이상의 유리 아민 기에서 운반체 단백질 또는 펩티드에 접합되는 것인 합성 신생 당접합체.
- 링커를 통해 운반체 단백질 또는 펩티드(CP-NH)의 하나 이상의 아민 기에 접합된 하나 이상의 탄수화물 항원(CA)을 포함하는 합성 신생 당접합체로서, 다음의 구조를 갖는 합성 신생 당접합체:
(화학식에서
- X는 O, S, NR1, 또는 CH2이고;
- R1은 H, COH(포름아미드), COMe, 또는 COEt이고;
- m은 1, 2, 3, 4, 또는 5이고;
- Y는 -(CH2)n- 또는 -(OCH2CH2O)n-이고;
- n은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고;
- o는 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이거나; o는 0이고 Z는 -CO-이고 Y는 -(OCH2CH2O)n-이거나; 또는 o는 0이고 Z는 -SO2-이고 Y는 -(OCH2CH2O)n-이고;
- Z는 -CO-, -NR2SO2-, -OCO-, -NR2CO-, 또는 -NR2CS-이고;
- R2는 H, Me, 또는 Et이고; 그리고
- p는 1 내지 50임). - 제26항 또는 제27항에 있어서,
- 탄수화물 항원은 보호되지 않은 것이거나;
- 탄수화물 항원은 제13항에 정의된 바와 같은 것이거나;
- 신생 당접합체는 제14항에 정의된 바와 같은 다가의 신생 당접합체이거나;
- 운반체 단백질 또는 펩티드는 제15항, 제16항, 제18항, 또는 제22항에 정의된 바와 같거나;
- 신생 당접합체는 제17항에 정의된 바와 같은 구조를 갖거나;
- 링커는 제19항에 정의된 바와 같은 것이거나;
- 신생 탄수화물 항원은 제20항 또는 제21항에 정의된 바와 같은 것이거나;
- 합성 신생 탄수화물은 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산되거나; 또는
- 이들의 임의의 조합인 것인 합성 신생 당접합체. - 신생 당접합체 백신 또는 적응적 면역 반응 유발 조성물을 생산하는 방법으로서, 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 신생 당접합체 또는 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 신생 당접합체를 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 보조제와 제형화하는 단계를 포함하는 방법.
- 제29항에 있어서, 보조제는 무기 화합물, 미네랄 오일, 미생물 유도체, 식물 유도체, 사이토카인, 스쿠알렌, 명반, 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄, 수산화 인산 칼슘, 톨 유사 수용체 효능제, 면역자극성 폴리뉴클레오티드(예컨대, CPG), 면역자극성 지질, 프로인트 보조제(Freund's adjuvant), RIBI의 보조제, QS-21, 무라밀 디펩티드, TiterMax, Steviune, Stimune 또는 이들의 임의의 조합이거나 이를 포함하는 것인 방법.
- 제29항 또는 제30항의 방법에 의해 생산되고/되거나 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 신생 당접합체 및 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 보조제를 포함하는 신생 당접합체 백신 또는 적응적 면역 반응 유발 조성물.
- 제31항에 있어서, (예를 들어, 종양 관련 탄수화물 항원을 발현하는 암, 예컨대, 유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer), 위암(stomach cancer), B 세포 림프종(B-cell lymphoma), 결장암(colon cancer), 폐암(lung cancer), 흑색종(melanoma), 신경모세포종(neuroblastoma), 난소암(ovarian cancer), 육종(sarcoma), 소세포 폐암(small cell lung cancer); 또는 탄수화물 항원을 발현하는 바이러스 또는 박테리아에 대한) 예방적 백신 또는 치료적 백신인 것인 신생 당접합체 백신.
- 대상체를 면역화, 백신 접종 또는 치료하는 방법으로서, 대상체에게 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 신생 당접합체, 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항의 합성 신생 당접합체, 제29항 또는 제30항의 방법에 의해 생산된 신생 당접합체 백신 또는 적응적 면역 반응 유발 조성물, 또는 제31항 또는 제32항의 신생 당접합체 백신을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 질환(예를 들어, 종양 관련 탄수화물 항원을 발현하는 암, 예컨대, 유방암, 전립선암, 위암, B 세포 림프종, 결장암, 폐암, 흑색종, 신경모세포종, 난소암, 육종, 소세포 폐암; 또는 탄수화물 항원을 발현하는 바이러스 또는 박테리아)를 갖는 대상체를 면역화, 백신 접종, 또는 치료하는 데 사용하기 위한, 또는 (예를 들어, 대상체로부터의 생물학적 샘플 내에서) 신생 당접합체에 특이적으로 결합하는 항체의 존재를 검출하기 위한, 또는 상기 면역화, 백신 접종 또는 치료를 검출하기 위한, 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 신생 당접합체, 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항의 합성 신생 당접합체, 제29항 또는 제30항의 방법에 의해 생산된 신생 당접합체 백신 또는 적응적 면역 반응 유발 조성물, 또는 제31항 또는 제32항의 신생 당접합체 백신.
- 질환(예를 들어, 종양 관련 탄수화물 항원을 발현하는 암, 예컨대, 유방암, 전립선암, 위암, B 세포 림프종, 결장암, 폐암, 흑색종, 신경모세포종, 난소암, 육종, 소세포 폐암; 또는 탄수화물 항원을 발현하는 바이러스 또는 박테리아)를 갖는 대상체를 면역화, 백신 접종, 또는 치료하기 위한, 또는 (예를 들어, 대상체로부터의 생물학적 샘플 내에서) 신생 당접합체에 특이적으로 결합하는 항체의 존재를 검출하기 위한, 또는 상기 면역화, 백신 접종 또는 치료를 검출하기 위한, 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 신생 당접합체, 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항의 합성 신생 당접합체, 제29항 또는 제30항의 방법에 의해 생산된 신생 당접합체 백신 또는 적응적 면역 반응 유발 조성물, 또는 제31항 또는 제32항의 신생 당접합체 백신의 용도.
- 질환(예를 들어, 종양 관련 탄수화물 항원을 발현하는 암, 예컨대, 유방암, 전립선암, 위암, B 세포 림프종, 결장암, 폐암, 흑색종, 신경모세포종, 난소암, 육종, 소세포 폐암; 또는 탄수화물 항원을 발현하는 바이러스 또는 박테리아)를 갖는 대상체의 면역화 또는 치료용, 또는 (예를 들어, 대상체로부터의 생물학적 샘플 내에서) 신생 당접합체에 특이적으로 결합하는 항체의 존재 검출용, 또는 상기 면역화 또는 치료 검출용 백신의 제조를 위한, 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 신생 당접합체, 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항의 합성 신생 당접합체, 제29항 또는 제30항의 방법에 의해 생산된 적응적 면역 반응 유발 조성물의 용도.
- 탄수화물 항원의 증가된 발현과 관련된 질환(예를 들어, 암, 예컨대, 유방암, 전립선암, 위암, B 세포 림프종, 결장암, 폐암, 흑색종, 신경모세포종, 난소암, 육종, 소세포 폐암; 또는 탄수화물 항원을 발현하는 바이러스 또는 박테리아)을 갖는 대상체의 치료를 위한 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 신생 당접합체, 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항의 합성 신생 당접합체, 제29항 또는 제30항의 방법에 의해 생산된 신생 당접합체 백신 또는 적응적 면역 반응 유발 조성물, 또는 제31항 또는 제32항의 신생 당접합체 백신의 용도.
- 신생 당접합체에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하기 위한, 또는 신생 당접합체 면역원에 특이적으로 결합하는 항체를 검출하기 위한, 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 신생 당접합체, 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항의 합성 신생 당접합체, 제29항 또는 제30항의 방법에 의해 생산된 신생 당접합체 백신 또는 적응적 면역 반응 유발 조성물, 또는 제31항 또는 제32항의 신생 당접합체 백신의 용도.
- 탄수화물 항원 또는 탄수화물 항원을 포함하는 종양 순환 세포에 특이적으로 결합하는 항체의 존재를 검출 또는 스크리닝하기 위한, 또는 탄수화물 항원을 이용한 면역화 또는 백신 접종으로 인한 항체의 존재를 검출하기 위한, 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 신생 당접합체, 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항의 합성 신생 당접합체, 제29항 또는 제30항의 방법에 의해 생산된 신생 당접합체 백신 또는 적응적 면역 반응 유발 조성물, 또는 제31항 또는 제32항의 신생 당접합체 백신의 용도.
- 제39항에 있어서, 검출 또는 스크리닝은 면역흡착 분석, ELISA, 마이크로어레이, 또는 면역블롯 분석과 같은 임의의 적합한 검출 방법을 통해 수행되는 것인 용도.
- 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에서 탄수화물 항원에 대한 면역 반응을 생성하기 위하여, 임의의 선행하는 청구항에 정의된 바와 같은 또는 임의의 선행하는 청구항에 의해 정의된 바와 같은 방법에 의해 생산된 신생 당접합체 또는 신생 당접합체 면역원을 투여하는 단계 및 선택적으로 탄수화물 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 존재에 대해 상기 대상체로부터의 생물학적 샘플을 스크리닝하는 단계를 포함하는 방법.
- SARS-CoV-2에 대해 대상체를 면역화하는 데 사용하기 위한, 대상체에서 항-SARS-CoV-2 항체의 생산을 유발하는 데 사용하기 위한, 또는 대상체로부터의 샘플 내의 항-SARS-CoV-2 항체의 존재를 검출하는 데 사용하기 위한 당접합체로서, 적합한 운반체 물질(예를 들어, 운반체 단백질 또는 펩티드)에 접합된 탄수화물 항원을 포함하고, 탄수화물 항원은 시알릴화 Thomsen-Friedenreich(TF) 항원, 비시알릴화 TF 항원, 시알릴화 Tn 항원, 비시알릴화 Tn 항원, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하거나 이로 구성되는 것인 당접합체.
- 제42항에 있어서, 탄수화물 항원은 시알릴화 TF 항원(예를 들어, (2,3)-S-TF 및/또는 디시알릴 코어 1)을 포함하거나 이로 구성되는 것인, 당접합체.
- 제42항 또는 제43항에 있어서, 탄수화물 항원은 Tn(예를 들어, 시알릴화 및/또는 비시알릴화 Tn)을 포함하거나 이로 구성되는 것인, 당접합체.
- 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 운반체 물질은 B 세포 에피토프 또는 T 세포 에피토프인 펩티드를 포함하는 것인, 당접합체.
- 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 탄수화물 항원은 서열번호 3의 펩티드의 위치 4 및/또는 6, 또는 위치 4 및/또는 6에 시스테인 또는 리신을 포함하는 서열번호 3의 펩티드의 변이체에 공유적으로 접합되는 것인, 당접합체.
- 제46항에 있어서, 서열번호 3의 펩티드 또는 펩티드 변이체는 운반체 물질에 포함되거나 이에 융합되는 것인, 당접합체.
- 제42항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 운반체 물질은 파상풍 톡소이드(TT), 디프테리아 톡소이드(DT), 교차 반응 물질 197(CRM197), 수막구균 외막 단백질 복합체(OMPC), H. 인플루엔자 단백질 D(HiD), 바이러스 유사 입자(VLP), 사이토카인, 면역원성 펩티드, 예컨대, 파상풍 독소 831-844(서열번호 1 또는 2), 알부민(예컨대, 소 혈청 알부민 또는 인간 혈청 알부민), 열쇠구멍삿갓조개헤모시아닌(KLH), 또는 이의 면역원성 단편이거나, 이로부터 유래하거나, 이를 포함하는 것인, 당접합체.
- 제42항 내지 제48항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 당접합체로서, (i) 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 신생 당접합체 또는 이러한 방법에서 정의된 바와 같은 신생 당접합체; (ii) 제24항 또는 제25항의 신생 탄수화물 항원; (iii) 제27항 또는 제28항의 합성 신생 당접합체; 또는 (iv) 제29항 또는 제30항의 방법에 정의된 바와 같거나 이에 의해 생산된, 또는 제31항 또는 제32항에 정의된 바와 같은, 신생 당접합체 백신 또는 적응적 면역 반응 유발 조성물인 당접합체.
- 제42항 내지 제48항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 당접합체로서, 다음을 포함하는 방법에 의해 생산된 당접합체: (a) 말단 알켄에 공유 연결된 수용성 탄수화물 항원(알케닐 탄수화물 항원)을 제공하는 단계(말단 알켄은 티올-엔 반응을 통해 티올 기에 직접 접합될 수 있고, 알케닐 탄수화물 항원은 보호되지 않은 수용성 알케닐 탄수화물 항원임); (b) 하나 이상의 유리 티올 기를 갖는 운반체 물질을 제공하는 단계; 및 (c) 광촉매 티올-엔 반응을 수행하여 탄수화물 항원을 하나 이상의 유리 티올 기에서 물질에 직접 접합시켜 당접합체를 생산하는 단계.
- 제50항에 있어서,
- 광촉매 티올-엔 반응은 운반체 물질 변성을 회피하고/하거나 운반체 물질의 활성, 항원성 및/또는 구조를 유지하는 반응 조건 하에서 수행되고/되거나;
- 광촉매 티올-엔 반응은 임의의 유기 용매의 부재 하에 수행되거나, 또는 상기 광촉매 티올-엔 반응은 운반체 물질 변성을 회피하기에 충분히 낮은 농도의 유기 용매의 존재 하에 수행되고/되거나;
- 광촉매 티올-엔 반응은 촉매의 존재 하에 수행되고, 촉매는 수용성 촉매, 예컨대, 수용성 유리 라디칼 생성 아조 화합물; 2,2'-아조비스[2-(2-이미다졸린-2-일)프로판]디하이드로클로라이드(Vazo 44 또는 VA-044); 2,2'-아조비스(2-아미디노프로판) 디하이드로클로라이드(AAPH); 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(LAP); 광개시제 활성을 갖는 금속 또는 금속 이온; 과산화물; tert-부틸 하이드로퍼옥사이드; 벤조일퍼옥사이드; 암모늄 퍼설페이트; 또는 광개시제 활성을 갖는 이의 임의의 유도체; 또는 수불용성 촉매, 예컨대 수불용성 유리 라디칼 생성 아조 화합물, 2,2-디메톡시-2-페닐아세토페논(DMPA), 아조비스이소부티로니트릴(AIBN), 2,2'-아조비스(2-메틸프로피오니트릴), 4,4'-아조비스(4-시아노펜탄산)(ACVA), 1,1'-아조비스(시아노시클로헥산)(ACHN), 디아젠디카르복실산 비스(N,N-디메틸아미드)(TMAD); 아조디카르복실산 디피페리디드(ADD), 또는 광개시제 활성을 갖는 이의 임의의 유도체이고/이거나;
- 광촉매 티올-엔 반응은 자외선 광 하의 조사를 포함하고/하거나;
- 광촉매 티올-엔 반응은 운반체 물질의 유리 티올 기당 알케닐 탄수화물 항원의 1 내지 200 몰 당량 사이의 반응을 포함하고/하거나; 상기 광촉매 티올-엔 반응은 10 내지 300, 10 내지 270, 10 내지 240, 10 내지 210, 10 내지 180, 10 내지 150, 10 내지 120, 10 내지 90, 10 내지 60, 또는 10 내지 30분 동안, 및/또는 운반체 물질의 총 유리 티올 농도의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50배의 감소를 달성하는 데 충분한 시간 동안 수행되고/되거나;
- 광촉매 티올-엔 반응은 운반체 물질 변성을 회피하는 pH에서 수행되고/되거나;
- 광촉매 티올-엔 반응은 운반체 물질에 접합 후 대상체의 내인성 효소에 의해 운반체 물질로부터 절단될 수 없는 탄수화물 항원을 생산하고/하거나;
- 알케닐 탄수화물 항원은 말단 알켄에 공유적으로 연결되고/되거나, 탄수화물 항원은 O-글리코시드 결합, S-글리코시드 결합, N-글리코시드 결합 또는 C-글리코시드 결합, 또는 알릴 아민과 환원당 사이에서의 환원성 아민화에 의해 수득된 결합을 통해, 운반체 물질에 접합되고/되거나;
- 광촉매 티올-엔 반응은 1개 초과 유형의 탄수화물 항원을 운반체 물질에 접합시키고/시키거나;
- (a)의 탄수화물 항원은 링커를 통해 말단 알켄에 연결되고/되거나;
- 단계 (b)에 제공된 운반체 물질은 (i) 하나 이상의 유리 티올 기를 갖는 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 운반체 물질, (ii) 운반체 물질의 용매 접근가능 위치에 하나 이상의 추가 시스테인 잔기를 부가하도록 조작된 운반체 물질; (iii) 티올화제로 처리된 운반체 물질; (iv) 환원제로 처리된 운반체 물질; 또는 (v) (i) 내지 (iv)의 임의의 조합인 것인 당접합체. - 제42항 내지 제48항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 당접합체로서,
(a) 다음의 구조를 갖는 합성 당접합체:
(화학식에서 CA는 탄수화물 항원이고; S-CM은 접합에 이용가능한 z 황 원자를 갖는 운반체 물질(z는 적어도 1임)이고; X는 O, S, NR1, 또는 CH2이고; R1은 -H, -COH, -COCH3, 또는 -COEt이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; R 2 는 H 또는 Me임); 또는 이의 입체이성질체; 또는
(b) 다음의 구조를 갖는 합성 당접합체:
(화학식에서 CA는 탄수화물 항원이고; S-CM은 접합에 이용가능한 z 황 원자를 갖는 운반체 물질(z는 적어도 1임)이고; X는 S, NR1, CH2 또는 O이고; R 1 은 -H, -COH, -COMe, 또는 -COEt이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; R 2 는 H 또는 Me이고; q는 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; R 3 및 R 4 는 각각 수소 원자이고 m은 1, 2, 3, 4 또는 5이거나, 또는 R 3 및 R 4 는 함께 질소 원자에 연결된 카르보닐과 라디칼 -CO-CH2- 또는 라디칼 -CO-CH2-CH2-를 형성하고, m은 1임); 또는 이의 입체이성질체; 또는
(c) 다음의 구조를 갖는 합성 당접합체:
(화학식에서 CA는 탄수화물 항원이고; y는 적어도 1이고; y가 1 초과인 경우, CA는 동일하거나 상이하고; [S] z -CM은 접합에 이용가능한 z 황 원자를 갖는 운반체 물질(z는 적어도 y와 동일함)이고; L은 다음 구조를 갖는 링커로 구성된 군으로부터 선택되는 링커:
화학식에서 X는 O, S, NR1, 또는 CH2이고; R 1 은 -H, -COH, -COCH3, 또는 -COEt이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; R 2 는 H 또는 Me이고; y가 1 초과인 경우, L은 동일하거나 상이함); 또는 이의 입체이성질체; 또는
(d) 다음의 구조를 갖는 합성 당접합체:
(화학식에서 CA는 탄수화물 항원이고; y는 적어도 1이고; y가 1 초과인 경우, CA는 동일하거나 상이하고; S-CM은 접합에 이용가능한 z 황 원자를 갖는 운반체 물질(z는 적어도 1이고 적어도 y와 동일함)이고; L은 다음 구조를 갖는 링커로 구성된 군으로부터 선택되는 링커:
화학식에서 X는 S, NR1, CH2 또는 O이고; R 1 은 -H, -COH, -COMe, 또는 -COEt이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; R 2 는 H 또는 Me이고; q는 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; R 3 및 R 4 는 각각 수소 원자이고 m은 1, 2, 3, 4 또는 5이거나, 또는 R 3 및 R 4 는 함께 질소 원자에 연결된 카르보닐과 라디칼 -CO-CH2- 또는 라디칼 -CO-CH2-CH2-를 형성하고, m은 1이고; y가 1 초과인 경우, L은 동일하거나 상이함); 또는 이의 입체이성질체; 또는
(e) 다음의 구조를 갖는 합성 당접합체:
(화학식에서 CA는 탄수화물 항원이고; y는 적어도 1이고; y가 1 초과인 경우, CA는 동일하거나 상이하고; [S] z -CM은 접합에 이용가능한 z 황 원자를 갖는 운반체 물질(z는 적어도 y와 동일함)이고; L은 다음 구조를 갖는 링커로 구성된 군으로부터 선택되는 링커:
화학식에서 X는 S, NR1, CH2 또는 O이고; R 1 은 -H, -COH, -COMe, 또는 -COEt이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; R 2 는 H 또는 Me이고; q는 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; r은 1, 2, 3, 4 또는 5이고; R 5 는 S-CM, 공유 결합, 또는 다음 구조의 라디칼:
화학식에서 R 3 및 R 4 는 각각 수소 원자이고 m은 1, 2, 3, 4 또는 5이거나, 또는 R 3 및 R 4 는 함께 질소 원자에 연결된 카르보닐과 라디칼 -CO-CH2- 또는 라디칼 -CO-CH2-CH2-를 형성하고, m은 1이고; y가 1 초과인 경우, L은 동일하거나 상이함)임); 또는 이의 입체이성질체인 당접합체. - 제52항에 있어서,
- (e)에 정의된 바와 같은 구조를 갖고, 링커는 다음의 구조:
(화학식에서 X는 S, NR1, CH2 또는 O이고; R 1 은 -H, -COH, -COMe, 또는 -COEt이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; R 2 는 H 또는 Me이고; q는 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; r은 1, 2, 3, 4 또는 5임)를 갖거나;
- (e)에 정의된 바와 같은 구조를 갖고, 링커는 다음의 구조:
또는
(화학식에서 X는 S, NR1, CH2 또는 O이고; R 1 은 -H, -COH, -COMe, 또는 -COEt이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; R 2 는 H 또는 Me이고; q는 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; r은 1 또는 2임)를 갖거나;
- 운반체 물질은 중합체, 폴리펩티드, 운반체 단백질, 고체 지지체, 입자, 또는 광촉매 티올-엔 반응을 통해 탄수화물 항원에 접합시키기에 적합한 적어도 1개 이상의 유리 티올 기를 갖는 임의의 기타 물질이거나 이를 포함하거나;
- 접합체 물질은 적어도 2개의 동일한 탄수화물 항원 또는 1개 초과 유형의 탄수화물 항원에 커플링되어, 다가의 합성 당접합체를 생산하거나;
- 탄수화물 항원은 대상체의 내인성 효소에 의해 운반체 단백질로부터 절단될 수 없거나; 또는
- 이들의 임의의 조합인 당접합체. - 제42항 내지 제53항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 1개 이상의 당접합체 및 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 보조제를 포함하는 SARS-CoV-2 백신.
- 제54항에 있어서, 적어도 2개의 상이한 당접합체를 포함하고, 각각의 당접합체는 시알릴화 TF 항원(모노- 또는 디-시알릴화 TF 항원), 비시알릴화 TF 항원, 시알릴화 Tn 항원 및 비시알릴화 Tn 항원으로부터 선택되는 적어도 2개의 상이한 탄수화물 항원에 접합된 운반체 물질을 포함하는 것인 SARS-CoV-2 백신.
- 제42항 내지 제53항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 당접합체 또는 제54항 또는 제55항의 SARS-CoV-2 백신으로서, 당접합체 또는 백신은 SARS-CoV-2 비리온 입자에 결합하고 바람직하게는 중화 활성을 갖는 항체의 생산을 유도하는 것인 당접합체 또는 SARS-CoV-2 백신.
- SARS-CoV-2에 대해 대상체에게 백신을 접종하거나 또는 대상체에서 항-SARS-CoV-2 항체의 생산을 유발하는 방법으로서, 제42항 내지 제53항 또는 제56항 중 어느 한 항의 당접합체 또는 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항의 SARS-CoV-2 백신을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- SARS-CoV-2 바이러스에 의한 감염으로부터 대상체를 보호하기 위한, 또는 COVID-19를 치료하기 위한 조성물로서, SARS-CoV-2 S 단백질에 발현된 O-연결 글리칸에 결합하는 하나 이상의 리간드(예를 들어, 항체, 항체 단편, 또는 렉틴)를 포함하고, O-연결 글리칸은 시알릴화 TF 항원(모노- 또는 디-시알릴화 TF 항원), 비시알릴화 TF 항원, 시알릴화 Tn 항원, 비시알릴화 Tn 항원, 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물.
- 제58항에 있어서, 하나 이상의 리간드는 재조합 단클론 항체(예를 들어, JAA-F11 또는 인간화 JAA-F11)를 포함하는 것인, 조성물.
- 제58항에 있어서, 하나 이상의 리간드는 (예를 들어, 시알릴화 및 비시알릴화 TF 항원 형태 둘 다에 결합하는) 렉틴을 포함하는 것인, 조성물.
- 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 렉틴은 자칼린이거나 자칼린 관련 렉틴인, 조성물.
- 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 비강 내 조성물로서 제형화되는, 조성물.
- 다음을 포함하는 복합체: (a) 시알릴화 TF 항원(모노- 또는 디-시알릴화 TF 항원), 비시알릴화 TF 항원, 시알릴화 Tn 항원, 비시알릴화 Tn 항원 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 O-연결 글리칸을 발현하는 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 단편; 및 (b) O-연결 글리칸에서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 단편에 결합된 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 정의된 리간드.
- 제63항에 있어서, SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 단편은 온전한 SARS-CoV-2 비리온 입자에 포함되는 것인 복합체.
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