KR20220112593A

KR20220112593A - 눈향나무 잎 추출물을 포함하는 어병 세균의 생장 억제용 조성물

Info

Publication number: KR20220112593A
Application number: KR1020210016316A
Authority: KR
Inventors: 박미진; 안병준; 함영석; 양지윤
Original assignee: 대한민국(산림청 국립산림과학원장)
Priority date: 2021-02-04
Filing date: 2021-02-04
Publication date: 2022-08-11
Also published as: KR102511159B1

Abstract

본 발명의 조성물이 포함하는 눈향나무 잎 추출물은 자연 유래 소재로, 어병 세균에 대하여 높은 항세균 효과를 나타냄으로써, 어병 세균을 제어하여 감염 질병 피해를 예방 또는 제어할 수 있는 친환경 소재로써의 가능성을 제안한다. 또한, 무분별하게 사용되는 기존의 항생제를 일부 보완하거나 대체할 수 있을 것으로 사료된다. 이러한 효과를 나타내는 눈향나무 잎 추출물은 사료 첨가제, 수질 개선제 등에 첨가함으로써 항생제 사용으로 인한 밀집형 양식 산업의 내성 균주 발생 문제점을 해소하는데 일부 기여할 수 있을 것이라 기대되는 바이다. 또한, 어병 세균에 의해 야기되는 인수공통감염병의 예방 및 치료용 약학적 조성물 또는 첨가제로써 활용될 수 있을 것이라 기대한다.

Description

눈향나무 잎 추출물을 포함하는 어병 세균의 생장 억제용 조성물{Composition for inhibiting the growth of fish disease bacteria containing extracts of leaves of Juniperus chinensis var. sargentii}

본 발명은 눈향나무 잎 추출물에 관련된 것으로서, 이를 이용한 어병 생장 억제용 조성물, 어병 세균성 질병의 예방 또는 치료용 조성물, 어병 세균으로부터 유발된 인수공통감염병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 어류에 대한 어병 세균성 질병의 예방 또는 치료방법에 관련된 것이다.

어업 기술이 고도화됨에 따라 그 규모가 거대화되고 대량 생산이 가능해졌다. 그러나, 제한된 장소에서 사육하는 방식의 밀집형 양식산업은 주변의 수질 관리가 어렵기 때문에 환경 오염 등의 문제를 발생시킨다. 이로 인해 어병 세균에 대한 감염 빈도가 증가하고, 좁은 공간에서 빠르게 질병이 전염되기 때문에 막대한 경제적 손실이 야기된다. 어종에 따른 세균성 질병에는 차이가 있지만, 주로 Streptococcus iniae, S. parauberis와 Lactococcus garvieae에 의한 streptococcosis, Edwardsiella tarda에 의한 edwardsiellosis가 있으며, 최근에는 Photobacterium damselae에 의한 vibriosis 등에 의한 피해가 보고되고 있다. 이들은 넙치의 세균성 질병을 유발하는 대표적인 감염성 병원균으로, 세균에 감염된 넙치는 출혈, 복부팽만, 신장 비대 등의 증상이 나타나고 결국에는 폐사로 이어진다.

S. iniae를 비롯한 일부 세균은 어류 뿐만 아니라 인간에게도 감염되어 질병을 유발하는 인수공통전염병 (zoonosis) 세균으로 알려져 있다. 이에 사람들은 어병 세균에 의한 질병을 치료 또는 예방함으로써, 어류의 사망률을 낮추고 어류 생산량을 늘리기 위해서 사료나 물에 항생제를 투여했다. 그러나, 항생제의 지속적인 사용과 무분별한 오ㆍ남용은 내성 균주의 출현을 초래할 뿐만 아니라, 환경 생태계의 교란을 야기할 가능성이 있다. 그러므로, 이러한 항생제 사용으로 인한 부작용을 최소화하고, 어병 세균을 효과적으로 제어할 수 있는 자연 유래의 대체 항생제 소재의 개발이 주목받고 있다.

천연 자원인 정유는 주로 향이 있는 식물에서 분리되는 2차 대사 물질 중 하나로, 그 성분은 주로 terpene류의 휘발성 방향 화합물로 구성되어 있다. 침엽수는 정유 함량이 높은 대표적인 식물로, 피톤치드 (phytoncide)라고도 불리는 정유는 다양한 그람 음성 세균과 양성 세균에 대하여 강한 항균 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 항산화, 항진균, 살충 효과 등 다양한 생물학적 효능이 있다고 알려져 있다. 정유를 포함하는 천연물의 어병 세균에 대한 항세균 활성 연구가 진행되고 있으나, 침엽수 측백나무과에 속하는 눈향나무 잎 정유에 대한 효능은 현재까지 알려진 바 없다. 이에 본 발명은 눈향나무 (Juniperus chinensis var. sargentii A. Henry) 잎 정유의 어병 세균에 대한 항세균 활성을 평가하고, 이를 통해, 눈향나무 잎 유래 정유가 어병 세균 감염에 의한 질병의 예방이나 수산용 의약품 등으로 활용 가능성을 확인하고자 하였다.

한국등록특허 제1869645호

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 눈향나무 잎 추출물을 이용한 어병 생장 억제용 조성물, 어병 세균성 질병의 예방 또는 치료용 조성물, 어병 세균으로부터 유발된 인수공통감염병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 어류에 대한 어병 세균성 질병의 예방 또는 치료방법을 제공함에 있다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 당업계 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 일 양태로서, 눈향나무 잎 추출물을 포함하는 어병 세균의 생장 억제용 조성물을 제공한다.

상기 추출물은 눈향나무 잎을 구성하는 다양한 부위에 대한 추출물을 모두 포괄하는 것으로 해석될 수 있고, 바람직하게는 테르펜(terpene) 계열의 화합물을 추출물 내 보다 많이 포함할 수 있도록 하는 측면에서 가장 바람직하게는 잎의 정유(essential oil)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 추출물은 눈향나무 잎에 존재하는 유효성분을 추출해낼 수 있는 방법에 의한 추출물이라면 특별히 제한되지 않고, 구체적으로는 냉침 추출물, 초음파 추출물, 환류 냉각 추출물, 상온 추출물, 열수 추출물 또는 증기증류 추출물일 수 있으며, 바람직한 일 실시예에 따를 때 증기증류(hydrodistillation) 추출물일 수 있다.

상기 추출물은 70 내지 150, 70 내지 140, 70 내지 130, 70 내지 120, 75 내지 150, 75 내지 140, 75 내지 130, 75 내지 120, 80 내지 150, 80 내지 140, 80 내지 130 또는 80 내지 120℃의 온도조건에서의 증기증류에 의한 추출물일 수 있고, 눈향나무 잎에 존재하는 유효성분을 효과적으로 추출하면서도 이를 변성하지 않도록 하는 효과를 고려할 때 바람직하게는 80 내지 120℃의 증기증류에 의한 추출물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 추출물은 눈향나무 잎에 존재하는 유효성분을 다양하게 포함하고 있는 것으로서, 구체적으로 트리사이클렌(tricyclene), α-피넨(α-pinene), β-미르센(β-myrcene), (+)-카렌((+)-carene), D-리모넨(D-limonene), 사비넨(sabinene), β-오시멘(β-ocimene), γ-테르피넨(γ-terpinene), 테르피놀렌(terpinolene), 1-테르피네올(1-terpineol), 트랜스-ρ-멘트-2-엔-1-올(trans-ρ-menth-2-en-1-ol), 테르피넨-4-올(terpinen-4-ol), α-테르피네올(α-terpineol), (-)-보르닐 아세테이트((-)-bornyl acetate), 2-운데카논(2-undecanone), β-엘레멘(β-elemene), β-카르요필렌(β-caryophyllene), (-)-게르마크렌 D((-)-germacrene D), α-무롤렌(α-muurolene), γ-카디넨(γ-cadinene), (+)-δ-카디넨((+)-δ-cadinene), 엘레몰(elemol), 세드레라놀(cedrelanol), τ-무롤롤(τ-muurolol), α-카디놀(α-cadinol), β-오이데스몰(β-eudesmol) 및 13-에피마눌(13-epimanool)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있고, 구체적인 일 실시예에 따를 때 사비넨(sabinene), (+)-테르피넨-4-올((+)-terpinen-4-ol), γ-테르피넨(γ-terpinene) 및 β-오이데스몰(β-eudesmol)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 추출물은 조성물 총 부피 대비 0.001 내지 1, 0.001 내지 0.9, 0.001 내지 0.8, 0.001 내지 0.7, 0.001 내지 0.6, 0.001 내지 0.5, 0.001 내지 0.4, 0.001 내지 0.3, 0.001 내지 0.2, 0.001 내지 0.1, 0.001 내지 0.09, 0.001 내지 0.08, 0.001 내지 0.07 또는 0.001 내지 0.06 부피%로 조성물 내 포함될 수 있고, 어병 세균의 생장을 효과적으로 억제하면서도 독성과 같은 부작용을 발생시키지 않도록 하는 측면에서 바람직하게는 0.001 내지 0.06 부피%로 조성물 내 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 어병 세균은 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda), 비브리오 익티오엔테리(Vibrio ichthyoenteri), 비브리오 앙구일라룸(V. anguillarum), 비브리오 하베이(V. harveyi), 포토박테리움 담셀레(Photobacterium damselae), 락토코커스 가르비에(Lactococcus garvieae), 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis), 스트렙토코커스 이니아에(S. iniae), 에어로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophylla), 에어로모나스 살모니시다(A. salmonicida), 슈도모나스 앙귤리셉티카(Pseudomonas anguilliseptica), 슈도모나스 플루오레센스(P. fluorescens), 플라보박테리움 콜룸나레(Flavobacterium columnare), 레니박테리움 살모니나룸(Renibacterium salmoninarum) 및 플렉시박터 마리티무스(Flexibacter maritimus)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 조성물은 눈향나무 잎 추출물을 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 담체, 부형제 또는 희석제를 포함한 조성물로 제공될 수 있다.

나아가 상기 조성물은 종래에 알려져 있는 어병 세균 생장 억제용 물질과 혼합하여 제공될 수도 있다. 즉, 상기 조성물은 어병 세균의 생장 억제 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

본 발명의 일 양태로서, 눈향나무 잎 추출물을 포함하는, 어류에 대한 어병 세균성 질병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 일 양태로서, 눈향나무 잎 추출물을 대상 어류 개체에 처리하는 단계를 포함하는, 어류에 대한 어병 세균성 질병의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

상기 어병 세균성 질병은 에드워드병, 연쇄구균병, 궤양병, 슈도모나스병, 뱀장어 적점병, 유결절증, 연어과 세균성 신장병, 메기류의 세균성 패혈증, 비브리오병, 하베이병, 장관백탁증, 세균성 부식병(담수어 활주세균병), 해수어의 부식병(해수어 활주세균병), 솔방울병, 붉은지느러미병 및 부스럼병(절창병)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 '처리'는 어병 세균성 질병의 예방 또는 치료 대상의 어류에 대해 상기 추출물이 효과를 발휘할 수 있도록 하는 통상의 모든 행위를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 예를 들어, 상기 눈향나무 잎 추출물 또는 이를 포함하는 조성물을 대상 어류가 서식하는 환경에 공급하는 항생제나 사료 첨가제의 형태로 적용하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 어병 세균성 질병의 예방 또는 치료용 조성물을 구체적으로 설명함에 있어, 상술한 어병 세균의 생장 억제용 조성물에 관련된 상세한 설명을 참조할 수 있음은 본 명세서를 참조하는 당업자에 자명할 것이다.

본 발명의 일 양태로서, 눈향나무 잎 추출물을 포함하는, 어병 세균으로부터 유발된 인수공통감염병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 인수공통감염병은 장티푸스(typhoid), 패혈증(sepsis), 복막염(peritonitis), 봉와직염(cellulitis), 괴사성 근막염(necrotizing fasciitis), 위장관질환(gastrointestinal disorder), 요로 감염(urinary tract infection), 심내막염(endocarditis), 당뇨(diabetes mellitus), 만성류마티스성 심장병(chronic rheumatic heart disease), cirrhosis(간경변증), 수막염(meningitis), 관절염(arthritis), 폐렴(pneumonia), 골수염(osteomyelitis) 및 독성 쇼크(toxic shock)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 약학적 조성물은 유효성분을 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 약학적 조성물로 제공될 수 있다.

상기 "약학적으로 허용되는"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다.

나아가 상기 약학적 조성물은 종래에 알려져 있는 어병 세균으로부터 유발된 인수공통감염병의 치료물질과 혼합하여 제공될 수도 있다. 즉, 상기 약학적 조성물은 어병 세균으로부터 유발된 인수공통감염병을 예방 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

상기 "투여"란 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, "개체"란 어병 세균으로부터 유발된 인수공통감염병이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.

상기 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다.

상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 보다 효과적인 흡수경로를 선택한다는 관점에서 바람직하게는 구강투여를 택할 수 있다.

상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 상기 조성물은 0.01 ~ 1000mg/kg/day로, 바람직하게는 0.1 ~ 500㎎/kg/day로 투여하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 그 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 약학적 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate), 탈크(talc) 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 유동 파라핀(liquid paraffin) 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트(ethyl oleate)와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골(macrogol), 트윈(tween) 61, 카카오지(cacao butter), 라우린지(laurinum), 글리세로 젤라틴(glycerogelatin) 등이 사용될 수 있다.

상기 어병 세균으로부터 유발된 인수공통감염병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 구체적으로 설명함에 있어, 상술한 어병 세균의 생장 억제용 조성물에 관련된 상세한 설명을 참조할 수 있음은 본 명세서를 참조하는 당업자에 자명할 것이다.

다만, 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 다양한 농도의 눈향나무 잎 추출물의 어병 세균에 대한 생장 억제 효과를 관찰한 결과이다.
도 2는 눈향나무 잎 추출물을 구성하는 화합물에 의한 어병 세균의 생장 억제 효과를 관찰한 결과이다.

이하, 보다 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 하기 실시예는 예시적인 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 눈향나무 잎 정유의 추출 및 이의 어병 세균 생장 억제 활성 평가

1. 눈향나무 잎 정유의 추출

눈향나무 잎은 강원도 강릉시에서 채취하였다. 눈향나무 잎에서 hydro-distillation 법을 이용하여 정유를 추출하였다. 10 L 부피의 둥근 플라스크에 시료 1 kg당 증류수를 5-6 L 비율로 혼합하였다. 추출은 heating mantle (Model: MS-DM608, Serial number: 201602, Misung Scientific. Co. Ltd., Korea)에서 100 ± 2 ℃ 온도 조건으로, 더 이상 정유가 추출되지 않을 때까지 진행되었다. 추출한 정유는 anhydrous Na₂SO₄ (98.5%, Samchun, Korea)에 의해 수분이 제거되었고, 0.45 μm pore size minisart^® syringe filter (Reference number: 16555-K, Sartorius Stedim Biotech GmbH, Germany)를 이용하여 여과되었다. 여과된 정유는 빛이 차단되는 갈색 병에 옮겨진 후, 질소를 채워 4 ℃ 냉장 보관되었다.

2. 어병 세균의 배양

Edwardsiella tarda FP5060, Vibrio ichthyoenteri FP 8487, Photobacterium damselae FP4101, Lactococcus garvieae FP5245, Streptococcus iniae FP5228, 그리고 S. parauberis FP3287은 모두 국립수산과학원의 해양수산생명자원으로부터 분양 받았으며, 25% glycerol stock으로 -40 ℃에서 보관되었다. BHI agar는 BHI broth (Bacto^TM brain heart infusion, Product number: 237500, BD Biosciences Korea Ltd., Korea)에 15 g/L agar를 첨가하여 제조되었다. 냉동 보관된 세균을 BHI agar plate에 접종하여 28 ℃ 배양기에서 24시간 배양하여 단일 군집을 확보되었다. 단일 군집을 4 mL BHI broth에 접종한 후, 250 rpm의 조건으로 overnight 배양되었다.

3. 눈향나무 잎 정유의 농도별 항세균 활성 평가

항세균 활성을 평가하기 위해 CLSI M07-A9의 microdilution method를 변형하여 사용하였다. 눈향나무 잎 정유는 dimethyl sulfoxide (DMSO, extra pure grade, Product number: 3047-4460, Duksan)에 용해되어 5% 농도 (v/v)로 제조되었으며, 사용 전까지 -40 ℃에 보관되었다. 96-well polystyrene microplate (Flat bottom well, Product number: 30096, SPL Life Sciences Co., Ltd., Pocheon, Korea)의 각 well에 BHI broth를 200 μL씩 분주하였다. 준비된 정유 시료는 2배씩 연속 희석하여 각 well에 2 μL 처리하였다. 그 후, 전배양한 세균의 농도가 optical density (O.D₆₀₀) = 0.05가 되도록 각 well에 접종하였으며, 28 ℃에서 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후, Epoch microplate spectrophotometer (BioTek Instruments, Inc., US) 기기를 이용하여 600 nm의 흡광도 수치에서 세균의 밀도를 측정하여, 눈향나무 정유의 항균력을 평가하였다.

그 결과를 도 1에서 확인할 수 있듯, 눈향나무 잎 정유에 의해 S. parauberis (E)를 제외한 나머지 5개 어병 세균의 생장이 억제되었다. 그 중, S. iniae (F)의 생장에 대하여 가장 강한 억제 효과가 나타났으며, 농도의존적으로 0.0125% 농도에서 약 50%, 0.25% 농도 이상에서 약 99% 생장이 억제됨을 나타냈다. L. garvieae (D) 또한 0.025% 이상의 눈향나무 잎 정유에서 약 95% 이상 생장이 억제되었다. V. ichthyoenteri (B)는 0.025% 농도에서 약 65% 생장이 억제되어, 0.05% 농도에서는 약 93% 억제 효과가 관찰되었다. E. tarda (A)의 생장은 0.05% 농도의 정유에 의해 약 20% 억제되었고, P. damselae (C)는 0.0125% 이상의 농도에서 약 35%의 생장 억제 효과가 관찰되었으며, 그 효과가 유지되었다.

실시예 2. 눈향나무 잎 정유를 구성하는 화합물 및 이의 어병 세균 생장 억제 활성 평가

1. 화합물의 분석

GC-MS 분석을 통하여 눈향나무 잎으로부터 추출된 정유의 성분이 분석되었다. GC-MS 분석은 TriPlus^TM 100 LS Liquid Auto-sampler (Catalog number: IQLAAAGAAHFACMMBES), ISQ^TM Series Single Quadrupole GC-MS System (Catalog number: IQLAAAGAAJFALOMAYE)로 구성된 TRACE^TM 1310 Gas Chromatograph가 사용되었으며, 모두 Thermo Fisher Scientific 제품이다 (Thermo Fisher Scientific Solutions LLC, Korea). Column은 VF-5MS (Silica, 길이 60 m ⅹ 내경 0.25 mm ⅹ 두께 0.25 μm, Agilent Technologies, Inc., US)가 사용되었다. 이동상 기체로 헬륨을 1 mL/min의 속도로 공급되었다. 정유 시료는 1 mL의 dichloromethane에 4 μL를 용해되었고, 1 μL 주입되었다. Injection temperature는 250 ℃로 유지되었고, 1:20의 비율의 분할 모드(split mode)가 사용되었다. Oven 온도는 초기 50 ℃로 5분간 유지된 후, 10 ℃/min으로 65 ℃까지 증가되었으며 30분 동안 유지되었다. 그 후, 5 ℃/min으로 210 ℃까지 온도가 상승되었으며, 10분 동안 유지되었다. 마지막으로 20 ℃/min으로 최고 325 ℃까지 온도가 증가되었으며, 10분 간 유지되었다. Flame ionization detector (FID)의 온도는 300 ℃로 설정되었고, air flow는 350 mL/min, hydrogen flow는 35 mL/min, 그리고 make-up gas (helium)은 40 mL/min의 속도로 설정되었다. MS data는 35 - 550 amu 범위의 mass를 EI ionization mode에서 0.2 sec/scan 속도로 수집되었다.

수집된 peak data 중에서 match quality가 높은 것을 1차로 선별되었고, n-alkanes (C₈ - C₂₀, Product number: 04071, Sigma-Aldrich, Korea)를 이용하여 Kovats retention index (KI)를 계산되었다. 계산된 KI 값을 National Institute of Standards and Technology (NIST, US)의 NIST Chemistry WebBook (Standard Reference Database Number 69)와 비교되었으며, 그 차이가 100 미만인 화합물이 최종적으로 선정되었다.

2. 화합물 분석 결과

하기 표 1에서 확인할 수 있듯, 구성 성분들은 대부분이 terpene계열의 화합물로 분석되었으며, 주요 성분은 sabinene (21.90%)과 elemol (21.17%)으로 확인도었다. 또한, terpinen-4-ol, γ-terpinene, β-eudesmol도 각각 8.24%, 4.47%, 3.64%로 상대적으로 높은 비율을 차지하였다.

Retention time (min)	화합물	구성 비율 (%)
24.41	Tricyclene	0.14
25.95	α-Pinene	1.45
36.04	β-Myrcene	0.84
37.92	(+)-4-Carene	0.16
42.02	D-Limonene	1.43
42.26	Sabinene	21.90
43.82	β-Ocimene	0.22
44.81	γ-Terpinene	4.47
46.90	Terpinolene	1.57
49.51	1-Terpineol	0.36
50.78	trans-ρ-Menth-2-en-1-ol	0.27
53.69	Terpinen-4-ol	8.24
54.82	α-Terpineol	0.26
61.94	(-)-Bornyl acetate	2.39
62.27	2-Undecanone	0.50
67.45	β-Elemene	0.29
68.83	β-Caryophyllene	0.19
71.09	(-)-Germacrene D	0.33
71.60	α-Muurolene	0.31
72.12	γ-Cadinene	0.27
72.24	(+)-δ-Cadinene	1.99
73.21	Elemol	21.17
75.90	Cedrelanol	0.58
75.96	τ-Muurolol	0.91
76.02	α-Cadinol	0.2
76.39	β-Eudesmol	3.64
88.94	13-Epimanool	0.25

3. 분석된 화합물의 항세균 활성 평가

상기 실시예 1-3의 항세균 활성 평가 방법과 동일하게 눈향나무 잎 정유를 구성하는 화합물에 의한 어병 세균의 생장 억제 효과를 관찰한 결과를 도 2에 나타내었다. 주요 성분인 sabinene에 의해 모든 어병 세균의 생장이 억제되었으며, S. iniae에 대하여 약 90%의 강한 억제 효과를 나타냈다. (+)-terpinen-4-ol은 E. tarda와 S. iniae에 대하여 높은 생장 억제 효과를 나타냈으며, 다른 어병 세균에 대해서도 평균적으로 약 20% 생장을 억제하였다. γ-Terpinene은 어병 세균에 대한 생장 억제 효과가 미비하였다. β-Eudesmol은 S. iniae의 생장을 약 88% 억제하였으며, P. damselae와 L. garvieae에 대하여도 45%의 높은 생장 억제 효과를 나타냈다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

눈향나무 잎 추출물을 포함하는 어병 세균의 생장 억제용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 추출물은 눈향나무 잎의 정유(essential oil)인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 추출물은 증기증류(hydrodistillation)에 의한 추출물인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 추출물은 80 내지 120℃의 증기증류에 의한 추출물인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 추출물은 엘레몰(elemol), 사비넨(sabinene), (+)-테르피넨-4-올((+)-terpinen-4-ol), γ-테르피넨(γ-terpinene) 및 β-오이데스몰(β-eudesmol)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 추출물은 조성물 총 부피 대비 0.001 내지 1 부피%로 조성물 내 포함되는 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 어병 세균은 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda), 비브리오 익티오엔테리(Vibrio ichthyoenteri), 비브리오 앙구일라룸(V. anguillarum), 비브리오 하베이(V. harveyi), 포토박테리움 담셀레(Photobacterium damselae), 락토코커스 가르비에(Lactococcus garvieae), 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis), 스트렙토코커스 이니아에(S. iniae), 에어로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophylla), 에어로모나스 살모니시다(A. salmonicida), 슈도모나스 앙귤리셉티카(Pseudomonas anguilliseptica), 슈도모나스 플루오레센스(P. fluorescens), 플라보박테리움 콜룸나레(Flavobacterium columnare), 레니박테리움 살모니나룸(Renibacterium salmoninarum) 및 플렉시박터 마리티무스(Flexibacter maritimus)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인 조성물.
눈향나무 잎 추출물을 포함하는, 어류에 대한 어병 세균성 질병의 예방 또는 치료용 조성물.
청구항 8에 있어서, 상기 어병 세균성 질병은 에드워드병, 연쇄구균병, 궤양병, 슈도모나스병, 뱀장어 적점병, 유결절증, 연어과 세균성 신장병, 메기류의 세균성 패혈증, 비브리오병, 하베이병, 장관백탁증, 세균성 부식병, 해수어의 부식병, 솔방울병, 붉은지느러미병 및 부스럼병으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 조성물.
눈향나무 잎 추출물을 포함하는, 어병 세균으로부터 유발된 인수공통감염병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 10에 있어서, 상기 인수공통감염병은 장티푸스(typhoid), 패혈증(sepsis), 복막염(peritonitis), 봉와직염(cellulitis), 괴사성 근막염(necrotizing fasciitis), 위장관질환(gastrointestinal disorder), 요로 감염(urinary tract infection), 심내막염(endocarditis), 당뇨(diabetes mellitus), 만성류마티스성 심장병(chronic rheumatic heart disease), cirrhosis(간경변증), 수막염(meningitis), 관절염(arthritis), 폐렴(pneumonia), 골수염(osteomyelitis) 및 독성 쇼크(toxic shock)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 조성물.
눈향나무 잎 추출물을 대상 어류 개체에 처리하는 단계를 포함하는, 어류에 대한 어병 세균성 질병의 예방 또는 치료방법.