KR20220100756A

KR20220100756A - 프러시안 블루 나노입자를 포함하는 상처 치료제, 드레싱재 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20220100756A
Application number: KR1020210002527A
Authority: KR
Inventors: 태기융; 사후 아비식; 양희석; 전진
Original assignee: 광주과학기술원; 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2021-01-08
Filing date: 2021-01-08
Publication date: 2022-07-18
Also published as: KR102476844B1

Abstract

본 발명의 일 실시예는 프러시안 블루 나노입자를 포함하는 상처 치료제, 드레싱재 및 이의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 프러시안 블루 나노입자의 강력한 ROS 소거능과 항염증 활성 및 각질 세포의 분화 유도, 조직의 미세혈관 신생 촉진, 콜라겐 침착 효과로 인하여 상처를 빠르게 회복하도록 유도하고 상처 부위의 피부 조직 재생을 빠르게 개선시킬 수 있는 효과를 갖는 상처 치료제, 드레싱재 및 이의 제조방법을 제공 가능한 효과가 있다.

Description

프러시안 블루 나노입자를 포함하는 상처 치료제, 드레싱재 및 이의 제조방법{Wound treatment and dressing material containing Prussian blue nanoparticles, and manufacturing method thereof}

본 발명은 상처 치료제, 드레싱재 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 프러시안 블루 나노입자를 포함하는 상처 치료제, 드레싱재 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

상처(wound)는 신체를 외부 감염원의 침입으로부터 보호하고 수분과 체온을 유지하는 피부 조직이 손상된 상태를 일컫는 것으로, 상처 치료(wound healing)는 손상된 조직의 기능과 형태적 특성을 정상화시키기 위한 필수적인 반응이다. 상처 발생 시 적절하게 치료되지 않으면 상처 부위를 통한 세균 감염 등으로 인체에 치명적 손상을 일으킬 수 있으므로 손상된 피부 부위가 가능한 한 빨리, 또 본래 피부 구조와 유사하게 복원되도록 조치를 취하는 것이 중요하다.

그러나 상처 발생 시 상처 부위에서 발생하는 과도한 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 및 염증 반응은 세포의 항산화 시스템을 압도하고 치유 과정을 방해하게 된다. 일반적으로 인간 포유류 세포는 증가된 세포 내 ROS에 대응하기 위한 기본적 항산화 방어 시스템을 갖추고 있지만, 상처 부위에서의 지속적인 산화 스트레스는 피부 세포(섬유 아세포, 각질 세포 등)의 기능을 손상시키고 염증, 괴사 및 섬유성 흉터를 촉진하여 피부 조직의 복구 과정을 지연시키게 된다.

이러한 문제를 해결하기 위하여, 최근 다양한 무기 나노 물질과 나노 기술 기반 치료제 등의 외인성 물질 도입을 통한 상처 조직의 빠른 치유와 회복을 위한 연구 개발이 활발하게 이루어지고 있다. 대표적으로, CeO₂ 나노입자, MnO₂ 나노입자, 탄소 나노 튜브, 풀러렌(Fullerene) 및 Pt 나노입자 등이 조직의 산화 스트레스와 염증으로 인한 손상을 억제하기 위하여 적용이 시도되었다.

그러나 종래의 나노입자들은 제한적인 ROS 소거능을 가지거나, 가장 중요하게는 생물학적 안정성, 즉 체내 생체 적합성이나 장기적인 생체 내 효과에 있어 완전히 조사되지 않았다는 문제점이 있었다. 예를 들어, 호흡기를 통해 CeO₂ 나노입자에 노출된 쥐의 폐에서 폐 섬유증이 유발되었고 정맥 투여 시에는 간 손상을 유발하는 것이 확인된 바 있다. 또한, MnO₂ 나노입자의 반복적 경구 노출이 쥐에서 유전적 손상이나 생화학적 변화 및 조직학적 변화를 일으킨다는 사실이 연구된 바 있다.

이러한 문제점을 해결하기 위하여, 이미 생물학적 안정성이 검증되어 확인된 바 있으면서도 충분한 상처 치유 효능을 갖는 나노 물질의 탐색이 필요한 실정이다.

대한민국 공개특허 제2012-0094896호

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 이미 생물학적 안정성이 충분히 검증되어 확인된 프러시안 블루 나노입자의 신규한 상처 치료 및 피부 재생 효능을 밝힘으로써 이를 이용하여 상처 치료 또는 피부 조직 재생 효율이 향상된 치료제 및 드레싱재를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 프러시안 블루 나노입자의 결정화 특성을 이용하여 프러시안 블루 나노입자를 도포 또는 코팅하려는 드레싱재의 환부 접촉면을 프러시안 블루 나노입자 형성을 위한 전구체 용액에 담그거나 도포함으로써 손쉽게 드레싱재를 제조 가능한 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱재의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예는 상처 치료제를 제공한다.

상기 상처 치료제는, 프러시안 블루 나노입자 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 상처는 창상(wound), 찰과상(abrasion), 열상(laceration), 자상(stab wound), 궤양 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 피부 조직 재생은 각질 세포의 분화 유도, 조직의 미세혈관 신생 촉진, 콜라겐 침착 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 상처 치료제는, 항염증제, 진통제, 항-감염제 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상을 포함하는 상처 치료를 위한 치료 성분을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 상처 치료제는, 현탁액, 겔, 로션, 크림 또는 연고 성상인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예는 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱재를 제공한다.

상기 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱재는, 프러시안 블루 나노입자가 환부 접촉면에 도포 또는 코팅된 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 드레싱재는, 하이드로콜로이드형, 폴리우레탄 폼형, 필름형 또는 하이드로겔형인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예는 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱재의 제조방법을 제공한다.

상기 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱재의 제조방법은, 드레싱재를 준비하는 단계; 및 상기 드레싱재의 환부 접촉면에 프러시안 블루 나노입자를 코팅하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 드레싱재의 환부 접촉면에 프러시안 블루 나노입자를 코팅하는 단계는, 프러시안 블루 나노입자 형성을 위한 전구체 용액을 준비하는 단계; 및 상기 드레싱재의 환부 접촉면을 상기 전구체 용액에 담그거나, 상기 전구체 용액을 상기 드레싱재의 환부 접촉면에 도포하여 상기 드레싱재의 환부 접촉면에 프러시안 블루 나노입자를 형성시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 프러시안 블루 나노입자 형성을 위한 전구체 용액을 준비하는 단계는, 페리시안화 이온([Fe(CN)₆]^3-)을 포함하는 화합물 및 철 이온(Fe³⁺)을 포함하는 화합물을 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및 상기 혼합물을 용매와 혼합하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 페리시안화 이온([Fe(CN)₆]^3-)을 포함하는 화합물은, 페리시안화칼륨(K₃Fe(CN)₆) 또는 페리시안화나트륨(Na₃Fe(CN)₆)인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 철 이온(Fe³⁺)을 포함하는 화합물은, 염화철(FeCl₃), 과염소산철(Fe(ClO₄)₃) 및 질산철(Fe(NO₃)₃)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 용매는 물인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 발명의 실시예에 따르면, 프러시안 블루 나노입자의 강력한 ROS 소거능과 항염증 활성 및 각질 세포의 분화 유도, 조직의 미세혈관 신생 촉진, 콜라겐 침착 효과로 인하여 상처를 빠르게 회복하도록 유도하고 상처 부위의 피부 조직 재생을 빠르게 개선시킬 수 있는 효과를 갖는 프러시안 블루 나노입자 첨가제를 포함하는 상처 치료제 및 드레싱재를 제공 가능한 효과가 있다.

또한, 본 발명의 실시예에 따르면, 프러시안 블루 나노입자의 결정화 특성을 이용하여 프러시안 블루 나노입자를 도포 또는 코팅하려는 드레싱재의 환부 접촉면을 프러시안 블루 나노입자 형성을 위한 전구체 용액에 담그거나 도포함으로써 손쉽게 드레싱재를 제조 가능한 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱재의 제조방법을 제공 가능한 효과가 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 본 발명의 PB 나노입자의 특성을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 PB 나노입자의 항산화 활성을 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 PB 나노입자의 시험관 내 세포 독성을 확인하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 PB 나노입자의 체외 항 염증 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 PB 나노입자의 생체 내 상처 치유 활성을 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 PB 나노입자를 처리한 상처 피부 샘플을 조직학적으로 분석한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 PB 나노입자를 처리한 상처 피부에서의 콜라겐 조직을 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 8은 본 발명의 PB 나노입자를 처리한 피부 상처 모델의 면역 조직 화학적 염색 분석 사진이다.
도 9는 본 발명의 PB 나노 자임의 생체 내 항 염증 효과를 나타내는 이미지 및 그래프이다.

이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결(접속, 접촉, 결합)"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 부재를 사이에 두고 "간접적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. 또한, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

이하 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 상처 치료제를 설명한다.

상기 상처 치료제는, 프러시안 블루(Prussian Blue, PB) 나노입자 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기 프러시안 블루 나노입자(이하 PB 나노입자)는, 페로시안화 철의 수화물로, 푸른 빛깔을 띄는 것을 특징으로 하며, 종래 주로 세슘이나 탈륨에 노출된 환자의 치료를 위해 사용되거나, 자기공명영상(MRI)을 위한 생체 적합성 조영제로 개발되어, 근적외선을 열로 변환하는 기능 덕분에 광열 암 치료에도 사용되어 FDA에서 승인되어 그 생체 안정성이 입증되었다.

상기 PB 나노입자는 또한 PB 나노입자는 입자는 카탈라아제(catalase), 퍼옥시다아제(peroxidase), 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase, SOD)와 같은 여러 생물학적 효소의 작용을 모방할 수 있는 특징을 가지므로 차세대 나노자임으로 각광받고 있다. 그러나 상기 PB 나노입자의 상처 치료 또는 피부 조직 재생을 위한 효능은 아직 연구된 바 없다.

이에 착안하여, 본 발명의 발명자들은, 상기 기존에 생체 적합성이 이미 충분히 입증된 바 있는 PB 나노입자를 이용하여 상처 치료제의 첨가제로서의 신규한 용도를 발명하기에 이르렀다.

이때, 상기 PB 나노입자는, 세포 내 ROS 소거능 및 염증성 사이토카인의 발현 억제를 통한 항염증 활성 특성뿐 아니라, 이를 통한 각질 세포의 분화 유도, 조직의 미세혈관 신생 촉진, 콜라겐 침착 효과를 갖는 것을 특징으로 한다.

전술한 바와 같이, 상처 발생 시 상처 부위에서 발생하는 과도한 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 및 염증 반응은 세포의 항산화 시스템을 압도하고 치유 과정을 방해하게 된다.

따라서, 상기 PB 나노입자를 첨가제로 포함하는 본 발명의 상처 치료제는, 상기 PB 나노입자의 강력한 ROS 소거능과 항염증 활성뿐만 아니라, 각질 세포의 분화 유도, 조직의 미세혈관 신생 촉진, 콜라겐 침착 효과로 인하여, 상처를 빠르게 회복하도록 유도하고 상처 부위의 피부 조직 재생을 빠르게 개선시킬 수 있는 효과를 갖는다.

이때, 상기 상처는 창상(wound), 찰과상(abrasion), 열상(laceration), 자상(stab wound), 궤양 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 할 수 있다.

이때, 상기 피부 조직 재생은 각질 세포의 분화 유도, 조직의 미세혈관 신생 촉진, 콜라겐 침착 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 상처 치료제는, 항염증제, 진통제, 항-감염제 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상을 포함하는 상처 치료를 위한 치료 성분을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상처 치료를 위해 사용되는 공지의 치료제 성분이라면 제한 없이 이용될 수 있다.

이때, 상기 상처 치료제는, 현탁액, 겔, 로션, 크림 또는 연고 성상인 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상처를 치료하기 위해 유효하고 효과적인 성상이라면 제한없이 해당될 수 있다.

상기와 같은 구성의 특징으로 인하여, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 프러시안 블루 나노입자의 강력한 ROS 소거능과 항염증 활성 및 각질 세포의 분화 유도, 조직의 미세혈관 신생 촉진, 콜라겐 침착 효과로 인하여 상처를 빠르게 회복하도록 유도하고 상처 부위의 피부 조직 재생을 빠르게 개선시킬 수 있는 효과를 갖는 프러시안 블루 나노입자 첨가제를 포함하는 상처 치료제를 제공 가능한 효과가 있다.

본 발명의 다른 실시예에 따른 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱재를 설명한다.

이때, 상기 드레싱재는, 하이드로콜로이드형, 폴리우레탄 폼형, 필름형 또는 하이드로겔형인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 '드레싱(dressing)'이란, 상처면을 보호하기 위하여 소정의 소재로 상처를 덮어주는 것을 말하며, 이때 사용되는 소재를 '드레싱재'라 한다. 드레싱재는 상처에 외부로부터의 이물 침입을 방지하고 물리적 충격 혹은 자극으로부터 보호하며, 내부의 상처 분비물을 흡수 또는 제거하여 상처가 효율적으로 아물도록 보조하는 역할을 한다.

드레싱은 크게 건조드레싱과 습윤드레싱으로 분류할 수 있다.

상기 건조드레싱은 전통적인 종래 방식의 드레싱을 의미한다. 이는 가격이 저렴할 뿐만 아니라 창상을 건조시켜 치유하는 것이 바이러스 등의 번식을 막고 감염을 줄일 수 있기 때문에 감염방지에 좋은 효과를 볼 수 있지만, 외부로부터의 세균에 대한 방어능력이 없고, 드레싱재가 상처 면에 고착하기 쉽고 이물을 남기게 되는 단점이 있다.

즉, 삼출액 흡수성, 물리적 보호성은 갖고 있으나, 상처의 회복에 필요한 습윤 환경 유지성, 이물질 세균 침입 방어 능력, 보온성 등 창상 치유 인자에 관한 특성은 보유하지 못한 단순 보호재로서의 특성을 갖고 있다.

상기 습윤드레싱은 종래 건조드레싱의 문제점을 해결하기 위한 것으로 상처의 치유는 건조 환경보다 습윤 환경에서 보다 효율적으로 진행된다는 사실에 착안하여 개발된 드레싱 기술이다. 특히, 삼출액에 포함되어 있는 다핵 백혈구, 대식세포, 단백질 분해효소, 세포 성장인자 등의 창상 치유에 관여하는 물질들이 건조 환경에서는 외부로 배출되거나 건조되어 그 역할을 못하게 되지만 습윤 환경에서는 원활하게 그 역할을 수행할 수 있기 때문에 상처 치유가 효율적으로 진행 가능하다.

상기 습윤드레싱으로 사용되는 드레싱재의 종류는 크게 하이드로콜로이드, 폴리우레탄 폼, 하이드로겔 등이 있다.

그러나 종래의 습윤 드레싱재는, 상처의 삼출액 흡수 기능 등은 뛰어나지만, 전술한 바와 같은 상처의 과도한 ROS 발생 등으로 인한 치유 효율 저하 문제나 상처 난 피부 조직 자체의 재생 능력을 향상시키는 것에 기여하지는 못한다는 문제점이 있었다.

이에, 본 발명의 발명자들은 전술한 상처 치료 또는 피부 조직 재생 효능을 갖는 프러시안 블루 나노입자를 본 발명의 드레싱재의 환부 접촉면에 도포 또는 코팅함으로써, 상기 프러시안 블루 나노입자가 상처 부위에 과도하게 발생된 ROS를 소거하고 염증성 사이토카인의 발현 억제를 통한 항염증 활성을 증진시킬 뿐 아니라, 상처 조직의 각질 세포 분화 유도, 조직의 미세혈관 신생 촉진 및 콜라겐 침착 효능을 통하여 상처 치유 효율을 현저하게 향상시킨 드레싱재를 발명하기에 이르렀다.

이때, 상기 상처는 창상(wound), 찰과상(abrasion), 열상(laceration), 자상(stab wound), 궤양 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

이때, 상기 피부 조직 재생은 각질 세포의 분화 유도, 조직의 미세혈관 신생 촉진, 콜라겐 침착 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기와 같은 구성의 특징으로 인하여, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 프러시안 블루 나노입자의 강력한 ROS 소거능과 항염증 활성 및 각질 세포의 분화 유도, 조직의 미세혈관 신생 촉진, 콜라겐 침착 효과로 인하여 상처를 빠르게 회복하도록 유도하고 상처 부위의 피부 조직 재생을 빠르게 개선시킬 수 있는 효과를 갖는 프러시안 블루 나노입자가 환부 접촉면에 도포된 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱재를 제공 가능한 효과가 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따른 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱재의 제조방법을 설명한다.

상기 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱재의 제조방법은, 드레싱재를 준비하는 단계; 및 상기 드레싱재의 환부 접촉면에 프러시안 블루 나노입자를 코팅하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.

이때, 상기 드레싱재의 환부 접촉면에 프러시안 블루 나노입자를 코팅하는 단계는, 프러시안 블루 나노입자 형성을 위한 전구체 용액을 준비하는 단계; 및 상기 드레싱재의 환부 접촉면을 상기 전구체 용액에 담그거나, 상기 전구체 용액을 상기 드레싱재의 환부 접촉면에 도포하여 상기 드레싱재의 환부 접촉면에 프러시안 블루 나노입자를 형성시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기와 같이 프러시안 블루 나노입자는 전구체 용액으로부터 스스로 결정화하는 특성을 가지므로, 프러시안 블루 나노입자를 도포 또는 코팅하려는 드레싱재의 환부 접촉면을 상기와 같이 프러시안 블루 나노입자 형성을 위한 전구체 용액에 담그거나 도포함으로써 본 발명의 드레싱재를 손쉽게 제조 가능하다.

이때, 상기 프러시안 블루 나노입자 형성을 위한 전구체 용액을 준비하는 단계는, 페리시안화 이온([Fe(CN)₆]^3-)을 포함하는 화합물 및 철 이온(Fe³⁺)을 포함하는 화합물을 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및 상기 혼합물을 용매와 혼합하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

이때, 상기 페리시안화 이온([Fe(CN)₆]^3-)을 포함하는 화합물은, 페리시안화칼륨(K₃Fe(CN)₆) 또는 페리시안화나트륨(Na₃Fe(CN)₆)인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

이때, 상기 철 이온(Fe³⁺)을 포함하는 화합물은, 염화철(FeCl₃), 과염소산철(Fe(ClO₄)₃) 및 질산철(Fe(NO₃)₃)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

이때, 상기 용매는 물인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

상기와 같은 구성의 특징으로 인하여, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 프러시안 블루 나노입자의 결정화 특성을 이용하여 프러시안 블루 나노입자를 도포 또는 코팅하려는 드레싱재의 환부 접촉면을 프러시안 블루 나노입자 형성을 위한 전구체 용액에 담그거나 도포함으로써 손쉽게 드레싱재를 제조 가능한 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱재의 제조방법을 제공 가능한 효과가 있다.

이하에서는 제조예, 비교예 및 실험예를 통해 본 발명에 대해 더욱 상세하게 설명한다. 하지만 본 발명이 하기 제조예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

<제조예 1> 프러시안 블루 나노입자의 제조

본 발명의 일 실시예에 따른 프러시안 블루 나노입자를 포함하는 상처 치료제를 제조하기 위하여, 먼저 프러시안 블루 나노입자를 제조하였다.

상기 프러시안 블루 나노입자는, K₃Fe(CN)₆과 FeCl₂를 반응시켜 합성되었다. 이를 위하여, 먼저 13.2mg(40μmol) K₃Fe(CN)₆을 9mL의 탈 이온수 (DIW)에 용해시키고 8mg(40μmol)의 FeCl₂를 1mL DI에 별도로 용해시켰다. 그런 다음 FeCl₂ 용액을 ferricyanide 용액에 첨가하고 혼합물을 60℃에서 12시간 동안 교반하여 반응을 완료하였다. 마지막으로 PB 나노입자는 분자량 컷오프(MWCO; molecular weight cut-off)가 100kD 인 Nanosep®원심 분리 장치(Pall Life Sciences, Ann Arbor, MI, USA)를 사용하여 스핀 여과에 의해 정제되었다.

<실험예 1> PB 나노입자의 확인

본 발명의 PB 나노입자의 특성을 분석하는 실험을 진행하였다. 먼저 PB 나노입자의 크기와 표면 전하는 동적 광 산란(Dynamic Light Scattering, DLS) 측정 (ELSZ 2000, Otsuka Electronics Co. Ltd., Osaka, Japan)에 의해 분석되었다. 나노입자의 형태는 투과 전자 현미경(TEM) 분석(TecnaiG2, FEI Co., Hillsboro, OR, USA)에 의해 분석되었다. PB 나노입자의 푸리에 변환 된 적외선 (FTIR) 스펙트럼은 FTIR 분광 광도계 (Spectrum 2000, Perkin-Elmar, Waltham, MA, USA)에서 KBr 펠릿 방법으로 분석 되었다. PB 나노입자의 결정도는 CuΚα 방사선을 사용하여 분말 X-선 회절(XRD) 측정(Rigaku RINT 2000, Rigaku Co., Tokyo, Japan)에 의해 분석되었다.

도 1은 PB 나노입자의 특성을 분석하여 나타낸 그래프이다.

도 1의 (a)는 PB 나노 자임의 UV- 가시 광선 흡수 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.

도 1의 (a)를 참조하면, PB 나노입자의 흡광도 스펙트럼은 Fe(II)와 Fe(III) 사이의 원자가 전하 이동으로 인해 약 690nm의 피크를 갖는 전형적인 넓은 스펙트럼의 PB를 나타내는 것을 확인할 수 있다.

도 1의 (b)는 DLS 측정에 의한 PB 나노 자임의 유체 역학적 크기 분포를 나타낸 그래프이다.

도 1의 (b)를 참조하면, PB 나노입자는 DLS 분석에서 우수한 단 분산도 (다 분산 지수 ~ 0.2)와 함께 34±8nm의 평균 유체 역학적 크기를 나타내는 것을 확인할 수 있다. 또한, PB 나노입자의 제타 전위는 -38±7mV로 음의 표면 전하를 나타낸다.

도 1의 (c)는 PB 나노입자의 저배율 TEM 이미지이다. 도 1의 (d)는 단일 PB 나노입자의 고배율 TEM 이미지이다.

도 1의 (c) 및 (d)를 참조하면, 단분산 PB 나노입자가 특징적인 입방체 모양으로 성공적으로 형성되었음을 확인할 수 있다.

도 1의 (e)는 PB 나노입자의 FTIR 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.

도 1의 (e)를 참조하면, PB 나노입자의 FTIR 스펙트럼은 2080cm^-1에서 주요 피크를 나타냈으며, 이는 Fe(II)-CN-Fe(III) 결합에서 늘어난 -C≡N-의 특성을 나타내는 피크임을 확인할 수 있다. 3415cm^-1 주변의 넓은 피크는 하이드록실기(-OH), 1611cm^-1의 피크는 H-O-H의 굽힘에서 발생하여 PB 나노입자 내에 물이 존재함을 나타낸다.

도 1의 (f)는 XRD 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.

도 1의 (f)를 참조하면, PB 나노입자의 XRD 측정은 16.8°, 24.2°, 34.6°, 38.9°, 50.2°, 53.4° 및 56.5°의 2θ값에서 특징적인 회절 피크를 보였으며, 전술한 흡광도 스펙트럼, DLS, TEM, FTIR 스펙트럼 및 XRD 패턴을 통해 좁은 크기 분포와 높은 결정도를 가진 PB 나노입자의 성공적인 합성을 확인할 수 있다.

<실험예 2> PB 나노입자의 항산화 활성 측정 실험

포유류 세포에서 SOD와 카탈라아제는 일반적으로 각각 과산화물(슈퍼옥사이드 음이온)과 H₂O₂의 분해를 담당하는 두 가지 주요 항산화 효소이다. 카탈라아제와 퍼옥시다아제는 독성 H₂O₂를 산소(O₂) 및 물(H₂O)과 같은 생체 독성을 갖지 않는 물질로 분해할 수 있으며, 이때 PB 나노입자는 다양한 산화환원 경로를 통해 SOD, 카탈라아제 및 퍼옥시다아제의 모방 활성을 나타낼 수 있다. 과산화수소(H₂O₂) 및 슈퍼옥사이드 음이온 산소(O^2-)는 상처 또는 조직 손상 시 세포에서 가장 많이 생성되는 ROS이므로, 따라서 본 실험예 2에서는 PB 나노입자의 과산화수소(H₂O₂) 분해 활성 및 과산화물 소거 활성을 확인하는 실험을 진행하였다.

먼저 PB 나노입자의 과산화수소 분해 활성을 확인하기 위하여, 다양한 농도의 PB 나노입자를 H₂O₂ 용액(250μM)과 혼합하고 37℃ 100rpm에서 교반하였다. 일정 시간 간격으로 반응 혼합물에서 용액 20μL를 추출하여 자일레놀 오렌지(xylenol orange) 분석을 통해 H₂O₂ 농도를 측정하였다. 농도 측정은 20μL의 샘플 용액을 200μL의 자일레놀 오렌지 시약과 혼합하고 실온에서 15분 동안 인큐베이션 한 다음 Varioskan™ LUX 마이크로 플레이트 리더(Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA)로 595nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도 값은 대조군이 되는 순수한 H₂O₂ 농도로 얻은 표준 곡선을 기반으로 변환되었다.

PB 나노입자의 슈퍼옥사이드 음이온(O^2-) 소거 활성은 SOD 분석 키트로 분석되었다. 이 분석에서 크산틴/크산틴 산화효소 반응 시스템에 의해 생성된 슈퍼옥사이드 음이온은 WST-1 시약과 반응하여 노란색 포르마잔 생성물을 생성하는데, 이는 450nm에서 흡광도로 측정 가능하다. 즉, 흡광도 변화는 과산화물 농도에 비례하며, 따라서 과산화물 소거 활성(Superoxide scavenging activity, %)은 하기 식 1과 같이 측정되었다.

[식 1]

과산화물 소거 활성(%) = 100 × (A_control - A_sample) / A_control

도 2는 본 발명의 PB 나노입자의 항산화 활성을 나타내는 그래프이다.

도 2의 (a)는 PB 나노입자의 카탈라아제 및 퍼옥시다아제 모방 활성을 통한 시간에 따른 과산화수소 분해 활성을 나타내는 그래프이다.

도 2의 (a)를 참조하면, PB 나노입자에 의한 시간 및 농도 의존적인 H₂O₂ 분해 활성을 확인할 수 있다. 낮은 농도의 PB(10μg/mL)는 30분 이내에 약 17%의 H₂O₂를 분해했으며, 120분 후에 분해율은 약 50%이다. 또한, H₂O₂ 분해율은 PB 농도가 증가함에 따라 크게 증가하는 것을 확인할 수 있다. 50μg/mL 및 100μg/mL PB의 존재 하에, 각각 약 65% 및 80%의 H₂O₂가 반응 60분 이내에 분해되었다. 그러나 120분의 반응 후에는 50μg/mL 및 100 μg/mL의 PB 모두 유사한 H₂O₂ 분해 능력을 보이는 것을 확인할 수 있다.

도 2의 (b)는 PB 나노입자의 SOD 모방 활성을 통한 과산화물 소거 활성을 나타내는 그래프이다.

도 2의 (b)를 참조하면, H₂O₂ 분해와 유사하게 PB 나노입자는 농도와 시간에 따라 높은 슈퍼옥사이드 소거능을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 10μg/mL의 PB는 반응 30분 및 60분 이내에 각각 약 44% 및 64%의 슈퍼옥사이드 라디칼을 제거하였다. PB 농도를 50μg/mL로 증가시킨 경우 슈퍼옥사이드의 90%가 30분 이내에 제거되었다. 50μg/mL 및 100μg/mL의 PB는 모두 120분 후에는 유사한 슈퍼옥사이드 소거 활성을 나타냈다. 이를 통해 PB 나노입자의 ROS 소거능 및 상기 ROS 소거능은 PB 나노입자의 농도 및 반응 시간에 비례하여 증가하는 것을 확인할 수 있다.

<실험예 3> PB 나노입자의 생체 적합성 확인 및 세포 내 ROS 소거 활성 확인 실험

본 발명의 PB 나노입자의 생체 적합성을 확인하기 위하여, 쥐의 섬유 아세포(NIH-3 T3)를 모델 세포주로 사용하여 PB 나노입자의 생체 적합성을 평가하는 실험을 진행하였다. 이를 위하여, NIH-3 T3를 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 DMEM에서 배양하고 CO₂ 배양기에서 37℃에서 12 시간 동안 배양 하였다. PB 나노입자의 시험관 내(in vitro) 세포 독성을 확인하기 위해 NIH-3 T3 세포를 96-well 조직 배양 플레이트(2x104cell/well)에 접종하였다. 세포 부착 후, 농도가 10μg/mL 내지 200μg/mL인 PB 나노입자를 세포에 첨가 하였다. 24 시간 배양 후, 세포를 세척하고 MTT 시약을 함유하는 새로운 배지에서 37℃에서 1시간 동안 배양 하였다. 배양된 세포를 세척하고 세포 생존력을 MTT 분석으로 측정 하였다.

세포 내 ROS 생성은 ROS 민감성 형광 프로브로 DCFH-DA를 사용하여 분석되었다. NIH-3 T3 세포를 PB 나노입자(50μg/mL)의 유무에 관계 없이 다양한 농도의 H₂O₂에 노출하였다. 2시간 처리 후, 세포를 세척하고 30분 동안 10μM DCFH-DA로 배양 하였다. 마지막으로 여기 파장이 485nm이고 방출 파장이 525nm인 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 세포 내 형광 신호를 측정하였다. 세포 내 형광 신호는 형광 현미경(TE2000, Nikon, Tokyo, Japan)으로 가시화되었다.

도 3은 본 발명의 PB 나노입자의 시험관 내 세포 독성을 확인하여 나타낸 그래프이다.

도 3의 (a)는 다양한 농도의 PB 나노입자로 처리 된 NIH-3 T3 섬유 아세포의 생존율을 나타낸 그래프이다.

도 3의 (a)를 참조하면, 거의 100%의 세포가 100μg/mL의 PB 나노입자의 존재 하에서 대사 활성이었고 세포 생존율은 200μg/mL의 PB 나노입자에서도 88±6% 임을 확인할 수 있다. 즉, PB 나노입자의 유의한 세포 독성은 관찰되지 않은 것을 확인할 수 있다.

도 3의 (b)는 다양한 농도의 H₂O₂로 처리된 NIH-3 T3 섬유아세포의 PB 나노입자(50μg/mL)의 첨가 여부에 따른 생존력을 나타낸 그래프이다.

도 3의 (b)를 참고하면, H₂O₂ 농도가 증가함에 따라 세포 생존력이 크게 감소하고, PB 나노입자 없이 세포 생존율은 각각 25μM, 50μM 및 100μM의 H₂O₂ 농도에서 37±6%, 13±2% 및 8±3% 인 것에 반해, PB 나노입자(50μg/mL)를 추가하면 동일한 H₂O₂ 환경에서 세포 생존율이 88±5%, 79±4%, 67±8%로 현저하게 향상된 것을 확인할 수 있다.

도 3의 (c)는 형광 현미경으로 시각화 된 NIH-3 T3 섬유아세포에서 H₂O₂ 매개 세포 내 ROS 생성에 대한 PB 나노입자의 첨가 여부에 따른 효과를 나타낸 사진이다.

도 3의 (d)는 마이크로 플레이트 리더를 통한 형광 측정에 의한 정량 분석 그래프이다.

도 3의 (c) 및 (d)를 참조하면, H₂O₂를 처리한 경우 높은 세포 내 형광 신호를 보이는 것으로 보아 세포 내에 높은 수준의 ROS가 있음을 확인할 수 있으나, 이에 PB 나노입자를 첨가하는 경우 형광 신호가 극적으로 감소한 것을 확인하여 PB 나노입자에 따른 세포 내 ROS 소거 활성을 확인할 수 있다.

<실험예 4> PB 나노입자의 체외(in vitro) 항 염증 효과 측정 실험

본 발명의 PB 나노입자의 체외 항 염증 효과를 측정하는 실험을 진행하였다. 이를 위하여, LPS로 자극 된 RAW 264.7 대식세포주를 이용하였다. LPS는 Toll-like receptor 4 (TLR4)를 통해 대식세포를 활성화하여 일련의 신호 발생 이벤트를 유발하여 ROS 및 기타 염증 매개체를 생성한다. 이러한 대식세포에 의해 생성 된 높은 수준의 ROS와 염증성 사이토 카인은 상처 회복을 더디게 하는 주요 원인이다. 따라서, 상처 치료 효율을 높이기 위해서는 과도하게 활성화된 대식세포의 염증 촉진 특성을 완화할 필요가 있다. 실험예 4에서는 유세포 분석을 통하여 대식세포에서 LPS 유도 ROS 생성에 대한 PB 나노입자의 억제 효과를 확인하였다.

이를 위하여, 먼저 RAW 264.7 대식세포주를 6-well 조직 배양 플레이트(5x105cell/well)에 접종하였다. 12시간 후, PB 나노입자(50μg/mL) 첨가 여부를 달리하고 LPS(100ng/mL)로 세포를 자극하였다. LPS 처리가 없는 세포는 대조군으로 사용되었다. 24시간 배양 후, 세포를 PBS(phosphate-buffered saline)로 세척하고 PureLink RNA 미니 키트를 사용하여 세포 내 모든 RNA를 분리하였다. 정제된 RNA의 농도와 품질은 260nm 및 280nm에서 흡광도 측정을 통해 측정되었다. AccuPower RocketScript CycleRT 프리믹스 (Bioneer, Seoul, Korea)를 사용하여 샘플 당 2μg의 RNA를 cDNA로 역전사하고 StepOnePlus Real-Time PCR 시스템(Applied Biosystems, CA, USA)에서 ROX와 함께 PowerUp SYBR Green Master Mix를 사용하여 RT-qPCR을 수행하였다. 이때, β은 정규화를 위한 내인성 참조 유전자로 사용되었다. 상대적인 유전자 발현은 대조군과 비교하여 ΔΔCt방법으로 계산되었다. 실험에 사용 된 프라이머 서열을 하기 표 1에 나타내었다. 그 다음, 단백질 수준 분석을 위해 대식세포를 LPS 자극 후 그 배지를 수집하여, TNF-α의 농도는 마우스 TNF-α ELISA 키트 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 측정하였다.

[표 1]

도 4는 PB 나노입자의 체외 항 염증 효과를 나타낸 그래프이다.

도 4의 (a)는 PB 나노입자(50μg/mL) 첨가 여부를 달리하여 LPS 자극된 뮤린 대식세포에서 측정한 ROS 생성에 대한 유세포 분석 그래프이다.

도 4의 (b)는 PB 나노입자 첨가 여부를 달리하여 LPS 유도 ROS의 현저한 감소를 보여주는 유세포 분석 데이터의 정량 분석 그래프이다.

도 4의 (a) 및 (b)를 참조하면, LPS 자극된 대식세포 내에서 ROS 수준이 증가하여 세포에서 높은 형광 신호가 관찰되는 것을 확인할 수 있다. 이와 달리, PB 나노입자를 첨가하였을 때 대식세포의 ROS 수준이 현저하게 낮은 것을 확인할 수 있다.

상기에 착안하여 유전자 발현 분석을 통해 PB 나노입자의 항 염증 효과를 구체적으로 분석하였다.

도 4의 (c)는 PB 나노입자 첨가 여부를 달리하여 LPS 활성화 RAW 264.7 세포에서 전 염증(TNF-α, IL-1β) 및 항 염증(ARG-1) 유전자의 발현을 분석한 그래프이다.

도 4의 (c)를 참조하면, 염증 환경에서 대식세포의 전 염증 유전자의 발현은 현저하게 증가하는 반면, 항 염증 유전자의 발현은 감소한다. PB 나노입자와 함께 배양 된 RAW 264.7 세포는 전 염증성 사이토 카인(TNF-α 및 IL-1β)의 발현이 증가하지 않은 것을 확인할 수 있다. 예상대로 대식세포에서 TNF-α와 IL-1β의 발현은 LPS로 자극 한 후 현저하게 증가하였으나, LPS와 PB 나노입자를 함께 처리 한 세포는 LPS 만 처리 한 세포에 비해 TNF-α와 IL-1β의 발현이 현저히 감소한 것을 확인할 수 있다. 또한, PB 나노입자가 처리되지 않은 대조군 세포에 비해 PB 나노입자를 처리한 세포에서 항 염증 유전자 ARG-1의 더 높은 발현이 관찰되는 것을 확인할 수 있다. 예상대로 ARG-1의 발현은 LPS 자극 후 감소했으나, 이에 비해 LPS와 PB 나노입자를 함께 처리 한 세포에서 ARG-1의 발현이 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있다(p<0.05).

유전자 발현 분석과 더불어 PB 나노 자임에 의한 TNF-α 분비 억제도 ELISA를 통해 단백질 수준에서 평가되었다

도 4의 (d)는 PB 나노입자 첨가 여부를 달리하여 LPS 자극 대식세포에 의한 TNF-α 분비를 측정한 그래프이다.

도 4의 (d)를 참조하면, TNF-α 분비는 대조군과 PB 나노입자 처리 된 세포에서 가장 최소인 것을 확인할 수 있다. 이와 대조적으로, LPS 자극된 대식세포는 높은 수준의 TNF-α를 생산하였다. 그러나 LPS로 자극하고 PB 나노입자를 처리 한 세포는 유전자 발현 분석과 동일하게 전 염증성 사이토 카인의 분비가 현저하게 감소(p<0.001) 된 것으로 확인되었다. 이를 통해, PB 나노입자는 ROS 소거와 더불어 항 염증 매개체로도 작용할 수 있음을 확인할 수 있다.

<실험예 5> PB 나노입자의 상처 치료 및 조직 재생 효과 확인 실험

본 발명의 PB 나노입자의 생체 내 상처 치료 및 조직 재생 효과를 확인하는 실험을 진행하였다.

이를 위하여, 먼저 마우스를 이용하여 염증 피부 상처 모델을 준비하였다.

<실시예 1> 염증 피부 상처 모델 준비

생체 내 상처 치유 실험에는 암컷 ICR 마우스를 이용하였다. 상처는, 먼저 수술용 가위를 사용하여 등쪽에 피부 절개(20×20mm²)를 형성하였다. 그런 다음 표피, 진피 및 피하 조직을 완전히 제거하여 근막을 노출시켰다. 이때, 6-0 실크 봉합사(Ethicon, Somerville, NJ, USA)를 사용하여 상처 가장자리에 8개의 봉합사를 적용하여 상처의 수축을 최소화하였다. 모든 마우스는 0일째부터 격일로 상처 부위에 10μg의 LPS를 피내 주사하여 급성 염증을 생성하였다. 그런 다음, PBS에 PB 나노입자(50μg 또는 500μg)를 첨가하여 전체 상처에 국소적으로 도포하였다. 50μg×4 그룹의 경우, 50μg PB 나노입자를 마우스 상처 부위에 4 일마다 반복적으로 국소 처리 하였다. 대조군 그룹의 마우스는 PBS만 처리하였다. 수술 및 치료 후 각 상처를 6.25cm² 크기의 파라 필름으로 덮은 다음 9.0cm² 크기의 투명 테가덤(tegaderm) 필름(3M), 거즈(대한 메디칼), 코반 붕대(대한 메디칼)로 드레싱하였다. 비접착성 파라 필름은 PB 나노입자의 손실을 최소화하기 위해 PB와 드레싱 사이의 장벽으로 사용되었다. 그러나, 각 파라 필름은 공기를 순환시키고 고름 축적을 방지하기 위해 여러 개의 작은 구멍(직경 1mm)으로 천공되었다. 2일 마다 파라 필름, 테가 덤, 거즈, 코반을 제거하고 상처 부위를 디지털 카메라로 촬영하였다. 그런 다음 파라 필름을 재사용하고 다른 드레싱을 새로 교체하여 상처 등을 덮었다. 14일 이후 상처 부위의 조직 외식편을 제거하고 조직 샘플을 조직학적 분석을 위하여 10% 중성 완충 포르말린에 고정하였다.

도 5는 PB 나노입자의 생체 내 상처 치유 활성을 나타내는 그래프이다.

도 5의 (a)는 상처 부위를 나타내는 사진이다.

도 5의 (b)는 상처 봉합률을 정량화하여 나타낸 그래프이다. 이때, *는 무 처리 군에 비해 p<0.05, @는 50μg 군에 비해 p<0.05, #은 500μg 군에 비해 p<0.05임을 나타낸다.

도 5의 (a) 및 (b)를 참조하면, 4일차까지 모든 PB 나노입자 처리 그룹은 동일하게 효과적이었고, 처리되지 않은 대조군보다 더 높은 상처 봉합률을 보이는 것을 확인할 수 있다. 그러나 6일부터 상처 봉합률은 PB 나노입자 처리 그룹간에 차이를 나타내기 시작하였으며, 적은 양의 PB(50μg) 치료군의 치유 효과는 6일부터 약화되기 시작하였으며, 치료하지 않은 군과의 차이는 시간이 지남에 따라 감소하는 것을 확인할 수 있다. 또한, 50μg 치료군과 비교하여, 500μg 치료군에서 더 높은 상처 봉합률을 보이는 것을 확인할 수 있으며, 이는 곧 PB 나노입자의 용량이 높을수록 효과적인 상처 봉합률을 갖는 것을 확인할 수 있다. 반면에, 적은 양의 PB 나노입자(4일마다 50μg PB 반복 도포)을 사용한 경우 500μg 또는 50μg 단일 처리보다 더 효과적인 것을 확인할 수 있다. 수술 후 10일 째에 50μg×4 그룹 만이 대조군 (58.9 ± 2.7 %)에 비해 훨씬 더 높은 상처 봉합률(73.5 ± 4.7 %)을 나타냈으며, 12 일째에 50μg×4 그룹 (89.9 ± 2.5 %) 및 500μg 그룹 (81.5 ± 3.6 %)은 대조군 (67.2 % ± 2.3 %) 및 50μg 그룹 (74.3 ± 4.1%)과 비교하여 유의 한 차이(p <0.05)를 나타내는 것을 확인할 수 있다. 결과적으로, 14 일째에 50μg×4 그룹은 95.5 ± 1.1 %의 상처 봉합 결과를 보였으며 이는 500μg 그룹 (87.6 ± 1.5 %), 50μg 그룹 (71.5 ± 5.5 %) 및 대조군 (72.0 ± 1.3%) 보다 현저하게 높은 것을 확인할 수 있다. 이를 통해, PB 나노입자의 농도가 높을수록, 또한, PB 나노입자를 반복적으로 처리할수록 상처 부위에서 지속적으로 ROS 소거 및 항염 효과를 제공함으로써 최상의 상처 봉합을 제공 할 수 있음을 확인할 수 있다.

<실험예 6> PB 나노입자 처리에 따른 상처 성숙 및 조직학적 분석 실험

본 발명의 PB 나노입자의 상처 성숙 및 조직 재생 효과 확인을 위하여 상처를 조직학적으로 분석해보는 실험을 진행하였다. 이를 위하여, 상기 실시예 1의 마우스의 피부 상처 부위를 4일마다 촬영하여 분석하였으며, H&E(헤마톡실린-에오신) 및 MT(Masson 's trichrome)으로 염색하여 상처 부위의 재생된 피부 층을 정의하고 상처 가장자리, 피하(SC), 육아 조직 면적 및 비대 표피(HE) 층의 두께를 정량화하여 Image J 소프트웨어로 정량 분석 하였다.

도 6은 상처 피부 샘플을 조직학적으로 분석한 그래프이다.

도 6의 (a)는 각 그룹을 H&E 염색(상단) 및 MT 염색(하단) 한 사진이다. 이때, 검은색 화살표는 피부 상처의 가장자리를 나타낸다.

도 6의 (b)는 (a)의 점선 사각형 상자를 확대하여 나타낸 이미지이다. 이때, EP는 표피, HE는 비대성 표피, DE는 진피, GR은 육아 조직을 나타낸다.

도 6의 (c)는 상처의 가장자리 간의 거리, (d)는 피하층 간의 거리, (e)는 육아 조직의 면적, (f)는 비대성 표피 두께를 비교한 그래프이다. 이때, *는 대조군에 비해 p<0.05를 나타내고, @는 50μg군에 비해 p<0.05를 나타낸다.

도 6을 참조하면, 대조군(No treat)은 비대성 표피 (151.03±15.03μm) 아래에 큰 면적의 육아 조직 (35.60±3.11mm²)이 존재하는 것을 확인할 수 있으며, 이는 곧 재생된 상처 조직의 성숙이 잘 일어나지 않은 것을 나타낸다. 또한, 미성숙된 재생 피부는 육아 조직이 피부층으로 완전히 분화하지 않아 상처 가장자리 거리 (15.03±2.00mm) 및 피하층 간 거리가 길다. 이와 달리 500μg의 PB 나노입자로 처리된 그룹은 상처 가장자리에서 재생 조직이 더 잘 성숙되어 대조군에 비해 상처 가장자리 거리 (7.89±1.06mm)와 비대성 표피 두께 (111.07±12.59 μm)가 현저하게 감소한 것을 확인할 수 있다. 특히, 50μg×4 그룹(4 일간 50μg의 PB 나노입자를 반복 처리 한 그룹)은 가장 낮은 상처 가장자리 거리 (6.31±0.28mm), SC 간 거리(9.85±0.37mm), 육아 조직 영역 (18.73±0.74mm²) 및 HE 두께 (79.10±13.41μm)를 나타내며 다른 그룹에 과립 조직이 적은 상피 및 진피층의 재건이 개선되었음을 확인할 수 있다.

<실험예 7> PB 나노입자의 상처 콜라겐 침착 및 조직 효과 확인 실험

콜라겐 침착은 상처 부위의 재생에 매우 중요하다. 이는 상처 치유의 첫 단계에서 형성되는 피브린-피브로넥틴 혈전을 대체하며 상처 부위를 보호한다. 게다가 콜라겐은 혈관 신생과 결합 조직 형성에 관여하는 세포의 부착, 성장, 분화를 위한 주형 역할을 하므로, 상처 부위에서의 콜라겐 침착은 피부 조직 재생을 위해 중요하다.

실험예 7에서는 본 발명의 PB 나노입자의 상처 부위의 콜라겐 침착 및 조직 효과를 확인하는 실험을 진행하였다.

이를 위하여, 먼저 시리우스 레드(Picro-sirius red) 염색을 통해 상처 부위의 콜라겐 침착을 확인하였다.

도 7은 상처 피부에서의 콜라겐 조직을 나타낸 사진 및 그래프이다.

도 7의 (a)는 시리우스 레드 염색 후 상처 조직 절편의 진피층에서 콜라겐 다발의 형태를 보여주는 명시야(Bright field) 이미지를 나타낸 도면이다.

도 7의 (a)를 참조하면, 대조군에서부터 500μg까지 PB 나노입자의 용량이 증가할수록 콜라겐 다발이 더 조밀하고 두껍게 형성된 것을 확인할 수 있다. 특히, 50μg×4 그룹은 다른 그룹에 비해 콜라겐이 가장 높은 밀도와 두께를 나타냈다. 이를 통해 PB 나노입자가 상처 치유 과정에서 콜라겐 침착을 향상시켰음을 확인할 수 있다.

본 발명의 PB 나노입자 처리는 콜라겐 침착뿐만 아니라 콜라겐 조직에도 영향을 미친다. 일반적으로 III형 콜라겐은 콜라겐 침착 초기 단계에서 많이 생성되어, 성숙 후기 단계에서 III형 콜라겐보다 더 강력한 특성을 갖는 I형 콜라겐으로 대체된다. 정상 피부 세포에서 콜라겐 섬유는 바구니 짜임새와 같은 형태를 나타내는 반면, 미성숙한 재생 상처 조직의 콜라겐 섬유는 일렬에 가깝게 정렬된 형태를 갖는다.

이러한 콜라겐 조직을 분석하기 위하여 새로 형성된 콜라겐 섬유의 배향을 편광 현미경으로 관찰하였다.

도 7의 (b)는 콜라겐 섬유의 배향을 편광 현미경으로 관찰한 이미지이다. 이때, 콜라겐 I형은 주황색-적색, 콜라겐 III형은 녹색-노란색으로 나타난다.

도 7의 (c) 및 (d)는 콜라겐 I형 및 III형의 분포를 분석하기 위한 이미지 및 그래프이다.

도 7의 (c) 및 (d)를 참조하면, 대조군과 50μg군은 주로 I형 콜라겐이 거의 없는 III형 콜라겐의 분포를 나타내었으며, 두 군 모두에서 콜라겐 배향이 일렬에 가깝게 정렬된 상태인 것을 확인할 수 있다. 500μg군에서도 III형 콜라겐 다발이 남아 있었지만, I 형 콜라겐이 바닥에서부터 점차 III 형 콜라겐 다발을 대체 한 것으로 확인되었으며, 대조군이나 50μg군에 비하여 콜라겐 배향이 훨씬 넓어진 것을 확인할 수 있다. 특히, 50μg×4 그룹의 경우, 콜라겐 섬유 다발이 다른 군에 비해 두께가 가장 두껍고 밀도가 높은 것을 확인할 수 있다.

<실험예 8> PB 나노입자의 상처 표피 분화 촉진 및 혈관 신생 효과 확인 실험

상처가 치유되는 과정에서는 각질 세포와 같은 상피 세포가 활성화되어 새로운 조직으로 이동하여 상처와 환경 사이의 장벽을 형성하게 된다. 상처 부위에서 재생 된 피부층이 성숙하는 동안, 표피의 각질 세포는 층을 이루고 분화하여 각질층 위에 놓인 기저층과 과립층을 형성하게 된다. 이러한 각질 세포는 기저 세포층에서 피부 표면을 향해 이동함에 따라 점차 분열 및 최종 분화 능력을 상실하게 되는데, 이 과정에서 각질화 된 외피의 세포질 단백질 전구체인 인볼루크린(involucrin)을 포함한 분화 의존성 단백질이 합성된다. 따라서, 본 발명의 실험예 8에서는 상기와 같은 상처에서의 표피 분화에 대한 PB 나노입자의 효과를 분석하기 위하여, 인볼루크린 등 분화 의존성 단백질의 발현을 분석하였다.

인볼루크린, CD31, α-SMA, F4/80 및 TNF-α의 발현 수준은 면역 형광 염색으로 확인되었다. 이를 위하여, 먼저 섹션화 된 실시예 1에 따른 상처 조직 샘플을 준비하여 0.1% Triton X-100 처리 후 5% 염소 혈청과 함께 실온에서 1 시간 동안 배양하여 비특이적 결합을 차단하였다. 그런 다음 샘플을 4℃에서 하룻밤 동안 1차 항체로 처리하였다(인볼루크린 및 CD31의 경우 1:100, α-SMA, F4/80 및 TNF-α의 경우 1:200으로 처리). 상기 샘플을 세척하여 형광단이 결합 된 2차 항체(Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA)와 반응시켰다. 마지막으로, 샘플을 핵염색 DAPI로 대조 염색하고 형광 현미경 (IX71 도립 현미경; Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 관찰하였다.

도 8은 피부 상처 모델의 면역 조직 화학적 염색 분석 사진이다.

도 8의 (a) 및 (b)의 녹색은 인볼루크린, 파란색은 DAPI, 빨간색(위쪽)은 Anti-CD31, 빨간색(아래쪽)은 anti-α-SMA, 흰색 화살표는 세동맥을 나타낸다.

도 8의 (c)는 인볼루크린, (d)는 CD3, 및 (e)는 세동맥을 발현 면적에 대한 백분율로 정량화한 그래프이다. 이때, *는 대조군에 비해 p<0.05, @는 50μg 군에 비해 p<0.05, #은 500μg 군에 비해 p<0.05를 나타낸다

도 8의 (a) 및 (c)를 참조하면, 대조군과 50μg 군에서는 표피층에 인볼루크린이 거의 발현되지 않은 것을 확인할 수 있다. 반면, 500μg 그룹에서는 인볼루크린의 발현이 향상된 것을 확인할 수 있으며, 특히, 50μg×4 그룹에서는 더욱 강한 발현이 관찰되는 것을 확인할 수 있다.

다음으로, 피부 상처 조직 재생을 위하여 섬유아세포와 상피 세포에 산소와 영양소 공급이 필요하므로 상처 재생에 필수적인 혈관 신생 특성을 평가하였다. 이를 위하여 α-SMA 항체 염색을 이용하였는데, 이는 새로운 혈관을 검출하기 위하여 혈관벽의 평활근 세포를 식별하는 역할을 한다. 이때, α-SMA는 평활근 세포뿐만 아니라 근섬유 아세포에서도 발현되기 때문에 새로 형성된 혈관을 나타내는 α-SMA 양성 원형 구조 만을 분석하였다. 이는 도 8의 (b)의 흰색 화살표로 표시된다. 이러한 원형 구조를 가진 세동맥의 단위 면적당 개수를 세어 분석하였다. 또한, CD31 항체 염색을 사용하여 상처 부위의 모세 혈관을 검출하였다.

도 8의 (b), (d) 및 (e)를 참조하면, 신생 세동맥의 수는 대조군 및 50μg 그룹에 비해 50μg×4 그룹 및 500μg 그룹에서 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있으며, 이때 50μg×4 그룹의 세동맥 수가 500μg군에 비해 현저히 많은 것을 확인할 수 있다. 또한, 대조군과 50μg 그룹 모두 낮은 CD31 발현을 나타내는 것에 반해 50μg×4 그룹은 다른 모든 그룹에 비해 CD31의 발현이 유의하게 높은 것을 확인할 수 있으며, 이를 통해, PB 나노입자의 반복적인 도포가 높은 수준의 혈관 신생 및 혈관 신생을 유도할 수 있으며, 이는 적절한 혈액 공급으로 인해 상처 피부의 재 상피화, 콜라겐 침착 및 피부 층의 성숙을 통해 상처 치유 효율을 향상시킬 수 있음을 확인할 수 있다.

<실험예 9> PB 나노입자의 생체 내(in vivo) 항 염증 효과 확인 실험

본 발명의 PB 나노입자의 생체 내 항 염증 효과를 확인하는 실험을 진행하였다.

이를 위하여, 대식세포 모집의 정도를 분석하기 위해 대식세포 표면에서 발현되고 일반적으로 조직 대식세포를 식별하는데 사용되는 F4/80 당 단백질의 면역 염색을 사용하였다.

도 9는 PB 나노 자임의 생체 내 항 염증 효과를 나타내는 이미지 및 그래프이다.

도 9의 (a) 및 (b)의 빨간색(위)은 F4/80을, 파란색은 DAPI를, 빨간색(아래)는 TNF-α를 나타낸다.

도 9의 (c) 내지 (e)는 각각 (c) F4/80의 중심 영역, (d) F4/80의 가장자리 영역 및 (e) TNF-α의 중심 영역에 대한 양성 발현 영역의 백분율을 정량화하여 나타낸 그래프이다.

도 9를 참조하면, F4/80 발현은 PB 나노입자의 용량이 증가함에 따라 감소하였으며, 50μg 그룹조차도 대조군보다 현저하게 감소 된 F4/80 양성 영역 (중앙 : 2.4 ± 0.9 %, 가장자리 : 2.5 ± 0.8 %)을 나타내었다. 50μg × 4그룹 (중앙 : 0.4 ± 0.1 %, 가장자리 : 0.3 ± 0.7 %) 그룹에서 F4/80의 발현은 대조군 또는 50μg 그룹보다 거의 10 배 가량 낮은 것으로 확인되었다. 활성화 된 대식세포에서 분비되는 염증의 급성 반응에 관여하는 전 염증 사이토카인 인 TNF-α 또한 PB 나노입자 처리에 의해 상처의 중앙부에서도 감소한 것을 확인할 수 있으며, 500μg 그룹(1.7 ± 0.2%) 또는 50μg × 4그룹 (1.4 ± 0.3%)은 대조군 (5.2 ± 1.4%)과 비교하여 약 1/3으로 감소한 TNF-α 발현을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 이를 통해, 본 발명의 PB 나노입자의 강력한 생체 내 항 염증 효과는 감염된 상처 모델에서 전 염증성 사이토 카인의 분비를 방지 할뿐만 아니라, 대식세포 부담을 감소시킬 수 있음 또한 확인할 수 있다. 따라서, 전반적으로 PB 나노입자의 항 염증 활성은 상처를 장기간의 염증 상태로부터 예방하고 효과적인 상처 치유를 촉진하는 데 기여 가능한 것을 확인할 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

프러시안 블루 나노입자 첨가제를 포함하는 상처 치료제.
제1항에 있어서,
상기 상처는 창상(wound), 찰과상(abrasion), 열상(laceration), 자상(stab wound), 궤양 또는 이들의 조합인 것인 상처 치료제.
제1항에 있어서,
상기 프러시안 블루 나노입자는, 각질 세포의 분화 유도, 조직의 미세혈관 신생 촉진, 콜라겐 침착 또는 이들의 조합을 통해 상처 부위의 피부 조직 재생을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 상처 치료제.
제1항에 있어서,
항염증제, 진통제, 항-감염제 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상을 포함하는 상처 치료를 위한 치료 성분을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 상처 치료제.
제1항에 있어서,
현탁액, 겔, 로션, 크림 또는 연고 성상인 것을 특징으로 하는 상처 치료제.
프러시안 블루 나노입자가 환부 접촉면에 도포 또는 코팅된 것을 특징으로 하는 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱재.
제6항에 있어서,
상기 상처는 창상(wound), 찰과상(abrasion), 열상(laceration), 자상(stab wound), 궤양 또는 이들의 조합인 것인 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱재.
제6항에 있어서,
상기 피부 조직 재생은 각질 세포의 분화 유도, 조직의 미세혈관 신생 촉진, 콜라겐 침착 또는 이들의 조합인 것인 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱재.
제6항에 있어서,
하이드로콜로이드형, 폴리우레탄 폼형, 필름형 또는 하이드로겔형인 것을 특징으로 하는 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱재.
드레싱재를 준비하는 단계; 및
상기 드레싱재의 환부 접촉면에 프러시안 블루 나노입자를 코팅하는 단계;
를 포함하는 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱재의 제조방법.
제10항에 있어서,
상기 드레싱재의 환부 접촉면에 프러시안 블루 나노입자를 코팅하는 단계는,
프러시안 블루 나노입자 형성을 위한 전구체 용액을 준비하는 단계; 및
상기 드레싱재의 환부 접촉면을 상기 전구체 용액에 담그거나, 상기 전구체 용액을 상기 드레싱재의 환부 접촉면에 도포하여 상기 드레싱재의 환부 접촉면에 프러시안 블루 나노입자를 형성시키는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱재의 제조방법.
제11항에 있어서,
상기 프러시안 블루 나노입자 형성을 위한 전구체 용액을 준비하는 단계는,
페리시안화 이온([Fe(CN)₆]^3-)을 포함하는 화합물 및 철 이온(Fe³⁺)을 포함하는 화합물을 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및
상기 혼합물을 용매와 혼합하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱재의 제조방법.
제12항에 있어서,
상기 페리시안화 이온([Fe(CN)₆]^3-)을 포함하는 화합물은, 페리시안화칼륨(K₃Fe(CN)₆) 또는 페리시안화나트륨(Na₃Fe(CN)₆)인 것을 특징으로 하는 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱재의 제조방법.
제12항에 있어서,
상기 철 이온(Fe³⁺)을 포함하는 화합물은, 염화철(FeCl₃), 과염소산철(Fe(ClO₄)₃) 및 질산철(Fe(NO₃)₃)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱재의 제조방법.
제12항에 있어서,
상기 용매는 물인 것을 특징으로 하는 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱재의 제조방법.