CN115317514B - PAA-CaO2NPs纳米喷雾及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于化学合成领域，具体涉及PAA‑CaO2纳米喷雾及其制备方法和应用。本发明提供了一种制备纳米粒子的组合物，所述的组合物由表面改性剂和纳米颗粒组成；所述的表面改性剂为PAA，所述的纳米颗粒为CaO2。本发明制备的PAA‑CaO2纳米粒子释放钙离子和活性氧是稳定可持续的，具有可调节的pH响应以及良好生物相容性，其中可调节的pH响应赋予PAA‑CaO2纳米粒子在酸性pH下增强的抗菌活性氧传递和成纤维细胞增殖迁移钙离子传递。用其纳米喷雾制剂能加速创面的愈合，具有促进凝血以及抑菌的功效。

Description

PAA-CaO2NPs纳米喷雾及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于化学合成领域，具体涉及PAA-CaO2纳米喷雾及其制备方法和应用。
背景技术
创伤修复一直是皮肤再生和组织工程领域的研究热点。皮肤是抵抗外力和物体的最大物理屏障，肿瘤切除、糖尿病溃疡和意外伤害都可能导致皮肤损伤。皮肤损伤需要紧急治疗，伤口未经处理可能增加感染、残疾和死亡的可能性。此外，如果不治疗伤口并让其完全愈合，由于暴露的皮下组织易受微生物定植和增殖的影响，伤口感染的潜在风险会显著增加。伤口愈合的阶段很复杂，包括止血、炎症、增殖和重塑。愈合延迟增加了对额外治疗措施的需求。在伤口处理过程中，感染的风险一直存在，因此患者需要频繁更换敷料以避免感染，直到皮肤恢复其屏障功能。在应对慢性创伤时，如不采取及时有效的伤口管理，压力、血流不畅和水肿在内的各种损伤都会进一步阻碍愈合，导致不可控的后果。
临床实践中，治疗大面积皮肤伤口最常见的策略是将自体或异体皮肤组织移植到伤口部位，以补偿组织损失。自体或异体移植的使用受限于继发性创伤的发生、供体的低可用性和高成本。伤口敷料的使用为促进缺损部位皮肤修复和重建提供了一种替代策略。使用纤维膜和水凝胶型伤口敷料已经在促进皮肤愈合方面得到了广泛研究。尽管纤维垫在防止细菌繁殖和改善透气性方面具有明显的优势，但它们很容易从伤口处脱落。作为一种替代策略，软水凝胶可以填充不规则的伤口，但会限制伤口部位的气体交换。因此，迫切需要新的伤口敷料配方来满足上述要求。
发明内容
伤口愈合是一个钙介导的过程。钙流入细胞可调节炎症细胞浸润、成纤维细胞增殖和角质形成细胞迁移。此外，钙在皮肤的正常内环境稳定中具有既定的作用，并且是角质形成细胞增殖和分化的调节剂。这些特征与皮肤高度相关，皮肤与其环境处于永久的动态平衡状态。临床上，通过海藻酸钙敷料对人体慢性伤口治疗直接局部应用钙已被证明是有益的。通过将银、新鲜血液、壳聚糖为基础基质与海藻酸钙的独特组合构建了一种新型敷料，用于治疗创伤，加速了慢性伤口的愈合，使得胶原沉积增加。
活性氧(ROS)是一个活性小化学分子家族，如过氧化氢、单线态氧、超氧阴离子和羟基自由基。在各种活性氧种类(ROS)中，过氧化氢(H2O2)的活性相对较差，这使得它能够从其生成位置迁移到更远的位置，作为信号分子或第二信使。当皮肤损伤发生时，周围组织中的H2O2浓度立即升高，然后达到峰值并逐渐消失。H2O2水平的动态变化伴随着创面的愈合过程，创面组织中H2O2的浓度在一定程度上影响创面的愈合。同上所述，伤口愈合是一个受到严格控制的过程，在这个过程中，H2O2发挥着多种功能。除了杀死微生物外，H2O2还充当信号分子或第二信使，传递损伤信息并刺激效应细胞作出反应。
值得注意的是，H2O2作为一种现成的ROS，可以化学改变重要生物分子如脂质、DNA等重要生物分子和DNA的结构，进一步干扰细菌代谢，最终杀死细菌，在机体的进一步生化作用下，依旧可以为伤口愈合过程中提供一定的氧源。不幸的是，过氧化氢在抗菌治疗中的局限性主要包括：效率低、工艺慢、局部富集浓度高。因此，开发具有高效、安全且无需特殊设备与额外的能量输入即可自主发挥作用的活性氧来源，无疑将成为该研究领域的重要突破。
截至目前，金属过氧化物纳米颗粒由于其在治疗耐药细菌感染及创伤愈合方面的前景而在感染伤口应用方面受到了广泛关注。正是活性氧(ROS)诱导的氧化应激在这些纳米颗粒的抗菌能力中发挥了重要作用。由此，我们通过Ca(OH)2与H2O2反应，形成一种既囊括了钙离子又包含了活性氧释放的CaO2纳米颗粒。
但是，在水溶液中制备的CaO2纳米颗粒倾向于聚集，难以控制其粒径和形貌，并且在水中容易水解。为了解决上述问题，我们引入了聚丙烯酸(Polyacrylic acid,PAA)作为表面改性剂来稳定CaO2纳米颗粒使团聚问题得到了缓解，所制得的无定形过氧化钙(PAA-CaO2)可以在缺氧的情况下有效地生成过氧化氢(H2O2)和游离钙离子作为治疗“药物”，为这一问题提供了一个潜在的解决方案。
因此，我们通过一锅法制备了具有高“药物”负载量、良好的生物相容性和生物降解性、pH响应性和合适的药物递送尺寸的新型纳米载体。更重要的是，从PAA-CaO2中释放钙离子和活性氧是稳定可持续的、可调节的pH响应和良好生物相容性的。可调节的pH响应赋予PAA-CaO2纳米粒子在酸性pH下增强的抗菌活性氧传递和成纤维细胞增殖迁移钙离子传递。药物的体内药效通过对SD大鼠模型中的急性伤口、感染伤口组织修复的综合研究做进一步评估。
本发明的目的之一，在于提供一种制备纳米粒子的组合物。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
所述的组合物由表面改性剂和纳米颗粒组成；所述的表面改性剂为PAA，
所述的纳米颗粒为CaO2。
本发明的目的之二，在于提供一种含有上述组合物的纳米粒子。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
所述的纳米粒子粒径为95nm～105nm。
本发明的目的之三，在于提供一种含有上述纳米粒子的制剂。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
所述的制剂包括乳剂，微球，喷雾，颗粒，片剂，悬浮剂中的一种或多种。
本发明的目的之三，在于提供一种纳米喷雾的制备方法，该方法为纳米喷雾的制备提供了一种新思路。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
基于一种纳米喷雾的制备方法，具体包括以下步骤：
S1：制备所述的纳米粒子，将其保存在无水乙醇中；
S2：将S1所得物离心，所得沉淀物分散并超声，即得。
进一步，所述的S1中纳米粒子的制备具体为：将PAA溶液和氯化钙溶液滴加到无水乙醇中，搅拌后滴加过氧化氢溶液，再加入氨水搅拌至浑浊，离心后洗涤即得。
进一步，所述的PAA溶液浓度为0.5mg/ml；所述的氯化钙溶液浓度为1mol/L；所述的过氧化氢溶液质量浓度为30％；所述的氨水质量浓度为5％。
进一步，所述的洗涤使用的洗涤剂为甲醇和甲醇-水混合液，洗涤条件为13000rpm，20min，20℃。
本发明的目的之四，在于提供一种上述的制备方法得到的纳米喷雾。
本发明的目的之五，在于提供一种上述的组合物或上述的纳米粒子或上述的制剂或上述的纳米喷雾在制备治疗创面愈合的药物中的应用。
本发明的目的之六，在于提供一种上述的组合物或上述的纳米粒子或上述的制剂或上述的纳米喷雾在制备钙离子释放剂中的应用。
本发明的有益之处在于：
1)本发明提供了一种具有高钙离子负载量、良好的生物相容性、生物降解性、pH响应性和合适药物递送尺寸的新型纳米载体。
2)本发明制备的PAA-CaO2纳米粒子释放钙离子和活性氧是稳定可持续的，具有可调节的pH响应以及良好生物相容性。其中可调节的pH响应赋予PAA-CaO2纳米粒子在酸性pH下增强的抗菌活性氧传递和成纤维细胞增殖迁移钙离子传递。
3)本发明提供的纳米喷雾制剂能加速创面的愈合，具有促进凝血以及抑菌的功效。
附图说明
图1为Ca2+累积释放曲线。
图2为PAA-CaO2 NPs的SEM电镜图。
图3为PAA-CaO2 NPs在不同pH值下的凝血试验。
图4为抗菌性能测试结果。
图5为不同pH值下PAA-CaO2 NPs处理后细菌形态SEM图像。
图6为PAA-CaO2 NPs处理细菌后的明场和ROS荧光染色图像。
图7为细胞增殖的荧光表征图像。
图8为CCK-8检测结果。
图9为划痕实验及细胞间隔平均减少量的统计结果。
图10为PAA-CaO2 NPs释放的游离Ca2+和ROS的细胞内检测。
图11为一般伤口愈合状态的动物活体图像。
图12为MRSA感染伤口愈合状态的动物活体图像。
图13为涂层平板及菌落平均数量的统计结果。
图14为PAA-CaO2 NPs的生物相容性测试。
具体实施方式
以下将对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
如无特殊说明，以下实施例中的百分数均表示试剂的质量分数。
实施例1.PAA-CaO2NPs纳米喷雾的制备
实验试剂：25％～28％氨水，30％过氧化氢，甲醇，聚丙烯酸(Polyacrylic acid，PAA)，无水氯化钙、超纯水。
制备步骤：取0.5mg/ml的PAA溶液，1mol/L的氯化钙溶液，以及上述其他试剂，将100μL的PAA溶液与100μL的氯化钙溶液缓慢滴加到100ml的无水乙醇当中，在一分钟内完成滴定，然后在20℃，800rpm下磁力搅拌10分钟；待搅拌完成之后，再向混合体系中缓慢滴加11μL30％的过氧化氢溶液，在1～2分钟内完成滴加，再向体系中加入稀释了5％的氨水300μL，其中300μL的5％氨水需要一次性快速加入到混合体系中，在800rpm，20℃条件下持续搅拌10分钟；待所得溶液由澄清变为浑浊，将其加入到5ml离心管内，分别使用甲醇和甲醇-水混合液洗涤1-2次，洗涤条件为13000rpm，20min，20℃，得到纳米粒子，-4℃保存在无水乙醇体系当中；离心去除无水乙醇，获得的沉淀用超纯水分散，后进行超声30min，制备得到纳米喷雾。
实施例2.CaO2负载能力和释放曲线测量
1)使用电感耦合等离子体源质谱仪(ICP-MS，Agilent7900，美国)检测包封后上清液中Ca2+的浓度，测定PAA-CaO2NPs中CaO2的含量。首先，将0.1gCaO2(m0)分散到15mL乙醇中。PAA-CaO2NPs合成后，离心得到沉淀，快速用水和乙醇洗涤，冷冻干燥后称重(mp)。然后，收集所有上清液，加入一定体积的盐酸(2M)。根据上清液体积和ICP-MS(波长＝422.7nm)测得的Ca2+浓度确定上清液中CaO2的量(ms)。CaO2负载量根据以下公式计算：CaO2负载量(％,w/w)＝PAA-CaO2NPs负载的CaO2质量/PAA-CaO2NPs的质量×100％＝(m0-ms)/mp×100％。
2)Ca2+释放量也通过袋滤法用ICP-MS测定。将装有1ml 2mg/ml PAA-CaO2NPs或2mg/ml CaO2NPs的透析袋(3500MW)分别浸入30mL不同pH值为5.5、6.5和7.4的PBS(无钙溶液)中。所有样品在37℃恒温水浴中以100r/min的速度振荡，在不同时间点(2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、48h、72h)采集检测样品进行检测Ca2+浓度。最后，基于一系列获得的Ca2+浓度拟合释放曲线来描述释放过程。
图1显示的是Ca2+的释放曲线，分别用不同pH值的生理盐水孵育材料测定离子释放浓度。即将材料放置于pH＝7.4、pH＝6.5的生理盐水中，于37℃下，放置振荡器(100rpm)中长达6小时，可以明显地看出PAA-CaO2NPs在酸性pH(6.5)下倾向于降解，从而触发了钙离子的释放。我们对比了在pH为6.5和7.4环境下CaO2NPs与PAA-CaO2NPs的释放动力学。显然，两种NPs都是pH响应的，Ca2+的释放随着pH从7.4下降到6.5而显著增加。酸性pH下Ca2+释放的增加归因于CaO2的降解，以及PAA和CaO2之间的静电相互作用的减少，当pH从7.4降低到6.5时，PAA的羧基去质子化较少。
值得注意的是，PAA作为一种生物相容性聚合物，具有更加微妙的pH敏感性，相同pH条件下，PAA-CaO2NPs的累积释放速率都明显大于CaO2NPs，当pH＝6.5时，72h时PAA-CaO2NPs的累积释放速率甚至达到了98.39％，而对比CaO2 NPs释放曲线，后者在48h的Ca2+累积释放率则出现了平台期，且最大累计释放率只有66.13％。结果提示，PAA和CaO2的组合可以作为可降解pH响应药物的很好的候选控释体系。
在上述pH值下，分别研究了PAA-CaO2NPs、CaO2 NPs和生理盐水存在下的体外凝血情况。对于生理盐水，在9小时内所有pH值均未观察到凝血。相比之下，PAA-CaO2 NPs在pH6.5和pH7.4时均能诱导凝血，凝血时间分别为1min和3min。结果表明，酸性物质本身对凝血作用没有影响，而PAA-CaO2NPs本身在中性条件下也具有血液相容性。然而，随着酸度的增加，PAA-CaO2NPs释放出更多的Ca2+，引起更快的血凝。而CaO2 NPs组凝血时间远远长于PAA-CaO2 NPs组(18min)，中性条件下(pH＝7.4)在9小时内甚至始终不发生凝血。凝血的结果也同时印证了材料释放的实验结果：PAA-CaO2NPs分解后的Ca2+传递具有较高的pH敏感性。值得注意的是，尽管在中性条件下PAA-CaO2NPs和CaO2NPs两者都具有一定相似的生物相容性，但是PAA-CaO2 NPs显示出更加优越的的促Ca2+释放效果以及随后的促凝血作用。
实施例3.PAA-CaO2NPs的表征
将PAA-CaO2NPs冻干后使用扫描电子显微镜(SEM，SU8010，Hitachi，Ltd.Japan)观察PAA-CaO2NPs和CaO2NPs的微形态。PAA-CaO2NPs和CaO2NPs的直径通过透射电子显微镜(TEM,7500,Hitachi,Ltd.Japan)观察。
如图2所示，制备得到的PAA-CaO2NPs均匀分布，且粒径较均匀散布在95nm～105nm范围内。
实施例4.PAA-CaO2NPs在不同pH值下的凝血试验
将0.5mL抗凝兔全血和0.5mL PAA-CaO2 NPs悬浮液在pH7.4、pH6.5的生理盐水中分别混合在柠檬酸盐抗凝管中。以生理盐水为对照，对样品进行时间记录和拍照。
在上述pH值下，分别研究了PAA-CaO2 NPs、CaO2 NPs和生理盐水存在下的体外凝血情况，结果如图3所示。对于生理盐水，在9小时内所有pH值均未观察到凝血。相比之下，PAA-CaO2 NPs在pH6.5和pH7.4时均能诱导凝血，凝血时间分别约为1min和3min。结果表明，酸性物质本身对凝血作用没有影响，而PAA-CaO2 NPs本身在中性条件下也具有血液相容性。然而，随着酸度的增加，PAA-CaO2 NPs释放出更多的Ca2+，引起更快的血凝。而CaO2 NPs组凝血时间远远长于PAA-CaO2 NPs组(约18min)，中性条件下(pH＝7.4)在9小时内甚至始终不发生凝血。凝血的结果也同时印证了材料释放的实验结果：PAA-CaO2 NPs分解后的Ca2+传递具有较高的pH敏感性。值得注意的是，尽管在中性条件下PAA-CaO2 NPs和CaO2 NPs两者都具有一定相似的生物相容性，但是PAA-CaO2 NPs显示出更加优越的的促Ca2+释放效果以及随后的促凝血作用。
实施例5.PAA-CaO2NPs的体外抗菌特性
本实施例中所有细菌实验均使用革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性大肠杆菌。
1)CaO2、PAA-CaO2和SS的抗菌活性采用改良圆盘扩散试验(K-B)方法。通过将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌接种在LB液体培养基中并在37℃(100rpm)下振荡过夜来制备细菌溶液，将它们接种在琼脂平板上并分成三组。将完全浸入两种喷雾溶液和SS中的5mm滤纸盘放在板的中心。37℃孵育24h后，测定抗菌环面积，评价抗菌能力。
2)对于细菌的SEM图像，通过离心(12000rpm，3分钟)收集1ml大肠杆菌/金黄色葡萄球菌(108CFU/ml)，然后分散到PBS缓冲液(pH6.5和pH7.4)作为对照和PBS含有PAA-CaO2NPs和CaO2NPs的缓冲液(pH6.5和pH7.4)作为实验组。它们在37℃下培养2h。然后，通过离心收集细菌并用2.5％戊二醛在4℃下固定4小时。将细菌进一步用PBS缓冲液(pH7.4)洗涤3次，然后用分级乙醇系列(30％、50％、70％、85％、95％和100％)脱水，每次20分钟。最后，将样品在冰箱中干燥并涂上金，然后在SEM下观察干燥细菌的图像。
在伤口发生时，细菌可以从皮肤进入体内，就像在其他创伤或手术中一样。是细菌和其他微生物侵入伤口是造成严重慢性感染的主要原因。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌是最具代表性的两种模型。以1mg/mL绿色合成的PAA-CaO2 NPs进行抗菌测验，以评估其抗菌潜力。结果如图4所示，PAA-CaO2NPs对两种细菌菌株均显示出抗菌活性。然而，与革兰氏阴性(大肠杆菌)细菌相比，对革兰氏阳性(金黄色葡萄球菌)具有更高的抗菌活性。在革兰氏阴性细菌组中，相同浓度条件下，PAA-CaO2 NPs组抑菌圈大小与单独的CaO2 NPs或者SS组相比均无明显差异,而在革兰氏阳性(金黄葡萄球菌)细菌实验组,PAA-CaO2 NPs处理组的抑菌圈面积大小高达8.97±0.26cm2，显著高于阳性对照SS组(2.045±0.19cm2)，说明PAA-CaO2NPs相比已上市的烧伤抗菌药SS，具有更加优越的抗菌性能，表现出强大而稳定的抑菌效果，且PAA-CaO2 NPs与CaO2 NPs对两种细菌的作用效果几乎是一致的，表明PAA的交联并不会影响活性氧释放的抑菌效应，但交联PAA可以在一定程度上可以改善材料的优越性，促进钙离子和活性氧的缓慢、持久释放。
而且我们也进一步发现了一个有趣的现象，与大肠杆菌菌株(Escherichia coli,E.coli)相比，绿色合成的PAA-CaO2NPs表现出对金黄色葡萄球菌菌株(Staphylococcusaureus,S.aureus)更高的抗菌活性，即对后者抑制细菌生长作用更加强大。以前的工作也报道了金属过氧化物纳米粒子对革兰氏阳性菌的毒性高于革兰氏阴性菌。我们猜测，这一特征与革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的不同细胞结构有关。金属和金属过氧化物纳米粒子的抗菌活性机制涉及膜损伤、纳米粒子内化、金属离子和影响细胞代谢的活性氧(ROS)等多项因素。例如，革兰氏阳性细胞(S.aureus)比革兰氏阴性菌(E.coli)具有更厚的肽聚糖层。尽管如此，革兰氏阴性菌(E.coli)具有被脂质和蛋白质包围的相对通透性较低的外膜，这可能导致对纳米颗粒和金属离子渗透到细胞中的更高阻挡力。此外，革兰氏阳性菌(S.aureus)的表面带有更多负电荷，这有助于吸引正离子，例如Ca2+，这些离子可以从PAA-CaO2NPs的溶解中缓慢而持久地释放出来。此外，细菌中产生的酸也会导致PAA-CaO2NPs释放出剧毒的OH·，导致与纳米粒子接触的细菌大量死亡。这一现象极大地激发了我们在耐多药耐药金黄色葡萄球菌(Multidrug-Resistant Staphylococcus Aureus，MRSA)感染伤口愈合模型上，进行PAA-CaO2 NPs抗菌活性的更深一步研究的兴趣。因为在已有的报道中，MRSA往往是皮肤上的常见细菌，使其成为一般皮肤伤口感染的主要原因和我们此次感染伤口愈合模型研究的主要目标。
不同pH值下PAA-CaO2NPs对细菌形态的影响。如图5所示，无论是在酸性还是中性缓冲溶液中，空白组细菌的细菌膜表面都保持完整。然而，当使用PAA-CaO2NPs处理细菌时，在酸性溶液(pH＝6.5)中孵育时，细菌膜遭到的破坏比在中性溶液(pH＝7.4)中更严重。这是由于，在酸的刺激下，PAA-CaO2NPs释放的大量活性氧(OH·、O2-、H2O2等)会氧化细胞膜，导致细菌内容物的泄漏。
实施例6.体外pH依赖性ROS生成
为了测定产生的pH依赖性ROS，通过离心(12000rpm，3分钟)收集1ml大肠杆菌/金黄色葡萄球菌(108CFU/ml)，然后分散到PBS缓冲液(pH6.5和pH7.4)中，以对照组和含有PAA-CaO2NPs和CaO2NPs的PBS缓冲液(pH6.5和pH7.4)作为实验组。将它们在37℃下轻轻摇动培4h。然后将细菌以12000rpm的速度离心3分钟，将2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)依次与细菌溶液混合，并在室温下避光染色30分钟。用PBS(pH7.4)洗涤3次。最后，用PBS(pH7.4)洗涤细菌并在荧光显微镜下对样品进行拍照。
我们同时使用了DCFH-DA作为荧光探针，检测不同pH值下细菌中ROS产生的差异。细菌与PAA-CaO2 NPs孵育2h后，在酸性缓冲液中可见明显的绿色荧光，而在中性条件下，几乎没有荧光，结果如图6所示。这可能是细菌在生长和代谢过程中产生的质子，导致在酸性缓冲溶液中产生的OH.非常少，因此产生的荧光太弱，无法观察到。上述结果表明，有毒OH.的释放是酸依赖的，应用于伤口感染是有益的。
正常情况下，DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。然后在不同的pH缓冲液中评估了CaO2 NPs分解的pH触发的Ca2+释放。在12小时内，在pH＝7.4时，Ca2+的释放量不到10％，而在模拟酸性微环境中产生的Ca2+更多，pH＝6.5时约为50％，pH5.0时为80％。这表明CaO2NPs对pH敏感，在酸性微环境中可分解为Ca2 +。原因是明确的：与中性条件下依赖于水电离产生的质子的缓慢水解进程相比，在酸性环境中，CaO2NPs的分解速度会突然加速，这取决于NPs周围的质子浓度。化学反应方程可以写如下：CaO2+2H+/Ca2++H2O2。与血液中已经存在的Ca2+不同，血液中氧化性过氧化氢的泄漏不受欢迎。而对比CaO2NPs与PAA-CaO2NPs组可以看出CaO2 NPs组不论在酸性环境还是中性环境下都有产生较为微弱的荧光，因此，在CaO2NPs表面修饰的聚丙烯酸(PAA)可进一步作为保护层。该层可以阻断CaO2核心的直接暴露于血液当中，从而一定程度上减少了血液循环过程中PAA-CaO2 NPs的降解(pH＝7.4)。此外，PAA-CaO2NPs中的-COO基团倾向于竞争质子并结合它们，这进一步增加了对一些弱pH振荡的抵抗力。与未修饰的NPs相比，PAA-CaO2NPs在微酸性缓冲溶液下产生的过氧化氢较少，这意味着修饰后的NPs在血液循环时的危害较小。
实施例7.细胞毒性测定
通过CCK-8法测定CaO2和PAA-CaO2的细胞毒性。所有L929细胞均为DMEM，含有1％P/S溶液(青霉素-链霉素)和10％胎儿血清FBS，温度为37℃，5％CO2。将细胞接种到96孔板中(0.5×105个/mL)。然后在每孔中加入10μL两种梯度喷雾溶液和无菌水(对照)，孵育24小时。然后使用分光光度计(Thermo Fisher Scientific-CN，USA)在450nm处测量吸光度值以评估细胞毒性。实验重复3次，处理后的细胞活力以对照细胞活力的百分比表示。
实施例8.体外细胞增殖和迁移
1)将L929细胞接种到6孔板上24小时后，丢弃原始培养基并用新鲜培养基(对照)以及含有PAA-CaO2NPs和CaO2NPs的培养基再培养24小时。进行肌动蛋白染色以通过FITC缀合的鬼笔环肽可视化细胞骨架，并使用DAPI对细胞核进行染色。
2)将L929细胞接种在6孔板(5×105细胞/mL)中，并在37℃下，5％CO2的培养箱中培养，直到每个孔中的细胞密度一致。然后，用高压灭菌的移液器吸头刮擦表面并用PBS冲洗三次，以去除细胞碎片。然后，将细胞用喷雾样品溶液(1mg/mL分散在0.1％DMSO水溶液中)处理并培养24h，以等量1×PBS的孔作为对照。使用倒置显微镜对划痕进行拍照，以观察细胞在划痕中的迁移。
鉴于PAA-CaO2NPs良好的抗菌性能和良好的控释效果，我们进一步探究了PAA-CaO2NPs对细胞的迁移、增殖促进作用。成纤维细胞在伤口愈合的增殖阶段一直起着至关重要的作用。对鼠上皮样成纤维细胞L929细胞系进行荧光染色，以评估PAA-CaO2NPs的体外增殖促进能力。如图7所示，加入的PAA-CaO2NPs作用24h后，PAA-CaO2NPs处理组的细胞核和细胞骨架与其他各组相比，差异最大，表明PAA-CaO2NPs对细胞增殖有很好的促进作用。这一现象也正好对应前面所讲述的PAA-CaO2NPs中缓慢释放产生的Ca2+和活性氧的伤口愈合调节作用。钙是一种关键的第二信使，参与对伤口愈合至关重要的几个信号级联。已知钙流入细胞可调节炎症细胞浸润、成纤维细胞增殖和角质形成细胞迁移。此外，钙在皮肤的正常内环境稳定中具有既定的作用，并且是角质形成细胞增殖和分化的调节剂。
如图8所示，CCK-8检测结果表明PAA-CaO2NPs促进细胞增殖的能力比单独的CaO2NPs处理组更强，展现出良好的细胞增值促进作用。接下来，我们进行了划痕试验，PAA-CaO2NPs对L929细胞迁移能力的影响。如图9所示，与其他几组相比，PAA-CaO2NPs处理组的细胞间隙减少最大(****P<0.0001)，与其他组相比具有显著的差异性，即该组细胞迁移能力最强，上述实验共同表明PAA-CaO2NPs能有效促进L929细胞的增殖和迁移，为体内创面愈合提供了有效的体外实验基础。
实施例9.体外ROS和Ca2+生成
DCFH-DA和Fluo-4 AM用作荧光ROS和Ca2+探针，以指示PAA-CaO2NPs和CaO2NPs诱导的ROS和Ca2+生成。将L929细胞分别暴露于PAA-CaO2NPs和CaO2NPs中4小时。然后将细胞用DCFH-DA和Fluo-4 AM染色30分钟。最后进行肌动蛋白染色以通过FITC缀合的鬼笔环肽可视化细胞骨架，并使用DAPI对细胞核进行染色，记录荧光图像。
体外细胞实验证实PAA-CaO2NPs对L929细胞的迁移、增殖具有极佳的促进作用，为了证实PAA-CaO2NPs在细胞水平上的确产生了促进细胞增殖、迁移能力的小分子Ca2+和活性氧进行伤口愈合调节作用。然后通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)监测ROS和Ca2+的产生。如图10所示，对照组表现出弱绿色发光，而用PAA-CaO2NPs培养的组表现出强烈的细胞内发光，表明外源游离Ca2+和H2O2的释放。因此，孵育的PAA-CaO2NPs可以释放Ca2+和H2O2，检测到的钙和ROS荧光信号用于PAA-CaO2NPs的降解。
据报道，由于ROS和Ca2+都是信号分子，钙超载和ROS的诱导增加会在细胞中形成一个自我放大的循环。一方面，胞质溶胶Ca2+的积累会刺激负责ROS产生的NADPH氧化酶活性，Ca2+促进ATP合成的过程也可诱导呼吸链电子泄漏和ROS水平升高。另一方面，ROS增加可通过调节质膜Ca2+通道(例如，VDCC、TRP和SOCE)、细胞内钙通道(例如，RyR和IP3R)和Ca2+ATP酶来引发Ca2+进入，从而降低调节钙水平或ROS水平)可以缓解细胞应激反应，细胞可以通过自我调节跳出自我放大回路，达到化学平衡。结果表明，收集到的ROS(或钙)信号最终减少了。
于是我们猜测在活性氧的检测组中，PAA-CaO2 NPs组的荧光强度高于CaO2NPs在于前者能够持续释放钙离子使细胞始终处于一种自我放大循环圈当中，ROS和Ca2+在细胞中能够持续发挥作用。
实施例10.动物伤口愈合试验
实验方案及操作已获得重庆医科大学伦理委员会批准，实验动物均为人工饲养。
1)正常动物模型组
成年雄性SD大鼠(8周)用作实验动物。将大鼠随机分为Control、SS、CaO2和PAA-CaO2组4组。用异氟醚挥发性麻醉机(RWD Life Science，深圳，中国)麻醉后，剃除背侧毛。借助圆钻从背部皮肤去除圆形伤口(D＝1cm)。各组伤口均用碘伏和酒精消毒，随后三组各喷10次相应的喷雾液，空白组不做任何处理。各组每两天消毒一次，然后对实验组进行喷雾处理。用摄像机记录伤口愈合过程，根据伤口闭合率评价伤口再生过程。
在研究细胞增殖和迁移后，建立损伤大鼠，以验证其体内愈合效果。不同的实验组的创面愈合状态结果如图11所示，其中PAA-CaO2NPs的面积减少最明显(**P<0.01)，说明与单一修饰剂相比，PAA-CaO2NPs具有一定的钙离子和活性氧创伤修复持续调节作用，修复效果优于阳性对照组SS以及CaO2NPs组。第7天，伤口面积显著减少，因为PAA-CaO2 NPs在早期愈合早期阶段抑制炎症反应，调节伤口初步有效愈合。第14天，PAA-CaO2 NPs处理组的愈合面积减小多于其他组，说明PAA-CaO2 NPs在创面修复中期具有良好的修复性能。
2)感染模型组
a.感染伤口愈合情况观察
为了进一步评价PAA-CaO2在创面的抑菌能力，建立了感染全层皮肤缺损模型。由于CaO2喷雾剂没有抗菌活性，将大鼠随机分为三组：对照组、SS和PAA-CaO2。麻醉后脱毛，直接用圆形穿孔器获得圆形伤口(D＝1cm)，将100μL金黄色葡萄球菌(106CFU/mL)溶液注入伤口建立感染模型，对照组给予1×PBS溶液处理。用摄像头记录创面愈合过程，根据创面闭合率评价创面再生过程。
由于PAA-CaO2NPs良好的抗菌性能和较低的细胞毒性以及有效的增值迁移促进能力，以及在体内伤口愈合效果显著的基础上，我们进一步研究了PAA-CaO2NPs在感染伤口的实际应用效果以及与已上市的抗菌药SS效果对比。鉴于感染鼠伤口严重性与恢复的缓慢性，相对于未经细菌感染的伤口，于是我们提高了各实验组的换药频率以有效地促进细菌感染伤口的愈合以更加贴合实际生活中喷雾试剂针对感染伤口的应用性。
在实验中，我们首先在SD大鼠的背部构建了一个直径约为1cm2的椭圆形伤口，然后将金黄葡萄球菌滴在伤口上，建立伤口感染模型。模型感染成功后，将所有小鼠分为3组：Control、SS、PAA-CaO2 NPs。如图12所示，在金黄葡萄球菌感染后1天(0d)，所有小鼠背部的伤口均出现水肿和炎症。然后，用不同的材料处理伤口。治疗4天后，与阳性对照组SS和空白组相比，PAA-CaO2NPs处理的创面渗出量相对较少，伤口长势良好，未出现明显的脓肿，创面面积也要小得多。创面愈合12天后，我们观察到PAA-CaO2 NPs处理组的创面几乎完全愈合，而空白组创面组具有一定的炎症现象以及不安全愈合的创面存在，PAA-CaO2NPs组与空白组以及SS组均存在显著的差异性(****P<0.0001)。体内感染伤口的治疗作用，进一步证实了构建的PAA-CaO2NPs在感染伤口的治疗、修复应用上，具有更高的可行性与实际应用性。我们猜这是因为敷料可以在伤口中产生足够的抗菌OH.，而不会对周围的正常组织造成不可逆的氧化损伤。也进一步说明了PAA-CaO2NPs释放的ROS相对于SS中含有的银离子具有更高的抗菌活性，前者同时协调Ca2+一起促进感染伤口的愈合。
b.感染伤口治疗情况观察
感染模型建立12小时后，每组随机选取3只大鼠。用拭子擦拭感染创面后，将拭子浸入3ml PBS溶液中12h。将溶液用铺板法涂布在琼脂板上，37℃孵育24h。然后进行细菌计数。第1天和第3天遵循相同的步骤。
为了更加量化评估PAA-CaO2NPs的杀菌效果，我们切除了伤口组织，并采集了脓肿渗出液，以量化观察伤口组织中的细菌数量。从生长的菌落中，我们可以看到PAA-CaO2NPs在感染伤口治疗中显示出最有效的伤口抗菌治疗，其显著清除了脓肿渗出液中的细菌(****P<0.0001)。在治疗的第二天PAA-CaO2 NPs治疗的感染伤口细菌已明显减少，几乎就已经没有菌落的生长了，结果如图13所示。
实施例11.PAA-CaO2NPs的血液相容性
通过溶血试验研究了PAA-CaO2NPs的血液相容性。取新鲜兔血以1500rpm离心分离红细胞，然后用PBS洗涤3次，直至上清液澄清。用PBS稀释纯化的RBC以获得RBC悬浮液(2％,v/v)。制备1mL RBCs悬浮液与20μL PBS混合作为阴性对照；制备1mL RBCs悬浮液与20μL0.1％Triton X-100混合，作为阳性对照；制备1mL红细胞悬浮液与20μL不同材料混合作为实验组。37℃孵育2h后，离心管中的混合物并用数字捕捉；37℃孵育1h后，将管中的混合物以1500rpm离心15min。吸光度通过酶标仪在545nm处测量上清液的浓度。HR(％)＝[(ODT-ODN/(ODP-ODN)]×100％。ODT、ODN和ODP分别是样品、阴性对照(PBS)和阳性对照(1％Triton-X)的吸光度值。
如图14的结果表明，PAA-CaO2NPs具有良好的生物相容性，为PAA-CaO2NPs在生物伤口上的应用奠定了一定的可行性。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.纳米粒子在制备治疗创面愈合的药物中的应用，其特征在于，所述的纳米粒子由表面改性剂和纳米颗粒组成；所述的表面改性剂为PAA，所述的纳米颗粒为CaO2。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的纳米粒子粒径为95nm~105nm。
3.含有纳米粒子的制剂在制备治疗创面愈合的药物中的应用，其特征在于，所述纳米粒子由表面改性剂和纳米颗粒组成；所述的表面改性剂为PAA，所述的纳米颗粒为CaO2，所述的制剂包括乳剂，微球，喷雾，颗粒，片剂，悬浮剂中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的纳米粒子粒径为95nm~105nm。
5.纳米喷雾在制备治疗创面愈合的药物中的应用，其特征在于，所述纳米喷雾的制备方法具体包括以下步骤：
S1：制备权利要求2所述的纳米粒子，将其保存在无水乙醇中；
S2：将S1所得物离心，所得沉淀物分散并超声，即得。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的S1中纳米粒子的制备具体为：将PAA溶液和氯化钙溶液滴加到无水乙醇中，搅拌后滴加过氧化氢溶液，再加入氨水搅拌至浑浊，离心后洗涤即得。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的PAA溶液浓度为0.5mg/ml；所述的氯化钙溶液浓度为1mol/L；所述的过氧化氢溶液质量浓度为30%；所述的氨水质量浓度为5%。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的洗涤使用的洗涤剂为甲醇和甲醇-水混合液，洗涤条件为13000rpm，20min，20℃。
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