KR20220100491A

KR20220100491A - 그람음성균 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물 및 항균제 내성 억제용 항균보조제

Info

Publication number: KR20220100491A
Application number: KR1020210063877A
Authority: KR
Inventors: 김광선; 조혜진; 아타누나스카
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2021-01-08
Filing date: 2021-05-18
Publication date: 2022-07-15

Abstract

본 발명은 니켈이 도핑된 산화아연과 흑린 나노시트가 콘쥬게이션된 나노복합체; 및 항균제를 유효성분으로 함유하는 그람음성균 감염 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 니켈이 도핑된 산화아연과 흑린 나노시트가 콘쥬게이션된 나노복합체는 mcr-1 유전자를 함유하고 있는 그람음성균에 특이적으로 작용하여 세균 표면에 양전하를 중화시켜 폴리믹신과의 상호작용을 촉진하여 폴리믹신에 대한 내성을 억제하고, 저용량의 폴리믹신 처리에도 항균제 감수성을 증가시켜 Mcr-1 유전자가 발현된 그람음성균에 대한 특이적 항균활성 증가를 확인함에 따라, 상기 나노복합체는 그람음성균 항균제 내성 억제용 항균보조제로 제공될 수 있으며, 폴리믹신계 항균제와 병용처리를 통하여 그람음성균 감염치료를 위한 약학조성물로 제공될 수 있다.

Description

그람음성균 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물 및 항균제 내성 억제용 항균보조제{Pharmaceutical composition for preventing or treating gram-negative bacteria infectious diseases and antibacterial adjuvant for inhibiting resistance to antimicrobial agents}

본 발명은 니켈이 도핑된 산화아연과 흑린 나노시트가 콘쥬게이션된 나노복합체; 및 항균제를 유효성분으로 함유하는 그람음성균 감염성 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

다제내성 (MDR) 그람음성균에 의한 감염은 심각한 글로벌 사망 부담과 증가된 사망률을 초래한다. 의료 환경에서 그람음성균은 폐렴, 혈류 감염, 상처 또는 수술 부위 감염, 수막염 등의 감염을 일으키며, 특히 중환자실 (ICU)의 환자는 이러한 감염 위험이 높다. 현재 이용 가능한 항생제에 대한 그람음성균의 빠른 내성과 환경적 압력을 견디는 타고난 능력은 다제내성 그람음성균 감염을 예방하거나 치료하기 위한 주요 관심사이다. 수평적 유전자 전달은 약물 내성을 전파하기 위해 하나의 세균에서 상호작용하는 다른 세균으로 유전 물질을 교환하는 주요 전략으로 알려졌다. 그러나 MDR 내성균 제어를 위해 효과적인 항균제가 부족하여 MDR 그람음성균 감염을 통제하기 위해 기존에 사용되었나, 세포독성을 유발하였던 마지막 수단 (last-resort) 항생제인 폴리믹신 (폴리믹신 B 및 콜리스틴)을 포함한 최후의 수단 항생제를 다시 사용하는 상황에 직면하였다.

마지막 수단 항생제인 폴리믹신은 포스포 에탄올 아민 (pEtN) 잔기와 4-아미노-4-데옥시-1로 지질 A를 변형하는 EptA 및 ArnT에 의한 폴리믹신 내성 위험에도 불구하고 MDR 그람음성균 감염 치료에서 광범위하게 사용되고 있다. 다행히 2015년까지 폴리믹신에 대한 자연 내성 균주는 확인되지 않았으나, EptA 계열에 포함되는 단백질의 종류인 Mcr-1을 암호화하는 콜리스틴 내성 유도 유전자 (mcr-1)가 이동형 형태로 전이 가능한 폴리믹신 내성의 출현이 확인됨에 따라 MDR 그람음성균 감염에 대한 최후의 수단인 폴리믹신의 사용을 위협했다. EptA를 사용하여 세균 표면의 지질 다당류 (LPS)에 대한 지질 A 변형은 일부 그람음성균의 표면의 음성 전하를 감소시킨다. 이것은 세균의 표면과 폴리믹신 사이의 양전하 반발을 통해 양전하를 띤 폴리믹신에 대한 내성을 부여하여, 세균 내부로의 폴리믹신 혼입을 감소시킨다. 따라서 이러한 내성 메커니즘을 제어하기 위한 새로운 세대의 항생제, 억제제, 대체 물질 또는 치료제의 개발이 필요한 실정이다.

대한민국 공개특허 제10-2017-0032689호 (2017.03.23. 공개)

본 발명은 그람음성균 감염 치료제인 폴리믹신 항균제의 내성 문제를 해결하고, 그람음성균에 대한 항균제의 감수성을 증가를 위해 니켈이 도핑된 산화아연과 흑린이 결합된 나노복합체를 항균보조제로 제공하며, 상기 나노복합체와 항균제의 병용처리를 통하여 폴리믹신 내성을 나타내는 그람음성균에 대한 항균용 약학조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 니켈이 도핑된 산화아연과 흑린 나노시트가 콘쥬게이션된 나노복합체; 및 항균제를 유효성분으로 함유하는 그람음성균 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 니켈이 도핑된 산화아연과 흑린 나노시트가 콘쥬게이션된 나노복합체를 유효성분으로 함유하는 그람음성균 항균제 내성 억제용 항균보조제를 제공한다.

본 발명에 따르면, 니켈이 도핑된 산화아연과 흑린 나노시트가 콘쥬게이션된 나노복합체는 mcr-1 유전자를 함유하여 표면에 양전하를 나타내는 그람음성균에 특이적으로 작용하여, 세균 표면의 전하를 중화시켜 폴리믹신 상호작용을 증진시킴으로서 폴리믹신에 대한 내성을 억제하고, 저용량의 폴리믹신 처리에도 항균제 감수성을 증가시키는 결과를 확인함에 따라, 상기 나노복합체는 그람음성균 항균제 내성 억제용 항균보조제로 제공될 수 있으며, 폴리믹신계 항균제와 병용처리를 통하여 그람음성균 감염치료를 위한 약학조성물로 제공될 수 있다.

도 1은 나노복합체의 결정상 및 원소 조성 및 원자 상태를 확인한 결과로, 도 1a는 ZO, NZO 및 NZB XRD 패턴과 NZB 나노복합체의 XPS 스펙트럼 분석 결과이며, 도 1b는 Zn 2p 피크이며, 도 1c는 Ni 2p 피크의 가우스 피팅 곡선이며, 도 1d는 P 2p 코어 피크이다.
도 2는 NZB 샘플의 형태 및 미세 구조를 확인한 결과로, 도 2a는 TEM 이미지이며, 도 2b는 HRTEM 이미지이며, 도 2c는 NZB 샘플의 아연에 대한 원소 매핑 이미지이며, 도 2d는 산소에 대한 원소 매핑 이미지이며, 도 2e는 Ni에 대한 원소 매핑 이미지이며, 도 2f는 P 요소에 대한 원소 매핑 이미지이다.
도 3은 NCCP16283의 형태 변화를 확인한 결과로, 도 3a는 대조군이며, 도 3b는 폴리믹신 B (PolB) (0.4 μg/mL)이 처리된 NCCP16283의 형태 변화를 확인한 결과이며, 도 3c는 NZB (125 μg/mL)이 처리된 NCCP16283의 형태 변화를 확인한 결과이며, 도 3d는 NZB (0.2 μg/mL)와 PolB (62.5 μg/mL)이 처리된 NCCP16283의 형태 변화를 확인한 결과로, 이미지는 n = 5의 대표 중 하나이다.
도 4는 나노 물질과 대장균의 표면 전하를 확인한 결과로, 도 4a는 BP, NZO 및 NZB의 제타 전위를 확인한 결과이며, 도 4b는 NZB 처리하지 않은 대장균 균주인 BW25113 및 NCCP16283에서 NZB의 제타 전위를 측정한 결과이며, BP, NZO 및 NZB 농도는 125 μg/mL로 결과는 n = 5 ± 표준 편차의 평균을 나타낸다 (P <0.05).
도 5는 10 및 25 μg/mL 농도의 NZB를 HEK293 (인간 배아 신장) 세포에 처리한 후 확인된 ZO, NZO 및 NZB 노출에 의한 세포독성 (WST 분석)을 확인한 결과로, 도 5a는 24 시간 후 세포독성을 확인한 결과이며, 도 5b는 48 시간 후 세포독성을 확인한 결과이며, 오차 막대는 표준 편차 (SD)를 나타낸다. P <0.05.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 발명자들은 니켈이 도핑된 산화아연과 흑린 나노시트가 콘쥬게이션된 나노복합체는 mcr-1 유전자를 함유하며 표면에 양전하를 나타내는 그람음성균에 특이적으로 작용하여 세균 표면의 전하를 중화시켜 세균-폴리믹신 상호작용을 증진시켜 폴리믹신에 대한 내성을 억제하고, 저용량의 폴리믹신 처리에도 항균제 감수성을 증가시키는 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 니켈이 도핑된 산화아연과 흑린 나노시트가 콘쥬게이션된 나노복합체; 및 항균제를 유효성분으로 함유하는 그람음성균 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.

상기 그람음성균은 mcr-1 유전자를 발현하는 것일 수 있다.

상기 mcr-1 유전자는 그람음성균 표면의 전하를 양성으로 전환하여 양전하를 나타내는 폴리믹신계 항균제에 대한 약물 내성을 유도하는 것일 수 있다.

상기 그람음성균은 슈도모나스 속 (Pseudomonas sp.), 살모넬라 속 (Salmonella sp.), 알칼리제네스 속 (Alcaligenes sp.), 이질균 속(Shigella sp.), 폐렴균 속(Pneumonia sp.), 비브리오균 속 (Vibrio sp.), 나이제리아균 속 (Neisseria sp.) 및 대장균 (Escherichia coli)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 나노복합체는 mcr-1 유전자에 의해 양전하를 나타내는 그람음성균 표면의 전하를 중화시켜 항균제의 내성을 억제하고, 항균제 감수성을 증가시키는 것일 수 있다.

본 발명의 실시예에 따르면, 본 발명의 나노복합체는 음전하를 나타내는 나노 시트인 흑린 (BP)이 mcr-1 유전자를 포함하는 대장균 균주를 포함하여 양전하를 나타내는 그람음성균과 더욱 효과적으로 상호 작용할 것으로 예상됨에 따라, Mcr-1 단백질이 발현된 대장균에 대한 NZB 결합이 양전하를 나타내는 항생제 폴리믹신 B (PolB)의 항균 효과를 증가시킬 것으로 예상하고, 이를 확인하기 위해, 대장균 균주 BW25113, pQE60-mcr-1의 BW25113, 폴리믹신 내성 균주 (NCCP) 및 NDM-1 MDR 균주와 함께 PolB와 NZB 간의 체커 보드 분석을 수행하여 NZB의 폴리믹신 B에 대한 약물 병용 효과를 확인하였다.

그 결과, 표 2의 FICI 값과 같이 NZB 대 PolB는 mcr-1 유전자 발현 대장균에 대해 최대 시너지 효능 (FICI_NZB/PolB = 0.175-0.225)을 나타냈으나, NDM-1을 포함한 다른 그람음성균 균주에 대해서는 상기 효과가 나타나지 않는 것을 확인하였다 (FICI_NZB/PolB = 2).

상기 결과로부터 PolB에 대한 NZB의 항균 활성 증진 효과는 Mcr-1 발현 대장균에 특이적임을 확인할 수 있었다.

상기 항균제는 폴리믹신 B 및 콜리스틴으로 이루어진 폴리믹신 계열 항균제로 이루어진 군에서 하나 또는 둘 이상 선택되는 것일 수 있다.

상기 나노복합체는 약학조성물 총 100 중량부에 대하여, 0.652 내지 2.5 중량부로 함유되는 것일 수 있다.

상기 항균제는 약학조성물 총 100 중량부에 대하여, 0.08 내지 0.64 중량부로 함유되는 것일 수 있다.

상기 그람음성균 감염성 질환은 피부감염, 폐렴, 패혈증, 장염, 크론병, 궤양성 대장염, 심내막염, 수막염, 외이도염, 중이염, 골수염, 요로감염, 기도감염 및 창상감염으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 니켈이 도핑된 산화아연과 흑린 나노시트가 결합된 나노복합체; 및 항균제를 유효성분으로 함유하는 그람음성균 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.

상기 나노복합체 및 항균제의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 니켈이 도핑된 산화아연과 흑린 나노시트가 콘쥬게이션된 나노복합체를 유효성분으로 함유하는 그람음성균 항균제 내성 억제용 항균보조제를 제공할 수 있다.

상기 그람음성균은 mcr-1 유전자를 함유하며, 상기 mcr-1 유전자가 발현하는 Mcr-1 단백질에 의해 세균 표면에 양전하를 나타내는 것일 수 있다.

상기 그람음성균은 슈도모나스 속 (Pseudomonas sp.), 살모넬라 속 (Salmonella sp.), 알칼리제네스 속 (Alcaligenes sp.), 이질균 속(Shigella sp.), 폐렴균 속(Pneumonia sp.), 비브리오균 속 (Vibrio sp.), 나이제리아균 속 (Neisseria sp.) 및 대장균 (Escherichia coli)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실험예>

하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.

1. Mcr-1 단백질 과량 발현 플라스미드의 제조

Mcr-1 단백질 과량 발현 플라스미드를 준비하기 위해 Mcr-1 단백질 인코딩 유전자의 DNA 서열을 NCBI 단백질 데이터베이스 (GenBank ID : ASK04346.1)에서 확보하고, GenSmartTM Codon Optimization (GenScript, NJ, USA)의 프로그램을 활용하여 단백질 발현을 위한 코돈을 최적화하였다. 최적화된 DNA 서열 (표 S2)을 합성하고 BamHI / BglII로 선형화된 pQE60 (Qiagen, CA, USA)으로 서브 클로닝하였다. 서브 클로닝된 플라스미드 DNA는 프라이머 pQE30-F 및 -R을 프라이머로 사용한 콜로니 PCR과 DNA 시퀀싱 분석으로 최종 확인하였다. 확보된 Mcr-1 단백질 과량 발현 플라스미드는 추가 실험을 위해 BW25113 균주로 형질 전환하였다.

2. X 선 회절 (XRD) 확인

니켈 필터링된 Cu Kα 방사원 (λ = 1.5406 A)이 장착된 X 선 회절계 (DAVINCI 디자인의 D8 Advance, Billerica, Bruker, MA, USA)를 사용하였으며 X 선 회절 (XRD) 패턴을 확인하기 위해, 2θ 범위 5 - 80 °의 ZO, NZO 및 NZB 샘플을 준비하였다. 대표적인 NZB 샘플의 미세 구조는 투과 전자현미경 (TEM; Bruker Nano GmbH)을 통해 평가되었으며, 이와 관련하여 탄소 코팅된 300 메쉬 Cu 그리드가 사용되었다. 또한, 대표적인 NZB 샘플에서 원소의 결합 에너지 및 화학적 상태는200 ~ 200의 결합에너지 범위에서 Axis Supra 스캐닝 X 선 광전자 분광법 (XPS) 마이크로 프로브 표면 분석 시스템 (Kratos Analytical, Manchester, UK)을 사용하여 확인하였으며, 1,200eV. 284.5 eV에서 C 1s 피크 위치는 결합에너지 기준으로 사용되었다.

3. 제타 전위 측정

제타 전위 (밀리 볼트, mV)는 Smoluchowski 방정식 ζ = μη / ε를 사용하여 1 mM NaCl에서 25 ℃에서 전기 영동 이동도 μ에서 결정된다. 여기서 η는 중간 점도이고, ε는 BP의 중간 유전 상수이다. DW의 NZO 및 NZB 또는 대장균 현탁액은 제조사의 지침에 따라 Nanopartica SZ-100 (Horiba Scientific)으로 측정되었다. BW25113 및 NCCP16283 대장균 균주를 NZB (125 μg / mL)의 최소 억제 농도 (MIC) 처리 유무에 관계없이 밤새 배양하고 OD₆₀₀ = 0.5로 희석하였다. 이후 12,000rpm에서 2 분간 원심분리하여 세포 배양 침전물을 수득하고 인산 완충 식염수 (PBS)로 3 회 세척한 후 DW 1 mL에 재현탁하여 제타 전위를 측정하였다. 각 샘플에 대해 표시된 제타 전위 값은 최소 5 회 측정 ± 표준 편차의 평균이다 (P <0.05).

4. 박테리아 생장 조건, 사용 균주 및 플라스미드

사용된 균주 및 플라스미드는 표 1과 같다. 균주를 Luria-Bertani (LB) 배지 또는 항생제가 있거나 없는 한천 플레이트에서 배양하였다. Keio (E. coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants) 컬렉션은 k1 및 유전자 특이적 프라이머를 사용한 콜로니 PCR을 수행하여 표적 유전자의 결실을 검증한 후 사용하였으며, 제조사의 프로토콜에 따른 Quick-Taq HS(Toyobo, Japan) 염료 혼합하여 사용하였다.

균주 및 플라스미드	정보
BW25113	Wild-type
Keio-arnT	arnT mutant
Keio-eptA	eptA mutant
NCCP16283	E. coli isolate, mcr-1
NCCP16284	E. coli isolate, mcr-1
BAA-2471	E. coli isolate, NDM-1, β-lactamase-1
BAA-2340	E. coli isolate, NDM-1, β-lactamase-1
KS7000¹	BW25113, pQE60
KS8000²	BW25113, pQE60-mcr-1
NCCP16285	Klebsiella isolate, mcr-1
ATCC19606	Acinetobacter baumannii
ATCC27853	Pseudomonas aeruginosa
pQE60	pQE60 plasmid
pQE60-mcr-1	mcr-1 containing pQE60 plasmid

* KS7000¹ 및 KS8000²은 BW25113 균주에 pQE60 또는 pQE60-mcr-1 플라스미드를 포함.

* 약어: PolB, 폴리믹신 B; NZB, 흑색 인을 함유한 니켈 도핑된 산화 아연; FICI, 분획 억제농도 지수/지수; NDM-1, 뉴델리메탈로-1; β-lactamase-1, β-락타마제-1; mcr-1: 콜리스틴 내성유도 유전자.

5. Mcr-1 단백질의 발현 분석

pQE60-mcr-1 플라스미드로부터의 Mcr-1 단백질 발현을 진행한 후 단백질 추출액을 SDS-PAGE 겔 전기 영동 및 웨스턴 블롯팅을 수행하여 발현 여부를 확인하였다. 먼저, Mcr-1 단백질 발현을 확인하기 위해 12% Mini-PROTEAN Stain-free TGX Precast 겔 (Bio-Rad, CA, USA)에서 단백질 추출액을 전기 영동한 후 히스티딘 태그 (His-tag, Sino Biological, PA, USA) 및 Clarity™ 웨스턴 ECL 기질 (Bio-Rad)에 대한 항체를 사용하여 히스티딘 태그 되어있는 Mcr-1 단백질에 대한 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 이미지 분석은 ChemiDocMP (Bio-Rad)와 Image Lab (Ver.6.1.0, Bio-Rad)을 사용하여 수행되었으며, n = 3의 대표 중 하나가 표시되었다.

6. 시험용 그람음성균 준비

항균 활성 및 항균 작용에 의한 세균의 형태학적 특성 조사에 사용된 세균은 다음과 같이 준비하였다. 먼저, 그람음성균 콜로니를 항생제가 있거나 없는 LB 한천 플레이트에 도말하고 Sensititre^TM Nephelometer (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)를 사용하여 0.5 McFarland 탁도 표준의 광학 밀도로 DW에 재현탁하였다. 개별 세균 배양액을 1,000 배 희석하여 Sensititre^TM 양이온 조정 Mueller-Hinton 배지에 접종하였다.

7. 항균활성 확인

대조군과 함께 하기와 같이 항균 샘플을 4 개의 그룹으로 나누고 표시된 농도 범위에서 준비하였다. (1) NFW (비처리 대조군), (2) NZB (0-250 μg/mL), (3) PolB (Polymyxin B, Sigma-Aldrich, 0-3.2 μg/mL) 및 (4) NZB (0-250 μg/mL)/PolB (0-3.2 μg/mL) 혼합물.

상기 항생제의 항균 활성을 확인하기 위해, 준비된 그람음성균 (섹션 2.4.5.)을 대조군, PolB, NZB 및 NZB PolB가 포함된 96-well 플레이트에 분주하고 흔들림 없이 37℃에서 16 시간 동안 배양하였다. 분수 억제 농도 지수/지수 (FICI)로서 최소 억제 농도 (MIC) 및 시너지효과는 체커 보드 분석을 사용하여 결정되었으며, [the revival of polymyxins for the management of multidrug-resistant gram-negative bacterial infections, Clin Infect Dis. 40 (2005) 1333-1341.]에 설명과 같이 해석되었다. NZB와 PolB의 시너지 평가를 위해 최소한 세 번의 반복실험이 수행되었다.

8. 세균의 형태학적 특성

세균의 물질 처리에 따른 형태학적 변화를 확인하기 위해, 체커 보드 분석을 수행하였다. 대조군, PolB, NZB 및 NZB/PolB의 sub-MIC에서 얻은 4 개의 샘플을 10,000×g에서 1 분 동안 원심분리하였다. 생성된 세균 배양 침전물을 2% 포름알데히드 및 1% 글루타르알데히드를 함유하는 500 μL PBS에 재현탁하고 5 분 동안 원심분리하였다. 최종 세균 배양 침전물을 2 회 세척하고 1 mL DW에 재현탁시켰다. 현탁액에서 5 μL 분취량을 수집하고 실리콘 웨이퍼 (5 × 5 mm, 남강 하이테크 (주), 성남, 한국)에 증착하여 실온에서 건조시켰다. 다목적 텅스텐 열 이온 방출 주사 전자현미경 (SEM) 시스템 (TESCAN, 프랑스 Fuveau)인 VEGA3을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 건조된 웨이퍼를 분석하였다.

9. 세포독성 분석 및 형태학적 변화 확인

American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)의 HEK293 세포는 5% CO₂에서 37℃에서 10% 태아소혈청과 함께 RPMI1640에서 유지되었다. 세포 생존율은 비색 WST 분석 (Ez-Cytox; DoGenBio, Seoul, Korea)으로 확인되었다. 세포를 well-당 5,000개 세포의 밀도로 96-well 플레이트에 접종하고 24 시간 동안 배양하였다.

그 후, 세포를 0.1% 디메틸 설폭 사이드에서 10-200 μg/mL 농도의 NZB 샘플 존재하에 24 또는 48 시간 동안 추가 배양한 후 WST 시약 (배지 부피의 1/10)을 첨가하여 세포 배양한 후 형성된 포르 마잔 염료의 양을 분광 광도계 마이크로 플레이트 리더 (BMG LABTECH GmbH, Ortenber, Germany)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 확인하였다. 상기 샘플로 처리된 HCT-15 세포의 형태는 위상차 현미경 (Leica DM IL LED; Leica, Wetzlar, Germany)을 사용하여 이미지화하였다.

<실시예 1> 나노복합체 합성

1. Ni 도핑된 ZnO 나노 입자 (NZO)의 합성

5 원자 퍼센트 (at %) (Zn²⁺와 관련하여) ZnO 기반 NP를 보유한 NZO는 이전 연구[B. Mehrad, N. M. Clark, G. G. Zhanel, J. P. Lynch, Chest. 147 (2015) 1413-1421.]에서 설명한대로 합성되었다.

2. BP 나노 시트 및 Ni 도핑된 ZnO-BP (NZB) 나노복합체 합성

2-1. 흑린 (black phosphorus, BP) 나노 시트 합성

이전에 보고된 방법 [Horizontal gene transfer mediatedbacterial antibiotic resistance, Front. Microbiol. 10 (2019) 1933.]의 벌크 BP 결정을 사용하여 BP 나노 시트를 합성하였다. 상기 합성 과정에는 초음파 처리를 통한 수성 박리 과정이 수행되었다. 먼저, 2.0 g의 NaOH를 N-메틸-2-피롤리돈 (NMP) 용매 60 mL에 5 분 동안 수욕 초음파 처리하에 첨가하였다. 이어서 원심분리 후 상층액을 수집하였다. 그 후, 벌크 BP 결정 (25 mg)을 NMP 함유한 포화 NaOH 용액에 첨가하였다. 생성된 현탁액을 20℃ 미만으로 온도가 유지된 얼음 욕조 초음파기를 사용하여 8 시간 동안 초음파 처리하였다. 그 후, 박리되지 않은 BP 결정을 2,000 rpm에서 15 분 동안 원심분리하여 분리하였다. 상층액을 후속적으로 수집하고 13,000 rpm에서 10 분 동안 다시 원심분리하였다. 마지막으로 원심분리 과정에서 수집된 BP 나노 시트를 물에 분산시키고 추가 사용을 위해 4 ℃에 보관하였다.

2-2. NZB 나노복합체 합성

5 μL의 준비된 BP 나노 시트 (2 mg/mL)를 합성된 NZO 100 mg이 용해되어 있는 탈이온수 (DW) 40 mL에 첨가하고 10 분 동안 계속 교반하였다. 그 후, 혼합물을 10 분 동안 초음파 처리한 후 혼합물을 연속 교반하면서 6 시간 동안 저장한 후 샘플을 원심분리로 수집하고 60℃에서 6 시간 동안 진공 건조하였다.

<실시예 2> 나노복합체 특성 확인

1. 상 구성 확인

실시예 1에서 제조된 NZO 및 NZB 샘플과 ZO의 결정상을 XRD를 사용하여 확인하였다.

그 결과, 도 1a와 같이 합성된 ZO, NZO 및 NZB의 XRD 반사 피크는 육각형 ZO (h-ZO) 구조 (JCPDS 36-1451)와 일치하였다. 그러나 약 16.78 ° 및 52.38 °에서 NZB 샘플의 일부 추가 피크가 확인되었다. 상기 피크는 BP의 (020) 및 (060) 격자 평면에 기인할 수 있다.

상기 결과로부터 액체 초음파 처리 후 불순물 없이 박리된 BP 나노 시트가 여전히 사방 정계 시스템에 있음이 확인됨에 따라 NZB 나노복합체가 성공적으로 형성된 것이 확인되었다.

2. XPS (X-ray photoelectron spectroscopy) 확인

대표적인 NZB 샘플의 원소 조성과 원자가 상태를 XPS로 확인하였다.

Zn 2p (도 1b) 및 Ni 2p (도 1c)의 결합 에너지 신호가 도 1b 내지 도 1d와 같이 확인되었으며, 도 1d 및 도 1b와 같이 P 2p 및 Zn 2p는 각각 1,021.9 및 1,045.0 eV에서 두 개의 강한 피크가 검출되었으며, 이는 각각 Zn 2p^3/2 및 Zn 2p^1/2 상태의 결합 에너지에 할당되었다. 또한 계산된 Zn 2p^3/2와 Zn 2p^1/2 사이의 결합 에너지 차이는 ~ 23.1 eV로 Zn²⁺ 아연의 원자가 상태를 확인하였다.

또한, 도 1c는 Ni 2p의 가우스 피팅 결합 에너지 곡선으로, 두 개의 주요 피크는 각각 Ni 2p^3/2 및 Ni 2p^1/2 상태의 결합 에너지를 나타내는 약 856.2 및 873.5 eV에 집중되어 있었다. 마찬가지로 Ni 2p^3/2와 Ni 2p^1/2 상태 사이의 계산된 에너지 차이는 17.3eV로 NiO (18.4eV)와 상당한 차이를 나타내는 것이 확인됨에 따라, NZB에 존재하는 Ni는 NiO와 상이한 것이 확인되었다.

또한, 도 1d에서 확인된 P 2p 피크의 결합 에너지는 앞서 발표된 다른 보고의 데이터와 일치하는 것으로 확인되었다.

상기 XPS 결과 및 XRD 결과로부터 NZB 나노복합체의 성공적인 형성이 확인되었다.

3. 나노복합체의 형태 및 미세 구조 확인

대표적인 NZB의 형태와 미세 구조가 도 2와 같이 확인되었다.

도 2a는 NZO 나노 입자가 BP 나노 시트에 분포된 NZB 나노 입자의 TEM 이미지이며, 도 2b는 NZB의 고해상도 TEM (HRTEM) 이미지로, 도 2b의 삽입은 도 2b의 표시된 영역에서 확대된 버전으로 면간 거리가 0.25 인 별개의 격자 무늬는 ZO의 (101) 평면에 해당된다. 또한 대표적인 NZB 샘플의 원소 매핑 이미지인 도 2c, 도 2d, 도 2e 및 도 2f와 같이 각각 Zn, O, Ni 및 P 원소가 좋은 분포를 나타내는 것이 확인되었다.

상기 TEM 및 HRTEM 이미지와 원소 매핑 결과로부터 NZB 나노복합체의 형성이 성공적으로 이루어진 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 3> 항균활성 확인

1. 대장균 균주에 대한 NZB의 항균 활성 확인

먼저, 표준, NCCP 내성균주 및 NDM-1 MDR 대장균 균주에 대한 폴리믹신 B (PolB)의 MIC로서 항균 활성을 확인하였다.

그 결과, 표 2와 같이 대조군 벡터 및 NDM-1을 함유하는 대장균 균주가 존재하거나 존재하지 않는 조건에서 BW25113에 대한 MIC 값이 0.8 μg/mL로 확인됨에 따라, 사용된 NDM-1을 함유하는 대장균 균주는 여전히 PolB에 취약한 것이 확인되었다.

한편, mcr-1 유전자를 이동성 요소로 포함하는 NCCP 내성균주는 BW25113 균주에 비해 PolB (MIC = 3.2 μg / mL)에 4 배 더 높은 내성을 나타내었다. 이러한 내성균주는 여러 개의 내성 유전자를 가질 수 있으므로 항생제 감수성에 대한 효과를 확인하기 어렵다. 이에 따라서 Mcr-1 단백질만을 발현할 수 있는 발현 벡터를 대장균에서 최대로 발현되도록 코돈 최적화 후 C-말단 6 × 히스티딘 태그 (Histidine tag)로 Mcr-1 단백질 코딩 영역에 대한 DNA 서열을 합성하여 제조한 플라스미드 pQE60, pQE60-mcr-1을 제작하였다.

제작된 플라스미드를 대장균 균주 BW25113에 형질전환하여 PolB 감수성에 대한 Mcr-1 단백질 효과를 평가하는 데 사용하였다. isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside를 활용하여 대장균에서 Mcr-1을 발현시키고 6 × 히스티딘 태그에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석으로 확인한 결과, Mcr-1 단백질이 제대로 발현되는 것을 확인하였다.

또한, 상기 균주의 MIC 분석을 추가로 수행한 결과, Mcr-1 단백질 과발현이 NCCP 내성균주에서 PolB (MIC = 3.2 μg/mL)에 대한 내성을 증가시키는 것으로 나타났다. 상기 결과로부터 NCCP 내성균주의 PolB 내성이 Mcr-1 단백질 발현에서 비롯되었음이 확인되었으며, 이러한 시스템을 통하여 다중 치료에서 Mcr-1의 역할을 평가할 수 있다.

한편, MIC 분석을 수행하여 대장균에 대한 나노복합체의 항균 활성을 추가로 확인한 결과, 표 2와 같이 실험에 사용된 모든 그람음성균에 대해 BP, NZO 및 NZB의 MIC 값이 각각 > 500, 200 및 200 μg/mL인 것으로 나타났다.

상기 결과로부터 NZB가 항균 활성을 나타내지만 균주 특징을 구별할 수는 없음이 확인되었으며, NZB의 항균 활성은 BP가 아닌 NZO에 의해 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

Strain	Monotherapy		Synergistic combination
	MIC (μg/mL)		MIC (μg/mL)				Maximum FICI _NZB/PolB
	PolB	NZB	PolB	Fold change to Monotherapy	NZB	Fold change to Monotherapy	Maximum FICI _NZB/PolB
BW25113	0.8	250	0.8	1	250	1	2
NCCP16283	3.2	250	0.4	8	25	10	0.225
NCCP16284	3.2	250	0.4	8	25	10	0.225
BAA-2471	0.8	250	0.4	2	125	2	1
BAA-2340	0.8	250	0.4	2	125	2	1
KS7000 ¹	0.8	250	0.4	2	125	2	1
KS8000 ²	6.4	250	0.8	8	12.5	20	0.175

* 약어: PolB, 폴리믹신 B; NZB, 흑색 인을 함유한 니켈 도핑된 산화 아연; FICI, 분획 억제농도 지수/지수.

2. NZB와 PolB의 시너지 효과 확인

음전하를 나타내는 나노 시트인 BP는 mcr-1을 포함하고 있는 대장균을 포함하여 양전하를 나타내는 세포와 더욱 효과적으로 상호 작용할 것으로 예상됨에 따라, mcr-1 발현된 대장균에 대한 NZB 결합이 양전하를 나타내는 항생제인 PolB와의 상승 작용을 증가시킬 것으로 예상되었다.

이를 확인하기 위해, 대장균 균주 BW25113, pQE60-mcr-1의 BW25113, NCCP 내성균주 및 NDM-1 MDR 균주와 함께 PolB와 NZB 간의 체커 보드 분석을 수행하여 NZB의 시너지 효과를 확인하였다.

표 2의 FICI 값을 참고하면 NZB 대 PolB는 mcr-1 유전자를 함유하는 대장균 균주에 대해 최대 시너지 효과 (FICI_NZB/PolB = 0.175-0.225)를 나타냈으며, NDM-1을 포함한 다른 균주에 대해서는 나타나지 않는 것을 확인하였다 (FICI_NZB/PolB = 2).

상기 결과로부터 PolB에 대한 NZB의 효능 증진은 Mcr-1 단백질이 발현되는 대장균 균주에 특이적인 것을 확인할 수 있었다.

폴리믹신 내성은 주로 세균 표면에 고정된 지질 A의 구조적 개조에서 발생하는 것으로 알려져 있으며, Mcr-1 단백질 발현 균주에서는 ArnT 및 EptA 변형이 관찰되었다. 이에 따라, PolB에 대한 NZB의 상승 작용을 위해 ArnT 또는 EptA 작용 억제가 필요한지를 확인하기 위해, arnT 또는 eptA의 전체 돌연변이 (Keio collections [Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection, Mol. Syst. Biol. 2 (2006) 2006.0008.])를 사용하여 PolB로 NZB의 체커 보드 분석을 수행하였다.

그 결과, keio-arnT 및 -eptA에 대한 PolB 및 NZB의 MIC가 BW25113과 동일하게 나타나는 것이 확인되었으며 (MIC = 0.8 μg / mL), keio-arnT 및 -eptA 균주에 대해 NCCP16283와 유사한 항균 효능 증진이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 ArnT 또는 EptA 발현 억제가 대장균에서 폴리믹신 B에 대한 NZB의 상승 작용을 유도하기에 적합한 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 4> 세균의 형태학적 특성 확인

PolB, NZO, NZB 및 NZB/PolB 병용처리의 항균 특성을 확인하기 위해, SEM을 사용하여 다양한 처리 조건하에서 세균의 형태학적 분석 (NCCP16283: mcr-1이 함유된 내성 균주)을 수행하였다.

그 결과, 도 3a와 같이 처리되지 않은 대장균은 매끄러운 표면과 정상적인 길이를 가진 전형적인 세균의 형태를 나타내었다. 반면, 도 3b, 도 3c 및 도 3d와 같이 PolB, NZB 및 NZB/PolB이 처리된 세균은 세포막 파괴가 확인되었다. 특히, NCCP16283은 PolB 처리와 비교하여 NZB 및 NZB/PolB가 처리된 세균의 형태가 정상 세균의 형태와 크게 차이가 나는 것이 확인되었다.

상기 결과로부터 NZB가 세균 사멸에서 다른 작용 기전을 나타내며, 표 1과 같이 더 많은 다제내성 세균 집단을 사멸시키기 위한 NZB의 PolB에 대한 시너지 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 5> NZB의 작용 메커니즘 확인 (세균 LPS에 대한 중화 전하)

대장균은 일반적으로 LPS 성분에 있는 음전하 지질 A로 인해 표면에 음전하를 나타내는 것으로 알려져 있다. 그러나 Mcr-1 단백질 변형은 ArnT 및 EptA를 변형하여 전체적인 지질 A 구조의 변형이 발생하고, 이로 인해 대장균의 표면의 전하를 음성에서 양성을 나타내도록 변형시킨다. NZB는 음전하를 나타내는 나노복합체이기 때문에 NZB와 mcr-1 유전자를 포함하여 표면이 변형된 대장균 사이의 전하 중화는 세균이 양전하를 나타내는 폴리믹신 B (PolB)에 의해 공격을 받기 쉬울 것으로 예상되었다.

상기 가설을 확인하기 위해 BP, NZO 및 NZB 샘플의 제타 전위를 측정하였다.

그 결과 도 4a를 참고하면, BP, NZO 및 NZB의 값은 각각 -30.8, +11.2 및 -41.2 mV 였다. NZO가 양전하를 나타냄에도 불구하고 NZO의 통합으로 BP 자체에 비해 NZB에서 음전하를 나타내는 BP가 증가하는 것을 확인하였다. 이러한 음전하의 증가는 Li⁺ 통합이 BP의 음전하를 증가시킨 이전 보고서에서 확인되었다 [Negatively charged 2D black phosphorus for highly efficient covalent functionalization, Mater. Chem. Front. 2 (2018) 1700-1706.].

또한, 대장균 균주 BW25113 및 NCCP16283의 표면의 전하가 MIC 이하 농도 (125 μg/mL)인 NZB 처리에 의해 변경되는지 여부를 추가로 확인하였다.

그 결과, 도 4b와 같이 BW25113 및 NCCP16283과 NZB 조합의 제타 전위는 각각 -56.9 및 -73.7 mV로 확인되었다. 한편 NZB가 없는 BW25113 및 NCCP16283의 제타 전위는 각각 -63.9 및 -51.4mV 였다.

상기 결과로부터 표면에 더 많은 음전하를 가진 그람음성균은 음전하를 나타내는 NZB와 상대적으로 낮은 상호 작용 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서 Mcr-1 단백질에 의해 변형된 그람음성균은 표면에서 음전하가 감소하고 NZB와 더 많이 상호 작용하여 도 3d와 같이 세균 표면에 변형을 유발하는 것이 확인되었으며, NZB 처리된 대장균의 표면에 polB가 매우 쉽게 침투하여 PolB의 시너지 효과를 유발하는 것이 확인되었다.

<실시예 6> NZB의 세포독성

NZB의 시험관 내 세포독성을 확인하기 위해, 다양한 농도의 NZB가 처리된 HEK293 세포 (인간 배아 신장 세포)에 대한 WST 분석을 수행하였다. FICI_NZB/PolB = 0.175-0.225인 NZB와 PolB 간의 시너지 효과에 대한 최저 농도를 결정하기 위해, 다양한 범위의 NZB와 PolB를 사용하여 추가 체커 보드 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 5와 같이 시너지 작용 농도인 12.5 μg/mL에서는 세포독성이 나타나지 않는 것이 확인되었다.

상기 결과로부터 PolB와 NZB 나노복합체의 시너지 작용 농도는 생체 적합하며, 폴리믹신 내성 세균 감염의 치료에 효과적임이 확인되었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

니켈이 도핑된 산화아연과 흑린 나노시트가 콘쥬게이션된 나노복합체; 및 항균제를 유효성분으로 함유하는 그람음성균 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 그람음성균은 mcr-1 유전자를 함유하여 Mcr-1 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 그람음성균 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 그람음성균은 슈도모나스 속 (Pseudomonas sp.), 살모넬라 속 (Salmonella sp.), 알칼리제네스 속 (Alcaligenes sp.), 이질균 속(Shigella sp.), 폐렴균 속(Pneumonia sp.), 비브리오균 속 (Vibrio sp.), 나이제리아균 속 (Neisseria sp.) 및 대장균 (Escherichia coli)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 그람음성균 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 나노복합체는 mcr-1 유전자가 발현하는 단백질에 의해 양전하를 나타내는 그람음성균 표면의 전하를 중화시켜 항균제의 내성을 억제하고, 항균제 감수성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 그람음성균 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 항균제는 폴리믹신 B 및 콜리스틴으로 이루어진 폴리믹신 계열 항균제로 이루어진 군에서 하나 또는 둘 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 그람음성균 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 나노복합체는 약학조성물 총 100 중량부에 대하여, 0.625 내지 2.5 중량부로 함유되는 것을 특징으로 하는 그람음성균 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 항균제는 약학조성물 총 100 중량부에 대하여, 0.08 내지 0.64 중량부로 함유되는 것을 특징으로 하는 그람음성균 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 그람음성균 감염성 질환은 피부감염, 폐렴, 패혈증, 장염, 크론병, 궤양성 대장염, 심내막염, 수막염, 외이도염, 중이염, 골수염, 요로감염, 기도감염 및 창상감염으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 그람음성균 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
니켈이 도핑된 산화아연과 흑린 나노시트가 결합된 나노복합체를 유효성분으로 함유하는 그람음성균 항균제 내성 억제용 항균보조제.
청구항 9에 있어서, 상기 그람음성균은 mcr-1 유전자를 함유하며, 상기 mcr-1 유전자가 발현하는 Mcr-1 단백질에 의해 세균 표면에 양전하를 나타내는 것을 특징으로 하는 그람음성균 항생제 내성 억제용 항균보조제.
청구항 9에 있어서, 상기 항균제는 폴리믹신 B 및 콜리스틴으로 이루어진 폴리믹신 계열 항균제로 이루어진 군에서 하나 또는 둘 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 그람음성균 항생제 내성 억제용 항균보조제.
청구항 9에 있어서, 상기 그람음성균은 슈도모나스 속 (Pseudomonas sp.), 살모넬라 속 (Salmonella sp.), 알칼리제네스 속 (Alcaligenes sp.), 이질균 속(Shigella sp.), 폐렴균 속(Pneumonia sp.), 비브리오균 속 (Vibrio sp.), 나이제리아균 속 (Neisseria sp.) 및 대장균 (Escherichia coli)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 그람음성균 항생제 내성 억제용 항균보조제.