KR20220097894A - 핵산 서열 농도의 측정 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 단편화된 핵산에서 측정된 상기 검출된 서열의 농도에 보정 계수를 적용함으로써 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 결정하는 방법에 관한 것이다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 10월 16일에 출원된 유럽 특허 출원번호 제EP19306346호의 우선권을 주장하고, 그 내용은 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 도입된다.
발명의 분야
본 발명은 생물학적 샘플에서 핵산 서열의 농도를 측정하는 방법에 관한 것이다.
정상적인 인간은 모든 건강한 이배체 세포에 23개의 염색체 2세트를 갖는다. 일부 조건에서는, 돌연변이가 상기 염색체 중 임의의 하나 이상에서 발생하여 염색체 이상을 유발할 수 있다. 이러한 이상은 유전 질환, 암 및 기타 질환과 관련될 수 있다. 염색체 이상의 검출은, 특정 질환을 발증하는 경향이 있는 개인을 특정하거나, 특정 개인에게 가장 권장되는 치료법을 정의할 수 있다. 이와 관련하여, 염색체 이상에 대한 검사는 매우 가치가 있다.
인간의 건강 외에도, 염색체 이상의 검출은, 곤충, 세균, 식물 및, 유전 공학으로 인해 유전자 변형 생물(GMO)의 검출이, 예를 들면, 품질 관리를 위해 수행될 수 있는 토양과 식품 등의 유기물-함유 혼합 샘플을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 추가의 종과 관련되어 있다. 바이러스, 바이로이드 및 기타 염색체를 포함하지 않는 게놈에서 발생하는 유전자 돌연변이의 검출도 매우 적절하다.
이러한 문맥에서, 정성적 및 정량적 방식 모두에서, 게놈 이상의 징후, 즉 생물학적 샘플 중의 특정 핵산 서열에 대한 변화를 검출하는 것이 적절하다.
이러한 검출은 현재 목적의 샘플에서 표적 핵산을 증폭함으로써 효율적으로 수행된다. 증폭은 올리고뉴클레오티드 프라이머를 샘플과 조합한 다음, 샘플을 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 조건 등의 핵산 정량화와 양립할 수 있는 증폭 조건에 적용하여 수행할 수 있다. 이러한 증폭 방법은, 단일 표적 핵산 서열의 복수 카피를 생성할 수 있고, 따라서 검출 역치에 도달할 수 있다.
그러나, 생물학적 샘플에서 이러한 특정 핵산 서열의 농도를 정량적 방식으로 측정하는 것은, 예를 들면, 그 목적이 유전자 질환을 검출하는 것 뿐만 아니라 정량화하는 경우, 예를 들면, 희귀 돌여변이의 진화를 모니터링하는 경우에 더 적합하다.
일부 경우에, 생물학적 샘플에 존재하는 핵산이 손상되어 통상 짧은 길이의 서열로 단편화된다. 단편화된 핵산의 이러한 모집단에서, 소정 PCR 검정에서 증폭되는 서열은 종종 랜덤으로 절단된다. 이 시나리오에서, 이 핵산 서열의 증폭은 PCR 방법으로 발생할 수 없기 때문에, 목적 핵산 서열의 존재를 과소평가하게 된다.
본 발명은 이러한 과소평가의 문제를 교정하는 방법을 제안한다.
본 발명은, 비-단편화된 핵산(non-fragmented nucleic acid)에서 검출된 서열(이하 추가로 정의됨)의 농도를 결정하는 방법으로서, 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 상기 검출된 서열의 측정된 농도를 보정 계수로 보정하고, 이에 의해 비-단편화된 핵산에서 상기 검출된 서열의 농도를 수득하는 것을 포함하고, 상기 보정 계수는 길이 분포(LD) 및 측정 방법의 적어도 하나의 파라미터에 기반하는, 방법에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 하기 단계를 포함하는, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 결정하는 방법이 제공된다:
i. 단편화된 핵산을 포함하는 상기 샘플에서 상기 검출된 서열의 농도를 측정 방법으로 측정하는 단계; 및
ii. 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 상기 검출된 서열의 측정된 농도를 보정 계수로 보정하여, 비-단편화된 핵산에서 상기 검출된 서열의 농도를 수득하는 단계로서, 상기 보정 계수는 길이 분포(LD) 및 측정 방법의 적어도 하나의 파라미터에 기반하는, 단계.
일부 실시형태에서, 하기 단계를 포함하는, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 결정하는 방법이 제공된다:
i. 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 핵산의 길이 분포(LD)를 결정하는 단계로서, 상기 단편화된 핵산은 비-단편화된 핵산으로부터 유래하는, 단계;
ii. 단편화된 핵산을 포함하는 상기 샘플에서 상기 검출된 서열의 농도를 측정 방법으로 측정하는 단계; 및
iii. 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 상기 검출된 서열의 측정된 농도를 보정 계수로 보정하여, 비-단편화된 핵산에서 상기 검출된 서열의 농도를 수득하는 단계로서, 상기 보정 계수는 길이 분포(LD) 및 측정 방법의 적어도 하나의 파라미터에 기반하는, 단계.
일부 실시형태에서, 이 방법은 하기 단계를 포함한다:
i. 단편화된 핵산의 샘플을 제공하는 단계로서, 상기 단편화된 핵산은 상기 비-단편화된 핵산으로부터 유래하는, 단계;
ii. 상기 단편화된 핵산의 핵산 단편 길이 분포(LD)를 제공하는 단계;
iii. 상기 단편화된 핵산 샘플에서 상기 검출된 서열의 농도를 측정 방법으로 측정하는 단계;
iv. 상기 단편화된 핵산의 상기 핵산 단편 길이 분포(LD) 및 상기 측정 방법의 파라미터에 따라 보정 계수를 결정하는 단계; 및
v. 상기 단편화된 핵산에서 상기 검출된 서열의 농도를 보정 계수로 보정하여, 비-단편화된 핵산에서 상기 검출된 서열의 농도를 수득하는 단계.
일 실시형태에서, 단편화된 핵산의 샘플은 하기 3개 카테고리의 임의의 조합이다:
i. 무세포 샘플 또는 세포 함유 샘플 중의 어느 하나,
ii. 자연적으로 단편화된 샘플 또는 인공적으로 단편화된 샘플 중의 어느 하나; 및
iii. 모든 유형의 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA).
일 실시형태에서, 측정 방법은 등온 정량적(isothermal quantitative) 핵산 증폭 방법이고, 바람직하게는 루프 매개(loop mediated) 등온 증폭 및 정량적 핵산 서열-기반 증폭으로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 측정 방법은 비-등온 정량적(non-isothermal quantitative) 핵산 증폭 방법이고, 바람직하게는 정량적 폴리머라제 연쇄 반응, 실시간 폴리머라제 연쇄 반응, 디지털 폴리머라제 연쇄 반응, 다중 폴리머라제 연쇄 반응 및 다중 디지털 폴리머라제 연쇄 반응으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 상기 측정 방법의 파라미터는 하기에서 추가로 정의되는 바와 같이 증폭되는 서열의 길이를 포함한다. 이 실시형태의 특정 구성에서, 핵산 단편의 적어도 5%는 증폭되는 서열의 길이보다 짧은 길이를 갖는다. 이 실시형태의 또 다른 특정 구성에서, 핵산 단편의 최대 95%는 증폭되는 서열의 길이보다 짧은 길이를 갖는다.
일 실시형태에서, 증폭되는 서열의 길이는 40bp 초과 200bp 미만, 바람직하게는 50bp 초과 170bp 미만, 더 바람직하게는 65bp 초과 150bp 미만, 훨씬 더 바람직하게는 70bp 초과 130bp 미만이다.
일 실시형태에서, 핵산 단편 길이 분포(LD)는 25bp 내지 350bp, 바람직하게는 30bp 내지 320bp, 보다 바람직하게는 35bp 내지 290bp, 훨씬 더 바람직하게는 40bp 내지 270bp의 범위에 포함된다.
본 발명은 추가로, 하기 단계를 포함하는, 비단편화 핵산에서 제1 검출된 서열 S1의 제1 농도 및 제2 검출된 서열 S2의 제2 농도의 함수를 결정하는 방법에 관한 것이다:
i. 상기 기재된 임의의 결정 방법에 따라 상기 비-단편화된 핵산에서 S1의 농도를 결정하는 단계;
ii. 상기 기재된 임의의 결정 방법에 따라 상기 비-단편화된 핵산에서 S2의 농도를 결정하는 단계; 및
iii. 상기 S1 농도 및 상기 S2 농도의 상기 함수를 계산하는 단계;
여기서, 상기 S1 농도 및 상기 S2 농도는 동일한 샘플에서 결정되고; S1과 관련된 증폭되는 서열의 길이는 S2와 관련된 증폭되는 서열의 길이와 상이하다.
본 발명은 또한 하기를 포함하는, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 결정하도록 구성된 시스템에 관한 것이다:
i. 단편화된 핵산의 샘플에서 상기 검출된 서열의 농도를 측정하도록 구성된 모듈(module)로서, 상기 단편화된 핵산은 상기 비-단편화된 핵산으로부터 유래하는, 모듈;
ii. 상기 단편화된 핵산의 핵산 단편 길이 분포(LD) 및 상기 측정의 파라미터에 따라 보정 계수를 계산하도록 구성된 모듈; 및
iii. 상기 보정 계수를 사용하여 비-단편화된 핵산에서 상기 검출된 서열의 농도를 계산하도록 구성된 모듈.
특정 구성에서, 상기 단편화된 핵산에서 상기 검출된 서열의 농도를 측정하도록 구성된 모듈은 등온 정량적 핵산 증폭 모듈이고, 바람직하게는 루프 매개 등온 증폭 모듈 및 정량적 핵산 서열 기반 증폭 모듈로부터 선택된다.
대안적 구성에서, 상기 단편화된 핵산에서 상기 검출된 서열의 농도를 측정하도록 구성된 모듈은 비-등온 정량적 핵산 증폭 모듈이고, 바람직하게는 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 모듈, 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 모듈, 디지털 폴리머라제 연쇄 반응 모듈, 다중 폴리머라제 연쇄 반응 모듈 및 다중 디지털 폴리머라제 연쇄 반응으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 상기 측정의 파라미터는 증폭되는 서열의 길이를 포함한다.
정의
본 발명에서 하기 용어는 하기의 의미를 갖는다.
용어 "앰플리콘"은 증폭 반응의 핵산 산물을 지칭한다. 앰플리콘은 일본쇄, 이본쇄, 또는 이들의 조합일 수 있다.
용어 "증폭"은 복제가 경시적으로 반복적으로 발생하여, 주형 분자의 적어도 하나의 세그먼트의 복수 카피를 형성하는 반응을 지칭한다. 증폭은, 증폭이 진행됨에 따라 카피 수의 기하급수적 또는 선형적 증가를 생성할 수 있다. 전형적 증폭은 카피 수 및/또는 신호의 1,000배 초과의 증가를 생성한다. 본 명세서에 개시된 액적 기반 검정에 대한 예시적 증폭 반응은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 또는 리가제 연쇄 반응을 포함할 수 있고, 이들 각각은 열 사이클에 의해 구동된다. 액적 기반 검정은, 또한 또는 대안적으로, 등온적으로 수행될 수 있는 기타 증폭 반응을 사용할 수 있다. 증폭은, 증폭 혼합물에서 수행되거나, 또는 그 발생에 대해 검정될 수 있고, 이는, 조성물에 존재하는 경우, 핵산 표적 분자의 복수의 카피를 생성할 수 있는 임의의 조성물이다. "증폭 혼합물"은, 그 중에서도, 적어도 하나의 프라이머 또는 프라이머 쌍, 적어도 하나의 프로브, 적어도 하나의 복제 효소(예를 들면, 적어도 하나의 DNA 등의 적어도 하나의 폴리머라제 및/또는 역전사효소 등의 RNA 폴리머라제), 및 데옥시뉴클레오티드(및/또는 뉴클레오티드) 트리포스페이트(dNTP 및/또는 NTP), 및 복제 효소 활성에 필수적인 성분을 포함하는 완충액 등의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
용어 "검정"은 샘플을 특성화하기 위해 사용되는 절차 및/또는 반응, 및 절차(들) 및/또는 반응(들)로부터 수득된 임의의 신호(들), 값(들), 데이터, 및/또는 결과(들)을 지칭한다.
용어 "절단"은 핵산 서열을 지칭하는 용어 "단편화"와 동등하다.
용어 "검출된 서열"은 본 발명의 방법에서 샘플로부터 정량화되는 정확한 서열을 지칭한다. 점 돌연변이의 경우, 검출된 서열은 검출되는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 형광성 리포터가 사용된다. 특정 서열에 연결된 형광성 리포터가 사용되는 경우(예: 도 1a에 도시된 바와 같이), "검출된 서열"은 증폭되는 서열보다 짧을 수 있고, 그 중에 함유될 수 있다(본 명세서에 추가로 정의됨). 유리 형광 리포터가 사용되는 경우(예: 도 1b에 도시된 바와 같이), 검출된 서열은 통상 앰플리콘이다.
용어 "디지털 PCR" 또는 "dPCR"은, 표적의 증폭을 서포트하는 샘플 구획의 수에 기반하여, 샘플 중의 핵산 표적의 존재/부재, 농도 및/또는 복제 수를 결정하기 위해 샘플의 구획에서 수행되는 PCR 분석을 지칭한다. 디지털 PCR의 개념은 핵산 이외에도 기타 유형의 분석물로 확장될 수 있다.
용어 "표지"는 화합물, 생물학적 입자(예: 세포, 세균, 포자, 바이러스 또는 세포소기관) 또는 액적 등의 임의의 실체로 접속 또는 도입된 식별 및/또는 식별 마커 또는 식별자를 지칭한다. 표지는, 예를 들면, 실체를 광학적으로 검출 가능하고/하거나 광학적으로 식별 가능하게 하는 염료일 수 있다. 표지에 사용되는 예시적 염료는 형광 염료(형광단) 및 형광 소광제이다.
핵산과 관련된 용어 "길이"는 일본쇄 분자를 형성하는 연속적 뉴클레오티드 또는 염기의 수 또는 이본쇄 분자를 형성하는 연속적 염기쌍(base pair)의 수를 지칭한다. 길이는 뉴클레오티드와 염기쌍으로 측정된다.
용어 "다중 디지털 PCR"은 적어도 2개의 상이한 핵산 서열, 특히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 그 이상의 상이한 핵산 서열을 동시에 증폭하기 위해 수행되는 디지털 PCR 검정을 지칭한다(마치 1개의 포트에서 다수의 개별 PCR 반응을 모두 함께 수행하는 것과 같이). 이 프로세스는 복수의 프라이머를 사용하여 샘플 중의 핵산을 증폭한다. 특히, "다중 디지털 PCR"은 "이중 디지털 PCR" 및 "삼중 디지털 PCR"을 포함한다. 반대로, 1개의 핵산 서열을 증폭하기 위해 수행되는 디지털 PCR 검정은 "단순 디지털 PCR"이고, 종종 "디지털 PCR"로 단축된다.
용어 "다중 PCR"은 적어도 2개의 상이한 핵산 서열, 특히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 그 이상의 상이한 핵산 서열을 동시에 증폭하기 위해 수행되는 PCR 검정을 지칭한다(마치 1개의 포트에서 다수의 개별 PCR 반응을 모두 함께 수행하는 것과 같이). 이 프로세스는 복수의 프라이머를 사용하여 샘플 중의 핵산을 증폭한다. 특히, "다중 PCR"은 "이중 PCR" 및 "삼중 PCR"을 포함한다. 반대로, 1개의 핵산 서열을 증폭하기 위해 수행되는 PCR 검정은 "단순 PCR"이고, 종종 "PCR"로 단축된다.
용어 "핵산"은, 증폭의 산물이든, 합성적으로 생성된 산물이든, RNA의 역전사의 산물이든, 또는 자연적으로 발생하는 산물이든 상관없이, 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 둘 다를 지칭한다. 통상, 핵산은 일본쇄 또는 이본쇄 분자이고, 천연 존재 뉴클레오티드로 구성된다.
천연 존재 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 단량체를 지칭하는 것 이외에, 용어 "뉴클레오티드"는 본 명세서에서 특정 상황과 관련하여 기능적으로 동등한, 유도체 및 유사체 및 화학적 변형을 포함하는 이들의 관련된 구조적 변이체를 지칭하는 것으로 이해되어야 하고, 문맥이 달리 명시하지 않는 한, 뉴클레오티드가 사용되고 있다(예: 상보적 염기에 대한 하이브리드화: 아데닌(A)은 티민(T)과 쌍을 형성하고, 구아닌(G)는 사이토신(C)과 쌍을 형성한다).
용어 "구획"은 벌크 볼륨의 분리된 부분을 지칭한다. 구획은, 벌크 볼륨을 형성하는, 준비된 샘플 등의 샘플로부터 생성된 샘플 구획일 수 있다. 벌크 볼륨으로부터 생성된 구획은 크기가 실질적으로 균일하거나 상이한 크기를 가질 수 있다(예: 2개 이상의 별개의 균일한 크기의 구획의 세트). 예시적 구획은 "액적"이다. 구획은 또한 소정의 크기 분포 또는 랜덤 크기 분포로 크기가 상이할 수 있다.
용어 "PCR" 또는 "폴리머라제 연쇄 반응"은, 복제의 연속 라운드를 달성하기 위해, 가열 및 냉각의 교호 사이클(즉, 열 사이클)에 의존하는 핵산 증폭 검정을 지칭한다. PCR은 보다 높은 용융(변성) 온도와 보다 낮은 어닐링/신장 온도 등의 2개 이상의 온도 설정점의 사이, 또는 보다 높은 용융 온도, 보다 낮은 온도, 보다 낮은 어닐링 온도, 및 중간 신장 온도 등의 3개 이상의 온도 설정점 사이에서 열 사이클에 의해 수행될 수 있다. 터치다운(Touchdown) PCR 등의 기타 형태의 PCR을 이 정의에 포함시킬 수 있고, 여기서 사이클링 반응 동안에 어닐링 및/또는 확장 온도가 변할 수 있다.
용어 "프라이머"는, 폴리뉴클레오티드 연장이 개시되는 조건, 예를 들면, 필수 뉴클레오시드 트리포스페이트(카피된 주형에 의해 지시됨) 및 폴리머라제의 존재를 포함하는 조건에서 적절한 완충액 및 적절한 온도 또는 온도 사이클(예: 폴리머라제 연쇄 반응에서와 같이)에서 위치되는 경우, 주형-지시된 핵산 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
용어 "프로브"는 적어도 하나의 염료 등의 적어도 하나의 표지에 연결된 핵산을 지칭한다.
용어 "정성적 PCR"은 일반적으로 표적 존재의 실질적 정량화 없이 표적이 샘플에 존재하는지의 여부를 결정하는 PCR 기반 분석을 지칭한다. 예시적 실시형태에서, 정성적 디지털 PCR은 구획의 패킷이 적어도 사전 정의된 백분율의 양성 액적을 포함하는지의 여부(양성 샘플) 또는 포함하지 않는지의 여부(음성 샘플)를 결정함으로써 수행될 수 있다.
용어 "정량적 PCR", "qPCR", "실시간 정량적 폴리머라제 연쇄 반응" 또는 "동역학적 폴리머라제 연쇄 반응"은 샘플에서 표적의 농도 및/또는 카피 수를 결정하는 PCR 기반 분석을 지칭한다. 이 기술은 PCR을 사용하여 표적 핵산을 동시에 증폭 및 정량화하고, 여기서 정량화는 표적 핵산에 하이브리드화한 경우에만 검출가능한 삽입 형광 염료, 또는 서열 증폭시에만 검출가능한 형광 리포터 분자를 함유하는 서열-특이적 프로브에 의한 것이다.
용어 "실시간 PCR"은, 반응의 최종적 열 사이클 전에 하나 이상의 열 사이클이 완료된 후 등의, 반응 중에 앰플리콘 형성이 측정되는 PCR 기반 분석을 지칭한다. 실시간 PCR은 일반적으로 표적 증폭의 동태에 기반하여 표적의 정량화를 제공한다.
용어 "복제"는 핵산 또는 이의 단편의 카피(즉, 직접 카피 및/또는 상보적 카피)를 형성하는 프로세스를 지칭한다. 복제는 일반적으로 특히 폴리머라제 및/또는 리가제 등의 효소를 포함한다. 복제된 핵산 및/또는 세그먼트는 복제를 위한 주형(및/또는 표적)이다.
용어 "샘플"은 임의의 적합한 공급원(들)으로부터의 목적 화합물, 조성물 및/또는 혼합물을 지칭한다. 샘플은, 샘플에 존재할 수 있는 적어도 하나의 분석물과 관련된 태양 등의 샘플의 태양을 분석하는 검정에 대한 일반적 대상이다. 샘플은 수집된 자연 상태 및/또는 변경된 상태에서, 예를 들면, 보관, 보존, 추출, 용해, 희석, 농축, 정제, 여과, 하나 이상의 시약과의 혼합, 사전-증폭(예: PCR 전에 샘플에 대한 제한된 사이클(예: <15)의 PCR을 실행함으로써 표적 농후화를 달성하기 위해), 앰플리콘의 제거(예: PCR 전에 우라실-d-글리코실라제(UDG, UNG, 우라실-N-글리코실라제 유전자라고도 공지됨)로 처리하여, 이전에 생성된 앰플리콘에 의한 임의의 캐리-오버 오염을 제거하기 위해(즉, 앰플리콘은, dTTP 대신에 dUTP로 생성되기 때문에, UDG로 소화 가능하다)), 분할 또는 이들의 조합에 의해 분석할 수 있다. 임상 샘플에는 비인두 세척액, 혈액, 혈장, 무세포 혈장, 백혈구 연층, 타액, 소변, 대변, 가래, 점액, 창상 스왑, 조직 생검, 우유, 유체 흡인물, 스왑(예: 비인두 스왑) 및/또는 조직이 포함될 수 있다. 샘플은 진단 목적(예: 감염성 병원체 등의 임상 분석물의 정량적 측정) 또는 모니터링 목적(예: 생물 위협제 등의 대상 환경 분석물이 소정 역치를 초과했는지의 여부를 결정하기 위해)을 위해 수집될 수 있다.
용어 "증폭되는 서열"은 정방향 프라이머의 서열로 개시하여 역방향 프라이머에 상보적인 서열로 종결하고, 프라이머 서열 사이에 위치된 추가의 염기 쌍을 함유하는, "검출가능한 서열"(상기에서 정의됨)을 포함하는 핵산을 지칭한다. 증폭되는 서열의 증폭의 산물은 앰플리콘이다. 최종적으로, 증폭은 농도의 결정에 의해 "증폭되는 서열"의 정량화를 가능하게 한다. 증폭되는 서열의 길이는 "La"로서 표시된다.
도 1은 한정이 아닌 예로서 정량적 핵산 증폭 방법의 개략도이다. 여기에서, 이본쇄 단편화된 핵산은 수평의 흑색 실선으로 표시된다. 2개의 프라이머(정방향 프라이머 FP 및 역방향 프라이머 RP)는 증폭되는 서열(SA)의 좌측 및 우측 경계를 각각 정의한다. 증폭되는 서열(SA)의 양쪽 쇄는 증폭 중에 카피된다. 도 1a에서, 검출된 서열(DS)은 증폭되는 서열(SA)의 일부이다. 형광 표지 프로브(Probe)는 검출된 서열에 특이적으로 결합한다. 도 1b에서, 검출된 서열(DS)과 증폭되는 서열(SA)은 동일하다. 형광 염료(FD)는 증폭 중에 생성된 이본쇄 핵산에 삽입된다.
도 2는 150bp를 중심으로 하는 길이 분포에 대해 실시예 E1에서 사용한 샘플의 DNA 단편의 길이 분포(LD)를 나타내는 그래프이다. f(i)는 샘플 내의 단편이 i개의 염기쌍(X-축) 길이를 갖는 확률(Y축 - 임의 단위)이다.
도 3은, 도 2에 도시된 샘플에 대해 추정된, 증폭되는 서열의 길이 La(염기 쌍 bp)의 함수로서, 증폭되는 서열이 절단되지 않는 확률 P를 나타낸다.
도 4는, 도 2에 도시된 샘플에 대해 추정된, 증폭되는 서열의 길이 La(염기 쌍 bp)의 함수로서 예측된 보정 계수(PCF)를 나타낸다.
도 2는 150bp를 중심으로 하는 길이 분포에 대해 실시예 E1에서 사용한 샘플의 DNA 단편의 길이 분포(LD)를 나타내는 그래프이다. f(i)는 샘플 내의 단편이 i개의 염기쌍(X-축) 길이를 갖는 확률(Y축 - 임의 단위)이다.
도 3은, 도 2에 도시된 샘플에 대해 추정된, 증폭되는 서열의 길이 La(염기 쌍 bp)의 함수로서, 증폭되는 서열이 절단되지 않는 확률 P를 나타낸다.
도 4는, 도 2에 도시된 샘플에 대해 추정된, 증폭되는 서열의 길이 La(염기 쌍 bp)의 함수로서 예측된 보정 계수(PCF)를 나타낸다.
본 출원은, 단편화된 핵산을 포함하는 핵산 샘플에서 검출된 서열의 측정된 농도를 보정하기 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 본 명세서에서 제공되는 방법 및 시스템은 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 실제 농도에 더 근접하는, 검출된 서열의 보정된 농도의 결정을 가능하게 한다. 검출된 서열의 농도를, 검출된 서열을 포함하는 증폭되는 서열의 증폭에 의해 측정하는 경우, 증폭되는 서열의 일부를 포함하지만 증폭되는 서열의 길이보다 짧은 길이를 갖는 단편은 복제되지 않는다. 절단된 표적 영역(즉, 증폭되는 서열)의 복제 실패는 농도의 과소평가를 유도한다. 본 명세서에 제공된 방법은 비-단편화된 핵산 샘플에서 핵산의 농도의 수득되는 과소평가를 보정하기 위해 적용될 수 있다.
따라서, 본 발명은, 일부 태양에서, 하기 단계를 포함하는, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 결정하는 방법(상기 검출된 서열의 카피의 수를 결정하는 것을 포함함)을 제공한다(이하 "기본 방법"이라 함). 일부 태양에서, 본 발명은 단편화된 핵산 분자를 포함하는 샘플에서 검출된 서열의 농도(상기 검출된 서열의 카피의 수를 포함함)를 보정하는 방법을 제공한다. 또한, 본 명세서에 기재된 방법에 유용한 키트, 소프트웨어, 디바이스 및 기타 제조 물품이 제공된다.
I. 본 출원의 방법
본 발명은, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 결정하는 방법으로서, 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 상기 검출된 서열의 측정된 농도를 보정 계수로 보정하고, 이에 의해 비-단편화된 핵산에서 상기 검출된 서열의 농도를 수득하는 것을 포함하고, 상기 보정 계수는 길이 분포 및 측정 방법의 적어도 하나의 파라미터에 기반한다.
일부 실시형태에서, 하기 단계를 포함하는, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 결정하는 방법이 제공된다:
i. 단편화된 핵산을 포함하는 상기 샘플에서 상기 검출된 서열의 농도를 측정 방법으로 측정하는 단계; 및
ii. 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 상기 검출된 서열의 측정된 농도를 보정 계수로 보정하여, 비-단편화된 핵산에서 상기 검출된 서열의 농도를 수득하는 단계로서, 상기 보정 계수는 길이 분포(LD) 및 측정 방법의 적어도 하나의 파라미터에 기반하는, 단계.
일부 실시형태에서, 하기 단계를 포함하는, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열(하기에서 추가로 정의됨)의 농도를 결정하는 방법이 제공된다:
i. 단편화된 핵산을 포함하는 상기 샘플에서 상기 검출된 서열을 포함하는 표적 영역(이하 "증폭되는 서열"이라 함)을 증폭하는 단계;
ii. 상기 검출된 서열의 농도를 측정하는 단계; 및
iii. 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 상기 검출된 서열의 측정된 농도를 보정 계수로 보정하여, 비-단편화된 핵산에서 상기 검출된 서열의 농도를 수득하는 단계로서, 상기 보정 계수는 길이 분포(LD) 및 측정 방법의 적어도 하나의 파라미터에 기반하는, 단계.
일부 실시형태에서, 하기 단계를 포함하는, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 결정하는 방법이 본 명세서에 제공된다:
i. 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 핵산의 길이 분포(LD)를 결정하는 단계로서, 상기 단편화된 핵산은 상기 비-단편화된 핵산으로부터 유래하는, 단계;
ii. 단편화된 핵산을 포함하는 상기 샘플에서 상기 검출된 서열의 농도를 측정 방법으로 측정하는 단계; 및 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 상기 검출된 서열의 측정된 농도를 보정 계수로 보정하여, 비-단편화된 핵산에서 상기 검출된 서열의 농도를 수득하는 단계로서, 상기 보정 계수는 길이 분포(LD) 및 측정 방법의 적어도 하나의 파라미터에 기반하는, 단계.
일부 실시형태에서, 하기 단계를 포함하는, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 엄밀하게 반영하도록, 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 검출된 서열의 측정된 농도를 보정하는 방법이 본 명세서에서 제공된다:
i. 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 핵산의 길이 분포(LD)를 결정하는 단계로서, 상기 단편화된 핵산은 비-단편화된 핵산으로부터 유래하는, 단계; 및
ii. 측정된 농도를 보정 계수로 보정하여 비-단편화된 핵산에서 상기 검출된 서열의 농도를 수득하는 단계로서, 상기 보정 계수는 길이 분포(LD), 및 검출된 서열의 농도를 결정하기 위해 사용된 측정 방법의 적어도 하나의 파라미터를 기반으로 하는, 단계.
일부 실시형태에서, 하기 단계를 포함하는, 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 검출된 서열의 측정된 농도를 보정하는 방법으로서, 검출된 서열의 측정된 농도는 샘플에서 검출된 서열의 실제 농도의 과소평가인, 방법이 제공된다:
i. 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 핵산의 길이 분포(LD)를 결정하는 단계로서, 상기 단편화된 핵산은 비-단편화된 핵산으로부터 유래하는, 단계; 및
ii. 측정된 농도를 보정 계수로 보정하여, 비-단편화된 핵산에서 상기 검출된 서열의 농도를 수득하는 단계로서, 상기 보정 계수는 길이 분포(LD), 및 검출된 서열의 농도를 결정하기 위해 사용되는 측정 방법의 적어도 하나의 파라미터를 기반으로 하는, 단계.
일부 실시형태에서, 하기 단계를 포함하는, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 엄밀하게 반영하도록, 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 검출된 서열의 측정된 농도를 보정하는 방법이 본 명세서에서 제공된다:
i. 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 핵산의 길이 분포(LD)를 결정하는 단계로서, 상기 단편화된 핵산은 비-단편화된 핵산으로부터 유래하는, 단계;
ii. 단편화된 핵산을 포함하는 상기 샘플에서 상기 검출된 서열의 농도를 측정 방법으로 측정하는 단계; 및
iii. 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 상기 검출된 서열의 측정된 농도를 보정 계수로 보정하여, 비-단편화된 핵산에서 상기 검출된 서열의 농도를 수득하는 단계로서, 상기 보정 계수는 길이 분포(LD) 및 측정 방법의 적어도 하나의 파라미터에 기반하는, 단계.
일부 실시형태에서, 하기 단계를 포함하는, 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 검출된 서열의 측정된 농도를 보정하는 방법으로서, 상기 검출된 서열의 측정된 농도는 샘플에서 검출된 서열의 실제 농도의 과소평가인, 방법이 제공된다:
i. 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 핵산의 길이 분포(LD)를 결정하는 단계로서, 상기 단편화된 핵산은 비-단편화된 핵산으로부터 유래하는, 단계;
ii. 단편화된 핵산을 포함하는 상기 샘플에서 상기 검출된 서열의 농도를 측정 방법으로 측정하는 단계; 및
iii. 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 상기 검출된 서열의 측정된 농도를 보정 계수로 보정하여, 비-단편화된 핵산에서 상기 검출된 서열의 농도를 수득하는 단계로서, 상기 보정 계수는 길이 분포(LD) 및 측정 방법의 적어도 하나의 파라미터에 기반하는, 단계.
일부 실시형태에서 본 출원의 방법은 단편화된 핵산의 서열을 수득하는 것을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 이 방법은 단편화된 핵산의 유전적 좌표를 수득 또는 예측하는 것을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 이 방법은 단편화된 핵산을 인접 서열로 조립하는 것을 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서 단편화된 핵산의 샘플은 하기 "핵산 샘플 및 길이 분포" 서브섹션에 기재된 바와 같이 하기 3개의 카테고리의 임의의 조합이다:
i. 무세포 샘플 또는 세포-함유 샘플 중의 어느 하나,
ii. 자연적으로 단편화된 샘플 또는 인공적으로 단편화된 샘플 중의 어느 하나; 및
iii. 모든 유형의 데옥시리보핵산 또는 리보핵산.
일부 실시형태에서, 측정 방법은 샘플 중의 핵산을 서열분석하는 것을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 검출된 서열의 농도를 측정하는 것은 검출된 서열을 포함하는 증폭되는 서열을 증폭하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 측정 방법은 등온 정량적 핵산 증폭 방법(예를 들면, 루프 매개 등온 증폭 또는 정량적 핵산 서열 기반 증폭)이다. 일부 실시형태에서, 측정 방법은 비-등온 정량적 핵산 증폭 방법(예를 들면, 정량적 폴리머라제 연쇄 반응, 실시간 폴리머라제 연쇄 반응, 디지털 폴리머라제 연쇄 반응, 다중 폴리머라제 연쇄 반응 및 다중 디지털 폴리머라제 연쇄 반응)이다.
전술한 방법의 어느 하나에 따른 일부 실시형태에서, 검출된 서열 및 증폭되는 서열은 동일하고, 측정 단계는 증폭 중에 생성된 핵산(예를 들면, 도 1에 도시된 형광단을 포함하는 형광 염료)에서 표지의 도입을 검출하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 검출된 서열은 증폭되는 서열의 서브세트이고/이거나, 측정 단계는 도 1a에 도시된 바와 같이 검출된 서열(예를 들면, 형광단을 포함하는 형광 표지된 프로브)에 대한 표지된 프로브의 결합을 검출하는 것을 포함한다.
본 발명의 기본 방법의 측정 단계에서 실시된 측정 방법은 본질적으로 보정 계수를 결정하는 데 관련된 일부 파라미터를 사용한다. 특정 실시형태에서, 측정 방법은 복제 및 증폭 혼합물을 사용하는 증폭 방법이다.
일부 실시형태에서, 이 방법은 샘플 중의 핵산의 길이 분포 및 상기 측정 방법의 적어도 하나의 파라미터에 기반하여 보정 계수를 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 측정 방법의 적어도 하나의 파라미터는 증폭되는 서열의 길이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 측정 방법의 적어도 하나의 파라미터는 증폭되는 서열의 길이만을 포함한다.
따라서, 예를 들면, 일부 실시형태에서, 하기 단계를 포함하는, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 결정하는 방법이 본 명세서에 제공된다:
i. 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 핵산의 길이 분포(LD)를 결정하는 단계로서, 상기 단편화된 핵산은 비-단편화된 핵산으로부터 유래하는, 단계;
ii. 단편화된 핵산을 포함하는 상기 샘플에서 상기 검출된 서열의 농도를 측정 방법으로 측정하는 단계; 및 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 상기 검출된 서열의 측정된 농도를 보정 계수로 보정하여, 비-단편화된 핵산에서 상기 검출된 서열의 농도를 수득하는 단계로서, 상기 보정 계수는 검출된 서열을 포함하는 길이 분포(LD) 및 검출된 서열을 포함하는 증폭되는 서열의 길이에 기반하는, 단계.
일부 실시형태에서, 하기 단계를 포함하는, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 보다 엄밀하게 반영하도록, 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 검출된 서열의 측정된 농도를 보정하는 방법이 본 명세서에서 제공된다:
i. 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 핵산의 길이 분포(LD)를 결정하는 단계로서, 상기 단편화된 핵산은 비-단편화된 핵산으로부터 유래하는, 단계; 및
ii. 측정된 농도를 보정 계수로 보정하여, 비-단편화된 핵산에서 상기 검출된 서열의 농도를 수득하는 단계로서, 상기 보정 계수는 길이 분포(LD), 및 검출된 서열을 포함하는 증폭되는 서열의 길이에 기반하는, 단계.
일부 실시형태에서, 하기 단계를 포함하는, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 보다 엄밀하게 반영하도록, 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 검출된 서열의 측정된 농도를 보정하는 방법이 본 명세서에서 제공된다:
i. 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 핵산의 길이 분포(LD)를 결정하는 단계로서, 상기 단편화된 핵산은 비-단편화된 핵산으로부터 유래하는, 단계;
ii. 단편화된 핵산을 포함하는 상기 샘플에서 상기 검출된 서열의 농도를 측정 방법으로 측정하는 단계; 및
iii. 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 상기 검출된 서열의 측정된 농도를 보정 계수로 보정하여, 비-단편화된 핵산에서 상기 검출된 서열의 농도를 수득하는 단계로서, 상기 보정 계수는 길이 분포(LD), 및 검출된 서열을 포함하는 증폭되는 서열의 길이에 기반하는, 단계.
증폭되는 서열의 길이는 La로 표시될 수 있고, 이는 실제로 프라이머의 길이(정방향 및 역방향), 및 프라이머 사이에 위치한 추가 염기쌍의 길이의 합계이다.
일 실시형태에서, 증폭되는 서열의 길이 La는 프라이머의 길이(정방향 및 역방향) 이상이고, 일부 실시형태에서는 약 200bp 이하, 예를 들면, 약 170bp 이하, 150bp 이하 또는 130bp 이하이다.
복제를 위해, 프라이머는 먼저 핵산에 결합해야 한다. 프라이머의 모든 염기가 핵산에 상보적인 경우, 결합은 최적이지만(DNA의 경우, 아데닌은 티민에 상보적이고, 구아닌은 시토신에 상보적이며; RNA의 경우, 아데닌은 우라실에 상보적이고, 구아닌은 시토신에 상보적임), 프라이머의 몇몇 염기가 핵산과 상보적이지 않은 경우, 결합은 또한 효율적일 수 있다. 달리 말하면, 프라이머가 결합해야 하는 몇몇 염기만큼 핵산 서열이 짧아지는 경우에도, 복제 프로세스는 여전히 효율적일 수 있다. 관련 파라미터는 La, 또는 n이 0보다 큰 정수인 La-n, 또는 75% 내지 100% 범위의 단축 계수 r을 갖는 r·La(r에 La를 곱한 것)일 수 있고, 단 r·La는 항상 정수 값이다. 일부 실시형태에서, n은 1 내지 15, 1 내지 10, 또는 1 내지 5의 정수이다. 일부 실시형태에서, r은 0.75 초과 1 미만, 0.8 초과 1 미만, 0.85 초과 1 미만, 0.9 초과 1 미만, 또는 0.95 초과 1 미만의 값이다.
길이 파라미터(La)를 사용하여, 보정 계수는 하기의 "보정 계수의 결정" 서브섹션에서 기재된 실시형태들 중 임의의 것에 따라 결정될 수 있다.
보정 계수는, n이 0 초과의 정수(예: 1 내지 15, 1 내지 10, 또는 1 내지 5)인 La-n 또는 75% 내지 100% 범위의 단축 계수 r을 갖는 r·La(r에 La를 곱한 것)와 유사하게 계산될 수 있고, 단, r·La는, 하기 "보정 계수의 결정" 서브섹션에 기재된 바와 같이 복제를 여전히 유도하는 단축 단편을 고려하기 위해 항상 정수 값이다.
일부 실시형태에서, 하기 단계를 포함하는, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 결정하는 방법이 제공된다:
i. 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 핵산의 길이 분포를 결정하는 단계로서, 상기 단편화된 핵산은 비-단편화된 핵산으로부터 유래하는, 단계; ii. 단편화된 핵산을 포함하는 상기 샘플에서 상기 검출된 서열의 농도를 측정 방법으로 측정하는 단계; iii. 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 상기 검출된 서열의 측정된 농도를 보정 계수로 보정하여, 비-단편화된 핵산에서 상기 검출된 서열의 농도를 수득하는 단계로서,
상기 보정 계수는 식 
에 의해 결정되고,
상기 식에서,
L은 (La-n) 또는 r*La이고,
La는 증폭되는 서열의 길이이고,
n은 0 초과 15 미만의 정수이고;
r은 0.75 내지 1이고;
f(i)는 샘플의 단편이 i개의 염기쌍 길이를 갖는 확률이고;
일부 실시형태에서, L은 La이다.
핵산 단편의 길이 분포와 관련하여, La(또는 La-n 또는 r·La)보다 짧은 길이의 단편은 어쨌든 복제되지 않는다. 이러한 단편이 증폭되는 서열의 일부를 포함하는 경우, 이는 복제되지 않고, 이는 농도의 과소평가를 유도한다.
본 명세서에 기재된 보정 계수는 또한 증폭되는 서열이 서열 단편화 바이어스에 기반하여 단편화되는 확률에 기반할 수 있다. 일부 실시형태에서, 증폭되는 서열이 단편화되는 상대적 확률이 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, 증폭되는 서열이 단편화되는 확률은 단편화의 공급원(예를 들면, 천연 존재 핵산의 단편화 또는 초음파 처리 등의 물리적 수단에 의한 단편화)에 의존한다. 예를 들면, 보정 계수는, 조정 전의 보정 계수에, 서열 단편화 바이어스에 기반하여 증폭되는 서열이 단편화되는 확률을 곱함으로써 조정될 수 있다. 또는, 증폭되는 서열이 서열 단편화 바이어스에 기반하여 단편화되는 확률은 단편화 길이 분포(LD) 곡선을 수정함으로써 설명될 수 있다.
일부 실시형태에서, 측정 방법의 적어도 하나의 파라미터는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 증폭 단계의 파라미터를 추가로 포함한다: 증폭되는 서열의 GC 함량; 증폭 프라이머의 GC 함량; 증폭 프라이머의 길이; 사용되는 폴리머라제의 유형; 및 증폭 사이클의 온도. 일부 실시형태에서, 증폭 단계의 추가 파라미터는 계수에 단편 길이 분포(LD) 곡선을 곱한 것으로, 또는 하기의 "보정 계수의 교정" 서브섹션에 기재된 교정 계수에 보정 계수를 곱한 것으로 도입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 측정 방법의 적어도 하나의 파라미터는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 측정 단계의 파라미터를 추가로 포함한다: 검출 프로브의 서열; 사용된 형광단의 광안정성; 사용된 형광단의 화학적 안정성; 사용된 형광단의 양자 수율; 및 사용된 형광단의 파장. 일부 실시형태에서, 증폭 단계의 추가 파라미터는 계수에 단편 길이 분포(LD) 곡선을 곱한 것으로, 또는 하기 "보정 계수의 교정" 서브섹션에 기재된 교정 계수에 보정 계수를 곱한 것으로 도입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 보정에는 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 측정된 농도에 보정 계수를 곱하는 것이 포함된다. 일부 실시형태에서, 보정은 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 측정된 농도에 보정 계수 및 추가 보정 계수를 곱하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 추가 보정 계수는 증폭되는 서열이 서열 단편화 바이어스에 기반하여 단편화되는 확률에 기반한다. 일부 실시형태에서, 추가 보정 계수는 전술한 바와 같이 측정 방법의 적어도 하나의 파라미터에 기반한다. 일부 실시형태에서, 추가 보정 계수는 서열 증폭에 영향을 미치는 측정 방법의 적어도 하나의 파라미터에 기반한다(예를 들면, 증폭되는 서열의 GC 함량). 일부 실시형태에서, 추가 보정 계수는 검출된 서열의 검출에 영향을 미치는 측정 방법의 적어도 하나의 파라미터에 기반한다(예: 사용된 형광단의 광안정성 또는 화학적 안정성). 일부 실시형태에서, 추가 보정 계수는 하기의 "보정 계수의 교정" 서브섹션에 기재된 바와 같이 실험적으로 결정된 보정 계수에 기반한다.
일부 실시형태에서, 샘플 중의 핵산의 적어도 5%가 증폭되는 서열의 길이보다 짧은 길이를 갖는 경우, 보정이 적용된다. 일부 실시형태에서, 샘플 중의 핵산 단편의 95% 이하가, 증폭되는 서열의 길이보다 짧은 길이를 갖는다.
본 출원은 또한, 비-단편화된 핵산의 동일한 샘플에서 제1 검출된 서열(검출된 서열 S1)의 제1 농도 및 제2 검출된 서열(검출된 서열 S2)의 제2 농도의 함수를 결정하는 방법을 제공한다. 함수는 분수 또는 비율일 수 있다.
이 목적을 위해, 본 명세서에 기재된 방법은
i. 단편화된 핵산을 포함하는 상기 샘플에서 제2 검출된 서열의 농도를 측정 방법으로 측정하는 단계; 및
ii. 단편화된 핵산에서 상기 제2 검출된 서열의 농도를 보정 계수로 보정하여, 비-단편화된 핵산에서 상기 제2 검출된 서열의 농도를 수득하는 단계로서, 상기 보정 계수는 길이 분포(LD) 및 측정 방법의 적어도 하나의 파라미터에 기반하는, 단계
를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제2 검출된 서열의 농도를 측정하는 것은 제2 검출된 서열을 포함하는 증폭되는 제2 서열을 증폭하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 측정 방법은 다중 증폭 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 증폭되는 제1 서열의 길이는 증폭되는 제2 서열의 길이와 상이하고, 상이한 보정 계수가, 제1 및 제2 검출된 서열에 적용된다. 일부 실시형태에서, 증폭되는 제1 서열 및 증폭되는 제2 서열의 길이는 동일하다. 일부 실시형태에서, 측정 방법의 기타 파라미터는 제1 검출된 서열과 제2 검출된 서열 사이에서 상이하다(예를 들면, 프로브의 결합/검출과 관련된 파라미터, 또는 "보정 계수의 결정" 서브섹션에 기재된 바와 같이 증폭에 영향을 미치는 임의의 파라미터).
일부 실시형태에서, 증폭되는 제1 서열은 돌연변이 대립유전자 검출 서열 또는 변이 대립유전자 검출 서열을 포함하고, 증폭되는 제2 서열은 대응하는 참조 대립유전자 검출 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 증폭되는 제1 서열은, 증폭되는 제2 서열에 의해 구성되는 대응하는 참조 서열과 비교하여, 삽입 또는 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이 방법은 제2 검출된 서열과 비교하여, 제1 검출된 서열의 보정된 돌연변이 대립유전자 분획(MAF)을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 이 방법은, 제2 검출된 서열과 비교하여, 제1 검출된 서열의 보정된 변이 대립유전자 분획(VAF)을 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 증폭되는 제1 서열은 카피 수 변동(CNV)을 포함하는 변이체 핵산으로부터 증폭되고, 증폭되는 제2 서열은 참조 핵산으로부터 증폭된다. 일부 실시형태에서, 이 방법은 변이체 서열과 비교하여, 참조 서열의 보정된 카피 수 변동(CNVreal)을 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
전술한 임의의 실시형태에서, 이 방법은, 제1 단편 길이 분포(LD1)를 갖는 제1 핵산 샘플 및 제2 단편 길이 분포(LD2)를 갖는 제2 핵산 샘플에서 검출된 서열의 측정된 농도에 기반하는 보정 계수를 교정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
핵산 샘플 및 길이 분포
본 명세서에 제공된 일부 실시형태에서, 단편화된 핵산을 함유하는 샘플이 제공된다. 단편화된 핵산은 실제로 단편화를 거친 원래 핵산, 즉 비-단편화된 핵산으로부터의 단편이다. 실제로는, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도는 요구되는 측정치이지만, 이용 가능한 샘플은 실제로는 단편화되어 있다. 일부 실시형태에서, 이 방법은, 비-단편화된 핵산을 단편화하여, 단편화된 핵산을 포함하는 샘플을 생성하는 단계를 포함하지 않는다.
샘플에는 임의 유형의 단편화된 핵산이 포함될 수 있다. 특히, 샘플은 무세포 샘플, 즉 타액, 혈장, 소변 또는 전혈 등의 세포로부터 핵산이 방출된 생물학적 액체; 또는 세포 함유 샘플, 즉 생검 등의 본질적으로 세포를 함유하는 생물학적 샘플일 수 있다. 게다가, 샘플은 자연적으로 단편화된 샘플일 수 있다. 즉, 비-단편화된 핵산은 샘플링 전, 즉 살아있는 생물 내에서, 또는 보존 처리 또는 저장 조건으로 인해 샘플링 후에 자연적으로 분해되어 있다. 샘플은 최종적으로 인공적으로 단편화된 샘플일 수 있다. 즉, 비-단편화된 핵산이 샘플링되고, 이어서 측정 방법의 필요성에 따라 인공적으로 분해된다. 또한, 샘플은 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)일 수 있다.
무세포의 자연적으로 단편화된 DNA 샘플의 예는 다음과 같다:
· 아폽토시스 중 및 사멸 세포의 식균작용 후의 리소좀 DNAse II 분해 후에 카스파제 활성화된 DNAse에 의해 소화된 DNA; 및
· 혈장 뉴클레아제에 의해 절단된 순환 DNA.
자연적으로 단편화된 RNA 샘플의 예에는 리보뉴클레아제(예: 엔도- 및 엑소-뉴클레아제)에 의해 절단된 메신저 RNA가 포함되지만 이들로 한정되지 않는다. 이러한 샘플은 무세포 또는 세포 함유 샘플일 수 있다.
인공적으로 단편화된 DNA 및 RNA 샘플의 예는 다음과 같다:
· 포르말린 고정 후에 핵산이 단편화되고, 이어서 파라핀(FFPE)에 매립된 것(세포 함유 샘플의 예); 및
· 음향 전단법을 사용하여 핵산이 단편화되어 있는 것(무세포 샘플의 예).
본 발명의 기본 방법의 측정 단계에서 실시되는 측정 방법은 등온 정량적 핵산 증폭 방법 또는 비-등온 정량적 핵산 증폭 방법일 수 있다.
등온 정량적 핵산 증폭 방법은 루프 매개 등온 증폭 또는 정량적 핵산 서열 기반 증폭일 수 있다. 이는 RNA 검출을 가능하게 하기 위해 역전사 단계와 조합시킬 수 있다.
비-등온 정량적 핵산 증폭 방법은 정량적 폴리머라제 연쇄 반응, 실시간 폴리머라제 연쇄 반응, 디지털 폴리머라제 연쇄 반응, 다중 폴리머라제 연쇄 반응 또는 다중 디지털 폴리머라제 연쇄 반응일 수 있다. 이는 RNA 검출을 가능하게 하기 위해 역전사 단계와 조합시킬 수 있다.
이 방법의 일부 실시형태에서, 핵산 단편의 길이 분포(LD)가 제공된다. 본 발명에서, 단편은 원래의 비-단편화된 핵산의 천연 또는 인공 단편화로부터 생성된 개별 핵산을 지칭한다. 비제한적 예시로서, 10000 염기쌍(bp)의 길이를 갖는 원래의 비-단편화 핵산은, 예를 들면, 75bp 길이의 25개 단편, 100bp 길이의 50개 단편 및 125bp 길이의 25개 단편으로 단편화되어, 짧은 쇄 핵산의 모집단을 생성한다. 이어서, 이 모집단에서 핵산 단편의 길이 분포, 즉 모든 가능한 길이에 대해, 소정 길이를 갖는 단편의 수를 정의하는 것이 가능하다. 길이 분포는 통상 통계 함수(예: 가우스(Gaussian) 또는 포아송(Poisson) 분포) 또는 평균값 및 표준 편차 등의 파라미터를 사용하여 정의할 수도 있다.
샘플 중의 핵산 단편의 길이 분포를 측정하는 데 적합한 디바이스는, 예를 들면, 아길런트 테크놀로지스(Agilent Technologies)의 테이프 스테이션(Tape Station) 4200 기기 또는 바이오어낼라이저(Bioanalyzer) 2100 기기 또는 퍼킨엘머(PerkinElmer)의 LabChip GX Touch 핵산 분석기이다.
핵산 단편의 길이 분포와 관련하여, 증폭되는 서열의 길이보다 짧은 길이를 갖는 단편, La(또는 상기 정의된 바와 같은 La-n 또는 r·La)는 복제되지 않는다. 이러한 단편이 증폭되는 서열의 일부를 포함하는 경우, 이는 복제되지 않고, 이것은 농도를 과소평가하게 된다. 본 명세서에 제공된 방법은 비-단편화된 핵산 샘플에서 핵산 농도의 수득되는 과소평가를 보정하기 위해 적용될 수 있다.
La(또는 La-n 또는 r·La)보다 길이가 짧은 단편이 몇 개만 있는 경우, 보정 계수는 작아질 가능성이 높다. 실제로, 출원인은 핵산 단편의 최소 5%가 La(또는 La-n 또는 r·La)보다 짧은 길이를 갖는 경우, 보정 계수가 보다 적절하다는 것을 주목한다. La(또는 La-n 또는 r·La)보다 짧은 길이를 갖는 단편의 비율은 적어도 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84% 또는 85%일 수 있다. 일부 실시형태에서, 보정 계수를 결정하고, 검출된 서열의 농도를 보정하는 단계는 핵산 단편의 적어도 5%가 La(또는 La-n 또는 r·La)보다 짧은 길이를 갖는 경우에 적용된다.
추가로, 거의 모든 단편의 길이가 La(또는 La-n 또는 r·La)보다 짧은 경우, 보정 계수는 매우 높아질 가능성이 있다. 실제로, 출원인은 최대 95%의 핵산 단편이 La(또는 La-n 또는 r·La)보다 짧은 길이를 갖는 경우에 보정 계수가 보다 적절하다는 것을 주목한다. La(또는 La-n 또는 r·La)보다 길이가 짧은 단편의 비율은 최대 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, 60%, 59%, 58%, 57%, 56%, 55%, 54%, 53%, 52%, 51%, 50%, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16% 또는 15%일 수 있다.
특히, 길이가 La(또는 La-n 또는 r·La)보다 짧은 단편의 비율은 5%-95%, 5%-90%, 5%-85%, 5%-80%, 5%-75%, 5%-70%, 5%-65%, 5%-60%, 5%-55%, 5%-50%, 10%-95%, 10%-90%, 10%-85%, 10%-80%, 10%-75%, 10%-70%, 10%-65%, 10%-60%, 10%-55%, 10%-50%, 15%-95%, 15%-90%, 15%-85%, 15%-80%, 15%-75%, 15%-70%, 15%-65%, 15%-60%, 15%-55%, 15%-50%, 20%-95%, 20%-90%, 20%-85%, 20%-80%, 20%-75%, 20%-70%, 20%-65%, 20%-60%, 20%-55%, 20%-50%, 25%-95%, 25%-90%, 25%-85%, 25%-80%, 25%-75%, 25%-70%, 25%-65%, 25%-60%, 25%-55%, 25%-50%, 30%-95%, 30%-90%, 30%-85%, 30%-80%, 30%-75%, 30%-70%, 30%-65%, 30%-60%, 30%-55%, 30%-50%, 35%-95%, 35%-90%, 35%-85%, 35%-80%, 35%-75%, 35%-70%, 35%-65%, 35%-60%, 35%-55%, 35%-50%, 40%-95%, 40%-90%, 40%-85%, 40%-80%, 40%-75%, 40%-70%, 40%-65%, 40%-60%, 40%-55%, 40%-50%, 45%-95%, 45%-90%, 45%-85%, 45%-80%, 45%-75%, 45%-70%, 45%-65%, 45%-60%, 45%-55%, 45%-50%일 수 있다.
또 다른 실시형태에서, La는 40bp 초과 200bp 미만, 바람직하게는 50bp 초과 170bp 미만, 보다 바람직하게는 65bp 초과 150bp 미만, 훨씬 더 바람직하게는 70bp 초과 130bp 미만이다. 일부 실시형태에서, 증폭되는 서열 La의 길이는 65-70bp, 70-75bp, 75-80bp, 80-90bp, 90-100bp, 100-110bp, 110-120bp 또는 120-130bp의 범위이다.
또 다른 실시형태에서, 핵산 단편 길이 분포는 10bp 내지 1000bp 범위에 포함된다. 핵산 단편 길이 분포는 바람직하게는 25bp 내지 350bp, 바람직하게는 30bp 내지 320bp, 보다 바람직하게는 35bp 내지 290bp, 훨씬 더 바람직하게는 40bp 내지 270bp 범위에 포함된다.
보정 계수의 결정
일부 실시형태에서, 보정 계수가 결정된다. 실제, 원래의 비-단편화된 핵산이 증폭되는 서열 내에서 단편화되는 경우, 사용된 측정 방법은 증폭되는 서열을 검출할 수 없다. 이러한 검출의 부재는 농도의 과소평가를 유도한다. 이 보정 계수는 핵산 단편 길이 분포, 및 증폭되는 서열의 길이 등, 증폭되는 서열의 카피가 단편화 중에 절단되는 확률을 정의하는 데 관련된 파라미터, 및 잠재적으로 측정 방법과 특히 연관된 파라미터에 의존한다.
일부 실시형태에서, 검출된 서열의 측정된 농도는 보정 계수로 보정되어, 비-단편화된 핵산, 즉 원래 샘플에서 검출된 서열의 농도가 수득된다.
일부 실시형태에서, 검출된 서열의 농도를 측정하기 위해 실시된 측정 방법은 보정 계수를 결정하기 위해 관련된 일부 파라미터를 본질적으로 사용한다. 일부 실시형태에서, 측정 방법은 복제 및 증폭 혼합물을 사용하는 증폭 방법이다.
특정 관련성의 파라미터는 증폭되는 서열의 길이(이하 La로 표기됨)이다. 증폭되는 서열의 길이 La는 실제로 프라이머의 길이(정방향 및 역방향)과 프라이머 사이에 위치한 추가의 염기쌍 길이의 합계이다.
일 실시형태에서, 증폭되는 서열 La의 길이는 프라이머의 길이(정방향 및 역방향) 이상이고, 200bp 미만, 바람직하게는 170bp 미만, 보다 바람직하게는 150bp 미만 및 훨씬 더 바람직하게는 130bp보다 짧다.
복제를 위해, 프라이머는 먼저 핵산에 결합해야 한다. 결합은 프라이머의 모든 염기가 핵산에 상보적인 경우에 최적이지만(DNA의 경우, 아데닌은 티민에 상보적이고, 구아닌은 시토신에 상보적이며; RNA의 경우, 아데닌은 우라실에 상보적이고, 구아닌은 시토신에 상보적임), 프라이머의 몇몇 염기가 핵산과 상보적이지 않은 경우, 결합도 또한 효율적이다. 달리 말하면, 프라이머가 결합해야 하는 몇몇 염기만큼 핵산 서열이 짧아지는 경우에도, 복제 프로세스는 여전히 효율적일 수 있다. 관련 파라미터는 La, 또는 n이 1 내지 15의 정수인 La-n, 또는 단축 계수 r이 75% 내지 100%의 범위인 r·La(r에 La를 곱한 것)일 수 있고, 단, r·La는 항상 정수 값이다. 일부 실시형태에서, r은 0.75 초과 1 미만, 0.8 초과 1 미만, 0.9 초과 1 미만, 또는 0.95 초과 1 미만의 값이고, 단, r·La는 항상 정수 값이다.
일부 실시형태에서, n 또는 r의 값은 프라이머가 결합해야 하는 몇몇 염기만큼 단축된 증폭되는 서열에 대한 프라이머 결합의 예측된 강도에 기반하여 예측할 수 있다. 예를 들면, n 또는 r의 값은 증폭되는 서열 및/또는 프라이머의 파라미터(예: 증폭되는 서열의 GC 함량; 증폭 프라이머의 GC 함량; 증폭 프라이머의 길이; 사용되는 폴리머라제의 유형; 증폭 사이클의 온도)에 기반하여 예측될 수 있다. 일부 실시형태에서, n 또는 r의 값은, (a) 증폭되는 전장 서열에 결합하는 프라이머의 예측 용융 온도(Tm), (b) 상기한 바와 같이 (즉, La-n 또는 r·La) n 또는 r의 계수만큼 단축된 증폭되는 서열에 결합하는 프라이머의 예측 용융 온도, 및 (c) 증폭 방법에 사용되는 어닐링 온도에 기반하여 예측될 수 있다.
일부 실시형태에서, n 또는 r의 값은, 예를 들면, 하기 "보정 계수의 교정" 서브섹션에 기재된 교정 단계에서 실험적으로 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, n 또는 r은 증폭되는 소정 서열 및 하나의 샘플에 대한 증폭 프라이머의 세트에 대해 실험적으로 결정될 수 있고, 이어서 증폭되는 서열 및 증폭 조건이 동일한 임의의 샘플에 대한 L 파라미터를 교정하기 위해 사용할 수 있다.
길이 파라미터 La를 사용하여, 보정 계수는 다음과 같은 방식으로 결정될 수 있다.
P(X)를 이벤트 X의 확률이라고 한다.
La를 증폭되는 서열의 길이(염기 쌍의 수)라고 한다.
f를 샘플 중의 핵산 단편 길이의 확률 분포라고 한다(f(i)는 샘플 중의 단편이 i개 염기 쌍의 길이를 갖는 확률이다).
비-단편화된 핵산의 절단 위치는 랜덤이고, 염기 쌍을 따라 동일 확률인 것으로 가정한다.
확률 유니버스 Ω을 상호 배타적 이벤트로 분할한다.
여기서,
S(La,i) = {증폭되는 서열의 제1 염기는 길이 i의 단편에 속한다}.
그러면,
P(증폭되는 서열은 절단되지 않는다)
베이즈(Bayes) 정리의 적용에 의한 
및
게다가, N을 단편화된 핵산 샘플 중의 단편의 총 수라고 한다:
따라서:
및
마지막으로, 비-단편화된 핵산 샘플에서 검출된 서열의 농도(Creal)는 단편화된 핵산 샘플에서 검출된 서열의 측정된 농도(Cmeasured)를 보정 계수로 곱한 후에 수득된다:
이 보정 계수는 샘플 중의 핵산 단편의 길이 분포(f)와, 증폭 방법의 파라미터, 즉 증폭되는 서열의 길이 La에 의존한다.
보정 계수는, n이 0보다 큰 정수(예를 들면, 1 내지 15, 1 내지 10, 또는 1 내지 5의 정수)인 La-n, 또는 단축 계수 r이 75% 내지 100%의 범위인 r·La(r에 La를 곱한 것)을 사용하여 유사하게 계산할 수 있고, 단, r·La는 복제를 여전히 유도하는 단축된 단편을 고려하기 위해 항상 정수 값이다.
예를 들면, 증폭 프라이머의 세트가 여전히 n배 단축된 표적 영역에 결합하여 증폭할 수 있는 일부 실시형태에서, 보정 계수는 하기 식에 의해 결정된다:
상기 식에서, L은 표적 영역의 길이 - n(La-n)이고, 여기서 n은 1 내지 15의 정수이고;
f(i)는 샘플 중의 단편이 i개 염기 쌍의 길이를 갖는 확률이고;
증폭 프라이머 세트가 여전히 단축 계수 r에 의해 단축된 표적 영역에 결합하여 증폭할 수 있는 일부 실시형태에서, 보정 계수는 하기 식에 의해 결정된다:
상기 식에서, L은 표적 영역의 길이에 r(r·La)을 곱한 것이고, 여기서, r은 0.75 이상 1 미만이고, 단, r·La는 항상 정수 값이고;
f(i)는 샘플의 단편이 i개 염기 쌍의 길이를 갖는 확률이고;
특히, 돌연변이를 겪은 핵산의 분획, 예를 들면, 돌연변이 대립유전자 분획(MAF)을 측정하는 것이 일부 경우에 관련될 수 있다. 이 특정 경우에, 제1 검출된 서열(S1)은 돌연변이체(mut)이고, 제2 검출된 서열(S2)은 야생형(wt)이다. 검출된 두 서열이 상이한 길이로 증폭되는 서열과 연관되어 있는 경우, 두 농도에 대한 보정 계수는 상이하고, 반드시 고려해야 한다.
일부 경우에, 증폭된 참조 핵산(ref)에 대하여 증폭된 변이체 핵산(var)의 비율, 즉 카피 수 변동(CNV)을 측정하는 것도 관련될 수 있다(변이가 반드시 참조의 돌연변이는 아님).
일부 실시형태에서, 이 방법은 하기 단계를 포함한다.
제1 단계에서, 비-단편화된 핵산 중의 S1의 농도는 상기 기재된 기본 방법에 따라 결정된다. 이 단계에서, 보정 계수는 S1과 연관된 증폭되는 서열의 길이를 고려하여 결정된다.
제2 단계에서, 비-단편화된 핵산 중의 S2의 농도는 상기 기재된 기본 방법에 따라 결정된다. 이 단계에서, 보정 계수는 S2와 연관된 증폭되는 서열의 길이를 고려하여 결정된다.
제3 단계에서, S1 농도와 S2 농도의 함수가 결정된다.
이 방법에서, 상기 S1 농도와 상기 S2 농도는 동일한 샘플에서 결정된다. 동일한 샘플에서 S1 및 S2 농도의 측정을 수행하기 위해, 다중 PCR 또는 다중 디지털 PCR이 특히 적합하다.
이 방법에서, S1과 연관된 증폭되는 서열의 길이는 S2와 연관된 증폭되는 서열의 길이와 상이하다.
돌연변이 대립유전자 분획(MAF)의 특정한 경우에서, 함수는 하기 관계식으로 결정되는 분획이다:
보정된 변이 대립유전자 분획(VAF)은 돌연변이 대립유전자 분획(MAF)을 결정하기 위해 사용된 것과 동일한 방법에 따라 결정될 수 있다.
카피 수 변동(CNV)의 특정 경우에, 함수는 다음 관계식에 따라 결정되는 비율이다.
보정 계수의 교정
일부 실시형태에서, 이 방법은 보정 계수를 교정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 교정 계수는 증폭되는 서열의 파라미터 또는 측정 방법의 파라미터(예: 증폭 또는 검출 단계의 파라미터)에 기반하여 교정된다.
본 명세서에 제공된 일부 실시형태에서, 보정 계수는 또한 증폭되는 서열이 서열 단편화 바이어스에 기반하여 단편화되는 확률에 기반할 수 있다. 일부 실시형태에서, 증폭되는 서열이 단편화될 상대적 확률은 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, 증폭되는 서열이 단편화될 확률은 단편화의 공급원(예: 천연 존재 핵산 단편화 또는 초음파 처리 등의 물리적 수단에 의한 단편화)에 의존한다. 일부 실시형태에서, 단편화 바이어스는 증폭되는 서열을 포함하는 영역의 염색질 구조에 의존한다. 일부 실시형태에서, 단편화 바이어스는 증폭되는 서열 내의 단편화와 연관된 서열의 상대적 발생에 의존한다(예를 들면, 제한 효소에 의해 표적화된 부위).
예를 들면, 일부 실시형태에서, 핵산 샘플은 아폽토시스 중에 카스파제-활성화된 DNAse에 의해 소화된 DNA를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 보정 계수는 증폭되는 서열이 아폽토시스 중에 단편화되는 확률에 기반한 보정 계수를 포함할 수 있다. 대부분의 체세포에서, DNA의 아폽토시스에 의한 절단은 이의 길이 및 배수에서 대략 195bp의 단편을 형성하는 반면, 신경 염색질의 단편화 패턴은 약 165bp의 크기를 특징으로 한다. 반복 가능한 길이는 단일 뉴클레오솜 크기에 대응한다(분해된 DNA 링커 포함). 뉴클레오솜 코어 내에서, DNA는 히스톤에 의해 뉴클레아제로부터 보호되는 반면, 링커는 소화에 취약하다. 따라서, 일부 실시형태에서, 보정 계수는, 염색질 구조(예를 들면, 뉴클레오솜 또는 링커 영역에서)에서의 위치에 기반하여, 증폭되는 서열이 단편화되는 확률을 나타내는 보정 계수에 적용된다.
일부 실시형태에서, 서열 단편화 바이어스는 위치 바이어스이다. 예를 들면, 일부 실시형태에서, 핵산 샘플은 RNA 샘플이다. RNA 전사물은 전사물 내의 특정 위치, 예를 들면, 전사물의 개시 및/또는 종료 지점에서 우선적으로 절단될 수 있다[참조: Tuerk A, Wiktorin G, Guler S (2017) Mixture models reveal multiple positional bias types in RNA-Seq data and lead to accurate transcript concentration estimates. PLOS Computational Biology 13(5): e1005515]. 따라서, 이러한 유형의 바이어스는 위치 바이어스라고 한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 보정 계수는, RNA 전사물 내에서 증폭되는 서열의 위치에 기초하여, 증폭되는 서열이 단편화되는 확률을 나타내는 보정 계수에 적용된다.
일부 실시형태에서, 핵산 샘플은 인공적으로 단편화된 핵산, 예를 들면, 기계적 전단 또는 효소적 단편화에 의해 생성된 핵산을 포함할 수 있다. 효소적으로 단편화된 핵산을 포함하는 핵산 샘플의 경우, 보정 계수를, 사용된 효소의 인식 서열 또는 서열 선호도(예: 트랜스포사제의 서열 바이어스)를 설명하는 보정 계수에 적용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 측정 방법의 적어도 하나의 파라미터는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 증폭 단계의 파라미터를 추가로 포함할 수 있다: 증폭되는 서열의 GC 함량; 증폭 프라이머의 GC 함량; 증폭 프라이머의 길이; 사용되는 폴리머라제의 유형; 및 증폭 사이클의 온도. 일부 실시형태에서, 측정 방법의 적어도 하나의 파라미터는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 측정 단계의 파라미터를 추가로 포함할 수 있다: 검출 프로브의 서열; 사용된 형광단의 광안정성; 사용된 형광단의 화학적 안정성; 사용된 형광단의 양자 수율; 및 사용된 형광단의 파장. 일부 실시형태에서, 증폭 단계의 추가 파라미터는, 길이 분포(LD) 곡선을 계수에 곱하거나, 또는 보정 계수를 교정 계수에 곱한 것으로 도입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기한 바와 같은 측정 방법의 추가 파라미터의 효과는 실험적으로 결정될 수 있고, 실험적으로 결정된 교정 계수로서 보정 계수에 통합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 이 방법은 제1 단편 길이 분포(LD1)를 갖는 제1 핵산 샘플 및 제2 단편 길이 분포(LD2)를 갖는 제2 핵산 샘플에서 검출된 서열의 측정된 농도에 기반하여 보정 계수를 교정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 핵산 샘플은 비-단편화된 샘플이다. 일부 실시형태에서, 제1 핵산 샘플은 단편화된 핵산을 포함하고, 여기서 핵산 단편의 5% 미만은 증폭되는 서열의 길이보다 짧은 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 제1 핵산 샘플은 제2 핵산 샘플에 대한 실측 보정 계수를 결정하기 위해 사용된다. 실측 보정 계수와 예측 보정 계수 사이의 상대 오차를 결정하고, 보정 계수로서 검출된 서열의 보정 농도의 계산에 적용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 당업자가 용이하게 이해할 수 있는 바와 같이, n 또는 r은, n 또는 r의 값이 예측된 보정 계수와 실측 보정 계수 사이에 최량의 적합을 제공하는지에 기초하여 결정될 수 있다.
본 명세서에 제공된 실시형태 중 어느 하나에 따른 일부 방법에서, 이 방법은 상기 기재된 파라미터 중 어느 하나에 기초한 교정 계수로 농도를 보정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 교정 계수는 본 명세서에 제공된 측정 방법 중 어느 하나에 따라 변형된 희석 계수로서 적용될 수 있다.
Ⅱ. 본 출원의 시스템
마지막으로, 본 발명은, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 결정하도록 구성된 시스템에 관한 것이다. 이 시스템은 하기 모듈을 포함한다.
제1 모듈은 단편화된 핵산의 샘플에서 검출된 서열의 농도를 측정하도록 구성되고, 상기 단편화된 핵산은 상기 비-단편화된 핵산으로부터 유래한다. 이 모듈은 본 발명의 기본 방법의 측정 단계를 실현한다.
적합한 모듈은 실시간 열순환기를 포함하고, 증폭 반응을 수행하기 위해 적절한 완충액에 프라이머, 인터칼레이팅 형광 염료 또는 형광 프로브 및 폴리머라제 효소를 포함하는 반응 혼합물을 사용한다. 또는, 실시간 열순환기 대신에 디지털 PCR 플랫폼을 사용할 수 있다. 이러한 디지털 PCR 플랫폼은, 분석 소프트웨어와 함께, PCR 저장소(종종 튜브, 플레이트 또는 미세유체 칩), 분할 시스템, 열순환기 및 형광 판독기로 구성된다.
제2 모듈은 상기 단편화된 핵산의 핵산 단편 길이 분포 및 상기 측정의 파라미터에 따라 보정 계수를 계산하도록 구성된다. 이 모듈은 통상 디스플레이 스크린, 적어도 하나의 마이크로프로세서, 데이터 교환 모듈 및 적어도 하나의 컴퓨터 판독가능 저장 매체를 포함하는 컴퓨터 장치이다. 또는, 이 모듈은 적어도 하나의 마이크로프로세서, 데이터 교환 모듈 및 적어도 하나의 컴퓨터 판독가능 저장 매체를 포함하는 원격 서버에 접속될 수 있다.
명령을 포함하는 컴퓨터 프로그램은, 프로그램이 컴퓨터 또는 원격 서버에 의해 실행될 때에, 컴퓨터 또는 원격 서버가 보정 계수를 자동적으로 계산하게 할 수 있다.
명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체는, 프로그램이 컴퓨터 또는 원격 서버에 의해 실행될 때에 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 컴퓨터 판독 가능 저장 매체는 비-일시적 컴퓨터 판독 가능 저장 매체이다.
제3 모듈은, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 보정 계수로 계산하도록 구성된다.
제1 모듈은 등온 정량적 핵산 증폭 모듈 또는 비-등온 정량적 핵산 증폭 모듈일 수 있다.
등온 정량적 핵산 증폭 모듈은 통상, 증폭 반응을 수행하기 위해 적절한 등온 완충액에서 등온 증폭과 호환되는 프라이머, 인터칼레이팅 형광 염료 및 폴리머라제 효소, 및 호환 가능한 분석 소프트웨어를 구비한 열-조절 형광 스캐너를 포함한다. 적합한 모듈은 루프 매개 등온 증폭, 정량적 핵산 서열 기반 증폭, RNA 기술의 신호 매개 증폭 및 쇄 치환 증폭을 수행하는 모듈이다.
비-등온 정량적 핵산 증폭 모듈은 통상, 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 모듈, 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 모듈, 디지털 폴리머라제 연쇄 반응 모듈, 다중 폴리머라제 연쇄 반응 모듈 및 다중 디지털 폴리머라제 연쇄 반응 모듈이다.
제2 모듈은, 보정 계수를 계산하기 위해 제1 모듈에 의해 수행된 측정의 파라미터로서 증폭되는 서열의 길이를 사용할 수 있다.
이러한 모든 파라미터는 제2 모듈에 의해 수행되는 보정 계수의 계산에서 하나 또는 조합하여 포함될 수 있다.
III. 예시적 실시형태
본 출원의 일 태양은 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 보정하는 방법을 제공한다. 본 출원의 또 다른 태양은 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 결정하도록 구성된 시스템을 제공한다.
이 목적을 위해, 본 출원은 하기의 예시적 실시형태를 제공한다:
실시형태 1. 하기 단계를 포함하는, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 결정하는 방법:
i. 단편화된 핵산의 샘플을 제공하는 단계로서, 상기 단편화된 핵산은 상기 비-단편화된 핵산으로부터 유래하는, 단계;
ii. 상기 단편화된 핵산의 핵산 단편 길이 분포(LD)를 제공하는 단계;
iii. 상기 단편화된 핵산 샘플에서 상기 검출된 서열의 농도를 측정 방법으로 측정하는 단계;
iv. 상기 단편화된 핵산의 상기 핵산 단편 길이 분포(LD) 및 상기 측정 방법의 파라미터에 따라 보정 계수를 결정하는 단계; 및
v. 상기 단편화된 핵산에서 상기 검출된 서열의 농도를 상기 보정 계수로 보정하여, 비-단편화된 핵산에서 상기 검출된 서열의 농도를 수득하는 단계.
실시형태 2. 실시형태 1에 있어서, 상기 단편화된 핵산의 샘플이 하기 3개 카테고리의 임의의 조합인, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 결정하는 방법:
i. 무세포 샘플 또는 세포 함유 샘플 중의 어느 하나,
ii. 자연적으로 단편화된 샘플 또는 인공적으로 단편화된 샘플 중의 어느 하나; 및
iii. 모든 유형의 데옥시리보핵산 또는 리보핵산.
실시형태 3. 선행 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 상기 측정 방법이 등온 정량적 핵산 증폭 방법이고, 바람직하게는 루프-매개 등온 증폭 및 정량적 핵산 서열-기반 증폭으로부터 선택되는, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 측정하는 방법.
실시형태 4. 실시형태 1 또는 2에 있어서, 상기 측정 방법이 비-등온 정량적 핵산 증폭 방법이고, 바람직하게는 정량적 폴리머라제 연쇄 반응, 실시간 중합 효소 연쇄 반응, 디지털 중합 효소 연쇄 반응, 다중 중합 효소 연쇄 반응 및 다중 디지털 중합 효소 연쇄 반응으로부터 선택되는, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 결정하는 방법.
실시형태 5. 실시형태 3 또는 4에 있어서, 상기 측정 방법의 파라미터가 증폭되는 서열의 길이를 포함하는, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 결정하는 방법.
실시형태 6. 실시형태 5에 있어서, 핵산 단편의 적어도 5%가 증폭되는 서열의 길이보다 짧은 길이를 갖는, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 결정하는 방법.
실시형태 7. 실시형태 5 또는 6에 있어서, 최대 95%의 핵산 단편이 증폭되는 서열의 길이보다 짧은 길이를 갖는, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 결정하는 방법.
실시형태 8. 실시형태 5 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 증폭되는 서열의 길이가 40bp 초과 200bp 미만, 바람직하게는 50bp 초과 170bp 미만, 더 바람직하게는 65bp 초과 150bp 미만, 훨씬 더 바람직하게는 70bp 초과 130bp 미만인, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 결정하는 방법.
실시형태 9. 실시형태 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산 단편 길이 분포가 25bp 내지 350bp, 바람직하게는 30bp 내지 320bp, 보다 바람직하게는 35bp 내지 290bp, 훨씬 더 바람직하게는 40bp 내지 270bp의 범위로 포함되는, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 결정하는 방법.
실시형태 10. 비-단편화된 핵산에서 제1 검출된 서열 S1의 제1 농도 및 제2 검출된 서열 S2의 제2 농도의 함수를 결정하는 방법으로서,
iv. 실시형태 5 내지 9 중 어느 하나에 따른 상기 비-단편화된 핵산에서 S1의 농도를 결정하는 단계;
v. 실시형태 5 내지 9 중 어느 하나에 따른 상기 비-단편화된 핵산에서 S2의 농도를 결정하는 단계; 및
vi. 상기 S1 농도 및 상기 S2 농도의 상기 함수를 계산하는 단계
를 포함하고;
여기서, 상기 S1 농도 및 상기 S2 농도는 동일한 샘플에서 결정되고;
S1과 연관된 증폭되는 서열의 길이는 S2와 연관된 증폭되는 서열의 길이와 상이한, 방법.
실시형태 11. 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 결정하도록 구성된 시스템으로서,
i. 단편화된 핵산의 샘플에서 상기 검출된 서열의 농도를 측정하도록 구성된 모듈로서, 상기 단편화된 핵산은 상기 비-단편화된 핵산으로부터 유래하는, 모듈;
ii. 상기 단편화된 핵산의 핵산 단편 길이 분포(LD) 및 상기 측정의 파라미터에 따라 보정 계수를 계산하도록 구성된 모듈; 및
iii. 상기 비-단편화된 핵산에서 상기 검출된 서열의 농도를 상기 보정 계수로 계산하도록 구성된 모듈
을 포함하는, 시스템.
실시형태 12. 실시형태 11에 있어서, 상기 단편화된 핵산에서 상기 검출된 서열의 농도를 측정하도록 구성된 모듈이 등온 정량적 핵산 증폭 모듈이고, 바람직하게는 루프 매개 등온 증폭 모듈 및 정량적 핵산 서열-기반 증폭 모듈로부터 선택되는, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 측정하도록 구성된 시스템.
실시형태 13. 실시형태 11에 있어서, 상기 단편화된 핵산에서 상기 검출된 서열의 농도를 측정하도록 구성된 모듈이 비-등온 정량적 핵산 증폭 모듈이고, 바람직하게는 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 모듈, 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 모듈, 디지털 폴리머라제 연쇄 반응 모듈, 다중 폴리머라제 연쇄 반응 모듈 및 다중 디지털 폴리머라제 연쇄 반응으로부터 선택되는, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 측정하도록 구성된 시스템.
실시형태 14. 실시형태 12 또는 13에 있어서, 상기 측정의 파라미터가 증폭되는 서열의 길이를 포함하는, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 결정하도록 구성된 시스템.
IV. 실시형태
본 출원의 일 태양은 단편화된 핵산을 포함하는 핵산 샘플에서 목적 핵산 서열의 존재의 과소평가와 관련된 문제를 교정하는 방법을 제공한다. 본 출원의 또 다른 태양은 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 결정하도록 구성된 시스템을 제공한다.
이 목적을 위해, 본 출원은 다음과 같은 실시형태를 제공한다.
실시형태 1'. 하기 단계를 포함하는, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 결정하는 방법:
i. 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 핵산의 길이 분포를 결정하는 단계로서, 상기 단편화된 핵산은 비-단편화된 핵산으로부터 유래하는, 단계;
ii. 단편화된 핵산을 포함하는 상기 샘플에서 상기 검출된 서열의 농도를 측정 방법으로 측정하는 단계; 및
iii. 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 상기 검출된 서열의 측정된 농도를 보정 계수로 보정하여, 비-단편화된 핵산에서 상기 검출된 서열의 농도를 수득하는 단계로서, 상기 보정 계수는 길이 분포 및 측정 방법의 적어도 하나의 파라미터에 기반하는, 단계.
실시형태 2'. 실시형태 1'에 있어서, 상기 검출된 서열의 농도를 측정하는 것이 검출된 서열을 포함하는 증폭되는 서열을 증폭하는 것을 포함하는, 방법.
실시형태 3'. 실시형태 2'에 있어서, 상기 검출된 서열 및 증폭되는 서열이 동일하고, 상기 측정 단계가 증폭 중에 생성된 핵산에서 표지의 도입을 검출하는 것을 포함하는, 방법.
실시형태 4'. 실시형태 3'에 있어서, 상기 표지가 형광단을 포함하는 형광 염료인, 방법.
실시형태 5'. 실시형태 2'에 있어서, 상기 검출된 서열이 증폭되는 서열의 서브세트이고, 측정하는 단계가 검출된 서열에 대한 표지된 프로브의 결합을 검출하는 것을 포함하는, 방법.
실시형태 6'. 실시형태 4'에 있어서, 상기 표지된 프로브가 형광단을 포함하는 형광 표지된 프로브인, 방법.
실시형태 7'. 상기 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 방법이, 샘플 중의 핵산의 길이 분포(LD) 및 상기 측정 방법의 적어도 하나의 파라미터에 기반하여 보정 계수를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 8'. 상기 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 측정 방법의 적어도 하나의 파라미터가 증폭되는 서열의 길이(La)를 포함하는, 방법.
실시형태 9'. 실시형태 2' 내지 8' 중 어느 한 실시형태에 있어서, 보정 계수가 하기 식에 의해 결정되는 방법:
상기 식에서,
L은 증폭되는 서열의 길이(La)이고;
f(i)는 샘플 중의 단편이 i개의 염기쌍 길이를 갖는 확률이고;
실시형태 10'. 실시형태 2' 내지 8' 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 증폭 프라이머의 세트가 n배 단축된 증폭되는 서열에 여전히 결합할 수 있고, 상기 보정 계수가 하기 식에 의해 결정되는, 방법:
상기 식에서,
L은 증폭되는 서열의 길이 - n(La-n)이고, 여기서 n은 1 내지 15의 정수이고;
f(i)는 샘플 중의 단편이 i개의 염기쌍 길이를 갖는 확률이고;
실시형태 11'. 실시형태 10'에 있어서, n이 1 내지 5의 정수인, 방법.
실시형태 12'. 실시형태 2' 내지 8' 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 증폭 프라이머 세트가 단축 계수 r에 의해 단축된 증폭되는 서열에 여전히 결합할 수 있고, 상기 보정 계수가 하기 식에 의해 결정되는, 방법:
상기 식에서,
L은 r(r·La)을 곱한 증폭되는 서열의 길이이고, 여기서 r은 0.75 이상 1 미만이고, 단, r·La는 항상 정수 값이고;
f(i)는 샘플 중의 단편이 i개 염기쌍의 길이를 갖는 확률이고;
실시형태 13'. 상기 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 보정 계수는 또한, 증폭되는 서열이 서열 단편화 바이어스에 기반하여 단편화되는 확률에 기반하는, 방법.
실시형태 14'. 실시형태 2' 내지 13' 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 측정 방법의 적어도 하나의 파라미터가, 증폭되는 서열의 GC 함량; 증폭 프라이머의 GC 함량; 증폭 프라이머의 길이; 사용되는 폴리머라제의 유형; 증폭 사이클의 온도로 이루어진 그룹으로부터 선택된 증폭 단계의 파라미터를 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 15'. 실시형태 4' 또는 6' 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 측정 방법의 적어도 하나의 파라미터가 검출 프로브의 서열; 사용된 형광단의 광안정성; 사용된 형광단의 화학적 안정성; 사용된 형광단의 양자 수율; 및 사용된 형광단의 파장으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 측정 단계의 파라미터를 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 16'. 상기 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 보정하는 단계가 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 측정된 농도를 보정 계수와 곱하는 것을 포함하는 방법.
실시형태 17'. 상기 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서, 샘플 중의 핵산의 적어도 5%가 증폭되는 서열의 길이보다 짧은 길이를 갖는 경우, 상기 보정이 적용되는, 방법.
실시형태 18'. 상기 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서, 샘플 중의 핵산 단편의 95% 이하가 증폭되는 서열의 길이보다 짧은 길이를 갖는, 방법.
실시형태 19'. 상기 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 증폭되는 서열의 길이가 40bp 초과 200bp 미만인, 방법.
실시형태 20'. 실시형태 19'에 있어서, 증폭되는 서열의 길이가 50bp 초과 170bp 미만인, 방법.
실시형태 21'. 실시형태 19'에 있어서, 증폭되는 서열의 길이가 65bp 초과 150bp 미만인, 방법.
실시형태 22'. 실시형태 19'에 있어서, 증폭되는 서열의 길이가 70bp 초과 130bp 미만인, 방법.
실시형태 23'. 상기 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서, 샘플 중의 핵산 단편의 길이 분포(LD)가 25bp 내지 350bp의 범위에 포함되는, 방법.
실시형태 24'. 실시형태 23'에 있어서, 샘플 중의 핵산 단편의 길이 분포(LD)가 30bp 내지 320bp 범위에 포함되는, 방법.
실시형태 25'. 실시형태 23'에 있어서, 샘플 중의 핵산 단편의 길이 분포(LD)가 35bp 내지 290bp 범위에 포함되는, 방법.
실시형태 26'. 실시형태 23'에 있어서, 샘플 중의 핵산 단편의 길이 분포(LD)가 40bp 내지 270bp 범위에 포함되는, 방법.
실시형태 27'. 상기 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 방법이 단편화된 핵산의 서열을 수득하는 것을 포함하지 않는, 방법.
실시형태 28'. 상기 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 방법이 단편화된 핵산의 유전적 좌표를 수득 또는 예측하는 것을 포함하지 않는, 방법.
실시형태 29'. 상기 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 방법이 단편화된 핵산을 연속 서열로 조립하는 것을 포함하지 않는, 방법.
실시형태 30'. 상기 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 방법이, 비-단편화된 핵산을 단편화하여, 단편화된 핵산을 포함하는 샘플을 생성하는 것을 포함하지 않는, 방법.
실시형태 31'. 상기 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 측정 방법이 샘플 중의 핵산을 서열분석하는 것을 포함하지 않는, 방법.
실시형태 32'. 상기 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 단편화된 핵산을 포함하는 샘플이 세포-함유 샘플인, 방법.
실시형태 33'. 실시형태 1' 내지 31' 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 단편화된 핵산을 포함하는 샘플이 무세포 샘플인, 방법.
실시형태 34'. 상기 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 단편화된 핵산을 포함하는 샘플이 자연적으로 단편화된 샘플인, 방법.
실시형태 35'. 실시형태 1' 내지 29' 또는 31' 내지 33' 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 단편화된 핵산을 포함하는 샘플이 인공적으로 단편화된 샘플인, 방법.
실시형태 36'. 상기 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 단편화된 핵산을 포함하는 샘플이 데옥시리보핵산 샘플인, 방법.
실시형태 37'. 상기 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 단편화된 핵산을 포함하는 샘플이 리보핵산 샘플인, 방법.
실시형태 38'. 실시형태 2'-37' 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 측정 방법이 등온 정량적 핵산 증폭 방법인, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 결정하는 방법.
실시형태 39'. 실시형태 38'에 있어서, 상기 측정 방법이 루프 매개 등온 증폭 및 정량적 핵산 서열-기반 증폭으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
실시형태 40'. 실시형태 2' 내지 37' 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 측정 방법이 비-등온 정량적 핵산 증폭 방법인, 방법.
실시형태 41'. 실시형태 40'에 있어서, 상기 측정 방법이 정량적 폴리머라제 연쇄 반응, 실시간 폴리머라제 연쇄 반응, 디지털 폴리머라제 연쇄 반응, 다중 폴리머라제 연쇄 반응 및 다중 디지털 폴리머라제 연쇄 반응으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
실시형태 42'. 상기 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제1 단편 길이 분포(LD1)를 갖는 제1 핵산 샘플 및 제2 단편 길이 분포(LD2)를 갖는 제2 핵산 샘플에서 검출된 서열의 측정된 농도에 기반하여 보정 계수를 교정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 43'. 상기 실시형태 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 방법이
i. 단편화된 핵산을 포함하는 상기 샘플에서 제2 검출된 서열의 농도를 측정 방법으로 측정하는 단계; 및
ii. 단편화된 핵산에서 상기 제2 검출된 서열의 측정된 농도를 보정 계수로 보정하여 비-단편화된 핵산에서 상기 제2 검출된 서열의 농도를 수득하는 단계로서, 상기 보정 계수는 길이 분포(LD) 및 측정 방법의 적어도 하나의 파라미터에 기반하는, 단계
를 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 44'. 실시형태 43'에 있어서, 상기 제2 검출된 서열의 농도를 측정하는 것이, 제2 검출된 서열을 포함하는 증폭되는 제2 서열을 증폭하는 것을 포함하는, 방법.
실시형태 45'. 실시형태 44'에 있어서, 상기 증폭되는 제1 서열의 길이가 증폭되는 제2 서열의 길이와 상이한, 방법.
실시형태 46'. 실시형태 43' 내지 45' 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 증폭되는 제1 서열이 돌연변이 대립유전자 검출 서열을 포함하고, 상기 증폭되는 제2 서열이 대응하는 참조 대립유전자 검출 서열을 포함하는, 방법.
실시형태 47'. 실시형태 43' 내지 45' 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 증폭되는 제1 서열이, 증폭되는 제2 서열에 의해 구성되는 대응하는 참조 서열과 비교하여, 삽입 또는 결실을 포함하는, 방법.
실시형태 48'. 실시형태 43' 내지 45' 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 방법이, 제2 검출된 서열과 비교하여, 제1 검출된 서열의 보정된 돌연변이 대립유전자 분획(MAF)을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 49'. 실시형태 48'에 있어서, 보정된 MAF(MAFreal)이 하기 식을 사용하여 계산되는, 방법:
실시형태 50'. 실시형태 43' 내지 45' 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 증폭되는 제1 서열이 카피 수 변동(CNV)을 포함하는 변이체 핵산으로부터 증폭되고, 상기 증폭되는 제2 서열이 참조 핵산으로부터 증폭되는, 방법.
실시형태 51'. 실시형태 43' 내지 45' 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 증폭되는 제1 서열이 카피 수 변동(CNV)을 포함하는 변이체 핵산으로부터 증폭되고, 상기 증폭되는 제2 서열이 참조 핵산으로부터 증폭되는, 방법.
실시형태 52'. 실시형태 43' 내지 45' 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 증폭되는 제1 서열이 카피 수 변동(CNV)을 포함하는 변이체 핵산으로부터 증폭되고, 상기 증폭되는 제2 서열이 참조 핵산으로부터 증폭되는, 방법.
실시형태 53'. 실시형태 50'에 있어서, 상기 방법이 다음 식을 사용하여, 변이체 서열과 비교하여 참조 서열의 보정된 카피 수 변동(CNVreal)을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법:
실시형태 54'. 실시형태 43' 내지 51' 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 측정 방법이 다중 증폭 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 55'. 하기를 포함하는, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 결정하도록 구성된 시스템:
i. 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 상기 검출된 서열의 농도를 측정하도록 구성된 모듈로서, 상기 단편화된 핵산은 상기 비-단편화된 핵산으로부터 유래하는, 모듈;
ii. 샘플 중의 핵산의 길이 분포(LD) 및 상기 측정치의 파라미터에 따라 보정 계수를 계산하도록 구성된 모듈; 및
iii. 비-단편화된 핵산에서 상기 검출된 서열의 농도를 상기 보정 계수로 계산하도록 구성된 모듈.
실시형태 56'. 실시형태 53'에 있어서, 상기 단편화된 핵산에서 상기 검출된 서열의 농도를 측정하도록 구성된 모듈이 등온 정량적 핵산 증폭 모듈이고, 루프 매개 등온 증폭 모듈 및 정량적 핵산 서열-기반 증폭 모듈로부터 선택되는, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 결정하도록 구성된 시스템.
실시형태 57'. 실시형태 53'에 있어서, 상기 단편화된 핵산에서 상기 검출된 서열의 농도를 측정하도록 구성된 모듈이 비-등온 정량적 핵산 증폭 모듈이고, 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 모듈, 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 모듈, 디지털 폴리머라제 연쇄 반응 모듈, 다중 폴리머라제 연쇄 반응 모듈 및 다중 디지털 폴리머라제 연쇄 반응으로부터 선택되는, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 측정하도록 구성된 시스템.
실시형태 58'. 실시형태 54' 또는 55에 있어서, 상기 측정의 파라미터가 증폭되는 서열의 길이를 포함하는, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 결정하도록 구성된 시스템.
실시형태 59'. 비-단편화된 핵산에서 제1 농도의 검출된 제1 서열 S1 및 제2 농도의 검출된 제2 서열 S2의 카피 수 변동(CNV)을 결정하는 방법으로서,
i. 단편화된 핵산을 포함하는 핵산 샘플에서 S1 및 S2의 농도를 측정하는 단계,
ii. 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 S1 및 S2의 측정된 농도를 보정 계수로 보정하여 비-단편화된 핵산에서 상기 검출된 서열의 농도를 수득하는 단계로서, 상기 보정 계수는 길이 분포(LD) 및 측정 방법의 적어도 하나의 파라미터에 기반하는, 단계;
iii. S1 및 S2의 보정된 농도를 사용하여 CNV를 계산하는 단계
를 포함하고;
여기서, S1 및 S2의 농도는 동일한 샘플에서 측정되고;
S1과 관련된 측정 방법의 적어도 하나의 파라미터는 S2와 관련된 측정 방법의 적어도 하나의 파라미터와 상이한, 방법.
실시형태 60'. 실시형태 59'에 있어서, 상기 S1 및 S2의 농도를 측정하는 것이 S1을 포함하는 증폭되는 제1 서열 및 S2를 포함하는 증폭되는 제2 서열을 증폭하는 것을 포함하는, 방법.
실시형태 61'. 실시형태 60'에 있어서, 상기 측정 방법의 적어도 하나의 파라미터가 증폭되는 서열의 길이를 포함하는, 방법.
실시형태 62'. 실시형태 61'에 있어서, S1을 포함하는 증폭되는 서열의 길이가 S2를 포함하는 증폭되는 서열의 길이와 상이한, 방법.
다양한 실시형태가 설명되고 예시되었지만, 상세한 설명은 본 명세서에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 특허청구범위에 의해 정의된 본 개시의 진정한 정신 및 범위를 벗어나지 않고도 당업자에 의해 실시형태에 다양한 수정이 이루어질 수 있다.
실시예
1
실시예
1의 방법:
a. 초음파 처리된 DNA의 제조
개시 샘플은 200ng/μl의 스톡 DNA(=6.06E+4cp/μl)(Human Genomic DNA, Bio-35025, Bioline, Paris, France)이고, 제조업체에 따르면 평균 길이가 50kbp를 초과한다.
Covaris® 마이크로튜브-15가 사용되고(15 내지 20μl ±1), 이는 제조업체에 따르면 최대 1μg의 DNA를 함유할 수 있다. 따라서, DNA 스톡 용액의 희석 단계는 TE: 트리스-EDTA로 수행된다. 이에 의해, 60ng/μl(=1.82E+4cp/μl)의 DNA 용액이 수득되고, 이는 Covaris® 마이크로튜브-15에서 초음파 처리할 수 있다.
초음파 처리는 M220 포커스드-울트라소니피케이터(Focused-ultrasonicator)(Covaris®, Brighton, United Kingdom)에서 수행된다.
먼저, Covaris®로 달성할 수 있는 최소 단편(대략 150bp를 중심으로 하는 길이 분포)를 제조하여, 인간 DNA 단편 길이의 분포, 즉 인간 혈장에서 발견된 모드(163, 316 및 465bp)에 최대한 가깝게 했다.
이어서, 200bp, 350bp, 550bp를 중심으로 하는 길이 분포를 제조한다.
모든 초음파 처리는 Covaris® 마이크로튜브-50(55μl±2.5) 또는 마이크로튜브 스냅-캡(Snap-Cap)(130μl±5)에서 이루어졌고, 이는 제조업체에 따르면 최대 5μg의 DNA를 함유할 수 있다.
b.
TapeStation을
사용한 초음파 처리된 DNA 샘플의 검증
그레이스케일 데이터는 4200 TapeStation 시스템(Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA) 전기영동 이미지로부터 추출하여, 모든 이론적 보정 계수를 계산하는 데 필요한 염기쌍 분포를 취득했다. 질량 단위를 염기쌍 단위로 변환하기 위해, 이미지 강도를 반전시키고, 이어서 이미지의 픽셀 위치에서 예상되는 단편 길이로 나누었다.
고감도 D1000 스크린테이프를 사용한다.
c.
프라이머
,
프로브
및
형광단
사용된 프라이머 및 프로브는 유로제네텍(Eurogentec)(Eurogentec, Angers, France)에 의해 합성되었고, 역상의 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 정제되었다.
TriPlex PCR 실험에 사용되는 형광단은 다음과 같이 FAM, HEX 및 시아닌(Cyanine)(Cy5)이다:
· 길이 117 염기쌍의 증폭되는 서열을 사용하여 서열 BRAF V600 WT를 검출하기 위한 블루 채널(Blue Channel)의 FAM 형광단;
· 길이 78 염기쌍의 증폭되는 서열을 사용하여 서열 EGFR L858 WT를 검출하기 위한 녹색 채널(Green Channel)의 HEX 형광단;
· 길이 81 염기쌍의 증폭되는 서열을 사용하여 서열 ALB를 검출하기 위한 적색 채널(Red Channel)의 Cy5 형광단.
제조 템플릿 BRAF-EGFR-ALB는 표 1에 제시되어 있다. 표기 {}는 잠금 핵산 염기를 의미한다.
| 검출된 서열 | 프라이머 & 프로브 |
초기 농도
( μM ) |
최종 농도
( μM ) |
5'으로부터 3'의 서열 | 서열번호 |
| BRAF V600 WT | 프라이머 정방향 | 200 | 0,5 | TACTGTTTTCCTTTACTTACTACACCTCAG | 1 |
| 프라이머 역방향 | 200 | 0,5 | ACTGATGGGACCCACTCCATC | 2 | |
| 프로브 (FAM) | 100 | 0,25 | CTAGCTACA{G}{T}GAAATCTCG | 3 | |
| EGFR L858 WT | 프라이머 정방향 | 200 | 0,5 | GCAGCATGTCAAGATCACAGATT | 4 |
| 프라이머 역방향 | 200 | 0,5 | CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT | 5 | |
| 프로브 (HEX) | 200 | 0,25 | AGTTTGG{C}{C}A{G}CCCAA | 6 | |
| ALB | 프라이머 정방향 | 200 | 0,5 | TGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTT | 7 |
| 프라이머 역방향 | 200 | 0,5 | CTCTCCTTCTCAGAAAGTGTGCATAT | 8 | |
| 프로브 (Cy5) | 100 | 0,25 | TGCTGAAACATTCACCTTCCATGCA | 9 |
d.
PCR
혼합물
PCR 반응은 Perfecta® Multiplex qPCR ToughMix®(Quanta Biosciences, Beverly, MA, USA)를 사용하여 최종 농도 1×에서 수행되었다. 0.1μM의 플루오레세인(VWR International, Fontenay-sous-Bois, France)을 PCR 혼합물에 첨가한다.
PCR 혼합물 어셈블리는 다음과 같다:
· Perfecta® qPCR Multiplex ToughMix® (1×)
· 플루오레세인 (0.1μM)
· 올리고뉴클레오티드 BRAF V600 WT, FAM fluorophore (1×)
· 올리고뉴클레오티드 EGFR L858 WT, HEX fluorophore (1X)
· 올리고뉴클레오티드 ALB, Cy5 fluorophore (1×)
· 물
| "초기 농도" (cp/μL) |
"최종 농도" (cp/μL) |
PCR 반응 (μL) |
|
| Perfecta qPCR Multiplex ToughMix (x) | 5 | 1 | 5.40 |
| 올리고스 (x) | 40 | 1 | 0.68 |
| 플루오레세인 (μM) | 1 | 0.1 | 2.70 |
| ADN hgDNA | 60606.1 | 3000 | 1.34 |
| 물 | 16.90 | ||
| 합계 - 최종 용적 (μL) | 27.02 |
샘플은, 표 2에 설명된 바와 같이, 초음파 처리되지 않은 경우의 각 표적 서열의 예상 최종 농도가 3000cp/μL이 되도록, PCR 혼합물에서 표적 서열을 희석하여 수득된다.
e.
dPCR
실험
샘플은 사파이어 칩(Stilla Technologies, Villejuif, France)의 입구 챔버에 로딩되고, 챔버당 27μL 용적이 로딩된다. 초음파 처리된 샘플당 3개의 복제물이 사용된다(샘플당 3개의 챔버). 1개의 초음파 처리되지 않은 샘플이 3개의 독립적 챔버에 3회 로딩된다.
Naica™ Geode(Stilla Technologies, Villejuif, France)는 샘플을 분할하도록 프로그래밍되어 있다.
PCR 조건은 다음과 같다: 95℃에서 10분, 이어서 95℃에서 30초, 58℃에서 15초의 45 사이클.
Naica™ Prism3(Stilla Technologies, Villejuif, France)를 사용한 이미지 취득을 위해, 청색, 녹색 및 적색 채널에 대해 디펄트로 설정된 노출 시간은 각각 65ms, 250ms 및 50ms이다.
f. 보정 계수 계산
본 발명의 방법에 따른 예측된 보정 계수("예측")는 150bp를 중심으로 하는 길이 분포에 대해 도 2에 도시된 바와 같이 실험적으로 측정된 샘플의 단편 길이 분포, 및 증폭되는 서열의 염기쌍(bp)의 길이로부터 계산된다.
본 발명의 방법에 따라 보정 계수를 계산하는 것은, 도 3에 도시된 바와 같이, 150bp를 중심으로 하는 길이 분포에 대해, 증폭되는 서열의 길이의 함수로서, 증폭되는 서열이 절단되지 않는 확률이 필요하다. 동일한 조건에 대한 보정 계수는 도 4에 도시되어 있다.
실측 보정 계수("Ground-truth")는 초음파 처리되지 않은 샘플 대 초음파 처리된 샘플에서 실험적으로 측정된 검출된 서열의 농도 사이의 비율을 계산함으로써 시험관내에서 수득된다.
상대 오차("상대 오차")는 실측 보정 계수에 대한 예측 보정 계수의 오차로서 정의된다.
실시예
1의 결과:
실험적 결과 및 이론적 결과를 표 3에 비교했다. 예측 및 실측 보정 계수는, 초음파 처리된 샘플에서 상이한 서열 길이(78bp, 81bp, 117bp)로 증폭되는 서열의 농도를 측정하는 TriPlex 디지털 PCR 실험으로 다양한 단편 길이(150bp, 200bp, 350bp, 550bp)에서 수득되었다. 각 실험 측정은 3회 수행되었고, 표시된 값은 3회 반복 값의 평균이다.
| 보정 계수 | ||||
| 길이 117bp의 증폭되는 서열 | 길이 81bp의 증폭되는 서열 | 길이 78bp의 증폭되는 서열 | ||
| 150bp에서 주문된 초음파 처리 | 예측 | 2,94 | 1,93 | 1,87 |
| 실측 | 2,51 | 1,67 | 1,64 | |
| 상대 오차 | 15% | 13% | 12% | |
| 200bp에서 주문된 초음파 처리 | 예측 | 2,28 | 1,68 | 1,64 |
| 실측 | 1,93 | 1,50 | 1,46 | |
| 상대 오차 | 15% | 11% | 11% | |
| 350bp에서 주문된 초음파 처리 | 예측 | 1,57 | 1,34 | 1,33 |
| 실측 | 1,31 | 1,18 | 1,16 | |
| 상대 오차 | 17% | 12% | 13% | |
| 550bp에서 주문된 초음파 처리 | 예측 | 1,28 | 1,18 | 1,17 |
| 실측 | 1,18 | 1,17 | 1,16 | |
| 상대 오차 | 8% | 1% | 1% | |
1% 내지 17% 범위의 수득된 상대 오차 값은 예측된 보정 계수가 일관하여 정확하고, 실측 보정 계수에 대하여 약간 과대평가를 나타내는 것을 알 수 있다.
상기로부터, 증폭되는 서열의 길이는 표준 PCR 서열을 대표하고, 단편 길이 분포는 자연적으로 발생하는 단편화와 일치하기 때문에, 본 발명의 방법은 실제 조건에서 직접 사용할 수 있는 결과를 제공한다고 추론할 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> STILLA TECHNOLOGIES
ANDRE Barbara
DANGLA Remi
<120> DETERMINATION OF NUCLEIC ACID SEQUENCE CONCENTRATIONS
<130> CV - 1302/PCT
<150> EP19306346.8
<151> 2019-10-16
<160> 9
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF V600 WT - Primer Forward
<400> 1
tactgttttc ctttacttac tacacctcag 30
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF V600 WT - Primer Reverse
<400> 2
actgatggga cccactccat c 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF V600 WT - Probe (FAM)
<220>
<221> modified_base
<222> 10
<223> /mod_base="OTHER"
/note="Locked Nucleic Acid (LAN) base"
<220>
<221> modified_base
<222> 11
<223> /mod_base="OTHER"
/note="Locked Nucleic Acid (LAN) base"
<400> 3
ctagctacag tgaaatctcg 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR L858 WT - Primer Forward
<400> 4
gcagcatgtc aagatcacag att 23
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR L858 WT - Primer Reverse
<400> 5
cctccttctg catggtattc tttct 25
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR L858 WT - Probe (HEX)
<220>
<221> modified_base
<222> 8
<223> /mod_base="OTHER"
/note="Locked Nucleic Acid (LAN) base"
<220>
<221> modified_base
<222> 9
<223> /mod_base="OTHER"
/note="Locked Nucleic Acid (LAN) base"
<220>
<221> modified_base
<222> 11
<223> /mod_base="OTHER"
/note="Locked Nucleic Acid (LAN) base"
<400> 6
agtttggcca gcccaa 16
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ALB - Primer Forward
<400> 7
tgaaacatac gttcccaaag agttt 25
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ALB - Primer Reverse
<400> 8
ctctccttct cagaaagtgt gcatat 26
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ALB - Probe (Cy5)
<400> 9
tgctgaaaca ttcaccttcc atgca 25
Claims (15)
- 하기 단계를 포함하는, 비-단편화된 핵산(non-fragmented nucleic acid)에서 검출된 서열의 농도를 결정하는 방법:
i. 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 핵산의 길이 분포(LD)를 결정하는 단계로서, 상기 단편화된 핵산은 비-단편화된 핵산으로부터 유래하는, 단계;
ii. 단편화된 핵산을 포함하는 상기 샘플에서 상기 검출된 서열의 농도를 측정 방법으로 측정하는 단계, 및
iii. 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 상기 검출된 서열의 측정된 농도를 보정 계수로 보정하여, 비-단편화된 핵산에서 상기 검출된 서열의 농도를 수득하는 단계로서, 상기 보정 계수는 길이 분포(LD), 및 측정 방법의 적어도 하나의 파라미터에 기반하는, 단계. - 제1항에 있어서, 상기 검출된 서열의 농도를 측정하는 단계가, 상기 검출된 서열을 포함하는 증폭될 서열을 증폭하는 것을 포함하고, 상기 측정 방법의 적어도 하나의 파라미터가 증폭될 서열의 길이(La)를 포함하는, 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 보정 계수가 하기 식에 의해 측정되는, 방법:
상기 식에서,
L은 증폭될 서열의 길이(La)이고;
f(i)는 샘플 내의 단편이 i개의 염기쌍(base pair)의 길이를 갖는 확률이고;
는 핵산 단편의 평균 길이이다.
- 제2항에 있어서, 샘플 내의 핵산의 적어도 5%가 증폭될 서열의 길이보다 짧은 경우, 상기 보정이 적용되는, 방법.
- 제2항에 있어서, 증폭될 서열의 길이가 40bp보다 길고 200bp보다 짧은, 방법.
- 제1항에 있어서, 샘플 중의 핵산 단편의 길이 분포(LD)가 25bp 내지 350bp 범위에 포함되는, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 단편화된 핵산의 유전적 좌표를 수득 또는 예측하는 것을 포함하지 않는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 측정 방법이 등온 정량적(isothermal quantitative) 핵산 증폭 방법인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 측정 방법이 비-등온 정량적(non-isothermal quantitative) 핵산 증폭 방법인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 방법이
i. 단편화된 핵산을 포함하는 상기 샘플에서 제2 검출된 서열의 농도를 측정 방법으로 측정하는 단계로서, 상기 제2 검출된 서열의 농도를 측정하는 것은 제2 검출된 서열을 포함하는 증폭될 제2 서열을 증폭하는 것을 포함하는, 단계; 및
ii. 단편화된 핵산에서 상기 제2 검출된 서열의 측정된 농도를 보정 계수로 보정하여, 비-단편화된 핵산에서 상기 제2 검출된 서열의 농도를 수득하는 단계로서, 상기 보정 계수는 길이 분포(LD) 및 측정 방법의 적어도 하나의 파라미터에 기반하고, 증폭될 제1 서열의 길이는 증폭될 제2 서열의 길이와 상이한, 단계
를 추가로 포함하는, 방법. - 제10항에 있어서, 상기 측정 방법은 다중 증폭 단계를 포함하는, 방법.
- 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 결정하도록 구성된 시스템으로서,
i. 단편화된 핵산을 포함하는 샘플에서 상기 검출된 서열의 농도를 측정하도록 구성된 증폭 모듈(module)로서, 상기 단편화된 핵산은 상기 비-단편화된 핵산으로부터 유래하는, 증폭 모듈;
ii. 샘플 중의 핵산의 길이 분포(LD) 및 상기 측정치의 적어도 하나의 파라미터에 따라 보정 계수를 계산하도록 구성된 모듈; 및
iii. 비-단편화된 핵산에서 상기 검출된 서열의 농도를 상기 보정 계수로 계산하도록 구성된 모듈
을 포함하는, 시스템. - 제12항에 있어서, 상기 단편화된 핵산에서 상기 검출된 서열의 농도를 측정하도록 구성된 모듈이, 루프 매개(loop mediated) 등온 증폭 모듈 및 정량적 핵산 서열-기반 증폭 모듈로부터 선택된, 등온 정량적 핵산 증폭 모듈인, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 결정하도록 구성된 시스템.
- 제12항에 있어서, 상기 단편화된 핵산에서 상기 검출된 서열의 농도를 측정하도록 구성된 모듈이, 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 모듈, 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 모듈, 디지털 폴리머라제 연쇄 반응 모듈, 다중 폴리머라제 연쇄 반응 모듈 및 다중 디지털 폴리머라제 연쇄 반응으로부터 선택된, 비-등온 정량적 핵산 증폭 모듈인, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 결정하도록 구성된 시스템.
- 제12항에 있어서, 상기 측정의 파라미터가 증폭될 서열의 길이를 포함하는, 비-단편화된 핵산에서 검출된 서열의 농도를 결정하도록 구성된 시스템.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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