KR20220095140A - 옥트레오타이드 생분해성 미립구의 최적화된 용출시험법을 이용한 ivivc 및 그의 분석 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 폴리에틸렌 글리콜 8000, 폴록사머 188, 및 트윈 80으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 계면활성제 및 소듐 아자이드를 포함하는 pH 7.4±0.1인 인산염 완충액을 용출 시험액으로 이용하는, 옥트레오타이드를 함유하는 생분해성 미립구의 in vitro 약물 방출과 in vivo 약동학의 상관관계 향상을 위한 용출시험법을 제공한다. 본 발명의 용출시험법은 옥트레오타이드를 함유하는 생분해성 미립구의 in vitro 약물 방출과 in vivo 약동학의 상관관계가 A 등급의 IVIVC를 나타내어 in vitro 용출 시험이 in vivo 시간-혈중농도 분석 시험을 대체할 수 있다.

Description

옥트레오타이드 생분해성 미립구의 최적화된 용출시험법을 이용한 IVIVC 및 그의 분석 방법{IVIVC using optimal dissolution test of octreotide biodegradable microspheres and analysis method thereof}

본 발명은 펩타이드 의약인 옥트레오타이드를 함유하는 생분해성 미립구의 in vitro 용출과 상용화된 서방형 옥트레오타이드의 in vivo 약동학의 상관 관계를 향상시키는 최적화된 용출시험법에 관한 것이다.

1997년 U.S. FDA는 서방형 경구제형에 대한 권고에서 in vitro-in vivo correlation (IVIVC)를 '투약된 제제의 생체 외 특성 그리고 그와 관련된 생체 내 반응의 상관성을 묘사하는 수학적 예측 모델'로 정의하였다. 이러한 IVIVC 분석은 의약품의 설계, 의약품의 개발 단계에서 최적 공정의 설계 및 개발 프로세스 중 생산 프로세스의 변경의 설계 등의 결정에 있어서 중요한 역할을 한다. 또한, 생산되는 의약품의 품질 보증과 관련된 in vitro 용출이 갖추어야 할 사항들을 결정하는데 도움을 준다.

경구투여되는 서방형 제형의 의약품들과는 달리 주사 특히, 근육이나 피하로 투여되어 수 주일에서 수 개월의 약물 방출이 이루어지는 의약품들이 개발되어 왔다. 이러한 서방형 의약품들은 소화 효소나 체내 기타 효소들에 의해 분해되는 문제 등을 가진 펩타이드 의약품들을 대상으로 개발되었고, 8개의 아미노산이 원형 (cyclic) 펩타이드를 이루는 옥트레오타이드 (octreotide)를 대상으로 하는 서방형 의약품이 개발되어 시판되고 있다. 옥트레오타이드 또는 그의 염 화합물인 초산 옥트레오타이드는 뇌하수체에서 과다 분비되는 성장호르몬으로 인한 말단비대증을 비롯하여 성장호르몬에 의해 증식되는 내분비성종양의 치료에도 사용되는데, 옥트레오타이드는 성장호르몬의 분비를 약 70% 정도 감소시키고 종양의 크기도 감소시키는 것으로 알려져 있다. 한편, 옥트레오타이드는 하루 2~3번 피하주사를 해야 하지만 서방형 주사제인 산도스타틴 라르 데포 (Sandostatin LAR Depot)는 옥트레오타이드 함유 매트릭스 고분자인 poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA)가 체내에서 천천히 분해되도록 설계되어 수 주에서 수 개월에 한 번씩 주사투여가 가능하다.

하지만, 상기 서방형 펩타이드 주사제 의약은 조성이 동일한 제형으로 의약을 제조할지라도 제조 과정이 다를 경우 펩타이드 의약을 함유한 생분해성 미립구의 IVIVC가 변동할 가능성이 높다. 동일한 분자량의 PLGA를 사용할지라도 미립구의 제조공정에 변화가 발생하면 펩타이드 의약의 in vitro 용출이 변동하고 이는 필연적으로 in vivo 효력의 차이를 유발한다. 또한, 상기 미립구에 로딩되는 약물의 양이 같거나 유사할지라도, 미립구에 존재하는 공극, 미립자의 입자 크기 및 입자 크기 분포 등의 물리화학적 특성의 차이가 존재하여 약물의 방출과 약효의 차이가 발생할 수 있기 때문에 생분해성 미립구를 이용한 서방형 약제의 안전성과 유효성의 확보를 위해 IVIVC분석은 매우 중요하다.

최근까지 생분해성 미립구에 함유된 약물의 in vitro 용출시험 방법은 USP-4법 (Flow-Through 법), 막투석법 (Membrane Dialysis 법, MD법) 및 샘플-분리법 (Sample-Separate 법, SS법) 등이 이용되었다. 상기 용출시험법 가운데 USP-4법은 시험액의 자동 연속 채취가 가능하고, 다중의 시료 분석을 통해 약물 방출의 프로파일을 상세하게 분석하는 것이 가능하지만, 미립구의 파편으로 인해 용출시험 셀의 필터가 막혀 유속에 변동이 발생하거나 시험액의 신속한 교체가 어려운 단점이 있다. MD법은 다른 방법에 비해 시료와 시험액의 교체가 용이하나, 멤브레인의 외부 시험액과 내부 시험액과의 약물 농도 평형이 늦게 이루어져 초기 약물 방출의 정도를 정확하게 분석하기 어렵다. SS법은 시험 초기 약물의 과다방출을 정확히 측정할 수 있고, 시료를 완전히 침지시킨 조건에서 유지할 수 있으나, 샘플링이 번거롭고 샘플링 과정 중 시료의 소실이 발생할 가능성이 있다. 현재까지 모든 생분해성 미립구에 함유된 의약에 대한 표준시험법은 규정된 바 없으며, 의약품의 특성에 적합한 최적화된 시험방법의 확보는 해당 의약품의 표준화된 설계, 개발, 생산 및 안전성의 확보에 필수불가결하다.

생분해성 미립구 기반 의약품의 in vitro 특성과 in vivo 응답성의 상관성은 일반적으로 전산 프로그램 내 모델을 적용하여 산출한 후 등급을 산정함으로써 판정한다. 상기 in vitro 특성은 약물의 용출 특성을, in vivo 응답성은 혈중 약물 농도 또는 혈액 순환계로 흡수된 약물량을 의미한다. 상기 등급에 있어서 A 등급의 상관성은 in vitro 용출과 in vivo 혈중 약물 농도가 일대일 (point to point)로 매칭되는 경우, B 등급의 상관성은 평균 in vitro 용출 속도와 평균 in vivo 머무름 시간 또는 용출 속도를 비교하기 위해 통계적인 모멘트 분석을 적용하는 경우, C 등급의 상관성은 약물의 50% 용출 속도를 나타내는데 소요된 시간에서 용출 파라미터와 C_max나 AUC와 같은 약동학 파라미터 사이에 하나의 관계성을 설정할 수 있는 경우, 마지막으로 다중 C 등급의 상관성은 다중의 용출 시간들과 하나 혹은 그 이상의 약동학 파라미터들 (C_max나 AUC)의 상관성을 고려하는 경우를 말한다. 이러한 기준은 1997년 Guidance for Industry Extended Release Oral Dosage Forms: Development, Evaluation, and Application of In Vitro/In Vivo Correlations, CATEGORIES OF IN VITRO/IN VIVO CORRELATIONS (FDA)에 따른다.

상기 PLGA와 같은 생분해성 고분자에 함유된 펩타이드 의약품의 IVIVC 분석을 수행함에 있어서 in vivo 응답성과 우수한 상관관계가 도출되기 위해서는 최적의 in vitro 용출시험 조건이 매우 중요하다. In vitro 용출시험 조건은 실제 약물 투여 부위와 그 주변 조직에서 약물이 나타내는 거동을 최대한 근접하게 묘사할 수 있어야 한다.

본 발명은 생분해성 미립구에 함유된 약물에 대한 높은 IVIVC를 도출할 수 있는 in vitro 용출 시험 방법과 조건의 도출을 위한 연구에 노력을 기울인 결과 완성하게 되었다.

따라서 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 옥트레오타이드 함유 생분해성 미립구에 대하여 IVIVC 분석에서 A 등급의 상관성을 나타내는 최적의 in vitro 시험 조건을 도출하는 것이다. 본 발명은 SS법 (Sample-Separate 법, 샘플-분리법)을 이용하여 in vitro 용출 시험분석 결과를, SD 래트를 대상으로 SC 투여하여 in vivo 약동학 시험분석 결과를 확보하여 IVIVC 분석을 실시함으로써 A 등급의 상관성을 나타내는 최적의 in vitro 시험 조건을 도출함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 옥트레오타이드의 생분해성 미립자에 대하여 in vivo 약동학 실험의 생략이 가능한 A 등급의 in vitro-in vivo 상관관계를 얻을 수 있는 IVIVC 분석 조건이 확립되지 않아, 상기 미립자의 피하주사 또는 근육주사 투여 부위에서의 거동 모사에 적합한 샘플-분리 용출시험 모델을 이용하여 IVIVC 분석하고자 하였고, 우수한 IVIVC를 나타내는 in vitro 용출시험의 최적 조건을 확립하여 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 옥트레오타이드 생분해성 미립구의 최적화된 용출시험법을 이용한 IVIVC 및 그의 분석 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예는 폴리에틸렌 글리콜 8000, 폴록사머 188 (Pluronic^® F-68), 및 트윈 80 (Polysorbate® 80)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 계면활성제 및 소듐 아자이드를 포함하는 pH 7.4±0.1인 인산염 완충액을 용출 시험액으로 이용하는, 옥트레오타이드를 함유하는 생분해성 미립구의 in vitro 약물 방출과 in vivo 약동학의 상관관계를 향상시키는 용출시험법을 제공한다.

상기 옥트레오타이드를 함유하는 생분해성 미립구에서 옥트레오타이드의 in vitro 약물 방출은 샘플 및 분리법 (sample and separate method)을 통한 용출 양상을 확인하여 결과를 얻을 수 있다.

본 발명의 용출시험법은 생분해성 미립구로부터 옥트레오타이드의 in vitro 약물 방출과 in vivo 약동학의 상관 관계가 level A를 나타낼 수 있게 한다.

상기 용출시험법에 이용되는 용출 시험액에 포함되는 상기 계면활성제는 용출 시험액 총 중량 대비 0.01 내지 1 중량% 포함될 수 있고, 바람직하게 0.015 내지 0.7 중량% 포함될 수 있으며, 더 바람직하게 0.018 내지 0.025 중량% 포함될 수 있고, 가장 바람직하게 0.02 중량% 포함될 수 있다. 상기 함량 범위를 가질 때, in vitro와 in vivo 간의 상관관계가 높게 나타났고, 특히 in vitro와 in vivo 간의 약동학 파라미터 편차가 적을 수 있다.

상기 용출시험법에 이용되는 용출 시험액에 포함되는 상기 소듐 아자이드는 용출 시험액 총 중량 대비 0.1 내지 1 중량%, 바람직하게 0.3 내지 0.8 중량%, 더 바람직하게 0.4 내지 0.6 중량%, 가장 바람직하게 0.5 중량% 포함될 수 있다.

상기 생분해성 미립구는 락타이드와 글리콜라이드의 중량비가 50:50 내지 65:35인 폴리(D,L-락타이드-코-글리콜라이드)-글루코오스를 생분해성 고분자로 포함할 수 있다. 상기 생분해성 미립구를 형성하는 고분자는 가지형 고분자가 이용되므로 in vitro 약물 용출 및 in vivo 약효에 큰 영향을 미치기 때문에 이들 사이에 상관관계 예측이 매우 어려운데, 본 발명의 약물용출액을 이용하는 경우 in vitro와 in vivo 간의 약동학 파라미터 편차가 적게 관찰된다.

상기 생분해성 미립구는 만니톨을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 용출시험액을 갖는 용출시험법은 상기 생분해성 미립구를 이용했을 때, in vitro와 in vivo 간의 약동학 파라미터 편차가 적게 관찰된다.

경구 서방형 제제에 비해 생분해성 미립자를 이용한 국소 서방형 제제에 대한 IVIVC에 대한 연구는 충분히 이루어지지 않고 있으며 매트릭스 고분자의 분해 특성에 따른 in vitro 및 in vivo 약물 방출의 거동이 상이하고 그에 따라 안전성과 유효성이 좌우될 수 있기 때문에 IVIVC의 규명과 가이드라인의 확립은 매우 중요하다. 이러한 IVIVC의 확립은 관련 제품의 생산 효율을 개선하기 위한 공정 개발의 변경을 가이드할 수 있을 뿐만 아니라 의약품의 품질을 보증하기 위해 필요한 in vitro 용출의 기준을 마련하는데 결정적인 도움을 줄 수 있다.

특히, A 등급의 IVIVC는 in vitro 용출 시험 결과를 통해 in vivo 생체이용률 분석 시험을 대신할 수 있음을 의미하므로 제네릭 의약품 개발에 매우 중요한 의미를 갖는다. 또한, 조성이 같은 한 가지 제형의 품목이 다른 공정을 통해 제조된 경우 IVIVC 분석을 통해 A 등급 여부를 확인함으로써 제조 공정의 적합성 여부를 판정할 수 있다는 측면에서 생분해성 미립구 제제의 생산 공정 개발에 매우 유리하다. 더욱이, 확보한 in vitro 용출 시험 결과를 이용하여 in vivo 시간-혈중 농도 프로파일 등을 예측할 수 있다.

In vitro 약물 용출시험 방법의 in vivo 약물 방출 거동 모사의 근접성에 있어서 USP-4법은 미립구 시료를 충진하여 시험하는 샘플 셀을 사용하고 미립구에 시험액을 통과시키면서 시험함으로써 in vivo에서 주사 부위에 형성된 미립구의 데포 (depot)에 흐르는 체액을 모사한다. 그러나, 수 일부터 수십 일까지 용출시험을 실시하는 동안 샘플 셀에서 미립구들의 뭉침 현상이 발생하거나 미립구의 분해 생성물이 셀의 상부에 설치된 필터를 막아 시험액의 흐름을 방해하여 유속을 변동시키는 현상이 발생한다. In vivo 시험 모델의 주사투여 부위에서 미립구의 데포가 형성되는 것을 감안하면 USP-4법이 적절한 in vitro 용출시험 모델이라고 전제할 수 있다. 그러나, in vivo에서 PLGA 미립구들의 뭉침현상이 발견되기도 하지만 미립구들이 대부분 개별적으로 존재하면서 주사투여 부위에서 같은 조직이나 기관 그리고 다른 조직이나 기관까지 확산되는 경우가 발생한다. 따라서 생분해성 미립구의 회합과 분산을 함께 모사할 수 있는 in vitro 용출 시험법의 개발이 필요하다. USP-4 법을 이용한 용출시헙법의 경우, 용출시험 기간 동안 PLGA의 분해물이 샘플 셀로부터 빠져나오는 것을 in vivo에서 미분해 또는 분해된 미립구가 주사투여부위 밖으로 이동하는 것을 모사하는 것으로 가정할 수 있으나, 실제로 USP-4 법에 적용되는 샘플 셀은 수십 ~ 수백 마이크로미터 크기의 미립구가 빠져나갈 수 있는 샘플 셀이 아니므로 in vivo에서 미립구들이 조직 내 또는 조직 사이를 이동하는 것에 관한 모사라고 가정하기는 어렵다.

SS법은 플라스크나 바이알 등에 생분해성 미립구에 함유된 의약품 시료를 담고 시험액을 가한 후, 주로 회전식 교반기를 이용해 일정 시간 동안 시료를 교반시키고 일정 시간 간격으로 시험액의 상등액 또는 일정량의 시료를 취하여 상등액에 존재하는 약물의 양 또는 미립구 내에 존재하는 약물의 양을 분석한다. USP-4 시험법이 시료 셀에서 간헐적으로 미립구의 응집이 발생하는 것에 SS법은 시 기간 동안 미분해 미립구와 분해물들의 회합이 발생하지만 응괴 등을 형성하는 응집현상은 발생하지 않는다. 투명 플라스크나 바이알을 사용하여 미립구의 형태 관찰이 가능하며 시료의 소실이 발생하지 않는다. USP-4법과는 달리 미립구가 완전 침지된 상태에서 용출시험을 실시하므로 in vivo 환경을 더 근접 모사하는 시험 조건으로 간주될 수 있다.

본 발명은 약물의 in vivo 용출에 대한 모사의 정확성을 높이기 위해, in vivo에서 피하 또는 근육 주사 부위에 형성된 데포에 체액 흐름을 모사하는 USP-4법 대신 in vivo에서 미립구의 회합과 분산을 모두 모사할 수 있고 미립구를 용출 시험기간 동안 지속적으로 침지상태로 유지하는 등 in vivo 조건을 더 잘 모사할 수 있는 SS법을 적용하였다. SS법은 시료 셀의 필터가 막히거나 유속이 일정하지 않은 USP-4법이 갖는 문제가 없고, 초기 약물의 과다 (burst) 방출을 정확히 측정할 수 있는 장점이 있다.

본 발명에서 생분해성 미립구 시료의 약물 in vitro 용출 시험에 이용되는 시험법은 SS법이고, 용출시험액은 생분해성 미립구가 투여되는 생체 내 조직이나 계 (system)을 모사할 수 있는 시험액이라면 제한을 받지 않는다. 본 발명은 생분해성 미립구의 국소 주사투여 즉, 피하 투여 또는 근육 투여를 가정하였고, 따라서 pH가 7.4 (±0.1) 인 인산염완충액이 용출시험액을 선정하는 것이 바람직하다.

상기 용출시험의 시험용기는 덮개가 있는 플라스크나 바이알이 바람직하고, 생분해성 미립구의 시간에 따른 분해정도를 육안으로 파악할 수 있도록 투명한 재질의 것이 더욱 바람직하다. 일정 시간이 경과한 후의 시료의 채취는 피펫 등을 이용하여 실시할 수 있으며 미립구나 분해산물 그리고 방출된 약물이 흡착되지 않도록 플라스틱 재질의 피펫을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 플라스크나 바이알에 있는 시험액의 상등액을 취하고 원심분리 한 후, LC-MS 등의 정량분석용 시료를 채취한 후 플라스크나 바이알의 여액은 버린다. 이 때 플라스크나 바이알에 남아 있는 침전물 등은 새로운 시험액을 가해 잘 현탁시킨 후 본래의 시료가 담겨있던 플라스크나 바이알에 가하는 것이 용출된 약물의 정확한 농도 측정과 시료 손실의 방지를 위해 바람직하다.

상기 SS법에서 교반기의 교반 속도는 분당 50 ~ 200 회전수가 바람직하며, 보다 바람직하게는 분당 100 ~ 150 회전수이다. 분당 회전수가 50 회전수 미만이면 생분해성 미립구가 교반에 의해서 유동성이 거의 발생하지 않고 분당 회전수가 200 이상이면 교반에 의해 유동성이 지나치게 발생하여 침전된 상태의 미립구가 거의 없고 시험액 내에 부유하며 단지 수 일이 경과하고도 그 형태가 붕괴된 미립구들이 발생하여 생체 내 환경을 모사하는 것으로 간주하기 어렵다.

상기 SS법에서 용출 시험 온도는 생분해성 미립구의 피하 또는 근육 주사 투여를 고려하여 36.5 ~ 37.0 °C의 범위에서 설정하고 항온조건으로 시험하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용한 모델 약물은 옥트레오타이드의 제품화된 생분해성 미립구 제제인 산도스타틴 라르® 데포 (SANDOSTATIN LAR® Depot)이고, 초산 옥트레오타이드(octreotide acetate)를 유효성분으로 포함한다. 상기 초산 옥트레오타이드 외에, PLGA-Glu (Poly(DL-lactide-co-glycolide)-Glucose) 및 만니톨을 성분을 더 포함한다. 상기 만니톨은 미립구의 안정적인 생성을 도와줄 수 있다. SANDOSTATIN LAR®은 옥트레오타이드(octreotide) 아세테이트 활성 펩티드를 포함하는 시판되는 비경구적 디포 제형이다. 10, 20 및 30 mg의 승인된 투여량으로, Sandostatin LAR®이 한달에 한번 intragluteal injection이 허용된다. Sandostatin LAR®의 주사후 옥트레오타이드의 약물동력학적 프로파일은 폴리머 매트릭스로부터 방출 프로파일과 이것의 생분해성을 반영한다. 사람에게 단일 I.M. 주입 후에, 옥트레오타이드 농도는 투여 후 1시간 내에 일시적인 초기 피크에 도달하고, 이어서 점차적으로 24시간 내에 검출할 수 없는 낮은 레벨로 감소한다. 1일에 초기 방출 후, 옥트레오타이드는 이어지는 7일 동안 대부분의 환자에서 하위 치료 수준(sub-therapeutic levels)으로 남는다. 이후에, 옥트레오타이드 농도는 다시 증가하고, 14일쯤(약 2-3주 후)에는 후속 3 내지 4주 동안 유지되는 안정적인 레벨(plateau levels)에 도달하고, 이어서 6주의 감소기가 이어진다(Sandostatin LAR® 10 mg, 20 mg 또는 30 mg 분말 및 근육내 주사를 위한 현탁 용매에 대한 상품 특성의 요약, 2013).

상기 SS법에서 용출 시험액에 사용 가능한 계면활성제는 생분해성 미립구의 응집 억제, PLGA와 시험액 또는 체액과의 계면장력 감소, 약물의 용해 및 PLGA의 분해 등에 영향을 미치는 계면활성제로서 비이온성 계면활성제가 바람직하며, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜 8000, 폴록사머 188(Pluronic^® F-68), 및 트윈 80 (Polysorbate® 80)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 이 때 계면활성제의 농도는 0.01 내지 1중량% (w/w)의 범위가 바람직하며, 바람직하게 0.01 내지 1 중량% 포함될 수 있고, 바람직하게 0.015 내지 0.7 중량% 포함될 수 있으며, 더 바람직하게 0.018 내지 0.025 중량% 포함될 수 있고, 가장 바람직하게 0.02 중량% 포함될 수 있다. 0.01중량% 미만의 농도는 계면활성이 거의 없고 1 중량% 초과의 농도는 시험액 내 기포가 다량 발생하여 시험에 바람직하지 않아 두 경우 모두 생체 내 환경을 모사하는 것으로 간주하기 어렵다.

본 발명은 상기 용출 시험액에 소듐 아자이드를 더 포함할 수 있다. 상기 소듐 아자이드를 추가하여 본 발명의 생분해성 미립구의 분해 및/또는 약물 방출 거동의 변화를 방지할 수 있다. 하나의 측면에서 장기간의 in vitro 약물 방출 동안 용출 시험액 내 미생물 번식을 억제함으로써 미생물에 의한 생분해성 고분자의 분해 거동의 변동과 그에 수반되는 약물 방출 거동의 변동을 억제하는 목적을 달성할 수 있다. 소듐 아자이드를 첨가하여, in vitro 약물 방출 시험의 재현성이 증진될 수 있고, IVIVC에서 level A 달성에 유리할 수 있다. 소듐 아자이드를 0.1 내지 1 중량% 포함할 수 있으며, 바람직하게 0.3 내지 0.8 중량%, 더 바람직하게 0.4 내지 0.6 중량% 포함할 수 있다. 소듐 아자이드를 적량 첨가하지 않는 경우 미생물 번식으로 생분해성 미립구가 분해되는 문제가 발생될 수 있고, 과량 첨가되는 경우 약물 특히, 1차 아민을 가진 약물과 특정 조건에서 반응하여 약물 분석을 간섭하는 문제가 발생할 수 있다.

상기 용출시험액 시료 LC-MS/MS 분석에 컬럼은 역상 컬럼이 바람직하고, 컬럼 온도는 35 - 40 ^oC 가 바람직하다. 상기 분석의 이동상은 0.1% 포름산/물 용액과 0.1% 포름산/아세토니트릴 용액의 시간에 따는 농도구배 조건이 바람직하다.

본 발명에서 옥트레오타이드 생분해성 미립구의 in vivo 약동학 시험에 사용하는 실험동물은 여러 종류를 사용하는 것이 가능하지만, 약물의 투여량, 투여 부위와 경로 및 혈액 시료 채취 용이성 등을 종합하여 랫드가 바람직하다.

상기 약동학 시험에서 약동학 파라미터를 산출하기 위해 초산 옥트레오타이드를 투여하는 정맥 투여군과 피하조직으로 옥트레오타이드 생분해성 미립구를 국소 투여하는 피하 투여군을 함께 시험하여 약동학 파라미터를 구하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 옥트레오타이드 함유 생분해성 미립구의 IVIVC 분석에서 옥트레오타이드 함유 생분해성 미립구의 in vitro 용출과 in vivo 약동학의 상관관계는 IVIVC를 도출할 수 있는 전문적인 프로그램을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 IVIVC 분석에서 in vitro 용출에 관한 모델은 가수분해와 자가촉매 (autocatalyst) 작용의 특성을 나타내는 PLGA에 적합하도록 침식성 매트릭스를 위한 모델의 적용이 바람직하다.

본 발명에서 IVIVC 상관성의 정도를 평가하기 위해 상기 in vitro 용출 시험 데이터와 상기 in vivo 약동학 시험의 혈중-약물 농도 프로파일과의 상관성은 체내 약물 용출 (D_iss)과 체내 흡수 분율 (F_abs)을 분석하여 산출하는 것이 바람직하다.

상기 산출한 F_abs와 상기 in vitro 용출 시험의 결과를 통해 구한 F_diss (체외 용출 분율)과 상관 관계를 구하여 IVIVC의 등급을 판정하기 위해 Levy plot를 작성한 후 상관계수 값 등을 구하여 그 값에 따라 A, B, C 및 다중 C 등급으로 IVIV의 상관성을 결정하는 것이 바람직하다. 이 때 A 등급의 상관관계는 F_diss와 F_abs가 포인트 투 포인트 매칭을 이루는 관계, B 등급의 상관관계는 in vitro 평균 용해 속도와 평균 in vivo 머무름 시간 또는 용해 속도를 비교하기 위해 통계적인 모멘텀 분석이 필요한 관계, C 등급의 상관관계는 50% 용해 속도에 소요된 시간과 같은 용해 파라미터와 C_max나 AUC와 같은 약동학 파라미터 사이에 특정 지점에서의 상관관계를 설정하는 단계 그리고 다중 C 등급의 다중의 용해 시간 포인트들을 하나 혹은 그 이상의 약동학 파라미터들 (C_max나 AUC)의 상관관계이다.

한편, PLGA-glucose를 매트릭스로 하는 생분해성 미립구로부터의 약물의 in vitro 용출은 초기에 미립구 표면의 약물의 확산, 지연기 (lag phase)에 에스터 결합의 분해로 인한 산 (acid) 부산물 생성, 대량 부식 (bulk erosion) 발생 및 다공성 증가 등의 현상이 발생한 후, 최종기에 확산 또는 부식 또는 두 현상의 조합과 같은 패턴과 기전에 의해 발생한다. 따라서, 상기 미립구로부터 약물의 in vitro 용출은 PLGA-glucose의 분해 및 분해물 등의 물리화학적 거동에 좌우될 수 있기 때문에 시험액의 pH 및 계면활성제의 양 등은 in vitro 약물 용출뿐만 아니라 in vivo 환경 모사를 위해 매우 중요하다. 특히, 약물이 함유된 생분해성 미립구가 국소 투여되는 부위의 체액의 pH, 국소 부위에서 생성되는 PLGA-glucose의 분해산물로 인한 국소 부위 pH 저하, PLGA-glucose의 자발촉매 (autocatalysis) 등을 충분히 고려한 시험용액 조건 설정은 생채 내 환경 모사 및 IVIVC 분석에 매우 중요하다.

본 발명은 in vitro 용출 시험이 in vivo 시간-혈중농도 분석 시험을 대체할 수 있는 새로운 용출시험법을 제공한다. 이를 통해 신약 및 제네릭 의약 개발에 소요되는 기간과 비용을 감소시키는 효과가 있다.

본 발명은 옥트레오타이드 생분해성 미립구의 최적화된 용출시험법을 이용한 IVIVC 및 그의 분석 방법에 관한 것으로서, 상기 생분해성 미립구의 체내 투여 환경을 모사하는 in vitro 용출 시험조건에서의 시험은 IVIVC가 높은 시험법을 제공할 수 있다.

본 명세서에 첨부되는 다음의 도면들은 본 발명의 바람직한 실시예를 예시하는 것이며, 전술한 발명의 내용과 함께 본 발명의 기술사상을 더욱 이해시키는 역할을 하는 것이므로, 본 발명은 그러한 도면에 기재된 사항에만 한정되어 해석되어서는 아니 된다.
도 1은 PBS (인산염완충액, pH 7.4)을 용리액으로 사용한 LC-MS/MS 분석을 통해 구하고 정량 한계가 1.49 ng/mL인 옥트레오타이드의 검량선이다.
도 2는 용출시험액 pH와 계면활성제 양을 변화시킨 다양한 용출시험액에서 생분해성 미립구로부터 옥트레오타이드의 시간에 따른 누적 in vitro 용출량을 나타낸 것이다.
도 3은 옥트레오타이드 기준 1 mg/kg의 용량으로 초산 옥트레오타이드를 정맥주사 투여한 SD 수컷 랫드의 시간에 따른 혈중 약물농도 프로파일을 나타낸 것이다.
도 4는 옥트레오타이드 기준 15 mg/kg의 용량으로 옥트레오타이드 함유 생분해성 미립구를 피하 투여한 SD 수컷 랫드의 시간에 따른 혈중 약물농도 프로파일을 나타낸 것이다.
도 5a 및 5b는 In vitro 용출 시험액 조건에 따른 생분해성 미립구의 옥트레오타이드 in vitro 용출 (F_diss) 분율과 in vivo 흡수 분율 (F_abs)의 관계를 나타낸 것으로, 도 5a의 (가), (나) 및 도 5b의 (다), (라)의 용출 시험액은 실시예 5에 제시한 것과 같고, 모든 시험 조건에서 미립구의 IVIV 상관성은 A 등급이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 본 발명이 속한 분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1> 옥트레오타이드 함유 생분해성 미립구의 In vitro 용출 시험

초산 옥트레오타이드 5.6 mg (옥트레오타이드로서 5.0 mg), Poly(DL-lactide-co-glycolide)-Glucose 94.0 mg 및 만니톨 20.4 mg을 갖는 총 질량 120 mg의 생분해성 미립구 (산도스타틴 라르 ®)를 회전식 덮개가 달린 바이알에 넣은 후, 용출시험액 10 mL을 가하였다. 이 때 용출시험액은 20 mM 인산염 완충액 (pH 7.4)에 3 mM KCl, 140 mM NaCl, 0.02% Tween 80 및 0.5% sodium azide를 가한 액으로서 NaOH 또는 인산으로 완충액의 pH를 7.4로 맞추어 제조한 후 필터로 멸균하여 준비하였다. 이 때, 용출 시험액은 pH가 각각 7.5와 5.5인 것과 Tween 80의 양이 각각 0.02%와 0.5%인 것을 준비하여 사용하였다.

시료와 용출시험액이 담긴 바이알을 37 °C의 항온에서 오비탈 교반기 (분당 회전수 100 ~120회, Shaking Incubator, BIONEX, 대한민국)에서 인큐베이션하였다. 정해진 시간에 교반기로부터 시료 바이알을 꺼내 상온에서 10분간 정치하였다. 시료 바이알로부터 9 mL의 상층액을 유리 피펫으로 특별한 주의를 기울이면서 원심분리 튜브로 옮겼다. 튜브에 담긴 상층액을 항온 원심분리기 (LABOGENE 1580R, ㈜ 자이로젠, 대한민국)를 이용하여 분리하고 일정량의 상층액 시료를 LC 바이알로 옮겼다. LC-MS/MS 분석용 시료를 취하고 남은 상층액을 조심스럽게 따라내어 버리면서 튜브 바닥에 입자가 버려지지 않도록 주의하였다. 튜브에 9 mL의 새 용출액을 가하고 입자들을 잘 현탁시켰다. 입자의 현탁액을 본래의 in vitro 용출 시험용 바이알로 옮기고 준비된 바이알은 항온 오비탈 교반기로 원위치시켰다. 시료당 용출시험 바이알은 두 개 이상으로 하였다.

<실시예 2> In vitro 용출 옥트레오타이드 시료의 LC-MS/MS 분석

실시예 1에서 준비한, 생분해성 미립구 (산도스타틴 라르 ®)의 in vitro 용출시험액에서 추출한 시료 200 μL에 내부 표준물질 (Disopyramide, 5 ng/mL) 20 μL를 첨가하여 LC-MS/MS 시스템 (Mass Spectrometry (Agilent 6460) with HPLC (Agilent 1200))을 이용하여 분석하였다. 이 때, 검량선의 범위는 0.5 - 8,000 ng/mL의 범위로 제조하였다. 도 1에 작성한 검량선을 나타내었다. 용출 시험에 사용한 각각의 용매에 working solution을 spiking한 후, 내부 표준물질 (Disopyramide, 5 ng/mL)을 첨가하여 LC-MS/MS 분석하여 표준을 제조하였다. 시료 분석에 사용하는 컬럼은 역상 C₁₈ 컬럼 (Atlantis^® T₃ 3 μm, Waters, MA, 미국), 컬럼 온도는 35 ^oC, 이동상은 A상과 B상이 각각 0.1% formic acid in water 용액 (5 - 95%) 과 0.1% formic acid in acetonitrile 용액이었다. 유속은 0.3 mL/min이고 시료주입량은 10 μL이었다. 분석된 옥테레오타이드의 양으로부터 옥트레오타이드의 용출율을 구했다. 옥트레오타이드의 100% 용출율은 생분해성 미립구 시료 120 mg 내에 함유된 5 mg의 옥트레오타이드가 방출시험액 20 mL로 모두 방출되는 농도인 '250 ug 옥트레오타이드 / mL 용출시험액'으로 설정하였다. 실시예 1의 용출 시험 시료들을 분석한 결과를 도 2에 나타내었다.

<실시예 3> 옥트레오타이드 생분해성 미립구의 in vivo 약동학 시험

랫드를 이용한 약동학 시험은 약 7 주령 SD 수컷 랫드를 이용하여 실험하였다. 정맥 투여군은 대퇴정맥에 튜브를 삽입한 후 튜브를 통해 1.0 mg/kg의 투여 용량으로 초산 옥트레오타이드를 투여하고, 피하 투여군은 주사기를 이용하여 진피아래 피하조직으로 15 mg/kg의 투여 용량으로 옥트레오타이드 함유 PLGA 생분해성 미립구 (산도스타틴 라르 ®)를 직접 투여하였다. 정맥 투여군은 튜브가 삽입된 대퇴정맥으로부터 정해진 시간에 채혈하고, 피하 투여군은 경동맥으로부터 주사기를 이용하여 정해진 시간에 채혈하였다.

<실시예 4> 옥트레오타이드 생분해성 미립구의 in vivo 약동학 분석

실시예 3에서 채혈한 시료는 원심분리하여 혈장을 분리하고 적정 유기용매를 사용하여 혈장 시료를 전 처리한 후 LC-MS/MS (Mass sepctrometry (4000 Qtrap) with HPLC (Agilent 1200))로 농도를 분석하였다. 이 때 SD 랫드의 혈액에서 원심분리한 혈장을 OASIS HLB μElution plate (Cat# 186001828BA, Waters, 미국)를 이용하여 고상추출 (Solid Phase Extraction)법으로 전처리하고 메탄올로 용리시킨 시료를 LC-MS/MS로 분석한 후, WinNonlin (Pharsight, USA) 프로그램을 이용하여 LC-MS/MS 분석을 통해 구한 옥트레오타이드의 혈중 농도-시간 데이터를 구하였다. 상기 분석의 결과로서 옥트레오타이드를 기준으로 1 mg/kg의 용량으로 수컷 SD 랫드에 정맥 주사 투여한 후, 시간에 따른 혈중 옥트레오타이드 농도 프로파일을 구한 결과를 도 3에 나타내었다. 또한, 수컷 SD 랫드에 옥트레오타이드를 기준으로 15 mg/kg의 용량으로 산도스타틴 라르®를 피하 투여한 후, 시간 경과에 따른 혈중 약물 농도 프로파일을 도 4에 나타내었다. 상기한 정맥 주사 투여 시험군과 피하투여 시험군의 데이터를 이용하여 각각의 비구획 약동학 파라미터 (non-compartmental pharmacokinetic parameter)를 산출하였고 그 결과를 표 1과 표 2에 나타내었다.

수컷 SD 랫드에 정맥 주사 (I.V.) 투여한 옥트레오타이드의 약동학 파라미터는 하기 표 1에 나타냈다.

수컷 SD 랫드에 피하 주사 (S.C.) 투여한 옥트레오타이드 함유 생분해성 미립구의 약동학 파라미터는 하기 표 2에 나타냈다.

<실시예 5> 옥트레오타이드 함유 생분해성 미립구의 IVIVC 분석

실시예 3 및 4에서 얻은 데이터로서 옥트레오타이드 함유 생분해성 미립구 (산도스타틴 라르®)의 in vitro 약물 방출과 in vivo 약동학의 상관관계는 Phoenix 64 WinNonlin with IVIVC tool kit (Certara USA, Inc., Princeton, NJ, USA) 프로그램을 이용하여 산출한다. 이 때 in vitro 용출 모델은 하기 식 (1)과 같이 침식성 매트릭스 제형에 적용 가능한 Weibull 모델을 적용한다.

상기 식 (1)에서, M은 일정 시간에 용출된 약의 양, M_o 는 용출된 약의 총량, T 는 지연 시간, a 는 시간 의존성을 나타내는 조정 파라미터이고 b는 용출 곡선의 형태이다.

식 (1)을 통해 Weibull모델의 적합성을 확인한 상기 실시예 3의 용출 데이터와 in vivo 약동학 시험의 혈중-약물 농도 프로파일과의 상관성을 하기 식 (2)와 같은 모델을 적용하여 분석한다.

상기 식 (2)에서 F_abs는 체내 흡수 분율, T_vivo는 체내 흡수 시간, D_iss는 체내 약물 용출, Abs_Scale 는 체내 흡수 조정 인자, 그리고 T_scale는 시간 조정 인자이다.

상기 실시예 2에서 각각의 용출 시험 조건에서 실시한 용출 시험의 결과를 상기 식 (1)을 이용하여 구한 F_diss (체외 용출 분율)과 상기 실시예 4의 실험결과를 상기 식 (2)를 이용하여 구한 F_abs (체내 흡수 분율)와의 상관 관계 (Levy plot)를 작성한 후, 구한 검량선의 기울기로부터 F_diss와 F_abs의 상관계수 (R²)값 등을 구하여 IVIVC의 등급을 정한다. 이 때 A 등급의 상관관계는 F_diss와 F_abs가 포인트 투 포인트 매칭을 이루는 관계를 의미한다. B 등급의 상관관계는 in vitro 평균 용해 속도와 평균 in vivo 머무름 시간 또는 용해 속도를 비교하기 위해 통계적인 모멘텀 분석이 필요한 관계를 의미한다. C 등급의 상관관계는 50% 용해 속도에 소요된 시간과 같은 용해 파라미터와 C_max나 AUC와 같은 약동학 파라미터 사이에 특정 지점에서의 상관관계를 설정하는 단계 그리고 다중 C 등급은 다중의 용해 시간 포인트들과 하나 혹은 그 이상의 약동학 파라미터들 (C_max나 AUC)의 상관관계이다.

도 5는 상기 실시예 2의 in vitro 용출 시험에서 pH를 7.4와 5.5로 변화시키고 Tween-80의 함량을 0.02%와 0.5%로 변화시켜 제조한 용출시험액에서 생분해성 미립구로부터의 옥트레오타이드의 용출 즉, 시료 코드가 55002, 5505, 74002 및 7405인 용출시험액에서 생분해성 미립구로부터의 방출되는 옥트레오타이드의 용출의 시간별 분율 (F_diss)과 in vivo 흡수 분율 (F_abs)의 상관 관계를 나타낸 것으로 네 가지 시료 모두 높은 상관계수 값을 나타내어 A 등급의 IVIVC 상관관계를 나타내었다. 상기한 시료별로는 74002시료 즉, 시험액의 pH가 7.4이고 계면활성제의 함량이 0.02%로 0.5%에 비해 상대적으로 낮은 것이 상관성이 가장 높았다.

도 5의 시료 코드는 다음 표 3을 참고할 수 있다.

시료 코드	pH	계면활성제 (트윈 80)
55002	5.5	0.02%
5505	5.5	0.5%
74002	7.4	0.02%
7405	7.4	0.5%

< 실시예 6> 옥트레오타이드 함유 생분해성 미립구의 약동학 파라미터 예측

In Vitro 용출 데이터 및 In Vivo 흡수 데이터에 대한 IVIVC 모델은 Phoenix 64 WinNonlin with IVIVC toolkit 프로그램을 사용하여 검증되었다. 간단히 말해서, 용출 및 흡수가 일치하는 분획에 대한 용출 시간과 흡수 시간에 대한 Levy T_vivo 대 T_vitro 플롯을 사용하여 구하였다. In Vitro 용출 프로파일을 식 (2)의 상관관계 모델에 대한 입력값으로 사용하여 흡수 데이터에 fitting하였다. 상관관계의 검증을 위해 모델을 기반으로 AUC_last를 예측하고, 실제 In Vivo 데이터 값과 비교하여 약동학 파라미터의 예측 오류 (%PE)를 구하였다. AUC_last의 추정과 비교를 위해 예측된 약동학 데이터와 관찰된 In Vivo 데이터에 대한 비구획 분석 (noncompartmental analysis)은 예측된 흡수 분율과 단위 임펄스 응답의 convolution을 통해 실행되었다. 하기 표 4는 식 (2)의 IVIVC모델에 시료코드 55002, 5505, 74002 및 7405의 용출시험 조건에서 얻은 In Vitro 데이터를 적용하여 예측한 AUC_last 값이며, 실측하여 구한 AUC_last 값과의 차이를 비교하여 나타낸 것이다. 약동학 파라미터의 예측이 양호한 것으로 평가되는 ±10~15% 범위의 %PE를 고려할 때, 다른 용출시험액에 비해 시료코드 5502의 용출시험액의 In Vivo 약동학 파라미터 예측 정확도가 높은 것으로 확인되었다.

약동학 파라미터	시료코드	예측값	타겟값	예측오차(%)
AUClast (μg·h/mL)	55002	311.8	347.8	-10.3
	5505	315.1	347.8	-9.4
	74002	372.5	347.8	7.1
	7405	268.8	347.8	-22.2

Claims (8)

1. 폴리에틸렌 글리콜 8000, 폴록사머 188, 및 트윈 80으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 계면활성제 및 소듐 아자이드를 포함하는 pH 7.4±0.1인 인산염 완충액을 용출 시험액으로 이용하는,
   옥트레오타이드를 함유하는 생분해성 미립구의 in vitro 약물 방출과 in vivo 약동학의 상관관계 향상을 위한 용출시험법.
2. 제1항에 있어서, 상기 옥트레오타이드를 함유하는 생분해성 미립구에서 옥트레오타이드의 in vitro 약물 방출은 샘플 및 분리법 (sample and separate method)을 통한 용출 양상을 확인한 것으로, 교반 속도는 분당 50 내지 200 회전수인 것을 특징으로 하는 용출시험법.
3. 제1항에 있어서, 생분해성 미립구로부터 옥트레오타이드의 in vitro 약물 방출과 in vivo 약동학의 상관 관계가 FDA의 IVIVC 기준 level A를 나타내는 것을 특징으로 하는 용출시험법.
4. 제1항에 있어서, 상기 계면활성제는 용출 시험액 총 중량 대비 0.015-0.7 중량% 포함되는 것을 특징으로 하는 용출시험법.
5. 제4항에 있어서, 상기 계면활성제는 트윈 80으로, 용출 시험액 총 중량 대비 0.018 내지 0.025 중량% 포함되는 것을 특징으로 하는 용출시험법.
6. 제1항에 있어서, 상기 소듐 아자이드는 용출 시험액 총 중량 대비 0.1 내지 1 중량% 포함되는 것을 특징으로 하는 용출시험법.
7. 제1항에 있어서, 생분해성 미립구는 락타이드와 글리콜라이드의 중량비가 50:50 내지 65:35인 폴리(D,L-락타이드-코-글리콜라이드)-글루코오스를 생분해성 고분자로 포함하는, 용출시험법.
8. 제7항에 있어서, 생분해성 미립구는 만니톨을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 용출시험법.

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