KR20220095077A - 항염 및 항산화 효과가 우수한 건강기능 식품 조성물 및 이를 포함하는 건강기능 식품 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 홍삼 농축액, 흑마늘 농축액 및 석류 농축액을 적정 비율로 혼합하여, 쓴맛의 강도가 낮아 기호도가 우수하면서도, 항염 및 항산화 효과가 우수한 건강기능 식품 조성물 및 이를 포함하는 건강기능 식품에 관한 것이다.
Description
본 발명은 항염 및 항산화 효과가 우수한 건강기능 식품 조성물 및 이를 포함하는 건강기능 식품에 관한 것이다.
인삼 유래의 건강기능식품은 현대 소비자의 면역 등 건강에 대한 관심 증가로 인해 가공인삼의 유효 성분 및 기능성이 평가된 간식 제품류, 추출액, 농축액 및 음료 등의 다양한 제형으로의 개발이 활발히 이루어지고 있다.
한편, 최근 건강기능식품으로서 인삼 외에도 흑마늘, 흑삼, 석류 등 다양한 원료의 수요 또한 늘면서, 가공 인삼과 다른 원료를 접목한 새로운 제품 개발이 요구되고 있다.
한편, 대한민국 공개특허 특2003-0037380 호에서는 홍삼 농축액을 이용한 건강보조식품에 대해 개시하고 있으나, 홍삼 농축액만을 포함하는 경우 쓴맛이 강해 기호도가 낮아지는 문제점이 있었다.
본 발명은 홍삼 농축액, 흑마늘 농축액 및 석류 농축액을 포함하여 쓴맛 강도가 낮아 기호도가 우수하면서도, 세포독성이 낮고, 우수한 항염 및 항산화 효과를 모두 발현하는, 항염 및 항산화 효과가 우수한 건강기능 식품 조성물 및 이를 포함하는 건강기능 식품을 제공하고자 한다.
상기한 과제를 해결하기 위한 본 발명의 항염 및 항산화 효과가 우수한 건강기능 식품 조성물은 상기 홍삼 농축액, 흑마늘 농축액 및 석류 농축액을 1 : 1 ~ 20 : 1 ~ 20 중량비로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어, 상기 건강기능 식품 조성물은 상기 홍삼 농축액을 5 ~ 150㎍/㎖로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어, 상기 홍삼 농축액, 흑마늘 농축액 및 석류 농축액을 1 : 5 ~ 15 : 5 ~ 15 중량비로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 목적으로, 상기 건강기능 식품 조성물을 포함하는 건강기능 식품을 제조할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어, 상기 건강기능 상기 건강기능 식품 조성물을 1,000㎍/㎖ 농도로 포함할 때, 하기 수학식 1에 의거하여 측정한 NO(nitrite) 제거율이 60.0% 이상일 수 있다.
[수학식 1]
NO 제거율(%)={1-(건강기능 식품 처리된 염증 유발 세포 내 NO 농도/염증 유발된 세포 내 NO 농도)}×100%
수학식 1에서 염증 유발된 세포 내 NO 농도는 RAW264.7 세포를 100ng/㎖의 유도 염증성 세포(LPS)로 처리한 후 24 시간 경과한 후 측정한 RAW264.7 세포 내 NO 농도(μM)이며, 건강기능 식품 처리된 염증 유발된 세포 내 NO 농도는 유도 염증성 세포(LPS)로 처리한 후 24 시간 경과된 RAW264.7 세포를 200μg/㎖ 농도의 건강기능 식품으로 처리한 다음 24시간 경과한 후에 측정한 세포 내 NO 농도(μM)이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어, 상기 건강기능 식품은 상기 건강기능 식품 조성물을 1,000㎍/㎖의 농도로 포함할 때, 하기 수학식 2에 의거하여 측정한 ROS(활성산소종) 제거율이 40.0% 이상일 수 있다.
[수학식 2]
ROS 제거율(%)= 100% - (건강기능 식품 처리된 염증 유발된 세포 내 ROS 농도/염증 유발된 세포 내 ROS 농도)×100%
수학식 2에서 염증 유발된 세포 내 ROS 농도는 RAW264.7 세포를 100ng/㎖의 유도 염증성 세포(LPS)로 처리한 후 24시간 경과한 후 측정한 RAW264.7 세포 내 LPS에 대한 ROS 농도(%)이며, 건강기능 식품 처리된 염증 유발된 세포 내 LPS의 ROS 농도(%)는 LPS로 처리한 후 24시간 경과한 RAW264.7 세포를 200μg/㎖ 농도의 건강기능 식품으로 처리한 뒤 24시간 경과한 후, 측정한 세포 내 LPS에 대한 ROS 농도(%)이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어, 상기 건강기능 식품은 스틱 용기에 포장된 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어, 상기 건강기능 식품은 상기 건강기능 식품 조성물 및 정제수를 포함하고, 상기 건강기능 식품 조성물을 농도 300㎍/㎖ 이상으로 포함할 수 있다.
본 발명을 통해 쓴맛의 강도가 낮아 기호도가 우수하면서도 세포독성이 낮고 NO(Nitrite) 및 세포 내 활성산소종(RCO)이 낮게 검출되어 항염 및 항산화 효과를 모두 발현하는, 항염 및 항산화 효과가 우수한 건강기능 식품 조성물 및 이를 포함하는 건강기능 식품을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 홍삼 농축액의 주요 진세노사이드 분석도이고,
도 2의 a ~ c는 본 발명의 일 실시예에 따른 홍삼 농축액, 흑마늘 농축액 및 석류 농축액의 세포생존율(세포독성, cytotoxicity) 분석 그래프,
도 3의 a ~ c는 본 발명의 일 실시예에 따른 홍삼 농축액, 흑마늘 농축액 및 석류 농축액의 염증 유도 후 세포생존율(세포독성, cytotoxicity) 분석 그래프,
도 4의 a ~ c는 본 발명의 일 실시예에 따른 홍삼 농축액, 흑마늘 농축액 및 석류 농축액의 NO(Nitrite) 검출 분석 그래프,
도 5의 a ~ c는 본 발명의 일 실시예에 따른 홍삼 농축액, 흑마늘 농축액 및 석류 농축액의 활성산소종(ROS) 검출 분석 그래프,
도 6의 a ~ d는 본 발명의 일 실시예에 따른 건강기능 식품 조성물의 세포생존율(세포독성, cytotoxicity)분석 그래프,
도 7의 a ~ d는 본 발명의 일 실시예에 따른 건강기능 식품 조성물의 염증 유도 후 세포생존율(세포독성, cytotoxicity)분석 그래프,
도 8의 a ~ d는 본 발명의 일 실시예에 따른 건강기능 식품 조성물의 NO(Nitrite) 검출 분석 그래프,
도 9의 a ~ d는 본 발명의 일 실시예에 따른 건강기능 식품 조성물의 활성산소종(ROS) 검출 분석 그래프,
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 건강기능 식품 조성물, 홍삼 농축액, 흑마늘 농축액 및 석류 농축액과 리포다당류(LPS)의 NO(Nitrite) 검출 분석 그래프 및 활성산소종(ROS) 검출 분석 그래프,
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 건강기능 식품 조성물, 홍삼 농축액, 흑마늘 농축액 및 석류 농축액과 리포다당류(LPS)의 염증인자 발현 억제 분석 그래프이다.
도 2의 a ~ c는 본 발명의 일 실시예에 따른 홍삼 농축액, 흑마늘 농축액 및 석류 농축액의 세포생존율(세포독성, cytotoxicity) 분석 그래프,
도 3의 a ~ c는 본 발명의 일 실시예에 따른 홍삼 농축액, 흑마늘 농축액 및 석류 농축액의 염증 유도 후 세포생존율(세포독성, cytotoxicity) 분석 그래프,
도 4의 a ~ c는 본 발명의 일 실시예에 따른 홍삼 농축액, 흑마늘 농축액 및 석류 농축액의 NO(Nitrite) 검출 분석 그래프,
도 5의 a ~ c는 본 발명의 일 실시예에 따른 홍삼 농축액, 흑마늘 농축액 및 석류 농축액의 활성산소종(ROS) 검출 분석 그래프,
도 6의 a ~ d는 본 발명의 일 실시예에 따른 건강기능 식품 조성물의 세포생존율(세포독성, cytotoxicity)분석 그래프,
도 7의 a ~ d는 본 발명의 일 실시예에 따른 건강기능 식품 조성물의 염증 유도 후 세포생존율(세포독성, cytotoxicity)분석 그래프,
도 8의 a ~ d는 본 발명의 일 실시예에 따른 건강기능 식품 조성물의 NO(Nitrite) 검출 분석 그래프,
도 9의 a ~ d는 본 발명의 일 실시예에 따른 건강기능 식품 조성물의 활성산소종(ROS) 검출 분석 그래프,
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 건강기능 식품 조성물, 홍삼 농축액, 흑마늘 농축액 및 석류 농축액과 리포다당류(LPS)의 NO(Nitrite) 검출 분석 그래프 및 활성산소종(ROS) 검출 분석 그래프,
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 건강기능 식품 조성물, 홍삼 농축액, 흑마늘 농축액 및 석류 농축액과 리포다당류(LPS)의 염증인자 발현 억제 분석 그래프이다.
본 발명의 발명자들은 홍삼 농축액, 흑삼 농축액 및 석류 농축액을 적절히 혼합하여, 세포독성이 우수하고 NO(Nitrite) 생성이 억제되어 항염의 효과가 있고, 세포 내 활성산소종(ROS)의 생성이 억제되어 항산화 효과가 우수한 최적의 배합비를 도출하였다.
이하에서는, 먼저, 본 발명의 일 실시예에 따른 항염 및 항산화 효과가 우수한 건강기능 식품 조성물에 대하여 상세하게 설명하도록 한다.
본 발명의 항염 및 항산화 효과가 우수한 건강기능 식품 조성물은 홍삼 농축액, 흑마늘 농축액 및 석류 농축액을 포함할 수 있다.
상기 건강기능 식품 조성물 중 본 발명에 사용되는 홍삼 농축액에 대해 이하와 같이 상세하게 설명한다.
먼저, 상기 홍삼 농축액은 홍삼에 주정을 투입하고 추출 및 여과하여 주정추출액을 제조하는 1단계; 상기 주정추출에 사용된 홍삼으로부터 정제수추출액을 얻는 2단계; 상기 주정추출액 및 정제수추출액을 혼합한 혼합물을 제조하는 3단계; 및 상기 혼합물을 농축하여 홍삼 농축액을 제조하는 4단계;를 포함하여 제조할 수 있다.
이때, 상기 1단계의 주정은 50 ~ 90% 농도의 알코올을 포함할 수 있고, 바람직하게는 55 ~ 85% 농도의 알코올을 포함할 수 있다.
또한, 상기 추출은 50 ~ 80℃ 하에서 6 ~ 10시간 동안 수행할 수 있고, 바람직하게는 60 ~ 70℃ 하에서 7 ~ 9시간 동안 수행할 수 있다.
다음으로, 상기 2단계의 정제수추출액은 상기 주정 추출액을 여과한 뒤 걸러진 홍삼에 정제수를 투입하고 추출 및 여과하여 얻을 수 있다.
이때, 상기 추출은 70 ~100℃ 하에서 6 ~ 10시간 동안 수행할 수 있고, 바람직하게는 80 ~ 90℃ 하에서 7 ~ 9시간 동안 수행할 수 있다.
다음으로, 상기 3단계의 혼합은 상기 주정추출액 및 정제수 추출액을 혼합하여 수행할 수 있다.
다음으로, 상기 4단계의 농축은 상기 혼합물을 70 ~100℃ 하에서 수행할 수 있고, 바람직하게는 80 ~ 90℃ 하에서 수행할 수 있으며, 상기 농축은 홍삼 농축액의 당도가 50 ~ 75브릭스(Brix)가 될 때까지 수행할 수 있으며, 바람직하게는 홍삼 농축액의 당도가 60 ~ 65Brix가 될 때까지 수행할 수 있다.
다음으로, 상기 4단계 이후 상기 홍삼 농축액을 동결건조기를 통해 건조하여 분말 타입의 홍삼 농축액을 얻는 5단계;를 더 포함할 수 있다.
한편, 상기 항염 및 항산화 효과가 우수한 건강기능 식품 조성물은 홍삼 농축액, 흑마늘 농축액 및 석류 농축액을 1 : 1 ~ 20 : 1 ~ 20의 중량비로 포함할 수 있고, 바람직하게는 1 : 5 ~ 15 : 5 ~ 15의 중량비로 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 1 : 8 ~ 13 : 8 ~ 13의 중량비로 포함할 수 있다.
만일, 상기 흑마늘 농축액을 1배 미만으로 포함하는 경우 항염/항산화 활성이 나타나지 않는 문제가 발생할 수 있고, 20배를 초과하여 포함하는 경우 세포독성을 야기시키는 문제가 발생할 수 있다.
또한, 만일, 상기 석류 농축액을 1배 미만으로 포함하는 경우 항염/항산화 활성이 나타나지 않는 문제가 발생할 수 있고, 20배를 초과하여 포함하는 경우 세포독성을 야기시키는 문제가 발생할 수 있다.
보다 상세하게는, 상기 홍삼 농축액은 상기 조성물 중에서 5 ~ 150㎍/㎖로 포함할 수 있고, 바람직하게는 10 ~ 130㎍/㎖로 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 25 ~ 100㎍/㎖로 포함할 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 30 ~ 100㎍/㎖로 포함할 수 있다.
이때, 상기 중량비는 농도비일 수 있다.
본 발명의 다른 목적으로, 상술한 항염 및 항산화 효과가 우수한 건강기능 식품 조성물을 포함하여 건강기능 식품을 제조할 수 있다.
상기 건강기능 식품은 상기 건강기능 식품 조성물을 배합(또는 혼합)한 뒤 정제수에 희석시켜 제조할 수 있다.
한편, 상기 건강기능 식품은 상기 건강기능 식품 조성물을 1,000㎍/㎖ 농도로 포함할 때, 하기 수학식 1에 의거하여 측정한 NO(nitrite) 제거율이 60.0% 이상일 수 있고, 바람직하게는 64% 이상일 수 있으며, 보다 바람직하게는 75% 이상일 수 있다.
[수학식 1]
NO 제거율(%)={1-(건강기능 식품 처리된 염증 유발 세포 내 NO 농도/염증 유발된 세포 내 NO 농도)}×100%
수학식 1에서 염증 유발된 세포 내 NO 농도는 RAW264.7 세포를 100ng/㎖의 유도 염증성 세포(LPS)로 처리한 후 24 시간 경과한 후 측정한 RAW264.7 세포 내 NO 농도(μM)이며, 건강기능 식품 처리된 염증 유발된 세포 내 NO 농도는 유도 염증성 세포(LPS)로 처리한 후 24 시간 경과된 RAW264.7 세포를 200μg/㎖ 농도의 건강기능 식품으로 처리한 다음 24시간 경과한 후에 측정한 세포 내 NO 농도(μM)이다.
한편, 상기 건강기능 식품은 상기 건강기능 식품 조성물을 1,000㎍/㎖의 농도로 포함할 때, 하기 수학식 2에 의거하여 측정한 ROS(활성산소종) 제거율이 40.0% 이상일 수 있고, 바람직하게는 45.0% 이상일 수 있으며, 보다 바람직하게는 50% 이상일 수 있다.
[수학식 2]
ROS 제거율(%)= 100% - (건강기능 식품 처리된 염증 유발된 세포 내 ROS 농도/염증 유발된 세포 내 ROS 농도)×100%
수학식 2에서 염증 유발된 세포 내 ROS 농도는 RAW264.7 세포를 100ng/㎖의 유도 염증성 세포(LPS)로 처리한 후 24시간 경과한 후 측정한 RAW264.7 세포 내 LPS에 대한 ROS 농도(%)이며, 건강기능 식품 처리된 염증 유발된 세포 내 LPS의 ROS 농도(%)는 LPS로 처리한 후 24시간 경과한 RAW264.7 세포를 200μg/㎖ 농도의 건강기능 식품으로 처리한 뒤 24시간 경과한 후, 측정한 세포 내 LPS에 대한 ROS 농도(%)이다.
이때, 상기 배합은 항염/항산화 활성을 갖는 최적농도의 비율로써 단순 혼합하는 어떤 방법으로 수행할 수 있다.
한편, 상기 건강기능 식품 조성물은 상기 건강기능 식품 중에서 300㎍/㎖ 이상으로 포함할 수 있고, 바람직하게는 400㎍/㎖ 이상으로 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 500㎍/㎖ 이상으로 포함할 수 있다.
만일, 상기 건강기능 식품 조성물을 300㎍/㎖ 미만으로 포함하는 경우 농도가 과도하게 묽어 항염/항산화 활성이 나타나지 않는 문제가 있을 수 있다.
한편, 상기 건강기능 식품은 스틱(stick) 용기에 포장된 것일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 하기 실시예들을 통해 설명한다. 이때, 하기 실시예들은 발명을 예시하기 위하여 제시된 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예들에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
준비예 1-1: 홍삼 농축액의 제조
홍삼 및 70% 농도의 주정을 1 : 10의 중량비로 투입하고, 이를 65℃ 하에서 7시간 동안 추출하여 홍삼 추출액을 제조하였다.
다음으로, 상기 홍삼 추출액을 여과하여 주정추출액을 얻으며, 이와는 별개로 상기 여과를 통해 걸러진 홍삼에 정제수를 투입한 후 85℃ 하에서 7시간 동안 추출 및 여과하여 정제수추출액을 얻었다.
다음으로, 상기 주정추출액과 정제수추출액을 혼합하여 혼합물을 제조하였다.
그리고, 상기 혼합물을 55℃에서 감압하면서 당도가 62.5(±2.5)브릭스(Brix)가 될 때까지 농축하여 홍삼 농축액을 얻었다.
준비예 2-1: 흑마늘 농축액
신우코퍼레이션 사의 흑마늘 농축액을 준비하였다.
준비예 3-1: 석류 농축액
해찬솔푸드 사의 석류 농축액을 준비하였다.
실험예 1: 홍삼 농축액의 주요 진세노사이드 분석
준비예 1-1에서 제조한 홍삼 농축액의 진세노사이드를 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 통해 유기화합물을 성분별로 분석하여 도 1에 나타내었다.
도 1을 살펴보면, 본 발명의 일 실시예에 따른 홍삼 농축액은 쓴맛의 강도가 높은 Rb1 및 Rg1의 함량이 높은 것으로 나타났다.
실시예 1-1: 건강기능 식품의 제조
(1)건강기능 식품 조성물의 제조
준비예 1-1에서 제조한 홍삼 농축액, 준비예 2-1의 흑마늘 농축액 및 준비예 3-1의 석류 농축액을 준비하였다.
그리고, 홍삼 농축액, 흑마늘 농축액 및 석류 농축액을 1 : 10 : 10 중량비로 포함하였다.
이때, 상기 홍삼 농축액, 흑마늘 농축액 및 석류 농축액은 각각 50㎍/㎖. 500㎍/㎖ 및 500㎍/㎖의 농도로 포함하였다.
(2)건강기능 식품의 제조
상기 건강기능 식품 조성물을 혼합한 뒤, 정제수에 상기 건강기능 식품 조성물을 1,000㎍/㎖ 농도로 포함하여 건강기능 식품(MIX-A)을 제조하였다.
실시예 1-2 ~ 실시예 1-4: 건강기능 식품의 제조
실시예 1-1과 동일한 방법으로 건강기능 식품을 제조하되, 건강기능 식품 중 건강기능 식품 조성물을 각각 100㎍/㎖. 250㎍/㎖ 및 500㎍/㎖의 농도로 포함하여 실시예 1-2 ~ 실시예 1-4를 실시하였다.
실시예 2-1: 건강기능 식품의 제조
(1)건강기능 식품 조성물의 제조
준비예 1-1에서 제조한 홍삼 농축액, 준비예 2-1의 흑마늘 농축액 및 준비예 3-1의 석류 농축액을 준비하였다.
그리고, 홍삼 농축액, 흑마늘 농축액 및 석류 농축액을 1 : 5 : 5 중량비로
이때, 상기 홍삼 농축액, 흑마늘 농축액 및 석류 농축액은 각각 50㎍/㎖. 250㎍/㎖ 및 250㎍/㎖의 농도로 포함하였다.
(2)건강기능 식품의 제조
정제수에 상기 건강기능 식품 조성물을 혼합한 뒤 이를 1,000㎍/㎖ 농도로 포함하는 건강기능 식품(MIX-B)을 제조하였다.
실시예 2-2 ~ 실시예 2-4: 건강기능 식품의 제조
실시예 2-1과 동일한 방법으로 건강기능 식품을 제조하되, 건강기능 식품 중 건강기능 식품 조성물을 각각 100㎍/㎖. 250㎍/㎖ 및 500㎍/㎖의 농도로 포함하여 실시예 2-2 ~ 실시예 2-4를 실시하였다.
실시예 3-1: 건강기능 식품의 제조
(1)건강기능 식품 조성물의 제조
준비예 1-1에서 제조한 홍삼 농축액, 준비예 2-1의 흑마늘 농축액 및 준비예 3-1의 석류 농축액을 준비하였다.
그리고, 홍삼 농축액, 흑마늘 농축액 및 석류 농축액을 1 : 20 : 20 중량비로 포함하였다.
이때, 상기 홍삼 농축액, 흑마늘 농축액 및 석류 농축액은 각각 25㎍/㎖. 500㎍/㎖ 및 500㎍/㎖의 농도로 포함하였다.
(2)건강기능 식품의 제조
상기 건강기능 식품 조성물을 혼합한 뒤 정제수에 1,000㎍/㎖ 농도로 포함하여 건강기능 식품(MIX-C)을 제조하였다.
실시예 3-2 ~ 실시예 3-4: 건강기능 식품의 제조
실시예 3-1과 동일한 방법으로 건강기능 식품을 제조하되, 건강기능 식품 중 건강기능 식품 조성물을 각각 100㎍/㎖. 250㎍/㎖ 및 500㎍/㎖의 농도로 포함하여 실시예 3-2 ~ 실시예 3-4를 실시하였다.
실시예 4-1: 건강기능 식품의 제조
(1)건강기능 식품 조성물
준비예 1-1에서 제조한 홍삼 농축액, 준비예 2-1의 흑마늘 농축액 및 준비예 3-1의 석류 농축액을 준비하였다.
그리고, 홍삼 농축액, 흑마늘 농축액 및 석류 농축액을 1 : 10 : 10 중량비로 포함하였다. (MIX-D)을 제조하였다.
이때, 상기 홍삼 농축액, 흑마늘 농축액 및 석류 농축액은 각각 25㎍/㎖. 250㎍/㎖ 및 250㎍/㎖의 농도로 포함하였다.
(2)건강기능 식품의 제조
상기 건강기능 식품 조성물을 혼합한 뒤, 정제수에 상기 건강기능 식품 조성물을 1,000㎍/㎖ 농도로 포함하여 건강기능 식품(MIX-D)을 제조하였다.
실시예 4-2 ~ 실시예 4-4: 건강기능 식품의 제조
실시예 4-1과 동일한 방법으로 건강기능 식품을 제조하되, 건강기능 식품 중 건강기능 식품 조성물을 각각 100㎍/㎖. 250㎍/㎖ 및 500㎍/㎖의 농도로 포함하여 실시예 4-2 ~ 실시예 4-4를 실시하였다.
실시예 5 ~ 실시예 6 및 비교예 1 ~ 비교예 6: 건강기능 식품의 제조
실시예 1-1과 동일한 방법으로 제조하되, 하기 표 5 ~ 표 6의 조건으로 실시예 5 ~ 실시예 6 및 비교예 1 ~ 비교예 6을 실시하였다.
실험예 2: 세포독성 평가
준비예 1-1, 준비예 2-1, 준비예 3-1, 실시예 1-1 ~ 실시예 1-4, 실시예 2-1 ~ 실시예 2-4, 실시예 3-1 ~ 실시예 3-4, 실시예 4-1 ~ 실시예 4-4, 실시예 5 ~ 실시예 6 및 비교예 1 ~ 비교예 6의 세포독성을 다음과 같은 방법으로 평가하여 그 결과값을 하기 표 1 ~ 표 6, 도 2 및 도 6에 나타내었다.
American Type Culture Collection 사의 마우스 대식세포(RAW264.7)을 96-well plate에 5 × 104 cells/well 농도로 분주하여 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin이 포함된 DMEM에 24시간 동안 안정화 시켰다.
그리고, DMEM-high 배지에 준비예 1-1 ~ 준비예 3-1 원료의 용해물을 0(Cont), 50, 100, 250, 500, 1000㎍/㎖ 농도로 처리하거나 상기 실시예 및 비교예 각각을 처리하여 5% CO2, 37℃ 인큐베이터(incubator)에서 24시간 배양시켰다.
그리고, 배양 후 2mg MTT 용액{3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-dipenyl-2H-tetrazolium bromide} 50㎕를 첨가하여 5% CO2, 37℃ 인큐베이터(incubator)에서 2시간 동안 반응시킨 후 배지를 제거하고, 다이메틸설폭시화물(dimethyl sulfoxide, DMSO)를 150㎕씩 첨가하여 실온에서 20분간 반응시켜 생성된 불용성의 포마잔(formazan) 결정을 용해하였다.
그리고, 마이크로플레이트 리더기(Microplate reader, BIO-RAD 450)를 이용하여 540㎚에서 흡광도 측정하여 세포독성을 평가(세포 생존능 측정)하였으며, 그 결과를 도 2 및 도 6에 나타내었다.
이때, 대조군으로서, LPS(유도 염증성 세포)를 준비하여 평가 수행하였다.
먼저, 도 2를 살펴보면, 준비예 2-1 및 준비예 3-1은 농도가 증가하여도 세포 독성이 저하되지 않는 반면에, 준비예 1-1은 농도가 높아질수록 세포 독성이 우수해지는 경향을 보였고, 특히 250㎍/㎖, 500㎍/㎖ 및 1,000㎍/㎖로 투입되었을 때 가장 세포독성이 낮아 우수한 물성을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 6을 살펴보면, MIX-A를 1,000㎍/㎖로 포함하는 실시예 1-1이 세포 독성 감소율이 가장 두드러지는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 3: 염증유도 후 세포독성 평가
준비예 1-1, 준비예 2-1, 준비예 3-1, 실시예 1-1 ~ 실시예 1-4, 실시예 2-1 ~ 실시예 2-4, 실시예 3-1 ~ 실시예 3-4, 실시예 4-1 ~ 실시예 4-4, 실시예 5 ~ 실시예 6 및 비교예 1 ~ 비교예 6의 염증유도 후 세포독성을 다음과 같은 방법으로 평가하여 그 결과값을 하기 표 1 ~ 표 6, 도 3 및 도 7에 나타내었다.
American Type Culture Collection 사의 마우스 대식세포(RAW264.7)을 96-웰 플레이트(well plate)에 5 × 104 cells/well 농도로 분주하여 10% 소 태아 혈청(Fetal bovine serum, FBS)와 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium) 배지에 24시간 동안 안정화 시켰다.
그리고, DMEM-high 배지에 준비예 1-1 ~ 준비예 3-1 원료의 용해물을 0(Cont), 50, 100, 250, 500, 1000㎍/㎖ 농도로 처리하거나 실시예 1-1 ~ 실시예 1-4, 실시예 2-1 ~ 실시예2-4, 실시예 3-1 ~ 실시예 3-4 및 실시예 4-1 ~ 실시예 4-4 각각을 처리한 뒤, DMEM-high 배지에 최종 LPS(염증 인자) 100ng/㎖ 농도로 첨가한 후(또는 H2O2 50μM/ml)를 5% CO2, 37℃ 인큐베이터(incubator)에서 24시간 배양시켰다.
그리고, 배양 후 2㎎ MTT 용액{3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-dipenyl-2H-tetrazolium bromide} 50㎕를 첨가하여 5% CO2, 37℃ 인큐베이터(incubator)에서 2시간 동안 반응시킨 후 배지를 제거하고, 다이메틸설폭시화물(dimethyl sulfoxide, DMSO)를 150㎕씩 첨가하여 실온에서 20분간 반응시켜 생성된 불용성의 포마잔(formazan) 결정을 용해하였다.
그리고, 마이크로플레이트 리더기(Microplate reader, BIO-RAD 450)를 이용하여 540㎚에서 흡광도 측정하여 세포독성(세포 생존능 측정)을 평가하였으며, 그 결과를 도 3 및 도 7에 나타내었다.
이때, 대조군으로서, LPS 유도 염증성 세포를 준비하여 평가 수행하였다.
먼저, 도 3을 살펴보면, 준비예 2-1 및 준비예 3-1은 농도가 증가하여도 세포 독성이 높은 반면에, 준비예 1-1은 농도가 높아질수록 세포 독성이 낮은 경향을 보였고, 특히 250㎍/㎖, 500㎍/㎖ 및 1,000㎍/㎖로 투입되었을 때 가장 세포독성이 낮아, 우수한 물성을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 7을 살펴보면, 실시예 1-1 ~ 실시예 1-4(Mix-A)가 가장 세포 독성 감소율이 높았으며, 특히, 실시예 1-1의 세포 독성이 가장 두드러지게 우수한 것을 알 수 있었다.
실험예 4: 항염 평가(NO(Nitrite) 검출)
준비예 1-1, 준비예 2-1, 준비예 3-1, 실시예 1-1 ~ 실시예 1-4, 실시예 2-1 ~ 실시예 2-4, 실시예 3-1 ~ 실시예 3-4, 실시예 4-1 ~ 실시예 4-4, 실시예 5 ~ 실시예 6 및 비교예 1 ~ 비교예 6의 항염 효능을 평가하기 위하여,
상기 실험예 2와 동일한 방법으로 마우스 대식세포를 배양시킨 후, 대조군으로서, LPS 유도 염증성 세포를 준비하여 평가 수행하였다.
상층액 80μl/ml을 취한 뒤 기질용액(N1 buffer) 40μl/ml을 더한 후 실온에서 10분간 반응시켰다. 그리고, 발색용액(N2 buffer) 40μl/ml을 더한 후 실온에서 10분간 반응시켰다. 그리고, 마이크로플레이트 리더기(Microplate reader, BIO-RAD 450)를 이용하여 540㎚에서 흡광도 측정하였고, 하기 수학식 1을 통해 NO(nitrite) 제거율을 측정하였으며, 그 결과를 도 4, 도 8, 도 10 및 하기 표 1 ~ 표 6에 나타내었다.
[수학식 1]
NO 제거율(%)={1-(건강기능 식품 처리된 염증 유발 세포 내 NO 농도/염증 유발된 세포 내 NO 농도)}×100%
수학식 1에서 염증 유발된 세포 내 NO 농도는 RAW264.7 세포를 100ng/㎖의 염증유발물질(LPS)로 처리한 후 24 시간 경과한 후 측정한 RAW264.7 세포 내 NO 농도(μM)이며, 건강기능 식품 처리된 염증 유발된 세포 내 NO 농도는 염증유발물질(LPS)로 처리한 후 24 시간 경과된 RAW264.7 세포를 200μg/㎖ 농도의 건강기능 식품으로 처리한 다음 24시간 경과한 후에 측정한 세포 내 NO 농도(μM)이다.
먼저, 도 4를 살펴보면, 농도 증가에 따라 준비예1-1의 NO(Nitrite) 검출량 감소가 가장 컸고, 특히, 농도가 100㎍/㎖, 250㎍/㎖, 500㎍/㎖ 및 1,000㎍/㎖일 때 가장 두드러지는 효과가 나타났다. 또한, 준비예 2-1은 준비예 1-1에 비해서는 둔한 감소량을 보였으나, 특히 500㎍/㎖ 이상의 농도일 때 NO(Nitrite) 검출량 감소가 가장 두드러지는 것을 알 수 있었다. 또한, 준비예 3-1은 단독으로 사용하였을 때 NO(Nitrite) 감소 정도가 크지 않은 것을 알 수 있었다.
또한, 도 8을 살펴보면, 건강기능 식품 조성물의 농도가 높아질수록 NO(Nitrite)이 검출량이 감소하는 경향을 보였으며, NO(Nitrite) 검출 감소 정도는 Mix-A에서 가장 현격하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 10을 살펴보면, 준비예 1-1 ~ 준비예 3-1의 원료보다 준비예 1-1 ~ 준비예 3-1 각각을 배합한 실시예 1-1 ~ 실시예 4-4가 NO(Nitrite)이 더 낮게 검출되었다.
특히, 준비예 1-1(홍삼농축액) 50㎍/㎖를 단독으로 사용한 것보다, Mix-A(실시예 1-1 ~ 실시예 1-4)가 더 낮은 농도의 NO(Nitrite)이 검출되어, 홍삼농축액을 단독으로 사용하는 것보다 본원발명과 같이 홍삼농축액, 흑마늘 농축액 및 석류 농축액을 혼합하는 것이 더 우수한 NO(Nitrite) 억제율을 보이는 것을 알 수 있었다.
실험예 5: 항산화 평가(ROS 측정)
준비예 1-1, 준비예 2-1, 준비예 3-1, 실시예 1-1 ~ 실시예 1-4, 실시예 2-1 ~ 실시예 2-4, 실시예 3-1 ~ 실시예 3-4, 실시예 4-1 ~ 실시예 4-4, 실시예 5 ~ 실시예 6 및 비교예 1 ~ 비교예 6의 항산화 효능을 평가하기 위하여,
10% 소 태아 혈청(Fetal bovine serum, FBS)와 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium) 배지에 24시간 동안 안정화 시켰다.
그리고, 준비예 1-1 ~ 준비예 3-1 원료의 용해물을 0(Cont), 50, 100, 250, 500, 1000㎍/㎖ 농도로 처리하거나 상기 실시예 및 비교에를 각각을 처리한 뒤, 5% CO2, 37℃ incubator에서 24시간 배양하고, 10μM DCF-DA(2', 7'-dichlorofluorescin diacetate) 37℃ incubator에서 40분 동안 반응 후, 50μM H2O2 37℃ incubator에서 60분간 반응 뒤, Ex 485, Em 530㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 하기 수학식 2를 통해 ROS(활성산소종) 제거율을 측정하였고, 그 결과를 도 5, 도 9, 도 10 및 하기 표 1 ~ 표 6에 나타내었다.
[수학식 2]
ROS 제거율(%)= 100% - (건강기능 식품 처리된 염증 유발된 세포 내 ROS 농도/염증 유발된 세포 내 ROS 농도)×100%
수학식 2에서 염증 유발된 세포 내 ROS 농도는 RAW264.7 세포를 100ng/㎖의 염증유발물질(LPS)로 처리한 후 24시간 경과한 후 측정한 RAW264.7 세포 내 LPS에 대한 ROS 농도(%)이며, 건강기능 식품 처리된 염증 유발된 세포 내 LPS의 ROS 농도(%)는 LPS로 처리한 후 24시간 경과한 RAW264.7 세포를 200μg/㎖ 농도의 건강기능 식품으로 처리한 뒤 24시간 경과한 후, 측정한 세포 내 LPS에 대한 ROS 농도(%)이다.
먼저, 도 5를 살펴보면, 준비예 1-1은 50㎍/㎖, 100㎍/㎖, 250㎍/㎖, 500㎍/㎖ 및 1,000㎍/㎖로 투입되었을 때 가장 낮은 수치의 세포 내 활성산소종(ROS)가 검출되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 준비예 2-1 및 준비예 3-1 또한 농도가 높아질수록 세포 내 활성산소종(ROS)가 감소하는 경향을 보이는 것을 알 수 있었다.
또한, 도 9를 살펴보면, Mix-A(실시예 1-1 ~ 실시예 1-4)이 가장 높은 활성산소종 감소율을 보였으며, Mix-B(실시예 2-1 ~ 실시예 2-4)가 그 다음으로 높은 활성산소종 감소율을 보였다.
또한, 도 10을 살펴보면, 준비예 1-1(홍삼농축액) 50㎍/㎖를 단독으로 사용한 것보다, Mix-A(실시예 1-1 ~ 실시예 1-4)가 더 낮은 농도의 활성산소종이 검출되어, 홍삼농축액을 단독으로 사용하는 것보다 본원발명과 같이 홍삼농축액, 흑마늘 농축액 및 석류 농축액을 혼합하는 것이 더 낮은 활성산소종이 검출되는 것을 알 수 있었다.
| Mix-A | 실시예 1-1 |
실시예 1-2 |
실시예 1-3 |
실시예 1-4 |
||
| 건강기능 식품 조성물 |
홍삼 농축액 (1) |
구분 | 준비예 1-1 |
준비예 1-1 |
준비예 1-1 |
준비예 1-1 |
| 농도(㎍/㎖) | 50 | 50 | 50 | 50 | ||
| 흑마늘농축액 (2) |
구분 | 준비예 2-1 |
준비예 2-1 |
준비예 2-1 |
준비예 2-1 |
|
| 농도(㎍/㎖) | 500 | 500 | 500 | 500 | ||
| 석류 농축액 (3) |
구분 | 준비예 3-1 |
준비예 3-1 |
준비예 3-1 |
준비예 3-1 |
|
| 농도(㎍/㎖) | 500 | 500 | 500 | 500 | ||
| (1):(2):(3) 중량비 | 1:10:10 | 1:10:10 | 1:10:10 | 1:10:10 | ||
| 건강기능 식품 |
조성물 농도(㎍/㎖) | 1,000 | 100 | 250 | 500 | |
| 용매 | 정제수 | 정제수 | 정제수 | 정제수 | ||
| 세포독성(%) | 95.3 | - | - | - | ||
| 염증유도 후 세포독성(%) | 90.2 | - | - | - | ||
| NO(Nitrite) | 농도(nM) | 2.50 | 20.13 | 14.57 | 8.19 | |
| 제거율(%) | 88.92 | 10.74 | 35.37 | 63.67 | ||
| 활성산소종 | (% of LPS) | 25.43 | 90.09 | 78.71 | 61.71 | |
| 제거율(%) | 74.57 | 9.01 | 21.29 | 38.29 | ||
| Mix-B | 실시예 2-1 |
실시예 2-2 |
실시예 2-3 |
실시예 2-4 |
||
| 건강기능 식품 조성물 |
홍삼 농축액 (1) |
구분 | 준비예 1-1 |
준비예 1-1 |
준비예 1-1 |
준비예 1-1 |
| 농도(㎍/㎖) | 50 | 50 | 50 | 50 | ||
| 흑마늘 농축액 (2) |
구분 | 준비예 2-1 |
준비예 2-1 |
준비예 2-1 |
준비예 2-1 |
|
| 농도(㎍/㎖) | 250 | 250 | 250 | 250 | ||
| 석류 농축액 (3) |
구분 | 준비예 3-1 |
준비예 3-1 |
준비예 3-1 |
준비예 3-1 |
|
| 농도(㎍/㎖) | 250 | 250 | 250 | 250 | ||
| (1):(2):(3) 중량비 | 1:5:5 | 1:5:5 | 1:5:5 | 1:5:5 | ||
| 건강기능 식품 |
조성물 농도(㎍/㎖) | 1,000 | 100 | 250 | 500 | |
| 용매 | 정제수 | 정제수 | 정제수 | 정제수 | ||
| 세포독성(%) | 97.5 | - | - | - | ||
| 염증유도 후 세포독성(%) | 98.1 | - | 89.8 | - | ||
| NO(Nitrite) | 농도(nM) | 3.98 | 19.14 | 16.38 | 11.44 | |
| 제거율(%) | 82.37 | 15.14 | 27.38 | 49.28 | ||
| 활성산소종 | (% of LPS) | 37.20 | 88.37 | 81.70 | 67.70 | |
| 제거율(%) | 62.80 | 11.63 | 18.30 | 32.30 | ||
| Mix-C | 실시예 3-1 |
실시예 3-2 |
실시예 3-3 |
실시예 3-4 |
||
| 건강기능 식품 조성물 |
홍삼 농축액 (1) |
구분 | 준비예 1-1 |
준비예 1-1 |
준비예 1-1 |
준비예 1-1 |
| 농도(㎍/㎖) | 25 | 25 | 25 | 25 | ||
| 흑마늘 농축액 (2) |
구분 | 준비예 2-1 |
준비예 2-1 |
준비예 2-1 |
준비예 2-1 |
|
| 농도(㎍/㎖) | 500 | 500 | 500 | 500 | ||
| 석류 농축액 (3) |
구분 | 준비예 3-1 |
준비예 3-1 |
준비예 3-1 |
준비예 3-1 |
|
| 농도(㎍/㎖) | 500 | 500 | 500 | 500 | ||
| (1):(2):(3) 중량비 | 1:20:20 | 1:15:15 | 1:15:15 | 1:15:15 | ||
| 건강기능 식품 |
조성물 농도(㎍/㎖) | 1,000 | 100 | 250 | 500 | |
| 용매 | 정제수 | 정제수 | 정제수 | 정제수 | ||
| 세포독성(% of LPS) | 97.9 | - | - | - | ||
| 염증유도 후 세포독성(% of LPS) | 98.6 | - | - | - | ||
| NO(Nitrite) | 농도(nM) | 4.67 | 21.15 | 17.59 | 12.38 | |
| 제거율(%) | 79.45 | 6.98 | 22.63 | 45.55 | ||
| 활성산소종 | (% of LPS) | 47.47 | 91.14 | 83.39 | 72.70 | |
| Mix-D | 실시예 4-1 |
실시예 4-2 |
실시예 4-3 |
실시예 4-4 |
||
| 건강기능 식품 조성물 |
홍삼 농축액 (1) |
구분 | 준비예 1-1 |
준비예 1-1 |
준비예 1-1 |
준비예 1-1 |
| 농도(㎍/㎖) | 25 | 25 | 25 | 25 | ||
| 흑마늘 농축액 (2) |
구분 | 준비예 2-1 |
준비예 2-1 |
준비예 2-1 |
준비예 2-1 |
|
| 농도(㎍/㎖) | 250 | 250 | 250 | 250 | ||
| 석류 농축액 (3) |
구분 | 준비예 3-1 |
준비예 3-1 |
준비예 3-1 |
준비예 3-1 |
|
| 농도(㎍/㎖) | 250 | 250 | 250 | 250 | ||
| (1):(2):(3) 중량비 | 1:10:10 | 1:10:10 | 1:10:10 | 1:10:10 | ||
| 건강기능 식품 |
조성물 농도(㎍/㎖) | 1,000 | 100 | 250 | 500 | |
| 용매 | 정제수 | 정제수 | 정제수 | 정제수 | ||
| 세포독성(% of LPS) | 98.2 | - | - | - | ||
| 염증유도 후 세포독성(% of LPS) | 98.9 | - | - | - | ||
| NO(Nitrite) | 농도(nM) | 7.95 | 21.01 | 18.62 | 15.23 | |
| 제거율(%) | 65.00 | 7.58 | 18.09 | 33.00 | ||
| 활성산소종 | (% of LPS) | 59.62 | 93.34 | 81.93 | 77.43 | |
| 제거율(%) | 40.38 | 6.67 | 18.07 | 22.57 | ||
| 실시예5 | 실시예6 | 비교예1 | 비교예2 | |||
| 건강기능 식품 조성물 |
홍삼 농축액 (1) |
구분 | 준비예 1-1 |
준비예 1-1 |
준비예 1-1 |
준비예 1-1 |
| 농도(㎍/㎖) | 130 | 30 | 50 | 50 | ||
| 흑마늘 농축액 (2) |
구분 | 준비예 2-1 |
준비예 2-1 |
준비예 2-1 |
준비예 2-1 |
|
| 농도(㎍/㎖) | 650 | 390 | - | 500 | ||
| 석류 농축액 (3) |
구분 | 준비예 3-1 |
준비예 3-1 |
준비예 3-1 |
준비예 3-1 |
|
| 농도(㎍/㎖) | 650 | 390 | 500 | - | ||
| (1):(2):(3) 중량비 | 1:5:5 | 1:13:13 | 1:0:10 | 1:10:0 | ||
| 건강기능 식품 |
조성물 농도(㎍/㎖) | 1,000 | 1,000 | 1,000 | 1,000 | |
| 용매 | 정제수 | 정제수 | 정제수 | 정제수 | ||
| 세포독성(% of LPS) | 92.4 | 96.7 | 96.5 | 96.0 | ||
| 염증유도 후 세포독성(% of LPS) | 88.6 | 96.0 | 96.1 | 95.4 | ||
| NO(Nitrite) | 농도(nM) | 4.98 | 7.15 | 18.8 | 16.92 | |
| 제거율(%) | 78.06 | 68.5 | 17.18 | 25.46 | ||
| 활성산소종 | (% of LPS) | 47.48 | 39.54 | 78.82 | 79.53 | |
| 제거율(%) | 52.52 | 60.46 | 21.18 | 20.47 | ||
| 비교예3 | 비교예4 | 비교예5 | 비교예6 | |||
| 건강기능 식품 조성물 |
홍삼 농축액 (1) |
구분 | 준비예 1-1 |
준비예 1-1 |
준비예 1-1 |
준비예 1-1 |
| 농도(㎍/㎖) | 50 | 50 | 50 | 50 | ||
| 흑마늘 농축액 (2) |
구분 | 준비예 2-1 |
준비예 2-1 |
준비예 2-1 |
준비예 2-1 |
|
| 농도(㎍/㎖) | 30 | 1,150 | 500 | 500 | ||
| 석류 농축액 (3) |
구분 | 준비예 3-1 |
준비예 3-1 |
준비예 3-1 |
준비예 3-1 |
|
| 농도(㎍/㎖) | 500 | 500 | 30 | 1,150 | ||
| (1):(2):(3) 중량비 | 1:0.6:10 | 1:23:10 | 1:10:0.6 | 1:10:23 | ||
| 건강기능 식품 |
조성물 농도(㎍/㎖) | 1,000 | 1,000 | 1,000 | 100 | |
| 용매 | 정제수 | 정제수 | 정제수 | 정제수 | ||
| 세포독성(% of LPS) | 95.5 | 99.7 | 95.6 | 99.5 | ||
| 염증유도 후 세포독성(% of LPS) | 94.8 | 99.5 | 94.9 | 99.0 | ||
| NO(Nitrite) | 농도(nM) | 12.79 | 2.1 | 14.51 | 2.3 | |
| 제거율(%) | 43.65 | 90.75 | 36.08 | 89.87 | ||
| 활성산소종 | (% of LPS) | 64.77 | 24.29 | 65.84 | 25.06 | |
| 제거율(%) | 35.23 | 75.71 | 34.16 | 74.94 | ||
상기 표 1 ~ 표 6을 살펴보면, 실시예는 세포 독성이 낮아 세포 생존율이 높고 NO 및 활성산소종 발생량이 적은 것을 확인할 수 있었다.
반면에, 흑마늘 농축액을 포함하지 않거나 석류 농축액을 포함하지 않은 비교예 1 ~ 비교예 2는 NO 및 활성산소종 발생량이 크게 증가하여 항염 및 항산화 효능이 불량한 것을 확인할 수 있었다.
또한, 흑마늘 농축액의 중량비가 1 중량비 미만이거나 석류 농축액의 중량비가 1 중량비 미만인 비교예 3 및 비교예 5는 NO 및 활성산소종 발생량이 크게 증가하여 항염 및 항산화 효능이 불량한 것을 확인할 수 있었다.
또한, 흑마늘 농축액의 중량비가 20 중량비를 초과하거나 석류 농축액의 중량비가 20 중량비를 초과하는 비교예 4 및 비교예 6은 세포독성이 크게 증가하여 세포생존율이 낮음에 따라 건강식품으로의 적용이 어려운 것을 확인할 수 있었다.
실험예 6: 염증인자 발현 억제 평가
염증인자 발현 억제 효능을 평가하기 위하여, 리포다당류(Lipopolysaccharide, LPS), 준비예 2-1의 흑마늘 농축액 500㎍/㎖, 준비예 1-1의 홍삼 농축액 50㎍/㎖, 석류 농축액 500㎍/㎖ 및 Mix-A ~ Mix-D(실시예 1-1 ~ 실시예 4-4) 각각을 마우스 대식세포(RAW264.7)에 반응시킨 세포를 차가운 용출용액(cold lysis buffer, Pro-PREPTM,iNiRON) 400 ㎕을 첨가하여 30분간 냉동(-20℃)처리하고, 원심분리(4℃, 13,000rpm, 10min 조건)하여 상층액을 취하여 BCA 법으로 단백질을 정량하였다.
그리고, 상기 정량된 단백질 50 ㎍/㎖과 sample buffer (60 mM Tris-Cl; pH 6.8, 2% SDS, 25% glycerol, 14.4 mM 2-mercaptaethanol, 0.1% bromphenol blue)를 혼합하여 100℃에서 5분간 끓인 후 급속 냉각시킨 뒤,각 레인(lane) 별로 120V에서 1시간 20분간 전기영동시킨 후, PVDF막으로 단백질을 부착시켰다.
그리고, 5% bovine serum albumin로 블로킹(blocking)하였으며, COX-2, iNOS, β-actin을 포함하는 1차 항체를 각각 4℃, 16시간 반응시킨 후 2차 항체인 HRP-conjugated anti-rabbit으로 실온에서 2시간 동안 처리하였다.
그리고, 목적 단백질을 동정하기 위하여 기질로 ECL (enhanced chemiluminescence, GE, Healthcare, Piscataway, NJ, USA)을 사용하고, 상기 막(membrane)을 X-ray film에 노출시켜 LAS3,000 image analyzer (Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)를 사용하여 밴드를 현상하여 정량화하였으며, 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11을 살펴보면, 실시예 1-1이 가장 염증인자 발현 억제가 잘 이루어진 것을 확인할 수 있었다.
이상에서 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 본 발명의 사상은 본 명세서에 제시되는 실시예에 제한되지 아니하며, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서, 구성요소의 부가, 변경, 삭제, 추가 등에 의해서 다른 실시 예를 용이하게 제안할 수 있을 것이나, 이 또한 본 발명의 사상범위 내에 든다고 할 것이다.
Claims (8)
- 홍삼 농축액, 흑마늘 농축액 및 석류 농축액을 1 : 1 ~ 20 : 1 ~ 20 중량비로 포함하는 항염 및 항산화 효과가 우수한 건강기능 식품 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 홍삼 농축액을 5 ~ 150㎍/㎖로 포함하는 것을 특징으로 하는 항염 및 항산화 효과가 우수한 건강기능 식품 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 홍삼 농축액, 흑마늘 농축액 및 석류 농축액을 1 : 5 ~ 15 : 5 ~ 15 중량비로 포함하는 것을 특징으로 하는 항염 및 항산화 효과가 우수한 건강기능 식품 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중에서 선택된 어느 한 항에 따른 건강기능 식품 조성물을 포함하는 건강기능 식품.
- 제4항에 있어서,
상기 건강기능 식품 조성물을 1,000㎍/㎖ 농도로 포함할 때, 하기 수학식 1에 의거하여 측정한 NO(nitrite) 제거율이 60.0% 이상인 것을 특징으로 하는 항염 및 항산화 효과가 우수한 건강기능 식품:
[수학식 1]
NO 제거율(%)={1-(건강기능 식품 처리된 염증 유발 세포 내 NO 농도/염증 유발된 세포 내 NO 농도)}×100%
수학식 1에서 염증 유발된 세포 내 NO 농도는 RAW264.7 세포를 100ng/㎖의 유도 염증성 세포(LPS)로 처리한 후 24 시간 경과한 후 측정한 RAW264.7 세포 내 NO 농도(μM)이며, 건강기능 식품 처리된 염증 유발된 세포 내 NO 농도는 유도 염증성 세포(LPS)로 처리한 후 24 시간 경과된 RAW264.7 세포를 200μg/㎖ 농도의 건강기능 식품으로 처리한 다음 24시간 경과한 후에 측정한 세포 내 NO 농도(μM)이다.
- 제4항에 있어서,
상기 건강기능 식품 조성물을 1,000㎍/㎖의 농도로 포함할 때, 하기 수학식 2에 의거하여 측정한 ROS(활성산소종) 제거율이 40.0% 이상인 것을 특징으로 하는 항염 및 항산화 효과가 우수한 건강기능 식품:
[수학식 2]
ROS 제거율(%)= 100% - (건강기능 식품 처리된 염증 유발된 세포 내 ROS 농도/염증 유발된 세포 내 ROS 농도)×100%
수학식 2에서 염증 유발된 세포 내 ROS 농도는 RAW264.7 세포를 100ng/㎖의 유도 염증성 세포(LPS)로 처리한 후 24시간 경과한 후 측정한 RAW264.7 세포 내 LPS에 대한 ROS 농도(%)이며, 건강기능 식품 처리된 염증 유발된 세포 내 LPS의 ROS 농도(%)는 LPS로 처리한 후 24시간 경과한 RAW264.7 세포를 200μg/㎖ 농도의 건강기능 식품으로 처리한 뒤 24시간 경과한 후, 측정한 세포 내 LPS에 대한 ROS 농도(%)이다.
- 제4항에 있어서,
상기 건강기능 식품은 스틱 용기에 포장된 것을 특징으로 하는 건강기능 식품.
- 제4항에 있어서,
상기 건강기능 식품 조성물 및 정제수를 포함하고,
상기 건강기능 식품 조성물을 농도 300㎍/㎖ 이상으로 포함하는 것을 특징으로 하는 건강기능 식품.
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| KR20030037380A (ko) | 2001-11-03 | 2003-05-14 | 주식회사 케이티앤지 | 홍삼농축액을 이용한 건강보조식품 및 그의 제조방법 |
| KR20130091385A (ko) * | 2012-02-08 | 2013-08-19 | 재단법인 진안홍삼연구소 | 과실 농축액을 함유하는 홍삼 건강 음료 |
| KR20180105361A (ko) * | 2017-03-15 | 2018-09-28 | (재)남해마늘연구소 | 흑마늘 농축액과 홍삼분말을 포함하는 고점도 음료의 제조방법 |
-
2021
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Patent Citations (3)
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 네이버 블로그에 게재된 ‘참다한홍삼’(2019.08.06.)* * |
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