KR20220093701A - 항염증성을 포함하는 생리활성 기능성을 가지는 콜라겐-히알루론산 복합 천연고분자 기반의 창상피복재용 나노섬유 멤브레인의 제조방법 - Google Patents
항염증성을 포함하는 생리활성 기능성을 가지는 콜라겐-히알루론산 복합 천연고분자 기반의 창상피복재용 나노섬유 멤브레인의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 방사와 동시에 가교가 되는 전기방사법을 시도하여 생체친화성이 우수한 천연고분자 기반의 의료용 창상피복재용 나노섬유 멤브레인의 제조방법에 관한 것으로서 본 발명에 의한 생리활성 항염물질을 도입한 아텔로콜라겐-히알루론산 기능성 나노섬유 멤브레인은 독성이 낮아 생체에 적합하고, 미세섬유상 구조로 유연성과 흡액성이 우수한 효과가 있으며, 천연고분자 방사 물질의 용액내 불용화를 위해 필수적인 후가교 과정을 없애고, 전기방사와 동시에 가교가 진행되도록 하는 방사시스템을 통해 제조시간을 줄이고 안정화 효과를 확보함으로써 인체적합성, 항염성, 항산화성, 형태안정, 부착성 및 흡액성이 우수한 미세 섬유구조체 기반의 의료용 나노섬유 멤브레인을 제공하여 창상피복재 용도로 적용할 수 있다.
Description
본 발명은 방사와 동시에 가교가 되는 전기방사법을 시도하여 생체친화성이 우수한 천연고분자 기반의 의료용 창상피복재용 나노섬유 멤브레인의 제조방법에 관한 것이다.
최근 고령화 사회의 급속한 성장, 대사질환 증가에 의해 만성창상을 가진 환자가 증가하고 있어 만성창상 치료가 주목받고 있다. 만성창상은 정상적인 창상치료 과정을 거쳐 일정기간이 경과 후에도 치유되지 않는 상처를 의미하며, 그 기간은 일반적으로 4주에서 3개월 이상이고 정상적인 상처관리 및 치료를 해도 20-30% 이하의 치유되지 않는 창상을 말한다.
일반적인 창상의 치료제와 달리 만성창상으로 쓰이는 치료 제품은 삼출물의 양에 따라 다양한 종류의 드레싱재가 있으며 최근에는 항균성 드레싱재, 통증을 완화시키는 기능성 드레싱재, 창상치유를 촉진시키는 세포치료제가 개발되어 난치성 만성창상에 사용되기 한다. 또한 창상치료제의 종류는 그 원재료에 따라 필름형, 폼형, 하이드로겔형, 하이드로콜로이드형 등으로 분류되고 최근에는 생체유래 재료를 이용하는 등 그 원재료가 매우 다양화 되고 있는 추세이다. 창상의 치유가 빨리 진행되기 위해서는 삼출물을 잘 흡수하고 상처부위가 외부에 노출을 방지하고 습윤상태를 유지하는 것이 가피를 형성시키는 치유과정보다 상피세포의 재생을 촉진시킨다.
이미 체내의 피부성분에 존재하는 콜라겐과 히알루론산은 가장 널리 사용되는 천연유래 생체고분자이다. 콜라겐은 단백질 성분의 일종으로 세포외기질 성분 중 70%를 차지하는 가장 풍부한 단백질 성분으로서 그 중 의료용으로 사용되는 아텔로 콜라겐은 항원성이 있는 분자 말단의 펩티드를 효소 처리해서 알레르기 반응을 제거해 항원성이 없고, 생체친화성이 좋은 콜라겐으로서 미용에 많이 사용하고 있는 가수분해 콜라겐의 젤라틴 일종과는 다른 의료용으로 적용 가능한 콜라겐이다. 이들 아텔로 콜라겐은 세포외기질의 대사활성, 염증세포의 주화성을 향상시키는데 도움이 되며, 조직의 성장을 지원하고 기계적 강도를 부여할 수 있는 생체물질이다.
히알루론산은 단백질 성분을 결합해주는 역할을 하며 세포의 보유, 이동, 분화와 같은 세포활동에 영향을 주며, 수분을 저장하는 능력이 뛰어나 생체에 용해되어 존재하는 여러 인자들과 상처부위의 보습성유지를 통한 창상 치유에 도움을 준다. 이러한 인체 적합한 생체고분자들의 조합은 각 물질 단독 사용에 비해 고유의 특성 발현 및 세포의 이동, 분열에서 이점을 나타낸다.
이러한 콜라겐 및 히알루론산 등의 천연고분자 물질은 종종 생체적합 드레싱 소재로 연구되고 있으나, 만성 창상 치유를 위한 기능성 드레싱 구조에 대한 여전히 충족되지 않은 부분이 있다. 예를 들어, 현재 가장 많이 제조 판매되는 폼이나 하이드로겔과 같은 스폰지 구조는 연조직에 사용하기에 불충분한 흡수율 및 제품을 피부에 붙였을 때 유연성의 한계가 있다. 또한 콜라겐과 히알루론산과 같은 생체고분자는 효소분해가 쉽고 유지기간이 짧아 후가교를 통한 물리적 안정성을 높여주는 과정이 필요하다.
따라서 이러한 치료효율성 개선을 고려하여 삼출물을 충분히 흡수할 수 있으며 부착 유연성 및 인체 움직임 대응에 물성확보를 위한 섬유형태의 멤브레인을 제조하고자 하였으며, 최근 전기방사를 이용한 생체적합소재의 나노섬유 멤브레인 연구가 진행되고 있으나, 아직까지는 의료용도로서 아텔로콜라겐, 히알루론산, 키토산과 같은 천연고분자를 이용하여 생체친화성과 유효한 치료효과 기능성을 가지는 전기방사 나노섬유 소재의 기술 및 상용화 수준 연구는 미흡한 실정이다.
그러므로 본 발명에서는 기존의 필름 및 폼형태의 만성창상 피복재의 유연성 및 흡수능력 저하의 문제점을 개선하기 위하여, 인체조직 구성성분이면서 조직재생에 도움을 줄 수 있는 생체고분자인 의료용 아텔로콜라겐, 히알루론산을 복합화하여 전기방사기법을 이용한 섬유기반의 나노섬유 멤브레인을 제조하고, 또한 생체 고분자의 형태유지 및 불용화를 위해 방사용액에 독성이 적은 생체친화성 가교제를 함께 혼합하여 방사와 동시에 가교되는 방식을 통해 종래의 후가교 공정의 문제를 해결하는 방법을 제공하여 인체안정성, 항염성, 형태안정, 피부 부착성 및 상처부위 삼출물 흡수율이 우수하여 만성창상 및 급성창상 등의 창상용 피복재로 활용할 수 있는 의료용도의 나노섬유 멤브레인을 제공하는 것을 기술적 과제로 한다.
그러므로 본 발명에 의하면, 히알루론산을 인산완충식염수에 교반하여 용해하여 히알루론산을 분산시킨 후, 분산된 히알루론산 용액에 아세트산 및 아틸로콜라겐을 첨가하여 아틸로콜라겐-히알루론산 용액으로 만들어 교반한 후, 항염제를 첨가하고 교반한 후, 생체친화성 가교제를 첨가하고 교반하여 방사용액을 준비한 후, 전기방사를 진행하여 방사와 동시에 가교가 되도록 하여 멤브레인을 제조한 후 건조한 것을 특징으로 하는 항염증성을 포함하는 생리활성 기능성을 가지는 콜라겐-히알루론산 복합 천연고분자 기반의 창상피복재용 나노섬유 멤브레인의 제조방법이 제공된다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.
본 발명은 생체에 적합한 천연고분자 원료를 이용하여 미세섬유 구조체 기반의 항염증, 항산화성, 조직재생 기능성과 같은 생리활성 기능성을 가지는 나노섬유 멤브레인의 제조에 관한 것으로, 생체친화성 가교제를 방사용액에 함께 혼합 방사하여 섬유제조와 동시에 가교가 함께 이루어지는 방사 시스템을 통해 가교 후에도 제조시간 단축 및 형태를 유지하고, 생체친화성, 항산화성, 항염증성 등의 치료효과 및 생리활성 기능성이 함유된 피부조직 개선/치료를 위한 창상치료용 나노섬유 멤브레인의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 전기방사를 위한 방사용액은 다음과 같이 준비한다. 우선, 히알루론산을 20배인산완충식염수(Phosphate Buffer Saline(pH 7.5))에 교반하여 용해하여 히알루론산을 분산시키는데, 용해되지 않는 히알루론산 덩어리 제거를 위해 초음파분산기를 이용하여 구동주파수 20~30khz에서 1~5분간 초음파 처리를 통해 히알루론산겔을 분산시킨다.
상기 히알루론산 천연고분자는 주로 약물전달시스템 개발 용도로 사용되는 고분자이나, 수산기가 많아 한 분자당 218개의 물분자를 끌어들여 자체무게의 1,000배의 물을 함유할 수 있어 방사용액 제조시 입자끼리 뭉쳐 겔화를 형성하므로, 다른 고분자와 복합 용해하지 않고 단독으로 용해하고, 이후 초음파처리를 통한 입자 분산을 시킨다. 히알루론산은 방사용액의 0.2~1중량% 함유되는 것이 바람직한데, 1중량% 초과시에서는 겔화가 크게 발생하므로 1중량% 이하의 저농도 사용이 필요하다.
이후, 잘 분산된 히알루론산 용액에 아세트산 및 아텔로콜라겐을 추가하여 아텔로콜라겐-히알루론산 용액을 만드는데, 2~3시간 동안 교반 및 1~5분간 초음파 처리하여 아텔로콜라겐-히알루론산 용액을 제조한다. 이때 아텔로콜라겐의 용해를 위해 pH4.5이하의 산성상태를 유지하며, 독성이 높은 유기용매는 사용하지 않는다.
상기 아텔로콜라겐은 생체적합성이 우수하고 저렴하다는 장점이 있어 조직공학 등에 다양하게 사용되고 있으며, 아텔로콜라겐으로 제조된 나노섬유는 높은 비표면적과 다공성의 3차원 구조를 가져 약물저장 및 세포외기질과 유사한 구조로 피부재생 치료효과를 촉진시킬 수 있는 장점이 있다. 아틸로콜라겐은 3~15중량%이 함유되는 것이 바람직한데, 3중량%미만에서는 방사시 섬유화가 되지 않는 문제점이 발생하며, 15중량%초과시에는 고농도로 방사니들에 통과하기가 어려워 방사가 불가한 문제점이 발생한다.
이후, 항염제를 첨가하고 교반하여 항염제가 담지된 아텔로콜라겐-히알루론산 용액을 만드는데, 상기 항염제는 항염효과를 가지는 aminoglycoside계 항염제로 겐타마이신(gentamicin), 스트렙토마이신(streptomycin), 아미카신(amikacin), 네오미신(neomycin), 토브라마이신(tobramycin) 중 어느 하나 이상의 항염제를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 aminoglycoside계 항염제는 Streptomyces 및 Micromonospora 속균에 의하여 생산되는 광범위 항염제로, 세균성 감염증 치료제 및 성장 촉진제로 임상에서 널리 사용되고 있으며, 염증치료의 목적으로 약물에 투입되어 흔히 사용되고 있는 항생제류이다. 항염제는 0.1~5중량%이 함유되는 것이 바람직한데, 0.1중량%미만에서는 방사되는 섬유내에 포함되므로 표면상 항염효과가 다소 낮은 문제점이 발생하며, 5중량%초과시에는 투입량 대비 성능발현에 대한 경제성이 낮아지고, 방사성에 다소 영향을 끼치는 문제점이 발생한다.
이후, 상기 용액에 생체친화성 가교제를 첨가하는데, EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide), BDDE(l,4-Butanediol diglycidyl ether), NDGA(nordihydroguairetic acid), genipin, apigenin, catechin, gallocatechin, epigallocatechin gallate, ferulic acid, quercetin, chlorogenic acid, protocatechuic acid 중 어느 하나 이상의 생체친화성 가교제를 투입하고 상온에서 30~60분 동안 교반하여 본 발명에서 사용할 방사용액을 준비하게 된다.
상기 생체친화성 가교제는 0.5~5중량%이 함유되는 것이 바람직한데, 0.5중량%미만에서는 가교성이 미비하여 나노섬유 형태안정성이 낮아지는 문제점이 발생하며, 5중량%초과시에는 천연고분자 용해 용액에서부터 미미한 가교현상이 일어나거나 점도가 높아져 나노섬유 형상 방사가 어려운 문제점이 발생한다.
본 발명에서 상기 생체친화성 가교제는 기존에 주로 사용되는 가교제인 glutaraldehyde(글루타알데히드) 대체 가교제로 제안하고 있으며 glutaraldehyde 보다 독성이 매우 낮아 의료용의 생체적용이 가능하다. 특히, 상기 EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)는 저온 가교제로 콜라겐 등의 카르복실산과 반응으로 가교를 유도할 수 있고, BDDE(l,4-Butanediol diglycidyl ether)는 에테르결합에 의한 가교반응을, NDGA(nordihydroguairetic acid)는 크레오소트 덤불에서 자연추출된 산화방지제 성분으로 카테콜 산화에 의한 콜라겐과의 가교결합을 유도할 수 있다, genipin, apigenin, catechin, gallocatechin, epigallocatechin gallate, ferulic acid, quercetin, chlorogenic acid, protocatechuic acid 등은 천연물 유래 물질로서 항산화 기능성을 가지면서, 프로테인계 물질인 콜라겐의 아미드기와 다당류 일종인 히알루론산의 함유된 아미드기 염기성 잔기와 에스테르기와의 친핵성 치환반응에 의한 가교반응을 형성한다. 이들 물질은 아텔로콜라겐-히알루론산의 표면 가교를 형성함으로서 물성 및 형태성 확보에 기여하고 의료용 물질 및 천연유래 기반 물질을 가교제로 첨가함으로서 생체친화성이 양호하고 항산화성도 추가적으로 부여 가능하다.
한편, 대부분의 천연고분자는 물에 대한 형태안정 및 분해반응에 대한 저항을 위해 제품으로 사용하기 위해서는 반드시 가교반응이 필요한데, 구조체 제작 후 가교반응이 필수적이다. 대체적으로 종래기술에서 가교하는 방법은 가교액에 제작한 구조체를 담가서 2~48시간 동안 가교용액 내에서 가교시켜 불용화시키는 방법으로 가교 후 구조체가 팽윤되어 형태가 변형되고 시간이 오래 걸리는 단점이 있다.
종래 가장 보편적으로 사용되는 가교제는 glutaraldehyde로서 glutaraldehyde 처리 가교방식은 용액상 침지하거나 상온에서 기화되는 증기로 가교하여 제조하고 있다. glutaraldehyde 기화 증기로 가교한 경우 나노섬유 구조체의 형태는 잘 유지되나 독성이 강해 의료용으로 사용하기에 부적합하며 가교 후 독성을 제거하기 위해 투석하는 시간이 오래 걸린다는 단점이 있었다.
따라서 본 발명에서 시도하는 방사와 동시에 가교될 수 있는 상기 방법은 독성이 적은 생체친화성 가교제를 함께 혼합하여 방사용액을 만든 후에 방사를 하는 것으로서 나노섬유가 방사되는 동시에 가교가 서서히 함께 진행되도록 한 것으로서, 제품의 형태 유지 및 공정을 줄여 시간을 단축할 수 있는 장점도 가진다.
콜라겐과 히알루론산 방사용액에 상기 EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide), genipin, catechin 등의 가교제 첨가시 가교속도는 종래기술의 glutaraldehyde보다 다소 느리지만, 방사용액에서 방사노즐로 방사하면서 나노섬유 형태가 되고, 콜라겐 및 히알루론산에 함유된 아미드기 잔기 또는 카복복실기는 가교제의 에스테르기와의 가교결합으로 섬유상의 형태가 확보될 수 있는 나노섬유 멤브레인이 제조될 수 있다.
이렇게 준비된 방사용액으로 전기방사를 하여 나노섬유 멤브레인을 제조하게 되는데, 전기방사조건은 온도 20~30℃내외, 습도 30~60%내외, 전압 10~30kV, 토출량 1~10㎕/min, TCD 10~15cm의 조건으로 후가교 과정이 필요없이 전기방사를 진행하여 나노섬유 멤브레인을 제조한다. 이후 가교 안정화 및 용액 건조를 고려하여 2~4시간 동안 40~60℃에서 보관하여 잔여 용매를 건조, 휘발시키게 된다. 이렇게 제조된 나노섬유 멤브레인은 생체친화성, 유연성, 흡액성, 경량성, 미세통기성이 우수하여 의료용도의 만성 및 급성창상 치료용 피복재로 적용 가능하다.
그러므로 본 발명의 생리활성 항염물질을 도입한 아텔로콜라겐-히알루론산 기능성 나노섬유 멤브레인은 인체에 무해하면서 섬유상 구조로 유연성과 흡수율이 우수한 효과가 있다. 또한 천연고분자 방사 물질의 불용화를 위해 필수적인 후가교 과정을 없애고, 전기방사와 동시에 가교가 진행되도록 하는 방사시스템을 통해 제조시간을 줄이고 안정화 효과를 확보함으로써 생체친화성, 항염성, 항산화성, 형태안정, 부착성 및 흡액성이 우수한 의료용도의 섬유구조체 기반의 만성 및 급성창상용 나노섬유 멤브레인을 제공하여 피복재 용도로 적용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1 내지 실시예 3의 나노섬유 멤브레인의 FE-SEM(Hitachi(SU8220))사진이며,
도 2는 실시예 1과 비교예 1의 멤브레인 형태사진이며,
도 3은 실시예 1, 실시예 4, 실시예 5의 나노섬유 멤브레인 내의 항생제(젠타마이신) 분산 사진이며,
도 4는 실시예 1의 나노섬유 멤브레인의 세포독성 평가 결과 그래프이며,
도 5는 실시예 1의 나노섬유 멤브레인 항염평가 결과 그래프이다.
도 2는 실시예 1과 비교예 1의 멤브레인 형태사진이며,
도 3은 실시예 1, 실시예 4, 실시예 5의 나노섬유 멤브레인 내의 항생제(젠타마이신) 분산 사진이며,
도 4는 실시예 1의 나노섬유 멤브레인의 세포독성 평가 결과 그래프이며,
도 5는 실시예 1의 나노섬유 멤브레인 항염평가 결과 그래프이다.
다음의 실시예에서는 본 발명의 의료용 창상피복재용 나노섬유 멤브레인의 제조방법의 비한정적인 예시를 하고 있다.
[실시예 1]
1. 방사용액 제조
방사용액을 제조하기 위해서는 먼저 히알루론산 1중량%를 20× Phosphate Buffer Saline(pH 7.5)에서 2시간 교반하여 용해한 후 24시간 상온에 보관하였다. 이후 용해되지 않는 히알루론산 덩어리 제거를 위해 초음파분산기(Ultrasonic Processor)를 이용하여 구동주파수 20khz에서 2분간 초음파 처리를 통해 히알루론산 겔을 분산시켰다. 분산된 히알루론산 용액에 아세트산을 5.5중량% 첨가하고 아텔로콜라겐 15중량%를 추가하여 아텔로콜라겐-히알루론산 방사용액을 2시간 동안 교반하였다. 여기에 항생제 성분인 겐타마이신 0.5중량%를 추가 투입하여 1시간 동안 교반을 실시하여 최종으로 항염증 생리활성 약물이 담지된 아텔로콜라겐-히알루론산 용액을 준비하였다.
2. 가교제 투입
준비된 상기 아텔로콜라겐-히알루론산 용액에 EDC 1.5중량%, gallocatechin 1중량%를 전기방사 직전에 투입하고 30분 동안 교반하여 가교제가 포함되어 있는 아텔로콜라겐-히알루론산 복합 방사용액을 준비하였다.
3. 나노섬유 멤브레인 제조
전기방사는 온도 25℃, 습도 40%에서 진행되었으며, 방사조건은 전압 12kV, 토출량 5㎕/min, TCD 13.5cm, 노즐게이지 25G(0.25mm)의 조건으로 전기방사를 진행하여 방사와 동시에 가교가 되도록 하여 나노섬유 멤브레인을 제작하였다. 이후 가교시간 및 용매 건조휘발을 고려하여 4시간 동안 40℃에서 보관하였다.
[실시예 2]
방사용액 제조시 아텔로콜라겐을 12.5중량%를 첨가하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 방사용액을 제조하고 전기방사하였다.
[실시예 3]
방사용액 제조시 아텔로콜라겐을 15중량%를 첨가하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 방사용액을 제조하고 전기방사하였다.
[실시예 4]
방사용액 제조시 항생제인 겐타마이신을 1중량%를 첨가하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 방사용액을 제조하고 전기방사하였다.
[실시예 5]
방사용액 제조시 항생제인 겐타마이신을 2중량%를 첨가하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 방사용액을 제조하고 전기방사하였다.
상기 제조된 나노섬유 멤브레인의 형태는 FE-SEM(Hitachi(SU8220))을 사용하여 도 1에 나타내었다.
[비교예 1]
실시예 1와 같이 방사용액에 가교제를 혼합하여 전기방사 하는 것과 달리, 가교제가 없는 방사용액을 사용하여 실시예 1과 동일한 조건으로 아텔로콜라겐-히알루론산 용액을 전기방사하여 멤브레인을 제조한 후, EDC 1.5중량%와 glutaraldehyde 0.5중량%를 에탄올과 증류수(9:1)의 혼합용액에 용해하여 준비한 가교액에 24시간 동안 침지하는 후가교 방법으로 상기 멤브레인의 가교를 진행하였다.
1. 멤브레인의 형태안정성 비교
실시예와 비교예의 멤브레인의 사진은 도 2에 나타내었으며, 실시예들과 같이 방사와 동시에 가교된 멤브레인의 경우 전기방사 후 형태변화 없이 양호하였는데 반해, 비교예 1은 독성성분이 있지만 형태안정성 확보를 위해 글루타알데히드를 조금 첨가했음에도 전기방사 후에 후가교한 멤브레인의 경우 가교용액에서 팽윤되고 형태안정성이 낮아져 건조시 방사직후 멤브레인의 형태가 사라지고 필름의 형태가 됨을 확인하였다.
이에 비교적 독성이 낮은 의료용으로 적용 가능할 만한 가교제의 적용을 위해서는 방사용액에 가교제를 첨가하여 전기방사시키는 본 발명의 실시예의 전기방사 방식을 적용하는 것이 바람직할 것으로 보이며, 비교예 1의 후가교 방식으로는 형태안정성 확보를 위해 가교성이 큰 독성의 가교제를 더욱 많이 사용해야 하므로 의료용도로 진행하기에는 부적합하다고 사료된다.
2. 나노섬유 멤브레인내 항생제의 분산정도 확인
항생제인 겐타마이신이 나노섬유에 내부에 잘 분산되어 있는지 확인하기 위하여 약물의 농도를 0.5~2중량%까지 달리한 실시예 1, 실시예 4 및 실시예 5의 멤브레인을 공초점 레이저 주사현미경(Carl zeiss(LSM 810))으로 촬영하여 도 3에 니타내었다. 그 결과 약물의 농도와 관계없이 매우 잘 분산됨을 확인하였으며, 약물의 양이 증가할수록 나노섬유 내에 더 많은 약물이 함유하고 있음을 확인하였다.
3. 나노섬유 멤브레인의 생체적합성 평가
<3-1> 세포 독성 평가
전기방사로 제조된 아텔로콜라겐-히알루론산 나노섬유 멤브레인의 세포독성을 확인하기 위하여 MTT assay을 수행하였다. 약 1g의 실시예 1의 아텔로콜라겐-히알루론산 나노섬유 멤브레인에 용출용매인 DMEM media+10% FBS(Fetal bovine serum)를 처리 후 37℃에서 24시간 동안 용출하여 용출액을 얻었다. 용출액은 100%, 50%, 25%, 12.5%, 6.25%, 3.125%, 1.5625%, 0.78125%의 농도로 희석하여 농도별 용출액을 준비하였다. MTT assay에 사용된 Raw 264.7 세포는 100㎕ 세포배양액, 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양 후 세포배양액을 제거하고 PBS(Phosphate Buffer saline)로 1번 세척 후 준비된 아텔로콜라겐-히알루론산 나노섬유 멤브레인 각 농도별로 희석된 용출액에 MTT 용액을 처리, 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 마이크로플레이트 리더기로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 독성여부는 IS0-10993-5-2009를 기준으로 평가 하였으며, 세포생존율 80% 이상일 때 독성이 없음으로 평가하였다. 그 결과, 용출액 희석 농도별 처리에 따른 세포생존율을 확인한 결과, 100~0.78125%의 희석액에서 87%이상의 세포생존율을 나타내 세포독성이 없는 것을 도 4를 통해 확인하였다.
<3-2> 세포생존율 평가
비교예 1의 나노섬유 멤브레인의 세포독성을 평가한 결과, 실시예 1의 방사액에 가교제를 미리 첨가하는 방식에 비해 세포생존율이 다소 낮았다(표 1 : 아텔로콜라겐-히알루론산 나노섬유 멤브레인 희석농도에 따른 세포생존율(세포독성)평가 결과). 이러한 비교예 1의 후가교 방식은 멤브레인 구조체 제작 후에 용액에 담가 서서히 가교하는 방식으로 가교제의 양이 많아지고, 형태안정성 확보를 위해 독성있는 글루타알데히드 등을 첨가를 하므로 이들 물질을 제거하기 위한 오랜시간 동안 충분한 투석시간이 필요하며, 투석이 완전하게 이루어지지 않으면 세포생존에 영향을 미쳐 의료용도로 다소 적합하지 않다는 것을 알 수 있었다.
| 농도 | Control | 100% | 50% | 25% | 12.5% | 6.25% | 3.125% | 1.5625% | 0.78125% |
| 실시예 1 | 100% | 87.75% | 87.96% | 88.79% | 92.16% | 92.20% | 91.99% | 91.25% | 90.63% |
| 비교예 1 | 100% | 65.45% | 66.71% | 67.25% | 70.01% | 72.13% | 74.85% | 75.62% | 77.54% |
<3-3> 항염효과 평가
항생제(겐타마이신)을 담지하고 있는 콜라겐-히알루론산 나노섬유 멤브레인의 상처 치료 효과를 검증하기 위하여 염증억제 반응시험인 NO(nitric oxide) assay 항염평가를 수행하였다. 약 1g의 실시예 1의 콜라겐-히알루론산 나노섬유 멤브레인에 용출용매인 DMEM media+10% FBS(Fetal bovine serum)를 처리 후 37℃에서 24시간 동안 용출하여 용출액을 얻었다. 용출액은 100%, 50%, 25%, 12.5%의 농도로 희석하여 농도별 용출액을 준비하였다. 시험세포주인 Raw 264.7 세포는 100㎕ 세포배양액, 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양 후 세포배양액을 제거하고 PBS로 1번 세척후 각 농도별로 희석된 용출액에 1㎍/㎖ LPS(lipopoly saccharide)을 처리하여 24시간 배양하였다. 이후 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 530nm에서 흡광도를 측정하고, 각 농도별로 NO 생성량을 농도로 환산하여 시료의 NO 억제(항염효과)가 있는지 확인하였다. 그 결과, Raw 264.7 세포에 LPS를 처리한 시료의 NO2 -농도에 비해 용출액에 LPS를 처리한 시료의 NO2 -의 농도가 낮아 항염효과가 있는 것을 도 5에서 확인하였다.
Claims (3)
- 히알루론산을 인산완충식염수(Phosphate Buffer Saline)에 교반하여 용해하여 히알루론산을 분산시킨 후, 분산된 히알루론산 용액에 아세트산 및 아틸로콜라겐을 첨가하여 아틸로콜라겐-히알루론산 용액으로 만들어 교반한 후, 항염제를 첨가하고 교반한 후, 생체친화성 가교제를 첨가하고 교반하여 방사용액을 준비한 후, 전기방사를 진행하여 방사와 동시에 가교가 진행되도록 하여 멤브레인을 제조한 후 용매를 휘발건조시키는 것을 특징으로 하는 항염증성을 포함하는 생리활성 기능성을 가지는 콜라겐-히알루론산 복합 천연고분자 기반의 창상피복재용 나노섬유 멤브레인의 제조방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 방사용액은 히알루론산 0.2~1중량%, 아틸로콜라겐 10~15중량%, 항염제 0.5~2중량%, 생체친화성 가교제 0.5~3중량%, 아세트산 1~10중량% 및 잔부로서 인산완충식염수로 이루어진 것을 특징으로 하는 항염증성을 포함하는 생리활성 기능성을 가지는 콜라겐-히알루론산 복합 천연고분자 기반의 창상피복재용 나노섬유 멤브레인의 제조방법. - 제 2항에 있어서,
상기 생체친화성 가교제는 EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide), BDDE(l,4-Butanediol diglycidyl ether), NDGA(nordihydroguairetic acid), genipin, apigenin, catechin, gallocatechin, epigallocatechin gallate, ferulic acid, quercetin, chlorogenic acid, protocatechuic acid 중 어느 하나 이상의 가교제이며, 상기 항염제는 겐타마이신(gentamicin), 스트렙토마이신(streptomycin), 아미카신(amikacin), 네오미신(neomycin), 토브라마이신(tobramycin) 중 어느 하나 이상의 항염제인 것을 특징으로 하는 항염증성을 포함하는 생리활성 기능성을 가지는 콜라겐-히알루론산 복합 천연고분자 기반의 창상피복재용 나노섬유 멤브레인의 제조방법.
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|---|---|---|---|---|
| KR20190018350A (ko) | 2017-08-14 | 2019-02-22 | 강원대학교산학협력단 | 나노피브릴 강화 고분자 수화겔 복합체 및 이의 제조방법 |
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