KR20220092493A - 국소 상처 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

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알베르토 라모스 베르니에리
마리아 데 로스 엔젤레스 라자르테
로미나 마벨 차베스 자라
니콜라스 아벨 세루시코
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콘세호 나시오날 데 인베스티가시오네스 시엔티피카스 이 테크니카스 (코니셋)
우니베르시다드 나시오날 데 투쿠만
유엔테크 아이엔씨.
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Abstract

1 종 이상의, 이미드기를 갖는 5원 또는 6원의 질소-함유 헤테로고리 화합물; 1 종 이상의 4.5 내지 6.5의 활성 pH를 가지는 이상의 데옥시리보뉴클레아제 효소; 및 1 종 이상의 카복실산을 포함하는 국소 상처 치료용 약학적 조성물; 이러한 약학적 조성물을 수득하기 위한 키트와 방법 및 상처 치료를 위한 용도.

Description

국소 상처 치료용 약학적 조성물
본 발명은 상처 치료용 국소 약학적 조성물에 관한 것이다. 나아가, 이는 또한 만성 상처의 치료에 유용한 국소 약학적 조성물 및 제형의 분야에 관한 것이다.
일련의 순서 단계와 예측 가능한 시간에 치유되지 않는 것으로 이해되는 만성 상처, 예컨대 정맥 궤양, 당뇨병성 족부 궤양, 욕창, 압박 궤양, 허혈성 궤양, 비정형 병변 등은 치유되지 않는 부상이다(1). 이는 세계 인구의 약 2%에 영향을 미치며(2) 의료 시스템에 큰 경제적 문제를 나타낸다(3). 만성 상처는 치유를 피하는 만성 염증 상태로 유지되지만(4), 치유 실패는 다인자적이다(5). 만성 상처는 과학자들에 의해 많이 연구되었고 그 결과로 치료 솔루션을 제공하려는 많은 제품이 존재한다. 그러나 현재까지 이러한 유형의 상처에 대한 총체적이고 효과적인 치료법은 없다.
시장에는 다양한 만성 상처를 위한 제품이 있다. 의사는 보통 상처 감염, 상처 괴사조직 제거 및 상처 관리를 위한 요법의 조합을 사용한다(6). 이러한 종류의 제품은 치유를 보장하지 않으며 의사는 종종 피부 대체물(7), 진공 보조 봉합(8), 성장 인자(9) 및 고압 요법(10)도 반복해 사용해야 한다. 그러나, 그들 중 어느 것도 동시에 모든 치료 요구 사항을 제공할 수 없고 따라서 제한된 치료 효능도 보여준다(11).
상처 감염에 대해 언급될 수 있는 제품들 중: 1) 은(silver)은 광범위한 활성을 가지며 다양한 형태로 제공될 수 있다. 그러나 효능을 유지하기 위해서는 충분히 높은 농도의 은이 지속적으로 방출되어야 한다. 예를 들어, 제대로 작동하려면 질산은은 하루에 12번 투여되어야 한다(12). 나아가, 최근 검토에서는 실버 설파디아진이 실무자들 사이에서 일반적으로 사용됨에도 불구하고 전반적인 상처 치유에 영향을 미친다는 설득력 있는 증거를 찾지 못했다(13). 2) 아이오딘-함유 화합물(예: 카덱소머 아이오딘 - 마이크로비드로 형성된 전분 격자 내의 아이오딘)은 상처 치유에 오랫동안 사용되어 왔지만, 특히 넓은 상처 부위에 대한 아이오딘-함유 화합물의 독성에 대한 몇 가지 우려가 있었다(14, 15). 3) 상처 부위에 도포하기 위한 항생제의 국소 제형도 개발되었다. 그러나, 최근 연구에서 항생제 연고의 일상적인 투여는 더 나은 결과를 가져오지 않고 종종 환자의 불편함과 항생제 내성 및 접촉성 피부염의 가능성을 초래했다(16-18).
만성 상처에 있는 대부분의 병원체는 함께 붙어 바이오필름이 될 수 있고, 이는 고분자 기질을 둘러싸고 있는 촘촘하게 뭉친 덩어리이므로, 항생제와 면역 체계에 의한 파괴를 피하는 데 도움이 된다. 이것은 상처 치유에 대한 물리적 장벽을 생성할 뿐만 아니라 염증 단계의 정상적인 해결이 연장될 수 있고, 바이오필름을 해결하는 것이 상처 치유의 주요 과제가 되었다. 그러나, 만성 상처에 대한 광범위한 박테리아 스펙트럼을 가진 항-바이오필름 제품은 없다. 사실, 만성 상처에 효과적이기 위해서 제품은 정균, 살균, 바이오필름 억제 및 바이오필름 파괴 특성을 동시에 제공할 수 있다.
상처 괴사조직 제거술(19)은 감염의 연료로만 작용하는 괴사 파편이 유지되어 상처 치유를 방해하게 하는 대신, 상피 세포 이동을 통해 증식하고 상처를 채울 수 있는 건강하고 잘 관류된 조직을 노출시키기 위해 비-생육가능성 조직 물질을 제거하는 것을 포함한다. 외과적 괴사조직 제거술은 상처 치료의 중요한 부분이지만, 감염, 통증, 비용 및 환자의 불편함 등 외과적 시술의 모든 불편함을 가지고 있다. 자가분해 괴사조직 제거는 습한 상처 환경에서 생성되고 일부 유형의 상처 드레싱에서 볼 수 있는 피브린 분해와 관련된 내인성 효소의 자체 활성화를 말한다. 그러나, 그것은 확실히 죽은 조직을 제거할 수 없기 때문에 외과적 괴사조직 제거술의 적절한 대체제가 될 수 없다. 따라서, 침습적 시술과 환자의 불편함 없이 정확한 괴사조직 제거를 가능하게 하는 제품은 없다.
상처 치료 드레싱(20)은 관련된 이환율을 감안할 때 만성 상처 치료에 매우 중요하다. 그러나, 모든 상처 관리 드레싱은 활성 제품이 아니며(치유 과정을 가속화할 수 없음) 치유 과정이 진행되는 동안 상처를 보호하는 데만 도움이 된다. 게다가, 다음과 같은 문제로 인해 어떤 종류의 만성 상처에도 불명료하게 사용할 수 없다: 1) 상처에 남아있는 제한된 양의 삼출물은 자가분해 괴사조직 제거를 허용하여 성공적인 상처 치유를 더욱 촉진하는 역할을 한다. 기존의 건조 거즈 상처 드레싱(예: Curity, Vaseline 거즈, Xeroform)은 이 과정을 저하시킬 수 있으며 제거할 때 더 많은 부상을 유발할 수 있다. 2) 접착력이 낮은 드레싱과 반투과성 필름(예: Bioclusive, Blisterfilm, Cutifilm, Flexigrid, OpSite, Tegaderm)은 액체 및 미생물 침투를 제한하지만, 공기와 수증기는 통과할 수 있도록 하는 기본 유형의 상처 드레싱을 나타낸다. 따라서, 전체 중 소수에 해당하는 비삼출성 상처에만 사용할 수 있다. 3) 하이드로콜로이드(예: Aquacel, Comfeel, DuoDERM, Granuflex, Tegasorb)는 일정량의 삼출물을 흡수해 습기를 유지할 수 있다. 그러나 불침투성으로 인해 공기 교환을 방지하므로 삼출성 상처에 사용해서는 안 된다. 게다가, 변경 사이에 오랜 시간이 걸린다. 4) 하이드로겔(예: Carrasyn, Curagel, Nu-Gel, Purilon, Restore, SAF-gel, XCell)은 건조 상처의 수분 촉진을 돕기 위해 추가로 사용될 수 있다. 이들은 제거하고 변경하기 쉽지만 과다 수분을 유발하여 치유를 지연시킬 수 있다. 5) 알지네이트 드레싱(예: Algisite, Kaltostat, Sorbsan, Tegagen)은 해조류에서 추출한 부직포 섬유로, 다량의 유체를 흡수하는 능력 때문에 일반적으로 삼출이 심한 상처에 사용된다. 이와 같이, 부작용은 알지네이트로 덮인 건조 상처에서 볼 수 있으며, 예를 들어 지혈이 될 수 있다(21). 6) 알지네이트 드레싱과 유사한 특성 및 부작용을 갖는 하이드로파이버(예: Aquacel Hydrofiber). 7) 폼(예: 3M Adhesive Foam, Allevyn, Lyofoam, Tielle)은 드레싱 교체 시 외상을 최소화하지만, 흡수 능력이 제한적이며 보통 정도의 삼출성 상처에만 사용할 수 있다. 8) 폼이나 항균성 물질, 예컨대 은, 베타인, 키틴, 또는 폴리헥사메틸렌 비구아나이드(Kendall AMD)가 포함된 하이드로겔과 같은 기존 상처 드레싱의 조합이 있다. 이러한 물질은 상처 치유에 대한 광범위한 적용에는 적합하지 않을 수 있지만 만성 하지 궤양과 같이 감염이 문제가 될 수 있는, 특히 바이오필름 형성의 면에서 적합할 수 있다. 그러나, 이들이 바이오필름 형성을 억제할 수는 있지만 진정한 치료 요건인 바이오필름 파괴를 일으킬 수는 없다. 9) 콜라겐 제품: 이는 난치성 상처 및 만성 궤양에 사용된다. 자유 라디칼 및 프로테아제와 같은 부정적인 반응기를 고갈시키면서 상처 치유에 중요한 세포 유형을 끌어들이는 환경을 촉진하는 데 도움이 되는 것으로 여겨진다(22). 그러나, 이 콜라겐은 상처 입은 조직의 새로운 콜라겐 생성을 위한 직접적인 대체제로 삼을 것이 아니었다(소 및 돼지 콜라겐을 비롯한 여러 소스에서 유래할 수 있음). 게다가, 그들은 감염된 상처에 유용하지 않다.
피부 대체물(7)은 일반적으로 상처에 부착할 수 있는 재료와 결합된 생물학적 유래 물질로 구성된다. 전반적으로, 이러한 드레싱은 비용이 많이 들고, 널리 채택되는 데 상당한 장벽이 된다. 게다가, 이들은 감염과 항원성에 높은 위험을 나타낸다. 시장에서 여러 피부 대체물을 찾을 수 있다: 1) 여러 옵션이 돼지 콜라겐 또는 폴리펩타이드(Biobrane 및 TransCyte)로 코팅된 메쉬 소재에 집중했지만, 후자는 신생아 섬유아세포 또는 돼지 이종이식편(EZ Derm)도 포함한다. 그러나, 이들은 얼굴 화상에 대해서만 비용-효율적이며 일반적인 적용에는 적합하지 않는다고 입증되었다. 2) 피부이식편은 신생아 포피조직에서 유래한 섬유아세포, 세포외기질, 및 생체흡수성 폴리글락틴 메쉬를 이용하여 개발된 소재이다. 그러나, 거부 반응 및 과민 반응(소 혈청이 제제에 미량 포함될 수 있음)에 높은 위험을 보였다. 3) 배양된 섬유아세포 및 소 I형 콜라겐의 진피층이 배양된 케라티노사이트의 표피층과 결합된 동종 이중층 배양 피부 등가물인 Apligraf. 이것은 상당한 비용이 드는데, Apligraf의 단일 적용 비용은 7.5-cm-직경-원형 디스크에 대해 US$1000가 넘을 수 있고 난치성, 만성, 비-치유성 상처에만 비용 효과적일 수 있어, 이러한 제품의 일반적인 적용 가능성을 다소 제한할 수 있기 때문이다. 4) Omnigraft는 콜라겐, 글리코사미노글리칸, 및 콘드로이틴-6-설페이트로 구성된 무세포 이중층 기질이며 장벽 기능을 위한 실리콘 층이 있다. 그러나, Omnigraft는 소 콜라겐이나 콘드로이틴 물질에 대한 과민성이 알려진 환자에게 사용해서는 안 되며 임상적으로 진단된 감염된 상처에도 사용해서는 안 된다.
진공 보조 봉합(VAC)(8)은 습한 환경을 유지하고, 혈류를 최적화하고, 삼출물을 제거하고, 상처 봉합을 촉진하기 위해 압력을 가함으로서, 이러한 장치는 만성 상처에서 결핍될 수 있는 수많은 요인을 완화할 수 있다. 그러나, 음압 드레싱이 노출된 혈관, 뼈 또는 신경과 직접 접촉하는 경우 위험할 수 있다. 게다가, 골수염이 있는 경우나 환자가 아크릴계 접착제에 알레르기나 과민성이 있는 경우에는 금기이다.
성장 인자(9), 만성 상처는 성장 인자와 사이토카인에 많은 섭동을 포함하므로 이러한 문제 중 일부를 해결하는 것이 도움이 될 수 있다. 그러나, 너무 많은 요인이 결핍되고 조절되지 않는 환경에서 단순히 하나를 교체하는 것만으로는 만성 상처 표현형을 구할 수 없다. 사실, 이중 맹검 무작위 대조 시험에서 치유를 향상시키는 것으로 입증된 이러한 치료법 중 유일한 것은 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)(Regranex becaplermin)이며 그 결과는 다소 미미했다.
상처 산소 공급이 만성 상처에 대한 가장 중요한 치료 표적 중 하나임에도 불구하고, 제자리(in situ) 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 증가시켜 혈관 생성을 증가시키는 제품은 없다.
고압산소(10)는 다른 기능 중에서 섬유아세포 증식 촉진, 면역 기능 강화, 및 혈관 신생 자극이 가능하다는 원리에 따라 상처 치유에 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 이상들이 반드시 실제로 실현되는 것은 아니어서, 그 사용에 있어 어느 정도 논란이 되고 있다. 중요하게도, 이 치료법은 고압 산소 챔버에 있는 환자에게 적용되는데, 산소의 국소 전달이 효과적이지 않아 근시, 및 발작으로 이어지는 뇌의 산소 독성, 및 기흉을 포함하는 심각한 부작용을 유발할 수 있기 때문이다.
AR093779와 같이 특정 접근법을 교시하는 여러 발명 특허가 찾아질 수 있으며, 그의 일부 발명자는 본 발명의 발명자와 동일하다. 본 출원은 만성 상처의 치료에서 성공적으로 제안된 Lactobacillus(락토바실러스) 발효물의 상청액을 교시한다(23-25). 본 문서에서는, 위에서 언급한 상청액을 "LAPS"라고 지칭할 것이다. 이 상청액의 기술적 문제는 발효 상청액이기 때문에 생산 조건에 따라 불확실하고 가변적인 조성을 갖는다는 점이다. 게다가, 치료 기능이 60일을 넘지 않는다는 증거가 있어, 시간 경과에 따른 안정성에 한계가 있다.
EP 0848 951 B1은 당뇨병성 족부 궤양 및 압박 궤양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 만성 상처의 치료 또는 예방용 조성물의 제조를 위한 N-아세틸 시스테인(NAC)의 용도를 제공하며, 여기서 조성물은 만성 궤양에 국소 투여하기 위한 연고의 형태이고, 연고는 다음으로 구성된다: 1) 0.01 내지 1% w/w의 NAC 또는 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 파생물 및 2) 캐리어: 셀룰로오스를 함유하는 하이드로겔(즉, 하이드록시에틸셀룰로오스), 폴리아크릴산의 하이드로겔(즉, carbopol) 또는 약학적 제제에 사용되는 크림/연고(예: cetomacrogol). 상기 캐리어는 증점제 또는 자극제로서의 알지네이트, 방부제(예: 벤질 알코올), pH 조절용 완충제(예: Na2HPO4/NaH2PO4), 삼투압 조절제(예: NaCl), 안정제(예: EDTA)를 포함할 수 있다. NAC를 기반으로 하는 청구된 만성 상처 치료용 조성물은 MMP를 억제함으로써 치유-촉진 작용을 보인다. 그러나, 이들의 절차 1에서, 이들은 NAC가 세포간 접착 분자-1(ICAM-1) 발현의 농도 의존적 억제를 나타낸다는 것을 입증했다. 이것은 만성 상처 치료에 바람직하지 않은데, ICAM-1이 없을 때 상처 치유가 지연된다는 것이 이전에 입증되었기 때문이다(26).
US 9,211,305 B2는 당뇨병성 족부 궤양의 치료를 위한 글리코사미노글리칸의 조성물을 교시하며, 특히 만성 궤양, 특히 당뇨병성 족부 궤양의 치료에서 저분자량 헤파린(LMWH) 및 초저분자량 헤파린(VLMWH)에 관한 것이며, 보다 구체적으로 만성 궤양, 특히 당뇨병성 족부 궤양 및 압박 궤양 치료용 의약품 제조에 사용된다. 구체적으로, 이 특허는 만성 상처를 치료하는 방법을 청구하지만 이 치료법은 항균 특성(정균, 살균, 항-바이오필름)을 제공하지 않으며 항산화 또는 혈관신생 특성도 제공하지 않는다. 따라서 다른 제품과 함께 사용해야 한다.
US 10,285,938 B2 항균 펩타이드는 면역계 경로에서 비교적 새로운 발견을 나타낸다. 합성 공학적으로 설계된 항균 펩타이드의 최근 디자인은 상대적으로 증가된 효능 및 효험/내약성, 향상된 특이성, 및 감소된 독성을 입증했다. 그러한 펩티드 중 하나인 XYLENTRA®는, 대형 + 병원체에 대한 중요한 시험관내(in vitro) 연구에서 상당한 가능성을 보여주었다. 추가로, 광범위한 동물 연구에서 XYLENTRA®가 수많은 병원체에 대한 항균 펩타이드임을 보여주었다. XYLENTRA® 펩타이드는 용질 저항성도 있다. XYLENTRA® 펩타이드는 시험 유기-체 Staphylococcus aureus(황색포도상구균) MTCC 96 및 Pseudomonas aeruginosa(녹농균)에 대해 상당한 항균 활성을 보였다. MTCC741. 명세서에 자세히 설명된 프로토콜을 사용하여 펩타이드로 처리한 동물에서 미-생물 개체군 수준의 실질적인 감소가 관찰되었다. 구체적으로, 그들은 전술한 항균 펩타이드를 사용하는 상처 치료 방법을 청구한다. 그러나, 이 방법은 항산화, MMP 억제, 혈관신생 등과 같은 치유-촉진 특성을 고려하지 않는다. 게다가 항균 특성과 관련하여, 그들은 바이오필름에 대한 효과(억제 및/또는 파괴)가 입증되지 않았다. 따라서, 다른 제품과 함께 사용해야 한다.
WO 2019/193333A1은 트리클로산(2,4,4 트리클로로 하이드록시 디페닐 에테르) 및 만성 상처 치료 및 특히 당뇨병성 족부 궤양 치료에 사용하기 위한 증점제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 트리클로산과 관련된 항균 특성을 갖는 국소 조성물. 활성 치유 촉진 성분: 피마자유, 호호바 오일, 알로에 베라 10:1; 활성 항균 성분: 트리클로산; 유화제: 스테아르산, GMSSE, 세틸 팔미테이트, 실리콘 유체 200 100 CS, 중질 유동 파라핀, 모노프로필렌글리콜. 겔화제: Carbopol 980 5%, 트리에탄올아민, 선택적 방부제: Nipastat 그러나, 이 조성물은 항산화, MMP 억제, 혈관신생 등과 같은 치유-촉진 특성을 고려하지 않는다. 게다가 항균 특성과 관련하여, 그들은 바이오필름에 대한 효과(억제 및/또는 파괴)를 나타내지 않는다. 따라서, 다른 제품과 함께 사용해야 한다.
산화 스트레스를 표적으로 삼는 것이 손상된 상처 치유의 치료에 핵심 요소라는 것을 확인하는 많은 저자가 있다(27-29). 이와 관련하여, 생체내(in vivo) 적용할 수 있는 두 가지 유형의 항산화제인 항산화 효소(예컨대 SOD, 카탈라제, 퍼옥시다제, 및 글루타티온 퍼옥시다제) 및 비효소적 항산화제(예컨대 비타민 C, 산화질소, 금속-결합 단백질 등)가 있다(27). 그러나, 항산화제에 대한 대부분의 임상 시험은 경구 투여로 제한되었다. 예를 들어 경구로 보충된 아스코르브산이 치유에 미치는 영향이 연구되었다(28, 29). 다른 한편, 만성 상처 치료를 위한 식물 추출물의 항산화제 또는 하이드로겔의 효소적 항산화제의 국소 적용이 제안되었다(27). 비효소적 항산화제가 만성 상처에 국소적으로 적용된 유일한 보고된 임상 시험은 강력한 활성산소(ROS) 제거제인 5% DMSO를 함유한 크림으로 수행되었으며 이 치료는 궤양 발생을 감소시킬 수 없었다(31). 더욱이, 발 뒤꿈치와 발목 부상의 발생률에 해로운 영향이 나타났다. 저자들은 이 예상치 못한 결과를 설명하기 위해 몇 가지 가설을 제안했는데, 특히 DMSO의 가능한 산화-촉진 활성을 불러일으켰다(31). 생리학적 농도에서, DMSO와 아스코르브산은 혈장에서 강력한 자유 라디칼 제거제로서, ROS로 인한 산화 손상으로부터 세포를 보호한다(32).
Ajwee DM et al. (2012)은 에토숙시미드와 페노바르비탈이 콜라겐화를 향상시켜 상처 치유를 촉진한다고 교시한다(33). 그들은 알비노 쥐 모델의 절개 상처에 에토숙시미드(Etho)를 적용했다. 그들은 연질 파라핀의 에토숙시미드-함유 연고 10% w/w(80 mg/mL)가 콜라겐화를 향상시켜 상처 치유를 크게 촉진한다는 것을 입증했다. 그들은 하루에 150 mg의 연고를 도포했다. 이는 하루에 15 mg의 Etho를 의미한다. 알비노 쥐의 체중이 140~180 g이고 이들 동물의 기준 체적량이 킬로그램당 50 mL임을 고려하면, 이 쥐의 대략적인 체적량은 10 mL이다. 매일 적용되는 Etho의 100%가 혈류로 이동되었다고 고려하면, 치료법 첫날 Etho는 15 mg/10 mL의 혈장 농도에 도달한다. 이는 1.5 mg/mL 또는 1500 μg/mL를 의미한다. 인간에서, 허용되는 치료 수준은 40 내지 100 μg/m이다(Zarontin 장래성 FDA 참조). 이 농도 이상에서는, 간독성, 백혈구 감소증, 혈소판 감소증, 진정, 및 메스꺼움이 관찰된다. 게다가, 이 조성물은 항균 특성(정균, 살균, 항-바이오필름)이 입증되지 않았다. 따라서, 상처 치료를 위해 다른 제품과 함께 사용해야 한다.
Goldberg SR et al. 그들의 리뷰(2020)에서 상처가 만성화되는 5가지 핵심 사항이 있음을 나타낸다(34):
1) 허혈. 허혈은 조직 손상, 괴사 및 박테리아에 의해 빠르게 군집화되는 개방 상처의 발달을 일으킨다.
2) 감염. 감염은 만성적이고 통제되지 않는 염증의 단계를 설정한다. 대부분의 만성 상처는 자연적으로 다균성이며 Staphylococcus 및 Pseudomonas 종이 우세하다.
3) 바이오필름 형성. 전염증 반응은 박테리아와 염증이 있는 궤양 부위를 차단하고 보호하는 바이오필름의 형성에 의해 지속된다. 바이오필름은 숙주의 면역 반응을 자극하는 동시에 항균 요법에 직접 저항하고 만성 염증을 자극한다.
4) 만성 염증 및 조직 손상. 숙주의 염증 세포가 손상된 조직을 제거하려고 할 때, 활성산소와 MMP와 같은 프로테아제가 방출되어, 추가 조직 손상을 유발한다. MMP의 과발현은 세포외 기질에 손상을 일으키고 만성, 비 치유성 상처의 근본적인 병리를 유발한다. MMP의 과잉 생산은 또한 상처 치유에 필요한 혈소판-유래 성장 인자 및 변형 성장 인자-b와 같은 중요한 성장 인자를 파괴한다.
5) 감소된 유사분열 활성. 격렬한 염증 환경으로 인해, 잔류 결합 조직 세포는 유사분열 활성이 감소되어 노화된다.
Goldberg et al.은 염증과 조직 파괴의 악순환이 박테리아, 손상되고 괴사된 조직을 제거하고 염증을 줄이기 위해 공격적인 임상 전략을 사용할 때까지 지속된다는 것을 나타낸다. 그들은 또한 기술 면에서 환자의 상처를 관리하는 최선의 접근 방식은 DIME 지원 제품 및 서비스 상처 관리 지침(35)임을 나타낸다. 이 가이드라인은 상처를 평가하고 치료 효과를 높이기 위해 동시에 사용해야 하는 모든 제품과 서비스를 인식하기 위한 포괄적인 접근 방식으로 구성되어 있다. 이 가이드라인에서 볼 수 있듯이, Goldberg가 제시한 5가지 핵심 포인트를 동시에 제공할 수 있는 제품은 시장에 없다(35).
그렇기 때문에 현재의 치료법은 보통 상처 감염, 상처 괴사조직 제거 및 상처 관리에 대한 요법을 조합하여 사용한다. 이러한 종류의 제품은 치유를 보장하지 않으며 의사는 종종 피부 대체물, 진공 보조 봉합, 성장 인자 및 고압 요법을 반복해 사용해야 한다. 그러나, 그들 중 어느 것도 동시에 모든 치료 요구 사항을 제공할 수 없고 따라서 제한된 치료 효능도 보여준다.
전문가들은 치료에 다음과 같은 치료 요구 사항이 동시에 모두 포함될 때 치료 효과가 증가할 것이라고 한다(36):
a) 감염 관리 및 바이오필름 제거(37, 38),
b) 삼출물의 양 및 구성 관리(39),
c) 특정 성장 인자 재구성(9),
d) 염증 관리(4) 및 기질 금속단백분해효소 축적(40) 및 산화 스트레스(29)와 같은 해로운 영향 및
e) 통증 조절(41).
본 발명은 만성 상처 치료용 조성물을 제공함으로써 배경기술에 기재된 문제를 해결하고, 조성물은 동시에 혈관신생, 광범위한 정균, 살균, 바이오필름 억제 및 바이오필름 파괴(만성 상처에서 가장 고립된 박테리아 S. aureus 및 P. aeruginosa 포함), 기질 금속단백분해효소(MMP) 억제(산성화 및 킬레이트화 특성을 통해), 상처 부위의 콜라겐 및 알파 액틴 형성 및 치유-촉진 특성을 제공한다.
게다가, 본 발명은 놀랍게도 그 성분들의 조합에 의해 생성되는 기능적 시너지를 보이는 만성 상처 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 조합하여 만성 상처의 치료적 치료법 문제에 대한 해결책을 구성하는 약학상 용도를 위한 성분을 포함하는 조성물 및 제형을 제공한다. 배경기술에서 제기된 문제를 해결한다.
본 발명의 목적은 상처 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 만성 상처 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 정맥 궤양, 동맥 궤양, 압박 궤양(욕창); 당뇨병성 족부 궤양 및 기계적 또는 바이오필름-형성 박테리아의 중복 감염에 따른 수술 후 상처를 치료하는 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 제자리 제제를 위한 국소 전달용 제형을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상처 치료를 위한 제자리 제조 겔 제형을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 조성물을 정교화하는 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상처 치료를 위한 제자리 제조 겔 제형을 가능하게 하는 장치를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 정맥 궤양, 동맥 궤양, 압박 궤양(욕창); 당뇨병성 족부 궤양 및 기계적 또는 바이오필름-형성 박테리아의 중복 감염에 따른 수술 후 상처를 포함한 만성 상처를 가진 포유류를 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 한 측면에서, 본원은 적어도 이미드기를 갖는 5원 또는 6원의 질소-함유 헤테로고리 화합물; 1 종 이상의 4.5 내지 6.5의 활성 pH를 가지는 이상의 데옥시리보뉴클레아제 효소; 및 1 종 이상의 카복실산을 포함하는 국소 상처 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 여기서 이미드기를 갖는 5원 또는 6원의 질소-함유 헤테로고리 화합물이, 에토숙시미드, 바르비투르산, 페노바르비탈, 5,5-디에틸 바르비투르산, 5-에틸-5-(1-메틸부틸)바르비투르산, 펜토바르비톤, 펜토바르비탈, 넴부탈, 5-에틸-5-(1-메틸프로필)바르비투르산, 부토바르비탈, 부티솔, 5-알릴-5-(1-메틸부틸)-바르비투르산, 세코바르비탈, 세코날, 페니토인, 하이단토인, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 이미드기를 갖는 5원 또는 6원의 질소-함유 헤테로고리 화합물을 포함하고; 여기서, 바람직하게는, 이미드기를 갖는 5원 또는 6원의 질소-함유 헤테로고리 화합물이 에토숙시미드이다. 여기서 데옥시리보뉴클레아제 효소가, DNase, rh-도르나제 알파(rh-dornase alfa), 소 췌장(bovine pancreatic) DNase I, DNase II, 원핵성(prokaryotic) DNase II 또는 진핵성(eukaryotic) DNase II, DNase II 알파, DNase II 베타, 돼지 비장(porcine spleen) DNase II, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 데옥시리보뉴클레아제 효소를 포함하고; 여기서, 바람직하게는, 데옥시리보뉴클레아제 효소가 재조합 인간 도르나제-알파이다. 여기서 카복실산이, 시트르산, 젖산, 아세트산, 포름산, 말산, 타르타르산, 살리실산, 옥살산, 벤조산, 프로피온산 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 카복실산을 포함하고; 여기서, 바람직하게는, 카복실산이 젖산이다.
본 발명의 다른 실시양태에서 상기 약학적 조성물은 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 60, 소르비탄 트리스테아레이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 옥톡시놀-9, 노녹시놀-9, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 인장 활성제를 추가로 포함하고; 여기서, 바람직하게는, 인장 활성제는 폴리소르베이트 80이다.
본 발명의 다른 실시양태에서 상기 약학적 조성물은 에틸렌 글리콜 테트라아세트산, 에틸렌디아민테트라아세트산, 디메르캅토숙신산, 2,3-디메르캅토-1-프로판술폰산, 리포산(1,2-디티올-3-발레르산), 옥살산, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 착물 형성 산을 추가로 포함하고; 여기서, 바람직하게는, 착물 형성 산은 에틸렌디아민테트라아세트산이다.
본 발명의 다른 실시양태에서 상기 약학적 조성물은 요산, 아스코르브산, 리포산 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 친수성 환원산을 추가로 포함하고; 여기서, 바람직하게는, 친수성 환원산은 아스코르브산이다.
본 발명의 다른 실시양태에서 상기 약학적 조성물은 셀룰로오스, 나노-결정질 셀룰로오스, 세균성 셀룰로오스, 하이드록시에틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 카복시메틸 셀룰로오스, 카보폴 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 겔화제를 추가로 포함하고; 여기서, 바람직하게는, 겔화제는 하이드록시에틸 셀룰로오스이다.
본 발명의 다른 실시양태에서 상기 약학적 조성물은 아세트산 0.2 M / 아세트산 나트륨 0.2 M: 비율 2.78 대 0.66%(v/v) pH = 4.2 내지 4.8; 아세트산 0.10 M / 아세트산 나트륨 0.01 M: 비율 1.05 대 10.05%(v/v) pH = 5,6; 일염기성 인산 칼륨 0.05 M pH = 4.5; 일염기성 인산 칼륨 0.36 M / 인산 이나트륨 0.07 M: 비율 4.92 대 0.98%(p/v) pH = 5,7; 일염기성 인산 칼륨 0.36 M / 인산 이나트륨 0.10 M: 비율 4.92 대 1.49%(p/v) pH = 6,0; 시트르산 0.31 M / 인산 이나트륨 0.20 M: 비율 2.99 대 1.42%(p/v) pH = 5.8; 시트르산 0.10 M / 시트르산 나트륨 0.03 M: 비율 1.92 a 0.77%(p/v) pH = 5,8; 쇠렌센 인산 완충액(
Figure pct00001
): 일염기성 인산나트륨 0.2 M/인산 이나트륨 2.3 M: 비율 1.2 대 16.33%(p/v) pH = 5,8; 행크스 평형 염액(Hank's balanced salt solution)(HBSS) : 염화 나트륨 0.14 M(0.800%), 염화 칼륨 5 mM(0.040%), 염화 칼슘 1 mM(0.014%), 황산 마그네슘 칠수화물 0.4 mM(0.010%), 염화 마그네슘 육수화물 0.5 mM(0.010%), 인산 이나트륨 이수화물 0.3 mM(0.006%), 일염기성 인산 칼륨 0.4 mM(0.006%), 포도당 6 mM(0.100%), 중탄산 나트륨 4 mM(0.035%): pH = 5.7; 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES) 1 M(pH = 6.5); 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 나트륨염, 4-모르폴린에탄술폰산(MES 나트륨염) 0.5 M(pH 5.5 - 6.7); N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산 나트륨염(BES) 0.5 M(pH = 6.0); N-(2-아세트아미도)-2-아미노에탄술폰산(ACES) 0.5 M(pH = 6.0); 2,2'-[(2-아미노-2-옥소에틸)이미노]디아세트산(ADA) 0.2 M(pH = 6.0); 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산)(PIPES) 0.5 M(pH = 6.0 - 6.8); 3-모르폴리노-2-하이드록시프로판술폰산(MOPSO) 0.2 M(pH = 6.0); 생리 식염수(0.9%) / MgCL2(5mM). pH 5.5; 1 M NaHCO3 용액 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 용액을 추가로 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태에서 상기 약학적 조성물은 약 4.5 내지 약 6.8의 pH를 가진다.
본 발명의 다른 실시양태에서 상기 약학적 조성물은 이미드기를 갖는 5원 또는 6원의 질소-함유 헤테로고리 화합물 1 종 이상을 약 0.5 내지 약 50 mg/mL; 바람직하게는 약 0.5 내지 약 30 mg/mL; 더욱 바람직하게는 약 0.5 내지 약 3 mg/mL를 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태에서 상기 약학적 조성물은 1 종 이상의 데옥시리보뉴클레아제 효소 약 0.5 내지 약 4000 μg/mL; 바람직하게는 약 1 내지 약 1000 μg/mL; 더욱 바람직하게는 약 1 내지 약 4 μg/mL; 더욱 바람직하게는 약 0.97 내지 약 3.9 μg/mL를 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태에서 상기 약학적 조성물은 1 종 이상의 카복실산 약 1 내지 약 15 mg/mL; 바람직하게는 약 1 내지 약 9 mg/mL; 더욱 바람직하게는 약 1.6 내지 약 9 mg/mL를 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태에서 상기 약학적 조성물은 1 종 이상의 인장 활성제 약 5 mg/mL 이하, 더욱 바람직하게는 약 3 mg/mL 이하를 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태에서 상기 약학적 조성물은 1 종 이상의 착물 형성 산 약 1 mg/mL 이하, 더욱 바람직하게는 약 0.75 mg/mL 이하를 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태에서 상기 약학적 조성물은 1 종 이상의 친수성 환원산 약 3 mg/mL 이하, 더욱 바람직하게는 약 2.5 mg/mL 이하를 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태에서 상기 약학적 조성물은 1 종 이상의 겔화제 약 25 mg/mL 이하, 더욱 바람직하게는 약 17 mg/mL 이하를 포함한다.
본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서 상기 약학적 조성물은 용액에 에토숙시미드, 재조합 인간 도르나제-알파 및 젖산을 포함한다.
본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서 상기 약학적 조성물은 에토숙시미드, 재조합 인간 도르나제-알파, 젖산 친수성 환원산, 폴리소르베이트 80, 아스코르브산, 에틸렌디아민테트라아세트산, 하이드록시에틸 셀룰로오스 및 pH 5.5의 생리 식염수 0.9% 및 MgCl2 5 mM을 포함하는 용액을 포함한다.
본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서 상기 약학적 조성물은 에토숙시미드 약 0.5 내지 약 30 mg/mL; 재조합 인간 도르나제-알파 약 1 내지 약 4 μg/mL; 젖산 약 1 내지 약 9 mg/mL; 약 2.5 mg/mL 이하의 아스코르브산; 약 3 mg/mL 이하의 폴리소르베이트-80; 약 0.75 mg/mL 이하의 에틸렌디아민테트라아세트산; 약 17 mg/mL 이하의 하이드록시에틸 셀룰로오스인 수용액을 포함한다.
본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서 상기 약학적 조성물은 에토숙시미드 약 0.5 내지 약 3 mg/mL; 재조합 인간 도르나제-알파 약 0.97 내지 약 3.9 μg/mL; 젖산 약 1.6 내지 약 8.7 mg/mL; 약 2.5 mg/mL 이하의 아스코르브산; 약 3 mg/mL 이하의 폴리소르베이트-80; 약 0.75 mg/mL 이하의 에틸렌디아민테트라아세트산; 약 17 mg/mL 이하의 하이드록시에틸 셀룰로오스의 수용액을 포함한다.
본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서 국소 상처 치료용 약학적 제형 키트는 본 발명의 약학적 조성물을 수득하기 위한 사용 이전에 혼합하기 위한 제1 조성물 및 제2 조성물을 포함하고, 여기서: 제1 조성물은 고체이고 데옥시리보뉴클레아제 효소 및 겔화제 분말을 포함하고; 제2 조성물은 이미드기를 갖는 5원 또는 6원의 질소-함유 헤테로고리 화합물 1 종 이상 및 1 종 이상의 카복실산을 포함하는 수성 액체이고; 제2 조성물은 4.5 내지 6.8의 pH를 갖는다.
본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서 국소 상처 치료용 약학적 제형 키트는 사용 이전에 혼합하기 위한 제1 조성물, 제2 조성물, 및 제3 조성물을 포함하고, 여기서: 제1 조성물은 고체이고 겔화제 분말을 포함하고; 제2 조성물은 고체이고 데옥시리보뉴클레아제 효소를 포함하고; 제3 조성물은 이미드기를 갖는 5원 또는 6원의 질소-함유 헤테로고리 화합물 1 종 이상 및 1 종 이상의 카복실산을 포함하는 수성 액체이고; 제3 조성물은 4.5 내지 6.8의 pH를 갖는다.
본 발명의 다른 실시양태에서 약학적 조성물 제형 키트는 각각 밀폐되고 분리된 용기에 담긴, 제1 조성물, 제2 조성물, 및 제3 조성물을 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 약학적 제형을 제조하는 방법으로서 하기 단계를 포함한다:
a. 제1 조성물을 제2 조성물과 접촉시키는 단계;
b. 혼합 및 진탕하여 겔 약학적 조성물을 수득하는 단계.
본 발명의 또 다른 목적은 발명의 약학적 제형으로부터 발명의 조성물을 제조하기 위한 방법으로서 사용 이전에 혼합되는 제1 조성물, 제2 조성물, 및 제3 조성물을 포함하고, 여기서 제1 조성물은 고체이고 겔화제 분말을 포함하고; 제2 조성물은 고체이고 데옥시리보뉴클레아제 효소를 포함하고; 제3 조성물은 이미드기를 갖는 5원 또는 6원의 질소-함유 헤테로고리 화합물 1 종 이상 및 1 종 이상의 카복실산을 포함하는 수성 액체이고; 제3 조성물은 4.5 내지 6.8의 pH를 갖고,
a. 제3 조성물을 제2 조성물과 접촉시키는 단계;
b. 제3 조성물을 제2 조성물과 혼합 및 진탕하는 단계;
c. 제1 조성물을 단계 b에서 수득한 혼합물과 접촉시키는 단계;
d. 혼합 및 진탕하여 겔 약학적 조성물을 수득하는 단계
를 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 약학적 조성물을 상처에 적어도 1일 1회 도포하는 것을 포함하는 포유동물의 상처를 치료하는 방법이다.
본 발명의 다른 실시양태에서 상기 상처는 당뇨병성 족부궤양, 정맥 궤양, 동맥 궤양, 압박 궤양, 바이오필름-형성 박테리아의 중복 감염을 특징으로 하는 기계적 상처, 또는 바이오필름-형성 박테리아의 중복 감염을 특징으로 하는 수술-후 상처, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 상처이다.
본 발명의 다른 실시양태는 본 발명의 약학적 제형을 포함하는 장치로서,
제1 조성물을 포함하는 제1 용기; 및
제2 조성물을 포함하는 제2 용기
를 포함하고,
여기서 제1 용기와 제2 용기는 제1 조성물 및 제2 조성물을 분리된 상태로 유지할 수 있는 접이식 막에 의해 분리된다.
본 발명의 다른 실시양태는 본 발명의 약학적 제형을 포함하는 장치로서,
제1 조성물을 포함하는 제1 용기;
제2 조성물을 포함하는 제2 용기; 및
제3 조성물을 포함하는 제3 용기
를 포함하고,
여기서,
제1 용기와 제2 용기는 제1 조성물 및 제2 조성물을 분리된 상태로 유지할 수 있는 제1 접이식 막에 의해 분리되고;
제2 용기와 제3 용기는 제2 조성물 및 제3 조성물을 분리된 상태로 유지할 수 있는 제2 접이식 막에 의해 분리된다.
본 발명의 다른 실시양태는 본 발명의 약학적 조성물을 생산하는 방법으로서,
a. 이미드기를 갖는 5원 또는 6원의 질소-함유 헤테로고리 화합물, 데옥시리보뉴클레아제 효소, 및 카복실산을 용액에 혼합하여, 혼합물을 형성하는 단계;
b. 혼합물의 pH가 4.50 내지 6.50일 때까지 알칼리성 용액을 혼합물에 적가하여, pH-조정된 혼합물을 형성하는 단계; 및
c. pH-조정된 혼합물을 살균하는 단계
를 포함한다.
여기서,
d. 겔화제를 첨가하는 단계
를 추가로 포함한다.
여기서,
e. 착물 형성 산, 인장 활성제 및 친수성 환원산을 첨가하는 단계
를 추가로 포함한다.
도 1: 본 발명의 제형을 포함하는 장치의 다이어그램. 각 조성물을 분리시키는 두 개의 접이식 막으로 분리된 세 개의 용기를 보여준다. 막이 깨지면 용기 조성물이 혼합된다.
도 2: P. aeruginosa에 대해 연구된 항병원성 특성의 백분율: 정균 활성, 바이오필름(BF) 형성 억제 및 언급된 조성물의 농도에서 조성물 M0 및 M13 및 개별 분자에 의해 야기된 사전 형성된 바이오필름 파괴. Etho = 에토숙시미드; AA = 아스코르브산; LA = 젖산; PS80= 폴리소르베이트 80; Dl= DNAse 1; MS= 혼합 용매; LAPS= Lactobacillus plantarum(락토바실러스 플란타럼) 상청액; M= 혼합물.
도 3: 언급된 조성물의 농도에서 조성물 M0 및 M13 및 개별 분자를 사용한 24시간의 처리 후 Pseudomonas aeruginosa의 생존 박테리아(CFU/mL)에서 발현되는 살균 효과. Etho = 에토숙시미드; AA = 아스코르브산; LA = 젖산; PS80= 폴리소르베이트 80; Dl= DNAse 1; LAPS= Lactobacillus plantarum 상청액; M= 혼합물; MS= 혼합 용매.
도 4: 다양한 항병원성 효과의 백분율: 정균 활성, 바이오필름(BF) 형성 억제 및 언급된 조성물의 농도에서 조성물 M15 및 개별 분자로 인한 Pseudomonas aeruginosa에 대한 사전 형성된 바이오필름 파괴. Etho = 에토숙시미드; AA = 아스코르브산; LA = 젖산; PS80= 폴리소르베이트 80; Dl= DNAse 1; LAPS= Lactobacillus plantarum 상청액; M= 혼합물; MS= 혼합 용매.
도 5: 언급된 조성물의 농도에서 조성물 M15 및 개별 분자를 사용한 24시간의 처리 후 생존한 Pseudomonas aeruginosa 박테리아(CFU/mL)에서 발현되는 살균 효과. Etho = 에토숙시미드; AA = 아스코르브산; LA = 젖산; PS80= 폴리소르베이트 80; Dl= DNAse 1; LAPS= Lactobacillus plantarum 상청액; M= 혼합물; MS= 혼합 용매.
도 6: 다양한 항병원성 효과의 백분율: 정균 활성, 바이오필름(BF) 형성 억제 및 언급된 조성물의 농도에서 조성물 M16 및 개별 분자로 인한 Pseudomonas aeruginosa 에 대한 사전 형성된 바이오필름 파괴. Etho = 에토숙시미드; AA = 아스코르브산; LA = 젖산; PS80= 폴리소르베이트 80; Dl= DNAse 1; LAPS= Lactobacillus plantarum 상청액; M= 혼합물; MS= 혼합 용매.
도 7: 언급된 조성물의 농도에서 조성물 M16 및 개별 분자를 사용한 24시간의 처리 후 생존한 Pseudomonas aeruginosa 박테리아(CFU/mL)에서 발현되는 살균 효과. Etho = 에토숙시미드; AA = 아스코르브산; LA = 젖산; PS80= 폴리소르베이트 80; Dl= DNAse 1; LAPS= Lactobacillus plantarum 상청액; M= 혼합물; MS= 혼합 용매.
도 8: S. aureus에 대해 연구된 항병원성 특성의 백분율: 정균 활성, 바이오필름(BF) 형성 억제 및 언급된 조성물의 농도에서 조성물 M0 및 M13 및 개별 분자에 의해 야기된 사전 형성된 바이오필름 파괴. Etho = 에토숙시미드; AA = 아스코르브산; LA = 젖산; PS80= 폴리소르베이트 80; Dl= DNAse 1; LAPS= Lactobacillus plantarum 상청액; M= 혼합물; MS= 혼합 용매.
도 9: 언급된 조성물의 농도에서 조성물 M0 및 M13 및 개별 분자를 사용한 24시간의 처리 후 S. aureus의 생존 박테리아(CFU/mL)에서 발현되는 살균 효과. Etho = 에토숙시미드; AA = 아스코르브산; LA = 젖산; PS80= 폴리소르베이트 80; Dl= DNAse 1; LAPS= Lactobacillus plantarum 상청액; M= 혼합물; MS= 혼합 용매.
도 10: 다양한 항병원성 효과의 백분율: 정균 활성, 바이오필름(BF) 형성 억제 및 언급된 조성물의 농도에서 조성물 M15 및 개별 분자로 인한 S. aureus에 대한 사전 형성된 바이오필름 파괴. Etho = 에토숙시미드; AA = 아스코르브산; LA = 젖산; PS80= 폴리소르베이트 80; Dl= DNAse 1; LAPS= Lactobacillus plantarum 상청액; M= 혼합물; MS= 혼합 용매.
도 11: 언급된 조성물의 농도에서 조성물 M15 및 개별 분자를 사용한 24시간의 처리 후 S. aureus의 생존 박테리아(CFU/mL)에서 발현되는 살균 효과. Etho = 에토숙시미드; AA = 아스코르브산; LA = 젖산; PS80= 폴리소르베이트 80; Dl= DNAse 1; LAPS= Lactobacillus plantarum 상청액; M= 혼합물; MS= 혼합 용매.
도 12: 다양한 항병원성 효과의 백분율: 정균 활성, 바이오필름(BF) 형성 억제 및 언급된 조성물의 농도에서 조성물 M16 및 개별 분자로 인한 S. aureus에 대한 사전 형성된 바이오필름 파괴. Etho = 에토숙시미드; AA = 아스코르브산; LA = 젖산; PS80= 폴리소르베이트 80; Dl= DNAse 1; LAPS= Lactobacillus plantarum 상청액; M= 혼합물; MS= 혼합 용매.
도 13: 언급된 조성물의 농도에서 조성물 M16 및 개별 분자를 사용한 24시간의 처리 후 S. aureus의 생존 박테리아(CFU/mL)에서 발현되는 살균 효과. Etho = 에토숙시미드; AA = 아스코르브산; LA = 젖산; PS80= 폴리소르베이트 80; Dl= DNAse 1; LAPS= Lactobacillus plantarum 상청액; M= 혼합물; MS= 혼합 용매.
도 14: Trolox(%AAR) 대비, MS, LAPS, AA(0.5 mg/mL 및 2.5 mg/mL), M15 및 M16에 의해 보여지는 항산화 활성의 백분율. MS= 혼합 용매; AA = 아스코르브산; LAPS= Lactobacillus plantarum 상청액; M= 혼합물.
도 15: 혼합 용매(MS), 혼합 용매 내의 EDTA 용액(0.25, 0.50, 및 0.75 mg/mL), M0, M13, M15 및 M16에 의해 보여지는 pH 7.0에서의 칼슘 및 아연 킬레이트화 백분율. MS= 혼합 용매.
도 16: 효소 활성의 보존을 평가하기 위해 다양한 시험 샘플에 대해 다른 시간에 DNAse 한천에서 측정된 DNAse 활성 후광(mm).
도 17: DNAse 한천에서 측정된 LAPS, 도르나제 알파 0.97 μg/mL, M0 및 M13(각각 도르나제 알파 0.97 μg/mL 포함); M15 및 M16(각각 3.90 μg/mL의 도르나제 알파 포함) DNAse 활성 후광(mm).
도 18: 닭 융모요막의 혈관신생증가율. Etho = 에토숙시미드; LAPS= Lactobacillus plantarum 상청액; M= 혼합물.
도 19는 24시간 동안 처리된 대식세포 J774 및 케라티노사이트 HaCaT에서 GAPDH 수준으로 정규화된 VEGF 수준에 대한 에토숙시미드의 효과를 나타낸다. 유전자 발현은 log 2 스케일로 변화한다. Y축은 대조군과 비교하여 각 에토숙시미드 처리에서 유전자 발현의 Log-2-배 변화이다. GAPDH는 cDNA 입력을 수정하기 위한 하우스키핑 유전자 역할을 했다.
도 20: 다양한 처리 동물에 24시간 치료법 적용 후 상처 봉합의 백분율.
도 21: 도면은 단일클론 항체(쥐 항-α-SMA-클론 αsm-1)를 사용하고 스트렙타비딘 퍼옥시다제 시스템과의 반응을 드러내어 알파 평활근 액틴(α-SMA)을 검출하기 위한 치료된 상처의 조직학적 섹션에 대한 면역조직화학 기술을 나타낸다.
본 발명은 다수의 기술적 효과, 주로 치료 효과를 달성하는 상처의 국소 치료용 약학적 조성물, 제형 및 키트를 제공한다.
본 발명으로 치료될 가능성이 있는 상처는 통상적인 치유 치료법에 불응성인 만성 궤양, 예컨대 정맥 궤양, 동맥 궤양, 압박 궤양(욕창); 당뇨병성 족부 궤양 및 기계적 또는 바이오필름-형성 박테리아의 중복 감염에 따른 수술 후 상처이다.
본원에서 사용되는 "이미드기를 갖는 5원 또는 6원의 질소-함유 헤테로고리 화합물"은 5원 또는 6원 고리를 갖고, 이 원자 중 거의 1개가 "N"이며 이미드기의 일부인, 약학적으로 허용되는 임의의 화합물을 지칭한다. 이미드 그룹은 -CO-NH-CO-이다. 본 개시내용의 일부 실시양태의 이미드 기를 갖는 5원 또는 6원의 질소-함유 헤테로고리 화합물의 예는, 에토숙시미드, 바르비투르산, 페노바르비탈, 5,5-디에틸 바르비투르산(바르비탈 또는 베로날), 5-에틸-5-(1-메틸부틸)바르비투르산(펜토바르비톤, 펜토바르비탈, 또는 넴부탈), 5-에틸-5-(1-메틸프로필)바르비투르산(부토바르비탈, 부티솔), 5-알릴-5-(1-메틸부틸)-바르비투르산(세코바르비탈 또는 세코날), 페니토인, 하이단토인 및 이들의 조합이나, 이에 제한되지는 않는다. 에토숙시미드가 본 발명의 예시로서 사용되었으나, 상기 나열된 약학적으로 허용되는 임의의 이미드기를 갖는 5원 또는 6원의 질소-함유 헤테로고리 화합물이 등가물이 될 수 있다.
본원에서 사용되는 "카복실산"은 약학적으로 허용되는 임의의 카복실산을 지칭한다. 본 개시내용의 일부 실시양태의 카복실산의 예는, 시트르산, 젖산, 아세트산, 포름산, 말산, 타르타르산, 살리실산, 옥살산, 벤조산, 프로피온산 및 이들의 조합이나, 이에 제한되지는 않는다. 젖산이 본 발명의 예시로서 사용되었으나, 상기 나열된 약학적으로 허용되는 임의의 카복실산이 등가물이 될 수 있다.
본원에서 사용되는 "데옥시리보뉴클레아제 효소"는 약학적으로 허용되는 4.5 내지 6.5의 활성 pH를 가지는 임의의 데옥시리보뉴클레아제 효소를 지칭한다. 본 개시내용의 일부 실시양태의 데옥시리보뉴클레아제 효소의 예는, 모든 기원의 DNase I: 원학생물 또는 진핵생물이나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어 재조합 인간 DNase 또는 rh-도르나제 알파 및 소 췌장 DNase I; 모든 기원의 DNase II: 원핵생물 또는 진핵생물. 예를 들어: DNase II 알파, DNase II 베타 및 돼지 비장 DNase II, 및 이들의 조합. rh-도르나제 알파가 본 발명의 예시로서 사용되었으나, 상기 나열된 약학적으로 허용되는 임의의 데옥시리보뉴클레아제 효소가 등가물이 될 수 있다.
본원에서 사용되는 "친수성 환원산"은 약학적으로 허용되는 임의의 친수성 환원산을 지칭한다. 본 개시내용의 일부 실시양태의 친수성 환원산의 예는, 요산, 아스코르브산, 리포산 및 이들의 조합이나, 이에 제한되지는 않는다. 아스코르브산이 본 발명의 예시로서 사용되었으나, 상기 나열된 약학적으로 허용되는 임의의 친수성 환원산이 등가물이 될 수 있다.
본원에서 사용되는 "착물 형성 산"은 약학적으로 허용되는 임의의 착물 형성 산을 지칭한다. 본 개시내용의 일부 실시양태의 착물 형성 산의 예는, 에틸렌 글리콜 테트라아세트산(EGTA), 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 디메르캅토숙신산(DMSA), 2,3-디메르캅토-1-프로판술폰산(DMPS), 리포산(1,2-디티올-3-발레르산), 옥살산 및 이들의 조합이나, 이에 제한되지는 않는다. EDTA가 본 발명의 예시로서 사용되었으나, 상기 나열된 약학적으로 허용되는 임의의 착물 형성 산이 등가물이 될 수 있다.
본원에서 사용되는 "인장 활성제"는 약학적으로 허용되는 임의의 계면활성제를 지칭한다. 본 개시내용의 일부 실시양태의 인장 활성제의 예는, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 60, 소르비탄 트리스테아레이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 옥톡시놀-9, 노녹시놀-9 40몰의 에틸렌 옥사이드에서 에톡실화된 피마자유, 7 내지 10몰의 에톡실화된 라우르 알코올, 크레모포어 콜리포어(Cremophor Kolliphor), Lipocol oxo 650, Solutol HS 15, Emulgin B1 PH, Lanette 20 PH, 폴리소르베이트, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80, 카프리 알코올, 데실 알코올, 라우릴 알코올에서 파생된 에톡실화 지방 알코올(에틸렌 옥사이드 6~30몰), 이소트리데실 알코올, 미리스틸 알코올, 에틸 알코올, 팔몰레일, 스테아릴, 올레일, 엘라이딜, 페트로셀리닐, 리놀릴 알코올, 리놀렌산, 엘라에오스테아릴 알코올, 에이코실, 아라킬, 가돌레일, 베헤닐 알코올, 에루실 알코올, 브라시딜 및 이들의 조합이나, 이에 제한되지는 않는다. 폴리소르베이트 80이 본 발명의 예시로서 사용되었으나, 상기 나열된 약학적으로 허용되는 임의의 인장 활성제가 등가물이 될 수 있다.
본원에서 사용되는 "겔화제"는 콜로이드 혼합물로서 액상에 용해될 때 약한 응집성 내부 구조를 형성하는, 약학적으로 허용되는 임의의 겔-형성제를 지칭한다. 본 개시내용의 일부 실시양태의 겔화제의 예는, 셀룰로오스, 나노-결정질 셀룰로오스, 세균성 셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 카보폴, 셀룰로오스 유도체, 에틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 구아검, 아라비아검, 하이드록시에틸메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸프로필셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스, 잔탄검, 키토산, 알지네이트, 젤라틴, 전분나트륨 글리콜산, 코르스카멜로사나트륨, 알긴산, 펙틴 및 이들의 조합이나, 이에 제한되지는 않는다. 하이드록시에틸 셀룰로오스가 본 발명의 예시로서 사용되었으나, 상기 나열된 약학적으로 허용되는 임의의 겔화제가 등가물이 될 수 있다.
본 발명은 용액에 3종 이상의 성분을 포함하는 국소 상처 치료용 약학적 조성물이다. 상기 성분의 농도는 mg/mL로, 이는 성분의 mg/상기 용액의 mL를 의미하고% w/v는 성분의 중량% / 상기 용액의 부피를 의미한다.
본 문서에서 불분명하게 사용된 용어 "용액" 또는 "MS" 또는 "혼합 용매"는 약학적으로 허용되는 임의의 수성 용매를 지칭한다. 본 개시내용의 일부 실시양태의 약학적으로 허용되는 수성 용매의 예는, 아세트산 0.2 M/아세트산나트륨 0.2 M: 비율 2.78 대 0.66%(v/v) pH = 4.2 내지 4.8; 아세트산 0.10 M/아세트산나트륨 0.01M: 비율 1.05 대 10.05%(v/v) pH = 5,6; 일염기성 인산칼륨 0.05 M pH = 4.5; 일염기성 인산칼륨 0.36 M/인산 이나트륨 0.07 M: 비율 4.92 대 0.98%(p/v) pH = 5,7; 일염기성 인산칼륨 0.36 M/인산 이나트륨 0.10 M: 비율 4.92 대 1.49%(p/v) pH = 6,0; 시트르산 0.31 M/인산 이나트륨 0.20 M: 비율 2.99 대 1.42%(p/v) pH = 5.8; 시트르산 0.10 M/시트르산 나트륨 0.03 M: 비율 1.92 a 0.77%(p/v) pH = 5,8; 쇠렌센의 인산염 완충액: 일염기성 인산나트륨 0.2 M/인산 이나트륨 2.3 M: 비율 1.2 대 16.33%(p/v) pH = 5,8; 행크 평형염 용액(HBSS): 염화나트륨 0.14 M(0.800%), 염화칼륨 5 mM(0.040%), 염화칼슘 1 mM(0.014%), 황산마그네슘 칠수화물 0.4 mM(0.010%), 염화마그네슘 육수화물 0.5 mM (0.010%), 인산 이나트륨 이수화물 0.3 mM(0.006%), 일염기성 인산칼륨 0.4 mM(0.006%), 포도당 6 mM(0.100%), 중탄산나트륨 4 mM(0.035%): pH = 5.7; 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES) 1 M(pH = 6.5); 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 나트륨염, 4-모르폴린에탄술폰산(MES 나트륨염) 0.5 M(pH 5.5 - 6.7); N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산 나트륨염(BES) 0.5 M(pH=6.0); N-(2-아세트아미도)-2-아미노에탄술폰산(ACES) 0.5 M(pH = 6.0); 2/2'-[(2-아미노-2-옥소에틸)이미노]디아세트산(ADA) 0.2 M(pH = 6.0); 피페라진-N,N,-비스(2-에탄술폰산)(PIPES) 0.5 M(pH = 6.0 - 6.8); 3-모르폴리노-2-하이드록시프로판술폰산(MOPSO) 0.2 M(pH = 6.0); 생리 식염수(0.9%) / MgCL2(5 mM). pH 5.5; 1M NaHCO3 용액 및 이들의 조합이나, 이에 제한되지는 않는다. pH 5.5에서 생리 식염수(0.9%) / MgCL2(5mM)가 본 발명의 예시로서 사용되었으나, 상기 나열된 약학적으로 허용되는 임의의 용액 또는 MS가 등가물이 될 수 있다. 본 발명의 실시예에 사용된 용액, 즉 탈혼합 용매(demixing solvent, MS)는 pH 5.5에서 생리 식염수(0.9%)와 5mM의 MgCl2이다.
본 발명의 조성물은 살균제이지만 벤질 알코올, 벤조산, 메틸 하이드록시벤조에이트, 프로필 하이드록시벤조에이트, 벤잘코늄 클로라이드, 클로로크레졸, 페닐수은 니트레이트, 클로로부탄올, 소듐 디하이드로아세테이트, 티메로살, 벤조산나트륨, 소르빈산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 약학적으로 허용되는 방부제와 함께 제형화될 수 있다.
본 발명의 조성물은 리도카인, 프라목신, 벤조카인 등 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 약학적으로 허용되는 마취제와 함께 제형화될 수 있다.
본 발명에 의해 달성되는 기술적 효과 중에서 다음을 상세히 설명할 수 있다:
정균 및 살균 효과: 시중에 나와 있는 기존 제품은 감소된 활성 스펙트럼을 가지는 반면, 본 발명의 조성물은 만성 상처에서 분리된 플랑크톤 균주의 99%를 제거할 수 있다. 이 효과는 어떤 선행기술의 제품으로도 얻을 수 없으므로, 현재로서는; 하나 이상의 제품을 사용해야 한다.
박테리아 바이오필름 형성 억제 효과: 기존의 억제제 제품은 한 번에 하나의 박테리아 균주만 억제하는 반면, 본 발명의 조성물은 만성 상처에서 분리된 균주의 바이오필름의 99%의 형성을 억제한다.
미리 형성된 박테리아 바이오필름의 파괴 효과: 시중에 나와 있는 박테리아 바이오필름 파괴 제품은 한 번에 단일 종의 바이오필름 파괴만을 일으키는 반면, 본 발명의 조성물은 만성 상처에서 분리된 대부분의 균주의 바이오필름, 시장에 제품이 없는 혼합 바이오필름(생체내에서 하나 이상의 종에 의해 형성됨)을 포함한 바이오필름의 95%의 파괴를 유발한다.
조직 제거(debriding) 효과: 본 발명의 조성물은 상처 표면으로부터 피브린/바이오필름/괴사 조직층을 제거한다.
상처 확대의 억제 효과: 이 효과는 본 발명의 조성물을 유발하는 MMP 및 자유 라디칼의 억제를 통해 달성된다. 그것은 또한 삼출물을 흡수하는 약학적 형태를 통해서도 한다. 이 목적을 위한 제품은 시중에 없다.
산소화 효과: 본 발명의 산소화력은 혈관신생을 자극하는 혈관내피성장인자(VEGF)의 발현 유도를 통해 달성된다. 호기성 병원성 식물상의 제거는 또한 상처의 pO2를 증가시킨다.
콜라겐화 효과: 본 발명은 궤양층에서 콜라겐의 형성 및 침착을 자극한다.
본 발명의 조성물은 적어도 6개월 동안 활성이 있는 것으로 입증되었기 때문에 선행 기술에 비해 확장된 안정성을 나타낸다.
본 발명의 제형을 담는 장치는 본 발명의 또 다른 목적이다. 상기 장치는, 한 실시양태에서, 3개의 용기: 제1 조성물을 저장하는 제1 용기, 제2 조성물을 저장하는 제2 용기 및 제3 조성물을 저장하는 제3 용기를 포함한다. 여기서 제1 조성물은 고체이고 겔화제 분말을 포함하고; 제2 조성물은 고체이고 데옥시리보뉴클레아제 효소를 포함하고 제3 조성물은 이미드기를 갖는 5원 또는 6원의 질소-함유 헤테로고리 화합물 1 종 이상 및 1 종 이상의 카복실산을 포함하는 수성 액체이고; 제3 조성물은 4.5 내지 6.8의 pH를 갖는다. 제3 조성물은 1 종 이상의 친수성 환원산; 1 종 이상의 인장 활성제; 1 종 이상의 착물 형성 산을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 한 실시양태는 용기의 장치를 제공하며, 여기서 제1 용기 및 제2 용기는 제1 조성물 및 제2 조성물을 분리된 상태로 유지할 수 있는 제1 접이식 막에 의해 분리되고; 제2 용기 및 제3 용기는 제2 조성물 및 제3 조성물을 분리된 상태로 유지할 수 있는 제2 접이식 막에 의해 분리된다.
본 문서에서 사용된 용어 "접이식 막"은 접히거나, 깨지거나, 부서지거나, 찢어지거나, 제거될 수 있는 강성 또는 유연한 재료로 만들어진, 상기 용기들을 분리하는 임의의 막 또는 필름을 지칭한다. 이러한 접이식 막은 예를 들어 중합체, 알루미늄, 규소와 같은 당업계에 공지된 임의의 재료로 제조된다. 인접한 용기를 분리하는 접이식 막이 부서지면, 상기 용기들의 조성물이 접촉하게 된다.
본 문서에서 사용된 용어 "용기"는 주변 및 다른 조성물로부터 분리된 조성물을 담는 임의의 용기를 의미한다. 이 용기는 접이식 막을 다른 용기와 공유할 수 있으며, 이 막이 깨졌을 때 용기들에 담긴 상기 조성물이 접촉하게 된다. 본 발명의 용기는 독립적이고 격리된 용기이거나 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이 이들 사이에 접이식 막을 공유하는 둘 또는 세 개의 용기를 갖는 단일 장치의 일부일 수 있다.
본 발명의 장치는 카트리지 또는 디스펜서이다.
한 실시양태는 제거 가능한 캡을 포함할 수 있는 노즐이 있는 디스펜서 장치를 제공한다.
예시적인 장치가 도1에 도시된다. 이 다중 구획 장치는 강성 재료의 원통형 카트리지이다. 여기에 개시된 이 장치를 만드는 데 유용한 재료에는 습기 및 산소 노출을 방지하기 위한 높은 차단성 폴리프로필렌, 알루미늄, 유리 등이 포함된다. 2개의 접이식 막이 이 예시적인 장치를 3개의 용기로 나눈다. 이 접이식 막은 압력 또는 당업계에 공지된 필름을 파괴하는 임의의 시스템에 의해 파괴될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상처 치료에 사용하기 전에 본 발명의 약학적 조성물을 제자리에서 제조하는 방법이다. 이 프로세스는 다음 단계를 포함한다:
a. 제2 접이식 막을 부수어 제3 조성물을 제2 조성물과 접촉시키는 단계;
b. 제3 조성물을 제2 조성물과 혼합 및 진탕하는 단계;
c. 제1접이식 막을 부수어 제1 조성물을 b 단계에서 수득한 혼합물과 접촉시키는 단계;
d. 혼합 및 진탕하여 본 발명의 겔 약학적 조성물을 수득하는 단계.
a단계에서 완벽한 혼합이 가능하다. 제2 용기의 제2 조성물의 효소는 제3 용기의 액체 수성 제3 조성물과 진탕될 때 전체 부피에 분포된다. a단계의 이 혼합물은 c단계에서 제1 용기의 제1 조성물의 겔화제와 결합되고, 진탕되어 본 발명의 균질한 겔 조성물을 얻는다.
한 실시양태는 본 발명의 제형을 담기 위한 장치를 제공한다. 상기 장치는 2개의 용기, 즉 제1 조성물을 저장하는 제1 용기 및 제2 조성물을 저장하는 제2 용기를 포함한다. 여기서, 제1 조성물은 고체이고 겔화제 분말 및 데옥시리보뉴클레아제 효소를 포함하고, 제2 조성물은 이미드기를 갖는 5원 또는 6원의 질소-함유 헤테로고리 화합물 1 종 이상 및 1 종 이상의 카복실산을 포함하는 수성 액체이고; 제3 조성물은 4.5 내지 6.8의 pH를 갖는다. 제3 조성물은 1 종 이상의 친수성 환원산; 1 종 이상의 인장 활성제; 1 종 이상의 착물 형성 산을 추가로 포함할 수 있다.
사용 이전에 제자리 제조된 본 발명의 제형은 사용된 효소와 유사한 유효 기간을 나타낼 것이다.
2개 또는 3개의 용기가 있는 본 발명의 장치에 포함된 본 발명의 제형에 대한 시간 경과에 따른 안정성은 약 2년이다. 이 안정성은 용액과 접촉하지 않고 분리된 용기 또는 구획에 동결건조된 분말 형태이기 때문에 사용된 효소의 안정성이다. 따라서, 본 발명의 장치 안의 본 발명의 제형은 선행기술에 비해 확장된 안정성을 나타낸다. 그리고 제형을 제조할 때 제1 조성물을 제2 조성물 및 제3 조성물에 접촉시키고(장치가 3개의 용기를 제시할 때) 진탕해 모든 조성물을 혼합하면, 제조된 겔은 약 6개월 또는 그 이상의 안정성을 나타낸다.
[실시예]
실시예 1
조성물 용액 제조
본 발명의 조성물의 상이한 성분의 용액이 제조되었다.
혼합 용매(MS): 생리 식염수(0.9%) / MgCL2(5mM). pH 5.5
염화나트륨 9.0000g과 염화마그네슘 육수화물(MgCl2·6 H2O) 1.0106g을 달아 용액 1리터를 준비하고 이를 증류수에 녹인다.
알칼리성 용액: 1M NaHCO3 용액. 메스플라스크에 중탄산나트륨 8.4g을 증류수에 용해시켜 100 mL의 용액을 조제한다. 플라스크의 표시를 채우기 전 과포화를 피하기 위해 비커에 있는 용매와 함께 중탄산나트륨을 완전히 용해시키는 것이 중요하다. 알칼리성 용액의 최종 pH는 약 8.6이다.
혼합 용매 중 젖산 용액(LA). LA를 상기 혼합 용매에 희석한 다음 몇 분 동안 혼합한다. 알칼리성 용액으로 최종 pH = 5.5에 도달한다. 제조된 농도는 다음과 같다: LA 1.63 mg/mL, LA 6.50 mg/mL, LA 8.67 mg/mL.
혼합 용매 중 폴리소르베이트 80 용액(PS80). PS80을 희석한 다음 균질화될 때까지 몇 분 동안 혼합한다. 알칼리성 용액을 사용하여 최종 pH = 5.5에 도달한다. 제조된 농도는 다음과 같다: PS80 2.0 mg/mL, PS80 3.0 mg/mL
혼합 용매 중 EDTA 용액: EDTA를 언급된 혼합 용매에 용해시킨 다음 몇 분 동안 혼합한다. 알칼리성 용액을 사용하여 최종 pH = 5.5에 도달한다. 제조된 농도는 EDTA 0.25 mg/mL, EDTA 0.50 mg/mL, EDTA 0.75 mg/mL이다.
혼합 용매 중 아스코르브산 용액(AA). AA를 언급된 용매 혼합물에 용해시킨 다음 몇 분 동안 혼합한다. 알칼리성 용액을 사용하여 최종 pH = 5.50에 도달한다. 제조된 농도는 다음과 같다: AA 0.5 mg/mL, AA 1.0 mg/mL, AA 2.50 mg/mL.
혼합 용매 중 에토숙시미드 용액(Etho). Etho를 혼합 용매에 용해시킨 다음 몇 분 동안 혼합한다. 알칼리성 용액을 사용하여 최종 pH = 5.5에 도달한다. 제조된 농도는 다음과 같다: Etho 0.50 mg/mL, Etho 3.00 mg/mL, Etho 30.00 mg/mL.
혼합 용매 중 rh-도르나제 알파 용액(D1). D1을 혼합 용매에 용해시킨 다음 몇 분 동안 혼합한다. 알칼리성 용액을 사용하여 최종 pH = 5.5에 도달한다. 제조된 농도는 다음과 같다: D1 250 μg/mL, D1 125 μg/mL, D1 62.5 μg/mL, D1 31.2μg/mL, D1 15.6 μg/mL, D1 7.8 μg/mL, D1 3.9 μg/mL, D1 1.9 μg/mL, D1 0.97 μg/mL, D1 0.5 μg/mL.
Lactobacillus plantarum 상청액 24시간(LAPS 24h) 대조군: L. plantarum ATCC 10241을 37℃에서 de Man Rogosa Sharpe(MRS)(브리타니아, 아르헨티나)에서 12시간 동안 성장시켰다. 8000 rpm에서 15분 동안 원심분리하고 0.22μm의 Millipore 필터로 여과하여 상청액(LAPS)을 얻었다. 그런 다음 제제를 2-8℃에서 24시간 동안 보관하였다. 젤 형태의 약제를 얻기 위해 하이드록시 셀룰로오스 1.7%를 첨가하였다.
Lactobacillus plantarum 상청액 6개월(LAPS 6m) 대조군: LAPS 24시간 제제를 2-8℃에서 6개월 동안 보관한 후 사용하였다.
실시예 2
발명의 조성물. 실험실에서 혼합물 No. 0(M0)의 제조.
본 발명의 조성물은 다음으로 구성된다:
a. 6.50 mg/mL 젖산(85% - 90% 순도)
b. 3.00 mg/mL 에토숙시미드
c. DNase(rh-도르나제 알파) 0.97 μg/mL
용액: 혼합물을 제조한다(a+b+c).
혼합 용매 50 mL에 150 mg의 에토숙시미드, 318 μL의 젖산 및 50 μg의 rh-도르나제 알파 효소를 첨가한다.
제조 방법
1. 150 mg의 에토숙시미드를 분석용 저울 Radwag AS 220 R2(Radwag LLC, Radom, Poland)의 시계 접시에 단다.
2. 혼합 용매를 사용하여 이 물질이 유리 비커에 용출되고 시계 접시에 입자가 남지 않도록 한다.
3. 50 mL의 용매 혼합물의 나머지를 비커에 첨가한 후, 고체 입자가 부분적으로 용해될 때까지 제제를 NUMAK GL-3250A 자기 교반기(Numak Technology LLC, Dubai, UAE)에 5분 동안 둔다.
4. 다음으로, 318 μL의 젖산을 제제에 첨가한다.
5. 이 물질을 첨가하고 나면, 혼합물을 5분 동안 추가로 교반한다.
6. 용액의 최종 pH가 5.5가 되도록 하기 위해, 50 mL의 용액을 100 mL 비커에 넣고 사전에 조정된 Lutron PH-206 pH 미터 전극(Lutron Electronics Co. Inc., Pennsylvania, USA)을 여기에 담근다.
7. 어셈블리를 교반기에 저회전으로 놓고 알칼리성 용액을 pH 5.5에 도달할 때까지 적가하면서, 응집체에 의해 생성되는 거품에 주의한다.
8. 제제를 10분 동안 1 atm 과압에서 120℃의 오토클레이브 Arcano LS-B75L에서 멸균한다.
9. 멸균 공정 완료 후, 50 mL의 제제를 원뿔형 튜브에 넣고 50 μg의 rh-도르나제 알파 효소(Roche, Basel, Switzerland)를 멸균 조건에서 첨가하여 최종 농도가 0.97 μg/mL가 되도록 한다. 이 단계는 생물학적 안전 캐비닛에서 수행한다.
10. 튜브를 밀봉하고 1분 동안 볼텍스에서 혼합한다.
11. 제제를 알루미늄 호일을 사용하여 빛을 차단한 다음 4 ℃ - 25 ℃에서 보관한다.
실시예 3
발명의 조성물. 실험실에서 혼합물 No. 13(M13)의 제조.
본 발명의 조성물은 다음으로 구성된다:
a. 3.00 mg/mL 폴리소르베이트 80
b. 1.00 mg/mL 아스코르브산
c. 6.50 mg/mL 젖산(85% - 90% 순도)
d. 0.50 mg/mL EDTA
e. 3.00 mg/mL 에토숙시미드
f. 0.97 μg/mL DNase
용액: 혼합물을 제조한다(a+b+c+d+e+f).
혼합 용매 50 mL에 다음을 첨가한다: 50 mg의 아스코르브산, 25 mg의 EDTA, 150 mg의 에토숙시미드, 50 μg의 rh-도르나제 알파, 141 μL의 폴리소르베이트 80 및 318 μL의 젖산.
제조 방법:
1. 50 mg의 아스코르브산과 25 mg의 EDTA를 분석용 저울 Radwag AS 220 R2(Radwag LLC, Radom, Poland)의 시계 접시에 단다.
2. 혼합 용매를 사용하여 이 물질이 유리 비커에 용출되고 시계 접시에 입자가 남지 않도록 한다.
3. 50 mL의 용매 혼합물의 나머지를 비커에 첨가한 후, 고체 입자가 부분적으로 용해될 때까지 제제를 NUMAK GL-3250A 자기 교반기(Numak Technology LLC, Dubai, UAE)에 5분 동안 둔다. 교반하는 동안, 141 μL의 폴리소르베이트 80을 200 μL 팁의 끝을 자름으로써 첨가한다.
4. 다음으로, 318 μL의 젖산을 제제에 첨가한다.
5. 150 mg의 에토숙시미드를 첨가한다.
6. 이 물질을 첨가하고 나면, 혼합물을 5분 동안 추가로 교반한다.
7. 상기 혼합물의 최종 pH가 5.5가 되도록 하기 위해, 50 mL의 혼합물을 100 mL 비커에 넣고 사전에 조정된 Lutron PH-206 pH 미터 전극(Lutron Electronics Co. Inc., Pennsylvania, USA)을 여기에 담근다.
8. 7단계의 혼합물을 교반기에 저회전으로 놓고 알칼리성 용액을 pH 5.5에 도달할 때까지 적가하면서, 응집체에 의해 생성되는 거품에 주의한다.
9. 8단계의 혼합물을 10분 동안 1 atm 과압에서 120℃의 오토클레이브 Arcano LS-B75L에서 멸균한다.
10. 멸균 공정 완료 후, 50 mL의 혼합물을 50 mL 원뿔형 튜브에 넣고 50 μg의 rh-도르나제 알파 효소(Roche, Basel, Switzerland)를 멸균 조건에서 첨가하여 최종 농도가 0.97 μg/mL가 되도록 한다. 이 단계는 생물학적 안전 캐비닛에서 수행한다.
11. 튜브를 밀봉하고 1분 동안 볼텍스에서 혼합한다.
12. 11단계의 발명의 조성물을 알루미늄 호일을 사용하여 빛을 차단한 다음 4 ℃ - 25 ℃에서 보관한다.
실시예 4
발명의 조성물. 실험실에서 혼합물 No. 15(M15)의 제조.
본 발명의 조성물은 다음으로 구성된다:
a. 2.00 mg/mL 폴리소르베이트 80
b. 0.50 mg/mL 아스코르브산
c. 1.63 mg/mL 젖산(85% - 90% 순도)
d. 0.25 mg/mL EDTA
e. 0.50 mg/mL 에토숙시미드
f. 3.90 μg/mL DNase
용액: 혼합물을 제조한다(a+b+c+d+e+f).
혼합 용매 50 mL에 다음을 첨가한다: 25.00 mg의 아스코르브산, 12.50 mg의 EDTA, 25 mg의 에토숙시미드, 200 μg의 rh-도르나제 알파, 94 μL의 폴리소르베이트 80 및 80 μL의 젖산.
제조 방법:
1. 25 mg의 아스코르브산과 12.50 mg의 EDTA를 분석용 저울 Radwag AS 220 R2(Radwag LLC, Radom, Poland)의 시계 접시에 단다.
2. 혼합 용매를 사용하여 이 물질이 유리 비커에 용출되고 시계 접시에 입자가 남지 않도록 한다.
3. 50 mL의 용매 혼합물의 나머지를 비커에 첨가한 후, 고체 입자가 부분적으로 용해될 때까지 제제를 NUMAK GL-3250A 자기 교반기(Numak Technology LLC, Dubai, UAE)에 5분 동안 둔다.
교반하는 동안, 94 μL의 폴리소르베이트 80을 200 μL 팁의 끝을 자름으로써 첨가한다.
4. 다음으로, 80 μL의 젖산을 제제에 첨가한다.
5. 25 mg의 에토숙시미드를 첨가한다.
6. 이 물질을 첨가하고 나면, 혼합물을 5분 동안 추가로 교반한다.
7. 상기 혼합물의 최종 pH가 5.5가 되도록 하기 위해, 50 mL의 혼합물을 100 mL 비커에 넣고 사전에 조정된 Lutron PH-206 pH 미터 전극(Lutron Electronics Co. Inc., Pennsylvania, USA)을 여기에 담근다.
8. 7단계의 혼합물을 교반기에 저회전으로 놓고 알칼리성 용액을 pH 5.5에 도달할 때까지 적가하면서, 응집체에 의해 생성되는 거품에 주의한다.
9. 제제를 10분 동안 1 atm 과압에서 120℃의 오토클레이브 Arcano LS-B75L에서 멸균한다.
10. 멸균 공정 완료 후, 50 mL의 조제 용액을 50 mL 원뿔형 튜브에 넣고 200 μg의 rh-도르나제 알파 효소(Roche, Basel, Switzerland)를 멸균 조건에서 첨가하여 최종 농도가 3.90 μg/mL가 되도록 한다. 이 단계는 생물학적 안전 캐비닛에서 수행한다.
11. 튜브를 밀봉하고 1분 동안 볼텍스에서 혼합한다.
12. 11단계의 발명의 조성물을 알루미늄 호일을 사용하여 빛을 차단한 다음 4 ℃ - 25 ℃에서 보관한다.
실시예 5
발명의 조성물. 실험실에서 혼합물 No. 16(M16)의 제조.
본 발명의 조성물은 다음으로 구성된다:
a. 3.00 mg/mL 폴리소르베이트 80
b. 2.50 mg/mL 아스코르브산
c. 8.67 mg/mL 젖산(85% - 90% 순도)
d. 0.75 mg/mL EDTA
e. 30.00 mg/mL 에토숙시미드
f. 3.90 μg/mL DNase
용액: 혼합물을 제조한다(a+b+c+d+e+f).
혼합 용매 50 mL에 다음을 첨가한다: 125 mg의 아스코르브산, 37.5 mg의 EDTA, 1500 mg의 에토숙시미드, 200 μg의 rh-도르나제 알파, 141 μL의 폴리소르베이트 80 및 424 μL의 젖산.
제조 방법:
1. 125 mg의 아스코르브산과 37.5 mg의 EDTA를 분석용 저울 Radwag AS 220 R2(Radwag LLC, Radom, Poland)의 시계 접시에 단다.
2. 혼합 용매를 사용하여 이 물질이 유리 비커에 용출되고 시계 접시에 입자가 남지 않도록 한다.
3. 50 mL의 용매 혼합물의 나머지를 비커에 첨가한 후, 고체 입자가 부분적으로 용해될 때까지 제제를 NUMAK GL-3250A 자기 교반기(Numak Technology LLC, Dubai, UAE)에 5분 동안 둔다. 교반하는 동안, 141 μL의 폴리소르베이트 80을 200 μL 팁의 끝을 자름으로써 첨가한다.
4. 다음으로, 424 μL의 젖산을 제제에 첨가한다.
5. 1500 mg의 에토숙시미드를 첨가한다.
6. 이 물질을 첨가하고 나면, 혼합물을 5분 동안 추가로 교반한다.
7. 제제의 pH를 측정하기 위해 Lutron PH-206 pH 미터 전극(Lutron Electronics Co. Inc., Pennsylvania, USA)을 조정한다.
8. 용액의 최종 pH가 5.5가 되도록 하기 위해, 50 mL의 용액을 pH 미터와 함께 교반기 위에 저회전으로 놓은 100 mL 비커에 넣고, 알칼리성 용액을 pH 수준에 도달할 때까지 적가하면서, 응집체에 의해 생성되는 거품에 주의한다.
9. 제제를 10분 동안 1 atm 과압에서 120℃의 오토클레이브 Arcano LS-B75L에서 멸균한다.
10. 멸균 공정 완료 후, 50 mL의 조제 용액을 50 mL 원뿔형 튜브에 넣고 200 μg의 rh-도르나제 알파 효소(Roche, Basel, Switzerland)를 멸균 조건에서 첨가하여 최종 농도가 3.90 μg/mL가 되도록 한다. 이 단계는 생물학적 안전 캐비닛에서 수행한다.
11. 튜브를 밀봉하고 1분 동안 볼텍스에서 혼합한다.
12. 11단계의 발명의 조성물을 알루미늄 호일을 사용하여 빛을 차단한 다음 4 ℃ - 25 ℃에서 보관한다.
실시예 6
발명의 조성물. 실험실에서 혼합물 No. 0(M0)의 겔 제조.
본 발명의 조성물은 다음으로 구성된다:
a. 6.50 mg/mL 젖산(85% - 90% 순도)
b. 3.00 mg/mL 에토숙시미드
c. DNase 0.97 μg/mL
d. 17 mg/mL 하이드록시에틸 셀룰로오스
용액: 혼합물을 제조한다(a+b+c).
혼합 용매 50 mL에 150.0 mg의 에토숙시미드, 318 μL의 젖산 및 50 μg의 rh-도르나제 알파 효소를 첨가한다
제조 방법:
1. 150.0 mg의 에토숙시미드를 분석용 저울 Radwag AS 220 R2(Radwag LLC, Radom, Poland)의 시계 접시에 단다.
2. 혼합 용매를 사용하여 이 물질이 유리 비커에 용출되고 시계 접시에 입자가 남지 않도록 한다.
3. 50 mL의 용매 혼합물의 나머지를 비커에 첨가한 후, 고체 입자가 부분적으로 용해될 때까지 제제를 NUMAK GL-3250A 자기 교반기(Numak Technology LLC, Dubai, UAE)에 5분 동안 둔다.
4. 다음으로, 318 μL의 젖산을 제제에 첨가한다.
5. 이 물질을 첨가하고 나면, 혼합물을 5분 동안 추가로 교반한다.
6. 상기 용액의 최종 pH가 5.5가 되도록 하기 위해, 50 mL의 용액을 100 mL 비커에 넣고 사전에 조정된 Lutron PH-206 pH 미터 전극(Lutron Electronics Co. Inc., Pennsylvania, USA)을 여기에 담근다.
7. 어셈블리를 교반기에 저회전으로 놓고 알칼리성 용액을 pH 5.5에 도달할 때까지 적가하면서, 응집체에 의해 생성되는 거품에 주의한다.
8. 제제를 10분 동안 1 atm 과압에서 120℃의 오토클레이브 Arcano LS-B75L에서 멸균한다.
9. 멸균 공정 완료 후, 50 mL의 제제를 원뿔형 튜브에 넣고 50 μg의 rh-도르나제 알파 효소(Roche, Basel, Switzerland)를 멸균 조건에서 첨가하여 최종 농도가 0.97 μg/mL가 되도록 한다. 이 단계는 생물학적 안전 캐비닛에서 수행한다.
10. 튜브를 밀봉하고 1분 동안 볼텍스에서 혼합한다.
겔: 혼합물을 제조한다(용액 + g).
11. 조제 혼합물에 0.85 g의 하이드록시에틸셀룰로오스를 첨가한다.
12. 균질화될 때까지 부드럽게 섞는다.
13. 제제를 알루미늄 호일을 사용하여 빛을 차단한 다음 4 - 25 ℃에서 보관하고 덮어둔다. 거품이 제거되기까지 6 내지 8 시간 동안 그대로 두어야 한다.
실시예 7
발명의 조성물. 실험실에서 혼합물 No. 13(M13)의 겔 제조.
본 발명의 조성물은 다음으로 구성된다:
a. 3.00 mg/mL 폴리소르베이트 80
b. 1.00 mg/mL 아스코르브산
c. 6.50 mg/mL 젖산(85% - 90% 순도)
d. 0.50 mg/mL EDTA
e. 3.00 mg/mL 에토숙시미드
f. 0.97 μg/mL DNase
g. 17 mg/mL 하이드록시에틸 셀룰로오스
용액: 혼합물을 제조한다(a+b+c+d+e+f).
혼합 용매 50 mL에 다음을 첨가한다: 50 mg의 아스코르브산, 25 mg의 EDTA, 150 mg의 에토숙시미드, 50 μg의 rh-도르나제 알파, 141 μL의 폴리소르베이트 80 및 318 μL의 젖산.
제조 방법:
1. 50 mg의 아스코르브산과 25 mg의 EDTA를 분석용 저울 Radwag AS 220 R2(Radwag LLC, Radom, Poland)의 시계 접시에 단다.
2. 혼합 용매를 사용하여 이 물질이 유리 비커에 용출되고 시계 접시에 입자가 남지 않도록 한다.
3. 50 mL의 용매 혼합물의 나머지를 비커에 첨가한 후, 고체 입자가 부분적으로 용해될 때까지 제제를 NUMAK GL-3250A 자기 교반기(Numak Technology LLC, Dubai, UAE)에 5분 동안 둔다. 교반하는 동안, 141 μL의 폴리소르베이트 80을 200 μL 팁의 끝을 자름으로써 첨가한다.
4. 다음으로, 318 μL의 젖산을 제제에 첨가한다.
5. 150 mg의 에토숙시미드를 첨가한다.
6. 이 물질을 첨가하고 나면, 혼합물을 5분 동안 추가로 교반한다.
7. 상기 혼합물의 최종 pH가 5.5가 되도록 하기 위해, 50 mL의 혼합물을 100 mL 비커에 넣고 사전에 조정된 Lutron PH-206 pH 미터 전극(Lutron Electronics Co. Inc., Pennsylvania, USA)을 여기에 담근다.
8. 7단계의 혼합물을 교반기에 저회전으로 놓고 알칼리성 용액을 pH 5.5에 도달할 때까지 적가하면서, 응집체에 의해 생성되는 거품에 주의한다.
9. 8단계의 혼합물을 10분 동안 1 atm 과압에서 120℃의 오토클레이브 Arcano LS-B75L에서 멸균한다.
10. 멸균 공정 완료 후, 50 mL의 혼합물을 50 mL 원뿔형 튜브에 넣고 50 μg의 rh-도르나제 알파 효소(Roche, Basel, Switzerland)를 멸균 조건에서 첨가하여 최종 농도가 0.97 μg/mL가 되도록 한다. 이 단계는 생물학적 안전 캐비닛에서 수행한다.
11. 튜브를 밀봉하고 1분 동안 볼텍스에서 혼합한다.
겔 수득: 혼합물을 제조한다(용액 + g).
12. 조제 혼합물에 0.85 g의 하이드록시에틸셀룰로오스를 첨가한다.
13. 균질화될 때까지 부드럽게 섞는다.
14. 제제를 알루미늄 호일을 사용하여 빛을 차단한 다음 4 - 25 ℃에서 보관하고 덮어둔다. 거품이 제거되기까지 6 내지 8 시간 동안 그대로 두어야 한다.
실시예 8
발명의 조성물. 실험실에서 혼합물 No. 15(M15)의 겔 제조.
본 발명의 조성물은 다음으로 구성된다:
a. 2.00 mg/mL 폴리소르베이트 80
b. 0.50 mg/mL 아스코르브산
c. 1.63 mg/mL 젖산(85% - 90% 순도)
d. 0.25 mg/mL EDTA
e. 0.50 mg/mL 에토숙시미드
f. 3.90 μg/mL DNase
g. 17 mg/mL 하이드록시에틸 셀룰로오스
용액: 혼합물을 제조한다(a+b+c+d+e+f).
혼합물 용매 50 mL에 다음을 첨가한다: 25.00 mg의 아스코르브산, 12.50 mg의 EDTA, 25 mg의 에토숙시미드, 200 μg의 rh-도르나제 알파, 94 μL의 폴리소르베이트 80 및 80 μL의 젖산.
제조 방법:
1. 25 mg의 아스코르브산과 12.5 mg의 EDTA를 분석용 저울 Radwag AS 220 R2(Radwag LLC, Radom, Poland)의 시계 접시에 단다.
2. 혼합 용매를 사용하여 이 물질이 유리 비커에 용출되고 시계 접시에 입자가 남지 않도록 한다.
3. 50 mL의 용매 혼합물의 나머지를 비커에 첨가한 후, 고체 입자가 부분적으로 용해될 때까지 제제를 NUMAK GL-3250A 자기 교반기(Numak Technology LLC, Dubai, UAE)에 5분 동안 둔다.
교반하는 동안, 94 μL의 폴리소르베이트 80을 200 μL 팁의 끝을 자름으로써 첨가한다.
4. 다음으로, 80 μL의 젖산을 제제에 첨가한다.
5. 25 mg의 에토숙시미드를 첨가한다.
6. 이 물질을 첨가하고 나면, 혼합물을 5분 동안 추가로 교반한다.
7. 상기 혼합물의 최종 pH가 5.5가 되도록 하기 위해, 50 mL의 혼합물을 100 mL 비커에 넣고 사전에 조정된 Lutron PH-206 pH 미터 전극(Lutron Electronics Co. Inc., Pennsylvania, USA)을 여기에 담근다.
8. 7단계의 혼합물을 교반기에 저회전으로 놓고 알칼리성 용액을 pH 5.5에 도달할 때까지 적가하면서, 응집체에 의해 생성되는 거품에 주의한다.
9. 제제를 10분 동안 1 atm 과압에서 120℃의 오토클레이브 Arcano LS-B75L에서 멸균한다.
10. 멸균 공정 완료 후, 50 mL의 조제 용액을 50 mL 원뿔형 튜브에 넣고 200 μg의 rh-도르나제 알파 효소(Roche, Basel, Switzerland)를 멸균 조건에서 첨가하여 최종 농도가 3.90 μg/mL가 되도록 한다. 이 단계는 생물학적 안전 캐비닛에서 수행한다.
11. 튜브를 밀봉하고 1분 동안 볼텍스에서 혼합한다.
겔 수득: 혼합물을 제조한다(용액 + g).
12. 조제 혼합물에 0.85 g의 하이드록시에틸셀룰로오스를 첨가한다.
13. 균질화될 때까지 부드럽게 섞는다.
14. 제제를 알루미늄 호일을 사용하여 빛을 차단한 다음 4 - 25 ℃에서 보관하고 덮어둔다. 거품이 제거되기까지 6 내지 8 시간 동안 그대로 두어야 한다.
실시예 9
발명의 조성물. 실험실에서 혼합물 No. 16(M16)의 겔 제조.
본 발명의 조성물은 다음으로 구성된다:
a. 3.00 mg/mL 폴리소르베이트 80
b. 2.50 mg/mL 아스코르브산
c. 8.67 mg/mL 젖산(85% - 90% 순도)
d. 0.75 mg/mL EDTA
e. 30.00 mg/mL 에토숙시미드
f. 3.90 μg/mL DNase
g. 17 mg/mL 하이드록시에틸 셀룰로오스
혼합물을 제조한다(a+b+c+d+e+f).
혼합 용매 50 mL에 다음을 첨가한다: 125 mg의 아스코르브산, 37.5 mg의 EDTA, 1500 mg의 에토숙시미드, 200 μg의 rh-도르나제 알파, 141 μL의 폴리소르베이트 80 및 424 μL의 젖산.
제조 방법:
1. 125 mg의 아스코르브산과 37.5 mg의 EDTA를 분석용 저울 Radwag AS 220 R2(Radwag LLC, Radom, Poland)의 시계 접시에 단다.
2. 혼합 용매를 사용하여 이 물질이 유리 비커에 용출되고 시계 접시에 입자가 남지 않도록 한다.
3. 50 mL의 용매 혼합물의 나머지를 비커에 첨가한 후, 고체 입자가 부분적으로 용해될 때까지 제제를 NUMAK GL-3250A 자기 교반기(Numak Technology LLC, Dubai, UAE)에 5분 동안 둔다. 교반하는 동안, 141 μL의 폴리소르베이트 80을 200 μL 팁의 끝을 자름으로써 첨가한다.
4. 다음으로, 424 μL의 젖산을 제제에 첨가한다.
5. 1500 mg의 에토숙시미드를 첨가한다.
6. 이 물질을 첨가하고 나면, 혼합물을 5분 동안 추가로 교반한다.
7. 제제의 pH를 측정하기 위해 Lutron PH-206 pH 미터 전극(Lutron Electronics Co. Inc., Pennsylvania, USA)을 조정한다.
8. 용액의 최종 pH가 5.5가 되도록 하기 위해, 50 mL의 용액을 pH 미터와 함께 교반기 위에 저회전으로 놓은 100 mL 비커에 넣고, 알칼리성 용액을 pH 수준에 도달할 때까지 적가하면서, 응집체에 의해 생성되는 거품에 주의한다.
9. 제제를 10분 동안 1 atm 과압에서 120℃의 오토클레이브 Arcano LS-B75L에서 멸균한다.
10. 멸균 공정 완료 후, 50 mL의 조제 용액을 50 mL 원뿔형 튜브에 넣고 200 μg의 rh-도르나제 알파 효소(Roche, Basel, Switzerland)를 멸균 조건에서 첨가하여 최종 농도가 3.90 μg/mL가 되도록 한다. 이 단계는 생물학적 안전 캐비닛에서 수행한다.
11. 튜브를 밀봉하고 1분 동안 볼텍스에서 혼합한다.
겔 수득: 혼합물을 제조한다(용액 + g).
12. 조제 혼합물에 0.85 g의 하이드록시에틸셀룰로오스를 첨가한다.
13. 균질화될 때까지 부드럽게 섞는다.
14. 제제를 알루미늄 호일을 사용하여 빛을 차단한 다음 4 - 25 ℃에서 보관하고 덮어둔다. 거품이 제거되기까지 6 내지 8 시간 동안 그대로 두어야 한다.
실시예 10
발명의 조성물. 바람직한 약학적 제형으로의 혼합물 No. 0(M0) 제조.
본 발명의 조성물은 다음으로 구성된다:
a. 6.5 mg/mL 젖산(85% - 90% 순도)
b. 3.00 mg/mL 에토숙시미드
c. 0.97 μg/mL DNase
d. 17 mg/mL 하이드록시에틸 셀룰로오스
용액: 혼합물을 제조한다(a+b).
혼합 용매 50 mL에, 150.0 mg의 에토숙시미드, 318 μL의 젖산을 첨가한다.
제조 방법:
1. 150.0 mg의 에토숙시미드를 분석용 저울 Radwag AS 220 R2(Radwag LLC, Radom, Poland)의 시계 접시에 단다.
2. 혼합 용매를 사용하여 이 물질이 유리 비커에 용출되고 시계 접시에 입자가 남지 않도록 한다.
3. 고체 입자가 부분적으로 용해될 때까지 제제가 있는 비커를 NUMAK GL-3250A 자기 교반기(Numak Technology LLC, Dubai, UAE)에 5분 동안 둔다.
4. 다음으로, 318 μL의 젖산을 제제에 첨가한다.
5. 이 물질을 첨가하고 나면, 혼합물을 5분 동안 추가로 교반한다.
6. 제제의 pH를 측정하기 위해 Lutron PH-206 pH 미터 전극(Lutron Electronics Co. Inc., Pennsylvania, USA)을 조정한다.
7. 용액의 최종 pH가 5.5가 되도록 하기 위해, 50 mL의 용액을 조정된 pH 미터 Lutron PH-206과 함께 교반기 위에 저회전으로 놓은 100 mL 비커에 넣고, 알칼리성 용액을 pH 수준에 도달할 때까지 적가하면서, 응집체에 의해 생성되는 거품에 주의한다.
8. 제제를 10분 동안 1 atm 과압에서 120℃의 오토클레이브 Arcano LS-B75L에서 멸균하고 4 - 25 ℃에서 밀폐되고 광원으로부터 차단된 곳에서 보관한다.
약학적 제형: 본 발명의 바람직한 약학적 형태는 겔이다. 겔은 2-단계 과정을 거쳐 얻어진다. 적용 장치는 2개의 접이식 막으로 분리된 3개의 용기를 포함한다. 본 발명의 제형은 다음을 포함한다:
제1 용기: 기대하는 유동학적 특성을 갖는 겔을 얻기 위해, 이 용기에 0.85 g의 동결건조된 하이드록시에틸 셀룰로오스를 충분히 넣는다.
제2 용기: 이 용기에 50 μg의 동결건조된 rh-도르나제 알파를 충분히 넣어 0.97 μg/mL의 최종 용액을 얻는다.
제3 용기: 이 용기에 50 mL의 8단계 제제를 넣는다.
첫 번째 혼합 단계에서, 제2막이 부숴져 제2 용기와 제3 용기의 내용물이 혼합된다. 혼합이 균질화를 향상시킨다.
두 번째 혼합 단계에서, 제1막이 부숴져 균질액과 제1 용기의 내용물이 혼합된다. 이 용기에는 부형제가 있으므로 이 단계에서 최종 제약 형태의 겔이 생성된다. 혼합이 모든 구성 요소의 균질화를 향상시킨다.
실시예 11
발명의 조성물. 바람직한 약학적 제형으로의 혼합물 No. 13(M13)의 제조.
본 발명의 조성물은 다음으로 구성된다:
a. 3.00 mg/mL 폴리소르베이트 80
b. 1.00 mg/mL 아스코르브산
c. 6.50 mg/mL 젖산(85% - 90% 순도)
d. 0.50 mg/mL EDTA
e. 3.00 mg/mL 에토숙시미드
f. 0.97 μg/mL DNase
g. 17 mg/mL 하이드록시에틸 셀룰로오스
용액: 혼합물을 제조한다(a+b+c+d+e).
혼합 용매 50 mL에 다음을 첨가한다: 50 mg의 아스코르브산, 25 mg의 EDTA, 150 mg의 에토숙시미드, 141 μL의 폴리소르베이트 80 및 318 μL의 젖산.
제조 방법:
1. 50 mg의 아스코르브산과 25 mg의 EDTA를 시계 접시에 단다.
2. 혼합 용매가 유리 비커에 용출되고 시계 접시에 입자가 남지 않도록 한다.
3. 50 mL의 용매 혼합물의 나머지를 비커에 첨가한 후, 고체 입자가 부분적으로 용해될 때까지 제제를 NUMAK GL-3250A 자기 교반기(Numak Technology LLC, Dubai, UAE)에 5분 동안 둔다.
교반하는 동안, 141 μL의 폴리소르베이트 80을 200 μL 팁의 끝을 자름으로써 첨가한다.
4. 다음으로, 318 μL의 젖산을 제제에 첨가한다.
5. 150 mg의 에토숙시미드를 첨가한다.
6. 이 물질을 첨가하고 나면, 혼합물을 5분 동안 추가로 교반한다.
7. 용액의 최종 pH가 5.5가 되도록 하기 위해, 50 mL의 용액을 조정된 pH 미터 Lutron PH-206과 함께 교반기 위에 저회전으로 놓은 100 mL 비커에 넣고, 알칼리성 용액을 pH 수준에 도달할 때까지 적가하면서, 응집체에 의해 생성되는 거품에 주의한다.
8. 제제를 10분 동안 1 atm 과압에서 120℃의 오토클레이브 Arcano LS-B75L에서 멸균하고 4 - 25 ℃에서 밀폐되고 광원으로부터 차단된 곳에서 보관한다.
약학적 제형: 본 발명의 바람직한 약학적 형태는 겔이다. 겔은 2-단계 과정을 거쳐 얻어진다. 적용 장치는 2개의 접이식 막으로 분리된 3개의 용기로 구성된다. 본 발명의 제형은 다음을 포함한다:
제1 용기: 기대하는 유동학적 특성을 갖는 겔을 얻기 위해, 이 용기에 0.85 g의 동결건조된 하이드록시에틸 셀룰로오스를 충분히 넣는다.
제2 용기: 이 용기에 50 μg의 동결건조된 rh-도르나제 알파를 충분히 넣어 0.97 μg/mL의 용액을 얻는다.
제3 용기: 이 용기에 50 mL의 8단계 제제를 넣는다.
첫 번째 혼합 단계에서, 제2막이 부숴져 제2 용기와 제3 용기의 내용물이 혼합된다. 혼합이 균질화를 향상시킨다.
두 번째 혼합 단계에서, 제1막이 부숴져 균질액과 제1 용기의 내용물이 혼합된다. 이 용기에는 부형제가 있으므로 이 단계에서 최종 제약 형태의 겔이 생성된다. 혼합이 모든 구성 요소의 균질화를 향상시킨다.
실시예 12
발명의 조성물. 바람직한 약학적 제형으로의 혼합물 No. 15(M15)의 제조.
본 발명의 조성물은 다음으로 구성된다:
a. 2.00 mg/mL 폴리소르베이트 80
b. 0.50 mg/mL 아스코르브산
c. 1.63 mg/mL 젖산(85% - 90% 순도)
d. 0.25 mg/mL EDTA
e. 0.50 mg/mL 에토숙시미드
f. 3.90 μg/mL DNase
g. 17 mg/mL 하이드록시에틸 셀룰로오스
용액: 혼합물을 제조한다(a+b+c+d+e).
혼합 용매 50 mL에 다음을 첨가한다: 25 mg의 아스코르브산, 12 mg의 EDTA, 25 mg의 에토숙시미드, 94 μL의 폴리소르베이트 80 및 80 μL의 젖산.
제조 방법:
1. 25 mg의 아스코르브산과 12.5 mg의 EDTA를 시계 접시에 단다.
2. 혼합 용매를 사용하여 이 물질이 유리 비커에 용출되고 시계 접시에 입자가 남지 않도록 한다.
3. 50 mL의 용매 혼합물의 나머지를 비커에 첨가한 후, 고체 입자가 부분적으로 용해될 때까지 제제를 NUMAK GL-3250A 자기 교반기(Numak Technology LLC, Dubai, UAE)에 5분 동안 둔다.
교반하는 동안, 94 μL의 폴리소르베이트 80을 200 μL 팁의 끝을 자름으로써 첨가한다.
4. 다음으로, 80 μL의 젖산을 제제에 첨가한다.
5. 25 mg의 에토숙시미드를 첨가한다.
6. 이 물질을 첨가하고 나면, 혼합물을 5분 동안 추가로 교반한다.
7. 용액의 최종 pH가 5.5가 되도록 하기 위해, 50 mL의 용액을 pH 미터와 함께 교반기 위에 저회전으로 놓은 100 mL 비커에 넣고, 알칼리성 용액을 pH 수준에 도달할 때까지 적가하면서, 응집체에 의해 생성되는 거품에 주의한다.
8. 제제를 10분 동안 1 atm 과압에서 120℃의 오토클레이브 Arcano LS-B75L에서 멸균하고 4 - 25 ℃에서 밀폐되고 광원으로부터 차단된 곳에서 보관한다.
약학적 제형: 본 발명의 바람직한 약학적 형태는 겔이다. 겔은 2-단계 과정을 거쳐 얻어진다. 적용 장치는 2개의 접이식 막으로 분리된 3개의 용기로 구성된다. 본 발명의 제형은 다음을 포함한다:
제1 용기: 기대하는 유동학적 특성을 갖는 겔을 얻기 위해, 이 용기에 0.85 g의 동결건조된 하이드록시에틸 셀룰로오스를 충분히 넣는다.
제2 용기: 이 용기에 200 μg의 동결건조된 rh-도르나제 알파를 충분히 넣어 3.90 μg/mL의 용액을 얻는다.
제3 용기: 이 용기에 50 mL의 8단계 제제를 넣는다.
첫 번째 혼합 단계에서, 제2막이 부숴져 제2 용기와 제3 용기의 내용물이 혼합된다. 혼합이 균질화를 향상시킨다.
두 번째 혼합 단계에서, 제1막이 부숴져 균질액과 제1 용기의 내용물이 혼합된다. 이 용기에는 부형제가 있으므로 이 단계에서 최종 제약 형태의 겔이 생성된다. 혼합이 모든 구성 요소의 균질화를 향상시킨다.
실시예 13
발명의 조성물. 바람직한 약학적 제형으로의 혼합물 No. 16(M16)의 겔 제조.
본 발명의 조성물은 다음으로 구성된다:
a. 3.00 mg/mL 폴리소르베이트 80
b. 2.50 mg/mL 아스코르브산
c. 8.67 mg/mL 젖산(85% - 90% 순도)
d. 0.75 mg/mL EDTA
e. 30.00 mg/mL 에토숙시미드
f. 3.90 μg/mL DNase
g. 17 mg/mL 하이드록시에틸 셀룰로오스
용액: 혼합물을 제조한다(a+b+c+d+e).
혼합 용매 50 mL에 다음을 첨가한다: 125 mg의 아스코르브산, 37.5 mg의 EDTA, 1500 mg의 에토숙시미드, 141 μL의 폴리소르베이트 80 및 424 μL의 젖산.
제조 방법:
1. 125 mg의 아스코르브산과 37.5 mg의 EDTA를 분석용 저울 Radwag AS 220 R2(Radwag LLC, Radom, Poland)의 시계 접시에 단다.
2. 용매 혼합물을 사용하여 이 물질이 유리 비커에 용출되고 시계 접시에 입자가 남지 않도록 한다.
3. 50 mL의 혼합 용매의 나머지를 비커에 첨가한 후, 고체 입자가 부분적으로 용해될 때까지 제제를 NUMAK GL-3250A 자기 교반기(Numak Technology LLC, Dubai, UAE)에 5분 동안 둔다.
교반하는 동안, 141 μL의 폴리소르베이트 80을 200 μL 팁의 끝을 자름으로써 첨가한다.
4. 다음으로, 424 μL의 젖산을 제제에 첨가한다.
5. 1500 mg의 에토숙시미드를 첨가한다.
6. 이 물질을 첨가하고 나면, 혼합물을 5분 동안 추가로 교반한다.
7. 6단계의 혼합물의 최종 pH가 5.5가 되도록 하기 위해, 50 mL의 용액을 pH 미터 Lutron PH-206 전극과 함께 교반기 위에 저회전으로 놓은 100 mL 비커에 넣고, 알칼리성 용액을 pH 수준에 도달할 때까지 적가하면서, 응집체에 의해 생성되는 거품에 주의한다.
8. 제제를 10분 동안 1 atm 과압에서 120℃의 오토클레이브 Arcano LS-B75L에서 멸균하고, 이 단계 후 4 - 25 ℃에서 밀폐되고 광원으로부터 차단된 곳에서 보관한다.
약학적 제형: 본 발명의 바람직한 약학적 형태는 겔이다. 겔은 2-단계 과정을 거쳐 얻어진다. 적용 장치는 2개의 접이식 막으로 분리된 3개의 용기로 구성된다. 본 발명의 제형은 다음을 포함한다:
제1 용기: 기대하는 유동학적 특성을 갖는 겔을 얻기 위해, 이 용기에 0.85 g의 동결건조된 하이드록시에틸 셀룰로오스를 충분히 넣는다.
제2 용기: 이 용기에 200 μg의 동결건조된 rh-도르나제 알파를 충분히 넣어 3.90 μg/mL의 용액을 얻는다.
제3 용기: 이 용기에 50 mL의 8단계 제제를 넣는다.
첫 번째 혼합 단계에서, 제2막이 부숴져 제2 용기와 제3 용기의 내용물이 혼합된다. 혼합이 균질화를 향상시킨다.
두 번째 혼합 단계에서, 제1막이 부숴져 균질액과 제1 용기의 내용물이 혼합된다. 이 용기에는 부형제가 있으므로 이 단계에서 최종 제약 형태의 겔이 생성된다. 혼합이 모든 구성 요소의 균질화를 향상시킨다.
실시예 14
발명의 조성물. 바람직한 약학적 제형으로의 혼합물 No. 0(M0) 제조.
본 발명의 조성물은 다음으로 구성된다:
a. 6.5 mg/mL 젖산(85% - 90% 순도)
b. 3.00 mg/mL 에토숙시미드
c. 0.97 μg/mL DNase
d. 17 mg/mL 하이드록시에틸 셀룰로오스
용액: 혼합물을 제조한다(a+b).
혼합 용매 50 mL에 다음을 첨가한다: 150.0 mg의 에토숙시미드 및 318 μL의 젖산.
제조 방법:
1. 150.0 mg의 에토숙시미드를 분석용 저울 Radwag AS 220 R2(Radwag LLC, Radom, Poland)의 시계 접시에 단다.
2. 전체 혼합 용매를 사용하여 이 물질이 유리 비커에 용출되고 시계 접시에 입자가 남지 않도록 한다.
3. 고체 입자가 부분적으로 용해될 때까지 제제가 있는 비커를 NUMAK GL-3250A 자기 교반기(Numak Technology LLC, Dubai, UAE)에 5분 동안 둔다.
4. 다음으로, 318 μL의 젖산을 제제에 첨가한다.
5. 이 물질을 첨가하고 나면, 혼합물을 5분 동안 추가로 교반한다.
6. 용액의 최종 pH가 5.5가 되도록 하기 위해, 50 mL의 용액을 조정된 Lutron PH-206 pH 미터 전극과 함께 교반기 위에 저회전으로 놓은 100 mL 비커에 넣고, 알칼리성 용액을 pH 수준에 도달할 때까지 적가하면서, 응집체에 의해 생성되는 거품에 주의한다.
7. 제제를 10분 동안 1 atm 과압에서 120℃의 오토클레이브 Arcano LS-B75L에서 멸균하고 4 - 25 ℃에서 밀폐되고 광원으로부터 차단된 곳에서 보관한다.
약학적 형태: 본 발명의 바람직한 약학적 형태는 겔이다. 겔은 1-단계 과정을 거쳐 얻어진다. 적용 장치는 1개의 접이식 막으로 분리된 2개의 용기로 구성된다. 본 발명의 제형은 다음을 포함한다:
제1 용기: 이 용기에 50 mL의 7단계 제제를 넣는다.
제2 용기: 이 용기에 50 μg의 동결건조된 rh-도르나제 알파를 충분히 넣어 0.97 μg/mL의 용액을 얻고 0.85 g의 동결건조된 하이드록시에틸 셀룰로오스를 충분히 넣어 기대하는 유동학적 특성을 갖는 겔을 얻는다.
혼합 단계에서, 접이식 막이 부숴져 제1 용기와 제2 용기의 내용물이 혼합된다. 혼합이 최종 약학적 형태를 얻게 하고 모든 구성 요소의 균질화를 향상시킨다.
실시예 15
발명의 조성물. 바람직한 약학적 제형으로의 혼합물 No. 13(M13)의 제조.
본 발명의 조성물은 다음으로 구성된다:
a. 3.00 mg/mL 폴리소르베이트 80
b. 1.00 mg/mL 아스코르브산
c. 6.50 mg/mL 젖산(85% - 90% 순도)
d. 0.50 mg/mL EDTA
e. 3.00 mg/mL 에토숙시미드
f. 0.97 μg/mL DNase
g. 17 mg/mL 하이드록시에틸 셀룰로오스
용액: 혼합물을 제조한다(a+b+c+d+e).
혼합 용매 50 mL에 다음을 첨가한다: 50 mg의 아스코르브산, 25 mg의 EDTA, 150 mg의 에토숙시미드, 141 μL의 폴리소르베이트 80 및 318 μL의 젖산.
제조 방법:
1. 50 mg의 아스코르브산과 25 mg의 EDTA를 분석용 저울 Radwag AS 220 R2(Radwag LLC, Radom, Poland)의 시계 접시에 단다.
2. 혼합 용매를 사용하여 이 물질이 유리 비커에 용출되고 시계 접시에 입자가 남지 않도록 한다.
3. 50 mL의 용매 혼합물의 나머지를 비커에 첨가한 후, 고체 입자가 부분적으로 용해될 때까지 제제를 NUMAK GL-3250A 자기 교반기(Numak Technology LLC, Dubai, UAE)에 5분 동안 둔다.
교반하는 동안, 141 μL의 폴리소르베이트 80을 200 μL 팁의 끝을 자름으로써 첨가한다.
4. 다음으로, 318 μL의 젖산을 제제에 첨가한다.
5. 150 mg의 에토숙시미드를 첨가한다.
6. 이 물질을 첨가하고 나면, 혼합물을 5분 동안 추가로 교반한다.
7. 용액의 최종 pH가 5.5가 되도록 하기 위해, 50 mL의 용액을 조정된 pH 미터 Lutron PH-206과 함께 교반기 위에 저회전으로 놓은 100 mL 비커에 넣고, 알칼리성 용액을 pH 수준에 도달할 때까지 적가하면서, 응집체에 의해 생성되는 거품에 주의한다.
8. 제제를 10분 동안 1 atm 과압에서 120℃의 오토클레이브 Arcano LS-B75L에서 멸균하고 4 - 25 ℃에서 밀폐되고 광원으로부터 차단된 곳에서 보관한다.
약학적 형태: 본 발명의 바람직한 약학적 형태는 겔이다. 겔은 1-단계 과정을 거쳐 얻어진다. 적용 장치는 1개의 접이식 막으로 분리된 2개의 용기로 구성된다. 본 발명의 제형은 다음을 포함한다:
제1 용기: 이 용기에 50 mL의 8 단계 제제를 넣는다.
제2 용기: 이 용기에 50 μg의 동결건조된 rh-도르나제 알파를 충분히 넣어 0.97 μg/mL의 용액을 얻고 0.85 g의 동결건조된 하이드록시에틸 셀룰로오스를 충분히 넣어 기대하는 유동학적 특성을 갖는 겔을 얻는다.
혼합 단계에서, 접이식 막이 부숴져 제1 용기와 제2 용기의 내용물이 혼합된다. 혼합이 최종 약학적 형태를 얻게 하고 모든 구성 요소의 균질화를 향상시킨다.
실시예 16
발명의 조성물. 바람직한 약학적 제형으로의 혼합물 No. 15(M15)의 제조
본 발명의 조성물은 다음으로 구성된다:
a. 2.00 mg/mL 폴리소르베이트 80
b. 0.50 mg/mL 아스코르브산
c. 1.63 mg/mL 젖산(85% - 90% 순도)
d. 0.25 mg/mL EDTA
e. 0.50 mg/mL 에토숙시미드
f. 3.90 μg/mL DNase
g. 17 mg/mL 하이드록시에틸 셀룰로오스
용액: 혼합물을 제조한다(a+b+c+d+e).
혼합 용매 50 mL에 다음을 첨가한다: 25 mg의 아스코르브산, 12.5 mg의 EDTA, 25 mg의 에토숙시미드, 94 μL의 폴리소르베이트 80 및 80 μL의 젖산.
제조 방법:
1. 25 mg의 아스코르브산과 12.5 mg의 EDTA를 분석용 저울 Radwag AS 220 R2(Radwag LLC, Radom, Poland)의 시계 접시에 단다.
2. 혼합 용매를 사용하여 이 물질이 유리 비커에 용출되고 시계 접시에 입자가 남지 않도록 한다.
3. 50 mL의 용매 혼합물의 나머지를 비커에 첨가한 후, 고체 입자가 부분적으로 용해될 때까지 제제를 NUMAK GL-3250A 자기 교반기(Numak Technology LLC, Dubai, UAE)에 5분 동안 둔다.
교반하는 동안, 94 μL의 폴리소르베이트 80을 200 μL 팁의 끝을 자름으로써 첨가한다.
4. 다음으로, 80 μL의 젖산을 제제에 첨가한다.
5. 25 mg의 에토숙시미드를 첨가한다.
6. 이 물질을 첨가하고 나면, 혼합물을 5분 동안 추가로 교반한다.
7. 용액의 최종 pH가 5.5가 되도록 하기 위해, 50 mL의 용액을 조정된 pH 미터 Lutron PH-206과 함께 교반기 위에 저회전으로 놓은 100 mL 비커에 넣고, 알칼리성 용액을 pH 수준에 도달할 때까지 적가하면서, 응집체에 의해 생성되는 거품에 주의한다.
8. 제제를 10분 동안 1 atm 과압에서 120℃의 오토클레이브 Arcano LS-B75L에서 멸균하고 4 - 25 ℃에서 밀폐되고 광원으로부터 차단된 곳에서 보관한다.
약학적 형태: 본 발명의 바람직한 약학적 형태는 겔이다. 겔은 1-단계 과정을 거쳐 얻어진다. 적용 장치는 1개의 접이식 막으로 분리된 2개의 용기로 구성된다. 본 발명의 제형은 다음을 포함한다:
제1 용기: 이 용기에 50 mL의 8 단계 제제를 넣는다.
제2 용기: 이 용기에 200 μg의 동결건조된 rh-도르나제 알파를 충분히 넣어 3.90 μg/mL의 용액을 얻고 이 용기에 0.85 g의 동결건조된 하이드록시에틸 셀룰로오스를 충분히 넣어 기대하는 유동학적 특성을 갖는 겔을 얻는다.
혼합 단계에서, 접이식 막이 부숴져 제1 용기와 제2 용기의 내용물이 혼합된다. 혼합이 최종 약학적 형태를 얻게 하고 모든 구성 요소의 균질화를 향상시킨다.
실시예 17
발명의 조성물. 바람직한 약학적 제형으로의 혼합물 No. 16(M16)의 제조
본 발명의 조성물은 다음으로 구성된다:
a. 3.00 mg/mL 폴리소르베이트 80
b. 2.50 mg/mL 아스코르브산
c. 8.67 mg/mL 젖산(85% - 90% 순도)
d. 0.75 mg/mL EDTA
e. 30.00 mg/mL 에토숙시미드
f. 3.90 μg/mL DNase
g. 17 mg/mL 하이드록시에틸 셀룰로오스
용액: 혼합물을 제조한다(a+b+c+d+e).
혼합 용매 50 mL에 다음을 첨가한다: 125 mg의 아스코르브산, 37.5 mg의 EDTA, 1500 mg의 에토숙시미드, 141 μL의 폴리소르베이트 80 및 424 μL의 젖산.
제조 방법:
1. 125 mg의 아스코르브산과 37.5 mg의 EDTA를 분석용 저울 Radwag AS 220 R2(Radwag LLC, Radom, Poland)의 시계 접시에 단다.
2. 혼합 용매를 사용하여 이 물질이 유리 비커에 용출되고 시계 접시에 입자가 남지 않도록 한다.
3. 50 mL의 용매 혼합물의 나머지를 비커에 첨가한 후, 고체 입자가 부분적으로 용해될 때까지 제제를 NUMAK GL-3250A 자기 교반기(Numak Technology LLC, Dubai, UAE)에 5분 동안 둔다.
교반하는 동안, 141 μL의 폴리소르베이트 80을 200 μL 팁의 끝을 자름으로써 첨가한다.
4. 다음으로, 424 μL의 젖산을 제제에 첨가한다.
5. 1500 mg의 에토숙시미드를 첨가한다.
6. 이 물질을 첨가하고 나면, 혼합물을 5분 동안 추가로 교반한다.
7. 용액의 최종 pH가 5.5가 되도록 하기 위해, 50 mL의 용액을 조정된 pH 미터 Lutron PH-206과 함께 교반기 위에 저회전으로 놓은 100 mL 비커에 넣고, 알칼리성 용액을 pH 수준에 도달할 때까지 적가하면서, 응집체에 의해 생성되는 거품에 주의한다.
8. 제제를 10분 동안 1 atm 과압에서 120℃의 오토클레이브 Arcano LS-B75L에서 멸균하고 4 - 25 ℃에서 밀폐되고 광원으로부터 차단된 곳에서 보관한다.
약학적 형태: 본 발명의 바람직한 약학적 형태는 겔이다. 겔은 1-단계 과정을 거쳐 얻어진다. 적용 장치는 1개의 접이식 막으로 분리된 2개의 용기로 구성된다. 본 발명의 제형은 다음을 포함한다:
제1 용기: 이 용기에 50 mL의 8 단계 제제를 넣는다.
제2 용기: 이 용기에 200 μg의 동결건조된 rh-도르나제 알파를 충분히 넣어 3.90 μg/mL의 용액을 얻고 0.85 g의 동결건조된 하이드록시에틸 셀룰로오스를 충분히 넣어 기대하는 유동학적 특성을 갖는 겔을 얻는다.
혼합 단계에서, 접이식 막이 부숴져 제1 용기와 제2 용기의 내용물이 혼합된다. 혼합이 최종 약학적 형태를 얻게 하고 모든 구성 요소의 균질화를 향상시킨다.
실시예 18
발명의 조성물. 실험실에서 혼합물 No. 0(M0)의 제조
본 발명의 조성물은 다음으로 구성된다:
a. 6.50 mg/mL 젖산(85% - 90% 순도)
b. 3.00 mg/mL 에토숙시미드
c. 0.97 μg/mL DNase
용액: 혼합물을 제조한다(a+b+c).
혼합 용매 50 mL에 다음을 첨가한다: 150 mg의 에토숙시미드, 50 μg의 rh-도르나제 알파, 및 318 μL의 젖산.
제조 방법
1. 150 mg의 에토숙시미드를 분석용 저울 Radwag AS 220 R2(Radwag LLC, Radom, Poland)의 시계 접시에 단다.
2. 전체 혼합 용매를 사용하여 이 물질이 유리 비커에 용출되고 시계 접시에 입자가 남지 않도록 한다.
3. 고체 입자가 부분적으로 용해될 때까지 제제가 있는 비커를 NUMAK GL-3250A 자기 교반기(Numak Technology LLC, Dubai, UAE)에 5분 동안 둔다.
4. 다음으로, 318 μL의 젖산을 제제에 첨가한다.
5. 이 물질을 첨가하고 나면, 혼합물을 5분 동안 추가로 교반한다.
6. 용액의 최종 pH가 5.5가 되도록 하기 위해, 50 mL의 용액을 조정된 pH 미터 Lutron PH-206과 함께 교반기 위에 저회전으로 놓은 100 mL 비커에 넣고, 알칼리성 용액을 pH 수준에 도달할 때까지 적가하면서, 응집체에 의해 생성되는 거품에 주의한다.
7. 제제를 10분 동안 1 atm 과압에서 120℃의 오토클레이브 Arcano LS-B75L에서 멸균한다.
8. 50 mL의 7 단계 제제를 원뿔형 튜브(50 mL)에 넣고 0.05 mL의 도르나제 알파 1 mg/mL 효소 Pulmozyme(Roche, Basel, Switzerland)을 멸균 조건에서 첨가하여 최종 농도가 0.97 μg/mL가 되도록 한다. 이 단계는 생물학적 안전 캐비닛에서 수행한다.
9. 튜브를 밀봉하고 10초 동안 볼텍스에서 혼합한다.
10. 제제를 알루미늄 호일을 사용하여 빛을 차단한 다음 4 ℃ - 25 ℃에서 보관한다.
실시예 19
발명의 조성물. 실험실에서 혼합물 No. 13(M13)의 제조
본 발명의 조성물은 다음으로 구성된다:
a. 3.00 mg/mL 폴리소르베이트 80
b. 1 mg/mL 아스코르브산
c. 6.50 mg/mL 젖산(85% - 90% 순도)
d. 0.50 mg/mL EDTA
e. 3.00 mg/mL 에토숙시미드
f. 0.97 μg/mL DNase
용액: 혼합물을 제조한다(a+b+c+d+e+f).
혼합 용매 50 mL에 다음을 첨가한다: 50 mg의 아스코르브산, 25 mg의 EDTA, 150 mg의 에토숙시미드, 50 μg의 rh-도르나제 알파, 141 μL의 폴리소르베이트 80 및 318 μL의 젖산.
제조 방법:
1. 50 mg의 아스코르브산과 25 mg의 EDTA를 분석용 저울 Radwag AS 220 R2(Radwag LLC, Radom, Poland)의 시계 접시에 단다.
2. 혼합 용매를 사용하여 이 물질이 유리 비커에 용출되고 시계 접시에 입자가 남지 않도록 한다.
3. 50 mL의 용매 혼합물의 나머지를 비커에 첨가한 후, 고체 입자가 부분적으로 용해될 때까지 제제를 NUMAK GL-3250A 자기 교반기(Numak Technology LLC, Dubai, UAE)에 5분 동안 둔다.
교반하는 동안, 141 μL의 폴리소르베이트 80을 200 μL 팁의 끝을 자름으로써 첨가한다.
4. 다음으로, 318 μL의 젖산을 제제에 첨가한다.
5. 150 mg의 에토숙시미드를 첨가한다.
6. 이 물질을 첨가하고 나면, 혼합물을 5분 동안 추가로 교반한다.
7. 용액의 최종 pH가 5.5가 되도록 하기 위해, 50 mL의 용액을 조정된 pH 미터 Lutron PH-206과 함께 교반기 위에 저회전으로 놓은 100 mL 비커에 넣고, 알칼리성 용액을 pH 수준에 도달할 때까지 적가하면서, 응집체에 의해 생성되는 거품에 주의한다.
8. 제제를 10분 동안 1 atm 과압에서 120℃의 오토클레이브 Arcano LS-B75L에서 멸균한다.
9. 50 mL의 8 단계 제제를 원뿔형 튜브(50 mL)에 넣고 0.05 mL의 도르나제 알파 1 mg/mL 효소 Pulmozyme(Roche, Basel, Switzerland)을 멸균 조건에서 첨가하여 최종 농도가 0.97 μg/mL가 되도록 한다. 이 단계는 생물학적 안전 캐비닛에서 수행한다.
10. 튜브를 밀봉하고 10초 동안 볼텍스에서 혼합한다.
11. 제제를 알루미늄 호일을 사용하여 빛을 차단한 다음 4 ℃ - 25 ℃에서 보관한다.
실시예 20
발명의 조성물. 실험실에서 혼합물 No. 15(M15)의 제조
본 발명의 조성물은 다음으로 구성된다:
a. 2.00 mg/mL 폴리소르베이트 80
b. 0.50 mg/mL 아스코르브산
c. 1.63 mg/mL 젖산(85% - 90% 순도)
d. 0.25 mg/mL EDTA
e. 0.50 mg/mL 에토숙시미드
f. 3.90 μg/mL DNase
용액: 혼합물을 제조한다(a+b+c+d+e+f).
혼합 용매 50 mL에 다음을 첨가한다: 25 mg의 아스코르브산, 12.5 mg의 EDTA, 25 mg의 에토숙시미드, 200 μg의 rh-도르나제 알파, 94 μL의 폴리소르베이트 80 및 80 μL의 젖산.
제조 방법:
1. 25 mg의 아스코르브산과 12.5 mg의 EDTA를 분석용 저울 Radwag AS 220 R2(Radwag LLC, Radom, Poland)의 시계 접시에 단다.
2. 혼합 용매를 사용하여 이 물질이 유리 비커에 용출되고 시계 접시에 입자가 남지 않도록 한다.
3. 50 mL의 용매 혼합물의 나머지를 비커에 첨가한 후, 고체 입자가 부분적으로 용해될 때까지 제제를 NUMAK GL-3250A 자기 교반기(Numak Technology LLC, Dubai, UAE)에 5분 동안 둔다.
교반하는 동안, 94 μL의 폴리소르베이트 80을 200 μL 팁의 끝을 자름으로써 첨가한다.
4. 다음으로, 80 μL의 젖산을 제제에 첨가한다.
5. 25 mg의 에토숙시미드를 첨가한다.
6. 이 물질을 첨가하고 나면, 혼합물을 5분 동안 추가로 교반한다.
7. 용액의 최종 pH가 5.5가 되도록 하기 위해, 50 mL의 용액을 조정된 pH 미터 Lutron PH-206과 함께 교반기 위에 저회전으로 놓은 100 mL 비커에 넣고, 알칼리성 용액을 pH 수준에 도달할 때까지 적가하면서, 응집체에 의해 생성되는 거품에 주의한다.
8. 제제를 10분 동안 1 atm 과압에서 120℃의 오토클레이브 Arcano LS-B75L에서 멸균한다.
9. 50 mL의 8 단계 제제를 원뿔형 튜브(50 mL)에 넣고 0.20 mL의 도르나제 알파 1 mg/mL 효소 Pulmozyme(Roche, Basel, Switzerland)을 멸균 조건에서 첨가하여 최종 농도가 3.90 μg/mL가 되도록 한다. 이 단계는 생물학적 안전 캐비닛에서 수행한다.
10. 튜브를 밀봉하고 10초 동안 볼텍스에서 혼합한다.
11. 제제를 알루미늄 호일을 사용하여 빛을 차단한 다음 4 ℃ - 25 ℃에서 보관한다.
실시예 21
발명의 조성물. 실험실에서 혼합물 No. 16(M16)의 제조
본 발명의 조성물은 다음으로 구성된다:
a. 3.00 mg/mL 폴리소르베이트 80
b. 2.50 mg/mL 아스코르브산
c. 8.67 mg/mL 젖산(85% - 90% 순도)
d. 0.75 mg/mL EDTA
e. 30.00 mg/mL 에토숙시미드
f. 3.90 μg/mL DNase
용액: 혼합물을 제조한다(a+b+c+d+e+f).
혼합 용매 50 mL에 다음을 첨가한다: 125 mg의 아스코르브산, 37.5 mg의 EDTA, 1500 mg의 에토숙시미드, 200 μg의 rh-도르나제 알파, 141 μL의 폴리소르베이트 80 및 424 μL의 젖산.
제조 방법:
1. 125 mg의 아스코르브산과 37.50 mg의 EDTA를 분석용 저울 Radwag AS 220 R2(Radwag LLC, Radom, Poland)의 시계 접시에 단다.
2. 혼합 용매를 사용하여 이 물질이 유리 비커에 용출되고 시계 접시에 입자가 남지 않도록 한다.
3. 50 mL의 용매 혼합물의 나머지를 비커에 첨가한 후, 고체 입자가 부분적으로 용해될 때까지 제제를 NUMAK GL-3250A 자기 교반기(Numak Technology LLC, Dubai, UAE)에 5분 동안 둔다.
교반하는 동안, 141 μL의 폴리소르베이트 80을 200 μL 팁의 끝을 자름으로써 첨가한다.
4. 다음으로, 424 μL의 젖산을 제제에 첨가한다.
5. 1500 mg의 에토숙시미드를 첨가한다.
6. 이 물질을 첨가하고 나면, 혼합물을 5분 동안 추가로 교반한다.
7. 용액의 최종 pH가 5.5가 되도록 하기 위해, 50 mL의 용액을 조정된 pH 미터 Lutron PH-206과 함께 교반기 위에 저회전으로 놓은 100 mL 비커에 넣고, 알칼리성 용액을 pH 수준에 도달할 때까지 적가하면서, 응집체에 의해 생성되는 거품에 주의한다.
8. 제제를 10분 동안 1 atm 과압에서 120℃의 오토클레이브 Arcano LS-B75L에서 멸균한다.
9. 50 mL의 8 단계 제제를 원뿔형 튜브(50 mL)에 넣고 0.20 mL의 도르나제 알파 1 mg/mL 효소 Pulmozyme(Roche, Basel, Switzerland)을 멸균 조건에서 첨가하여 최종 농도가 3.90 μg/mL가 되도록 한다. 이 단계는 생물학적 안전 캐비닛에서 수행한다.
10. 튜브를 밀봉하고 10초 동안 볼텍스에서 혼합한다.
11. 제제를 알루미늄 호일을 사용하여 빛을 차단한 다음 4 ℃ - 25 ℃에서 보관한다.
실시예 22
발명의 겔 조성물. 실험실에서 혼합물 No. 0(M0)의 제조
본 발명의 조성물은 다음으로 구성된다:
a. 6.50 mg/mL 젖산(85% - 90% 순도)
b. 3.00 mg/mL 에토숙시미드
c. 0.97 μg/mL DNase
d. 17 mg/mL 하이드록시에틸 셀룰로오스
용액: 혼합물을 제조한다(a+b+c).
혼합 용매 50 mL에 다음을 첨가한다: 150 mg의 에토숙시미드, 50 μg의 rh-도르나제 알파, 및 318 μL의 젖산.
제조 방법:
1. 150.0 mg의 에토숙시미드를 분석용 저울 Radwag AS 220 R2(Radwag LLC, Radom, Poland)의 시계 접시에 단다.
2. 전체 혼합 용매를 사용하여 이 물질이 유리 비커에 용출되고 시계 접시에 입자가 남지 않도록 한다.
3. 고체 입자가 부분적으로 용해될 때까지 제제가 있는 비커를 NUMAK GL-3250A 자기 교반기(Numak Technology LLC, Dubai, UAE)에 5분 동안 둔다.
4. 다음으로, 318 μL의 젖산을 제제에 첨가한다.
5. 이 물질을 첨가하고 나면, 혼합물을 5분 동안 추가로 교반한다.
6. 용액의 최종 pH가 5.5가 되도록 하기 위해, 50 mL의 용액을 조정된 pH 미터 Lutron PH-206과 함께 교반기 위에 저회전으로 놓은 100 mL 비커에 넣고, 알칼리성 용액을 pH 수준에 도달할 때까지 적가하면서, 응집체에 의해 생성되는 거품에 주의한다.
7. 제제를 10분 동안 1 atm 과압에서 120℃의 오토클레이브 Arcano LS-B75L에서 멸균한다.
8. 50 mL의 7 단계 제제를 원뿔형 튜브(50 mL)에 넣고 0.05 mL의 도르나제 알파 1 mg/mL 효소 Pulmozyme(Roche, Basel, Switzerland)을 멸균 조건에서 첨가하여 최종 농도가 0.97 μg/mL가 되도록 한다. 이 단계는 생물학적 안전 캐비닛에서 수행한다.
9. 튜브를 밀봉하고 10초 동안 볼텍스에서 혼합한다.
겔 수득: 혼합물을 제조한다(용액 + g).
10. 조제 혼합물에 0.85 g의 하이드록시에틸셀룰로오스를 첨가한다.
11. 균질화될 때까지 부드럽게 섞는다.
12. 제제를 알루미늄 호일을 사용하여 빛을 차단한 다음 4 - 25 ℃에서 보관하고 덮어둔다. 거품이 제거되기까지 6 내지 8 시간 동안 그대로 두어야 한다.
실시예 23
발명의 겔 조성물. 실험실에서 혼합물 No. 13(M13)의 제조
본 발명의 조성물은 다음으로 구성된다:
a. 3.00 mg/mL 폴리소르베이트 80
b. 1 mg/mL 아스코르브산
c. 6.50 mg/mL 젖산(85% - 90% 순도)
d. 0.50 mg/mL EDTA
e. 3.00 mg/mL 에토숙시미드
f. 0.97 μg/mL DNase
g. 17 mg/mL 하이드록시에틸 셀룰로오스
용액: 혼합물을 제조한다(a+b+c+d+e+f).
혼합 용매 50 mL에 다음을 첨가한다: 50 mg의 아스코르브산, 25 mg의 EDTA, 150 mg의 에토숙시미드, 50 μg의 rh-도르나제 알파, 141 μL의 폴리소르베이트 80 및 318 μL의 젖산.
제조 방법:
1. 50 mg의 아스코르브산과 25 mg의 EDTA를 분석용 저울 Radwag AS 220 R2(Radwag LLC, Radom, Poland)의 시계 접시에 단다.
2. 혼합 용매를 사용하여 이 물질이 유리 비커에 용출되고 시계 접시에 입자가 남지 않도록 한다.
3. 50 mL의 용매 혼합물의 나머지를 비커에 첨가한 후, 고체 입자가 부분적으로 용해될 때까지 제제를 NUMAK GL-3250A 자기 교반기(Numak Technology LLC, Dubai, UAE)에 5분 동안 둔다.
교반하는 동안, 141 μL의 폴리소르베이트 80을 200 μL 팁의 끝을 자름으로써 첨가한다.
4. 다음으로, 318 μL의 젖산을 제제에 첨가한다.
5. 150 mg의 에토숙시미드를 첨가한다.
6. 이 물질을 첨가하고 나면, 혼합물을 5분 동안 추가로 교반한다.
7. 용액의 최종 pH가 5.5가 되도록 하기 위해, 50 mL의 용액을 조정된 pH 미터 Lutron PH-206과 함께 교반기 위에 저회전으로 놓은 100 mL 비커에 넣고, 알칼리성 용액을 pH 수준에 도달할 때까지 적가하면서, 응집체에 의해 생성되는 거품에 주의한다.
8. 제제를 10분 동안 1 atm 과압에서 120℃의 오토클레이브 Arcano LS-B75L에서 멸균한다.
9. 50 mL의 8 단계 제제를 원뿔형 튜브(50 mL)에 넣고 0.05 mL의 도르나제 알파 1 mg/mL 효소 Pulmozyme(Roche, Basel, Switzerland)을 멸균 조건에서 첨가하여 최종 농도가 1.00 μg/mL가 되도록 한다. 이 단계는 생물학적 안전 캐비닛에서 수행한다.
10. 튜브를 밀봉하고 10초 동안 볼텍스에서 혼합한다.
겔 수득: 혼합물을 제조한다(용액 + g).
12. 조제 혼합물에 0.85 g의 하이드록시에틸셀룰로오스를 첨가한다.
13. 균질화될 때까지 부드럽게 섞는다.
14. 제제를 알루미늄 호일을 사용하여 빛을 차단한 다음 4 - 25 ℃에서 보관하고 덮어둔다. 거품이 제거되기까지 6 내지 8 시간 동안 그대로 두어야 한다.
실시예 24
발명의 겔 조성물. 실험실에서 혼합물 No. 15(M15)의 제조
본 발명의 조성물은 다음으로 구성된다:
a. 2.00 mg/mL 폴리소르베이트 80
b. 0.50 mg/mL 아스코르브산
c. 1.63 mg/mL 젖산(85% - 90% 순도)
d. 0.25 mg/mL EDTA
e. 0.50 mg/mL 에토숙시미드
f. 3.90 μg/mL DNase
g. 17 mg/mL 하이드록시에틸 셀룰로오스
용액: 혼합물을 제조한다(a+b+c+d+e+f).
혼합 용매 50 mL에 다음을 첨가한다: 25 mg의 아스코르브산, 12.5 mg의 EDTA, 25 mg의 에토숙시미드, 200 μg의 rh-도르나제 알파, 94 μL의 폴리소르베이트 80 및 80 μL의 젖산.
제조 방법:
1. 25 mg의 아스코르브산과 12.5 mg의 EDTA를 분석용 저울 Radwag AS 220 R2(Radwag LLC, Radom, Poland)의 시계 접시에 단다.
2. 혼합 용매를 사용하여 이 물질이 유리 비커에 용출되고 시계 접시에 입자가 남지 않도록 한다.
3. 50 mL의 용매 혼합물의 나머지를 비커에 첨가한 후, 고체 입자가 부분적으로 용해될 때까지 제제를 NUMAK GL-3250A 자기 교반기(Numak Technology LLC, Dubai, UAE)에 5분 동안 둔다.
교반하는 동안, 94 μL의 폴리소르베이트 80을 200 μL 팁의 끝을 자름으로써 첨가한다.
4. 다음으로, 80 μL의 젖산을 제제에 첨가한다.
5. 25 mg의 에토숙시미드를 첨가한다.
6. 이 물질을 첨가하고 나면, 혼합물을 5분 동안 추가로 교반한다.
7. 용액의 최종 pH가 5.5가 되도록 하기 위해, 50 mL의 용액을 조정된 pH 미터 Lutron PH-206과 함께 교반기 위에 저회전으로 놓은 100 mL 비커에 넣고, 알칼리성 용액을 pH 수준에 도달할 때까지 적가하면서, 응집체에 의해 생성되는 거품에 주의한다.
8. 제제를 10분 동안 1 atm 과압에서 120℃의 오토클레이브 Arcano LS-B75L에서 멸균한다.
9. 50 mL의 8 단계 제제를 원뿔형 튜브(50 mL)에 넣고 0.20 mL의 도르나제 알파 1 mg/mL 효소 Pulmozyme(Roche, Basel, Switzerland)을 멸균 조건에서 첨가하여 최종 농도가 3.90 μg/mL가 되도록 한다. 이 단계는 생물학적 안전 캐비닛에서 수행한다.
10. 튜브를 밀봉하고 10초 동안 볼텍스에서 혼합한다.
겔 수득: 혼합물을 제조한다(용액 + g).
11. 조제 혼합물에 0.85 g의 하이드록시에틸셀룰로오스를 첨가한다.
12. 균질화될 때까지 부드럽게 섞는다.
13. 제제를 알루미늄 호일을 사용하여 빛을 차단한 다음 4 - 25 ℃에서 보관하고 덮어둔다. 거품이 제거되기까지 6 내지 8 시간 동안 그대로 두어야 한다.
실시예 25
발명의 겔 조성물. 실험실에서 혼합물 No. 16(M16)의 제조
본 발명의 조성물은 다음으로 구성된다:
a. 3.00 mg/mL 폴리소르베이트 80
b. 2.50 mg/mL 아스코르브산
c. 8.67 mg/mL 젖산(85% - 90% 순도)
d. 0.75 mg/mL EDTA
e. 30.00 mg/mL 에토숙시미드
f. 3.90 μg/mL DNase
g. 17 mg/mL 하이드록시에틸 셀룰로오스
용액: 혼합물을 제조한다(a+b+c+d+e+f).
혼합 용매 50 mL에 다음을 첨가한다: 125 mg의 아스코르브산, 37.50 mg의 EDTA, 1500 mg의 에토숙시미드, 200 μg의 rh-도르나제 알파, 141 μL의 폴리소르베이트 80 및 424 μL의 젖산.
제조 방법:
1. 125 mg의 아스코르브산과 37.50 mg의 EDTA를 분석용 저울 Radwag AS 220 R2(Radwag LLC, Radom, Poland)의 시계 접시에 단다.
2. 혼합 용매를 사용하여 이 물질이 유리 비커에 용출되고 시계 접시에 입자가 남지 않도록 한다.
3. 50 mL의 용매 혼합물의 나머지를 비커에 첨가한 후, 고체 입자가 부분적으로 용해될 때까지 제제를 NUMAK GL-3250A 자기 교반기(Numak Technology LLC, Dubai, UAE)에 5분 동안 둔다.
교반하는 동안, 141 μL의 폴리소르베이트 80을 200 μL 팁의 끝을 자름으로써 첨가한다.
4. 다음으로, 424 μL의 젖산을 제제에 첨가한다.
5. 1500 mg의 에토숙시미드를 첨가한다.
6. 이 물질을 첨가하고 나면, 혼합물을 5분 동안 추가로 교반한다.
7. 용액의 최종 pH가 5.5가 되도록 하기 위해, 50 mL의 용액을 조정된 pH 미터 Lutron PH-206과 함께 교반기 위에 저회전으로 놓은 100 mL 비커에 넣고, 알칼리성 용액을 pH 수준에 도달할 때까지 적가하면서, 응집체에 의해 생성되는 거품에 주의한다.
8. 제제를 10분 동안 1 atm 과압에서 120℃의 오토클레이브 Arcano LS-B75L에서 멸균한다.
9. 50 mL의 8 단계 제제를 원뿔형 튜브(50 mL)에 넣고 0.20 mL의 도르나제 알파 1 mg/mL 효소 Pulmozyme(Roche, Basel, Switzerland)을 멸균 조건에서 첨가하여 최종 농도가 3.90 μg/mL가 되도록 한다. 이 단계는 생물학적 안전 캐비닛에서 수행한다.
10. 튜브를 밀봉하고 10초 동안 볼텍스에서 혼합한다.
겔 수득: 혼합물을 제조한다(용액 + g).
11. 조제 혼합물에 0.85 g의 하이드록시에틸셀룰로오스를 첨가한다.
12. 균질화될 때까지 부드럽게 섞는다.
13. 제제를 알루미늄 호일을 사용하여 빛을 차단한 다음 4 - 25 ℃에서 보관하고 덮어둔다. 거품이 제거되기까지 6 내지 8 시간 동안 그대로 두어야 한다.
본 발명의 조성물에 대한 시험과 관련된 실시예
본 발명의 다양한 조성물은 그들의 기술적 효과를 입증하기 위해 제형화되고 시험되었다.
본 발명을 평가하기 위해 사용된 본 발명의 일부 조성물의 요약은 하기 표에서 볼 수 있다:
Figure pct00002
개별 분자의 용액 또한 시험하여(실시예 1에서 볼 수 있는 바와 같이 제조) 본 발명의 조성물의 상승적 특성을 입증하였다. 시험된 용액은 다음과 같다:
1. 혼합 용매 중 젖산(LA): 1.63 mg/mL, 6.50 mg/mL, 8.67 mg/mL. 모든 용액의 최종 pH: 5.5
2. 혼합 용매 중 폴리소르베이트 80(PS80): 2.0 mg/mL, 3.0 mg/mL. 모든 용액의 최종 pH: 5.5
3. 혼합 용매 중 EDTA: 0.25 mg/mL, 0.50 mg/mL, 0.75 mg/mL 모든 용액의 최종 pH: 5.5
4. 혼합 용매 중 아스코르브산(AA): 0.5 mg/mL, 1.0 mg/mL, 2.5 mg/mL. 모든 용액의 최종 pH: 5.5
5. 혼합 용매 중 에토숙시미드(Etho): 0.50 mg/mL, 3.00 mg/mL, 30.00 mg/mL. 모든 용액의 최종 pH: 5.5
6. 혼합 용매 중 도르나제 알파(D1): 250 μg/mL, 125 μg/mL, 62.5 μg/mL, 31.2 μg/mL, 15.6 μg/mL, 7.8 μg/mL, 3.9 μg /mL, 1.9 μg/mL, 0.97 μg/mL, 0.5 μg/mL. 모든 용액의 최종 pH: 5.5.
실시예 26
항병원성 효과
박테리아 균주:
1) 뮤코이드 Pseudomonas aeruginosa(내부 코드 LEF037): 6개월 이상 진행된 만성 정맥 궤양으로부터 임상적으로 분리됨.
2) 메티실린 내성 Staphylococcus aureus(내부 코드 LEF006). 6개월 이상 진행된 만성 하지정맥 궤양으로부터 임상적으로 분리됨.
박테리아 현탁액: P. aeruginosa LEF037을 37℃의 Luria-Bertani(LB) 배양 배지에서 12시간 동안 성장시켰다. 이 배양으로부터, 현탁액(OD600nm = 0.120)을 LB에서 제조하였다. S. aureus LEF006을 37℃에서 Brain Heart Infusion(BHI) 배양 배지에서 12시간 동안 성장시켰다. 이 배양으로부터, BHI에서 현탁액(OD600nm = 0.120)을 제조하였다.
대조군: 수행된 분석에서 다음과 같은 대조군을 사용했다:
a. P. aeruginosa에 대한 정상 성장 대조군: Luria Bertani 배지(LB)(pH 7.2)
b. S. aureus에 대한 정상 성장 대조군: Brain Heart Infusion(BHI) 배지(pH 7.2)
c. 희석 효과 대조군: 혼합 용매(MS)(pH 5.50).
d. 새로 수득한 LAPS 효과의 대조군: LAPS를 4℃(pH 5.22)에서 24시간 동안 보관함(LAPS 24h).
e. LAPS 활성 보존 대조군: LAPS를 4℃(pH 6.05)에서 6개월 동안 보관함(LAPS6m).
Lactobacillus plantarum 상청액(LAPS): LAPS 대조군을 실시예 1 세부사항에 따라 제조하였다. L. plantarum ATCC 10241을 37℃에서 de Man Rogosa Sharpe(MRS)(브리타니아, 아르헨티나)에서 12시간 동안 성장시켰다. 상청액(LAPS)을 8000 rpm에서 15분 동안 원심분리하고 0.22 μm의 Millipore 필터로 여과하여 수득하였다. 이 상청액은 특허 출원 번호 AR093779에 해당하며 만성 상처 치료를 위한 최고의 치료 효과의 알려진 제품으로 간주된다. 이 제품은 본 발명이 해결하고자 하는 몇 가지 문제를 제시한다. 한편으로, 시간이 지남에 따라 효율성이 떨어지는 것이 아래에 제시된 시험에서 관찰된다. 또한 발효 과정에 의존하기 때문에 절대적으로 정의된 조성이 없기 때문에 규제 문제가 있다. 본 발명은 시간이 지남에 따라 확장된 큰 안정성을 달성하고, 인간 치료용으로 절대적으로 정의되고 승인된 구성요소로 구성된다.
개별 분자의 용액: 모든 용액은 실시예 1에 따라 최종 pH가 5.5인 혼합 용매에서 제조되었다. 제조된 용액은 다음과 같다: 1. 젖산(LA)(1.63, 6.50 및 8.67 mg/mL); 2. 폴리소르베이트 80(PS80)(2.0 및 3.0 mg/mL); 3. EDTA(0.25, 0.50 및 0.75 mg/mL); 4. 아스코르브산(AA)(0.5, 1.0 및 2.5 mg/mL); 5. 에토숙시미드(Etho)(0.50, 3.00 및 30.00 mg/mL); 6. rh-도르나제 알파(D1)(0.97 및 3.9 μg/mL).
M0, M13, M15 및 M16(표 1 참조). 본 발명의 조성물은 실시예 18 내지 21에 따라 정교화되었다.
정균 효과 측정을 위한 시험: 정균 분석을 위해, 96웰 플레이트(Deltalab. Argentina)(200 μL 용량)를 사용했다. 모든 분석은 100 μL의 LB 배양 배지 또는 BHI 배양 배지에 각각 50 μL의 P. aeruginosa 또는 S. aureus 세균 현탁액을 사용하여 삼중으로 수행되었다. 그런 다음, 다음과 같이 샘플을 배치했다.
a) 50 μL의 대조군(대조군 참조)
b) 50 μL의 개별 분자 용액(개별 분자의 용액 참조)
c) 50 μL의 분자 혼합물.
이어서, 다음 판독 프로그램을 사용하여 마이크로플레이트를 마이크로플레이트 판독기(Multiskan Go. Thermo Scientific, Germany)에 넣었다: a) 37℃에서 배양; b) 58분마다 약간의 교반(3초 지속), c) 600 nm에서 흡광도 24시간 동안 시간당 1회 판독 주기. 모든 웰에 대한 초기 광학 밀도(OD)는 0.100이었다. 데이터는 Microsoft Excel®에서 분석하여 평균을 계산했다. 결과는 24시의 정균 효과의 백분율로 열에 표시했다.
살균 효과 측정을 위한 시험: 정균 효과 측정에 사용된 시험에서, 각 웰에서 10 μL 분취량을 취하여, 연속으로 희석하고 각 희석액의 한 분취량을 LB 또는 BHI 한천에 박테리아 균주에 따라 접종했다. 콜로니 형성 단위(CFU)의 초기 수를 계산하여 처리 24시간 후에 얻은 최종 CFU 수와 비교했다. 생존 박테리아의 수를 계산하고, 처리 후 얻은 CFU/mL 수에 따라 열에 표시했다.
바이오필름 억제 효과 측정을 위한 시험: 성장 억제 시험 24시간 후, 웰의 내용물을 버리고, 빈 웰을 멸균 생리 식염수로 3회 세척하였다. 플레이트를 실온에서 15분 동안 건조시켰다(표면이 아래로 향하게 하여 흡수지 상에서). 각 웰에, 200 μL의 0.1% 크리스털 바이올렛을 첨가하고 플레이트를 실온에서 15분 동안 부드럽고 일정하게 볼텍스(Labnet)에서 교반하며 배양하여 웰 벽에 부착된 바이오필름을 염색하였다. 그 후, 웰의 내용물을 버리고, 멸균 생리 식염수로 3회 세척하고, 실온에서 15분 동안 건조시켰다(표면이 아래로 향하게 하여 흡수지 상에서). 이어서, 바이오필름에 부착된 크리스털 바이올렛을 용해하기 위해, 200 μL의 96° 에탄올을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 실온에서 10분 동안 부드럽고 일정하게 볼텍스(Labnet)에서 교반하며 배양하였다. 크리스털 바이올렛의 양은 형성된 바이오필름의 양에 정비례한다. 이러한 방식으로, 각 웰에서 색의 강도가 형성된 바이오필름의 양에 정비례하는 용액을 얻었다. 흡광도 판독은 Multiskan Go 마이크로플레이트 판독기(Thermo Scientific)로 37℃, 540nm에서 정확하게 수행되었다. 데이터는 Microsoft Excel®에서 처리되었고, 평균이 계산되었으며, 결과는 바이오필름 형성 억제의 백분율로 열에 표시했다.
바이오필름 파괴 효과 측정을 위한 시험: 96-웰 플레이트(Deltalab)에 150 μL의 배양 배지 + 50 μL의 박테리아 현탁액을 넣었다. 플레이트를 바이오필름이 형성될 때까지 24시간 동안 37℃에서 습한 챔버에서 배양했다. 그 후, 웰의 내용물을 조심스럽게 버리고, 벽에 부착된 바이오필름의 손실을 방지하면서 멸균 생리 식염수로 부드럽게 3회 세척하였다. 플레이트는 생물학적 안전 캐비닛에서 실온에서 20분 동안 건조되었다. 이어서, 150 μL의 배양 배지를 첨가하였다 각각: 50 μL의 대조군, 50 μL의 개별 분자 용액 및 50 μL의 분자 혼합물. 모든 시험은 삼중으로 수행되었다. 플레이트를 37℃의 습한 챔버에서 24시간 동안 배양했다. 그 후, 웰의 내용물을 버리고 멸균 식염수로 3회 세척하였다. 플레이트를 실온에서 15분 동안 건조시켰다(표면이 아래로 향하게 하여 흡수지 상에서). 웰을 실온에서 15분 동안 부드럽고 일정하게 볼텍스(Labnet)에서 교반하며 0.1% 바이올렛 크리스털의 200 μL/웰로 염색했다. 웰의 내용물을 버리고, 멸균 식염수로 3회 세척하고 플레이트를 실온에서 15분 동안 건조했다(표면이 아래로 향하게 하여 흡수지 상에서). 마지막으로, 96° 에탄올의 200 μL/웰을 첨가하여 바이오필름에 부착된 바이올렛 크리스털을 용해시켰다. 플레이트를 실온에서 15분 동안 부드럽고 일정하게 볼텍스(Labnet)에서 교반하며 10분 동안 배양했다. 생성된 용액의 흡광도를 Multiskan Go 마이크로플레이트 판독기(Thermo Scientific)로 540 nm(37 ℃)에서 측정했다. 데이터는 Microsoft Excel®에서 처리되었고, 평균이 계산되었으며, 결과는 바이오필름 파괴의 백분율로 열에 표시했다.
결과 및 결론
도 2는 상이한 항병원성 효과의 백분율을 보여준다: 언급된 조성물에 존재하는 농도에서 조성물 M0 및 M13 및 개별 분자에 의해 야기된 Pseudomonas aeruginosa에 대한 정균 활성, 바이오필름(BF) 형성의 억제 및 사전 형성된 바이오필름 파괴. 도면은 또한 LAPS 24시간, LAPS 6개월 및 혼합 용매(MS)에 대한 이러한 특성을 보여준다.
개별 분자는 각 속성에 대해 약간의 활성을 나타냈다. 그럼에도 불구하고, M0와 M13은 모든 활동에 시너지 효과를 보여준다. LAPS 24시간은 뛰어난 정균 및 BF 억제 효과를 나타내었지만 바이오필름에 대한 파괴 효과는 조성물보다 낮았다. 게다가, 6개월 후 LAPS는 항 병원 효과를 크게 잃었다.
도 3은 언급된 조성물의 농도에서 조성물 M0 및 M13 및 상이한 개별 분자를 사용한 24시간의 처리 후 Pseudomonas aeruginosa의 생존 박테리아(CFU/mL)에서 발현되는 살균 효과를 보여준다.
도면에서 볼 수 있듯이, 생존 박테리아 수준이 대조군(미-처리)과 유사하기 때문에 개별 분자 중 어느 것도 살균 효과를 일으키지 않았다. LAPS는 중요한 살균 효과를 나타내었지만 시간이 지나면서 잃었다. M0는 현저한 살균 효과를 나타내는 반면 M13은 박테리아의 절대적인 제거를 일으켰다.
도 4는 다양한 항병원성 효과의 백분율을 보여준다: 언급된 조성물의 농도에서 조성물 M15 및 개별 분자로 인한 Pseudomonas aeruginosa에 대한 정균 활성, 바이오필름(BF) 형성 억제 및 사전 형성된 바이오필름 파괴. 도면은 또한 LAPS 24시간, LAPS 6개월 및 혼합 용매(MS)에 대한 이러한 특성을 보여준다. 개별 분자는 각 속성에 대해 약간의 활성을 나타냈다. 그럼에도 불구하고, M15는 모든 활동에 시너지 효과를 보여준다. 비록 LAPS 24시간은 뛰어난 정균 및 BF 억제 효과를 나타내었지만, 바이오필름에 대한 파괴 효과는 M15 조성물보다 낮았다. 게다가, 6개월 후 LAPS는 항 병원 효과를 크게 잃었다.
도 5는 언급된 조성물의 농도에서 조성물 M15 및 상이한 개별 분자를 사용한 24시간의 처리 후 생존한 Pseudomonas aeruginosa 박테리아(CFU/mL)에서 발현되는 살균 효과를 보여준다. 도면에서 볼 수 있듯이, 생존 박테리아 수준이 대조군(미-처리)과 유사하기 때문에 개별 분자 중 어느 것도 살균 효과를 일으키지 않았다. LAPS는 중요한 살균 효과를 나타내었지만 시간이 지나면서 잃었다. M15은 박테리아의 뛰어난 제거를 일으켰다.
도 6은 다양한 항병원성 효과의 백분율을 나타낸다: 언급된 조성물의 농도에서 조성물 M16 및 개별 분자로 인한 Pseudomonas aeruginosa에 대한 정균 활성, 바이오필름(BF) 형성 억제 및 사전 형성된 바이오필름 파괴. 도면은 또한 LAPS 24시간, LAPS 6개월 및 혼합 용매(MS)에 대한 이러한 특성을 보여준다. 개별 분자는 각 속성에 대해 약간의 활성을 나타냈다. 그럼에도 불구하고, M16은 모든 활동에 현저한 시너지 효과를 보여준다. 비록 LAPS 24시간은 뛰어난 정균 및 BF 억제 효과를 나타내었지만, 바이오필름에 대한 파괴 효과는 제형보다 낮았다. 게다가, 6개월 후 LAPS는 항-병원 효과를 크게 잃었다.
도 7은 언급된 조성물의 농도에서 조성물 M16 및 상이한 개별 분자를 사용한 24시간의 처리 후 생존한 Pseudomonas aeruginosa 박테리아(CFU/mL)에서 발현되는 살균 효과를 보여준다. 도면에서 볼 수 있듯이, 생존 박테리아 수준이 대조군(미-처리)과 유사하기 때문에 개별 분자 중 일부가 적은 살균 효과를 일으켰다. LAPS는 중요한 살균 효과를 나타내었지만, 시간이 지나면서 잃은 반면, M16은 박테리아의 완벽한 제거를 일으켰다.
도 8은 항병원성 특성의 백분율을 보여준다: 언급된 조성물의 농도에서 조성물 M0 및 M13 및 개별 분자에 의해 야기된 Staphylococcus aureus에 대한 정균 활성, 바이오필름(BF) 형성 억제 및 사전 형성된 바이오필름 파괴. 도면은 또한 LAPS 24시간, 6개월 및 혼합 용매(MS)에 대한 이러한 특성을 보여준다.
개별 분자는 각 속성에 대해 약간의 활성을 나타냈다. 그럼에도 불구하고, M13은 모든 활동에 시너지 효과를 보여준다. M0는 바이오필름(BF) 형성의 억제를 위한 시너지 효과를 제시하고 바이오필름 파괴를 나타냈다. 비록 LAPS 24시간은 뛰어난 정균 및 BF 억제 효과를 나타내었지만, 바이오필름에 대한 파괴 효과는 제형보다 낮았다. 게다가, 6개월 후 LAPS는 항-병원 효과를 크게 잃었다.
도 9는 언급된 조성물의 농도에서 조성물 M0 및 M13 및 상이한 개별 분자를 사용한 24시간의 처리 후 Staphylococcus aureus의 생존 박테리아(CFU/mL)에서 발현되는 살균 효과를 보여준다.
도면에서 볼 수 있듯이, 생존 박테리아 수준이 대조군(미-처리)과 유사하기 때문에 개별 분자 중 대부분이 살균 효과를 일으키지 않았다. LAPS는 중요한 살균 효과를 나타내었지만, 시간이 지나면서 잃었다. M0은 현저한 살균 효과를 보여주는 반면, M13의 박테리아 제거가 더 높았다.
도 10은 다양한 항병원성 효과의 백분율을 보여준다: 언급된 조성물의 농도에서 조성물 M15 및 개별 분자로 인한 S. aureus에 대한 정균 활성, 바이오필름(BF) 형성 억제 및 사전 형성된 바이오필름 파괴. 도면은 또한 LAPS 24시간, 6개월 및 혼합 용매(MS)에 대한 이러한 특성을 보여준다.
개별 분자는 각 속성에 대해 약간의 활성을 나타냈다. 그럼에도 불구하고, M15는 모든 활동에 시너지 효과를 보여준다. 비록 LAPS 24시간은 뛰어난 정균 및 BF 억제 효과를 나타내었지만, 바이오필름에 대한 파괴 효과는 제형보다 낮았다. 게다가, 6개월 후 LAPS는 항-병원 효과를 크게 잃었다.
도 11은 언급된 조성물의 농도에서 조성물 M15 및 상이한 개별 분자를 사용한 24시간의 처리 후 Staphylococcus aureus의 생존 박테리아(CFU/mL)에서 발현되는 살균 효과를 나타낸다.
도면에서 볼 수 있듯이, 생존 박테리아 수준이 대조군(미-처리)과 유사하기 때문에 개별 분자 중 대부분이 살균 효과를 일으키지 않았다. LAPS는 일부 살균 효과를 나타내었지만, 시간이 지나면서 잃었다. 마지막으로, M15는 박테리아의 뛰어난 제거를 일으켰다.
도 12는 다양한 항병원성 효과의 백분율을 보여준다: 언급된 제형의 농도에서 조성물 M16 및 개별 분자로 인한 Staphylococcus aureus에 대한 정균 활성, 바이오필름(BF) 형성 억제 및 사전 형성된 바이오필름 파괴. 도면은 또한 LAPS 24시간, 6개월 및 혼합 용매(MS)에 대한 이러한 특성을 보여준다.
개별 분자는 각 속성에 대해 약간의 활성을 나타냈다. 그럼에도 불구하고, M16은 모든 활동에 현저한 시너지 효과를 보여준다. 비록 LAPS 24시간은 뛰어난 정균 및 BF 억제 효과를 나타내었지만, 바이오필름에 대한 파괴 효과는 제형보다 낮았다. 게다가, 6개월 후 LAPS는 항-병원 효과를 크게 잃었다.
도 13은 언급된 조성물의 농도에서 조성물 M16 및 상이한 개별 분자를 사용한 24시간의 처리 후 Staphylococcus aureus의 생존 박테리아(CFU/mL)에서 발현되는 살균 효과를 보여준다.
도면에서 볼 수 있듯이, 생존 박테리아 수준이 대조군(미-처리)과 유사하기 때문에 개별 분자 중 일부가 적은 살균 효과를 일으킨다. LAPS는 중요한 살균 효과를 나타내었지만, 시간이 지나면서 잃은 반면, M16은 박테리아의 가장 큰 제거를 일으켰다.
바이오필름 파괴 능력은 바이오필름이 상처에 이미 형성되었을 때 환자가 의사에게 가기 때문에 만성 상처 치료에서 가장 많이 찾는 특성 중 하나이다. 기존의 항균제는 다음과 같은 이유로 바이오필름 파괴를 일으킬 수 없고, 특히 생체내에서 상대적인 효능을 갖는 것으로 알려져 있다:
● 각 종은 바이오필름의 매트릭스에서 서로 다른 화학적 조성을 가진다.
● 감염은 다중 미생물로, 혼합된 바이오필름을 형성한다.
● 기존 처리는 특정 화학 조성을 가리킨다.
그렇기 때문에 기존 치료법은 항상 새로운 감염원이 되는 혼합된 바이오필름 잔해를 남기고, 감염을 진행시킨다. 좋은 파괴적 처리는 혼합된 바이오필름과 다른 종의 바이오필름을 공격하여 100%에 가까운 파괴를 생성해야 한다.
결론
놀랍게도, 본 발명의 성분은 만성 상처에서 가장 일반적으로 확인된 박테리아(P. aeruginosa 및 S. aureus)에서 시너지적인 정균, 살균, 바이오필름 억제 및 파괴 특성을 보여준다. 본 발명은 또한 P. aeruginosa 및 S.aureus에 대해 연구된 특성에서 LAPS보다 우수한 효과를 보여준다.
실시예 27
본 발명의 조성물의 항산화 능력
항산화 활성을 측정하는 방법은 자유 라디칼(양성자 제공 물질은 항산화 물질)을 포획하는 2,2-디페닐-1-피크릴 하이드라질(DPPH) 능력을 기반으로 한다. DPPH* 라디칼은 항산화 물질로부터 양성자를 받아 DPPH가 된다. 이에 따라, 항산화 효과는 DPPH* 감소에 비례한다. DPPH*는 517 nm에서 최대 흡광도를 가지며, DPPH가 형성될 때 보라색에서 노란색으로 변한다. 따라서, 517 nm에서 흡광도 저하를 따라 분광광도법으로 항산화 효과를 측정할 수 있다. 그런 다음, 샘플의 초기 및 최종 흡광도 값으로, 억제 계수 50(IC50)을 계산한다. IC50은 DPPH*의 50%를 줄이는 데 필요한 항산화 물질의 최소 농도를 나타낸다. IC50을 얻기 위해, 두 가지 증가하는 농도 곡선이 수행된다: 첫 번째는 테스트된 샘플을 사용하고 두 번째는 참조 표준(Trolox)을 사용한다. 마지막으로, 상대적 항산화 활성(%AAR)의 백분율은 Sharma et al.(42)의 권장 사항에 따라 계산된다.
DPPH* 라디칼의 스톡 용액(SS) 및 작업 용액(WS)의 제조: 무수 메탄올 중 약 100 ppm의 DPPH 용액을 제조한다. 용액은 실온에서 어두운 곳에서 최소 30분 동안 보관해야 한다. 그런 다음 WS는 무수 메탄올을 사용하여 SS로부터, 517 nm의 파장에서 마이크로플레이트에서 0.800 ± 0.100의 흡광도가 얻어질 때까지 제조한다.
표준 Trolox 용액 준비: SS = 500 ppm을 준비한다. 10 mL의 부피를 얻으려면, 5 mg의 Trolox를 10 mL의 무수 메탄올에 용해시켜야 한다. 6개의 WS는 다음 농도로 제조한다: 25, 50, 100, 150, 200 및 250 ppm.
샘플: 1) 혼합 용매(MS), 2) 혼합 용매에 각각 0.5 및 2.5 mg/mL의 아스코르브산을 포함하는 용액을 실시예 1에 나타낸 바와 같이 제조하였다. 3) M15(실시예 20에 따라 정교화한 본 발명의 조성물) 4) M16(실시예 21에 따라 정교화한 본 발명의 조성물) 및 5) LAPS(실시예 1 상세내용에 따라 제조됨).
분광광도법: 흡광도(Abs) 판독을 UV-Vis 적합 마이크로플레이트를 사용하여 517 nm에서 분광광도계로 삼중으로 수행하였다.
a. 웰에 배치: 샘플 블랭크(12.5 μL의 샘플 또는 WS 25 ppm); 샘플(샘플 12.5 μL의 샘플 또는 25~250 ppm의 WS); 초기 DPPH 값(12.5 μL의 무수 메탄올)
b. 무수 메탄올로 흡광도 0에 도달한다.
c. 샘플 블랭크 웰에 250 μL의 무수 메탄올을 첨가한다.
d. DPPH 기준선 및 샘플 웰에 250 μL의 DPPH* WS를 첨가한다.
e. 517 nm에서 흡광도를 기록한다(초기 DPPH Abs).
f. 30분 동안 보관한다(어두운 곳 및 실온에서).
g. 517 nm에서 흡광도를 기록한다(최종 DPPH Abs).
h. 흡광도 판독값을 기록한다(샘플의 빈 Abs)
i. 샘플과 Trolox의 포획 비율을 계산한다.
참조 표준(Trolox) 및 분석된 샘플이 있는 곡선: 두 개의 곡선이 정교화되어, 세로축(y)에 포획%가 표시되고 가로축(x)에, Trolox 또는 분석된 샘플 농도의 자연 로그(Ln)가 표시된다(각각 TEAC 또는 샘플의 ppm). 각 그래프의 (y) 축을 값 50으로 대입하고 그래프의 선형 회귀에 의해 얻은 방정식을 사용하여 IC50을 계산한다. 그런 다음, 각 IC50 값을 사용하여%AAR을 계산한다.
결과
도 14에서 혼합 용매는 항산화 활성을 나타내지 않음을 알 수 있다. 비록 LAPS에는 아스코르브산이 없지만, 페놀 화합물의 함량으로 인해% AAR 값을 나타낸다. 놀랍게도, 조성물 M15 및 M16은 동등한 아스코르브산 농도 용액(AA 0.5 및 2.5 mg/mL)보다 더 나은 항산화 활성을 가졌다.
결론
발명의 조성물은 아스코르브산의 항산화 능력을 향상시킨다.
실시예 28
조성물의 킬레이트화 능력
다음 용액을 pH 7.0의 혼합 용매(MS)에서 제조하였다. 모든 용액에는 ZnCl2(1 ppm), CaCl2(100 ppm) 및 MgCl2(25 ppm)를 보충하였다. 여기에 사용된 Zn, Ca 및 Mg의 농도는 만성 상처의 삼출물에서 일반적으로 발견되는 농도와 비슷하였다. 반응을 위해 선택된 pH(7.0)는 본 발명의 조성물(pH 5.5) 및 만성 상처로부터의 삼출물(pH 8.5)의 조합으로부터 유래할 것이다. 제조된 용액은 실시예 1에 나타낸 바와 같이: EDTA(0.25, 0.50 및 0.75 mg/mL)이었다. M0, M13, M15 및 M16은 실시예 18 내지 21에 따라 정교화되었다. LAPS 탈단백화: 실시예 1에 따라 수득된 LAPS 24시간 샘플에 대해, 사용된 상용 키트의 시약 및 지시를 사용하여 탈단백화 과정을 수행하였다.
조제 용액에 남아있는 칼슘(킬레이트화되지 않은)의 측정: 상업용 칼슘 측정 키트(Wiener Lab)를 사용하였다. 이것은 알칼리성 pH에서 칼슘과 o-크레졸프탈레인 콤플렉스(o-CPC)의 반응을 기반으로 하는 비색법으로, 570 nm에서 광색계로 측정 가능한 마젠타 복합체를 제공한다.
준비된 용액에 남아있는 아연(킬레이트화되지 않은)의 측정: 상업적인 아연 측정 키트(Randox Lab)를 사용하였다. 이것은 알칼리 pH에서 아연과 디메틸글리옥심 및 살리실알독신의 반응을 기반으로 하는 비색법으로, 560 nm에서 광색계로 측정이 가능한 유색 복합물을 제공한다.
LAPS에서 아연의 측정을 위해, 이전의 탈단백화 단계가 필요하였다. 따라서, 동일한 부분의 LAPS와 탈단백화 시약(트리클로로아세트산 370 mmol/L)을 원뿔형 튜브에 혼합하고, 균질화하고 10,000 xg에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 시험에 사용하였다.
결과
도 15는 아연, 칼슘 및 마그네슘의 조합이 사용된 경우에도, EDTA가 시험된 모든 농도에서 아연을 완전히 킬레이트할 수 있었음을 보여준다. EDTA는 또한 아연, 칼슘 및 마그네슘의 조합이 사용된 경우에도 0.50, 0.75 및 1.00 mg/mL 농도에서 칼슘을 완전히 킬레이트화할 수 있었다. 그러나, EDTA 0.25 mg/mL는 사용 가능한 모든 칼슘을 킬레이트화할 수 없었다. M0에는 EDTA가 없지만 여전히 칼슘과 아연 모두에 대해 킬레이트화 활성을 보였다. 0.25 mg/mL의 EDTA를 함유한 M15는 등가 농도의 EDTA 단독과 비교하여 칼슘 킬레이트력(아연 킬레이트력은 아님)을 잃었다. 대조적으로, 각각 0.50 mg/mL 및 0.75 mg/mL의 EDTA를 함유하는 M13 및 M16은, EDTA 등가물 단독에 비해 최대 킬레이트력을 유지했다. 모든 혼합물은 아연 킬레이트력이 없는 LAPS에 비해 우수한 킬레이트력을 나타냈다.
결론
조성물은 EDTA와 무관한 킬레이트화 능력을 갖는다. 놀랍게도, 조성물의 구성요소는 EDTA의 킬레이트화 능력을 향상시킨다.
실시예 29
조성물로부터의 DNAse 활성의 시간적 증가 및 보존
DNAse 한천은 고도로 중합된 DNA와 한천을 응고제로 포함하는 배양 배지이다. DNA는 그것을 가수분해하는 데옥시리보뉴클레아제 효소(DNAse)의 기질이다. 이 배지는 다양한 샘플과 미생물에서 DNAse 활성을 감지할 수 있도록 한다. 효소의 존재는 염산 1N을 추가하여 시각화할 수 있다. 가수분해된 디옥시리보핵산은 투명도를 나타내는 반면 중합된 디옥시리보핵산은 침전되어 배양 배지에 불투명도를 생성한다.
플레이트 준비: DNAse 한천 플레이트를 제조업체 권장 사항(Britania, CABA, Argentina)에 따라 제조하였다. 플레이트에서 2 mm의 한천 높이에 도달하는 20 mL 부피의 용융 배지를 사용하였다. 멸균 펀치를 사용하여 한천 위에 직경 5 mm의 웰을 만들었다. 따라서 각 웰에 접종된 부피는
Figure pct00003
Figure pct00004
였다.
보정 곡선: rh-도르나제 알파 용액(Roche. Basel, Switzerland)을 다음 농도로 혼합 용매에 희석하여 사용하였다: Cl(0.1 μg/mL); C2(0.97 μg/mL); C3(2.0 μg/mL); 4(3.90 μg/mL); C5(8.0 μg/mL); C6(10.0 μg/mL); C7(100.0 μg/mL) 및 C8(1000 μg/mL).
분석된 샘플: LAPS, M0, M13, M15, M16(모두 하이드록시에틸 셀룰로오스로 겔화됨)을 25℃ 및 4℃에 보관하였다. DNAse 활성을 6개월 동안 일주일에 한 번 측정하였다. 실시예 1에 나타낸 바와 같이 LAPS를 제조하고 본 발명의 조성물을 실시예 22 내지 25에 따라 정교화하였다.
DNAse 한천 플레이트에 접종: 보정 곡선의 포인트와 다른 겔화된 샘플을 6개월 동안 이중으로 접종하였다.
배양: 32℃에서 24시간(인간의 정상 피부 온도)
공개: 플레이트는 전체 플레이트의 표면을 덮기에 충분한 HCI(1M)를 추가하여 넘치게 하였다. 그 다음, 플레이트를 휴지시키고 HCl을 첨가한 후 최대 5분까지 관찰하였다. DNase 활성을 밀리미터 후광 직경으로 기록되는 식재 구역 주변의 투명한 소멸을 분석하여 측정하였다.
결과
도 16은 본 발명의 조성물에서 DNAse 활성의 최대 6개월까지의 보존을 보여주는 반면, LAPS는 2개월 미만에서 이러한 효소 활성을 상실했다.
도 17에 도시된 바와 같이, 본 발명의 조성물은 DNAse 단독의 등가물 요액보다 더 높은 효소 활성을 갖는다. 예를 들어, 0.97 μg/mL의 DNAse 농도를 갖는 M0 및 M13은 13-15 mm의 후광을 나타낸 반면, 0.97 μg/mL 농도의 DNAse 단독(C2)의 농도는 8-10 mm의 후광을 나타냈다. 3.90 μg/mL의 DNAse 농도를 갖는 M15 및 M16은 17-20 mm의 후광을 나타낸 반면 3.90 μg/mL 농도의 DNAse 단독(C4)의 농도는 13-15 mm의 후광을 나타냈다. 이것은 본 발명의 조성물에서 도르나제 알파에 대한 증폭된 DNAse 활성을 입증한다.
결론
조성물의 구성 요소는 도르나제 알파의 DNAse 활성을 개선하고 시간에 따른 효소 활성을 확장하도록 한다.
실시예 30
조성물의 혈관신생 능력
혈관신생은 기존 혈관 구조에서의 새로운 혈관 생성을 포함하는 복잡한 생물학적 과정이다. 이 과정은 여러 다른 세포 유형의 협력을 포함하며, 특히 증식, 생존 및 활성화된 내피 세포에 의한 조직 침범을 포함한다. 혈관신생에 대한 대부분의 조사에는 적어도 하나의 생체내 연구가 포함된다. 닭 융모요막 분석(CAM)은 다양한 응용 분야에 적합하다. 이 분석에서, 다양한 농도의 에토숙시미드와 젖산 및 혼합물의 혈관신생 특성을 시험하였다.
재료 및 방법
중량이 30-90 g인 상업 계란을 사용하였다. 난관경을 사용하여 융모요막의 생존력을 결정하여 수정된 난자와 생존 가능한 난자를 선택하였다.
절차: 계란을 인큐베이터에 넣기 전에 포비돈 요오드로 소독하고 인큐베이션 6 내지 9일 째에 난관에서 부화란을 관찰하여 생존력과 대조군 연령을 결정하였다. 그 후, 기실을 확인하고 난각을 조심스럽게 부수고 손질하여 내부 고환막이 쉽게 노출되도록 하였다. 막을 37℃에서 2 mL의 NaCl(0.9%)로 적셨다. 생리 식염수 용액을 이후 버리고 밑에 있는 융모요막에 접근하기 위해 집게로 고환 막을 조심스럽게 제거하였다. 융모요막이 손상된 계란(출혈 또는 기타 손상의 존재)을 버렸다.
그 다음, 300 μL의 다음 용액을 융모요막에 천천히 넣었다: 에토숙시미드 3.0 mg/mL; 에토숙시미드 0.5 mg/mL; M0; M13; M15; LAPS; 음성 대조군(PBS). 각 용액을 삼중으로 평가하였다.
실시예 1에 나타낸 바와 같이 에토숙시미드 용액 및 LAPS를 수득했다. 본 발명의 조성물을 실시예 18 내지 21에 따라 정교화하였다.
알을 투명 필름으로 덮고 적용 후 5분, 24, 48 및 72시간 후에 사진을 촬영하였다.
혈관 신생 시험: 소프트웨어 Image J plus를 사용하여 디지털 이미지 분석을 수행하였다. CAM 면적(cm2)당 혈관신생 길이(cm)를 용액 첨가 전(basal) 및 24시간 및 48시간 후 평가하였다. 그 다음, 혈관신생의 증가율을 계산하였다.
결과
도 18은 LAPS 및 에토숙시미드, M0, M13 및 M15의 다양한 용액이 존재할 때의 혈관형성 동역학을 보여준다. 볼 수 있는 바와 같이, LAPS는 혈관신생 효과를 나타내지 않았다. 에토숙시미드는 혈관신생 특성을 보였으나 3.0 mg/mL보다 0.5 mg/mL에서 더 좋았다. 혼합물 M0, M13 및 M15는 동일한 농도의 에토숙시미드를 사용한 용액에 비해 증가된 혈관신생 효과를 나타냈다.
결론
본 발명의 조성물은 에토숙시미드의 혈관신생력을 놀랍게도 증폭시킨다.
실시예 31
에토숙시미드를 사용한 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 발현 조절
재료 및 방법
세포주는 최소 필수 배지(MEM), 소 태아 혈청(FBS), L-글루타민을 사용하여 American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, MD, USA)의 프로토콜에 따라 성장 및 유지하였다.
VEGF 유전자의 발현을 평가하기 위해 다음 세포주를 사용하였다:
a. 25 ng/mL의 E. coli(L-8274, Sigma)의 지질다당류(LPS)로 자극된 쥐 대식세포 세포주 J774(ATCC).
b. 성인 인간 피부 케라티노사이트 세포주 HaCaT(ATCC).
세포를 유전자 발현에 대한 효과를 평가하기 위해 다른 농도의 에토숙시미드로 24시간 동안 플레이팅하였다.
J774 대식세포 세포주 및 HaCaT 케라티노사이트의 단층을 컨플루언트 세포가 얻어질 때까지 사용하고, 이를 12-웰 플레이트에서 최종 부피 300 μL/웰로 실시예 1에 나타낸 바와 같이 0.5 및 3.0 mg/mL의 에토숙시미드로 자극하였다. J774 대식세포주의 경우, 대조군(대조군 + LPS)으로 LPS(25 ng/mL)를 포함하는 MEM 1X를 사용하여, 모든 처리에 LPS(25 ng/mL)를 보충하였다. HaCaT 케라티노사이트는 대조군으로 1X MEM을 사용하여, 10% FBS가 포함된 MEM에서 에토숙시미드 농도로 처리하였다.
플레이트를 24시간 동안 5% CO2가 포함된 습한 대기에서 37℃에서 배양하였다. 각 실험에 대해 각 세포주에 대해 3개의 복제 플레이트를 수행하였다.
VEGF 및 GAPDH mRNA 수준을 StepOnePlus Real-Time PCR Systems(Applied Biosystems) 및 Power Up SYBR Green Master Mix(ROCHE) 키트를 사용하여 각 샘플에 대해 3회 측정하였다. VEGF 및 GAPDH에 대한 프라이머 서열은 다음과 같았다: VEGF의 경우 5'-ACCTCCACCATGCCAAGT-3'(센스) 및 5'-TTGGTCTGCATTCACATCTG-3'(안티센스) 및 GAPDH의 경우 5'-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3'(센스) 및 5'-CCCTGTTGCTGTAGCCAAAT-3'(안티센스). VEGF에 대한 평균 값을 각 샘플에 대한 평균 GAPDH 값으로 정규화하였다. 각 실험에 대해 그룹 평균을 결정하고 MEM 그룹으로 정규화하였다.
결과 및 고찰
결과적으로, 대식세포와 케라티노사이트 세포 모두에서 VEGF의 발현 수준을 유도하였다. VEGF 발현의 유도 수준은 대식세포에서 에토숙시미드 0.5 mg/mL(도 19) 및 케라티노사이트에서 3.0 mg/mL(도 19)에서 발생한다.
정상적인 치유 과정의 증식 단계에서, 혈관신생이 일어나 VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor)와 같은 혈관신생 성장 인자의 조절에 따라 손상된 부위의 새로운 혈관이 회복된다(43, 44). 만성 상처에서 VEGF는 감소되거나 없는 수준을 나타내는 경향이 있으며(45), 이는 낮은 활성으로 인한 상처의 불충분한 혈관화의 원인일 가능성이 있다(46). VEGF는 VEGFR-1을 통해 대식세포에 의한 세포자멸사 세포의 흡수를 자극한다(46, 47). 이것이 치유 중에 발생하면 대식세포에서 VEGF의 증가된 발현이 염증의 해결을 돕고(46) 치유의 증식 단계로의 이동을 촉진한다.
케라티노사이트는 또한 상처 치유 동안 VEGF의 주요 공급원 중 하나이다(46, 48). 표피 케라티노사이트에 의해 생성된 VEGF는 기저 진피 내 혈관의 내피 세포를 조절함으로써 작동한다(46). 따라서, 케라티노사이트에서 VEGF의 증가된 발현은 혈관신생을 자극한다.
결론: 에토숙시미드에 의해 대식세포와 케라티노사이트에서 VEGF의 발현이 증가하였다.
실시예 32
조성물의 상처 치유 효과(49)
동물: 8-10주령의 Wistar/Cmedc 계통의 42마리 수컷 쥐를 각각 6마리의 동물로 구성된 7개의 실험 그룹(그룹 A, B, C, D, E, F 및 G)으로 나누어 사용하였다.
절단 상처 모델(50): 동물을 마취하고 수술 부위를 준비하여 수술을 시작하였다. 이를 위해, 면도된 등 피부를 포비돈 요오드와 70° 에탄올 용액으로 세척하고 소독하였다. 이어서, 멸균된 5 mm 직경의 생검 펀치를 사용하여 등 흉부에 두 개의 상처(동물의 왼쪽에 해당하는 상처 1, 오른쪽에 상처 2)를 만들어 피부와 다육질 원추를 절개하였다. 그 후, 각 실리콘 링에 접착성 시아노아크릴레이트(Tegaderm™ 3M)를 놓고 링 내부를 절개하여 피부에 접착하였다. 접착제로 피부와 실리콘 링을 고정한 후, 피부에 5개의 바늘을 꿰메고, 폴리프로필렌 봉합사로 실리콘 링 외부를 천공하여 위치를 고정하였다. 수술 후 동물이 회복된 후, 동물들이 실리콘 링을 제거하는 것을 방지하기 위해 엘리자베션 칼라를 채웠다.
상처 베드의 세균 집락 평가: 의도하지 않은 총 세균 부하를 추정하기 위해, 상처 1에서 각 실험 그룹마다 한 동물의 면봉질(swab)을 수행하였다. 얻은 샘플을 10 mL의 멸균 1X PBS가 들어 있는 튜브에 넣고 연속 희석 및 플레이트 카운트(APC)를 위해 한천에 플레이팅하여 총 박테리아 부하를 결정하였다. 37℃에서 24시간 배양 후 CFU/상처를 계산하였다.
만성 상처의 상태를 모방하기 위한 Staphylococcus aureus ATCC 29213 감염: 두 상처 모두 모든 실험 그룹의 동물에 국소 접종하였다. 접종물은 멸균 1X PBS(1.5 x 108 CFU/mL에 해당)에서 McFarland's 0.5 규모로 조정된 S. aureus ATCC 29213의 세균 현탁액 10 μL였다. 결과적으로, 각 상처에서 얻은 최종 세균 농도는 1.5 x 106총 CFU였다.
치료: 각 그룹의 모든 동물의 두 상처를 다음과 같은 겔화 하이드록시에틸 셀룰로오스 조성으로 국소적으로 치료하였다: 그룹 A(M0), 그룹 B(M13), 그룹 C(M15), 그룹 D(M16), 그룹 E(LAPS), 그룹 F(혼합 용매) 및 그룹 G(처리 없는 대조군). 첫 번째 투여는 감염 후 48시간에 이루어지며 그 다음 시험이 끝날 때까지 매일 적용되었다. 해당 시험물질을 도포하기 전에 면봉과 멸균 생리용액을 이용하여 동물의 상처를 세척하였다. 7일까지, 각 시험 물질 조성물 20 μL를 각 상처에 투여하고, 8일부터 10 μL로 감량하였다.
본 발명의 조성물(M0, M13, M15 및 M16)을 실시예 22 내지 25에 따라 정교화하였다.
동물 관찰 및 모니터링: 동물의 임상 징후, 행동 및 체중 변화를 매일 평가하였다. 또한, 3 내지 5일마다 Olympus Stylus SZ-15 디지털 카메라를 사용하여 상처를 촬영하고 Image ProPlus 6.0 프로그램을 사용하여 상처 부위를 정량화하였다.
부검: 처리하지 않은 대조군의 상처가 40% 치유에 도달했을 때 모든 실험군의 동물 1, 3 및 5를 희생시켰다(수술 후 약 6일째). 모든 실험 그룹의 동물 2, 4 및 6은 처리되지 않은 대조군의 상처가 약 80% 치유에 도달했을 때 희생시켰다(수술-후 약 10일째). 종료 시점에서, 대조군의 동물을 안락사시켰다.
조직병리학: 각 그룹의 동물 2, 4 및 6의 피부 샘플에서 상피화 및 콜라겐 생성은 마손 삼색으로 염색된 조직학적 내장의 디지털 분석에 의해 결정된다.
면역조직화학: 알파 평활근 액틴(α-SMA)을 검출하기 위해 조직학적 섹션에서 면역조직화학 기술을 수행하였다. 모노클로날 항체(쥐 항-α-SMA - 클론 αsm-1 Novocastra, NCL-SMA)를 사용하여 pH 6의 시트레이트 완충액을 사용하여 마이크로웨이브에서 항원 회수를 수행하고 스트렙타비딘 퍼옥시다제 시스템과의 반응을 나타내었다.
결과
도 20은 처리된 동물의 상이한 그룹에 적용된 처리 24시간에서의 상처 봉합 백분율을 나타낸다. 조성물(M0, M13, M15 및 M16)을 감염 후 24시간 후에 시험하였다. Image ProPlus 6.0 소프트웨어를 사용하여 사진을 분석하여 상처 부위 봉합 비율을 측정했다. M0 및 M13(에토숙시미드 3.00 mg/mL 사용), M15(에토숙시미드 0.5 mg/mL 사용) 및 M16(에토숙시미드 30.0 mg/mL 사용)으로 처리된 동물은 처리되지 않은 대조군에 비해 더 높은 치유 백분율을 보여주었다.
Figure pct00005
콜라겐의 존재를 모든 실험군(미처리 대조군, MS, LAPS, M0, M13, M15 및 M16)의 동물에서 마손 삼색 염색으로 평가하였다. 콜라겐화를 추정하는 데 사용되는 조직병리학적 분류는 Abramov 스코어링 시스템으로, Nisbet et al.(2010)에서 채택되었으며, 여기서 콜라겐의 양은 0 = 콜라겐 부재, 1 = 부족, 2 = 보통 및 3 = 풍부로 분류된다. 각 동물의 두 상처를 표피에서 진피까지 5개의 고-배율 필드(400X)로 연구하였다.
Figure pct00006
Figure pct00007
는 알비노 쥐 모델의 절개 상처에 에토숙시미드(Etho)를 적용했다. 그들은 연질 파라핀에 함유된 에토숙시미드 함유 연고 10% w/w(80 mg/mL)가 콜라겐화를 향상시켜 상처 치유를 크게 촉진한다는 것을 증명한다. 이 특허의 발명자들은 또한 S. aureus에 감염된 절개 상처 모델에서 Wistar 쥐에 다른 성분(M0, M13, M15 및 M16)과 결합된 에토숙시미드를 적용했다. 본 발명의 조성물은 유사하거나 더 나은 콜라겐화 결과를 얻을 수 있었지만 감염된 상처에 소량의 에토숙시미드(0.5 내지 30 mg/mL)가 있었다. 두 분석의 결과는 다음 표에서 볼 수 있다. Ajwee et al. 열의 데이터는 그의 논문에서 추출되었고 10% w/w 농도의 에토숙시미드는 연질 파라핀의 밀도 값을 사용하여 80 mg/mL로 변환되었다.
Figure pct00008
알파 평활근 액틴(α-SMA) 발현을 치유 과정과 관련된 혈관 및 근섬유아세포의 근육층의 특정 마커로 연구하였다. 근섬유아세포는 상처 봉합 및 조직 구축에 중요한 특수 수축성 섬유아세포이다. α-SMA의 발현은 사진(도 21)에서 갈색으로 보인다. 더 많은 양과 강도의 갈색은 더 큰 α-SMA 발현을 의미한다. 수술-후 7일(시험의 첫 번째 종료점)에, 미-처리 대조군(도 21G) 및 혼합 용매(MS) 겔로 처리된 그룹(도 21F)은 혈관에서의 α-SMA 발현만을 나타내었다. LAPS는 근섬유아세포에서 α-SMA 발현을 약간 증가시켰다(도 21E). 한편, 조성물-처리된 상처는 성분 농도에 정비례하는 α-SMA 발현을 나타내었다. 예를 들어, M0 및 M15는 보통의 발현을 나타내었고(도 21C), M13은 높은 발현을 나타내었고(도 21B) M16은 매우 높은 발현을 나타내었다(도 21D).
결론: 본 발명의 조성물은 치유 과정을 가속화하면서 콜라겐 및 알파 평활근 액틴 생성을 자극하면서, 동시에 살균 효과를 달성한다.
참고 문헌
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013

Claims (36)

  1. ● 1 종 이상의, 이미드기를 갖는 5원 또는 6원의 질소-함유 헤테로고리 화합물;
    ● 1 종 이상의 4.5 내지 6.5의 활성 pH를 가지는 데옥시리보뉴클레아제 효소; 및
    ● 1 종 이상의 카복실산
    을 포함하는, 국소 상처 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    이미드기를 갖는 5원 또는 6원의 질소-함유 헤테로고리 화합물이 에토숙시미드, 바르비투르산, 페노바르비탈, 5,5-디에틸 바르비투르산, 5-에틸-5-(1-메틸부틸)바르비투르산, 펜토바르비톤, 펜토바르비탈, 넴부탈, 5-에틸-5-(1-메틸프로필)바르비투르산, 부토바르비탈, 부티솔, 5-알릴-5-(1-메틸부틸)-바르비투르산, 세코바르비탈, 세코날, 페니토인, 하이단토인 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 이미드기를 갖는 5원 또는 6원의 질소-함유 헤테로고리 화합물을 포함하는, 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    데옥시리보뉴클레아제 효소가 DNase, rh-도르나제 알파(rh-dornase alfa), 소 췌장(bovine pancreatic) DNase I, DNase II, 원핵성(prokaryotic) DNase II 또는 진핵성(eukaryotic) DNase II, DNase II 알파, DNase II 베타, 돼지 비장(porcine spleen) DNase II 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 데옥시리보뉴클레아제 효소를 포함하는, 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    카복실산이 시트르산, 젖산, 아세트산, 포름산, 말산, 타르타르산, 살리실산, 옥살산, 벤조산, 프로피온산 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 카복실산을 포함하는, 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    ● 이미드기를 갖는 5원 또는 6원의 질소-함유 헤테로고리 화합물 1 종 이상을 약 0.5 내지 약 50 mg/mL;
    ● 1 종 이상의 데옥시리보뉴클레아제 효소 약 0.5 내지 약 4000 μg/mL;
    ● 1 종 이상의 카복실산 약 1 내지 약 15 mg/mL
    를 포함하는, 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 60, 소르비탄 트리스테아레이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 옥톡시놀-9, 노녹시놀-9 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 인장 활성제를 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    약 5 mg/mL 이하의 인장 활성제를 포함하는, 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    에틸렌 글리콜 테트라아세트산, 에틸렌디아민테트라아세트산, 디메르캅토숙신산, 2,3-디메르캅토-1-프로판술폰산, 리포산(1,2-디티올-3-발레르산), 옥살산 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 착물 형성 산을 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    약 1 mg/mL 이하의 착물 형성 산을 포함하는, 약학적 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    요산, 아스코르브산, 리포산 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 친수성 환원산을 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    약 3 mg/mL 이하의 친수성 환원산을 포함하는, 약학적 조성물.
  12. 제1항에 있어서,
    셀룰로오스, 나노-결정질 셀룰로오스, 세균성 셀룰로오스, 하이드록시에틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 카복시메틸 셀룰로오스, 카보폴 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 겔화제를 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    약 25 mg/mL 이하의 겔화제를 포함하는, 약학적 조성물.
  14. 제1항에 있어서,
    아세트산 0.2 M / 아세트산 나트륨 0.2 M: 비율 2.78 대 0.66%(v/v) pH = 4.2 내지 4.8; 아세트산 0.10 M / 아세트산 나트륨 0.01 M: 비율 1.05 대 10.05%(v/v) pH = 5,6; 일염기성 인산 칼륨 0.05 M pH = 4.5; 일염기성 인산 칼륨 0.36 M / 인산 이나트륨 0.07 M: 비율 4.92 대 0.98%(p/v) pH = 5,7; 일염기성 인산 칼륨 0.36 M / 인산 이나트륨 0.10 M: 비율 4.92 대 1.49%(p/v) pH = 6,0; 시트르산 0.31 M / 인산 이나트륨 0.20 M: 비율 2.99 대 1.42%(p/v) pH = 5.8; 시트르산 0.10 M / 시트르산 나트륨 0.03 M: 비율 1.92 a 0.77%(p/v) pH = 5,8; 쇠렌센 인산 완충액(
    Figure pct00014
    ): 일염기성 인산나트륨 0.2M/인산 이나트륨 2.3 M: 비율 1.2 대 16.33%(p/v) pH = 5,8; 행크스 평형 염액(Hank's balanced salt solution)(HBSS): 염화 나트륨 0.14 M(0.800%), 염화 칼륨 5 mM(0.040%), 염화 칼슘 1 mM(0.014%), 황산 마그네슘 칠수화물 0.4 mM(0.010%), 염화 마그네슘 육수화물 0.5 mM(0.010%), 인산 이나트륨 이수화물 0.3 mM(0.006%), 일염기성 인산 칼륨 0.4 mM(0.006%), 포도당 6 mM(0.100%), 중탄산 나트륨 4 mM(0.035%): pH = 5.7; 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES) 1 M(pH = 6.5); 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 나트륨염, 4-모르폴린에탄술폰산(MES 나트륨염) 0.5 M(pH 5.5 - 6.7); N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산 나트륨염(BES) 0.5 M(pH = 6.0); N-(2-아세트아미도)-2-아미노에탄술폰산(ACES) 0.5 M(pH = 6.0); 2,2'-[(2-아미노-2-옥소에틸)이미노]디아세트산(ADA) 0.2 M(pH = 6.0); 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산)(PIPES) 0.5 M(pH = 6.0 - 6.8); 3-모르폴리노-2-하이드록시프로판술폰산(MOPSO) 0.2 M(pH = 6.0); 생리 식염수(0.9%) / MgCl2(5 mM) pH 5.5; 1 M NaHCO3 용액 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 용액을 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
  15. 제1항에 있어서,
    1 종 이상의, 이미드기를 갖는 5원 또는 6원의 질소-함유 헤테로고리 화합물이 에토숙시미드를 포함하고;
    1 종 이상의 4.5 내지 6.5의 활성 pH를 가지는 데옥시리보뉴클레아제 효소가 재조합 인간 도르나제-알파를 포함하고;
    1 종 이상의 카복실산이 젖산을 포함하는,
    약학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    1 종 이상의 친수성 환원산;
    1 종 이상의 인장 활성제;
    1 종 이상의 착물 형성 산;
    1 종 이상의 겔화제; 및
    용액
    을 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
  17. 제1항에 있어서,
    이미드기를 갖는 5원 또는 6원의 질소-함유 헤테로고리 화합물이 에토숙시미드를 포함하고;
    데옥시리보뉴클레아제 효소가 재조합 인간 도르나제-알파를 포함하고;
    카복실산이 젖산을 포함하고,
    아스코르브산
    폴리소르베이트-80;
    에틸렌디아민테트라아세트산;
    하이드록시에틸 셀룰로오스; 및
    pH 5.5의 생리 식염수 0.9% 및 MgCl2 5 mM을 포함하는 용액
    을 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
  18. 제1항에 있어서,
    4.5 내지 6.8의 pH를 가지는, 약학적 조성물.
  19. 제1항에 있어서,
    에토숙시미드 약 0.5 내지 약 30 mg/mL;
    재조합 인간 도르나제-알파 약 1 내지 약 4 μg/mL;
    젖산 약 1 내지 약 9 mg/mL
    의 수용액을 포함하고;
    약 2.5 mg/mL 이하의 아스코르브산;
    약 3 mg/mL 이하의 폴리소르베이트-80;
    약 0.75 mg/mL 이하의 에틸렌디아민테트라아세트산;
    약 17 mg/mL 이하의 하이드록시에틸 셀룰로오스
    를 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
  20. 제1항에 있어서,
    에토숙시미드 약 0.5 내지 약 3 mg/mL;
    재조합 인간 도르나제-알파 약 0.97 내지 약 3.9 μg/mL;
    젖산 약 1.6 내지 약 8.7 mg/mL;
    을 포함하고;
    약 2.5 mg/mL 이하의 아스코르브산;
    약 3 mg/mL 이하의 폴리소르베이트-80;
    약 0.75 mg/mL 이하의 에틸렌디아민테트라아세트산;
    약 17 mg/mL 이하의 하이드록시에틸 셀룰로오스
    를 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
  21. 약학적 조성물을 수득하기 위한 사용 이전에 혼합하기 위한 제1 조성물 및 제2 조성물을 포함하는 국소 상처 치료용 약학적 제형 키트로서,
    a. 제1 조성물은 고체이고 데옥시리보뉴클레아제 효소 및 겔화제 분말을 포함하고;
    b. 제2 조성물은 이미드기를 갖는 5원 또는 6원의 질소-함유 헤테로고리 화합물 1 종 이상 및 1 종 이상의 카복실산을 포함하는 수성 액체이고;
    c. 제2 조성물은 4.5 내지 6.8의 pH를 갖는,
    국소 상처 치료용 약학적 제형 키트.
  22. 약학적 조성물을 수득하기 위한 사용 이전에 혼합하기 위한 제1 조성물, 제2 조성물 및 제3 조성물을 포함하는 국소 상처 치료용 약학적 제형 키트로서,
    a. 제1 조성물은 고체이고 겔화제 분말을 포함하고;
    b. 제2 조성물은 고체이고 데옥시리보뉴클레아제 효소를 포함하고;
    c. 제3 조성물은 이미드기를 갖는 5원 또는 6원의 질소-함유 헤테로고리 화합물 1 종 이상 및 1 종 이상의 카복실산을 포함하는 수성 액체이고;
    d. 제3 조성물은 4.5 내지 6.8의 pH를 갖는,
    국소 상처 치료용 약학적 제형 키트.
  23. 제21항에 있어서,
    제1 조성물, 제2 조성물 및 제3 조성물 각각은 밀폐되고 분리된 용기에 담긴, 약학적 제형 키트.
  24. 제22항에 있어서,
    제1 조성물, 제2 조성물 및 제3 조성물 각각은 밀폐되고 분리된 용기에 담긴, 약학적 조성물.
  25. a. 제1 조성물을 제2 조성물과 접촉시키는 단계;
    b. 혼합 및 진탕하여 겔 약학적 조성물을 수득하는 단계
    를 포함하는, 제21항에 따른 약학적 제형을 제조하는 방법.
  26. 사용 이전에 혼합되는 제1 조성물, 제2 조성물 및 제3 조성물을 포함하는 약학적 제형으로부터 제12항의 조성물을 제조하기 위한 방법으로서,
    제1 조성물은 고체이고 겔화제 분말을 포함하고; 제2 조성물은 고체이고 데옥시리보뉴클레아제 효소를 포함하고; 제3 조성물은 이미드기를 갖는 5원 또는 6원의 질소-함유 헤테로고리 화합물 1 종 이상 및 1 종 이상의 카복실산을 포함하는 수성 액체이고; 제3 조성물은 4.5 내지 6.8의 pH를 갖고, 상기 방법은
    a. 제3 조성물을 제2 조성물과 접촉시키는 단계;
    b. 제3 조성물을 제2 조성물과 혼합 및 진탕하여 혼합물(b)를 형성하는 단계;
    c. 제1 조성물을 혼합물(b)와 접촉시켜 혼합물(c)를 형성하는 단계;
    d. 혼합 및 진탕하여 겔 약학적 조성물을 수득하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  27. 제1항에 따른 약학적 조성물을 상처에 적어도 1일 1회 도포하는 것을 포함하는, 포유동물의 상처를 치료하는 방법.
  28. 제21항에 따른 약학적 제형을 상처에 적어도 1일 1회 도포하는 것을 포함하는, 포유동물의 상처를 치료하는 방법.
  29. 제22항에 따른 약학적 제형을 상처에 적어도 1일 1회 도포하는 것을 포함하는, 포유동물의 상처를 치료하는 방법.
  30. 제27항에 있어서,
    상처가 당뇨병성 족부궤양, 정맥 궤양, 동맥 궤양, 압박 궤양, 바이오필름-형성 박테리아의 중복 감염을 특징으로 하는 기계적 상처, 바이오필름-형성 박테리아의 중복 감염을 특징으로 하는 수술-후 상처 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 상처인, 방법.
  31. 제28항 또는 제29항에 있어서,
    상처가 당뇨병성 족부궤양, 정맥 궤양, 동맥 궤양, 압박 궤양, 바이오필름-형성 박테리아의 중복 감염을 특징으로 하는 기계적 상처, 또는 바이오필름-형성 박테리아의 중복 감염을 특징으로 하는 수술-후 상처 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 상처인, 방법.
  32. 제1 조성물을 포함하는 제1 용기; 및
    제2 조성물을 포함하는 제2 용기
    를 포함하고,
    제1 용기와 제2 용기는 제1 조성물 및 제2 조성물을 분리된 상태로 유지할 수 있는 접이식 막에 의해 분리된,
    제21항에 따른 약학적 제형 키트를 포함하는 장치.
  33. 제1 조성물을 포함하는 제1 용기;
    제2 조성물을 포함하는 제2 용기; 및
    제3 조성물을 포함하는 제3 용기
    를 포함하고,
    제1 용기와 제2 용기는 제1 조성물 및 제2 조성물을 분리된 상태로 유지할 수 있는 제1 접이식 막에 의해 분리되고;
    제2 용기와 제3 용기는 제2 조성물 및 제3 조성물을 분리된 상태로 유지할 수 있는 제2 접이식 막에 의해 분리된,
    제22항에 따른 약학적 제형 키트를 포함하는 장치.
  34. a. 이미드기를 갖는 5원 또는 6원의 질소-함유 헤테로고리 화합물, 데옥시리보뉴클레아제 효소 및 카복실산을 용액에 혼합하여, 혼합물을 형성하는 단계;
    b. 혼합물의 pH가 4.50 내지 6.50일 때까지 알칼리성 용액을 혼합물에 적가하여, pH-조정된 혼합물을 형성하는 단계; 및
    c. pH-조정된 혼합물을 살균하는 단계
    를 포함하는, 제1항에 따른 약학적 조성물을 생산하는 방법.
  35. 제34항에 있어서,
    d. 겔화제를 첨가하는 단계
    를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  36. 제34항에 있어서,
    e. 착물 형성 산, 인장 활성제 및 친수성 환원산을 첨가하는 단계
    를 추가로 포함하는 것인, 방법.
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