CN114341111A - 用于局部伤口治疗的药物组合物 - Google Patents

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A·R·韦尼里
M·德·洛斯·安杰利斯·拉扎特
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N·A·塞鲁西科
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Youtaike Co ltd
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Tukuman National University
Youtaike Co ltd
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Abstract

一种用于局部伤口治疗的药物组合物，其包含一种或多种具有酰亚胺基团的5个或6个原子的含氮杂环化合物、一种或多种活性pH在4.5和6.5之间的脱氧核糖核酸酶和一种或多种羧酸；试剂盒、用于获得该药物组合物的方法、以及用于伤口治疗的用途。

Description

用于局部伤口治疗的药物组合物
技术领域
本发明涉及用于治疗伤口的局部药物组合物。此外，还涉及用于治疗慢性伤口的局部药物组合物和制剂的领域。
背景技术
慢性伤口为不愈合的损伤，理解为在一系列有序阶段(ordered stage)和在可预测的时间内不愈合的伤口，例如静脉性溃疡、糖尿病足部溃疡、褥疮、压疮、缺血性溃疡、非典型病变等(1)。它们影响约2％的世界人口(2)并且代表医疗体系的重大经济问题(3)。慢性伤口处于阻碍愈合的慢性炎症状态(4)，尽管愈合的失败是多因素的(5)。科学家对慢性伤口进行了大量研究，得到大量试图提供治疗解决方案的产品。然而，迄今为止尚没有针对这些类型的伤口的全面且有效的疗法。
市场中有很多用于慢性伤口的产品。对于伤口感染、伤口清创和伤口护理，医师通常使用组合疗法(6)。这些种类的产品无法确保愈合并且医生还必须经常重复使用皮肤替代品(7)、真空辅助闭合(vacuum assisted closure)(8)、生长因子(9)和高压氧疗法(hyperbaric therapy)(10)。然而，它们均无法同时提供所有治疗要求，因此它们也显示出受限的治疗效果(11)。
在可以提及用于伤口感染的产品中：1)银具有广谱的活性并且可以多种形式获得。然而，需要以足够高的浓度持续释放银以保持功效。例如，为了适当地起作用，必须每天给予硝酸银12次(12)。此外，最近的综述没有发现磺胺嘧啶银对整体伤口愈合具有任何作用的令人信服的证据，尽管其在从业者中普遍使用(13)。2)含碘化合物(即，卡地姆碘(cadexomer iodine)-在淀粉晶格内形成为微珠的碘)长期用于伤口愈合，但是一直存在一些对含碘化合物的毒性(尤其是在大的伤口区域上)的担心(14，15)。3)还开发了抗生素的局部制剂以施用于伤口部位。然而，最近关于抗生素软膏的常规给药的研究没有带来更好的结果，而是经常导致患者不适以及抗生素耐药性和接触性皮炎的可能性(16-18)。
慢性伤口中的绝大多数病原体能够粘附在一起形成生物膜，其代表在聚合物基质周围紧密堆积的物质，从而有助于逃避抗生素和免疫系统的破坏。这不仅对伤口愈合构成了物理屏障，而且可能会使炎症期的正常消退延长，并且解决生物膜已成为伤口愈合中的主要挑战。然而，没有针对慢性伤口的细菌广谱的抗生物膜产品。事实上，为了对慢性伤口有效，产品可以同时提供抑菌、杀菌、生物膜抑制和生物膜破坏特性。
伤口清创(19)包括除去不能存活的组织材料，以暴露能够通过上皮细胞迁移来增殖和填充伤口床的健康、灌注良好的组织，而不是保留仅用作感染的刺激因素并且阻碍伤口愈合的坏死碎片。手术清创是伤口护理的重要组成部分，但是其具有手术操作所具有的所有不便，如感染、疼痛、成本和患者不适。自溶性清创是指在潮湿的伤口环境中产生的参与纤维蛋白降解的内源性酶的自活化并且见于一些类型的伤口敷料。然而，它当然不能除去失活的组织，因此无法用作手术清创的充分替代品。因此，不存在允许在没有侵入性操作和患者不适的情况下进行正确清创的产品。
考虑到与之相关的发病率，伤口护理敷料(20)对于慢性伤口治疗非常重要。然而，所有伤口护理敷料都不是活性产品(它们无法加速愈合过程)并且仅在愈合过程发生时有助于保护伤口。此外，由于以下问题，它们均不能模糊地用于任何种类的慢性伤口：1)保留在伤口上的有限量的渗出液可进行自溶性清创，这用于进一步促进成功的伤口愈合。传统的干纱布伤口敷料(即，Curity、凡士林纱布、Xeroform)可能会削弱该过程，同时在移除时也会造成进一步损伤。2)低附着敷料和半透膜(即，Bioclusive、Blisterfilm、Cutifilm、Flexigrid、OpSite、Tegaderm)代表了伤口敷料的基本类型，其目的为限制液体和微生物渗透但是允许空气和水蒸气通过。因此，它们仅可以用于在伤口中占少数的非渗出性伤口。3)亲水胶体(即，Aquacel、Comfeel、DuoDERM、Granuflex、Tegasorb)可以吸收一定量的渗出液，保持湿润的环境。然而，由于其不可渗透性，它们阻碍气体交换并且不应当用于渗出性伤口。此外，更换需要很长时间。4)可以额外使用水凝胶(即，Carrasyn、Curagel、Nu-Gel、Purilon、Restore、SAF-gel、XCell)以帮助促进干燥伤口湿润。它们容易去除和更换，但是可能会导致水分过多并且因此使愈合延迟。5)海藻酸盐敷料(即，Algisite、Kaltostat、Sorbsan、Tegagen)是源自海藻的无纺布，其由于吸收大量液体的能力而通常用于高度渗出性伤口。因此，可以在用海藻酸盐包扎的干燥伤口中看到不良反应，例如它们可以止血(21)。6)与海藻酸盐敷料相比具有相似特性和不良反应的水纤维(即，Aquacel水纤维)。7)泡棉(即，3M粘合泡棉、Allevyn、Lyofoam、Tielle)在敷料更换期间使创伤最小，但是具有有限的吸收能力并且仅可以用于中度渗出性伤口。8)存在例如泡棉或水凝胶等传统伤口敷料与例如银、甜菜碱、几丁质或聚六亚甲基双胍(Kendall AMD)等抗菌化合物的组合。这些材料可能不适于广谱应用于治愈伤口，但是可以适用于感染可能成为问题的慢性下肢溃疡，尤其是在形成生物膜的情况下。然而，它们可以抑制生物膜形成，但是它们无法产生作为真正的治疗要求的生物膜破坏。9)胶原蛋白产品：它们已用于顽固性伤口和慢性溃疡。认为胶原蛋白产品有助于促使环境吸引对于伤口愈合至关重要的细胞类型，同时消耗例如自由基和蛋白酶等不良效应因子(22)。然而，该胶原蛋白不旨在直接替代受伤组织中新产生的胶原蛋白(这是因为它可以源自多种来源，包括牛和猪胶原蛋白)。此外，它们对感染的伤口没有作用。
皮肤替代品(7)通常由一种生物衍生物质与允许将其放置在伤口上的一种材料组合而成。总体而言，这些敷料相当昂贵，代表了广泛采用的重大障碍。此外，它们代表了感染的高风险和抗原性。可以在市场中找到数种皮肤替代品：1)虽然多种选择均聚焦于覆盖有猪胶原蛋白或多肽的网状材料(Biobrane和TransCyte)，后者还包含新生成纤维细胞或猪异种移植物(EZ Derm)。然而，它们显示仅对于面部烧伤而不是对于一般应用具有成本效益。2)Dermagraft为使用源自新生儿包皮组织的成纤维细胞、细胞外基质和生物可吸收聚乳糖补片(polyglactin mesh)开发的材料。然而，其显示高的排斥和过敏风险(这是因为牛血清可能会以痕量包含在制剂中)。3)Apligraf，一种同种异体双层培养的皮肤等同物，其中培养的成纤维细胞和牛I型胶原蛋白的真皮层与培养的角质形成细胞的表皮层组合。然而，这造成巨大的成本，这是因为，对于7.5cm直径的圆盘，Apligraf的单次应用会花费超过US$1000，并且其仅对于顽固性、慢性、未愈合的伤口具有成本效益，在一定程度上限制了这些产品的通用适用性。4)Omnigraft为由胶原蛋白、粘多糖和软骨素-6-硫酸盐构成的无细胞双层基质，具有用作屏障功能的有机硅层。然而，Omnigraft不应当用于已知对牛胶原蛋白或软骨素材料敏感的患者，当然也不应当用于临床诊断的感染伤口。
真空辅助闭合(VAC)(8)通过保持湿润的环境、优化血流、除去渗出液和施加压力以促进伤口闭合，这些装置能够减少慢性伤口中可能缺乏的许多因素。然而，如果将负压敷料放置为与暴露的血管、骨骼或神经直接接触，则会是危险的。此外，在存在骨髓炎或者患者对丙烯酸系粘合剂过敏或敏感时禁用。
生长因子(9)，由于慢性伤口在生长因子和细胞因子方面包含如此多的干扰因素(perturbation)，解决其中一些问题可能会是有帮助的。然而，在如此多的因素缺乏和失调的环境中，仅替换一者无法挽救慢性伤口表型。事实上，在双盲随机对照试验中，这些疗法中唯一一种被证明可改善愈合的疗法为血小板衍生生长因子(PDGF)(Regranexbecaplermin)，并且这些结果非常适中。
尽管伤口氧合是慢性伤口的最重要的治疗目标之一，但是没有通过增加原位血管内皮生长因子(VEGF)来增加血管形成的产品。
基于高压氧除了其它功能以外还可以促进成纤维细胞增殖、增强免疫功能和刺激血管生成的原理，高压氧(10)已用于伤口愈合。然而，这些理想在实践中不一定能实现，导致其使用中一定程度的争议。重要的是，该疗法应用于高压氧舱中的患者，由于尚未证实局部递送氧气是有效的，因此这可能会导致显著的副作用，包括近视、大脑中的氧毒性导致癫痫和气胸。
可以发现数个发明专利教导了特定的方法，例如一些发明人与本发明的发明人相同的AR093779：该申请教导了一种乳酸菌发酵物的上清液，其被成功地提出用于治疗慢性伤口(23-25)。在该文献中，本发明人将上述上清液称为“LAPS”。该上清液的技术问题在于，由于其为发酵上清液，因此其根据生产条件包含不确定且可变的组成。此外，其随着时间的推移具有有限的稳定性，这是因为有证据表明其治疗功能不超过60天。
EP0848951B1提供了N-乙酰半胱氨酸(NAC)用于制备用于治疗或预防选自由糖尿病足部溃疡和压疮组成的组中的慢性伤口的组合物的用途，其中组合物为用于对慢性溃疡局部给药的软膏的形式，并且软膏包含：1)0.01％至1％w/w NAC或者其药学上可接受的盐或衍生物，和2)载体：包含纤维素(即，羟乙基纤维素)的水凝胶、聚丙烯酸(即，卡波姆)的水凝胶或者用于药物制剂的乳膏/软膏(即，聚西托醇(cetomacrogol))。以上载体可以包括作为增稠剂或刺激剂的海藻酸盐、防腐剂(即，苯甲醇)、控制pH的缓冲剂(即，Na2HPO4/NaH2PO4)、调节渗透压的试剂(即，NaCI)、稳定剂(即，EDTA)。请求保护的基于NAC的用于慢性伤口治疗的组合物通过抑制MMP显示促愈合作用。然而，在他们的过程1中，他们证实了NAC显示出对细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达的浓度依赖性抑制。这对于慢性伤口治疗不是可取的，这是因为之前证实了在没有ICAM-1的情况下，伤口愈合会延迟(26)。
US9,211,305B2教导了一种用于治疗糖尿病足部溃疡的粘多糖的组合物，其具体涉及低分子量肝素(LMWH)和极低分子量肝素(VLMWH)用于治疗慢性溃疡、特别是糖尿病足部溃疡，并且更具体地，涉及用于治疗慢性溃疡并且特别是糖尿病足部溃疡和压疮的药用产品的制造。具体地，该专利请求保护用于治疗慢性伤口的方法，但是该治疗不提供抗菌特性(抑菌、杀菌、抗生物膜)，也不提供抗氧化特性或血管生成特性。因此，其必须与其它产品组合使用。
US10,285,938B2抗菌肽代表了免疫系统途径中相对较新的发现。合成工程化抗菌肽的最近设计已经在比较中证实了增加的效力和功效/耐受性、增强的特异性和降低的毒性。一种此类肽
Figure BDA0003532486030000061
从针对大量病原体的重要体外研究中显示出显著的前景。此外，广泛的动物研究显示
Figure BDA0003532486030000062
是抗大量病原体的抗菌肽。
Figure BDA0003532486030000064
肽也是耐溶质的(solute resistant)。肽
Figure BDA0003532486030000063
对测试生物体金黄色葡萄球菌MTCC96和铜绿假单胞菌MTCC741显示出显著的抗菌活性。使用该申请中详细描述的方案，在用肽处理的动物中观察到微生物群体水平的明显降低。具体地，他们请求保护使用上述抗菌肽治疗伤口的方法。然而，该方法没有考虑到促愈合特性，如抗氧化、MMP抑制、血管生成等。除此之外，关于它们的抗菌特性，它们没有证实对生物膜的有效性(抑制和/或破坏)。因此，其必须与其它产品组合使用。
WO2019/193333A1涉及包含三氯生(2,4,4-三氯羟基二苯基醚)和增稠剂的药物组合物，其用于治疗慢性伤口并且特别是治疗糖尿病足部溃疡。具体地，具有与三氯生相关的抗菌特性的局部用组合物。活性促愈合成分：蓖麻油、荷荷巴油、芦荟10:1；活性抗菌成分：三氯生；乳化剂：硬脂酸、GMSSE、棕榈酸鲸蜡酯、硅油200 100 CS、重质液体石蜡、单丙二醇(Monopropilenglicol)；凝胶剂(Gelificant)：卡波姆980 5％、三乙醇胺；可选防腐剂：Nipastat。然而，该组合物没有考虑到促愈合特性，如抗氧化、MMP抑制、血管生成等。除此之外，关于它们的抗菌特性，它们没有证实对生物膜的有效性(抑制和/或破坏)。因此，其必须与其它产品组合使用。
有许多作者确信靶向氧化应激是受损伤口愈合的治疗中的关键因素(27-29)。在这一点上，存在两类可以体内应用的抗氧化剂，抗氧化酶(例如SOD、过氧化氢酶、过氧化物酶和谷胱甘肽过氧化物酶)和非酶抗氧化剂(例如维生素C、一氧化氮、金属结合蛋白等)(27)。然而，大多数使用抗氧化剂的临床试验限于口服给药。例如，研究了口服补充的抗坏血酸对愈合的影响(28，29)。另一方面，提出局部施用水凝胶形式的来自植物提取物的抗氧化剂或酶抗氧化剂用于慢性伤口治疗(27)。唯一报道的将非酶抗氧化剂局部施用于慢性伤口的临床试验使用包含5％DMSO(一种有效的活性氧物质(ROS)清除剂)的乳膏来进行，并且该治疗无法减少溃疡发生(31)。此外，注意到对足跟和踝关节损伤的发生率的不利影响。作者提出数个假设来解释该意想不到的结果，特别是他们提到DMSO可能的促氧化活性(31)。在生理浓度下，DMSO和抗坏血酸是血浆中有效的自由基清除剂，保护细胞免受由ROS引起的氧化性损伤(32)。
Ajwee DM等人(2012)教导了乙琥胺和苯巴比妥通过增强胶原化来促进伤口愈合(33)。他们将乙琥胺(Etho)施用于大白鼠(Albino rat)模型中的切除伤口。他们证实了含有乙琥胺的软膏(10％w/w(80mg/ml)在软石蜡中)通过增强胶原化显著地促进伤口愈合。他们每天施用150mg软膏。这意味着每天15mg Etho。考虑到大白鼠的重量为140g至180g并且这些动物的参考血容量(volemia)为每千克50mL，则这些大鼠的血容量近似为10mL。如果我们认为每天施用的Etho 100％转移至血流中，则治疗的第一天，Etho的血浆浓度达到15mg/10mL。这意味着1.5mg/mL或1500μg/mL。在人类中，接受的治疗水平为40至100μg/mL(参见扎荣廷(Zarontin)前景FDA)。高于该浓度，观察到肝毒性、白细胞减少、血小板减少、镇静和恶心。此外，该组合物尚未证实抗菌特性(抑菌、杀菌、抗生物膜)。因此，其必须与其它产品组合使用用于伤口治疗。
Goldberg SR等人在他们的综述(2020)中指出，成为慢性伤口存在五个关键点(34)：
1)缺血。缺血导致组织损伤、坏死和迅速被细菌占据的开放性伤口的发展。
2)感染。感染为慢性和不受控制的炎症奠定了基础。大多数慢性伤口本质上是多微生物的，其中葡萄球菌属和假单胞菌属占优势。
3)生物膜形成。促炎反应通过形成生物膜而持续存在，所述生物膜隔离并保护细菌和发炎的溃疡部位。生物膜刺激宿主免疫应答，同时还直接抵抗抗菌疗法并且刺激慢性炎症。
4)慢性炎症和组织损伤。当宿主的炎症细胞试图除去受损组织时，释放活性氧物质和蛋白酶如MMP，引起进一步的组织损伤。MMP的过表达引起对细胞外基质的损伤并且驱动慢性不愈合伤口的潜在病理。MMP的过度生成也会破坏重要的生长因子，例如伤口愈合所必需的血小板衍生生长因子和转化生长因子-b。
5)降低的促有丝分裂活性。由于激烈的炎症环境，残留的结缔组织细胞使促有丝分裂活性降低并且变得衰老。
Goldberg等人指出这种炎症和组织破坏的恶性循环持续存在，直至使用积极的临床策略除去细菌、受损和坏死的组织以及减轻炎症。他们还指出，在现有技术的情况下，管理患者伤口的最佳方法是DIME支持产品和服务伤口护理指南(35)。该指南包括一种综合方法以评估伤口和识别有必要同时使用以提高治疗有效性的所有产品和服务。如可以在该指南中看到的，市场中没有产品具有同时提供由Goldberg指出的5个关键点的能力(35)。
这是目前的治疗通常使用组合疗法用于伤口感染、伤口清创和伤口护理的原因。这些种类的产品无法确保愈合并且医师还必须经常重复使用皮肤替代品、真空辅助闭合、生长因子和高压氧疗法。然而，它们均无法同时提供所有提及的治疗要求，因此它们也显示出相对的治疗效果。
专家指出，当疗法同时包括所有以下治疗要求时，治疗有效性将提高(36)：
a)管理感染和生物膜清除(37，38)，
b)管理渗出液的量和组成(39)，
c)特定的生长因子重构(9)，
d)管理炎症(4)及其有害影响，如基质金属蛋白酶的累积(40)和氧化应激(29)，以及
e)疼痛控制(41)。
发明内容
本发明通过提供用于慢性伤口治疗的组合物来解决现有技术中描述的问题，所述组合物同时提供血管生成、广谱抑菌、杀菌、生物膜抑制和生物膜破坏(包括慢性伤口中最多分离出来的细菌金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌)、基质金属蛋白酶(MMP)抑制(通过其酸化和螯合特性)、伤口床中的胶原蛋白和α肌动蛋白形成以及促愈合特性。
此外，本发明提供用于慢性伤口治疗的组合物，其令人惊讶地显示出由其组分的组合产生的功能协同。
本发明提供包含用于药物用途的组分的组合物和制剂，其组合构成慢性伤口的治疗性处理问题的解决方案。解决现有技术中存在的问题。
本发明的目的在于提供用于治疗伤口的组合物。
本发明的目的还在于提供用于治疗慢性伤口的组合物。
本发明的目的还在于提供用于治疗慢性伤口的组合物，所述慢性伤口包括静脉性溃疡、动脉性溃疡、压疮(褥疮)；糖尿病足部溃疡、以及由于被形成生物膜的细菌重复感染而慢性化的机械性伤口或术后伤口。
本发明的目的还在于提供用于原位制备的局部递送用制剂。
本发明的目的还在于提供原位制备的用于治疗伤口的凝胶制剂。
本发明的目的还在于提供制作所述组合物的方法。
本发明的目的还在于提供能够原位制备用于治疗伤口的凝胶制剂的装置。
本发明的目的还在于提供用于治疗具有慢性伤口的哺乳动物的方法，所述慢性伤口包括静脉性溃疡、动脉性溃疡、压疮(褥疮)；糖尿病足部溃疡、以及由于被形成生物膜的细菌重复感染而慢性化的机械性伤口或术后伤口。
附图说明
图1：包含本发明的制剂的装置的图。其示出由使各组合物隔离的两个可塌缩膜(collapsible membranes)隔开的三个容器。当膜破裂时，容器组合物混合。
图2：针对铜绿假单胞菌研究的以下抗病原体特性的百分比：由组合物M0和M13以及浓度为其在所提及的组合物中的浓度的单一分子引起的抑菌活性、生物膜(BF)形成的抑制和预先形成的生物膜破坏。Etho＝乙琥胺；AA＝抗坏血酸；LA＝乳酸；PS80＝聚山梨醇酯80；D1＝DNAse 1；MS＝混合溶剂；LAPS＝植物乳杆菌上清液；M＝混合物
图3：在使用组合物M0和M13以及浓度为其在所提及的组合物中的浓度的单一分子处理24h之后，以铜绿假单胞菌的存活细菌(CFU/mL)表示的杀菌效果。Etho＝乙琥胺；AA＝抗坏血酸；LA＝乳酸；PS80＝聚山梨醇酯80；D1＝DNAse 1；LAPS＝植物乳杆菌上清液；M＝混合物；MS＝混合溶剂
图4：不同的抗病原体效果的百分比：针对铜绿假单胞菌，由组合物M15以及浓度为其在所提及的组合物中的浓度的单一分子引起的抑菌活性、生物膜(BF)形成的抑制和预先形成的生物膜破坏。Etho＝乙琥胺；AA＝抗坏血酸；LA＝乳酸；PS80＝聚山梨醇酯80；D1＝DNAse 1；LAPS＝植物乳杆菌上清液；M＝混合物；MS＝混合溶剂
图5：在使用组合物M15以及浓度为其在所提及的组合物中的浓度的单一分子处理24h之后，以铜绿假单胞菌的存活细菌(CFU/mL)表示的杀菌效果。Etho＝乙琥胺；AA＝抗坏血酸；LA＝乳酸；PS80＝聚山梨醇酯80；D1＝DNAse1；LAPS＝植物乳杆菌上清液；M＝混合物；MS＝混合溶剂
图6：不同的抗病原体效果的百分比：针对铜绿假单胞菌，由组合物M16以及浓度为其在所提及的组合物中的浓度的单一分子引起的抑菌活性、生物膜(BF)形成的抑制和预先形成的生物膜破坏。Etho＝乙琥胺；AA＝抗坏血酸；LA＝乳酸；PS80＝聚山梨醇酯80；D1＝DNAse 1；LAPS＝植物乳杆菌上清液；M＝混合物；MS＝混合溶剂。
图7：在使用组合物M16以及浓度为其在所提及的组合物中的浓度的单一分子处理24h之后，以铜绿假单胞菌的存活细菌(CFU/mL)表示的杀菌效果。Etho＝乙琥胺；AA＝抗坏血酸；LA＝乳酸；PS80＝聚山梨醇酯80；D1＝DNAse1；LAPS＝植物乳杆菌上清液；M＝混合物；MS＝混合溶剂。
图8：针对金黄色葡萄球菌研究的以下抗病原体特性的百分比：由组合物M0和M13和浓度为其在所提及的组合物中的浓度的单一分子引起的抑菌活性、生物膜(BF)形成的抑制和预先形成的生物膜破坏。Etho＝乙琥胺；AA＝抗坏血酸；LA＝乳酸；PS80＝聚山梨醇酯80；D1＝DNAse 1；LAPS＝植物乳杆菌上清液；M＝混合物；MS＝混合溶剂。
图9：在使用组合物M0和M13以及浓度为其在所提及的组合物中的浓度的单一分子处理24h之后，以金黄色葡萄球菌的存活细菌(CFU/mL)表示的杀菌效果。Etho＝乙琥胺；AA＝抗坏血酸；LA＝乳酸；PS80＝聚山梨醇酯80；D1＝DNAse 1；LAPS＝植物乳杆菌上清液；M＝混合物；MS＝混合溶剂。
图10：不同的抗病原体效果的百分比：针对金黄色葡萄球菌，由组合物M15以及浓度为其在所提及的组合物中的浓度的单一分子引起的抑菌活性、生物膜(BF)形成的抑制和预先形成的生物膜破坏。Etho＝乙琥胺；AA＝抗坏血酸；LA＝乳酸；PS80＝聚山梨醇酯80；D1＝DNAse 1；LAPS＝植物乳杆菌上清液；M＝混合物；MS＝混合溶剂
图11：在使用组合物M15以及浓度为其在所提及的组合物中的浓度的单一分子处理24h之后，以金黄色葡萄球菌的存活细菌(CFU/mL)表示的杀菌效果。Etho＝乙琥胺；AA＝抗坏血酸；LA＝乳酸；PS80＝聚山梨醇酯80；D1＝DNAse1；LAPS＝植物乳杆菌上清液；M＝混合物；MS＝混合溶剂。
图12：不同的抗病原体效果的百分比：针对金黄色葡萄球菌，由组合物M16以及浓度为其在所提及的组合物中的浓度的单一分子引起的抑菌活性、生物膜(BF)形成的抑制和预先形成的生物膜破坏。Etho＝乙琥胺；AA＝抗坏血酸；LA＝乳酸；PS80＝聚山梨醇酯80；D1＝DNAse 1；LAPS＝植物乳杆菌上清液；M＝混合物；MS＝混合溶剂。
图13：在使用组合物M16以及浓度为其在所提及的组合物中的浓度的单一分子处理24h之后，以金黄色葡萄球菌的存活细菌(CFU/mL)表示的杀菌效果。Etho＝乙琥胺；AA＝抗坏血酸；LA＝乳酸；PS80＝聚山梨醇酯80；D1＝DNAse1；LAPS＝植物乳杆菌上清液；M＝混合物；MS＝混合溶剂。
图14：MS、LAPS、AA(0.5mg/mL和2.5mg/mL)、M15和M16显示的相对于Trolox的抗氧化活性的百分比(％AAR)。MS＝混合溶剂；AA＝抗坏血酸；LAPS＝植物乳杆菌上清液；M＝混合物
图15：混合溶剂(MS)、EDTA在混合溶剂中的溶液(0.25、0.50和0.75mg/mL)、M0、M13、M15和M16显示的pH 7.0下的钙和锌螯合百分比。MS＝混合溶剂。
图16：对于不同的测试样品，在不同的时间在DNAse琼脂中测得的DNAse活性晕圈(halos)(mm)，以评价酶活性的保守性。
图17：在DNAse琼脂中测得的LAPS、链道酶α0.97μg/mL、M0和M13(各自含有0.97μg/mL的链道酶α)、M15和M16(各自含有3.90μg/mL的链道酶α)的DNAse活性的晕圈(mm)。LAPS＝植物乳杆菌上清液；M＝混合物。
图18：鸡胚绒毛尿囊膜中血管形成增加的百分比。Etho＝乙琥胺；LAPS＝植物乳杆菌上清液；M＝混合物。
图19示出乙琥胺在巨噬细胞J774中和在角质形成细胞HaCaT(处理24小时)中对相对于GAPDH水平标准化的VEGF水平的影响。基因表达以log 2刻度变化。Y轴为各乙琥胺处理组中的基因表达相对于对照组的Log-2倍数变化。GAPDH用作管家基因以校正cDNA输入。
图20.在不同组的治疗动物中施加治疗24小时时伤口闭合的百分比。
图21：图示出了对来自经治疗的伤口的组织切片进行的免疫组化技术，使用单克隆抗体(小鼠抗-α-SMA-克隆αsm-1)并且用链霉亲和素过氧化物酶系统揭示该反应以检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)。
具体实施方式
在本发明的一方面，本文中提供的是用于局部伤口治疗的药物组合物，其至少包含具有酰亚胺基团的5个或6个原子的含氮杂环化合物、一种或多种活性pH在4.5和6.5之间的脱氧核糖核酸酶、和一种或多种羧酸。其中，具有酰亚胺基团的5个或6个原子的含氮杂环化合物包括选自由乙琥胺、巴比妥酸、苯巴比妥、5,5-二乙基巴比妥酸、5-乙基-5-(1-甲基丁基)巴比妥酸、戊巴比通(pentobarbitone)、戊巴比妥(pentobarbital)、耐波他(Nembutal)、5-乙基-5-(1-甲基丙基)巴比妥酸、正丁巴比妥、仲丁巴比妥(butisol)、5-烯丙基-5-(1-甲基丁基)-巴比妥酸、司可巴比妥、速可眠、苯妥英、乙内酰脲、及其混合物组成的组的具有酰亚胺基团的5个或6个原子的含氮杂环化合物；其中，优选地，具有酰亚胺基团的5个或6个原子的含氮杂环化合物为乙琥胺。其中脱氧核糖核酸酶包括选自由DNase、rh-链道酶α(rh-dornase alfa)、牛胰腺DNase I、DNase II、原核DNase II或真核DNase II、DNase IIα、DNase IIβ、猪脾DNase II、及其混合物组成的组中的脱氧核糖核酸酶；其中，优选地，脱氧核糖核酸酶为重组人链道酶-α。其中羧酸包括选自由柠檬酸、乳酸、乙酸、甲酸、苹果酸、酒石酸、水杨酸、草酸、苯甲酸、丙酸、及其混合物组成的组中的羧酸；其中，优选地，羧酸为乳酸。
在本发明的另一实施方案中，所述药物组合物进一步包含一种或多种选自由聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯60、脱水山梨糖醇三硬脂酸酯、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、辛苯醇醚-9、壬苯醇醚-9、及其混合物组成的组中的表面活性剂；其中，优选地，表面活性剂为聚山梨醇酯80。
在本发明的另一实施方案中，所述药物组合物进一步包含一种或多种选自由乙二醇四乙酸、乙二胺四乙酸、二巯基琥珀酸、2,3-二巯基-l-丙磺酸、硫辛酸(l,2-二硫醇-3-戊酸)、草酸、及其混合物组成的组中的形成络合物的酸；其中，优选地，形成络合物的酸为乙二胺四乙酸。
在本发明的另一实施方案中，所述药物组合物进一步包含一种或多种选自由尿酸、抗坏血酸、硫辛酸、及其混合物组成的组中的亲水性还原酸；其中，优选地，亲水性还原酸为抗坏血酸。
在本发明的另一实施方案中，所述药物组合物进一步包含一种或多种选自由纤维素、纳米晶纤维素、细菌纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、微晶纤维素、羧甲基纤维素、卡波姆、及其混合物组成的组中的胶凝剂；其中，优选地，胶凝剂为羟乙基纤维素。
在本发明的另一实施方案中，所述药物组合物进一步包含选自由以下组成的组中的溶液：乙酸0.2M/乙酸钠0.2M：比率2.78％至0.66％(v/v)pH＝4.2至4.8；乙酸0.10M/乙酸钠0.01M：比率1.05％至10.05％(v/v)pH＝5.6；磷酸二氢钾0.05M pH＝4.5；磷酸二氢钾0.36M/磷酸二钠0.07M：比率4.92％至0.98％(p/v)pH＝5.7；磷酸二氢钾0.36M/磷酸二钠0.10M：比率4.92％至1.49％(p/v)pH＝6.0；柠檬酸0.31M/磷酸二钠0.20M：比率2.99％至1.42％(p/v)pH＝5.8；柠檬酸0.10M/柠檬酸钠0.03M：比率1.92％至0.77％(p/v)pH＝5.8；索伦森磷酸盐缓冲液(Sorensen's phosphate buffer)：磷酸二氢钠0.2M/磷酸二钠2.3M：比率1.2％至16.33％(p/v)pH＝5.8；汉克平衡盐溶液(Hank’s balanced salt solution，HBSS)：氯化钠0.14M(0.800％)、氯化钾5mM(0.040％)、氯化钙1mM(0.014％)、七水硫酸镁0.4mM(0.010％)、六水氯化镁0.5mM(0.010％)、磷酸二钠二水合物0.3mM(0.006％)、磷酸二氢钾0.4mM(0.006％)、葡萄糖6mM(0.100％)、碳酸氢钠4mM(0.035％)：pH＝5.7；4-(2-羟乙基)-l-哌嗪乙磺酸(HEPES)1M(pH＝6.5)；2-(N-吗啉代)乙磺酸钠盐、4-吗啉乙磺酸(MES钠盐)0.5M(pH 5.5-6.7)；N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸钠盐(BES)0.5M(pH＝6.0)；N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(ACES)0.5M(pH＝6.0)；2,2’-[(2-氨基-2-氧代乙基)亚氨基]二乙酸(ADA)0.2M(pH＝6.0)；哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸)(PIPES)0.5M(pH＝6.0-6.8)；3-吗啉代-2-羟基丙磺酸(MOPSO)0.2M(pH＝6.0)；盐水溶液(0.9％)/MgCL2(5mM)，pH5.5；1MNaHCO3溶液、及其组合。
在本发明的另一实施方案中，所述药物组合物的pH在约4.5和约6.8之间。
在本发明的另一实施方案中，所述药物组合物包含约0.5至约50mg/ml的一种或多种具有酰亚胺基团的5个或6个原子的含氮杂环化合物；优选约0.5至约30mg/ml；更优选约0.5至约3mg/ml。
在本发明的另一实施方案中，所述药物组合物包含约0.5至约4000μg/ml的一种或多种脱氧核糖核酸酶；更优选约1至约1000μg/ml；更优选约1至约4μg/ml，更优选约0.97至约3.9μg/ml。
在本发明的另一实施方案中，所述药物组合物包含约1至约15mg/ml的一种或多种羧酸，更优选约1至约9mg/ml，更优选约1.6至约9mg/ml。
在本发明的另一实施方案中，所述药物组合物包含约5mg/ml以下的一种或多种表面活性剂，更优选约3mg/ml以下。
在本发明的另一实施方案中，所述药物组合物包含约1mg/ml以下的一种或多种形成络合物的酸，更优选约0.75mg/ml以下。
在本发明的另一实施方案中，所述药物组合物包含约3mg/ml以下的一种或多种亲水性还原酸，更优选约2.5mg/ml以下。
在本发明的另一实施方案中，所述药物组合物包含约25mg/ml以下的一种或多种胶凝剂，更优选约17mg/ml以下。
在本发明的特别优选的实施方案中，药物组合物在溶液中包含乙琥胺、重组人链道酶-α和乳酸。
在本发明的特别优选的实施方案中，药物组合物包含乙琥胺、重组人链道酶-α、乳酸、亲水性还原酸、聚山梨醇酯80、抗坏血酸、乙二胺四乙酸、羟乙基纤维素、以及pH为5.5的包含0.9％盐水溶液和5mM MgCl2的溶液。
在本发明的特别优选的实施方案中，药物组合物包含以下物质的水溶液：约0.5至约30mg/ml的乙琥胺；约1至约4μg/ml的重组人链道酶-α；约1至约9mg/ml的乳酸；约2.5mg/ml以下的抗坏血酸；约3mg/ml以下的聚山梨醇酯-80；约0.75mg/ml以下的乙二胺四乙酸；约17mg/ml以下的羟乙基纤维素。
在本发明的特别优选的实施方案中，药物组合物包含以下物质的水溶液：约0.5至约3mg/ml的乙琥胺；约0.97至约3.9μg/ml的重组人链道酶-α；约1.6至约8.7mg/ml的乳酸；约2.5mg/ml以下的抗坏血酸；约3mg/ml以下的聚山梨醇酯-80；约0.75mg/ml以下的乙二胺四乙酸；约17mg/ml以下的羟乙基纤维素。
在本发明的特别优选的实施方案中，用于局部伤口治疗的药物制剂试剂盒包括在使用前混合以获得本发明的组合物的第一组合物和第二组合物，其中：第一组合物为固体并且包含脱氧核糖核酸酶和胶凝剂粉末；并且第二组合物为包含至少一种具有酰亚胺基团的5个或6个原子的含氮杂环化合物和至少一种羧酸的水性液体；并且第二组合物的pH在4.5和6.8之间。
在本发明的特别优选的实施方案中，用于局部伤口治疗的药物制剂试剂盒包括在使用前混合的第一组合物、第二组合物和第三组合物，其中：第一组合物为固体并且包含胶凝剂粉末；第二组合物为固体并且包含脱氧核糖核酸酶；并且第三组合物为包含至少一种具有酰亚胺基团的5个或6个原子的含氮杂环化合物和至少一种羧酸的水性液体；并且第三组合物的pH在4.5和6.8之间。
在本发明的另一实施方案中，药物制剂试剂盒包含第一组合物、第二组合物和第三组合物，各自容纳在密封且独立的容器中。
本发明的另一目的为用于制备所述药物制剂的方法，其包括如下步骤：
a.使第一组合物与第二组合物接触；
b.混合并且振摇，获得凝胶药物组合物。
本发明的另一目的为用于从包含在使用前混合的第一组合物、第二组合物和第三组合物的本发明的药物制剂来制备本发明的组合物的方法，其中第一组合物为固体并且包含胶凝剂粉末；第二组合物为固体并且包含脱氧核糖核酸酶；并且第三组合物为包含至少一种具有酰亚胺基团的5个或6个原子的含氮杂环化合物和至少一种羧酸的水性液体；并且第三组合物的pH在4.5和6.8之间，所述方法包括：
a.使第三组合物与第二组合物接触；
b.将第三组合物与第二组合物混合并且振摇；
c.使第一组合物与在步骤b中获得的混合物接触；
d.混合并且振摇，获得凝胶药物组合物。
本发明的另一目的为用于治疗哺乳动物的伤口的方法，其包括每天至少一次将本发明的药物组合物施用于伤口。
在本发明的另一实施方案中，所述伤口为选自由糖尿病足部溃疡、静脉性溃疡、动脉性溃疡、压疮、特征在于被形成生物膜的细菌重复感染的机械性伤口、特征在于被形成生物膜的细菌重复感染的术后伤口、及其组合组成的组中的伤口。
本发明的另一实施方案为包括本发明的药物制剂的装置，其包括：
包含第一组合物的第一容器、和
包含第二组合物的第二容器，
其中第一容器和第二容器由能够保持第一组合物与第二组合物隔离的可塌缩膜隔开。
本发明的另一实施方案为包括本发明的药物制剂的装置，其包括：
包含第一组合物的第一容器、
包含第二组合物的第二容器、和
包含第三组合物的第三容器，
其中：
第一容器和第二容器由能够保持第一组合物与第二组合物隔离的第一可塌缩膜隔开；并且
第二容器和第三容器由能够保持第二组合物与第三组合物隔离的第二可塌缩膜隔开。
本发明的另一实施方案为用于生产本发明的药物组合物的方法，其包括以下步骤：
a.在溶液中混合具有酰亚胺基团的5个或6个原子的含氮杂环化合物、脱氧核糖核酸酶和羧酸，由此形成混合物；
b.向混合物中滴加碱性溶液直至混合物的pH在4.50和6.50之间，由此形成pH经调节的混合物；和
c.将pH经调节的混合物灭菌。
其中进一步包括以下步骤：
d.添加胶凝剂。
其中进一步包括以下步骤：
e.添加形成络合物的酸、表面活性剂和亲水性还原酸。
具体实施方式
本发明提供实现多种技术效果、主要是治疗效果的用于局部治疗伤口的药物组合物、制剂和试剂盒。
可能用本发明来治疗的伤口为常规愈合治疗难治性慢性溃疡，例如静脉性溃疡、动脉性溃疡、压疮(褥疮)、糖尿病足部溃疡、以及由于被形成生物膜的细菌重复感染而慢性化的机械性伤口或术后伤口。
如本文中所使用的术语“具有酰亚胺基团的5个或6个原子的含氮杂环化合物”是指任何药学上可接受的化合物，其具有化学5原子环或6原子环，其中，这些原子中的至少一个为“N”并且为酰亚胺基团的一部分。酰亚胺基团为-CO-NH-CO-。本公开的一些实施方案的具有酰亚胺基团的5个或6个原子的含氮杂环化合物的实例为乙琥胺、巴比妥酸、苯巴比妥、5,5-二乙基巴比妥酸(巴比妥或佛罗拿(veronal))、5-乙基-5-(1-甲基丁基)巴比妥酸(戊巴比通(Pentobarbitone)、戊巴比妥(Pentobarbital)或耐波他(Nembutal))、5-乙基-5-(1-甲基丙基)巴比妥酸(仲丁巴比妥(Butabarbital)、仲丁巴比妥(butisol))、5-烯丙基-5-(1-甲基丁基)-巴比妥酸(司可巴比妥或速可眠)、苯妥英、乙内酰脲、及其组合，而没有限制。乙琥胺已用于本发明的实施例，但是以上列出的任何药学上可接受的具有酰亚胺基团的5个或6个原子的含氮杂环化合物可以是等同的。
如本文中所使用的术语“羧酸”是指任何药学上可接受的羧酸。本公开的一些实施方案的羧酸的实例为柠檬酸、乳酸、乙酸、甲酸、苹果酸、酒石酸、水杨酸、草酸、苯甲酸、丙酸及其组合，而没有限制。乳酸已用于本发明的实施例，但是以上列出的任何药学上可接受的羧酸可以是等同的。
如本文中所使用的术语“脱氧核糖核酸酶”是指任何药学上可接受的活性pH在4.5和6.5之间的脱氧核糖核酸酶。本公开的一些实施方案的脱氧核糖核酸酶的实例为任何来源的DNase I：原核或真核，例如，重组人DNase或rh-链道酶α以及牛胰腺DNase I；任何来源的DNase II：原核或真核，例如，DNase IIα、DNase IIβ和猪脾DNase II、及其组合，而没有限制。rh-链道酶α已用于本发明的实施例，但是以上列出的任何药学上可接受的脱氧核糖核酸酶可以是等同的。
如本文中所使用的术语“亲水性还原酸”是指任何药学上可接受的亲水性还原酸。本公开的一些实施方案的亲水性还原酸的实例为尿酸、抗坏血酸、硫辛酸及其组合，而没有限制。抗坏血酸已用于本发明的实施例，但是以上列出的任何药学上可接受的亲水性还原酸可以是等同的。
如本文中所使用的术语“形成络合物的酸”是指任何药学上可接受的形成络合物的酸。本公开的一些实施方案的形成络合物的酸的实例为乙二醇四乙酸(EGTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二巯基琥珀酸(DMSA)、2,3-二巯基-l-丙磺酸(DMPS)、硫辛酸(l,2-二硫醇-3-戊酸)、草酸及其组合，而没有限制。EDTA已用于本发明的实施例，但是以上列出的任何药学上可接受的形成络合物的酸可以是等同的。
如本文中所使用的术语“表面活性剂”是指任何药学上可接受的表面活性剂。本公开的一些实施方案的表面活性剂的实例为聚山梨醇酯20，聚山梨醇酯80，聚山梨醇酯60，脱水山梨糖醇三硬脂酸酯，脱水山梨糖醇单硬脂酸酯，辛苯醇醚-9，壬苯醇醚-9，乙氧基化蓖麻油(40摩尔环氧乙烷)，7至10摩尔的乙氧基化月桂醇，克列莫佛(Cremophor)，Kolliphor，Lipocol oxo 650，Solutol HS 15，Emulgin B1 PH，Lanette 20PH，聚山梨醇酯，聚山梨醇酯20，聚山梨醇酯60，聚山梨醇酯80，源自辛醇、癸醇、月桂醇、异十三烷醇、肉豆蔻醇、乙醇、棕榈油醇、硬脂醇、油醇、反油醇(elaidyl)、岩芹醇(petroselinyl)、亚油醇、亚麻醇、桐醇、二十烷醇、花生醇、二十碳烯醇(gadoleyl)、山嵛醇、瓢儿菜醇、二十二碳烯醇(brassidyl)的乙氧基化脂肪醇(6至30摩尔环氧乙烷)，及其组合，而没有限制。聚山梨醇酯80已用于本发明的实施例，但是以上列出的任何药学上可接受的表面活性剂可以是等同的。
如本文中所使用的术语“胶凝剂”是指在溶解于液相中作为胶体混合物时形成弱凝聚的内部结构的任何药学上可接受的凝胶形成剂。本公开的一些实施方案的胶凝剂的实例为纤维素、纳米晶纤维素、细菌纤维素、羟丙基纤维素、微晶纤维素、卡波姆、纤维素衍生物、乙基纤维素、羟乙基纤维素、瓜尔豆胶、阿拉伯树胶、羟乙基甲基纤维素、羟乙基丙基纤维素、羧甲基纤维素、黄原胶、壳聚糖、海藻酸盐、明胶、羟基乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠(sodium corscarmelosa)、海藻酸、果胶、及其组合，而没有限制。羟乙基纤维素已用于本发明的实施例，但是以上列出的任何药学上可接受的胶凝剂可以是等同的。
本发明为在溶液中包含至少三种组分的用于局部伤口治疗的药物组合物。所述组分的浓度以mg/ml计，意指mg组分/ml所述溶液，并且以％w/v计意指％组分的重量/所述溶液的体积。
如本文中模糊使用的术语“溶液”或“MS”或“混合溶剂”是指任何药学上可接受的水性溶剂。本公开的一些实施方案的药学上可接受的水性溶剂的实例为：乙酸0.2M/乙酸钠0.2M：比率2.78％至0.66％(v/v)pH＝4.2至4.8；乙酸0.10M/乙酸钠0.01M：比率1.05％至10.05％(v/v)pH＝5.6；磷酸二氢钾0.05M pH＝4.5；磷酸二氢钾0.36M/磷酸二钠0.07M：比率4.92％至0.98％(p/v)pH＝5.7；磷酸二氢钾0.36M/磷酸二钠0.10M：比率4.92％至1.49％(p/v)pH＝6.0；柠檬酸0.31M/磷酸二钠0.20M：比率2.99％至1.42％(p/v)pH＝5.8；柠檬酸0.10M/柠檬酸钠0.03M：比率1.92％至0.77％(p/v)pH＝5.8；索伦森磷酸盐缓冲液：磷酸二氢钠0.2M/磷酸二钠2.3M：比率1.2％至16.33％(p/v)pH＝5.8；汉克平衡盐溶液(HBSS)：氯化钠0.14M(0.800％)、氯化钾5mM(0.040％)、氯化钙1mM(0.014％)、七水硫酸镁0.4mM(0.010％)、六水氯化镁0.5mM(0.010％)、磷酸二钠二水合物0.3mM(0.006％)、磷酸二氢钾0.4mM(0.006％)、葡萄糖6mM(0.100％)、碳酸氢钠4mM(0.035％)：pH＝5.7；4-(2-羟乙基)-l-哌嗪乙磺酸(HEPES)1M(pH＝6.5)；2-(N-吗啉代)乙磺酸钠盐、4-吗啉乙磺酸(MES钠盐)0.5M(pH 5.5-6.7)；N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸钠盐(BES)0.5M(pH＝6.0)；N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(ACES)0.5M(pH＝6.0)；2,2’-[(2-氨基-2-氧代乙基)亚氨基]二乙酸(ADA)0.2M(pH＝6.0)；哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸)(PIPES)0.5M(pH＝6.0-6.8)；3-吗啉代-2-羟基丙磺酸(MOPSO)0.2M(pH＝6.0)；盐水溶液(0.9％)/MgCl2(5mM)，pH 5.5；1M NaHCO3溶液、及其组合，而没有限制。pH 5.5的盐水溶液(0.9％)/MgCl2(5mM)已用于本发明的实施例，但是以上列出的任何药学上可接受的溶液或MS可以是等同的。用于本发明的实施例的溶液为混合溶剂(MS)，其为pH 5.5的盐水溶液(0.9％)和5mM MgCl2。
本发明的组合物是杀菌剂，但是可以与选自由以下组成的组中的药学上可接受的防腐剂一起配制：苯甲醇、苯甲酸、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、苯扎氯铵、氯甲酚、硝酸苯汞、氯丁醇、脱氢乙酸钠、硫柳汞、苯甲酸钠、山梨酸、及其组合。
本发明的组合物可以与选自由以下组成的组中的药学上可接受的麻醉剂一起配制：利多卡因、普莫卡因(pramoxine)、苯佐卡因、及其组合。
在由本发明实现的技术效果中，可以详述如下：
抑菌和杀菌效果：市场上现有的产品仅具有缩减的活性谱(spectrum ofactivity)，而本发明的组合物能够清除99％的从慢性伤口分离的浮游菌株。该效果无法由任何现有技术产品实现，因此，目前必须使用超过一种的产品。
细菌生物膜形成的抑制效果：现有的抑制剂产品一次仅抑制一种细菌菌株，而本发明的组合物抑制99％的从慢性伤口分离的菌株的生物膜的形成。
预先形成的细菌生物膜的破坏效果：市场上的细菌生物膜破坏产品一次仅造成单一物种的生物膜的破坏，而本发明的组合物造成95％的慢性伤口最多分离出的菌株的生物膜破坏，包括混合生物膜(由超过一种的物种在体内形成)，市场上没有针对混合生物膜的产品。
清创效果：本发明的组合物从伤口表面去除纤维蛋白/生物膜/坏死组织层。
伤口扩大的抑制效果：该效果通过由本发明的组合物引起的对MMP和自由基的抑制来实现。该效果还通过吸收渗出液的药物形式来实现。市场上没有用于该目的的产品。
氧合效果：本发明的氧合能力通过诱导刺激血管生成的血管内皮生长因子(VEGF)的表达来实现。需氧病原菌群的清除也使伤口中的pO2增加。
胶原化效果：本发明刺激胶原蛋白在溃疡床中的形成和沉积。
与现有技术相比，本发明的组合物表现出延长的稳定性，这是因为已证实其至少6个月有活性。
用于容纳本发明的制剂的装置是本发明的另一目的。在一个实施方案中，所述装置包括三个容器：储存第一组合物的第一容器、储存第二组合物的第二容器和储存第三组合物的第三容器。其中第一组合物为固体并且包含胶凝剂粉末，第二组合物为固体并且包含脱氧核糖核酸酶，并且第三组合物为包含至少一种具有酰亚胺基团的5个或6个原子的含氮杂环化合物和至少一种羧酸的水溶液；并且第三组合物的pH在4.5和6.8之间。第三组合物可以进一步包含一种或多种亲水性还原酸、一种或多种表面活性剂、一种或多种形成络合物的酸。
本发明的一个实施方案提供三个容器的装置，其中第一容器和第二容器由能够保持第一组合物与第二组合物隔离的第一可塌缩膜隔开，并且第二容器和第三容器由能够保持第二组合物与第三组合物隔离的第二可塌缩膜隔开。
如本文中所使用的术语“可塌缩膜”是指任何可塌缩、可破裂(breakable)、易破碎(frangible)、可撕裂或可移除的由刚性或柔性材料制成的膜(membrane)或膜(film)，以将所述容器隔开。例如，这些可塌缩膜由本领域已知的任何材料例如聚合物、铝、硅制成。当分隔相邻容器的可塌缩膜破裂时，所述容器中的组合物接触。
如本文中所使用的术语“容器”是指任何容纳与周围环境和其它组合物隔离的组合物的容器。该容器可以与另一容器共用一个可塌缩膜，当该膜破裂时，这些容器中容纳的所述组合物接触。本发明的容器可以为独立且分离的容器，或者可以为具有彼此之间共用可塌缩膜的两个或三个容器的单一装置的一部分，如图1中所示。
本发明的装置为药筒(cartridge)或分配器。
一个实施方案提供具有喷嘴的分配器装置，其可以包括可移除的盖子。
示例性装置在图1中示出。该多隔室装置为刚性材料的圆柱形药筒。可用于制成本文中公开的该装置的材料包括高阻隔聚丙烯、铝、玻璃等，用于防止水分和氧暴露。两个可塌缩膜将该示例性装置分成三个容器。可以通过压力或者使用本领域已知的任何破坏膜的系统来使该可塌缩膜破裂。
本发明的另一目的为在用于伤口治疗之前原位制备本发明的药物组合物的方法。该方法包括以下步骤：
a.使第三组合物与第二组合物接触，使第二可塌缩膜破裂；
b.将第三组合物与第二组合物混合并且振摇；
c.使第一组合物与在步骤b中获得的混合物接触，使第一可塌缩膜破裂；
d.混合并且振摇，获得本发明的凝胶药物组合物。
在步骤a中，完美的混合是可行的：第二容器中的第二组合物的酶在与第三容器的第三液体水性组合物一起振摇时分布在所有体积中。在步骤c中，将来自步骤a的该混合物与第一容器中的第一组合物的胶凝剂组合，并且振摇以获得本发明的均质凝胶组合物。
一个实施方案提供用于容纳本发明的制剂的装置。所述装置包括两个容器：储存第一组合物的第一容器和储存第二组合物的第二容器。其中，第一组合物为固体并且包含胶凝剂粉末和脱氧核糖核酸酶，并且第二组合物为包含至少一种具有酰亚胺基团的5个或6个原子的含氮杂环化合物和至少一种羧酸的水溶液；并且第三组合物的pH在4.5和6.8之间。第三组合物可以进一步包含一种或多种亲水性还原酸、一种或多种表面活性剂、一种或多种形成络合物的酸。
在应用之前原位制备的本发明的制剂会呈现与所使用的酶相似的有效期。
具有两个或三个容器的本发明的装置中容纳的本发明的制剂的随时间推移的稳定性为约两年。该稳定性为所使用的酶的稳定性，这是因为其以冻干粉末的形式存在于隔离的容器或隔室中，而不与溶液接触。因此，与现有技术相比，本发明的装置中的本发明的制剂呈现延长的稳定性。并且当制备制剂时，使第一组合物与第二组合物和第三组合物(当装置具有3个容器时)接触并且振摇以将所有组合物混合，制备的凝胶呈现约6个月以上的稳定性。
实施例
实施例1
组分溶液制备
制备本发明组合物的不同组分的溶液。
混合溶剂(MS)：盐水溶液(0.9％)/MgCl2(5mM)，pH 5.5
称量9.0000g氯化钠和1.0106g六水氯化镁(MgCl2·6H2O)并且将它们溶解于蒸馏水中来制备一升溶液。
碱性溶液：1M NaHCO3溶液。在容量瓶中，将8.4g碳酸氢钠溶解于蒸馏水中来制备100mL溶液。重要的是，在容量瓶中定容之前，在烧杯中用溶剂将碳酸氢钠完全溶解以避免过饱和。碱性溶液的最终pH约为：8.6
在混合溶剂中的乳酸溶液(LA)。将LA在上述混合溶剂中稀释，然后混合几分钟。使用碱性溶液达到最终pH＝5.5。制备的浓度为：LA 1.63mg/mL、LA 6.50mg/mL、LA 8.67mg/mL。
在混合溶剂中的聚山梨醇酯80溶液(PS80)。将PS80稀释，然后混合几分钟直至达到均质化。使用碱性溶液达到最终pH＝5.5。制备的浓度为：PS802.0mg/mL、PS80 3.0mg/mL
在混合溶剂中的EDTA溶液：将EDTA溶解于上述混合溶剂中，然后混合几分钟。使用碱性溶液达到最终pH＝5.5。制备的浓度为：EDTA 0.25mg/mL、EDTA 0.50mg/mL、EDTA0.75mg/mL
在混合溶剂中的抗坏血酸溶液(AA)。将AA溶解于上述溶剂混合物中，然后混合几分钟。使用碱性溶液达到最终pH＝5.50。制备的浓度为：AA 0.5mg/ml、AA 1.0mg/ml、AA2.50mg/mL。
在混合溶剂中的乙琥胺溶液(Etho)。将Etho溶解于混合溶剂中，然后混合几分钟。使用碱性溶液达到最终pH＝5.5。制备的浓度为：Etho 0.50mg/mL、Etho 3.00mg/mL、Etho30.00mg/ml。
在混合溶剂中的rh-链道酶α溶液(Dl)。将D1溶解于混合物溶剂中，然后混合几分钟。使用碱性溶液达到最终pH＝5.5。制备的浓度为：Dl 250μg/ml、Dl 125μg/ml、Dl 62.5μg/ml、Dl 31.2μg/ml、Dl 15.6μg/mL、Dl 7.8μg/ml、Dl 3.9μg/mL、Dl 1.9μg/ml、Dl 0.97μg/mL、Dl 0.5μg/ml。
24小时的植物乳杆菌上清液(LAPS 24h)对照：植物乳杆菌ATCC 10241在de ManRogosa Sharpe(MRS)(Britania.Argentina)中、在37℃下生长12小时。通过以8000rpm离心15min并且用0.22μm的微孔过滤器过滤来获得上清液(LAPS)。然后将制剂在2-8℃下储存24小时。为了获得凝胶药物形式，添加1.7％的羟乙基纤维素。
6个月的植物乳杆菌上清液(LAPS 6m)对照：在使用之前，将LAPS 24h的制剂在2-8℃下储存6个月。
实施例2
本发明的组合物。在实验室中制备混合物No.0(M0)。本发明的组合物由以下物质构成：
a.6.50mg/ml的乳酸(纯度为85％-90％)
b.3.00mg/ml的乙琥胺
c.DNase(rh-链道酶α)0.97μg/ml
溶液：配制混合物(a+b+c)
在50mL混合溶剂中，添加150mg乙琥胺、318μl乳酸和50μg rh-链道酶α酶。
制备方式
1.用分析天平Radwag AS 220R2(Radwag LLC，Radom，Poland)在表面皿上称量150mg乙琥胺。
2.借助混合溶剂，将该物质在玻璃烧杯上洗脱，以免在表面皿中留下任何颗粒。
3.在将50mL溶剂混合物的剩余部分添加至烧杯中之后，将制剂置于NUMAK GL-3250A磁力搅拌器(Numak Technology LLC，Dubai，UAE)上5min直至固体颗粒部分溶解。
4.接下来，将318μl乳酸添加至制剂中。
5.一旦添加这些物质，将混合物再搅拌5分钟。
6.使溶液的最终pH达到5.5，将50mL溶液置于100mL烧杯中并且将预先校准的Lutron PH-206pH计电极(Lutron Electronics Co.Inc.，Pennsylvania，USA)浸入其中。
7.将组件置于低转速的搅拌器上，并且滴加碱性溶液直至达到pH 5.5，注意由其聚集体产生的泡腾。
8.将制剂在高压釜Arcano LS-B75L中、在120℃下、在1atm超压下灭菌10min。
9.在灭菌过程完成之后，将50mL制剂置于锥形管中，并且在无菌条件下添加50μgrh-链道酶α酶(Roche，Basel，Switzerland)，以达到最终浓度为0.97μg/ml。该步骤在生物安全柜中进行。
10.将管密封并且在涡旋机中混合1分钟。
11.使用铝箔将制剂与光隔离，然后在4℃-25℃下储存。
实施例3
本发明的组合物。在实验室中制备混合物No.13(M13)。
本发明的组合物包含：
a.3.00mg/ml的聚山梨醇酯80
b.1.00mg/ml的抗坏血酸
c.6.50mg/ml的乳酸(纯度85％-90％)
d.0.50mg/ml的EDTA
e.3.00mg/ml的乙琥胺
f.0.97μg/ml的DNase
溶液：配制混合物(a+b+c+d+e+f)
在50mL混合溶剂中添加：50mg抗坏血酸、25mg EDTA、150mg乙琥胺、50μg rh-链道酶α、141μl聚山梨醇酯80和318μl乳酸。
制备方式：
1.用分析天平Radwag AS 220R2(Radwag LLC，Radom，Poland)在表面皿上称量50mg抗坏血酸和25mg EDTA。
2.借助混合溶剂，将该物质在玻璃烧杯上洗脱，以免在表面皿中留下任何颗粒。
3.在将50mL溶剂混合物的剩余部分添加至烧杯中之后，将制剂置于NUMAK GL-3250A磁力搅拌器(Numak Technology LLC，Dubai，UAE)上5min直至固体颗粒部分地溶解。在搅拌期间，用200μl吸头通过释放其尖端添加141μl聚山梨醇酯80。
4.接下来，将318μl乳酸添加至制剂中。
5.添加150mg乙琥胺。
6.一旦添加这些物质，将混合物再搅拌5分钟。
7.使所述混合物的最终pH达到5.5，将50mL混合物置于100mL烧杯中并且将预先校准的Lutron PH-206pH计电极(Lutron Electronics Co.Inc.，Pennsylvania，USA)浸入其中。
8.将步骤7的混合物置于低转速的搅拌器上，并且滴加碱性溶液直至达到pH 5.5，注意由其聚集体产生的泡腾。
9.将步骤8的混合物在高压釜Arcano LS-B75L中、在120℃下、在1atm超压下灭菌10min。
10.在灭菌过程完成之后，将50mL混合物置于50mL锥形管中，并且在无菌条件下添加50μg rh-链道酶α酶(Roche，Basel，Switzerland)，以达到最终浓度为0.97μg/ml。该步骤在生物安全柜中进行。
11.将管密封并且在涡旋机中混合1分钟。
12.使用铝箔将步骤11的本发明的组合物与光隔离然后在4℃-25℃下储存。
实施例4
本发明的组合物。在实验室中制备混合物No.15(M15)。本发明的组合物包含：
a.2.00mg/ml的聚山梨醇酯80
b.0.50mg/ml的抗坏血酸
c.1.63mg/ml的乳酸(纯度85％-90％)
d.0.25mg/ml的EDTA
e.0.50mg/ml的乙琥胺
f.3.90μg/ml的DNase
配制混合物(a+b+c+d+e+f)
在50mL混合物溶剂中添加：25.00mg抗坏血酸、12.50mg EDTA、25mg乙琥胺、200μgrh-链道酶α、94μl聚山梨醇酯80和80μl乳酸。
制备方式：
1.用分析天平Radwag AS 220R2(Radwag LLC，Radom，Poland)在表面皿上称量25mg抗坏血酸和12.50mg EDTA。
2.借助混合溶剂，将该物质在玻璃烧杯上洗脱，以免在表面皿中留下任何颗粒。
3.在将50mL溶剂混合物的剩余部分添加至烧杯中之后，将制剂置于NUMAK GL-3250A磁力搅拌器(Numak Technology LLC，Dubai，UAE)上5min直至固体颗粒部分地溶解。
在搅拌期间，用200μl吸头通过释放其尖端添加94μl聚山梨醇酯80。
4.接下来，将80μl乳酸添加至制剂中。
5.添加25mg乙琥胺。
6.一旦添加这些物质，将混合物再搅拌5分钟。
7.使所述混合物的最终pH达到5.5，将50mL混合物置于100mL烧杯中并且将预先校准的Lutron PH-206pH计电极(Lutron Electronics Co.Inc.，Pennsylvania，USA)浸入其中。
8.将步骤7的混合物置于低转速的搅拌器上，并且滴加碱性溶液直至达到pH 5.5，注意由其聚集体产生的泡腾。
9.将制剂在高压釜Arcano LS-B75L中、在120℃下、在1atm超压下灭菌10min。
10.在灭菌过程完成之后，将50mL制剂溶液置于50mL锥形管中，并且在无菌条件下添加200μg rh-链道酶α酶(Roche，Basel，Switzerland)，以达到最终浓度为3.90μg/ml。该步骤在生物安全柜中进行。
11.将管密封并且在涡旋机中混合1分钟。
12.使用铝箔将步骤11的本发明的组合物与光隔离，然后在4℃-25℃下储存。
实施例5
本发明的组合物。在实验室中制备混合物No.16(M16)。本发明的组合物包含：
a.3.00mg/ml的聚山梨醇酯80
b.2.50mg/ml的抗坏血酸
c.8.67mg/ml的乳酸(纯度85％-90％)
d.0.75mg/ml的EDTA
e.30.00mg/ml的乙琥胺
f.3.90μg/ml的DNase
配制混合物(a+b+c+d+e+f)
在50mL混合溶剂中添加：125mg抗坏血酸、37.5mg EDTA、1500mg乙琥胺、200μg rh-链道酶α、141μl聚山梨醇酯80和424μl乳酸。
制备方式：
1.用分析天平Radwag AS 220R2(Radwag LLC，Radom，Poland)在表面皿上称量125mg抗坏血酸和37.5mg EDTA。
2.借助混合溶剂，将该物质在玻璃烧杯上洗脱，以免在表面皿中留下任何颗粒。
3.在将50mL溶剂混合物的剩余部分添加至烧杯中之后，将制剂置于NUMAK GL-3250A磁力搅拌器(Numak Technology LLC，Dubai，UAE)上5min直至固体颗粒部分地溶解。在搅拌期间，用200μl吸头通过释放其尖端添加141μl聚山梨醇酯80。
4.接下来，将424μl乳酸添加至制剂中。
5.添加1500mg乙琥胺。
6.一旦添加这些物质，将混合物再搅拌5分钟。
7.将Lutron PH-206pH计电极(Lutron Electronics Co.Inc.，Pennsylvania，USA)校准，以测量制剂的pH。
8.使溶液的最终pH达到5.5，将50mL溶液与pH计置于在低转速的搅拌器上的100mL烧杯中，并且滴加碱性溶液直至达到pH水平，注意由其聚集体产生的泡腾。
9.将制剂在高压釜Arcano LS-B75L中、在120℃下、在1atm超压下灭菌10min。
10.在灭菌过程完成之后，将50mL制剂溶液置于50mL锥形管中，并且在无菌条件下添加200μg rh-链道酶α酶(Roche，Basel，Switzerland)，以达到最终浓度为3.90μg/ml。该步骤在生物安全柜中进行。
11.将管密封并且在涡旋机中混合1分钟。
12.使用铝箔将步骤11的本发明的组合物与光隔离，然后在4℃-25℃下储存。
实施例6
本发明的组合物。在实验室中制备混合物No.0(M0)的凝胶制剂。
本发明的组合物由以下物质构成：
a.6.50mg/ml的乳酸(纯度85％-90％)
b.3.00mg/ml的乙琥胺
c.DNase 0.97μg/ml
d.17mg/ml的羟乙基纤维素
溶液：配制混合物(a+b+c)
在50mL混合溶剂中，添加150.0mg乙琥胺、318μl乳酸和50μg rh-链道酶α酶。
制备方式
1.用分析天平Radwag AS 220R2(Radwag LLC，Radom，Poland)在表面皿上称量150.0mg乙琥胺。
2.借助混合溶剂，将该物质在玻璃烧杯上洗脱，以免在表面皿中留下任何颗粒。
3.在将50mL溶剂混合物的剩余部分添加至烧杯中之后，将制剂置于NUMAK GL-3250A磁力搅拌器(Numak Technology LLC，Dubai，UAE)上5min直至固体颗粒部分地溶解。
4.接下来，将318μl乳酸添加至制剂中。
5.一旦添加这些物质，将混合物再搅拌5分钟。
6.使溶液的最终pH达到5.5，将50mL溶液置于100mL烧杯中并且将预先校准的Lutron PH-206pH计电极(Lutron Electronics Co.Inc.，Pennsylvania，USA)浸入其中。
7.将组件置于低转速的搅拌器上，并且滴加碱性溶液直至达到pH 5.5，注意由其聚集体产生的泡腾。
8.将制剂在高压釜Arcano LS-B75L中、在120℃下、在1atm超压下灭菌10min。
9.在灭菌过程完成之后，将50mL制剂置于锥形管中，并且在无菌条件下添加50μgrh-链道酶α酶(Roche，Basel，Switzerland)，以达到最终浓度为0.97μg/ml。该步骤在生物安全柜中进行。
10.将管密封并且在涡旋机中混合1分钟。
Gel：配制混合物(溶液+g)
11.将0.85g羟乙基纤维素添加至制备的混合物中。
12.轻轻地混合直至均质。
13.使用铝箔将制剂与光隔离，然后在4-25℃下储存，并且加盖。应当静置6至8小时直至气泡消失。
实施例7
本发明的组合物。在实验室中制备混合物No.13(M13)的凝胶制剂。
本发明的组合物包含：
a.3.00mg/ml的聚山梨醇酯80
b.1.00mg/ml的抗坏血酸
c.6.50mg/ml的乳酸(纯度85％-90％)
d.0.50mg/ml的EDTA
e.3.00mg/ml的乙琥胺
f.0.97μg/ml的DNase
g.17mg/ml的羟乙基纤维素
溶液：配制混合物(a+b+c+d+e+f)
在50mL混合溶剂中添加：50mg抗坏血酸、25mg EDTA、150mg乙琥胺、50μg rh-链道酶α、141μl聚山梨醇酯80和318μl乳酸。
制备方式：
1.用分析天平Radwag AS 220 R2(Radwag LLC，Radom，Poland)在表面皿上称量50mg抗坏血酸和25mg EDTA。
2.借助混合溶剂，将该物质在玻璃烧杯上洗脱，以免在表面皿中留下任何颗粒。
3.在将50mL溶剂混合物的剩余部分添加至烧杯中之后，将制剂置于NUMAK GL-3250A磁力搅拌器(Numak Technology LLC，Dubai，UAE)上5min直至固体颗粒部分地溶解。在搅拌期间，用200μl吸头通过释放其尖端添加141μl聚山梨醇酯80。
4.接下来，将318μl乳酸添加至制剂中。
5.添加150mg乙琥胺。
6.一旦添加这些物质，将混合物再搅拌5分钟。
7.使所述混合物的最终pH达到5.5，将50mL混合物置于100mL烧杯中并且将预先校准的Lutron PH-206pH计电极(Lutron Electronics Co.Inc.，Pennsylvania，USA)浸入其中。
8.将步骤7的混合物置于低转速的搅拌器上，并且滴加碱性溶液直至达到pH 5.5，注意由其聚集体产生的泡腾。
9.将步骤8的混合物在高压釜Arcano LS-B75L中、在120℃下、在1atm超压下灭菌10min。
10.在灭菌过程完成之后，将50mL混合物置于50mL锥形管中，并且在无菌条件下添加50μg rh-链道酶α酶(Roche，Basel，Switzerland)，以达到最终浓度为0.97μg/ml。该步骤在生物安全柜中进行。
11.将管密封并且在涡旋机中混合1分钟。
获得凝胶：配制混合物(溶液+g)
12.将0.85g羟乙基纤维素添加至制备的混合物中。
13.轻轻混合直至均质。
14.使用铝箔将制剂与光隔离，然后在4-25℃下储存，并且加盖。应当静置6至8小时直至气泡消失。
实施例8
本发明的组合物。在实验室中制备混合物No.15(M15)的凝胶制剂。
本发明的组合物包含：
a.2.00mg/ml的聚山梨醇酯80
b.0.50mg/ml的抗坏血酸
c.1.63mg/ml的乳酸(纯度85％-90％)
d.0.25mg/ml的EDTA
e.0.50mg/ml的乙琥胺
f.3.90μg/ml的DNase
g.17mg/ml的羟乙基纤维素
配制混合物(a+b+c+d+e+f)
在50mL混合物溶剂中添加：25.00mg抗坏血酸、12.50mg EDTA、25mg乙琥胺、200μgrh-链道酶α、94μl聚山梨醇酯80和80μl乳酸。
制备方式：
1.用分析天平Radwag AS 220R2(Radwag LLC，Radom，Poland)在表面皿上称量25mg抗坏血酸和12.5mg EDTA。
2.借助混合溶剂，将该物质在玻璃烧杯上洗脱，以免在表面皿中留下任何颗粒。
3.在将50mL溶剂混合物的剩余部分添加至烧杯中之后，将制剂置于NUMAK GL-3250A磁力搅拌器(Numak Technology LLC，Dubai，UAE)上5min直至固体颗粒部分地溶解。
在搅拌期间，用200μl吸头通过释放其尖端添加94μl聚山梨醇酯80。
4.接下来，将80μl乳酸添加至制剂中。
5.添加25mg乙琥胺。
6.一旦添加这些物质，将混合物再搅拌5分钟。
7.使所述混合物的最终pH达到5.5，将50mL混合物置于100mL烧杯中并且将预先校准的Lutron PH-206pH计电极(Lutron Electronics Co.Inc.，Pennsylvania，USA)浸入其中。
8.将步骤7的混合物置于低转速的搅拌器上，并且滴加碱性溶液直至达到pH 5.5，注意由其聚集体产生的泡腾。
9.将制剂在高压釜Arcano LS-B75L中、在120℃下、在1atm超压下灭菌10min。
10.在灭菌过程完成之后，将50mL制剂溶液置于50mL锥形管中，并且在无菌条件下添加200μg rh-链道酶α酶(Roche，Basel，Switzerland)，以达到最终浓度为3.90μg/ml。该步骤在生物安全柜中进行。
11.将管密封并且在涡旋机中混合1分钟。
获得凝胶：配制混合物(溶液+g)
12.将0.85g羟乙基纤维素添加至制备的混合物中。
13.轻轻混合直至均质。
14.使用铝箔将制剂与光隔离，然后在4-25℃下储存，并且加盖。应当静置6至8小时直至气泡消失。
实施例9
本发明的组合物。在实验室中制备混合物No.16(M16)的凝胶制剂。
本发明的组合物包含：
a.3.00mg/ml的聚山梨醇酯80
b.2.50mg/ml的抗坏血酸
c.8.67mg/ml的乳酸(纯度85％-90％)
d.0.75mg/ml的EDTA
e.30.00mg/ml的乙琥胺
f.3.90μg/ml的DNase
g.17mg/ml的羟乙基纤维素
配制混合物(a+b+c+d+e+f)
在50mL混合溶剂中添加：125mg抗坏血酸、37.5mg EDTA、1500mg乙琥胺、200μg rh-链道酶α、141μl聚山梨醇酯80和424μl乳酸。
制备方式：
1.用分析天平Radwag AS 220 R2(Radwag LLC，Radom，Poland)在表面皿上称量125mg抗坏血酸和37.5mg EDTA。
2.借助混合溶剂，将该物质在玻璃烧杯上洗脱，以免在表面皿中留下任何颗粒。
3.在将50mL溶剂混合物的剩余部分添加至烧杯中之后，将制剂置于NUMAK GL-3250A磁力搅拌器(Numak Technology LLC，Dubai，UAE)上5min直至固体颗粒部分地溶解。在搅拌期间，用200μl吸头通过释放其尖端添加141μl聚山梨醇酯80。
4.接下来，将424μl乳酸添加至制剂中。
5.添加1500mg乙琥胺。
6.一旦添加这些物质，将混合物再搅拌5分钟。
7.将Lutron PH-206pH计电极(Lutron Electronics Co.Inc.，Pennsylvania，USA)校准，以测量制剂的pH。
8.使溶液的最终pH达到5.5，将50mL溶液与pH计置于在低转速的搅拌器上的100mL烧杯中，并且滴加碱性溶液直至达到pH水平，注意由其聚集体产生的泡腾。
9.将制剂在高压釜Arcano LS-B75L中、在120℃下、在1atm超压下灭菌10min。
10.在灭菌过程完成之后，将50mL制剂溶液置于50mL锥形管中，并且在无菌条件下添加200μg rh-链道酶α酶(Roche，Basel，Switzerland)，以达到最终浓度为3.90μg/ml。该步骤在生物安全柜中进行。
11.将管密封并且在涡旋机中混合1分钟。
获得凝胶：配制混合物(溶液+g)
12.将0.85g羟乙基纤维素添加至制备的混合物中。
13.轻轻混合直至均质。
14.使用铝箔将制剂与光隔离，然后在4-25℃下储存，并且加盖。应当静置6至8小时直至气泡消失。
实施例10
本发明的组合物。将混合物No.0(M0)制备为优选药物制剂。
本发明的组合物由以下物质构成：
a.6.5mg/ml的乳酸(纯度85％-90％)
b.3.00mg/ml的乙琥胺
c.0.97μg/ml的DNAse
d.17mg/ml的羟乙基纤维素
溶液：配制混合物(a+b)
在50mL混合溶剂中，添加150.0mg乙琥胺和318μl乳酸。
制备方式
1.用分析天平Radwag AS 220R2(Radwag LLC，Radom，Poland)在表面皿上称量150.0mg乙琥胺。
2.借助全部混合溶剂，将该物质在玻璃烧杯上洗脱，以免在表面皿中留下任何颗粒。
3.将具有制剂的烧杯置于NUMAK GL-3250A磁力搅拌器(Numak Technology LLC，Dubai，UAE)上5min直至固体颗粒部分地溶解。
4.接下来，将318μl乳酸添加至制剂中。
5.一旦添加这些物质，将混合物再搅拌5分钟。
6.将Lutron PH-206pH计电极(Lutron Electronics Co.Inc.，Pennsylvania，USA)校准，以测量制剂的pH。
7.使溶液的最终pH达到5.5，将50mL溶液与经校准的pH计Lutron PH-206置于在低转速的搅拌器上的100mL烧杯中，并且滴加碱性溶液直至达到pH水平，注意由其聚集体产生的泡腾。
8.将制剂在高压釜Arcano LS-B75L中、在120℃下、在1atm超压下灭菌10min，并且在4-25℃下储存，密封并且与光源隔绝。
药物制剂：本发明的优选药物形式为凝胶。经过两步法(two-stage process)获得凝胶。应用装置包括由两个可塌缩膜隔开的三个容器。本发明的制剂包括：
容器1：在该容器中加入0.85g冻干羟乙基纤维素(适量)以获得具有期望的流变特性的凝胶。
容器2：在该容器中放入50μg冻干rh-链道酶α(适量)以获得0.97μg/ml的最终溶液。
容器3：在该容器中放入50mL步骤8的制剂。
在第一混合阶段，使2号膜破裂以使容器2和3的内容物混合。该混合提高了均化性。
在第二混合阶段，使1号膜破裂以使匀浆与容器1内容物混合。该容器具有赋形剂，因此在该阶段获得最终的凝胶药物形式。该混合提高了所有组分的均化性。
实施例11
本发明的组合物。将混合物No.13(M13)制备为优选药物制剂。
本发明的组合物包含：
a.3.00mg/ml的聚山梨醇酯80
b.1.00mg/ml的抗坏血酸
c.6.50mg/ml的乳酸(纯度85％-90％)
d.0.50mg/ml的EDTA
e.3.00mg/ml的乙琥胺
f.0.97μg/ml的DNase
g.17mg/ml的羟乙基纤维素
溶液：配制混合物(a+b+c+d+e)
在50mL混合溶剂中添加：50mg抗坏血酸、25mg EDTA、150mg乙琥胺、141μl聚山梨醇酯80和318μl乳酸。
制备方式：
1.在表面皿上称量50mg抗坏血酸和25mg EDTA。
2.将混合溶剂在玻璃烧杯上洗脱，以免在表面皿中留下任何颗粒。
3.在将50mL溶剂混合物的剩余部分添加至烧杯中之后，将制剂置于NUMAK GL-3250A磁力搅拌器(Numak Technology LLC，Dubai，UAE)上5min直至固体颗粒部分地溶解。
在搅拌期间，用200μl吸头通过释放其尖端添加141μl聚山梨醇酯80。
4.接下来，将体积为318μl的乳酸添加至制剂中。
5.添加150mg乙琥胺。
6.一旦添加这些物质，将混合物再搅拌5分钟。
7.使溶液的最终pH达到5.5，将50mL溶液与经校准的pH计Lutron PH-206置于在低转速的搅拌器上的100mL烧杯中，并且滴加碱性溶液直至达到pH水平，注意由其聚集体产生的泡腾。
8.将制剂在高压釜Arcano LS-B75L中、在120℃下、在1atm超压下灭菌10min，并且在4-25℃下储存，密封并且与光源隔绝。
药物制剂：本发明的优选药物形式为凝胶。经过两步法获得凝胶。应用装置包括由两个可塌缩膜隔开的三个容器。本发明的制剂包括：
容器1：在该容器中加入0.85g冻干羟乙基纤维素(适量)以获得具有期望的流变特性的凝胶。
容器2：在该容器中放入50μg冻干rh-链道酶α(适量)以获得0.97μg/ml的溶液。
容器3：在该容器中放入50mL步骤8的制剂。
在第一混合阶段，使2号膜破裂以使容器2和3的内容物混合。该混合提高了均化性。
在第二混合阶段，使1号膜破裂以使匀浆与容器1内容物混合。该容器具有赋形剂，因此在该阶段获得最终的凝胶药物形式。该混合提高了所有组分的均化性。
实施例12
本发明的组合物。将混合物No.15(M15)制备为优选药物制剂。
本发明的组合物包含：
a.2.00mg/ml的聚山梨醇酯80
b.0.50mg/ml的抗坏血酸
c.1.63mg/ml的乳酸(纯度85％-90％)
d.0.25mg/ml的EDTA
e.0.50mg/ml的乙琥胺
f.3.90μg/ml的DNase
g.17mg/ml的羟乙基纤维素
溶液：配制混合物(a+b+c+d+e)
在50mL混合溶剂中添加：25mg抗坏血酸、12mg EDTA、25mg乙琥胺、94μl聚山梨醇酯80和80μl乳酸。
制备方式：
1.在表面皿上称量25mg抗坏血酸和12.5mg EDTA。
2.借助混合溶剂，将该物质在玻璃烧杯上洗脱，以免在表面皿中留下任何颗粒。
3.在将50mL溶剂混合物的剩余部分添加至烧杯中之后，将制剂置于NUMAK GL-3250A磁力搅拌器(Numak Technology LLC，Dubai，UAE)上5min直至固体颗粒部分地溶解。
在搅拌期间，用200μl吸头通过释放其尖端添加94μl聚山梨醇酯80。
4.接下来，将体积为80μl的乳酸添加至制剂中。
5.添加25mg乙琥胺。
6.一旦添加这些物质，将混合物再搅拌5分钟。
7.使溶液的最终pH达到5.5，将50mL溶液与pH计置于在低转速的搅拌器上的100mL烧杯中，并且滴加碱性溶液直至达到pH水平，注意由其聚集体产生的泡腾。
8.将制剂在高压釜Arcano LS-B75L中、在120℃下、在1atm超压下灭菌10min，并且在4-25℃下储存，密封并且与光源隔绝。
药物制剂：本发明的优选药物形式为凝胶。经过两步法获得凝胶。应用装置包括由两个可塌缩膜隔开的三个容器。本发明的制剂包括：
容器1：在该容器中加入0.85g冻干羟乙基纤维素(适量)以获得具有期望的流变特性的凝胶。
容器2：在该容器中放入200μg冻干rh-链道酶α(适量)以获得3.90μg/ml的溶液。
容器3：在该容器中放入50mL步骤8的制剂。
在第一混合阶段，使2号膜破裂以使容器2和3的内容物混合。该混合提高了均化性。
在第二混合阶段，使1号膜破裂以使匀浆与容器1内容物混合。该容器具有赋形剂，因此在该阶段获得最终的凝胶药物形式。该混合提高了所有组分的均化性。
实施例13
本发明的组合物。将混合物No.16(M16)制备为优选药物制剂。
本发明的组合物包含：
a.3.00mg/ml的聚山梨醇酯80
b.2.50mg/ml的抗坏血酸
c.8.67mg/ml的乳酸(纯度85％-90％)
d.0.75mg/ml的EDTA
e.30.00mg/ml的乙琥胺
f.3.90μg/ml的DNase
g.17mg/ml的羟乙基纤维素
溶液：配制混合物(a+b+c+d+e)
在50mL混合溶剂中添加：125mg抗坏血酸、37.5mg EDTA、1500mg乙琥胺、141μl聚山梨醇酯80和424μl乳酸。
制备方式：
1.用分析天平Radwag AS 220R2(Radwag LLC，Radom，Poland)在表面皿上称量125mg抗坏血酸和37.5mg EDTA。
2.借助溶剂混合物，将该物质在玻璃烧杯上洗脱，以免在表面皿中留下任何颗粒。
3.在将50mL混合溶剂的剩余部分添加至烧杯中之后，将制剂置于NUMAK GL-3250A磁力搅拌器(Numak Technology LLC，Dubai，UAE)上5min直至固体颗粒部分地溶解。
在搅拌期间，用200μl吸头通过释放其尖端添加141μl聚山梨醇酯80。
4.接下来，将体积为424μl的乳酸添加至制剂中。
5.添加1500mg乙琥胺。
6.一旦添加这些物质，将混合物再搅拌5分钟。
7.使步骤6的混合物的最终pH达到5.5，将50mL溶液与pH计Lutron PH-206电极置于在低转速的搅拌器上的100mL烧杯中，并且滴加碱性溶液直至达到pH水平，注意由其聚集体产生的泡腾。
8.将制剂在高压釜Arcano LS-B75L中、在120℃下、在1atm超压下灭菌10min，并且在该步骤之后在4-25℃下储存，密封并且与光源隔绝。
药物制剂：本发明的优选药物形式为凝胶。经过两步法获得凝胶。应用装置包括由两个可塌缩膜隔开的三个容器。本发明的制剂包括：
容器1：在该容器中加入0.85g冻干羟乙基纤维素(适量)以获得具有期望的流变特性的凝胶。
容器2：在该容器中放入200μg冻干rh-链道酶α(适量)以获得3.90μg/ml的溶液。
容器3：在该容器中放入50mL步骤8的制剂。
在第一混合阶段，使2号膜破裂以使容器2和3的内容物混合。该混合提高了均化性。
在第二混合阶段，使1号膜破裂以使匀浆与容器1内容物混合。该容器具有赋形剂，因此在该阶段获得最终的凝胶药物形式。该混合提高了所有组分的均化性。
实施例14
本发明的组合物。将混合物No.0(M0)制备为优选药物制剂。
本发明的组合物包含：
a.6.50mg/ml的乳酸(纯度85％-90％)
b.3.00mg/ml的乙琥胺
c.0.97μg/ml的DNase
d.17mg/ml的羟乙基纤维素
溶液：配制混合物(a+b)
在50mL混合溶剂中添加：150mg乙琥胺和318μl乳酸。
制备方式：
1.用分析天平Radwag AS 220 R2(Radwag LLC，Radom，Poland)在表面皿上称量150.0mg乙琥胺。
2.借助全部混合溶剂，将该物质在玻璃烧杯上洗脱，以免在表面皿中留下任何颗粒。
3.将具有制剂的烧杯置于NUMAK GL-3250A磁力搅拌器(Numak Technology LLC，Dubai，UAE)上5min直至固体颗粒部分地溶解。
4.接下来，将318μl乳酸添加至制剂中。
5.一旦添加这些物质，将混合物再搅拌5分钟。
6.使溶液的最终pH达到5.50，将50mL溶液与经校准的Lutron PH-206pH计电极置于在低转速的搅拌器上的100mL烧杯中，并且滴加碱性溶液直至达到pH水平，注意由其聚集体产生的泡腾。
7.将制剂在高压釜Arcano LS-B75L中、在120℃下、在1atm超压下灭菌10min，并且在4-25℃下储存，密封并且与光源隔绝。
药物形式：本发明的优选药物形式为凝胶。经过一步法(one-stage process)获得凝胶。应用装置包括由一个可塌缩膜隔开的两个容器。本发明的制剂包括：
容器1：在该容器中放入50mL步骤7的制剂。
容器2：在该容器中放入50μg冻干rh-链道酶α(适量)以获得0.97μg/ml的溶液，并且放入0.85g冻干羟乙基纤维素(适量)以获得具有期望的流变特性的凝胶。
在混合过程中，使可塌缩膜破裂以使容器1和2的内容物混合。该混合使得获得最终药物形式并且提高了所有组分的均化性。
实施例15
本发明的组合物。将混合物No.13(M13)制备为优选药物制剂。
本发明的组合物由以下物质构成：
a.3.00mg/ml的聚山梨醇酯80
b.1mg/ml的抗坏血酸
c.6.50mg/ml的乳酸(纯度85％-90％)
d.0.50mg/ml的EDTA
e.3.00mg/ml的乙琥胺
f.0.97μg/ml的DNase
g.17mg/ml的羟乙基纤维素
溶液：配制混合物(a+b+c+d+e)
在50mL混合溶剂中添加：50mg抗坏血酸、25mg EDTA、150mg乙琥胺、141μl聚山梨醇酯80和318μl乳酸。
制备方式：
1.用分析天平Radwag AS 220R2(Radwag LLC，Radom，Poland)在表面皿上称量50mg抗坏血酸和25mg EDTA。
2.借助混合溶剂，将该物质在玻璃烧杯上洗脱，以免在表面皿中留下任何颗粒。
3.在将50mL溶剂混合物的剩余部分添加至烧杯中之后，将制剂置于NUMAK GL-3250A磁力搅拌器(Numak Technology LLC，Dubai，UAE)上5min直至固体颗粒部分地溶解。
在搅拌期间，用200μl吸头通过释放其尖端添加141μl聚山梨醇酯80。
4.接下来，将体积为318μl的乳酸添加至制剂中。
5.添加150mg乙琥胺。
6.一旦添加这些物质，将混合物再搅拌5分钟。
7.使溶液的最终pH达到5.5，将50mL溶液与经校准的pH计Lutron PH-206置于在低转速的搅拌器上的100mL烧杯中，并且滴加碱性溶液直至达到pH水平，注意由其聚集体产生的泡腾。
8.将制剂在高压釜Arcano LS-B75L中、在120℃下、在1atm超压下灭菌10min，并且在4-25℃下储存，密封并且与光源隔绝。
药物形式：本发明的优选药物形式为凝胶。经过一步法获得凝胶。应用装置包括由一个可塌缩膜隔开的两个容器。本发明的制剂包括：
容器1：在该容器中放入50mL步骤8的制剂。
容器2：在该容器中放入50μg冻干rh-链道酶α(适量)以获得0.97μg/ml的溶液，并且放入0.85g冻干羟乙基纤维素(适量)以获得具有期望的流变特性的凝胶。
在混合过程中，使可塌缩膜破裂以使容器1和2的内容物混合。该混合使得获得最终药物形式并且提高了所有组分的均化性。
实施例16
本发明的组合物。将混合物No.15(M15)制备为优选药物制剂。
本发明的组合物包含：
a.2.00mg/ml的聚山梨醇酯80
b.0.50mg/ml的抗坏血酸
c.1.63mg/ml的乳酸(纯度85％-90％)
d.0.25mg/ml的EDTA
e.0.50mg/ml的乙琥胺
f.3.90μg/ml的DNase
g.17mg/ml的羟乙基纤维素
溶液：配制混合物(a+b+c+d+e)
在50mL混合溶剂中添加：25mg抗坏血酸、12.5mg EDTA、25mg乙琥胺、94μl聚山梨醇酯80和80μl乳酸。
制备方式：
1.用分析天平Radwag AS 220 R2(Radwag LLC，Radom，Poland)在表面皿上称量25mg抗坏血酸和12.5mg EDTA。
2.借助混合溶剂，将该物质在玻璃烧杯上洗脱，以免在表面皿中留下任何颗粒。
3.在将50mL溶剂混合物的剩余部分添加至烧杯中之后，将制剂置于NUMAK GL-3250A磁力搅拌器(Numak Technology LLC，Dubai，UAE)上5min直至固体颗粒部分地溶解。
在搅拌期间，用200μl吸头通过释放其尖端添加94μl聚山梨醇酯80。
4.接下来，将体积为80μl的乳酸添加至制剂中。
5.添加25mg乙琥胺。
6.一旦添加这些物质，将混合物再搅拌5分钟。
7.使溶液的最终pH达到5.5，将50mL溶液与经校准的pH计Lutron PH-206置于在低转速的搅拌器上的100mL烧杯中，并且滴加碱性溶液直至达到pH水平，注意由其聚集体产生的泡腾。
8.将制剂在高压釜Arcano LS-B75L中、在120℃下、在1atm超压下灭菌10min，并且在4-25℃下储存，密封并且与光源隔绝。
药物形式：本发明的优选药物形式为凝胶。经过一步法获得凝胶。应用装置包括由一个可塌缩膜隔开的两个容器。本发明的制剂包括：
容器1：在该容器中放入50mL步骤8的制剂。
容器2：在该容器中放入200μg冻干rh-链道酶α(适量)以获得3.90μg/ml的溶液，并且放入0.85g冻干羟乙基纤维素(适量)以获得具有期望的流变特性的凝胶。
在混合过程中，使可塌缩膜破裂以使容器1和2的内容物混合。该混合使得获得最终药物形式并且提高了所有组分的均化性。
实施例17
本发明的组合物。将混合物No.16(M16)制备为优选药物制剂。
本发明的组合物由以下物质构成：
a.3.00mg/ml的聚山梨醇酯80
b.2.50mg/ml的抗坏血酸
c.8.67mg/ml的乳酸(纯度85％-90％)
d.0.75mg/ml的EDTA
e.30.00mg/ml的乙琥胺
f.3.90μg/ml的DNAse
g.17mg/ml的羟乙基纤维素
溶液：配制混合物(a+b+c+d+e)
在50mL混合溶剂中添加：125mg抗坏血酸、37.5mg EDTA、1500mg乙琥胺、141μl聚山梨醇酯80和424μl乳酸。
制备方式：
1.用分析天平Radwag AS 220 R2(Radwag LLC，Radom，Poland)在表面皿上称量125mg抗坏血酸和37.5mg EDTA。
2.借助混合溶剂，将该物质在玻璃烧杯上洗脱，以免在表面皿中留下任何颗粒。
3.在将50mL溶剂混合物的剩余部分添加至烧杯中之后，将制剂置于NUMAK GL-3250A磁力搅拌器(Numak Technology LLC，Dubai，UAE)上5min直至固体颗粒部分地溶解。
在搅拌期间，用200μl吸头通过释放其尖端添加141μl聚山梨醇酯80。
4.接下来，将体积为424μl的乳酸添加至制剂中。
5.添加1500mg乙琥胺。
6.一旦添加这些物质，将混合物再搅拌5分钟。
7.使溶液的最终pH达到5.5，将50mL溶液与经校准的pH计Lutron PH-206置于在低转速的搅拌器上的100mL烧杯中，并且滴加碱性溶液直至达到pH水平，注意由其聚集体产生的泡腾。
8.将制剂在高压釜Arcano LS-B75L中、在120℃下、在1atm超压下灭菌10min，并且在4-25℃下储存，密封并且与光源隔绝。
药物形式：本发明的优选药物形式为凝胶。经过一步法获得凝胶。应用装置包括由一个可塌缩膜隔开的两个容器。本发明的制剂包括：
容器1：在该容器中放入50mL步骤8的制剂。
容器2：在该容器中放入200μg冻干rh-链道酶α(适量)以获得3.90μg/ml的溶液并且放入0.85g冻干羟乙基纤维素(适量)以获得具有期望的流变特性的凝胶。
在混合过程中，使可塌缩膜破裂以使容器1和2的内容物混合。该混合使得获得最终药物形式并且提高了所有组分的均化性。
实施例18
本发明的组合物。在实验室中制备混合物No.0(M0)。本发明的组合物包含：
a.6.50mg/ml的乳酸(纯度85％-90％)
b.3.00mg/ml的乙琥胺
c.0.97μg/ml的DNAse
溶液：配制混合物(a+b+c)
在50mL混合溶剂中添加：150mg乙琥胺、50μg rh-链道酶α和318μl乳酸。
制备方式：
1.用分析天平Radwag AS 220 R2(Radwag LLC，Radom，Poland)在表面皿上称量150.0mg乙琥胺。
2.借助全部混合溶剂，将该物质在玻璃烧杯上洗脱，以免在表面皿中留下任何颗粒。
3.将具有制剂的烧杯置于NUMAK GL-3250A磁力搅拌器(Numak Technology LLC，Dubai，UAE)上5min直至固体颗粒部分地溶解。
4.接下来，将318μl乳酸添加至制剂中。
5.一旦添加这些物质，将混合物再搅拌5分钟。
6.使溶液的最终pH达到5.5，将50mL溶液与经校准的pH计Lutron PH-206置于在低转速的搅拌器上的100mL烧杯中，并且滴加碱性溶液直至达到pH水平，注意由其聚集体产生的泡腾。
7.将制剂在高压釜Arcano LS-B75L中、在120℃下、在1atm超压下灭菌10min。
8.将50mL步骤7的制剂置于锥形管(50mL)中，并且在无菌条件下添加0.05mL链道酶α1mg/mL酶Pulmozyme(Roche，Basel，Switzerland)以达到最终浓度为0.97μg/ml。该步骤在生物安全柜中进行。
9.一旦密封，将管在涡旋机中混合10秒。
10.使用铝箔将制剂与光隔离，然后在4℃-25℃下储存。
实施例19
本发明的组合物。在实验室中制备混合物No.13(M13)。本发明的组合物包含：
a.3.00mg/ml的聚山梨醇酯80
b.1mg/ml的抗坏血酸
c.6.50mg/ml的乳酸(纯度85％-90％)
d.0.50mg/ml的EDTA
e.3.00mg/ml的乙琥胺
f.0.97μg/ml的DNase
溶液：配制混合物(a+b+c+d+e+f)
在50mL混合溶剂中添加：50mg抗坏血酸、25mg EDTA、150mg乙琥胺、50μg rh-链道酶α、141μl聚山梨醇酯80和318μl乳酸。
制备方式：
1.用分析天平Radwag AS 220 R2(Radwag LLC，Radom，Poland)在表面皿上称量50mg抗坏血酸和25mg EDTA。
2.借助混合溶剂，将该物质在玻璃烧杯上洗脱，以免在表面皿中留下任何颗粒。
3.在将50mL溶剂混合物的剩余部分添加至烧杯中之后，将制剂置于NUMAK GL-3250A磁力搅拌器(Numak Technology LLC，Dubai，UAE)上5min直至固体颗粒部分地溶解。
在搅拌期间，用200μl吸头通过释放其尖端添加141μl聚山梨醇酯80。
4.接下来，将体积为318μl的乳酸添加至制剂中。
5.添加150mg乙琥胺。
6.一旦添加这些物质，将混合物再搅拌5分钟。
7.使溶液的最终pH达到5.5，将50mL溶液与经校准的pH计Lutron PH-206置于在低转速的搅拌器上的100mL烧杯中，并且滴加碱性溶液直至达到pH水平，注意由其聚集体产生的泡腾。
8.将制剂在高压釜Arcano LS-B75L中、在120℃下、在1atm超压下灭菌10min。
9.将50mL步骤8的制剂置于锥形管(50mL)中，并且在无菌条件下添加0.05mL链道酶α1mg/mL酶Pulmozyme(Roche，Basel，Switzerland)以达到最终浓度为0.97μg/ml。该步骤在生物安全柜中进行。
10.一旦密封，将管在涡旋机中混合10秒。
11.使用铝箔将制剂与光隔离，然后在4℃-25℃下储存。
实施例20
本发明的组合物。在实验室中制备混合物No.15(M15)。本发明的组合物由以下物质构成：
a.2.00mg/ml的聚山梨醇酯80
b.0.50mg/ml的抗坏血酸
c.1.63mg/ml的乳酸(纯度85％-90％)
d.0.25mg/ml的EDTA
e.0.50mg/ml的乙琥胺
f.3.90μg/ml的DNase
溶液：配制混合物(a+b+c+d+e+f)
在50mL混合溶剂中添加：25mg抗坏血酸、12.5mg EDTA、25mg乙琥胺、200μg rh-链道酶α、94μl聚山梨醇酯80和80μl乳酸。
制备方式：
1.用分析天平Radwag AS 220 R2(Radwag LLC，Radom，Poland)在表面皿上称量25mg抗坏血酸和12.5mg EDTA。
2.借助混合溶剂，将该物质在玻璃烧杯上洗脱，以免在表面皿中留下任何颗粒。
3.在将50mL溶剂混合物的剩余部分添加至烧杯中之后，将制剂置于NUMAK GL-3250A磁力搅拌器(Numak Technology LLC，Dubai，UAE)上5min直至固体颗粒部分地溶解。
在搅拌期间，用200μl吸头通过释放其尖端添加94μl聚山梨醇酯80。
4.接下来，将体积为80μl的乳酸添加至制剂中。
5.添加25mg乙琥胺。
6.一旦添加这些物质，将混合物再搅拌5分钟。
7.使溶液的最终pH达到5.5，将50mL溶液与经校准的pH计Lutron PH-206置于在低转速的搅拌器上的100mL烧杯中，并且滴加碱性溶液直至达到pH水平，注意由其聚集体产生的泡腾。
8.将制剂在高压釜Arcano LS-B75L中、在120℃下、在1atm超压下灭菌10min。
9.将50mL步骤8的制剂置于锥形管(50mL)中，并且在无菌条件下添加0.20mL链道酶α1mg/mL酶Pulmozyme(Roche，Basel，Switzerland)以达到最终浓度为3.90μg/ml。该步骤在生物安全柜中进行。
10.一旦密封，将管在涡旋机中混合10秒。
11.使用铝箔将制剂与光隔离，然后在4℃-25℃下储存。
实施例21
本发明的组合物。在实验室中制备混合物No.16(M16)。本发明的组合物包含：
a.3.00mg/ml的聚山梨醇酯80
b.2.50mg/ml的抗坏血酸
c.8.67mg/ml的乳酸(纯度85％-90％)
d.0.75mg/ml的EDTA
e.30.00mg/ml的乙琥胺
f.3.90μg/ml的DNase
溶液：配制混合物(a+b+c+d+e+f)
在50mL混合溶剂中添加：125mg抗坏血酸、37.5mg EDTA、1500mg乙琥胺、200μg rh-链道酶α、141μl聚山梨醇酯80和424μl乳酸。
制备方式：
1.用分析天平Radwag AS 220 R2(Radwag LLC，Radom，Poland)在表面皿上称量125mg抗坏血酸和37.50mg EDTA。
2.借助混合溶剂，将该物质在玻璃烧杯上洗脱，以免在表面皿中留下任何颗粒。
3.在将50mL溶剂混合物的剩余部分添加至烧杯中之后，将制剂置于NUMAK GL-3250A磁力搅拌器(Numak Technology LLC，Dubai，UAE)上5min直至固体颗粒部分地溶解。
在搅拌期间，用200μl吸头通过释放其尖端添加141μl聚山梨醇酯80。
4.接下来，将体积为424μl的乳酸添加至制剂中。
5.添加1500mg乙琥胺。
6.一旦添加这些物质，将混合物再搅拌5分钟。
7.使溶液的最终pH达到5.5，将50mL溶液与经校准的pH计Lutron PH-206置于在低转速的搅拌器上的100mL烧杯中，并且滴加碱性溶液直至达到pH水平，注意由其聚集体产生的泡腾。
8.将制剂在高压釜Arcano LS-B75L中、在120℃下、在1atm超压下灭菌10min。
9.将50mL步骤8的制剂置于锥形管(50mL)中，并且在无菌条件下添加0.20mL链道酶α1mg/mL酶Pulmozyme(Roche，Basel，Switzerland)以达到最终浓度为3.90μg/ml。该步骤在生物安全柜中进行。
10.一旦密封，将管在涡旋机中混合10秒。
11.使用铝箔将制剂与光隔离，然后在4℃-25℃下储存。
实施例22
本发明的凝胶组合物。在实验室中制备混合物No.0(M0)。
本发明的组合物包含：
a.6.50mg/ml的乳酸(纯度85％-90％)
b.3.00mg/ml的乙琥胺
c.0.97μg/ml的DNase
d.17mg/ml的羟乙基纤维素
溶液：配制混合物(a+b+c)
在50mL混合溶剂中添加：150mg乙琥胺、50μg rh-链道酶α和318μl乳酸。
制备方式：
1.用分析天平Radwag AS 220 R2(Radwag LLC，Radom，Poland)在表面皿上称量150.0mg乙琥胺。
2.借助全部混合溶剂，将该物质在玻璃烧杯上洗脱，以免在表面皿中留下任何颗粒。
3.将具有制剂的烧杯置于NUMAK GL-3250A磁力搅拌器(Numak Technology LLC，Dubai，UAE)上5min直至固体颗粒部分地溶解。
4.接下来，将318μl乳酸添加至制剂中。
5.一旦添加这些物质，将混合物再搅拌5分钟。
6.使溶液的最终pH达到5.5，将50mL溶液与经校准的pH计Lutron PH-206置于在低转速的搅拌器上的100mL烧杯中，并且滴加碱性溶液直至达到pH水平，注意由其聚集体产生的泡腾。
7.将制剂在高压釜Arcano LS-B75L中、在120℃下、在1atm超压下灭菌10min。
8.将50mL步骤7的制剂置于锥形管(50mL)中，并且在无菌条件下添加0.05mL链道酶α1mg/mL酶Pulmozyme(Roche，Basel，Switzerland)以达到最终浓度为0.97μg/ml。该步骤在生物安全柜中进行。
9.一旦密封，将管在涡旋机中混合10秒。
获得凝胶：配制混合物(溶液+g)
10.将0.85g羟乙基纤维素添加至制备的混合物中。
11.轻轻混合直至均质。
12.使用铝箔将制剂与光隔离，然后在4-25℃下储存并且加盖。应当静置6至8小时直至气泡消失。
实施例23
本发明的凝胶组合物。在实验室中制备混合物No.13(M13)。
本发明的组合物包含：
a.3.00mg/ml的聚山梨醇酯80
b.1mg/ml的抗坏血酸
c.6.50mg/ml的乳酸(纯度85％-90％)
d.0.50mg/ml的EDTA
e.3.00mg/ml的乙琥胺
f.0.97μg/ml的DNase
g.17mg/ml的羟乙基纤维素
溶液：配制混合物(a+b+c+d+e+f)
在50mL混合溶剂中添加：50mg抗坏血酸、25mg EDTA、150mg乙琥胺、50μg rh-链道酶α、141μl聚山梨醇酯80和318μl乳酸。
制备方式：
1.用分析天平Radwag AS 220 R2(Radwag LLC，Radom，Poland)在表面皿上称量50mg抗坏血酸和25mg EDTA。
2.借助混合溶剂，将该物质在玻璃烧杯上洗脱，以免在表面皿中留下任何颗粒。
3.在将50mL溶剂混合物的剩余部分添加至烧杯中之后，将制剂置于NUMAK GL-3250A磁力搅拌器(Numak Technology LLC，Dubai，UAE)上5min直至固体颗粒部分地溶解。
在搅拌期间，用200μl吸头通过释放其尖端添加141μl聚山梨醇酯80。
4.接下来，将体积为318μl的乳酸添加至制剂中。
5.添加150mg乙琥胺。
6.一旦添加这些物质，将混合物再搅拌5分钟。
7.使溶液的最终pH达到5.5，将50mL溶液与经校准的pH计Lutron PH-206置于在低转速的搅拌器上的100mL烧杯中，并且滴加碱性溶液直至达到pH水平，注意由其聚集体产生的泡腾。
8.将制剂在高压釜Arcano LS-B75L中、在120℃下、在1atm超压下灭菌10min。
9.将50mL步骤8的制剂置于锥形管(50mL)中，并且在无菌条件下添加0.05mL链道酶α1mg/mL酶Pulmozyme(Roche，Basel，Switzerland)以达到最终浓度为1.00μg/ml。该步骤在生物安全柜中进行。
10.一旦密封，将管在涡旋机中混合10秒。
获得凝胶：配制混合物(溶液+g)
12.将0.85g羟乙基纤维素添加至制备的混合物中。
13.轻轻混合直至均质。
14.使用铝箔将制剂与光隔离，然后在4-25℃下储存，并且加盖。应当静置6至8小时直至气泡消失。
实施例24
本发明的凝胶组合物。在实验室中制备混合物No.15(M15)。
本发明的组合物由以下物质构成：
a.2.00mg/ml的聚山梨醇酯80
b.0.50mg/ml的抗坏血酸
c.1.63mg/ml的乳酸(纯度85％-90％)
d.0.25mg/ml的EDTA
e.0.50mg/ml的乙琥胺
f.3.90μg/ml的DNase
g.17mg/ml的羟乙基纤维素
溶液：配制混合物(a+b+c+d+e+f)
在50mL混合溶剂中添加：25mg抗坏血酸、12.5mg EDTA、25mg乙琥胺、200μg rh-链道酶α、94μl聚山梨醇酯80和80μl乳酸。
制备方式：
1.用分析天平Radwag AS 220 R2(Radwag LLC，Radom，Poland)在表面皿上称量25mg抗坏血酸和12.5mg EDTA。
2.借助混合溶剂，将该物质在玻璃烧杯上洗脱，以免在表面皿中留下任何颗粒。
3.在将50mL溶剂混合物的剩余部分添加至烧杯中之后，将制剂置于NUMAK GL-3250A磁力搅拌器(Numak Technology LLC，Dubai，UAE)上5min直至固体颗粒部分地溶解。
在搅拌期间，用200μl吸头通过释放其尖端添加94μl聚山梨醇酯80。
4.接下来，将体积为80μl的乳酸添加至制剂中。
5.添加25mg乙琥胺。
6.一旦添加这些物质，将混合物再搅拌5分钟。
7.使溶液的最终pH达到5.5，将50mL溶液与经校准的pH计Lutron PH-206置于在低转速的搅拌器上的100mL烧杯中，并且滴加碱性溶液直至达到pH水平，注意由其聚集体产生的泡腾。
8.将制剂在高压釜Arcano LS-B75L中、在120℃下、在1atm超压下灭菌10min
9.将50mL步骤8的制剂置于锥形管(50mL)中，并且在无菌条件下添加0.20mL链道酶α1mg/mL酶Pulmozyme(Roche，Basel，Switzerland)以达到最终浓度为3.90μg/ml。该步骤在生物安全柜中进行。
10.一旦密封，将管在涡旋机中混合10秒。
获得凝胶：配制混合物(溶液+g)
11.将0.85g羟乙基纤维素添加至制备的混合物中。
12.轻轻混合直至均质。
13.使用铝箔将制剂与光隔离，然后在4-25℃下储存并且加盖。应当静置6至8小时直至气泡消失。
实施例25
本发明的凝胶组合物。在实验室中制备混合物No.16(M16)。
本发明的组合物包含：
a.3.00mg/ml的聚山梨醇酯80
b.2.50mg/ml的抗坏血酸
c.8.67mg/ml的乳酸(纯度85％-90％)
d.0.75mg/ml的EDTA
e.30.00mg/ml的乙琥胺
f.3.90μg/ml的DNase
g.17mg/ml的羟乙基纤维素
溶液：配制混合物(a+b+c+d+e+f)
在50mL混合溶剂中添加：125mg抗坏血酸、37.50mg EDTA、1500mg乙琥胺、200μgrh-链道酶α、141μl聚山梨醇酯80和424μl乳酸。
制备方式：
1.用分析天平Radwag AS 220 R2(Radwag LLC，Radom，Poland)在表面皿上称量125mg抗坏血酸和37.50mg EDTA。
2.借助混合溶剂，将该物质在玻璃烧杯上洗脱，以免在表面皿中留下任何颗粒。
3.在将50mL溶剂混合物的剩余部分添加至烧杯中之后，将制剂置于NUMAK GL-3250A磁力搅拌器(Numak Technology LLC，Dubai，UAE)上5min直至固体颗粒部分地溶解。
在搅拌期间，用200μl吸头通过释放其尖端添加141μl聚山梨醇酯80。
4.接下来，将体积为424μl的乳酸添加至制剂中。
5.添加1500mg乙琥胺。
6.一旦添加这些物质，将混合物再搅拌5分钟。
7.使溶液的最终pH达到5.5，将50mL溶液与经校准的pH计Lutron PH-206置于在低转速的搅拌器上的100mL烧杯中，并且滴加碱性溶液直至达到pH水平，注意由其聚集体产生的泡腾。
8.将制剂在高压釜Arcano LS-B75L中、在120℃下、在1atm超压下灭菌10min。
9.将50mL步骤8的制剂置于锥形管(50mL)中，并且在无菌条件下添加0.20mL链道酶α1mg/mL酶Pulmozyme(Roche，Basel，Switzerland)以达到最终浓度为3.90μg/ml。该步骤在生物安全柜中进行。
10.一旦密封，将管在涡旋机中混合10秒。
获得凝胶：配制混合物(溶液+g)
11.将0.85g羟乙基纤维素添加至制备的混合物中。
12.轻轻混合直至均质。
13.使用铝箔将制剂与光隔离，然后在4-25℃下储存并且加盖。应当静置6至8小时直至气泡消失。
与使用本发明的组合物的试验相关的实施例
配制本发明的各种组合物并且对其进行试验以证明它们的技术效果。
用于评价本发明的本发明的一些组合物的总结可以参见下表：
Figure BDA0003532486030000621
表1：来自受试组合物的混合溶剂(MS；pH 5.5)中不同组分的浓度
还对单一分子的溶液(如实施例1中所述来制备)进行试验以证明本发明的组合物的协同特性。受试溶液为：
1.在混合溶剂中的乳酸(LA)：1.63mg/ml、6.50mg/ml、8.67mg/ml。所有溶液的最终pH：5.5
2.在混合溶剂中的聚山梨醇酯80(PS80)：2.0mg/ml、3.0mg/ml。所有溶液的最终pH：5.5
3.在混合溶剂中的EDTA：0.25mg/ml、0.50mg/ml、0.75mg/ml。所有溶液的最终pH：5.5
4.在混合溶剂中的抗坏血酸(AA)：0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.5mg/ml。所有溶液的最终pH：5.5
5.在混合溶剂中的乙琥胺(Etho)：0.50mg/ml、3.00mg/ml、30.00mg/ml。所有溶液的最终pH：5.5
6.在混合溶剂中的链道酶α(D1)：250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.2μg/mL,15.6μg/mL、7.8μg/mL、3.9μg/mL、1.9μg/mL、0.97μg/mL、0.5μg/mL。所有溶液的最终pH：5.5.
实施例26
抗病原效果
细菌菌株：
1)黏液型铜绿假单胞菌(内部代码LEF037)：从发展超过6个月的慢性静脉性溃疡中临床分离。
2)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(内部代码LEF006)。从发展超过6个月的慢性静脉性腿部溃疡中临床分离。
细菌悬浮液：铜绿假单胞菌LEF037在Luria-Bertani(LB)培养基中在37℃下生长12h。由该培养物，在LB中制备悬浮液(OD600nm＝0.120)。金黄色葡萄球菌LEF006在脑心浸液(BHI)培养基中在37℃下生长12h。由该培养物，在BHI中制备悬浮液(OD600nm＝0.120)。
对照：在所进行的试验中，使用以下对照：
a.铜绿假单胞菌的正常生长对照：Luria Bertani培养基(LB)(pH 7.2)
b.金黄色葡萄球菌的正常生长对照：脑心浸液(BHI)培养基(pH 7.2)
c.稀释效果对照：混合溶剂(MS)(pH 5.50)。
d.新获得的LAPS效果的对照：在4℃下储存24小时的LAPS(pH 5.22)(LAPS 24h)。
e.LAPS活性保持对照：在4℃下储存6个月的LAPS(pH 6.05)(LAPS6m)。
植物乳杆菌上清液(LAPS)：根据实施例1的详细内容来制备LAPS对照。植物乳杆菌ATCC 10241在de Man Rogosa Sharpe(MRS)(Britania.Argentina)中在37℃下生长12h。通过以8000rpm离心15min和用0.22μm的微孔过滤器过滤来获得上清液(LAPS)。该上清液对应于专利申请No.AR093779并且被认为是已知的慢性伤口治疗的治疗效果最好的产品。该产品存在本发明旨在解决的一些问题。一方面，从以下所示的试验观察到该产品随时间推移而失去功效。该产品还存在监管问题，这是因为，由于该产品依赖于发酵过程而不具有绝对明确的组成。本发明实现了随时间推移而延长的好的稳定性并且由绝对明确且批准用于人类治疗用途的组分构成。
单一分子的溶液：根据实施例1在混合溶剂中制备所有溶液，最终pH为5.5。制备的溶液为：1.乳酸(LA)(1.63、6.50和8.67mg/ml)；2.聚山梨醇酯80(PS80)(2.0和3.0mg/ml)；3.EDTA(0.25、0.50和0.75mg/ml)；4.抗坏血酸(AA)(0.5、1.0和2.5mg/ml)；5.乙琥胺(Etho)(0.50、3.00和30.00mg/ml)；6.rh-链道酶α(Dl)(0.97和3.9μg/ml)。
M0、M13、M15和M16(参见表1)。根据实施例18至21制作本发明的组合物。
用于测定抑菌效果的试验：对于抑菌试验，使用96孔板(Deltalab.Argentina)(200μL容量)。分别用50μL铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌的细菌悬浮液、使用100μL LB培养基或BHI培养基一式三份进行所有试验。然后，放置以下样品：
a)50μL对照(参见对照)，
b)50μL单一分子的溶液(参见单一分子的溶液)，
c)50μL分子的混合物。
随后，将微孔板置于酶标仪(Multiskan Go.Thermo Scientific.Germany)中，使用以下读数程序：a)在37℃下温育；b)每58分钟轻微摇动(持续3秒)；c)600nm处的吸光度读数周期，每小时一次，持续24h。所有孔的初始光密度(OD)为0.100。在Microsoft
Figure BDA0003532486030000651
中分析数据，计算平均值。结果作为24h的抑菌效果的百分比以柱形图显示。
用于测定杀菌效果的试验：从用于测定抑菌效果的试验，从各孔取10μL等分试样，进行连续稀释，并且根据细菌菌株将各稀释液的一份等分试样接种在LB或BHI琼脂上。对菌落形成单位(CFU)的初始数量进行计数以与24h处理后获得的CFU的最终数量比较。计算存活细菌的数量，根据处理后获得的CFU数量/mL将它们以柱形图表示。
用于测定生物膜抑制效果的试验：在24h的生长抑制试验之后，弃去孔中的内容物，并且将空孔用无菌盐水溶液洗涤三次。将板在室温下干燥15分钟(面朝下，在吸水纸上)。向各孔中添加200μL 0.1％紫色晶体，并且将板在室温下温育15min，同时在涡旋机(Labnet)中轻轻持续搅拌以将附着至孔壁的生物膜染色。此后，弃去孔中的内容物，用无菌盐水溶液洗涤三次，并且在室温下干燥15分钟(面朝下，在吸水纸上)。随后，为了溶解附着至生物膜的结晶紫，将200μL 96°乙醇添加至各孔中，并且，在室温下，将板温育10分钟，同时在涡旋机(Labnet)中轻轻持续搅拌。结晶紫的量与形成的生物膜的量成正比。以该方式，在各孔中获得溶液，其颜色强度与形成的生物膜的量成正比。在Multiskan Go酶标仪(Thermo Scientific)中，在540nm处、在37℃下准确地进行吸光度读取。在Microsoft
Figure BDA0003532486030000661
中处理数据，计算平均值，并且结果作为抑制生物膜形成的百分比以柱形图显示。
用于测定生物膜破坏效果的试验：在96孔板(Deltalab)中，放置150μL培养基+50μL细菌悬浮液。将板在潮湿室中、在37℃下温育24小时直至生物膜形成。此后，小心地弃去孔中的内容物，用无菌盐水溶液轻轻洗涤三次，避免附着至壁的生物膜的损失。将板在生物安全柜中在室温下干燥20min。随后，添加150μL培养基并且分别添加50μL对照、50μL单一分子的溶液和50μL分子的混合物。所有试验一式三份进行。将板在潮湿室中在37℃下温育24小时。此后，弃去孔中的内容物并且用无菌盐水洗涤3次。将板在室温下干燥15分钟(面朝下置于吸水纸上)。将孔用200μL/孔的0.1％紫色晶体染色15分钟，同时在室温下、在涡旋机(Labnet)中轻轻持续搅拌。弃去孔中的内容物，用无菌盐水洗涤三次，并且将板在室温下干燥15分钟(面朝下置于吸水纸上)。最后，添加200μL/孔的96°乙醇以溶解附着至生物膜的紫色晶体。在室温下，将板温育10分钟，同时在涡旋机(Labnet)中轻轻持续搅拌。在MultiskanGo酶标仪(Thermo Scientific)中在540nm处(37℃)测量所得溶液的吸光度。在Microsoft
Figure BDA0003532486030000662
中处理数据，计算平均值，并且结果作为生物膜破坏的百分比以柱形图显示。
结果和讨论
图2示出不同的抗病原体效果的百分比：针对铜绿假单胞菌，由组合物M0和M13以及浓度为其在上述组合物中的浓度的单一分子引起的抑菌活性、生物膜(BF)形成的抑制和预先形成的生物膜破坏。该图还示出LAPS 24小时、LAPS 6个月和混合溶剂(MS)的这些特性。
单一分子对于每种特性均表现出一些活性。尽管如此，M0和M13对于所有活性均显示协同作用。虽然LAPS 24h具有很好的抑菌效果和抑制BF效果，但是其对生物膜的破坏效果低于组合物。此外，6个月后，LAPS急剧地失去其抗病原体效果。
图3示出在使用组合物M0和M13以及浓度为其在上述组合物中的浓度的不同单一分子处理24h之后，以铜绿假单胞菌的存活细菌(CFU/mL)表示的杀菌效果。
如图所示，单一分子均未引起杀菌效果，因为存活细菌水平与对照(未处理)相似。LAPS显示重要的杀菌效果，但是其随着时间推移而消失。M0显示显著的杀菌效果而M13引起细菌的完全消除。
图4示出不同的抗病原体效果的百分比：针对铜绿假单胞菌，由组合物M15和浓度为其在所提及的组合物中的浓度的单一分子引起的抑菌活性、生物膜(BF)形成的抑制和预先形成的生物膜破坏。该图还示出LAPS 24小时、LAPS 6个月和混合溶剂(MS)的这些特性。单一分子对于每种特性均表现出一些活性。尽管如此，M15对于所有活性显示协同作用。虽然LAPS 24h具有很好的抑菌效果和抑制BF效果，但是其对生物膜的破坏效果低于组合物M15。此外，6个月后，LAPS急剧地失去其抗病原体效果。
图5示出在使用组合物M15和浓度为其在上述组合物中的浓度的不同单一分子处理24h之后，以铜绿假单胞菌的存活细菌(CFU/mL)表示的杀菌效果。如图所示，单一分子均未引起杀菌效果，因为存活细菌水平与对照(未处理)相似。LAPS具有重要的杀菌效果，但是其随着时间推移而消失。M15引起细菌的大量消除。
图6示出不同的抗病原体效果的百分比：针对铜绿假单胞菌，由组合物M16以及浓度为其在所提及的组合物中的浓度的单一分子引起的抑菌活性、生物膜(BF)形成的抑制和预先形成的生物膜破坏。该图还示出24小时LAPS、6个月LAPS和混合溶剂(MS)的这些特性。单一分子对于每种特性均表现出一些活性。尽管如此，M16对于所有活性均显示显著的协同作用。虽然LAPS 24h具有很好的抑菌效果和抑制BF效果，但是其对生物膜的破坏效果低于制剂。此外，6个月后，LAPS急剧地失去其抗病原体效果。
图7示出在使用组合物M16和浓度为其在上述组合物中的浓度的不同单一分子处理24h之后，以铜绿假单胞菌的存活细菌(CFU/mL)表示的杀菌效果。如图所示，一些单一分子引起低的杀菌效果，因为存活细菌水平与对照(未处理)相似。LAPS具有重要的杀菌效果，但是其随着时间推移而消失，而M16引起细菌的完全消除。
图8示出不同的抗病原体效果的百分比：针对金黄色葡萄球菌，由组合物M0和M13和浓度为其在所提及的组合物中的浓度的单一分子引起的抑菌活性、生物膜(BF)形成的抑制和预先形成的生物膜破坏。该图还示出24小时LAPS、6个月LAPS和混合溶剂(MS)的这些特性。
单一分子对于每种特性均表现出一些活性。尽管如此，M13对于所有活性显示协同作用。M0显示出对于抑制生物膜(BF)形成的协同作用并且进行生物膜破坏。虽然LAPS 24h具有很好的抑菌效果和抑制BF效果，但是其对生物膜的破坏效果低于制剂。此外，6个月后，LAPS急剧地失去其抗病原体效果。
图9示出在使用组合物M0和M13和浓度为其在上述组合物中的浓度的不同单一分子处理24h之后，以金黄色葡萄球菌的存活细菌(CFU/mL)表示的杀菌效果。
如图所示，大多数单一分子未引起杀菌效果，因为存活细菌水平与对照(未处理)相似。LAPS具有重要的杀菌效果，但是其随着时间推移而消失。M0显示显著的杀菌效果而M13的细菌消除效果更高。
图10示出不同的抗病原体效果的百分比：针对金黄色葡萄球菌，由组合物M15以及浓度为其在所提及的组合物中的浓度的单一分子引起的抑菌活性、生物膜(BF)形成的抑制和预先形成的生物膜破坏。该图还示出24小时LAPS、6个月LAPS和混合溶剂(MS)的这些特性。
单一分子对于每种特性均表现出一些活性。尽管如此，M15对于所有活性显示协同作用。虽然LAPS 24h具有很好的抑菌效果和抑制BF效果，但是其对生物膜的破坏效果低于制剂。此外，6个月后，LAPS急剧地失去其抗病原体效果。
图11示出在使用组合物M15和浓度为其在上述组合物中的浓度的不同单一分子处理24h之后，以金黄色葡萄球菌的存活细菌(CFU/mL)表示的杀菌效果。
如图所示，大多数单一分子未引起杀菌效果，因为存活细菌水平与对照(未处理)相似。LAPS具有一些杀菌效果，但是其随着时间推移而消失。最后，M15引起细菌的大量消除。
图12示出不同的抗病原体效果的百分比：针对金黄色葡萄球菌，由组合物M16和浓度为其在上述制剂中的浓度的单一分子引起的抑菌活性、生物膜(BF)形成的抑制和预先形成的生物膜破坏。该图还示出24小时LAPS、6个月LAPS和混合溶剂(MS)的这些特性。
单一分子对于每种特性均表现出一些活性。尽管如此，M16对于所有活性均显示显著的协同作用。虽然LAPS 24h具有很好的抑菌效果和抑制BF效果，但是其对生物膜的破坏效果低于制剂。此外，6个月后，LAPS急剧地失去其抗病原体效果。
图13示出在使用组合物M16和浓度为其在上述组合物中的浓度的不同单一分子处理24h之后，以金黄色葡萄球菌的存活细菌(CFU/mL)表示的杀菌效果。
如图所示，一些单一分子引起低的杀菌效果，因为存活细菌水平与对照(未处理)相似。LAPS具有重要的杀菌效果，但是其随着时间推移而消失，而M16引起细菌的最大消除。
生物膜破坏能力是慢性伤口治疗中最受欢迎的特性之一，这是因为患者在生物膜已经在伤口上形成时就医。已知常规的抗菌剂由于以下原因不能引起生物膜破坏，尤其是在体内具有相对功效：
·各物种在其生物膜的基质中均具有不同的化学组成。
·感染为多种微生物感染，这导致混合生物膜的形成。
·现有的疗法针对特定的化学组成。
这是现有的疗法总是使混合生物膜残留而成为新的感染源、使感染慢性化的原因。良好的破坏性疗法应当攻击混合生物膜和不同物种的生物膜，产生接近100％的破坏。
结论
令人惊讶的是，本发明的组分在慢性伤口中最常见的细菌(铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌)中显示协同的抑菌特性、杀菌特性、生物膜抑制和破坏特性。本发明还在针对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌研究的性质方面显示优于LAPS的效果。
实施例27
本发明的组合物的抗氧化能力
用于测定抗氧化活性的方法基于2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)捕获自由基的能力(给质子物质为抗氧化物质)。DPPH*自由基接受来自抗氧化物质的质子并且变为DPPH。以该方式，抗氧化效果与DPPH*降低成比例。DPPH*在517nm处吸光度最大，当DPPH形成时，从紫色变为黄色。因此，在517nm处的吸光度下降之后，可以通过分光光度法来测量抗氧化效果。然后，使用样品吸光度的初始值和最终值，计算抑制系数50(IC50)。IC50表示还原50％DPPH*所需的抗氧化物质的最低浓度。为了获得IC50，作出两条递增浓度曲线：第一条使用供试样品并且第二条使用参比标准品(Trolox)。最后，按照Sharma等人的建议来计算相对抗氧化活性的百分比(％AAR)(42)。
DPPH*自由基的储备溶液(SS)和工作溶液(WS)的制备：制备约100ppm DPPH在无水甲醇中的溶液。必须将溶液在室温下在黑暗中静置至少30分钟。然后用无水甲醇从SS制备WS，直至在517nm的波长处在微孔板上获得0.800±0.100的吸光度。
标准Trolox溶液的制备：制备SS＝500ppm。为了获得10mL的体积，应当将5mgTrolox溶解于10mL无水甲醇中。以25ppm、50ppm、100ppm、150ppm、200ppm和250ppm的浓度制备六种WS。
样品：1)混合溶剂(MS)，2)如实施例1中所示制备在混合溶剂中分别包含0.5和2.5mg/mL抗坏血酸的溶液，3)M15(根据实施例20制成的本发明的组合物)，4)M16(根据实施例21制成的本发明的组合物)，和5)LAPS(根据实施例1细节来制备)。
分光光度法：用分光光度计在517nm处使用UV-Vis合适的微孔板一式三份进行吸光度(Abs)读数。
a.置于孔上：样品空白(12.5μL样品或WS 25ppm)；样品(12.5μL样品或25ppm至250ppm的WS)；初始DPPH值(12.5μL无水甲醇)
b.用无水甲醇达到零吸光度。
c.将250μL无水甲醇添加至样品空白孔中。
d.将250μL DPPH*WS添加至DPPH基线和样品孔。
e.记录517nm处的吸光度(初始DPPH Abs)
f.保持静置30分钟(在黑暗中且在室温下)。
g.记录517nm处的吸光度(最终DPPH Abs)。
h.记录吸光度读数(样品的空白Abs)
i.计算样品和Trolox的捕获百分比。
使用参比标准品(Trolox)的曲线和使用分析样品的曲线：制作两条曲线，在纵轴(y)上标绘捕获％并且在横轴(x)上标绘Trolox或分析样品的浓度(分别为TEAC或样品的ppm)的自然对数(Ln)。在每个图中将值50代入(y)轴并且使用通过该图的线性回归获得的方程计算IC50。然后，使用各IC50值计算％AAR。
结果
在图14中可以看出混合溶剂不表现出抗氧化活性。虽然LAPS不含有抗坏血酸，但是由于其酚类化合物的含量，LAPS显示％AAR的值。令人惊讶的是，组合物M15和M16具有比它们的等效抗坏血酸浓度溶液(AA0.5和2.5mg/ml)更好的抗氧化活性。
结论
本发明的组合物增强抗坏血酸的抗氧化特性。
实施例28
组合物的螯合能力
在pH 7.0的混合溶剂(MS)中制备以下溶液。所有溶液均添加有ZnCl2(1ppm)、CaCl2(100ppm)和MgCl2(25ppm)。这里使用的Zn、Ca和Mg的浓度接近于在来自慢性伤口的渗出液中通常发现的浓度。为反应选择的pH(7.0)由本发明的组合物(pH 5.5)与来自慢性伤口的渗出液(pH 8.5)的组合产生。制备的溶液为：EDTA(0.25、0.50和0.75mg/ml)，如实施例1中所示；根据实施例18至21来制成M0、M13、M15和M16。并且将LAPS脱蛋白：对根据实施例1获得的LAPS 24h样品，使用所采用的商业化试剂盒的试剂和说明来进行脱蛋白过程。
制备的溶液中剩余钙(未螯合)的测量：使用商业化钙测量试剂盒(Wiener Lab)。这是一种基于钙与邻甲酚酞络合酮(o-CPC)在碱性pH下反应得到在570nm处可通过光比色法测量的品红色络合物的比色法。
制备的溶液中剩余锌(未螯合)的测量：使用商业化锌测量试剂盒(Randox Lab)。这是一种基于锌与丁二酮肟和水杨醛肟在碱性pH下反应得到在560nm处可通过光比色法测量的有色络合物的比色法。
为了测定LAPS中的锌，预先的脱蛋白步骤是必要的。因此，将等份的LAPS和脱蛋白试剂(三氯乙酸370mmol/L)在锥形管中混合、均质化并且以10,000×g离心10min。将上清液用于试验。
结果
图15显示即使在使用锌、钙和镁的组合时，EDTA也能够在所有试验浓度下完全螯合锌。即使在使用锌、钙和镁的组合时，EDTA也能够在0.50、0.75和1.00mg/ml的浓度下完全螯合钙。然而，0.25mg/ml的EDTA无法螯合所有可获得的钙。M0不含有EDTA，但是仍然对钙和锌二者显示螯合活性。与单独的等效浓度的EDTA相比，包含0.25mg/mL的EDTA的M15失去钙螯合能力(虽然不是锌螯合能力)。相比之下，分别包含0.50mg/ml和0.75mg/mL的EDTA的M13和M16与它们单独的EDTA等效物相比保留了最大螯合能力。与同样不具有锌螯合能力的LAPS相比，所有混合物均显示优异的螯合能力。
结论
组合物具有独立于EDTA的螯合能力。令人惊讶的是，组合物的组分提高了EDTA的螯合能力。
实施例29
提高和及时保持来自组合物的DNAse活性
DNAse琼脂为包含高度聚合的DNA和作为固化剂的琼脂的培养基。DNA为水解DNA的脱氧核糖核酸酶(DNAse)的底物(substratum)。该培养基允许检测不同样品和微生物中的DNAse活性。添加1N盐酸可以观察到酶的存在。水解的脱氧核糖核酸呈透明而聚合的脱氧核糖核酸产生沉淀导致培养基上的不透明。
板制备：根据制造商(Britania，CABA，Argentina)的建议来制备DNAse琼脂板。采用体积为20mL的熔融培养基，在板中达到琼脂高度为2mm。使用无菌冲头在琼脂上制成直径为5mm的孔。因此，每孔的接种体积为π×r2×h＝π×(2.5mm)2×2mm＝40mm＝40μL。
校准曲线：采用rh-链道酶α溶液(Roche，Basel，Switzerland)，在混合溶剂中以如下浓度进行稀释：C1(0.1μg/ml)；C2(0.97μg/ml)；C3(2.0μg/ml)；4(3.90μg/ml)；C5(8.0μg/ml)；C6(10.0μg/ml)；C7(100.0μg/ml)y C8(1000μg/ml)。
分析样品：在25℃和4℃下储存的LAPS、M0、M13、M15、M16(均用羟乙基纤维素胶凝)。每周测量一次DNAse活性，持续6个月。如实施例1中所示制备LAPS并且根据实施例22至25来制成本发明的组合物。
在DNAse琼脂板上接种：一式两份接种校准曲线的点和不同胶凝样品6个月。
温育：32℃下24小时(人的正常皮肤温度)
显示：添加足量的HCl(1M)将板淹没以覆盖整个板的表面。然后，在添加HCl之后，将板静置并且观察至多不超过5分钟。测量DNAse活性，分析接种区周围的透明消失，以毫米记录晕圈直径。
结果
图16显示本发明的组合物中的DNAse活性保持长达6个月，而LAPS在小于2个月内失去其酶活性。
如图17所示，本发明的组合物与它们的仅DNAse的等效溶液相比具有更高的酶活性。例如，DNAse浓度为0.97μg/ml的M0和M13显示13-15mm的晕圈而单独的0.97μg/ml的DNAse浓度(C2)显示8-10mm的晕圈。此外，DNAse浓度为3.90μg/ml的M15和M16显示17-20mm的晕圈而单独的3.90μg/ml的DNAse浓度(C4)显示13-15mm的晕圈。这证实了本发明的组合物中链道酶α的增强的DNAse活性。
结论
组合物的组分提高了链道酶α的DNAse活性并且允许延长酶活性的时间。
实施例30
组合物的血管生成能力
血管生成是涉及从现存的脉管系统生成新血管的复杂的生物学过程。该过程涉及数种不同细胞类型的合作，并且特别是涉及活化的内皮细胞的增殖、存活和组织侵袭。大多数血管生成的研究包括至少一项体内研究。鸡胚绒毛尿囊膜试验(CAM)适于各种各样的应用。在该试验中，测试了不同浓度的乙琥胺和乳酸以及混合物的血管生成特性。
材料和方法
使用重量在30-90g之间的鸡蛋商业品系。通过使用卵镜(ovoscope)，确定绒毛尿囊膜的活力，从而仅选择受精且有活力的鸡蛋。
过程：在将鸡蛋置于孵化器中之前，将它们用聚维酮碘消毒，并且在温育的第6天至第9天，在卵镜下观察鸡胚以确定活力和控制年龄。此后，对气囊(air chamber)进行标识，并且小心地打碎和修剪蛋壳，以利于内部卵壳膜的暴露。将膜用2mL 37℃下的NaCl(0.9％)润湿。随后倾倒盐水溶液，并且用镊子将卵壳膜小心地除去，从而获得下层的绒毛尿囊膜。丢弃绒毛尿囊膜受损(存在出血或任何其它损伤)的鸡蛋。
然后，将300μl以下溶液缓慢地置于绒毛尿囊膜上：乙琥胺3.0mg/ml；乙琥胺0.5mg/ml；M0；M13；M15；LAPS；阴性对照(PBS)。一式三份对各溶液进行评价。
如实施例1中所示获得乙琥胺溶液和LAPS，同时根据实施例18至21来制成本发明的组合物。
用透明膜覆盖鸡蛋，并且在应用后5分钟、24小时、48小时和72小时拍摄照片。
血管生成试验：通过使用软件Image J plus来进行数字图像分析。在溶液添加之前(基础(basal))以及24小时和48小时之后评价每CAM面积(cm2)的血管形成长度(cm)。然后，计算血管形成增加的百分比。
结果
图18示出在存在LAPS、乙琥胺的不同溶液、M0、M13和M15的情况下血管形成的动力学。如可以看到的，LAPS不显示血管生成效果。乙琥胺显示血管生成特性，尽管其在0.5mg/ml下比3.0mg/ml更好。与具有相同浓度的乙琥胺的溶液相比，混合物M0、M13和M15显示提高的血管生成效果。
结论
本发明的组合物令人惊讶地增强了乙琥胺的血管生成能力。
实施例31
用乙琥胺调节血管内皮生长因子(VEGF)表达
材料和方法
按照美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD，USA)的方案，使用最低必需培养基(MEM)、胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺使细胞系生长并且维持细胞系。
为了评价VEGF基因的表达，使用以下细胞系：
a.鼠巨噬细胞系J774(ATCC)，用25ng/mL的来自大肠杆菌(L-8274，Sigma)的脂多糖(LPS)刺激。
b.成人皮肤角质形成细胞系HaCaT(ATCC)。
将细胞用不同浓度下的乙琥胺铺板24小时以评价它们对基因表达的影响。
使用J774巨噬细胞系和HaCaT角质形成细胞的单层，直至获得汇合细胞，在12孔板中，如实施例1中所示用0.5mg/ml和3.0mg/ml的乙琥胺刺激所述汇合细胞，最终体积为300μL/孔。对于J774巨噬细胞系，所有处理均补充有LPS(25ng/mL)，使用具有LPS(25ng/mL)的MEM 1×作为对照(对照+LPS)。在具有10％FBS的MEM中用不同浓度的乙琥胺处理HaCaT角质形成细胞，使用1×MEM作为对照。
将板在37℃下、在含有5％CO2的湿润气氛中温育24小时。对于各实验的各细胞系，准备一式三份板。
对于各样品，使用StepOnePlus实时PCR系统(Applied Biosystems)和Power UpSYBR Green Master Mix(ROCHE)试剂盒一式三份测量VEGF和GAPDH mRNA的水平。VEGF和GAPDH的引物序列为：对于VEGF为5'-ACCTCCACCATGCCAAGT-3'(正义)和5'-TTGGTCTGCATTCACATCTG-3'(反义)，并且对于GAPDH为5'-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3'(正义)和5'-CCCTGTTGCTGTAGCCAAAT-3'(反义)。对于各样品，将VEGF的平均值标准化为平均GAPDH值。对于各实验，确定组平均值并且相对于MEM组进行标准化。
结果和讨论
结果，在巨噬细胞和角质形成细胞二者中均诱导VEGF表达水平。VEGF表达的诱导水平在巨噬细胞中在乙琥胺为0.5mg/ml时出现(图19)并且在角质形成细胞中在3.0mg/ml时出现(图19)。
在正常愈合过程的增殖阶段期间，发生血管生成，允许在血管生成生长因子例如VEGF(血管内皮生长因子)的调节下在受伤区域重建新血管(43，44)。在慢性伤口中，VEGF倾向于显示降低的或缺失的水平(45)，并且，由于低活性，这是伤口的血管形成不足的一个可能原因(46)。VEGF通过VEGFR-1刺激巨噬细胞摄取凋亡细胞(46，47)。如果这发生在愈合期间，巨噬细胞中VEGF的表达增加有助于炎症的消退(46)并且有利于向愈合的增殖阶段发展。
角质形成细胞也是伤口愈合期间VEGF的主要来源之一(46，48)。由表皮角质形成细胞产生的VEGF通过调节下层真皮内血管中的内皮细胞起作用(46)。因此，角质形成细胞中VEGF的表达增加刺激血管生成。
结论：乙琥胺引起巨噬细胞和角质形成细胞中VEGF的表达增加。
实施例32
组合物的伤口愈合效果(49)
动物：使用Wistar/Cmedc品系的42只雄性大鼠，8-10周龄，分成7个实验组，每组6只动物(A、B、C、D、E、F和G组)。
切除伤口模型(50)：手术由麻醉动物和准备手术区域开始。为此，清洗经剃毛的背部皮肤并且用聚维酮碘和70°乙醇溶液消毒。随后，使用无菌的、直径5mm的活检穿孔器，在背侧胸部上形成两个伤口(伤口1，对应于动物的左侧，和伤口2，对应于动物的右侧)，切开皮肤和肉质圆锥花序(fleshy panicle)。此后，将粘合剂氰基丙烯酸酯(TegadermTM3M)置于各硅酮环上并且粘附至皮肤，注意环的内部有切口。当粘合剂固定皮肤和硅酮环时，对皮肤进行五次简单的缝合，在硅酮环的外部对其进行打孔以使用聚丙烯缝合线固定位置。手术后和动物恢复期间，放置伊丽莎白项圈(Elizabethan collar)，从而防止动物将硅酮环取下。
伤口床中细菌定植的评价：为了估计总的非特定细菌载量(unintentionalbacterial load)，对来自各实验组的一只动物的伤口1进行拭子采样。将获得的样品置于包含10mL无菌1×PBS的试管中，并且通过连续稀释和在用于平板计数的琼脂(APC)上铺板来确定总细菌载量。在37℃下温育24h之后，计算CFU/伤口。
感染金黄色葡萄球菌ATCC 29213以模拟慢性伤口的情况：在所有实验组的动物中均在两个伤口中局部接种。接种物为10μl金黄色葡萄球菌ATCC29213的细菌悬液，在无菌1×PBS中调整至McFarland的0.5级(相当于1.5×108CFU/ml)。因此，在各伤口中获得的最终细菌浓度为1.5×106总CFU。
治疗：每组中所有动物的两个伤口均用以下羟乙基纤维素胶凝组合物进行局部治疗：A组(M0)、B组(M13)、C组(M15)、D组(M16)、E组(LAPS)、F组(混合溶剂)和G组(未经治疗的对照)。第一次给药在感染后48h进行，然后每天应用一次直至试验结束。在应用相应的受试物质之前，使用拭子和无菌生理溶液来清洁动物的伤口。直至第7天，对各伤口给予20μl各受试物质组合物，从第8天起将剂量减少至10μl。
根据实施例22至25来制成本发明的组合物(M0、M13、M15和M16)。
动物的观察和监测：每天评价动物的临床体征、行为和体重的变化。此外，每3至5天，使用Olympus Stylus SZ-15数码照相机对伤口进行拍照并且使用Image ProPlus 6.0程序对它们的面积进行定量。
尸检：当未治疗的对照组的伤口达到40％愈合时(手术后第6天左右)，将所有实验组的动物1、3和5处死。当未治疗的对照组的伤口达到约80％愈合时(手术后第10天左右)，将所有实验组的动物2、4和6处死。在终点，使来自对照组的动物安乐死。
组织病理学：在各组的动物2、4和6的皮肤样品中，通过对用Masson's三色染色的组织学图像进行数字化分析来确定上皮形成和胶原蛋白生成。
免疫组化：对组织切片进行免疫组化技术以检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)。使用单克隆抗体(小鼠抗-α-SMA-克隆αsm-1Novocastra，NCL-SMA)，使用pH 6的柠檬酸盐缓冲液在微波中进行抗原复苏(antigenic recovery)，并且显示与链霉亲和素过氧化物酶系统的反应。
结果
图20示出在不同组的被治疗动物中应用治疗24h时伤口闭合的百分比。在感染后24h对组合物(M0、M13、M15和M16)进行测试。通过使用软件Image ProPlus 6.0分析照片来测量伤口区域闭合的百分比。相对于未治疗的对照，用M0和M13(含有乙琥胺3.00mg/ml)、M15(含有乙琥胺0.5mg/ml)和M16(含有乙琥胺30.0mg/ml)治疗的动物显示更高的愈合百分比。
Figure BDA0003532486030000801
表2：使用Abramov评分作为组织病理学分级来评价胶原化。MS＝混合溶剂；LAPS＝植物乳杆菌上清液；M＝混合物。
在所有实验组(未治疗的对照、MS、LAPS、M0、M13、M15和M16)的动物中用Masson's三色染色来评价胶原蛋白的存在。用于评估胶原化的组织病理学分级为Abramov评分体系，改编自Nisbet等人(2010)，其中将胶原蛋白的量分级为：0＝没有胶原蛋白、1＝缺乏、2＝中等和3＝丰富。每只动物的两个伤口均用5个高放大倍率视野(400×)从表皮观察至真皮进行研究。(Nisbet等人，2010.Effect of three types of honey on cutaneous woundhealing.Wounds 22:11；275-283)。
Ajwee等人(2012)Ajwee DM等人(2012)，Ethosuximide and phenobarbitalpromote wound healing via enhancing collagenization.Chemical Biology&DrugDesign,79(1),137-142将乙琥胺(Etho)应用于大白鼠模型的切除伤口。他们证实了在软石蜡中的含有乙琥胺的软膏10％w/w(80mg/ml)通过增强胶原化显著地促进伤口愈合。本专利的发明人也将与其它组分(M0、M13、M15和M16)组合的乙琥胺应用于作为感染有金黄色葡萄球菌的切除伤口模型的Wistar大鼠。本发明的组合物使得获得相似或更好的胶原化结果，但是在感染伤口中使用少量的乙琥胺(0.5至30mg/ml)。可以在下表中看到来自两个试验的结果。Ajwee等人一列中的数据是从其论文中摘录的并且通过使用软石蜡密度值将10％w/w的乙琥胺浓度转换为80mg/ml。
Figure BDA0003532486030000811
表3
研究了α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达作为与愈合过程相关的血管的肌层和肌成纤维细胞的特定标志物。肌成纤维细胞是特化的可收缩成纤维细胞，其在伤口闭合和组织挛缩中至关重要。α-SMA的表达在照片(图21)中显示为棕色。棕色的量和强度越大意味着α-SMA表达越多。在手术后7天(试验的第一个终点)，未处理的对照(图21G)和用混合溶剂(MS)凝胶处理的组(图21F)仅显示血管中的α-SMA表达。LAPS轻微地提高肌成纤维细胞中的α-SMA表达(图21E)。另一方面，经组合物处理的伤口显示与其组分的浓度成正比的α-SMA表达。例如，M0和M15显示中等表达(图21C)，M13显示高表达(图21B)并且M16显示非常高的表达(图21D)。
结论：本发明的组合物加速愈合过程，同时还刺激胶原蛋白和α平滑肌肌动蛋白产生，达到同时杀菌的效果。
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Claims (36)

1.一种用于局部伤口治疗的药物组合物，其包含：
·一种或多种具有酰亚胺基团的5个或6个原子的含氮杂环化合物；
·一种或多种活性pH在4.5和6.5之间的脱氧核糖核酸酶；和
·一种或多种羧酸。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述具有酰亚胺基团的5个或6个原子的含氮杂环化合物包括选自由乙琥胺、巴比妥酸、苯巴比妥、5,5-二乙基巴比妥酸、5-乙基-5-(1-甲基丁基)巴比妥酸、戊巴比通、戊巴比妥、耐波他、5-乙基-5-(1-甲基丙基)巴比妥酸、正丁巴比妥、仲丁巴比妥、5-烯丙基-5-(1-甲基丁基)-巴比妥酸、司可巴比妥、速可眠、苯妥英、乙内酰脲、及其混合物组成的组中的具有酰亚胺基团的5个或6个原子的含氮杂环化合物。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述脱氧核糖核酸酶包括选自由DNase、rh-链道酶α、牛胰腺DNase I、DNase II、原核DNase II或真核DNase II、DNase IIα、DNase IIβ、猪脾DNase II、及其混合物组成的组中的脱氧核糖核酸酶。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述羧酸包括选自由柠檬酸、乳酸、乙酸、甲酸、苹果酸、酒石酸、水杨酸、草酸、苯甲酸、丙酸、及其混合物组成的组中的羧酸。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其包含：
·约0.5至约50mg/ml的一种或多种具有酰亚胺基团的5个或6个原子的含氮杂环化合物；
·约0.5至约4000μg/ml的一种或多种脱氧核糖核酸酶；
·约1至约15mg/ml的一种或多种羧酸。
6.根据权利要求1所述的药物组合物，其进一步包含一种或多种选自由聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯60、脱水山梨糖醇三硬脂酸酯、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、辛苯醇醚-9、壬苯醇醚-9、及其混合物组成的组中的表面活性剂。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其包含约5mg/ml以下的所述表面活性剂。
8.根据权利要求1所述的药物组合物，其进一步包含一种或多种选自由乙二醇四乙酸、乙二胺四乙酸、二巯基琥珀酸、2,3-二巯基-l-丙磺酸、硫辛酸(1,2-二硫醇-3-戊酸)、草酸、及其混合物组成的组中的形成络合物的酸。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其包含约1mg/ml以下的所述形成络合物的酸。
10.根据权利要求1所述的药物组合物，其进一步包含一种或多种选自由尿酸、抗坏血酸、硫辛酸、及其混合物组成的组中的亲水性还原酸。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其包含约3mg/ml以下的所述亲水性还原酸。
12.根据权利要求1所述的药物组合物，其进一步包含一种或多种选自由纤维素、纳米晶纤维素、细菌纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、微晶纤维素、羧甲基纤维素、卡波姆、及其混合物组成的组中的胶凝剂。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，其包含约25mg/ml以下的所述胶凝剂中的一者。
14.根据权利要求1所述的药物组合物，其进一步包含选自由以下组成的组中的溶液：乙酸0.2M/乙酸钠0.2M：比率2.78％至0.66％(v/v)pH＝4.2至4.8；乙酸0.10M/乙酸钠0.01M：比率1.05％至10.05％(v/v)pH＝5.6；磷酸二氢钾0.05M pH＝4.5；磷酸二氢钾0.36M/磷酸二钠0.07M：比率4.92％至0.98％(p/v)pH＝5.7；磷酸二氢钾0.36M/磷酸二钠0.10M：比率4.92％至1.49％(p/v)pH＝6.0；柠檬酸0.31M/磷酸二钠0.20M：比率2.99％至1.42％(p/v)pH＝5.8；柠檬酸0.10M/柠檬酸钠0.03M：比率1.92％至0.77％(p/v)pH＝5.8；索伦森磷酸盐缓冲液：磷酸二氢钠0.2M/磷酸二钠2.3M：比率1.2％至16.33％(p/v)pH＝5.8；汉克平衡盐溶液(HBSS)：氯化钠0.14M(0.800％)、氯化钾5mM(0.040％)、氯化钙1mM(0.014％)、七水硫酸镁0.4mM(0.010％)、六水氯化镁0.5mM(0.010％)、磷酸二钠二水合物0.3mM(0.006％)、磷酸二氢钾0.4mM(0.006％)、葡萄糖6mM(0.100％)、碳酸氢钠4mM(0.035％)：pH＝5.7；4-(2-羟乙基)-l-哌嗪乙磺酸(HEPES)1M(pH＝6.5)；2-(N-吗啉代)乙磺酸钠盐、4-吗啉乙磺酸(MES钠盐)0.5M(pH 5.5-6.7)；N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸钠盐(BES)0.5M(pH＝6.0)；N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(ACES)0.5M(pH＝6.0)；2,2’-[(2-氨基-2-氧代乙基)亚氨基]二乙酸(ADA)0.2M(pH＝6.0)；哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸)(PIPES)0.5M(pH＝6.0-6.8)；3-吗啉代-2-羟基丙磺酸(MOPSO)0.2M(pH＝6.0)；盐水溶液(0.9％)/MgCl2(5mM)，pH 5.5；1M NaHCO3溶液、及其组合。
15.根据权利要求1所述的药物组合物，其中：
所述一种或多种具有酰亚胺基团的5个或6个原子的含氮杂环化合物包括乙琥胺；
所述一种或多种活性pH在4.5和6.5之间的脱氧核糖核酸酶包括重组人链道酶-α；
所述一种或多种羧酸包括乳酸。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其进一步包含：
一种或多种亲水性还原酸；
一种或多种表面活性剂；
一种或多种形成络合物的酸；
一种或多种胶凝剂；和
溶液。
17.根据权利要求1所述的药物组合物，其中：
所述具有酰亚胺基团的5个或6个原子的含氮杂环化合物包括乙琥胺；
所述脱氧核糖核酸酶包括重组人链道酶-α；
所述羧酸包括乳酸，
并且进一步包含：
抗坏血酸；
聚山梨醇酯-80；
乙二胺四乙酸；
羟乙基纤维素；和
pH为5.5的包含0.9％盐水溶液和5mM MgCl2的溶液。
18.根据权利要求1所述的药物组合物，其pH在4.5和6.8之间。
19.根据权利要求1所述的药物组合物，其包含以下物质的水溶液：
约0.5至约30mg/ml的乙琥胺、
约1至约4μg/ml的重组人链道酶-α、
约1至约9mg/ml的乳酸，
并且其中所述药物组合物进一步包含：
约2.5mg/ml以下的抗坏血酸、
约3mg/ml以下的聚山梨醇酯-80、
约0.75mg/ml以下的乙二胺四乙酸、
约17mg/ml以下的羟乙基纤维素。
20.根据权利要求1所述的药物组合物，其包含：
约0.5至约3mg/ml的乙琥胺、
约0.97至约3.9μg/ml的重组人链道酶-α、
约1.6至约8.7mg/ml的乳酸，
并且其中所述药物组合物进一步包含：
约2.5mg/ml以下的抗坏血酸、
约3mg/ml以下的聚山梨醇酯-80、
约0.75mg/ml以下的乙二胺四乙酸、
约17mg/ml以下的羟乙基纤维素。
21.一种用于局部伤口治疗的药物制剂试剂盒，其包括用于在使用前混合以获得药物组合物的第一组合物和第二组合物，其中：
a.所述第一组合物为固体并且包含脱氧核糖核酸酶和胶凝剂粉末；和
b.所述第二组合物为包含至少一种具有酰亚胺基团的5个或6个原子的含氮杂环化合物和至少一种羧酸的水性液体；和
c.所述第二组合物的pH在4.5和6.8之间。
22.一种用于局部伤口治疗的药物制剂试剂盒，其包括用于在使用前混合以获得药物组合物的第一组合物、第二组合物和第三组合物，其中：
a.所述第一组合物为固体并且包含胶凝剂粉末；
b.所述第二组合物为固体并且包含脱氧核糖核酸酶；和
c.所述第三组合物为包含至少一种具有酰亚胺基团的5个或6个原子的含氮杂环化合物和至少一种羧酸的水性液体；和
d.所述第三组合物的pH在4.5和6.8之间。
23.根据权利要求21所述的药物制剂试剂盒，其中所述第一组合物、第二组合物和第三组合物中的每一者均容纳在密封且独立的容器中。
24.根据权利要求22所述的药物制剂，其中所述第一组合物、第二组合物和第三组合物中的每一者均容纳在密封且独立的容器中。
25.一种用于制备根据权利要求21所述的药物制剂的方法，其包括：
a.使所述第一组合物与所述第二组合物接触；
b.混合并且振摇以获得凝胶药物组合物。
26.一种用于从包含在使用前混合的第一组合物、第二组合物和第三组合物的药物制剂来制备权利要求12的组合物的方法，其中所述第一组合物为固体并且包含胶凝剂粉末，所述第二组合物为固体并且包含脱氧核糖核酸酶，并且所述第三组合物为包含至少一种具有酰亚胺基团的5个或6个原子的含氮杂环化合物和至少一种羧酸的水性液体，并且所述第三组合物的pH在4.5和6.8之间，所述方法包括：
a.使所述第三组合物与所述第二组合物接触；
b.将所述第三组合物与所述第二组合物混合并且振摇以形成混合物(b)；
c.使所述第一组合物与所述混合物(b)接触以形成混合物(c)；
d.混合并且振摇以获得凝胶药物组合物。
27.一种用于治疗哺乳动物的伤口的方法，其包括每天至少一次将根据权利要求1所述的药物组合物施用于所述伤口。
28.一种用于治疗哺乳动物的伤口的方法，其包括每天至少一次将根据权利要求21所述的药物制剂施用于所述伤口。
29.一种用于治疗哺乳动物的伤口的方法，其包括每天至少一次将根据权利要求22所述的药物制剂施用于所述伤口。
30.根据权利要求27所述的方法，其中所述伤口为选自由糖尿病足部溃疡、静脉性溃疡、动脉性溃疡、压疮、特征在于被形成生物膜的细菌重复感染的机械性伤口、特征在于被形成生物膜的细菌重复感染的术后伤口、及其组合组成的组中的伤口。
31.根据权利要求28和29所述的方法，其中所述伤口为选自由糖尿病足部溃疡、静脉性溃疡、动脉性溃疡、压疮、特征在于被形成生物膜的细菌重复感染的机械性伤口、或特征在于被形成生物膜的细菌重复感染的术后伤口、及其组合组成的组中的伤口。
32.一种包括根据权利要求21所述的药物制剂试剂盒的装置，其包括：
包含第一组合物的第一容器、和
包含第二组合物的第二容器，
其中所述第一容器和所述第二容器由能够保持所述第一组合物与所述第二组合物隔离的可塌缩膜隔开。
33.一种包括根据权利要求22所述的药物制剂试剂盒的装置，其包括：
包含第一组合物的第一容器、
包含第二组合物的第二容器、和
包含第三组合物的第三容器；
其中：
所述第一容器和所述第二容器由能够保持所述第一组合物与所述第二组合物隔离的第一可塌缩膜隔开；并且
所述第二容器和所述第三容器由能够保持所述第二组合物与所述第三组合物隔离的第二可塌缩膜隔开。
34.一种用于生产根据权利要求1所述的药物组合物的方法，其包括：
a.在溶液中混合具有酰亚胺基团的5个或6个原子的含氮杂环化合物、脱氧核糖核酸酶和羧酸，由此形成混合物；
b.向所述混合物中滴加碱性溶液直至所述混合物的pH在4.50和6.50之间，由此形成pH经调节的混合物；和
c.将所述pH经调节的混合物灭菌。
35.根据权利要求34所述的方法，其进一步包括以下步骤：
d.添加胶凝剂。
36.根据权利要求34所述的方法，其进一步包括以下步骤：
e.添加形成络合物的酸、表面活性剂和亲水性还原酸。
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