KR20220079258A - Immunity-enhancing composition comprising placenta fermented product as an active ingredient and manufacturing method thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 면역 조절능을 가지는 세포 독성이 감소된 양태반 발효 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 데케라 디아민(Dekkera deamine) 효모 균주를 이용하여 발효시킨 양태반 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 데케라 디아민(Dekkera deamine) 효모 균주로 발효시키는 최적의 공정을 통해 양태반의 이취를 제거하고 면역을 증진시킬 수 있다는 사실을 확인하였다.
따라서 본 발명에 따라 제조된 양태반 발효물은 식품 또는 건강기능성 식품 원료, 화장품 원료, 사료 원료 등으로 다양하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.The present invention relates to a placental fermented composition with reduced cytotoxicity and immunomodulatory activity and a method for preparing the same, and more particularly, to a placenta composition fermented using a Dekkera deamine yeast strain and a method for preparing the same is about According to the present invention, it was confirmed that it is possible to remove the off-flavor of the placenta and enhance immunity through the optimal process of fermentation with a decera diamine ( Dekkera deamine ) yeast strain.
Therefore, it is expected that the fermented placenta prepared according to the present invention can be variously used as food or health functional food raw material, cosmetic raw material, feed raw material, and the like.
Description
본 발명은 양태반 발효 조성물의 면역 조절 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 효모 균주를 이용하여 발효시킨 양태반 발효 조성물의 면역 조절 용도에 관한 것이다.The present invention relates to the use of a placenta fermentation composition for immunomodulating, and more particularly, to the use of the placenta fermentation composition fermented using a yeast strain for immunomodulating.
최근 건강에 대한 관심이 증대되고 사람들의 기호가 다양해지면서 기능성은 좋으나 물질 자체의 이취 등으로 인하여 사용에 제한이 있는 물질에 대하여 사용상 한계를 극복하기 위한 다양한 시도가 행해지고 있다.Recently, as interest in health has increased and people's preferences have been diversified, various attempts are being made to overcome the limitations in use of substances that have good functionality but are restricted in use due to the odor of the substance itself.
그 예로, 양의 태반인 양태반은 사람의 태반과 분자 구조가 유사해 인체에 부담이 가거나 유해하지 않으며, 피부미용 및 노화방지 등의 효과로 주목 받고 있어 건강기능성 식품 원료, 화장품 원료 등으로 그 이용이 점차 늘고 있다. 구체적으로, 양태반은 85%가 단백질 성분으로 구성되어 있는데, 이는 닭 가슴살의 약 3배, 두부의 약 6배, 우유의 약 18배이며, 양태반에는 17종의 아미노산이 함유되어 있고 특히 이 중 40%가 체내에서 합성할 수 없어 음식으로 섭취해야 하는 필수 아미노산으로 구성되어 있다. 또한, 양태반에는 콜라겐, 엘라스틴, 히알루론산, 비타민 등 피부 미용에 유용한 성분들이 다량 함유되어 있으며, UVB에 의한 콜라겐, 엘라스틴, 피브릴린-1(fibrillin-1)의 발현 감소를 유의적으로 억제하고 피부의 수분 함량을 증가시킨다고 보고되어 있는 등 피부 세포를 건강하게 유지해주는 기능이 있어 최근 화장품 소재로 각광받고 있다(한국식품영양과학회, Vol 48 No.1, 2019, 18-23). 더욱이, 양태반에는 면역력을 조절하고 상처 치료와 세포 재생에 필요한 성장인자가 풍부하며, 인터루킨(Interleukin)이 포함되어 있어 면역기능을 향상시키는 효과가 있다.For example, placenta, a sheep placenta, has a similar molecular structure to that of a human, so it is not burdensome or harmful to the human body. use is gradually increasing. Specifically, the placenta consists of 85% protein, which is about 3 times that of chicken breast, about 6 times that of tofu, and about 18 times that of milk. 40% of it is composed of essential amino acids that the body cannot synthesize and must be obtained from food. In addition, the placenta contains a large amount of ingredients useful for skin care, such as collagen, elastin, hyaluronic acid, and vitamins, and significantly inhibits the decrease in the expression of collagen, elastin, and fibrillin-1 caused by UVB. and has been reported to increase the moisture content of the skin, and has recently been spotlighted as a cosmetic material because it has the ability to keep skin cells healthy (Korean Society for Food and Nutrition,
이러한 다양한 효과가 있는 양태반은 현재 호주에서 생산되어 국외에서 식품 원료로 사용되고 있으며, 국내에서는 기능성 식품의 원료로 사용되고 있다. 그러나 양태반은 상기와 같은 효과에도 불구하고 세포독성이 있고 과도한 면역조절 반응을 보이기에 활용에 어려움이 따른다. 따라서 상기와 같이 양태반의 세포독성을 낮추고 면역조절 효능을 활용 가능한 범위까지 조절할 수 있는 공정의 개발이 필요한 실정이다.Placenta with these various effects is currently produced in Australia and used as a food raw material abroad, and is used as a raw material for functional food in Korea. However, despite the above effects, placenta is cytotoxic and exhibits an excessive immunomodulatory response, so it is difficult to utilize. Therefore, there is a need to develop a process capable of lowering the cytotoxicity of the placenta as described above and controlling the immunomodulatory efficacy to a usable range.
상기와 같은 배경하에, 본 발명자들은 양태반을 면역반응을 조절할 수 있는 조성물을 개발하기 위해 연구 노력한 결과, 양태반을 발효시키는 과정을 통해 세포독성이 낮추고, 면역을 증진시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. Under the above background, the present inventors have made research efforts to develop a composition capable of regulating the immune response of the placenta, and as a result, by confirming that the cytotoxicity can be lowered and immunity can be enhanced through the process of fermenting the placenta. The invention was completed.
이에, 본 발명은 양태반 발효물을 유효성분으로 포함하는, 면역증강용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a composition for enhancing immunity, comprising fermented placenta as an active ingredient.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 상기 조성물의 제조방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.In addition, it is another object of the present invention to provide a method for preparing the composition, comprising the following steps.
(a) 양태반을 준비하는 단계; (b) 상기 양태반에 효모 균주를 첨가하고 발효시키는 단계; 및 (c) 상기 발효물을 수득하는 단계.(a) preparing a placenta; (b) adding a yeast strain to the placenta and fermenting; and (c) obtaining the fermented product.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 양태반 발효물을 유효성분으로 포함하는, 면역증강용 조성물을 제공한다.In order to achieve the object of the present invention as described above, the present invention provides a composition for enhancing immunity, comprising a fermented placenta as an active ingredient.
본 발명의 일구현예로, 상기 양태반 발효물은 데케라 디아민(Dekkera deamine) 효모 균주(기탁번호: KCTC 14262BP)로 발효한 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the placenta fermented product may be fermented with Dekkera deamine yeast strain (Accession No.: KCTC 14262BP).
본 발명의 다른 구현예로,상기 조성물은 IL-10, IL-4, CREB 및 ARG-1으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 mRNA의 발현을 증진시키는 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the composition may enhance the expression of one or more mRNAs selected from the group consisting of IL-10, IL-4, CREB and ARG-1.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 2.5 내지 400μg/mL의 농도일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the composition may have a concentration of 2.5 to 400 μg/mL.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 일산화 질소(Nitric oxide)의 분비를 증진시키는 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the composition may be to enhance the secretion of nitric oxide.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 상기 조성물의 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for preparing the composition comprising the following steps.
(a) 양태반을 준비하는 단계; (b) 상기 양태반에 효모 균주를 첨가하고 발효시키는 단계; 및 (c) 상기 발효물을 수득하는 단계.(a) preparing a placenta; (b) adding a yeast strain to the placenta and fermenting; and (c) obtaining the fermented product.
본 발명의 일구현예로, 상기 효모 균주는 데케라 디아민(Dekkera deamine) 효모 균주(기탁번호: KCTC 14262BP)일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the yeast strain may be a dekera diamine ( Dekkera deamine ) yeast strain (Accession No.: KCTC 14262BP).
본 발명에 따르면 양태반을 효모 균주를 활용하여 발효하는 경우, 기존의 양태반에 비해 세포독성이 낮고 적절한 면역증진 효과를 가지는 발효 조성물을 제조할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 양태반 발효물은 식품 또는 건강기능성 식품 원료, 화장품 원료, 사료 원료 등으로 다양하게 이용될 수 있으며, 면역 관련 치료제 분야 등에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.According to the present invention, when placenta is fermented using a yeast strain, it is possible to prepare a fermented composition having low cytotoxicity and an appropriate immune enhancing effect compared to conventional placenta. Therefore, the fermented placenta according to the present invention can be variously used as food or health functional food raw material, cosmetic raw material, feed raw material, etc., and is expected to be utilized in the field of immune-related therapeutics.
단, 본 발명의 효과는 상기 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.However, the effect of the present invention is not limited to the above effect, and it should be understood to include all effects that can be inferred from the configuration of the invention described in the detailed description or claims of the present invention.
도 1은 양태반의 이취를 억제하기 위한 최적의 제조 조건을 찾기 위해 관능평가를 수행한 결과이다.
도 2는 본 발명의 양태반 발효 조성물(SPF)을 Raw264.7 세포에 처리했을 때, 일산화 질소(NO)의 분비능을 확인하기 위해 SPF 처리시의 NO 분비 수준을 양태반(SP) 및 LPS와 비교 분석한 결과로서, 도 2a는 2.5 내지 50μg/mL의 SP 및 SPF를 처리했을 때 NO 분비 수준 대조군 및 양성 대조군(LPS 처리군)과 비교하여 나타낸 것이고, 도 2b는 50 내지 400μg/mL의 SP 및 SPF를 처리했을 때 NO 분비 수준을 대조군 및 양성 대조군(LPS 처리군)과 비교하여 나타낸 것이며, 도 2c는 2.5 내지 500μg/mL에서 SPF를 처리했을 때 NO 분비 수준을 대조군 및 양성 대조군(LPS 처리군)과 비교하여 나타낸 것이다.
도 3은 무처리 대조군, 양성 대조군(LPS 처리군)과 본 발명의 양태반 발효 조성물(SPF)의 시간에 따른 일산화 질소(NO)의 분비능을 확인한 것으로서, SPF의 농도를 2.5, 40, 400μg/mL으로 처리하면서 시간에 흐름에 따른 NO의 분비를 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 양태반 발효 조성물(SPF)을 Raw264.7 세포에 처리했을 때, 세포 생존율을 비교분석하기 위해 무처리 대조군, LPS(1μg/mL) 처리한 양성 대조군과 농도를 달리한 양태반 처리군(Sheep placenta) 및 본 발명의 양태반 발효 조성물(SPF)을 처리하면서 MTT assay를 수행한 결과로서, 도 4a는 2.5 내지 50μg/mL의 농도에서, 도 4b는 50 내지 400μg/mL의 농도에서, 4c는 2.5 내지 500μg/mL의 농도에서 세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 5는 Raw264.7 세포에 무처리 대조군, 양성 대조군(LPS 처리군) 및 본 발명의 양태반 발효 조성물(SPF)(200, 400μg/mL)을 처리한 다음, Live/Dead Staining을 수행한 결과이다.
도 6은 본 발명의 양태반 발효 조성물(SPF)을 Raw264.7 세포에 처리했을 때, 시간의 흐름에 따른 세포 생존율을 비교분석하기 위해 무처리 대조군, LPS(1μg/mL) 처리한 양성 대조군 및 본 발명의 양태반 발효 조성물(SPF)를 처리하면서 시간의 흐름에 따른 세포 생존율을 확인한 것으로서, SPF를 2.5, 40, 400μg/mL의 농도로 처리한 다음 30시간 및 48시간이 경과한 다음 세포 사진을 촬영한 결과이다.
도 7은 Raw264.7 세포에 1μg/mL 농도의 LPS 및 2.5, 40, 400μg/mL 농도의 SPF를 처리했을 때, 대식세포로의 분화 여부를 관찰한 결과이다.
도 8은 Raw264.7 세포에 1μg/mL 농도의 LPS 및 2.5, 40, 400μg/mL 농도의 SPF를 처리한 다음 면역과 관련한 사이토 카인의 발현 변화를 확인한 결과로서, 도 8a는 M1 phase와 관련된 사이토카인(iNOS, IL-6, TNF-α, IL-1β)의 발현을 확인한 결과이고, 도 8b는 M2 phase와 관련된 사이토카인(IL-4, IL-10, CREB)의 발현을 확인한 결과이다.
도 9는 balb/C 마우스의 비장세포에 10μg/mL 농도의 Con A와 17.5, 25, 50, 100, 200, 400μg/mL 농도의 본 발명의 양태반 발효물(SPF)을 처리한 다음 WST-1 assay를 통해 세포증식능을 확인한 결과이다.
도 10은 balb/C 마우스의 비장세포에 10μg/mL 농도의 Con A를 처리한 뒤 사이토 카인의 발현 변화를 확인한 결과로서, 도 10a는 M1 phase와 관련되어 있는 IL-6 및 iNOS의 발현을 확인한 결과이며, 도 10b는 M2 phase와 관련되어 있는 IL-10, ARG-1, CREB 및 IL-4의 발현을 확인한 결과이다.
도 11은 balb/C 마우스의 비장세포에 10μg/mL 농도의 Con A 및 본 발명의 양태반 발효물(SPF)을 2.5 및 200μg/mL 농도로 처리한 다음 사이토카인의 발현 변화를 확인한 결과로서, 도 11a는 M1 phase와 관련되어 있는 IL-6, iNOS 및 TNF-α의 발현을 확인한 결과이며, 도 11b는 M2 phase와 관련되어 있는 IL-10, ARG-1, CREB 및 IL-4의 발현을 확인한 결과이다.1 is a result of sensory evaluation to find the optimal manufacturing conditions for suppressing off-flavor of placenta.
Figure 2 is when the placenta fermentation composition (SPF) of the present invention is treated to Raw264.7 cells, the NO secretion level at the time of SPF treatment to confirm the secretion ability of nitric oxide (NO) with placenta (SP) and LPS As a result of comparative analysis, FIG. 2a shows the NO secretion level control and positive control (LPS-treated group) when treated with SP and SPF of 2.5-50 μg/mL, and FIG. 2b shows SP of 50-400 μg/mL. And when SPF was treated, the NO secretion level was compared with the control and positive control group (LPS-treated group), and Figure 2c shows the NO secretion level of the control group and the positive control group (LPS-treated) when SPF was treated at 2.5 to 500 μg/mL. group) compared to
3 is an untreated control, a positive control (LPS-treated group) and the placenta fermentation composition (SPF) of the present invention to confirm the secretion ability of nitric oxide (NO) over time, the concentration of SPF 2.5, 40, 400 μg / This is the result of confirming the secretion of NO over time while processing with mL.
Figure 4 is when the placenta fermentation composition (SPF) of the present invention is treated to Raw264.7 cells, the amount of concentration different from that of the untreated control, LPS (1 μg/mL)-treated positive control for comparative analysis of cell viability As a result of performing the MTT assay while treating the placenta-treated group (Sheep placenta) and the placenta fermentation composition (SPF) of the present invention, FIG. 4a is at a concentration of 2.5 to 50 μg/mL, FIG. 4b is 50 to 400 μg/mL In concentration, 4c is the result of confirming cell viability at a concentration of 2.5 to 500 μg/mL.
Figure 5 shows Raw264.7 cells treated with an untreated control, a positive control (LPS-treated group) and a placental fermentation composition (SPF) (200, 400 μg/mL) of the present invention, followed by Live/Dead Staining. to be.
6 is an untreated control, LPS (1 μg/mL)-treated positive control and Cell viability was confirmed over time while processing the placenta fermentation composition (SPF) of the present invention, and after 30 hours and 48 hours have elapsed after treatment with SPF at concentrations of 2.5, 40, and 400 μg/mL, photographs of cells is the result of taking
7 shows the results of observation of differentiation into macrophages when Raw264.7 cells were treated with LPS at a concentration of 1 μg/mL and SPF at a concentration of 2.5, 40, and 400 μg/mL.
8 is a result of confirming the expression change of cytokines related to immunity after treatment of Raw264.7 cells with LPS at a concentration of 1 μg/mL and SPF at a concentration of 2.5, 40, and 400 μg/mL, FIG. 8a shows cytokines related to the M1 phase It is a result of confirming the expression of kinase (iNOS, IL-6, TNF-α, IL-1β), Figure 8b is a result of confirming the expression of cytokines (IL-4, IL-10, CREB) related to the M2 phase.
9 shows splenocytes of balb/C mice treated with Con A at a concentration of 10 μg/mL and a placental ferment (SPF) of the present invention at a concentration of 17.5, 25, 50, 100, 200, and 400 μg/mL, followed by WST- 1 This is the result of confirming the cell proliferative ability through assay.
10 is a result of confirming the expression change of cytokines after treatment of Con A at a concentration of 10 μg/mL in splenocytes of balb/C mice, FIG. 10 a shows the expression of IL-6 and iNOS related to M1 phase. Results, Figure 10b is the result of confirming the expression of IL-10, ARG-1, CREB and IL-4 related to the M2 phase.
11 is a result of confirming the expression change of cytokines after treating the splenocytes of balb/C mice with Con A at a concentration of 10 μg/mL and the placental ferment (SPF) of the present invention at a concentration of 2.5 and 200 μg/mL, Figure 11a is the result of confirming the expression of IL-6, iNOS and TNF-α related to the M1 phase, Figure 11b is the expression of IL-10, ARG-1, CREB and IL-4 related to the M2 phase This is the confirmed result.
본 발명자들은 상기와 같은 배경하에, 본 발명자들은 양태반을 면역반응을 조절할 수 있는 조성물을 개발하기 위해 연구 노력한 결과, 양태반을 효모 균주로 발효시키는 과정을 통해 세포독성이 낮추고, 면역을 증진시킬 수 있음을 확인하였는바, 이로써 본 발명을 완성하게 되었다.As a result of the present inventors' research efforts to develop a composition capable of regulating the immune response of the placenta, under the above background, the present inventors lowered cytotoxicity through the process of fermenting the placenta with a yeast strain, and improved immunity. It was confirmed that this could be done, thereby completing the present invention.
이에, 본 발명은 양태반 발효물을 유효성분으로 포함하는, 면역증강용 조성물을 제공한다.Accordingly, the present invention provides a composition for enhancing immunity, comprising fermented placenta as an active ingredient.
본 발명에서 사용되는 용어, "효모"는 곰팡이나 버섯 무리이지만 균사가 없고, 광합성능 및 운동성을 가지지 않은 단세포 생물의 총칭을 말한다. 효모 자체는 지방 및 단백질원으로 사료 등에 사용되며, 식품이나 사료의 발효에도 사용될 수 있다. 효모는 올리고당을 분해할 수 있는 효소를 분비하며 효모의 세포벽은 동물에게 유용한 성분으로 작용할 수 있으므로, 이를 이용해 제조된 발효 조성물은 동물성 원료의 성분 및 기능성을 개선할 수 있다. As used herein, the term "yeast" refers to a group of fungi or mushrooms, but without hyphae, and refers to a generic term for single-celled organisms that do not have photosynthetic performance and motility. Yeast itself is used for feed as a source of fat and protein, and can also be used for fermentation of food or feed. Since yeast secretes enzymes capable of decomposing oligosaccharides and the cell wall of yeast can act as a useful component for animals, a fermentation composition prepared using the same can improve the components and functionality of animal raw materials.
본 발명에서 사용되는 용어, "효소(enzyme)"란 반응물인 기질과 결합하여 효소-기질 복합체를 형성하는 방법으로 화학 반응의 활성화 에너지를 낮추는 작용을 하는 것으로, 본 발명의 효소는 이에 제한되는 것은 아니지만, 단백질 또는 RNA일 수 있다.As used herein, the term "enzyme" refers to a method of forming an enzyme-substrate complex by binding with a substrate, which is a reactant, and lowering the activation energy of a chemical reaction. The enzyme of the present invention is limited thereto However, it may be a protein or RNA.
본 발명에 있어서, 상기 양태반 발효물은 데케라 디아민(Dekkera deamine) 효모 균주(기탁번호: KCTC 14262BP)로 발효한 것일 수 있다.In the present invention, the placenta fermented product may be fermented with Dekkera deamine yeast strain (Accession No.: KCTC 14262BP).
본 발명에 따른 데케라 디아민(Dekkera deamine) 효모 균주는 흰색의 막대 형태이며 염에 내성을 갖는 균주로 전통 발효 사과식초에서 분리된 것이다. pH 6.8(최적 pH 7.0) 및 7.0% 염 농도하에 10~40℃(최적 온도 30℃)의 환경에서 성장한다. 상기 균주는 26S rRNA 유전자 D1/D2 및 ITS(internal transcribed spacer) 영역의 서열에 대한 계통발생학적 분석 결과 데케라 브루셀렌시스(Dekkera bruxellensis)와 유전적으로 가장 유사하다.Dekkera diamine ( Dekkera deamine ) yeast strain according to the present invention is a white rod-shaped strain having resistance to salt and is isolated from traditional fermented apple cider vinegar. Grown in an environment of 10-40°C (
본 발명에 있어서, 상기 데케라 디아민(Dekkera deamine) 효모 균주는 2020년 8월 6일에 한국 생명공학연구원의 생물자원센터에 Dekkera deamine kh3라는 이름으로 기탁되어, 기탁번호 KCTC 14262BP를 부여 받았다.In the present invention, the Dekkera diamine ( Dekkera deamine ) yeast strain was deposited in the name of Dekkera deamine kh3 at the Bioresource Center of the Korea Institute of Biotechnology and Biotechnology on August 6, 2020, and was given an accession number KCTC 14262BP.
본 발명에서 사용되는 용어, "발효(fermentation)"란 효소 작용에 의하여 유기물에서 화학적 변화가 일어나는 대사 과정을 말한다. 식품을 생산하는 관점에서는 유기물이 화학적 반응으로 생활에 유용한 음식이나 음료를 만드는 미생물의 활동으로 넓게 정의한다. As used herein, the term "fermentation" refers to a metabolic process in which a chemical change occurs in an organic material by an enzyme action. From the perspective of food production, organic matter is broadly defined as the activity of microorganisms that make food or drink useful for life through chemical reaction.
본 발명에 있어서, 상기 단백질은 식품 유래 단백질, 동물성 단백질 및 식물성 단백질로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다. 예컨대, 식품 유래 단백질은 바람직하게 육류, 생선, 해조류 또는 난류 등의 식품 유래 단백질을 포함할 수 있고, 동물성 단백질은 바람직하게 가축 부산물을 포함할 수 있고 더욱 바람직하게는 양태반을 포함할 수 있으며, 식물성 단백질은 바람직하게는 콩 또는 곡물류 유래 단백질을 포함할 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the protein may be any one or more selected from the group consisting of food-derived proteins, animal proteins and vegetable proteins. For example, the food-derived protein may preferably include a food-derived protein such as meat, fish, seaweed or egg, and the animal protein may preferably include livestock by-products and more preferably include placenta, The vegetable protein may preferably include, but is not limited to, soy or grain-derived protein.
본 명세서에서 사용되는 용어, "사이토카인"은 세포 신호전달의 역할을 하는 단백질 (5-20 kDa)을 의미할 수 있다. 사이토카인은 세포에 의해 방출되고 사이토카인을 방출하는 세포들 및/또는 다른 세포들의 거동에 영향을 준다. 사이토카인의 비-제한적 예들에는 케모카인, 인터페론, 인터루킨, 림포카인, 종양 괴사 인자, 모노카인 및 콜로니 자극 인자들이 포함된다. 사이토카인은 면역 세포들, 가령, 대식세포, B 림프구들, T 림프구들, 비만세포 및 단핵구, 내피 세포, 섬유모세포 및 간질 세포들을 비롯한(그러나 이에 제한되는 것은 아님) 광범위한 세포들에 의해 생성될 수 있다. 사이토카인은 하나 이상의 유형의 세포에 의해 생성될 수 있다. 사이토카인은 수용체들을 통해 작용하며 면역계에서 특히 중요하고, 체액성 및 세포계 면역 반응들 사이의 균형을 조절하며, 세포 집단의 성숙, 성장 및 반응성(responsiveness)을 조절한다. 본 명세서의 사이토카인은 자연 발생 사이토카인일 수 있거나 또는 자연 발생 사이토카인의 돌연변이 버전일 수 있다. 본 출원에서 사용되는, "자연 발생" 은 또한 야생형으로도 지칭될 수 있으며, 대립유전자 변종들을 포함한다. 자연 발생 사이토카인의 돌연변이된 버전 또는 "돌연변이"는 사이토카인의 기능, 활성 및/또는 특이성을 변화시키기 위하여 자연 발생 서열에 대해 이루어진 특정 돌연변이들을 지칭한다. 한 구체예에서, 돌연변이들은 사이토카인의 기능, 활성 및/또는 특이성을 향상시킬 수 있다. 또 다른 구체예에서, 돌연변이들은 사이토카인의 기능, 활성 및/또는 특이성을 감소시킬 수 있다. 돌연변이는 사이토카인의 하나 이상의 아미노산 잔기들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다.As used herein, the term “cytokine” may refer to a protein (5-20 kDa) that plays a role in cell signaling. Cytokines are released by cells and affect the behavior of cytokine-releasing cells and/or other cells. Non-limiting examples of cytokines include chemokines, interferons, interleukins, lymphokines, tumor necrosis factors, monokines, and colony stimulating factors. Cytokines can be produced by a wide range of cells, including but not limited to immune cells, such as macrophages, B lymphocytes, T lymphocytes, mast cells and monocytes, endothelial cells, fibroblasts and stromal cells. can Cytokines may be produced by more than one type of cell. Cytokines act through receptors and are of particular importance in the immune system, regulating the balance between humoral and cellular immune responses, and regulating the maturation, growth and responsiveness of cell populations. A cytokine herein may be a naturally occurring cytokine or may be a mutated version of a naturally occurring cytokine. As used herein, “naturally occurring” may also refer to wild-type and includes allelic variants. A mutated version or “mutation” of a naturally occurring cytokine refers to specific mutations made to a naturally occurring sequence to alter the function, activity and/or specificity of the cytokine. In one embodiment, the mutations may enhance the function, activity and/or specificity of a cytokine. In another embodiment, the mutations may reduce the function, activity and/or specificity of the cytokine. Mutations may include deletions or additions of one or more amino acid residues of the cytokine.
본 발명에 있어서, 본 발명의 양태반 발효 조성물은 상기 사이토카인의 발현을 조절하는 것일 수 있으며, 본 발명에 있어서 사이토카인은 M1 phase 및 M2 phase와 관련이 있는 사이토카인일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니지만, iNOS, IL-6, TNF-α, IL-1β, iNOS, IL-4, IL-10, CREB 및 ARG-1일 수 있으며, 본 발명의 조성물은 IL-10, IL-4, CREB 및 ARG-1의 발현을 증진시킬 수 있다.In the present invention, the placental fermentation composition of the present invention may regulate the expression of the cytokine, and in the present invention, the cytokine may be a cytokine related to the M1 phase and the M2 phase, and is limited thereto Although not, it may be iNOS, IL-6, TNF-α, IL-1β, iNOS, IL-4, IL-10, CREB and ARG-1, and the composition of the present invention is IL-10, IL-4, CREB and ARG-1 expression.
본 발명에 있어서, 일산화 질소(nitric oxide, NO)는 유전자 활성을 개시/중단 시키는 신호 조절 분자로서, 면역과 관련된 작용으로 감염에 대항하고 종양세포를 파괴할 수 있으며 상처 치유 기능을 강화시킬 수 있다. 본 발명의 양태반 발효 조성물은 NO의 분비를 증가시킬 수 있으나, 양태반 자체를 사용한 경우보다는 NO의 분비가 낮아 과면역 반응을 유도하지 않으면서 적절한 수준의 면역에 활용될 수 있다.In the present invention, nitric oxide (NO) is a signal-regulating molecule that initiates/stops gene activity, and can fight infection and destroy tumor cells through immune-related action, and enhance wound healing. . The placental fermentation composition of the present invention can increase the secretion of NO, but the secretion of NO is lower than when the placenta itself is used, so it can be utilized for an appropriate level of immunity without inducing a hyperimmune response.
본 발명에서는 구체적인 실시예를 통해 양태반에 상기 데케라 디아민(Dekkera deamine) 효모 균주를 첨가하여 발효시킨 양태반 발효물이 기존의 양태반에 비해 세포 독성이 감소하고, 적합한 면역 조절능을 가진다는 사실을 확인하였다.In the present invention, according to a specific example, the placenta fermented product fermented by adding the dekkera deamine yeast strain to the placenta has reduced cytotoxicity compared to the conventional placenta and has a suitable immune modulating ability. fact confirmed.
본 발명의 일실시예에서는, 양태반을 데케라 디아민 효모 균주로 발효시키는 경우 기존에 과발현 되었던 면역활성이 조절되는 것을 NO의 분비 감소를 통해 확인할 수 있었고, 세포 생존율 또한 양태반에 비해 증가된 것을 확인하였다(실시예 2 참조).In one embodiment of the present invention, when the placenta was fermented with the decera diamine yeast strain, it was confirmed that the previously overexpressed immune activity was regulated through a decrease in NO secretion, and the cell viability was also increased compared to the placenta. It was confirmed (refer to Example 2).
상기와 같은 결과를 통해 양태반을 데케라 디아민 효모 균주로 발효시키는 경우 세포 독성이 감소하고 과발현되었던 면역 증진능이 유효한 수준으로 유지되는 것을 확인하였기에, 본 발명의 양태반 발효 조성물이 면역 증진용 조성물로 유용하게 사용할 수 있다는 사실을 확인할 수 있었다.Through the above results, it was confirmed that when placenta was fermented with decera diamine yeast strain, cytotoxicity was reduced and the overexpressed immune enhancing ability was maintained at an effective level. I was able to confirm that it could be useful.
이에, 본 발명의 다른 양태로서, 하기의 단계를 포함하는, 상기 조성물의 제조방법을 제공한다.Accordingly, as another aspect of the present invention, there is provided a method for preparing the composition comprising the following steps.
(a) 양태반을 준비하는 단계; (b) 상기 양태반에 효모 균주를 첨가하고 발효시키는 단계; 및 (c) 상기 발효물을 수득하는 단계.(a) preparing a placenta; (b) adding a yeast strain to the placenta and fermenting; and (c) obtaining the fermented product.
본 발명에 있어서, 상기 효모 균주는 데케라 디아민(Dekkera deamine) 효모 균주(기탁번호: KCTC 14262BP)일 수 있다.In the present invention, the yeast strain may be a decera diamine ( Dekkera deamine ) yeast strain (Accession No.: KCTC 14262BP).
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred examples are presented to help the understanding of the present invention. However, the following examples are only provided for easier understanding of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.
[실시예][Example]
실시예 1. 양태반 발효물의 발효 조건 최적화Example 1. Optimization of Fermentation Conditions of Placental Fermentation
양태반 발효물을 면역조절을 위한 조성물로 사용하기 위해서는 우선 악취에 가까운 냄새가 나는 양태반의 악취를 제거할 필요가 있기에, 본 발명자들은 본 발명의 데케라 디아민(Dekkera deamine) 균주를 활용하여 양태반의 악취를 제거하는 최적의 조건을 찾기위한 연구를 수행하였다.In order to use the fermented placenta as a composition for immunomodulation , it is necessary to first remove the odor of the placenta, which smells close to the bad odor. A study was conducted to find the optimal conditions to remove the odor of the placenta.
증류수(distilled water)로 세척한 다음 현탁한 데케라 디아민(Dekkera deamine) 균주를 2%의 양태반 4mL 용액에 접종하였다. 최적의 조건을 탐색하기 위해 글리세롤은 1%, 2%, 3%, 4% 또는 5% 농도로 첨가하였고, 데케라 디아민(Dekkera deamine) 효모 균주는 OD600값을 1로 맞춘 후 0.25, 0.5, 1, 2, 3 또는 4ml을 첨가하여 1 내지 4일 동안 발효를 진행하였고, 사람 10명에 대해서 가장 향이 좋은 조건에 가장 높은 점수를 부여하고 향이 좋지 않은 조건에 낮은 점수를 부여하는 관능평가를 수행하였다. 그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 아무런 처리하지 않은 양태반이 가장 낮은 점수를 받았으며, 2% 글리세롤 첨가, OD600=1의 효모 균주 2ml 첨가 및 3일 동안의 발효 기간이 이취를 제거하기 위한 최적의 조건인 것을 확인할 수 있었다.After washing with distilled water (distilled water), the suspended dekera diamine ( Dekkera deamine ) strain was inoculated into a 4mL solution of 2% placenta. To explore the optimal conditions, glycerol was added at a concentration of 1%, 2%, 3%, 4% or 5%, and dekkera diamine ( Dekkera deamine ) The yeast strain was fermented for 1 to 4 days by adding 0.25, 0.5, 1, 2, 3 or 4ml after setting the OD 600 value to 1, giving the highest score to the condition with the best flavor for 10 people And sensory evaluation was performed to give a low score to the unfavorable scent condition. As a result, as shown in FIG. 1 , the placenta without any treatment received the lowest score, and the addition of 2% glycerol, the addition of 2 ml of the yeast strain with OD 600 = 1, and the fermentation period for 3 days were optimal for removing off-flavor. It could be confirmed that the condition of
실시예 2. 본 발명의 발효 조성물 처리에 의한 Raw264.7 세포의 생존율 및 일산화 질소(NO) 분비능 변화 확인Example 2. Confirmation of changes in viability and nitric oxide (NO) secretion ability of Raw264.7 cells by treatment with the fermentation composition of the present invention
2-1. 본 발명의 발효 조성물 처리 농도에 따른 NO 분비능 확인2-1. Confirmation of NO secretory ability according to the treatment concentration of the fermentation composition of the present invention
처리 농도에 따른 NO 분비 수준 및 세포 생존율을 측정하기 위해 무처리 대조군, LPS(Lipopolysaccharide)를 처리한 양성 대조군, 양태반 처리군(Sheep placenta, SP) 및 양태반 발효물 처리군(Sheep placenta formation with Dekkera deamine, SPF)으로 그룹을 나눈 다음, LPS 그룹은 1㎍/mL의 농도로 처리하고, 양태반 처리군(SP) 및 양태반 발효물 처리군(SPF)은 2.5, 5, 10, 20, 40, 50, 100, 200, 300, 400㎍/mL의 농도로 처리하였다. 처리 후 24시간이 경과한 다음, 상층액의 NO 분비량을 Griess reagent assay를 통해 확인하였다. 결과 값은 평균±SD(n=3)로 나타내었고, 양측검정(two tails t-test)으로 검증되었으며, 유효값은 대조군과 비교하여 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001로 나타내었다.In order to measure the NO secretion level and cell viability according to the treatment concentration, an untreated control group, a positive control group treated with lipopolysaccharide (LPS), a placenta treated group (Sheep placenta, SP) and a placenta fermented group (Sheep placenta formation with Dekkera deamin e, SPF), the LPS group was treated at a concentration of 1 μg/mL, and the placental treated group (SP) and the placenta treated group (SPF) were 2.5, 5, 10, 20 , 40, 50, 100, 200, 300, and 400 μg/mL were treated. After 24 hours of treatment, the amount of NO secretion in the supernatant was confirmed by Griess reagent assay. Result values were expressed as mean±SD (n=3), verified by a two-tails t-test, and effective values were *P<0.05, **P<0.01, ***P compared to the control group. It is expressed as <0.001.
그 결과, 2.5 내지 50㎍/mL 범위에서는 도 2a에 나타낸 바와 같이, 무처리 대조군의 경우 2.5μM, LPS 처리군이 22.367±1.186μM의 NO 분비를 보여주었고, 더 높은 NO 분비 유도능을 보여주었고, 50 내지 400㎍/mL 범위에서는 도 2b에 나타낸 바와 같이, 무처리 대조군의 경우 2.5 μM, LPS 처리군이 21.606±0.459μM의 NO 분비를 보여주었다. 도 2a 및 2b에 나타낸 바와 같이, 양태반 처리군(SP)은 2.5 내지 400㎍/mL 범위에서 양성 대조군인 LPS 처리군과 유사하거나 높은 NO 분비를 보여주는 것을 확인할 수 있었으며, 양태반 발효물 처리군(SPF)은 무처리 대조군에 비해 NO 분비능이 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었으나 양성 대조군 및 양태반 처리군에 비해 낮은 NO 분비를 보여주었다. 상기 양태반 처리군 및 양태반 발효물 처리군의 NO 분비는 100㎍/mL 농도까지는 농도에 따라 증가하는 추세를 보였지만 200㎍/mL 농도 이후로는 급격하게 감소하여 400㎍/mL에서는 2.492±0.209μM로 확인되었다.As a result, in the range of 2.5 to 50 μg/mL, as shown in FIG. 2a, the untreated control group showed NO secretion of 2.5 μM and the LPS treated group 22.367±1.186 μM, and showed a higher NO secretion inducing ability. , in the range of 50 to 400 μg/mL, as shown in FIG. 2b , NO secretion of 2.5 μM in the untreated control group and 21.606±0.459 μM in the LPS treatment group was shown. As shown in FIGS. 2A and 2B , it was confirmed that the placenta treated group (SP) exhibited similar or high NO secretion to the positive control LPS treated group in the range of 2.5 to 400 μg/mL, and the placenta fermented group treated group (SPF) was able to confirm that the NO secretory ability was significantly increased compared to the untreated control group, but showed a lower NO secretion compared to the positive control group and the placenta treated group. NO secretion of the placenta-treated group and the placenta-treated group showed a tendency to increase according to the concentration up to the concentration of 100 μg/mL, but decreased sharply after the concentration of 200 μg/mL, and at 400 μg/mL, 2.492±0.209 was confirmed as μM.
상기와 같은 결과를 재확인하기 위해 무처리 대조군, 양성 대조군 및 양태반 발효물 처리군(SPF)을 더 넓은 농도 범위(2.5 내지 500㎍/mL)에서 처리하여 NO 분비를 확인하였다. 그 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이 모든 그룹에서 기존과 유사한 수준의 NO 분비를 보여줌을 재확인할 수 있었다. In order to reconfirm the above results, NO secretion was confirmed by treating the untreated control group, the positive control group, and the placental ferment treatment group (SPF) in a wider concentration range (2.5 to 500 μg/mL). As a result, as shown in Figure 2c, it was possible to reconfirm that all groups showed a similar level of NO secretion as before.
이러한 결과를 통해 본 발명자들은 데케라 디아민(Dekkera deamine)을 통해 발효시킨 본 발명의 양태반 발효물이 양태반 처리군보다 낮은 NO 분비를 보여주기에, 면역을 조절할 수 있지만 기존처럼 과도한 면역반응을 유도하지 않는다는 사실을 확인할 수 있었다.Through these results, the present inventors found that the placenta fermented product of the present invention fermented through dekkera deamine shows lower NO secretion than the placenta treated group, so it is possible to regulate immunity, but it is possible to control excessive immune response as before. I was able to confirm that it wasn't induced.
2-2. 본 발명의 발효 조성물 처리 후 시간 경과에 따른 NO 분비능 확인2-2. Confirmation of NO secretion over time after treatment with the fermentation composition of the present invention
시간 경과에 따른 NO 분비 수준을 측정하기 위해 무처리 대조군, LPS를 처리한 양성 대조군 및 양태반 발효물 처리군(SPF)으로 그룹을 나눈 다음, LPS 그룹은 1㎍/mL의 농도로, 양태반 발효물 처리군(SPF)은 2.5, 40, 400㎍/mL의 농도로 처리하고, 0, 1, 3, 6, 12, 24, 30, 36, 48시간마다 Griess reagent assay를 통해 NO 분비능이 유지되는지 여부를 확인하였다. 상기 실험의 결과 값은 평균±SD(n=3)로 나타내었고, 양측검정(two tails t-test)으로 검증되었으며, 유효값은 대조군과 비교하여 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001로 나타내었다.To determine the level of NO secretion over time, groups were divided into untreated control, LPS-treated positive control and placental ferment-treated group (SPF), and then the LPS group was administered at a concentration of 1 μg/mL and placenta. The fermented product treatment group (SPF) was treated at a concentration of 2.5, 40, and 400 μg/mL, and NO secretion was maintained through Griess reagent assay every 0, 1, 3, 6, 12, 24, 30, 36, and 48 hours. It was checked whether or not The result value of the experiment was expressed as the mean±SD (n=3), verified by a two-tails t-test, and the effective value was *P<0.05, **P<0.01, * compared to the control group. **P<0.001.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 12시간이 경과할 때까지는 대조군 1.457±0.625μM, LPS 처리군 1.645±0.221μM, SPF 2.5 ㎍/mL 처리군 1.061±0.104μM, SPF 40㎍/mL 처리군 1.576±0.161μM, SPF 400 ㎍/mL 처리군 2.141±0.038 μM로 비슷한 양의 NO 형성능을 보여 주었으나, 24시간 이후부터는 대조군 2.226±0.131μM LPS 처리군 15.135±1.001μM, SPF 2.5㎍/mL 처리군 10.505±0.631μM, SPF 40㎍/mL 처리군 11.717±0.029μM, SPF 400㎍/mL 처리군 6.106±0.347μM을 보여주어 대조군과 유의한 정도의 NO 분비능의 차이가 발생함을 확인할 수 있었다. SPF 처리 농도에 따라 구체적으로 NO 분비 수준을 확인했을 때 400㎍/mL의 SPF 처리군은 완만한 수준을 보이며 NO 분비가 증가하였으나, 2.5, 40㎍/mL의 농도로 SPF를 처리한 경우에는 LPS 처리군과 유사한 수준의 NO 분비 수준을 보여주었다. As a result, as shown in FIG. 3, until 12 hours elapsed, control group 1.457±0.625 μM, LPS treatment group 1.645±0.221 μM, SPF 2.5 μg/mL treatment group 1.061±0.104 μM,
2-3. 본 발명의 발효 조성물 처리 농도에 따른 세포 생존율 확인2-3. Confirmation of cell viability according to the treatment concentration of the fermentation composition of the present invention
처리 농도에 따른 세포 생존율을 측정하기 위해 무처리 대조군, LPS(Lipopolysaccharide)를 처리한 양성 대조군, 양태반 처리군(Sheep placenta, SP) 및 양태반 발효물 처리군(Sheep placenta formation with Dekkera deamine, SPF)으로 그룹을 나눈 다음, LPS 그룹은 1㎍/mL의 농도로 처리하고, 양태반 처리군(SP) 및 양태반 발효물 처리군(SPF)은 2.5, 5, 10, 20, 40, 50, 100, 200, 300, 400㎍/mL의 농도로 처리하였다. 처리 후 24시간이 경과한 다음, MTT assay를 수행하여 세포 생존율을 확인하였다. 상기 실험의 결과 값은 평균±SD(n=3)로 나타내었고, 양측검정(two tails t-test)으로 검증되었으며, 유효값은 대조군과 비교하여 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001로 나타내었다.In order to measure the cell viability according to the treatment concentration, an untreated control group, a positive control group treated with lipopolysaccharide (LPS), a placenta treated group (Sheep placenta, SP) and a placenta fermented group (Sheep placenta formation with Dekkera deamine , SPF) ), the LPS group was treated at a concentration of 1 μg/mL, and the placental treated group (SP) and the placenta treated group (SPF) were treated with 2.5, 5, 10, 20, 40, 50, They were treated at concentrations of 100, 200, 300, and 400 μg/mL. After 24 hours of treatment, MTT assay was performed to confirm cell viability. The result value of the experiment was expressed as the mean±SD (n=3), verified by a two-tails t-test, and the effective value was *P<0.05, **P<0.01, * compared to the control group. **P<0.001.
그 결과, 2.5 내지 50㎍/mL 범위에서 생존율을 확인한 도 4a 및 50 내지 400㎍/mL의 범위에서 생존율을 확인한 도 4b의 범위 모두에서 본 발명 양태반 발효물 처리군(SPF)의 생존율이 80% 이상으로 나타났으며, 모든 농도 범위에서 양태반 처리군(SP) 및 양성 대조군 보다 높은 생존율을 보여주었다.As a result, the viability of the placenta fermented product treatment group (SPF) of the present invention was 80 in both the range of FIG. 4a confirming the survival rate in the range of 2.5 to 50 μg/mL and FIG. 4b confirming the survival rate in the range of 50 to 400 μg/mL. % or more, and showed a higher survival rate than the placenta treated group (SP) and the positive control group in all concentration ranges.
상기와 같은 결과를 재확인하기 위해 무처리 대조군, 양성 대조군 및 양태반 발효물 처리군(SPF)의 전체 농도 범위에서 생존율을 더 넓은 농도 범위(2.5 내지 500㎍/mL)에서 확인하였다. 그 결과, 도 4c에 나타낸 바와 같이 기존 실험과 유사한 정도의 생존율을 보임을 재확인 할 수 있었다.In order to reconfirm the above results, the viability was confirmed in a wider concentration range (2.5 to 500 μg/mL) in the total concentration range of the untreated control group, the positive control group, and the placental fermented product treated group (SPF). As a result, as shown in FIG. 4c , it could be reconfirmed that the survival rate was similar to that of the previous experiment.
또한, 세포 생존 여부를 이미징을 통해 관찰하기 위해 Raw264.7 세포를 3x104세포/접시의 밀도로하여 60mm 배양 접시에 시딩(seeding)한 다음날, 배양한 세포들에 LPS(1μg/mL)와 본 발명 양태반 발효물(200, 400μg/mL)을 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 이렇게 배양된 세포에 초록색(생존 세포), 빨간색(사멸 세포)으로 염색을 수행한 Live/Dead staining의 결과에서도, 도 5에 나타낸 바와 같이 LPS를 처리한 세포에 비해 본 발명의 양태반 발효물을 처리한 경우(200, 400㎍/mL)의 생존율이 유의하게 높은 것을 확인할 수 있었다.In addition, in order to observe cell viability through imaging, Raw264.7 cells were seeded in a 60 mm culture dish at a density of 3x10 4 cells/dish. The next day, the cultured cells were treated with LPS (1 μg/mL) and Inventive placental ferment (200, 400 μg/mL) was treated and incubated for 24 hours. In the results of Live/Dead staining in which the cultured cells were stained with green (living cells) and red (dead cells), as shown in FIG. It was confirmed that the survival rate in the case of treatment (200, 400㎍ / mL) was significantly high.
2-4. 본 발명의 발효 조성물 처리 후 시간 경과에 따른 세포 생존율 확인2-4. Confirmation of cell viability over time after treatment with the fermentation composition of the present invention
시간 경과에 따른 세포 생존율을 측정하기 위해 무처리 대조군, LPS를 처리한 양성 대조군 및 양태반 발효물 처리군(SPF)으로 그룹을 나눈 다음, LPS 그룹은 1㎍/mL의 농도로, 양태반 발효물 처리군(SPF)은 2.5, 40, 400㎍/mL의 농도로 처리하고, 30, 48시간에 세포 사진을 촬영하여 세포 생존율을 확인하였다. 그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 LPS처리군에 비해 SPF 처리군에서 다수의 세포를 확인할 수 있어 높은 생존율을 보여줌을 확인할 수 있었다.To measure cell viability over time, groups were divided into untreated control, LPS-treated positive control, and placental fermented (SPF) groups, and the LPS group was administered at a concentration of 1 μg/mL and placental fermentation. The water treatment group (SPF) was treated with concentrations of 2.5, 40, and 400 μg/mL, and cell viability was confirmed by taking pictures of the cells at 30 and 48 hours. As a result, as shown in FIG. 6 , it was confirmed that a large number of cells could be identified in the SPF-treated group compared to the LPS-treated group, showing a high survival rate.
상기와 같은 결과를 통해 본 발명자들은 데케라 디아민(Dekkera deamine)을 이용해 양태반을 발효했을 때 세포 독성이 완화되고, 과도한 NO의 분비가 아닌, 유의한 수준의 NO 분비 유도능을 보여줌을 확인할 수 있었다.Through the above results, the present inventors can confirm that the cytotoxicity is alleviated when the placenta is fermented using decera diamine ( Dekkera deamine ), and it can be confirmed that it shows a significant level of NO secretion inducing ability, not excessive NO secretion. there was.
실시예 3. 양태반 발효물 처리에 의한 Raw264.7 세포의 분화 확인Example 3. Confirmation of Differentiation of Raw264.7 Cells by Placental Fermentation Treatment
Raw264.7은 LPS의 처리에 의해 대식세포(macrophage)로의 분화가 일어난다고 알려져 있기에, 본 발명의 발효 조성물을 처리하는 경우 같은 결과를 보여주는지 여부 확인하기 위해, 무처리 대조군, LPS를 처리한 양성 대조군 및 양태반 발효물 처리군(SPF)으로 그룹을 나눈 다음, LPS 그룹은 1㎍/mL의 농도로, 양태반 발효물 처리군(SPF)은 2.5, 40, 400㎍/mL의 농도로 처리했다. 처리 후 30 시간이 경과한 다음, 현미경에 부착된 카메라로 사진을 촬영하여 Raw264.7 세포의 표면을 관찰하였다.Raw264.7 is known that differentiation into macrophages occurs by the treatment of LPS, in order to check whether the same result is shown when treating the fermentation composition of the present invention, the untreated control, LPS-treated positive Groups were divided into control group and placental ferment treated group (SPF), then the LPS group was treated with a concentration of 1 μg/mL and the placental ferment treated group (SPF) with a concentration of 2.5, 40, and 400 μg/mL. did. After 30 hours of treatment, the surface of Raw264.7 cells was observed by taking pictures with a camera attached to a microscope.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 SPF를 처리한 경우에도 LPS를 처리한 경우와 동일하게 대식세포로의 분화가 일어남을 확인할 수 있었다(하얀 화살표).As a result, as shown in FIG. 7 , it was confirmed that differentiation into macrophages occurred in the same manner as in the case of LPS treatment even when SPF was treated (white arrow).
실시예 4. 양태반 발효물 처리에 의한 Raw264.7 세포의 사이토카인 분비능 변화 확인Example 4. Confirmation of Cytokine Secretion Ability of Raw264.7 Cells by Placental Fermentation Treatment
면역세포에서 분비하는 사이토카인이 면역반응의 조절에서 중요한 역할을 차지하고 있기에, 본 발명의 발효 조성물 처리하는 경우 사이토카인의 발현 변화를 확인하기 위해, 무처리 대조군, LPS를 처리한 양성 대조군 및 양태반 발효물 처리군(SPF)으로 그룹을 나눈 다음, LPS 그룹은 1㎍/mL의 농도로, 양태반 발효물 처리군(SPF)은 2.5, 40, 400㎍/mL의 농도로 처리했다. 처리 후 6, 12, 24시간 마다 세포의 상대적 M1 phase 및 M2 phase와 관련되어 있는 mRNA의 발현(iNOS, IL-6, TNF-α, IL-1β, IL-4, IL-10, CREB)을 qRT-PCR로 측정하였다. 상기 실험의 결과 값은 평균±SD(n=3)로 나타내었고, 양측검정(two tails t-test)으로 검증되었으며, 유효값은 대조군과 비교하여 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001로 나타내었다.Since cytokines secreted from immune cells play an important role in the regulation of immune responses, in order to check the expression changes of cytokines when treated with the fermentation composition of the present invention, untreated control, LPS-treated positive control and placenta After dividing the groups into fermented fermented products (SPF), the LPS group was treated at a concentration of 1 μg/mL, and the placental ferment treated group (SPF) was treated with a concentration of 2.5, 40, and 400 μg/mL. The expression of mRNA (iNOS, IL-6, TNF-α, IL-1β, IL-4, IL-10, CREB) related to the relative M1 phase and M2 phase of cells was measured every 6, 12, and 24 hours after treatment. It was measured by qRT-PCR. The result value of the experiment was expressed as the mean±SD (n=3), verified by a two-tails t-test, and the effective value was *P<0.05, **P<0.01, * compared to the control group. **P<0.001.
그 결과, M1 phase와 관련된 사이토카인의 발현을 나타낸 도 8a(iNOS, IL-6, TNF-α, IL-1β)에서 확인할 수 있는 바와 같이, SPF 처리군은 모두 대조군에 비해 유의적으로 높은 mRNA 발현을 확인할 수 있었으며, TNF-α와 IL-1β은 12시간이 경과했을 때 가장 높은 발현을 보여주고, 24시간이 경과한 경우 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었으나, 이 경우에도 여전히 대조군에 비해 유의하게 높은 발현을 보여주는 것을 확인하였고, M2 phase와 관련된 사이토카인의 발현을 나타낸 도 8b(IL-4, IL-10, CREB)에서도 SPF 처리군은 모두 대조군에 비해 유의적으로 높은 mRNA 발현을 보여주었다. IL-4와 CREB는 24시간이 경과했을 때 가장 증가된 발현양을 보여주었고, IL-10은 12시간이 경과했을 때 가장 증가된 발현양을 보여줌을 확인할 수 있었다.As a result, as can be seen in FIG. 8a (iNOS, IL-6, TNF-α, IL-1β) showing the expression of cytokines related to the M1 phase, all of the SPF-treated groups had significantly higher mRNA than the control group. Expression was confirmed, and TNF-α and IL-1β showed the highest expression when 12 hours elapsed, and it was confirmed that the expression decreased when 24 hours elapsed, but even in this case, it was still significant compared to the control group. In Figure 8b (IL-4, IL-10, CREB) showing the expression of cytokines related to the M2 phase, it was confirmed that the SPF-treated group all showed significantly higher mRNA expression than the control group. . IL-4 and CREB showed the highest expression levels when 24 hours elapsed, and IL-10 was confirmed to show the highest expression levels when 12 hours passed.
상기와 같은 결과를 토대로 본 발명자들은 본 발명의 발효 조성물을 처리하는 경우 면역반응에 주요한 역할을 하는 사이토카인의 분비를 증진시켜 면역을 증진시킬 수 있다는 사실을 확인하였다.Based on the above results, the present inventors confirmed the fact that when the fermentation composition of the present invention is treated, it is possible to enhance immunity by enhancing the secretion of cytokines that play a major role in the immune response.
실시예 5. 양태반 발효물 처리에 의한 마우스 비장세포의 증식율 및 사이토카인 분비능의 변화 확인Example 5. Confirmation of changes in proliferation rate and cytokine secretion ability of mouse splenocytes by treatment with placenta fermented product
5-1. 비장세포의 증식율 변화 확인5-1. Confirmation of change in proliferation rate of splenocytes
Raw264.7외의 다른 세포에서도 본 발명의 발효 조성물이 유사한 면역 증진 효과를 가지고 있는지 여부를 확인하기 위해 4주령 Balb/C male 마우스의 비장에서 유리시킨 비장세포에 대한 실험을 수행하였다. 실험을 위해 무처리 대조군, Concanavalin A(Con A) 처리군(양성 대조군) 및 양태반 발효물 처리군(SPF)으로 그룹을 나누어, 양태반 발효물은 17.5, 25, 50, 100, 200, 400μg/mL의 농도로 처리하였고, Con A는 10μg/mL의 농도로 처리하였다. 처리 후 36시간이 경과한 다음, WST-1 시약으로 세포 증식을 확인하였다. 상기 실험의 결과 값은 평균±SD(n=3)로 나타내었고, 양측검정(two tails t-test)으로 검증되었으며, 유효값은 대조군과 비교하여 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001로 나타내었다.In order to check whether the fermentation composition of the present invention has a similar immune enhancing effect in cells other than Raw264.7, an experiment was performed on splenocytes released from the spleen of 4-week-old Balb/C male mice. For the experiment, the group was divided into an untreated control group, a Concanavalin A (Con A) treated group (positive control group) and a placental fermented product group (SPF), with 17.5, 25, 50, 100, 200, 400 μg of placental ferment It was treated at a concentration of /mL, and Con A was treated at a concentration of 10 μg/mL. After 36 hours of treatment, cell proliferation was confirmed with WST-1 reagent. The result value of the experiment was expressed as the mean±SD (n=3), verified by a two-tails t-test, and the effective value was *P<0.05, **P<0.01, * compared to the control group. **P<0.001.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, CON A 처리군 및 SPF 처리군 모두 비장세포의 증식능을 유의적으로 증가시키는 것을 확인하였으며, 농도를 달리하여 처리한 SPF 처리군의 경우 처리 농도에 따라 세포증식능이 증가하는 결과를 확인할 수 있었는데, 200μg/mL 처리군에서 최대로 증가한 후 400μg/mL 농도에서는 다시 감소하는 결과를 확인할 수 있었다. As a result, as shown in FIG. 9 , it was confirmed that both the CON A treatment group and the SPF treatment group significantly increased the proliferative capacity of splenocytes, and in the case of the SPF treatment group treated with different concentrations, the cell proliferation ability according to the treatment concentration It was confirmed that this increased result, which increased to the maximum in the 200 μg/mL treatment group, and then decreased again at the 400 μg/mL concentration.
5-2. 비장세포의 사이토카인 분비능 변화 확인5-2. Confirmation of changes in cytokine secretion ability of splenocytes
① 상기 실시예 5-1의 결과에 따라 SPF의 농도를 비장세포의 증식능이 가장 높게 증가한 200μg/mL 및 비교를 위한 낮은 농도로 2.5μg/mL로 선정하였다. 본 발명의 발효 조성물에 대한 실험을 진행하기 전에, 먼저 면역 T 세포의 마이토젠인 CON A를 비장세포에 10μg/mL의 농도로 처리한 다음, 2, 24, 36 및 48 시간마다 비장세포의 M1 phase 및 M2 phase와 관련된 사이토카인(IL-6, iNOS, IL-4, IL-10, CREB, ARG-1)의 mRNA 발현 수준을 확인하였다. 상기 실험의 결과 값은 평균±SD(n=3)로 나타내었고, 양측검정(two tails t-test)으로 검증되었으며, 유효값은 대조군과 비교하여 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001로 나타내었다.① According to the results of Example 5-1, the SPF concentration was selected to be 200 μg/mL, in which the proliferative ability of splenocytes increased the most, and 2.5 μg/mL as a low concentration for comparison. Before proceeding with the experiment on the fermentation composition of the present invention, splenocytes were first treated with CON A, a mitogen of immune T cells, at a concentration of 10 μg/mL, and then splenocytes M1 of every 2, 24, 36 and 48 hours. The mRNA expression levels of cytokines (IL-6, iNOS, IL-4, IL-10, CREB, ARG-1) related to phase and M2 phase were confirmed. The result value of the experiment was expressed as the mean±SD (n=3), verified by a two-tails t-test, and the effective value was *P<0.05, **P<0.01, * compared to the control group. **P<0.001.
그 결과, 도 10a에 나타낸 바와 같이 M1 phase와 관련된 사이토카인인 IL-6 및 iNOS는 12시간이 경과한 다음 무처리 대조군에 비해 유의하게 발현 수준이 증가했다가 차이가 점차 감소하고 있음을 확인할 수 있었으며, 도 10b에 나타낸 바와 같이 M2 phase와 관련되어 있는 사이토카인인 IL-10, ARG-1, CREB 및 IL-4는 시간의 경과에 따라 발현양이 증가하여 36 시간이 경과했을 때 가장 높은 발현을 보여줌을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in Figure 10a, the M1 phase-related cytokines IL-6 and iNOS significantly increased the expression level compared to the untreated control after 12 hours elapsed, and then it can be confirmed that the difference is gradually decreasing. As shown in FIG. 10b, the cytokines IL-10, ARG-1, CREB and IL-4 related to the M2 phase increased their expression over time, and the highest expression when 36 hours had elapsed. was able to confirm that
② CON A을 1μg/mL 농도로 단독 처리한 그룹과 CON A를 동일한 농도로 처리한 다음, SPF를 2.5 및 200μg/mL의 농도로 추가로 처리한 그룹으로 나누어 M1 phase 및 M2 phase와 관련된 사이토카인(IL-6, iNOS, TNF-α, IL-4, IL-10, CREB, ARG-1)의 mRNA 발현 수준을 확인하였다. 상기 실험의 결과 값은 평균±SD(n=3)로 나타내었고, 양측검정(two tails t-test)으로 검증되었으며, 유효값은 대조군과 비교하여 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001로 나타내었다.② The group treated with CON A alone at a concentration of 1 μg/mL and the group treated with CON A at the same concentration, and then divided into groups additionally treated with SPF at a concentration of 2.5 and 200 μg/mL, cytokines related to M1 phase and M2 phase mRNA expression levels of (IL-6, iNOS, TNF-α, IL-4, IL-10, CREB, ARG-1) were confirmed. The result value of the experiment was expressed as the mean±SD (n=3), verified by a two-tails t-test, and the effective value was *P<0.05, **P<0.01, * compared to the control group. **P<0.001.
그 결과 도 11a에 나타낸 바와 같이, 2.5 및 200μg/mL의 SPF를 처리하는 경우 M1 phase와 관련되어 있는 사이토카인인 IL-6, iNOS, TNF-α의 발현이 대조군에 비해 유의하게 증가하는 것을 확인하였으며, 2.5μg/mL의 SPF를 처리하는 경우 IL-6 및 TNF-α의 발현은 CON A만 단독으로 처리했을 때보다 더 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었으나, 200μg/mL의 농도로 처리한 경우 M1 phase와 관련된 모든 사이토카인의 mRNA 발현이 CON A 단독 처리한 경우보다 감소하는 것을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 11a, it was confirmed that the expression of IL-6, iNOS, and TNF-α, which are cytokines related to the M1 phase, significantly increased compared to the control when treated with SPF of 2.5 and 200 μg/mL When SPF of 2.5 μg/mL was treated, it was confirmed that the expression of IL-6 and TNF-α increased more than when only CON A was treated, but when treated at a concentration of 200 μg/mL It was confirmed that the mRNA expression of all cytokines related to the M1 phase was reduced compared to the case of CON A alone treatment.
M2 phase와 관련된 사이토카인(IL-4, IL-10, CREB, ARG-1)의 발현을 확인했을 때, 도 11b에 나타낸 바와 같이, 2.5 및 200μg/mL의 SPF를 처리한 경우 모두에서 CON A를 처리한 경우 보다 발현 수준이 더 증가한 것을 확인할 수 있었다.When the expression of cytokines (IL-4, IL-10, CREB, ARG-1) related to the M2 phase was confirmed, as shown in FIG. 11b, CON A in all cases treated with SPF of 2.5 and 200 μg/mL It was confirmed that the expression level was further increased than when treated.
상기와 같은 결과를 통해 본 발명의 발명자들은 양태반 발효물인 SPF가 CON A에 의해 과발현된 M1 phase관련 사이토카인인 IL-6, iNOS 및 TNF-α 발현량을 유의미하게 줄여주면서 항염증 및 세포 치유에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는 M2 phase 관련 사이토카인인 IL-10, IL-4, CREB 및 ARG-1의 발현 수준을 증진 시킨다는 사실을 확인할 수 있었다.Through the above results, the inventors of the present invention found that SPF, a placenta fermented product, significantly reduced the expression levels of IL-6, iNOS and TNF-α, the M1 phase-related cytokines overexpressed by CON A, while providing anti-inflammatory and cell healing properties. It was confirmed that it enhances the expression level of IL-10, IL-4, CREB and ARG-1, which are known to play an important role in M2 phase-related cytokines.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.The description of the present invention stated above is for illustration, and those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains can understand that it can be easily modified into other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. There will be. Therefore, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not restrictive.
Claims (7)
A composition for enhancing immunity, comprising a placenta fermented product as an active ingredient.
상기 양태반 발효물은 데케라 디아민(Dekkera deamine) 효모 균주(기탁번호: KCTC 14262BP)로 발효한 것을 특징으로 하는, 조성물.
The method of claim 1,
The placenta fermented product is characterized in that it is fermented with a Dekkera deamine yeast strain (Accession No.: KCTC 14262BP), the composition.
상기 조성물은 IL-10, IL-4, CREB 및 ARG-1으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 mRNA의 발현을 증진시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
The method of claim 1,
The composition is characterized in that it enhances the expression of one or more mRNA selected from the group consisting of IL-10, IL-4, CREB and ARG-1, the composition.
상기 조성물은 2.5 내지 400μg/mL의 농도인 것을 특징으로 하는, 조성물.
The method of claim 1,
The composition is characterized in that the concentration of 2.5 to 400 μg / mL, the composition.
상기 조성물은 일산화 질소(Nitric oxide)의 분비를 증진시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
The method of claim 1,
The composition is characterized in that to enhance the secretion of nitric oxide (Nitric oxide), the composition.
(a) 양태반을 준비하는 단계;
(b) 상기 양태반에 효모 균주를 첨가하고 발효시키는 단계; 및
(c) 상기 발효물을 수득하는 단계.
A method for preparing the composition of claim 1, comprising the steps of:
(a) preparing a placenta;
(b) adding a yeast strain to the placenta and fermenting; and
(c) obtaining the fermented product.
상기 효모 균주는 데케라 디아민(Dekkera deamine) 효모 균주(기탁번호: KCTC 14262BP)인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
7. The method of claim 6,
The yeast strain is Dekkera diamine ( Dekkera deamine ) Yeast strain (Accession No.: KCTC 14262BP), characterized in that, the manufacturing method.
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| KR20110017742A (en) * | 2009-08-14 | 2011-02-22 | 문상욱 | Fermented placenta compositin and use thereof |
| KR20160122110A (en) * | 2015-01-21 | 2016-10-21 | 주식회사 엘지생활건강 | A composition for reinforcing immune function and anti-fatigue comprising fermented placenta and its use |
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