KR20220070514A - 소분자 조절제를 사용한 il-17 표적 결합 검정을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
IL-17 및 IL-17의 소분자 조절제를 포함하는 샘플 내의 유리 IL-17을 측정하기 위한 방법.
Description
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 2020년 9월 14일자로 출원된 미국 가출원 제63/077,978호; 2020년 1월 12일자로 출원된 미국 가출원 제62/960,031호; 및 2019년 9월 30일자로 출원된 미국 가출원 제62/908,195호에 대하여 35 U.S.C. § 119(e) 하에서 이익을 주장하며; 이들의 전체 개시내용은 이로써 본 명세서에 참고로 포함된다.
전자적으로 제출된 서열
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본 출원은 파일 레퍼런스가 "004852.11713/142WO1(JBI6152WOPCT1)"이고, 작성일이 2020년 9월 23일이며, 크기가 44 kb인 ASCII 포맷 서열 목록으로서 EFS-웹을 통해 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함한다. EFS-웹을 통해 제출된 서열 목록은 본 명세서의 일부이며, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
인터류킨-17A(IL-17 또는 IL-17A)는 인터류킨-23(IL-23) 및 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β)와 같은 사이토카인에 반응하여 활성화된 Th17 세포, CD8+ T 세포, γδ T 세포, 및 NK 세포에 의해 분비되는 사이토카인이다. IL-17은 염증에서 또는 숙주 방어에서 조직 손상의 병리 및 호중구의 동원에 관여하는 상피 세포, 섬유아세포, 및 활막세포를 포함한 다수의 세포 유형으로부터의 매개체, 예컨대 항미생물 펩티드, 전염증성 사이토카인, 및 케모카인의 생성을 조절한다. IL-17은 또한 다른 사이토카인, 예컨대 TNF-α 및 IL-Ιβ와 상승작용하여 전염증성 환경을 강화시킨다.
면역 조절 기능에 관여하기 때문에, IL-17의 억제제(또는 IL-17의 조절제)는 다양한 자가면역 질병에 대한 가능한 치료제로서 연구 중이다. 항-IL-17 mAb는 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염의 치료에 있어서 임상적으로 검증되어 있으며, 다발성 경화증의 치료에 대한 개념 증명(proof of concept)을 입증해 왔다. IL-17의 경구 소분자 조절제가 아직까지 임상 시험으로 진행되지는 않았지만, 이들은 그들의 개발이 생물학적 제제가 이용 불가능한 많은 환자에 대한 치료 선택지의 폭을 넓힐 수 있기 때문에 매력적인 개발 분야로 남아 있다. (예를 들어, 문헌[S. Liu et al. Scientific Reports, 6, 30859] 참조, https://doi.org/10.1038/srep30859).
제약 산업에서의 IL-17의 대분자 조절제의 임상 유용성 및 IL-17의 소분자 조절제의 출현에도 불구하고, 현재 IL-17과 이의 소분자 조절제 사이의 결합 활성을 측정할 수 있는 보고된 표적 결합 검정이 없다. 즉, 현재 이용가능한 면역검정 키트는 IL-17 및 IL-17의 소 조절제가 존재하는 샘플에서 단지 총 IL-17(조절제-결합된 IL-17 및 유리 IL-17 둘 모두를 포함함)의 수준만을 측정할 수 있다. 그러나, 표적 결합을 결정하기 위하여 IL-17의 소분자 조절제의 존재 하에서 단지 유리 IL-17만을 특이적으로 검출하기 위한 검정은 없다. 따라서, 소분자 조절제에 의한 IL-17 표적 결합의 수준에 대한 정보가 부족하다.
더욱이, 질병 관련 바이오마커가 환자에서 항-IL-17 치료 효과를 모니터링하는 데 사용되어 왔지만, 임상 평가의 초기 단계에서 종종 포함되는 건강한 대상체에서 항-IL-17 효과를 모니터링하기 위한 어떠한 바이오마커도 개발되어 있지 않다. 대상체(예를 들어, 인간)에서 IL-17 소분자 조절제의 IL-17과의 표적 결합을 입증할 수 있는 측정이 임상 연구를 통해 SM 조절제를 진행하는 데 중요하다.
따라서, 샘플에서의 SM 조절제에 의한 IL-17 결합을 평가하고, 임상적으로 관련된 파라미터, 예컨대 약동학적(PK) 및 약력학적(PD) 정보를 연구하기 위한 방법(들)에 대한 필요성이 존재하며, 이는 결국, 안전하고 효능있는 요법을 위한 최적 투여량의 결정에 도움을 줄 수 있다.
일반적인 태양에서, 본 출원은 IL-17 및 SM 조절제를 포함하는 샘플 내의 유리 IL-17(즉, SM 조절제(들)에 결합되지 않은 IL-17)의 양을 결정하는 방법에 관한 것이다.
IL-17 및 IL-17의 소분자(SM) 조절제를 포함하는 샘플 내의 유리 IL-17의 양을 결정하는 방법이 본 명세서에 제공되며, 상기 방법은
i.
상기 샘플을 제1 포획 항체와 접촉시켜, 상기 제1 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17을 포함하는 제1 복합체, 및 상기 제1 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17을 포함하는 제2 복합체를 포함하는 혼합물을 형성하는 단계;
ii.
단계 i)로부터의 상기 혼합물을 제1 검출제와 접촉시켜, 상기 제1 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17, 및 상기 제1 검출제를 포함하는 제3 복합체를 형성하지만, 상기 제1 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17, 및 상기 제1 검출제를 포함하는 제4 복합체를 형성하지 않는 단계; 및
iii.
상기 제3 복합체 내의 상기 제1 검출제의 양을 측정함으로써 상기 유리 IL-17의 양을 결정하는 단계를 포함하며,
바람직하게는, 상기 제1 검출제는 제1 검출 항체이다.
상기 방법의 일 실시 형태에서, 단계 i)로부터의 혼합물을 제1 검출제와 접촉시키기 전에 어떠한 세척 단계도 수행되지 않는다.
대상체에서 IL-17의 SM 조절제의 표적 결합을 결정하는 방법이 본 명세서에 추가로 제공되며, 상기 방법은 a) 제1항의 방법을 사용하여 상기 SM 조절제의 투여 전에 상기 대상체로부터의 샘플 내의 유리 IL-17의 양을 결정하는 단계; b) 제1항의 방법을 사용하여 상기 SM 조절제의 투여 후에 상기 대상체로부터의 샘플 내의 유리 IL-17의 양을 결정하는 단계; 및 c) 단계 a)와 단계 b)로부터 결정된 유리 IL-17의 양을 비교하는 단계를 포함한다.
대상체에서 IL-17의 SM 조절제의 표적 결합을 결정하는 방법이 본 명세서에 추가로 제공되며, a) 제1항의 방법을 사용하여 상기 SM 조절제의 투여 후에 2개 이상의 시점에서 상기 대상체로부터의 샘플 내의 유리 IL-17의 양을 결정하는 단계; 및 b) 단계 a)로부터 결정된 상기 2개 이상의 시점에서의 유리 IL-17의 양을 비교하는 단계를 포함한다.
IL-17 및 IL-17의 SM 조절제를 포함하는 샘플 내의 조절제-결합된 IL-17의 양을 결정하는 방법이 본 명세서에 추가로 제공되며, 상기 방법은
i.
상기 샘플의 제1 일부분을 제1 포획 항체와 접촉시켜, 상기 제1 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17을 포함하는 제1 복합체, 및 상기 제1 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17을 포함하는 제2 복합체를 포함하는 제1 혼합물을 형성하는 단계;
ii.
단계 i)로부터의 상기 제1 혼합물을 제1 검출제와 접촉시켜, 상기 제1 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17, 및 상기 제1 검출제를 포함하는 제3 복합체를 형성하지만, 상기 제1 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17, 및 상기 제1 검출제를 포함하는 제4 복합체를 형성하지 않는 단계;
iii.
상기 샘플의 제2 일부분을 제2 포획 항체와 접촉시켜, 상기 제2 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17을 포함하는 제5 복합체, 및 상기 제2 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17을 포함하는 제6 복합체를 포함하는 제2 혼합물을 형성하는 단계;
iv.
상기 제2 혼합물을 제2 검출제와 접촉시켜, 상기 제2 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17, 및 상기 제2 검출제를 포함하는 제7 복합체, 및 상기 제2 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17, 및 상기 제2 검출제를 포함하는 제8 복합체를 형성하는 단계;
v.
상기 제3 복합체 내의 상기 제1 검출제의 양을 측정함으로써 상기 유리 IL-17의 양을 결정하는 단계;
vi.
상기 제7 복합체 및 상기 제8 복합체 내의 상기 제2 검출제의 총량을 측정함으로써 상기 IL-17의 총량을 결정하는 단계; 및
vii.
단계 (vi)에서의 상기 IL-17의 총량으로부터 단계 (v)에서 결정된 상기 유리 IL-17의 양을 차감함으로써 상기 샘플 내의 상기 조절제-결합된 IL-17의 양을 결정하는 단계를 포함하며,
바람직하게는, 상기 제1 검출제는 제1 검출 항체이고, 상기 제2 검출제는 제2 검출 항체이다.
대상체에서 IL-17의 SM 조절제의 표적 결합을 결정하는 방법이 본 명세서에 추가로 제공되며, 상기 방법은 전술된 방법을 사용하여 상기 SM 조절제의 투여 후에 상기 대상체로부터의 샘플 내의 조절제-결합된 IL-17의 양을 결정하는 단계를 포함한다.
전술된 임의의 방법의 일 실시 형태에서, SM 조절제는 분자량이 약 100 내지 1500 g/mol이다.
전술된 임의의 방법의 추가의 실시 형태에서, SM 조절제는 분자량이 약 400 내지 1050 g/mol, 또는 약 500 내지 1000 g/mol, 또는 약 600 내지 900 g/mol이다.
전술된 임의의 방법의 다른 추가의 실시 형태에서, SM 조절제는 분자량이 약 300 내지 750 g/mol, 또는 약 500 내지 800 g/mol, 또는 약 600 내지 900 g/mol이다.
전술된 임의의 방법의 다른 추가의 실시 형태에서, SM 조절제는 분자량이 약 300 내지 750 g/mol이다. 전술된 임의의 방법의 다른 추가의 실시 형태에서, SM 조절제는 분자량이 약 500 내지 800 g/mol이다. 전술된 임의의 방법의 다른 추가의 실시 형태에서, SM 조절제는 분자량이 약 600 내지 900 g/mol이다.
전술된 임의의 방법의 다른 추가의 실시 형태에서, SM 조절제는 하기 구조를 갖는 화합물 #1 내지 화합물 #6 및 이들의 약제학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
전술된 임의의 방법의 다른 추가의 실시 형태에서, SM 조절제는 하기 구조를 갖는 화합물 #2 내지 화합물 #6 및 이들의 약제학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
전술된 임의의 방법의 다른 추가의 실시 형태에서, 제1 검출제 및/또는 제2 검출제는 검출가능한 표지로 표지되고, 더 바람직하게는 표지는 효소 또는 비오틴이다.
전술된 임의의 방법의 다른 추가의 실시 형태에서, 제1 포획 항체 및 제1 검출제는 하기 표의 쌍으로부터 선택된다:
전술된 임의의 방법의 다른 추가의 실시 형태에서, 제1 포획 항체는 DuoSet ELISA 키트 DY317(R&D Systems, Inc.로부터 입수됨)의 포획 항체이고, 제1 검출제는 인간 mAb4538 항체(Janssen Biotech, Inc.로부터 입수됨)이다.
전술된 임의의 방법의 다른 추가의 실시 형태에서, 제2 포획 항체 및 제2 검출제는 하기 표의 쌍으로부터 선택된다:
전술된 임의의 방법의 다른 추가의 실시 형태에서, 제2 포획 항체 및 제2 검출제는 각각 DuoSet ELISA 키트 DY317(R&D Systems, Inc.로부터 입수됨)의 포획 항체 및 검출 항체이다.
전술된 임의의 방법의 다른 추가의 실시 형태에서, 샘플은 SM 조절제에 의한 생체외(ex vivo) 또는 생체내(in vivo) 처리 하에서 대상체로부터 획득되는 생물학적 샘플이다. 대상체는 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있다. 생물학적 샘플은 세포 또는 조직으로부터 제조된 샘플, 또는 혈청, 혈장 또는 다른 생물학적 유체 샘플로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
전술된 임의의 방법의 다른 추가의 실시 형태에서, 상기 방법은 상기 샘플 내의 상기 IL-17의 정량 하한(LLOQ)이 약 0.01 또는 약 0.1 또는 약 0.25, 또는 약 0.5, 또는 약 0.75, 또는 약 1 pg/ml인 검출 감도를 갖는다.
IL-17 및 IL-17의 SM 조절제를 포함하는 샘플 내의 유리 IL-17의 양을 결정하기 위한 키트가 본 명세서에 추가로 제공되며, 상기 키트는
i.
제1 포획 항체 - 여기서, 상기 샘플과의 접촉 시에, 상기 제1 포획 항체는 상기 제1 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17을 포함하는 제1 복합체, 및 상기 제1 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17을 포함하는 제2 복합체를 형성함 -; 및
ii.
제1 검출제 - 여기서, 상기 제1 복합체 및 상기 제2 복합체와의 접촉 시에, 상기 제1 검출제는 상기 제1 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17, 및 상기 제1 검출제를 포함하는 제3 복합체를 형성하지만, 상기 제1 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17, 및 상기 제1 검출제를 포함하는 제4 복합체를 형성하지 않음 - 를 포함하며,
바람직하게는, 상기 제1 검출제는 제1 검출 항체이다.
IL-17 및 IL-17의 SM 조절제를 포함하는 샘플 내의 조절제-결합된 IL-17의 양을 결정하기 위한 키트가 본 명세서에 추가로 제공되며, 상기 키트는
i.
제1 포획 항체 - 여기서, 상기 샘플과의 접촉 시에, 상기 제1 포획 항체는 상기 제1 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17을 포함하는 제1 복합체, 및 상기 제1 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17을 포함하는 제2 복합체를 형성함 -;
ii.
제1 검출제 - 여기서, 상기 제1 복합체 및 상기 제2 복합체와의 접촉 시에, 상기 제1 검출제는 상기 제1 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17, 및 상기 제1 검출제를 포함하는 제3 복합체를 형성하지만, 상기 제1 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17, 및 상기 제1 검출제를 포함하는 제4 복합체를 형성하지 않음 -; 및
iii.
제2 포획 항체 - 여기서, 상기 샘플과의 접촉 시에, 상기 제2 포획 항체는 상기 제2 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17을 포함하는 제5 복합체, 및 상기 제2 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17을 포함하는 제6 복합체를 형성함 -;
iv.
제2 검출제 - 여기서, 상기 제5 복합체 및 상기 제6 복합체와의 접촉 시에, 상기 제2 검출제는 상기 제2 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17, 및 상기 제2 검출제를 포함하는 제7 복합체, 및 상기 제2 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17, 및 상기 제2 검출제를 포함하는 제8 복합체를 각각 형성함 - 를 포함하며,
바람직하게는, 상기 제1 검출제는 제1 검출 항체이고, 상기 제2 검출제는 제2 검출 항체이다.
전술된 임의의 키트의 일 실시 형태에서, 제1 검출제 및/또는 제2 검출제는 검출가능한 표지로 표지되고, 더 바람직하게는 표지는 효소 또는 비오틴이다.
전술된 임의의 키트의 추가의 실시 형태에서, 제1 포획 항체 및 제1 검출제는 하기 표의 쌍으로부터 선택된다:
전술된 임의의 키트의 다른 추가의 실시 형태에서, 제1 포획 항체는 DuoSet ELISA 키트 DY317(R&D Systems, Inc.로부터 입수됨)의 포획 항체이고, 제1 검출제는 인간 mAb4538 항체(Janssen Biotech, Inc.로부터 입수됨)이다.
전술된 임의의 키트의 다른 추가의 실시 형태에서, 제2 포획 항체 및 제2 검출제는 하기 표의 쌍으로부터 선택된다:
전술된 키트들 중 어느 하나의 다른 추가의 실시 형태에서, 제2 포획 항체 및 제2 검출제는 각각 DuoSet ELISA 키트 DY317(R&D Systems, Inc.로부터 입수됨)의 포획 항체 및 검출 항체이다.
본 발명의 다른 태양, 특징 및 이점은 본 발명 및 그의 바람직한 실시 형태의 상세한 설명을 포함한 하기의 개시내용 및 첨부된 청구범위로부터 명백할 것이다.
전술한 개요뿐만 아니라, 본 출원의 바람직한 실시 형태의 하기의 상세한 설명도 첨부 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 그러나, 본 출원은 도면에 나타낸 정확한 실시 형태로 제한되지 않음이 이해되어야 한다.
도 1a 내지 도 1c는 IL-17 표적 결합 검정의 개략도를 나타낸다: 도 1a - 포획 항체/검출제 쌍을 사용하여 IL-17을 검출하기 위한 면역검정; 도 1b - 본 발명의 포획 항체/검출제 쌍을 사용하여 소분자(SM) 조절제의 존재 하에서, 단지 유리 IL-17만을 검출하기 위한(그러나 조절제-결합된 IL-17은 그렇지 않기 위한) 면역검정; 및 도 1c - 현재 이용가능한 포획 항체/검출제 쌍을 사용하여 유리 IL-17 및 조절제-결합된 IL-17 둘 모두를 포함하는 총 IL-17(즉, SM 조절제와 결합된 IL-17)을 검출하기 위한 면역검정.
도 2a 내지 도 2f는 소분자(SM) 조절제 화합물 #1, 화합물 #2, 화합물 #3, 화합물 #4, 화합물 #5, 및 화합물 #6을 각각 포함하는 샘플에서, 검출제로서의 mAb4538(Janssen Biotech, Inc.로부터 입수된 IL-17의 항체)과 쌍을 형성하는 DuoSet ELISA 키트 DY317(R&D Systems, Inc.)의 포획 항체를 사용하여, 유리 IL-17을 검출하지만, 조절제-결합된 IL-17은 검출하지 않는 것을 나타낸다.
도 3a 내지 도 3f는 SM 조절제 화합물 #1, 화합물 #2, 화합물 #3, 화합물 #4, 화합물 #5, 및 화합물 #6을 각각 포함하는 샘플에서 DuoSet ELISA 키트 DY317을 사용하여 총 IL-17을 검출하는 것을 나타낸다.
도 4a 내지 도 4f는 SM 조절제 화합물 #1, 화합물 #2, 화합물 #3, 화합물 #4, 화합물 #5, 및 화합물 #6을 각각 포함하는 샘플에서 검출제로서의 항체 ABIN1724556(Covalab Antibodies Online으로부터 입수됨)과 쌍을 형성하는 DuoSet ELISA 키트 DY317의 포획 항체를 사용하여 총 IL-17을 검출하는 것을 나타낸다.
도 5a 및 도 5b는 일정 범위의 농도의 SM 조절제를 포함하는 샘플에서, 검출제로서의 mAb4538과 쌍을 형성하는 DuoSet ELISA 키트 DY317의 포획 항체를 사용하여 유리 IL-17을 검출하는 것을 나타낸다.
도 1a 내지 도 1c는 IL-17 표적 결합 검정의 개략도를 나타낸다: 도 1a - 포획 항체/검출제 쌍을 사용하여 IL-17을 검출하기 위한 면역검정; 도 1b - 본 발명의 포획 항체/검출제 쌍을 사용하여 소분자(SM) 조절제의 존재 하에서, 단지 유리 IL-17만을 검출하기 위한(그러나 조절제-결합된 IL-17은 그렇지 않기 위한) 면역검정; 및 도 1c - 현재 이용가능한 포획 항체/검출제 쌍을 사용하여 유리 IL-17 및 조절제-결합된 IL-17 둘 모두를 포함하는 총 IL-17(즉, SM 조절제와 결합된 IL-17)을 검출하기 위한 면역검정.
도 2a 내지 도 2f는 소분자(SM) 조절제 화합물 #1, 화합물 #2, 화합물 #3, 화합물 #4, 화합물 #5, 및 화합물 #6을 각각 포함하는 샘플에서, 검출제로서의 mAb4538(Janssen Biotech, Inc.로부터 입수된 IL-17의 항체)과 쌍을 형성하는 DuoSet ELISA 키트 DY317(R&D Systems, Inc.)의 포획 항체를 사용하여, 유리 IL-17을 검출하지만, 조절제-결합된 IL-17은 검출하지 않는 것을 나타낸다.
도 3a 내지 도 3f는 SM 조절제 화합물 #1, 화합물 #2, 화합물 #3, 화합물 #4, 화합물 #5, 및 화합물 #6을 각각 포함하는 샘플에서 DuoSet ELISA 키트 DY317을 사용하여 총 IL-17을 검출하는 것을 나타낸다.
도 4a 내지 도 4f는 SM 조절제 화합물 #1, 화합물 #2, 화합물 #3, 화합물 #4, 화합물 #5, 및 화합물 #6을 각각 포함하는 샘플에서 검출제로서의 항체 ABIN1724556(Covalab Antibodies Online으로부터 입수됨)과 쌍을 형성하는 DuoSet ELISA 키트 DY317의 포획 항체를 사용하여 총 IL-17을 검출하는 것을 나타낸다.
도 5a 및 도 5b는 일정 범위의 농도의 SM 조절제를 포함하는 샘플에서, 검출제로서의 mAb4538과 쌍을 형성하는 DuoSet ELISA 키트 DY317의 포획 항체를 사용하여 유리 IL-17을 검출하는 것을 나타낸다.
다양한 간행물, 논문, 및 특허가 배경기술에 그리고 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되어 있거나 기재되어 있으며; 이들 참고문헌 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 명세서에 포함된 문헌, 행동, 재료, 장치, 물품 등에 대한 논의는 본 발명에 대한 상황을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러한 논의는 이들 대상 중 임의의 것 또는 모든 것이 개시되거나 청구된 임의의 발명에 대하여 종래 기술의 일부를 형성하는 것을 인정하는 것은 아니다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 그렇지 않으면, 본 명세서에 사용되는 소정의 용어는 본 명세서에 제시된 바와 같은 의미를 갖는다. 본 명세서에 인용된 모든 특허, 공개된 특허 출원 및 간행물은 마치 본 명세서에 완전히 기재되어 있는 것처럼 참고로 포함된다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태(부정 관사 및 정관사)는, 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면, 복수의 지시 대상을 포함한다는 것에 유의해야 한다.
달리 지시되지 않는 한, 일련의 요소 앞의 용어 "적어도"는 일련 내의 각각의 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 당업자는 단지 일반적인 실험을 사용하여, 본 명세서에서 설명된 본 발명의 구체적인 실시 형태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 그러한 등가물은 본 발명에 의해 포함되도록 의도된다.
본 명세서 및 후술되는 청구범위 전체에 걸쳐, 문맥상 달리 필요로 하지 않는 한, 단어 "포함하다" 및 변형 형태, 예컨대 "포함한다" 및 "포함하는"은 언급된 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 군을 포함하지만, 어떠한 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 군을 배제하지는 않음을 내포하는 것으로 이해될 것이다. 본 명세서에서 사용될 때, 용어 "포함하는"은 용어 "함유하는" 또는 "구비하는"으로 치환될 수 있거나, 경우에 따라서는 본 명세서에 사용될 때 용어 "갖는"으로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, "~로 이루어진"은 청구범위 요소에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계, 또는 구성성분을 배제한다. 본 명세서에서 사용될 때, "~로 본질적으로 이루어진"은 청구항의 기본적이고 신규한 특징에 실질적으로 영향을 주지 않는 재료 또는 단계를 배제하지 않는다. 본 출원의 태양 또는 실시 형태와 관련하여 본 명세서에 사용되는 모든 경우에, 임의의 전술한 용어 "포함하는", "함유하는", "구비하는" 및 "갖는"은 본 개시내용의 범주를 변동시키기 위해 용어 "~로 이루어진" 또는 "~로 본질적으로 이루어진"으로 대체될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 다수의 언급된 요소들 사이의 접속 용어 "및/또는"은 개별 선택지 및 조합된 선택지 둘 모두를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 2개의 요소들이 "및/또는"에 의해 결합되는 경우, 제1 선택지는 제2 요소 없이 제1 요소의 적용가능성을 지칭한다. 제2 선택지는 제1 요소 없이 제2 요소의 적용가능성을 지칭한다. 제3 선택지는 제1 요소와 제2 요소가 함께 적용가능함을 지칭한다. 이들 선택지 중 어느 것이든 하나는 이 의미 내에 속하는 것으로 이해되며, 이에 따라 본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "및/또는"의 요건을 충족시킨다. 이들 선택지 중 하나 초과의 동시 적용가능성 또한 이 의미 내에 속하는 것으로 이해되며, 이에 따라 용어 "및/또는"의 요건을 충족시킨다.
달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에 기재된 농도 또는 농도 범위와 같은 임의의 수치 값은 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 수치 값은 전형적으로 인용된 값의 ±10%를 포함한다. 예를 들어, 1 mg/mL의 농도는 0.9 mg/mL 내지 1.1 mg/mL를 포함한다. 마찬가지로, 1 mg/mL 내지 10 mg/mL의 농도 범위는 0.9 mg/mL 내지 11 mg/mL를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한, 수치 범위의 사용은 모든 가능한 하위범위, 그 범위 내의 모든 개별 수치 값, 예를 들어 그러한 범위 내의 정수 및 값의 분율을 명시적으로 포함한다.
아미노산 서열과 관련하여 사용될 때, 어구 "퍼센트(%) 서열 동일성" 또는 "% 동일성" 또는 "와 동일한 %"는 아미노산 서열의 전체 길이를 구성하는 아미노산 잔기의 수와 대비하여 2개 이상의 정렬된 아미노산 서열의 동일한 아미노산의 매치("히트(hit)")의 수를 나타낸다. 다른 측면에서는, 정렬을 사용하여, 2개 이상의 서열에 대하여, 서열들이 당업계에 알려진 바와 같은 서열 비교 알고리즘을 사용하여 측정된 바와 같은 최대 일치도에 대해 비교되고 정렬될 때, 또는 수작업으로 정렬되고 시각적으로 검사될 때, 동일한 아미노산 잔기의 백분율(예를 들어, 아미노산 서열의 전장 대비 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성)이 결정될 수 있다. 따라서, 서열 동일성을 결정하기 위해 비교되는 서열들은 아미노산의 치환(들), 부가(들) 또는 결실(들)에 의해 상이할 수 있다. 단백질 서열들을 정렬하기에 적합한 프로그램은 당업자에게 알려져 있다. 단백질 서열들의 서열 동일성 백분율은, 예를 들어 CLUSTALW, Clustal Omega, FASTA 또는 BLAST와 같은 프로그램을 사용하여, 예를 들어 NCBI BLAST 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다(문헌[Altschul SF, et al (1997), Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]).
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "대상체"는 본 출원의 일 실시 형태에 따른 방법에 의해 치료될 것이거나 치료된 적이 있는 임의의 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간을 의미한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "포유동물"은 모든 포유동물을 포함한다. 포유동물의 예에는 소, 말, 양, 돼지, 고양이, 개, 마우스, 래트, 토끼, 기니 피그, 비인간 영장류 (NHP), 예컨대 원숭이 또는 유인원, 인간 등, 더 바람직하게는 인간이 포함되지만 이로 제한되지 않는다.
본 출원의 독자를 돕기 위한 시도로, 다양한 단락 또는 섹션에서 설명이 분리되어 있거나 본 출원의 다양한 실시 형태로 설명되고 있다. 이들 분리는 단락 또는 섹션 또는 실시 형태의 요지를 다른 단락 또는 섹션 또는 실시 형태의 요지로부터 분리하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 반대로, 당업자는 발명의 상세한 설명이 넓은 응용을 가지며, 고려될 수 있는 다양한 섹션, 단락, 및 문장의 모든 조합을 포함한다는 것을 이해할 것이다. 임의의 실시예의 논의는 단지 예시적인 것으로 의도되며, 청구범위를 포함하는 본 개시내용의 범주가 이들 실시예로 제한됨을 시사하고자 의도되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "IL-17" 또는 "IL-17A"는 인터류킨 17A를 지칭한다. 그것은 IL17, CTLA8, 또는 CTLA-8로도 명명된다. 인터류킨 17A는 전염증성 사이토카인이다. 이 사이토카인은 IL-23에 의한 자극에 반응하여 T 헬퍼 17 세포로서 알려진 T 헬퍼 세포의 유형에 의해 생성된다. IL17A에 의해 인코딩된 단백질은 IL17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E 및 IL-17F를 포함한 IL-17 패밀리의 창시 구성원(founding member)이다. IL-17E는 IL-25로도 알려져 있다. IL-17 패밀리의 모든 구성원은 유사한 단백질 구조를 갖는다. IL-17은 NF-카파B 및 미토겐-활성화된 단백질 키나제의 활성을 조절한다. 그것은 IL-6 및 사이클로옥시게나제-2(PTGS2/COX-2)의 발현을 자극할 뿐만 아니라 산화질소(NO)의 생성을 향상시킬 수 있다. 고수준의 IL17은 류마티스성 관절염, 건선 및 다발성 경화증을 포함한 몇몇 만성 염증성 질병과 관련되어 있다. "IL-17"은 임의의 동물종으로부터의 IL-17A뿐만 아니라 IL-17A의 재조합 산물을 포함한다. IL-17은 IL-17A의 동종이량체 또는 IL-17A와 IL-17F의 이종이량체로 존재할 수 있다. 인간 IL-17의 예시적인 아미노산 서열이 GenBank 수탁 번호 NP_002181.1로 제시되어 있으며, 이는 핵산 서열, 예컨대 GenBank 수탁 번호 NM_002190.3과 같은 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "조절제"는 소분자 화합물 및 대분자, 예컨대 항체를 포함하여, IL-17에 결합할 수 있는 임의의 작용제(agent) 또는 분자를 지칭한다.
용어 "소분자 조절제(들)" 및/또는 "SM 조절제(들)" 및/또는 "IL-17의 SM 조절제(들)"는 본 명세서에서 상호교환 가능하게 사용되며, IL-17에 결합할 수 있고 분자량이 약 100 g/mol 내지 약 1500 g/mol, 또는 400 g/mol 내지 약 1050 g/mol, 또는 500 g/mol 내지 약 1000 g/mol, 또는 약 600 g/mol 내지 약 900 g/mol, 또는 약 300 g/mol 내지 약 750 g/mol, 또는 약 500 내지 약 800 g/mol의 범위인 임의의 소분자 화합물을 지칭한다. 대안적으로, SM 조절제는 분자량이 약 100 g/mol 또는 200 g/mol 또는 약 300 g/mol 또는 약 400 g/mol 또는 약 500 g/mol 또는 약 600 g/mol의 하한 내지 약 400 g/mol 또는 약 500 g/mol 또는 약 600 또는 약 700 g/mol 또는 약 800 g/mol 또는 약 900 g/mol 또는 약 1000 g/mol 또는 약 1100 g/mol, 또는 약 1200 g/mol 또는 약 1300 g/mol 또는 약 1400 g/mol 또는 약 1500 g/mol의 상한일 수 있다.
용어 "대분자 조절제(들)" 및/또는 "LM 조절제(들)" 및/또는 "IL-17의 LM 조절제(들)"는 본 명세서에서 상호교환 가능하게 사용되며, IL-17에 결합할 수 있고, 분자량이 약 1500 달톤 초과이거나 바람직하게는 분자량이 약 2000 달톤 내지 약 250,000 달톤의 범위인 임의의 대분자 화합물(예를 들어, 항체, 단백질 등)을 지칭한다. 달톤(기호 Da)은 본 명세서에서 몰질량의 단위로 사용되며, 정의는 다음과 같다: 1 Da = 1 g/mol.
소분자의 경우, 절대 입체화학은 칸-인골드-프렐로그(Cahn-Ingold-Prelog) R-S 체계에 따라 특정된다. 절대 배치가 알려진 키랄 중심은 표준 순위 결정 규칙(standard sequence-rule) 절차에 의해 배정된 접두사 R 및 S로 묘사되거나 표지되고, 필요한 경우 적절한 로칸트(locant)가 앞에 붙는다(문헌[Pure & Appl. Chem. 45, 1976, 11-30]). 소정의 예는 (R*) 또는 (S*)로서 묘사되거나 표지되는 화학 구조를 함유한다. (R*) 또는 (S*)가 화합물의 명칭에서 또는 화합물의 화학적 표현에서 사용되는 경우, 그러한 화합물은 그러한 입체중심에서 순수한 단일 이성질체이지만; 그러한 입체중심의 절대 배치는 확립되어 있지 않음을 전달하고자 한다. 따라서, (R*)로 지정되는 화합물은 그러한 입체중심에서 (R) 또는 (S) 중 어느 하나의 절대 배치를 갖는 순수한 단일 이성질체인 화합물을 지칭하고, (S*)로 지정되는 화합물은 그러한 입체중심에서 (R) 또는 (S) 중 어느 하나의 절대 배치를 갖는 순수한 단일 이성질체인 화합물을 지칭한다. 예를 들어, 는 하기 중 어느 하나인 화합물을 지칭한다:
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "유리 IL-17"은 생물학적 샘플 내의 소분자 조절제 또는 대분자 조절제에 결합되지 않은 IL-17 분자(들)를 지칭한다.
용어 "샘플"과 "생물학적 샘플"은 본 명세서에서 상호교환 가능하게 사용되며, 유기체로부터 획득되거나 유래되고 진단 검정 또는 모니터링 검정에 사용될 수 있는 다양한 샘플 유형을 포함한다. 이들 용어는 생물학적 기원의 혈액 및 다른 액체 샘플, 고형 조직 샘플, 예컨대 생검 검체 또는 이로부터 유래되는 조직 배양물 또는 세포 및 이들의 자손을 포함한다. 이들 용어는, 조달 후에 임의의 방식으로, 예를 들어 시약에 의한 처리, 가용화, 또는 소정의 성분들에 대한 풍부화에 의해 조작된 샘플을 포함한다. 이 용어는 임상 샘플을 포함하고, 또한 세포 배양물, 세포 상층액, 세포 용해물, 혈청, 혈장, 생물학적 유체, 및 조직 샘플 내의 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 넓은 의미로 사용되며, 단일클론 또는 다중클론인 인간 항체, 인간화 항체, 복합 항체 및 키메라 항체 및 항체 단편을 포함한 면역글로불린 또는 항체 분자를 포함한다. 일반적으로, 항체는 특정 항원에 대하여 결합 특이성을 나타내는 단백질 또는 펩티드 사슬이다. 항체는 임의의 종으로부터 유래될 수 있으며, 예를 들어 IgM, IgG(예를 들어, IgGl, IgG2, IgG3, 또는 IgG4), IgD, IgA, 또는 IgE일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항원-결합 단편"은 항체 단편, 예컨대 다이아바디(diabody), Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 이황화물 안정화된 Fv 단편(dsFv), (dsFv)2, 이중특이성 dsFv(dsFv-dsFv'), 이황화물 안정화된 다이아바디(ds 다이아바디), 단일쇄 항체 분자(scFv), 단일 도메인 항체(sdab), scFv 이량체(2가 다이아바디), 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체의 일부분으로부터 형성된 다중특이성 항체, 낙타화(camelized) 단일 도메인 항체, 나노바디, 도메인 항체, 2가 도메인 항체, 또는 항원에 결합하지만 완전한 항체 구조를 포함하지 않는 임의의 다른 항체 단편을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "단일클론 항체"는 단일 분자 조성의 항체의 제조를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "다중클론 항체"는 동일한 항원 상의 또는 상이한 항원 상의 몇몇 상이한 특이적 항원 결정인자들에 결합하거나 그와 반응할 수 있는 상이한 항체 분자들의 조성물을 지칭한다. 다중클론 항체의 항원 특이성의 변동성은 다중클론 항체를 구성하는 개별 항체들의 가변 영역에, 특히 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역에 위치한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "포획제(capture agent)"는 IL-17이 조절제에 결합되어 있는지 그렇지 않은지에 관계 없이 IL-17에 특이적으로 결합하는 작용제를 지칭한다. "포획제"는 조절제에 결합되지 않은 IL-17 및 조절제에 결합된 IL-17에 특이적으로 결합하는 항체 또는 가용성 수용체와 같은 작용제를 포함하고자 한다. 그러한 포획제, 예컨대 포획 항체는 구매가능하거나 시험연구중(investigational)인 작용제일 수 있다. 포획제, 예컨대 포획 항체는 용액 상태로 제공되거나 표면에 사전-코팅될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "검출제"는 조절제에 결합되지 않은 IL-17 또는 조절제에 결합된 IL-17, 또는 둘 모두에 특이적으로 결합하는 작용제를 지칭한다. 바람직한 실시 형태에서, 용어 "검출제"는 조절제에 결합되지 않은 IL-17에는 특이적으로 결합하지만 조절제에 결합된 IL-17에는 그렇지 않은 작용제를 지칭한다. "검출제", 예컨대 검출 항체 또는 검출 가용성 수용체는 조절제에 결합되지 않은 IL-17 또는 조절제에 결합된 IL-17 중 어느 하나를 검출하는 데 사용될 수 있다. 검출제, 예컨대 검출 항체는 구매가능하거나 시험연구중일 수 있다. 검출제는 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해, 예컨대 방사성 또는 형광 태그를 사용하여, 또는 효소 또는 비오틴에 직접 또는 간접적으로 결합함으로써 검출될 수 있다. 바람직하게는, 검출제, 예컨대 검출 항체는 검출가능한 표지, 예컨대 효소 또는 비오틴으로 표지될 수 있다.
효소는 소정의 기질을 검출가능한 생성물로 전환시킬 수 있다. 예를 들어, 효소는 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)에서 일반적으로 사용되는 하기 효소들 중 하나일 수 있다:
비오틴은 비타민 B7로도 불리는 수용성 B 비타민이다. 비오틴은 상당한 친화성으로 아비딘, 스트렙타비딘 및 뉴트라비딘(NeutrAvidin)에 결합할 수 있다. 이들 단백질(아비딘, 스트렙타비딘 및 뉴트라비딘)은 상기 언급된 검출가능한 효소에 추가로 접합되어 신호를 생성할 수 있다.
용어 "특이적으로 결합하는"은 2개의 작용제, 예를 들어 항원과 항체에 대하여, 심지어 많은 다른 다양한 작용제의 존재 하에서도, 하나의 작용제(예를 들어, 항원)가 다른 작용제(예를 들어, 항체)와 회합하는 능력, 즉, 작용제들의 이종 혼합물에서 다른 작용제에 대한 하나의 작용제의 우선적인 결합을 나타내는 능력을 특징으로 하는 이들 작용제 사이의 결합을 지칭한다. 용어 "KD"는 해리 상수를 지칭하며, 이는 Kd 대 Ka의 비(즉, Kd/Ka)로부터 구해지고, 몰농도(M)로 표현된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 항원에 "특이적으로 결합하는" 항체는 1×10-7 M 이하, 바람직하게는 1×10-8 M 이하, 더 바람직하게는 5×10-9 M 이하, 1×10-9 M 이하, 5×10-10 M 이하, 또는 1×10-10 M 이하의 KD로 항원에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 지칭한다. 결합제에 대한 KD 값은 본 발명을 고려하여 당업계의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 항체의 KD는 표면 플라즈몬 공명을 사용함으로써, 예컨대 바이오센서 시스템, 예를 들어 Biacore® 시스템을 사용함으로써, 또는 바이오층 간섭법 기술, 예컨대 Octet RED96 시스템을 사용함으로써 결정될 수 있다. 항체의 KD 값이 작을수록, 항체가 표적 항원에 결합하는 친화도는 더 높다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "키트"는 시약 및 다른 물질의 조합을 지칭한다. 키트는 완충제, 단백질 안정화 시약, 신호 생성 시스템(예를 들어, 형광 신호 발생 시스템), 항체, 제어 단백질뿐만 아니라, 시험 용기(예를 들어, 미세적정 플레이트 등)와 같은 시약을 포함할 수 있는 것으로 고려된다. 용어 "키트"는 시약 및/또는 다른 물질의 특정 조합으로 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 일 실시 형태에서, 키트는 시약의 사용에 대한 설명서를 추가로 포함한다. 시험 키트는 임의의 적합한 방식으로 패키징될 수 있는데, 전형적으로는, 필요에 따라 시험을 수행하기 위한 지시 시트와 함께, 단일 용기 또는 다양한 용기 내에 요소들을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 키트는 또한 바람직하게는 양성 대조군 샘플을 포함한다. 키트는 당업계에 알려진 다양한 방식으로 생성될 수 있다.
IL-17 표적 결합 검정
본 출원은 대체적으로 IL-17 표적 결합 검정에 관한 것이다. 본 출원을 사용하여, 총 IL-17 검출 검정과 함께, IL-17 및 SM 조절제(들)를 포함하는 샘플 내의 유리 IL-17(즉, SM 조절제(들)에 결합되지 않은 IL-17)의 양을 측정하여, SM 조절제에 의한 IL-17 표적 결합의 수준이 결정될 수 있다.
SM 조절제를 수반하는 연구에서, 현재 이용가능한 검정은 단지 생물학적 샘플 내의 IL-17의 총량만을 측정할 수 있는데, 그 이유는, 그러한 검정에서의 검출 항체는 유리 IL-17(즉, SM 조절제(들)에 결합되지 않은 IL-17)과 SM 조절제(들)에 결합된 IL-17 사이를 구별할 수 없기 때문이다. 따라서, 그러한 생물학적 샘플 내의 IL-17과 이의 SM 조절제(들) 사이의 결합은 모니터링될 수 없다. 그러나, 본 출원은 IL-17의 소 조절제의 존재 하에서 샘플 내의 유리 IL-17의 양을 결정하는 신규한 방법을 제공한다. IL-17의 총량으로부터 유리 IL-17의 양을 차감함으로써, 생물학적 샘플 내의 SM 조절제에 의한 IL-17 결합의 수준이 결정될 수 있다. 결과적으로, 이러한 혁신적인 방법은 임상적으로 관련된 파라미터, 예컨대 약동학적(PK) 및 약력학적(PD) 정보를 연구하는 데 사용될 수 있으며, 이러한 정보는 결과적으로, 효능 및 안전성을 최적화하기 위한 최적 투여량을 결정하는 데 도움이 될 수 있다. 더욱이, 본 명세서에 기재된 방법은 건강한 대상체 또는 환자에게 적용될 수 있는데, 그 이유는, 이러한 혁신적인 방법은 질병 판독(들)과 무관하게 SM 조절제(들)들 존재 하에서 유리 IL-17을 측정할 수 있기 때문이다.
따라서, 본 출원은 IL-17 및 IL-17의 SM 조절제를 포함하는 샘플 내의 유리 IL-17의 양을 결정하는 방법을 제공하며, (도 1b를 참조하여) 상기 방법은
i.
상기 샘플을 제1 포획 항체와 접촉시켜, 상기 제1 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17을 포함하는 제1 복합체, 및 상기 제1 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17을 포함하는 제2 복합체를 포함하는 혼합물을 형성하는 단계;
ii.
단계 i)로부터의 상기 혼합물을 제1 검출제(바람직하게는, 제1 검출 항체)와 접촉시켜, 상기 제1 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17, 및 상기 제1 검출제를 포함하는 제3 복합체를 형성하지만, 상기 제1 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17, 및 상기 제1 검출제를 포함하는 제4 복합체를 형성하지 않는 단계; 및
iii.
상기 제3 복합체 내의 상기 제1 검출제의 양을 측정함으로써 상기 유리 IL-17의 양을 결정하는 단계를 포함한다.
샘플을 제1 포획 항체와 접촉시킨 후에, 제1 포획 항체는 샘플 내의 유리 IL-17 및 SM 조절제에 결합된 IL-17에 특이적으로 결합하여, 혼합물 중에 각각 제1 및 제2 복합체를 형성한다. 소정 실시 형태에서, 제1 포획 항체는 고체 담체에 부착되고, 혼합물은 샘플의 나머지와 함께 고체 담체에 부착된 제1 IL-17 복합체 및 제2 IL-17 복합체를 함유한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "제1 검출제"는 제1 포획 항체에 의해 포획되는 유리 IL-17에는 특이적으로 결합하지만, 제1 포획 항체에 의해 포획되는 조절제-결합된 IL-17에는 그렇지 않은 작용제, 예컨대 항체 또는 수용체를 지칭한다. 구체적으로는, 제1 검출제를 제1 복합체 및 제2 복합체와 접촉시킬 때, 그것은 제1 포획 항체, 유리 IL-17, 및 제1 검출제를 포함하는 제3 복합체를 형성하지만, 제1 포획 항체, 조절제-결합된 IL-17, 및 제1 검출제를 포함하는 제4 복합체를 형성하지 않는다.
따라서, 제1 포획 항체와 제1 검출제는 IL-17 및 IL-17의 SM 조절제를 포함하는 샘플 내의 유리 IL-17의 양을 측정하기 위해 쌍으로 사용된다.
예시적인 제1 검출제 및 쌍을 형성하는 제1 항체는 하기 표 1에 열거된 쌍으로부터 선택될 수 있다.
[표 1]
표 1에 열거된 제1 검출제 중에서, Janssen Biotech, Inc.로부터 입수된 IL-17 항체 mAb7024, mAb3584, mAb3077, mAb732, mAb4538, 및 mAb5548은 미국 특허 제8,519,107호에 개시되어 있으며, 이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 이의 상세한 서열 정보가 표 2에 열거되어 있다.
[표 2]
소정 실시 형태에서, 제1 검출제, 예컨대 제1 검출 항체는 검출가능한 표지로 표지되며, 바람직하게는 표지는 효소 또는 비오틴이다. 추가의 실시 형태에서, 제1 검출제는 표지된 효소, 예컨대 스트렙타비딘 접합된 서양고추냉이 퍼옥시다제와 상호작용하기 위한 마커, 예컨대 비오틴으로 표지되는데, 이는 과산화수소의 존재 하에서 테트라메틸벤지딘과 작용하여 제1 검출제의 양을 결정하기 위한 색상 신호를 발생한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "세척", "세척 단계", 또는 "세척하는"은 단계 (i)에서의 혼합물로부터 포획 항체에 결합되지 않은 (유리 IL-17 및 조절제-결합된 IL-17 둘 모두를 포함한) 총 IL-17을 분리하는 데 사용되는 공정을 지칭한다. 세척에 사용되는 용액은 일반적으로 완충액("세척 완충액")이다. 일부 실시 형태에서, 세척 완충액은 저농도의 세제(detergent)를 함유한다. 일부 실시 형태에서, 세척 완충액은 150 mM NaCl 및 0.05% Tween 20을 포함하는 pH = 약 7.4의 10 mM 인산염 완충액이다. 세척 완충액의 pH는 바람직하게는 약 6 내지 약 9의 범위이다. 일부 실시 형태에서, pH는 약 7.0이다. 세척 단계는 1회 또는 다회(예를 들어, 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 또는 6회) 수행될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 세척 단계는 3 내지 6회 수행된다.
소정 실시 형태에서, 세척 단계는 단계 (i) 후에 그리고 혼합물을 제2 검출제와 접촉시키는 단계 (ii) 전에 수행된다.
일부 실시 형태에서, 어떠한 세척 단계도 수행되지 않는다. 예를 들어, 소정 실시 형태에서, 어떠한 세척 단계도 단계 (i) 후에 그리고 혼합물을 제2 검출제와 접촉시키는 단계 (ii) 전에 수행되지 않는다.
본 출원은 대상체에서 IL-17의 SM 조절제(들)의 표적 결합을 결정하는 방법을 추가로 제공한다. 상기 방법은 a) 전술된 바와 같이, SM 조절제의 투여 전에 대상체로부터의 샘플 내의 유리 IL-17의 양을 결정하는 단계; b) 전술된 바와 같이, SM 조절제의 투여 후에 대상체로부터의 샘플 내의 유리 IL-17의 양을 결정하는 단계; 및 c) 단계 a)와 단계 b)로부터 결정된 유리 IL-17의 양을 비교하는 단계를 포함한다. 또는, 상기 방법은 (aa) 전술된 바와 같이, SM 조절제의 투여 후에 2개 이상의 시점에서 대상체로부터의 샘플 내의 유리 IL-17의 양을 결정하는 단계; 및 (bb) SM 조절제의 투여 후에 다양한 시점에서의 유리 IL-17의 양의 변화를 평가하는 단계를 포함할 수 있다. 그러한 바와 같이, IL-17의 SM 조절제의 표적 결합 활성은 평가되고, IL-17의 SM 조절제의 치료 계획(therapeutic regime)의 조정을 보조하는 데 사용될 수 있다.
본 출원은 IL-17 및 IL-17의 SM 조절제를 포함하는 샘플 내의 총 IL-17(유리 IL-17 및 조절제-결합된 IL-17)의 양을 결정하는 방법을 추가로 또한 제공한다. (예를 들어, 도 1c를 참조하여) 상기 방법은
i.
상기 샘플의 일부분을 제2 포획 항체와 접촉시켜, 상기 제2 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17을 포함하는 제5 복합체, 및 상기 제2 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17을 포함하는 제6 복합체를 포함하는 제2 혼합물을 형성하는 단계;
ii.
상기 제2 혼합물을 제2 검출제(바람직하게는, 제2 검출 항체)와 접촉시켜, 상기 제2 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17, 및 상기 제2 검출제를 포함하는 제7 복합체, 및 상기 제2 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17, 및 상기 제2 검출제를 포함하는 제8 복합체를 형성하는 단계;
iii.
상기 제7 복합체 및 상기 제8 복합체 내의 상기 제2 검출제의 총량을 측정함으로써 상기 IL-17의 총량을 결정하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "제2 포획 항체"와 "제2 검출제"(바람직하게는, "제2 검출 항체")는 샘플 내의 IL-17의 총량(즉, 유리 IL-17 및 조절제-결합된 IL-17)을 측정하기 위해 쌍으로 사용된다. 구체적으로는, 제2 검출제는 제2 포획 항체에 의해 포획되는 유리 IL-17 및 제2 포획 항체에 의해 포획되는 조절제-결합된 IL-17 둘 모두에 결합한다. 따라서, 제2 검출제를 제2 복합체와 접촉시킬 때, 그것은 제2 포획 항체, SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17 및 제2 검출제를 포함하는 제7 복합체, 및 제2 포획 항체, SM 조절제에 결합된 IL-17, 및 제2 검출제를 포함하는 제8 복합체를 형성한다.
따라서, 제2 포획 항체와 제2 검출제는 샘플 내의 총 IL-17의 양을 측정하기 위해 쌍으로 사용된다.
예시적인 제2 검출제 및 쌍을 형성하는 제2 항체는 하기 표 3에 열거된 쌍으로부터 선택될 수 있다.
[표 3]
소정 실시 형태에서, 제2 검출제는 검출가능한 표지로 표지되며, 바람직하게는 표지는 효소 또는 비오틴이다. 추가의 실시 형태에서, 제2 검출제는 표지된 효소, 예컨대 스트렙타비딘 접합된 서양고추냉이 퍼옥시다제와 상호작용하기 위한 마커, 예컨대 비오틴으로 표지되는데, 이는 과산화수소의 존재 하에서 테트라메틸벤지딘과 작용하여 제2 검출제, 예컨대 제2 검출 항체의 양을 결정하기 위한 색상 신호를 발생한다.
소정 실시 형태에서, 세척 단계는 단계 (i) 후에 그리고 제2 혼합물을 제2 검출제와 접촉시키는 단계 (ii) 전에 수행된다.
일부 실시 형태에서, 어떠한 세척 단계도 수행되지 않는다. 예를 들어, 소정 실시 형태에서, 어떠한 세척 단계도 단계 (i) 후에 그리고 제2 혼합물을 제2 검출제와 접촉시키는 단계 (ii) 전에 수행되지 않는다.
본 출원은 IL-17 및 IL-17의 SM 조절제를 포함하는 샘플 내의 조절제-결합된 IL-17의 양을 결정하는 방법을 추가로 또한 제공한다. 상기 방법은, a) 전술된 바와 같이, 제1 포획 항체 및 제1 검출제를 사용하여 샘플 내의 유리 IL-17의 양을 결정하는 단계; b) 전술된 바와 같이, 제2 포획 항체 및 제2 검출제를 사용하여 샘플 내의 총 IL-17의 양을 결정하는 단계; 및 c) 단계 (b)에서의 총 IL-17의 양으로부터 단계 (a)에서 결정된 유리 IL-17의 양을 차감하여 샘플 내의 조절제-결합된 IL-17의 양을 얻는 단계를 포함한다.
샘플 내의 조절제-결합된 IL-17의 양을 측정함으로써, SM 조절제의 특이성 및 표적 결합이 평가될 수 있다.
앞서 언급된 바와 같이, 용어 "소분자 조절제(들)" 및/또는 "SM 조절제(들)" 및/또는 "IL-17의 SM 조절제"는, IL-17에 결합할 수 있고 분자량이 약 100 g/mol 내지 약 1500 g/mol, 또는 400 g/mol 내지 약 1050 g/mol, 또는 500 g/mol 내지 약 1000 g/mol, 또는 약 600 g/mol 내지 약 900 g/mol, 또는 약 300 g/mol 내지 약 750 g/mol, 또는 약 500 내지 약 800 g/mol의 범위인 임의의 소분자 화합물을 지칭한다. 대안적으로, SM 조절제는 분자량이 약 100 g/mol 또는 200 g/mol 또는 약 300 g/mol 또는 약 400 g/mol 또는 약 500 g/mol 또는 약 600 g/mol의 하한 내지 약 400 g/mol 또는 약 500 g/mol 또는 약 600 또는 약 700 g/mol 또는 약 800 g/mol 또는 약 900 g/mol 또는 약 1000 g/mol 또는 약 1100 g/mol, 또는 약 1200 g/mol 또는 약 1300 g/mol 또는 약 1400 g/mol 또는 약 1500 g/mol의 상한일 수 있다.
본 명세서에 사용된 IL-17의 예시적인 SM 조절제는, 제한 없이, 하기 표 4에 열거된 화합물 #1 내지 화합물 #6 및 이들의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다:
[표 4]
하기 화합물:
은 문헌[Liu, S. et al. "Binding site elucidation and structure guided design of macrocyclic IL-17A antagonists," Scientific Reports, 6 30859, DOI: 10.1038/srep30859 (2016)]에 개시되어 있다. 이 화합물은 부분입체 이성질체들의 혼합물로서 제조되었으며, 이것을 초임계 유체 크로마토그래피(SFC)(컬럼: DAICEL CHIRALPAK AD (250 mm * 30 mm, 10 um); 이동상: [0.1% NH3H2O IPA]; B%: 40% 내지 40%, 5.3분; 420분)로 분리하였다. 본 명세서에서 화합물 #1로 지정된 더 강력한 부분입체 이성질체: 을 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 평가하였다.
화합물 #2 내지 화합물 #5는 발명의 명칭이 "Macrocyclic Compounds for Modulating IL-17"인 국제 특허 출원 공개 WO 2013/116682호에 개시되어 있으며, 이는 본 명세서에 참고로 포함된다(예를 들어, 도 12, 화합물 479, 화합물 529, 화합물 487, 및 화합물 159를 각각 참조).
화합물 #6은 발명의 명칭이 "Compounds for Modulating IL-17"인 국제 특허 출원 공개 WO 2014/066726호에 개시되어 있으며, 이는 본 명세서에 참고로 포함된다(예를 들어, 도 6, 화합물 286 참조).
소정 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 샘플 내의 IL-17의 정량 하한(LLOQ)이 약 0.01 또는 약 0.1 또는 약 0.25, 또는 약 0.5, 또는 약 0.75, 또는 약 1 pg/ml인 검출 감도를 달성한다.
소정 실시 형태에서, IL-17은 인간 IL-17이다.
소정 실시 형태에서, 샘플은 인간 IL-17의 SM 조절제에 의한 생체외 또는 생체내 처리 하에서 인간 대상체로부터 획득되는 생물학적 샘플이다.
소정 실시 형태에서, 샘플은 인간 IL-17이 주사된 동물(예를 들어, 마우스)로부터 획득된 생물학적 샘플일 수 있다.
소정 실시 형태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직으로부터 제조된 샘플, 또는 혈청, 혈장 또는 다른 생물학적 유체 샘플로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 출원의 실시 형태에 따르면, 상기 방법은 SM 조절제를 대상체에게 투여하기 전 및 후에 대상체로부터의 생물학적 샘플 내의 유리 IL-17의 결정된 양에 기초하여 대상체에 대한 치료 계획을 조정하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 조정은 SM 조절제에 의한 치료의 투여량 또는 빈도를 증가 또는 감소시키는 것이거나, 현재 사용되는 SM 조절제가 IL-17에 대해 역치 수준 미만으로 결합하는 것으로 밝혀진 경우, 상이한 조절제로 교체하는 것일 수 있다. 치료 계획은 또한 대상체에 대한 SM 조절제의 투여 후 2개 이상의 시점에서 대상체로부터의 생물학적 샘플 내의 유리 IL-17의 결정된 양에 기초하여 조정될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 대상체는 IL-17-매개 염증성 질병을 앓고 있다. IL-17-매개 염증성 질병은 건선, 건선성 관절염, 류마티스성 관절염, 강직성 척추염, 화농성 한선염, 수포성 유사천포창, 아토피성 피부염, 백반증, 다발성 경화증, 천식, 포도막염, 만성 폐색성 폐 장애, 다발성 골수종, 및 전신 홍반성 루푸스로부터 선택될 수 있다. 일부 실시 형태에서, IL-17-매개 염증성 질병은 건선, 건선성 관절염, 및 강직성 척추염으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, IL-17-매개 염증성 질병은 건선이다. 일부 실시 형태에서, IL-17-매개 염증성 질병은 건선성 관절염이다. 일부 실시 형태에서, IL-17-매개 염증성 질병은 강직성 척추염이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 본 발명의 IL-17 표적 결합 검정은 환자에서 2상 용량에 대해 결정하기 위한 그리고 백업 분자 또는 시험 재설계를 위하여 개선된 표적 결합이 필요한지의 여부를 결정하기 위한 인간 1상 시험에서, 인간 시험에서 용량을 모델링하기 위한 전임상 모델에 사용될 수 있다. 환자 2상 시험에서 표적 결합 검정과 효능의 상관관계는 개선된 표적 결합이 더 우수한 효능에 필요한지의 여부를 결정하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 검정은 질병에 대한 임의의 판독과 무관하게 소분자 IL-17 조절제(들)의 존재 하에서 유리 IL-17을 측정하는 데 사용될 수 있다. 이 검정은 건강한 대상체 또는 IL-17-매개 염증성 질병의 환자에게 적용될 수 있다. 표적 결합 판독 및 시험 분자 PK는, 효능을 달성하고 안전성 연구에서 신호를 최소화하도록 하는 최적 용량을 결정하기 위해 모델링하는 데 사용될 수 있다.
본 출원은 IL-17 및 SM 조절제를 포함하는 샘플 내의 유리 IL-17의 양을 결정하기 위한 키트를 추가로 또한 제공하며, 상기 키트는
i.
제1 포획 항체 - 여기서, 상기 샘플과의 접촉 시에, 상기 제1 포획 항체는 상기 제1 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17을 포함하는 제1 복합체, 및 상기 제1 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17을 포함하는 제2 복합체를 각각 형성함 -; 및
ii.
제1 검출제(예컨대, 제1 검출 항체) - 여기서, 상기 제1 복합체 및 상기 제2 복합체와의 접촉 시에, 상기 제1 검출제는 상기 제1 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17, 및 상기 제1 검출제를 포함하는 제3 복합체를 형성하지만, 상기 제1 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17, 및 상기 제1 검출제를 포함하는 제4 복합체를 형성하지 않음 - 를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 키트는 제1 검출제를 검출하기 위한 하나 이상의 시약을 추가로 포함한다.
본 출원은 IL-17 및 SM 조절제를 포함하는 샘플 내의 조절제-결합된 IL-17의 양을 결정하기 위한 키트를 추가로 또한 제공하며, 상기 키트는
i.
제1 포획 항체 - 여기서, 상기 샘플과의 접촉 시에, 상기 제1 포획 항체는 상기 제1 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17을 포함하는 제1 복합체, 및 상기 제1 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17을 포함하는 제2 복합체를 형성함 -;
ii.
제1 검출제(예컨대, 제1 검출 항체) - 여기서, 상기 제1 복합체 및 상기 제2 복합체와의 접촉 시에, 상기 제1 검출제는 상기 제1 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17, 및 상기 제1 검출제를 포함하는 제3 복합체를 형성하지만, 상기 제1 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17, 및 상기 제1 검출제를 포함하는 제4 복합체를 형성하지 않음 -; 및
iii.
제2 포획 항체 - 여기서, 상기 샘플과의 접촉 시에, 상기 제2 포획 항체는 상기 제2 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17을 포함하는 제5 복합체, 및 상기 제2 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17을 포함하는 제6 복합체를 형성함 -;
iv.
제2 검출제(예컨대, 제2 검출 항체) - 여기서, 상기 제5 복합체 및 상기 제6 복합체와의 접촉 시에, 상기 제2 검출제는 상기 제2 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17, 및 상기 제2 검출제를 포함하는 제7 복합체, 및 상기 제2 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17, 및 상기 제2 검출제를 포함하는 제8 복합체를 각각 형성함 - 를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 키트는 제1 검출제 및/또는 제2 검출제를 검출하기 위한 하나 이상의 시약을 추가로 포함한다.
실시 형태
본 발명은 또한 하기의 비제한적인 실시 형태를 제공한다.
실시 형태 1은 IL-17 및 IL-17의 소분자(SM) 조절제를 포함하는 샘플 내의 유리 IL-17의 양을 결정하는 방법이며, 상기 방법은
i.
상기 샘플을 제1 포획 항체와 접촉시켜, 상기 제1 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17을 포함하는 제1 복합체, 및 상기 제1 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17을 포함하는 제2 복합체를 포함하는 혼합물을 형성하는 단계;
ii.
단계 i)로부터의 상기 혼합물을 제1 검출제와 접촉시켜, 상기 제1 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17, 및 상기 제1 검출제를 포함하는 제3 복합체를 형성하지만, 상기 제1 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17, 및 상기 제1 검출제를 포함하는 제4 복합체를 형성하지 않는 단계; 및
iii.
상기 제3 복합체 내의 상기 제1 검출제의 양을 측정함으로써 상기 유리 IL-17의 양을 결정하는 단계를 포함한다.
실시 형태 2는, 실시 형태 1에 있어서, 상기 제1 검출제는 제1 항체인, 방법이다.
실시 형태 3은, 실시 형태 1 또는 실시 형태 2에 있어서, 상기 제1 포획 항체 및 상기 제1 검출제는 하기 표의 쌍으로부터 선택되는, 방법이다:
실시 형태 4는, 실시 형태 3에 있어서, 상기 제1 포획 항체는 DuoSet ELISA 키트 DY317(R&D Systems, Inc.)의 포획 항체이고, 상기 제1 검출제는 인간 mAb4538 항체(Janssen Biotech, Inc.로부터 입수됨)인, 방법이다.
실시 형태 5는, 실시 형태 1 내지 실시 형태 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 SM 조절제는 분자량이 약 100 내지 1500 g/mol인, 방법이다.
실시 형태 5a는, 실시 형태 5에 있어서, 상기 SM 조절제는 분자량이 약 400 내지 1050 g/mol인, 방법이다.
실시 형태 5b는, 실시 형태 5에 있어서, 상기 SM 조절제는 분자량이 약 500 내지 1000 g/mol인, 방법이다.
실시 형태 5c는, 실시 형태 5에 있어서, 상기 SM 조절제는 분자량이 약 500 내지 800 g/mol인, 방법이다.
실시 형태 5d는, 실시 형태 5에 있어서, 상기 SM 조절제는 분자량이 약 600 내지 900 g/mol인, 방법이다.
실시 형태 5e는, 실시 형태 5에 있어서, 상기 SM 조절제는 분자량이 약 300 내지 750 g/mol인, 방법이다.
실시 형태 5f는, 실시 형태 5에 있어서, 상기 SM 조절제는 하기 구조를 갖는 화합물 #1 내지 화합물 #6 및 이들의 약제학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법이다:
실시 형태 5g는, 실시 형태 5에 있어서, 상기 SM 조절제는 하기 구조를 갖는 화합물 #2 내지 화합물 #6 및 이들의 약제학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법이다:
실시 형태 6은, 실시 형태 1 내지 실시 형태 5 중 어느 하나에 있어서, 단계 i)로부터의 상기 제1 혼합물을 단계 (ii)에서의 상기 제1 검출제와 접촉시키기 전에 어떠한 세척 단계도 수행되지 않는, 방법이다.
실시 형태 7은 대상체에서 IL-17의 SM 조절제의 표적 결합을 결정하는 방법으로서, 상기 방법은 a) 실시 형태 1 내지 실시 형태 6 중 어느 하나의 방법을 사용하여 상기 SM 조절제의 투여 전에 상기 대상체로부터의 샘플 내의 유리 IL-17의 양을 결정하는 단계; b) 실시 형태 1 내지 실시 형태 6 중 어느 하나의 방법을 사용하여 상기 SM 조절제의 투여 후에 상기 대상체로부터의 샘플 내의 유리 IL-17의 양을 결정하는 단계; 및 c) 단계 a)와 단계 b)로부터 결정된 유리 IL-17의 양을 비교하는 단계를 포함한다.
실시 형태 8은 대상체에서 IL-17의 SM 조절제의 표적 결합을 결정하는 방법으로서, 상기 방법은, a) 실시 형태 1 내지 실시 형태 6 중 어느 하나의 방법을 사용하여 상기 SM 조절제의 투여 후에 2개 이상의 시점에서 상기 대상체로부터의 샘플 내의 유리 IL-17의 양을 결정하는 단계; 및 b) 단계 a)로부터 결정된 유리 IL-17의 양을 비교하는 단계를 포함한다.
실시 형태 9는, 실시 형태 1 내지 실시 형태 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플은 상기 SM 조절제에 의한 생체외 또는 생체내 처리 하에서 인간 대상체로부터 획득되는 생물학적 샘플인, 방법이다.
실시 형태 10은, 실시 형태 1 내지 실시 형태 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 세포 또는 조직으로부터 제조되거나 추출된 샘플, 또는 혈청, 혈장 또는 다른 생물학적 유체 샘플로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법이다.
실시 형태 11은, 실시 형태 1 내지 실시 형태 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 상기 샘플 내의 상기 IL-17의 정량 하한(LLOQ)이 약 0.01 또는 약 0.1 또는 약 0.25 또는 약 0.5 또는 약 0.75, 또는 1 pg/ml인 검출 감도를 갖는, 방법이다.
실시 형태 12는 IL-17 및 IL-17의 SM 조절제를 포함하는 샘플 내의 조절제-결합된 IL-17의 양을 결정하는 방법으로서, 상기 방법은
i.
상기 샘플의 제1 일부분을 제1 포획 항체와 접촉시켜, 상기 제1 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17을 포함하는 제1 복합체, 및 상기 제1 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17을 포함하는 제2 복합체를 포함하는 제1 혼합물을 형성하는 단계;
ii.
단계 i)로부터의 상기 제1 혼합물을 제1 검출제와 접촉시켜, 상기 제1 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17, 및 상기 제1 검출제를 포함하는 제3 복합체를 형성하지만, 상기 제1 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17, 및 상기 제1 검출제를 포함하는 제4 복합체를 형성하지 않는 단계;
iii.
상기 샘플의 제2 일부분을 제2 포획 항체와 접촉시켜, 상기 제2 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17을 포함하는 제5 복합체, 및 상기 제2 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17을 포함하는 제6 복합체를 포함하는 제2 혼합물을 형성하는 단계;
iv.
상기 제2 혼합물을 제2 검출제와 접촉시켜, 상기 제2 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17, 및 상기 제2 검출제를 포함하는 제7 복합체, 및 상기 제2 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17, 및 상기 제2 검출제를 포함하는 제8 복합체를 형성하는 단계;
v.
상기 제3 복합체 내의 상기 제1 검출제의 양을 측정함으로써 상기 유리 IL-17의 양을 결정하는 단계;
vi.
상기 제7 복합체 및 상기 제8 복합체 내의 상기 제2 검출제의 총량을 측정함으로써 상기 IL-17의 총량을 결정하는 단계; 및
vii.
단계 (vi)에서의 상기 IL-17의 총량으로부터 단계 (v)에서 결정된 상기 유리 IL-17의 양을 차감함으로써 상기 샘플 내의 상기 조절제-결합된 IL-17의 양을 결정하는 단계를 포함한다.
실시 형태 13은, 실시 형태 12에 있어서, 상기 제1 검출제는 제1 검출 항체인, 방법이다.
실시 형태 14는, 실시 형태 12 또는 실시 형태 13에 있어서, 상기 제2 검출제는 제2 검출 항체인, 방법이다.
실시 형태 15는, 실시 형태 12 내지 실시 형태 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 포획 항체 및 상기 제1 검출제는 하기 표의 쌍으로부터 선택되는, 방법이다:
실시 형태 16은, 실시 형태 15에 있어서, 상기 제1 포획 항체는 DuoSet ELISA 키트 DY317(R&D Systems, Inc.)의 포획 항체이고, 상기 제1 검출제는 인간 mAb4538 항체(Janssen Biotech, Inc.로부터 입수됨)인, 방법이다.
실시 형태 17은, 실시 형태 12 내지 실시 형태 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 포획 항체 및 상기 제2 검출제는 하기 표의 쌍으로부터 선택되는, 방법이다:
실시 형태 18은, 실시 형태 17에 있어서, 상기 제2 포획 항체 및 상기 제2 검출제는 각각 DuoSet ELISA 키트 DY317(R&D Systems, Inc.)의 포획 항체 및 검출제인, 방법이다.
실시 형태 19는, 실시 형태 12 내지 실시 형태 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 SM 조절제는 하기 구조를 갖는 화합물 #1 내지 화합물 #6 및 이들의 약제학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법이다:
실시 형태 19a는, 실시 형태 12 내지 실시 형태 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 SM 조절제는 하기 구조를 갖는 화합물 #2 내지 화합물 #6 및 이들의 약제학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법이다:
실시 형태 20은, 실시 형태 12 내지 실시 형태 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플은 상기 SM 조절제에 의한 생체외 또는 생체내 처리 하에서 인간 대상체로부터 획득되는 생물학적 샘플인, 방법이다.
실시 형태 21은, 실시 형태 12 내지 실시 형태 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 세포 또는 조직으로부터 제조되거나 추출된 샘플, 또는 혈청, 혈장 또는 다른 생물학적 유체 샘플로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법이다.
실시 형태 22는, 실시 형태 12 내지 실시 형태 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 상기 샘플 내의 상기 IL-17의 정량 하한(LLOQ)이 약 0.01 또는 약 0.1 또는 약 0.25 또는 약 0.5 또는 약 0.75, 또는 1 pg/ml인 검출 감도를 갖는, 방법이다.
실시 형태 23은 IL-17 및 IL-17의 SM 조절제를 포함하는 샘플 내의 유리 IL-17의 양을 결정하기 위한 키트로서, 상기 키트는
iii.
제1 포획 항체 - 여기서, 상기 샘플과의 접촉 시에, 상기 제1 포획 항체는 상기 제1 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17을 포함하는 제1 복합체, 및 상기 제1 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17을 포함하는 제2 복합체를 형성함 -; 및
iv.
제1 검출제 - 여기서, 상기 제1 복합체 및 상기 제2 복합체와의 접촉 시에, 상기 제1 검출제는 상기 제1 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17, 및 상기 제1 검출제를 포함하는 제3 복합체를 형성하지만, 상기 제1 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17, 및 상기 제1 검출제를 포함하는 제4 복합체를 형성하지 않음 - 를 포함하며,
바람직하게는, 상기 제1 검출제는 제1 검출 항체이다.
실시 형태 24는, 실시 형태 23에 있어서, 제1 검출제는 제1 검출 항체인, 키트이다.
실시 형태 25는, 실시 형태 23 또는 실시 형태 24에 있어서, 상기 제1 포획 항체 및 상기 제1 검출제는 하기 표의 쌍으로부터 선택되는, 키트이다:
실시 형태 26은, 실시 형태 25에 있어서, 상기 제1 포획 항체는 DuoSet ELISA 키트 DY317(R&D Systems, Inc.)의 포획 항체이고, 상기 제1 검출제는 인간 mAb4538 항체(Janssen Biotech, Inc.로부터 입수됨)인, 키트이다.
실시 형태 27은 IL-17 및 IL-17의 SM 조절제를 포함하는 샘플 내의 조절제-결합된 IL-17의 양을 결정하기 위한 키트로서, 상기 키트는
i.
제1 포획 항체 - 여기서, 상기 샘플과의 접촉 시에, 상기 제1 포획 항체는 상기 제1 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17을 포함하는 제1 복합체, 및 상기 제1 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17을 포함하는 제2 복합체를 형성함 -;
ii.
제1 검출제 - 여기서, 상기 제1 복합체 및 상기 제2 복합체와의 접촉 시에, 상기 제1 검출제는 상기 제1 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17, 및 상기 제1 검출제를 포함하는 제3 복합체를 형성하지만, 상기 제1 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17, 및 상기 제1 검출제를 포함하는 제4 복합체를 형성하지 않음 -; 및
iii.
제2 포획 항체 - 여기서, 상기 샘플과의 접촉 시에, 상기 제2 포획 항체는 상기 제2 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17을 포함하는 제5 복합체, 및 상기 제2 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17을 포함하는 제6 복합체를 형성함 -;
iv.
제2 검출제 - 여기서, 상기 제5 복합체 및 상기 제6 복합체와의 접촉 시에, 상기 제2 검출제는 상기 제2 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17, 및 상기 제2 검출제를 포함하는 제7 복합체, 및 상기 제2 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17, 및 상기 제2 검출제를 포함하는 제8 복합체를 각각 형성함 - 를 포함하며,
바람직하게는, 상기 제1 검출제는 제1 검출 항체이고, 상기 제2 검출제는 제2 검출 항체이다.
실시 형태 28은, 실시 형태 27에 있어서, 제1 검출제는 제1 검출 항체인, 키트이다.
실시 형태 29는, 실시 형태 27 또는 실시 형태 28에 있어서, 상기 제2 검출제는 제2 검출 항체인, 키트이다.
실시 형태 29는, 실시 형태 27 내지 실시 형태 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 포획 항체 및 상기 제1 검출제는 하기 표의 쌍으로부터 선택되는, 키트이다:
실시 형태 31은, 실시 형태 30에 있어서, 상기 제1 포획 항체는 DuoSet ELISA 키트 DY317(R&D Systems, Inc.)의 포획 항체이고, 상기 제1 검출제는 인간 mAb4538 항체(Janssen Biotech, Inc.로부터 입수됨)인, 키트이다.
실시 형태 32는, 실시 형태 27 내지 실시 형태 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 포획 항체 및 상기 제2 검출제는 하기 표의 쌍으로부터 선택되는, 키트이다:
실시 형태 33은, 실시 형태 32에 있어서, 상기 제2 포획 항체 및 상기 제2 검출제는 각각 DuoSet ELISA 키트 DY317(R&D Systems, Inc.)의 포획 항체 및 검출제인, 키트이다.
실시예
당업자는 광범위한 본 발명의 개념으로부터 벗어나지 않고서 전술된 실시 형태에 변경이 이루어질 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 본 발명은 개시된 특정 실시 형태로 제한되는 것이 아니라, 본 명세서에 의해 한정되는 바와 같은 본 출원의 사상 및 범주 내의 변형들을 포함하도록 의도됨이 이해된다.
실시예 1
재료
(하기 표 5에 열거된) 3개의 포획 항체/검출제 쌍을 SM 조절제로서 (표 5에 전술된 바와 같은) 화합물 #1 내지 화합물 #6을 사용하여 시험하였다.
[표 5]
방법
재조합 IL-17의 2배 및 8점 연속 희석물을 1 ng/ml로부터 출발하여 희석제 중에 넣어서 2회 반복하여 제조하였다. SM 조절제에 대한 차별화 특성을 시험하기 위하여, 10 μM SM 조절제 또는 0.1% DMSO를 함유하는 비히클 대조군의 존재 하에서 IL-17 보정 샘플을 제조하였다. IL-17 샘플을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
고결합 96웰 플레이트를 실온에서 하룻밤 PBS 중 4 ㎍/ml의 포획 항체의 100 μL/웰로 코팅하였다. 코팅된 플레이트를 플레이트 세척기(Zoom HT Microplate Washer) 상에서 6 x 400 μL/웰로 세척하고, 실온에서 2.5시간 동안 300 μL/웰의 블로킹제(PBS 중 1% BSA)로 블로킹한 후, 플레이트 세척기 상에서 6 x 400 μL/웰로 블로킹하였다.
적정된 IL-17을 10 μM의 최종 농도의 SM 조절제와 인큐베이션함으로써 샘플을 제조하였다. 95 μL/웰의 샘플을 포획 항체 코팅된 플레이트에 첨가함으로써 ELISA 검정으로 IL-17 수준을 측정하였다. 플레이트를 실온에서 30분 동안 유지하고, 이어서 5 μL/웰의 검출제를 최종 500 ng/mL가 되도록 첨가하고, 실온에서 추가 30분 동안 유지한 후, 플레이트 세척기 상에서 6 x 400 μL/웰로 세척하였다. 스트렙타비딘 접합된 서양고추냉이 퍼옥시다제를 100 μL/웰로 첨가하고, 암실에서 실온에서 20분 동안 인큐베이션한 후, 플레이트 세척기 상에서 6 x 400 μL/웰로 인큐베이션하고, 이어서 100 μL/웰의 기질 용액을 첨가하고, 암실에서 실온에서 20분 동안 인큐베이션함으로써, 측정을 위한 색상의 발현을 수행하였다. 이어서, 50 μL/웰의 정지 용액을 첨가함으로써 반응을 정지시키고, 450 내지 540 nm에서 플레이트 판독기에서 플레이트를 측정하였다.
플레이트 판독기(Molecular Devices Spectra Max 340fPC)로부터의 광학 밀도(OD) 판독을 Softmax Pro6.3 및 GraphPad Prism으로 분석하고, OD 값 vs. IL-17 농도의 용량 반응 곡선으로서 플롯하였다.
결과
도 2a 내지 도 2f에 나타낸 바와 같이, 검출제로서의 mAb4538(500 ng/ml, 미국 특허 제8,519,107호에 개시된 바와 같음)과 쌍을 형성하는 DuoSet ELISA 키트 DY317의 포획 항체를 사용하여, IL-17의 농도에 상응하는 신호에 의해 (SM 조절제가 결합되지 않은) 유리 IL-17만이 검출될 수 있었지만, SM 조절제-결합된 IL-17은 검출될 수 없었다.
그러나, DuoSet ELISA 키트 DY317을 사용하거나 항체 ABIN1724556(CovalAb R&D(Antibodies Online))과 쌍을 형성하는 DuoSet ELISA 키트 DY317의 포획 항체를 사용하여, (유리 형태 및 조절제-결합된 형태의) 총 IL-17을 용량 의존적 방식으로 검출하였다(도 3a 내지 도 3f 및 도 4a 내지 도 4f).
실시예 2
실시예 1에 기재된 것과 유사한 ELISA 검정에 의해, 다양한 포획 항체/검출제 쌍(표 6으로부터 선택된 포획 항체 및 표 7로부터 선택된 검출제를 사용함)을 SM 조절제로서 화합물 #1을 사용하여 시험하였다. 하기 표 8은 유리 인간 IL-17을 SM 조절제-결합된 인간 IL-17과 구별할 수 있는, 이 실험에 의해 확인된 포획 항체/검출제 쌍을 열거하였다. 하기 표 9는 유리 인간 IL-17을 SM 조절제-결합된 인간 IL-17과 구별할 수 없는 포획 항체/검출제 쌍을 열거하였다.
[표 6]
[표 7]
[표 8]
[표 9]
실시예
3
이 실시예에서는, 적정된 SM 조절제와 함께 1000 pg/ml의 IL-17을 함유하는 샘플을, 검출제로서의 mAb4538(Janssen Biotech, Inc.로부터 입수됨)과 쌍을 형성하는 DuoSet ELISA 키트 DY317(R&D Systems, Inc.로부터 입수됨)의 포획 항체를 사용하여 검정하였다. 도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같이, 화합물의 증가하는 농도에 따라 유리 IL-17의 감소하는 수준이 검출되었는데, 이는, IL-17 SM 조절제의 용량-의존적 표적 결합을 입증한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Janssen Biotech, Inc.
<120> Compositions and Methods for an IL-17 Target Engagement Assay with Small Molecule Modulators
<130> 004852.11713/142WO1 (JBI6152WOPCT1)
<150> 63/077,978
<151> 2020-09-14
<150> 62/960,031
<151> 2020-01-12
<150> 62/908,195
<151> 2019-09-30
<160> 39
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LCDR1 of mAb4538, mAb732, and mAb3584
<400> 1
Arg Ala Ser Gln Asn Val Trp Ala Phe Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LCDR2 of mAb4538, mAb732, and mAb3584
<400> 2
Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LCDR3 of mAb4538 and mAb3584
<400> 3
Gln Gln Tyr Arg Ser Thr Leu Ser Leu Thr
1 5 10
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR1 of mAb4538, mAb732, and mAb3584
<400> 4
Ser Ser Ser Ala Ala Trp Gly
1 5
<210> 5
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR2 of mAb4538, mAb732, and mAb3584
<400> 5
Arg Ile Ser Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val
1 5 10 15
Lys Ser
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR3 of mAb4538, and mAb732
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Glu Val Asp Ser Met Tyr Tyr Ser Tyr Phe Asp Ile
1 5 10
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL of mAb4538 and mAb3584
<400> 7
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Trp Ala Phe
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Ser Thr Leu
85 90 95
Ser Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 8
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH of mAb4538 and mAb732
<400> 8
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Gly Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Ile Ser Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Asp Ser Met Tyr Tyr Ser Tyr Phe Asp
100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 9
<211> 215
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LC of mAb4538 and mAb3584
<400> 9
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Trp Ala Phe
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Ser Thr Leu
85 90 95
Ser Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gln Pro
100 105 110
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
115 120 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala
145 150 155 160
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
165 170 175
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
180 185 190
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
195 200 205
Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 10
<211> 454
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HC of mAb4538 and mAb732
<400> 10
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Gly Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Ile Ser Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Asp Ser Met Tyr Tyr Ser Tyr Phe Asp
100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LCDR3 of mAb732
<400> 11
Thr Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Ser Leu Thr
1 5 10
<210> 12
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL of mAb732
<400> 12
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Trp Ala Phe
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro
85 90 95
Ser Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LCDR1 of mAb7024 and mAb3077
<400> 13
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp Leu Asn
1 5 10
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LCDR2 of mAb7024 and mAb3077
<400> 14
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LCDR3 of mAb7024 and mAb3077
<400> 15
Gln Gln Tyr Ser Asp Asp Pro Thr
1 5
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR1 of mAb7024 and mAb3077
<400> 16
Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR2 of mAb7024
<400> 17
Ser Ile Ile Pro Trp Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR3 of mAb7024 and mAb3077
<400> 18
Asp Ser Glu Tyr Tyr Phe Asp His
1 5
<210> 19
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL of mAb7024 and mAb3077
<400> 19
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asp Asp Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 20
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH of mAb7024
<400> 20
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ser Ile Ile Pro Trp Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Glu Tyr Tyr Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 21
<211> 212
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LC of mAb7024 and mAb3077
<400> 21
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asp Asp Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gln Pro Lys Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn
115 120 125
Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val
130 135 140
Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu
145 150 155 160
Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser
165 170 175
Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser
180 185 190
Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro
195 200 205
Thr Glu Cys Ser
210
<210> 22
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HC of mAb3077
<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ser Ile Ile Pro Trp Phe Gly Trp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Glu Tyr Tyr Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LCDR1 of mAb5548
<400> 23
Ser Gly Asp Asn Leu Gly Asp Lys Tyr Ala Asn
1 5 10
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LCDR2 of mAb5548
<400> 24
Asp Asp Ile Asp Arg Pro Ser
1 5
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LCDR3 of mAb5548
<400> 25
Gly Ser Tyr Asp Phe Phe Leu Gly Leu Ile Val
1 5 10
<210> 26
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR1 of mAb5548
<400> 26
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 27
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR2 of mAb5548
<400> 27
Thr Ile Ser Leu Thr Ser Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 28
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR3 of mAb5548
<400> 28
Gln Leu Thr Leu Asp Val
1 5
<210> 29
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL of mAb5548
<400> 29
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Leu Gly Asp Lys Tyr Ala
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Asp Asp Ile Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Tyr Asp Phe Phe Leu Gly Leu
85 90 95
Ile Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 30
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH of mAb5548
<400> 30
Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Leu Thr Ser Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Leu Thr Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 31
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LC of mAb5548
<400> 31
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Leu Gly Asp Lys Tyr Ala
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Asp Asp Ile Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Tyr Asp Phe Phe Leu Gly Leu
85 90 95
Ile Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln
115 120 125
Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly
130 135 140
Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly
145 150 155 160
Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala
165 170 175
Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser
180 185 190
Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val
195 200 205
Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210
<210> 32
<211> 445
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HC of mAb5548
<400> 32
Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Leu Thr Ser Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Leu Thr Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 33
<211> 215
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LC of mAb732
<400> 33
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Trp Ala Phe
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro
85 90 95
Ser Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gln Pro
100 105 110
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
115 120 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala
145 150 155 160
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
165 170 175
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
180 185 190
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
195 200 205
Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 34
<211> 447
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HC of mAb7024
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ser Ile Ile Pro Trp Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Glu Tyr Tyr Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 35
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR3 of mAb3584
<400> 35
Glu Val Asp Ser Ile Tyr Tyr Ser Tyr Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 36
<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH of mAb3584
<400> 36
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Gly Trp Ile Arg Gln Ser Pro Arg Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Leu Gly Arg Ile Ser Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val
50 55 60
Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln
65 70 75 80
Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Glu Val Asp Ser Ile Tyr Tyr Ser Tyr Phe Asp Ile
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 37
<211> 454
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HC of mAb3584
<400> 37
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Gly Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Ile Ser Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Asp Ser Ile Tyr Tyr Ser Tyr Phe Asp
100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 38
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCDR2 of mAb3077
<400> 38
Ser Ile Ile Pro Trp Phe Gly Trp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 39
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH of mAb3077
<400> 39
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ser Ile Ile Pro Trp Phe Gly Trp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Glu Tyr Tyr Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
Claims (27)
- IL-17 및 IL-17의 소분자(SM) 조절제를 포함하는 샘플 내의 유리 IL-17의 양을 결정하는 방법으로서,
i. 상기 샘플을 제1 포획 항체와 접촉시켜, 상기 제1 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17을 포함하는 제1 복합체, 및 상기 제1 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17을 포함하는 제2 복합체를 포함하는 혼합물을 형성하는 단계;
ii. 단계 i)로부터의 상기 혼합물을 제1 검출제와 접촉시켜, 상기 제1 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17, 및 상기 제1 검출제를 포함하는 제3 복합체를 형성하지만, 상기 제1 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17, 및 상기 제1 검출제를 포함하는 제4 복합체를 형성하지 않는 단계; 및
iii. 상기 제3 복합체 내의 상기 제1 검출제의 양을 측정함으로써 상기 유리 IL-17의 양을 결정하는 단계를 포함하며,
바람직하게는, 상기 제1 검출제는 제1 검출 항체인, 방법. - 제1항에 있어서, 단계 i)로부터의 상기 혼합물을 상기 제1 검출제와 접촉시키기 전에 어떠한 세척 단계도 수행되지 않는, 방법.
- 대상체에서 IL-17의 SM 조절제의 표적 결합을 결정하는 방법으로서,
a) 제1항의 방법을 사용하여 상기 SM 조절제의 투여 전에 상기 대상체로부터의 샘플 내의 유리 IL-17의 양을 결정하는 단계; b) 제1항의 방법을 사용하여 상기 SM 조절제의 투여 후에 상기 대상체로부터의 샘플 내의 유리 IL-17의 양을 결정하는 단계; 및 c) 단계 a)와 단계 b)로부터 결정된 유리 IL-17의 양을 비교하는 단계를 포함하는, 방법. - 대상체에서 IL-17의 SM 조절제의 표적 결합을 결정하는 방법으로서,
a) 제1항의 방법을 사용하여 상기 SM 조절제의 투여 후에 2개 이상의 시점에서 상기 대상체로부터의 샘플 내의 유리 IL-17의 양을 결정하는 단계; 및 b) 단계 a)로부터 결정된 상기 2개 이상의 시점에서의 유리 IL-17의 양을 비교하는 단계를 포함하는, 방법. - IL-17 및 IL-17의 SM 조절제를 포함하는 샘플 내의 조절제-결합된 IL-17의 양을 결정하는 방법으로서,
i. 상기 샘플의 제1 일부분을 제1 포획 항체와 접촉시켜, 상기 제1 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17을 포함하는 제1 복합체, 및 상기 제1 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17을 포함하는 제2 복합체를 포함하는 제1 혼합물을 형성하는 단계;
ii. 단계 i)로부터의 상기 제1 혼합물을 제1 검출제와 접촉시켜, 상기 제1 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17, 및 상기 제1 검출제를 포함하는 제3 복합체를 형성하지만, 상기 제1 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17, 및 상기 제1 검출제를 포함하는 제4 복합체를 형성하지 않는 단계;
iii. 상기 샘플의 제2 일부분을 제2 포획 항체와 접촉시켜, 상기 제2 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17을 포함하는 제5 복합체, 및 상기 제2 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17을 포함하는 제6 복합체를 포함하는 제2 혼합물을 형성하는 단계;
iv. 상기 제2 혼합물을 제2 검출제와 접촉시켜, 상기 제2 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17, 및 상기 제2 검출제를 포함하는 제7 복합체, 및 상기 제2 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17, 및 상기 제2 검출제를 포함하는 제8 복합체를 형성하는 단계;
v. 상기 제3 복합체 내의 상기 제1 검출제의 양을 측정함으로써 상기 유리 IL-17의 양을 결정하는 단계;
vi. 상기 제7 복합체 및 상기 제8 복합체 내의 상기 제2 검출제의 총량을 측정함으로써 상기 IL-17의 총량을 결정하는 단계; 및
vii. 단계 (vi)에서의 상기 IL-17의 총량으로부터 단계 (v)에서 결정된 상기 유리 IL-17의 양을 차감함으로써 상기 샘플 내의 상기 조절제-결합된 IL-17의 양을 결정하는 단계를 포함하며,
바람직하게는, 상기 제1 검출제는 제1 검출 항체이고, 상기 제2 검출제는 제2 검출 항체인, 방법. - 대상체에서 IL-17의 SM 조절제의 표적 결합을 결정하는 방법으로서,
제5항의 방법을 사용하여 상기 SM 조절제의 투여 후에 상기 대상체로부터의 샘플 내의 조절제-결합된 IL-17의 양을 결정하는 단계를 포함하는, 방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SM 조절제는 분자량이 약 100 내지 1500 g/mol인, 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 SM 조절제는 분자량이 약 400 내지 1050 g/mol, 또는 약 500 내지 1000 g/mol, 또는 약 600 내지 900 g/mol인, 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 SM 조절제는 분자량이 약 300 내지 750 g/mol, 또는 약 500 내지 800 g/mol, 또는 약 600 내지 900 g/mol인, 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 검출제 및/또는 상기 제2 검출제는 검출가능한 표지로 표지되고, 더 바람직하게는 상기 표지는 효소 또는 비오틴인, 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 제1 포획 항체는 DuoSet ELISA 키트 DY317(R&D Systems, Inc.로부터 입수됨)의 포획 항체이고, 상기 제1 검출제는 인간 mAb4538 항체(Janssen Biotech, Inc.로부터 입수됨)인, 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 제2 포획 항체 및 상기 제2 검출제는 각각 DuoSet ELISA 키트 DY317(R&D Systems, Inc.로부터 입수됨)의 포획 항체 및 검출 항체인, 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 상기 SM 조절제에 의한 생체외(ex vivo) 또는 생체내(in vivo) 처리 하에서 대상체로부터 획득되는 생물학적 샘플인, 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 대상체는 포유동물, 바람직하게는 인간인, 방법.
- 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 세포 또는 조직으로부터 제조된 샘플, 또는 혈청, 혈장 또는 다른 생물학적 유체 샘플로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 샘플 내의 상기 IL-17의 정량 하한(LLOQ)이 약 0.01 또는 약 0.1 또는 약 0.25, 또는 약 0.5, 또는 약 0.75, 또는 약 1 pg/ml인 검출 감도를 갖는, 방법.
- IL-17 및 IL-17의 SM 조절제를 포함하는 샘플 내의 유리 IL-17의 양을 결정하기 위한 키트로서,
i. 제1 포획 항체 - 여기서, 상기 샘플과의 접촉 시에, 상기 제1 포획 항체는 상기 제1 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17을 포함하는 제1 복합체, 및 상기 제1 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17을 포함하는 제2 복합체를 형성함 -; 및
ii. 제1 검출제 - 여기서, 상기 제1 복합체 및 상기 제2 복합체와의 접촉 시에, 상기 제1 검출제는 상기 제1 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17, 및 상기 제1 검출제를 포함하는 제3 복합체를 형성하지만, 상기 제1 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17, 및 상기 제1 검출제를 포함하는 제4 복합체를 형성하지 않음 - 를 포함하며,
바람직하게는, 상기 제1 검출제는 제1 검출 항체인, 키트. - IL-17 및 IL-17의 SM 조절제를 포함하는 샘플 내의 조절제-결합된 IL-17의 양을 결정하기 위한 키트로서,
i. 제1 포획 항체 - 여기서, 상기 샘플과의 접촉 시에, 상기 제1 포획 항체는 상기 제1 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17을 포함하는 제1 복합체, 및 상기 제1 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17을 포함하는 제2 복합체를 형성함 -;
ii. 제1 검출제 - 여기서, 상기 제1 복합체 및 상기 제2 복합체와의 접촉 시에, 상기 제1 검출제는 상기 제1 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17, 및 상기 제1 검출제를 포함하는 제3 복합체를 형성하지만, 상기 제1 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17, 및 상기 제1 검출제를 포함하는 제4 복합체를 형성하지 않음 -; 및
iii. 제2 포획 항체 - 여기서, 상기 샘플과의 접촉 시에, 상기 제2 포획 항체는 상기 제2 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17을 포함하는 제5 복합체, 및 상기 제2 포획 항체 및 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17을 포함하는 제6 복합체를 형성함 -;
iv. 제2 검출제 - 여기서, 상기 제5 복합체 및 상기 제6 복합체와의 접촉 시에, 상기 제2 검출제는 상기 제2 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합되지 않은 IL-17, 및 상기 제2 검출제를 포함하는 제7 복합체, 및 상기 제2 포획 항체, 상기 SM 조절제에 결합된 IL-17, 및 상기 제2 검출제를 포함하는 제8 복합체를 각각 형성함 - 를 포함하며,
바람직하게는, 상기 제1 검출제는 제1 검출 항체이고, 상기 제2 검출제는 제2 검출 항체인, 키트. - 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 제1 검출제 및/또는 상기 제2 검출제는 검출가능한 표지로 표지되고, 더 바람직하게는 상기 표지는 효소 또는 비오틴인, 키트.
- 제24항에 있어서, 상기 제1 포획 항체는 DuoSet ELISA 키트 DY317(R&D Systems, Inc.로부터 입수됨)의 포획 항체이고, 상기 제1 검출제는 인간 mAb4538 항체(Janssen Biotech, Inc.로부터 입수됨)인, 키트.
- 제26항에 있어서, 상기 제2 포획 항체 및 상기 제2 검출제는 각각 DuoSet ELISA 키트 DY317(R&D Systems, Inc.로부터 입수됨)의 포획 항체 및 검출 항체인, 키트.
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