KR20220070199A - 자궁내막 수용성 예측 방법 - Google Patents

자궁내막 수용성 예측 방법 Download PDF

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KR20220070199A
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귀잉 니
소피아 헹
룩 요한 프란스 롬바우츠
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허드슨 인스티튜트 오브 메디컬 리서치
모나쉬 아이브이에프 피티와이 엘티디
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Abstract

본 발명은 대상체에서 배아 착상에 대한 자궁내막 수용성을 예측하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 대상체의 자궁내막 상피 세포에서 포도칼릭신의 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 상피 수용성을 모니터링하고 상피 수용성을 개선하는 방법에 관한 것이다.

Description

자궁내막 수용성 예측 방법
관련 출원 데이터
본 출원은 "자궁내막 수용성 예측 방법(Methods of predicting endometrial receptivity)"을 발명의 명칭으로 하여 2019년 6월 25일에 출원된 오스트레일리아 특허 출원 제2019902204호로부터 우선권을 주장하며, 이 출원의 전체 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 제출된다. 서열 목록의 전체 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 대상체에서 배아 착상에 대한 자궁내막 수용성을 예측하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 대상체의 자궁내막 상피 세포에서 포도칼릭신(podocalyxin)의 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 상피 수용성을 모니터링하고 상피 수용성을 개선하는 방법을 제공한다.
배아 착상은 임신을 확립하는 핵심 단계이며, 착상 실패는 불임을 유발할 수 있다. 보조 생식 기술(ART)은 불임을 극복하기 위한 주요 개입이지만, 낮은 착상률(평균 ART 주기 당 약 30%)은 ART 성공을 상당히 제한한다.
착상은 배아와 자궁 사이의 고도로 조정된 상호작용을 포함한다. 착상이 성공하려면, 배아가 잘 발달되어 착상이 가능해야 하며, 자궁이 수용가능한 상태여야 한다.
배아 배양 및 선택에서의 혁신은 최근 몇 년 동안 ART를 상당히 개선하였다. 하지만, 착상전 유전자 스크리닝을 포함하는 최신 배아 기술로도, 착상 실패는 여전히 제한적인 장애물로 남아 있으며, 이는 착상 결과를 결정하는 데 자궁내막의 중요성을 강조한다.
자궁의 안쪽 막인 자궁내막은 착상에 참여하며, 착상의 과정은 종마다 크게 다르다. 인간의 착상은 배아가 자궁내막 내강 상피에 부착되고, 상피 층을 가로지르고, 기저 막 아래를 통과하고, 결국 기질 구획으로 이동해야 한다. 이어서 내강 상피는 착상 부위를 다시 봉합하여, 조직 내의 배아를 완전히 캡슐화한다. 이러한 인간의 착상 캐스케이드는 독특하며 인간의 착상 과정의 모든 양태를 개괄한 동물 모델은 없다.
매 월경 주기에서, 인간의 자궁내막은 난소 호르몬인 에스트로겐과 프로게스테론의 영향 하에 실질적으로 재형성되어(remodel) 프로게스테론이 우세한 중간-분비기(28일 주기 중 20~24일차)에만 수용적이 된다. 이는 자궁내막 수용성을 착상을 위한 배아 발달과 동기화한다.
하지만, 자궁내막 수용성을 조절하는 상세한 분자 및 세포 메커니즘은 완전히 밝혀지지 않은 채 남아 있다. 특히, 내강 상피가 배아 부착 및 침입에 대해 어떻게 재형성되는지는 알려져 있지 않다. 데이터 세트는 연구마다 매우 다르지만, 자궁내막 조직의 전사체 분석은 수용성에서 많은 수의 유전자가 상향 또는 하향 조절되는 것으로 밝혀졌다. ERA(자궁내막 수용성 어레이)라고 하는 마이크로어레이 기반 mRNA 시그니쳐 기술이 수용성 창(receptive window)을 식별하기 위해 개발되었지만, ERA의 유용성은 여전히 시험되는 중에 있다. 또한, ERA는 전체 조직 생검을 사용하며, 따라서 특정 세포 유형 또는 특정 분자의 특정 관련성을 정확히 찾아낼 수 없다.
따라서, 배아 착상을 위한 최적의 기간을 예측하고 착상 실패를 감소시키는 방법의 개발에 대한 당업계의 지속적인 요구가 있음이 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명을 생성함에 있어서, 본 발명자들은 인간의 자궁내막 상피 수용성의 핵심 음성 조절자로서 포도칼릭신을 확인하였다. 본 발명자들은 인간 조직 샘플에서 이 조절자의 역할과 IVF 환자의 착상 실패의 연관성을 연구했다. 또한 포도칼릭신의 발현을 수정하고 조절하는 방법을 평가하였다. 놀랍게도, 본 발명자들은 샘(glandular) 상피 세포가 아닌 내강(luminal) 상피 세포에서의 포도칼릭신의 하향 조절이 상피 수용성을 의미한다는 것을 알아내었다.
본 발명자들의 발견은 대상체에서 배아 착상에 대한 자궁내막 수용성을 식별하거나 예측하는 방법에 대한 기초를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 대상체에서 배아 착상에 대한 자궁내막 수용성을 예측하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 대상체의 자궁내막 상피 세포에서 포도칼릭신(podocalyxin)의 수준을 결정하는 단계를 포함한다.
한 예에서, 본 발명은 대상체에서 배아 착상에 대한 자궁내막 상피 수용성을 예측하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 대상체의 자궁내막 상피 세포에서 포도칼릭신의 수준을 결정하는 단계를 포함한다.
한 예에서, 포도칼릭신의 상기 수준을 결정하는 단계는, 상기 자궁내막 상피 세포에서, 포도칼릭신 단백질의 양 및/또는 분포 패턴을 결정하는 단계, 및/또는 포도칼릭신을 인코딩하는 핵산 분자의 양을 결정하는 단계를 포함한다.
한 예에서, 포도칼릭신의 상기 수준을 결정하는 단계는 상기 자궁내막 상피 세포에서 포도칼릭신 단백질의 양 및/또는 분포 패턴을 결정하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 포도칼릭신의 상기 수준을 결정하는 단계는 상기 자궁내막 상피 세포에서 포도칼릭신 단백질의 양을 결정하는 단계를 포함한다. 또 다른 예에서, 포도칼릭신의 상기 수준을 결정하는 단계는 상기 자궁내막 상피 세포에서 포도칼릭신 단백질의 분포 패턴을 결정하는 단계를 포함한다.
한 예에서, 포도칼릭신의 상기 수준을 결정하는 단계는 상기 자궁내막 상피 세포에서, 포도칼릭신을 인코딩하는 핵산 분자의 양을 결정하는 단계를 포함한다.
한 예에서, 핵산 분자는 mRNA이다. 상기 자궁내막 상피 세포에서 핵산 분자의 양을 측정하는 방법은 당업계에 알려져 있고/있거나 본 명세서에 설명되어 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 실시간 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 사용하여 검출된다.
한 예에서, 상기 방법은 상기 대상체에서의 포도칼릭신의 상기 수준을 적어도 하나의 참조(reference)에서의 자궁내막 상피 세포에서의 포도칼릭신의 수준과 비교하는 단계를 추가로 포함한다. 참조를 결정하는 방법은 당업자에게 명백할 것이고/이거나 본 명세서에 설명되어 있다.
한 예에서, 상기 방법은 (a) 상기 대상체에서의 상기 포도칼릭신의 상기 수준이 상기 참조에서의 상기 포도칼릭신의 상기 수준보다 더 높은지, 또는 (b) 상기 대상체에서의 상기 포도칼릭신의 상기 수준이 상기 참조에서의 포도칼릭신의 상기 수준보다 더 낮은지를 결정하는 단계를 포함한다.
한 예에서, 상기 자궁내막 상피 세포는 내강 상피 세포 및/또는 샘 상피 세포이다. 예를 들어, 상기 자궁내막 상피 세포는 내강 상피 세포이다. 또 다른 예에서, 상기 자궁내막 상피 세포는 샘 상피 세포이다.
한 예에서, 본 발명의 방법은 하기를 제공한다:
(i) 상기 대상체의 내강 상피 세포에서의 포도칼릭신의 더 낮은 수준 및 샘 상피 세포에서의 포도칼릭신의 더 높은 수준이 자궁내막 상피 수용성을 나타내거나; 또는
(ii) 상기 대상체의 내강 상피 세포에서의 포도칼릭신의 더 높은 수준 및 샘 상피 세포에서의 포도칼릭신의 더 높은 수준이 전-자궁내막(pre-endometrial) 상피 수용성을 나타내거나; 또는
(iii) 상기 대상체의 내강 상피 세포에서의 포도칼릭신의 더 낮은 수준 및 샘 상피 세포에서의 포도칼릭신의 더 낮은 수준이 후-자궁내막(post-endometrial) 상피 수용성을 나타냄.
한 예에서, 상기 대상체의 내강 상피 세포에서의 포도칼릭신의 더 낮은 수준 및 샘 상피 세포에서의 포도칼릭신의 더 높은 수준이 자궁내막 상피 수용성을 나타낸다.
한 예에서, 상기 대상체의 내강 상피 세포에서의 포도칼릭신의 더 높은 수준 및 샘 상피 세포에서의 포도칼릭신의 더 높은 수준이 전-자궁내막 상피 수용성을 나타낸다.
한 예에서, 상기 대상체의 내강 상피 세포에서의 포도칼릭신의 더 낮은 수준 및 샘 상피 세포에서의 포도칼릭신의 더 낮은 수준이 후-자궁내막 상피 수용성을 나타낸다.
한 예에서, 상기 방법은 포도칼릭신의 상기 수준을 결정하기 위해 포도칼릭신에 특이적으로 결합하는 항체 또는 압타머(aptamer)를 사용하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 포도칼릭신의 상기 수준을 결정하기 위해 포도칼릭신에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하는 단계를 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 항체는 당업자에게 명백할 것이고/이거나 본 명세서에 설명되어 있다. 또 다른 예에서, 상기 방법은 포도칼릭신의 상기 수준을 결정하기 위해 포도칼릭신에 특이적으로 결합하는 압타머를 사용하는 단계를 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 압타머는 당업자에게 명백할 것이고/이거나 본 명세서에 설명되어 있다.
한 예에서, 상기 항체 또는 압타머는 검출가능한 표지에 컨쥬게이트(conjugate)된다. 예를 들어, 상기 항체는 검출가능한 표지에 컨쥬게이트된다. 또 다른 예에서, 상기 압타머는 검출가능한 표지에 컨쥬게이트된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 검출가능한 표지는 당업자에게 명백할 것이고/이거나 본 명세서에 설명되어 있다. 예를 들어, 상기 검출가능한 표지는 방사성표지, 효소, 형광 표지, 발광 표지, 생물발광 표지, 자기 표지, 보결분자단(prosthetic group), 조영제 및 초음파 작용제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 예에서, 상기 검출가능한 표지는 방사성표지이다. 예를 들어, 상기 방사성표지는 방사성요오드(125I, 131I); 테크네튬; 이트륨; 35S 또는 3H일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
한 예에서, 상기 검출가능한 표지는 효소이다. 예를 들어, 상기 효소는 호스래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼리성 포스파타아제, β-갈락토시다아제 또는 아세틸콜린에스테라아제일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
한 예에서, 상기 검출가능한 표지는 형광 표지이다. 예를 들어, 상기 형광 표지는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
한 예에서, 상기 검출가능한 표지는 발광 표지이다. 예를 들어, 상기 발광 표지는 루미놀일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
한 예에서, 상기 검출가능한 표지는 생물발광 표지이다. 예를 들어, 상기 생물발광 표지는 루시페라아제, 루시페린 또는 에쿠오린일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
한 예에서, 상기 검출가능한 표지는 자기 표지이다. 예를 들어, 상기 자기 표지는 가돌리늄 또는 산화철 킬레이트일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
한 예에서, 상기 검출가능한 표지는 보결분자단이다. 예를 들어, 상기 보결분자단은 스트렙타비딘/비오틴 또는 아비딘/비오틴일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
한 예에서, 상기 검출가능한 표지는 조영제이다.
한 예에서, 상기 검출가능한 표지는 초음파 작용제이다. 예를 들어, 상기 초음파 작용제는 마이크로기포-방출 작용제(microbubble-releasing agent)일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 한 예에서, 상기 초음파 작용제는 마이크로기포-방출 작용제이다.
한 예에서, 포도칼릭신의 상기 수준을 결정하는 단계는 프로게스테론의 하류 조절자 및/또는 포도칼릭신의 상류 조절자의 상기 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 상기 프로게스테론의 하류 조절자 및/또는 포도칼릭신의 상류 조절자는 마이크로RNA이다. 또 다른 예에서, 상기 방법은 포도칼릭신의 상기 수준을 결정하기 위해 마이크로RNA의 상기 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 상기 마이크로RNA는 miR-199 또는 miR-145이다. 추가의 예에서, 마이크로RNA의 상기 수준 및 포도칼릭신의 상기 수준 사이에 역의 관계가 있다. 예를 들어, 상기 마이크로RNA의 상승된 수준은 포도칼릭신의 더 낮은 수준을 나타낸다.
포도칼릭신의 상기 수준을 검출하는 방법은 당업자에게 명백할 것이고/이거나, 본 명세서에 설명되어 있다. 예를 들어, 상기 방법은 면역조직화학적 검정, 제자리(in situ) 혼성화, 유세포분석, 효소-결합 면역흡착 검정, 웨스턴 블롯, 실시간 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 또는 초음파 분자 영상화를 수행하는 단계를 포함한다.
한 예에서, 상기 방법은 면역조직화학적 검정을 수행하는 단계를 포함한다.
한 예에서, 상기 방법은 유세포분석을 수행하는 단계를 포함한다.
한 예에서, 상기 방법은 효소-결합 면역흡착 검정을 수행하는 단계를 포함한다.
한 예에서, 상기 방법은 웨스턴 블롯을 수행하는 단계를 포함한다.
한 예에서, 상기 방법은 실시간 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 수행하는 단계를 포함한다.
한 예에서, 상기 방법은 초음파 분자 영상화를 수행하는 단계를 포함한다.
한 예에서, 상기 방법은 시험관내 또는 생체외에서 자궁내막 상피 세포에 대해 수행된다. 예를 들어, 상기 방법은 시험관내에서 자궁내막 상피 세포에 대해 수행된다. 또 다른 예에서, 상기 방법은 생체외에서 자궁내막 상피 세포에 대해 수행된다.
한 예에서, 상기 방법은 생물학적 샘플에서 상기 대상체로부터 수득된 자궁내막 상피 세포에 대해 수행된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 생물학적 샘플은 당업자에게 명백할 것이고/이거나, 본 명세서에 설명되어 있다. 예를 들어, 상기 생물학적 샘플은 자궁내막 생검, 자궁액 샘플 및 질액 샘플로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 예에서, 상기 생물학적 샘플은 자궁내막 생검이다.
한 예에서, 상기 생물학적 샘플은 자궁내막 상피 세포이다.
한 예에서, 상기 생물학적 샘플은 자궁액 샘플이다.
한 예에서, 상기 생물학적 샘플은 질액 샘플이다.
한 예에서, 상기 대상체는 프로게스테론, 프로제스토젠 또는 이들의 유사체 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물로 이전에 치료받은 적이 있다. 예를 들어, 상기 대상체는 불임에 대한 치료를 받고 있다. 또 다른 예에서, 상기 대상체는 배아 착상 실패로 인한 치료를 받고 있다.
한 예에서, 포도칼릭신의 상기 수준이 한 주기 동안 적어도 하나의 생물학적 샘플 및 적어도 하나의 시점에서 결정된다. 예를 들어, 포도칼릭신의 상기 수준이 한 주기 동안 1, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 또는 9, 또는 10개의 시점에서 결정된다.
한 예에서, 상기 방법은 상기 대상체 내로 배아를 착상하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 상기 배아의 착상은 상기 대상체에서 포도칼릭신의 상기 수준에 기초한다.
한 예에서, 포도칼릭신의 상기 수준은 상기 대상체의 제1 주기에서 결정되고, 배아는 상기 대상체의 후속 주기에서 착상된다.
본 발명은 또한 대상체에서 불임을 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 대상체의 자궁내막 상피 세포에서 포도칼릭신의 수준을 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명은 대상체에서 불임을 진단하고 예후하는 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 상기 대상체의 자궁내막 상피 세포에서 포도칼릭신의 수준을 결정하는 단계를 포함한다.
한 예에서, 포도칼릭신의 상기 수준이 한 주기 동안 적어도 하나의 생물학적 샘플 및 적어도 하나의 시점에서 결정된다.
본 발명은 또한 대상체에서 배아 착상에 대한 자궁내막 상피 수용성을 모니터링하고 최적의 자궁내막 상피 수용성을 예측하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하나 이상의 시점에서 상기 대상체의 자궁내막 상피 세포에서 포도칼릭신의 수준을 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 대상체에서 배아 착상에 대한 자궁내막 상피 수용성을 개선하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 대상체의 자궁내막 상피 세포에서 포도칼릭신의 수준을 결정하는 단계, 및 상기 세포에서의 포도칼릭신의 상기 수준에 기초하여 상기 대상체에게 상기 자궁내막 상피 세포에서의 포도칼릭신의 상기 수준을 감소시키기에 충분한 양의 화합물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 대상체에서 배아 착상에 대한 자궁내막 상피 수용성을 개선하는 것에 대한 화합물의 유효성을 평가하는 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 상기 대상체의 자궁내막 상피 세포에서 포도칼릭신의 수준을 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 대상체는 이전에 상기 화합물로 치료를 받은 적이 있다.
본 발명은 또한 대상체에서 배아 착상에 대한 자궁내막 상피 수용성을 개선하기 위한 화합물을 사용하는 치료를 최적화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 대상체에게 화합물을 투여하는 단계, 상기 대상체의 자궁내막 상피 세포에서 포도칼릭신의 수준을 결정하는 단계, 및, 선택적으로, 포도칼릭신의 상기 수준에 기초하여 상기 대상체에 대한 상기 치료를 수정하는 단계를 포함한다.
한 예에서, 상기 수정은 투여량, 화합물의 유형 및/또는 투여 경로 중 하나 이상 또는 전부이다.
한 예에서, 상기 화합물은 프로게스테론, 포르제스토젠, 또는 이들의 유사체, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 촉매 핵산, 간섭 RNA, siRNA, 마이크로RNA 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 상기 화합물은 miR-199 또는 miR-145와 같은 마이크로RNA이다.
도 1은 HUVEC 및 HEEC에서 포도칼릭신(PCX) mRNA 발현의 실시간 qRT-PCR 분석을 보여주는 그래픽 표현이다. 데이터는 평균 ± SD로 표시된다.
도 2는 (A) 내강 상피(LE); (B) 샘 상피(GE), 및 (C) 월경 주기의 증식기(Prolif), 초기(E)-, 중간(M)- 및 후기(L)-분비기(Sec)의 혈관(BV)에서 PCX 면역조직화학적 염색 강도의 정량화를 보여주는 그래픽 표현이다. 데이터는 평균 ± SD로 표시된다. Prolif; E-Sec; M-Sec; L-Sec. *P<0.05, **P<0.005, ***P<0.0005.
도 3은 48, 72 및 98h 동안 프로게스테론(P)이 있거나 없이 에스트로겐(E)으로 처리된 1차 HEEC에서 (A) mRNA 수준 및 (B) PCX의 단백질 수준을 보여주는 그래픽 표현이다. 데이터는 평균 ± SD로 표시되며, *P<0.05, **P<0.005이다.
도 4는 이시카와(Ishikawa) 세포에서 PCX의 일시적인 녹다운(KD) 또는 안정한 과발현(PCX-OE)의 효과를 보여주는 그래픽 표현이다. PCX의 일시적인 녹다운은 PCX mRNA 발현을 감소시키고(A), 피브로넥틴에 대한 부착력을 증가시켰다(B). PCX의 과발현은 PCX mRNA 발현을 증가시키고(C), 피브로넥틴에 대한 부착성을 감소시켰다. 평균 ± SD, ***P<0.0005, ****P<0.0001.
도 5는 이시카와 단층(monolayer)을 과발현하는 PCX 상에 1차 세포영양막(trophoblast) 스페로이드의 부착의 정량화를 보여주는 그래픽 표현이다. 평균 ± SD, n=3-5 *P<0.05, **P<0.005, ****P<0.0001.
도 6은 이시카와 단층을 과발현하는 PCX를 통해 1차 세포영양막 스페로이드의 침입의 정량화를 보여주는 그래픽 표현이다. 평균 ± SD, n=3 *p<0.05, **p<0.005.
도 7은 이시카와 단층을 과발현하는 PCX 상에 인간 배아의 (A) 부착 및 (B) 침입의 정량화를 보여주는 그래픽 표현이다. 평균 ± SD, n=3, **P<0.005; *p<0.05.
도 8은 대조군과 PCX-OE 이시카와 세포 사이의 (A-F) 상향 조절된 유전자 및 (G-L) 하향 조절된 유전자의 실시간 qRT-PCR 분석을 보여주는 그래픽 표현이다. 평균 ± SD, n=3. *P<0.05, **P<0.005, ***P<0.0005 ****P<0.0001.
도 9는 대조군과 PCX-OE 세포 사이의 (A) 트랜스-상피 전기 저항(TER) 및 (B) FITC-덱스트란의 플럭스를 보여주는 그래픽 표현이다. 평균 ± SD, n=3 **P<0.005.
도 10은 PCX- 및 PCX+ 그룹의 착상 성공 및 실패의 비율을 보여주는 그래픽 표현이다. *P=0.036, 피셔 정확 검정(Fisher's exact test).
도 11은 E+P vs E 처리 후 1차 자궁내막 상피 세포에서 mir145 및 mir199의 실시간 RT-PCR 분석을 보여주는 그래픽 표현이다. E 세포에 대한 E+P 세포의 배수 변화 ± SD, n=4, *P<0.05.
도 12는 mir145, mir199 또는 이들의 조합으로 형질감염시킨 후 이시카와 세포의 PCX mRNA의 실시간 RT-PCR 분석을 보여주는 그래픽 표현이다. 24h에서 대조군 세포에 대한 배수 변화 ± SD, n=4.
서열 목록의 핵심
Figure pct00001

Figure pct00002
일반적인 정의
본 명세서 전반에 걸쳐, 달리 구체적으로 언급되지 않거나 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단일 단계, 물질의 조성, 단계들의 그룹 또는 물질의 조성들의 그룹에 대한 언급은 복수(즉, 하나 이상)의 이들 단계, 물질의 조성, 단계들의 그룹 또는 물질의 조성들의 그룹을 포괄하는 것으로 이해해야 한다.
본 발명은 단지 예시의 목적을 위해 의도된 본 명세서에 설명된 특정 예들에 의해 범위가 제한되지 않는다. 기능적으로 동등한 생성물, 조성물 및 방법은 명백히 본 발명의 범위 내에 있다.
광범위하게 설명되는 바와 같은 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어나지 않으면서 특정 구현예들에 나타난 바와 같은 본 발명에 대해 수많은 변형 및/또는 수정이 이루어질 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 따라서, 본 구현예들은 모든 양태에서 예시적인 것으로 여겨져야 하며 제한적으로 여겨져서는 안 된다.
본 명세서에서 논의되고/되거나 참조된 모든 간행물은 그 전체가 본 명세서에 포함된다.
본 명세서에 포함된 문서, 행위, 자료, 장치, 물품 등에 대한 임의의 논의는 오로지 본 발명에 대한 맥락을 제공하는 목적을 위한 것이다. 이들 자료 중 임의의 것 또는 전부가 본 출원의 각 청구항의 우선일 이전에 존재했던 것과 같이 본 발명과 관련된 분야의 선행 기술 기초의 일부를 형성하거나 통상의 일반적인 지식이었다는 것을 인정하는 것으로 여겨져서는 안 된다.
본 명세서에서 본 발명의 임의의 예는 달리 명시적으로 언급되지 않는 한 본 발명의 임의의 다른 예에 준용(mutatis mutandis)되어 적용되는 것으로 취해져야 한다. 달리 말하면, 본 발명의 임의의 특정 예는 (상호 배타적인 경우를 제외하고는) 본 발명의 임의의 다른 특정 예와 조합될 수 있다.
특정한 특징 또는 특징들의 그룹 또는 방법 또는 방법 단계들을 개시하는 본 발명의 임의의 예는 특정한 특징 또는 특징들의 그룹 또는 방법 또는 방법 단계들을 부인하기 위한 명시적 지원을 제공하기 위해 취해질 것이다.
달리 명시적으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 모든 기술적이고 과학적인 용어는 당업계(예를 들어, 세포 배양, 분자 유전학, 생식 생물학, 면역조직화학, 단백질 화학, 및 생화학)의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 가지는 것으로 여겨져야 한다.
달리 명시되지 않는 한, 본 발명에 사용되는 재조합 단백질, 세포 배양, 및 면역학적 기술은 당업자에게 잘 알려진 표준 절차이다. 이러한 기술은 Perbal 1984; Sambrook 1989; Brown 1991; Glover 1995; Ausubel 1988; Harlow 1988; Coligan 1991과 같은 출처의 문헌 전반에 걸쳐 기재되고 설명되어 있다.
용어 "및/또는", 예를 들어, "X 및/또는 Y"는 "X 및 Y" 또는 "X 또는 Y"를 의미하는 것으로 이해해야 하며, 양자의 의미 또는 어느 하나의 의미에 대한 지원을 명시적으로 제공하는 것으로 여겨져야 한다.
본 명세서 전반에 걸쳐 단어 "포함하다(comprise)" 또는 "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 그룹을 포함하는 것을 의미하지만, 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 그룹을 배제하는 것을 의미하지는 않음을 이해해야 할 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 인간을 포함하는 임의의 동물, 예를 들어 포유동물을 의미하는 것으로 여겨져야 한다. 예시적인 대상체는 인간 및 인간이 아닌 영장류를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 대상체는 인간이다. 한 예에서, 대상체는 여성 인간이다.
자궁내막 상피 수용성
자궁내막 재형성은 인간 월경 주기의 핵심 특징이며, 비-부착 상태에서 부착 상태로의 전환은 배아 착상에 중요하다. 구체적으로, 착상 배아와 직접 상호작용하여 부착을 개시하는 내강 상피의 정점 표면(apical surface)은 수용성을 위해 재형성되어야 한다. 따라서, 자궁내막이 배아 착상에 대해 수용적인 주기 동안 최적의 시점을 결정할 수 있도록 하는 것이 바람직하다.
본 발명은 예를 들어 자연적으로 달성되는 수정 후 착상인 자연적으로 달성되는 임신, 또는 보조 생식 기술을 이용하여 달성되는 임신을 위한 최적의 타이밍을 결정하기 위한 방법을 제공한다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명자들은 자궁내막 상피 세포가 수용성을 위해 상피에서 하향 조절되어야 하는 핵심 착상 방지 조절자(anti-implantation regulator)로서 포도칼릭신을 본질적으로 발현한다는 것을 알아내었다. 특히 본 발명자들은 놀랍게도 샘 상피가 아니라 자궁내막 내강 상피에서 상기 조절자의 하향 조절이 자궁내막 상피 수용성을 의미한다는 것을 알아내었다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "자궁내막 상피 수용성(endometrial epithelial receptivity)"은 자궁내막이 착상에 수용적인 동안의 월경 주기의 기간을 지칭한다. 이 기간 동안, 자궁내막은 배반포의 부착을 허용하는 기능적인 상태를 획득한다. 이 기간은 바람직하게는 월경 주기의 중간-분비기(mid-secretory phase) 또는 인간의 28일 월경 주기 중 20 내지 24일차에 해당한다.
본 발명자들은 또한 자궁내막 상피의 내강 세포 및 샘 세포 양자 모두에서 포도칼릭신의 상향 조절 또는 상승된 수준이 전-수용성(pre-receptivity)을 신호한다는 것을 입증하였다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "전-수용성" 또는 "전-자궁내막 상피 수용성"은 자궁내막이 아직 착상에 수용적이지 않지만 그 주기에서 착상에 수용적이 되어가는 과정에 있는 동안의 월경 주기의 기간을 지칭한다.
본 발명자들은 또한 자궁내막 상피의 내강 세포 및 샘 세포 양자 모두에서 포도칼릭신의 하향 조절 또는 감소된 수준이 후-수용성(post-receptivity)을 신호한다는 것을 입증하였다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "후-수용성" 또는 "후-자궁내막 상피 수용성"은 자궁내막이 착상에 수용적이었지만 착상에 대한 그 주기 동안의 기간이 발생했던 월경 주기의 기간을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "주기(cycle)" 또는 "월경 주기"는 여성 및 기타 암컷 영장류에서 배란 및 월경의 과정을 지칭한다. 당업자는 이 용어가 난소(난소 주기로도 알려짐) 및 자궁의 내막 또는 자궁내막(자궁 주기로도 알려짐) 양자 모두와 연관된 변화를 포괄한다는 것을 이해할 것이다. 난소 주기는 난포기, 배란 및 황체기로 이루어지며, 자궁 주기는 월경, 증식기 및 분비기로 이루어진다. 인간의 평균 월경 주기는 28일이다.
한 예에서, 본 발명은 자궁내막 상피 수용성의 예측을 필요로 하는 대상체에서 자궁내막 상피 수용성을 예측하는 방법을 제공한다.
포도칼릭신의 수준 결정
포도칼릭신 유사 단백질 1(PCLP-1)이라고도 알려진 포도칼릭신(PODXL 또는 PCX)은 막통과(transmembrane) 시알로뮤신(sialomucin)의 CD34 계열의 구성원이며, 세포 부착력, 이동 및 극성의 조절과 관련이 있다. PODXL는 신장 족세포(podocyte), 조혈 전구 세포, 혈관 내피, 및 뉴런의 하위세트에 의해 발현되며; 비정상적인 발현은 다양한 암과 관련이 있다. 유형 I 막통과 단백질로서, PODXL는 광범위하게 O-글리코실화 및 시알릴화된 세포외 도메인과, 막통과 영역 및 짧은 세포내 영역을 갖는다. 인코딩된 단백질은 22개 아미노산 신호 펩티드, 439개 잔기의 세포외 도메인, 21개 잔기의 막통과 도메인 및 76개 아미노산 C-말단 세포내 도메인을 갖는다. 단지 명명의 목적으로만 그리고 제한없이, 인간 PODXL의 예시적인 서열은 NCBI 참조 서열 NG_042104.1에 제시되어 있다. 용어 '포도칼릭신(PODXL 또는 PCX)'은 포도칼릭신 mRNA 또는 포도칼릭신의 돌연변이 또는 다형 형태의 대안적 슬라이싱으로부터 발생할 수 있는 임의의 이소형(isoform)을 포함한다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 단지 명명의 목적으로만 그리고 제한없이, 인간 PODXL 이소형 1 및 2의 예시적인 서열은 각각 GenBank 등록 번호 NP_001018121 및 GenBank 등록 번호 NP_005388에 제시되어 있다. 다른 종의 PODXL의 서열은 본 명세서에 제공되는 서열 및/또는 공개적으로 이용가능한 데이터베이스를 사용하여 결정될 수 있고/있거나, 표준 기술(예를 들어, Ausubel 1988 또는 Sambrook 1989에 기재된 바와 같음)을 사용하여 결정될 수 있다.
본 발명자들은 포도칼릭신이 수용성 확립 시에 내강 상피 세포에서 현저하게 하향 조절된다는 것을 알아내었다.
따라서, 본 명세서에 설명되는 임의의 개시내용의 방법은 대상체의 자궁내막 상피 세포에서 포도칼릭신의 수준을 결정하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 포도칼릭신과 관련하여 용어 "수준(level)"은 유전자 및/또는 단백질의 기능성의 수준(즉, 기능적 수준)을 지칭하는 것으로 이해해야 한다. 예를 들어, 수준(또는 "발현의 수준")은 유전자에 의해 발현된 mRNA 전사물(transcript)의 척도 또는 인코딩된 단백질의 척도를 지칭한다.
한 예에서, 포도칼릭신의 수준을 결정하는 단계는, 자궁내막 상피 세포에서 포도칼릭신 단백질의 양을 결정하는 단계, 및/또는 포도칼릭신을 인코딩하는 핵산 분자의 양을 결정하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 포도칼릭신의 수준과 관련하여 용어 "양"은 mRNA 분자 및/또는 단백질의 양을 지칭하는 것으로 이해될 것이다. 분포 패턴을 평가하는 다양한 방법이 당업자에게 이용가능하며, 당업자는 특정 값 또는 양이 사용되는 평가 방법에 따라 달라질 것임을 인식할 것이다. 또한 이 용어는 절대 값 및 상대 값 양자 모두를 포괄한다는 것도 명백할 것이다. 예를 들어, 양은 참조 또는 대조군 샘플, 평가되는 세포의 수(예를 들어 100개의 세포 당 양) 및/또는 세포의 유형(예를 들어, 내강 상피 세포vs. 샘 상피 세포)에 상대적일 수 있다. 또 다른 예에서, 양은 샘플에 존재하는 mRNA 분자 및/또는 단백질의 양의 절대 값일 수 있다.
한 예에서, 포도칼릭신의 수준을 결정하는 단계는 포도칼릭신 단백질의 분포 패턴을 결정하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "분포 패턴"은 대상체에서 포도칼릭신 단백질의 특정 패턴 및/또는 세포 국소화를 지칭한다. 분포 패턴을 평가하는 다양한 방법이 당업자에게 이용가능하며, 사용되는 분석 방법에 의존할 것이다. 당업자는 이 용어가 설명적 분석(예를 들어, 존재 또는 부재), 다중파라미터 및 반-정량적(semi-quantitative) 스코어링(예를 들어, 강함, 약함 또는 부재)를 포괄한다는 것을 인식할 것이다.
한 예에서, 포도칼릭신의 수준은 세포의 집단에서의 수준이다.
본 발명에서 "세포의 집단" 또는 "세포 집단"에 대한 언급은 모두 자궁내막 상피 세포를 지칭한다. 자궁내막이 내강 상피 세포 및 샘 상피 세포 양자 모두로 구성되고 이 용어가 양자 모두의 세포의 집단을 포괄한다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "내강 상피"(LE)는 자궁의 내강을 둘러싸고 있는 세포를 지칭한다.
용어 "샘 상피"(GE)는 자궁내막 또는 자궁 샘의 세포를 지칭한다.
따라서, 대상체에서 포도칼릭신의 수준은 세포의 집단에서(즉, 샘 상피 세포 및 내강 상피 세포 양자 모두에서)의 수준일 수 있거나, 포도칼릭신의 수준이 세포의 집단의 하위세트에서(즉, 샘 상피 세포 또는 내강 상피 세포에서)의 수준일 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
한 예에서, 포도칼릭신의 수준은 내강 상피 세포 및 샘 상피 세포에서의 포도칼릭신의 수준이다. 예를 들어, 포도칼릭신의 수준은 참조 또는 대조군과 비교된다.
한 예에서, 포도칼릭신의 수준은 내강 상피 세포 또는 샘 상피 세포에서의 포도칼릭신의 수준이다. 예를 들어, 포도칼릭신의 수준은 내강 상피 세포에서의 포도칼릭신의 수준이다. 또 다른 예에서, 포도칼릭신의 수준은 샘 상피 세포에서의 포도칼릭신의 수준이다. 한 예에서, 내강 상피 세포 또는 샘 상피 세포에서의 포도칼릭신의 수준은 참조 또는 대조군과 비교된다. 또 다른 예에서, 내강 상피 세포에서의 포도칼릭신의 수준은 샘 상피 세포에서의 포도칼릭신의 수준과 비교된다. 또 다른 예에서, 샘 상피 세포에서의 포도칼릭신의 수준은 내강 상피 세포에서의 포도칼릭신의 수준과 비교된다.
본 명세서에 설명되는 임의의 방법의 한 예에서, 상기 방법은 (a) 상기 대상체에서의 상기 포도칼릭신의 상기 수준이 상기 참조에서의 상기 포도칼릭신의 상기 수준보다 더 높은지, 또는 (b) 상기 대상체에서의 상기 포도칼릭신의 상기 수준이 상기 참조에서의 포도칼릭신의 상기 수준보다 더 낮은지를 결정하는 단계를 포함한다.
포도칼릭신의 수준과 관련하여 용어 "더 높은"은, 대상체에서 포도칼릭신을 인코딩하는 핵산 분자 또는 포도칼릭신 단백질의 수준이 대조군 또는 참조 수준과 비교하여, 또는 한 세포 집단에서 다른 것과 비교하여, 더 크거나 증가된 것을 의미한다. 상기로부터 포도칼릭신의 수준이 통계학적으로 상당한 양, 예를 들어 단지 적어도 약 10%, 또는 약 20%, 또는 약 30%, 또는 약 40%, 또는 약 50%, 또는 약 60%, 또는 약 70%, 또는 약 80%, 또는 약 90%, 또는 약 95%만큼 증가될 필요가 있음이 명백할 것이다.
포도칼릭신 발현의 수준과 관련하여 용어 "더 낮은"은, 대상체에서 포도칼릭신을 인코딩하는 핵산 분자 또는 포도칼릭신 단백질의 수준이 대조군 또는 참조 수준과 비교하여, 또는 한 세포 집단에서 다른 것과 비교하여, 더 줄어들거나 감소된 것을 의미한다. 상기로부터 포도칼릭신의 수준이 통계학적으로 상당한 양, 예를 들어 단지 적어도 약 10%, 또는 약 20%, 또는 약 30%, 또는 약 40%, 또는 약 50%, 또는 약 60%, 또는 약 70%, 또는 약 80%, 또는 약 90%, 또는 약 95%만큼 감소될 필요가 있음이 명백할 것이다.
포도칼릭신의 수준을 결정하는 방법
포도칼릭신을 인코딩하는 포도칼릭신 핵산 분자 또는 포도칼릭신 단백질의 수준을 결정하는 방법은 당업자에게 명백할 것이고/이거나 본 명세서에 설명되어 있다.
핵산 분자의 수준 결정
핵산을 검출하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 혼성화 기반 검정, 증폭 기반 검정 및 제한 엔도뉴클레아제 기반 검정을 포함한다. 예를 들어, 전사된 유전자의 수준은 특히 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭, 리가아제 연쇄 반응 또는 사이클링 프로브 기술에 의해 결정될 수 있다.
프라이머 설계 및 생산
당업자에게 명백할 것인 바와 같이, 본 발명의 검정에 사용되는 특정 프라이머는 사용되는 검정 형식에 의존할 것이다. 분명하게, 관심 마커에 특이적으로 혼성화하거나 이를 검출할 수 있는 프라이머가 바람직하다. 예를 들어, PCR 또는 혼성화를 위한 프라이머를 설계하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, Dieffenbach 1995에 기재되어 있다. 또한, 다양한 검정을 위한 최적의 프라이머를 설계하는 여러 소프트웨어 패키지가 공개적으로 이용가능하며, 예를 들어 Center for Genome Research(미국 메사추세츠주 캠브리지 소재)로부터의 Primer 3가 이용가능하다. 본 발명에 사용하기에 적합한 프라이머는 바람직하게는 헤어핀을 형성하지 않거나, 자가 프라이밍하지 않거나, (예를 들어, 검출 검정에 사용되는 또 다른 프라이머와 함께) 프라이머 이량체를 형성하지 않는 것들이다.
또한, 프라이머(또는 이의 서열)은 표적 핵산으로부터 변성되는 온도(즉, 프로브 또는 프라이머의 융점, 또는 Tm)를 결정하기 위해 평가된다. Tm을 결정하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, Santa Lucia, 1995 또는 Bresslauer et al., 1986에 기재되어 있다.
본 발명에서 포도칼릭신의 검출을 위해 사용되는 예시적인 프라이머는 하기를 포함한다:
hPODXL-정방향: 5'-GAGCAGTCAAAGCCACCTTC-3',
hPODXL-역방향: 5'-TGGTCCCCTAGCTTCATGTC -3';
적합한 대조군 프라이머는 또한 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들어 18s 및 β-액틴을 포함한다. 본 발명에 사용하기 위한 예시적인 대조군 서열은 하기를 포함한다:
18s-정방향: 5'-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3'
18s-역방향: 5'-GCTGGAATTACCGCGGCT-3'
본 발명의 프라이머를 생성/합성하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 합성은 Gait 1984에 기재되어 있다. 예를 들어, 프로브 또는 프라이머는 생물학적 합성(예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제를 사용한 핵산의 분해)에 의해 또는 화학적 합성에 의해 수득될 수 있다. 짧은 서열(최대 약 100개의 뉴클레오티드)의 경우 화학적 합성이 바람직하다.
한 예에서, 프라이머는 하나 이상의 검출가능한 마커를 포함한다. 예를 들어, 프라이머는 예를 들어 플루오레세인(FITC), 5,6-카복시메틸 플루오레세인, 텍사스 레드, 니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일(NBD), 쿠마린, 단실 클로라이드, 로다민, 4'-6-디아미디노-2-페닐리노돌(DAPI), 및 시아닌 염료 Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 및 Cy7, 플루오레세인(5-카복시플루오레세인-N-하이드록시석신이미드 에스테르), 로다민(5,6-테트라메틸 로다민)과 같은 형광 표지를 포함한다. 이러한 형광체(fluors)에 대해, 최대 흡수 및 방출은 각각 FITC(490 nm; 520 nm), Cy3(554 nm; 568 nm), Cy3.5(581 nm; 588 nm), Cy5(652 nm: 672 nm), Cy5.5(682 nm; 703 nm) 및 Cy7(755 nm; 778 nm)이다.
대안적으로, 프라이머는 예를 들어 형광 반도체 나노결정(예를 들어, US 6,306,610에 기재된 바와 같음), 방사성표지 또는 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다아제(HRP), 알칼리성 포스파타아제(AP) 또는 β-갈락토시다아제)로 표지된다.
이러한 검출가능한 표지는 프라이머의 검출, 예를 들어 프라이머의 혼성화, 또는 프라이머를 사용하여 생성된 증폭 생성물의 검출을 용이하게 한다. 이러한 표지된 프라이머를 생성하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 또한, 표지된 프라이머의 생성을 위한 상업적인 공급원은 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어 Sigma-Genosys(오스트레일리아 시드니 소재)이다.
중합효소 연쇄 반응(PCR)
PCR 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 Dieffenbach 1995에 기재되어 있다. 일반적으로, PCR의 경우 적어도 약 20개의 뉴클레오티드 또는 적어도 약 30개의 뉴클레오티드를 포함하는 2개의 비-상보적 핵산 프라이머 분자가 핵산 주형(template) 분자의 상이한 가닥에 혼성화되며, 주형의 특이적 핵산 분자 사본이 효소적으로 증폭된다. PCR 생성물은 전기영동 및 핵산에 결합하는 검출가능한 마커를 사용하여 검출할 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 검출가능한 마커(예를 들어, 형광단)로 표지하고, 증폭 생성물은 예를 들어 광순환기(lightcycler)(Perkin Elmer, 미국 메사추세츠주 웰즐리 소재)를 사용하여 검출한다. 대안적으로, PCR 생성물은 예를 들어 질량 분석법을 사용하여 검출한다. 분명하게, 본 발명은 또한 예를 들어 TaqMan 검정과 같은 PCR의 정량적 형태(예컨대, 실시간 PCR; RT-PCR)를 포괄한다. TaqMan 검정(US 5,962,233에 기재된 바와 같음)은 한 쪽 말단에 공여자 염료가 있고 다른 쪽 말단에 수용자 염료가 있는 대립유전자(allele) 특이적 (ASO) 프로브를 사용하여 염료 쌍이 형광 공명 에너지 전달(FRET)을 통해 상호작용하도록 한다.
리가아제 연쇄 반응(LCR)
리가아제 연쇄 반응(예를 들어, EU 320,308 및 US 4,883,750에 기재되어 있음) 인접한 표적 핵산에 혼성화하는 2개 이상의 뉴클레오티드를 사용한다. 이어서 리가아제 효소를 사용하여 올리고뉴클레오티드를 연결한다. 다른 프라이머에 인접한 프라이머 중 하나의 말단에 뉴클레오티드에 대해 상보적이지 않은 하나 이상의 뉴클레오티드(들)가 존재하면, 리가아제는 프라이머를 연결할 수 없어서, 검출가능한 증폭 생성물을 생성하는 데 실패한다. 이이서 열순환을 사용하여 결찰된 올리고뉴클레오티드가 추가의 올리고뉴클레오티드에 대한 표적이 된다. 이어서 결찰된 단편은 예를 들어, 전기영동, 또는 MALDI-TOF를 사용하여 검출한다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 하나 이상의 프로브를 검출가능한 마커로 표지함으로써, 신속한 검출을 용이하게 한다.
사이클링 프로브 기술
사이클링 프로브 기술은 표적 서열에 혼성화할 수 있는 DNA-RNA-DNA를 포함하는 키메라 합성 프로브를 사용한다. 표적 서열에 혼성화하면, 형성된 RNA-DNA 이중체(duplex)가 프로브를 절단하는 RNase H에 대해 표적이 된다. 이어서 절단된 프로브는 예를 들어 전기영동 또는 MALDI-TOF를 사용하여 검출한다.
Qβ 복제
Qβ 복제는 또한 본 발명에서 또 다른 증폭 방법으로서 사용될 수 있다. 이 방법에서, 표적의 서열과 상보적인 영역을 갖는 RNA의 복제 서열을 RNA 중합효소의 존재 하에 샘플에 첨가한다. 중합효소는 이어서 검출될 수 있는 복제 서열을 복사할 것이다.
가닥 변위 증폭(SDA: Strand displacement amplification)
가닥 변위 증폭(SDA)은 올리고뉴클레오티드, DNA 중합효소 및 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 표적 서열을 증폭한다. 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산에 혼성화되고 중합효소는 이 영역의 사본을 생성하는 데 사용된다. 이어서 복사된 핵산 및 표적 핵산의 이중체는 복사된 핵산의 시작 부분에 있는 뉴클레오티드의 서열을 특이적으로 인식하는 엔도뉴클레아제로 꼭 맞춰진다(nicked). DNA 중합효소는 꼭 맞춰진 DNA를 인식하고 이전에 생성된 핵산을 대체하는 동시에 표적 영역의 또 다른 사본을 생성한다. SDA의 장점은 등온 형식으로 발생하며, 그럼으로써 고-처리량 자동 분석을 용이하게 한다는 것이다.
기타 핵산 증폭 방법
기타 핵산 증폭 절차는 핵산 서열 기반 증폭(NASBA) 및 3SR(WO 88/10315)을 포함하는 전사 기반 증폭 시스템(TAS)을 포함한다.
뉴클레오티드 서열의 직접 시퀀싱 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Ausubel 1995 및 Sambrook 1989에서 찾을 수 있다. 시퀀싱은 임의의 적합한 방법, 예를 들어 디데옥시 시퀀싱, 화학적 시퀀싱, 차세대 시퀀싱 기술 또는 이들의 변형에 의해 수행될 수 있다. 직접 시퀀싱은 특정 서열의 임의의 염기 쌍에서 변이를 결정할 수 있는 장점이 있다.
포도칼릭신 폴리펩티드 또는 단백질의 수준 결정
포도칼릭신 단백질 또는 폴리펩티드(상이한 이소형을 포함함)의 양 또는 수준을 검출하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 면역조직화학, 면역형광, 면역블롯, 웨스턴 블롯, 도트 블롯, 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 방사성면역검정(RIA), 효소 면역검정, 형광 공명 에너지 전달(FRET), 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간(MALDI-TOF), 전자분무 이온화(ESI), 질량 분석법(탠덤 질량 분석법, 예를 들어 LC MS/MS를 포함함), 바이오센서 기술, 소멸성 광섬유 기술 또는 단백질 칩 기술을 포함한다. 예를 들어, 적합한 검정은 반-정량적 검정 및/또는 정량적 검정이다.
용어 "단백질"은 단일 폴리펩티드 사슬, 즉, 펩티드 결합에 의해 연결된 일련의 연속 아미노산 또는 서로에 공유결합적으로 또는 비공유결합적으로 연결된 일련의 폴리펩티드 사슬(즉, 폴리펩티드 복합체)을 포함하는 것으로 여겨져야 한다. 예를 들어, 일련의 폴리펩티드 사슬은 적합한 화학 결합 또는 이황화 결합을 사용하여 공유결합적으로 연결될 수 있다. 비공유 결합의 예에는 수소 결합, 이온 결합, 반 데 발스 힘, 및 소수성 상호작용이 포함된다.
용어 "폴리펩티드" 또는 "폴리펩티드 사슬"은 펩티드 결합에 의해 연결된 일련의 연속 아미노산을 의미하는 것으로 상기 단락으로부터 이해될 것이다.
한 예에서, 샘플에서 포도칼릭신의 수준을 결정하는 방법은, 항체 또는 리간드와 폴리펩티드 또는 단백질 사이의 복합체가 형성되기에 충분한 시간 동안 및 조건 하에 포도칼릭신 폴리펩티드 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 리간드와 대상체의 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계, 및 이어서 상기 복합체를 검출하는 단계를 포함한다.
리간드
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "리간드"는 포도칼릭신 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 화합물, 분자, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 화학물질, 소분자, 천연 화합물 등을 포함하는 것으로 여겨져야 한다. 이러한 리간드는 임의의 공정, 예를 들어, 수소 결합, 반 데르 발스 상호작용, 소수성 상호작용, 정전기 상호작용, 이황화 결합 형성 또는 공유 결합 형성에 의해 포도칼릭신 폴리펩티드에 결합될 수 있다.
항체
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 온전한 단일클론 또는 다클론 항체, 면역글로불린(IgA, IgD, IgG, IgM, IgE) 단편, 인간화 항체, 또는 재조합 단일 사슬 항체뿐만 아니라, 예를 들어 Fab, F(ab)2, 및 Fv 단편과 같은 이들의 단편을 지칭한다.
포도칼릭신의 검출에 사용하기에 적합한 항체는 당업자에게 명백할 것이고/이거나 본 명세서에 설명되어 있으며, 예를 들어 구매가능한 항체인 AF1658(R&D Systems); 3D3(Santa Cruz) 및/또는 EPR9518(Abcam)을 포함한다.
한 예에서, 상기 항체는 포도칼릭신의 수준을 결정하도록 포도칼릭신에 특이적으로 결합한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합한다"("specifically binds" 또는 "binds specifically")는 항체가, 대체 항원 또는 세포와 반응하거나 결합하는 것보다 더 빈번하게, 더 신속하게, 더 긴 지속기간으로, 및/또는 더 큰 친화도로 특정 항원 또는 이를 발현하는 세포와 반응하거나 결합하는 것을 의미하는 것으로 여겨져야 한다. 일반적으로, 반드시 필수인 것은 아니지만, 결합에 대한 언급은 특이적 결합을 의미하며, 각 용어는 다른 용어에 대한 명시적인 지원을 제공하는 것으로 이해해야 한다.
항체는 당업자에게 알려진 다양한 방법 중 임의의 것에 의해, 예를 들어 Harlow 1988에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 기술 중 하나에서, 포도칼릭신 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하는 면역원이 다양한 포유동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 양, 돼지, 닭 또는 염소) 중 임의의 하나에 주입된다. 면역원은 천연 공급원으로부터 얻거나, 재조합 발현 수단에 의해 생성되거나, 예컨대 화학적 합성(예를 들어, BOC 화학 또는 FMOC 화학)에 의해 인공적으로 생성된다. 이 방법에서, 포도칼릭신 폴리펩티드 또는 이의 단편은 변형 없이 면역원으로서의 역할을 할 수 있다. 대안적으로, 포도칼릭신 폴리펩티드 또는 이의 단편은 예를 들어 소 혈청 알부민과 같은 캐리어 단백질에 연결된다. 면역원 및 선택적으로 단백질에 대한 캐리어는 바람직하게는 하나 이상의 부스터 면역화 및 주기적으로 상기 동물로부터 수집된 혈액을 포함하는 미리 결정된 일정에 따라 동물 숙주 내로 주입된다. 선택적으로, 면역원은 면역원에 대한 면역 반응을 향상시키기 위해, 예를 들어 Freund 완전 또는 불완전 애주번트와 같은 애주번트의 존재 하에 주입된다.
관심 항원성 폴리펩티드에 특이적인 단일클론 항체는 예를 들어 Kohler et al., 1976의 기술 및 이에 대한 개선을 사용하여 제조될 수 있다. 간단하게는, 이러한 방법은 원하는 특이성(즉, 관심 폴리펩티드와의 반응성)을 갖는 항체를 생성할 수 있는 불멸 세포주의 제조를 포함한다. 이러한 세포주는 예를 들어 상기 설명된 바와 같이 면역화된 동물로부터 수득된 비장 세포로부터 생성될 수 있다. 비장 세포는 예를 들어 골수종 세포 융합 파트너, 바람직하게는 면역화된 동물과 동계인(syngenic) 것과의 융합에 의해 불멸화된다. 다양한 융합 기술이 사용될 수 있으며, 예를 들어 비장 세포 및 골수종 세포가 비이온성 세제와 결합되거나 전기융합될 수 있고, 이어서 하이브리드 세포의 성장은 지원하지만 골수종 세포의 성장은 지원하지 않는 선택적 배지에서 성장할 수 있다. 바람직한 선택 기술은 HAT(하이포잔틴, 아미노프테린, 및 티미딘) 선택을 사용한다. 충분한 시간, 일반적으로 약 1 내지 2주 후에, 하이브리드의 콜로니가 관찰된다. 단일 콜로니를 선택하고 세포가 성장한 성장 배지를 폴리펩티드(면역원)에 대한 결합 활성의 존재에 대해 시험한다. 반응성 및 특이성이 높은 하이브리드도마가 바람직하다.
단일클론 항체는 예를 들어 상기 설명된 바와 같은 친화성 정제(purification)와 같은 방법을 사용하여, 성장 하이브리도마 콜로니의 상청액으로부터 분리한다. 추가로, 수율을 향상시키기 위해 마우스와 같은 적절한 척추동물 숙주의 복강 내로 하이브리도마 세포주를 주입하는 것과 같은 다양한 기술을 사용할 수 있다. 이어서 이러한 동물 대상체의 복수액(ascites fluid) 또는 혈액으로부터 단일클론 항체를 수확한다. 크로마토그래피, 겔 여과, 침전, 및/또는 추출과 같은 통상적인 기술에 의해 항체로부터 오염을 제거한다.
대안적으로, 관심 포도칼릭신 폴리펩티드의 형태 또는 이의 단편에 결합할 수 있는 단일클론 항체는 예를 들어 인간 B-세포 하이브리도마 기술(Kozbar et al., 1983), 인간 단일클론 항체(Cole 1985)를 생성하기 위한 EBV - 하이브리도마 기술(Cole 1985), 또는 조합 항체 라이브러리의 스크리닝(Huse et al., 1989)과 같은 방법을 사용하여 생성한다.
한 예에서, 상기 항체는 검출가능한 표지에 컨쥬게이트된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "검출가능한 표지"는 시각적으로 또는 적합한 검출기를 사용하여 검출될 수 있는 광학 신호 또는 기타 신호 또는 생성물을 생성하거나 생성하도록 유도될 수 있는 분자 태그 또는 원자 태그 또는 마커이다. 검출가능한 표지는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 방사성표지, 효소, 형광 표지, 발광 표지, 생물발광 표지, 자기 표지, 보결원자단, 조영제 및 초음파 작용제를 포함한다.
일반적으로 사용되는 형광 표지는 알렉사(Alexa), Cy5 및 Cy5.5와 같은 시아닌, 및 인도시아닌, 및 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 실시에 유용한 형광 표지는 또한 제한 없이, 1,5 IAEDANS; 1,8-ANS; 4-메틸움벨리페론; 5-카복시-2,7-디클로로플루오레세인; 5-카복시플루오레세인(5-FAM); 5-카복시나프토플루오레세인(pH 10); 5-카복시테트라메틸로다민(5-TAMRA); 5-FAM(5-카복시플루오레세인); 5-HAT(하이드록시 트립타민); 5-하이드록시 트립타민(HAT); 5-ROX(카복시-X-로다민); 5-TAMRA(5-카복시테트라메틸로다민); 6-카복시로다민 6C; 6-CR 6G; 6-JOE; 7-아미노-4-메틸쿠마린; 7-아미노악티노마이신 D(7-AAD); 7-하이드록시-4-메틸쿠마린; 9-아미노-6-클로로-2-메톡시아크리딘; ABQ; 산성 푹신(Fuchsin); ACMA(9-아미노-6-클로로-2-메톡시아크리딘); 아크리딘 오렌지+DNA; 아크리딘 오렌지+RNA; 아크리딘 오렌지, DNA 및 RNA 양자 모두; 아크리딘 레드; 아크리딘 옐로우; 아크리플라빈(Acriflavin); 아크리플라빈 퓰겐(Feulgen) SITSA; 에쿠오린(광단백질); 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 350; 알렉사 플루오르 430; 알렉사 플루오르 488; 알렉사 플루오르 532; 알렉사 플루오르 546; 알렉사 플루오르 568; 알렉사 플루오르 594; 알렉사 플루오르 633; 알렉사 플루오르 647; 알렉사 플루오르 660; 알렉사 플루오르 680; 알리자린 콤플렉손(Alizarin Complexon); 알리자린 레드; 알로피코시아닌(APC); AMC, AMCA-S; AMCA(아미노메틸쿠마린); AMCA-X; 아미노악티노마이신 D; 아미노쿠마린; 아미노메틸쿠마린(AMCA); 아닐린 블루; 안트로실 스테아레이트(Anthrocyl stearate); APC(알로피코시아닌); APC-Cy7; APTRA-BTC=비율 염료(Ratio Dye), Zn2+; APTS; 아스트라존(Astrazon) 밝은 레드 4G; 아스트라존 오렌지 R; 아스트라존 레드 6B; 아스트라존 옐로우 7 GLL; 아타브린(Atabrine); ATTO-TAG CBQCA; ATTO-TAG FQ; 아우라민; 아우로포스핀(Aurophosphine) G; 아우로포스핀; BAO 9(비스아미노페닐옥사디아졸); BCECF(높은 pH); BCECF(낮은 pH); 황산 베르베린; 베타 락타마아제; BFP 블루 시프트 GFP(Y66H); 블루 형광 단백질; BFP/GFP FRET 바이메인(Bimane); 비스벤즈암니드(Bisbenzamnide); 비스벤지미드(Hoechst); 비스-BTC=비율 염료, Zn2+; 블랑코포르(Blancophor) FFG; 블랑코포르 SV; BOBO-1; BOBO-3; 보디피(Bodipy) 492/515; 보디피 493/503; 보디피 500/510; 보디피 505/515; 보디피 530/550; 보디피 542/563; 보디피 558/568; 보디피 564/570; 보디피 576/589; 보디피 581/591; 보디피 630/650-X; 보디피 650/665-X; 보디피 665/676; 보디피 Fl; 보디피 FL ATP; 보디피 Fl-세라마이드; 보디피 R6G SE; 보디피 TMR; 보디피 TMR-X 컨쥬게이트; 보디피 TMR-X, SE; 보디피 TR; 보디피 TR ATP; 보디피 TR-X SE; BO-PRO-1; BO-PRO-3; 밝은 설포플라빈(Sulphoflavin) FF; BTC-비율 염료 Ca2+; BTC-5N-비율 염료, Zn2+; 칼세인(Calcein); 칼세인 블루; 칼슘 크림슨; 칼슘 그린; 칼슘 그린-1 Ca2+ 염료; 칼슘 그린-2 Ca2+; 칼슘 그린-5N Ca2+; 칼슘 그린-C18 Ca2+; 칼슘 오렌지; 칼코플루오르(Calcofluor) 화이트; 카복시-X-로다민(5-ROX); 캐스케이드(Cascade) 블루; 캐스케이드 옐로우 399; 카테콜아민; CCF2(GeneBlazer); CFDA; CFP―시안 형광 단백질; CFP/YFP; FRET; 클로로필; 크로모마이신 A; 크로모마이신 A; CL-NERF(비율 염료, pH); CMFDA; 코엘렌테라진(Coelenterazine); 코엘렌테라진 cp(Ca2+ 염료); 코엘렌테라진 f; 코엘렌테라진 fcp; 코엘렌테라진 h; 코엘렌테라진 hcp; 코엘렌테라진 ip; 코엘렌테라진 n; 코엘렌테라진 O; 쿠마린 팔로이딘; C-피코시아닌; CPM 메틸쿠마린; CTC; CTC 포마잔; Cy2; Cy3.1 8; Cy3.5; Cy3; Cy5.1 8; Cy5.5; Cy5; Cy7; 시안 GFP; 고리형 AMP 형광센서(FiCRhR); CyQuant 세포 증식 검정; 답실(Dabcyl); 단실(Dansyl); 단실 아민; 단실 카다베린; 단실 클로라이드; 단실 DHPE; 단실 플루오라이드; DAPI; 답옥실(Dapoxyl); 답옥실 2; 답옥실 3; DCFDA; DCFH(디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트); DDAO; DHR(디하이드로로다민 123); Di-4-ANEPPS; Di-8-ANEPPS(비-비율(non-ratio)); DiA(4-Di-16-ASP); 디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트(DCFH); DiD-지용성 트레이서; DiD (DiIC18(5)); DIDS; 디하이드로로다민 123(DHR); DiI(DiIC18(3)); 디니트로페놀; DiO(DiOC18(3)); DiR; DiR(DiIC18(7)); DM-NERF(높은 pH); DNP; 도파민; DsRed; 레드 형광 단백질; DTAF; DY-630-NHS; DY-635-NHS; EBFP; ECFP; EGFP; ELF 97; 에오신; 에리트로신; 에리트로신 ITC; 에티듐 브로마이드; 에티듐 호모이량체-1(EthD-1); 에크리신(Euchrysin); 유코라이트(EukoLight); 유로퓸(III) 클로라이드; EYFP; 패스트(Fast) 블루; FDA; 퓰겐(파라로잘리닌); FIF(포름알데히드 유도된 형광); FITC; FITC 항체; 플라조(Flazo) 오렌지; 플루오(Fluo)-3; 플루오-4; 플루오레세인(FITC); 플루오레세인 디아세테이트; 플루오로-에메랄드; 플루오로-골드(하이드록시스틸바미딘); 플루오르-루비; FluorX; FM 1-43; FM 4-46; 푸라(Fura) 레드(높은 pH); 푸라 레드/플루오-3; 푸라-2, 고 칼슘; 푸라-2, 저 칼슘; 푸라-2/BCECF; 제나크릴(Genacryl) 밝은 레드 B; 제나크릴 밝은 옐로우 10GF; 제나크릴 핑크 3G; 제나크릴 옐로우 5GF; GeneBlazer(CCF2); GFP(S65T); GFP 레드 시프트(rsGFP), GFP 야생형, 비-UV 여기(wtGFP); GFP 야생형, UV 여기(wtGFP); GFPuv; 글록살산(Gloxalic Acid); 과립상 블루(Granular Blue); 헤마토포르피린(Haematoporphyrin); 훼히스트(Hoechst) 33258; 훼히스트 33342; 훼히스트 34580; HPTS; 하이드록시쿠마린; 하이드록시스틸바미딘(플루오로골드); 하이드록시트립타민; Indo-1, 고 칼슘; Indo-1, 저 칼슘; 인도디카보시아닌(DiD); 인도트리카보시아닌(DiR); 인트라화이트(Intrawhite) Cf; JC-1; JO-JO-1; JO-PRO-1; 레이저프로(LaserPro); 라우로단(Laurodan); LDS 751(DNA); LDS 751(RNA); 류코포르(Leucophor) PAF; 류코포르 SF; 류코포르 WS; 리사민 로다민(Lissamine Rhodamine); 리사민 로다민 B; LIVE/DEAD 키트 동물 세포, 칼세인/에티듐 호모이량체; LOLO-1; LO-PRO-1; 루시퍼 옐로우; 라이소 트래커(Lyso Tracker) 블루; 라이소 트래커 블루-화이트; 라이소 트래커 그린; 라이소 트래커 레드; 라이소 트래커 옐로우; 라이소센서(LysoSensor) 블루, 라이소센서 그린; 라이소센서 옐로우/블루; 매그(Mag) 그린; 매그달라(Magdala) 레드(Phloxin B); 매그-푸라(Mag-Fura) 레드; 매그-푸라-2; 매그-푸라-5; 매그-Indo-1; 마그네슘 그린; 마그네슘 오렌지; 말라카이트 그린; 마리나 블루; 맥실론(Maxilon) 밝은 플라빈 10 GFF; 맥실론 밝은 플라빈 8 GFF; 메로시아닌; 메톡시쿠마린; 미토트래커(Mitotracker) 그린 FM; 미토트래커 오렌지; 미토트래커 레드; 미트라마이신(Mitramycin); 모노브로모비메인; 모노브로모비메인(mBBr-GSH); 모노클로로모비메인; MPS(메틸 그린 파이로닌 스틸벤); NBD; NBD 아민; 나일(Nile) 레드; 니트로벤족사디돌; 노르아드레날린; 뉴클리어(Nuclear) 패스트 레드; 뉴클리어 옐로우; 닐로산 브릴리언트 이아빈(Nylosan Brilliant Iavin) E8G; 오레곤(Oregon) 그린; 오레곤 그린 488-X; 오레곤 그린; 오레곤 그린 488; 오레곤 그린 500; 오레곤 그린 514; 퍼시픽 블루; 파라로잘리닌(퓰겐); PBFI; PE-Cy5; PE-Cy7; PerCP; PerCP-Cy5.5; PE-텍사스레드[레드 613]; 플록신(Phloxin) B(매그달라 레드); 포르와이트(Phorwite) AR; 포르와이트 BKL; 포르와이트 Rev; 포르와이트 RPA; 포스핀 3R; 포토레지스트; 피코에리트린 B[PE]; 피코에리트린 R[PE]; PKH26 (Sigma); PKH67; PMIA; 폰토크롬(Pontochrome) 블루 블랙; POPO-1; POPO-3; PO-PRO-1; PO-PRO-3; 프리뮬린; 프로시온 옐로우; 프로피듐 요오다이드(PI); PyMPO; 피렌; 파이로닌; 파이로닌 B; 파이로잘(Pyrozal) 밝은 플라빈 7GF; QSY 7; 퀴나크린 머스터드; 레드 613[PE-텍사스레드]; 리소루핀(Resorufin); RH 414; Rhod-2; 로다민; 로다민 110; 로다민 123; 로다민 5 GLD; 로다민 6G; 로다민 B; 로다민 B 200; 로다민 B 엑스트라; 로다민 BB; 로다민 BG; 로다민 그린; 로다민 팔리치딘(Phallicidine); 로다민 팔로이딘; 로다민 레드; 로다민 WT; 로즈 벵갈; R-피코시아닌; R-피코에리트린(PE); rsGFP; S65A; S65C; S65L; S65T; 사파이어 GFP; SBFI; 세로토닌; 세브론(Sevron) 밝은 레드 2B; 세브론 밝은 레드 4G; 세브론 밝은 레드 B; 세브론 오렌지; 세브론 옐로우 L; sgBFP; sgBFP(슈퍼 글로우 BFP); sgGFP; sgGFP(슈퍼 글로우 GFP); SITS; SITS(프리뮬린); SITS (스틸벤 이소티오설폰산); SNAFL 칼세인; SNAFL-1; SNAFL-2; SNARF 칼세인; SNARF1; 나트륨 그린; 스펙트럼아쿠아; 스펙트럼그린; 스펙트럼오렌지; 스펙트럼 레드; SPQ(6-메톡시-N-(3-설포프로필)퀴놀리늄); 스틸벤; 설포로다민 B can C; 설포로다민 G 엑스트라; SYTO 11; SYTO 12; SYTO 13; SYTO 14; SYTO 15; SYT; SYTO 17; SYTO 18; SYTO 20; SYTO 21; SYTO 22; SYTO 23; SYTO 24; SYTO 25; SYTO 40; SYTO 41; SYTO 42; SYTO 43; SYTO 44; SYTO 45; SYTO 59; SYTO 60; SYTO 61; SYTO 62; SYTO 63; SYTO 64; SYTO 80; SYTO 81; SYTO 82; SYTO 83; SYTO 84; SYTO 85; SYTOX 블루; SYTOX 그린; SYTOX 오렌지; 테트라사이클린; 테트라메틸로다민(TRITC); 텍사스 레드; 텍사스 레드-X 컨쥬게이트; 티아디카보시아닌(DiSC3); 티아진 레드 R; 티아졸 오렌지; 티오플라빈 5; 티오플라빈 S; 티오플라빈 TCN; 티올라이트(Thiolyte); 티오졸(Thiozole) 오렌지; 티노폴(Tinopol) CBS (칼코플루오르 화이트); TMR; TO-PRO-1; TO-PRO-3; TO-PRO-5; TOTO-1; TOTO-3; 트리컬러(TriColor)(PE-Cy5); TRITC(테트라메틸로다민-이소티오시아네이트); 트루 블루; 트루레드(TruRed); 울트라라이트(Ultralite); 우라닌(Uranine) B; 유비텍스(Uvitex) SFC; wt GFP; WW 781; X-로다민; XRITC; 자일렌 오렌지; Y66F; Y66H; Y66W; 옐로우 GFP; YFP; YO-PRO-1; YO-PRO-3; YOYO-1; 및 YOYO-3을 포함할 수 있다.
한 예에서, 검출가능한 표지는 효소이다. 효소는 적절한 기질에 작용하여 검출가능한 염료를 생성할 수 있다. 본 발명에 유용한 효소의 예는 제한 없이, 알칼리성 포스파타아제 및 호스래디스 퍼옥시다아제를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 효소는 예를 들어 루시퍼라아제일 수 있다. 효소는 통상적인 화학적 방법에 의해 항체에 연결될 수 있거나, 융합 단백질로서 항체와 함께 발현될 수 있다.
본 발명에서 검출가능한 표지로서 유용한 방사성동위원소는 당업계에 잘 알려져 있으며, 3H, 11C, 18F, 35S, 64Cu, 67Ga, 68Ga, 99mTc, 111In, 123I, 124I, 125I, 및 131I를 포함할 수 있다. 칼시토닌 수용체에 결합하는 화합물의 카복이실, 아미노, 또는 설프히드릴 기와 반응할 수 있는 감마 방출 방사성 물질, 예를 들어, 99mTc 및 111In의 부착은 감마 신티그래피(gamma scintigraphy)를 사용하는 검출 방법에 사용하기에 적합하다. 화합물의 카복이실, 아미노, 또는 설프히드릴 기와 반응할 수 있는 방사성 11C, 18F, 64Cu, 67Ga, 68Ga, 124I, 및 131I 화합물의 부착은 PET/SPECT 영상화를 사용하는 검출 방법에 사용하기에 적합하다.
효소 결합 면역흡착 검정(ELISA) 및 형광 결합 면역흡착 검정(FLISA)
표준 고상 ELISA 또는 FLISA 형식은 다양한 샘플로부터의 단백질의 농도를 결정하는 데 특히 유용하다. 한 형태에서 이러한 검정은 생물학적 샘플을, 예를 들어 폴리스티렌 또는 폴리카보네이트 마이크로웰 또는 딥스틱, 막, 또는 유리 지지체(예를 들어, 유리 슬라이드)와 같은 고체 매트릭스 상에 고정화하는 단계를 포함한다.
포도칼릭신 폴리펩티드 내의 마커에 특이적으로 결합하는 항체는 고정된 생물학적 샘플과 직접 접촉하게 되고, 상기 샘플에 존재하는 표적 단백질 중 임의의 것과 직접 결합을 형성한다. 이 항체는 일반적으로 예를 들어 FLISA의 경우 형광 표지(예를 들어 FITC 또는 텍사스 레드) 또는 형광 반도체 나노결정(US 6,306,610에 기재된 바와 같음), 또는 ELISA의 경우 효소(예를 들어 호스래디시 퍼옥시다아제(HRP), 알칼리성 포스파타아제(AP) 또는 β-갈락토시다아제)와 같은 검출가능한 리포터 분자로 표지되거나, 또는 대안적으로 상기 제1 항체에 결합하는 제2 표지된 항체를 사용할 수 있다. 임의의 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 세척한 후, 형광 표지의 경우 표지를 직접 검출하거나, 효소 표지의 경우 예를 들어 과산화 수소, TMB, 또는 톨루이딘, 또는 5-브로모-4-클로로-3-인돌-베타-D-갈락토피라노사이드(x-gal)와 같은 기질의 첨가를 통해 표지를 검출한다.
이러한 ELISA 또는 FLISA 기반 시스템은, 예를 들어 분리된 및/또는 재조합 포도칼릭신 폴리펩티드 또는 이의 면역원성 단편 또는 이의 에피토프와 같은, 항체가 결합하는 단백질 표준의 알려진 양에 대해 검출 시스템을 보정함으로써 샘플에서 단백질의 양을 정량화하기에 적합하다.
또 다른 예에서, ELISA는, 예를 들어 막, 폴리스티렌 또는 폴리카보네이트 마이크로웰, 폴리스티렌 또는 폴리카보네이트 딥스틱 또는 유리 지지체와 같은 고체 매트릭스 상에서 포도칼릭신 폴리펩티드 내의 질병 또는 장애의 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 리간드를 고정화하는 것으로 구성된다. 이어서 샘플은 상기 항체와 물리적 관계를 맺게 되며, 샘플 내의 상기 마커는 결합되거나 '포획'된다. 이어서 결합된 단백질은 표지된 항체를 사용하여 검출된다. 대안적으로, 상기 제2 (검출) 항체와 결합하는 제3 표지된 항체를 사용할 수 있다.
본 명세서에 설명되는 검정 형식을, 예를 들어 스크리닝 공정의 자동화와 같은 고 처리량 형식, 또는 Mendoza et al., 1999에 기재되어 있는 바와 같은 량 형식에 적용할 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 또한, 예를 들어 경쟁 ELISA(competitive ELISA)와 같은, 상기 설명된 검정의 변형은 당업자에게 명백할 것이다.
웨스턴 블로팅
또 다른 예에서, 웨스턴 블로팅은 샘플에서 포도칼릭신 폴리펩티드 내의 마커의 수준을 결정하기 위해 사용된다. 이러한 검정에서, 당업계에 알려져 있으며 예를 들어 Scopes 1994에 기재되어 있는 기술을 사용하여 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 사용하여 샘플로부터의 단백질을 분리한다. 이어서 분리된 단백질을, 당업계에 알려져 있는 방법, 예를 들어 전기이동(electrotransfer)을 사용하여, 예를 들어 막(예를 들어, PVDF 막)과 같은 고체 지지체로 옮긴다. 이어서 이 막을 차단하고 포도칼릭신 폴리펩티드 내의 마커에 특이적으로 결합하는 표지된 항체 또는 리간드로 탐침한다. 대안적으로, 표지된 2차, 또는 심지어 3차 항체 또는 리간드를 사용하여 특이적 1차 항체의 결합을 검출한다. 이어서 사용되는 표지에 적합한 검정을 사용하여 표지의 수준을 결정한다.
적절한 검정은 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들어 농도계를 포함한다. 한 예에서, 단백질 밴드 또는 스팟의 강도는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 SDS-PAGE 겔 상에 로딩된 단백질의 총량에 대해 정규화된다. 대안적으로, 검출된 마커의 수준은 대조군/참조 단백질의 수준에 대해 정규화된다. 이러한 대조군 단백질은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 액틴, 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH), β2 마이크로글로불린, 하이드록시-메틸빌란 합성효소, 하이포잔틴 포스포리보실-트랜스퍼라아제 1(HPRT), 리보솜 단백질 L13c, 석시네이트 탈수소효소 복합체 서브유닛 A 및 TATA 박스 결합 단백질(TBP)을 포함한다.
면역조직화학
당업자에게 명백할 것인 바와 같이, 본 명세서에 설명된 바와 같은 예를 들어 면역조직화학 및/또는 면역형광과 같은 조직화학적 방법은 포도칼릭신의 준세포(subcellular) 국소화를 결정/검출하는 데 유용하다. 이러한 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 Immunohistochemistry(Cuello 1984)에 기재되어 있다.
조직화학적 방법에서 포도칼릭신의 국소화를 분석하는 방법은 당업자에게 명백할 것이고/이거나 본 명세서에 설명되어 있다. 예시적인 방법은 예를 들어 하기를 포함한다:
● 양성으로 염색된 세포 및 구조의 평가. 예를 들어, 양성으로 간주되는 세포 및/또는 구조는 각 샘플에 대해 양성으로 염색된 세포의 절대량을 결정하기 위해 계수된다.
● 양성으로 염색된 세포 및/또는 면적 비율의 평가. 예를 들어, 양성으로 염색된 세포의 백분율이 결정되고, 이는 계수된 세포의 총 수 및/또는 평가된 총 면적에 대한 것이다. 백분율에 소정 점수 값이 주어지면, 정량적 및 정성적 스코어링의 조합이 사용될 수 있다. 예를 들어, "존재" 점수는 양성 염색된 세포의 66% 이상에 대해 주어지며; "부재" 점수는 10% 미만의 세포 염색이 관찰되거나 가시적인 염색이 관찰되지 않을 때 주어진다. 또 다른 예에서, 샘플은 점수 0(염색 없음), 1(10% 미만의 세포 염색), 2(10%~50%의 세포 염색), 또는 3(50% 초과의 세포 염색)이 지정된다.
● 정성적 스코어링. 예를 들어, IHC 발현의 힘은 양성 또는 음성이거나; 또는 음성(-), 약함(+), 보통(++) 및 강함(+++)인 범주에 할당될 수 있다. 범주가 기호 대신 숫자 값으로 표시되는 경우, 이 접근 방식은 정성적 방식으로부터 반-정량적 방식으로 변환된다.
● 디지털 분석. 예를 들어, 이미지 분석 소프트웨어(예를 들어, Fiji 1.51o)가 평균 염색(또는 피크 픽셀) 강도를 결정하는 데 사용된다.
방사성면역검정
대안적으로, 상기 수준은 방사성면역검정(RIA)을 사용하여 검출된다. 검정의 기본 원리는 항체-항원 상호작용을 검출하기 위해 방사성표지된 항체 또는 항원을 사용하는 것이다. 포도칼릭신 폴리펩티드 내의 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 리간드는 고체 지지체에 결합되며 샘플은 상기 항체와 직접 접촉하게 된다. 결합된 항원의 수준을 검출하기 위해, 분리된 및/또는 재조합 형태의 항원이 방사성표지되고 상기 동일한 항체와 접촉하게 된다. 세척 후, 결합된 방사능의 수준이 검출된다. 생물학적 샘플의 임의의 항원이 방사성표지된 항원의 결합을 억제함에 따라, 검출된 방사능의 수준은 샘플의 항원의 수준에 반비례한다. 이러한 검정은 분리된 항원의 증가하는 알려진 농도를 사용하여 표준 곡선을 사용함으로써 정량화할 수 있다.
당업자에게 명백할 것인 바와 같이, 이러한 검정은 방사능활성 표지 대신에 예를 들어 효소 또는 형광 분자와 같은 임의의 리포터 분자를 사용하도록 변형될 수 있다.
바이오센서 또는 광학 면역센서 시스템
대안적으로, 샘플에서 포도칼릭신의 수준은 바이오센서 또는 광학 면역센서 시스템을 사용하여 결정된다. 일반적으로, 광학 바이오센서는 리간드 또는 항체가 표적 폴리펩티드에 결합하는 것을 전기적 신호로 정량적으로 변환하기 위해 광학 원리를 이용하는 장치이다. 이러한 시스템은 4개의 주요 범주로 그룹화될 수 있다: 반사 기술; 표면 플라스몬 공명; 광섬유 기술 및 통합 광학 장치. 반사 기술은 타원측정법, 다중 통합 반사 분광법, 및 형광 모세관 충전 장치를 포함한다. 광섬유 기술은 소멸장 형광, 광섬유 모세관, 및 광섬유 형광 센서를 포함한다. 통합 광학 장치는 평면 소멸장 형광, 입력 그레이딩 커플러 면역센서, 마하젠더(Mach-Zehnder) 간섭계, 하트만(Hartman) 간섭계 및 차동 간섭계 센서를 포함한다. 광학 면역센서의 이러한 예들은 일반적으로 Robins, 1991에 의해 기재되어 있다. 이들 장치의 더 구체적인 설명은 예를 들어 미국 특허 번호 4,810,658; 4,978,503; 5,186,897; 및 Brady et al., 1987에서 찾을 수 있다.
생물학적 샘플
당업자에게 명백할 것인 바와 같이, 생물학적 샘플의 유형 및 크기는 사용되는 검출 수단에 의존할 것이다. 예를 들어, PCR과 같은 예를 들어 검정은 단일 세포를 포함하는 세포 상에서 수행될 수 있지만, 세포의 집단이 바람직하다. 또한, 단백질 기반 검정은 항원 기반 검정에 대해 충분한 단백질을 제공하기에 충분한 세포를 필요로 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "샘플" 또는 "생물학적 샘플"은 대상체로부터 수득되는 임의의 유형의 적합한 물질을 지칭한다. 이 용어는 임상 샘플, 생물학적 유체(예를 들어, 자궁경부액, 질액), 조직 샘플, 간 세포를 포괄하고, 또한 배양 중인 세포, 세포 상청액, 이로부터 유래된 세포 용해물을 포함한다. 샘플은 공급원으로부터 직접 수득하거나 적어도 1-단계의 (부분) 정제 후에 사용할 수 있다. 샘플이 본 발명의 방법을 방해하지 않는 임의의 배지에서 제조될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 통상적으로, 샘플은 세포 또는 조직을 포함하고/하거나, 세포 또는 조직을 포함하는 수용액 또는 생물학적 유체이다. 당업자는 선택 및 전처리 방법을 알고 있을 것이다. 전처리는 예를 들어, 점성 유체를 희석하는 단계를 포함할 수 있다. 샘플의 처리는 여과, 증류, 분리, 농축을 포함할 수 있다.
한 예에서, 생물학적 샘플은 대상체로부터 미리 얻었다. 따라서, 한 예에서, 임의의 구현예에 따른 본 명세서에 설명된 바와 같은 방법은 생물학적 샘플을 제공하는 단계를 추가로 포함한다.
한 예에서, 임의의 구현예에 따른 본 명세서에 설명된 바와 같은 방법은 예를 들어 게놈 DNA, mRNA, cDNA 또는 단백질과 같은 샘플로부터의 추출물을 사용하여 수행된다.
한 예에서, 생물학적 샘플은 내강 상피 세포 및/또는 샘 상피 세포를 포함한다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 내강 상피 세포를 포함한다. 또 다른 예에서, 생물학적 세포는 샘 상피 세포를 포함한다.
참조 샘플
앞의 설명에서 명백할 것인 바와 같이, 본 발명의 일부 검정은 정량화를 위해 적합한 참조 샘플 또는 대조군을 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 참조 샘플은 당업자에게 명백할 것이고/이거나 본 명세서에 설명되어 있다. 예를 들어, 참조는 정상 개체 또는 확립된 데이터 세트(예를 들어, 연령, 샘플 유형 및/또는 주기의 단계에 의해 매칭됨)로부터의 내부 참조(즉, 동일한 대상체로부터 유래함)일 수 있다.
한 예에서, 참조는 내부 참조 또는 샘플이다. 예를 들어, 참조는 자가 참조이다. 한 예에서, 내부 참조는 분석 중인 샘플과 동시에 대상체로부터 수득된다. 또 다른 예에서, 내부 참조는 분석 중인 샘플로서 더 이른 시점에 대상체로부터 수득된다. 예를 들어, 샘플은 이전 주기로부터 수득된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "정상 개체"는 대상체가 불임이 아니고/아니거나 현재 임신하지 않은 것에 기초하여 선택되는 것을 의미하는 것으로 여겨져야 한다.
한 예에서, 참조는 확립된 데이터 세트이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 확립된 데이터 세트는 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들어 하기를 포함한다:
● 연령, 샘플 유형 및/또는 주기의 단계에 의해 매칭된 또 다른 대상체 또는 대상체의 집단으로부터 유래한 자궁내막 상피 세포를 포함하는 데이터 세트;
● 세포가 포도칼릭신 발현을 유도하도록 처리된 적이 있는 시험관내 자궁내막 상피 세포를 포함하는 데이터 세트; 및
● 세포가 포도칼릭신 발현을 억제하도록 처리된 적이 있는 시험관내 자궁내막 상피 세포를 포함하는 데이터 세트.
참조 샘플의 맥락에서 용어 '자궁내막 상피 세포'가 샘 세포 및/또는 내강 세포를 포함한다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 참조 샘플은 샘 세포 및 내강 세포를 포함한다. 또 다른 예에서, 참조 샘플은 샘 세포를 포함한다. 추가의 예에서, 참조 샘플은 내강 세포를 포함한다.
한 예에서, 참조는 검정에 포함되지 않는다. 대신, 적합한 참조는 이전에 생성된 확립된 데이터 세트로부터 얻는다. 이어서 시험 샘플을 처리, 분석 및/또는 검정하여 얻은 데이터를 샘플에 대해 얻은 데이터와 비교한다.
자궁내막 상피 수용성의 모니터링
본 발명은 또한 대상체에서 배아 착상에 대한 자궁내막 상피 수용성을 모니터링하고 최적의 자궁내막 상피 수용성을 예측하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하나 이상의 시점에서 대상체의 자궁내막 상피 세포에서의 포도칼릭신의 수준을 결정하는 단계를 포함한다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 자궁내막 상피 수용성과 관련하여 용어 "모니터링"은 예후의 결정, 약물 요법의 선택, 진행중인 약물 요법의 평가, 결과의 예측, 주기의 진행 후 요법에 대한 반응 결정(합병증의 진단을 포함함), 시간경과에 따른 환자의 월경 주기와 관련된 정보 제공, 또는 요법으로부터 가장 이익을 얻을 가능성이 있는 환자 선택을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "최적의"는 월경 주기에서 배아 착상에 가장 유리한 기간을 지칭한다.
한 예에서, 대상체의 자궁내막 상피 수용성을 모니터링하는 방법은 주기 동안 다수의 시점에서 포도칼릭신의 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 포도칼릭신의 수준은 난소 주기 동안의 시점 및/또는 자궁 주기 동안의 시점에서 결정된다. 한 예에서, 포도칼릭신의 수준은 난포기, 배란 및/또는 황체기 동안 결정된다. 추가의 예에서, 포도칼릭신의 수준은 월경, 증식기 및/또는 분비기 동안 결정된다. 또한, 포도칼릭신의 수준은 주기의 단일 단계에서 다수의 시점에서 결정될 수 있다. 예를 들어, 포도칼릭신의 수준은 자궁 주기의 분비기 동안 다수의 지점에서 결정될 수 있다.
위에 논의된 바와 같이, 인간의 평균 월경 주기는 28일이지만, 이는 가변적임을 당업자는 이해할 것이다.
예를 들어, 난소 주기의 각 단계의 평균 기간은 하기와 같다:
● 난포기: 1일차에서 14일차;
● 황체기: 15일차에서 28일차.
예를 들어, 자궁 주기의 각 단계의 평균 기간은 하기와 같다:
● 월경: 1일차에서 4일차
● 증식기: 5일차에서 14일차;
● 분비기: 15일차에서 28일차.
한 예에서, 포도칼릭신의 수준은 더 이른 시점에서의 대상체의 포도칼릭신의 수준과 비교된다. 본 발명의 맥락에서 "더 이른 시점"에 대한 언급은 임의의 이전 시점에서 대상체의 또 다른 샘플에서 결정된 수준을 지칭한다. 예를 들어, 더 이른 시점은 분석 중인 샘플과 동일한 주기에서의 시점 또는 이전 주기에서의 동일한 시점을 지칭할 수 있다.
당업자에게 명백할 것인 바와 같이, 주기 및/또는 다중 주기들의 지속기간에 걸쳐 대상체에서의 포도칼릭신의 수준을 모니터링하는 능력은 배아 착상에 대한 최적의 자궁내막 상피 수용성을 예측하는 데 도움이 될 것이다. 예를 들어, 포도칼릭신의 수준을 모니터링하는 단계는 대상체의 제1 주기에서 결정되고, 배아는 상기 대상체의 제2 주기에서 착상된다.
불임의 진단 및 예후
본 명세서에 개시된 바와 같이, 본 발명의 발명자들은 자궁내막 상피 수용성에 있어서 포도칼릭신의 역할을 입증하였다. 본 명세서에 개시된 방법이 불임 및 착상 실패의 근본적인 원인을 확인하는 데 유용할 것이라는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 대상체에서 불임의 진단 및 예후를 위한 스크리닝 시험으로서 유용하다.
따라서, 본 발명은 예를 들어 대상체에서 불임을 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 대상체의 자궁내막 상피 세포에서 포도칼릭신의 수준을 결정하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "불임"은 12개월 이상의 규칙적인 비보호 성관계 후에 임상적 임신에 도달하지 못하는 것으로 정의되는 생식계의 질병을 지칭한다.
본 발명은 또한 대상체에서 불임의 진단 및 예후 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 대상체의 자궁내막 상피 세포에서 포도칼릭신의 수준을 결정하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "진단"은 대상체에서 불임의 확인을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 불임에 관한 용어 "예후"는 불임 진단의 가능성이 있거나 예상되는 발병, 진행 및/또는 결과를 지칭한다.
한 예에서, 상기 대상체는 불임의 위험이 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 불임의 "위험이 있는" 대상체는 검출가능한 불임 또는 불임의 증상을 갖거나 갖지 않을 수 있다. "위험이 있는"은 대상체가 하나 이상의 위험 인자-이는 당업계에 알려져 있고/있거나 본 명세서에 설명되어 있는 질병 또는 상태의 발병과 상관관계가 있는 측정가능한 파라미터임-를 가지고 있음을 나타낸다.
대조군보다 불임 발병 위험이 더 높은 경우 대상체는 위험이 있다. 대조군은 불임을 겪지 않았거나 가족력이 없는 일반 모집단(예를 들어, 연령, 성별, 인종 및/또는 민족에 의해 매칭됨)으로부터 무작위로 선택된 한 명 이상의 대상체를 포함할 수 있다. 대상체는 불임과 관련된 "위험 인자"가 그 대상체와 관련된 것으로 밝혀지면 위험이 있는 것으로 여겨질 수 있다. 위험 인자는 예를 들어 대상체의 집단에 대해 통계학적 또는 역학적 연구를 통해 주어진 장애와 관련된 임의의 활동, 특징, 사건 또는 속성을 포함할 수 있다. 따라서 기본 위험 인자를 식별하는 연구가 대상체를 구체적으로 포함하지 않는 경우에도 대상체는 위험에 있는 것으로 분류될 수 있다.
한 예에서, 본 발명의 방법은 불임의 증상의 개시 전 또는 후에 수행된다. 불임의 증상은 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들어 하기를 포함할 수 있다:
● 연령. 30대 후반 이상의 여성은 일반적으로 20대 초반의 여성보다 가임력이 더 낮음;
● 자궁내막증(endometriosis)의 병력;
● 자궁선근증(adenomyosis)의 병력;
● 당뇨병, 루푸스, 관절염, 고혈압, 및 천식과 같은 만성 질환;
● 호르몬 불균형;
● 담배 흡연, 음주, 및 작업장 위험 또는 독소에 대한 노출을 포함하는 환경 인자;
● 너무 많은 체지방 또는 너무 적은 체지방;
● 냉동 수술 또는 원추형 생검으로 치료된 적이 있는 비정상적인 자궁경부암 진단 검사(Pap smears);
● 성병;
● 나팔관 질병;
● 다회 유산;
● 근종;
● 골반 수술; 및
● 출생 시 존재하거나 인생 중 나중에 발생하는 자궁의 이상.
위에 설명된 바와 같이, 대상체에서 자궁내막 상피 수용성을 모니터링하는 방법은 대상체에서의 불임의 진단 및 예후에 유용할 것이다. 한 예에서, 대상체에서의 불임의 진단 및 예후 방법은 주기 동안 다수의 시점에서 포도칼릭신의 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 포도칼릭신의 수준은 난소 주기 동안의 시점에서 및/또는 자궁 주기 동안의 시점에서 결정된다. 한 예에서, 포도칼릭신의 수준은 난포기, 배란 및/또는 황체기 동안 결정된다. 추가의 예에서, 포도칼릭신의 수준은 월경, 증식기 및/또는 분비기 동안 결정된다. 또한, 포도칼릭신의 수준은 주기의 단일 단계에서 다수의 시점에서 결정될 수 있다. 예를 들어, 포도칼릭신의 수준은 자궁 주기의 분비기 동안 다수의 지점에서 결정된다.
의료 영상화
포도칼릭신의 수준을 모니터링하기 위해 본 명세서에 설명된 방법에 추가하여, 생체내 포도칼릭신을 모니터링하는 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 포도칼릭신에 결합하는 화합물을 생체내 영상화 방법에 사용할 수 있다. 구체적으로, 포도칼릭신에 결합하고 검출가능한 표지에 컨쥬게이트 또는 결합되고/되거나 그로 코팅된 화합물(조영제를 포함함)을 알려진 의료 영상화 기술에 사용할 수 있다.
생체내 포도칼릭신을 영상화하기 위해, 검출가능한 표지는 영상화에 의해 검출가능한 신호를 방출할 수 있는 임의의 분자 또는 작용제일 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 표지는 단백질, 방사성동위원소, 형광단, 가시광선 발광 형광단, 적외선 발광 형광단, 금속, 강자성 물질, 전자기 방출 물질, 특이적 MR 분광 시그니쳐를 갖는 물질, X-선 흡수 또는 반사 물질, 또는 음파 변경 물질일 수 있다.
영상화 방법의 예는 MRI, MR 분광법, 방사선촬영, CT, 초음파, 평면 감마 카메라 영상, 단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT), 양전자 방출 단층촬영(PET), 기타 핵의학 기반 영상, 가시광선을 이용한 광학 영상, 루시퍼라아제를 이용한 광학 영상, 형광단을 이용한 광학 영상, 기타 광학 영상, 근적외선을 이용한 영상, 또는 적외선을 이용한 영상을 포함한다.
영상화를 위한 다양한 기술이 당업자에게 알려져 있고/있거나 본 명세서에 설명되어 있다. 이러한 기술 중 임의의 것은 본 발명의 영상화 방법의 맥락에서 포도칼릭신에 결합하는 화합물에 컨쥬게이트된 검출가능한 표지 또는 조영제로부터의 신호를 측정하는 데 적용될 수 있다. 예를 들어, 광학 영상은 널리 사용되는 영상화 방식이다. 예에는 세포 성분의 광학 표지화, 및 형광 혈관조영술(fluorescein angiography) 및 인도시아닌 그린 혈관조영술과 같은 혈관조영술이 포함된다. 광학 영상 작용제의 예에는 예를 들어, 플루오레세인, 플루오레세인 유도체, 인도시아닌 그린, 오레곤 그린, 오레곤 그린 유도체의 유도체, 로다민 그린, 로다민 그린의 유도체, 에오신, 에리틀리로신(erytlirosin), 텍사스 레드, 텍사스 레드의 유도체, 말라카이트 그린, 나노골드 설포석신이미딜 에스테르, 캐스케이드 블루, 쿠마린 유도체, 나프탈렌, 피리딜옥사졸 유도체, 캐스케이드 옐로우 염료, 답옥실 염료가 포함된다.
한 예에서, 포도칼릭신의 수준은 초음파를 사용하여 검출된다. 예를 들어, 검출가능한 표지는 초음파 작용제이다. 적합한 초음파 작용제는 당업자에게 명백할 것이고/이거나 본 명세서에 설명되어 있다. 예를 들어, 초음파 작용제는 마이크로기포-방출 작용제(예를 들어, Willmann et al., 2017; Yeh et al., 2015; Abou-Elkacem et al., 2015; Tsuruta et al., 2014에 기재된 바와 같음)이다. 한 예에서, 포도칼릭신을 검출하는 화합물은 마이크로기포에 커플링된다. 다양한 커플링 방법이 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들어 공유 및 비공유 커플링을 포함한다. 대상체에게 마이크로기포를 투여한 후, 마이크로기포와 표적(즉, 자궁내막 상피 세포) 사이의 접촉은 초음파 장의 외부 적용에 의해 강화된다. 공명 주파수 근처의 초음파 장에 의해 구동되는 마이크로기포는 비야크네스(Bjerknes) 힘으로도 알려진 순(net) 1차 및 2차 초음파 방사력을 경험한다. 초음파는 초음파 전파 방향으로 상당한 거리(최대 밀리미터)에 걸쳐 마이크로기포를 변위시킬 수 있으며 마이크로기포들 사이에 인력을 일으켜 응집체 형성을 유발할 수 있다. 따라서, 마이크로기포는 표적에 집중될 수 있다.
주기 및/또는 다중 주기의 지속기간에 걸쳐 생체내 대상체에서 포도칼릭신의 수준을 모니터링하는 능력은 대상체의 불임을 진단하는 데 도움이 되어, 치료적 예후의 확립을 허용할 것이다.
자궁내막 상피 수용성의 개선 및 착상 실패 치료
본 발명자들은 또한 추정 수용기 동안 자궁내막 내강 상피에서의 포도칼릭신의 지속적인 발현이 착상 실패와 관련이 있음을 보여주었다.
현재 IVF 시술에서, 자궁내막은 배아 이식 전에 프로게스테론으로 자극된다. 하지만, 자궁내막 상피 수용성에 대한 호르몬 제제의 효과를 평가하는 마커가 없기 때문에 투여 전의 약물 유형, 투여량 및/또는 경로의 최적화가 없다.
본 발명자들은 프로게스테론이 특히 수용성 발달을 위해 내강 상피에서 포도칼릭신을 하향 조절함을 보여주었다.
추가적으로, 본 발명자들은 마이크로RNA인 miR-145 및 miR-199가 자궁내막 상피 수용성의 확립 동안 포도칼릭신의 억제에서 프로게스테론의 하류 조절자임을 보여주었다.
따라서, 본 발명자들의 발견은 보조 생식 기술에 대한 자궁내막 프로토콜을 최적화하기 위해 기능적인 바이오마커로서 포도칼릭신을 사용하기 위한 기초를 제공한다. 예를 들어, 본 발명자들의 발견은 또한 착상 실패를 치료하기 위해 포도칼릭신을 표적화하는 방법에 대한 기초를 제공한다.
본 발명의 한 예에서, 본 발명의 임의의 예에 따른 본 명세서에 설명된 바와 같은 방법은 포도칼릭신의 발현 및/또는 수준을 감소시키는 단계를 포함한다.
예를 들어, 본 발명은 대상체의 자궁내막 상피 세포에서 포도칼릭신의 수준을 결정하는 단계, 및, 선택적으로, 상기 세포에서의 포도칼릭신의 상기 수준에 기초하여 상기 자궁내막 상피 세포에서의 포도칼릭신의 상기 수준을 감소시키기에 충분한 양의 화합물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서의 배아 착상에 대한 자궁내막 상피 수용성을 개선하는 방법을 제공한다.
예를 들어, 대상체는 상기 세포에서의 포도칼릭신의 상기 수준에 기초하여 전-수용 상태에 있을 수 있고, 상기 대상체에 대한 화합물의 투여는 상기 자궁내막 상피 세포에서의 포도칼릭신의 상기 수준을 감소시키기에 충분하며, 그럼으로써 상기 대상체를 수용 상태로 전환시킨다.
이 발견은 또한 배아 착상에 대한 자궁내막 상피 수용성 개선에 대한 화합물의 효과를 평가하는 방법에 대한 기초를 제공한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "화합물"은 본 명세서에 설명된 임의의 방법에 사용하기에 적합한 임의의 작용제를 지칭하는 것으로 이해해야 한다. 예를 들어, 본 발명에 사용하기에 적합한 화합물은 자궁내막 상피 세포에서 포도칼릭신의 수준을 변경하는(예를 들어 상기 수준을 감소시키는) 임의의 작용제를 지칭한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 화합물은 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들어 자궁내막 내강 상피 세포에서 포도칼릭신 전사 또는 핵산의 번역을 하향 조절하는 임의의 작용제를 포함한다. 예를 들어, 적합한 화합물은 호르몬 제제 및 핵산을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
호르몬 제제
본 명세서에 설명된 임의의 방법의 한 예에서, 화합물은 호르몬 제제이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 다양한 호르몬 제제는 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들어 프로게스테론, 프로제스토젠 및 이들의 유사체 및 이들의 조합을 포함한다.
핵산
본 명세서에 설명된 임의의 방법의 한 예에서, 화합물은 핵산이다. 예를 들어, 핵산은 안티센스 폴리뉴클레오티드, 촉매 핵산, 간섭 RNA, siRNA 또는 마이크로RNA이다.
안티센스 핵산
용어 "안티센스 핵산"은 본 발명의 임의의 예에서 본 명세서에 설명된 바와 같은 폴리펩티드를 인코딩하고 mRNA 번역과 같은 전사후 사건을 방해할 수 있는 특이적 mRNA 분자의 적어도 일부에 상보적인 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체(예를 들어, LNA 또는 PNA), 또는 이들의 조합을 의미하는 것으로 여겨야 한다. 안티센스 방법의 사용은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, Hartmann 1999 참조).
본 발명의 안티센스 핵산은 생리학적 조건 하에서 표적 핵산에 혼성화할 것이다. 안티센스 핵산은 구조적 유전자 또는 코딩 영역에 상응하는 서열, 또는 유전자 발현 또는 스플라이싱을 제어하는 데 영향을 미치는 서열을 포함한다. 예를 들어, 안티센스 핵산은 포도칼릭신을 인코딩하는 핵산의 표적화된 코딩 영역, 또는 5'-비번역 영역(UTR) 또는 3'-UTR 또는 이들의 조합에 상응할 수 있다. 이는 예를 들어 표적 유전자의 엑손 서열에만 전사 동안 또는 전사 후에 스플라이싱될 수 있는 인트론 서열에 부분적으로 상보적일 수 있다. 안티센스 서열의 길이는 포도칼릭신을 인코딩하는 핵산의 적어도 19개의 연속 뉴클레오티드, 예를 들어 적어도 100, 200, 500 또는 1000개의 뉴클레오티드와 같은 적어도 50개의 뉴클레오티드이어야 한다. 전체 유전자 전사체에 상보적인 전장 서열이 사용될 수 있다. 길이는 100~2000개의 뉴클레오티드일 수 있다. 표적화된 전사체에 대한 안티센스 서열의 동일성의 정도는 적어도 90%, 예를 들어 95~100%이어야 한다.
촉매 핵산
용어 "촉매 핵산"은 독특한 기질을 특이적으로 인식하고 이 기질의 화학적 변형을 촉매작용하는 DNA 분자 또는 DNA-함유 분자(당업계에서 "데옥시리보자임" 또는 "DNA자임"으로도 알려짐) 또는 RNA 또는 RNA-함유 분자("리보자임" 또는 "RNA자임"으로도 알려짐)를 지칭한다. 촉매 핵산의 핵산 염기는 염기 A, C, G, T(RNA의 경우, U)일 수 있다.
통상적으로, 촉매 핵산은 표적 핵산의 특이적 인식을 위한 안티센스 서열, 및 효소 활성을 절단하는 핵산(본 명세서에서 "촉매 도메인"으로도 지칭됨)을 함유한다. 본 발명에 유용한 리보자임의 유형은 해머헤드 리보자임 및 헤어핀 리보자임이다.
RNA 간섭
RNA 간섭(RNAi)은 특히 특정 단백질의 생성을 억제하는 데 유용하다. 이론에 제한되지 않고, 이 기술은 관심 유전자의 mRNA 또는 이의 일부, 이 경우에는 포도칼릭신을 인코딩하는 mRNA와 본질적으로 동일한 서열을 함유하는 dsRNA 분자의 존재에 의존한다. 편리하게는, dsRNA는 재조합 벡터 숙주 세포에서 단일 프로모터로부터 생성될 수 있으며, 여기서 센스 및 안티센스 서열은 비관련 서열-이는 센스 및 안티센스 서열이 혼성화하여, 루프 구조를 형성하는 비관련 서열과 dsRNA 분자를 형성하는 것을 가능하게 함-옆에 있다. 본 발명에 적합한 dsRNA 분자의 설계 및 생성은 특히 WO99/32619, WO99/53050, WO99/49029 및 WO01/34815를 고려하면, 당업자의 능력 범위 내에 있다.
혼성화하는 센스 및 안티센스 서열의 길이는, 각각 적어도 30 또는 50개의 뉴클레오티드, 예를 들어 적어도 100, 200, 500 또는 1000개의 뉴클레오티드와 같은, 적어도 19개의 연속 뉴클레오티드이어야 한다. 전체 유전자 전사체에 상응하는 전장 서열이 사용될 수 있다. 길이는 100~2000개의 뉴클레오티드일 수 있다. 표적화된 전사체에 대한 센스 및 안티센스의 동일성의 정도는 적어도 85%, 예를 들어, 95~100%와 같이 적어도 90%이어야 한다.
예시적인 소간섭 RNA("siRNA"분자는 표적 mRNA의 약 19~21개의 연속 뉴클레오티드와 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어 siRNA 서열은 디뉴클레오티드 AA로 시작하고, 약 30~70%(예를 들어, 30~60%, 예컨대 40~60%, 예를 들어 약 45%~55%)의 GC-함량을 포함하며, 예를 들어 표준 BLAST 검색에 의해 결정된 바와 같이 도입될 포유동물의 게놈 내의 표적 이외의 임의의 뉴클레오티드 서열에 대해 높은 백분율 동일성을 갖지 않는다. 포도칼릭신의 발현을 감소시키는 예시적인 siRNA는 Santa Cruz Biotechnology로부터 구매가능하다.
포도칼릭신의 발현을 감소시키는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)가 또한 당업계에 알려져 있으며 Santa Cruz Biotechnology로부터 구매가능하다.
마이크로RNA(miRNA 또는 miR) 분자는 길이가 18 내지 25개인 뉴클레오티드를 포함하며, 효소 다이서(Dicer)에 의한 pre-miRNA 절단의 생성물이다. "Pre-miRNA" 또는 "pre-miR"는 Drosha로 알려진 이중 가닥 RNA-특이적 리보뉴클레아제에 의한 pri-miR 절단의 생성물인 헤어핀 구조를 갖는 비-코딩 RNA를 의미한다. 포도칼릭신 발현을 감소시키는 예시적인 마이크로RNA는 당업자에게 명백할 것이고/이거나 본 명세서에 설명되어 있다. 예를 들어, 핵산은 miR-199 또는 mir-145와 같은 마이크로RNA이다.
복용량 및 투여
한 예에서, 본 방법은 대상체의 자궁내막 상피 세포에서 포도칼릭신의 수준을 결정하는 단계, 및 상기 세포에서의 포도칼릭신의 상기 수준에 기초하여 상기 세포에서의 포도칼릭신의 상기 수준을 감소시키기에 충분한 양의 화합물을 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 상기 대상체에서의 포도칼릭신의 상기 수준에 기초하여, 투여량, 화합물의 유형 및/또는 경로 중 하나 이상 또는 모두가 수정된다.
세포에서의 포도칼릭신의 수준을 감소시키는 데 필요한 화합물의 양 또는 투여량은 당업자에게 명백할 것이다. 복용량은 유해 부작용을 일으킬 정도로 크지 않아야 할 것이다. 일반적으로, 복용량은 환자의 연령, 상태, 성별 및 질병의 정도에 따라 변할 것이며 당업자에 의해 결정될 수 있다. 임의의 합병증이 있는 경우 개별 의사가 복용량을 조절할 수 있다.
복용량은 하루 또는 며칠 동안, 매일 1회 이상의 투여량으로, 약 0.1 mg/kg 내지 약 300 mg/kg, 예를 들어, 약 0.2 mg/kg 내지 약 200 mg/kg, 예컨대, 약 0.5 mg/kg 내지 약 20 mg/kg으로 각기 다를 수 있다.
일부 예에서, 상기 화합물은 후속(유지 투여량)보다 더 많은 초기(또는 로딩) 투여량으로 투여된다.
일부 예에서, 화합물이 후속 투여량에 사용되는 것보다 더 낮은 투여량으로 초기 투여되는 투여량 증량 요법이 사용된다.
대상체는 적어도 약 2회 노출, 예를 들어 약 2 내지 60회 노출, 더 구체적으로는 약 2 내지 40회 노출, 가장 구체적으로는, 약 2 내지 20회 노출과 같은 1회 이상의 노출 또는 투여량 세트를 제공함으로써, 포도칼릭신의 상기 수준에 기초하여 상기 화합물로 재치료될 수 있다.
본 발명의 방법에 따른 화합물의 투여는 예를 들어 수용자의 생리학적 상태, 투여의 목적이 치료적인지 예방적인지의 여부, 및 숙련된 실무자에게 알려진 기타 인자에 따라 연속적이거나 간헐적일 수 있다. 투여는 미리 선택된 기간 동안 내내 본질적으로 연속적일 수 있거나, 예를 들어 병태의 발병 동안 또는 후에 일련의 간격을 둔 투여량일 수 있다.
위에 설명된 바와 같이, 대상체에서 자궁내막 상피 수용성을 모니터링하는 방법은 상기 자궁내막 상피 수용성의 개선에 있어서 화합물의 효과를 모니터링하고 결정하는 데 유용할 것이다. 화합물의 투여 동안 대상체에서 자궁내막 상피 수용성을 모니터링하는 것은 또한 대상체의 치료 요법을 최적화하는 데 도움이 될 것이다. 예를 들어, 포도칼릭신의 수준은 화합물의 투여 전 및/또는 투여 후에 결정되며, 그에 따라 투여되는 화합물의 투여량, 경로 및/또는 유형이 조정된다.
화합물의 투여량, 경로 및/또는 유형의 최적화는 대상체에서 자궁내막 상피 수용성을 개선하는 데 도움이 될 것이며 착상 가능성을 최대화한다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
실시예
실시예 1: 재료 및 방법
1차 자궁내막 상피 세포의 분리를 위한 인간 자궁내막 조직
Monash Medical Centre(오스트레일리아, 맬버른 소재)의 Human Ethics Committee로부터 윤리 승인을 얻었으며, 모든 환자는 사전 서면 동의가 제공되었다. 자궁경 확장술, 소파술 또는 난관 개방성 평가를 받는 여성으로부터 자궁내막 생검을 얻었다. 월경 주기 단계는 조직의 일상적인 조직학적 연대측정에 의해 확인되었다.
1차 인간 자궁내막 상피 세포(HEEC)의 분리
증식기(6~14일차)의 조직을 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)/F12(DMEM/F12, Thermo Fisher Scientific, 미국 메사추세츠주 소재) 내로 수집하고, 세포를 수집 24h 이내에 분리하였다. 세포를 앞서 설명한 바와 같은 효소 소화 및 여과에 의해 분리하였다(Marwood et al., 2009). 간단히 말하면, 자궁내막 조직 샘플은 2x20분 동안의 일정한 진탕과 함께 37℃ 수조에서 클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum)(7.5 U/ml; Sigma)로부터의 콜라게나아제 및 DNase 1(2000 U/ml; Roche, 오스트레일리아 뉴사우스웨일스주 캐슬 힐 소재)로 소화되었다. 소화 반응물을 10% 소태아 혈청(FBS)(Bovogen Biologicals Pty Ltd, 오스트레일리아) 및 1% 항생제-항진균제(Sigma)로 보충된 DMEM/F12를 함유하는 완전 배지로 켄칭하고, 45μm 나일론 메쉬를 통해 여과하였다. 메쉬 상에 남아 있는 인간 자궁내막 상피 세포(HEEC)를 10ml의 PBS로 새 튜브로 헹구고 RT에서 5분 동안 1000rpm으로 원심분리했으며; 세포 펠릿을 10% FBS 및 1% 항생제-항진균제로 보충된 DMEM/F12에 재현탁하고, 24-웰 플레이트 내로 시딩하고, 가습 인큐베이터에서 5% CO2 하에 37℃에서 인큐베이션하였다.
다음 날, 임의의 비부착 세포 및 적혈구 세포를 제거하고 부착된 HEEC를 90~95% 컨플루언시(confluency)에 도달할 때까지 3일마다 신선한 배지로 보충했다. 이어서 HEEC를 사용하여 PCX의 호르몬 조절을 조사했다.
1차 HEEC로부터 원형질막 단백질의 분리
위와 같이 분리되었지만 추가 배양을 하지 않은 1차 HEEC를 얼음처럼 차가운 용해 완충액[25mM 이미다졸 및 100mM NaC1 pH 7.0 함유 프로테아제 억제제 칵테일(Roche)]으로 용해시키고, 27.5-게이지 바늘 및 시린지를 통해 7회 통과시키고, 4℃에서 5분 동안 15,000g에서 원심분리했다. 상청액을 1h 동안(15분마다 와류와 함께) 얼음 상에서 100mM Na2CO3로 인큐베이션하고 4℃에서 60분 동안 100,000g에서 원심분리하여 원형질막을 함유하는 펠릿을 수집하였다.
원형질막 단백질(100μg)을 필터-보조 샘플 제조(FASP) 컬럼(Expedeon Inc., 미국 캘리포니아주 소재)을 사용하여 처리하였다. FASP 컬럼으로부터의 트립신 펩티드를 원심분리에 의해 수집하고 질량 분석기 분석을 위해 C18 StageTips 상에서 탈염시켰다.
질량 분석기 분석
추출된 펩티드를, 95% 용매 A(milliQ 물 중 0.1% 포름산)에서 100% 용매 B(0.1% 포름산, 80% 아세토니트릴(Mallinckrodt Baker, 미국 펜실베이니아주 센터 밸리 소재), 및 20% milliQ 물)로, 0.4μL/분의 유량으로 설정된 선형 60분 구배를 갖는 nanoAcquity C18 150 × 0.075 mm I.D. 컬럼(Waters)을 사용하여, 나노 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC) 시스템(Waters nanoAcquity, Waters, 미국 매사추세츠주 밀포드 소재) 상에서, 나노-유동 역상 액체 크로마토그래피로 주입하고 분리하였다. 나노 UPLC를 전체 스캔(70000 해상도)을 획득하도록 설정된 나노-전자분무 이온 공급원(Thermo Fisher Scientific, 독일 브레멘 소재)이 장착된 Q-Exactive 질량 분석기에 온라인으로 커플링하고, 단일-하전 종과의 고에너지 충돌 해리를 사용하여 단편화를 위해 선택된 상위-10개의 다중 하전 종은 무시하였다. 단편 이온을 1e5 강도로 설정된 이온 임계값과 함께, 17500으로 설정된 해상도로 분석하였다. 활성화 시간은 30 ms로 설정되었고, 정규화된 충돌 에너지는 ±20% 단계화되어 26으로 설정되었다. 전체-스캔 MS 및 고해상도 MS/MS 스펙트럼으로 구성된 원시 파일을 Maxquant 알고리즘(버전 1.4)을 사용하여 검색하였다. 트립신은 2개의 누락된 절단으로 설정되었고, 산화된 메티오닌에 대해 설정된 가변 수정, 및 카바미도메틸 Cys 잔기 형태의 고정된 수정(각각 40 및 17로 설정된 수정된 펩티드에 대한 컷오프 점수 및 델타 점수가 있는 기본 Maxquant 설정을 사용함)으로 파일을 검색하였다. 모든 MS/MS를 또한 Mascot(Matrix Science, 영국 런던 소재; 버전 2.4.1)를 사용하여 분석하였다. Mascot는 0.040 Da의 단편 이온 질량 허용오차 및 20 PPM의 모(parent) 이온 허용오차로 검색되었다. 시스테인의 카바미도메틸은 Mascot에서 고정된 수정으로서 지정되었다. N-말단의 메티오닌 및 아세틸의 산화는 Mascot에서 가변 수정으로서 지정되었다.
이어서 보고된 펩티드를 Scaffold(버전 Scaffold4.4.1.1, Proteome Software Inc., 미국 오레곤주 포틀랜드 소재)에서 분석하였다. 펩티드 식별은 Scaffold Local FDR 알고리즘에 의해 95% 초과의 확률로 확립될 수 있는 경우 허용되었다. 단백질 식별은 90% 초과의 확률로 확립되고 각 샘플로부터 적어도 하나의 식별된 펩티드가 함유될 수 있는 경우 허용되었다.
1차 HEEC의 배양 및 호르몬 치료
융합(confluent) HEEC를 가습 인큐베이터에서 5% CO2 하에 37℃에서 5 hr 동안 12웰-플레이트 또는 유리 커버슬립으로 시딩하고, 이어서 10% 차콜 스트리핑된 FBS로 보충된 DMEM/F12를 함유하는 완전 배지에서 10nM의 17ß-에스트라디올(E)(Sigma)로 밤새 프라이밍하였다. 다음 날, E 프라이밍 배지를 제거하고 세포를 1μM 메드록시프로게스테론-17-아세테이트(P)(Sigma)가 없거나 있는 10nM E를 함유하는 신선한 완전 배지(이는 각각 E 및 E+P로 지정됨)로 보충하였다. 세포를 48h, 72h 및 96h의 시간 경과 동안 E 또는 E+P로 처리하였다. 각 시점이 끝나면, 세포를 RNA 분리를 위해 PBS로 2회 세척, 트립신처리, 펠릿화 및 급속 냉동하거나, 단백질 분리를 위해 얼음같이 차가운 PBS로 긁거나, 면역형광을 위해 얼음같이 차가운 100% 메탄올 또는 4%(W/v) 파라포름알데히드(PFA)로 고정하였다.
PCX 단백질의 국소화를 위한 정상 건강 여성으로부터의 자궁내막 조직
자궁내막 조직을 노스캐롤라이나 대학교 및 그린빌 병원 시스템의 인간 대상체 보호를 위한 윤리 위원회에 따라 수득하였다. 생검을 25~35일의 월경 간격(n=22)으로 월경 주기의 상이한 단계에서 정상 건강 여성으로부터 취하였다. 제외 기준은 다음을 포함한다: 18세 미만 또는 35세 초과의 연령, 29 초과의 체질량 지수, 지난 1년 이내의 비정상적인 PAP 검사, 임신을 시도하거나 현재 임신 중임, 성생활을 하고 있으며 콘돔을 사용하지 않음, 자궁 내 장치가 있는 경우, 임신 상실의 이력, 근종과 같은 자궁 이상, 모유수유, 자궁내막 형태에 영향을 미치는 약물, 알려진 자궁경부 협착증, 베타딘에 대한 알레르기 및 기저 의학적 장애. 월경의 시작일을 기준으로 주기 일을 결정했다. 소변 LH는 홈 테스트 키트(Ovuquick One Step, Conception Technologies, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)로 결정했다. 자궁내막 샘플을 보고된 주기 일 및 LH 급증(LH+) 후 일 수로 분류했다. 주기 일은 또한 헤마톡실린 및 에오신으로 확인했다. 자궁내막 생검은 월경 주기의 증식기(n=5), 초기-분비기(n=6, LH+4-5), 중간-분비기(n=6, LH+7-10) 및 후기-분비기(n=5, LH+12-13)로부터 얻었다. 모든 자궁내막 생검을 포르말린으로 고정하고 파라핀에 포매하였다.
인간 자궁내막 조직에서 PCX의 면역조직화학적 국소화
자궁내막 절편(5μm)을 히스토졸에서 탈파라핀화하고, 재수화하고 항원을 전자레인지(0.01M 시트르산 완충액 pH 6.0에서 고출력으로 10분)로 회수했다. 내인성 퍼옥시다아제를 메탄올 중 3% H2O2로 10분 동안 켄칭하고 비특이적 결합을 0.1% Tween 20을 함유하는 고염분 TBS(0.3M NaCl, 0.05M Tris 염기 pH 7.6) 중 15% 말 혈청으로 20분 동안 차단했다. 절편을 0.1% Tween 20을 함유하는 고염분 TBS 중 10% 송아지 태아 혈청에서 1차 PCX 항체(Ab2, P42에 대한 세부사항, 2μg/ml)로 37℃에서 1h 동안 인큐베이션하였다. 마우스 IgG(Dako)는 음성 대조군에서 1차 항체를 대체하였다. 절편을 세척하고 적절한 비오틴화된 2차 항체(Vector laboratories, Inc. 미국)를 실온에서 30분 동안 적용하였다. 신호를 StreptABC/HRP(Dako)로 실온에서 30분 동안 증폭하고 디아미노벤지딘(Dako)으로 가시화하였다. 세포 핵을 헤마톡실린(블루)으로 염색하고 절편을 DPX 시약으로 장착시켰다.
자궁내막 조직에서 PCX 염색의 정량화
슬라이드를 이미지 분석 소프트웨어 Fiji 1.51o(National Institutes of Health, 미국 메릴랜드주 베데스다 소재)를 사용하여 맹검 분석하였다. 매 절편에 대해, LE, GE 및 BV의 3개의 대표 이미지를 촬영했다. 각 이미지를 롤링 볼 알고리즘을 이용하는 배경 빼기, 및 내장 벡터 헤마톡실린 및 디아미노벤지딘(HDAB) 플러그인을 이용하는 "컬러 데콘볼루션"에 의해 분석하였으며, 이는 이미지를 헤마톡실린, DAB 및 배경의 3개의 패널로 분리했다. DAB 패널(PCX 염색을 나타냄) 상에서, 관심 영역을 프리핸드 툴로 선택하고 그레이 값을 측정하였다. 섹션 당 평균 그레이 값을 3개의 대표 이미지로부터 계산하고 광학 밀도 단위[ODU = log10(255/평균 그레이 값)으로 변환하였으며, 이를 PCX 염색 강도를 표현하는 데 사용하였다.
웨스턴 블롯 분석
세포를 50mM Tris-HCl pH7.4, 150mM NaCl, 1mM EGTA, 2mM EDTA, 1% Triton X 함유 프로테아제 억제제 칵테일(Roche)로 용해시켰다. 용해물을 드라이아이스 상에 10분 동안 동결하고, 이어서 추가의 5분 동안 실온에서 해동했다. 이 동결-해동 주기를 3회 반복했다. 이어서 샘플을 4℃에서 10분 동안 14000rpm에서 원심분리하고 단백질을 함유하는 상청액을 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리하고 폴리비닐 디플루오라이드 막(GE Healthcare, 오스트레일리아 뉴사우스웨일스주 라이댈미어 소재) 상으로 옮겼다. 막을 0.02% Tween20을 함유하는 Tris-완충 식염수[10mmol/L Tris(pH7.5) 및 0.14mol/L NaCl] 중 5% BSA로 차단시켰다. 3개의 PCX 항체를 웨스턴 블롯 분석에 사용했으며: Ab1은 고도로 글리코실화된 뮤신 영역 aa 23-427(AF1658, R&D Systems 미국 미네소타주 미니애폴리스 소재)에 대해 생성되었고; Ab2는 세포외 도메인 aa 251-427(3D3, Santa Cruz, 미국 텍사스주 달라스 소재)의 일부에 대해 생성되었으며(Kershaw et al., 1997); Ab3은 PCX aa 300-500(EPR9518, Abcam, 영국 케임브리지주 소재)의 세포외, 막통과 및 세포내 부분에 대해 생성되었다(Kershaw et al., 1997). 적절한 2차 항체는 염소 IgG-HRP, 마우스 IgG-HRP 또는 토끼 IgG-HRP(Dako, 오스트레일리아 빅토리아주 소재)를 포함하였다. Lumi-광 강화제 용액(Roche)을 사용하여 밴드를 가시화하였다. 로딩 제어를 위해 β-액틴(Cell Signaling Technology, 미국 메사추세츠주 덴버 소재)에 대해 막을 조사했다. PCX(rPCX, aa23-427, R&D Systems)의 세포외 부분 및 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)가 함유된 재조합 인간 PCX를 양성 대조군으로 제공하였다. 이 실험을 4회 반복하였다.
이시카와 세포에서 PCX의 일시적인 녹다운
이시카와 세포(일본 이바라키현에 있는 National Hospital Organization, Kasumigaura Medical Center의 Masato Nishida 교수의 관대한 선물)를 10%(v/v) FBS, 1% 항생제-항진균제 및 1% L-글루타민으로 보충된 변형 이글 배지(MEM, Life Technologies, 미국 캘리포니아 칼즈배드 소재)를 함유하는 완전 배지 내의 6-웰 플레이트에서 5.6x105개 세포/웰로 밤새 배양하였다. 다음 날, 세포를 형질감염을 위해 Opti-MEM 배지로 보충하였다. PCX-고유 27mer siRNA 이중체(SR303611B) 및 범용 스크램블된 음성 대조군 siRNA 이중체(SR30004)를 Origene(미국 메릴랜드주 록빌)으로부터 얻었다. 대조군 또는 PCX siRNA(20μM 스톡)를 함유하는 1마이크로리터의 마스터 믹스를 250 μl Opti-MEM 배지에 첨가하고, 4μl의 리포펙타민 형질감염 시약을 250μl Opti-MEM 배지 중에 희석하였으며, 이어서 이들을 함께 혼합하고 웰에 첨가하였다. 37℃에서 24h 인큐베이션한 후, 세포를 완전 배지로 변경하고 또 다른 24h 동안 배양하고 qRT-PCR 및 웨스턴 블롯으로 PCX 녹다운(KD)을 확인하였다.
이시카와 세포에서 PCX의 안정적인 과발현
인간 PCX 개방 판독(RC210816) 및 빈 pCMV6(대조군 플라스미드)의 발현 구성체를 Origene으로부터 구매하였다. 이시카와 세포를 6-웰 플레이트 상에서 성장시켜 10% FBS, 1% 항생제-항진균제 및 1% L-글루타민으로 보충된 MEM 배지 중에 합류시키고, 이어서 PBS로 세척하고, 다음 날 앞서 설명한 바와 같은 형질감염을 위해 Opti-MEM 배지로 보충하였다(Heng et al., 2015). Opti-MEM 배지(Life Technologies) 중 1:3 비율의 플라스미드 DNA(PCX 또는 대조군 함유) 및 리포펙타민 형질감염 시약(Life Technologies)의 마스터믹스를 웰(1μg DNA/웰)에 첨가하고 가습 인큐베이터에서 5% CO2 하에 37℃에서 24h 동안 인큐베이션하였다. 세포를 신선한 Opti-MEM 배지로 보충하고 또 다른 24h 동안 배양하고, 이어서 2% 제네티신이 함유된 완전 배지를 함유하는 10cm 페트리접시 내로 옮겼다. 약 90% 컨플루언시에 도달한 후, 세포를 트립신처리하고, 25cm 페트리접시에서 매우 드문드문 시딩하고(약 20,000개 세포/접시), 개별 콜로니가 형성될 때까지 배양하였다. 이어서 각 콜로니를 트립신처리하고 96-웰 플레이트 내로 옮겼다. 잘 자란 콜로니를 48-, 24-, 12- 및 6-웰 플레이트의 더 큰 웰로 순차적으로 확장시켰다. 최종 콜로니를 qRT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다.
qRT-PCR에 의한 이시카와 세포의 PCX 확인
RNeasy 미니 키트(Qiagen, 독일 힐덴 소재)를 사용하여 1차 HEEC, HUVEC 및 이시카와 세포(PCX-OE, PCX-KD 및 대조군)으로부터 총 RNA를 추출하고, TURBO DNA-프리 키트(Invitrogen, 리투아니아 빌니우스 소재)로 처리하였다. 총 RNA(500 ng)를 Superscript III First-Strand Synthesis System(Invitrogen, 미국 캘리포니아 칼즈배드 소재)을 제조사 지침에 따라 사용하여 역전사하였다. qRT-PCR을 PCX에 대해 상기와 같이 수행하였다. Power SYBR Green PCR 마스터 믹스(Applied Biosystems, 영국 워링턴 소재) 및 표 1에 나열된 프라이머를 사용하여, Applied Biosystems 7900HT 패스트 실시간 PCR 시스템 상에서 정량적 PCR을 수행하였다.
[표 1] 프라이머 서열
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1차 HEEC에서 PCX의 면역형광 분석
유리 커버슬립 상에서 성장한 세포를 얼음같이 차가운 메탄올로 10분 동안 고정하고 PBS로 3회 헹구었다. 세포를 PBS 중 0.1% Triton-X100으로 5분 동안 투과시키고 PBS 중 15% 말 혈청 및 2% 인간 혈청으로 30분 동안 차단시켰다. 세포를 Ab1(6μg/ml)과 함께 5% 말 혈청/PBS 중에 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날, 세포를 0.2% Tween20을 함유하는 PBS로 5분 동안 3회 세척하고 말 항염소 비오틴화된 2차 항체(10μg/ml, Vector Laboratories, 영국 피터버러 소재)로 RT에서 1h 동안, 이어서 스트렙타비딘 컨쥬게이트된 Alexa Fluor 488(10μg/ml, Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재)로 RT에서 2h 동안 인큐베이션하였다. DAPI(0.5μg/ml, Sigma)로 핵을 염색하였다. 형광 현미경(Olympus Optical, 일본 도쿄 소재)으로 신호를 가시화하였다.
피브로넥틴에 대한 이시카와 세포 부착력의 분석
피브로넥틴에 대한 이시카와 세포 부착력의 분석을 앞서 Heng et al., 2015에 기재된 바와 같이 수행하였다.
간단히 말하면, 96-웰 플레이트를 10μg/ml 피브로넥틴(Corning Life Sciences, 미국 매사추세츠주 튜크스베리 소재)으로 코팅하고 이시카와 세포(PCX-OE, PCX-KD 또는 대조군)를 피브로넥틴 코팅된 웰에 첨가하고(2x104개 세포/웰) 37℃에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 비-부착 세포를 제거하고 웰을 PBS+(Ca2+Mg2+ 함유)로 부드럽게 세척하고, 10% 에탄올 중 0.2% 크리스탈 바이올렛과 함께 RT에서 5분 동안 교반 없이 인큐베이션하였다. 크리스탈 바이올렛 용액을 제거한 후, 각 웰을 PBS+로 3회 세척하여 모든 잔류 크리스탈 바이올렛 얼룩을 제거했다. 결합된 세포(보라색으로 염색됨)를 가용화 완충액(0.1 M NaH2PO4, pH 4.5 및 50% 에탄올의 50/50 혼합물)으로 로커에서 5분 동안 RT에서 250rpm으로 가용화하였다. Envision 플레이트 판독기(PerkinElmer, 미국 매사추세츠주 월섬 소재)로 560nm에서의 흡광도를 측정하였다. 배지만 있는 웰은 음성 대조군으로 포함되었다.
만삭 태반으로부터 영양막 융모의 수집 및 분리
Monash Health Human Research Ethics Committee에서 윤리 승인을 얻었으며 모든 대상체에게 건강한 만삭의 단일아(singleton) 임신의 선택적 제왕절개로부터 태반 샘플을 수집하는 데 대한 서면 동의가 제공되었다.
영양막을 앞서 설명한 대로 분리하였다(Wallace et al., 2017). 간단히 말하면, 태반 자엽을 절제하고 행크(Hank) 균형 염 용액으로 세척하고, 융모(약 25g)를 자엽으로부터 긁어내고 DMEM 저 글루코스, 1% 페니실린, 1% 스트렙토마이신, 0.25% 트립신, 0.25% 등급 II 디스파제, 0.1 mg/ml DNase 1를 함유하는 완충액으로 37℃ 진탕 수조에서 15분 동안 소화시켰다. 3회 주기의 소화 후, 세포 현탁액을 Percoll 구배 원심분리로 분리하고, 영양막 세포를 수집하고 10% FBS, 1% 항생제-항진균제가 포함된 DMEM에서 8% O2 하에 37℃에서 밤새 배양하였다.
1차 영양막 스페로이드의 제조
AggreWellTM 400 플레이트(Stemcell Technologies, 캐나다 밴쿠버 소재)를 제조사의 프로토콜에 따라 2ml 부착 방지 헹굼 용액으로 미리 헹구고, RT에서 5분 동안 2000g에서 원심분리하고, 2ml의 DMEM/F12 배지로 세척했다. 1차 영양막 세포를 트립신처리하고 EB 형성 배지(Stemcell)에 재현탁하고 9.6 x105개 세포/ml를 AggreWellTM 400 플레이트의 각 웰로 옮겼다. 각 웰에 EB 배지를 총 2ml/웰로 채우고, RT에서 5분 동안 100g에서 원심분리하고 가습 인큐베이터에서 48h 동안 5% CO2 하에 37℃에서 인큐베이션하였다.
스페로이드 침입 연구를 위해, 원심분리 전에 1ml 당 5μl의 비브런트 세포-표지 용액 DiO 또는 DiI(Thermo Fisher Scientific)을 배지에 첨가하였다. 이 48h 인큐베이션 후에 직경이 대략 100 μm인 영양막 스페로이드가 형성되었다. 수동 피펫팅으로 스페로이드를 Aggrewell 플레이트로부터 제거하고, 40μm 세포 스트레이너를 통해 통과시켜 크기가 약 100μM 미만인 스페로이드를 제거했다. 부착 및 침입 실험을 위해 플레이트의 상단에서 세포 스트레이너를 뒤집고 10% FBS, 1% 항생제-항진균제로 보충된 DMEM/F12로 헹굼으로써 최종 스페로이드를 저 결합 6-웰 플레이트 내로 수집하였다.
이시카와 단층에 대한 1차 영양막 스페로이드 부착의 평가
대조군 또는 PCX-OE 이시카와 세포를 96-웰 평평한 바닥 플레이트에서 37℃에서 밤새 배양하여 단층을 형성하였다. 이어서, 동시에 제조된 1차 영양막 스페로이드를 이시카와 단층 의 상단으로 옮기고(100μl의 배지에서 웰 당 대략 30개의 스페로이드), 각각 1h, 2h, 4h, 6h, 12h 또는 24h 동안 인큐베이션하였다. 웰을 PBS로 세척하여 비부착 스페로이드를 제거하기 전에, 각 웰에 첨가된 영양막 스페로이드의 정확한 수를 계수하였다. 신선한 배양 배지를 첨가하고 각 웰 부착된 스페로이드를 계수하고 부착률(부착된 스페로이드/사전-세척된 스페로이드의 백분율)을 계산하였다. 각 실험은 3중 웰의 평균을 기초로 하였으며 최종 데이터는 3~5회의 독립적인 실험의 평균 ±SD로 표시하였다.
이시카와 단층을 통과하는 1차 영양막 스페로이드의 평가
8-웰 챔버(Sarstedt, 독일)를 포함하는 유리 커버슬립 슬라이드를 DMEM 중 콜라겐 유형 1(Merck-Millipore, 미국) 및 인간 피브로넥틴(Corning, 미국)의 혼합물로 RT에서 10분 동안, 이어서 37℃에서 1h 동안 코팅하였다. 대조군 및 PCX-OE 이시카와 세포를 G418를 함유하는 조절 배지에서 매트릭스의 상단에서 배양하여 37℃, 5% CO2에서 밤새 단층을 형성하였다. 다음 날, 조절 배지를 각 웰로부터 제거하고, 스페로이드를 염색하는 데 사용된 조합에 따라 비브런트(vybrant) 세포-표지 용액 DiO 또는 DiI를 함유하는 조절 배지로 보충하고(Thermo Fisher Scientific, 1ml의 배지 당 5μl), 또 다른 24hr 동안 인큐베이션하였다. 비브런트 용액을 함유하는 배지를 제거하고 웰을 PBS로 2회 세척하고, 이어서 100μl의 영양막 조절 배지(10% FBS 및 1% 항생제-항진균제로 보충된 DMEM/F12) 중 대략 1~3개의 스페로이드를 대조군 또는 PCX-OE 이시카와 단층의 각 챔버로 옮기고, 37℃, 5% CO2에서 24h 또는 48h 동안 공동배양하였다. 이어서 37℃, 5% CO2 인큐베이터(Olympus, 일본)가 장착된 공초점 현미경을 사용하여 챔버를 영상화하였다.
인간 배아 부착의 평가
대조군 또는 PCX-OE 이시카와 세포를 G418을 함유하는 조절 배지에서 96-웰 평평한 바닥 플레이트에서 37℃, 5% CO2에서 밤새 배양하여 단층을 형성하였다. 인간 배아와 공동배양하기 전에, 조절 배지를 제거하고 G418이 없는 신선한 배지로 보충하고 37℃, 5% CO2에서 4h 동안 평형이 되도록 두었다.
Centre for Reproductive Medicine(CRG, UZ Brussels, 벨기에)에서 수집된 냉동보존된 인간 배아의 사용은 Institute Ethical Committee 및 Federal Committee for Scientific Research on Human Embryos in vitro의 승인을 받았다. 환자로부터 서면 동의 하에, 이 특정 연구에 사용된 배아는 법적으로 결정된 5년의 냉동 보존 기간 후에 연구를 위해 기증된 배아로부터 유래했다. Gardner and Schoolcraft 기준(Gardner et al., 1999)에 따라 내부 세포 덩어리(ICM) 및 영양외배엽(TE) 양자 모두에 대해 A 또는 B 스코어링을 갖는 완전 및 확장 배반포인 양질의 유리화된, 5일 후 수정(dpf) 배반포를, 제조사의 프로토콜에 따라 유리화 해동 키트(Vit Kit-Thaw, Irvine Scientific, 미국)를 사용하여 가온하고, 회수하기 위해 20% O2, 6% CO2 및 89% N2로 37℃에서 Origio 배반포 배지(Origio, The Netherlands)의 25μl 액적으로 옮겼다. 각 배반포의 투명대(ZP)에 레이저를 사용하여 대략 1/4 길이의 큰 구멍을 만들어 배아가 밤새 부화하는 것을 도왔다. 형태학적 스코어링에 기초하여, ZP로부터 부화된 양질의 6dp 배아만을 추가 실험에 사용하였다. 각 배아를 배양 액적으로부터 제거하고, 이시카와 조절 배지(G418이 없음)로 헹구고, 대조군 및 PCX-OE 단층의 상단으로 옮기고, 37℃, 5% CO2에서 15h 및 24h 동안 공동배양하였다. 이시카와 단층에 대한 배아 부착률을 입체 광학 현미경(Nikon, 일본)으로 평가하였으며, 이때 상이한 시점에서 200μl 팁을 사용하여 배지를 위아래로 3~4회 부드럽게 피펫팅하였다. 자유 부동 배아는 부착되지 않은 것으로 간주하였다. 부착률을 이식된 배아의 총 수에 대한 부착된 배아의 수의 백분율로 계산하였다. 최종 데이터는 3회의 독립적인 실험의 평균 값이었다.
이시카와 단층을 통과하는 인간 배아의 평가
이시카와 단층을 가로지르는 영양막 스페로이드의 평가를 위해 앞서 설명한 바와 같이 8-웰 챔버를 포함하는 유리 커버슬립 슬라이드의 매트릭스의 층 상에 대조군 및 PCX-OE 이시카와 세포의 단층을 준비하였다. 이 모델은 또한 상기 부착 검정과 동일한 선택 기준을 가진 6dpf 배아를 사용했지만, 5dpf 배아를 가온하는 대신, 침습 모델 배아를 설정하기 전에 DiO 또는 DiI로 염색해야 하기 때문에 3dpf 배아를 가온하였다. 따라서, 양질의 유리화된 3dpf 배반포를, Gardner 및 Schoolcraft 기준(Gardner et al., 1999)에 따른 압축 C1 및 C2 단계에서, 유리화 해동 키트(Vit Kit-Thaw, Irvine Scientific, 미국)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 가온하고, 회수하기 위해 20% O2, 6% CO2 및 89% N2로 37℃에서 Origio 배반포 배지(Origio, The Netherlands)의 25μl 액적으로 옮겼다. 각 4dpf 배반포의 투명대(ZP)에 레이저를 사용하여 큰 구멍을 만들고 밤새 회수되도록 두었다. 다음 날 양질의 5dpf 배반포를 비브런트 세포-표지 용액 DiO 또는 DiI를 함유하는 배양 액적으로 옮기고(Thermo Fisher Scientific, 1ml의 배지 당 10μl), 20% O2, 6% CO2 및 89% N2로 37℃에서 24h 동안 인큐베이션하였다. 형태학적 스코어링에 기초하여, ZP로부터 부화된 양질의 6dpf 배아만을 침입 검정 실험에 사용하였다. 각 배아를 배양 액적으로부터 제거하고, 이시카와 조절 배지(G418이 없음)로 헹구고, 대조군 또는 PCX-OE 단층의 상단으로 옮기고, 37℃, 5% CO2에서 24h 동안 공동배양하였다. 공동배양 후, 각 챔버를 공초점 현미경(Zesis, 독일)을 사용하여 영상화하였다.
영양막 스페로이드 및 인간 배아 침입의 공초점 영상 분석
이시카와 단층(대조군 또는 PCX-OE)으로 공동배양된 1차 영양막 스페로이드 또는 인간 배아에 대한 표면 매핑을 Imaris 소프트웨어(버전 9.2.1, Bitplane, AG)를 사용하여 수행하였다. 침습의 정도를 단층을 통해 침입하고 이시카와 단층 아래에 존재하는 스페로이드/배아의 부피에 의해 결정하였다.
대조군 및 PCX-OE 이시카와 세포의 RNAseq
이시카와 세포를 10% FBS, 1% 항생제-항진균제 및 1% L-글루타민으로 보충된 MEM 배지 내의 6-웰 플레이트에서 5.6x105개 세포/웰로 밤새 배양하였다. 다음 날, 세포를 PBS로 세척하고, RNeasy 미니 키트(Qiagen)를 사용하여 대조군 및 PCX-OE 이시카와 세포로부터 총 RNA를 분리하고 TURBO DNA-프리 키트(Invitrogen)로 처리했다.
초기 원시 판독 처리를 수행하고, FastQC(Andrews 2010)를 사용하여 원시 75bp 단일-종단 FASTQ 판독을 품질에 대해 평가하였으며, R/Bioconductor 패키지 ngsReports(Ward et al. 2018)를 사용하여 결과를 집계하였다. 이어서 AdapterRemoval(Schubert et al. 2016)을 사용하여 서열 어댑터에 대해 판독을 트리밍하고, RNA-seq 정렬 알고리즘 STAR(Dobin et al. 2013)를 사용하여 인간 게놈 GRCh37에 정렬하였다. 정렬 후, featureCounts(Liao et al. 2014)를 사용하여 맵핑된 서열 판독을 GRCh37.p13(NCBI:GCA_000001405.14 2013-09) 유전자 간격에 요약하였고, 발현 분석을 위해 계수 표를 R 통계 프로그래밍 환경으로 전송하였다. 또한 Picard 툴 패키지(http://broadinstitute.github.io/picard)의 기능 MarkDuplicates를 사용하여 서열 복제의 효과를 조사했다.
Bioconductor 패키지 edgeR(Robinson et al. 2009; McCarthy et al. 2012) 및 limma(Richie et al. 2015)를 사용하여 유전자 발현 분석을 R에서 수행하였다. 2개 초과의 샘플에서 100만당 1 수(cpm) 미만인 유전자를 제거함으로써 유전자 수를 낮은 발현 수에 대해 필터링하고, 이어서 M-값의 트리밍된 평균 방법으로 정규화하였다(TMM; Robinson & Oshlack, 2010). 선형 모델링 및 경험적 Bayes 중재를 사용하여 limma(Law et al. 2014)의 붐 함수(voom function)로부터 이용가능한 log-CPM 수 및 정밀 가중치에 대해 차등 유전자 발현을 수행하였다.
결과의 주석은 biomaRt(Durinck et al. 2009)에서 이용가능한 Ensembl 주석(http://grch37.ensembl.org)을 사용하여 수행되었고, 발현 결과는 pheatmap 패키지(Kolde 2019)를 사용하여 히트맵에 표시하였다. KEGG 경로(https://www.genome.jp/kegg/pathway.html) 및 Molecular Signature(MSigDB) 데이터베이스(Liberzon et al. 2015)에서 clusterProfiler(Yu et al. 2012) 및 msigdbr(Dolgalev 2018)를 사용하여 추가 경로 및 유전자 세트 풍부도 분석을 수행하였다.
이시카와 세포에서 접합 단백질의 면역형광
대조군 및 PCX-OE 이시카와 세포를 4%(w/v) 파라포름알데히드(E-카드헤린, Wnt-7A, 클라우딘-4 및 ZO-1 분석용), 또는 100% 메탄올(오클루딘(occluding)용) 중에 고정된 유리 커버슬립 상에 성장시켰다. 이어서 개별 항체에 최적화된 프로토콜(E-카드헤린: 1h 동안 PBS 중 10% 말 혈청 및 1% BSA; Wnt-7A: 2h 동안 PBS 중 10% 말 혈청; 클라우딘-4: 1h 동안 0.2% Tween20를 함유하는 PBS 중 10% 말 혈청, 2% 인간 혈청, 0.1% 생선 피부 젤라틴 및 0.1% Triton X-100; ZO-1: 2h 동안 PBS 중 1% BSA; 및 오클루딘: 1h 동안 0.2% Tween20를 함유하는 PBS 중 10% 염소 혈청, 2% 인간 혈청, 0.1% 생선 피부 젤라틴 및 0.1% Triton X-100)을 사용하여 RT에서 세포를 차단시켰다.
세포를 1차 항체인, E-카드헤린(2μg/ml, ab1416, Abcam), Wnt-7A(6μg/ml, AF3008, R&D), 클라우딘-4(6μg/ml, sc-376643, Santa Cruz), 오클루딘(1μg/ml, 71-1500, Thermo Fisher) 및 ZO-1(10μg/ml, 61-7300, Thermo Fisher)으로 4℃에서 밤새 조사하였다. 다음 날, 세포를 PBS에서 15분 동안 3회 세척하고, 적절한 비오틴화된 2차 항체와 함께 RT에서 1h 동안 인큐베이션한 후, 스트렙타비딘 컨쥬케이트된 Alexa Fluor 488을 RT에서 1h 동안 첨가하였다. 핵을 RT에서 5분 동안 DAPI로 염색하였다(PBS 중 0.5μg/ml, Sigma). 형광 신호를 형광 현미경(Olympus Optical, 일본 도쿄 소재)으로 가시화하였다.
이시카와 단층 투과성의 평가
트랜스-상피 전기 저항(TER) 및 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-컨쥬게이트된 덱스트란 40,000의 상부 웰에서 하단 웰로의 수송 양자 모두를 측정하기 위해, 10μg/ml 피브로넥틴(BD Biosciences, 오스트레일리아 뉴사우스웨일스주 소재)으로 코팅된 투과성 트랜스웰 인서트(6.5mm, 0.4μm 기공, Corning, 미국 뉴욕주 소재)를 사용하였다. 대조군 및 PCX-OE 이시카와 세포를 시딩하고(인서트 당 6x104개 세포), 2% G418을 함유하는 완전 배지와 함께 밤새 인큐베이션하였다. Millipore MilliCell-Electrical Resistance System(Millipore, 미국 매사추세츠주 소재)를 사용하여 96h 후 TER을 측정하였다. 상부 챔버는 무혈청 배지로 교체하였고 하부 챔버는 완전 배지를 함유하였다(양자 모두 2% G418을 함유함). TER 측정 내내 가온 플레이트를 사용하여 세포를 37℃에서 유지하였다. 각 웰로부터 4개의 TER 판독값(ohm x cm2)을 취하고, 이중체 웰로부터의 판독값을 평균하여 원시 TER을 얻었다. 동일한 실험에서 세포를 함유하지 않는 웰로부터의 백그라운드 TER을 빼서 최종 값을 얻었다.
FITC 덱스트란의 통과를 측정하기 위해, 대조군 및 PCX-OE 이시카와 세포를 또한 96h 동안 배양하였다. 그 후, 2% G418을 함유하는 신선한 완전 배지를 하단 챔버에 첨가하고, 2% G418 및 FITC 덱스트란(1mg/ml, Sigma)을 함유하는 신선한 완전 배지를 상부 챔버에 첨가하였다. 37℃에서 2h 동안 세포를 인큐베이션하고, 하단 챔버로부터 배지를 수집하고 485/535nm(Clariostar, BMG LabTech, 오스트레일리아 빅토리아주 소재)에서 형광 측정을 위해 PBS 중 1:5로 희석하였다. 백그라운드(PBS 단독)를 뺀 후 최종 형광 판독값을 얻고, 데이터를 4회의 독립적인 실험의 평균 ± SD로 표시하였다.
자궁내막 스크래치 절차로부터 얻은 자궁내막 조직
생식력 치료 중 자궁내막 스크래치 절차 동안 생검된 아카이빙된 자궁내막 조직의 코호트를 내강 상피에서의 PCX의 면역조직화학적 분석을 위해 검색하였다. 모든 생검은 IVF 처리 직전 달의 자연 주기의 중간-분비기(d20-24)에 수행하였다. 모든 환자는 스크래치 절차를 거치기 전에 2주기 이상의 착상 실패를 경험하였으며, 스크래치 직후의 다음 주기에 단일 고품질 배아(등급 A-C)가 이식되었다. 샘플은 2012~2016에 Monash IVF(Clayton, 오스트레일리아 빅토리아주 소재)에서 생검되었고, 포르말린에 고정한 후 Anatpath Services(Gardenvale, 오스트레일리아 빅토리아주 소재)에 의해 분석/아카이빙되었다. 이 연구를 위해 Anatpath로부터 이러한 조직을 검색하는 것에 대한 윤리 승인은 Monash Health로부터 얻었다.
통계
GraphPad Prism 버전 7.00(GraphPad Software, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)을 언페어드 t-test, 일원(one-way) ANOVA 또는 피셔 정확 검정(Fisher's exact test)(적절한 경우)의 통계 분석에 사용하였으며, 데이터는 평균 ± SD로 표시하였다. 유의성은 *P < 0.05, **P ≤ 0.005, ***P ≤ 0.0005 and ****P ≤ 0.0001로 정의되었다.
실시예 2: 1차 인간 자궁내막 상피 세포에서의 포도칼릭신의 단백질체 식별
인간 자궁내막 조직으로부터 1차 자궁내막 상피 세포(HEEC)를 분리하고 실시예 1에 설명된 바와 같이 원형질막 단백질에 대해 풍부화하였다.
생성된 단백질을 질량 분석기로 분석하고 총 250개의 단백질을 식별하였다(표 2). 이들 중, 47개는 세포막 단백질로 여겨졌으며, 그 중 10개는 포도칼릭신(PCX)을 포함하는 세포 부착력과 관련되었다.
단백질체 발견을 확인하기 위해, 증식기 자궁내막으로부터 분리된 1차 HEEC의 총 세포 용해물(단백질체 연구의 경우)을 인간 PCX의 상이한 영역에 대한 3개의 항체를 사용하여 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
약 150kDa의 우세한 밴드가 두 세포 유형 모두에서 상용성인 수준을 갖는 3개의 항체 모두에 의해 검출되었다. Ab1은 HUVEC 및 HEEC 양자 모두에서 약 80kDa의 추가의 희미한 밴드를 검출하였지만, Ab2는 주로 HUVEC에서 약 45, 37 및 30kDa의 추가의 밴드를 인식하였다. rPCX의 크기는 약간 150kDa 미만이었으며, 이는 세포외 도메인만을 함유하는 것과 일치한다. 이러한 데이터는 PCX가 증식기 자궁내막 상피 세포에서 발현되었음을 확인시켜 주었다.
RT-PCR 분석은 HEEC 및 HUVEC에서 상용성인 수준의 PCX mRNA 전사체(양성 대조군; 도 1)를 검출하여, 이 발견을 더욱 검증하였다.
[표 2] 월경 주기의 증식기로부터 분리된 인간 자궁내막 상피 세포(HEEC)의 원형질막-풍부화 단백질의 LC-MS/MS 분석에 의해 식별된 단백질
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실시예 3: PCX는 인간 자궁내막의 상피 및 내피 세포의 정단 막(apical membrane)에 국소화되어 있으며 수용성 확립과 동시에 내강 상피에서 특이적으로 하향 조절된다
월경 주기에 걸친 인간 자궁내막에서 PCX의 세포 국소화를 실시예 1에 설명된 바와 같이 면역조직화학에 의해 시험하였다.
3개의 PCX 항체 모두 유사한 패턴의 염색을 검출했다. 증식기에서, PCX는 내강 및 샘 상피 세포(각각 LE 및 GE) 양자 모두뿐만 아니라 혈관(BV)의 내피 세포의 정점 표면에 강하게 국소화되었다. 스트로마는 검출 없음/미달을 나타내었다. 이 패턴은 초기 분비기까지 다소 지속되었으며, 그 후 특히 LE에서 급격한 차이가 나타났다. 중간-분비기에서, PCX 염색은 GE 및 BV 양자 모두에서 여전히 강했지만, LE에서는 거의 검출되지 않았다. 후기-분비기에서, LE는 최소 PCX로 계속 유지되었지만, GE는 이전 단계에 비해 더 희미한 PCX 염색을 나타냈다.
주기에 걸쳐 LE, GE 및 BV의 PCX 염색을 정량화하였다(도 2A~2C). 도 2에 나타난 바와 같이, LE는 주기 진행에 따라 가장 극적인 변화를 보여주었다. LE의 PCX는 증식기에서 가장 높았지만, 수용성의 확립과 동시에, 중간-분비기부터 극심하고 특이적으로 감소하였다. 대조적으로, GE의 PCX는 가변적이었고 후기-분비기까지 상당한 감소를 나타내지 않았다. BV의 PCX는 상당한 주기-의존적 변화를 나타내지 않았다.
실시예 4: PCX는 시험관내 1차 HEEC에서 에스트로겐에 의해 강화되고 프로게스테론에 의해 감소된다
에스트로겐(E) 및 프로게스테론(P)은 각각 자궁내막 증식과 분화를 구동하며, 이러한 호르몬이 1차 HEEC에서 PCX에 미치는 영향이 결정되었다.
증식기로부터 1차 HEEC(단백질체학 연구의 경우)를 분리하고, E 단독(증식기를 모방하기 위함) 또는 E 프라이밍 후 P(E+P, 분비기를 모방하기 위함)를 각각 48, 72 및 96h 동안 처리하였다. 실시간 RT-PCR 분석은, PCX mRNA가 E에 의해 점진적이지만 미묘하게 증가하나, E+P에 의해 초과시간 동안 감소했음을 보여주었음에도(도 3A), 시간-의존 변화는 E 및 E+P 모두에 대해 통계적으로 상당하지 않았다. 하지만, PCX mRNA는 E 단독보다 E+P로 처리된 세포에서 72h에서 상당히 더 낮았고, 96h에서 매우 상당히 더 낮았다(도 3A). 웨스턴 블롯 분석은 E vs E+P의 차이가 96h에서만 상당했지만 PCX 단백질 변화의 유사한 패턴을 보여주었다(도 3B).
이 발견을 추가로 검증하기 위해, E 또는 E+P로 96h 동안 처리된 HEEC를 면역형광법으로 분석하였다. E로 처리된 세포는 강한 PCX 염색을 나타냈지만, E+P로 처리된 세포는 훨씬 더 감소된 수준의 PCX를 나타내었다. 종합하면, 이러한 결과는 E가 1차 HEEC에서 PCX를 촉진하는 반면, P는 이를 감소시키는 것과 일치한다. 하지만, 분리된 세포에서의 PCX 변화는 자궁내막 조직의 LE에서 관찰된 것만큼 급격하지 않았으며, 이는 1차 세포가 LE 및 GE 기원의 혼합물이었기 때문에 가능성이 매우 높다(마커가 없기 때문에 추가의 하위유형 정제는 더 이상 불가능함). 그럼에도, 이러한 결과는 P가 자궁내막 상피 세포에서 PCX를 감소시킨다는 개념을 뒷받침한다.
실시예 5: PCX 녹다운은 이시카와 세포 부착을 증가시키지만 과발현은 이를 감소시킨다
PCX의 독특한 발현 패턴과 호르몬 조절은 PCX가 배아 착상에 대한 상피 수용성에 영향을 미치는지의 여부에 대한 조사를 촉진시켰다. 1차 HEEC의 부족 때문에, 이시카와 세포를 기능 연구에 사용했다. 이시카와 세포에서 PCX 발현 수준이 변경되었고 피브로넥틴에 대한 부착성이 결정되었다.
PCX는 이시카와 세포에서 siRNA에 의해 일시적으로 녹다운(KD)되었다. 실시간 RT-PCR 분석은 대조군(CON) 세포에 비해 PCX-KD에서 PCX mRNA의 60% 감소를 보여주었다(도 4A). 웨스턴 블롯 분석은 이 녹다운을 추가로 확인시켜 주었다. 피브로넥틴에 대한 부착력을 시험했을 때, PCX-KD 세포는 대조군보다 2.5배 더 부착력이 있었으며(도 4B), 이는 PCX를 감소시키는 것이 부착성을 증가시켰음을 시사한다.
그 후, PCX는 이시카와 세포에서 과발현(OE)되었다. 전장 인간 PCX는 이시카와 세포 내로 안정적으로 감염되었고, PCX 과발현이 RT-PCR(도 4C) 및 웨스턴 블롯에 의해 확인되었다. PCX-OE 세포는 대조군 세포보다 2.8배의 PCX를 발현하였다. 이러한 PCX-OE 세포는 피브로넥틴에 대한 대조군보다 부착력이 75% 낮다(도 4D). 종합하면, 이러한 결과는 PCX 발현의 수준과 이시카와 세포 부착성 사이의 역 상관관계를 시사한다.
실시예 6: PCX 과발현은 영양막 스페로이드 부착에 대한 이시카와 세포 수용성을 감소시킨다
이시카와 세포의 단층이 자궁내막 상피를 모방하고, 1차 인간 영양막으로 만들어진 스페로이드(약 100μm)는 배반포를 모방하는 시험관내 모델(Heng et al., 2015)을 사용하여, 배아 부착에 대한 이시카와 수용성에 미치는 PCX-OE의 영향을 시험하였다. 동일한 수의 스페로이드가 이시카와 단층의 상단에서 공동배양되었으며, 24h에 걸쳐 안정한 스페로이드 부착을 평가하였다(도 5). 대조군 단층의 경우, 첨가된 스페로이드의 25%가 1h 이내에, 42%가 2h 이내에, 그리고 72%가 4h 이내에 부착되었다. 그 후 부착은 시간이 지남에 따라 서서히 증가하여, 12h까지 76%에 도달하고 24h까지 최대 91%에 도달했다. 하지만, 도 5에 나타난 바와 같이, PCX-OE 단층은 매우 상이한 부착 역학을 나타냈다. 단지 6%의 스페로이드가 1h 이내에 부착되었고 11%가 2h 이내에 부착되었으며; 부착은 4h까지 22%, 그리고 6h까지 27%로 서서히 증가하였다. 12h에도, PCX-OE 단층에 대한 스페로이드 부착(64%)은 대조군(76%)보다 여전히 상당히 낮았다. 24h까지에서야 82%의 최대 부착률에 도달한 PCX-OE는 대조군과 크게 다르지 않았다. 이러한 결과는 PCX가 영양막 스페로이드 부착에 대한 이시카와 세포 수용성을 감소시켰으며, 부착 과정을 늦추었음을 시사한다.
실시예 7: PCX 과발현은 이시카와 단층을 통한 영양막 스페로이드의 침입을 방해한다
인간에서, 착상은 배아가 내강 상피에 부착된 다음 상피 세포 사이를 가로질러 스트로마로 이동해야 한다. PCX가 이시카와 단층을 통한 영양막 스페로이드의 횡단 과정에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 영양막 스페로이드와 이시카와 세포를 상이한 염료로 표지하고, 매트릭스의 층 상에 이시카와 세포를 배양하여 단층을 형성하고, 이어서 각각 24h 및 48h 동안 상단에 스페로이드를 공동배양했다. 이시카와 단층 내에서 영양막 스페로이드의 위치를 공초점 z-스택 스캐닝 현미경으로 조사했다. 24h까지, 스페로이드 침입은 대조군 단층에 대해 분명하게 가시적이었지만, PCX-OE 단층에 대해서는 과정이 막 시작되었다. 48h까지, 모든 스페로이드가 단층을 침투했지만, 침투의 정도는 대조군 세포보다 PCX-OE의 경우 여전히 가시적으로 더 적었다. 이시카와 단층 아래에 존재하는 스페로이드의 부피를 침입의 측정으로 정량화하였다(도 6). PCX-OE 단층 아래의 평균 스페로이드 부피는 각각 24h 및 48h에서 대조군의 30%(매우 상당함) 및 40%(상당함)이었다. 이러한 데이터는 PCX-OE가 이시카와 단층을 영양막 스페로이드가 가로지르는 것을 더 어렵게 만들었음을 시사한다.
실시예 8: 이시카와 세포에서 PCX 과발현은 또한 인간 배아의 부착 및 침입을 방해한다
영양막 스페로이드 대신 인간 배아를 사용하여 시험관내 부착 및 침입 검정을 반복하였다. 인간 배반포를 대조군 및 PCX-OE 이시카와 세포 단층의 상단에 공동배양하였으며, 안정한 부착을 각각 15h 및 24h에 평가하였다(도 7A). 15h에, 대조군 단층에 첨가된 배반포의 65%가 부착된 반면, PCX-OE 단층에는 25%만이 부착되었다. 하지만, 24h까지, 부착률은 양 단층 모두에서 78%에 도달하였다. 이 데이터는 이시카와 단층에서 PCX가 배아 부착의 속도를 역시 감소시켰음을 시사하며, 이는 영양막 스페로이드로 수행된 관찰과 일치한다.
이어서 이시카와 단층을 통한 배아 침입을 평가하였다. 염료-표지된 배반포를 염료-표지된 이시카와 단층의 상단에 24h 동안 공동배양하였으며, 단층 내에서 배아의 위치를 공초점 영상에 의해 조사하였다. 배아 침입은 대조군 단층보다 PCX-OE의 경우 가시적으로 더 적었다. PCX-OE 단층을 통해 침투된 배아의 정량화된 부피는 대조군보다 상당히 더 작았다(도 7B). 또한 48h에 배아 침입을 평가하였지만, 모든 배아가 그 시점까지 붕괴되었고 이용가능한 데이터가 없었다. 이러한 결과는 PCX가 이시카와 단층을 통한 배아 횡단도 방해했음을 시시하며, 이는 역시 영양막 스페로이드로 수행된 관찰과 일치한다.
실시예 9: PCX 과발현은 세포 부착력 및 착상에 필요한 유전자를 하향 조절하지만, 상피 장벽 기능을 조절하는 유전자는 상향 조절한다
대조군 및 PCX-OE 이시카와 세포의 RNAseq 분석
PCX가 어떻게 이시카와 세포를 배아 부착 및 침입에 덜 수용적이도록 만드는지를 이해하기 위해, 대조군 및 PCX-OE 이시카와 세포의 총 mRNA 전사를 RNAseq로 비교했다. 15,103개 유전자의 발현이 검출되었으며, 두 세포 유형은 감독되지 않은 클러스터링 분석에 의해 2개의 별개의 그룹으로 클러스터링되었다(데이터는 표시되지 않음). 총 940개의 유전자가, PCX-OE에서 하향 조절된 659개 및 상향 조절된 281개인 두 그룹 사이에서, 대조군과 비교하여 상당히 상이하게 발현되는 것으로 밝혀졌다[p<0.01, Log(2)FC > 2 또는 < -2](도 3).
[표 3] PCX-OE와 대조군 이시카와 세포 사이에 상당히 상이하게 발현된 유전자
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이러한 차등적으로 발현된 유전자(DEG)는 KEGG 경로 풍부화 분석에 의해 20개의 분자 경로에서 풍부한 것으로 밝혀졌으며(표 4), 이러한 경로에서 상향 조절된 것보다 하향 조절된 유전자가 더 많았다. 배아 착상과 관련될 수 있는 경로는 ECR-수용체 상호작용, 세포 부착, 중심(focal) 부착 및 칼슘의 신호전달, Wnt 및 cAMP 및 백혈구 경내피 이동을 포함한다(표 4).
[표 4] 차등적으로 발현된 유전자에 의해 풍부화된 분자 경로
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세포 부착 및 상피 접합이 배아 부착 및 침입에 특히 중요하기 때문에, 이들 경로에 대해 보다 집중적인 분석을 수행하였다. 세포 부착 관련 유전자의 경우, 59개가 차등적으로 발현되었으며, 41개(70%)가 하향 조절되고 18개(30%)가 상향 조절되었다. 상피 밀착 접합의 경우, 46개의 유전자가 차등 발현을 나타냈으며, 20개(43%)가 하향 조절되고 26개(57%)가 상향 조절되었다. 부착 접합의 경우, 32개의 유전자가 차등적으로 발현되었으며, 12개(37%)가 하향 조절되고 20개(63%)가 상향 조절되었다. 갭 접합의 경우, 36개가 차등 발현을 나타냈으며, 26개(72%)가 하향 조절되었고 10개(28%)가 상향 조절되었다. 종합하면, 이러한 데이터는 PCX-OE가 우선적으로 세포 부착 및 갭 접합에 관여하는 유전자의 발현을 감소시키지만 밀착/부착 접합과 관련된 유전자의 발현은 증가시켰음을 시사한다. 특히, 주요 부착 접합 유전자 CDH1(E-카드헤린을 인코딩함), 밀착 접합 유전자 TJP1(ZO-1), CLDN4(클라우딘 4) 및 OCLN(오클루딘)은 모두 대조군 세포보다 PCX-OE에서 상당히 상향 조절되었으며, 이는 실시간 RT-PCR 분석에 의해 추가로 검증되었다(도 8).
배아 착상과 관련된 것으로 알려진 것들을 식별하기 위해 DEG를 추가로 조사하였다. 도 8A~F에 나타난 바와 같이, WNT7A(Wnt 계열 구성원 7A, Wnt 7A) 및 LEFTY2(좌-우 결정 인자 2)와 같은, 발현이 착상 실패와 연결된 다수의 유전자는 PCX-OE 세포에서 매우 상당히 상향 조절되었다. 대조적으로, LIF(인터루킨 6 계열 사이토카인), CSF1(콜로니 자극 인자 1), ERBB4(HER4), FGF2(섬유아세포 성장 인자 2), TGFB1(TGF-베타-1)을 포함하는 다수의 수용성 촉진 인자, 및 MMP14(MT1-MMP)와 같은 소수의 매트릭스 메탈로펩티다아제는 PCX-OE 세포에서 매우 상당히 하향 조절되었다(도 8G-L). 이러한 결과는 PCX가 자궁내막 수용성의 상류 음성 조절자로 작용한다는 것을 시사한다.
PCX 세포-세포 연결을 더 단단하게 하고 상피 장벽 기능을 증가시킨다
PCX-OE 세포의 주요 기능적 특징은 이시카와 단층을 통한 배아 침입을 억제하는 것이었으며, 세포 접합 단백질인 E-카드헤린, Wnt 7A, 오클루딘, 클라우딘 4 및 ZO-1의 면역형광을 조사했다. 이들 단백질 모두는 대조군 세포와 비교하여 PCX-OE에서 고도로 상승되었으며, 이는 이들의 mRNA 발현이 상당히 상향 조절되는 것과 일치한다. 이러한 염색 결과는 PCX-OE 세포가 대조군 이시카와 세포보다 더 밀접하게 서로 연결되었음을 시사한다. 이 결과를 확인하기 위해, 상피 장벽 무결성의 생물물리학적 측정인, 단층을 가로지르는 트랜스-상피 전기 저항(TER)을 측정하였다. TER는 대조군 단층에서보다 PCX-OE에서 상당히 더 높았다(도 9A). 또한 큰 분자에 대한 단층의 투과성을 결정하였다. FITC-표지된 덱스트란(Mol wt 40kDa)을 단층의 상단에 첨가하고, 하단 챔버에서 형광 신호를 측정하여 하단으로의 플럭스를 정량화하였다. PCX-OE 단층을 통한 덱스트란 통과는 대조군의 것보다 매우 상당히 더 낮았으며(도 9B), 이는 PCX-OE 세포가 더 단단히 결합되는 것과 일치한다. 종합하면, 이러한 결과는 PCX가 주요 상피 세포 밀봉제로서 작용하여, 세포 접합 단백질의 범위를 상향 조절하여 세포-세포 연결을 더 단단하게 하고 상피 장벽 기능을 증가시킨다는 것을 시사한다. 따라서 이러한 데이터는 PCX-OE 단층이 대조군 이시카와 단층보다 영양막 스페로이드 및 배아가 통과하기 더 어려운 이유에 대한 신규한 분자 및 메커니즘적 통찰을 제공한다.
종합하면, 이 연구들은 PCX가 상피 접합 및 단층 무결성을 관리하는 데 중요한 조절 역할을 한다는 것을 시사한다. 결론적으로, PCX는 배아 부착뿐만 아니라 침입에 대한 상피 수용성을 음성적으로 조절하고, 자궁내막 LE에서의 PCX 하향 조절은 자궁내막 수용성을 확립하기 위한 기능적인 필수요소이다.
실시예 10: 추정 수용성 자궁내막의 LE의 양성 PCX 면역염색은 IVF 환자의 착상 실패와 상당히 연관된다
LE의 PCX가 배아 착상에 대한 자궁내막 수용성의 음성 조절자임을 추가로 확인하기 위해, IVF 환자의 자궁내막 조직에서 PCX를 시험했다. 많은 불임 센터의 현재 실무에서, 2~3 주기 후에 형태학적 정상 배아를 착상하지 못하는 환자는 다음 주기 전에 중간-분비(추정 수용)기에서 "자궁내막 스크래치 생검"을 거친다. 이 생검은 배아가 정상적으로 이식되는 이러한 특정 시간에 수행되며, 이는 그 효능이 논란의 여지가 있기는 하지만 스크래치-관련 손상이 다음 주기에서 더 높은 착상률로 이어진다는 레벨 1 증거 때문이다(van Hoogenhuijze et al., 2019; Frantz et al., 2019; Sar-Shalom et al., 2018: Nastri et al., 2015; Gnainsky et al., 2010). 오스트레일리아의 Monash IVF에서 사전에 생검된 86개의 그러한 조직을 얻었다. 이 환자들은 다음 주기에 1개의 고품질 배아를 이식받았고 이들의 착상 결과는 알려져 있었다.
이러한 자궁내막 조직에서 PCX를 면역조직화학에 의해 시험하였으며, LE의 PCX 염색과 착상 결과 사이의 연관성을 결정하였다(표 5). 모든 조직(n=86)은 샘과 혈관에서 양성 PCX 염색을 나타냈다(데이터는 표시되지 않음). LE 염색이 시험되었을 때, 이들 조직 중 66개(77%)가 PCX에 대해 음성(PCX-)인 한편, 나머지 20개(23%)는 LE 세포의 1/4 초과에서 PCX에 대해 양성으로 염색되었으며 이는 PCX+로 정의되었다.
[표 5] 포도칼릭신 발현과 착상 실패의 연관성
Figure pct00053
이어서 PCX- 및 PCX+ 코호트의 착상 결과(6주 초음파)를 별도로 분석하였다(도 10). 전체적으로, 전체 코호트 중 30명(35%)이 성공적인 착상을 달성하였다. PCX- 그룹(총 66명)에서, 27명(41%)이 착상에 성공했지만 다른 39명(59%)은 그렇지 않았다. 하지만, PCX+ 그룹(총 20명)에서는, 3명(15%)만 착상이 성공했고 17명(85%)은 실패했다. 두 그룹 간의 차이는 통계적으로 상당하였다(p=0.036, 피셔 정확 검정).
이러한 결과는 LE에서 PCX가 배아 착상의 중요한 음성 조절자라는 중요한 임상 증거를 제공한다. 나아가, 이 데이터는 초기 기능 연구와 함께 LE에서 자궁내막 PCX 양성이 또한 IVF 환자의 착상 실패에 기여할 수도 있다는 것을 시사한다.
실시예 11: 마이크로RNA에 의한 자궁내막 상피 PCX의 조절
수용성에 대한 인간 자궁내막 상피 세포에서의 PCX의 프로게스테론-유도 하향 조절 이면의 분자 메커니즘을 조사하였다. PCX를 표적화할 수 있는 13개의 잠재적인 miRNA를 생물정보학적으로 식별하였으며(표 6), 자궁내막 상피 세포에서 프로게스테론-유도 PCX 하향 조절에 대한 관련성을 조사하였다.
[표 6] PCX를 표적화할 수 있는 생물정보학적으로 예측된 miRNA
Figure pct00054
1차 인간 자궁내막 상피 세포를 분리하고 에스트로겐(E, 증식기를 모방하기 위함) 또는 에스트로겐+프로게스테론(E+P, 분비기를 모방하기 위함)으로 96h 동안 처리하였으며, 상기 miRNA의 수준을 실시간 RT-PCR으로 분석하였다. 또한, 대조군 마이크로RNA(hsa-miR-361-5p)를 사용하였다.
간단히 말하면, 총 RNA는 mirVanaTM miRNA Isolation Kits(Thermo Fisher Scientific)로 추출하였고, NanoDrop™ 1000 Spectrophotometer(Thermo)를 사용하여 RNA 농도를 결정하였다. miRNA(10ng)를 TaqMan® Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 역전사하였다. 표 8에 명시된 조건 하에 QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System(Applied Biosystems)을 사용하여, miRNA 검정(Thermo Fisher Scientific로부터 구매함, 표 7)으로 실시간 RT-PCR을 수행하였다.
[표 8] 마이크로RNA의 실시간 RT-PCR 분석의 사이클링 조건
Figure pct00055
일부 miRNA는 검출을 나타내지 않았고 E+P 처리 후 다수가 가변적이고 일관성 없는 변화를 나타내었다. 하지만, miR-145 및 miR-199는 E 단독으로 처리된 세포와 비교하여 E+P에서 중간정도이지만 일관되고 상당한 상향 조절을 나타내었다(도 11). E 처리에 비해 E+P 후의 평균 배수 변화는 miR-145의 경우 1.38이고 miR-199의 경우 1.50이었다.
이러한 결과는 두 miRNA가 수용성의 확립에 있어서 프로게스테론에 의한 PCX의 하향 조절을 매개할 수 있음을 시사한다.
이 두 miRNA가 PCX를 직접적으로 하향 조절할 수 있음을 확인하기 위해, 이러한 miRNA의 모방체를 인간 자궁내막 상피 이시카와 세포주 내로 형질감염시키고 PCX 발현의 수준에 미치는 영향을 시험하였다.
10% FCS, 1% L-글루타민(Sigma) 및 1% 항생제-항진균제로 보충된 MEM(Thermo Fisher Scientific)을 함유하는 완전 배지에서 12-웰 플레이트(웰 당 3.0x105개)에서 이시카와 세포를 밤새 배양하였다. 다음 날, 세포를 형질감염을 위해 Opti-MEM로 보충하였다. 리포펙타민 RNAiMAX 형질감염 시약(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 각각 24, 48, 72h 동안 대조군 및 miRNA 모방체(5pm, 모두 Thermo Fisher Scientific)를 이시카와 세포 내로 형질감염시키고, PCX mRNA 수준을 실시간 RT-PCR로 시험하였다. 두 miRNA(각각 5pm)의 조합도 시험하였다.
형질감염 후, miR-145 및 miR-199 양자 모두는 PCX mRNA를 상당히 하향 조절하였다(도 12). 두 miRNA는 PCX mRNA를 24h에 약 34%까지 억제하였으며, 이 억제는 약 50~60%까지 증가하고 48~72h까지 정체 상태가 되었다. 두 miRNA가 함께 형질감염된 경우, 상승 효과는 명백하지 않았다.
이러한 결과는 miR-145 및 miR-199 양자 모두가 자궁내막 상피 세포에서 PCX 발현을 억제할 수 있음을 확인시켜 준다.
[표 7] miRNA 검정의 세부사항
Figure pct00056
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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-152-3p <400> 32 ucagugcaug acagaacuug g 21 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-145-5p <400> 33 guccaguuuu cccaggaauc ccu 23 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-219a-5p <400> 34 ugauugucca aacgcaauuc u 21 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-34a-5p <400> 35 uggcaguguc uuagcugguu gu 22 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-mir-181a-5p <400> 36 aacauucaac gcugucggug agu 23 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-144-3p <400> 37 uacaguauag augauguacu 20 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-802 <400> 38 caguaacaaa gauucauccu ugu 23 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-125b-5p <400> 39 ucccugagac ccuaacuugu ga 22 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-143-3p <400> 40 ugagaugaag cacuguagcu c 21 <210> 41 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-202-5p <400> 41 uuccuaugca uauacuucuu ug 22 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-506-3p (124-3p.2) <400> 42 uaaggcaccc uucugaguag a 21 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-16-5p (15-5p) <400> 43 uagcagcacg uaaauauugg cg 22 <210> 44 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-361-5p (Control) <400> 44 uuaucagaau cuccaggggu ac 22

Claims (31)

  1. 대상체에서 배아 착상에 대한 자궁내막 수용성을 예측하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체의 자궁내막 상피 세포에서 포도칼릭신(podocalyxin)의 수준을 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 포도칼릭신의 상기 수준을 결정하는 단계는, 상기 자궁내막 상피 세포에서, 포도칼릭신 단백질의 양 및/또는 분포 패턴을 결정하는 단계, 및/또는 포도칼릭신을 인코딩하는 핵산 분자의 양을 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 핵산 분자는 mRNA인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 대상체에서의 포도칼릭신의 상기 수준을 적어도 하나의 참조(reference)에서의 자궁내막 상피 세포에서의 포도칼릭신의 수준과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 방법은 (a) 상기 대상체에서의 상기 포도칼릭신의 상기 수준이 상기 참조에서의 상기 포도칼릭신의 상기 수준보다 더 높은지, 또는 (b) 상기 대상체에서의 상기 포도칼릭신의 상기 수준이 상기 참조에서의 포도칼릭신의 상기 수준보다 더 낮은지를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자궁내막 상피 세포는 내강(luminal) 상피 세포 및/또는 샘(glandular) 상피 세포인 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    (i) 상기 대상체의 내강 상피 세포에서의 포도칼릭신의 더 낮은 수준 및 샘 상피 세포에서의 포도칼릭신의 더 높은 수준이 자궁내막 상피 수용성을 나타내거나; 또는
    (ii) 상기 대상체의 내강 상피 세포에서의 포도칼릭신의 더 높은 수준 및 샘 상피 세포에서의 포도칼릭신의 더 높은 수준이 전-자궁내막(pre-endometrial) 상피 수용성을 나타내거나; 또는
    (iii) 상기 대상체의 내강 상피 세포에서의 포도칼릭신의 더 낮은 수준 및 샘 상피 세포에서의 포도칼릭신의 더 낮은 수준이 후-자궁내막(post-endometrial) 상피 수용성을 나타내는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 포도칼릭신의 상기 수준을 결정하기 위해 포도칼릭신에 특이적으로 결합하는 항체 또는 압타머(aptamer)를 사용하는 단계를 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항체 또는 압타머는 검출가능한 표지에 컨쥬게이트(conjugate)되어 있는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 검출가능한 표지는 방사성표지, 효소, 형광 표지, 발광 표지, 생물발광 표지, 자기 표지, 보결분자단(prosthetic group), 조영제 및 초음파 작용제로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 초음파 작용제는 마이크로기포-방출제(microbubble-releasing agent)인 방법.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 포도칼릭신의 상기 수준을 결정하는 단계는 프로게스테론의 하류 조절자 및/또는 포도칼릭신의 상류 조절자의 상기 수준을 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 프로게스테론의 하류 조절자 및/또는 포도칼릭신의 상류 조절자는 마이크로RNA인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 마이크로RNA는 miR-199 또는 miR-145인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 면역조직화학적 검정, 제자리(in situ) 혼성화, 유세포분석, 효소-결합 면역흡착 검정, 웨스턴 블롯, 실시간 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 또는 초음파 분자 영상화를 수행하는 단계를 포함하는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 시험관내 또는 생체외에서 자궁내막 상피 세포에 대해 수행되는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 방법은 생물학적 샘플에서 상기 대상체로부터 수득된 자궁내막 상피 세포에 대해 수행되는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 자궁내막 생검, 자궁액 샘플 및 질액 샘플로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 프로게스테론, 프로제스토젠 또는 이들의 유사체 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물로 이전에 치료받은 적이 있는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 포도칼릭신의 상기 수준이 한 주기 동안 적어도 하나의 생물학적 샘플 및 적어도 하나의 시점에서 결정되는 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체 내로 배아를 착상하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 포도칼릭신의 상기 수준은 상기 대상체의 제1 주기에서 결정되고, 배아는 상기 대상체의 후속 주기에서 착상되는 방법.
  23. 대상체에서 불임을 검출하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체의 자궁내막 상피 세포에서 포도칼릭신의 수준을 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  24. 대상체에서 불임을 진단하고 예후하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체의 자궁내막 상피 세포에서 포도칼릭신의 수준을 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 포도칼릭신의 상기 수준이 한 주기 동안 적어도 하나의 생물학적 샘플 및 적어도 하나의 시점에서 결정되는 방법.
  26. 대상체에서 배아 착상에 대한 자궁내막 상피 수용성을 모니터링하고 최적의 자궁내막 상피 수용성을 예측하는 방법으로서, 상기 방법은 하나 이상의 시점에서 상기 대상체의 자궁내막 상피 세포에서의 포도칼릭신의 수준을 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  27. 대상체에서 배아 착상에 대한 자궁내막 상피 수용성을 개선하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체의 자궁내막 상피 세포에서 포도칼릭신의 수준을 결정하는 단계, 및 상기 세포에서의 포도칼릭신의 상기 수준에 기초하여, 상기 대상체에게 상기 자궁내막 상피 세포에서의 포도칼릭신의 상기 수준을 감소시키기에 충분한 양의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  28. 대상체에서 배아 착상에 대한 자궁내막 상피 수용성을 개선하는 것에 대한 화합물의 유효성을 평가하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체의 자궁내막 상피 세포에서 포도칼릭신의 수준을 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 대상체는 이전에 상기 화합물로 치료를 받은 적이 있는 방법.
  29. 대상체에서 배아 착상에 대한 자궁내막 상피 수용성을 개선하기 위한 화합물을 사용하는 치료를 최적화하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체에게 화합물을 투여하는 단계, 상기 대상체의 자궁내막 상피 세포에서 포도칼릭신의 수준을 결정하는 단계, 및, 선택적으로, 포도칼릭신의 상기 수준에 기초하여 상기 대상체에 대한 상기 치료를 수정하는 단계를 포함하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 수정은 투여량, 화합물의 유형 및/또는 투여 경로 중 하나 이상 또는 전부인 방법.
  31. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 프로게스테론, 포르제스토젠, 또는 이들의 유사체, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 촉매 핵산, 간섭 RNA, siRNA, 마이크로RNA 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
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