KR20220063101A

KR20220063101A - 리포펩타이드와 폴리(i:c) 아쥬반트를 포함하는 재조합 코로나-19 백신 조성물

Info

Publication number: KR20220063101A
Application number: KR1020210152168A
Authority: KR
Inventors: 염정선; 안병철; 정수경; 허윤기; 함수진
Original assignee: 주식회사 차백신연구소
Priority date: 2020-11-09
Filing date: 2021-11-08
Publication date: 2022-05-17
Also published as: WO2022098184A1; US20230390384A1

Abstract

본 발명은 리포펩타이드와 폴리(I:C) 아쥬반트를 포함하는 재조합 코로나-19 백신 조성물에 관한 것으로,
본 발명의 일 측면에서 제공하는 코로나바이러스감염증-19의 예방 또는 치료용 백신 조성물은 재조합 코로나-19 항원에 대해 체액성 면역반응과 세포성 면역반응 모두 높게 유도할 수 있으므로, 코로나-19 백신으로 개발하여 상업적으로 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

Description

리포펩타이드와 폴리(I:C) 아쥬반트를 포함하는 재조합 코로나-19 백신 조성물{Recombinant corona-19 vaccine composition comprising lipopeptide and poly(I:C) adjuvant}

본 발명은 리포펩타이드와 폴리(I:C) 아쥬반트를 포함하는 재조합 코로나-19 백신 조성물에 관한 것이다.

2019년 12월에 중국 후베이성 우한시에서 발생한 코로나-19는 2020년 3월까지 약 114 개국으로 감염이 확산되었다. 이에 세계보건기구(WHO)는 코로나-19가 세계적 대유행(Pandemic) 상황이라고 선언하였다. 이후 2020년 9월까지 전세계적으로 약 3천 5백만명의 감염 환자가 발생하였으며, 이 중 약 1백만명이 사망하였으며, 계속 감염환자 및 사망자가 증가하고 있다.

코로나-19는 발열과 함께 마른 기침, 객담, 호흡곤란 등과 같은 호흡기 증상을 보이며 급성 호흡곤란증후군과 심부전 및 부정맥 등의 합병증을 유발할 수 있다. 이러한 경우 산소치료, 항바이러스제 및 항생제 투여를 통해 보존적 치료를 진행하고 있지만 코로나바이러스에 대한 치료제가 아니기 때문에 충분한 효과를 볼 수 없다는 문제점이 있다.

코로나-19는 기침이나 재채기를 할 때 생긴 비말을 통한 전파가 주된 감염 경로로 기초감염재생산수(한 사람의 감염자가 전염가능기간 동안에 감염시키는 평균 인원수)가 2~2.5로 독감보다 전파력이 높은 것으로 알려져 있으며, 무증상 감염자도 바이러스를 전파시킬 수 있어 바이러스를 효과적으로 차단하기 어려운 문제점이 있다. 따라서 근원적인 치료법이 없고 전파력이 높은 코로나-19를 효과적으로 예방할 수 있는 백신을 개발하는 것이 중요하다.

한편, 코로나바이러스(Coronavirus, CoV)는 계통학적으로 코로나바이러스과(Coronaviridae)에 속하는 바이러스를 지칭하며 하위군인 Ortho coronaviridae에는 alpha-CoV, beta-CoV, delta-CoV, gamma-CoV의 4가지 속으로 분류된다. 그 중에서, alpha-CoV와 beta-CoV만 포유동물에 감염되며, delta-CoV와 gamma-CoV는 조류와 일부 포유 동물에 감염된다.

지금까지 인간을 감염시킬 수 있는 코로나바이러스(HCoV)는 7종류로, alpha-CoV의 HCoV-229E, HCoV-NL63과, beta-CoV의 HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, MERS-CoV와 함께, 2019년 코로나바이러스 감염증(코로나 19, COVID-19)의 원인 병원체인 SARS-CoV-2가 속해있다. HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-HKU1은 사람에서 일반적인 감기나 위장관 질환을 유발하지만, SARS-CoV, MERS-CoV와 함께, SARS-CoV-2는 심각한 급성 호흡기 전염병을 유발한다.

SARS-CoV-2는 SARS-CoV, MERS-CoV와 계통수(phylogenetic tree)에서 공통된 beta-CoV에 속해 있으나, 하기 Maximum Likelihood 방법을 통한 SARS-CoV, MERS-CoV-2 및 SARS-CoV-2의 진화적 분석 결과에 나타낸 바와 같이, 분자 계통학적 측면에서 SARS-CoV와는 분명하게 구분되고, 염기서열 유사성이 절반 남짓한 MERS-CoV와는 꽤 오래전에 나뉘어 진화하였다.

[SARS-CoV, MERS-CoV-2 및 SARS-CoV-2의 진화적 분석, Maximum Likelihood]

또한, SARS-CoV-2는 SARS-CoV와 비교해 구조와 병원성이 유사한 부분도 있으나, 백신 개발에 가장 중요하게 고려되어야 할 단백질 구조, 즉, 스파이크 단백질(spike protein, S)에 명확한 구조 차이가 있다. SARS-CoV-2에서 퓨린-유사 절단 부위(furin-like cleavage site, SLLR-ST)의 존재는, S 단백질의 프라이밍(priming)을 촉진하고, 나아가 SARS-CoV에 비해 SARS-CoV-2 전파력을 더욱 높이는 원인이 된다(비특허문헌 1, Le Infezioni in Medicina, n. 2, 174-184, 2020, SARS-CoV-2, SARS-CoV, and MERS-CoV: a comparative overview).

이를 더욱 구체적으로 설명하면, RSVR↓SV에 의한 MERS-CoV의 S 단백질 절단은 바이러스 방출(viral egress) 동안 푸린(furin)에 의해 매개되는 반면, SARS-CoV는 퓨린-유사 절단 부위(furin-like cleavage site, SLLR-ST)가 부족하기 때문에 S 단백질이 완전히 절단되지 않는다. MERS-CoV에서 S 단백질 절단은 표적 세포에 의해 발현된 프로테아제 (엘라 스타제, 카텝신 L 또는 TMPRS)에 의해 보존된 서열 AYT↓M에서 발생한다. 반면, SARS-CoV-2의 S 단백질에는 PRRAR↓SV 서열을 형성하는 단일 Arg↓ 절단 부위 1(cleavage site 1)의 업스트림(upstream)에 12개의 추가적인 뉴클레오티드를 가지고 있고, 이는 상기 퓨린-유사 절단 부위(furin-like cleavage site, SLLR-ST)에 해당한다. 전술한 바와 같이, SARS-CoV-2에서 퓨린-유사 절단 부위(furin-like cleavage site, SLLR-ST)의 존재는, S 단백질의 프라이밍(priming)을 촉진하고, 나아가 SARS-CoV에 비해 SARS-CoV-2 전파력을 더욱 높이는 원인이 된다. 즉, SARS-CoV-2와 SARS-CoV 명확한 구조 차이가 존재한다.

나아가, SARS-CoV 환자의 경우 치사율이 매우 높아 별도의 사스 치료제가 존재하지 않는 반면, SARS-CoV-2 환자의 경우 치사율이 SARS-CoV 환자 대비 상대적으로 낮지만 전염성이 매우 강하여 COVID-19에 대한 예방 백신의 필요성이 매우 시급한 실정이다.

또한, SARS-CoV-2의 RNA 염기서열은, 기존의 SARS-CoV 및 MERS-CoV의 RNA 염기서열과 비교해 명확한 차이점이 있다. 대표적으로, SARS-CoV-2의 RNA 염기서열은, 기존 SARS-CoV의 RNA 염기서열과 17.7%의 차이가 있다.

- SARS 코로나바이러스(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_004718.3)

- MERS 바이러스(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_019843.3)

- SARS-CoV-2 바이러스(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_045512.2)

상기 17.7%의 차이는 SARS-CoV-2에 대한 예방, 치료를 위해서 기존 SARS-CoV 치료제를 그대로 사용할 수 없고, SARS-CoV-2를 위한 새로운 백신 개발이 반드시 필요할 정도의 현저한 차이임이 자명하다.

SARS-CoV-2는 외피를 가지며 바이러스 유전체인 RNA 자체가 전사체로 작용하는 양성 단일가닥 RNA (positive single strand RNA)로, 약 30 kb 길이의 5'-capping 구조와 3'-poly-A tail로 구성된다. SARS-CoV-2의 유전체는 표면돌기 당단백질 (Spike glycoprotein, S), 뉴클레오단백질(Nucleoprotein, N), 막단백질 (Membrane protein, M), 외피단백질 (Envelope protein, E)로 구성되는 4가지의 구조 단백질을 코딩하고 있다. S 당단백질은 숙주 세포의 수용체와 특이적인 결합을 하고, N 단백질은 RNA 게놈과 결합하여 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)를 만들고, M 단백질은 membrane과 캡시드 사이를 이어주며, E 단백질은 바이러스의 조립에 관여하며 외피를 구성한다.

SARS-CoV-2의 S 단백질은 2개의 functional subunit인 S1과 S2 subunit으로 이루어져 있으며, 3개의 S 단백질이 삼량체의 융합(trimeric fusion) 구조를 이루고 있다. S1 subunit은 숙주 세포의 수용체인 안지오텐신 전환효소 2(Angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)와 결합하는 수용체-결합 도메인(receptor-binding domain, RBD)를 포함하고 있으며, S2 subunit은 숙주 세포의 세포막과의 융합을 통해 바이러스가 세포내로 침입할 수 있도록 하는 역할을 한다. 그렇기 때문에 SARS-CoV-2의 치료제나 백신 개발의 주된 타겟으로 삼고있다. 그러나, 다른 코로나바이러스들과의 아미노산 상동성 비교 결과, S 단백질의 S1 subunit과 RBD 부분에서 상동성이 비교적 낮은 것으로 알려져 있기 때문에, 치료제나 백신 개발에 주의가 필요하다. 또한, SARS-CoV-2는 유전자 분석을 통해 3가지 그룹 (A(또는 S), B(또는 V), C(또는 G))로 구분하고 있는데, 유럽 및 미국에서 발견되는 C(또는 G) 그룹의 경우 RBD 부분의 특정 아미노산의 변이에 의해 전파력이 더 강력해진 것이라는 보고도 있다. 따라서 유전적 변이에도 효과가 있는 백신이나 치료제의 개발이 필요한 실정이다. 하지만, 현재 개발이 완료된 코로나-19 백신은 없으며, 개발의 시급성을 고려하여 전세계 다수의 기업, 기관, 연구소 등에서 다양한 백신 플랫폼을 이용하여 백신을 개발하고 있다. 현재 가장 앞서 개발 중인 백신은 불활화백신, 바이러스벡터, mRNA 백신 등이 있다. 불활화백신은 전통적인 백신 개발에 이용되어 검증된 시스템이지만 코로나-19의 병원체를 직접 사용하기 때문에 위험성을 가지며 특수한 BSL3 시설이 필요하다는 단점이 있다. mRNA와 바이러스벡터 백신은 빠른 생산이 가능한 반면 아직 백신 제품으로 허가 사례가 없어 효능과 안전성에 대한 불확실성을 가지고 있다. 재조합 단백질 백신은 안전성이 우수하나 단독 투여로는 낮은 면역원성을 보인다. 다만, 아쥬반트를 이용하여 면역 효능을 향상시킬 수 있다.

아쥬반트는 백신 항원과 같이 사용하여 백신의 임상적 효과를 강화하기 위해 백신항원에 대한 면역반응을 증가시키거나 바람직한 방향으로 유도시키는 물질 혹은 물질의 조합들이다. 아쥬반트는 직접 또는 간접적인 면역자극과 항원 전달에 작용하여 백신항원에 대한 면역반응을 증가 및 조절하거나, 방어 효과 유지기간을 연장하는 등 백신의 임상적 유효성을 증진 및 개선하는 것이 주요 기능이다. 병원성 세균이나 바이러스가 감염하면 면역세포의 표면수용체(Pattern Recognition Receptor)가 병원성 미생물의 특이한 패턴(Pathogen-associated molecular pattern, PAMP)을 인지하여 선천성 면역반응을 일으키게 된다. 톨유사수용체(Toll like receptor, TLR)은 대표적인 표면수용체로서 사람에서는 약 13종이 알려져 있다. 톨유사수용체에 반응하는 TLR 작용체 (TLR ligands)는 면역세포를 직접 자극하여 선천성 면역반응을 활성화시키고, 백신항원에 대한 후천성 면역인 체액성 면역과 세포성 면역반응을 유도하여 인체를 감염원으로부터 보호하거나 조직 복구에 기여하기 때문에 아쥬반트로 개발되고 있다.

코로나-19 환자의 면역원성을 분석한 결과, Germinal center의 부재, T follicular helper cell (Tfh cell) 및 GC B 세포 발생 감소 등으로 인해 Germinal center 유래 체액성 면역반응이 일어날 수 없음이 보고되었다(비특허문헌 2, Naoki Kaneko, et al., 2020, Loss of Bcl-6-expressing T follicular helper cells and germinal centers in COVID-19, cell. 183: 143-157).

따라서, Germinal center 유래 체액성 면역반응을 유도할 수 있는 기술이 필요하며, 본 발명 기술의 아쥬반트는 이러한 T follicular helper cell과 Germinal center B 세포의 발생을 증가시켜 체액성 면역반응을 향상시킬 수 있는 물질로(비특허문헌 3, Lee BR et al. Combination of TLR1/2 and TLR3 ligands enhances CD4(+) T cell longevity and antibody responses by modulating type I IFN production, Sci Rep.2016 Sep 1, 6:32526) 코로나-19에 의한 체액성 면역반응 억제를 해결할 수 있는 효과적인 코로나-19 아쥬반트로 기능할 수 있다.

또한, SARS-CoV-2 특이적인 Memory T cell이 바이러스 감염을 예방하고 증상을 완화시킬 수 있는 중요한 요인으로 보고되어 체액성 면역반응뿐만 아니라 세포성 면역반응의 유도도 필요하다(비특허문헌 4, Takuya Sekine, et al., 2020, Robust T cell immunity in convalescent individuals with asymptomatic or mild COVID-19). 또한, 이러한 세포성 면역반응의 향상은 체액성 면역반응이 감소되는 코로나-19 감염 증상을 해결할 수 있는 방법이 될 수 있다. 본 발명 기술의 아쥬반트는 체액성 면역반응뿐만 아니라 세포성 면역반응도 강력하게 유도하며 특히 memory phase에서 항원-특이적 CD4+ T cell 빈도를 높게 유지시키는 물질로 백신을 효과적으로 향상시킬 수 있는 코로나-19 아쥬반트로 기능할 수 있다.

이에 본 발명자들은 백신과 치료제가 전무한 코로나-19 백신의 개발 연구를 통해 리포펩타이드와 폴리(I:C)의 복합 아쥬반트인 L-pampo가 재조합 코로나-19 항원에 대한 체액성 면역반응과 세포성 면역반응 모두 높게 유도하는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 아쥬반트 L-pampo를 포함하는 백신 조성물은 재조합 코로나-19 항원의 면역 향상을 통해 효과적인 코로나-19 백신으로 개발하여 상업적으로 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

비특허문헌 1, Ali A. Rabaan, et al., Le Infezioni in Medicina, n. 2, 174-184, 2020, SARS-CoV-2, SARS-CoV, and MERS-CoV: a comparative overview 비특허문헌 2, Naoki Kaneko, et al., 2020, Loss of Bcl-6-expressing T follicular helper cells and germinal centers in COVID-19, cell. 183: 143-157 비특허문헌 3, Lee BR et al. Combination of TLR1/2 and TLR3 ligands enhances CD4(+) T cell longevity and antibody responses by modulating type I IFN production, Sci Rep.2016 Sep 1, 6:32526 비특허문헌 4, Takuya Sekine, et al., 2020, Robust T cell immunity in convalescent individuals with asymptomatic or mild COVID-19

본 발명의 일 측면에서의 목적은,

코로나바이러스감염증-19 (Coronavirus disease 2019, COVID-19)의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 일 측면에서의 목적은,

상기 코로나바이러스감염증-19의 예방 또는 치료용 백신 조성물을, 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 신종 코로나바이러스에 대한 면역 반응을 생성하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 일 측면에서의 목적은,

코로나바이러스감염증-19 (Coronavirus disease 2019, COVID-19)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명의 일 측면은,

코로나바이러스의 항원(Antigen) 및

리포펩타이드 및 폴리(I:C)를 포함하는 백신 아쥬반트를 포함하는,

코로나바이러스감염증-19 (Coronavirus disease 2019, COVID-19)의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 일 측면은,

상기 코로나바이러스감염증-19의 예방 또는 치료용 백신 조성물을, 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 신종 코로나바이러스에 대한 면역 반응을 생성하는 방법을 제공한다.

나아가, 본 발명의 또 다른 일 측면은,

코로나바이러스의 항원(Antigen) 및

코로나바이러스감염증-19 (Coronavirus disease 2019, COVID-19)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 측면에서 제공하는 코로나바이러스감염증-19의 예방 또는 치료용 백신 조성물은 재조합 코로나-19 항원에 대해 체액성 면역반응과 세포성 면역반응 모두 높게 유도할 수 있으므로, 코로나-19 백신으로 개발하여 상업적으로 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

도 1은 마우스모델에서의 재조합 코로나 단백질과 아쥬반트 L-pampo로 제조된 시험백신의 코로나-19 S1 항원특이적인 항체가를 확인한 도이다.
도 2는 마우스모델에서의 재조합 코로나 단백질과 아쥬반트 L-pampo로 제조된 시험백신의 코로나-19 RBD 항원특이적인 항체가를 확인한 도이다.
도 3은 마우스모델에서의 재조합 코로나 단백질과 아쥬반트 L-pampo로 제조된 시험백신의 코로나-19 NP 항원특이적인 항체가를 확인한 도이다.
도 4는 마우스모델에서의 재조합 코로나 단백질과 아쥬반트 L-pampo로 제조된 시험백신의 세포성 면역반응을, ELISPOT 방법을 이용하여 IFN-γ spot의 수를 비교한 도이다.
도 5은 마우스모델에서의 재조합 코로나 단백질과 아쥬반트 L-pampo로 제조된 시험백신의 세포성 면역반응을, 사이토카인(cytokine) ELISA 방법을 이용하여 IFN-γ 분비 정도를 비교한 도이다.
도 6은 마우스모델에서의 재조합 코로나 단백질과 아쥬반트로 L-pampo 또는 타 아쥬반트로 제조된 시험백신의 항체가 유도를 비교한 도이다.
도 7은 마우스모델에서의 ACE2 수용체와 RBD 단백질의 결합 억제 방법을 이용하여 재조합 코로나 단백질과 아쥬반트로 L-pampo 또는 타 아쥬반트로 제조된 시험백신의 중화항체 유도를 비교한 도이다.
도 8은 마우스모델에서의 재조합 코로나 단백질과 아쥬반트로 L-pampo 또는 타 아쥬반트로 제조된 시험백신의 세포성 면역반응 유도를 비교한 도이다.
도 9는 마우스모델에서의 재조합 코로나 단백질과 아쥬반트 L-pampo의 리포펩타이드 Pam3CSK4와 폴리(I:C) 중량비에 따른 항체가 유도를 비교한 도이다.
도 10은 마우스모델에서의 재조합 코로나 단백질과 아쥬반트 L-pampo의 리포펩타이드 Pam3CSK4와 폴리(I:C) 중량비에 따른 중화항체 유도를 비교한 도이다.
도 11은 마우스모델에서의 재조합 코로나 단백질과 아쥬반트 L-pampo의 리포펩타이드 Pam3CSK4와 폴리(I:C) 중량비에 따른 세포성 면역반응 유도를 비교한 도이다.
도 12는 마우스모델에서의 재조합 코로나 단백질과 아쥬반트 L-pampo의 리포펩타이드 종류에 따른 항체가 유도를 비교한 도이다.
도 13은 마우스모델에서의 재조합 코로나 단백질과 아쥬반트 L-pampo의 리포펩타이드 종류에 따른 중화항체 유도를 비교한 도이다.
도 14는 마우스모델에서의 재조합 코로나 단백질과 아쥬반트 L-pampo의 리포펩타이드 종류에 따른 세포성 면역반응 유도를 비교한 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

한편, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 실시 형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.

나아가, 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 "포함"한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.

본 발명의 일 측면은,

코로나바이러스의 항원(Antigen) 및

여기서, 상기 코로나바이러스의 항원(Antigen)은, 신종 코로나바이러스(2019 novel coronavirus, 2019-nCoV) 항원이다.

보다 구체적으로, 상기 항원은 코로나-19 병원체인 SARS-CoV-2 바이러스의 체내 감염에 중요한 역할을 하는 Spike protein (S)와 그 구성요소인 Spike protein 1 (S1), Receptor binding domain (RBD) 및 Nucleoprotein (NP)의 바이러스 단백질, 불활화바이러스 항원 또는 그 조합 (예를 들면, S1과 RBD 조합)이 제공될 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 리포펩타이드(lipopeptide)는 박테리아와 마이코플라즈마에서 유래한 리포펩타이드의 합성유사체(synthetic analogue)로 J. Metzger 등에 의해 처음 합성되었다(Metzger, J. et al., 1991, Synthesis of novel immunologically active tripalmitoyl-S-glycerylcysteinyl lipopeptides as useful intermediates for immunogen preparations. Int. J. Peptide Protein Res. 37: 46-57).

하기 화학식 1의 화합물 분자구조는 N-palmitoyl-S-[2,3-bis(palmitoyloxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cystein-SKKKK(pam3Cys-SKKKK)이며, 이외에도 다양한 유사체들이 합성된 바 있다.

H. Schild 등에 따르면 Pam3Cys-Ser-Ser을 인플루엔자 바이러스 T 세포 에피토프와 결합시켜 마우스에 투여한 경우, 바이러스 특이적인 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte, CTL)가 유도되었다. 본 발명에서도 Pam3Cys-SKKKK가 수산화 알루미늄보다 SARS-CoV-2 항원 특이적 항체가가 상대적으로 현저히 우수함을 확인하였다(도 6 참조). 일반적으로 리포펩타이드는 TLR2에 대한 리간드로 알려져 있다. 이러한 리포펩타이드의 사용은 Pam3Cys-SKKKK에 한정되지 않으며, 리포펩타이드는 글리세롤 분자에 결합된 지방산과 여러 아미노산으로 구성될 수 있다. 그 예로 PHC-SKKKK, Ole2PamCys-SKKKK, Pam2Cys-SKKKK, PamCys(Pam)-SKKKK, Ole2Cys-SKKKK, Myr2Cys-SKKKK, PamDhc-SKKKK, PamCSKKKK, Dhc-SKKKK 등이 포함된다. 분자 내에 지방산의 숫자는 한 개이거나 그 이상일 수 있다. 리포펩타이드에 아미노산의 수는 하나이거나 그 이상일 수 있다. 또한, 지방산과 아미노산은 화학적으로 변형될 수 있다. 나아가, 리포펩타이드는 그람 양성이나 그람 음성인 박테리아나 마이코플라즈마로부터 유래한 분자 일부이거나 분자 전체 형태로 된 지질 단백질일 수 있다.

상기 폴리(I:C)는 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 연구에서 타입1 인터페론의 강력한 유도체로 사용되어 왔다. 더욱이 폴리(I:C)는 포유류에서 가장 강력한 항원 제시 세포인 수지상세포(dendritic cell)를 안정적이고 성숙하게 형성하는 것으로 알려졌다(Rous, R. et al 2004. poly(I:C) used for human dendritic cell maturation preserves their ability to secondarily secrete bioactive Il-12, International Immunol. 16: 767-773). 이러한 기존보고에 따르면 폴리(I:C)는 강력한 IL-12 유도물질이며, IL-12는 면역반응을 Th1이 발달하도록 추진하여 세포성 면역반응과 IgG2a 또는 IgG2b 항체 형성을 유도하는 중요한 사이토카인이다. 또한, 폴리(I:C)는 펩티드 항원에 대한 강력한 아쥬반트 활성을 갖는 것으로 알려졌다(Cui, Z. and F. Qui. 2005. Synthetic double stranded RNA poly I:C as a potent peptide vaccine adjuvant: Therapeutic activity against human cervical cancer in a rodent model. Cancer Immunol. Immunotherapy 16: 1-13). 폴리(I:C)는 길이가 50 내지 5,000 bp 범위일 수 있고, 50 내지 2,000 bp인 것이 적합하며, 100 내지 500 bp가 바람직하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 리포펩타이드 및 폴리(I:C)는 0.1 내지 10 : 1의 중량비, 1.25 내지 2 : 1의 중량비, 1.25 내지 1.5 : 1의 중량비, 1.25 : 1의 중량비로 백신 조성물에 포함될 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니고, 환자의 상태에 따라 적절한 수준으로 조절할 수 있다. 또한, 상기 백신 조성물은 수용액 제형일 수 있다. 즉, 상기 백신 조성물은 코로나바이러스의 항원(Antigen), 리포펩타이드 및 폴리(I:C)를 포함하는 백신 아쥬반트의 수용액 제형을 구성요소로 포함할 수 있다.

상기 백신 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및 아쥬반트로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 일례로, 상기 백신 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있고, 인체 또는 수의용으로 제형화되어 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 경로는 경구, 복강, 정맥, 근육, 피하, 피내 등의 경로로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 주사제로 제형화하여 투여하는 것이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스텔(예, 올레인산에칠 등), 알코올류(예, 에탄올, 벤질알코욜, 프로필렌글리콘, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다. 상기 백신 조성물은 약제학적 유효량으로 투여할 수 있다. 이때, 용어 "약제학적 유효량"이란 백신효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 투여될 항원에 따라 달라지며, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여경로, 투여 방법 등 의학분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 1회 내지 수회 투여가 가능하다.

상기 백신 조성물은 신종 코로나바이러스에 대해 우수한 방어 면역능을 나타내며, 본 발명의 다른 일 측면은, 코로나바이러스감염증-19의 예방 또는 치료용 백신 조성물을, 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 신종 코로나바이러스에 대한 면역 반응을 생성하는 방법을 제공한다.

단, 만약 상기 백신 조성물을 인간(환자)에게 투여할 경우, 생체 내 면역반응을 자극하기에 유효한 양으로 투여할 수 있으며, 일례로 인간에게 일회 내지 수회로 투여할 수 있고, 투여량은 1-250 ㎍, 더욱 바람직하게는 10-100 ㎍일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 일 측면은,

코로나바이러스의 항원(Antigen) 및

구체적으로, 코로나-19의 항원인 S1, RBD, NP 단백질과 리포펩타이드인 Pam3CSK4 및 폴리(I:C)가 포함되도록 제조된 시험 백신을 사용하여 마우스모델에서의 항원특이적인 항체가를 확인해본 결과, 본 발명의 일 측면에서 제공하는 백신 조성물은 S1, RBD, NP 단백질에 특이적인 항체가가, 항원 단독으로 사용한 시험군 대비 현저히 높게 나타남을 확인하였다(도 1 내지 3 참조). 나아가, 상기 제조한 시험 백신의 세포성 면역반응을 분석한 결과, 본 발명의 일 측면에서 제공하는 백신 조성물은 항원 단독으로 사용한 시험군 대비 코로나-19 항원 S1, RBD, NP에 특이적인 IFN-γ 분비 세포들을 더 많이 유도함을 확인하였다(도 4 및 도 5 참조). 이로부터, 본 발명의 일 측면에서 제공하는 백신 조성물은 높은 항원 특이적 항체를 생성하며 항원 특이적 세포성 면역반응도 강하게 유도함으로써 효과적인 코로나-19 백신으로 사용될 수 있음을 확인하였다.

또한, 코로나-19의 항원인 S1, RBD 단백질과 리포펩타이드인 Pam3CSK4 및 폴리(I:C)가 포함되도록 제조된 시험 백신을 사용하되, 아쥬반트 종류만 다르게 한 대조군과 비교하며 마우스모델에서의 항원특이적인 항체가를 확인해본 결과, 본 발명의 일 측면에서 제공하는 백신 조성물은 S1, RBD 단백질에 특이적인 항체가가, 아쥬반트로 Alum 및 오일 에멀젼 등을 사용한 시험 백신 대비 현저히 높게 나타남을 확인하였다(도 6 참조). 또한, 상기 시험 백신과 대조군 시험 백신을 대상으로 중화항체 효능을 확인해본 결과, 본 발명의 일 측면에서 제공하는 백신 조성물은 Alum 및 오일 에멀젼 등을 혼합한 대조군에 비해 중화항체를 높게 유도됨을 확인하였다(도 7 참조). 또한, 상기 시험 백신과 대조군 시험 백신을 대상으로 세포성 면역반응을 평가해본 결과, Alum 및 오일 에멀젼 등을 혼합한 대조군에 비해 Pam3CSK4 및 폴리(I:C)가 아쥬반트로 포함된 시험 백신에서 가장 많은 IFN-γ spot 형성이 유도됨을 확인하였다(도 8 참조). 이로부터, 본 발명의 일 측면에서 제공하는 백신 조성물은 타 아쥬반트 Alum 및 오일 에멀젼 등이 포함된 백신 조성물에 비하여 강력한 면역 효능을 보일 수 있는 코로나-19 백신 조성물임을 확인하였다.

또한, 코로나-19의 항원인 S1, RBD 단백질과 리포펩타이드인 Pam3CSK4 및 폴리(I:C)가 포함되도록 제조된 시험 백신을 사용하되, 리포펩타이드인 Pam3CSK4와 폴리(I:C)의 중량비를 다르게 하여 마우스모델에서의 항원특이적인 항체가를 확인해본 결과, Pam3CSK4 및 폴리(I:C)가 아쥬반트로 포함된 시험 백신은 S1, RBD 단백질에 특이적인 항체가가, Pam3CSK4 또는 폴리(I:C) 중 하나만을 사용한 시험 백신 대비 높은 항체가를 유도하며 Pam3CSK4 및 폴리(I:C)의 중량비가 1.25대 1을 사용한 시험 백신에서 가장 높은 항체가가 나타남을 확인하였다(도 9 참조). 또한, 중화항체 유도를 확인해본 결과, Pam3CSK4 및 폴리(I:C)의 중량비가 1.25대 1을 사용한 시험 백신에서 가장 높은 중화항체를 유도함을 확인하였다(도 10). 또한, 세포성 면역반응을 평가해본 결과, 폴리(I:C) 하나만을 사용한 시험 배신에서 가장 많은 IFN-γ spot 형성이 유도되었으며, Pam3CSK4 및 폴리(I:C)의 중량비가 1.25대 1을 사용한 시험 백신이 다른 중량비를 사용한 시험 백신보다 많은 IFN-γ spot 형성이 유도됨을 확인하였다(도 11). 이로부터, 본 발명의 일 측면에서 제공하는 백신 조성물은 리포펩타이드인 Pam3CSK4 또는 폴리(I:C) 중 하나만을 포함한 백신 조성물에 비하여 강력한 체액성 면역 효능을 보이며 특히, Pam3CSK4 및 폴리(I:C)의 중량비가 1.25대 1을 포함한 시험 백신은 강력한 체액성 및 세포성 면역반응을 유도하는 코로나-19 백신 조성물임을 확인하였다.

나아가, 코로나-19의 남아공 변이 항원인 RBD 단백질과 리포펩타이드 및 폴리(I:C)가 포함되도록 제조된 시험 백신을 사용하되, 리포펩타이드의 종류를 다르게 하여 마우스모델에서의 항원특이적인 항체가를 확인해본 결과, Pam3CSK4 또는 FSL-1 리포펩타이드와 폴리(I:C)가 포함된 제형에서 가장 높은 항체가를 나타냈으며, PHC-SK4 리포펩타이드와 폴리(I:C)가 포함된 제형도 높은 항체가를 유도하였다(도 12). 또한, 중화항체 유도를 확인해본 결과, PHC-SK4 리포펩타이드와 폴리(I:C)가 포함된 제형에서 가장 높은 중화항체가를 나타냈으며, FSL-1 또는 Pam3CSK4 리포펩타이드와 폴리(I:C)가 포함된 제형도 높은 중화항체를 유도함을 확인하였다(도 13). 또한, 세포성 면역반응을 평가해본 결과, Pam2Cys-SK4 리포펩타이드를 제외한 다른 리포펩타이드와 폴리(I:C)를 포함한 모든 제형에서 많은 IFN-γ spot 형성이 유도됨을 확인하였다(도 14). 이로부터, 본 발명의 일 측면에서 제공하는 백신 조성물은 높은 세포성 면역 효능을 보이며 특히, Pam3CSK4, PHC-SK4 또는 FSL-1 리포펩타이드와 폴리(I:C)가 포함된 백신 조성물은 강력한 체액성 및 세포성 면역반응을 유도하는 코로나-19 백신 조성물임을 확인하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 마우스 모델에서의 코로나-19 백신 효능 확인

실시예 1-1. 시험 백신의 제조 및 투여

시험 백신은 코로나-19의 항원인 S1(spike protein 1), RBD(receptor-binding domain), NP(nucleoprotein)를 각각 1 ㎍ (혹은 3 ㎍)을 혼합한 후 상기 혼합물에 Pam3CSK4 25 ㎍ (혹은 75 ㎍)과 폴리(I:C) 20 ㎍ (혹은 60 μg)의 L-pampo가 포함되도록 제조하였다. 각 시험 백신은 투여량(dose) 당 각각의 항원 1 ㎍ 혹은 3 ㎍을 사용하여 6 주령 암컷 Balb/c 마우스(오리엔트 바이오, 한국)에 2주 간격으로 2회에 걸쳐서 근육 주사하였다.

실시예 1-2. 항원특이적인 항체가 분석

상기 실시예 1-1의 방법으로 제조 및 투여된 시험 백신의 항원특이적인 항체 유도 효능을 분석하기 위하여, 면역투여 완료 후 2주차에 혈청(serum)을 분리하여 항원특이적인 항체 형성을 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 방법으로 분석하여 항체가를 결정하였다.

구체적으로, 항체를 분석하기 위해 96웰 마이크로플레이트(microplate)에 S1, RBD, NP항원을 각각 0.1 ㎍/웰의 농도로 코팅한 뒤, 비특이적 결합을 막기 위하여 1%의 소혈청 알부민(Bovine serum albumin)으로 1시간 동안 반응시켰다. 상기 마이크로플레이트를 세척하고 각 웰에 순차적으로 희석된 혈청을 넣고 37℃에서 2시간 동안 반응시켰으며, 2차 항체로 항-마우스 염소 IgG-HRP(Goat anti-mouse IgG, Sigma, 미국)를 넣고 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 상기 반응시킨 마이크로플레이트를 세척하고 발색시약 TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine) 페록시다아제 기질(peroxidase substrate, KPL, 미국)을 첨가하고 상온에서 반응시킨 다음 ELISA 리더기를 이용하여 450nm에서 O.D(optical dencity) 값을 측정하였다. 항체가는 음성대조군 대비 O.D 값을 나타내는 항체 희석배수의 역수로 정의하였다.

마우스모델에서의 재조합 코로나 단백질과 아쥬반트 L-pampo로 제조된 시험백신의 코로나-19 S1 항원특이적인 항체가를 확인한 결과를 도 1에 나타냈다.

마우스모델에서의 재조합 코로나 단백질과 아쥬반트 L-pampo로 제조된 시험백신의 코로나-19 RBD 항원특이적인 항체가를 확인한 결과를 도 2에 나타냈다.

도 3은 마우스모델에서의 재조합 코로나 단백질과 아쥬반트 L-pampo로 제조된 시험백신의 코로나-19 NP 항원특이적인 항체가를 확인한 결과를 도 3에 나타냈다.

도 1에 나타낸 바와 같이, S1 단백질에 특이적인 항체가는 항원 단독으로 사용한 시험군 G2와 G5에 비해 항원과 Pam3CSK4 및 폴리(I:C)를 함께 사용한 L-pampo 시험군들에서 높은 항체가를 나타냈다. 또한, 각각 3 ㎍ 항원 S1, RBD, NP와 Pam3CSK4 75 ㎍ 및 폴리(I:C) 60 ㎍을 혼합하여 제조한 백신을 투여한 G7에서 가장 높은 항체가를 보였다. 또한, 도 2와 도 3에 나타낸 바와 같이, RBD 단백질 혹은 NP 단백질에 특이적인 항체가는 도 1과 유사한 경향성을 보이며 S1, RBD, NP 각각 3 ㎍ 항원과 Pam3CSK4 75 ㎍ 및 폴리(I:C) 60 ㎍을 혼합하여 제조한 백신을 투여한 G7에서 가장 높은 항체가를 보였다.

실시예 1-3. 세포성 면역반응 분석

상기 실시예 1-1의 방법으로 제조 및 투여된 시험 백신의 세포성 면역반응을 분석하기 위하여 면역투여 완료 후 2주차에 마우스로부터 비장을 적출하여 전체 비장세포(splenocyte)를 분리한 후, ELISPOT(enzymelinked immuno-spot) 방법과 사이토카인 ELISA 방법을 사용하여 분석하였다.

구체적으로, ELISPOT 방법은 먼저 IFN-γ에 대한 항체가 부착된 ELISPOT 플레이트를 PBS로 세척한 후, 완전 배지(Complete media)를 첨가하여 플레이트를 활성화하였다. 상기 ELISPOT 플레이트에 마우스의 비장세포를 5 x 10⁵ cells/웰로 분주한 후, 각각의 코로나-19 항원(S1, RBD, NP)을 넣고 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 24시간 동안 반응시켰다. 이후, 비장세포를 제거하고 PBS로 플레이트를 세척한 다음, Mouse IFN-γ ELISpot^PLUS 키트(Mabtech, 스웨덴)에 있는 비오틴이 결합된 항체를 0.5% FBS가 포함된 PBS로 희석해 플레이트의 웰에 각각 첨가하였다. 이를 상온에서 2시간 동안 반응시킨 뒤, 세척하고 HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 스트렙타비딘(streptavidin)을 플레이트의 웰에 각각 넣어 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이를 세척하고 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) 발색시약을 넣고 뚜렷한 스팟이 나올 때까지 반응시킨 후, 반응이 완료되면 3차 증류수를 넣어 반응을 정지시켰다. 플레이트를 증류수로 여러 번 세척하고, 실온에서 건조시킨 후 ELISPOT 리더기를 이용해 스팟을 계산하였다.

한편, 사이토카인 ELISA를 수행하기 위한 시료는 96웰 플레이트에 마우스의 비장세포를 1.5 x 10⁶ cells/웰로 분주한 후, 각각의 코로나-19 항원(S1, RBD, NP)을 넣고 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 48시간 동안 반응시켰다. 각 개체의 배양액을 튜브로 옮긴 후, 4℃, 3000 rpm 조건에서 5분간 원심분리하여 상층액을 수득하여 확보하였다. Mouse IFN(interferon)-γ ELISA 키트(BD, 미국)에 포함된 코팅용 항체를 코팅 버퍼에 희석해 96웰 플레이트에 분주하고, 37℃에서 2시간 동안 플레이트를 코팅하였다. 세척한 다음 10% FBS (Fetal bovine serum)을 넣고, 37℃에서 1시간 동안 블로킹하였다. 플레이트를 세척한 후, 표준 용액과 상기에서 수득한 시료 (비장세포 배양액)을 각 웰에 분주하고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 세척 후 비오틴(biotin)이 결합된 항체와 HRP가 결합된 스트렙타비딘을 혼합한 작동 디텍터(working detector)을 분주하고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 플레이트를 세척한 후, TMB 발색시약을 넣고 상온에서 5 내지 10분간 반응시킨 다음 정지 용액을 이용해 발생 반응을 멈추고, ELISA 리더기를 이용하여 450nm에서 O.D값을 측정하였다. 표준 용액의 값을 이용하여 검량선을 그려 수식을 만들고 이를 바탕으로 분석 시료의 IFN-γ 분비량을 계산하였다.

마우스모델에서의 재조합 코로나 단백질(S1, RBD, NP)과 아쥬반트 L-pampo로 제조된 시험백신의 세포성 면역반응을, ELISPOT 방법을 이용한 IFN-γ spot 분석방법으로 확인한 결과를 도 4에 나타냈다.

마우스모델에서의 재조합 코로나 단백질(S1, RBD, NP)과 아쥬반트 L-pampo로 제조된 시험백신의 세포성 면역반응을, 싸사이토카인 ELISA 방법을 이용한 IFN-γ 분비 분석방법으로 확인한 결과를 도 5에 나타냈다.

도 4에 나타낸 바와 같이, IFN-γ ELISPOT의 분석 결과, 항원 단독으로 사용한 시험군에 비해, 항원과 Pam3CSK4 및 폴리(I:C)를 함께 사용한 L-pampo 시험군들에서 코로나-19 항원(S1, RBD, NP)에 특이적인 IFN-γ 분비 세포들을 가장 많이 유도하였다.

또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, IFN-γ ELISA의 분석 결과, 항원 단독으로 사용한 시험군에 비해 항원과 Pam3CSK4 및 폴리(I:C)를 함께 사용한 L-pampo 시험군들에서 코로나-19 항원(S1, RBD, NP)에 특이적인 IFN-γ 분비를 강력하게 유도하였다. 특히 Pam3CSK4 75 ㎍ 및 폴리(I:C) 60 ㎍을 혼합하여 제조한 백신을 투여한 경우 항원 농도와 관계없이 월등히 높은 세포성 면역반응을 유도하였다.

따라서, 상기 [실시예 1]의 결과를 통해, 본 발명 아쥬반트를 포함하는 코로나-19 백신 조성물은 높은 중화항체와 항원 특이적 항체를 생성하며 항원 특이적 세포성 면역반응도 강하게 유도함으로써 효과적인 코로나-19 백신으로 사용될 수 있음을 확인하였다.

[실시예 2] 아쥬반트 L-pampo와 타 아쥬반트와의 효과 비교

실시예 2-1. 시험 백신의 제조 및 투여

시험 백신은 코로나-19의 항원인 S1과 RBD 단백질을 각각 5 ㎍씩 혼합한 후 상기 혼합물에 본 발명 아쥬반트 L-pampo 또는 타 아쥬반트(Alum, Addavax, AddaS03)를 포함시키도록 제조하였다. 현재 상용화된 오일 에멀젼 아쥬반트와 본 발명 아쥬반트의 효능 비교를 위해 Addavax(MF59 유사 아쥬반트)와 AddaS03(AS03 유사 아쥬반트)를 사용하였다.

보다 구체적으로, 본 발명 아쥬반트를 포함하는 시험 백신은 각각 5 ㎍의 S1, RBD 항원과 L-pampo [Pam3CSK4 75 ㎍과 폴리(I:C) 60 ㎍]를 포함하도록 제조하였다. Alum 아쥬반트를 포함하는 시험 백신은 각각 5 ㎍의 S1, RBD 항원과 Alum 100 ㎍를 포함하도록 제조하였다. Addavax 아쥬반트를 포함하는 시험 백신은 각각 5 ㎍의 S1, RBD 항원과 Addavax (1:1, v/v)을 각각 혼합하여 제조하였다. AddaS03 아쥬반트를 포함하는 시험 백신은 각각 5 ㎍의 S1, RBD 항원과 AddaS03 (1:1, v/v)을 각각 혼합하여 제조하였다.

각 시험 백신은 투여량(dose) 당 각각의 항원 5 ㎍을 사용하여 Balb/c 마우스에 3주 간격으로 2회에 걸쳐서 근육 주사하였다.

실시예 2-2. 항원특이적인 항체가 분석

상기 실시예 2-1의 방법으로 제조 및 투여된 시험 백신의 항원특이적인 항체 유도 효능을 분석하기 위하여, 2회 면역투여 2주 후에 혈청(serum)을 분리하여 항원특이적인 항체 형성을 ELISA법으로 분석하여 항체가를 결정하였다.

마우스모델에서의 재조합 코로나 단백질 S1, RBD와 아쥬반트 L-pampo로 제조된 시험백신과 오일 에멀젼 아쥬반트로 제조된 시험백신과의 항체가 유도를 비교한 결과를 도 6에 나타냈다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 모든 실험군에서 항원특이적인 항체가가 증가하는 것으로 나타났다. 다만, 오일 에멀젼 아쥬반트를 혼합한 실험군에 비해, L-pampo [Pam3CSK4 75 ㎍과 폴리(I:C) 60 ㎍]가 포함된 실험군에서 가장 높은 항체가 형성을 유도하는 것으로 확인되어, 본 발명의 아쥬반트 L-pampo가 오일 에멀젼 아쥬반트보다 SARS-CoV-2 항원에 대한 항체 형성을 현저하게 향상시킴을 확인하였다.

실시예 2-3. 중화항체 유도 분석

상기 실시예 2-1의 방법으로 제조 및 투여된 시험 백신의 중화항체 유도를 분석하기 위하여 2회 면역투여 완료 후 2주차에 마우스 혈청을 분리하여, ACE2(angiotensin-converting enzyme 2) 수용체와 RBD 단백질의 결합 억제 방법을 사용하여 분석하였다.

구체적으로, ACE2 수용체와 RBD 단백질의 결합 억제 방법은 먼저 96웰 마이크로플레이트에 RBD 항원을 0.1 ㎍/웰의 농도로 코팅한 뒤, 비특이적 결합을 막기위하여 1%의 소혈청 알부민(Bovine serum albumin)으로 2시간 동안 반응시켰다. 상기 마이크로플레이트를 세척하고 각 웰에 순차적으로 희석된 혈청을 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. HRP를 결합시킨 사람 ACE2 (HRP-conjugate human ACE2) 단백질을 넣고 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 상기 반응시킨 마이크로플레이트를 세척하고 발색시약 TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine) 페록시다아제 기질(peroxidase substrate, KPL, 미국)을 첨가하고 상온에서 반응시킨 다음 ELISA 리더기를 이용하여 450nm에서 O.D값을 측정하였다. ACE2 수용체와 RBD 단백질의 50% 결합 억제 항체가는 음성대조군 대비 O.D값의 50%를 나타내는 항체 희석배수의 역수로 정의하였다.

마우스모델에서의 재조합 코로나 단백질과 아쥬반트 L-pampo로 제조된 시험백신과 타 아쥬반트로 제조된 시험백신과의 중화항체 유도를 비교한 결과를 도 7에 나타냈다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 오일 에멀젼 아쥬반트를 혼합한 실험군에 비해, L-pampo [Pam3CSK4 75 ㎍과 폴리(I:C) 60 ㎍]가 포함된 실험군에서 가장 높은 ACE2 수용체와 RBD 단백질의 결합을 억제하는 항체가를 유도하는 것으로 보임으로써, 본 발명의 아쥬반트가 오일 에멀젼 아쥬반트보다 SARS-CoV-2에 대한 중화항체 형성을 현저하게 향상시킴을 확인하였다.

실시예 2-4. 세포성 면역반응 분석

상기 실시예 2-1의 방법으로 제조 및 투여된 시험 백신의 세포성 면역반응을 분석하기 위하여 32회 면역투여 완료 후 2주차에 마우스로부터 비장을 적출하여 전체 비장세포(splenocyte)를 분리한 후, ELISPOT 방법을 사용하여 분석하였다.

마우스모델에서의 재조합 코로나 단백질과 아쥬반트 L-pampo로 제조된 시험백신과 오일 에멀젼 아쥬반트로 제조된 시험백신과의 세포성 면역반응 유도를 비교한 결과를 도 8에 나타냈다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 오일 에멀젼 아쥬반트를 혼합한 실험군에 비해 L-pampo [Pam3CSK4 75 ㎍과 폴리(I:C) 60 ㎍]가 포함된 실험군에서 가장 많은 IFN-γ spot 형성이 유도되었다.

따라서, 상기 [실시예 2]의 결과로부터, 본 발명 아쥬반트 L-pampo를 포함하는 백신 조성물은 타 아쥬반트 Alum 및 오일 에멀젼이 포함된 백신 조성물에 비하여 강력한 면역 효능을 보일 수 있는 코로나-19 백신 조성물임을 확인하였다.

[실시예 3] L-pampo의 리포펩타이드와 폴리(I:C) 중량비에 따른 백신 효능 확인

실시예 3-1. 시험 백신의 제조 및 투여

시험 백신은 코로나-19의 항원인 S1과 RBD 단백질을 각각 5 ㎍씩 혼합한 후 상기 혼합물에 리포펩타이드인 Pam3CSK4와 폴리(I:C)의 중량비를 1.25 내지 3.5 : 1 또는 1 : 3.5 등 다양한 비율로 제조된 본 발명 아쥬반트 L-pampo를 포함시키도록 제조하였다. 또한, 고용량의 Pam3CSK4 75 ㎍ 또는 폴리(I:C) 60 ㎍을 각각 포함하는 시험 백신을 제조하였다.

각 시험 백신은 Balb/c 마우스에 3주 간격으로 2회에 걸쳐서 근육 주사하였다.

실시예 3-2. 항원특이적인 항체가 분석

상기 실시예 3-1의 방법으로 제조 및 투여된 시험 백신의 항원특이적인 항체 유도 효능을 분석하기 위하여, 2회 면역투여 2주 후에 혈청(serum)을 분리하여 항원특이적인 항체 형성을 ELISA법으로 분석하여 항체가를 결정하였다.

마우스모델에서 재조합 코로나 단백질과 리포펩타이드인 Pam3CSK4와 폴리(I:C)의 중량비에 따른 L-pampo 아쥬반트 시험백신의 항체가 유도를 비교한 결과를 도 9에 나타냈다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 모든 실험군에서 항원특이적인 항체가가 증가하는 것으로 나타났다. 다만, L-pampo가 포함된 실험군에서 Pam3CSK4 75 ㎍ 또는 폴리(I:C) 60 ㎍을 각각 포함하는 실험군보다 높은 항체가를 유도하는 것으로 확인되었다. 또한, Pam3CSK4와 폴리(I:C)의 중량비를 1.25 : 1로 제조한 L-pampo가 포함된 실험군이 다른 중량비로 제조한 L-pampo가 포함된 실험군에 비해 가장 높은 항체가 형성을 유도하는 것으로 확인되었다.

실시예 3-3. 중화항체 유도 분석

상기 실시예 3-1의 방법으로 제조 및 투여된 시험 백신의 중화항체 유도를 분석하기 위하여 2회 면역투여 완료 후 2주차에 마우스 혈청을 분리하여, ACE2 수용체와 RBD 단백질의 결합 억제 방법을 사용하여 분석하였다.

마우스모델에서의 재조합 코로나 단백질과 아쥬반트로 사용한 리포펩타이드 Pam3CSK4와 폴리(I:C)의 중량비에 따른 중화항체 유도를 비교한 결과를 도 10에 나타냈다.

도 10에 나타낸 바와 같이, Pam3CSK4와 폴리(I:C)의 중량비를 1.25 : 1로 제조한 L-pampo가 포함된 실험군에서 가장 높은 ACE2 수용체와 RBD 단백질 결합 억제 항체가를 보여 높은 중화항체 유도를 확인되었다.

실시예 3-4. 세포성 면역반응 분석

상기 실시예 3-1의 방법으로 제조 및 투여된 시험 백신의 세포성 면역반응을 분석하기 위하여 2회 면역투여 완료 후 2주차에 마우스로부터 비장을 적출하여 전체 비장세포(splenocyte)를 분리한 후, ELISPOT 방법을 사용하여 분석하였다.

마우스모델에서의 재조합 코로나 단백질과 아쥬반트로 사용한 리포펩타이드 Pam3CKS4와 폴리(I:C)의 중량비에 따른 세포성 면역반응 유도를 비교한 결과를 도 11에 나타냈다.

도 11에 나타낸 바와 같이, Pam3CSK4와 폴리(I:C)의 중량비를 1.25 : 1로 제조한 L-pampo가 포함된 실험군이 다른 중량비의 L-pampo가 포함된 실험군에 비해 가장 높은 가장 많은 IFN-γ spot 형성이 유도되었다.

따라서, 상기 [실시예 3]의 결과로부터, 리포펩타이드인 Pam3CSK4와 폴리(I:C)를 포함하는 본 발명 아쥬반트 L-pampo는 리포펩타이드인 Pam3CSK4 또는 폴리(I:C) 중 하나만 포함된 백신 조성물에 비하여 높은 면역 효능을 보이며, 특히 Pam3CSK4와 폴리(I:C)의 중량비를 1.25 : 1로 제조한 L-pampo가 포함된 백신 조성물에서 가장 강력한 면역 효능을 보이는 코로나-19 백신 조성물임을 확인하였다.

[실시예 4] 리포펩타이드 종류에 따른 코로나-19 백신 효능 확인

실시예 4-1. 시험 백신의 제조 및 투여

시험 백신은 코로나-19의 남아공 변이 항원인 3.65 ㎍의 RBD 항원과 본 발명 아쥬반트 L-pampo의 구성성분인 폴리(I:C) 20 ㎍와 Pam3CSK4, Dhc-SK4, Pam-Dhc-SK4, Pam-CSK4, Pam2Cys-SK4, PHC-SK4 및 FSL-1 등의 다양한 리포펩타이드를 각각 25 ㎍ 포함하도록 제조하였다.

실시예 4-2. 항원특이적인 항체가 분석

상기 실시예 4-1의 방법으로 제조 및 투여된 시험 백신의 항원특이적인 항체 유도 효능을 분석하기 위하여, 2회 면역투여 2주 후에 혈청(serum)을 분리하여 항원특이적인 항체 형성을 ELISA법으로 분석하여 항체가를 결정하였다.

마우스모델에서의 재조합 코로나 단백질과 아쥬반트 L-pampo의 리포펩타이드 종류에 따른 항체가 유도를 비교한 결과를 도 12에 나타냈다.

도 12에 나타낸 바와 같이, 다양한 리포펩타이드와 폴리(I:C)를 포함한 아쥬반트 L-pampo의 실험군 모두 항원단독 실험군보다 높은 항체가를 나타내었다. 그 중 Pam3CSK4, PHC-SK4 또는 FSL-1 리포펩타이드로 제조한 L-pampo가 포함된 실험군이 다른 리포펩타이드로 제조된 L-pampo 실험군보다 높은 항체가 형성을 유도하는 것을 확인하였다.

실시예 4-3. 중화항체 유도 분석

상기 실시예 4-1의 방법으로 제조 및 투여된 시험 백신의 중화항체 유도를 분석하기 위하여 2회 면역투여 완료 후 2주차에 마우스 혈청을 분리하여, ACE2 수용체와 RBD 단백질의 결합 억제 방법을 사용하여 분석하였다.

마우스모델에서의 재조합 코로나 단백질과 아쥬반트 L-pampo의 리포펩타이드 종류에 따른 중화항체 유도를 비교한 결과를 도 13에 나타냈다.

도 13에 나타낸 바와 같이, 다양한 리포펩타이드와 폴리(I:C)를 포함한 아쥬반트 L-pampo의 실험군 모두 항원단독 실험군보다 모두 높은 ACE2 수용체와 RBD 단백질의 결합을 억제하는 항체가를 보였다. 그 중 Pam3CSK4, PHC-SK4 또는 FSL-1 리포펩타이드로 제조한 L-pampo가 포함된 실험군이 다른 리포펩타이드로 제조된 L-pampo가 포함된 실험군보다 높은 ACE2 수용체와 RBD 단백질의 결합을 억제하는 항체를 유도함으로써 강력한 중화항체 유도 효능을 확인하였다.

실시예 4-4. 세포성 면역반응 분석

상기 실시예 4-1의 방법으로 제조 및 투여된 시험 백신의 세포성 면역반응을 분석하기 위하여 2회 면역투여 완료 후 2주차에 마우스로부터 비장을 적출하여 전체 비장세포(splenocyte)를 분리한 후, ELISPOT 방법을 사용하여 분석하였다.

마우스모델에서의 재조합 코로나 단백질과 아쥬반트 L-pampo의 리포펩타이드 종류에 따른 세포성 면역반응 유도를 비교한 결과를 도 14에 나타냈다.

도 14에 나타낸 바와 같이, 다양한 리포펩타이드와 폴리(I:C)를 포함한 아쥬반트 L-pampo의 실험군 모두 항원단독 실험군보다 많은 IFN-γ spot 형성이 유도되었으며, Pam2Cys-SK4를 제외한 다른 리포펩타이드로 제조된 L-pampo를 포함한 실험군 모두 많은 IFN-γ spot 형성이 유도되었다.

따라서, 상기 [실시예 4]의 결과로부터, 다양한 리포펩타이드와 폴리(I:C)를 포함하는 본 발명 아쥬반트 L-pampo는 높은 면역 효능을 보이며, 특히 Pam3CSK4, PHC-SK4 및 FSL-1 리포펩타이드로 제조한 L-pampo가 포함된 백신 조성물에서 가장 강력한 면역 효능을 보이는 코로나-19 백신 조성물임을 확인하였다.

Claims

코로나바이러스의 항원(Antigen) 및
리포펩타이드 및 폴리(I:C)를 포함하는 백신 아쥬반트를 포함하는,
코로나바이러스감염증-19 (Coronavirus disease 2019, COVID-19)의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 코로나바이러스의 항원(Antigen)은,
신종 코로나바이러스(2019 novel coronavirus, 2019-nCoV) 항원인 것을 특징으로 하는, 코로나바이러스감염증-19의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 리포펩타이드는 Pam3Cys-SKKKK, PHC-SKKKK, Ole2PamCys-SKKKK, Pam2Cys-SKKKK, PamCys(Pam)-SKKKK, Ole2Cys-SKKKK, Myr2Cys-SKKKK, PamDhc-SKKKK, PamCSKKKK 및 Dhc-SKKKK로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 코로나바이러스감염증-19의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 리포펩타이드 및 폴리(I:C)는 0.1 내지 10 : 1의 중량비인 것을 특징으로 하는, 코로나바이러스감염증-19의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 백신 조성물은 수용액 제형인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 백신 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및 아쥬반트로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 코로나바이러스감염증-19의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 백신 조성물은 경구, 경피, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내 및 비강 중에서 선택되는 어느 하나의 투여경로를 통해 투여되는 것을 특징으로 하는, 코로나바이러스감염증-19의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 백신 조성물은 신종 코로나바이러스에 대한 방어 면역능을 갖는 것을 특징으로 하는, 코로나바이러스감염증-19의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제1항의 코로나바이러스감염증-19의 예방 또는 치료용 백신 조성물을, 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 신종 코로나바이러스에 대한 면역 반응을 생성하는 방법.
코로나바이러스의 항원(Antigen) 및
리포펩타이드 및 폴리(I:C)를 포함하는 백신 아쥬반트를 포함하는,
코로나바이러스감염증-19 (Coronavirus disease 2019, COVID-19)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.