KR20220056847A - 조작된 종양선택적 단백질 발현 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은 종양선택적 번역을 달성하기 위한 기술을 제공한다. 본 개시내용에 기재된 암 대 정상 세포의 번역 양상을 연구하기 위한 2 개의 상보적인 파이프라인의 사용은 암 세포 특이적 단백질 발현을 위한 합성 DNA 또는 mRNA 작제물을 조작하는데 사용될 수 있는 종양선택적 서열 모티프의 식별을 가능하게 한다. 본 개시내용은 종양선택적 모티프의 특징을 설명하고, 높은 치료적 관심의 페이로드를 코딩하는데 사용될 수 있는 모듈식 종양선택적 작제물 설계의 실시양태를 제공한다.

Description

조작된 종양선택적 단백질 발현

관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 2019 년 6 월 21 일자로 출원된 미국 가특허출원 제62/864,673호에 대한 우선권을 주장하며, 그 전체 내용은 본원에 참조로 원용된다.

암 치료를 위한 개선된 요법을 개발할 필요가 있다. 암세포를 특이적으로 표적화하는 맞춤형 요법은 독특한 치료 옵션의 기회를 제공할 수 있다.

요약

본 발명은 번역가능한 핵산 서열의 종양선택적 발현을 달성하는 기술을 제공한다.

치료적 목적을 위한 핵산 전달은 급성장하고 있는 강력한 분야이다. 특히 번역가능한 RNA 분자 (예컨대, mRNA)를 포함하는 핵산의 전달을 안정화 및/또는 이를 수행하기 위한 기술과 구체적으로 관련하여 이 분야에서 유의한 진전이 최근에 이루어졌다.

무엇보다도, 본 개시내용은 미국 식품의약국 (FDA)에 의한 RNA 치료제의 최초 시판 승인을 비롯하여 이러한 우수한 발달 등에도 불구하고 종양선택성이 여전히 도전 과제로 남아 있다는 통찰력을 제공한다. 본 개시내용은 번역가능한 RNA (예컨대, mRNA)이거나 이를 전달하는 것들을 포함하는 핵산의 종양선택적 번역을 달성하기 위한 기술을 제공한다. 무엇보다도, 본 개시내용에 의해 달성된 종양선택성은 이러한 종양선택성 없이 이용가능하지 않고/않거나 권장되지 않는 (예컨대, 허용할 수 없는 위험 프로파일과 연관된) 특정 치료적 전략 (예컨대, 특히 독성 약제를 포함할 수 있음), 예를 들어, 비-종양 세포 및/또는 조직에 또는 상에 하나 이상의 바람직하지 않은 영향을 미칠 수 있는 전략의 사용을 허용한다.

본 개시내용은 (예컨대, mRNA에서) 번역가능한 핵산 서열의 종양선택적 발현을 달성하는 기술을 제공한다. 무엇보다도, 본 개시내용은 번역가능한 핵산 (예컨대, mRNA)에 포함될 때 하나 이상의 코딩된 생성물의 종양선택적 발현을 달성하는 서열 모티프를 정의한다. 특히, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 종양선택적 판독-초과 모티프를 제공한다.

본 개시내용은 연구에서 종양 발달 및/또는 진행과 연관된 리보솜 구조 및 기능의 변경이 점점 더 밝혀짐을 이해하고 있다. 예를 들어, Bastide and David Oncogenesis 2018 Apr 7(4):34 참고. 본 개시내용은 이러한 리보솜 변경이 암 요법을 개선하기 위해 이용될 수 있음을 추가로 이해하고 있다. 무엇보다도, 본 개시내용은 종양선택적 번역 판독-초과가 번역 생성물 (예컨대, 폴리펩티드)의 종양선택적 발현 및/또는 활성을 달성하기 위해 활용될 수 있음을 교시한다.

본 개시내용은 종양선택적 번역 서열 요소, 예를 들어, 종양선택적 판독-초과 모티프를 정의하기 위한 기술을 제공하고, 또한 정의된 이러한 종양선택적 번역 서열 요소를 제공한다. 또한, 본 개시내용은 암세포를 표적화하도록 의도된 페이로드의 종양선택적 발현 및/또는 활성을 (예컨대, 종양선택적 전달 및/또는 발현을 통해) 달성하는 것을 목표로 하는 기존 기술과 관련된 다양한 통찰력을 제공한다.

예를 들어, 본 개시내용은 "종양선택적" 또는 "암 세포 특이적"으로서 기재된 많은 기술이 종종 암 및 비-암 상황 사이에 적당한 구별만을 달성한다는 것을 이해하고 있다. 예를 들어, Wroblewska et al.은 세포내 miR-21 수준이 높고 miR-141, miR-142 (3p) 및 miR-146a 수준이 낮을 때 활성화되는 mRNA 회로를 사용하였으며, HEK293 세포에 비해 HeLa 세포에서 단지 대략 6-배 더 높은 생체외 세포 살해를 수득하였다 (Nat Biotechnol. 2015 Aug;33(8):839-41). 마찬가지로, Jain et al., 2018 (Nucleic Acid Ther. 2018 Oct 1; 28(5): 285 96.)은 miR-122 및 miR-142 표적 부위 삽입을 사용하여, 생체내 mRNA 활성을 각자, 간 및 비장에서 89% 및 85% 저하시켰다 (~6-10 배 감소에 상응함). 그러나, 종양내 주사될 때 miRNA 표적 부위가 삽입된 mRNA의 유의한 부분이 종양 침윤 면역 세포를 포함하는 건강한 세포에 의해 흡수되는 것으로 또한 나타났다 (Hewitt et al., Sci Transl Med. 2019 Jan 30;11(477)). 면역 세포에서의 이러한 활성은 세포 살해 단백질을 코딩하는 mRNA의 면역-종양학 응용에 역효과를 낼 수 있다.

본 개시내용은 특히 번역 판독-초과에 기여할 수 있는 서열 요소를 평가하기 위한 특정 기존 기술의 문제의 원인을 식별한다. 무엇보다도, 리보솜 프로파일링은 번역 판독-초과를 추론하는 데 사용되어 왔다. 그러나, 리보솜 프로파일링은 리보솜을 저속화하거나 멈추게 하는 RNA 서열 및 구조에 대한 편향을 갖는다. 따라서, 이러한 이벤트는 과잉표현될 수 있으며, 단독으로 사용할 경우 판독-초과의 효율성의 부정확한 결정을 초래할 수 있다. 반면에, LC/MS 기반 프로테오믹스 접근법은 RNA 수준 인공물이 없지만, 낮은 날림성 (즉, 이온화, 전달 및 검출의 낮은 효율성) 또는 풍부도를 가진 펩티드를 놓칠 수 있기 때문에 높은 위음성 비율을 갖는다. 따라서, 본 개시내용은 무엇보다도, 번역 판독-초과에 기여할 수 있는 서열 요소를 평가하기 위한 기술의 신규한 사용을 기재한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 번역이 적절한 비교가능한 비-암 세포(들)와 비교하여 암 세포(들)에서 가급적 발생할 때 번역을 "종양선택적"인 것으로 간주한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 번역은 적절한 비교가능한 비-암 세포와 비교하여 암 세포(들)에서 2 (2)-배 이상 더 높은 것으로 관찰될 때 종양선택적인 것으로 간주될 수 있으며; 일부 실시양태에서, 종양선택적 번역은 적절하게 비교가능한 비-암 세포와 비교하여 암 세포(들)에서 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 배 이상 또는 그 초과-배 더 높을 수 있다.

일부 실시양태에서, 종양선택적 번역은 (예컨대, 번역이 적절한 비교가능한 비-암 세포(들)에서 검출가능하지 않지만, 관련 암 세포(들)에서 검출가능할 때) 종양특이적인 것으로 간주될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 뉴클레오티드 서열이 종양선택적 번역 서열 요소인 (또는 이의 상보체인) 서열 요소를 포함하는 조작된 핵산을 제공한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 종양선택적 번역 서열 요소를 포함하고/하거나 페이로드 서열의 종양선택적 번역을 나타내는 번역가능한 핵산 (예컨대, RNA, 구체적으로 mRNA)이거나 이를 전달하는 기술을 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 뉴클레오티드 서열이 종양선택적 번역 서열 요소이거나 이의 상보체인 서열 요소를 포함하는 조작된 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조작된 핵산의 뉴클레오티드 서열은 개방 판독 프레임 또는 이의 상보체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양선택적 번역 서열 요소는 개방 판독 프레임 내 또는 업스트림에서 종양선택적 판독-초과 모티프이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양선택적 판독초과 모티프는 업스트림 플랭킹 서열, 정지 코돈 및 다운스트림 플랭킹 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 종양선택적 판독초과 모티프는 판독초과 정지 코돈 및 다운스트림 플랭킹 서열의 처음 14 개의 뉴클레오티드에 걸쳐 있는 영역 내에서, VNNNNNNMNNMWK, NNNVWNNKGHHNH, DVHVNNNCWNNNB, MWBNNNNNNNNNN, WGNNSNHNHDNNN, VNNNNNNMNNMWK 또는 VMNNWNKNNNNNN을 포함하는 군으로부터 선택된 서열을 포함하며, 여기서 V는 A, C 또는 G를 나타내고, M은 A 또는 C를 나타내고, W는 A 또는 T/U를 나타내고, K는 G 또는 T/U를 나타내고, H는 A, C 또는 T/U를 나타내고, D는 A, G 또는 T/U를 나타내고, B는 C, G 또는 T/U를 나타내고, S는 G 또는 C를 나타내고, N은 임의의 뉴클레오티드를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 종양선택적 판독 초과 모티프는 스템 루프; 다운스트림 플랭킹 서열의 처음 50 개의 뉴클레오티드 및 바람직하게는 정지 코돈 및 다운스트림 플랭킹 서열의 처음 16 개의 뉴클레오티드 내에 위치한 이 스템 루프의 일부, 또는 이들의 조합 내의 벌지 루프, 유사매듭 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 스템 루프는 다운스트림 플랭킹 서열의 처음 50 개의 뉴클레오티드 내에 20 개 초과의 염기쌍 뉴클레오티드를 포함한다.

일부 실시양태에서, 종양선택적 판독 초과 모티프는 42% 초과, 48% 초과, 바람직하게는 54% 초과의 GC 함량을 갖는 다운스트림 플랭킹 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양선택적 판독 초과 모티프는 프롤린 잔기를 코딩하는 코돈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 핵산의 개방 판독 프레임은 자살 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 조작된 핵산은 저하된 면역원성을 갖는다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열이 개방 판독 프레임, 또는 이의 상보체를 포함하는 핵산을 제공하며, 이 핵산 안에 또는 그 이전에 종양선택적 판독-초과 모티프가 조작되고, 여기서 개방 판독 프레임은 자살 단백질, 세포 표면 항원, 항체 약제, 독소, 유전자 변형 단백질 또는 바이러스 복제 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 페이로드 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 뉴클레오티드 서열이 종양선택적 번역 서열 요소이거나 이의 상보체인 서열 요소를 포함하는 조작된 핵산을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 나노입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 핵산은 세포에서 발현되어, 약학 조성물의 투여가 세포에 RNA를 전달하도록 한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 방법은 뉴클레오티드 서열이 종양선택적 번역 서열 요소이거나 이의 상보체인 서열 요소를 포함하는 조작된 핵산 또는 조작된 핵산을 포함하는 약학 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료되는 대상체의 암은 종양원성 리보솜을 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양원성 리보솜은 p53 활성의 손실, RB 활성의 손실, FBL 과발현 또는 리보솜 단백질 유전자의 반접합 손실 중 하나 이상을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 판독-초과 컨센서스 서열, 높은 G-C 함량을 갖는 서열; 코돈 코딩 프롤린; 스템 루프; 벌지 루프, 유사매듭 또는 이들의 조합을 포함하는 종양선택적 번역 서열 요소를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 전사체-전반의 번역체 분석을 포함하는 종양-선택적 핵산 서열을 식별하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 개방 판독 프레임 내에 또는 이전에 판독초과 모티프를 삽입함으로써 종양선택적 핵산을 조작하는 방법을 제공한다.

도 1은 예시적인 종양-선택적 판독초과 모티프의 개략도이다. 각각의 모티프는 업스트림 플랭킹 서열, 정지 코돈 및 다운스트림 플랭킹 서열을 포함한다. 업스트림 플랭킹 서열 (대략 60 개의 뉴클레오티드)은 코돈의 3^번째 (워블) 위치 내에서 높은 GC 함량을 갖는다. 다운스트림 플랭킹 서열 (대략 50 개의 뉴클레오티드)은 높은 GC 함량, 처음 10-12 개의 뉴클레오티드 내의 선형 컨센서스 서열 및 스템 루프 구조 (또는 다른 안정한 RNA 구조)를 갖는다.
도 2는 U1n 내지 U10n의 작제물 맵이다. 각각의 작제물은 7-메틸구아노신 캡, 5'UTR, 코딩 영역, 3'UTR 및 폴리-A 꼬리 (전사-후 첨가됨)를 함유한다. 코딩 영역은 시작 코돈 (ATG/AUG), 판독초과 (RT) 모티프, 자가-절단 펩티드 및 제1 ATG/AUG가 결여된 나노루시퍼라제 코딩 영역 (개방 판독 프레임)을 포함한다. 이 모듈식 설계는 벡터 백본 및 RT 모티프를 보존하면서 코딩된 유전자의 신속한 교체를 허용한다.
도 3은 테스트된 작제물의 번역 활성을 도시한다. 건강한 (HUVEC) 및 암 (NCI-H1299) 세포는 형질주입 24 시간 전에 씨딩된다. 리포펙타민 제형화된 작제물 (U1n-U10n)은 실온에서 15 분 동안 항온처리한 다음, 세포 배양 배지에 첨가된다. 나노루시퍼라제 활성은 16 시간 후에 측정된다. 형질주입은 삼중으로 수행되고, 데이터는 평균 +/- SD로서 도시된다.
도 4는 예시적인 판독초과 모티프의 이차 구조를 도시한다. U2n 작제물의 정지 코돈을 둘러싼 판독초과 모티프는 내부 루프 및 벌지를 갖는 큰 스템 루프 구조를 포함한다.
도 5는 Onco-333의 작제물 맵이다. Onco-333의 설계는 캡 구조, 5'UTR 서열, 판독초과 모티프를 함유하는 반딧불이 루시퍼라제 (fLuc) 코딩 영역, 3'UTR 서열 및 폴리-A 꼬리 (전사후 첨가됨)를 포함한다.
도 6은 Onco-333 mRNA의 생체외 테스트를 도시한다. Onco-333 mRNA는 건강한 세포 (BJ 섬유아세포), 형질전환된 세포 (Rb 및 p53 기능을 억압하는 Ad E1A 및 E1B를 발현하는 HEK293 세포) 및 백혈병 세포 (K562)로 형질주입되어, 건강한 세포에서 fLuc 활성이 검출가능하지 않음을 입증한다. 루시퍼라제 활성은 Bright Glo 검정 (Promega)로 측정된다. 형질주입은 삼중으로 수행되고, 데이터는 평균 +/- SD로서 묘사된다.
도 7은 Onco-333 mRNA의 생체내 테스트를 도시한다. Onco-333 mRNA 및 야생형 mRNA (대조군 mRNA)는 TransIT mRNA 시약으로 제형화되고, 건강한 C57/Bl6 마우스에 (I.V.) 주사된다. 24 시간 후 fLuc 활성 수준을 엑스 비보에서 간, 비장, 골수 (BM) 및 폐 조직 균질물에서 측정하여, Onco-333이 생체내에서 또한 종양-선택적임을 입증한다 (그룹당 n=3).
도 8은 인간 및 마우스 백혈병 및 TP53 돌연변이를 포함하는 폐암 세포주에서의 Onco-333 활성을 도시한다. 뮤린 비-소세포 폐암 세포 (LL/2), 인간 비-소세포 폐암 세포 (NCI-H1299), 인간 급성 골수 백혈병 (HL-60), 뮤린 급성 골수 백혈병 (C1498) 세포는 Onco-333 mRNA로 형질주입되고, fLuc 활성은 24 시간 후에 측정된다. (실험은 삼중으로 수행되며, 데이터는 평균 +/- SD로서 도시된다). TP53의 돌연변이 상태는 다음과 같다: LL2: c.G1001C:p.R334P, H1299: 동형접합성 c.(del), HL60: 동형접합성 c.(del).
도 9는 판독초과 전사물의 3'UTR 서열 내에서 발견되는 서열 특징의 분석을 입증한다. 건강한 및 암 RT 전사물은 위치 가중치 매트릭스 (PWM)를 사용하여 분석되며, 이는 서열 특징이 동일한 정확한 뉴클레오티드 위치에 위치한다고 가정한다. 분석적 전경은 RT 전사물의 3'UTR으로부터의 처음 120 개의 뉴클레오티드를 함유하고, 배경은 인간 전사체의 3'UTR으로부터의 처음 120 개의 뉴클레오티드의 나머지를 함유한다. 정지 코돈 (amber, ochre 및 opal)은 완벽하게 정렬되었다. 추가로, RT mRNA 전사물의 3'UTR 서열의 처음 120 개의 뉴클레오티드의 분석은 GC 풍부 서열을 나타낸다. 적색 수평선은 과잉 또는 과소 표현에 대한 p<0.05 유의선이다. 왼쪽에 도시된 바와 같이, 건강한 RT 전사물은 유의한 경향을 갖지 않는다. 반면에, 암 전사물은 처음 48-50 개의 뉴클레오티드 내에서 G-C 과잉표현 및 AU 과소표현을 갖는다.
도 10은 판독초과 전사물의 코딩 영역 서열 내에서 발견되는 서열 특징의 분석을 입증한다. 3'UTR의 초기 영역 외에도, 암 RT 전사물의 코딩 서열 (CDS) 영역의 마지막 뉴클레오티드는 또한 건강한 RT 전사물에서 관찰되지 않는 일부 차별적인 경향을 갖는다. 도시된 바와 같이, TAG 및 TGA 정지 코돈을 갖는 암 특이적 RT 전사물은 워블 염기에서 G/C 뉴클레오티드의 과잉표현을 갖는다. 더 강한 이차 구조는 더 높은 G/C 뉴클레오티드 함량을 필요로 하나, 코딩 영역은 대부분의 코돈에서 처음 두 위치가 고정되어 있는 올바른 단백질을 코딩하기 위한 코돈 제약을 갖는다.
도 11은 염기쌍 커버리지 분석을 입증한다. RNA 모티프의 이차 구조를 분석하기 위해, 암 RT 및 건강한 RT 전사물을 Co-fold 알고리즘을 통해 전체 mRNA로서 폴딩하였다. 암 및 건강한 RT 전사물에 대한 정지 코돈 (정지 코돈을 포함하는 CDS의 100 개의 뉴클레오티드, 3'UTR의 100 개의 nt) 주변 영역의 점 괄호 표기법을 추출하였다. 커버리지 분석은 각각의 뉴클레오티드 위치 (x-축)에 걸쳐 아치형 (arching)을 이루는 염기쌍 (y-축)의 수를 식별함으로써 수행된다. 주황색 선은 건강한 상태를 나타내고, 청색 선은 암 RT 전사물을 나타낸다. 이 분석은 정지 코돈 판독초과가 정지 코돈 주변에 더 구조화된 영역을 필요로 함을 도시한다. 정지 코돈은 X 축 상의 위치 2-4에 위치한다. 암 전사물은 정지 코돈 및 3'UTR의 처음 16 개의 뉴클레오티드 주변에 더 구조화되어 있다.
도 12 및 13은 종양-선택적 판독초과 전사물 내의 선형 컨센서스 서열을 도시한다. ochre를 포함하는 건강한 및 암 RT 전사물의 3'UTR 영역의 처음 13 개의 뉴클레오티드는 서열 특징이 동일한 정확한 뉴클레오티드 위치에 위치한다고 가정하지 않는 GLAM2 (모티프의 갭이 있는 국소 정렬)를 통해 분석된다. 이 분석은 다음의 컨센서스 서열을 나타내며: VNNNNNNMNNMWK, NNNVWNNKGHHNH, DVHVNNNCWNNNB, MWBNNNNNNNNNN, WGNNSNHNHDNNN, VNNNNNNMNNMWK 또는 VMNNWNKNNNNNN, 여기서 V는 A, C 또는 G를 나타내며, M은 A 또는 C를 나타내며, W는 A 또는 T/U를 나타내며, K는 G 또는 T/U를 나타내며, H는 A, C 또는 T/U를 나타내며, D는 A, G 또는 T/U를 나타내며, B는 C, G 또는 T/U를 나타내며, S는 G 또는 C를 나타내며, N은 임의의 뉴클레오티드를 나타낸다.
도 14 및 15는 딥 러닝을 사용하여 상이한 정지 코돈을 갖는 종양-선택적 판독초과 전사물의 비교 분석을 입증한다. 피드포워드 딥 신경망 (완전히 연계된 자동인코더) 모델은 UAG (Amber), UAA (Ochre) 및 UGA (Opal) 코돈 이후의 판독초과 서열의 유사성을 분석하기 위해 암 판독초과 전사물의 3'UTR 영역의 처음 13 개의 뉴클레오티드로 구축되고 훈련된다. 이어서, 본 발명자들은 기본 구성요소 분석으로부터 2-D 및 3-D 이미지를 생성하며, 이는 UGA가 확산된 표현을 갖는 반면 Amber 및 ochre 전사물은 잠재 공간에서 매우 빽빽한 클러스터를 가지고 있음을 도시한다. 이는 문헌에 보고된 정지 코돈의 효율성과 상관관계가 있다.
도 16은 열 민감성 SV40 큰 T-항원을 통한 p53 억제가 있거나 없는 세포에서 Onco-333 활성을 추가로 입증한다. 32⁰C에서 성장한 세포는 p53 활성을 억제하는 기능적 SV40을 가지고 있으며, p53 억제를 해제하는 39⁰C에서 성장한 세포에 비해 높은 Onco-333 발현을 갖는다.
도 17a 및 17b는 본 개시내용에 기재된 종양선택적 모티프를 사용하여 2 개의 리포터 페이로드의 종양선택적 발현을 추가로 입증한다.

정의

투여 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "투여"는 전형적으로 대상체 또는 시스템에 대한 조성물의 투여를 지칭한다. 당업자는 적절한 상황에서 대상체, 예를 들어, 인간에 투여하기 위해 활용될 수 있는 다양한 경로를 인지할 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 투여는 전신적 또는 국소적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 경장 또는 비경구일 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 주사 (예컨대, 근육내, 정맥내 또는 피하 주사)에 의한 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 주사는 볼루스 주사, 점적, 관류 또는 주입을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서 투여는 국부적일 수 있다. 당업자는 예를 들어, 귀내 (귀), 협측, 결막, 피부, 치아, 자궁경부, 부비동내, 기관내, 경장, 경막외, 양막외, 체외, 간질, 복강내, 양막내, 동맥내, 관절내, 담즙내, 기관지내, 윤활낭내, 심장내, 연골내, 미추내, 해면내, 강내, 대뇌내, 수조내, 각막내, 치관내, 해면체내, 피내, 디스크내, 관내, 십이지장내, 경막내, 표피내, 식도내, 위내, 치은내, 병변내, 관강내, 림프내, 골수내, 수막내, 근육내, 안구내, 난소내, 심낭내, 복강내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 부비강내(intrasinal), 척수내, 활막내, 건내, 고환내, 척수강내, 흉곽내, 세관내, 종양내, 고실내, 자궁내, 혈관내, 정맥내, 정맥내 볼루스, 정맥내 점적, 뇌실내, 유리체내, 후두, 비강, 비위, 안과, 경구, 구인두, 비경구, 경피, 관절주위, 경막주위, 회음부, 치주, 직장, 호흡기 (예컨대, 흡입), 구후부, 연조직, 지주막하, 결막하, 피하, 설하, 점막하, 국부, 경피, 경점막, 태반, 경기관, 요관, 요도 또는 질을 포함하는 www.fda.gov에 나열된 것들 중에서 본원에 기재된 특정 요법과 함께 사용하기 위한 적절한 투여 경로를 인지할 것이다. 일부 실시양태에서, 투여는 전기-삼투, 혈액투석, 침윤, 이온삼투, 관개 및/또는 폐쇄 드레싱을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 간헐적 (예컨대, 시간상 분리된 복수의 용량) 및/또는 주기적 (예컨대, 공통 기간으로 분리된 개별 용량) 투약인 투약을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 연속 투약을 포함할 수 있다.

약제 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약제"는 예를 들어, 소분자, 폴리펩티드, 핵산, 당류, 지질, 금속, 또는 이들의 조합 또는 복합체를 포함하는 화합물, 분자 또는 임의의 화학 부류의 엔티티를 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 용어 "약제"는 중합체를 포함하는 화합물, 분자 또는 엔티티를 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 용어는 하나 이상의 중합체성 모이어티를 포함하는 화합물 또는 엔티티를 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 용어 "약제"는 특정 중합체 또는 중합체성 모이어티가 실질적으로 없는 화합물, 분자 또는 엔티티를 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 용어는 임의의 중합체 또는 중합체성 모이어티가 결여되거나 실질적으로 없는 화합물, 분자 또는 엔티티를 지칭할 수 있다.

아미노산 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산"은 예컨대, 하나 이상의 펩티드 결합의 형성을 통해 폴리펩티드 쇄에 통합될 수 있는 임의의 엔티티를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 아미노산은 일반 구조 H₂N-C(H)(R)-COOH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 아미노산은 자연-발생 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 아미노산은 비-자연 아미노산이고; 일부 실시양태에서, 아미노산은 D-아미노산이고; 일부 실시양태에서, 아미노산은 L-아미노산이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "표준 아미노산"은 자연 발생 펩티드에서 일반적으로 발견되는 20 개의 L-아미노산 중 임의의 것을 지칭한다. "비표준 아미노산"은 자연 공급원에서 발견될 수 있는지 여부에 관계없이 표준 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드에서의 카복시- 및/또는 아미노-말단 아미노산을 포함하는 아미노산은 위의 일반 구조와 비교하여 구조적 변형을 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 아미노산은 일반 구조와 비교하여 (예컨대, 아미노 기, 카복실산 기, 하나 이상의 양성자 및/또는 하이드록실 기의) 메틸화, 아미드화, 아세틸화, 페길화, 글리코실화, 인산화 및/또는 치환에 의해 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 변형은 예를 들어, 달리 동일한 비변형 아미노산을 함유하는 것과 비교하여 변형된 아미노산을 함유하는 폴리펩티드의 안정성 또는 순환 반감기를 변경할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 변형은 달리 동일한 비변형 아미노산을 함유하는 것과 비교하여 변형된 아미노산을 함유하는 폴리펩티드의 관련 활성을 유의하게 변경하지 않는다. 문맥으로부터 명백해질 바와 같이, 일부 실시양태에서, 용어 "아미노산"은 유리 아미노산을 지칭하기 위해 사용될 수 있으며; 일부 실시양태에서 이는 폴리펩티드의 아미노산 잔기, 예컨대, 폴리펩티드 내의 아미노산 잔기를 지칭하기 위해 사용될 수 있다.

항체 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 특정 표적 항원에 대한 특이적 결합을 부여하기에 충분한 표준 면역글로불린 서열 요소를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 당업계에 알려진 바와 같이, 자연에서 생산된 온전한 항체는 일반적으로 "Y-자형" 구조로서 지칭되는 것으로 서로 회합하는 2 개의 동일한 중쇄 폴리펩티드 (각각 약 50 kD) 및 2 개의 동일한 경쇄 폴리펩티드 (각각 약 25 kD)로 구성된 대략 150 kD 사량체 약제이다. 각각의 중쇄는 4 개 이상의 도메인 (각각 약 110 개의 아미노산 길이)- 아미노-말단 가변 (VH) 도메인 (Y 구조의 끝에 위치됨) 뒤에 이어지는 3 개의 불변 도메인: CH1, CH2 및 카복시-말단 CH3 (Y 스템의 염기에 위치됨)으로 구성되어 있다. "스위치"로서 알려진 짧은 영역은 중쇄 가변 영역 및 불변 영역을 연계한다. "힌지"는 CH2 및 CH3 도메인을 나머지 항체에 연계한다. 이 힌지 영역에서의 2 개의 이황화 결합은 온전한 항체에서 2 개의 중쇄 폴리펩티드를 서로 연계한다. 각각의 경쇄는 2 개의 도메인 - 다른 "스위치"에 의해 서로 분리된, 아미노-말단 가변 (VL) 도메인 뒤에 이어지는 카복시-말단 불변 (CL) 도메인으로 구성된다. 온전한 항체 사량체는 중쇄 및 경쇄가 단일 이황화 결합에 의해 서로 연결된 2 개의 중쇄-경쇄 이합체로 구성되고; 2 개의 다른 이황화 결합은 중쇄 힌지 영역을 서로 연계하여, 이합체를 서로 연계하고 사량체를 형성한다. 자연-생산된 항체는 또한 전형적으로 CH2 도메인에서 글리코실화된다. 자연 항체의 각각의 도메인은 압축된 역평행 베타 배럴에서 서로에 대해 패킹된 2 개의 베타 시트 (예컨대, 3-, 4- 또는 5-가닥 시트)로부터 형성된 "면역글로불린 폴딩"을 특성화하는 구조를 가지고 있다. 각각의 가변 도메인은 "보체 결정 영역" (CDR1, CDR2 및 CDR3)으로서 알려진 3 개의 초가변 루프 및 4 개의 다소 불변성인 "프레임워크" 영역 (FR1, FR2, FR3 및 FR4)을 함유한다. 자연 항체가 폴딩될 때, FR 영역은 도메인의 구조적 프레임워크를 제공하는 베타 시트를 형성하고, 중쇄 및 경쇄 둘 모두로부터의 CDR 루프 영역은 3-차원 공간에서 함께 모여, Y 구조의 끝에 위치한 단일 초가변 항원 결합 부위를 생성한다. 자연-발생 항체의 Fc 영역은 보체 시스템의 요소에 결합하고, 또한 예를 들어, 세포독성을 매개하는 효과기 세포를 포함하는 효과기 세포 상의 수용체에 결합한다. 당업계에 알려진 바와 같이, Fc 수용체에 대한 Fc 영역의 친화도 및/또는 기타 결합 속성은 글리코실화 또는 다른 변형을 통해 조정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따라 생산 및/또는 활용되는 항체는 이러한 글리코실화가 변형되거나 조작된 Fc 도메인을 비롯한 글리코실화된 Fc 도메인을 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, 특정 실시양태에서, 자연 항체에서 발견되는 충분한 면역글로불린 도메인 서열을 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 복합체는 이러한 폴리펩티드가 자연적으로 생산 (예컨대, 항원에 반응하는 유기체에 의해 생성)되는지, 또는 재조합 공학, 화학 합성 또는 기타 인공 시스템 또는 방법론에 의해 생산되는지 여부에 상관없이 "항체"로 지칭되고/되거나 이로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 다클론성이며; 일부 실시양태에서, 항체는 단클론성이다. 일부 실시양태에서, 항체는 마우스, 토끼, 영장류 또는 인간 항체의 특성화인 불변 영역 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체 서열 요소는 당업계에 알려진 바와 같이 인간화, 영장류화, 키메라화 등이다. 더욱이, 본원에 사용된 용어 "항체"는 적절한 실시양태에서 (달리 언급되거나 문맥으로부터 명백하지 않는 한) 대안적 제시에서 항체의 구조적 및 기능적 특징을 활용하기 위한 당업계에 알려지거나 개발된 작제물 또는 형식 중 임의의 것을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 실시양태에서, 본 발명에 따라 활용되는 항체는 비제한적으로 온전한 IgA, IgG, IgE 또는 IgM 항체; 이중- 또는 다중- 특이적 항체 (예컨대, 자이바디(Zybodies)® 등); 항체 단편, 예컨대, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fd' 단편, Fd 단편, 및 단리된 CDR 또는 이들의 세트; 단일 쇄 Fv; 폴리펩티드-Fc 융합체; 단일 도메인 항체 (예컨대, 상어 단일 도메인 항체, 예컨대, IgNAR 또는 이의 단편); 카멜로이드 항체; 마스킹된 항체 (예컨대, 프로바디(Probodies)®); 소형 모듈형 면역약제 ("SMIPs^TM"); 단일 쇄 또는 탠덤 디아바디 (TandAb®); VHH; 안티칼린(Anticalins)®; 나노바디(Nanobodies)® 미니바디; BiTE®; 안키린 반복 단백질 또는 DARPINs®; 아비머(Avimers)®; DART; TCR-유사 항체, 애드넥틴(Adnectins)®; 아필린(Affilins)®; 트랜스-바디(Trans-bodies)®; 아피바디(Affibodies)®; 트리머X(TrimerX)®; 미세단백질; 파이노머(Fynomers)®, 센티린(Centyrins)®; 및 KALBITOR®로부터 선택된 형식이다. 일부 실시양태에서, 항체는 자연적으로 생산되는 경우 가질 공유 변형 (예컨대, 글리칸의 부착)이 결여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 공유 변형 (예컨대, 글리칸, 페이로드 [예컨대, 검출가능한 모이어티, 치료적 모이어티, 촉매 모이어티 등], 또는 다른 펜던트 기 [예컨대, 폴리-에틸렌 글리콜, 등]의 부착)을 함유할 수 있다.

항체 약제 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체 약제"는 특정 항원에 특이적으로 결합하는 약제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 용어는 특이적 결합을 부여하기에 충분한 면역글로불린 구조적 요소를 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체를 포함한다. 예시적인 항체 약제는 단클론성 항체 또는 다클론성 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체 약제는 마우스, 토끼, 영장류 또는 인간 항체의 특성화인 하나 이상의 불변 영역 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 약제는 당업계에 알려진 바와 같이 인간화, 영장류화, 키메라 등의 하나 이상의 서열 요소를 포함할 수 있다. 많은 실시양태에서, 용어 "항체 약제"는 대안적 제시에서 항체의 구조적 및 기능적 특징을 활용하기 위한 당업계에 알려지거나 개발된 작제물 또는 형식 중 하나 이상을 지칭하기 위해 사용된다. 예를 들어, 실시양태에서, 본 발명에 따라 활용되는 항체 약제는 비제한적으로 온전한 IgA, IgG, IgE 또는 IgM 항체; 이중- 또는 다중- 특이적 항체 (예컨대, 자이바디(Zybodies)® 등); 항체 단편, 예컨대, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fd' 단편, Fd 단편, 및 단리된 CDR 또는 이들의 세트; 단일 쇄 Fv; 폴리펩티드-Fc 융합체; 단일 도메인 항체 (예컨대, 상어 단일 도메인 항체, 예컨대, IgNAR 또는 이의 단편); 카멜로이드 항체; 마스킹된 항체 (예컨대, 프로바디(Probodies)®); 소형 모듈형 면역약제 ("SMIPs^TM"); 단일 쇄 또는 탠덤 디아바디 (TandAb®); VHH; 안티칼린(Anticalins)®; 나노바디(Nanobodies)® 미니바디; BiTE®; 안키린 반복 단백질 또는 DARPINs®; 아비머(Avimers)®; DART; TCR-유사 항체, 애드넥틴(Adnectins)®; 아필린(Affilins)®; 트랜스-바디(Trans-bodies)®; 아피바디(Affibodies)®; 트리머X(TrimerX)®; 미세단백질; 파이노머(Fynomers)®, 센티린(Centyrins)®; 및 KALBITOR®로부터 선택된 형식이다. 일부 실시양태에서, 항체는 자연적으로 생산되는 경우 가질 공유 변형 (예컨대, 글리칸의 부착)이 결여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 공유 변형 (예컨대, 글리칸, 페이로드 [예컨대, 검출가능한 모이어티, 치료적 모이어티, 촉매 모이어티 등] 또는 다른 펜던트 기 [예컨대, 폴리-에틸렌 글리콜 등]의 부착)을 함유할 수 있다. 많은 실시양태에서, 항체 약제는 아미노산 서열이 상보성 결정 영역 (CDR)으로서 당업자에 의해 인식되는 하나 이상의 구조적 요소를 포함하는 폴리펩티드이거나 이를 포함하며; 일부 실시양태에서 항체 약제는 아미노산 서열이 참조 항체에서 발견되는 것과 실질적으로 동일한 하나 이상의 CDR (예컨대, 하나 이상의 중쇄 CDR 및/또는 하나 이상의 경쇄 CDR)을 포함하는 폴리펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서 포함된 CDR은 서열이 동일하거나 참조 CDR과 비교하여 1-5 개 사이의 아미노산 치환을 함유한다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시양태에서 포함된 CDR은 참조 CDR과 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성을 나타낸다는 점에서 실질적으로 동일하다. 일부 실시양태에서 포함된 CDR은 참조 CDR과 96%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 서열 동일성을 나타낸다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시양태에서 포함된 CDR은 포함된 CDR 내의 하나 이상의 아미노산이 참조 CDR과 비교하여 결실, 첨가 또는 치환되지만 포함된 CDR이 참조 CDR의 것과 달리 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시양태에서 포함된 CDR은 포함된 CDR 내의 1-5 개의 아미노산이 참조 CDR과 비교하여 결실, 첨가 또는 치환되지만 포함된 CDR이 참조 CDR에 대해 달리 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시양태에서 포함된 CDR은 포함된 CDR 내의 하나 이상의 아미노산이 참조 CDR과 비교하여 치환되지만 포함된 CDR이 참조 CDR의 것과 달리 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시양태에서 포함된 CDR은 포함된 CDR 내의 1-5 개의 아미노산이 참조 CDR과 비교하여 결실, 첨가 또는 치환되지만 포함된 CDR이 참조 CDR에 대해 달리 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시양태에서, 항체 약제는 아미노산 서열이 면역글로불린 가변 도메인으로서 당업자에 의해 인식되는 구조적 요소를 포함하는 폴리펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 약제는 면역글로불린-결합 도메인과 상동성이거나 대체로 상동성인 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드 단백질이다.

암 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "암"은 세포가 상대적으로 비정상적인, 비제어된 및/또는 자율적인 성장을 나타내어, 비정상적으로 상승된 증식 속도 및/또는 세포 증식의 제어의 유의한 손실로 특성화된 이상 성장 표현형을 나타내는 질환, 장애 또는 병태를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 암은 하나 이상의 종양으로 특성화될 수 있다. 당업자는 예를 들어, 부신겉질 암종, 성상세포종, 기저 세포 암종, 카르시노이드, 심장병, 담관암종, 척색종, 만성 골수증식성 신생물, 두개인두종, 유관 제자리 암종, 뇌실막종, 안내 흑색종, 위장관 카르시노이드 종양, 위장관 간질 종양 (GIST), 임신성 융모성 질환, 신경아교종, 조직구증, 백혈병 (예컨대, 급성 림프아구성 백혈병 (ALL), 급성 골수 백혈병 (AML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 모양세포 백혈병, 골수성 백혈병, 골수 백혈병), 림프종 (예컨대, 버킷 림프종 [비-호지킨 림프종], 피부 T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 균상 식육종, 세자리 증후군, AIDS-관련 림프종, 여포성 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종), 흑색종, 메르켈 세포 암종, 중피종, 골수종 (예컨대, 다발성 골수종), 골수이형성 증후군, 유두종증, 부신경절종, 갈색세포종, 흉막폐모세포종, 망막모세포종, 육종 (예컨대, 유잉 육종, 카포시 육종, 골육종, 횡문근육종, 자궁 육종, 혈관 육종), 윌름스 종양 및/또는 부신 피질, 항문, 충수, 담관, 방광, 뼈, 뇌, 유방, 기관지, 중추신경계, 자궁경부, 결장, 자궁내막, 식도, 눈, 나팔관, 담낭, 위장관, 생식 세포, 두경부, 심장, 장, 신장 (예컨대, 윌름스 종양), 후두, 간, 폐 (예컨대, 비-소세포 폐암, 소세포 폐암), 입, 비강, 구강, 난소, 췌장, 직장, 피부, 위, 고환, 인후, 갑상선, 음경, 인두, 복막, 뇌하수체, 전립선, 직장, 침샘, 요관, 요도, 자궁, 질 또는 외음부의 암을 비롯한 다양한 유형의 암을 인지하고 있다. 일부 실시양태에서, 암은 하나 이상의 고형 종양이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 암은 하나 이상의 혈액 종양일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.

병용 요법 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "병용 요법"은 대상체가 2 개 이상의 치료적 양생법 (예컨대, 2 개 이상의 치료제)에 동시에 노출되는 임상 개입을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 2 개 이상의 치료적 양생법이 동시에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 2 개 이상의 치료적 양생법은 순차적으로 투여될 수 있다 (예컨대, 제2 양생법의 임의의 용량의 투여 전에 제1 양생법이 투여됨). 일부 실시양태에서, 2 개 이상의 치료적 양생법은 중복 투약 양생법으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 병용 요법의 투여는 다른 약제(들) 또는 양식을 받는 대상체에 하나 이상의 치료제 또는 양식의 투여를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 병용 요법은 개별 약제가 단일 조성물로 함께 (또는 심지어는 반드시 동시에) 투여되는 것을 반드시 필요로 하지 않는다. 일부 실시양태에서, 2 개 이상의 치료제 또는 병용 요법의 방식은 개별적으로, 예컨대, 별도의 조성물로, 별도의 투여 경로를 통해 (예컨대, 하나의 약제는 경구로, 다른 약제는 정맥내로) 및/또는 상이한 시간 포인트에 대상체에 투여된다. 일부 실시양태에서, 2 개 이상의 치료제가 조합 조성물로 함께 투여되거나, 심지어 조합 화합물로 (예컨대, 단일 화학적 복합체 또는 공유 엔티티의 일부로서), 동일한 투여 경로를 통해 및/또는 같은 시간에 투여될 수 있다.

비교가능한 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "비교가능한"은 서로 동일하지 않을 수 있지만 서로 비교를 허용할 만큼 충분히 유사하여, 당업자가 관찰된 상이함 또는 유사점에 기반하여 결론이 합리적으로 도출될 수 있음을 이해할 것인 2 개 이상의 약제, 엔티티, 상황, 조건 세트 등을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 조건, 상황, 개체 또는 집단의 비교가능한 세트는 복수의 실질적으로 동일한 특징 및 하나 또는 소수의 다양한 특징을 특성화한다. 당업자는 문맥상, 비교가능한 것으로 간주되는 2 개 이상의 이러한 약제, 엔티티, 상황, 조건 세트에 대해 임의의 주어진 상황에서 어느 정도의 동일성이 요구되는지 이해할 것이다. 예를 들어, 당업자는 수득된 결과의 상이함 또는 상이한 상황, 개체 또는 집단의 세트 하에서 또는 이로 관찰된 현상이 다양한 이들 특징의 변동에 의해 유발되거나 이를 나타낸다는 합리적인 결론을 보증하기에 충분한 숫자 및 유형의 실질적으로 동일한 특징으로 특성화될 때 상황, 개체 또는 집단의 세트가 서로 비교가능하다는 것을 이해할 것이다.

상응하는 : 폴리펩티드, 핵산 및 화학적 화합물의 맥락에서 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상응하는"은 구조적 요소, 예컨대, 아미노산 잔기, 뉴클레오티드 잔기의 위치/동일성, 또는 적절한 참조 화합물 또는 조성물과의 비교를 통해 화합물 또는 조성물의 화학적 모이어티를 지정한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 중합체의 단량체 잔기 (예컨대, 폴리펩티드에서의 아미노산 잔기 또는 폴리뉴클레오티드에서의 핵산 잔기)는 적절한 참조 중합체에서의 잔기 "에 상응하는" 것으로서 식별될 수 있다. 예를 들어, 당업자는 단순함을 위해 폴리펩티드의 잔기가 종종 참조 관련 폴리펩티드를 기반으로 하는 표준 넘버링 시스템을 사용하여 지정되어, 아미노산이 위치 190의 잔기에 "상응"하며, 예를 들어, 특정 아미노산 쇄에서 실제로 190^번째 아미노산일 필요는 없지만 오히려 참조 폴리펩티드의 위치 190에서 발견되는 잔기에 상응한다는 것을 이해할 것이며; 당업자는 "상응하는" 아미노산을 식별하는 방법을 용이하게 이해한다 (예컨대, Benson et al. Nucl. Acids Res. (1 January 2013) 41 (D1): D36-D42; Pearson et al. PNAS Vol.85, pp. 2444-2448, April 1988 참고). 당업자는 예를 들어, 본 개시내용에 따른 폴리펩티드 및/또는 핵산에서 "상응하는" 잔기를 식별하는 데 활용할 수 있는 소프트웨어 프로그램, 예를 들어, BLAST, CS-BLAST, CUSASW++, DIAMOND, FASTA, GGSEARCH/GLSEARCH, Genoogle, HMMER, HHpred/HHsearch, IDF, Infernal, KLAST, USEARCH, parasail, PSI-BLAST, PSI-Search, ScalaBLAST, Sequilab, SAM, SSEARCH, SWAPHI, SWAPHI-LS, SWIMM, 또는 SWIPE를 포함하는 다양한 서열 정렬 전략을 인지할 것이다.

발현 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 핵산 서열의 "발현"은 핵산 서열로부터 유전자 생성물의 생성을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 유전자 생성물은 전사물 (예컨대, 일차 전사물 또는 가공된 전사물, 예컨대, mRNA)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 생성물은 폴리펩티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열의 발현은 다음 중 하나 이상을 포함한다: (1) (예컨대, 전사에 의한) DNA 서열로부터의 RNA 주형의 생산; (2) (예컨대, 스플라이싱, 편집, 5' 캡 형성 및/또는 3' 단부 형성에 의한) RNA 전사물의 가공; (3) RNA의 폴리펩티드 또는 단백질로의 번역; 및/또는 (4) 폴리펩티드 또는 단백질의 번역-후 변형.

플랭킹 서열 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "플랭킹 서열"은 관심 서열 또는 도메인에 선행하거나 후속하는 임의의 서열을 지칭한다. 예를 들어, 정지 코돈의 업스트림 영역은 "업스트림 플랭킹 영역"으로서 지칭될 수 있다.

유전자 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유전자"는 유전자 생성물 (예컨대, RNA 생성물 및/또는 폴리펩티드 생성물)을 코딩하는 DNA 또는 RNA 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 유전자는 코딩 서열 (예컨대, 특정 유전자 생성물을 코딩하는 서열)을 포함하며; 일부 실시양태에서, 유전자는 비-코딩 서열을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 유전자는 코딩 (예컨대, 엑손) 및 비-코딩 (예컨대, 인트론) 서열 둘 모두를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자는 예를 들어, 유전자 발현 (예컨대, 세포-유형-특이적 발현, 유도성 발현)의 하나 이상의 양태를 제어하거나 영향을 미칠 수 있는 하나 이상의 조절 요소 (예컨대, 프로모터, 인핸서, 침묵자, 종결 신호)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자는 (예컨대, 염색체 또는 다른 복제가능한 핵산에서의 또는 상의) 게놈에 위치하거나 게놈에서 발견된다 (또는 위치하거나 발견된 것과 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다).

돌연변이체 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "돌연변이체"는 참조 유기체, 세포, 또는 생체 분자와 비교하여 유전적 변이를 갖는 유기체, 세포 또는 생체분자 (예컨대, 핵산 또는 폴리펩티드)를 지칭한다. 예를 들어, 돌연변이 핵산 또는 폴리펩티드는, 일부 실시양태에서, 예를 들어, 참조 핵산 분자와 비교하여 하나 이상의 잔기 (예컨대, 하나 이상의 핵염기 또는 아미노산)의 치환, 하나 이상의 잔기의 결실 (예컨대, 내부 결실 또는 절두), 하나 이상의 잔기의 삽입, 2 개 이상의 잔기의 역전 등을 가질 수 있다. 당업자는 이러한 핵산 또는 폴리펩티드 돌연변이체의 다양한 특정 유형 - 예컨대, 융합체, 삽입결실 등에 익숙할 것이다. 돌연변이 핵산 또는 폴리펩티드를 포함하거나 발현하는 유기체 또는 세포는 또한 때때로 본원에서 "돌연변이체"로서 지칭된다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체는 유전자 생성물의 기능 손실과 연관된 유전적 변이체를 포함한다. 기능 손실은 기능의 완전한 소실, 예컨대, 활성 (예컨대, 결합 활성, 효소 활성 등)의 소실 또는 기능, 예컨대, 줄어든 활성 (예컨대, 결합 활성, 효소적 활성 등)의 부분적 손실일 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체는 기능의 획득, 예컨대, 기존 활성의 향상, 또는 적절한 참조에 대한 새로운 활성의 획득과 연관된 유전적 변이체 (예컨대, 유전적 변이가 부재한 동일한 엔티티)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 기능 획득 돌연변이체는 특성화 또는 활성의 변경을 획득할 수 있다. 일부 실시양태에서, 기능 획득 돌연변이체는 구성적 활성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 기능 손실 돌연변이체는 바람직한 활성을 손실 (또는 참조에 비해 저하)시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체의 구조, 수준 및/또는 활성이 비교되는 참조 유기체, 세포 또는 생체분자는 야생형 유기체, 세포 또는 생체분자이다.

핵산 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산"은 3 개 이상의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 DNA이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 RNA이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 단일 가닥이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 이중 가닥이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 단일 가닥 및 이중 가닥 부분 둘 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 하나 이상의 포스포디에스테르 연결을 포함하는 백본을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 포스포디에스테르 및 비-포스포디에스테르 연결 둘 모두를 포함하는 백본을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 핵산은 예컨대, "펩티드 핵산"에서와 같이 하나 이상의 포스포로티오에이트 또는 5'-N-포스포르아미다이트 연결 및/또는 하나 이상의 펩티드 결합을 포함하는 백본을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 하나 이상의 또는 모든 자연 잔기 (예컨대, 아데닌, 시토신, 데옥시아데노신, 데옥시시티딘, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘, 구아닌, 티민, 우라실)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 하나 이상의 또는 모든 비-자연 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-자연 잔기는 뉴클레오시드 유사체 (예컨대, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로피닐-시티딘, C-5 프로피닐-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-아이오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, 0(6)-메틸구아닌, 2-티오시티딘, 메틸화된 염기, 개재 염기, 및 이들의 조합)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-자연 잔기는 자연 잔기에 있는 것들과 비교하여 하나 이상의 변형된 당 (예컨대, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스 및 6탄당)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 기능적 유전자 생성물, 예컨대, RNA 또는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 핵산은 하나 이상의 인트론을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 핵산은 자연 공급원으로부터의 단리, (예컨대, 생체내 또는 생체외에서, 예컨대, 상보적 주형에 기반한 중합에 의한) 효소 합성, 재조합 세포 또는 시스템에서의 생식, 또는 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 1 10, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 개 이상 또는 그 초과의 잔기 길이이다.

펩티드: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "펩티드"는 전형적으로 비교적 짧은, 예를 들어, 약 100 개 미만의 아미노산, 약 50 개 미만의 아미노산, 약 40 개 미만의 아미노산, 약 30 개 미만의 아미노산, 약 25 개 미만의 아미노산, 약 20 개 미만의 아미노산, 약 15 개 미만의 아미노산, 또는 10 개 미만의 아미노산의 길이를 갖는 폴리펩티드를 지칭한다.

약학 조성물 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약학 조성물"은 인간 또는 동물 대상체에 투여하기에 적합한 조성물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화된 활성제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성제는 치료적 양생법에서 투여하기에 적절한 유닛 용량 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 치료적 양생법은 원하는 치료적 효과의 달성을 필요로 하는 대상체 또는 집단에 투여될 때 원하는 치료적 효과를 달성할 통계적으로 유의한 확률을 나타내는 것으로 결정된 일정에 따라 투여되는 하나 이상의 용량을 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 다음에 적합한 것들을 포함하는 고체 또는 액체 형태로 투여하기 위해 특별히 제형화될 수 있다: 경구 투여, 예를 들어, 드렌치 (수성 또는 비-수성 용액 또는 현탁액), 정제, 예컨대, 협측, 설하 및 전신 흡수를 표적화하는 것들, 볼루스, 분말, 과립, 혀에 적용하기 위한 페이스트; 예를 들어, 무균 용액 또는 현탁액, 또는 서방성 제형과 같은 피하, 근육내, 정맥내 또는 경막외 주사에 의한 비경구 투여; 국부 적용, 예를 들어, 크림, 연고 또는 피부, 폐 또는 구강에 적용되는 제어-방출 패치 또는 스프레이; 질내 또는 직장내, 예를 들어, 페서리, 크림, 또는 폼; 설하로; 안구로; 경피적으로; 또는 비강, 폐 및 기타 점막 표면. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 인간 대상체에 투여하기 위해 의도되고 이에 적합하다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 무균이고/이거나 실질적으로 발열원이 없다.

폴리펩티드 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 3 개 이상의 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 또는 모든 자연 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 또는 모든 비-자연 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 또는 모든 D-아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 또는 모든 L-아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 폴리펩티드의 N-말단에서, 폴리펩티드의 C-말단에서, 또는 이들의 임의의 조합에서 하나 이상의 펜던트 기 또는 다른 변형, 예컨대, 하나 이상의 아미노산 측쇄에 부착되거나 변형되는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 변형, 예컨대, 아세틸화, 아미드화, 아미노에틸화, 비오틴화, 카르바밀화, 카보닐화, 시트룰린화, 탈아미드화, 탈이민화, 제거, 글리코실화, 지질화, 메틸화, 페길화, 인산화, 수모일화 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 분자내 또는 분자간 이황화 결합에 참여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 사이클릭일 수 있고/있거나 사이클릭 부분을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 사이클릭이 아니고/아니거나 임의의 사이클릭 부분을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 선형이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 스테이플된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 (예컨대, 항체에서와 같이) 하나 이상의 다른 폴리펩티드와의 비-공유 또는 공유 회합에 의한 비-공유 복합체 형성에 참여한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 자연에서 발생하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 자연에서 발생하지 않는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 사람의 손의 작용을 통해 설계 및/또는 생산된다는 점에서 조작된 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 용어 "폴리펩티드"는 참조 폴리펩티드, 활성 또는 구조의 명칭에 첨부될 수 있으며; 이러한 경우에 관련 활성 또는 구조를 공유하고 따라서 폴리펩티드의 동일한 부류 또는 패밀리의 구성원으로 간주될 수 있는 폴리펩티드를 지칭하기 위해 본원에 사용된다. 이러한 각각의 부류에 대해, 본 명세서는 아미노산 서열 및/또는 기능이 알려진 부류 내의 예시적인 폴리펩티드를 제공하고/하거나 당업자가 인지할 것이며; 일부 실시양태에서, 이러한 예시적인 폴리펩티드는 폴리펩티드 부류 또는 패밀리에 대한 참조 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 부류 또는 패밀리의 구성원은 부류의 참조 폴리펩티드와; 일부 실시양태에서 부류 내의 모든 폴리펩티드와 유의한 서열 상동성 또는 동일성을 나타내고/내거나, 공통 서열 모티프 (예컨대, 특성화 서열 요소)를 공유하고/하거나 공통 활성을 (일부 실시양태에서 비교가능한 수준에서 또는 지정된 범위 내에서) 공유한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 구성원 폴리펩티드는 약 30-40% 이상이고 종종 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 초과인 참조 폴리펩티드와의 서열 상동성 또는 동일성의 전체 정도를 나타내고/내거나 매우 높은 서열 동일성, 종종 90% 초과 또는 심지어 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 초과의 서열 동일성을 나타내는 하나 이상의 영역 (예컨대, 일부 실시양태에서 특성화 서열 요소를 포함할 수 있는 보존된 영역)을 포함한다. 이러한 보존된 영역은 일반적으로 3-4 개 이상 및 종종 최대 20 개 이상의 아미노산을 포함하며; 일부 실시양태에서, 보존된 영역은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 개 이상 또는 그 초과의 인접 아미노산의 하나 이상의 스트레치를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유용한 폴리펩티드는 모 폴리펩티드의 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유용한 폴리펩티드는 복수의 단편을 포함할 수 있으며, 이들 각각은 관심 폴리펩티드에서 발견되는 것과 상이한 공간적 배열로 동일한 모 폴리펩티드에서 발견되므로 (예컨대, 모체에 직접 연결된 단편은 관심 폴리펩티드에서 공간적으로 분리될 수 있거나 그 반대일 수 있고/있거나 단편은 모체에서와 관심 폴리펩티드에서 상이한 순서로 존재할 수 있음), 관심 폴리펩티드는 모 폴리펩티드의 유도체이다.

참조 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "참조"는 비교가 수행되는 표준물질 또는 대조군을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 약제, 동물, 개체, 집단, 샘플, 서열, 또는 관심 값은 참조 또는 대조군 약제, 동물, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값과 비교된다. 일부 실시양태에서, 참조 또는 대조군은 관심의 테스트 또는 결정과 실질적으로 동시에 테스트 및/또는 결정된다. 일부 실시양태에서, 참조 또는 대조군은 임의로 실재하는 배지에 구현된 역사적 참조 또는 대조군이다. 전형적으로, 당업자가 이해하는 바와 같이, 참조 또는 대조군은 평가 중인 것들과 비교가능한 조건 또는 상황 하에서 결정되거나 특성화된다. 당업자는 특정 가능한 참조 또는 대조군에 대한 의존 및/또는 비교를 정당화하기에 충분한 유사성이 존재하는 경우를 이해할 것이다.

샘플 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "샘플"은 본원에 기재된 바와 같이 관심 공급원으로부터 수득되거나 유래된 생물학적 샘플을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 관심 공급원은 유기체, 예컨대, 미생물, 식물, 동물 또는 인간이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 생물학적 조직 또는 유체, 또는 이의 하나 이상의 구성요소이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 골수; 혈액; 혈액 세포; 복수; 조직 또는 생검 샘플; 세포-함유 체액; 자유 부유 핵산; 객담; 타액; 소변; 뇌척수액, 복막액; 흉막액; 대변; 림프; 부인과 유체; 피부 면봉; 질 면봉; 구강 면봉; 비강 면봉; 세척액 또는 세정액, 예컨대, 관 세정액 또는 기관지폐포 세정액; 흡인물; 찰과물; 골수 표본; 조직 생검 표본; 수술 표본; 기타 체액, 분비물 및/또는 배설물; 및/또는 이로부터의 세포이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 개체, 예컨대, 인간 또는 동물 대상체로부터 수득된 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수득된 세포는 샘플을 수득한 개체로부터의 세포이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플은 임의의 적절한 수단에 의해 관심 공급원으로부터 직접 수득한 "일차 샘플"이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 일차 생물학적 샘플은 생검 (예컨대, 미세 바늘 흡인 또는 조직 생검), 수술, 체액 (예컨대, 혈액, 림프, 대변) 수집으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 수득된다. 일부 실시양태에서, 문맥으로부터 명백해질 바와 같이, 용어 "샘플"은 일차 샘플을 가공함으로써 (예컨대, 일차 샘플의 하나 이상의 구성요소를 제거하고/하거나 일차 샘플에 하나 이상의 약제를 첨가함으로써) 수득되는 제제를 지칭한다. 예를 들어, 반-투과성 막을 사용한 여과. 이러한 "가공된 샘플"은 예를 들어, 샘플로부터 추출되거나 기술, 예컨대, mRNA의 증폭 또는 역전사, 특정 구성요소의 단리 및/또는 정제를 일차 샘플에 적용함으로써 수득된 핵산 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

대상체: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 유기체, 예를 들어, 포유류 (예컨대, 인간, 비-인간 포유류, 비-인간 영장류, 영장류, 실험실 동물, 마우스, 랫트, 햄스터, 저빌, 고양이, 개)를 지칭한다. 일부 실시양태에서 인간 대상체는 성인, 청소년 또는 소아 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태, 예컨대, 본원에 제공된 바와 같이 치료될 수 있는 질환, 장애 또는 병태, 예컨대, 본원에 나열된 암 또는 종양을 앓고 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태에 대해 감수성이고; 일부 실시양태에서, 감수성 대상체는 질환, 장애 또는 병태가 발달하기 쉬운 경향이 있고/있거나 (참조 대상체 또는 집단에서 관찰된 평균 위험과 비교하여) 이의 증가된 위험을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 대상체는 특정 증상 (예컨대, 질환의 임상적 징후) 또는 질환, 장애 또는 병태의 특성화를 나타내지 않는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태의 임의의 증상 또는 특성화를 나타내지 않는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 환자이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 진단 및/또는 요법이 투여되고/되거나 투여된 개체이다.

치료제 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료제"는 일반적으로 대상체에 투여될 때 원하는 효과 (예컨대, 원하는 생물학적, 임상적 또는 약리학적 효과)를 이끌어내는 약제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 약제는 적절한 집단에 걸쳐 통계적으로 유의한 효과를 나타내는 경우 치료제로 간주된다. 일부 실시양태에서, 적절한 집단은 질환, 장애 또는 병태로 고통받고/거나 이에 대해 감수성인 대상체의 집단이다. 일부 실시양태에서, 적절한 집단은 모델 유기체의 집단이다. 일부 실시양태에서, 적절한 집단은 하나 이상의 기준, 예컨대, 연령 그룹, 성별, 유전적 배경, 기존 임상 병태, 요법에 대한 사전 노출에 의해 정의될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료제는 유효량으로 대상체에 투여될 때 대상체의 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징을 경감, 호전, 완화, 억제, 예방, 이의 발병 지연, 이의 중증도 저하 및/또는 이의 발생을 저하시키는 물질이다. 일부 실시양태에서, "치료제"는 인간에 대한 투여용으로 판매될 수 있기 전에 정부 기관에 의해 승인되었거나 승인을 받아야 하는 약제이다. 일부 실시양태에서, "치료제"는 인간에 투여하기 위해 의학적 처방이 필요한 약제이다. 일부 실시양태에서, 치료제는 본원에 기재된 바와 같은 CREBBP 길항제일 수 있다.

치료적 유효량 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료적 유효량"은 이것이 투여되는 대상체 또는 집단에서 원하는 효과 (예컨대, 원하는 생물학적, 임상적 또는 약리학적 효과)를 생산하는 양을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 용어는 특정 투약 양생법 (예컨대, 치료적 투약 양생법)에 따라 대상체에 투여될 때 원하는 효과를 달성할 수 있는 통계학적으로 가능성이 있는 양을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 용어는 질환, 장애 및/또는 병태를 앓고/앓거나 이에 감수성인 집단의 적어도 유의한 백분율 (예컨대, 약 25%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 이상 또는 그 초과)에서 효과를 생산하기에 충분한 양을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 치료적 유효량은 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상의 발생 및/또는 중증도를 저하시키고/시키거나 발병을 지연시키는 양이다. 당업자는 용어 "치료적 유효량"이 실제로 특정 개체에서 달성된 성공적인 치료를 필요로 하지 않는다는 것을 이해할 것이다. 오히려, 치료적 유효량은 이러한 치료를 필요로 하는 환자에 투여될 때 유의한 수의 대상체에서, 예컨대, 치료된 환자 집단 내의 약 25%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 이상, 또는 그 초과의 환자에서 특정 원하는 반응을 제공하는 양일 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료적 유효량에 대한 언급은 하나 이상의 특이적 조직 (예컨대, 질환, 장애 또는 병태에 의해 영향을 받은 조직) 또는 체액 (예컨대, 혈액, 타액, 혈청, 땀, 눈물, 소변)에서 측정된 바와 같이 원하는 효과를 유도하기에 충분한 양에 관한 언급일 수 있다. 당업자는 일부 실시양태에서 치료적 유효량의 특정 약제 또는 요법이 단일 용량으로 제형화 및/또는 투여될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 실시양태에서, 치료적 유효 약제는 예를 들어, 투약 양생법의 일부로서 복수의 용량으로 제형화 및/또는 투여될 수 있다.

종양 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "종양"은 세포 또는 조직의 비정상적인 성장을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 종양은 전암성 (예컨대, 양성), 악성, 전-전이성, 전이성 및/또는 비-전이성인 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 종양은 암과 연관되거나 암의 징후이다. 일부 실시양태에서, 종양은 분산 종양 또는 액체 종양일 수 있다. 일부 실시양태에서, 종양은 고형 종양일 수 있다.

업스트림 및 다운스트림 : 본원에 사용된 바와 같이 RNA를 기재할 때 용어 "업스트림"는 RNA 분자의 5' 단부를 향하거나 이에 근접한 것을 지칭하고, 용어 "다운스트림"는 RNA 분자의 3' 단부"를 향하거나 이에 근접한 것을 지칭한다. DNA를 기재할 때 본원에 사용된 바와 같이, "업스트림"은 코딩 가닥의 5' 단부를 향하고, "다운스트림"은 코딩 가닥의 3' 단부를 향한다. DNA의 역-평행 배향 때문에, 이는 주형 가닥의 3' 단부가 업스트림에 있고 5' 단부가 다운스트림에 있음을 의미한다.

변이체 : 분자, 예컨대, 핵산, 단백질 또는 소분자의 맥락에서 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변이체"는 예컨대, 참조 엔티티와 비교하여 하나 이상의 화학적 모이어티의 존재 또는 부재 또는 수준에서, 참조 분자와 유의한 구조적 동일성을 나타내지만 참조 분자와 구조적으로 상이한 분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 변이체는 또한 이의 참조 분자와 기능적으로 상이하다. 일반적으로, 특정 분자가 참조 분자의 "변이체"로 적절하게 간주되는지 여부는 참조 분자와의 구조적 동일성 정도에 기반한다. 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 임의의 생물학적 또는 화학적 참조 분자는 특정 특성화 구조적 요소를 갖는다. 정의에 따르면 변이체는 하나 이상의 이러한 특성화 구조적 요소를 공유하지만 참조 분자와 하나 이상의 양태에서 상이한 별개의 분자이다. 몇 가지 예를 들자면, 폴리펩티드는 선형 또는 3-차원 공간에서 서로에 대해 지정된 위치를 갖고/갖거나 특정 구조적 모티프 및/또는 생물학적 기능에 기여하는 복수의 아미노산으로 구성된 특성화 서열 요소를 가질 수 있으며; 핵산은 선형 또는 3-차원 공간에서 다른 것에 대해 지정된 위치를 갖는 복수의 뉴클레오티드 잔기로 구성된 특성화 서열 요소를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 상이함 및/또는 폴리펩티드 또는 핵산의 공유 구성요소인 (예컨대, 폴리펩티드 또는 핵산 백본에 부착되는) 화학적 모이어티 (예컨대, 탄수화물, 지질, 포스페이트 기)의 하나 이상의 상이함의 결과로서 참조 폴리펩티드 또는 핵산과 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 또는 99% 이상인 참조 폴리펩티드 또는 핵산과의 전체 서열 동일성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 참조 폴리펩티드 또는 핵산과 하나 이상의 특성화 서열 요소를 공유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 참조 폴리펩티드 또는 핵산은 하나 이상의 생물학적 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 참조 폴리펩티드 또는 핵산의 생물학적 활성 중 하나 이상을 공유한다. 일부 실시양태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 참조 폴리펩티드 또는 핵산의 생물학적 활성 중 하나 이상이 결여되어 있다. 일부 실시양태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 참조 폴리펩티드 또는 핵산과 비교하여 저하된 수준의 하나 이상의 생물학적 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 관심 폴리펩티드 또는 핵산은 참조 폴리펩티드 또는 핵산이 참조의 것과 동일하지만 특정 위치에서 소수의 서열 변경의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열을 갖는 경우 참조 폴리펩티드 또는 핵산의 "변이체"로 간주된다. 전형적으로, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 또는 약 2% 미만의 변이체의 잔기는 참조와 비교하여 치환, 삽입 또는 결실된다. 일부 실시양태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 참조와 비교하여 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6, 약 5, 약 4, 약 3, 약 2, 또는 약 1개의 치환된 잔기를 포함한다. 종종, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 참조에 비해 매우 적은 수 (예컨대, 약 5, 약 4, 약 3, 약 2, 또는 약 1 개 미만의) 수의 치환, 삽입 또는 결실된 기능적 잔기 (즉, 특정 생물학적 활성에 참여하는 잔기)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 참조와 비교하여 약 5, 약 4, 약 3, 약 2, 또는 약 1 개 이하의 첨가 또는 결실을 포함하며, 일부 실시양태에서는 첨가 또는 결실을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 참조와 비교하여 약 25, 약 20, 약 19, 약 18, 약 17, 약 16, 약 15, 약 14, 약 13, 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6 개 미만, 일반적으로 약 5, 약 4, 약 3 또는 약 2 개 미만의 첨가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 참조 폴리펩티드 또는 핵산은 자연에서 발견되는 것이다. 일부 실시양태에서, 참조 폴리펩티드 또는 핵산은 인간 폴리펩티드 또는 핵산이다.

특정 실시양태의 상세한 설명

암

본 개시내용은 무엇보다도 암의 치료, 예컨대, 대상체에서 종양의 치료에 유용한 방법 및 조성물을 제공한다.

암은 전 세계적으로 주요 사망 원인 중 하나이며; 연간 진단된 새로운 암 사례 수는 2030 년까지 2,300만 건을 초과할 것으로 예상된다. 미국 국립 암 연구소에서 발표한 통계에 따르면, 2018 년에 미국에서 170만 명 초과의 새로운 암 사례가 진단되었으며, 60만 명 초과의 사람들이 이 질환으로 사망하였다.

가장 흔한 암은 내림차순으로 유방암, 폐암 및 기관지암, 전립선암, 결장 및 직장암, 피부 흑색종, 방광암, 비-호지킨 림프종, 신장 및 신우암, 자궁내막암, 백혈병, 췌장암, 갑상선암 및 간암이다. 남성 및 여성의 35% 초과가 일생 중 어느 시점에서 암 진단을 받을 것으로 예상된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 치료에 적합한 종양 또는 암은 예를 들어, 급성 림프아구성 백혈병 (ALL), 급성 골수 백혈병 (AML), 부신 피질암, 부신겉질 암종, AIDS-관련 암 (예컨대, 카포시 육종, AIDS-관련 림프종, 원발성 CNS 림프종), 항문암, 충수암, 성상세포종, 비정형 횡문근 종양, 기저 세포 암종, 담관암, 방광암, 골암, 뇌종양, 유방암, 기관지 종양, 버킷 림프종, 카르시노이드 종양, 암종, 심장병 (심장) 종양, 중추신경계 종양, 자궁경부암, 담관암종, 척색종, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 골수증식성 신생물, 결장직장암, 두개인두종, 피부 T-세포 림프종, 유관 제자리 암종 (DCIS), 배아 종양, 자궁내막암, 자궁내막 육종, 뇌실막종, 식도, 후신경모세포종, 유잉 육종, 두개외 생식 세포 종양, 생식선외 생식 세포 종양, 눈암, 나팔관암, 담낭암, 위 (위) 암, 위장 카르시노이드 종양, 위장관 간질 종양 (GIST), 생식 세포 종양, 임신성 영양막 질환, 신경교종, 모양세포 백혈병, 두경부암, 간세포 (간) 암, 호지킨 림프종, 하인두암, 안내 흑색종, 섬세포 종양, 카포시 육종, 신장 종양, 랑게르한스 세포 조직구증, 후두암, 백혈병, 구순 및 구강암, 간암, 폐암, 림프종, 남성 유방암, 악성 섬유성 조직구종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 중피종, 구강암, 다발성 내분비샘종양 증후군, 다발성 골수종, 형질 세포 신생물, 균상식육종, 골수이형성 증후군, 골수이형성/골수증식성 신생물, 비강암, 비인두암, 신경모세포종, 비-호지킨 림프종, 비-소세포 폐암, 구강암, 구강 암, 구인두암, 골육종, 난소암, 췌장암, 췌장 신경내분비 종양 (섬세포 종양), 부신경절종, 부비동암, 부갑상선암, 음경암, 인두암, 갈색세포종, 뇌하수체 종양, 흉막폐모세포종, 원발성 중추신경계 (CNS) 림프종, 원발성 복막암, 전립선암, 직장암, 신세포 (신장) 암, 망막모세포종, 망막모세포종, 횡문근육종, 횡문근육종, 침샘암, 육종, 세자리 증후군, 피부암, 소장암, 연조직 육종, 편평 세포 암종, 편평 경부암, 위 (위) 암, T-세포 림프종, 고환암, 고환암, 인후암, 흉선 암종, 흉선종, 갑상선암, 요도암, 자궁 육종, 자궁 육종, 질암, 혈관 종양, 외음부암, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 윌름스 종양을 포함한다. 일부 바람직한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 치료에 적합한 종양 또는 암은 폐암 (비-소세포 폐암 및 소세포 폐암 둘 모두), 결장암, 췌장암, 두경부암, 식도암, 난소암 (예컨대, 고등급 장액성 난소암), 방광암, 간암, 위암, 흑색종, AML (예컨대, 요법 관련된 AML, 복합 핵형 AML, 17p 결실이 있는 AML), 만성 골수 백혈병 및 버킷 림프종을 포함하여, p53 돌연변이 또는 비활성화의 높은 빈도를 갖는 암을 포함한다.

리보솜

리보솜은 단백질 합성의 중심이다. 리보솜은 핵산 코드의 지시에 따라 개별 아미노산을 함께 연결함으로써 단백질을 합성한다. 진핵생물 리보솜은 4 개의 rRNA 종 및 80 개의 리보솜 단백질 (RP)로 만들어진 복잡한 거대분자 기계이다. 성숙한 리보솜은 2 개의 서브유닛, 즉 18S rRNA 및 33 개의 RP를 함유하는 작은 40S 리보솜 서브유닛, 및 28S, 5.8S 및 5S rRNA 및 47 개의 RP를 함유하는 큰 60S 리보솜 서브유닛으로 구성된다. rRNA는 특징, 예컨대, 염기 메틸화, 슈도우리딜화 및 2'-하이드록실에서의 리보스 메틸화 (2'-O-메틸화)를 포함하여 아주 많이 변형된다. 가장 풍부한 rRNA 변형은 슈도우리딘 합성효소 및 H/ACA 박스 소핵소체 RNA (snoRNA)에 의한 우리딘의 슈도우리딘으로의 이성질체화, 및 메틸트랜스퍼라제 피브릴라린 (FBL)에 의해 수행되는 리보스의 2'-O-메틸화이다.

전형적으로, 리보솜은 RNA 코드에서 지시를 "판독할" 것이며; 일부 실시양태에서, 코드를 함유하는 핵산은 mRNA이다. 일부 실시양태에서, 리보솜의 구조적 특징은 리보솜 활성에 의해 생성되는 초기 폴리펩티드인 아미노산 스트링과 상호작용한다. 일부 실시양태에서 리보솜은 초기 폴리펩티드의 폴딩에 영향을 미칠 수 있다.

종양선택적 번역

종양원성 리보솜

본 개시내용은 연구가 종양 발달 및/또는 진행과 연관된 리보솜 구조 및 기능의 변경을 점점 더 밝혀내고 있다는 것을 이해하고 있다. 예를 들어, Bastide and David Oncogenesis 2018 Apr 7(4):34 참고. 종양원성 리보솜은 급격하게 변경된 번역 양상 ("번역체")을 갖는다. 다양한 종양유전자를 보다 효과적으로 번역하는 것 외에도, 암 리보솜은 낮은 번역 충실도 및/또는 변경된 또는 증가된 정지 코돈 판독-초과를 특성화하는 것으로 나타났다.

종양원성 리보솜의 변경된 기능에 기여할 수 있는 다양한 메커니즘이 설명되어 있다. 이는 리보솜 생합성의 변경, 리보솜 단백질 유전자의 돌연변이, 리보솜 단백질 발현의 변경, rRNA의 발현 변경 및/또는 rRNA의 변형의 변경을 포함한다. 예를 들어, Bastide and David Oncogenesis. 2018 Apr; 7(4): 34 참고. rRNA 2'-O-메틸화 패턴의 변경이 또한 암 진화에 관여한다. 일부 암에서, p53 비활성화는 FBL 과발현 및 rRNA 메틸화 양상의 후속 변화를 촉발한다 (Marcel et al. Cancer Cell. 2013;24:318-330). 이러한 p53 비활성화 (및/또는 FBL 과발현 및/또는 rRNA 메틸화의 변화)는 손상된 번역 충실도 및 IRES-함유 mRNA의 증가된 번역을 초래한다. p53 단백질을 코딩하는 유전자인 TP53은 가장 흔한 돌연변이된 종양 억압 유전자이다, rRNA 변형과 함께 리보솜 단백질의 변화를 통한 리보솜 조절과도 밀접하게 연계되어 있다. 리보솜 단백질 유전자 반수체기능부전은 모든 암의 약 43%에서 발견된다 (Ajore et al., EMBO Mol Med. 2017;9(4):498-507). 건강한 세포에서, 임의의 필수 리보솜 단백질 유전자의 두 복사본 모두의 손실은 치명적이다. 그러나, 리보솜 단백질 유전자의 단일 사본이 손실되면, 리보솜 단백질의 화학량론이 변경되고 리보솜 단백질 RPL5 및 RPL11은 5S rRNA와 함께 MDM2에 결합하고 p53을 안정화하여 성장 저지 또는 아폽토시스를 자극하는 더 높은 유리 (비결합) 형태를 갖는다. 건강한 세포에서 이러한 p53 매개된 제어 메커니즘을 "손상된 리보솜 생합성 체크포인트 (Gentilella et al. Mol Cell. 2017;67(1):55-70.e4)"라고 한다. TP53 외에도, 일반적으로 돌연변이되는 다른 종양 억압 유전자인 망막모세포종 (RB1) 유전자는 또한 리보솜 조절에 관여하여, MYC 종양유전자-형질전환된 노화 인간 세포에서 번역 판독-초과를 억압한다 (del Toro et al. BioRxiv. 2019;10.1101/788380).

본 개시내용은 종양선택적 판독-초과가 암 치료를 위한 강력한 전략으로서 이용될 수 있음을 이해하고 있다. 본 개시내용은 무엇보다도 이러한 핵산에 포함되고/되거나 이에 의해 코딩되는 페이로드의 발현이 (비-종양 세포에 비해) 종양 세포에서 선택적으로 또는 특이적으로 발현되는 것을 보장하는 기술을 제공함으로써 핵산 치료제 (특히 RNA, 예컨대, mRNA 치료제를 포함함) 분야에서의 광범위한 작업에 기초한다.

진정한 종양선택적 또는 종양특이적 발현을 제공함으로써, 본 개시내용은 종양선택적 또는 종양특이적 페이로드 발현이 달성될 수 없는 상황에서 요구될 수 있는 표적화된 (예컨대, 종양선택적) 전달 전략을 개발 및/또는 활용할 필요성을 저하시키거나 없앤다. 물론, 본 개시내용을 판독하는 당업자는 임의의 이용가능한 이러한 종양선택적 전달 기술이 일부 실시양태에서 제공된 기술과 바람직하게 조합될 수 있으며; 이는 전적으로 필요하지 않음을 이해할 것이다.

대안적으로 또는 추가적으로, 진정한 종양선택적 또는 종양특이적 발현을 제공함으로써, 본 개시내용은 이러한 높은 정도의 선택성 없이는 부적절하거나 바람직하지 않을 수 있는 페이로드를 활용하는 옵션을 생성한다. 예를 들어, 본원에서 논의된 바와 같이, 세포독성 페이로드 (예컨대, 독소, 네크롭토시스-유발성(pro-necroptotic), 파이롭토시스-유발성(pro-pyroptotic), 아폽토시스-유발성(pro-apoptotic) 단백질)는 본원에 기재된 정도로 종양선택성을 보장할 수 없는 기술과 함께 활용될 때 허용가능하지 않은 부작용 및/또는 독성학 프로파일을 가질 수 있다.

종양선택적 번역 서열 요소

판독-초과 모티프

무엇보다도, 본 개시내용은 상이한 리보솜 (예컨대, 종양 세포의 리보솜 - 예컨대, 종양원성 리보솜 - 대 비-종양 세포의 리보솜 - 예컨대, 비-종양원성 리보솜)이 상이한 진행성 및/또는 판독-초과 특성 (예컨대, 구조의 중지에 대한 상이한 반응 및/또는 이를 통한 진행성에 영향을 미치는 정지 코돈)을 갖는다는 인식을 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양원성 리보솜은 비-종양원성 리보솜과 비교하여 프레임 이동을 갖는다. 일부 실시양태에서, 종양원성 리보솜에 의한 프레임 이동은 본원에 기재된 페이로드 서열의 발현을 초래할 수 있다.

일부 실시양태에서, 종양원성 리보솜은 표준 정지 코돈을 통해 판독-초과하거나 가공한다. 일부 실시양태에서, 종양원성 리보솜에 의한 정지 코돈의 판독-초과는 정지 코돈을 초기 폴리펩티드에 통합된 아미노산으로의 번역을 초래한다. 일부 실시양태에서, 종양원성 리보솜에 의한 정지 코돈의 판독-초과는 그 정지 코돈 다음의 다운스트림 (3'UTR) 서열의 일부 또는 전부의 번역을 초래한다.

임의의 특정 이론에 얽매이지 않으면서, 본 개시내용은 정지 코돈의 리보솜 판독-초과가 18s rRNA, 및 리보솜에 의해 결합된 RNA (예컨대, mRNA) 사이의 상호작용에 의해 유발될 수 있음을 관찰한다. 예를 들어, rRNA의 나선은 mRNA 서열과 상호작용할 수 있다. Namy et al. EMBO Rep. 2001 Sep 15; 2(9): 787-793은 코돈 판독-초과의 정지를 야기하는 S. 세르비사에(S. cervisae)에서의 rRNA의 나선 17과 리보솜에 의해 결합된 mRNA의 상호작용을 설명함을 참고한다. 본 개시내용은 무엇보다도 인간 rRNA 나선 37이 정지 코돈 판독-초과에 기여하는 mRNA의 서열과 상호작용할 수 있음을 인식한다.

대안적으로 또는 추가적으로, 종양선택적 리보솜 정지 코돈 판독-초과는 번역가능한 핵산 (예컨대, RNA, 예컨대, mRNA)에 하나 이상의 특정 구조적 특징을 포함함으로써 유도 및/또는 향상될 수 있다. 일부 실시양태에서, 번역가능한 핵산 (예컨대, RNA, 예컨대, mRNA)의 하나 이상의 일차 구조 특징을 사용하여 종양선택적 정지 코돈 판독-초과를 유도 및/또는 향상시킬 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 실시양태에서, 번역가능한 핵산 (예컨대, RNA, 예컨대, mRNA)의 하나 이상의 이차 및/또는 삼차 구조 특징 (예컨대, 스템 루프, 벌지 루프, 키싱 루프, 유사매듭 또는 분지 루프)은 종양선택적 정지 코돈 판독-초과를 유도 및/또는 향상시키는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 정지 코돈 판독-초과를 유도 및/또는 향상시킬 수 있는 구조적 특징은 다운스트림 플랭킹 서열의 처음 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 또는 120 개의 뉴클레오티드 내에 있다. 일부 추가 실시양태에서, 정지 코돈 판독-초과를 유도 및/또는 향상시킬 수 있는 구조적 특징의 부분은 다운스트림 플랭킹 서열의 처음 16 개의 뉴클레오티드에 포함된다.

일부 실시양태에서, 정지 코돈 판독-초과를 유도 및/또는 향상시킬 수 있는 구조적 특징은 다운스트림 플랭킹 서열의 처음 10, 20, 30, 40, 50, 60 개 이상의 뉴클레오티드 내의 10, 20, 30, 40, 50 개 이상의 염기쌍 뉴클레오티드를 포함한다.

본 개시내용의 일부 실시양태에 따르면, 정지 코돈 판독-초과는 본원에 기재된 바와 같은 종양선택적 판독-초과 모티프의 사용을 통해 유도 및/또는 향상될 수 있다.

대안적으로 또는 추가적으로, 일부 실시양태에서, 높은 G-C 함량의 하나 이상의 영역의 포함은 종양특이적 정지 코돈 판독-초과를 유도하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 번역가능한 핵산의 (예컨대, RNA, 예컨대, mRNA의) 3'UTR에서 높은 G-C 함량은 종양특이적 정지 코돈 판독 초과를 유도 및/또는 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 정지 코돈에 선행하는 뉴클레오티드에서의 높은 G-C 함량은 정지 코돈의 종양특이적 정지 코돈 판독-초과를 유도 및/또는 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 정지 코돈에 선행하는 60 개의 뉴클레오티드에서의 높은 G-C 함량은 해당 정지 코돈의 종양특이적 정지 코돈 판독-초과를 유도 및/또는 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 정지 코돈 다음의 50 개의 뉴클레오티드에서의 높은 G-C 함량은 해당 정지 코돈의 종양특이적 정지 코돈 판독초과를 유도 및/또는 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 정지 코돈 후의 (즉, 3'UTR에서의) 처음 120 개의 뉴클레오티드의 높은 G-C 함량은 해당 정지 코돈의 종양특이적 정지 코돈 판독초과를 유도 및/또는 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 높은 G-C 함량은 비-판독초과 전사물에 대해 4 이상의 이항 확률의 로그-오즈 (log-odds)을 의미한다. 일부 실시양태에서, 판독초과 모티프는 다운스트림 플랭킹 서열에서 42% 초과, 48% 초과, 바람직하게는 54% 초과의 GC 함량을 포함한다.

일부 실시양태에서, 판독초과 모티프는 판독초과 정지 코돈 및 다운스트림 플랭킹 서열의 처음 14 개의 뉴클레오티드에 걸쳐 있는 영역 내에서, 아미노산 서열 VNNNNNNMNNMWK (서열번호 24), NNNVWNNKGHHNH (서열번호 25), DVHVNNNCWNNNB (서열번호 26), MWBNNNNNNNNNN (서열번호 27), WGNNSNHNHDNNN (서열번호 28), VNNNNNNMNNMWK (서열번호 29) 또는 VMNNWNKNNNNNN (서열번호 30)을 포함하며, 여기서 V는 A, C 또는 G를 나타내고, M은 A 또는 C를 나타내고, W는 A 또는 T/U를 나타내고, K는 G 또는 T/U를 나타내고, H는 A, C 또는 T/U를 나타내고, D는 A, G 또는 T/U를 나타내고, B는 C, G 또는 T/U를 나타내고, S는 G 또는 C를 나타내고, N은 임의의 뉴클레오티드를 나타낸다.

본 개시내용은 초기 폴리펩티드에 프롤린의 도입을 초래하는 코돈의 포함이 초기 폴리펩티드의 꼬임을 유도할 수 있고, 이러한 꼬임이 종양선택적 정지 코돈 판독-초과를 유도 및/또는 향상시키기 위해 사용될 수 있다는 통찰력을 추가로 제공한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 종양선택적 정지-코돈 판독 초과는 종양선택적 정지 코돈 판독-초과를 유도 및/또는 향상시키기 위해 본원에 기재된 다른 전략 중 하나 이상에 대한 대안으로서 또는 이에 추가하여 번역가능한 핵산에 하나 이상의 프롤린-코딩 코돈을 포함함으로써 유도 및/또는 향상될 수 있다.

일부 실시양태에서, mRNA의 스템 루프는 정지 코돈 판독-초과를 유도 및/또는 향상시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 정지 코돈 판독초과를 유도 및/또는 향상시키는 스템 루프는 정지 코돈의 대략 20, 40, 60, 80 또는 120 개의 뉴클레오티드 내에 있다. 일부 실시양태에서, 정지 코돈 판독-초과를 유도 및/또는 향상시키는 스템 루프는 정지 코돈 직전의 코딩 서열에 있다. 일부 실시양태에서, 정지 코돈 판독-초과를 유도 및/또는 향상시키는 스템 루프는 3'UTR에 있다. 일부 실시양태에서, 정지 코돈 판독-초과를 유도 및/또는 향상시키는 스템 루프는 코딩 영역 및 3'UTR 경계에 걸쳐 있는 영역에 있다. 일부 실시양태에서, mRNA의 벌지 루프 또는 유사매듭은 정지 코돈 판독-초과를 유도 및/또는 향상시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 정지 코돈 판독-초과를 유도 및/또는 향상시키는 핵산 구조는 판독-초과를 초래하지 않은 핵산 구조에 비해 낮은 깁스 자유 에너지를 갖는다. 일부 실시양태에서, 정지 코돈 판독-초과를 유도하는 핵산의 3'UTR의 처음 25, 50, 또는 75 개의 뉴클레오티드는 비-암 정지 코돈 판독-초과 대응물보다 5 kcal/몰; 10 kcal/몰; 15 kcal/몰; 20 kcal/몰; 25 kcal/몰; 30 kcal/몰 더 낮은 델타 G를 갖는다. 일부 실시양태에서, 정지 코돈 판독-초과를 유도하는 핵산의 3'UTR의 처음 25, 50, 또는 75 개의 뉴클레오티드는 비-암 정지 코돈 판독-초과 대응물보다 5 kcal/몰 내지 20 kcal/몰; 5 kcal/몰 내지 10 kcal/몰; 또는 10 kcal/몰 내지 20 kcal/몰; 25 kcal/몰; 30 kcal/몰 더 낮은 범위의 델타 G를 갖는다.

일부 실시양태에서, 아미노글리코시드 (예컨대, 겐타마이신) 및 마크로리드 (예컨대, 에리트로마이신)는 정지 코돈 판독-초과를 유도할 수 있다. 임의의 이론에 구속되지 않으면서, 아미노글리코시드는 18s rRNA에 결합함으로써 정지 코돈 판독-초과를 유도할 수 있고, 마크로리드는 큰 리보솜 서브유닛 내에서 펩티드 채널을 결합함으로써 정지 코돈 판독-초과를 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노글리코시드 및 마크로리드는 건강한 (정상) 세포에서 정지 코돈 판독-초과를 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노글리코시드 또는 마크로리드로 치료된 대상체는 정지 코돈 판독-초과 모티프를 포함하는 핵산으로 치료되어서는 안 된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 종양선택적 번역 서열 요소가 종양특이적일 수 있고 암 세포에서만 번역 및 페이로드 발현을 초래할 수 있다는 (즉, 비-암 세포에서 검출가능한 발현 없음) 인식을 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 실시양태에서, 종양선택적 번역 서열 요소는 적절하게 비교가능한 비-암 세포와 비교하여 암 세포(들)에서 2, 5, 10, 15, 20, 30-배 이상 더 많이 번역된다.

일부 실시양태에서, 종양선택적 번역 서열 요소는 내부 리보솜 진입 분절/부위 (IRES)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 종양원성 리보솜, 또는 RNA 결합 단백질은 종양선택적 번역 서열 요소에서 IRES에 우선적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 종양선택적 번역 서열 요소는 번역 개시 RNA 결합 단백질 (RBP)에 의해 결합되거나 이의 결합을 지시할 수 있다. 일부 실시양태에서, 종양선택적 번역 서열 요소는 IRES를 포함할 수 있고, RBP에 의해 결합되거나 이의 결합을 지시할 수 있다.

판독-초과 평가

본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 종양선택적 번역 서열 요소의 식별 및/또는 특성화에 유용한 정지-코돈 판독초과의 평가 (예컨대, 식별 및/또는 특성화)와 관련된 다양한 통찰력을 제공한다.

예를 들어, 본원의 예증에 기재된 바와 같이, 본 개시내용은 정지 코돈 판독-초과를 평가하기 위한 특정 공통 접근법에 대한 문제의 원인을 식별한다. 무엇보다도, 본 개시내용은 많은 이전 접근법이 (예컨대, 리보솜 프로파일링 및/또는 RNA Seq 연구를 통해) 리보솜 점유 또는 (예컨대, 질량 분석법을 통해) 폴리펩티드 생산의 분석에 의존해 왔다는 것을 이해하고 있다. 본 개시내용은 이러한 접근법이 기술에 내재된 편향으로 인해 위양성 및/또는 위음성 결과를 제공할 수 있지만 항상 인정되는 것은 아니라는 통찰력을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 정지 코돈 판독 초과가 바람직하게는 (i) 리보솜 점유 또는 위치; 및 (ii) 판독-초과 폴리펩티드의 생산을 독립적으로 평가하는 기술의 조합의 사용을 통해 평가된다는 것을 교시한다.

본 개시내용은 정지-코돈 판독-초과를 평가하기 위한 많은 이전 접근법이 관찰된 수준 또는 특징 (리보솜 프로파일링, RNA Seq, 질량 분석법, 또는 하나 이상의 다른 기술, 또는 임의의 이들의 조합)을 그 자체가 하나 이상의 암-관련 특징을 갖고 따라서 본원에 기재된 바와 같은 "비-암" 참조와의 비교 진정한 비교를 제공하지 않는 "참조"와 비교하였다는 통찰력을 제공한다.

예를 들어, 본 개시내용은 많은 세포주가 본원에 기재된 바와 같이 종양선택적 정지-코돈 판독초과를 평가하기 위한 참조로서 이들의 유용성을 저하시키는 하나 이상의 암-관련 특징을 포함한다는 것을 인식한다. 예를 들어, HEK293 세포는 바람직하게는 본 개시내용의 많은 실시양태에서 종양선택적 정지-코돈 판독초과를 평가하기 위한 "비-암" 참조로서 사용되지 않는데, 이는 이들 세포가 p53을 불활성화시키고 세포를 불멸 및 종양형성 세포주로 형질전환시키고 이러한 평가에서 이들의 성능에 영향을 미칠 수 있고 종양선택성을 식별하려고 시도하는 분석을 왜곡하거나 파괴할 수 있는 하나 이상의 바이러스 유전자, 예컨대, 아데노바이러스 E1B 유전자 삽입을 함유할 수 있기 때문이다.

핵산

무엇보다도, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 종양선택적 번역에 참여하고/하거나 이와 달리 이에 관련된 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 종양선택적 판독-초과 모티프를 포함하는 번역가능한 핵산이거나 이를 포함하거나 전달하는 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 관심 페이로드를 코딩하고 본원에 기재된 바와 같은 종양선택적 번역 서열 요소를 포함하는 번역가능한 핵산이거나 이를 포함하거나 전달하는 핵산을 제공한다.

일부 실시양태에서, 제공된 핵산은 DNA (예컨대, 단일 또는 이중-가닥 DNA)이거나 이를 포함할 수 있으며, 이는 예컨대, 세포로 도입될 때, 전사되어 또는 전사되는 주형 가닥을 생성하여, 본원에 기재된 바와 같이 번역가능한 핵산 (예컨대, RNA, 예컨대, mRNA)을 생산한다. 일부 실시양태에서, 제공된 핵산은 본원에 기재된 번역가능한 핵산이거나 이를 포함할 수 있는 (또는 이의 상보체이거나 이를 포함할 수 있는) RNA (예컨대, mRNA)이거나 이를 포함할 수 있다 (예컨대, 코딩 서열 및 종양선택적 번역 서열 요소(들)이거나 이를 포함할 수 있다).

일부 실시양태에서, 제공된 핵산은 DNA 또는 RNA 또는 둘 모두이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제공된 핵산은 자연-발생 DNA 및/또는 RNA에 비해 화학적으로 변형된다. 일부 실시양태에서, 제공된 핵산은 슈도우리딘으로 변형되지 않는다.

일부 실시양태에서, 제공된 핵산은 본원에 기재된 바와 같은 번역가능한 핵산이다. 일부 실시양태에서, 제공된 핵산은 본원에 기재된 바와 같은 번역가능한 핵산을 생산하기 위해 발현가능하다 (예컨대, 발현하도록 전사될 수 있음). 일부 실시양태에서, 제공된 핵산은 본원에 기재된 바와 같은 번역가능한 핵산의 상보체, 또는 이러한 번역가능한 핵산 (또는 이의 상보체)을 생산하도록 발현가능한 핵산의 상보체이다.

따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 RNA (예컨대, mRNA) 치료제 분야의 최근 개발을 기초로 하고 이를 향상시킨다. 몇몇 그룹은 예를 들어, RNA 생산 및/또는 안정성 개선; 포유동물 (예컨대, 인간) 대상체에 대한 RNA 투여 및/또는 전달을 용이하게 하기 위한 캡슐화 또는 기타 시스템 제공; 등을 위한 기술 개발에 중요한 작업을 수행하였다. 회사, 예컨대, BioNTech AG, CureVac AG, Ethris AG, Moderna Therapeutics, 및 Translate Bio, Inc., 등의 최근 작업은 여러 임상 후보 및 최근에는 미국 식품의약국에서 승인한 최초의 RNA 치료제의 개발을 야기하였으며; 당업자는 RNA 치료제의 생산, 안정성, 투여 등에 이용가능한 기술 중 임의의 것 또는 전부가 번역가능한 RNA를 포유동물 (예컨대, 인간) 대상체에 투여하는 본 개시내용의 이들 실시양태에 적용하능하고/하거나 이에 활용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

유사하게, 본 개시내용은 예컨대, 포유동물 (예컨대, 인간) 대상체의 세포에 번역가능한 핵산을 전달할 수 있는 DNA 및/또는 RNA 벡터의 개발을 포함하는 유전자 요법 분야의 다양한 개발을 기초로 하고 이를 향상시킨다. 종양용해성 바이러스에 대한 최근 작업은 다양한 악성종양에서 효율적인 유전자 전달 및 세포 살해를 입증하였다 (Raman et al., Immunotherapy. 2019 Jun;11(8):705-723; Mahalingam et al., Cancers (Basel). 2018 May 25;10(6)). 또한, 자가-증폭 mRNA 레플리콘을 연구하는 그룹은 연장된 단백질 발현으로 효율적인 국소 전달 및 개선된 약동학 프로파일을 입증하였다 (Avogadri et al, Cancer Immunol Res. 2014 May;2(5):448-58; Huysmans et al., 2019 bioRxiv 10.1101/528612). 본 개시내용의 일부 실시양태에서, 제공된 핵산은 종양용해성 바이러스 입자 또는 종양용해성 DNA 또는 RNA 또는 중합체 또는 지질 나노입자로 제형화된 자가-증폭 mRNA를 포함한다.

일부 실시양태에서, 제공된 핵산은 대상체에서 도입, 생산 및/또는 발현될 때 (적절한 참조에 비해) 낮은 또는 저하된 면역원성을 나타내도록 조작된다. 당업자는 이를 함유하지 않은 핵산과 비교하여 이를 함유하는 핵산의 면역원성을 증가 또는 감소시킬 수 있는 특정 서열 요소 및/또는 화학적 변형을 인지하고 있다. 많은 실시양태에서, 제공된 핵산은 대상체에서 도입, 생산 및/또는 발현되거나 될 것들이 예상된 또는 관찰된 낮은 면역원성을 특성화하도록 조작된다. 예를 들어, 제공된 mRNA는 GC 함량을 증가시키거나 (Thess et al., 2015, Mol Ther. 23:1456-64), U 함량을 감소시킴으로써 (Kariko & Sahin, 2017, WIPO 특허출원 WO 2017/036889 A1호; Vaidyanathan, et al., 2018. 12: 530-542) 조작될 수 있다. 제공된 mRNA는 비-표준 뉴클레오티드, 예컨대, 슈도우리딘, N1-메틸-슈도우리딘, 메톡시-우리딘 및 2-티오우리딘을 mRNA에 통합하여 변형된 것을 함유할 수 있다 (Kariko, 2005, Immunity. 23:165-75; Kariko, 2008, Mol Ther. 16:1833-40; Kormann et al., 2011, Nat Biotechnol. 29:154-157; Andries et al., 2015, J Control Release. 217:337-344).

대안적으로 또는 추가적으로, 일부 실시양태에서, 번역가능한 페이로드를 포함하거나 코딩하는 제공된 핵산은 대상체에서 도입 및/또는 생산될 때 페이로드가 비교적 낮은 면역원성을 나타내도록 조작된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 면역원성 에피토프(들)는 특정 페이로드에 대해 정의될 수 있고, (예컨대, 하나 이상의 이러한 면역원성 에피토프(들) 내에 서열 변경을 갖거나, 예컨대, 번역-후 변형 패턴을 변경함으로써 이의 면역원성에 달리 영향을 미치는) 덜-면역원성 변이체가 본 개시내용에 따라 활용될 수 있다.

코딩 서열

본원에 기재된 바와 같이, 본 개시내용은 특히 코딩 서열 (예컨대, 페이로드 코딩 서열) 및 종양선택적 번역 서열 요소를 포함하는 번역가능한 핵산에 관한 것이다.

본 개시내용을 판독하는 당업자는 매우 다양한 유용한 페이로드 서열이 알려져 있으며 본원의 교시에 따라 활용될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 실시양태에서, 페이로드는 암 세포에서 발현될 때, 대상체 내에서 생존 및/또는 증식하는 능력을 저하시키는 유전자 생성물 (예컨대, 폴리펩티드)이다.

일부 실시양태에서, 페이로드 서열은 세포에 독성일 수 있고/있거나 (예컨대, 효소적으로) 독성 약제를 생성할 수 있다.

일부 실시양태에서, 페이로드 서열은 세포를 면역학적 공격 및/또는 클리어런스에 보다 감수성이도록 만들 수 있다. 예를 들어, 일부 이러한 실시양태에서, 페이로드 서열은 대상체의 면역계 및/또는 대상체에게 투여되었거나 투여될 면역학적 요법 (예컨대, CAR-T 또는 CAR-NK 세포, 증식된 T-세포 등)에 특히 매력적인 막관통 단백질 및/또는 세포내 시그널링 분자 (예컨대, ITAM 또는 공동자극 분자 엔도도메인)에 융합된 항원, 항체, 항체 단편, 또는 이들의 키메라 버전이거나 이를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 이러한 실시양태에서, 페이로드 서열은 면역학적 체크포인트를 완화하거나 억제하는 약제이거나 이를 포함할 수 있다.

본원에 언급된 바와 같이, 제공된 개시내용의 하나의 특징은 이러한 종양제한적 발현 없이 허용가능하지 않은 및/또는 권장되지 않은 페이로드가 효과적으로 활용될 수 있도록 종양선택성의 정도를 달성한다는 것이다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 사용하기 위한 페이로드 서열은 암세포에서 및/또는 특정 상황 하에서 (예컨대, 별도의 약제의 존재 하에) 선택적으로 활성이다. 그러나, 일부 실시양태에서, 특히 본 개시내용에 의해 제공되는 종양선택성의 정도의 견지에서, 일부 실시양태에서, 페이로드는 구성적으로 활성이고/이거나 번역-후 변형, 예컨대, 절단 또는 인산화를 필요로 하지 않는 단백질을 포함한다.

일부 실시양태에서, 페이로드는 이것이 생산되는 세포로부터 (예컨대, 번역에 의해) 분비되지 않는다. 일부 다른 실시양태에서, 페이로드는 종양 미세환경으로 분비되는 단백질이다.

일부 실시양태에서, 폴리펩티드 페이로드는 항체, 세포 표면 단백질 (예컨대, 내인성 또는 투여된 면역 세포 - 예컨대, T 세포, NK 세포 등에 의해 표적화된 항원 또는 에피토프이거나 이를 포함함), 효소, 유전자 변형 단백질, 자살 단백질, 독소, 바이러스 복제 단백질, 바이러스 표면 항원 등이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 페이로드는 암 치료용으로 승인된 생물학적 약제이거나 이를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서 링커는 종양선택적 번역 서열 요소 및 페이로드 서열 사이에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 2A 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 PT2A 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 F2Am 링커를 포함한다.

항체 약제

암 치료에 유용한 여러 항체 치료제가 당업계에 알려져 있다. mRNA 치료 분야의 최근 개발은 관심 항체 약제를 코딩하는 번역가능한 핵산의 전달이 항체 치료제를 투여하기 위한 실행가능하고 효과적인 전략일 수 있음을 나타낸다 (예를 들어, Van Hocke & Roose, J. Translational Med. 17:54,Feb 22, 2019 참고). 본 개시내용을 판독하는 당업자는 이의 교시가 치료적 항체 약제에 적용가능함을 이해할 것이며; 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 번역가능한 핵산은 치료적 항체 약제이거나 이의 구성요소인 폴리펩티드를 코딩한다. 본 개시내용의 일부 실시양태에서, 이러한 약제는 수용체 티로신 키나제 (예컨대, EGFR, Her2, CD20, FGFR) 또는 혈관형성-유발 인자 (예컨대, VEGF, VEGFR, PDGF, PDGFR)에 대한 항체 약제일 수 있다. 일부 다른 실시양태에서, 페이로드는 항체 약제 (예컨대, 단일 쇄 가변 단편 (scFv), 나노바디 또는 이중특이적 항체), 융합 단백질, 또는 합성 폴리펩티드일 수 있다.

면역 체크포인트 억제제 및 조정자

면역 체크포인트는 면역계의 조절자이다. 이들은 인간 종양의 면역 회피 및 탈출에 유의한 역할을 한다. 이들의 조정자는 암 치료제 분야에서 유의한 효능을 보여주었다 (Wei et al., Cancer Discov. 2018. 10.1158/2159-8290 참고). 종양으로부터 분비될 때 이러한 면역 조정자의 종양내 농도는 더 높고, 이들의 전신 농도는 더 낮다. 이러한 개선된 약동학적 프로파일은 이러한 약제와 연관된 효능을 끌어올리고 독성을 낮출 수 있다. 일부 실시양태에서, 페이로드는 면역 체크포인트 억제제, 즉, 면역 체크포인트 단백질에 대한 길항제 항체 약제, 예컨대, 항-PD1, 항-PDL1, 항-CTLA-4, 항-TIM3, 항-BTLA, 항-VISTA, 항-LAG-3, 항-TIGIT, 항-CD39, 항-SIRP-α일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 다른 실시양태에서, 페이로드는 CD-28, OX40, GITR, CD137, CD27, HVEM 또는 CD27에 대한 효능제 항체이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 다른 실시양태에서, 페이로드는 공동자극 분자, 예컨대, CD80, CD86 및 OX40L일 수 있다.

사이토카인

사이토카인은 면역 세포의 조절에 중요한 역할을 한다. IL-2 및 IFN-알파는 전이성 흑색종 및 신세포 암종 (고 용량, 볼루스 II-2) 및 III기 흑색종 (IFN-알파)의 치료를 위해 FDA 승인을 받은 최초의 두 가지 면역요법 사이토카인이었다 (Lee and Margolin, Cancers (Basel). 2011 Dec; 3(4): 3856-3893). 그러나, 이들의 임상적 사용은 전신 독성 문제로 인해 제한된다 (Rosenberg, J Immunol, 2014, 192 (12) 5451-5458). 당업자는 사이토카인의 종양-선택적 생산 및 분비가 치료적 윈도우를 크게 개선시킬 수 있음을 이해할 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 사용하기 위한 페이로드는 IL-2, IL-2 슈퍼카인/뮤테인, IL-12, IL15, IL15, IL15R-알파 융합체, IL-23, IL-36, TNF-알파, IFN-알파, IFN-감마, FLT3 리간드, CCL4, RANTES, GM-CSF, 또는 이들의 조작된 변이체 또는 융합체일 수 있다.

종양 미세환경 조정자

인간 암에서, 종양 미세환경은 항-종양 면역 반응을 예방하거나 억압하기 위해 자주 변경된다 (Binnewies et al., Nature Medicine, 24, 541-550, 2018; Valkenburg et al., Nature Reviews Clinical Oncology, 15, 366-381, 2018). 세포외 기질을 변경하여 면역 세포 침윤을 향상시키거나 환경을 악화시켜, 차가운 종양을 뜨거운 종양으로 바꾸는 종양 미세환경의 다양한 조정자가 있다. 이러한 조정자 중 일부는 전임상 모델에서 효능의 징후를 보였다. 그러나, 일부 다른 것은 전신 독성 문제로 인해 전임상 또는 임상 개발 중에 중단되지 않았다 (예를 들어, Ramanathan et al, Journal of Clinical Oncology, Jan 18-20, 2018 36.4_suppl.208 참고). 본 개시내용은 전신 효과를 최소화하면서 종양내 활성을 향상시킬 수 있는 이러한 면역 조정자의 국소 분비를 가능하게 하는 방법을 당업자에게 교시한다. 일부 실시양태에서, 페이로드는 단백질, 예컨대, 키누레니나제, 아데노신 데아미나제 (ADA2) 및 15-하이드록시프로스타글란딘 데하이드로게나제 (15-PGDH)일 수 있다. 일부 다른 실시양태에서, 페이로드는 세포외 기질을 분해하고 종양 스트로마를 변경시키는 효소, 예컨대, 히알루로니다제 및 콜레가나제일 수 있다.

세포 표면 항원

당업자는 종양 세포의 표면 상에 발현된 항원 또는 에피토프를 면역학적으로 표적화함으로써 암을 치료하기 위해 개발된 다양한 치료적 기술을 인지하고 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 사용하기 위한 번역가능한 핵산에 의해 코딩된 페이로드는 대상체의 면역 시스템 및/또는 대상체에 투여되는 면역 요법 (예컨대, 세포 요법, 예컨대, CAR-T 또는 CAR-NK 요법, 또는 입양 면역요법)에 의해 면역학적으로 표적화될 수 있는 이러한 항원 또는 에피토프를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 이러한 세포 표면 항원 또는 에피토프는 관련 암세포에 의해 이미 발현된 항원 또는 에피토프이거나 이를 포함할 수 있고; 임의의 특정 이론에 얽매이지 않으면서, 본 개시내용은 이러한 항원 또는 에피토프의 증가된 발현이 이의 표적화를 용이하게 할 수 있음을 제안한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항원 또는 에피토프는 관련 종양 세포에 의해 이미 발현되지 않은 것일 수 있고; 일부 이러한 실시양태에서, 이는 기존의 면역 반응 또는 요법에 의한 표적화를 허용하도록 선택될 수 있다.

유전자 변형 단백질

본 개시내용을 판독하는 당업자는 유전자 변형 효소 및 예를 들어, 암 세포의 게놈, 전사체 등의 하나 이상의 양태를 변형 또는 파괴하기 위한 이들의 사용에 대한 이의 교시의 관련성을 인지할 것이다.

예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 번역가능한 핵산에 의해 코딩된 페이로드는 (예컨대, 뉴클레아제이거나 이를 포함하는) 유전자 변형 단백질이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 변형 효소는 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제 (TALEN), 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), CRISPR 기반 유전자 변형 시스템 (예컨대, Cas 효소)의 하나 이상의 구성요소이거나 이를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 우선적으로 또는 관련 암 세포에서만 발견되는 서열을 표적화하는 유전자 변형 단백질 (예컨대, 뉴클레아제). 그러나, 본 개시내용을 판독하는 당업자는 유전자 변형 단백질 자체가 암 세포에서만 우선적으로 발현될 것이기 때문에, 달성되는 종양선택성의 정도가 암 세포에 특히 특이적이지 않은 서열을 표적화하는 유전자 변형 단백질의 사용을 허용함을 이해할 것이다.

자살 단백질

당업자는 "자살 단백질" ("자살 유전자"에 의해 코딩됨)로서 일반적으로 지칭되는 다양한 단백질을 이해할 것이고, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 번역가능한 핵산에 포함된 페이로드 서열이 자살 단백질이거나 이를 포함한다는 것을 이해할 것이다.

일부 실시양태에서, 자살 단백질은 세포 사멸을 유도하는 단백질이다. 일부 실시양태에서, 자살 단백질은 면역원성 세포 사멸, 예컨대, 네크롭토시스, 파이롭토시스 또는 페롭토시스를 유도하는 단백질이다. 본 개시내용은 네크롭토시스를 유도하는 특정 자살 단백질이 본 개시내용에 따른 사용에 특히 유리할 수 있다는 통찰력을 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용은 네크롭토시스가 적응 면역 반응을 유도 및/또는 촉진할 수 있음을 관찰한다. 임의의 특정 이론에 얽매이지 않으면서, 본 개시내용은 네크롭토시스가 RIPK의 활성화를 야기하는 Fas, TNF 및 LPS를 포함하는 면역 리간드를 포함함을 관찰한다. Dhuriya and Sharma J Neuroinflammation. 2018 Jul 6;15(1):199; Linkermann and Green N Engl J Med. 2014 Jan 30; 370(5): 455-465. 본 개시내용은 적응 면역 반응을 유도 및/또는 촉진할 수 있는 네크롭토시스 자살 단백질의 사용이 종양 세포의 억제, 파괴 및/또는 제거를 용이하게 할 수 있음을 교시한다. 일부 실시양태에서, 자살 단백질은 아폽토시스를 유도하고; 일부 이러한 실시양태에서, 자살 단백질은 p53이거나, p53-매개된 아폽토시스 경로에 관여하는 단백질이다 (예컨대, PUMA, BIM, BAX, BAK, tBID, CASPASE-3, CASPASE-7, CASPASE-8, CASPASE-9).

일부 실시양태에서, 자살 단백질은 이를 발현하는 세포가 별도의 약제에 의한 살해에 보다 감수성이게 만드는 단백질이거나 이를 포함한다. 한 가지 예를 들자면, 당업자는 포유류에서 자연적으로 발견되지 않고 효소(들)를 발현하지 않는 세포에 무해할 수 있는 물질을 독소로 전환시키는 특정 바이러스 및/또는 박테리아 효소를 인지하고 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 자살 단백질은 달리 비활성제 (예컨대, 약물)를 예컨대, 핵산 합성을 억제하는 독성 항대사물질로 전환시키는 효소이거나 이를 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, 자살 단백질은 티미딘 키나제이며, 여기서 티미딘 키나제를 코딩하는 페이로드 서열은 간시클로비르 또는 발라시클로비르 치료와 공동-투여되거나 그 전에 투여된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 사용하기 위한 자살 단백질 페이로드는 혼합 계통 키나제 도메인 유사 슈도키나제 (MLKL), 수용체-상호작용 세린/트레오닌-단백질 키나제 3 (RIPK3), 수용체-상호작용 세린/트레오닌-단백질 키나제 1 (RIPK1), 사멸 도메인을 갖는 Fas-연관 단백질 (FADD) 또는 가스더민 D (GSDMD), 시스테인-아스파르트산 프로테아제, 시스테인 아스파타제 또는 시스테인-의존적 아스파테이트-지시된 프로테아제 (CASPASE-1 또는 CASP-1), CASPASE-4, CASPASE-5, CASPASE-12, PYCARD/ASC (PYD 및 CARD 도메인 함유/사멸 도메인을 갖는 Fas-연관 단백질) 또는 이들의 변이체이다.

독소

일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 사용하기 위한 페이로드는 독소 단백질이거나 이를 포함할 수 있다. 당업자는 암 세포를 살해하는 데 유용할 수 있는 다양한 독소 단백질을 인지할 것이다. 본원에 언급된 바와 같이, 이러한 페이로드가 비-암 세포에서 발현되는 경우 유의한 유해한 효과를 가질 수 있음에도 불구하고 달성된 종양선택성의 정도가 심지어 매우 강력한 페이로드가 활용될 수 있다는 것이 본 개시내용의 하나의 특징이다. 일부 실시양태에서, 페이로드는 암 세포로부터 분비되지 않는 독소이다.

일부 실시양태에서, 독소는 박테리아 독소이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 독소는 독이 있는 동물에 의해 생산된 독소이거나 이를 포함할 수 있다 (예를 들어, Kozlov et al Rec Pat DNA Gene Sequ1:200, 2007 참고). 일부 실시양태에서, 독소는 식물 독소이거나 이를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 페이로드로서 활용될 수 있는 독소는 포스포리파제 또는 레시티나제이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유용한 독소는 치명적인 독소이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유용한 독소는 외독소이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유용한 독소는 기공-형성 독소이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유용한 독소는 발열성 외독소이거나 이를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 페이로드로서 활용될 수 있는 독소는 바실러스 (예컨대, 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis)), 보르타델라 (예컨대, 보르타델라 퍼투시스(Bortadella pertussis)), 클로스트리디움 (클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)), 코리네박테리움 (예컨대, 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae)), 에스케리시아 (예컨대, 대장균(Eschericia coli)), 리스테리아 (예컨대, 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)), 슈도모나스 (슈도모나스 아에루기노사(pseudomonas aeruginosa)), 스타필로코커스 (예컨대, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylocococus aureus)), 스트렙토코커스, 시겔라 (예컨대, 시겔라 디센테리아에(shigella dysenteriae))인 박테리아에서 발견되는 (또는 유래된) 독소이다.

일부 실시양태에서, 독소는 콜레라 독소 (예컨대, A-5B), 디프테리아 독소 (예컨대, A/B), 백일해 독소 (예컨대, A-5B), 대장균 열-불안정 독소 LT (예컨대, A-5B), 시가 독소 (예컨대, A-5B), 슈도모나스 외독소 (예컨대, A/B), 보툴리눔 독소 (예컨대, A/B), 파상풍 독소 (예컨대, A/B), 탄저병 독소 (예컨대, 치사 인자 [LF]), 스타필로코커스 아우레아우스(staphylococcus aureaus) 엑스폴리아틴 B이거나 이를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 독소는 퍼프린지오리신 (예컨대, 클로스트리디움 퍼프린젠스로부터), 용혈소 (예컨대, 대장균으로부터), 리스테리오리신 (예컨대, 리스테리아 모노사이토게네스로부터), 탄저병 EF (예컨대, 바실리스 안트라시스(bacillys anthracis)으로부터), 알파 독소 (예컨대, 스타필로코커스 아우레아우스), 뉴몰리신 (예컨대, 스트렙토코커스 뉴모니아에(streptococcus pneumoniae)로부터), 스트렙톨리신 PO (예컨대, 스트렙토코커스 피오게네스(streptococcus pyogenes)로부터), 류코시딘 (예컨대, 스타필로코커스 아우레우스로부터)이거나 이을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 독소는 외독소의 구성요소 (예컨대, 탄저병 독소의 치사 인자), 즉, 그 자체로 포유동물 세포로 내재화될 수 없는 것일 수 있다.

일부 실시양태에서, 독소는 리신 또는 아마니틴이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 독소는 알파-아마니틴이거나 이를 포함할 수 있다.

유도성 또는 억압성 단백질

유전자 조학 및 합성 생물학의 최근 발전은 소분자 조정자를 통해 유도성 또는 억압성인 단백질을 허용한다. 일부 실시양태에서, 억압성 단백질은 리간드-유도 분해 (LID) 도메인에 융합될 수 있으며, 이는 소분자 쉴드-1로 처리시 단백질의 단백질분해 절단을 초래한다. 일부 다른 실시양태에서, 유도성 단백질은 이합체화에 의해 소분자 리미두시드에 의해 활성화되는 유도성 카스파제-9일 수 있다. 활성화된 카스파제-9는 세포의 빠른 아폽토시스를 야기한다. 일부 다른 실시양태에서, 유도 또는 억압은 다른 분해 도메인 (예컨대, 디하이드로폴레이트 환원효소 기반 불안정화 도메인) 또는 이합체화 도메인 (예컨대, FKBP-FRB) 및/또는 다른 소분자 (예컨대, 독시사이클린, 라파마이신, 트리메토프림)를 통해 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 사용하기 위한 페이로드는 유도성 또는 억압성 단백질이거나 이를 포함할 수 있다.

바이러스 단백질

당업자는 본원에 기재된 페이로드로서 유용한 단백질을 생산하는 다양한 바이러스를 인지하고 있다. 일부 실시양태에서, 페이로드는 바이러스 단백질이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 페이로드는 엡스타인-바 바이러스의 LMP1 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서 페이로드는 종양용해성 바이러스 단백질이거나 이를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 페이로드는 바이러스 복제 단백질이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이러스 복제 단백질은 바이러스 복제 주기에 필요한 단백질이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 복제 단백질은 효소이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 복제 단백질은 프로테아제, 폴리머라제 또는 전사효소이다.

생산

본 개시내용을 판독하는 당업자는 본원에 기재된 바와 같은 번역가능한 핵산을 생산하기 위해 유용하게 사용될 수 있는 다양한 기술이 이용가능함을 이해할 것이다. 일부 실시양태에서, 이러한 생산은 엑스 비보 (즉, 본원에 기재된 바와 같은 암 치료를 필요로 하는 대상체 외부에서)일 수 있이며; 일부 실시양태에서, 이러한 생산은 생체내일 수 있다.

일부 실시양태에서, 번역가능한 핵산은 화학적 합성 및/또는 화학적 변형 (예컨대, 캡핑)에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 생산될 수 있다.

일부 실시양태에서, 번역가능한 핵산은 주형 핵산의 복사에 의해 (예컨대, 복제 또는 전사를 통해) 전체적으로 또는 부분적으로 생산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 복사는 엑스 비보일 수 있고; 일부 실시양태에서, 이는 생체내일 수 있다.

전달

본 개시내용을 판독하는 당업자는 본 개시내용에 따라 (적어도) 암 세포에 번역가능한 핵산의 전달을 달성하기 위해 다양한 기술이 이용가능함을 이해할 것이며, 더욱이 일부 전달 방식이 번역가능한 핵산 (예컨대, mRNA)을 포함하는 조성물의 투여를 포함하고, 일부 전달 방식이 (예컨대, 번역가능한 핵산을 코딩하고 주형화하는 벡터의 투여를 통해) 투여 후 번역가능한 핵산이 생성되는 조성물의 투여를 포함함을 이해할 것이다.

나노입자 전달

본원에 언급된 바와 같이, 당업자는 포유동물 (예컨대, 인간) 대상체 내를 비롯하여 세포에 핵산의 효과적인 전달을 달성하기 위해 다양한 투여 시스템이 개발되었음을 인지할 것이다.

이러한 이용가능한 기술 중에는, 예를 들어, 하이드로겔, 지질 및/또는 중합체 나노입자 기술을 포함하는 다양한 나노입자 기술이 있다.

일부 실시양태에서, 핵산은 지질 나노입자를 사용하여 본 개시내용에 따라 대상체에 전달된다. 본원에 사용된 바와 같이, 어구 "지질 나노입자"는 하나 이상의 지질 (예컨대, 양이온성 지질, 비-양이온성 지질, 및 PEG-변형된 지질)을 포함하는 전달 비히클을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 지질 나노입자는 핵산의 하나 이상의 카피를 하나 이상의 표적 세포에 전달하도록 제형화된다. 적합한 지질의 예는 예를 들어, 포스파티딜 화합물 (예컨대, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 스핑고지질, 세레브로시드, 및 강글리오시드)을 포함한다.

일부 실시양태에서, 핵산은 중합체 나노입자를 사용하여 본 개시내용에 따라 대상체에 전달된다. 적합한 중합체는 예를 들어, 폴리아크릴레이트, 폴리알키시아노아크릴레이트, 폴리락티드, 폴리락티드-폴리글리콜리드 공중합체, 폴리카프로락톤, 덱스트란, 알부민, 젤라틴, 알기네이트, 콜라겐, 키토산, 사이클로덱스트린, 덴드리머 및 폴리에틸렌이민을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 전달에 사용하기 위한 지질은 본원에 참조로 원용되는 국제 특허 공개공보 WO 2010/053572호에 기재된 것들을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 2012 년 3 월 29 일에 출원된 미국 가특허출원 제61/617,468호 (본원에 참조로 원용됨)에 기재된 이온화가능한 양이온성 지질을 포함하는 지질 나노입자, 예컨대, (15Z,18Z)-N,N-디메틸-6-(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-l-일)테트라코사-15,18-디엔-1-아민 (HGT5000), (15Z,18Z)-N,N-디메틸-6-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)테트라코사-4,15,18-트리엔-l-아민 (HGT5001), 및 (15Z,18Z)-N,N-디메틸-6-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)테트라코사-5,15,18-트리엔-1-아민 (HGT5002)를 사용한다.

일부 실시양태에서, 지질 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 또는 "DOTMA"가 사용된다. (Feigner et al. (Proc. Nat'l Acad. Sci. 84, 7413 (1987); 미국특허 제4,897,355호). DOTMA는 단독으로 제형화되거나 중성 지질, 디올레오일포스파티딜-에탄올아민 또는 "DOPE" 또는 기타 양이온성 또는 비-양이온성 지질과 조합되어 리포솜 전달 비히클 또는 지질 나노입자로 될 수 있으며, 이러한 리포솜은 핵산의 표적 세포로의 전달을 향상시키는 데 사용될 수 있다. 다른 적합한 지질은 예를 들어, 5-카복시스페밀글리신디옥타데실아미드 또는 "DOGS", 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민-카복사미도)에틸]-N,N-디메틸-l-프로판아미늄 또는 "DOSPA" (Behr et al. Proc. Nat.'l Acad. Sci. 86, 6982 (1989); 미국특허 제5,171,678호; 미국특허 제5,334,761호), l,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판 또는 "DODAP", l,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 또는 "DOTAP"를 포함한다. 고려되는 지질은 또한 l,2-디스테아릴옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판 또는 "DSDMA", 1,2-디올레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판 또는 "DODMA", 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판 또는 "DLinDMA", l,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판 또는 "DLenDMA", N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드 또는 "DODAC", N,N-디스테아릴-N,N-디메틸아르노늄 브로마이드 또는 "DDAB", N-(l,2-디미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드 또는 "DMRIE", 3-디메틸아미노-2-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시부탄-4-옥시)-1-(시스,시스-9,12-옥타데카디에녹시)프로판 또는 "CLinDMA", 2-[5'-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시)-3'-옥사펜톡시)-3-디메틸 1-1-(시스,시스-9', 1-2'-옥타데카디에녹시)프로판 또는 "CpLinDMA", N,N-디메틸-3,4-디올레일옥시벤질아민 또는 "DMOBA", 1,2-N,N'-디올레일카르바밀-3-디메틸아미노프로판 또는 "DOcarbDAP", 2,3-딜리놀레오일옥시-N,N'-디메틸프로필아민 또는 "DLinDAP", l,2-N,N'-딜리놀레일카르바밀-3-디메틸아미노프로판 또는 "DLincarbDAP", l,2-딜리놀레오일카르바밀-3-디메틸아미노프로판 또는 "DLinCDAP", 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[l,3]-디옥솔란 또는 "DLin- -DMA", 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[l,3]-디옥솔란 또는 "DLin-K-XTC2-DMA", 및 2-(2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,l 2-디엔-1-일)-l,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸에탄아민 (DLin-KC2-DMA)) (WO 2010/042877호; Semple et al., Nature Biotech. 28: 172-176 (2010) (Heyes, J., et al., J Controlled Release 107: 276-287 (2005); Morrissey, DV., et al., Nat. Biotechnol. 23(8): 1003-1007 (2005); PCT 공개공보 WO2005/121348A1호 참고), DLin-MC3-DMA (WO2015199952A1호 Tam and Cullis Pharmaceutics. 2013 Sep; 5(3): 498-507 참고) 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 콜레스테롤-기반 양이온성 지질의 사용이 또한 본 발명에 의해 고려된다. 이러한 콜레스테롤-기반 양이온성 지질은 단독으로 또는 다른 양이온성 또는 비-양이온성 지질과 조합하여 사용될 수 있다. 적합한 콜레스테롤-기반 양이온성 지질은 예를 들어, DC-Choi (N,N-디메틸-N-에틸카복사미도콜레스테롤), l,4-비스(3-N-올레일아미노-프로필)피페라진 (Gao, et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 179, 280 (1991); Wolf et al. BioTechniques 23, 139 (1997); 미국특허 제5,744,335호), 또는 ICE를 포함한다.

일부 실시양태에서, 종양용해성 바이러스는 암 세포를 우선적으로 감염시키고 살해하는 바이러스이다. 일부 실시양태에서 종양용해성 바이러스는 암 세포를 우선적으로 감염시키고 살해하는 야생형 바이러스이다. 일부 실시양태에서 종양용해성 바이러스는 암 세포를 우선적으로 감염시키고 살해하는 조작된 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 종양용해성 바이러스는 헤르페스 바이러스, 백시니아 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 폴리오바이러스, 레오바이러스, 세네카바이러스, 아데노바이러스일 수 있다.

벡터 전달

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 번역가능한 핵산은 번역가능한 핵산을 코딩 및/또는 주형화하는 핵산 벡터의 투여에 의해 대상체에 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유용한 벡터는 바이러스 벡터이거나 이를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 벡터 시스템 (예컨대, 바이러스 벡터 시스템)은 자연에서 발견되는 구성요소 및/또는 서열 (즉, 야생형 구성요소 및/또는 서열)이거나 이를 포함할 수 있으며; 일부 실시양태에서, 벡터 시스템은 조작된 구성요소 및/또는 서열 (즉, 서열이 적절한 야생형 참조에 비해 변형된 구성요소 및/또는 야생형 참조에서 함께 발견되지 않지만, 예를 들어, 복수의 상이한 공급원으로부터의 구성요소의 집합을 나타내는 구성요소)이거나 이를 포함할 수 있다.

당업자는 본 개시내용에 따라 유용할 수 있는 다양한 바이러스 벡터 시스템에 익숙하다.

일부 실시양태에서, 바이러스 벡터 시스템은 암 세포를 우선적으로 감염시키는 바이러스 (예컨대, 종양용해성 바이러스)이거나 이의 구성요소를 포함할 수 있다. 당업자는 예를 들어, 백시니아 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 폴리오바이러스, 레오바이러스, 세네카바이러스, 및 아데노바이러스를 포함하는 다양한 종양용해성 바이러스를 인지하고 있다.

본 개시내용은 종양용해성 바이러스 벡터 시스템의 사용이 예를 들어, 종양 세포에 대한 살해의 상보적 메커니즘을 잠재적으로 제공하는 데 있어서 특정 이점을 가질 수 있다는 통찰력을 제공한다.

그러나, 본원에 언급된 바와 같이, 본 개시내용에 따라 달성된 종양선택성의 정도는 핵산 전달 벡터의 종양선택성을 본 개시내용의 많은 실시양태에 중요하지 않게 한다.

대상체

본원에 기재된 바와 같이, 본 개시내용은 암 치료에 특히 유용한 기술을 제공한다.

일부 실시양태에서, 제공된 기술은 암을 앓는 대상체에 적용된다. 즉, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 번역가능한 핵산 (예컨대, 하나 이상의 종양선택적 번역 서열 요소 및 페이로드-코딩 서열을 포함함)은 (예컨대, 번역가능한 핵산을 포함하는 조성물, 또는 번역가능한 핵산이 대상체에서 또는 대상체에 의해 생성되도록 유발하는 조성물의 투여에 의해) 전달된다.

일부 실시양태에서, 대상체는 다른 요법 (예컨대, 암 및/또는 암 또는 이의 치료의 하나 이상의 부작용을 치료하기 위한 다른 요법)을 받았고/거나, 받고 있고/있거나 받을 것이다. 일부 이러한 실시양태에서, 페이로드는 다른 요법에 대한 세포의 감수성을 증가시키는 단백질이거나 이를 포함한다.

일부 실시양태에서, 대상체는 건강한 세포에서 정지 코돈 판독초과를 유발하는 것으로 알려진 약제를 받고 있지 않다. 일부 실시양태에서, 대상체는 아미노글리코시드 및/또는 마크로리드를 받고 있지 않다.

일부 실시양태에서, 대상체는 낭포성 섬유증 및/또는 뒤센 근이영양증 요법 (예컨대, 아탈루렌 또는 PTC124)을 받고 있지 않다.

일부 실시양태에서, 대상체는 피로나리딘 테트라포스페이트 (항-말라리아), 및 포타슘 파라-아미노벤조에이트 (PABA, 페이로니 질환에 사용됨), 실험 화합물 RTC13, RTC14 및 NB54, 및/또는 허브 보충제 에신을 받고 있지 않다.

일부 실시양태에서, 대상체는 리보솜병증, 예컨대, 다이아몬드-블랙판 빈혈, 선천성 각화이상증, 슈와흐만-다이아몬드 증후군, 5q-골수이형성 증후군, 트리처 콜린스 증후군, 연골-모발 저형성증, 고립된 선천성 무기력증, 보웬-콘라디 증후군, 북미 인디언 아동 간경변증에 의해 영향을 받지 않는다.

예증

실시예 1: 예시적인 종양선택적 판독-초과 모티프

본 실시예는 본원에 기재된 바와 같이 종양선택적 발현을 부여하는 특정 예시적인 판독-초과 모티프 (즉, "종양선택적 판독-초과 모티프")뿐만 아니라 이러한 모티프를 식별 및/또는 특성화하기 위한 특정 접근법을 설명한다. 본원에 기재된 바와 같이, 본 개시내용은 특정 구조적 특징 (예컨대, 일차, 이차 및/또는 삼차 구조적 특성화)을 갖는 핵산 서열 요소가 특히 암세포에서 특이적으로 판독-초과 번역을 지시함으로써 비-질환 세포에 비해 암 세포에서 선택적 번역을 지시한다는 것을 교시하며; 따라서, 본 개시내용은 종양선택적 판독-초과 모티프인 서열 요소를 정의하고 특성화하고 기재한다.

본원에 기재된 특정 종양선택적 판독-초과 모티프 (즉, 적절하게 비교가능한 비-암 세포와 비교하여 암 세포에서 특이적으로 mRNA 정지 코돈의 판독-초과를 지시함)를 상이한 기술의 조합을 사용함으로써 식별 및/또는 특성화하였다. 일부 실시양태에서, 종양선택적 발현을 부여하는 판독-초과 모티프는 (1) 리보솜 프로파일링 (예컨대, Ribo-seq) 분석에서 증가된 리보솜 점유를 나타내고, (2) 이의 존재가 암-특이적 프로테옴에서 LC/MS에 의해 검출가능한 3'-UTR-코딩된 펩티드의 상승된 수준과 상관관계가 있고/있거나, (3) 리포터 작제물에 포함될 때 하나 이상의 종양선택적 리보솜에 대한 증가된 판독-초과를 구체적으로 부여한다는 것을 특성화한다.

실제로, 무엇보다도, 본 개시내용은 전사체 내의 서열의 번역을 평가하기 위해 당업계에서 활용되는 특정 기술의 문제의 원인에 관한 구체적인 통찰력을 제공하고, 유용한 종양선택적 판독-초과 모티프의 식별 및/또는 특성화에 효과적인 전략을 설명한다.

예를 들어, 본 개시내용은 이용가능한 기술, 예컨대, Ribo-seq (리보솜 프로파일링)이 예를 들어, 임의의 주어진 세포에서 리보솜 위치에 대한 전사체-전반의 정보를 제공하는 데 유용하다는 것을 이해하고 있다. 본 개시내용은 (특히 삼중항 주기성과 관련하여) 이러한 정보가 번역 효율을 추론하는 데 사용될 수 있지만, 리보솜을 저속화하거나 멈추게 하는 RNA 서열 및 구조에 편향되어 있으며, 명백한 판독-초과 모티프로서의 이러한 서열 및 구조를 "거짓" 식별할 수 있다는 통찰력을 제공한다.

본 개시내용은 리보솜 국소화 분석의 이러한 문제가 동일한 편향을 갖지 않는 하나 이상의 상보적 분석을 수행함으로써 적어도 부분적으로 해결될 수 있음을 교시한다. 예를 들어, 본 개시내용은 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LC/MS)이 이러한 RNA-수준 인공물이 없다는 것을 이해하고 있으며; 단백질 또는 폴리펩티드는 고해상도 LC/MS 시스템, 예컨대, Orbitrap으로 용이하게 검출될 수 있다. 그러나, 본 개시내용은 예를 들어, 낮은 날림성을 갖는 펩티드가 LC/MS-전용 접근법으로 과소표현되거나 놓칠 수 있다는 점에서 이러한 LC/MS 기술의 문제의 원인을 추가로 이해하고 있다. 또한, 액체 크로마토그래피의 특정 분획의 가장 풍부한 20 개의 펩티드에 속하지 않는 펩티드는 검출되지 않는다.

본 개시내용은 예를 들어, 하나 이상의 리보솜 점유 분석 기술 (예컨대, Ribo-seq/리보솜 프로파일링) 및 하나 이상의 폴리펩티드 분석 기술 (예컨대, LC/MS, 리포터 폴리펩티드 등)의 조합을 구체적으로 포함하는 기술의 조합의 신중한 선택이 본원에 기재된 바와 같이 종양선택적 판독-초과 모티프(들)를 정확하고 및/또는 효율적으로 식별 및/또는 특성화하는 데 중요할 수 있음을 입증한다.

본 실시예는 암 세포 및 건강한 세포에서 판독-초과 전사체를 철저히 조사하고/하거나 특정 종양선택적 판독-초과 모티프를 정의 및/또는 특성화하기 위한 Ribo-seq 및 LC/MS 기술의 조합의 사용을 설명한다.

프로테오믹 수준에서 판독-초과 이벤트를 결정하기 위해, 질량-분석법-기반 데이터 생성 파이프라인을 구축하였다. 예컨대, Mertins et al. Nature. 2016 May 25; 534(7605): 55-62 참고. 간단히 말해서, 3' UTR로만 코딩할 수 있는 추정 펩티드 목록은 맞춤형 파이썬 스크립트를 사용하여 준비하였다. 그런 다음, 일반 CDS (SwissProt 인간 프로테옴으로부터), 추정 소형 개방 판독 프레임 (sORF) 펩티드 데이터세트 (Price2, ORF-RATER, Rp-Bp), 셀레노단백질 데이터세트 (selenoDB) 및 오염 펩티드를 검색 공간에 첨가하였다. 데코이 펩티드를 MaxQuant 소프트웨어 (버전 1.6.4.0)에 의해 생성하였다. MS-MS 탠덤 이온 스펙트럼을 클라우드 컴퓨팅 (96 vCPU, 768 GB RAM, 4x900 GB SSD를 갖는 AWS 인스턴스)을 통해 MaxQuant에 의해 검색 공간의 추정 펩티드와 분석하고 매칭하였다. 판독 파일을 3'UTR로만 코딩할 수 있는 펩티드를 추출하기 위해 맞춤형 파이썬 스크립트로 분석하였다. 펩티드가 인간 CDS로부터 기인할 수 없음을 검증하기 위해, 펩티드 서열을 NCBI 인간 프로테옴에 대해 블라스팅하였다. 또한, 공개적으로 이용가능한 LC-MS 데이터를 사용하여, 본 발명자들은 이러한 펩티드가 인간 종양 또는 건강한 샘플에서 생산되는지 여부, TCGA 유방암 MS 프로테옴 데이터 및 CPTAC 건강한 유방 프로테옴 데이터, 및 17 명의 건강한 성인 조직, 7 개의 태아 조직 및 6 개의 정제된 일차 조혈 세포를 각자 포함하는 인간 프로테옴 데이터의 초안 맵을 조사하였다 (Mertins et al., 2016. Nature. 534(7605):55-62; Kim et al., 2014. Nature. 509(7502):575-81). 이 파이프라인은 정지 코돈 판독-초과 이벤트를 통해 리보솜에 의해서만 생산될 수 있는 많은 수의 펩티드를 식별하였다.

핵산 서열 상의 리보솜 위치 및 건강한 세포 및 암 세포로부터의 게놈-전체 번역 프로파일링을 분석하여, 판독-초과를 또한 제안할 3'UTR 영역에서의 더 많은 수의 리보솜을 갖는 전사물을 식별하였다. 예컨대, Zur et al., Sci Rep. 2016 Feb 22;6:21635; Ingolia et al. Science. 2009 Apr 10;324(5924):218-23 참고. 간단히 말해서, 리보솜에 의해 보호되는 mRNA 영역을 딥 시퀀싱하였다. 28-32 개의 nt의 판독체를 리보솜이 점유하는 영역을 식별하기 위해 전사체에 맵핑하였다. 이 분석은 GAPDH의 3'UTR 영역이 상대적으로 낮은 리보솜 점유율을 갖는 것으로서 식별된 반면, FUNDC1 및 CYTH1 둘 모두는 3'UTR에 대한 상대적으로 높은 판독 계수를 갖는다.

질량 분석법 파이프라인에 의해 식별된 펩티드 데이터 세트에 상응하는 핵산 서열은 Ribo-Seq로 분석되었는데, 그 이유는 번역 리보솜 풋프린트가 3'UTR 서열에서 발견될 때 정지 코돈 판독-초과 이벤트가 검증될 수 있기 때문이다. Trips-Viz 서버 도구 (Michel et al, 2018 Nucleic Acids Res. 2018 Jan 4;46(D1):D823-D830; Kiniry et al, Nucleic Acids Res. 2019 Jan 8;47(D1):D847-D852)를 인간 악성종양 및 건강한 세포주로부터의 24 개의 데이터세트에서 리보솜 풋프린트에 대한 관심 전사물을 확인하는 데 사용하였다. 또한, 생물정보학 도구의 독점 파이프라인 및 Ribo-seq 분석을 위한 그래픽 사용자 인터페이스를 사용하였다. CDS 영역 상의 판독수를 3' UTR로부터의 판독수와 비교하였다. 건강한 데이터 세트의 더 적은 양의 데이터를 설명하기 위해, Ribo-seq 분석의 삼중항 주기성 컷오프를 암세포의 경우 0.72, 건강한 세포의 경우 0.000으로 설정하였다. 각각의 전사물에 대해, CDS 영역 내에서 활성적으로 번역된 mRNA를 나타내기에 충분한 수의 판독체 (>500 개의 판독체)가 있고 다른 다운스트림 ORF에 상응하지 않는 3'UTR 영역 내에 명확한 리보솜 풋프린트 신호가 있는 경우, 그 전사물을 판독-초과 mRNA로 간주하였다.

판독-초과 전사물을 또한 역순으로 검색하였다. 인간 전사물의 판독-초과 속도를 Ribo-seq에 의해 결정하였고, 질량 분석법 데이터세트를 상위 Ribo-seq 히트가 LC/MS 판독-초과 데이터세트에 또한 존재하는지 여부를 결정하기 위해 확인하였다. 높은 Ribo-seq 판독 계수는 번역을 방해하는 mRNA의 이차 구조로부터 기인할 수 있으므로, 암 세포의 높은 번역 속도와 상관 관계가 없을 수 있다.

무엇보다도, 본원에 기재된 분석은 정지 코돈 UAA 및 UAG를 갖는 종양-선택적 판독초과 전사물의 업스트림 3'UTR 서열 (10 mer)이 종양-선택적 판독초과 전사물을 함유하는 UGA의 3'UTR 서열과 비교하여 서로 더 밀접하게 연관되어 있음을 식별하였다. 완전 연계된 자동인코더인 딥 러닝 모델은 UAA 및 UAG 그룹이 잠재 공간에서 매우 긴밀한 클러스터를 갖는 반면 UGA 그룹은 확산 표현을 가지고 있음을 보여주었다 (도 14 및 15). 이는 문헌에 보고된 정지 코돈의 효율성과 상관관계가 있다 (Loughran et al., Nucleic Acids Res. 2014; 42:8928-38).

또한, NUPACK 및 CoFold를 포함하는 알고리즘을 사용하여 표준 정지 코돈 근처의 구조적 특징에 대해 판독-초과 정지 코돈을 갖는 것으로서 식별된 핵산 서열을 분석하였다. 위치 가중치 매트릭스 기반 서열 분석을 CDS의 마지막 120 개의 뉴클레오티드 및 mRNA 판독-초과 전사물의 3'UTR의 처음 120 개의 nt에 적용하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, 3 개의 가능한 정지 코돈 각각에 대해 암 판독-초과 전사물은 건강한 판독-초과 전사물과 비교하여 3'UTR의 처음 120 개의 뉴클레오티드, 특히 처음 48-50 개의 뉴클레오티드 내에서 G-C 과잉표현을 가지고 있다. 추가적으로, 도 10에 도시된 바와 같이, 판독-초과 정지 코돈을 갖는 암 판독-초과 전사물의 코딩 서열 (CDS)의 마지막 120 개의 뉴클레오티드는 또한 건강한 판독-초과 전사물과 비교하여 G-C 뉴클레오티드의 과잉표현을 갖는다. 건강한 판독-초과 전사물은 또한 CDS 및 3'UTR 둘 모두에서 비-판독초과 전사물과 비교할 때 G-C 과잉표현을 갖는다. 인간 전사체의 CoFold 분석은 정지 코돈 주변 영역을 검토하여 수행하였다 (CDS에서 100 개의 뉴클레오티드, 3'UTR에서 100 개의 nt). 이 분석은 정지 코돈 판독-초과가 정지 코돈 주변, 특히 정지 코돈 및 3'UTR 서열의 처음 16 개의 뉴클레오티드 내에서 더 높은 정도의 염기 쌍, 즉, 더 구조화된 영역, 예컨대, 스템 루프 및 벌지 루프를 포함한다는 것을 보여주었다 (도 11). 암 전사물은 정지 코돈 영역 주변에서 훨씬 더 구조화되어 있다. 이 증가된 상대적 구조는 건강한 판독-초과 전사물에 비해 평균 7.52 kcal/몰 더 낮은 ΔG 값에 상응한다. 암 전사물은 3'UTR의 처음 50 개의 뉴클레오티드 내에서 평균 22.5 개의 염기쌍 (대 21.6 개의 염기쌍) 및 55% GC 함량 (대 42%)을 가지고 있다.

실시예 2: 예시적인 종양선택적 판독-초과 작제물

본 실시예는 본원에 기재된 바와 같은 예시적인 종양선택적 판독-초과 모티프뿐만 아니라 이의 특정 특성화를 통합하는 작제물을 설명한다.

예를 들어, 실시예 1에 기재된 바와 같이 식별 및/또는 특성화된 추정 종양-선택적 판독-초과 모티프를 통합하는 작제물을 제조하였다. Ribo-seq 분석에서 종양선택적 판독-초과 프로파일을 갖는 것으로 입증된 질량 분석법 판독-초과 이벤트 목록으로부터의 10 개의 히트가 종양선택적 작제물에 포함되도록 선택하였다. 이러한 예시적인 추정 종양선택적 판독-초과 모티프의 서열은 표 1에 나열되어 있다.

도 2는 나노-루시퍼라제를 코딩하는 작제물에서 판독-초과 모티프가 삽입된 위치를 설명하는 예시적인 테스트 작제물 맵을 도시한다. 이 특정 판독-초과 모티프는 정지 코돈 주변의 추정 종양선택적 판독-초과 서열을 포함하였으며; 판독-초과 모티프는 정지 코돈뿐만 아니라 인접 코딩 영역으로부터 유래된 플랭킹 서열 및 카세트가 유래된 원래 유전자의 3'UTR을 포함하였다. 도 3은 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC) 또는 H1299 폐암 세포로 형질주입되었을 때 10 개의 작제물 각각의 나노-루시퍼라제 발현 수준을 도시한다. 테스트한 대부분의 판독-초과 서열은 건강한 세포에 비해 암 세포에서 선호되는 발현을 보여주었다. 도 4는 작제물 U2n의 정지 코돈 주변 영역의 폴딩을 도시한다. 정지 코돈 및 3'UTR 서열에 걸쳐 있는 큰 스템 루프 구조가 있다.

본원에 기재된 바와 같이 후보 및/또는 식별된 종양선택적 판독-초과 모티프의 종양선택성을 추가로 평가하기 위해, 예시적인 판독-초과 서열을 반딧불이 루시퍼라제 서열에 삽입하여 도 5에 입증된 바와 같이 작제물, Onco-333을 생성하였다. 도 6을 참조하여 알 수 있는 바와 같이, 이 작제물은 백혈병 K562 세포 및 형질전환된 HEK293 세포에서 발현되었지만 건강한 BJ 포피 세포에서는 발현되지 않았다. 추가적으로, 야생형 반딧불이 루시퍼라제 mRNA는 건강한 마우스 조직에서 발현되었지만, 판독-초과 서열을 함유하는 반딧불이 루시퍼라제 서열은 건강한 마우스 조직에서 발현되지 않았다 (도 7). 도 8에 도시된 바와 같이, 이 작제물을 또한 양성 발현을 나타내는 인간 또는 뮤린 기원의 TP53 돌연변이체 암 세포주에서 테스트하였다. 이 데이터는 판독-초과 모티프의 종양선택성을 입증한다.

Onco-333 fLuc 서열 (UTR 서열 및 폴리 A 꼬리는 대문자로 표시됨):

GAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACCatggaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcgccattctatccgctggaagatggaaccgctggatagcaactgcataaggctatgaagagatacgccctggttcctggaacaattgcttttacagatgcacatatcgaggtggacatcacttacgctgagtacttcgaaatgtccgttcggttggcagaagctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacagaatcgtcgtatgcagtgaaaactctcttcaattctttatgccggtgttgggcgcgttatttatcggagttgcagttgcgcccgcgaacgacatttataatgaacgtgaattgctcaacagtatgggcatttcgcagcctaccgtggtgttcgtttccaaaaaggggttgcaaaaaattttgaacgtgcaaaaaaagctcccaatcatccaaaaaattattatcatggattctaaaacggattaccagggatttcagtcgatgtacacgttcgtcacatctcatctacctcccggttttaatgaatacgattttgtgccagagtccttcgatagggacaagacaattgcactgatcatgaactcctctggatctactggtctgcctaaaggtgtcgctctgcctcatagaactgcctgcgtgagattctcgcatgccagagatcctatttttggcaatcaaatcattccggatactgcgattttaagtgttgttccattccatcacggttttggaatgtttactacactcggatatttgatatgtggatttcgagtcgtcttaatgtatagatttgaagaagagctgtttctgaggagccttcaggattacaagattcaaagtgcgctgctggtgccaaccctattctccttcttcgccaaaagcactctgattgacaaatacgatttatctaatttacacgaaattgcttctggtggcgctcccctctctaaggaagtcggggaagcggttgccaagaggttccatctgccaggtatcaggcaaggatatgggctcactgagactacatcagctattctgattacacccgagggggatgataaaccgggcgcggtcggtaaagttgttccattttttgaagcgaaggttgtggatctggataccgggaaaacgctgggcgttaatcaaagaggcgaactgtgtgtgagaggtcctatgattatgtccggttatgtaaacaatccggaagcgaccaacgccttgattgacaaggatggatggctacattctggagacatagcttactgggacgaagacgaacacttcttcatcgttgaccgcctgaagtctctgattaagtacaaaggctatcaggtggctcccgctgaattggaatccatcttgctccaacaccccaacatcttcgacgcaggtgtcgcaggtcttcccgacgatgacgccggtgaacttcccgccgccgttgttgttttggagcacggaaagacgatgacggaaaaagagatcgtggattacgtcgccagtcaagtaacaaccgcgaaaaagttgcgcggaggagttgtgtttgtggacgaagtaccgaaaggtcttaccggaaaactcgacgcaagaaaaatcagagagatcctcataaaggccaagaagggcggaaagatcgccgtgtaaGCTGCCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (서열번호 22)

Onco-333 RT 모티프:

ctatccgctggaagatggaaccgctggaTAGcaactgcataaggctatgaagaga (서열번호 23)

점 괄호 표기법:

실시예 3: 예시적인 종양선택적 판독-초과 작제물

본 실시예는 본원에 기재된 바와 같은 예시적인 종양선택적 판독-초과 모티프뿐만 아니라 이의 특정 특성화를 통합하는 작제물을 추가로 설명한다.

onco-333의 번역 활성을 FL-62891 세포에서 7 일 동안 32⁰ 및 39⁰의 2 개의 상이한 조건 하에서 테스트하였다. 39'C로 이동하면, FL-62891 세포에서 발견되는 SV40 항원의 열 민감성 변이체가 비활성화되어, p53 기능의 탈-억제 (즉, 활성화) 및 p21 수준의 증가 및 p53 상의 음성 피드백 루프에 의한 감소하는 p53 수준을 초래한다. 세포를 50,000 개의 세포/웰로 백색-바닥 96-웰 플레이트에 씨딩하였다. 플레이트를 상응 온도로 유지하고, 48 시간 후 세포를 200 ng onco-333 mRNA/웰로 형질주입시켰다. 16 시간의 항온처리 후, Promega GloMax 플레이트 판독기에서 Bright-Glo 루시퍼라제 검정으로 반딧불이 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 형질주입은 삼중으로 수행하였고, 데이터는 평균 +/- SD로서 도시하였다. (p= 0.019). 특히, p53 활성의 감소는 증가된 onco-333 발현을 초래한다. 도 16.

도 17은 본 개시내용에 기재된 종양선택적 모티프를 포함하는 작제물로부터 나노-루시퍼라제의 종양선택적 발현을 도시한다. 건강한 인간 내피 세포 (HUVEC) 및 인간 폐암 세포 (NCI-H1299)를 추정 종양선택적 나노-루시퍼라제 작제물 (U11-U17)로 형질주입시키고, 24 시간 후에 나노-루시퍼라제 (nLuc) 활성을 Promega GloMax Discover 마이크로플레이트 판독기로 측정하였다. 도 17a는 암 세포에서 종양선택적 작제물로부터의 나노-루시퍼라제의 특이적 발현을 도시한다. 건강한 인간 섬유아세포 (WI-38) 및 인간 폐암 세포 (NCI-H1299)를 추정 종양-선택적 반딧불이-루시퍼라제 (fLuc) 작제물로 형질주입시키고, 24 시간 후에 상대적인 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 도 17b는 암 세포에서의 종양선택적 작제물로부터 반딧불이-루시퍼라제의 특이적 발현을 도시한다. 형질주입을 삼중으로 수행하였다. 평균 +/- 표준편차로서 도시된 데이터.

이들 예시적인 추정 종양선택적 판독-초과 모티프의 서열은 표 2에 나열되어 있다:

등가물

당업자는 일상적인 실험만을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 구체적인 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범주는 위의 설명으로 제한되는 것으로 의도되지 않고, 오히려 다음 청구범위에 제시된 바와 같다:

SEQUENCE LISTING <110> KERNAL BIOLOGICS, INC. <120> ENGINEERED ONCOSELECTIVE PROTEIN EXPRESSION <130> 2013260-0006 <140> PCT/US2020/038742 <141> 2020-06-19 <150> 62/864,673 <151> 2019-06-21 <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 aaacgcaagc aagaggaaca aatggaaact gagcattttg ctctgtaaag catttcagat 60 gcagcttgtg tg 72 <210> 2 <211> 306 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2 gcgctgaccc agctgatcca gctctatcat cgcttccacc gggtgctgtc ccagccgcag 60 ctccgagccc tccctgcccg ggctgagctc atcaacattc accaccttat ggtggagctc 120 aagaagcata agcccaactt ctgatgtgcc agaaaccgcc ctgagatctg ccggtcatct 180 ccatggactt ctgcacccca ttccataccc ttcttcacct ggggtacccc ttccagtttt 240 ccccttgctt cccaggccct tgacatggct tacctgcctt cactcccagc accttgccca 300 acagga 306 <210> 3 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 3 cttccagcag aggagaacat gtctaacacg tgcctcaaaa gcactgggga gttagtagtg 60 cagtggcatc tgaaacctgt ggagcagaaa gcacatgagt cctaatgccc cagcagcttc 120 cgattg 126 <210> 4 <211> 222 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 4 atagtatacc ctggaattgc tgtatttttc cagaatgcct tcatcttttt tggagggctg 60 gtttttaagt ttggccgcac tgaagactta tggcagtgaa cacatctgat ttcccacagc 120 acaacagccc tgcatgggtt tgtttgtttt tttactgctc actcccaacc ttttgtaatg 180 ccattttcta aacttatttc tgagtgtagt ctcagcttaa ag 222 <210> 5 <211> 201 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 5 ggtgacaaat ccattcgttt ccgtcccacg ctggtcttca gggatcacca cgctcacctg 60 ttcctcaata ttttcagtga catcttagca gacttcaagt aaagaagcca tttccactac 120 agtgagaaag cccggatccc aacagttgtc aaattgatta gtttgcctaa ttcatgtttt 180 cacttaaaag tatcagaggt g 201 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 11 gaggttctcc aggaccttag gtttgatgcg gaatctgccg agtgatggcg gctccccagg 60 gatgcgccga gggagatggg aaacggggcg gatggcgccc agcccagccc taactgccag 120 ctggctgggg ttgcgcccca ctgcgctgct gaccttcctg cagttccaga cacctcccac 180 aataaagagc tcctcctctg t 201 <210> 12 <211> 201 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 12 atcctagctt cggtgctggc agtgtcccaa caggaatacc tagacagtat gaagaaaaac 60 aaagtgcaca gagacccgcc cccagacaag agttgatgga gacccaggga ttggacacca 120 tctcccaacc ccagtactcc tgctctccgg tgccacctca ccttctttgg cttcttccct 180 cttgcctcct tctgttcttt c 201 <210> 13 <211> 201 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 13 actgtttcct atgatcctag gaaacccact gtgaagaaaa ttgccccaat gatggccaag 60 acaattaaag ctttcaagaa cagattctcc cgacgataaa ctgaggactt gccttggaaa 120 tggaatctgg ggaggcagga 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1908 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 22 gaaataagag agaaaagaag agtaagaaga aatataagag ccaccatgga agacgccaaa 60 aacataaaga aaggcccggc gccattctat ccgctggaag atggaaccgc tggatagcaa 120 ctgcataagg ctatgaagag atacgccctg gttcctggaa caattgcttt tacagatgca 180 catatcgagg tggacatcac ttacgctgag tacttcgaaa tgtccgttcg gttggcagaa 240 gctatgaaac gatatgggct gaatacaaat cacagaatcg tcgtatgcag tgaaaactct 300 cttcaattct ttatgccggt gttgggcgcg ttatttatcg gagttgcagt tgcgcccgcg 360 aacgacattt ataatgaacg tgaattgctc aacagtatgg gcatttcgca gcctaccgtg 420 gtgttcgttt ccaaaaaggg gttgcaaaaa attttgaacg tgcaaaaaaa gctcccaatc 480 atccaaaaaa ttattatcat ggattctaaa acggattacc agggatttca gtcgatgtac 540 acgttcgtca catctcatct acctcccggt tttaatgaat acgattttgt gccagagtcc 600 ttcgataggg acaagacaat tgcactgatc atgaactcct ctggatctac tggtctgcct 660 aaaggtgtcg ctctgcctca tagaactgcc tgcgtgagat tctcgcatgc cagagatcct 720 atttttggca atcaaatcat tccggatact 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oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(3) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (6)..(7) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 25 nnnvwnnkgh hnh 13 <210> 26 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (5)..(7) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (10)..(12) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 26 dvhvnnncwn nnb 13 <210> 27 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (4)..(13) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 27 mwbnnnnnnn nnn 13 <210> 28 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (3)..(4) <223> a, c, t, g, 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Claims (33)

1. 종양선택적 번역 서열 요소이거나 이의 상보체인 서열 요소를 포함하는 뉴클레오티드 서열의 조작된 핵산.
2. 제1항에 있어서, 상기 조작된 핵산의 뉴클레오티드 서열이 개방 판독 프레임 또는 이의 상보체를 포함하는, 조작된 핵산.
3. 제2항에 있어서, 상기 종양선택적 번역 서열 요소가 개방 판독 프레임 내 또는 이의 업스트림에서의 종양선택적 판독-초과 모티프이거나 이를 포함하는, 조작된 핵산.
4. 제3항에 있어서, 상기 종양선택적 판독초과 모티프가 업스트림 플랭킹 서열, 정지 코돈 및 다운스트림 플랭킹 서열을 포함하는, 조작된 핵산.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 종양선택적 판독초과 모티프가 판독초과 정지 코돈 및 다운스트림 플랭킹 서열의 처음 14 개의 뉴클레오티드에 걸쳐 있는 영역 내에서, VNNNNNNMNNMWK, NNNVWNNKGHHNH, DVHVNNNCWNNNB, MWBNNNNNNNNNN, WGNNSNHNHDNNN, VNNNNNNMNNMWK 또는 VMNNWNKNNNNNN을 포함하는 군으로부터 선택된 서열을 포함하며, 여기서 V는 A, C 또는 G를 나타내고, M은 A 또는 C를 나타내고, W는 A 또는 T/U를 나타내고, K는 G 또는 T/U를 나타내고, H는 A, C 또는 T/U를 나타내고, D는 A, G 또는 T/U를 나타내고, B는 C, G 또는 T/U를 나타내고, S는 G 또는 C를 나타내고, N은 임의의 뉴클레오티드를 나타내는, 조작된 핵산.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양선택적 판독 초과 모티프가 스템 루프; 다운스트림 플랭킹 서열의 처음 50 개의 뉴클레오티드 및 바람직하게는 정지 코돈 및 다운스트림 플랭킹 서열의 처음 16 개의 뉴클레오티드 내에 위치한 이 스템 루프의 일부, 또는 이들의 조합 내의 벌지 루프, 유사매듭 또는 이들의 조합을 포함하는, 조작된 핵산.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 스템 루프가 다운스트림 플랭킹 서열의 처음 50 개의 뉴클레오티드 내에 20 개 초과의 염기쌍 뉴클레오티드를 포함하는, 조작된 핵산.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 종양선택적 판독 초과 모티프가 42% 초과, 48% 초과, 바람직하게는 54% 초과의 GC 함량을 갖는 다운스트림 플랭킹 서열을 포함하는, 조작된 핵산.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 종양선택적 판독 초과 모티프가 프롤린 잔기를 코딩하는 코돈을 포함하는, 조작된 핵산.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개방 판독 프레임이 자살 단백질을 코딩하는, 조작된 핵산.
11. 제10항에 있어서, 상기 자살 단백질이 네크롭토시스를 유도하는, 조작된 핵산.
12. 제11항에 있어서, 상기 자살 단백질이 구성적으로 활성인 MLKL인, 조작된 핵산.
13. 제10항에 있어서, 상기 자살 단백질이 파이롭토시스를 유도하는, 조작된 핵산.
14. 제13항에 있어서, 상기 자살 단백질이 구성적으로 활성인 가스더민 D인, 조작된 핵산.
15. 제1항에 있어서, 상기 조작된 핵산이 저하된 면역원성을 갖는, 조작된 핵산.
16. 개방 판독 프레임 또는 이의 상보체를 포함하는 서열의 핵산으로서, 그 안에 또는 그 이전에 종양선택적 판독-초과 모티프가 조작되고, 여기서 상기 개방 판독 프레임은 자살 단백질, 세포 표면 항원, 항체 약제, 독소, 유전자 변형 단백질 또는 바이러스 복제 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 페이로드 단백질을 코딩하는, 핵산.
17. 제1항의 핵산을 포함하는 약학 조성물.
18. 제17항에 있어서, 상기 약학 조성물이 나노입자를 포함하는, 약학 조성물.
19. 제18항에 있어서, 상기 나노입자가 지질 나노입자인, 약학 조성물.
20. 제18항에 있어서, 상기 조작된 핵산이 RNA이거나 이를 포함하는, 약학 조성물.
21. 제18항에 있어서, 상기 조작된 핵산이 DNA이거나 이를 포함하는, 약학 조성물.
22. 제18항에 있어서, 상기 조작된 핵산이 세포에서 발현되어, 약학 조성물의 투여가 세포에 RNA를 전달하도록 하는, 약학 조성물.
23. 제1항의 조작된 핵산 또는 제17항의 약학 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
24. 제23항에 있어서, 상기 대상체의 암이 종양원성 리보솜을 포함하는 것인, 방법.
25. 제24항에 있어서, 상기 종양원성 리보솜이 p53 활성의 손실, RB 활성의 손실, FBL 과발현 또는 리보솜 단백질 유전자의 반접합 손실 중 하나 이상을 포함하는 것인, 방법.
26. 제23항에 있어서, 상기 대상체가 아미노글리코시드 항생제, 마크롤리드 항생제, 아탈루렌, 또는 이바카프토르, 이바카프토르/루마카프토르를 받지 않은 것인, 방법.
27. 제23항에 있어서, 상기 대상체가 다이아몬드-블랙판 빈혈, 선천성 각화이상증, 슈와흐만-다이아몬드 증후군, 5q-골수이형성 증후군, 트리처 콜린스 증후군, 연골-모발 저형성증, 고립된 선천성 무기력증, 보웬-콘라디 증후군, 또는 북미 인디언 아동 간경변증을 앓지 않은 것인, 방법.
28. 제23항에 있어서, 상기 투여 단계가 복수의 용량을 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
29. 제23항에 있어서, 상기 암에 대한 면역 반응의 하나 이상의 특징을 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
30. 제29항에 있어서, 상기 투여 단계가 모니터링이 면역 반응이 확립되었음을 검출할 때까지 용량을 계속 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
31. 판독-초과 컨센서스 서열, 높은 G-C 함량을 갖는 서열; 코돈 코딩 프롤린; 스템 루프; 벌지 루프, 유사매듭 또는 이들의 조합을 포함하는, 종양선택적 번역 서열 요소.
32. 전사체-전반의 번역체 분석을 포함하는, 종양-선택적 핵산 서열을 식별하는 방법.
33. 제32항에 있어서, 상기 방법이 Ribo-seq 및 LC/MS-기반 프로테오믹스 파이프라인을 포함하는 것인, 방법.

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