KR20220047611A - 이중특이적 항체에 대한 제형 최적화 - Google Patents

이중특이적 항체에 대한 제형 최적화 Download PDF

Info

Publication number
KR20220047611A
KR20220047611A KR1020227008403A KR20227008403A KR20220047611A KR 20220047611 A KR20220047611 A KR 20220047611A KR 1020227008403 A KR1020227008403 A KR 1020227008403A KR 20227008403 A KR20227008403 A KR 20227008403A KR 20220047611 A KR20220047611 A KR 20220047611A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
protein
amino acid
acid sequence
profile
peptide
Prior art date
Application number
KR1020227008403A
Other languages
English (en)
Inventor
천 저우
원화 왕
딩장 류
Original Assignee
리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. filed Critical 리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
Publication of KR20220047611A publication Critical patent/KR20220047611A/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39591—Stabilisation, fragmentation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B15/00—ICT specially adapted for analysing two-dimensional or three-dimensional molecular structures, e.g. structural or functional relations or structure alignment
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B15/00—ICT specially adapted for analysing two-dimensional or three-dimensional molecular structures, e.g. structural or functional relations or structure alignment
    • G16B15/30—Drug targeting using structural data; Docking or binding prediction
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B5/00—ICT specially adapted for modelling or simulations in systems biology, e.g. gene-regulatory networks, protein interaction networks or metabolic networks
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)

Abstract

본 발명은 이중특이적 항체의 제형 최적화 방법 및 시스템을 제공한다. 본 출원은 또한 이중특이적 항체 및 이의 제형 최적화를 구성하기 위한 분자 후보를 선택하는 방법 및 시스템을 제공한다. 이중특이적 항체의 물리-화학적 매개변수가 특성화된다. 제형 최적화 전략은 상호작용 매개변수의 예측에 의해 안내된다. 다양한 제형 최적화 전략이 이러한 물리-화학적 매개변수를 기반으로 하여 제공된다.

Description

이중특이적 항체에 대한 제형 최적화
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2019년 8월 20일(20. 08. 2019)자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/889,354호에 대한 우선권 및 이의 이익을 주장하며, 이의 내용은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
분야
본 발명은 대체적으로 이중특이적 항체의 제형 최적화 방법 및 시스템에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이중특이적 항체를 생성하기 위한 펩타이드 또는 단백질의 조합물을 선택하는 방법 및 시스템을 제공하고 이의 제형 최적화 방법을 제공한다.
이중특이적 항체는 2개의 상이한 항원을 표적으로 하기 때문에, 통상적인 단클론성 항체와 비교하여 향상된 효능 및 표적 특이성을 갖는 매우 가치있는 생물의약품이다. 이중특이적 항체의 설계는, 다중 조직-특이적 항체와 세포독성 약물을 결합하여 종양에 아주 근접하여 상기 약물을 방출하는 것과 같은, 소분자 약물과 결합된 다중 조직-특이적 항체로 지향될 수 있다. 작은 약물 분자는 정제된 이중특이적 항체와 접합되어 항체-약물 접합체(ADC)를 생성할 수 있다. 그러나, 이중특이적 항체의 2개의 Fab 암(arm)이 2개의 상이한 모 항체로부터 유래된 이종성을 가지기 때문에, 이중특이적 항체의 약물 개발 및 제형 최적화는 이중특이적 항체의 구조 및 조성 복잡성으로 인해 어려울 수 있다.
이중특이적 항체의 2개의 이종성 Fab 암은 상이한 물리-화학적 특성, 예컨대 표면 소수성 또는 표면 전하의 차이를 가질 수 있다. 이중특이적 항체의 구조적 복잡성은 수용해도에 부정적이거나 불리한 영향을 미치는 물리-화학적 특성의 변화를 야기한다. 문제는 이중특이적 항체의 제형 개발 동안 고점도 또는 단백광으로 인한 용해도 감소를 포함한다. 수용해도는 약물 제형의 생체이용률에 대한 제약이다. 안정적인 단백질-기반 제형의 개발은 면역원성 반응과 관련된 안전성 문제, 합리적인 유통 기간 동안의 약물 안정성, 및 주사를 통한 전달 최적화에 중요하다. 이중특이적 항체의 제형을 최적화하기 위해, 다양한 제형 조건, 예컨대, pH, 이온 강도, 완충염, 또는 온도 하에서 단백질 안정성 및 용해도를 이해하는 것이 유익하다.
이중특이적 항체를 생성하기 위한 표적 물리-화학적 특성을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 조합물을 선택하는 방법 및 시스템에 대한 필요성이 존재함을 이해할 것이다. 이중특이적 항체의 제형 개발을 위한 조성물을 최적화하는 방법에 대한 필요성도 추가로 존재한다.
이종 Fab 암으로 인한 이중특이적 항체의 구조적 복잡성은 수용해도에 부정적이거나 불리한 영향을 야기할 수 있다. 문제는 이중특이적 항체의 제형 개발 동안 고점도 또는 단백광을 포함한다. 본 출원은 이중특이적 항체 및 이의 제형 최적화를 구성하기 위한 분자 후보를 선택하는 방법 및 시스템을 제공한다. 이중특이적 항체 및 이의 모 항체의 물리-화학적 매개변수의 프로파일이 특성화된다. 이러한 물리-화학적 매개변수를 기반으로 하여 다양한 제형 최적화 전략이 제공된다.
본 개시내용은, 펩타이드 또는 단백질의 복수의 아미노산 서열을 수용하는 단계; 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질을 선택하는 단계; 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 단백질-단백질 상호작용의 프로파일을 결정하는 단계; 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 단백질-단백질 상호작용의 표적 프로파일을 선택하는 단계; 및 단백질-단백질 상호작용의 표적 프로파일에 따라 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 조합물을 생성하는 단계를 포함하는, 표적 물리-화학적 특성을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 조합물을 생성하는 방법을 제공한다. 일부 예시적인 실시형태에서, 본 출원의 방법에서, 단백질-단백질 상호작용은 반발성 또는 유인성 단백질-단백질 상호작용일 수 있으며, 여기서 단백질-단백질 상호작용의 프로파일은 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 상호작용 매개변수를 측정함으로써 결정될 수 있다.
일부 예시적인 실시형태에서, 본 출원의 방법은 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 물리-화학적 특성의 프로파일을 결정하는 단계를 더 포함하며, 여기서 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 조합물은 단백질-단백질 상호작용의 표적 프로파일 및 물리-화학적 특성의 프로파일에 따라 생성될 수 있고, 물리-화학적 특성은 이론적 등전점, 실험적 등전점, 표면 소수성, 상대 표면 소수성, 소수성 지수, 표면 전하, 전하 불균일성, 2차 삼투 바이알 계수, 교반 안정성, 단백광, 점도, 또는 계면 감도일 수 있다. 일부 예시적인 실시형태에서, 표면 소수성 또는 표면 전하는 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 구조적 모델링을 수행함으로써 결정될 수 있다.
일부 바람직한 예시적인 실시형태에서, 본 출원의 방법에서, 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 조합물의 농도는 약 20 ㎎/㎖ 내지 약 200 ㎎/㎖, 또는 적어도 약 70 ㎎/㎖, 또는 적어도 약 100 ㎎/㎖일 수 있다.
일부 예시적인 실시형태에서, 본 출원의 방법에서, 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 조합물은 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체일 수 있으며, 여기서 본 출원의 방법은 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체를 생성하기 위한 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 가변 영역의 소수성 지수, 표면 전하, 또는 전하 불균일성을 결정하는 단계를 더 포함한다.
본 개시내용은 적어도 부분적으로, 펩타이드 또는 단백질의 복수의 아미노산 서열; 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 선택; 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 단백질-단백질 상호작용의 프로파일; 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 단백질-단백질 상호작용의 표적 프로파일; 및 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 조합물을 포함하는, 표적 물리-화학적 특성을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 조합물을 생성하기 위한 시스템을 제공하며, 여기서 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질은 단백질-단백질 상호작용의 표적 프로파일에 따라 선택된다. 일부 예시적인 실시형태에서, 본 출원의 시스템에서, 단백질-단백질 상호작용은 반발성 또는 유인성 단백질-단백질 상호작용일 수 있으며, 여기서 단백질-단백질 상호작용의 프로파일은 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 상호작용 매개변수를 측정함으로써 결정된다.
일부 예시적인 실시형태에서, 본 출원의 시스템은 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 물리-화학적 특성의 프로파일을 더 포함하며, 여기서 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 조합물은 단백질-단백질 상호작용의 표적 프로파일 및 물리-화학적 특성의 프로파일에 따라 선택되고, 물리-화학적 특성은 이론적 등전점, 실험적 등전점, 표면 소수성, 상대 표면 소수성, 소수성 지수, 표면 전하, 전하 불균일성, 2차 삼투 바이알 계수, 교반 안정성, 단백광, 점도, 또는 계면 감도일 수 있다. 일부 예시적인 실시형태에서, 표면 소수성 또는 표면 전하는 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 구조적 모델링을 수행함으로써 결정될 수 있다.
일부 바람직한 예시적인 실시형태에서, 본 출원의 시스템에서, 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 조합물의 농도는 약 20 ㎎/㎖ 내지 약 200 ㎎/㎖, 또는 적어도 약 70 ㎎/㎖, 또는 적어도 약 100 ㎎/㎖일 수 있다.
일부 예시적인 실시형태에서, 본 출원의 시스템에서, 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 조합물은 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체일 수 있으며, 여기서 본 출원의 시스템은 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 가변 영역의 소수성 지수, 표면 전하, 또는 전하 불균일성의 프로파일을 더 포함한다.
본 개시내용은 적어도 부분적으로, 제형에서 적어도 하나의 성분을 최적화하거나 선택하는 방법을 제공하며, 여기서 제형은 본 출원의 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 조합물을 포함하고, 방법은 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 단백질-단백질 상호작용의 표적 프로파일을 기반으로 하여 제형의 이온 강도를 조정하는 단계, 및 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 단백질-단백질 상호작용의 표적 프로파일을 기반으로 하여 제형의 pH 값을 조정하는 단계를 포함한다.
일부 바람직한 예시적인 실시형태에서, 본 출원의 제형 최적화 방법은 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 단백질-단백질 상호작용의 표적 프로파일을 기반으로 하여 염을 제형에 첨가하는 단계를 더 포함한다. 일부 바람직한 예시적인 실시형태에서, 본 출원의 제형 최적화 방법은 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 단백질-단백질 상호작용의 표적 프로파일을 기반으로 하여 소수성 부형제를 제형에 첨가하는 단계를 더 포함하며, 여기서 적어도 하나의 성분은 염화나트륨, 아세테이트, 히스티딘, 또는 아르기닌 하이드로클로라이드이다.
본 개시내용은 적어도 부분적으로, 제형에서 적어도 하나의 성분을 최적화하거나 선택하는 방법을 포함하는 이중특이적 또는 다중-특이적 항체의 제형을 최적화하는 방법을 제공하며, 여기서 제형은 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체를 포함하고, 방법은 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 단백질-단백질 상호작용의 프로파일을 결정하는 단계; 및 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 단백질-단백질 상호작용의 프로파일을 기반으로 하여 제형에서 적어도 하나의 성분을 최적화하거나 선택하는 단계를 포함한다.
일부 예시적인 실시형태에서, 이중특이적 또는 다중-특이적 항체의 제형을 최적화하는 방법에서, 단백질-단백질 상호작용의 프로파일은 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 상호작용 매개변수를 측정함으로써 결정될 수 있다. 일부 예시적인 실시형태에서, 이중특이적 또는 다중-특이적 항체의 제형을 최적화하는 방법은 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 단백질-단백질 상호작용의 프로파일을 기반으로 하여 제형의 이온 강도를 조정하는 단계, 또는 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 단백질-단백질 상호작용의 프로파일을 기반으로 하여 제형의 pH 값을 조정하는 단계를 더 포함한다.
일부 예시적인 실시형태에서, 이중특이적 또는 다중-특이적 항체의 제형을 최적화하는 방법은 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 물리-화학적 특성의 프로파일을 결정하는 단계를 더 포함하며, 여기서 제형에서 적어도 하나의 성분을 최적화하거나 선택하는 것은 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 단백질-단백질 상호작용의 프로파일 및 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 물리-화학적 특성의 프로파일을 기반으로 한다.
일부 예시적인 실시형태에서, 이중특이적 또는 다중-특이적 항체의 제형을 최적화하는 방법은 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 단백질-단백질 상호작용의 프로파일을 기반으로 하여 염을 제형에 첨가하는 단계, 또는 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 단백질-단백질 상호작용의 프로파일을 기반으로 하여 소수성 부형제를 제형에 첨가하는 단계를 더 포함한다. 일부 예시적인 실시형태에서, 이중특이적 또는 다중-특이적 항체의 제형을 최적화하는 방법에서, 적어도 하나의 성분은 염화나트륨, 아세테이트, 히스티딘, 또는 아르기닌 하이드로클로라이드이다.
일부 예시적인 실시형태에서, 이중특이적 또는 다중-특이적 항체의 제형을 최적화하는 방법에서, 물리-화학적 특성은 이론적 등전점, 실험적 등전점, 표면 소수성, 상대 표면 소수성, 소수성 지수, 표면 전하, 전하 불균일성, 2차 삼투 바이알 계수, 교반 안정성, 단백광, 점도, 또는 계면 감도이며, 여기서 표면 소수성 또는 표면 전하는 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 구조적 모델링을 수행함으로써 결정될 수 있다.
일부 예시적인 실시형태에서, 이중특이적 또는 다중-특이적 항체의 제형을 최적화하는 방법에서, 단백질-단백질 상호작용은 반발성 또는 유인성 단백질-단백질 상호작용이다. 일부 예시적인 실시형태에서, 이중특이적 또는 다중-특이적 항체의 제형을 최적화하는 방법에서, 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 농도는 약 20 ㎎/㎖ 내지 약 200 ㎎/㎖, 또는 적어도 약 70 ㎎/㎖, 또는 적어도 약 100 ㎎/㎖이다. 일부 예시적인 실시형태에서, 이중특이적 또는 다중-특이적 항체의 제형을 최적화하는 방법은 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 가변 영역의 소수성 지수, 표면 전하, 또는 전하 불균일성을 결정하는 단계를 더 포함한다.
일부 예시적인 실시형태에서, 이중특이적 또는 다중-특이적 항체의 제형을 최적화하는 방법은 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 물리-화학적 특성의 프로파일을 결정하는 단계를 더 포함하며, 여기서 제형에서 적어도 하나의 성분을 최적화하거나 선택하는 것은 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 단백질-단백질 상호작용의 프로파일 및 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 물리-화학적 특성의 프로파일을 기반으로 한다.
일부 예시적인 실시형태에서, 이중특이적 또는 다중-특이적 항체의 제형을 최적화하는 방법은 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 단백질-단백질 상호작용의 프로파일을 기반으로 하여 염을 제형에 첨가하는 단계, 또는 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 단백질-단백질 상호작용의 프로파일을 기반으로 하여 소수성 부형제를 제형에 첨가하는 단계를 더 포함한다. 일부 예시적인 실시형태에서, 이중특이적 또는 다중-특이적 항체의 제형을 최적화하는 방법에서, 적어도 하나의 성분은 염화나트륨, 아세테이트, 히스티딘, 또는 아르기닌 하이드로클로라이드이다.
일부 예시적인 실시형태에서, 이중특이적 또는 다중-특이적 항체의 제형을 최적화하는 방법에서, 물리-화학적 특성은 이론적 등전점, 실험적 등전점, 표면 소수성, 상대 표면 소수성, 소수성 지수, 표면 전하, 전하 불균일성, 2차 삼투 바이알 계수, 교반 안정성, 단백광, 점도, 또는 계면 감도이며, 여기서 표면 소수성 또는 표면 전하는 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 구조적 모델링을 수행함으로써 결정된다.
일부 예시적인 실시형태에서, 이중특이적 또는 다중-특이적 항체의 제형을 최적화하는 방법에서, 단백질-단백질 상호작용은 반발성 또는 유인성 단백질-단백질 상호작용이다. 일부 예시적인 실시형태에서, 이중특이적 또는 다중-특이적 항체의 제형을 최적화하는 방법에서, 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 농도는 약 20 ㎎/㎖ 내지 약 200 ㎎/㎖, 또는 적어도 약 70 ㎎/㎖, 또는 적어도 약 100 ㎎/㎖이다. 일부 예시적인 실시형태에서, 이중특이적 또는 다중-특이적 항체의 제형을 최적화하는 방법은 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 가변 영역의 소수성 지수, 표면 전하, 또는 전하 불균일성을 결정하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 이들 및 다른 양태는 하기 설명 및 첨부된 도면과 함께 고려될 때 더 잘 인식되고 이해될 것이다. 하기 설명은 다양한 실시형태 및 이의 수많은 특정 세부사항을 나타내지만, 이는 제한이 아니라 예시의 방식으로 제공되는 것이다. 많은 치환, 변형, 추가, 또는 재배열이 본 발명의 범주 내에서 이루어질 수 있다.
도 1은 예시적인 실시형태에 따른 구조적 모델링을 기반으로 한 BsAb1, mAb-A의 Fab, 및 mAb-B의 Fab의 표면 지도를 나타내는 도면. 직사각형의 음영 영역은 소수성 패치의 위치를 나타낸다. 원의 음영 영역은 음전하 패치의 위치를 나타낸다. 삼각형의 음영 영역은 양전하 패치를 나타낸다.
도 2A 내지 2C는 예시적인 실시형태에 따른 단백질 제형의 단백광을 특성화하기 위한 BsAb1, mAb-A, 및 mAb-B 제형의 OD 405㎚에서의 광학 밀도의 측정을 나타내는 도면. A5는 pH 5의 10mM 아세테이트의 완충액 조성물을 나타낸다. H6은 pH 6의 10mM 히스티딘의 완충액 조성물을 나타낸다. H6N은 pH 6의 10mM 히스티딘, 150mM NaCl의 완충액 조성물을 나타낸다.
도 3A 내지 도 3C는 예시적인 실시형태에 따른 BsAb1, mAb-A 및 mAb-B 제형에 대한 점도의 측정을 나타내는 도면. 150 ㎎/㎖에서 직경이 10㎚인 면역글로불린의 이론적 점도를 비교로서 무니 방정식에 의해 계산하였다. A5는 pH 5의 10mM 아세테이트의 완충액 조성물을 나타낸다. H6은 pH 6의 10mM 히스티딘의 완충액 조성물을 나타낸다. H6N은 pH 6의 10mM 히스티딘, 150mM NaCl의 완충액 조성물을 나타낸다. H6Arg는 pH 6의 10mM 히스티딘, 150mM ArgHCl의 완충액 조성물을 나타낸다.
도 4는 예시적인 실시형태에 따른 다양한 제형에서 BsAb1의 계면 감도를 조사하기 위한 교반 안정성의 측정을 나타내는 도면. 측정은 대조군 및 교반된 단백질 제형을 포함한다. H6은 pH 6의 10mM 히스티딘의 완충액 조성물을 나타낸다. H6N은 pH 6의 10mM 히스티딘, 150mM NaCl의 완충액 조성물을 나타낸다. H6Arg은 pH 6의 10mM 히스티딘, 150mM ArgHCl의 완충액 조성물을 나타낸다.
도 5A는 예시적인 실시형태에 따른, mAb-A 및 mAb-B의 공동 제형을 포함하는 다양한 완충액 조성물에서 BsAb1, mAb-A, 및 mAb-B에 대한 상호작용 매개변수(kD)의 측정을 나타내는 도면. A5는 pH 5의 10mM 아세테이트의 완충액 조성물을 나타낸다. H6은 pH 6의 10mM 히스티딘의 완충액 조성물을 나타낸다. H6N은 pH 6의 10mM 히스티딘, 150mM NaCl의 완충액 조성물을 나타낸다. H6Arg는 pH 6의 10mM 히스티딘, 150mM ArgHCl의 완충액 조성물을 나타낸다. 도 5B는 예시적인 실시형태에 따른 조성 구배-다각도 광 산란(composition gradient-multi-angle light scattering: CG-MALS)을 사용하여 다양한 단백질 농도에서 pH 6의 10mM 히스티딘에서 BsAb1 제형의 2차 삼투 바이랄 계수(second osmotic viral coefficient) B 22 의 측정을 나타내는 도면.
도 6A는 예시적인 실시형태(150 ㎎/㎖의 농도에서)에 따른 단백광 및 상호작용 매개변수 kD에 대한 상관관계 분석을 나타내는 도면. 도 6B는 예시적인 실시형태에 따른 점도 및 상호작용 매개변수 kD에 대한 상관관계 분석을 나타내는 도면. 도 6C는 예시적인 실시형태에 따른(70 ㎎/㎖의 농도에서) 단백광 및 상호작용 매개변수 kD에 대한 상관관계 분석을 나타내는 도면.
이중특이적 항체는 종래의 단클론성 항체와 비교하여 효능 및 표적 특이성을 향상시킬 수 있는 2개의 상이한 항원-결합 부위가 있는 우수한 치료 효과를 목표로 하는 차세대 항체이다. 이중특이적 항체의 적용은 자가면역, 종양학, 또는 만성 염증성 적응증을 포함하여 광범위한 치료 영역에 걸쳐 있다. 예를 들어, 암 요법에서, 이중특이적 항체는 다양한 면역-수용체의 자극을 동시에 달성하여 종양 세포독성 면역 반응을 촉발하고 향상시킬 수 있다.
이중특이적 항체의 투여는 지배적으로 정맥내 또는 피하 주사와 같은 비경구 주사이다. 환자 순응도를 개선시키기 위해 피하 투약량에서 적은 주사 부피의 요구로 인해 단백질 고농도 제형에 대한 요구가 증가하고 있다. 일반적으로, 단백질 농도에 대한 요구는 피하 제형에서 100 ㎎/㎖ 초과를 목표로 할 수 있다. 그러나, 단백질 분자가 고농도에서 응집 및/또는 침전하는 경향이 있어 고점도 및 단백광을 야기할 수 있기 때문에, 고농도 단백질 제형의 개발은 어려울 수 있다. 단백질은 일반적으로 고농도에서 자기-회합 경향이 더 높다.
이중특이적 항체의 2개의 Fab 암은 2개의 상이한 모 항체로부터 유래하기 때문에, 이들은 이종성이다. 2개의 이종성 Fab 암은 현저하게 상이한 물리-화학적 특성을 가질 수 있기 때문에, 이중특이적 항체의 구조 및 조성 복잡성은 단백광, 고점도, 또는 계면 감도의 문제와 같은 제형 개발에서 문제를 유발할 수 있다. 본 출원은 단백질-단백질 상호작용의 프로파일 및/또는 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 물리-화학적 특성의 프로파일을 기반으로 하여 이중특이적 항체를 생성하기 위해 펩타이드 또는 단백질의 조합물을 선택하는 것과 같이, 이중특이적 항체를 구성하기 위한 분자 후보를 선택하는 방법 및 시스템을 제공한다.
본 출원은 본 출원의 방법을 사용하여 생성될 수 있는 이중특이적 항체의 제형 최적화 방법을 추가로 제공한다. 본 출원은 이중특이적 항체 및 이의 모 항체의 구조적 모델링에 의해 고농도에서 이중특이적 항체의 불리한 단백질 거동의 분자 메커니즘을 조사하는 방법 및 시스템을 제공한다. 물리-화학적 매개변수의 프로파일은 특성화되고 이중특이적 항체와 이의 모 항체 사이에서 비교될 수 있다. 다양한 제형 최적화 전략이 물리-화학적 매개변수를 기반으로 하여 제공된다.
본 출원은 단백질-단백질 상호작용을 정량화하기 위해 단백질 상호작용 매개변수 kD를 사용하여 단백질 거동을 예측하는 방법 및 시스템을 제공한다. 특히, 본 출원은 용액에서, 특히 단백질 고농도에서 이중특이적 항체의 분자 메커니즘의 특성화를 제공한다. 본 출원은, 이온 강도, pH 값, 또는 완충액 염을 조정하는 것과 같은 다양한 제형 조건의 영향을 탐색하여 이중특이적 항체에 대한 제형 개발 동안 단백광 및 고점도를 감소시키는 방법 및 시스템을 제공한다.
단백질-단백질 상호작용, 예컨대, 반발성 또는 유인성 단백질-단백질 상호작용은 용액 중 단백질 고농도에서 단백질 거동과 관련이 있다. 유인성 단백질-단백질 상호작용은 불리한 단백질 거동에 기인할 수 있기 때문에, 반발성 단백질-단백질 상호작용이 일반적으로 바람직하다. 단백질-단백질 상호작용을 특성화하는 방법은 동적 광 산란(DLS), 정적 광 산란(SLS), 소각 X-선(SAXS), 분석 초원심분리(AUC) 및 막 삼투압측정을 포함한다. DLS 측정에서, 단백질-단백질 상호작용의 특성 및 규모는 상대적으로 희석된 상황에서 단백질 농도에 대한 확산 계수의 비이상적인 의존성으로부터 상호작용 매개변수 kD로 추론될 수 있다. SLS는 단백질 농도 구배에 따른 비이상적인 광산란 강도 변화를 측정한다. 2차 삼투 바이랄 계수 B 22 는 SLS를 사용하여 측정될 수 있다.
단백질-단백질 상호작용은 용액 중 단백질 고농도에서 단백질의 특징(단백질 거동)을 지배할 수 있다. 본 출원은 상호작용 매개변수 kD를 사용하여 단백질 고농도에서 이중특이적 항체의 거동을 예측하는 방법 및 시스템을 제공한다. 상호작용 매개변수 kD는 이중특이적 항체 및 이의 제형 최적화를 구성하기 위한 분자 후보를 선택하기 위한 단백질 고농도 거동에 대한 합리적인 예측을 제공할 수 있다. 본 출원의 방법 및 시스템은 kD를 측정하여 단백질 거동을 예측함으로써 이중특이적 항체를 생성하는 후보 분자를 선택하는 데 사용될 수 있다. 추가적으로, 본 출원은 이중특이적 항체를 포함하는 제형에서 적어도 하나의 성분을 최적화하거나 선택하는 방법을 제공한다.
본 출원의 방법은 이중특이적 항체의 제형 최적화를 위해 단백광/점도와 상호작용 매개변수 kD 사이의 합리적인 상관관계를 얻기 위한 예측을 제공한다. 본 출원의 방법은 또한 이중특이적 항체의 제형 최적화를 위해 단백광/점도와 단백질-단백질 상호작용 사이의 합리적인 상관관계를 얻기 위한 예측을 제공한다.
일부 예시적인 실시형태에서, 이중특이적 항체에서 단백질-단백질 상호작용의 물리-화학적 특성은 주로 정전기적 특성일 수 있고, 이온 강도를 증가시키고 pH 값을 조정하는 전략은 이중특이적 항체에 대한 제형 최적화의 결과를 효과적으로 개선시킬 수 있다.
본 출원은 이중특이적 항체를 포함하는 제형을 최적화하는 방법을 제공하며, 여기서 방법은 이중특이적 항체의 단백질-단백질 상호작용, 예컨대, 유인성 단백질-단백질 상호작용의 프로파일을 결정하는 단계를 포함한다. 이중특이적 항체의 단백질-단백질 상호작용의 프로파일을 기반으로 하여 제형의 이온 강도 또는 pH 값을 조정함으로써, 예컨대, 이온 강도를 증가시키거나 pH 값을 감소시켜 유인성 단백질-단백질 상호작용을 완화시키는 것을 통해 단백광 및 점도를 감소시킴으로써, 이중특이적 항체 제형의 단백광 및/또는 점도는 현저하게 감소될 수 있다.
이중특이적 항체의 우수한 치료 효과로 인해 이중특이적 항체의 제형 최적화에 대한 수요가 증가하고 있다. 본 명세서에 개시된 예시적인 실시형태는 상호작용 매개변수 kD의 측정에 따라 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 단백질-단백질 상호작용의 표적 프로파일을 기반으로 하여 이중특이적 항체를 생성하기 위해 펩타이드 또는 단백질의 조합물을 선택하는 방법 및 시스템을 제공함으로써 상기 언급한 수요를 충족시키는 방법 및 시스템을 제공함으로써 상기 언급한 수요를 충족시킨다. 본 개시내용은 또한 이중특이적 항체를 포함하는 제형을 최적화하는 방법을 제공한다. 최적화 전략은 상호작용 매개변수 kD의 예측에 의해 안내될 수 있다. 이러한 전략은 또한 이중특이적 항체의 제형 개발 동안 고점도 또는 단백광의 문제를 해결하기 위해 오랫동안 느껴온 필요성을 해결한다.
용어 "하나"는 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 하고; 용어 "약" 및 "대략"은 당업자에 의해 이해될 바와 같이 표준 편차를 허용하는 것으로 이해되어야 하며; 범위가 제공되는 경우, 종점은 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하다(include)", "포함한다(includes)", 및 "포함하는(including)"은 비-제한적인 것을 의미하며, 각각 "포함하다(comprise)", "포함한다(comprises)", 및 "포함하는(comprising)"을 의미하는 것으로 이해된다.
일부 예시적인 실시형태에서, 본 개시내용은, 펩타이드 또는 단백질의 복수의 아미노산 서열을 수용하는 단계; 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질을 선택하는 단계, 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 단백질-단백질 상호작용의 프로파일을 결정하는 단계; 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 단백질-단백질 상호작용의 표적 프로파일을 선택하는 단계; 및 단백질-단백질 상호작용의 표적 프로파일에 따라 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 조합물을 생성하는 단계를 포함하는, 표적 물리-화학적 특성을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 조합물을 생성하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "펩타이드" 또는 "단백질"은 공유 결합된 아마이드 결합을 갖는 임의의 아미노산 중합체를 포함한다. 단백질은 일반적으로 당업계에서 "펩타이드" 또는 "폴리펩타이드"로 알려진 하나 이상의 아미노산 중합체 사슬을 포함한다. 단백질은 하나 또는 다수의 폴리펩타이드를 포함하여 단일 기능 생체분자를 형성할 수 있다. 일부 예시적인 실시형태에서, 단백질은 항체, 이중특이적 항체, 다중-특이적 항체, 항체 단편, 단클론성 항체, 숙주-세포 항체 또는 이들의 조합물일 수 있다.
일부 예시적인 실시형태에서, 본 개시내용은 제형에서 적어도 하나의 성분을 최적화하거나 선택하는 방법을 제공하며, 여기서 제형은 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체를 포함하고, 방법은 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 단백질-단백질 상호작용의 프로파일을 결정하는 단계, 및 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 단백질-단백질 상호작용의 프로파일을 기반으로 하여 제형에서 적어도 하나의 성분을 최적화하거나 선택하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "항체"는 이황화 결합에 의해 상호 연결된 4개의 폴리펩타이드 사슬, 즉 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)로 이루어진 면역글로불린 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(HCVR 또는 VH) 및 중쇄 불변 영역을 가진다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역을 가진다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인(CL)으로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라고 불리는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는, 상보성 결정 영역(CDR)이라고 불리는 초가변 영역으로 추가로 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카복시-말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된, 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성될 수 있다. 용어 "항체"는 임의의 아이소타입 또는 하위부류의 글리코실화된 면역글로불린 및 비-글리코실화된 면역글로불린 둘 다에 대한 언급을 포함한다. 용어 "항체"는 항체를 발현하도록 형질감염된 숙주 세포로부터 단리된 항체와 같이, 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 것을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. IgG는 항체의 하위세트를 포함한다.
예시적인 실시형태
본 명세서에 개시된 실시형태는, 펩타이드 또는 단백질의 복수의 아미노산 서열을 수용하는 단계; 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질을 선택하는 단계, 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 단백질-단백질 상호작용의 프로파일을 결정하는 단계; 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 단백질-단백질 상호작용의 표적 프로파일을 선택하는 단계; 및 단백질-단백질 상호작용의 표적 프로파일에 따라 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 조합물을 생성하는 단계를 포함하는, 표적 물리-화학적 특성을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 조합물을 생성하는 방법 및 시스템을 제공한다.
일부 예시적인 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 물리-화학적 특성의 프로파일을 결정하는 단계를 더 포함하며, 여기서 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 조합물은 단백질-단백질 상호작용의 표적 프로파일 및 물리-화학적 특성의 프로파일에 따라 생성될 수 있다. 일부 예시적인 실시형태에서, 물리-화학적 특성은 이론적 등전점, 실험적 등전점, 표면 소수성, 상대 표면 소수성, 소수성 지수, 표면 전하, 전하 불균일성, 2차 삼투 바이알 계수, 교반 안정성, 단백광, 점도, 또는 계면 감도이다.
일부 바람직한 예시적인 실시형태에서, 본 출원의 방법에서, 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 조합물의 농도는 약 20 ㎎/㎖ 내지 약 200 ㎎/㎖, 또는 적어도 약 70 ㎎/㎖, 또는 적어도 약 100 ㎎/㎖, 약 1 ㎎/㎖ 내지 약 400 ㎎/㎖, 약 50 ㎎/㎖ 내지 약 300 ㎎/㎖, 약 100 ㎎/㎖ 내지 약 300 ㎎/㎖, 약 80 ㎎/㎖ 내지 약 250 ㎎/㎖, 약 80 ㎎/㎖ 내지 약 150 ㎎/㎖, 적어도 약 50 ㎎/㎖, 적어도 약 67 ㎎/㎖ 적어도 약 70 ㎎/㎖, 적어도 약 75 ㎎/㎖, 적어도 약 90 ㎎/㎖, 적어도 약 120 ㎎/㎖, 또는 적어도 약 150 ㎎/㎖이다.
시스템은 상기 의약품, 펩타이드, 단백질, 항체, 항-약물 항체, 항원-항체 복합체, 단백질 의약품, 크로마토그래피 칼럼, 또는 질량분석기 중 임의의 것으로 제한되지 않는 것으로 이해된다.
숫자 및/또는 문자로 본 명세서에 제공된 바와 같은 방법 단계의 연속적인 표지는 방법 또는 이의 임의의 실시형태를 표시된 특정 순서로 제한하는 것을 의미하지 않는다.
특허, 특허 출원, 공개된 특허 출원, 수탁 번호, 기술 논문 및 학술 논문을 포함하여 다양한 간행물이 명세서 전체에 걸쳐 인용된다. 이들 인용된 참고문헌 각각은 본 명세서에 전문이 모든 목적을 위해 참조에 의해 원용된다. 달리 기재되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 개시내용은 본 개시내용을 보다 상세하게 설명하기 위해 제공되는 하기 실시예를 참조하여 더 완전하게 이해될 것이다. 실시예는 예시적인 것으로 의도되며 본 개시내용의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
재료 및 시약 준비
1.1 이중특이적 항체의 제조
"놉-인-홀(knob-in-hole)" 기법을 사용하여 이중특이적 항체를 제조하였다(Xu et al., Production of bispecific antibodies in "knobs-into-holes" using a cell-free expression system. mAbs, 2015, 7(1):231-242). BsAb1은 "놉-인-홀" 기법을 사용하여 모 mAb-A 및 mAb-B로부터 구성된 IgG 4 단클론성 항체이다. BsAb1은 공통 경쇄 및 2개의 상이한 Fab 암을 가진다. BsAb1 제형은 약 pH 6의 10mM 히스티딘 및 약 70 내지 85 ㎎/㎖의 BsAb1을 포함하는 제형과 같이, 중간 내지 높은 단백질 농도에서 고점도 및 단백광을 나타내었다.
2.1 표적 제형 완충액의 제조
약 pH 5 내지 8의 범위에서 아세테이트, 히스티딘, 아르기닌 하이드로 클로라이드, 또는 염화나트륨의 성분을 포함하는 다양한 표적 제형 완충액을 표 1에 나타낸 바와 같이 제조하였다. 원래의 제형 완충액에 있는 모든 단백질 샘플을 표 1에 나타낸 바와 같이 표적 제형 완충액으로 투석하였다. 가변 경로 길이 UV/Vis 분광기(Solo/VPE, C-Technologies Inc, 미국 뉴저지주 소재)를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 모든 화학물질은 시약 등급 이상이다.
표적 제형 완충액의 조성
표적 제형 완충액 약어
10mM 아세테이트, pH 5 A5
10mM 히스티딘, pH 6 H6
10mM 히스티딘, 150mM NaCl, pH 6 H6N
10mM 히스티딘, 150mM ArgHCl, pH 6 H6Arg
10mM Tris, pH 8 T8
항체의 물리-화학적 특성을 특성화하는 방법
1.1 탁도 측정
UV/VIS 자동 스캐너(Spectramax 190, Molecular Devices, 미국 캘리포니아주 소재)를 이용하여 405㎚에서 광학 밀도를 측정하여 실온에서 단백질 제형의 탁도 및 단백광을 정량화하였다.
2.1 무차원 머무름 시간을 얻기 위한 소수성 상호작용 크로마토그래피-고성능 액체 크로마토그래피(HIC-HPLC)
Agilent 1200 HPLC 기기(Agilent, 미국 캘리포니아주 산타클라라 소재)에서 t-뷰틸 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 칼럼(Tosoh Bioscience, 미국 펜실베이니아주 소재)에 결합한 단백질을 (NH4)2SO4의 구배를 감소시키면서 용리하였다. 머무름 시간을 구하여 하기 방정식 1을 사용하여 무차원 머무름 시간(DRT)을 계산하였다:
Figure pct00001
(방정식 1)
여기서, ts는 샘플의 용리 시간이고, ti는 용리 구배의 시작 시간이며, te는 구배의 종료 시간을 나타낸다. DRT를 사용하여 단백질 분자 중 상대 표면 소수성의 순서를 결정하였다.
3.1 마이크로칩-기반 점도 측정
VROC® Initium(Rheosense, 미국 캘리포니아주 소재)을 사용하여 다양한 제형 조건에서 단백질 용액의 겉보기 점도를 측정하였다. 온도를 20℃로 설정하였다. 기기 성능을 보장하기 위해 샘플 준비 또는 처리 전후에 2 cP 및 80 cP의 점도 기준 표준물을 측정하였다. 중간 전단 속도를 사용하여 다양한 제형 조건에서 단백질 용액의 겉보기 점도를 측정하였다.
4.1 등전점의 결정을 위한 이미지 모세관 등전점 전기영동
이미지 모세관 등전점 전기영동(imaged capillary isoelectric focusing; iCIEF), 예를 들어 iCE3TM(Protein Simple, 미국 캘리포니아주 소재)을 사용하여 단백질의 등전점(pI)을 측정하였다. 단백질 pI는 iCIEF 측정 전하 프로파일에서 주요 피크로 결정되었다.
5.1 서열 및 구조 분석을 포함한 단백질의 상동성 모델
Molecular Operating Enviro㎚ent(MOE)(Chemical Computing Group, 캐나다 퀘벡 소재)를 사용하여 5DWU 프레임워크로 단백질의 상동성 모델을 구축하였다. 단백질 특성 분석 모듈을 사용하여 정적 모델 구조를 기반으로 하여 pI 값을 계산하였다. Sharma외 다수의 알고리즘(Sharma et al., In silico selection of therapeutic antibodies for development: Viscosity, clearance, and chemical stability. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2014, 111(52):18601-18606)을 기반으로 하여 BioMOE 모듈을 이용하여 표면 특성을 분석하고 계산하였다.
6.1 단백질-단백질 상호작용의 측정
상호작용 매개변수 kD 및 2차 삼투 바이랄 계수 B 22 를 결정하여 단백질-단백질 상호작용을 측정하였다. 상호작용 매개변수 kD를 2 ㎎/㎖ 내지 10 ㎎/㎖에서 동적 광 산란(DLS), 예컨대, Wyatt DynaPro 플레이트 판독기(Wyatt Technology, 미국 캘리포니아주 소재)를 사용하여 측정하였다. 방정식 2에 나타낸 바와 같이, 상호 확산 계수에 대한 거대분자 농도의 영향으로부터 kD 값을 추론하였다:
Figure pct00002
(방정식 2)
여기서, Dm은 상호 확산 계수이고, D0은 무한 희석에서 Dm의 값이며, kD는 1차 상호작용 매개변수이고, c는 단백질 농도이다. 상대적으로 희석된 단백질 농도 범위에서, 고차 농도 효과는 무시될 수 있으며, kD는 Dm 대 c의 선형 플롯에서 기울기를 y-절편으로 나눈 값과 같다.
2차 삼투 바이랄 계수 B 22 를 정적 광 산란(SLS), 예컨대, Wyatt 조성 구배-다각도 광 산란(CG-MALS) 시스템(DAWN HELEOS MALS 검출기 및 Optilab rEX 굴절률 검출기와 결합된 Calypso III, Wyatt Technology, 미국 캘리포니아주 소재)을 사용하여 측정하였다. 약 14 ㎎/㎖의 단백질 용액을 1 ㎖/분의 유속으로 Calypso III에서 약 3 ㎎/㎖로 6 단계로 희석하였다. 658㎚에서 다각도로부터 광 산란 강도를 사용하여 초과 레일리(Rayleigh) 비율을 결정하였고 굴절률 측정을 사용하여 단백질 농도를 결정하였다. 문헌(Alford et al., High concentration formulations of recombinant human interleukin-1 receptor antagonist: I. Physical characterization. J Pharm Sci, 2008, 97(8):3035-3050; Kalonia et al., 2016. Effects of Protein Conformation, Apparent Solubility, and Protein-Protein Interactions on the Rates and Mechanisms of Aggregation for an IgG1 Monoclonal Antibody. The Journal of Physical Chemistry B, 2016, 120(29):7062-7075)에 앞서 기재된 하기 방정식 3 및 4를 사용하여 2차 삼투 바이랄 계수를 결정하였다:
Figure pct00003
(방정식 3)
여기서, Mw는 질량-평균 분자량이고, c는 단백질 농도이며, R(θ)는 초과 레일리 비율이고, 광학 상수인 K는 방정식 4에 기재되어 있다:
Figure pct00004
(방정식 4)
여기서, n0은 용매 굴절률이고, dn/dc는 굴절률 증가분을 나타내며, NA는 아보가드로수이고, λ는 입사 밉의 파장이다.
7.1 시차 주사 열량계 측정
시차 주사 열량계(DSC), 예를 들어 MicroCal VP-DSC(Malvern Instruments, 영국 우스터셔 소재)를 이용하여 열 램핑(thermal ramping) 동안 단백질의 겉보기 용융 온도(Tm)를 측정하였다. 전형적인 실험 설정에서, 다양한 제형 조건에서 위약 및 1 ㎎/㎖ 단백질 용액을 20℃에서 105℃까지 1℃/분으로 가열하였다. 획득한 서모그램 데이터를 위약에서 차감하고 비-2상태 언폴딩 모델을 사용하여 Origin 7.0 소프트웨어로 Tm에 대해 분석하였다.
8.1 교반 안정성의 측정
1 ㎎/㎖의 계면활성제가 없는 단백질 용액을 실온에서 1000 rpm으로 와류 혼합하였다. 이어서, 마이크로 플로우 영상(micro-flow imaging; MFI) 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 응집 프로파일을 특성화하였다.
실시예 1. 이중특이적 항체 및 이의 모 항체의 물리-화학적 특성의 결정
서열 및 구조 분석을 포함하여 단백질 상동성 모델링을 BsAb1, mAb-A, 및 mAb-B에 대하여 수행하였다. 단백질의 표면 특성을 분석하였다. 이중특이적 항체, 예를 들어 BsAb1, 및 이의 모 항체, 예를 들어 mAb-A 및 mAb-B의 물리-화학적 특성을 표 2에 나타낸 바와 같이 결정하였다. 정적 모델 구조를 기반으로 하여, 항체의 이론적 등전점(pI)을 결정하였다. iCIEF를 사용하여 pI의 실험 값을 측정하였다. pI의 실험값은 pI의 이론값과 유사하지만 약간 차이가 있었다. 흥미롭게도, BsAb1의 pI 값은 mAb A의 pI 값보다 더 크지만, mAb-B의 pI 값보다 더 작다. HIC-HPLC에 의해 측정된 상대 표면 소수성은 BsAb1 및 mAb-B가 상대적으로 더 높은 소수성을 가짐을 나타내었다. mAb-A, mAb-B 및 BsAb1의 불변 영역에서의 유사성을 고려하여, Fv 전하, Fv 소수성 지수 및 Fv 전하 불균일성을 결정함으로써 이들 사이의 pI 차이를 정확히 보여주도록 이들 항체의 가변 영역(Fv)을 모델링하였다.
BsAb1, mAb-A, 및 mAb-B의 물리-화학적 특성.
물리-화학적 특성 BsAb1 mAb-A mAb-B
pI(이론) 6.84 6.3 7.77
pI(실험, iCIEF) 약 6.9 약 6.3 약 7.3
HΦ%(HIC-HPLC) 30 20 32
Fv 표면 전하 3 -1 8
Fv 소수성 지수 1.15 1.08 1.23
Fv 전하 불균일성 -13 -53 9
표면 특성 분석에 따르면, 모델링 결과는 mAb-B가 가장 높은 Fv 표면 전하(총 전하) 및 Fv 소수성을 갖는 것을 나타낸다. Fv 표면 전하 및 Fv 소수성 값은 높은 것에서 낮은 것으로 mAb-B, BsAb1, 및 mAb-A의 순서이다. 그러나, Fv 전하 불균일성의 값은 표 2에 나타낸 바와 같이 역순이다. 표면 지도로서 BsAb1, mAb-A의 Fab, 및 mAb-B의 Fab의 구조적 모델링이 도 1에 나타내어져 있다. 직사각형의 음영 영역은 소수성 패치의 위치를 나타낸다. 원의 음영 영역은 음전하 패치의 위치를 나타낸다. 삼각형의 음영 영역은 양전하 패치를 나타낸다. 도 1의 표면 지도에 나타낸 바와 같이, BsAb1의 2개의 Fab 암은 독특한 표면 특성, 예컨대, 뚜렷한 표면 전하 및 소수성을 가진다. 이러한 결과는 mAb-A의 Fv 영역에서 높은 전하 불균일성 및 낮은 표면 전하가 더 높은 농도에서 mAb-A 및 BsAb1의 불리한 거동에 기인할 수 있음을 나타낸다.
이들 항체의 용융 온도, 예를 들어 Tm을 결정하였다. 결과는 용융 온도 사이에 유의한 차이가 없음을 나타낸다. 이는 이중특이적 항체, 예를 들어 BsAb1, 및 이의 모 항체, 예를 들어 mAb-A 및 mAb-B가 비슷한 형태적 안정성을 가진다는 것을 시사한다.
실시예 2. 단백질 제형의 단백광의 측정
405㎚에서 광학 밀도를 측정함으로써 단백질 용액의 단백광을 특성화하였다. 도 2A 내지 2C에 나타낸 바와 같이 BsAb1, mAb-A, 및 mAb-B의 단백질 제형에 대하여 OD 405㎚에서 광학 밀도의 측정을 수행하였다. 표 1의 표적 제형 완충액에 나타낸 바와 같이, A5는 pH 5의 10mM 아세테이트의 조성물을 나타낸다. H6은 pH 6의 10mM 히스티딘의 조성물을 나타낸다. H6N은 pH 6의 10mM 히스티딘, 150mM NaCl의 조성물을 나타낸다. T8은 pH 8의 10mM Tris의 조성물을 나타낸다. BsAb1이 pH 6의 10mM 히스티딘의 제형 완충액(도 2A에서 H6으로 지정됨) 중에서 제조될 때, BsAb1의 단백질 농도 및 OD405의 측정값은 도 2A에 나타낸 바와 같이 20 ㎎/㎖ 내지 150 ㎎/㎖의 범위에서 일차 종속을 가진다. 그러나, BsAb1의 단백질 농도가 50 ㎎/㎖를 초과할 때, 상당한 탁함이 시각적으로 관찰되었다. BsAb1의 제형 완충액에 150mM의 NaCl을 포함하였을 때, 50 ㎎/㎖ 초과의 단백질 농도에서 단백광이 상당히 감소하였고, OD450의 측정값은 BsAb1의 단백질 농도에 대하여 여전히 일차 종속이었다. pH 5에서 10mM 아세테이트를 포함하는 제형 완충액(도 2A에서 A5로 지정됨)에서 BsAb1을 제조함으로써 pH 범위의 효과를 또한 조사하였다. BsAb1의 제형 완충액의 pH 값이, 예를 들어 pH 6에서 pH 5로 감소될 때, 단백광이 현저하게 감소하였다. 역으로, pH가 8로 상승될 때, 단백광의 현저한 선형 증가가 있었다. 도 2A에 나타내어져 있지 않지만, pH 8에서 10mM을 포함하는 제형 완충액(T8로 지정됨)에서 BsAb1의 단백광을 표 3에 나타낸 바와 같이 측정하였다.
Tris pH 8에서 BsAb1의 단백광
BsAb1의 농도(T8에서 제조됨) 405에서 OD
20.4 ㎎/㎖ 0.078
49.0 ㎎/㎖ 0.125
67.2 ㎎/㎖ 0.152
대조적으로, 도 2B 및 2C에 나타낸 바와 같이 모 mAb-A 및 mAb-B는 BsAb1과 비교하여 상이한 단백광 프로파일을 완료하였다. mAb-A는 pH 6의 10mM 히스티딘의 제형 완충액에서 불안정하였으며, 이는 심각한 침전을 겪었고 결국 6.3 ㎎/㎖ 단백질 농도에서 상부 상이 있는 상 분리를 겪었다. mAb-A의 제형 완충액에 150mM의 NaCl을 포함하여 이온 강도를 증가시켰을 때, 단백광은 현저하게 감소하였고, 용해도는 증가하였다(도 2B의 H6N). 또한 pH 5의 10mM 아세테이트를 포함하는 제형 완충액(도 2B에서 A5)에서 mAb-A를 제조함으로써 pH 범위의 효과를 조사하였다. mAb-A의 제형 완충액의 pH 값이, 예를 들어 pH 6에서 pH 5로 감소될 때, 단백광은 현저하게 감소하였다. 3가지 제형 완충액에서 mAb-B를 제조하였고(도 2C), mAb-B의 OD405의 측정값은 3가지 모든 조건에서 낮았다. 예를 들어 pH 6에서 pH 5로, pH 값을 감소시키는 전략(도 2C의 A5)만 최소한의 영향을 미쳤다. mAb-B의 제형 완충액에 150mM의 NaCl을 포함하여 이온 강도를 증가시켰을 때, 단백광은 약간 증가하였다(도 2C의 H6N).
실시예 3. 단백질 제형 점도의 측정
마이크로칩-기반 점도계를 사용하여 다양한 조건에서 단백질 제형의 용액 점도를 측정하였다. 이러한 접근법은 공기-물 계면으로부터의 간섭을 피할 수 있고, 또한 소량의 샘플을 사용하는 특성을 이용할 수 있다. 도 3A 내지 3C에 나타낸 바와 같이 pH 5의 10mM 아세테이트의 조성물(A5), pH 6의 10mM 히스티딘의 조성물(H6), pH 6의 10mM 히스티딘, 150mM NaCl의 조성물(H6N), pH 6의 10mM 히스티딘, 150mM ArgHCl의 조성물(H6Arg), 및 pH 8의 10mM Tris(T8)를 포함하여, 다양한 제형 완충액에서 BsAb1, mAb-A, 또는 mAb-B를 제조하였다. 10mM 히스티딘(pH 6) 중 BsAb1의 점도는 단백질 농도에 대한 지수 의존성을 나타내었고, 150 ㎎/㎖에서 120 CP만큼 높이 도달했는데, 이는 약물 제조 및 투여에 대해 허용 가능한 범위를 훨씬 초과하는 것이다(도 3A의 H6). 비교로서, 150 ㎎/㎖에서 직경이 10㎚인 면역글로불린의 이론적 점도를 무니 방정식에 의해 계산하였다. 얻어진 결과는 단지 약 4 cP이며, 이는 경질 구체 배제만 분자간 상호작용에 기인한다는 가정으로 이어졌다(도 3A). 150mM NaCl을 첨가하여 이온 강도를 증가시킴으로써, 또는 예를 들어 pH 8에서 pH 5로 pH 값을 감소시킴으로써 BsAb1 제형의 점도는 크게 감소되었다. BsAb1 제형에 150mM의 ArgHCl을 포함할 때(도 3A에서 H6Arg), BsAb1 제형의 점도가 모든 제형 완충액 중에서 가장 큰 정도로 감소되었다. 다양한 단백질 농도에 걸쳐 150mM의 ArgHCl을 포함하는 BsAb1 제형의 점도는 무니 방정식에 의해 계산되고 예측된 이론적 점도와 유사하였다. 이온 강도 및 pH 값의 변화는 mAb-A 제형에 대해 유사한 효과를 나타내었다(도 3B). 도 3A에 나타내어져 있지 않지만, 표 4에 나타낸 바와 같이 제형 T8에서 BsAb1의 점도를 또한 측정하였다.
Tris pH 8에서 BsAb1의 점도
BsAb1의 농도(T8에서 제조됨) 점도(cp)
20.4 ㎎/㎖ 1.27
49.0 ㎎/㎖ 1.85
67.2 ㎎/㎖ 2.37
이전 실시예에서 논의된 바와 같이(도 2B), 150mM의 NaCl을 첨가하거나 pH를, 예를 들어 pH 6에서 pH 5로 감소시킴으로써 mAb-A를 150 ㎎/㎖ 초과에서 재가용화시킬 수 있었다. 그러나, 150 ㎎/㎖의 단백질 농도에서, pH 5의 10mM 아세테이트(A5)에서 mAb-A의 점도는 도 3B에 나타낸 바와 같이 pH 6의 10mM 히스티딘, 150mM NaCl(H6N)에서 mAb-A의 점도보다 현저하게 더 높았다. 150mM ArgHCl의 사용은 또한 mAb-A를 최대 150 ㎎/㎖까지 가용화시킬 수 있었다(도 3B에서 H6Arg). 추가적으로, mAb-A 제형에서 150mM ArgHCl의 사용은 이론적으로 예측되는 값에 가깝게 점도를 추가로 감소시켰다. 대조적으로, 다양한 pH 값 또는 이온 강도에서 mAb-B 제형의 점도는 유사하고 비슷하다. mAb-B 제형에서 150mM ArgHCl의 사용은 유의한 차이에 기여하지 않으며, 이는 단지 점도를 이론적 값으로 약간 개선시켰다(도 3C).
ArgHCl의 첨가는 BsAb1, mAb-A 및 mAb-B 제형의 점도를 현저하게 감소시킬 수 있기 때문에, 이는 고농도에서 이들 단백질의 거동이 이들 단백질의 표면 소수성에 의해 영향을 받았음을 나타낸다. BsAb1의 2개의 이종성 Fab 암 사이에 최소한의 교차 상호작용이 존재할 가능성이 있다. BsAb1의 고점도 및 단백광은 mAb-A 유래의 Fab 암으로 인한 것일 가능성이 있다.
실시예 4. 교반 안정성에서 이온 강도, pH 및 부형제의 효과
다양한 제형에서 BsAb1의 계면 감도를 조사하기 위해 교반 안정성을 측정하였다. 1 ㎎/㎖의 단백질 용액을 실온에서 1000 rpm으로 와류 혼합하였다. 이어서, 마이크로 플로우 영상(MFI) 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 응집 프로파일을 특성화하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 이온 강도를 증가시키는 전략은 교반 시 보이지 않는 입자의 형성을 현저하게 감소시킬 수 있다. ArgHCl의 존재는 공기-물 계면 안정성의 개선을 제공할 수 있다. 결과는 BsAb1의 계면 감도가 단백질-단백질 상호작용에 의해 현저하게 조절됨을 나타낸다. 도 4에 나타낸 바와 같이, H6은 pH 6의 10mM 히스티딘의 조성물을 나타낸다. H6N은 pH 6의 10mM 히스티딘, 150mM NaCl의 조성물을 나타낸다. H6Arg는 pH 6의 10mM 히스티딘, 150mM ArgHCl의 완충액 조성물을 나타낸다.
실시예 5. 상호작용 매개변수 및 2차 삼투 계수의 측정
상호작용 매개변수 kD를 2 ㎎/㎖ 내지 10 ㎎/㎖에서 동적 광 산란(DLS), 예컨대, Wyatt DynaPro 플레이트 판독기(Wyatt Technology, 미국 캘리포니아주 소재)를 사용하여 측정하였다. 방법 섹션에 기재된 바와 같이 kD 값을 추정하였다. 방법 섹션에 기재된 바와 같이 2차 삼투 바이랄 계수 B 22 를 Wyatt 조성 구배-다각도 광 산란(CG-MALS)에 의해 측정하였다.
단백질 상호작용 매개변수(kD)를 DLS에 의해 측정하였다. 결과는 BsAb1의 상호작용 매개변수 kD가 pH 6의 10mM 히스티딘(도 5A의 H6) 및 pH 8(표 5)의 존재 하에 상당한 음의 값을 가진다는 것을 나타내며, 이는 pH 6에서 강력한 유인성 단백질-단백질 상호작용의 존재를 나타낸다. 이온 강도를 증가시키고(150mM의 NaCl 또는 150mM의 ArgHCl을 첨가함) pH 값을 변화시키는(pH 6에서 pH 5로) 전략은 도 5A에 나타낸 바와 같이 BsAb1 제형의 kD 값을 증가시킬 수 있다. 도 5A에 나타내어져 있지 않지만, 추가적인 제형에서 BsAb1의 점도를 또한 표 5에 나타낸 바와 같이 측정하였다.
Tris pH 8에서 BsAb1의 점도
BsAb1의 제형 성분 kD(㎖/g)
아세테이트, pH5.0 + 프롤린 -2.86
아세테이트, pH5.0 + 시트레이트 -12.5
아세테이트, pH5.0 + MgCl2 -15.6
아세테이트, pH5.0 + Na2SO4 -20.4
His, pH6.0 + 프롤린 -23.4
His, pH6.0 + 시트레이트 -11.7
His, pH6.0 + MgCl2 -11.9
His, pH6.0 + Na2SO4 -15
Tris, pH8.0 -7.03
Tris, pH8.0 + 프롤린 -9.19
Tris, pH8.0 + 시트레이트 -7.79
Tris, pH8.0 + MgCl2 -10.8
Tris, pH8.0 + Na2SO4 -8.3
도 5A 및 표 5에 나타낸 바와 같이, BsAb1 제형에서 150mM의 ArgHCl을 첨가하거나 pH 값을 pH 8에서 pH 5로 감소시키는 것은 BsAb1 제형의 kD 값을 kD가 약 -5.37 ㎖/g인 세타 조건(theta condition)으로 증가시킬 수 있다. kD 값이 세타 조건에 도달하면, 밀집된 농도에서 경질 구체 반발을 제외하고 순 단백질-단백질 상호작용이 존재하지 않는다.
BsAb1과 비교하여, mAb-A의 상호작용 매개변수 kD는 pH 6의 10mM 히스티딘의 존재 하에 훨씬 더 큰 음의 값을 가지며(도 5A), 이는 훨씬 더 강력한 유인성 단백질-단백질 상호작용의 존재를 나타낸다. 이온 강도를 증가시키고(150mM의 NaCl 또는 150mM의 ArgHCl을 첨가함) pH 값을 변화시키는(pH 8에서 pH 5로) 전략은 도 5A 및 표 5에 나타낸 바와 같이 mAb-A 제형의 kD 값을 증가시킬 수 있다. 그러나, mAb-A 제형의 조정된 kD 값은 상응하는 제형에서 BsAb1 제형의 값과 비교하여 훨씬 더 음의 값이다. 도 5A 및 표 5에 나타낸 바와 같이, mAb-A 제형에서 150mM의 ArgHCl을 첨가하는 것은 mAb-A 제형의 kD 값을 세타 조건으로 증가시킬 수 있다. 대조적으로, mAb-B 제형의 kD 값은 도 5A에 나타낸 바와 같이 세타 조건에 가깝거나 이를 초과하였다(오차 = 삼중 표준 편차). mAb-A 및 mAb-B의 공동 제형은 BsAb1과 비교하여 단백질-단백질 상호작용의 유사한 수준을 가진다. 결과를 기반으로 하여, 이온 강도를 증가시키는 것, pH 값을 낮추는 것, 및 소수성 부형제를 사용하는 것은 유인성 단백질-단백질 상호작용을 효과적으로 감소시킬 수 있다.
분자간 상호작용 매개변수 kD 분석은 상당한 유인성 단백질-단백질 상호작용이 pH 6의 10mM 히스티딘 중 BsAb1 분자 사이에 존재함을 나타내었다. pH 6의 제형의 pH 값은 약 6.9의 BsAb1의 pI에 가깝다. 따라서, 150mM의 NaCl을 제형에 첨가하는 전략이 단백질-단백질 상호작용을 최소 수준으로 현저하게 감소시킬 수 있음을 입증하였다. pH 6에서 BsAb1의 전반적으로 낮은 단백질 전하를 고려할 때, 이온 강도의 조정은 제형의 점도를 감소시키는 상당한 효과를 도입할 수 있기 때문에, 쌍극자-쌍극자 상호작용과 같은 단거리 정전기 상호작용은 BsAb1의 불리한 고농도 거동에 기여할 수 있는 유인성 단백질-단백질 상호작용의 원인이 됨을 시사한다.
단백질 고농도에서 BsAb1의 고점도 및 단백광은 단거리 정전기 상호작용 및 소수성 상호작용에 기인하며, 이때 하나의 Fab 암은 유인성 자가 상호작용을 지배한다. 따라서, 이온 강도를 증가시키고/시키거나 소수성 부형제를 첨가함으로써 제형에서 BsAb1의 불리한 고농도 거동을 효과적으로 완화시킬 수 있다. 이러한 결과는 BsAb1의 분자간 상호작용 매개변수 kD가 단백질 고농도 거동에 대한 합리적인 예측을 제공할 수 있음을 입증한다. 따라서, kD의 측정은 이중특이적 항체 및 이의 제형 최적화를 구성하기 위한 분자 후보를 선택하는 데 사용될 수 있다.
다양한 단백질 농도에서 pH 6의 10mM 히스티딘 중 BsAb1 제형의 2차 삼투 바이랄 계수 B 22 를 도 5B에 나타낸 바와 같이 Wyatt 조성 구배-다각도 광 산란(CG-MALS)에 의해 측정하였다. 결과는 pH 6의 10mM 히스티딘의 존재 하에 BsAb1 제형에서 강력한 유인성 단백질-단백질 상호작용의 존재를 나타내는 큰 음의 B22 값을 나타낸다. 이러한 결과는 상호작용 매개변수 kD의 측정을 기반으로 하여 단백질-단백질 상호작용의 예측이 신뢰성 있음을 확인시켜 주었다.
실시예 6. 상호작용 매개변수와 연관된 상관관계 분석
도 6A(150 ㎎/㎖의 농도에서) 및 도 6C(70 ㎎/㎖의 농도에서)에 나타낸 바와 같이 피어슨 상관관계(Pearson correlation)를 사용하여 단백광과 상호작용 매개변수 kD 사이의 관계를 분석하였다. 도 6A에 나타내지 않았지만, 표 6에 나타낸 바와 같이 추가적인 제형에서 BsAb1의 단백광과 상호작용 매개변수 kD 사이의 관계를 또한 측정하였다.
Tris pH 8에서 BsAb1의 점도
BsAb1의 제형 성분 OD405(70 ㎎/㎖에서)
아세테이트, pH5.0 + 프롤린 0.1179
아세테이트, pH5.0 + 시트레이트 0.2194
아세테이트, pH5.0 + MgCl2 0.1815
아세테이트, pH5.0 + Na2SO4 0.2657
His, pH6.0 + 프롤린 0.2187
His, pH6.0 + 시트레이트 0.1848
His, pH6.0 + MgCl2 0.1799
His, pH6.0 + Na2SO4 0.2202
Tris, pH8.0 0.152(67 ㎎/㎖에서)
Tris, pH8.0 + 프롤린 0.15
Tris, pH8.0 + 시트레이트 0.152
Tris, pH8.0 + MgCl2 0.1711
Tris, pH8.0 + Na2SO4 0.1595
도 6B에 나타낸 바와 같은 피어슨 상관관계를 사용하여 점도와 상관관계 매개변수 kD 사이의 관계를 분석하였다. 피어슨 상관관계 계수, 예를 들어 피어슨 r은 2개 변수 사이의 선형 상관관계의 측정값이다. 단백광/점도와 상호작용 매개변수 kD 사이에 합리적인 상관관계가 존재한다. 결과는 단백광/점도와 단백질-단백질 상호작용 사이에 합리적인 상관관계의 존재를 나타낸다. 단백질-단백질 상호작용은 용액 중 단백질 고농도에서 단백질의 특징(단백질 거동)을 지배한다.

Claims (38)

  1. 표적 물리-화학적 특성을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 조합물을 생성하는 방법으로서,
    펩타이드 또는 단백질의 복수의 아미노산 서열을 수용하는 단계;
    목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질을 선택하는 단계;
    상기 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 단백질-단백질 상호작용의 프로파일을 결정하는 단계;
    상기 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 단백질-단백질 상호작용의 표적 프로파일을 선택하는 단계; 및
    상기 단백질-단백질 상호작용의 표적 프로파일에 따라 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 조합물을 생성하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단백질-단백질 상호작용의 프로파일은 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 상호작용 매개변수를 측정함으로써 결정되는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 물리-화학적 특성의 프로파일을 결정하는 단계를 더 포함하되, 상기 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 조합물은 단백질-단백질 상호작용의 표적 프로파일 및 물리-화학적 특성의 프로파일에 따라 생성되는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 물리-화학적 특성은 이론적 등전점, 실험적 등전점, 표면 소수성, 상대 표면 소수성, 소수성 지수, 표면 전하, 전하 불균일성, 2차 삼투 바이알 계수, 교반 안정성, 단백광, 점도, 또는 계면 감도인, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 표면 소수성 또는 표면 전하는 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 구조적 모델링을 수행함으로써 결정되는, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 단백질-단백질 상호작용은 반발성 또는 유인성 단백질-단백질 상호작용인, 방법.
  7. 제2항에 있어서, 상기 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 조합물은 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체인, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체를 생성하기 위한 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 가변 영역의 소수성 지수, 표면 전하, 또는 전하 불균일성을 결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 조합물의 농도는 약 20 ㎎/㎖ 내지 약 200 ㎎/㎖인, 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 조합물의 농도는 적어도 약 70 ㎎/㎖인, 방법.
  11. 표적 물리-화학적 특성을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 조합물을 생성하기 위한 시스템으로서,
    펩타이드 또는 단백질의 복수의 아미노산 서열을 포함하는 제1 데이터 저장부,
    목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 선택을 가능하게 하는 제1 데이터 저장부에 결합된 제1 프로세서, 및
    상기 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 단백질-단백질 상호작용의 프로파일을 생성하고, 상기 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 단백질-단백질 상호작용의 표적 프로파일을 선택하며, 상기 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 조합물을 식별할 수 있되, 상기 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 조합물은 단백질-단백질 상호작용의 표적 프로파일에 따라 선택되는 것인, 제2 프로세서
    를 포함하는, 시스템.
  12. 제11항에 있어서, 상기 단백질-단백질 상호작용의 프로파일은 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 상호작용 매개변수를 측정함으로써 결정되는, 시스템.
  13. 제11항에 있어서, 상기 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 물리-화학적 특성의 프로파일을 더 포함하되, 상기 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 조합물은 단백질-단백질 상호작용의 표적 프로파일 및 물리-화학적 특성의 프로파일에 따라 선택되는, 시스템.
  14. 제13항에 있어서, 상기 물리-화학적 특성은 이론적 등전점, 실험적 등전점, 표면 소수성, 상대 표면 소수성, 소수성 지수, 표면 전하, 전하 불균일성, 2차 삼투 바이알 계수, 교반 안정성, 단백광, 점도, 또는 계면 감도인, 시스템.
  15. 제14항에 있어서, 상기 표면 소수성 또는 표면 전하는 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 구조적 모델링을 수행함으로써 결정되는, 시스템.
  16. 제11항에 있어서, 상기 단백질-단백질 상호작용은 반발성 또는 유인성 단백질-단백질 상호작용인, 시스템.
  17. 제11항에 있어서, 상기 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 조합물은 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체인, 시스템.
  18. 제17항에 있어서, 상기 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 가변 영역의 소수성 지수, 표면 전하, 또는 전하 불균일성의 프로파일을 더 포함하는, 시스템.
  19. 제11항에 있어서, 상기 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 조합물의 농도는 약 20 ㎎/㎖ 내지 약 200 ㎎/㎖인, 시스템.
  20. 제11항에 있어서, 상기 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 조합물의 농도는 적어도 약 70 ㎎/㎖인, 시스템.
  21. 제형에서 적어도 하나의 성분을 최적화하거나 선택하는 방법으로서, 상기 제형은 제1항의 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 조합물을 포함하고, 상기 방법은,
    상기 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 단백질-단백질 상호작용의 표적 프로파일을 기반으로 하여 상기 제형의 이온 강도를 조정하는 단계, 및
    상기 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 단백질-단백질 상호작용의 표적 프로파일을 기반으로 하여 상기 제형의 pH 값을 조정하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 단백질-단백질 상호작용의 표적 프로파일을 기반으로 하여 염을 상기 제형에 첨가하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  23. 제21항에 있어서, 상기 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 단백질의 단백질-단백질 상호작용의 표적 프로파일을 기반으로 하여 소수성 부형제를 제형에 첨가하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  24. 제21항에 있어서, 상기 적어도 하나의 성분은 염화나트륨, 아세테이트, 히스티딘, 또는 아르기닌 하이드로클로라이드인, 방법.
  25. 제형에서 적어도 하나의 성분을 최적화하거나 선택하는 방법으로서, 상기 제형은 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체를 포함하고, 상기 방법은,
    상기 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 단백질-단백질 상호작용의 프로파일을 결정하는 단계, 및
    상기 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 단백질-단백질 상호작용의 프로파일을 기반으로 하여 상기 제형에서 적어도 하나의 성분을 최적화하거나 선택하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 단백질-단백질 상호작용의 프로파일은 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 상호작용 매개변수를 측정함으로써 결정되는, 방법.
  27. 제25항에 있어서, 상기 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 단백질-단백질 상호작용의 프로파일을 기반으로 하여 상기 제형의 이온 강도를 조정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  28. 제25항에 있어서, 상기 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 단백질-단백질 상호작용의 프로파일을 기반으로 하여 상기 제형의 pH 값을 조정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  29. 제25항에 있어서, 상기 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 물리-화학적 특성의 프로파일을 결정하는 단계를 더 포함하되, 상기 제형에서 적어도 하나의 성분을 최적화하거나 선택하는 것은 상기 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 단백질-단백질 상호작용의 프로파일 및 상기 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 물리-화학적 특성의 프로파일을 기반으로 하는, 방법.
  30. 제25항에 있어서, 상기 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 단백질-단백질 상호작용의 프로파일을 기반으로 하여 염을 상기 제형에 첨가하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  31. 제25항에 있어서, 상기 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 단백질-단백질 상호작용의 프로파일을 기반으로 하여 소수성 부형제를 상기 제형에 첨가하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  32. 제25항에 있어서, 적어도 하나의 성분은 염화나트륨, 아세테이트, 히스티딘, 또는 아르기닌 하이드로클로라이드인, 방법.
  33. 제29항에 있어서, 상기 물리-화학적 특성은 이론적 등전점, 실험적 등전점, 표면 소수성, 상대 표면 소수성, 소수성 지수, 표면 전하, 전하 불균일성, 2차 삼투 바이알 계수, 교반 안정성, 단백광, 점도, 또는 계면 감도인, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 표면 소수성 또는 표면 전하는 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 구조적 모델링을 수행함으로써 결정되는, 방법.
  35. 제25항에 있어서, 상기 단백질-단백질 상호작용은 반발성 또는 유인성 단백질-단백질 상호작용인, 방법.
  36. 제29항에 있어서, 상기 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 가변 영역의 소수성 지수, 표면 전하, 또는 전하 불균일성을 결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  37. 제25항에 있어서, 상기 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 농도는 약 20 ㎎/㎖ 내지 약 200 ㎎/㎖인, 방법.
  38. 제25항에 있어서, 상기 이중특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 농도는 적어도 약 70 ㎎/㎖인, 방법.
KR1020227008403A 2019-08-20 2020-08-20 이중특이적 항체에 대한 제형 최적화 KR20220047611A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962889354P 2019-08-20 2019-08-20
US62/889,354 2019-08-20
PCT/US2020/047156 WO2021035028A2 (en) 2019-08-20 2020-08-20 Formulation optimization for bispecific antibodies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220047611A true KR20220047611A (ko) 2022-04-18

Family

ID=72322561

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227008403A KR20220047611A (ko) 2019-08-20 2020-08-20 이중특이적 항체에 대한 제형 최적화

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20210054050A1 (ko)
EP (1) EP4017877A2 (ko)
JP (1) JP2022544818A (ko)
KR (1) KR20220047611A (ko)
CN (1) CN114787629A (ko)
AU (1) AU2020332821A1 (ko)
BR (1) BR112022002797A2 (ko)
CA (1) CA3151337A1 (ko)
IL (1) IL290690A (ko)
MX (1) MX2022002110A (ko)
WO (1) WO2021035028A2 (ko)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3689912A1 (en) * 2007-09-26 2020-08-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in cdr
MX2016006571A (es) * 2013-11-29 2016-08-05 Genentech Inc Aparatos y metodos de seleccion de anticuerpo.
WO2016036678A1 (en) * 2014-09-02 2016-03-10 Medimmune, Llc Formulations of bispecific antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
JP2022544818A (ja) 2022-10-21
IL290690A (en) 2022-04-01
EP4017877A2 (en) 2022-06-29
WO2021035028A3 (en) 2021-04-08
CN114787629A (zh) 2022-07-22
BR112022002797A2 (pt) 2022-08-09
AU2020332821A1 (en) 2022-03-10
WO2021035028A2 (en) 2021-02-25
MX2022002110A (es) 2022-05-18
CA3151337A1 (en) 2021-02-25
US20210054050A1 (en) 2021-02-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Shatz et al. Contribution of antibody hydrodynamic size to vitreal clearance revealed through rabbit studies using a species-matched fab
CA2860543C (en) Abeta antibody formulation
Wang et al. Viscosity-lowering effect of amino acids and salts on highly concentrated solutions of two IgG1 monoclonal antibodies
Sule et al. Rapid analysis of antibody self-association in complex mixtures using immunogold conjugates
CN108366968B (zh) 制造蛋白质微粒的组合物和方法
Podobnik et al. Conjugation of PolyPEG to interferon alpha extends serum half-life while maintaining low viscosity of the conjugate
Beck et al. 6th Annual European Antibody Congress 2010: November 29–December 1, 2010, Geneva, Switzerland
Khodabakhsh et al. Development of a novel nano-sized anti-VEGFA nanobody with enhanced physicochemical and pharmacokinetic properties
JP2022553640A (ja) 眼障害を処置する方法
Datta-Mannan et al. Modulation of the biophysical properties of bifunctional antibodies as a strategy for mitigating poor pharmacokinetics
KR102441221B1 (ko) 농도-의존적 자가-상호작용 나노입자 분광법을 사용하는 단백질의 자가-결합하는 능력을 결정하기 위한 분석
Woldeyes et al. Viscosities and protein interactions of bispecific antibodies and their monospecific mixtures
Manikwar et al. Characterization of a novel bispecific antibody with improved conformational and chemical stability
JP2021530458A (ja) 高濃度液体抗体製剤
US20210166780A1 (en) Multi-domain proteins with increased native state colloidal stability
KR20220047611A (ko) 이중특이적 항체에 대한 제형 최적화
Mock et al. Development of in silico models to predict viscosity and mouse clearance using a comprehensive analytical data set collected on 83 scaffold-consistent monoclonal antibodies
CN113194925A (zh) 抗体制剂
Banks et al. Suppression of Electrostatic Mediated Antibody Liquid–Liquid Phase Separation by Charged and Noncharged Preferentially Excluded Excipients
AU2016230182B2 (en) Anti-human membrane-type ADAM28 antibody
Zhang et al. Overview on biotherapeutic proteins: impact on bioanalysis
JP2022531331A (ja) 抗ｉｌ－６抗体製剤
Yadav et al. Biotherapeutics ADME and PK/PD Principles
Joerg et al. Introduction into novel constructs
KR20230009897A (ko) 항-IL-23p19 항체를 포함하는 제제, 이의 제조방법 및 용도