KR20220044504A - 개인 hla 패턴의 결정, 예후인자로서의 용도, 표적 유전자 및 치료제 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 암 환자 및/또는 자가면역 질환과 관련된 장애를 앓고 있는 환자의 신체 샘플(조직 또는 혈액 샘플)에서 개별적인 HLA 패턴(성체 및/또는 배아)의 시험관내 측정 방법, 및 맞춤 치료를 위해 상기 환자를 계층화하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 암과 같은 신생물 질환, 자가면역 질환, 감염성 질환 및 임신 관련 상태에 대한 예후 생물마커로서 핵산 분자뿐만 아니라, 상응하는 키트 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 치료제 및 치료제 제조 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 신체 샘플, 특히 암 환자 및/또는 자가면역 질환과 관련된 장애를 앓고 있는 환자의 조직 또는 혈액 샘플에서 개별적인 HLA 패턴(성체 및/또는 배아)의 시험관내 측정 방법 및 맞춤 치료를 위해 상기 환자를 계층화하는 방법에 관한 것이다.
화학적 또는 생물학적 종양 요법은 아직 단일 환자의 개별적인 종양 세포 유형에 초점을 맞추지 않고 있지만 일반적으로 악성 여부 및 개별 환자와 무관하게 빠르게 분열하는 모든 세포를 탐지한다.
최종 결과에서 이러한 유형의 치료법은 종종 효과가 없거나 심각한 부작용을 동반한다. 보다 표적화되고 고도로 개별적인 치료법이 매우 유용할 것이다.
잘-조절된 전체 유기체의 존재의 기초는 세포 간의 연통 또는 세포 대화이다. 이러한 대화와 그 조절은 세포가 끊임없이 죽고/죽거나 재생성되더라도 전체 유기체의 존재를 유지할 수 있게 한다. 이러한 대화의 결과로서, 줄기세포 연구로부터 공지된 바와 같이 세포의 분화도 조절된다. 이 대화는 심지어 하나의 세포 클론이 임신 중의 경우와 같이 매우 빠른 성장을 보인다 하더라도 두 개의 상이한 세포 클론의 잘 조절된 협력을 가능하게 한다.
인간의 세포 대화의 기초는 HLA 그룹을 갖는 MHC(주요 조직 적합성 복합체)이다. HLA 그룹에 의한 세포 식별은 모든 세포 연통의 기초이다. 세포 연통은 자연 살해 세포(NK 세포)의 살해 면역글로불린 유사 수용체(KIR) 또는 LILR(백혈구 면역글로불린 유사 수용체)과 같은 특정 수용체와 협력하여 전개되고, 후속적으로 사이토카인, 성장 인자 등과 같은 추가의 인자와 연루된다.
하기와 같이 기재될 수 있는 다양한 HLA 그룹이 공지되어 있다:
HLA 그룹 A, B 및 C(MHC I): 실질적으로 모든 성체 및 체세포를 식별한다.
HLA 그룹 D(DR, DP, DQ 등; MHC II): 면역 적격 세포 및/또는 항원 제시에서 중요한 역할을 한다.
HLA 그룹 E, F 및 G: 특히 소위 침입 전선에서 배아 세포를 식별한다.
추가로, MHC 복합체는 부류 III에 속하는 보체 인자와 같은 추가 물질을 또한 포함한다.
종양 세포는 기본적으로 전체 유기체의 임의의 다른 세포와 동일한 유전 암호를 갖는다. 따라서, 세포 분열과 세포 분화에 관한 유기체 전체의 정보 외에는 어떠한 정보도 갖고 있지 않다. 결과적으로, 모든 악성 종양 질환은 독특하고 개별적이다, 즉 각각의 유기체에 특이적이다.
일부 종양 질환에서, 추가적인 유전 정보가 외부에서, 예를 들어 바이러스 벡터, 예를 들어 소위 종양유전자에 의해 세포에 도입된다. 그러나, 종양유전자는 또한 출산 이후부터 유전 물질의 필수적인 부분을 형성할 수도 있다. 종양유전자 및/또는 이의 활성화 및 기타 외부 인자는 종양 세포의 생물학에 영구적으로 영향을 미칠 수 있다. 그러나 종양 세포는 전체 유기체의 세포 대화 및 그 안에서 유효한 규칙에 계속 관여한다.
인간과 같이 높은 세포 분화를 가진 유기체는 다능성 또는 전능성을 상실함으로써 높은 분화에 대해 "대가를 지불"한다. 기관 손실의 경우에, 온전한 회복은 더 이상 불가능하고 결합 조직에 의한 수복만 가능하다. 불가사리와 같이, 생물이 그다지 강하게 분화되지 않는 경우에는, 전능성 또는 다능성의 상실이 그렇게 뚜렷하지 않기 때문에, 예를 들어 팔을 잃은 경우 새 팔이 더 작아도 다시 자랄 수 있다.
전능성은 기본적으로 고등 생물의 유전 물질에도 또한 암호화되어 있다. 이는, 이전에는 이러한 유전 물질이 수정란 세포에서부터 분화된 유기체로의 발달을 통제해야 했다는 단순한 사실에 의해 입증된다. 클로닝 실험은 또한 복제양 "돌리(Dolly)"의 유방 세포와 같은 고도로 분화된 세포의 유전 물질이 핵에서 "0으로" "재설정"("재프로그램화")되는 것이 가능하다는 것을 보여준다. 최종 분석에서, 이것은 또한, 상대적으로 나이 든 두 개인(아버지와 어머니가 되는)의 유전 물질이 "0"으로 재설정되고 새로운 존재의 발생을 위해 다시 암호화되는 난자의 번식 및/또는 수정에도 적용된다.
이에 상응하여, 종양 세포에 또한, 전체 유기체에서 가능한 모든 성장 및 분화 과정, 즉 초기 배아 착상, 초기 배아-모체 세포 대화 및 후속적인 배아-태아 발달의 기전을 근본적으로 암호화하는 유전 물질이 제공된다는 것이 분명하다.
모든 종양 세포는 다양한 정도로 그의 분화를 상실하고(따라서 "탈분화되고") 다양한 정도로 "되돌아 가기(way back)"를 한다. 이러한 "되돌아 가기"의 본질적인 특징은 세포 분화의 상실 및 특정 세포 성능의 상실 및 또한 조절되지 않는 세포 성장의 (재)획득이다.
종양 세포는 표면에 전형적인 배아 HLA 그룹을 발현할 수 있음이 공지되어 있다. 각각의 연구는 아직 단편적이지만, 이러한 배아 HLA 그룹의 발현은 종양 세포가 자신의 유기체의 비특이적 면역 방어의 공격을 회피하는 상황에 기여한다. 표면에서 이러한 전형적인 HLA 그룹의 발현은 세포가, 예를 들어 NK 세포뿐만 아니라 림프구 및 추가 면역 적격 세포상의 상응하는 수용체를 활성화할 수 있게 하고, 따라서 NK 세포 및 림프구의 비특이적 면역 방어의 공격이 없을 뿐만 아니라, 개별적인 경우에 종양 세포(및 또한 배아 세포)는 "면역 방어가 그들을 위해 일하게" 할 수 있다, 즉 자체 발달에 이로운 성장 인자 및 사이토카인의 합성에 의해 그렇게 하게 할 수 있다.
여기서, 예를 들어 TAM(종양-연관된 대식세포) 또는 MDSC(면역관용 "골수-유래된 억제인자 세포")의 현상을 언급해야 한다. 이러한 현상은 심지어 악성 종양의 미세-환경에서의 종양 증식을 지지한다(즉 "돌변한다"). 이는 유사하게 사이토카인에, 예를 들어 종양에서 생성되는 듯하고(NK 세포에 의한 듯한) 혈관신생유도 효과를 갖고, 따라서 종양 세포의 증식과 이동을 지지하는 MIF(대식세포 이동 억제 인자)에, 유사하게 적용된다.
종양 세포는 그다지 내성일 필요는 없다. 공지된 바와 같이, 종양 세포는 "건강하고" 분화된 표준 세포보다 화학요법에 더 민감하고 또한 방사선에 더 민감하다. 이들의 세포 분열속도도 또한 특별히 높지 않다. 악성 종양 세포로부터 발생하는 위험은 무엇보다도, 세포 연통에 기초하여 진행하는 조절되지 않는 성장을 "강화할 수 있다"는 것이다.
이러한 상황은 또한 현재의 지식에 따르면 "악성 줄기세포"로서 지칭될 수 있는 악성 세포가 확산되고 군집화하기 때문에 전이가 우세하게 형성된다는 사실에 의해 예시된다. 이를 바로 잡는다면, 이와 같은 "악성 줄기세포"는 인접한 조직과의 세포 연통에 의해 성장 조절 및 분화 압력을 또한 국소적으로 피할 수 있게 될 것이다. 탈분화로부터 형성되는 바와 같이, 줄기세포는 일반적인 줄기세포처럼 행동할 것이고, 이 경우에 초점은 특히 배아모체 연통(배아모체 대화의)의 기능 방식을 향한다.
세포의 악성 퇴행은 모든 개인에 특이적인 특유의 과정이다. 이는 개인 전체에 걸쳐 병리학적으로 잘 분류될 수 있는(항상 재발하는) 종양 유형이 존재한다는 사실에 의해 변경되지 않는다. 이러한 상황은 오히려 악성 종양이 모든 탈분화 및 모든 "되돌아 가기"에 의해 형성되는 것은 아니라는 사실에 대한 증거이다. 이는 오히려 단지 몇몇 무리들만이 "되돌아 가는 길"에 "생존"할 수 있고, 따라서 개인 전체에 걸쳐 전형적인 종양 개체가 생성될 가능성이 높다.
세포의 탈분화 또는 "퇴행"은 추정상 모든 전체 유기체에서 비교적 보편적인 과정이다. 그러나, 이러한 세포 중 단지 일부만이 생존에 필요한 세포 생물학적 및 의사소통적 전제조건(세포에서 세포로)을 갖기 때문에 종양 질환의 형성으로 이어지는 경우는 거의 없다. 생존 가능성을 보여주는 세포는 아마도 결합된 형태로 상기에서 언급한 두 가지 기전을 사용한다. 한편으로, 이들은 면역 체계의 공격을 피하기 위해 배아모체 연통의 회복을 사용하고 심지어 세포 성장 과정에서 이러한 연통으로부터 지원을 얻고; 다른 한편으로, 이들은 완전히 또는 부분적으로 발현된(원래 성인) HLA 패턴(및 또한 자신의 어머니의 패턴에 해당하는 패턴(하기 참조))에 의해 보호되는, 따라서 확대되는 동안 특정 면역 방어의 공격을 피할 수 있다.
"획득" 면역은 임신 중에 발달하고 신체 자신의 HLA 그룹에 대한 내성뿐만 아니라, 항상 자신의 어머니의 외부 성체 HLA 그룹에 대하여 내성이 있음을 의미한다.
현재 지식에 따르면, 종양 세포는 기본적으로, 복합체 중의 보조-인자로서 베타-미세글로불린에 결합하면서, 세포외 알파 1 및 알파 2 도메인으로 구성된 틈에 항원으로서 펩티드를 제시하는 막관통 단백질로서 전체 유기체의 다른 모든 체세포와 동일한 성체 HLA 그룹을 발현한다. 결과적으로, 상기 세포는 특정 면역 방어의 공격으로부터 보호된다. 이는 또한, 원래의 HLA 패턴의 일부가 "되돌아 가는 길에" 상실되거나, 덜 치밀하게 발현되거나, 또는 변화된, 즉 손상된 형태(종양 세포의 경우 비전형적이지 않다)로 이용가능한 경우에도 원칙적으로 적용된다.
여기서, 모체 유기체에서 플러싱되고 거기에 남아 있는 배아의 배아 세포와의 비교가 유용하다(이를 "미세키메라 현상"이라고 한다). 배아 세포(주로 태반 또는 영양막)상의 배아 표면 구조, 특히 HLA-G, E 및 -F는 모체의 면역계가 세포를 공격하는 것을 방지한다.
배아 세포의 특정 분화가 이미 발생한 경우(여기서 대개는 배아의 진짜 세포), 이는 상응하는 기관에 특이적으로 통합된다. 이것은 종종 특정한 전이 형성 패턴을 선호하는 악성 종양의 행동을 매우 강하게 반영한다.
배아 세포의 배아 표면 구조가 유지되면, 상기 배아 세포는 종양 세포와 유사하게 어머니의 일생 동안 공격받지 않을 것이다.
임신 중에 매우 많은 배아 세포가 모체로 플러싱되는 경우, 이러한 관용은 심지어 모체를 "인계"하려는 시도로 이어질 수 있다, 즉, 예를 들어 매우 위협적인 HELLP 증후군(용혈, 간 효소 상승, 혈소판 수 감소)의 경우에서와 같이, "이식편 대 숙주병" 반응 결과로 이어질 수 있다.
그러나, 추정상 배아 세포는 HLA-G, E, F 보호를 적어도 부분적으로 상실하고 선택적으로 추가적인 분화를 동반한다는 사실로 인해 미세키메라 현상에 대한 역반응이 또한 있을 수 있다.
이어서, 배아 세포는 분화시 모체 유기체의 경우와 상이한 "성체" HLA 구조를 나타내기 때문에 모체 유기체의 염증성 역반응이 존재한다. 전형적인 결과로서, 염증 부위 주변에 결합 조직이 형성되고 이는 특정한 면역 질환을 유발할 수 있다(하시모토 갑상선염 참조).
이러한 유기체의 염증성 역반응은 종양 세포가 추가 분화 동안 표면에서 HLA 특성을 형성하기 때문에 종양 세포의 경우에는 일어나지 않고, 상기 특성은 숙주 유기체의 특성과 다르지 않다.
성체 HLA 패턴의 이러한 완전하거나 불완전한 발현은, 종양 세포에 대해 공지되고 설명된 추가적인 항원 발현(또는 과발현)에 의해 종양 세포가 두드러지는 경우에조차 특정한 면역 방어의 공격을 방지한다. 원래의 성체 HLA 패턴의 완전하거나 불완전한 발현으로 인한 보호는 분명히 매우 효과적이어서, 종양 세포가 (특정) 면역 반응의 효과적인 공격 없이도, 즉 B 림프구 및 T 림프구 발생 없이도 (따라서 결과적으로 "눈에 띄는") 특정 항원 패턴을 발현할 수 있다. 종양 항원 발현 패턴이 개별적인 종양 유형에 상대적으로 특이적이라는 것은 주목할 만하다. 변화된 및/또는 돌연변이된 MHC-/HLA 그룹이 항원 제시 캐스케이드(APM(항원 처리 기구))를 점점 더 불완전하게 하고 따라서 전형적인, 인간 관련 항원 또는 자신의 항원이 (더 이상) 거의 제시되지 않거나 제시되지 않을 수도 있다. 그러나 이러한 추정 과정의 기초가 되는 분자 기전은 불분명하고 아직 확인되지 않았다.
전체 유기체가, HLA 발현 패턴이 유기체 또는 모체의 HLA 발현 패턴과 강력하거나 완전하게 다른 체세포와 대면할 때, 기억 세포의 형성과 함께 면역 방어의 공격이 있을 것을 가정해야 한다. 물론 "기억"은 주로 다양한 HLA 그룹을 대상으로 한다. 그러나 이러한 면역계의 공격에 이은 외부 세포의 파괴는 또한 다른 표면 구조에 대한 항체의 형성을 동반함이 공지되어 있다. 개별 사례에서, 심지어 인지질과 같은 편재하는 세포 구성성분에 대한 항체가 형성되기도 한다("항인지질 증후군").
이러한 배경에 대해서, 2개의 기전, 즉 "되돌아가는 종양 세포"가 다른 세포 및 면역계와 연통하는 방식 및/또는 배아 시기의 상실된 연통 특성이 회복되는 방식을 전체로서, 이러한 이해로부터 이러한 기본 원리 및 이에 상응하는 약제를 고려하여 치료 개념을 발전시키기 위해 고려해야 할 필요가 있다.
특정 면역 방어(즉, T- 및 B-림프구) 외에도, 단핵구 및 이로부터 생성되는 대식세포가 또한 종양 성장에 한 역할을 한다. 그러나 대식세포는 비특이적 면역 방어 세포(예를 들어 NK 살해 세포) 또는 특이적 면역 방어 세포(예를 들어 T-세포 또는 B-세포)가 존재할 때만 활성화될 수 있다. 그러나 이는 항원 제시 세포(예를 들어 수지상 세포)가 돌연변이된 또는 "외부" 단백질을 나타내는 경우 "프라이밍"을 필요로 하고, 따라서 세포독성 T-세포의 형성을 유도한다. 여기서 인터페론 γ(IFN-γ) 또는 종양 괴사 인자(TNF-α)와 같은 다수의 사이토카인도 또한 한 역할을 한다.
배아 세포와 종양 세포의 비교는 대식세포의 경우에도 마찬가지로 나타난다. 대식세포는 임신이 된 경우 기저 자궁내막에서 발견될 수 있다. 상기 세포는 일반적으로 배아의 침습 행동을 억제하는 효과를 가지고, 이식 배아와 자궁근층 사이에 소위 "보호벽"을 형성한다. 한편, 배아는 대식세포 이동 억제 인자, 즉 대식세포의 공격을 제한하고 억제하는 인자를 분비한다. 이것은 악성 종양에도 마찬가지로 적용된다(상기 참조).
결론적으로 현재의 이해는 막 결합된 MHC I 매개된 펩티드 제시 및 후속적인 면역 세포상의 특정 수용체(예를 들어 KIR 및 LILR)에의 결합을 기반으로 하는 종양 세포와 면역 세포 간의 직접적인 세포 대 세포 연통에 기반한다.
종양 세포와 면역계 사이의 연통에 대한 분자적 기초는 아직 제대로 이해되지 않고 있다. 소위 "체크포인트"를 공격하는 항체 기반 치료의 등장으로, 각 표적 구조의 측정(예를 들어 mRNA 또는 단백질 기반 PD-L1 발현의 정량화) 및/또는 종양 돌연변이 부담 및/또는 MSI 상태의 측정은 치료에 대한 반응이나 연장된 생존 기간(DFS, MFS, DSS 또는 OS)을 예후할 때 일부 영향을 미치는 것으로 나타났다.
본원에 사용되는 바와 같이, 질환의 "결과를 예측하는"이라는 용어는 주어진 치료법을 받는 환자의 결과에 대한 예측 및 치료를 받지 않는 환자의 예후를 모두 포함하는 것을 의미한다. "결과를 예측하는"이라는 용어는 특히 바람직하게는 주어진 시간틀 내에서 전이 또는 사망과 같은 사건을 겪는 환자의 위험과 관련될 수 있다.
결론적으로, 여러 종류의 종양에 대해 개별적인 재발 위험과 화학 요법 또는 대체 치료 옵션에 대한 반응에 대해 암 환자를 더 잘 분류해야 하는 의학적 필요성이 높다.
이는 한편으로 돌연변이(KRAS, NRAS, EGFR, cMET, HER2, ESR1, FGRF3 등), 분자 하위분류 전사물(예를 들어 ESR1 PGR, ERBB2; 증식 유전자, 예를 들어 MKI67, RACGAP1, BIRC5, MYBL1, FOXM1; 케라틴, 예를 들어 KRT4, KRT5, KRT17, KRT18, KRT19, KRT20 등; EMT 마커, 예를 들어 SNAI1, SNAI2, FOXA1 등), 면역 유전자(예를 들어 CD3, CD8, CD19, CD68, CD168, CSF1R, IGKC, IGHM, IFNG), 체크포인트 유전자(예를 들어 PD-L1, PD-L2, CD86, CD80, L-ICOS, B7-H3, B7-H4; PD1, CTLA4, CD28, ICOS)와 같은 종양 세포 특이적 특성의 결정뿐만 아니라, 다른 한편으로 본 개시내용에 기재된 바와 같은 HLA 발현 패턴의 결정("HLA 분류")을 수반할 수 있다.
예를 들어, 두 방광암 병기 모두의 매우 이질적인 그룹에 대한 최적의 치료 절차는 현재 임상 병리학적 특징에 의해서는 예후를 안정적으로 평가할 수 없기 때문에 명확하지 않다.
유방암과 같은 암의 수용체 상태를 검출하기 위해 현재 전 세계적으로 적용되는 표준 방법론은 포르말린 고정 및 파라핀 포매(FFPE) 생검 또는 절제 조직으로부터의 면역조직화학(IHC)이다. 유방암에서, 내분비 또는 표적 전신 치료(예를 들어 트라스투주맙)의 투여는 대부분 IHC를 기반으로 한다. 그러나, 다수의 마커를 시험하여 개별적인 위험을 측정하는 IHC-기반 접근 방식은 상술한 진단/치료 딜레마를 해결하는데 도움이 될 수 있는, 방광암의 신뢰할 수 있는 예후적 하위분류를 생성시키지 않는다. 또한 IHC에 의한 시험은 일반적으로 감도가 부족하다는 문제가 있다.
따라서 신뢰할 수 있는 개별적인 위험 평가를 가능하게 하고, 적합한 종양 치료 섭생(즉, 환자 계층화)의 선택을 용이하게 하고, 치료 성공의 예후와 예측을 허용하는, 방광암의 분자적 하위분류를 위한 신뢰할 수 있고, 객관적이고, 정량적이고 재현가능한 시험 시스템이 명백히 필요하다. 더욱이, 이와 같은 시험 시스템은 상당한 비율의 암 환자에게 적합한 분산적인 검사를 허용해야 한다.
상기 및 다른 목적은 하기에 기재되는 본 발명에 의해 해결된다.
본 발명은 암 환자 및/또는 자가면역 질환과 관련된 장애를 앓고 있는 환자의 신체 샘플(조직 또는 혈액 샘플)에서 개별적인 HLA 패턴(성체 및/또는 배아)의 시험관내 측정 방법 및 맞춤 치료를 위해 상기 환자를 계층화하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 암과 같은 신생물 질환, 자가면역 질환, 감염성 질환 및 임신 관련 상태에 대한 예후 생물마커로서 핵산 분자뿐만 아니라, 상응하는 키트 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 치료제 및 치료제 제조 방법에 관한 것이다.
본원에 사용되는 바와 같은 "샘플", "생물학적 샘플", 또는 "임상 샘플"이란 용어는 환자로부터 수득된 샘플을 지칭한다. 샘플은 임의의 생물학적 조직 또는 유체의 것일 수 있다. 이와 같은 샘플은 비제한적으로 객담, 혈액, 혈청, 혈장, 혈액 세포(예를 들어 백혈구), 조직, 코어 또는 미세바늘 생검 샘플, 세포-함유 체액, 자유 부유 핵산, 소변, 복막액 및 흉수, 뇌척수액, 누액, 또는 이들로부터의 세포를 포함한다. 생물학적 샘플은 또한 조직학적 목적을 위해 채취한 동결 또는 고정 섹션 또는 미세 해부된 세포 또는 이의 세포외 부분과 같은 조직 섹션을 포함할 수 있다. 분석하고자 하는 생물학적 샘플은 흡인 또는 천공, 절제 또는 생검 또는 절제된 세포 물질로 이어지는 기타 외과적 방법으로 채취한 신생물 병변의 조직 물질이다. 이와 같은 생물학적 샘플은 환자로부터 수득된 세포를 포함할 수 있다. 세포를 고형 종양 물질, 세척액 또는 체액의 세포 "도말"에서 찾을 수도 있다. 샘플은 처리된 샘플, 예를 들어 동결, 고정, 포매 등의 샘플일 수 있다. 바람직한 유형의 샘플은 포르말린 고정된 파라핀 포매(FFPE) 샘플이다. FFPE 샘플의 제조는 표준 의학적 실시이고 이러한 샘플은 장기간 보존될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 "환자"란 용어는 척추동물, 특히 인간 및 또 다른 포유동물, 예를 들어 설치류, 토끼 또는 원숭이와 같은 동물을 포함하는 임의의 포유동물과 같은 임의의 유기체를 지칭한다. 설치류는 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그 또는 친칠라일 수 있다. 바람직하게는, 환자는 인간이다.
하나의 태양에서, 본 발명은 종양의 개별적인 HLA 패턴을 측정하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 제1 HLA 유전자의 제1 영역을 암호화하는 RNA 전사물의 제1 발현 수준을 측정하는 단계; 제2 HLA 유전자의 제2 영역의 RNA 전사물의 제2 발현 수준을 측정하는 단계; 측정된 상기 제1 및 제2 발현 수준을 비교하여 개별적인 HLA 패턴을 획득함을 포함하고, 여기서 상기 제1 HLA 유전자 및 제2 HLA 유전자는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-D, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H- HLA-J를 암호화하는 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, 제1 HLA 유전자 및 제2 HLA 유전자는 상이한 HLA 그룹을 암호화할 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 HLA 유전자는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-D, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H 및 HLA-J로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나를 암호화할 수 있다. 유사하게, 상기 제2 HLA 유전자는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-D, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H 및 HLA-J로 이루어지는 군으로부터 선택된 또 다른 하나를 암호화할 수 있다.
이와 같은 경우에서, 제1 및 제2 발현 수준의 비교를 "유전자간(intergenic)"이라 칭할 수 있다.
특히, 제1 HLA 유전자는 고전적인 HLA 유전자, 즉 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C로 이루어지는 군으로부터 선택된 유전자를 암호화할 수 있는 반면, 제2 HLA 유전자는 비-전형적인 HLA 유전자 또는 위유전자, 즉 HLA-D, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H 및 HLA-J로 이루어지는 군으로부터 선택된 유전자를 암호화할 수 있다.
다른 실시태양에서, 제1 HLA 유전자 및 제2 HLA 유전자는 동일하거나, 동일한 HLA 그룹을 암호화할 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 및 제2 HLA 유전자는 모두 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-D, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H 및 HLA-J로 이루어지는 군으로부터 선택된 단일 그룹을 암호화할 수 있다.
이와 같은 경우에, 제1 및 제2 발현 수준의 비교를 "유전자내(intragenic)"라 칭할 수 있다.
특히, 본 개시내용은 환자, 예를 들어 암 환자에서 종양의 개별적인 HLA 패턴을 측정하는 시험관내 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 샘플, 예를 들어 암 환자의 종양 조직 또는 혈액의 샘플에서 성체 HLA 그룹(예를 들어 HLA-A, HLA-B, HLA-C; MHC I), HLA 그룹 D(DR, DP, DQ 등; MHCII), "배아" HLA(예를 들어 HLA-E, HLA-F, HLA-G) 및 HLA 위유전자(예를 들어 HLA-H, HLA-J)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 RNA 전사물의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따라, "RNA 전사물"이란 용어는 센스 및/또는 안티센스 방향의 전사 산물과 관련될 것이다.
바람직하게, 상기 용어는 "메신저 RNA"를 의미하는 "mRNA"를 포함하고 이에 관한 것이고 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 "전사물"에 관한 것이다. mRNA는 전형적으로 5' 번역되지 않은 영역(5'-UTR), 단백질 또는 펩티드 암호화 영역 및 3' 번역되지 않은 영역(3'-UTR)을 포함한다. mRNA는 세포 및 시험관내에서 제한된 반감기를 갖는다.
다른 경우에, 예를 들어 안티센스 RNA(aRNA) 전사물의 경우, 상기 RNA는 펩티드 또는 단백질을 암호화하지 않을 수도 있다. 그러나, 상기 RNA는 mRNA에 상보성일 수 있고 이에 의해 상응하는 센스 mRNA의 펩티드 또는 단백질로의 번역을 조절할 수 있다. 본 개시내용의 목적을 위해서, 안티센스 RNA 전사물은, HLA 그룹 단백질 또는 펩티드로 직접 번역되지 않지만, 각각의 "HLA 유전자"의 추가의 "영역"(안티센스 영역)과 관련되는 것으로서 간주될 수 있다.
일부의 경우에, 제1 발현 수준 및 제2 발현 수준은 모두 센스 NRA 전사물에 관한 것일 수 있다. 다른 경우에, 상기 제1 발현 수준은 센스 RNA 전사물에 관한 것일 수 있는 반면, 상기 제2 발현 수준은 안티센스 RNA 전사물에 관한 것일 수 있다(또는 이와 역일 수 있다). 바람직하게, 반드시는 아니지만, 상기 센스 및 안티센스 전사물은 동일한 HLA 그룹과 관련된다. 예를 들어, 상기 안티센스 전사물은 동일한 HLA 그룹의 센스 전사물에 적어도 부분적으로 상보성일 수 있다.
"발현 수준"이란 용어는 예를 들어 유전자 발현의 측정된 수준을 지칭한다. "발현 수준의 패턴"이란 용어는 참조 유전자, 예를 들어 하우스키퍼, 또는 반대로 조절된 유전자, 또는 예를 들어 DNA-칩 분석에서 산출된 평균 발현값에 비교된 유전자 발현의 측정된 수준을 지칭한다. 패턴은 2개 유전자의 비교로 제한되지 않고 참조 유전자 또는 샘플에 대한 유전자의 다중 비교에 더 관련된다. 특정한 "발현 수준의 패턴"이 또한 여기서 이후에 개시되는 다수 유전자의 비교 및 측정에 의해 생성되고 측정될 수 있고 이들 전사물의 서로에 대한 상대적인 풍부성을 나타낼 수 있다. 발현 수준을 또한, 상이한 조직에서의 발현, 예를 들어 암성 조직 대 비-암성 조직에서의 유전자 발현과 관련하여 평가할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 "발현 수준"이란 용어는 전사물 및/또는 단백질을 생성시키기 위한 특정 유전자(예를 들어 HLA-E, HLA-F, HLA-G)의 발현을 지칭한다. 본 발명에 따라, 상기 발현 수준을, 예를 들어 전사된 mRNA를 측정하거나(예를 들어 노던 블럿에 의해), 역 전사(RT) 정량적 PCR(RT-qPCR)에 의해, 또는 mRNA의 직접 염색에 의해(예를 들어 원위치 하이브리드화에 의해), RNA 전사물 수준, 특히 mRNA 수준(전사 수준)에 대해 측정한다.
일부 실시태양에서, 발현 수준을 종양 샘플에서 하나 이상의 참조 유전자의 (평균) 발현 수준에 대해 정규화한다. 본원에 사용되는 바와 같은 "참조 유전자"란 용어는 검사하고자 하는 시스템, 즉 암 중의 RNA 전사물/mRNA 수준에 대해 상대적으로 불변의 발현 수준을 갖는 유전자를 지칭하고자 한다. 이러한 유전자는 하우스키핑 유전자로 지칭될 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 하나 이상의 참조 유전자는 CALM2, B2M, RPL37A, GUSB, HPRT1 및 GAPDH, 바람직하게는 CALM2 및/또는 B2M을 포함하는 군으로부터 선택된다. 다른 적합한 참조 유전자는 당업자에게 공지되어 있다.
제1 및 제2 영역 각각은 엑손-엑손-경계를 포함하거나 또는 하나 이하의 엑손 부분을 포함할 수 있다(즉 엑손-엑손 경계를 포함하지 않는다).
예를 들어, 제1 영역 및 제2 영역 중 하나(예를 들어 제1 영역)는 2개의 엑손 부분에 걸쳐 있을 수 있고(즉, 엑손-엑손-경계를 포함하고), 상기 제1 영역 및 제2 영역 중 다른 하나(예를 들어, 제2 영역)는 하나 이하의 엑손 부분을 포함한다(즉, 엑손-엑손 경계를 포함하지 않는다).
대안적으로, 제1 영역은 엑손-엑손-경계를 포함할 수 있고(즉, 2개의 엑손 부분에 걸쳐 있고) 제2 영역은 엑손-엑손-경계를 포함할 수 있다. 상기 제1 영역 및 제2 영역은 공통의 엑손 부분을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 영역은 엑손 2와 엑손 3 사이의 경계를 포함할 수 있다(즉, 엑손 2/엑손 3 경계를 포함한다). 이러한 경우에, 상기 제2 영역은 임의의 엑손(예를 들어 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4 등) 부분을 포함하거나, 또는 임의의 엑손-엑손-경계(예를 들어 엑손 3/엑손 4 경계, 엑손 4/엑손 5 경계)를 포함할 수 있다. 상기 엑손-엑손 경계의 그룹은 또한 엑손 스키핑에 의해 형성된 경계, 예를 들어 엑손 2/엑손 4 - 경계 등을 포함한다.
추가의 대안에서, 제1 영역은 하나 이하의 엑손 부분을 포함할 수 있고 제2 영역은 하나 이하의 엑손 부분을 포함할 수 있다.
일부 실시태양에서, 제1 영역은 HLA 그룹의 신호 펩티드 영역을 암호화할 수 있고 제2 영역은 HLA 그룹의 막관통 영역을 암호화할 수 있다.
일반적으로, 개별적인 HLA 패턴의 측정 방법은 또한 상기 개별적인 HLA 패턴이 제1 및 제2 발현 수준의 비교에 기초하여 우세하게 용해성인지 또는 막-결합된 것인지의 여부를 결정함을 포함할 수 있다. 특히, HLA 그룹의 신호 펩티드 영역을 암호화하는 영역의 발현 수준이 상기 HLA 그룹의 막관통 영역을 암호화하는 영역의 발현 수준을 초과하는 경우, 상기 개별적인 HLA 패턴은 우세하게 용해성임을 결정할 수 있다. HLA 그룹의 막관통 영역을 암호화하는 영역의 발현 수준이 상기 HLA 그룹의 신호 펩티드 영역을 암호화하는 영역의 발현 수준과 본질적으로 같거나 이를 초과하는 경우, 상기 개별적인 HLA 패턴은 우세하게 막-결합된 것임을 결정할 수 있다.
일반적으로, 개별적인 HLA 패턴의 측정 방법은 또한 제1 및 제2 발현 수준의 비교에 기초하여 HLA 동형을 결정함을 포함할 수 있다. 특히, 제1 엑손 부분을 암호화하는 영역의 발현 수준이 제2 엑손 부분을 암호화하는 영역의 발현 수준을 초과하는 경우, 상기 개별적인 HLA 패턴은, 상기 제1 엑손을 포함하고 상기 제2 엑손은 포함하지 않는 하나 이상의 동형을 포함하는 것으로 결정될 수 있다.
일반적으로, 개별적인 HLA 패턴의 측정 방법은 또한 HLA 그룹의 하나 이상의 추가적인 영역(예를 들어 제3 영역)에 대한 하나 이상의 추가적인 발현 수준(예를 들어 제3 발현 수준)을 측정함을 포함할 수 있고, 여기서 비교는 상기 개별적인 HLA 패턴을 획득하기 위해서 상기 측정된 추가적인 발현 수준에 기초한다.
"RNA 발현 수준"이란 용어는 전사된 RNA, 초기의 이어맞춰지지 않은 RNA 전사물 또는 성숙한 mRNA로 전환된 DNA 유전자 서열 정보의 측정된 수준을 지칭한다. RNA 발현을, 유전자의 전체 RNA 또는 하위서열의 수준을 측정함으로써 모니터링할 수 있다.
일부 실시태양에서, RNA 전사물의 발현 수준 측정은 RNA 전사물의 발현 수준이 RNA 전사물의 한정된 발현 임계값보다 낮거나 높은지를 결정함(=이분법)을 포함한다. 상기 발현 수준이 상기 한정된 발현 임계값와 같은 경우에, 상기 발현 수준은 상기 한정된 발현 임계값보다 높은 발현 수준의 그룹에 속하는 것으로 간주될 수 있다. 따라서, 본원에 사용되는 바와 같은 "한정된 발현 임계값보다 높은"이란 용어 표현은 상기 한정된 발현 임계값 이상인 발현 수준을 포함한다. "한정된 발현 임계값보다 높은" 발현 수준을 또한 "발현-양성"으로서 지칭할 수 있는 반면, "한정된 발현 임계값보다 낮은" 발현 수준은 또한 "발현-음성"으로서 지칭될 수 있다.
일부 실시태양에서, 하나 이상의 HLA의 신호-펩티드의 상동성 영역을 암호화하는 RNA 전사물의 발현 수준을 측정하고 이를 하나 이상의 HLA의 상동성 막관통 영역을 암호화하는 발현 수준과 관련하여 설정하고/하거나, 하나 이상의 HLA의 다른 세포질 꼬리와 관련하여 설정하고, 이에 의해, 분비된 알파 도메인 대 막관통 국소화된 HLA의 비를 개별적인 HLA 및 HLA 동형에 대해 결정할 수 있다.
"RNA 전사물의 발현 수준의 측정" 단계는 (i) RNA 전사물의 발현 수준을 측정하고 (ii) 측정된 상기 RNA 전사물의 발현 수준을 분석함(예를 들어 참조 발현 수준, 예를 들어 한정된 발현 임계값에의 비교에 의해)을 포함할 수 있고, 여기서 상기 RNA 전사물의 발현 수준의 측정 순서는 측정된 상기 RNA 전사물의 발현 수준의 분석 순서와 독립적일 수도, 독립적이지 않을 수도 있다.
일부 실시태양에서, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-D, HLA-E, HLA-F, HLA-G 및 HLA 위유전자(HLA-H 및/또는 HLA-J)로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3 또는 4개 유전자의 RNA 전사물의 발현 수준을 측정한다.
일부 실시태양에서, 획득된 개별적인 HLA 패턴은 HLA 그룹의 하나 이상의 동형의 발현의 존재 및/또는 부재 및/또는 수준을 가리킬 수 있다. 예를 들어, HLA-G의 공지된 동형은 HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6 및 HLA-G7을 포함한다. 이를 추가적인 배아 HLA 그룹 HLA-E 및 HLA-F뿐만 아니라 HLA 위유전자 HLA-H 및 HLA-J에도 적용한다. 이와 같은 실시태양에서, 추가의 현재 공지되지 않은 HLA 그룹의 동형이 존재하는 것으로 결정될 수 있다.
HLA 그룹의 하나 이상의 동형의 발현의 존재 및/또는 수준을 가리키는 상기 획득된 개별적인 HLA 패턴을 또한 종양의 분자 하위유형을 식별하고/하거나 치료제의 제조 방법에 사용할 수 있다.
추가로 또는 대안적으로, 동형, 특히 용해성 동형의 발현의 존재 및/또는 부재 및/또는 수준의 표시를 (a) 보조 생식, 예를 들어 시험관 수정, IVF에서 배아 이식 안정화, (b) 예를 들어 숙주 대 이식편 반응에서 이식 거부 위험 감소, 및/또는 (c) 자가면역 급증의 위험 감소 또는 영향 최소화에 사용할 수 있다. 이와 같은 용도는 특히 HLA-E, HLA-F 및/또는 HLA-G의 용해성 및 생물학적으로 활성인 동형을 포함하는 매질 또는 치료제의 생산을 포함할 수 있다. 이와 같은 용해성 및 생물학적으로 활성인 동형의 예는 HLA-G5를 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 방법은 종양 샘플에서 면역 유전자(예를 들어 CD3, CD8, CD19, CD68, CD168, CSF1R, IGKC, IGHM, IFNG)의 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 RNA 전사물의 발현 수준을 측정함을 추가로 포함한다.
본 개시내용의 하나의 실시태양으로서 HLA 분류와, PD-L1, PD-L2, CD86, CD80, L-ICOS, B7-H3, B7-H4; PD1, CTLA4, CD28 및/또는 ICOS의 단백질 기반 및/또는 mRNA 기반 평가에 의해 예시되는 바와 같은 체크포인트 특성의 측정과의 조합이, 진행된 암의 임상 상황에서 인간화된 항체와 같은 특정 억제제에 의한 체크포인트 유전자를 표적화하는 경우에 특히 중요하다. 상기 HLA 분류는 화학요법제 및/또는 체크포인트 억제제(예를 들어 항-PD1 또는 항-PL-L1 또는 항-CTLA4 약물)에 대한 반응 예측을 위해서 체크포인트 표적 유전자를 단독으로 정량화하는 값을 추가하는 HLA 발현 패턴 정보를 제공한다.
본 개시내용의 하나의 실시태양으로서 HLA 분류와, 면역 유전자(예를 들어 CD3, CD8, CD19, CD68, CD168, CSF1R, IGKC, IGHM, IFNG)의 단백질 기반 및/또는 mRNA 기반 평가에 의해 예시되는 바와 같은 면역세포 침윤물의 정량화와의 조합은, 특히 신보조(neoadjuvant) 치료 전략에 대한 반응을 예측하는 경우에, 화학요법제 및 또는 항 체크포인트 약물에 대한 반응 예측을 위해 체크포인트 표적 유전자를 단독으로 정량화하는 값을 추가한다.
본 발명의 하나 이상의 실시태양에 따라, 면역 체크포인트 억제제는 항체, 변형된 항체 포맷, 표적 결합 성질을 유지하는 항체 유도체 또는 단편, 항체-기반 결합 단백질, 올리고펩티드 결합제 및 항체 모방물질로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다.
"항체"(또한 같은 뜻으로 "면역글로불린"(Ig)이라 칭한다)는 일반적으로 4개의 폴리펩티드 쇄, 2개의 중(H) 쇄 및 2개의 경(L) 쇄를 포함하고, 따라서 다량체성 단백질, 또는 그의 동등한 Ig 상동체(예를 들어 단지 중쇄만을 포함하는 카멜리드 나노바디, 중쇄 또는 경쇄로부터 유래될 수 있는 단일 도메인 항체(dAb)); 및 그의 완전길이 기능성 돌연변이체, 변이체, 또는 유도체(비제한적으로 Ig 분자의 필수적인 에피토프 결합 특징을 유지하고 이중 특이성, 이중특이성, 다중특이성, 및 이중 가변 도메인 면역글로불린을 포함하는, 쥐, 키메라, 인간화된 및 완전한 인간 항체 포함)이고; 면역글로불린 분자는 임의의 부류(예를 들어 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 또는 하위부류(예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2) 및 알로타입을 가질 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 "항체-기반 결합 단백질"은 다른 비-면역글로불린, 또는 비-항체 유래된 성분의 상황에서 하나 이상의 항체-유래된 VH, VL, 또는 CH 면역글로불린 도메인을 함유하는 임의의 단백질을 나타낼 수 있다. 이와 같은 항체-기반 단백질은 비제한적으로 (i) 면역글로불린 CH 도메인의 부분 또는 전부와, 수용체 또는 수용체 성분을 포함한 결합 단백질의 Fc-융합 단백질, (ii) VH 및 또는 VL 도메인이 대안의 분자 스캐폴드에 커플링된 결합 단백질, 또는 (iii) 면역글로불린 VH, 및/또는 VL, 및/또는 CH 도메인이 천연 항체 또는 항체 단편에서 통상적으로 발견되지 않는 방식으로 결합되고/되거나 조합된 분자를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "항체 유도체 또는 단편"은 완전길이가 아닌 항체로부터 유래된 하나 이상의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 분자에 관한 것이고, 비제한적으로 (i) 가변 경(VL), 가변 중(VH), 불변 경(CL) 및 불변 중 1(CH1) 도메인으로 이루어지는 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 가교에 의해 연결되는 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어지는 Fab(Fd) 단편의 중쇄 부분; (iv) 항체의 단일 가지의 VL 및 VH 도메인으로 이루어지는 가변 단편(Fv) 단편; (v) 단일 가변 도메인을 포함하는 도메인 항체(dAb) 단편; (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR); (vii) 단쇄 Fv 단편(scFv); (viii) VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄상에서 발현되지만, 동일한 쇄상의 2개의 도메인간의 짝짓기를 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용하여, 상기 도메인들이 또 다른 쇄의 상보성 도메인과 강제로 짝을 짓고 2개의 항원 결합 부위를 생성시키는 2가의 이중특이성 항체인 다이아바디; 및 (ix) 상보성 경쇄 폴리펩티드와 함께 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 탠덤 Fv 분절(VH-CH1-VH-CH1)을 포함하는 선형 항체; 및 (x) 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄의 다른 비-완전길이 부분, 또는 그의 돌연변이체, 변이체 또는 유도체를 단독으로 또는 임의의 조합으로 포함한다. 어쨌든, 상기 유도체 또는 단편은 표적 결합 성질을 유지한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "변형된 항체 포맷"이란 용어는 항체-약물-접합체, 폴리알킬렌 옥사이드-변형된 scFv, 모노바디, 다이아바디, 카멜리드 항체, 도메인 항체, 이중- 또는 삼중특이성 항체, IgA, 또는 J 쇄 및 분비 성분에 의해 결합된 2개의 IgG 구조, 샤크 항체, 신세계 영장류 프레임워크 + 비-신세계 영장류 CDR, 힌지 영역이 제거된 IgG4 항체, CH3 도메인으로 조작된 2개의 추가적인 결합 부위를 갖는 IgG, Fc 감마 수용체에 대한 친화성을 증대시키기 위해 변경된 Fc 영역을 갖는 항체, CH3+VL-VH를 포함하는 이량체화된 구성 등을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "항체 모방물질"이란 용어는 면역글로불린 패밀리에 속하지 않는 단백질, 및 심지어 비-단백질, 예를 들어 앱타머, 또는 합성 중합체를 지칭한다. 일부 유형은 항체-유사 베타-시트 구조를 갖는다. 항체에 비해 "항체 모방물질" 또는 "대안의 스캐폴드"의 잠재적인 장점은 보다 양호한 용해도, 보다 높은 조직 침투, 열 및 효소에 대한 보다 높은 안정성, 및 비교적 저렴한 생산 비용이다.
일부 항체 모방물질을 큰 라이브러리로 제공할 수 있고, 이는 모든 가능한 표적에 대해 특이적인 결합 후보를 제공한다. 항체와 마찬가지로, 표적 특이 항체 모방물질도 대량자료처리 선별(HTS) 기술뿐만 아니라, 파지 디스플레이, 세균 디스플레이, 효모 또는 포유동물 디스플레이처럼 확립된 디스플레이 기술을 사용하여 개발될 수 있다. 현재 개발된 항체 모방물질은 예를 들어 안키린 반복 단백질(DARPin), C-유형 렉틴, 에스 아우레우스의 A-도메인 단백질, 트랜스페린, 리포칼린, 피브로넥틴의 10번째 유형 III 도메인, 쿠니츠(Kunitz) 도메인 프로테아제 억제제, 유비퀴틴 유래된 결합제(애필린이라 칭한다), 감마 결정 유래된 결합제, 시스테인 매듭 또는 노틴, 티오레독신 A 스캐폴드 기반 결합제, SH-3 도메인, 스트라도바디(stradobodies), 다이설파이드 결합 및 Ca2+에 의해 안정화된 막 수용체의 "A 도메인", CTLA4-기반 화합물, Fyn SH3, 및 앱타머(특정한 표적 분자에 결합하는 펩티드 분자)를 포함한다.
본 발명의 하나 이상의 실시태양에 따라, 면역 체크포인트 억제제는 표 1에 제시된 바와 같은 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다. 표 1에서, DART는 '이중-친화성 재-표적화'를 가리키고; mAb는 '단클론 항체'를 가리키고; NA는 '적용가능하지 않음'을 가리킨다.
| 면역 체크포인트 억제제 | |||
| 표적 | 약물 명칭 | 약물 유형 | mAb 아이소타입 |
| CTLA-4 | 이필리무맙 | 인간 mAb | IgG1k |
| 트레멜리무맙 | 인간 mAb | IgG2k | |
| AGEN-1884 | 인간 mAb | IgG1 | |
| PD-1 | 펨브롤리주맙 | 인간화된 mAb | IgG4k |
| 니볼루맙 | 인간 mAb | IgG4k | |
| PDR001 | 인간화된 mAb | IgG4 | |
| SHR1210 | 인간화된 mAb | IgG4k | |
| 세미플리맙 | 인간 mAb | IgG4 | |
| REGN2810 | 인간 mAb | IgG4 | |
| 피딜리주맙 | 인간화된 mAb | IgG1k | |
| AMP 514 | 인간화된 mAb | IgG4k | |
| BGB A317 | 인간화된 mAb | IgG4 | |
| PF-06801591 | mAb | - | |
| AMP224 | 인간 IgG의 Fc 도메인 및 PD-L2의 융합 단백질 | NA | |
| PD-L1 | 아테졸리주맙 | 인간화된 mAb | IgG1k |
| 두르발루맙 | 인간 mAb | IgG1k | |
| 아벨루맙 | 인간 mAb | IgG1k | |
| CK-301 | 체크포인트 치료제 | 완전한 인간 항체 | |
| BMS 936559 | 인간 mAb | IgG4 | |
| 7-H3 | MGA-271 | 인간화된 mAb | IgG1 |
| MGD-009 | B7-H3 x CD3 DART 단백질 | NA | |
| LAG-3 | IMP-321 | LAG-3 및 인간 IgG1 융합 단백질 | NA |
| BMS-986016 | mAb | - | |
| LAG-525 | 인간화된 mAb | IgG4 | |
| TIM-3 | TSR-022 | 인간화된 mAb | IgG4 |
| MBG-453 | mAb | - | |
| VISTA | CA-170 | 소-분자 길항물질 | NA |
| GITR | TRX-518 | 인간화된 mAb | IgG1 |
| INCAGN01876 | 인간 mAb | IgG1 | |
| GWN-323 | 인간 mAb | IgG1 | |
| MEDI1873 | 인간 mAb | IgG1 | |
| MK-4166 | 인간 mAb | IgG1 | |
| MK-1248 | mAb | - | |
| BMS986156 | mAb | - | |
| CD27 | 발리루맙 | 인간 | IgG1k |
| CD70 | SGN-CD70A | mAb | - |
| CD40 | ISF35 | 아데노바이러스 벡터 | NA |
| RO70097890 | mAb | - | |
| OX40 | MEDI-6469 | mAb | 쥐 IgG1 |
| MOXR-0916 | 인간화된 mAb | IgG1 | |
| PF-04518600 | 인간 mAb | IgG2 | |
| MEDI-0562 | 인간화된 mAb | IgG1 | |
| 4-1BB | 유렐루맙 | 인간 mAb | IgG4k |
| 유토밀루맙 | 인간 mAb | IgG2 | |
또 다른 태양에서, 본 발명은 암 치료에서 상술한 바와 같은 방법의 용도에 관한 것이고, 상기 용도는 첫 번째 단계로서, 종양 치료를 위해서 암 환자를 계층화하고, 두 번째 단계로서, 상기 암 환자에게 선택된 항 HLA 종양 치료 섭생을 제공함을 포함한다.
본 발명에 따라 "종양 치료를 위해서 암 환자를 계층화함"은 암 환자를 특정한 분자 종양 하위유형을 갖는 환자 그룹으로 할당함을 포함하고, 이는 의료 종사자로 하여금 가장 적합한 종양 치료 섭생을 선택할 수 있게 한다.
본 개시내용의 일부 실시태양에서 상기 치료는 신생물 질환을 앓고 있는 환자에 대해서 특정한 HLA 동형에 대해 발생한 인간화된 항체 또는 RNA 또는 단백질 기반 면역화의 사용을 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 용도는 생체외에서 용해성 HLA 도메인의 생성을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 생성은 합성 단량체(α1, α2, α3) 또는 자연 발생 순서의 다량체(예를 들어 α1α2α3, α1α2, α1α3) 또는 드노보 순서(α2α3) 또는 드노보 콘카타머(예를 들어 α1α1α1, α2α2α2, α3α3α3, α1α1α2, α1α1α3, α1α1α1α1α2α2α2α3α3α3 등)로서 천연 알파 도메인의 조합을 포함할 수 있다.
상기 치료제는 자가면역 질환과 관련된 장애를 앓고 있는 환자 또는 조기 유산의 잠재적 위험이 있는 임산부에게 적용하여 자가면역 증상을 감소시키고 출산까지 임신을 지속할 수 있게 하는 면역 내성을 증가시키기 위한 것일 수 있다.
일반적으로, 치료제의 제조 방법은 상술한 바와 같은 방법을 사용하여 개별적인 HLA 패턴을 측정하고 치료제를 제조시킴을 포함할 수 있다.
일부 실시태양에서, 치료제는 상기 치료제가 측정된 상기 개별적인 HLA 패턴에 특이적으로 결합하도록 하는 단백질, 단백질 도메인 및/또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 이와 같은 치료제 결합의 결과로서, 측정된 상기 개별적인 HLA 패턴과, 예를 들어 면역적격 세포상의 리간드 또는 수용체간의 결합 또는 상호작용이 차단될 수 있다.
예를 들어, 치료제는 측정된 개별적인 HLA 패턴에 기반한 용해성 HLA 도메인 또는 항체를 포함할 수 있다.
일부 실시태양에서, 치료제는 핵산, 특히 RNA를 포함할 수 있다. 이와 같은 RNA는 공지된 RNA 백신화 기법에 따라, 상기 치료제 주사 후 면역계에 의해 합성될 수 있는 항원을 암호화할 수 있다. 이와 같은 치료제의 항원으로의 번역의 결과로서, 면역적격 세포의 반응이, 측정된 상기 개별적인 HLA 패턴에도 불구하고 촉발될 수 있다.
예를 들어, 치료제는 측정된 개별적인 HLA 패턴에 기반한 용해성 HLA 도메인 또는 항체를 포함할 수 있다.
일부 실시태양에서 상기 언급한 모든 합성 알파 도메인 조합은 시스(즉, HLA-G 또는 HLA-F 또는 HLA-E 또는 HLA-A와 같은 단지 하나의 단일 HLA 유전자의 알파 도메인들을 조합함으로써) 또는 트랜스(즉, HLA-G와 HLA-E 또는 HLA-F 또는 HLA-A; HLA-A와 HLA-E 또는 HLA-F 또는 HLA-G 등과 같이 하나 초과의 HLA 유전자의 알파 도메인들을 조합함으로써)로 발생할 수 있다.
일부 구현예에서, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-D, HLA-E, HLA-F의 상기 언급한 합성 알파 도메인을, 적용된 HLA 알파 도메인의 감소된 확산 및 증가된 국소 저장소를 위해 이량체화 및/또는 다량체화할 수 있는 용해성 HLA 알파 도메인을 획득하기 위해서 HLA-G내의 치환과 유사한 위치에 추가적인 시스테인을 함유하도록 생물공학적으로 조작한다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 역전사(RT) 정량적 PCR(RT-qPCR)에 의해, 예를 들어 방광암 환자에서 종양의 분자 하위유형을 식별하기 위한 키트에 관한 것으로, 상기 키트는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-D, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H 및 HLA-J로 이루어지는 군으로부터 선택된 유전자에 특이적인 하나 이상의 탐침 및 프라이머의 적어도 한 쌍을 포함한다.
본 발명은 또한 종양의 분자 하위유형을 식별하기 위한 상술한 바와 같은 키트의 용도에 관한 것이다.
"방광암"이란 용어는 방광 또는 요도 조직에서 기원하는 암 유형에 관한 것이다. 일부 실시태양에서, 방광암은 비-근육-침습성 방광암(NMIBC) 또는 근육-침습성 방광암(MIBC)이다. 때때로 방광암은 전이성이다. 통상적인 전이 부위에는 뼈, 간, 폐 및 뇌가 있다. 방광암은 인간 및 다른 포유류에서 발생한다. 인간의 경우 대부분 남성에서 발생하지만 여성 방광암도 발생할 수 있다. 일반적으로 방광암의 치료에는 수술, 약물(예를 들어 면역요법 및/또는 화학요법 및/또는 BCG에 의한 면역요법), 방사선 및/또는 표적 요법이 포함될 수 있다.
거의 모든 방광암은 요로상피에서 시작된다. 암이 방광의 다른 층으로 또는 다른 층을 통해 성장함에 따라 더욱 진행하게 되고, 여기서 병기의 분류는 더 깊은 조직 층에서 종양 침윤의 진행을 따른다. 병기는 하기와 같이 정의된다: Ta(pTa): 비침습성 유두암종, Tis(pTis): 비침습성 편평 암종(제자리 편평 암종 또는 CIS), T1(pT1): 종양이 방광 내벽의 세포층으로부터 아래의 결합 조직으로 성장하였지만 여전히 NMIBC인 것으로 간주된다, T2(pT2): 종양이 근육층으로 성장하였다(MIBC), T3(pT3): 종양이 방광의 근육층을 통과하여 이를 둘러싸는 지방 조직층내로 성장하였다; T4(pT4): 종양이 지방 조직을 넘어 주변 장기 또는 구조로 확산되었다. 종양이 하기 중 어느 하나로 성장할 수 있다: 전립선의 기질(주요 조직), 정낭, 자궁, 질, 골반벽 또는 복벽.
"프라이머 쌍" 및 "탐침"은 본 발명의 의미 내에서, 분자 생물학 분야의 숙련가에게 주지된 상기 용어의 통상적인 의미를 가질 것이다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, "프라이머 쌍" 및 "탐침"은 검출하거나 정량분석하고자 하는 표적 폴리뉴클레오타이드의 영역의 보체에 일치하거나, 상보성이거나, 상동성이거나 동종인 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자로서 이해될 것이다. 일부 실시태양에서, 뉴클레오타이드 유사체가 또한 프라이머 및/또는 탐침으로서 사용하기 위해 포함된다. 동역학적 또는 실시간 PCR 적용에 사용되는 탐침 기술은 예를 들어 로슈 몰레큘러 다이아그노스틱스(Roche Molecular Diagnostics)로부터 입수할 수 있는 TaqMan(등록상표) 시스템, 연장 탐침, 예를 들어 스콜피온(Scorpion)(등록상표) 프라이머, 이중 하이브리드화 탐침, 케미콘 인터내셔널 인코포레이티드(Chemicon International, Inc)로부터 입수할 수 있는 앰플리플루오르(Amplifluor)(등록상표), 또는 마이너 그루브(Minor Groove) 결합제일 수 있다.
일부 실시태양에서, 키트는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-D, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H 및 HLA-J로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 2, 3 또는 4개 유전자에 대한 특정한 탐침 및 프라이머의 특정한 쌍을 포함한다.
일부 실시태양에서, 키트는
- HLA-G-특이성 프라이머 및 하나 이상의 HLA-E-특이성 탐침의 적어도 한 쌍;
- HLA-G-특이성 프라이머 및 하나 이상의 HLA-F-특이성 탐침의 적어도 한 쌍; 및/또는
- HLA-F-특이성 프라이머 및 하나 이상의 HLA-G-특이성 탐침의 적어도 한 쌍
을 포함한다.
일부 실시태양에서, 키트는 HLA-그룹-특이성 프라이머 및 하나 이상의 HLA-그룹-특이성 탐침의 적어도 한 쌍을 포함하고, 여기서 상기 프라이머 및 탐침의 쌍은 둘 다 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-D, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H 및 HLA-J로 이루어지는 군으로부터 선택된 유전자에 특이적이다.
바람직하게, 본 발명에 따라 사용하기 위한 프라이머는 15 내지 30 뉴클레오타이드, 특히 데옥시리보뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 프라이머는 (1) 표적 mRNA-서열(예를 들어 HLA-E, HLA-F 또는 HLA-G)에 특이적이고, (2) 120 bp 미만(바람직하게는 100 bp 미만)의 앰플리콘 크기를 제공하고, (3) 모든 공지된 단백질-암호화 이어맞추기 변이체를 검출하고, (4) 공지된 다형성(예를 들어 단일 뉴클레오타이드 다형성, SNP)을 포함하지 않고, (5) mRNA-특이성이고(엑손/인트론 고려; 바람직하게는 DNA의 증폭이 없다), (6) 이량체화하는 경향이 없고, 및/또는 (7) 58℃ 내지 62℃ 범위의 용융 온도 Tm(바람직하게, Tm은 대략 60℃이다)을 갖도록 설계된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "뉴클레오타이드"란 용어는 고유(천연) 뉴클레오타이드를 포함하고, 이는 아데닌(A), 티미딘(T), 사이토신(C), 구아닌(G) 및 우라실(U)로 이루어지는 군으로부터 선택된 질소함유 염기, 리보스, 아라비노스, 자일로스 및 피라노스의 군으로부터 선택된 당, 및 데옥시리보스("뉴클레오사이드"로서 일반적으로 지칭되는 염기와 당의 조합), 및 1 내지 3개의 포스페이트 기를 포함하고, 포스포다이에스테르 뉴클레오사이드간 연결을 형성할 수 있다. 더욱이, 본원에 사용되는 바와 같이, "뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드 유사체를 지칭한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "뉴클레오타이드 유사체"는 A, G, C, T 또는 U의 유사체(즉, 염기 A, G, C, T 또는 U를 포함하는 뉴클레오타이드의 유사체)를 의미할 것이고, 이는 DNA 또는 RNA 폴리머라제(어느 것이든 적용가능한 것)에 의해 인식되고 DNA 또는 RNA 가닥(어느 것이든 적합한 것)에 통합된다. 이와 같은 뉴클레오타이드 유사체의 예는 비제한적으로 5-프로피닐 피리미딘(즉 5-프로피닐-dTTP 및 5-프로피닐-dCTP), 7-데아자 퓨린(즉, 7-데아자-dATP 및 7-데아자-dGTP), 아미노알릴-dNTP, 비오틴-AA-dNTP, 2-아미노-dATP, 5-메틸-dCTP, 5-요오도-dUTP, 5-브로모-dUTP, 5-플루오로-dUTP, N4-메틸-dCTP, 2-티오-dTTP, 4-티오-dTTP 및 알파-티오-dNTP를 포함한다. 또한, 표지된 유사체, 예를 들어 형광 유사체, 예를 들어 DEAC-프로필렌다이아민(PDA)-ATP, 모르폴리노 뉴클레오사이드 유사체에 기반한 유사체뿐만 아니라 잠금 핵산(LNA) 유사체가 포함된다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 프라이머와 관련하여 사용되는 바와 같은 "표적 mRNA-서열에 특이적인"이란 용어표현은 적합한 온도 및 용액 이온 강도 조건, 특히 PCR 조건하에서 표적 mRNA-서열의 cDNA에 하이브리드화(즉 어닐링)하는 프라이머의 능력을 지칭하고자 한다. 상기 온도 및 용액 이온 강도 조건은 하이브리드화의 엄격성을 결정한다. 하이브리드화는 2개의 핵산(즉 프라이머 및 cDNA)이 상보성 서열을 함유할 것을 요구하지만, 상기 하이브리드화의 엄격성에 따라, 염기간의 오합치가 가능하다. 일부 실시태양에서, "적합한 온도 및 용액 이온 강도 조건"은 58℃ 내지 62℃ 범위의 온도(바람직하게는 대략 60℃의 온도) 및 PCR 반응 혼합물에 통상적으로 사용되는 용액 이온 강도를 지칭한다. 일부 실시태양에서, 상기 프라이머의 서열은 당해 분야에 공지된 서열 비교 알고리즘에 의해 결정되는 바와 같이, 표적 mRNA-서열의 cDNA의 상응하는 서열에 80%, 바람직하게는 85%, 보다 바람직하게는 90%, 훨씬 더 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상보성이다.
예를 들어, 프라이머는 엄격한 또는 보통으로 엄격한 하이브리드화 조건하에서 표적 mRNA-서열의 cDNA에 하이브리드화할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 "엄격한 하이브리드화 조건"은 68℃에서 5x SSC/5x 덴하르트(Denhardt) 용액/1.0% SDS 중에서 하이브리드화 및 실온에서 0.2x SSC/0.1% SDS에서 세척을 수반하거나, 또는 당해 분야에서 인정되는 이의 균등한 조건(예를 들어 하이브리드화를 60℃에서 2.5x SSC 완충제에서 수행한 다음, 37℃에서 낮은 완충제 농도에서 수회의 세척 단계를 수행하고 안정하게 남아있는 조건)을 수반할 수 있다. 본원에 정의된 바와 같은 "보통으로 엄격한 하이브리드화 조건"은 42℃에서 3x SSC에서 세척, 또는 당해 분야에서 인정되는 이의 균등한 조건을 포함함을 수반한다. 염 농도 및 온도의 매개변수를, 프라이머와 표적 핵산간의 최적 수준의 일치성을 성취하기 위해 변화시킬 수 있다. 이와 같은 조건에 관한 지침을 당해 분야에서, 예를 들어 문헌[J. Sambrook et al. eds., 2000, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor]; 및 문헌[Ausubel et al. eds., 1995, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, N.Y.]에 의해 입수할 수 있다.
일부 실시태양에서, 탐침은 상기에 정의된 바와 같은 엄격한 또는 보통으로 엄격한 하이브리드화 조건하에서 표적 mRNA-서열의 (증폭된) cDNA에 하이브리드화한다.
바람직하게, 본 발명에 따라 사용하기 위한 탐침은 20 내지 35 뉴클레오타이드, 특히 데옥시리보뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 탐침은 (1) 표적 mRNA-서열(예를 들어 HLA-E, HLA-F 또는 HLA-G)에 특이적이고, (2) 공지된 다형성(예를 들어 단일 뉴클레오타이드 다형성, SNP)을 포함하지 않고, 및/또는 (3) 상응하는 프라이머(들)의 용융 온도 Tm보다 대략 5℃ 내지 8℃ 더 높은 용융 온도 Tm을 갖도록 설계된다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 탐침과 관련하여 사용되는 바와 같은 "표적 mRNA-서열에 특이적인"이란 용어표현은 적합한 온도 및 용액 이온 강도 조건, 특히 PCR 조건하에서 표적 mRNA-서열의 (증폭된) cDNA에 하이브리드화(즉 어닐링)하는 탐침의 능력을 지칭하고자 한다. 상기 온도 및 용액 이온 강도 조건은 하이브리드화의 엄격성을 결정한다. 하이브리드화는 2개의 핵산(즉 탐침 및 cDNA)이 상보성 서열을 함유할 것을 요구하지만, 상기 하이브리드화의 엄격성에 따라, 염기간의 오합치가 가능하다. 일부 실시태양에서, "적합한 온도 및 용액 이온 강도 조건"은 63℃ 내지 70℃ 범위의 온도 및 PCR 반응 혼합물에 통상적으로 사용되는 용액 이온 강도를 지칭한다. 일부 실시태양에서, 상기 탐침의 서열은 당해 분야에 공지된 서열 비교 알고리즘에 의해 결정되는 바와 같이, 표적 mRNA-서열의 (증폭된) cDNA의 상응하는 서열에 80%, 바람직하게는 85%, 보다 바람직하게는 90%, 훨씬 더 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상보성이다.
일부 실시태양에서, 상기 방법은 서열번호 1, 2, 3의 서열을 포함하거나 갖는 HLA-A-특이성 프라이머; 및/또는 서열번호 4, 5, 6의 서열을 포함하거나 갖는 HLA-B/C-특이성; 및/또는 서열번호 7 내지 27의 서열을 포함하거나 갖는 HLA-G-특이성 프라이머; 및/또는 서열번호 28 내지 33의 서열을 포함하거나 갖는 HLA-H-특이성 프라이머의 사용을 포함한다.
일부 실시태양에서, 정량적 PCR은 형광-기반 정량적 실시간 PCR이다.
일부 실시태양에서, 탐침의 검출은 증폭-매개된 탐침 변위에 기반한다.
일부 실시태양에서, 탐침은 형광 리포터 모이어티 및 형광 소광제 모이어티를 포함하는 이중-표지 탐침이다.
일부 실시태양에서, 키트는 역전사효소 및 DNA 폴리머라제를 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 역전사효소 및 DNA 폴리머라제는 1-단계 역전사(RT) 정량적 PCR(RT-qPCR)을 허용하는 효소-믹스의 형태로 제공된다.
일부 실시태양에서, 키트는 참조 유전자-특이성 프라이머 및 하나 이상의 참조 유전자-특이성 탐침의 적어도 한 쌍을 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 참조 유전자는 CALM2, B2M, RPL37A, GUSB, HPRT1 및 GAPDH로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상이다. 본원에 사용되는 바와 같이, CALM2는 칼모듈린-2, 포스포릴라제 키나제, 델타(Ref.Seq. (mRNA): NM_001743)를 지칭하고, B2M은 베타-2 미세글로불린(Ref.Seq. (mRNA): NM_004048)을 지칭하고, RPL37A는 60S 리보솜 단백질 L37a(Ref.Seq. (mRNA): NM_000998)를 지칭하고, GUSB는 베타-글루쿠로니다제(Ref.Seq. (mRNA): NM_000181)를 지칭하고, HPRT1은 하이포잔틴-포스포리보실-트랜스퍼라제 1(Ref.Seq. (mRNA): NM_000194)을 지칭하고 GAPDH는 글리세린알데하이드-3-포스페이트-데하이드로게나제(Ref.Seq. (mRNA): NM_002046)를 지칭한다.
일부 실시태양에서, 키트는 하나 이상의 대조용 RNA 샘플을 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 프라이머는 120 bp 미만의 앰플리콘 크기를 제공한다.
일부 실시태양에서, HLA-A-특이성 프라이머는 15 내지 30 뉴클레오티드의 길이를 가지고 서열번호 1, 2 또는 3의 서열의 적어도 10개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하고/하거나, HLA-B/C-특이성 프라이머는 15 내지 30 뉴클레오티드의 길이를 가지고 서열번호 4, 5 또는 6의 서열의 적어도 10개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하고/하거나, HLA-G-특이성 프라이머는 15 내지 30 뉴클레오티드의 길이를 가지고 서열번호 7 내지 27의 서열 중 하나의 적어도 10개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하고/하거나, HLA-H-특이성 프라이머는 15 내지 30 뉴클레오티드의 길이를 가지고 서열번호 28 내지 33의 서열 중 하나의 적어도 10개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시태양에서, 암 적응증은 유방암, 난소, 폐암, 방광암, 위암 또는 결장암이다.
추가의 태양에서, 본 발명은 예후 생물마커(들)로서 또는 암에 대한 예측 생물마커(들)로서, 특히 화학요법에 대한 내성을 가리키거나 면역요법에 대한 내성을 가리키는 예측 생물마커(들)로서 HLA-E의 RNA 전사물의 발현 수준 및/또는 HLA-F의 RNA 전사물의 발현 수준 및/또는 HLA-G의 RNA 전사물의 발현 수준의 용도에 관한 것이다.
"마커" 또는 "생물마커"란 용어는, 검출될 수 있는 존재 또는 농도를 가지고, 예를 들어 수학적 연산에 의해, 알려진 조건, 예를 들어 질병 상태와 상관될 수 있는 생물학적 분자, 예를 들어 핵산, 펩티드, 단백질, 호르몬 등 또는 이들의 조합을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "예후 마커"란 용어는 치료되거나 치료되지 않은 환자에서 각각의 질환(예를 들어 방광암)의 있음직한 과정에 대한 정보를 제공하는 마커를 지칭한다. 일부 실시태양에서, 상기 예후는 질병-특이성 생존(DSS), 무-재발 생존(RFS), 무-진행 생존(PFS) 및 원격 무-재발 생존 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시태양에서, 예후는 DSS를 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같은 "단일 예후 생물마커"란 용어는 추가적인 예후 마커가 예후에 사용/분석되지 않음을 의미한다.
일부 실시태양에서, HLA-E의 RNA 전사물의 발현 수준 또는 HLA-F의 RNA 전사물의 발현 수준 또는 HLA-G의 RNA 전사물의 발현 수준을 단일 예후 생물마커로서 사용한다.
일부 실시태양에서,
- HLA-G의 RNA 전사물의 한정된 발현 임계값보다 낮은 HLA-E의 RNA 전사물의 발현 수준은 양성 예후를 가리키고/거나;
- HLA-F의 RNA 전사물의 한정된 발현 임계값보다 낮은 HLA-F의 RNA 전사물의 발현 수준은 음성 예후를 가리키고/거나;
- HLA-G의 RNA 전사물의 한정된 발현 임계값보다 낮은 HLA-F의 RNA 전사물의 발현 수준은 양성 예후를 가리킨다.
일부 실시태양에서, 양성 예후는 연장된 질병-특이성 생존(DSS), 무-재발 생존(RFS), 무-진행 생존(PFS) 및 원격 무-재발 생존 중 하나 이상, 바람직하게는 DSS의 증가된 확률을 포함한다.
일부 실시태양에서,
- HLA-E의 RNA 전사물의 한정된 발현 임계값보다 높은 HLA-E의 RNA 전사물의 발현 수준은 음성 예후를 가리키고/거나;
- HLA-F의 RNA 전사물의 한정된 발현 임계값보다 높은 HLA-F의 RNA 전사물의 발현 수준은 양성 예후를 가리키고/거나;
- HLA-F의 RNA 전사물의 한정된 발현 임계값보다 높은 HLA-G의 RNA 전사물의 발현 수준은 음성 예후를 가리킨다.
일부 실시태양에서, 음성 예후는 연장된 질병-특이성 생존(DSS), 무-재발 생존(RFS), 무-진행 생존(PFS) 및 원격 무-재발 생존 중 하나 이상, 바람직하게는 DSS의 감소된 확률을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 예를 들어 본원에 정의된 바와 같은 방법에서, 방광암 환자에서 종양의 분자 하위유형을 식별하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 프라이머 및/또는 본원에 정의된 바와 같은 탐침의 쌍의 용도에 관한 것으로, 여기서 상기 프라이머 및/또는 탐침의 쌍은 HLA-E, HLA-F 및 HLA-G로 이루어지는 군으로부터 선택된 유전자에 특이적이다.
일부 실시태양에서, 탐침은 형광 리포터 모이어티 및 형광 소광제 모이어티를 포함하는 이중-표지 탐침이다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 역전사(RT) 정량적 PCR(RT-qPCR)에 의해 방광암 환자에서 종양의 분자 하위유형을 식별하기 위한 키트의 제조를 위한 본원에 정의된 바와 같은 프라이머 및/또는 본원에 정의된 바와 같은 탐침의 쌍의 용도에 관한 것으로, 여기서 상기 프라이머 및/또는 탐침의 쌍은 HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H 또는 HLA-J로 이루어지는 군으로부터 선택된 유전자에 특이적이다.
일부 실시태양에서, 탐침은 형광 리포터 모이어티 및 형광 소광제 모이어티를 포함하는 이중-표지 탐침이다.
하나의 태양에서, 본 발명은 암이 있는 환자에서 종양의 분자 하위유형을 식별하는 시험관내 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 RNA 전사물의 발현 수준을 측정하고 그 후에 상술한 바와 같이 HLA 발현을 측정함을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "종양의 분자 하위유형"(또는 "암의 분자 하위유형")이란 용어는 별개의 분자 프로파일, 예를 들어 유전자 발현 프로파일에 의해 특성화되는 종양/암의 하위유형을 지칭한다.
일부 실시태양에서, 상기 방법은 하나 이상의 추가적인 비-참조 유전자의 발현 수준, 특히 RNA 전사물의 발현 수준의 측정을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "비-참조 유전자"란 용어는, 검사하려는 시스템, 즉 암에서 RNA 전사물/mRNA 수준에 대해 가변 발현 수준을 가지고, 따라서 예를 들어 종양/암의 하위분류 및/또는 암 진행의 평가에 사용될 수 있는 유전자를 지칭한다. 일부 실시태양에서, 비-참조 유전자는 종양 마커, 예를 들어 종래 기술로부터 공지된 종양 마커 중에서 선택된다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 비-참조 유전자는 방광-특이성 또는 비-방광-특이성 유전자일 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 방법은 3, 2 또는 1 초과의 추가적인 비-참조 유전자의 발현 수준, 특히 RNA 전사물의 발현 수준의 측정을 포함하지 않는다.
일부 실시태양에서, 상기 방법은 임의의 추가적인 비-참조 유전자의 발현 수준, 특히 RNA 전사물의 발현 수준의 측정을 포함하지 않는다. 즉, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H, 또는 HLA-J 이외의 유전자, 및 임의로 HLA-A, HLA-B, HLA-C 및 HLA-D 중에서 선택된 하나 이상의 유전자, 및 임의로 하나 이상의 참조 유전자의 발현 수준, 특히 RNA 전사물의 발현 수준을 측정하지 않는다.
일부 실시태양에서, 최대 7, 바람직하게는 6, 보다 바람직하게는 5, 훨씬 더 바람직하게는 4개의 상이한 비-참조 유전자의 RNA 전사물의 발현 수준을 측정한다.
일부 실시태양에서, 상기 방법은 임의의 다른 진단 단계, 예를 들어 림프절 상태의 조직학적 분류 또는 측정을 포함하지 않는다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 면역조직화학(IHC)을 수반하는 어떠한 단계도 포함하지 않는다.
본 발명의 일부 실시태양에서, 종양은 고형 종양이다. 일부 실시태양에서, 종양은 방광 또는 요관 종양이거나 또는 방광 또는 요관 종양으로부터 유래한다(예를 들어 전이에 의해). 본원에 사용되는 바와 같은 "방광"이란 용어는 방광을 지칭한다.
일부 실시태양에서, 종양의 샘플은 암 환자로부터 단리된 종양 조직 샘플(예를 들어 종양의 생검 또는 절제 조직)일 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 종양 조직 샘플은 종양 조직 샘플의 동결-섹션이거나 화학적으로 고정된 종양 조직 샘플이다. 보다 바람직한 실시태양에서, 종양 조직 샘플은 포르말린-고정된 및 파라핀-포매된(FFPE) 종양 조직 샘플이다. 일부 실시태양에서, 종양의 샘플은 종양 조직 샘플로부터 추출된 (전체)RNA이다. 특히 바람직한 실시태양에서, 종양의 샘플은 FFPE 종양 조직 샘플로부터 추출된 (전체)RNA이다. 당업자는 RNA 추출 절차를 수행할 수 있다. 예를 들어, FFPE 종양 조직의 5 내지 10 ㎛ 컬로부터 전체 RNA를 하이 퓨어 RNA 파라핀 키트(High Pure RNA Paraffin Kit)(로슈, 스위스 바젤 소재) 또는 XTRAKT RNA 추출 키트(스트레티파이어 몰레큘러 패쏠로지(Stratifyer Molecular Pathology), 독일 쾰른 소재) 또는 RNXtract(등록상표) 추출 키트(바이오엔테크 다이아그노스틱스(BioNTech Diagnostics) GmbH, 독일 마인츠 소재)를 사용하여 추출할 수 있다. 또한, 사용/시험하고자 하는 샘플 물질을 냉동고에서 보관하고 각 샘플 물질을 해동한 후 적합한 시점에서 본 발명의 방법을 수행하는 것도 가능하다. 상기 샘플은 치료학적 치료의 개시 전에, 치료학적 치료 중에, 및/또는 치료학적 치료 후에, 즉 암 요법의 투여 전, 투여 중 또는 투여에 이어서 암 환자로부터 수득될 수 있다.
추가의 태양에서, 본 발명은 종양 치료를 위해 예를 들어 방광암 환자를 계층화하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 첫 번째 단계로서, 상기에 정의된 바와 같은 시험관내 방법을 사용하여 암 환자에서 종양의 분자 하위유형을 식별하고, 두 번째 단계로서 상기 시험관내 방법에 의해 식별된 분자 하위유형에 기반하여 종양 치료 섭생을 선택함을 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 종양 치료를 위해 방광암 환자를 계층화하는 방법은 상기에 정의된 바와 같은 시험관내 방법을 사용하여 암 환자에서 종양의 분자 하위유형을 식별하는 단계 외에, 림프절 상태의 조직학적 분류 또는 측정과 같은 어떠한 다른 진단 단계도 포함하지 않는다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 면역조직화학(IHC)을 수반하는 어떠한 단계도 포함하지 않는다.
일부 실시태양에서, 분자 하위유형은 HER2-양성, 삼중-음성(또한 "기저-형"이라 칭한다), 관내강 A형 및 관내강 B형으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. "기저-형"이란 용어는 상기와 같은 종양이 유전자 발현에 있어서 기저 상피세포의 경우와 일부 유사성을 갖는다는 사실을 지칭한다. "관내강"이란 용어는 종양과 관내강 상피간의 유전자 발현의 유사성으로부터 유래한다.
일부 실시태양에서, HER2, ESR1 및 Ki67의 RNA 전사물의 발현 수준을 측정하고, 분자 하위유형을 HER2+, HER2-/ESR1+, HER2-/ESR1-/Ki67+ 및 HER2-/ESR1-/Ki67-을 포함하는, 바람직하게는 이들로 이루어지는 군으로부터 선택한다. 일부 실시태양에서, 상기 분자 하위유형은 MIBC에 관한 것이다. 분자 하위유형들은 임상 결과 및 치료법에 대한 반응이 현저하게 상이할 수 있다.
일부 실시태양에서,
- 분자 하위유형은 HER2-양성이고, 종양 치료 섭생은 경요도(transurethral) 절제 및/또는 BCG-주입 및/또는 화학요법 및/또는 항-HER2 요법 및/또는 면역 체크포인트를 표적화하는 항체의 투여 및/또는 방광절제술에 이은 항-HER2 요법 및/또는 화학요법의 투여를 포함하고/거나;
- 분자 하위유형은 삼중-음성이고, 종양 치료 섭생은 경요도 절제 및/또는 BCG-주입 및/또는 화학요법, 특히 신보조 화학요법, 및/또는 면역 체크포인트를 표적화하는 항체의 투여 및/또는 방광절제술을 포함하고/거나;
- 분자 하위유형은 관내강 A형이고, 종양 치료 섭생은 경요도 절제 및/또는 BCG-주입 및/또는 방광절제술 및/또는 화학요법, 특히 보조 화학요법, 및/또는 (보조) 내분비 요법을 포함하고/거나;
- 분자 하위유형은 관내강 B형이고, 종양 치료 섭생은 경요도 절제 및/또는 BCG-주입 및/또는 내분비 요법 및/또는 화학요법, 특히 보조 화학요법 또는 수술기주위 상황에서 화학요법, 및/또는 방광절제술을 포함한다.
일부 실시태양에서,
- 분자 하위유형은 관내강 A형이고, 방광암은 NMIBC이고, 종양 치료 섭생은 경요도 절제(TUR) 및/또는 바실러스 칼메트-게랑(BCG)주입, 바람직하게는 TUR 및 BCG-주입을 포함하고/거나;
- 분자 하위유형은 관내강 B형이고, 방광암은 NMIBC이고, 종양 치료 섭생은 보조 내분비 요법과 함께 또는 상기 요법 없이 보조 화학요법을 포함하고/거나;
- 분자 하위유형은 HER2-양성이고, 방광암은 NMIBC이고, 종양 치료 섭생은 (신)보조 항-HER2 요법과 함께 또는 상기 요법 없이 (신)보조 화학요법을 포함하고/거나;
- 분자 하위유형은 삼중-음성이고, 방광암은 NMIBC이고, 종양 치료 섭생은 신보조 화학요법을 포함하고/거나;
- 분자 하위유형은 관내강 A형이고, 방광암은 MIBC이고, 종양 치료 섭생은 (i) 방광절제술 및 (ii) 보조 화학요법 및/또는 보조 내분비 요법, 바람직하게는 보조 화학요법 또는 보조 내분비 요법을 포함하고/거나;
- 분자 하위유형은 관내강 B형이고, 방광암은 MIBC이고, 종양 치료 섭생은 (i) 방광절제술 및 (ii) 보조 화학요법 및/또는 보조 내분비 요법, 바람직하게는 보조 화학요법 및 보조 내분비 요법을 포함하고/거나;
- 분자 하위유형은 HER2-양성이고, 방광암은 MIBC이고, 종양 치료 섭생은 (i) 방광절제술 및 (ii) 보조 화학요법 및/또는 보조 항-HER2 요법, 바람직하게는 보조 화학요법 및 보조 항-HER2 요법을 포함하고/거나;
- 분자 하위유형은 삼중-음성이고, 방광암은 MIBC이고, 종양 치료 섭생은 후속적인 방광절제술과 함께 또는 상기 절제술 없이 신보조 화학요법을 포함한다.
일부 실시태양에서, 분자 하위유형은 HER2-양성이고, 암은 바람직하게는 NMIBC이고, 종양 치료 섭생은 내분비 요법, 호르몬 요법 및/또는 화학요법과 함께 항-HER2 요법을 포함하고, 이들은 모두 보조 또는 신보조 요법의 형태로 있을 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 분자 하위유형은 HER2-양성이고, 암은 바람직하게는 NMIBC이고, 종양 치료 섭생은 주입 요법, 예를 들어 BCG-주입을 포함한다.
일부 실시태양에서, 분자 하위유형은 관내강 B형이고, 방광암은 바람직하게는 NMIBC이고, 종양 치료 섭생은 주입 요법(예를 들어 BCG-주입) 및/또는 신보조/보조 화학요법을, 바람직하게는 내분비 요법과 함께, 예를 들어 타목시펜(놀바덱스(Nolvadex)(등록상표)), 풀베스트란트(파슬로덱스(Faslodex)(등록상표)) 또는 아로마타제 억제제와 함께 포함한다.
"항-HER2 요법"이란 용어의 의미는 당업자에게 공지되어 있다. 일부 실시태양에서, 항-HER2 요법은 항-HER2 항체, 특히 단클론 항-HER2 항체의 투여를 포함한다. 단클론 항-HER2 항체는 단독으로 투여되거나 함께 투여될 수 있는 트라스투주맙(허셉틴(Herceptin)(등록상표)) 및 페르투주맙(퍼제타(Perjeta)(등록상표))을 포함한다. 트라스투주맙은 오직 HER2가 과발현되는 암에서만 유효하다. 다른 단클론 항체, 예를 들어 에르투막소맙(렉소문(Rexomun)(등록상표))은 현재 임상 시험 중에 있다. 항-HER2 항체를 치료 모이어티/작용제, 예를 들어 세포독성제, 약물(예를 들어 면역억제제), 화학요법제 또는 방사성핵종, 또는 방사성동위원소를 포함하도록 추가로 변형시킬 수 있다. 따라서, 종양 치료 섭생이 항-HER2 요법 및 화학요법(의 조합)을 포함하는 경우, 화학요법제에 접합된 항-HER2 항체를 사용할 수 있다. 세포독소 또는 세포독성제는, 세포에 유해하고 특히 세포를 살해하는 임의의 작용제를 포함한다. 예로는 메르탄신 또는 엠탄신(DM1), 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신, 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 액티노마이신 D, 아마니틴, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀올, 및 퓨로마이신 및 이의 유사체 또는 동족체가 있다. 일부 실시태양에서, 항체 접합체는 트라스투주맙(T)-DM1, 예를 들어 트라스투주맙 엠탄신이다. 항체 접합체를 형성시키기 위한 다른 적합한 치료제는 비제한적으로 대사길항물질(예를 들어 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 플루다라빈, 5-플루오로우라실 데카바진), 알킬화제(예를 들어 메클로르에타민, 티오에파클로람부실, 멜팔란, 카머스틴(BSNU) 및 로머스틴(CCNU), 사이클로포스파미드, 부설판, 다이브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-다이클로로다이아민 백금(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린(예를 들어 다우노루비신(이전에는 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들어 닥티노마이신(이전에는 액티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신(AMC)), 및 유사분열-방지제(예를 들어 빈크리스틴 및 빈블라스틴)을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 치료제는 세포독성제 또는 방사성독성제이다. 또 다른 실시태양에서, 치료제는 면역억제제이다. 일부 실시태양에서, 치료제는 GM-CSF이다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 치료제는 독소루비신, 시스플라틴, 블레오마이신, 설페이트, 카머스틴, 클로람부실, 사이클로포스파미드 또는 리신 A이다. 추가의 치료학적 모이어티는 mRNA 및/또는 단백질 합성에 작용하는 치료학적 모이어티를 포함한다. 여러 전사 억제제가 공지되어 있다. 예를 들어, 전사 억제제이면서 DNA 손상제인 액티노마이신 D는 DNA 내에 삽입되고, 따라서 전사의 초기 단계를 억제한다. 플라보피리돌은 전사의 연장 단계를 표적화한다. α-아마니틴은 RNA 폴리머라제 II에 직접 결합하고, 이는 개시 및 연장 단계 모두의 억제로 이어진다. 항-HER2 항체는 또한 방사성동위원소, 예를 들어 요오드-131, 이트륨-90 또는 인듐-111에 접합되어 세포독성 방사성약제를 생성시킬 수 있다. 항HER2 항체의 투여에 대한 대안은 HER2를 표적화하는 소 화합물, 예를 들어 라파티닙(타이커브(Tykerb)(등록상표) 또는 타이버브(Tyverb)(등록상표)), 아파티닙 또는 네라티닙의 투여이다. 항-HER2 요법은 또한 내분비 요법(또한 항-호르몬 치료로서 지칭된다), 호르몬 요법, 예를 들어 프로제스틴에 의한 요법, 및/또는 화학요법이 보충될 수 있다.
화학요법은 화학요법제, 예를 들어 세포증식억제 화합물 또는 세포독성 화합물의 투여를 포함한다. 전통적인 화학요법제는 대부분의 암 세포의 주요 성질 중 하나인 빠르게 분열하는 세포를 살해함으로써 작용한다. "화학요법제"란 용어는 탁산, 백금 화합물, 뉴클레오사이드 유사체, 캄토테신 유사체, 안트라사이클린 및 안트라사이클린 유사체, 에토포시드, 블레오마이신, 비노렐빈, 사이클로포스파미드, 대사길항물질, 유사분열-방지제, 및 항체 접합체와 관련하여 상술한 작용제를 비롯한 알킬화제, 및 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시태양에서, 화학요법제는 백금-기반이다, 즉 백금-기반 화합물, 예를 들어 시스플라틴의 투여를 포함한다. 화학요법제에 대한 언급은 임의의 전구약물, 예를 들어 에스테르, 염 또는 유도체, 예를 들어 상기 작용제의 접합체를 포함할 수 있다. 예로는 상기 작용제와 담체 물질과의 접합체, 예를 들어 단백질-결합된 패클리탁셀, 예를 들어 알부민-결합된 패클리탁셀이 있다. 바람직하게, 상기 작용제의 염은 약학적으로 허용가능하다. 화학요법제는 종종, 대개는 3 내지 6개월 동안 병용 제공된다. 가장 통상적인 치료 중 하나는 AC로서 공지된 사이클로포스파미드 + 독소루비신(아드리아마이신; 안트라사이클린 및 안트라사이클린 유사체의 그룹에 속한다)이다. 때때로, 탁산 약물, 예를 들어 도세탁셀이 첨가되고, 이때 이 섭생은 CAT로서 공지되어 있고; 탁산은 암세포에서 미세소관을 공격한다. 균등한 결과를 생성시키는 또 다른 통상적인 치료는 사이클로포스파미드, 대사길항물질인 메토트렉세이트, 및 뉴클레오사이드 유사체인 플루오로우라실(CMF)이다. 또 다른 표준 화학요법 치료는 플루오로우라실, 에피루비신 및 사이클로포스파미드(FEC)를 포함하고, 탁산, 예를 들어 도세탁셀, 또는 비노렐빈이 보충될 수 있다.
일부 실시태양에서, 분자 하위유형은 관내강 B형이고, 종양 치료 섭생은 화학요법제의 투여를 포함한다. 일부 실시태양에서, 분자 하위유형은 관내강 B형이고, 종양 치료 섭생은 탁산, 바람직하게는 도세탁셀의 투여를 포함한다. 일부 실시태양에서, 탁산을 백금-기반 화학요법과 병용 투여한다.
내분비 요법(또한 항-호르몬 치료로서 지칭된다)은 에스트로젠 및/또는 프로제스테론 수용체를 차단/하향-조절하는 약물, 예를 들어 타목시펜(놀바덱스(등록상표)) 또는 풀베스트란트(파슬로덱스(등록상표)), 또는 대안적으로 아로마타제 억제제에 의해 에스트로젠의 생산을 차단하는 약물, 예를 들어 아나스트로졸(아리미덱스(Arimidex)(등록상표)) 또는 레트로졸(페마라(Femara)(등록상표))의 투여에 의해, 에스트로젠이 계속해서 증가하는 것을 요구하는 암을 표적화한다. 그러나, 아로마타제 억제제는 오직 폐경-후 환자에게만 적합하다. 이는 폐경후 여성에서 활성 아로마타제가 폐경전 여성에서 일반적인 형태와 상이하기 때문이고, 따라서 이들 작용제는 폐경전 여성의 우세한 아로마타제를 억제하기에는 유효하지 않다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 암 치료에 사용될 수 있고, 방법은 첫 번째 단계로서, 상기에 정의된 바와 같은 방법을 사용하여 종양 치료를 위한 방광암 환자를 계층화하고, 두 번째 단계로서, 상기 방광암 환자에게 선택된 종양 치료 섭생을 제공함을 포함한다. 상기 종양 치료 섭생은 상기에 정의된 바와 같은 시험관내 방법에 의해 식별된 분자 하위유형에 기반하여 선택된다.
상기 방법의 첫 번째 및 두 번째 단계를 시간 및/또는 위치에 관하여, 서로 별도로 수행할 수 있다. 상기 첫 번째 단계는 예를 들어 치료 지침의 발행을 생성시킬 수 있고, 이는 상이한 시간 및/또는 위치에서 두 번째 단계를 수행하기 위해 사용된다. 상기 첫 번째 단계는 또한 즉시 두 번째 단계가 이어질 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 방법은 보조/신보조 화학요법에 찬성 또는 반대의 직접적인 결정을 위해 상기에 정의된 시험관내 방법에 의해 획득된 정량적인 결과를 사용함을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명을 암 치료에 사용할 수 있고, 여기서 방광암은 상기에 정의된 바와 같은 분자 하위유형을 특징으로 하고, 상기 방법은 상기 분자 하위유형에 기반하여 선택된 종양 치료 섭생을 제공함을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 치료제의 제조 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 상술한 바와 같은 방법을 사용하여 개별적인 HLA 패턴을 결정하고 상기 결정된 HLA 패턴에 기반하여 용해성 HLA 도메인 또는 항체를 생성시킴을 포함한다. 본 발명은 또한 암 치료에 사용하기 위한 상기에 따라 제조된 치료제에 관한 것이다.
도 1은 실시예 2에 따른, 잠재적인 번역 개시 부위에서 HLA-A1, -A2, -B, -E, -F1, -F2, -F3, -J, -G 및 HLA-H의 서열 정렬을 묘사한다.
도 2는 엑손 4에서 엑손 5에의 접합부에서의 HLA-A1, -A2, -B, -E, -F1, -F2, -F3, -J, -G 및 HLA-H의 서열 정렬을 묘사한다.
도 3은 엑손 8에서의 HLA-A1, -A2, -B, -E, -F1, -F2, -F3, -J, -G 및 HLA-H의 서열 정렬을 묘사한다.
도 4는 근육 침습성 방광암 환자의 FFPE 조직으로부터의 RT-qPCR에 의해 측정된 바와 같은 관내강 및 기저 하위유형 마커, 체크포인트 표적 유전자 및 FGFR1 내지 4 유전자 발현의 데이터 분포를 묘사한다.
도 5는 근육 침습성 방광암 환자의 XX 조직으로부터의 RT-qPCR에 의해 측정된 바와 같은 관내강 및 기저 하위유형 마커, 체크포인트 표적 유전자 및 FGFR1 내지 4 유전자 mRNA 발현의 유전자간 스피어만 상관관계를 묘사한다.
도 6은 근육 침습성 방광암 환자의 FFPE 조직으로부터의 RT-qPCR에 의해 측정된 바와 같은 HLA 유전자 mRNA 발현의 유전자간 스피어만 상관관계를 묘사한다.
도 7은 HLA-A 엑손 8, HLA-G 엑손 8 및 HLA-G 엑손 5 mRNA 발현의 조합에 의한 계층화에 기반한 근육 침습성 방광암 환자의 FFPE 조직으로부터의 질병 특이성 생존(DSS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다.
도 8은 HLA-A 엑손 8 및 HLA-G 엑손 8 mRNA 발현의 유전자간 조합에 의한 계층화에 기반한 근육 침습성 방광암 환자의 FFPE 조직으로부터의 질병 특이성 생존(DSS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다.
도 9는 HLA-G 엑손 8 및 엑손 5 mRNA 발현의 유전자내 조합에 의한 계층화에 기반한 근육 침습성 방광암 환자의 FFPE 조직으로부터의 질병 특이성 생존(DSS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다.
도 10은 오직 HLA-G 엑손 8 및 엑손 5 mRNA 발현만의 단일 유전자 측정에 의한 계층화에 기반한 근육 침습성 방광암 환자(n=61)의 FFPE 조직으로부터의 질병 특이성 생존(DSS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다.
도 11은 RT-qPCR에 의해 측정된 바와 같은 HLA-F 동형 및 안티센스 HLA-F 발현의 상대적인 mRNA 발현(40-DCT)의 데이터 분포를 묘사한다.
도 12는 RT-qPCR에 의해 측정된 바와 같은 ESR1, HLA-F3 및 HLA-F AS1 발현의 상대적인 mRNA 발현(40-DCT)의 데이터 분포를 묘사한다.
도 13은 무진행 생존을 예측하기 위해 RT-qPCR에 의해 측정된 바와 같은 신보조적으로 치료된 난소 암 환자의 치료-전 생검 샘플에서 HLA-F3 mRNA 발현에 대한 분할 시험을 묘사한다.
도 14는 진행된 난소암 환자(n=27)의 신선한 조직으로부터의 RT-qPCR에 의해 정량분석된 바와 같은 오직 HLA-F3만의 단일 유전자 측정에 의한 계층화에 기반한 무진행 생존(PFS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다.
도 15는 진행된 난소암 환자(n=27)의 신선한 조직으로부터의 RT-qPCR에 의해 정량분석된 바와 같은 오직 HLA-F3만의 단일 유전자 측정에 의한 계층화에 기반한 전체 생존(OS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다.
도 16은 등급, FIGO 단계, 원발 부위 및 HLA-F3 mRNA 발현을 포함한 콕스 비례 위험 모델을 사용한 OS에 대한 다변량 분석을 묘사한다.
도 17은 무진행 생존을 예측하기 위해 RT-qPCR에 의해 측정된, 신보조적으로 치료된 난소 암 환자의 치료-전 생검 샘플에서 ESR1 및 HLA-F3 mRNA 발현에 대한 분할 시험을 묘사한다.
도 18은 진행된 난소암 환자(n=27)의 신선한 조직으로부터의 RT-qPCR에 의해 정량분석된 바와 같은 계층화 ESR1 및 HLA-F3 mRNA 발현에 기반한 무진행 생존(PFS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다.
도 19는 진행된 난소암 환자(n=27)의 신선한 조직으로부터의 RT-qPCR에 의해 정량분석된 바와 같은 계층화 ESR1 및 HLA-F3 mRNA 발현에 기반한 전체 생존(OS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다.
도 20은 등급, FIGO 단계, 원발 부위 및 ESR1 및 HLA-F3 mRNA 발현의 조합을 포함한 콕스 비례 위험 모델을 사용한 PFS에 대한 다변량 분석을 묘사한다.
도 21은 등급, FIGO 단계, 원발 부위 및 ESR1 및 HLA-F3 mRNA 발현의 조합을 포함한 콕스 비례 위험 모델을 사용한 OS에 대한 다변량 분석을 묘사한다.
도 22는 진행된 난소암 환자(n=27)의 신선한 조직으로부터의 RT-qPCR에 의해 정량분석된 바와 같은 계층화 HLA-F3 및 HLA-F AS1 mRNA 발현에 기반한 전체 생존(OS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다.
도 23은 진행된 난소암 환자(n=27)의 신선한 조직으로부터의 RT-qPCR에 의해 정량분석된 바와 같은 계층화 HLA-F3 및 HLA-F AS1 mRNA 발현에 기반한 전체 생존(OS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다.
도 24는 등급, FIGO 단계, 원발 부위 및 HLA-F3 및 HLA-F AS1의 조합을 포함한 콕스 비례 위험 모델을 사용한 PFS에 대한 다변량 분석을 묘사한다.
도 25는 등급, FIGO 단계, 원발 부위 및 HLA-F3 및 HLA-F AS1의 조합을 포함한 콕스 비례 위험 모델을 사용한 OS에 대한 다변량 분석을 묘사한다.
도 26은 진행된 또는 전이성 요로상피암 코호트의 콘소트(consort) 다이어그램을 묘사한다.
도 27은 RT-qPCR 분석에 의해 정량분석된 바와 같은 HLA-F1/F2 발현에 의한 계층화에 기반한 국소 진행된 또는 전이성 UBC를 갖는 근육 침습성 방광암 환자(n=55)로부터의 질병 특이성 생존(DSS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다.
도 28은 RT-qPCR 분석에 의해 정량분석된 바와 같은 HLA-F1/F2 및 HLA-G 엑손 8 mRNA 발현에 의한 계층화에 기반한 국소 진행된 또는 전이성 UBC를 갖는 근육 침습성 방광암 환자(n=55)로부터의 질병 특이성 생존(DSS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다.
도 29는 RT-qPCR 분석에 의해 정량분석된 바와 같은 HLA-F1/F2 및 HLA-B/C 엑손 8 mRNA 발현에 의한 계층화에 기반한 국소 진행된 또는 전이성 UBC를 갖는 근육 침습성 방광암 환자(n=55)로부터의 질병 특이성 생존(DSS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다.
도 30은 RT-qPCR 분석에 의해 정량분석된 바와 같은 HLA-B/C 엑손 8 mRNA 발현에 의한 계층화에 기반한 국소 진행된 또는 전이성 UBC를 갖는 근육 침습성 방광암 환자(n=55)로부터의 질병 특이성 생존(DSS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다.
도 2는 엑손 4에서 엑손 5에의 접합부에서의 HLA-A1, -A2, -B, -E, -F1, -F2, -F3, -J, -G 및 HLA-H의 서열 정렬을 묘사한다.
도 3은 엑손 8에서의 HLA-A1, -A2, -B, -E, -F1, -F2, -F3, -J, -G 및 HLA-H의 서열 정렬을 묘사한다.
도 4는 근육 침습성 방광암 환자의 FFPE 조직으로부터의 RT-qPCR에 의해 측정된 바와 같은 관내강 및 기저 하위유형 마커, 체크포인트 표적 유전자 및 FGFR1 내지 4 유전자 발현의 데이터 분포를 묘사한다.
도 5는 근육 침습성 방광암 환자의 XX 조직으로부터의 RT-qPCR에 의해 측정된 바와 같은 관내강 및 기저 하위유형 마커, 체크포인트 표적 유전자 및 FGFR1 내지 4 유전자 mRNA 발현의 유전자간 스피어만 상관관계를 묘사한다.
도 6은 근육 침습성 방광암 환자의 FFPE 조직으로부터의 RT-qPCR에 의해 측정된 바와 같은 HLA 유전자 mRNA 발현의 유전자간 스피어만 상관관계를 묘사한다.
도 7은 HLA-A 엑손 8, HLA-G 엑손 8 및 HLA-G 엑손 5 mRNA 발현의 조합에 의한 계층화에 기반한 근육 침습성 방광암 환자의 FFPE 조직으로부터의 질병 특이성 생존(DSS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다.
도 8은 HLA-A 엑손 8 및 HLA-G 엑손 8 mRNA 발현의 유전자간 조합에 의한 계층화에 기반한 근육 침습성 방광암 환자의 FFPE 조직으로부터의 질병 특이성 생존(DSS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다.
도 9는 HLA-G 엑손 8 및 엑손 5 mRNA 발현의 유전자내 조합에 의한 계층화에 기반한 근육 침습성 방광암 환자의 FFPE 조직으로부터의 질병 특이성 생존(DSS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다.
도 10은 오직 HLA-G 엑손 8 및 엑손 5 mRNA 발현만의 단일 유전자 측정에 의한 계층화에 기반한 근육 침습성 방광암 환자(n=61)의 FFPE 조직으로부터의 질병 특이성 생존(DSS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다.
도 11은 RT-qPCR에 의해 측정된 바와 같은 HLA-F 동형 및 안티센스 HLA-F 발현의 상대적인 mRNA 발현(40-DCT)의 데이터 분포를 묘사한다.
도 12는 RT-qPCR에 의해 측정된 바와 같은 ESR1, HLA-F3 및 HLA-F AS1 발현의 상대적인 mRNA 발현(40-DCT)의 데이터 분포를 묘사한다.
도 13은 무진행 생존을 예측하기 위해 RT-qPCR에 의해 측정된 바와 같은 신보조적으로 치료된 난소 암 환자의 치료-전 생검 샘플에서 HLA-F3 mRNA 발현에 대한 분할 시험을 묘사한다.
도 14는 진행된 난소암 환자(n=27)의 신선한 조직으로부터의 RT-qPCR에 의해 정량분석된 바와 같은 오직 HLA-F3만의 단일 유전자 측정에 의한 계층화에 기반한 무진행 생존(PFS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다.
도 15는 진행된 난소암 환자(n=27)의 신선한 조직으로부터의 RT-qPCR에 의해 정량분석된 바와 같은 오직 HLA-F3만의 단일 유전자 측정에 의한 계층화에 기반한 전체 생존(OS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다.
도 16은 등급, FIGO 단계, 원발 부위 및 HLA-F3 mRNA 발현을 포함한 콕스 비례 위험 모델을 사용한 OS에 대한 다변량 분석을 묘사한다.
도 17은 무진행 생존을 예측하기 위해 RT-qPCR에 의해 측정된, 신보조적으로 치료된 난소 암 환자의 치료-전 생검 샘플에서 ESR1 및 HLA-F3 mRNA 발현에 대한 분할 시험을 묘사한다.
도 18은 진행된 난소암 환자(n=27)의 신선한 조직으로부터의 RT-qPCR에 의해 정량분석된 바와 같은 계층화 ESR1 및 HLA-F3 mRNA 발현에 기반한 무진행 생존(PFS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다.
도 19는 진행된 난소암 환자(n=27)의 신선한 조직으로부터의 RT-qPCR에 의해 정량분석된 바와 같은 계층화 ESR1 및 HLA-F3 mRNA 발현에 기반한 전체 생존(OS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다.
도 20은 등급, FIGO 단계, 원발 부위 및 ESR1 및 HLA-F3 mRNA 발현의 조합을 포함한 콕스 비례 위험 모델을 사용한 PFS에 대한 다변량 분석을 묘사한다.
도 21은 등급, FIGO 단계, 원발 부위 및 ESR1 및 HLA-F3 mRNA 발현의 조합을 포함한 콕스 비례 위험 모델을 사용한 OS에 대한 다변량 분석을 묘사한다.
도 22는 진행된 난소암 환자(n=27)의 신선한 조직으로부터의 RT-qPCR에 의해 정량분석된 바와 같은 계층화 HLA-F3 및 HLA-F AS1 mRNA 발현에 기반한 전체 생존(OS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다.
도 23은 진행된 난소암 환자(n=27)의 신선한 조직으로부터의 RT-qPCR에 의해 정량분석된 바와 같은 계층화 HLA-F3 및 HLA-F AS1 mRNA 발현에 기반한 전체 생존(OS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다.
도 24는 등급, FIGO 단계, 원발 부위 및 HLA-F3 및 HLA-F AS1의 조합을 포함한 콕스 비례 위험 모델을 사용한 PFS에 대한 다변량 분석을 묘사한다.
도 25는 등급, FIGO 단계, 원발 부위 및 HLA-F3 및 HLA-F AS1의 조합을 포함한 콕스 비례 위험 모델을 사용한 OS에 대한 다변량 분석을 묘사한다.
도 26은 진행된 또는 전이성 요로상피암 코호트의 콘소트(consort) 다이어그램을 묘사한다.
도 27은 RT-qPCR 분석에 의해 정량분석된 바와 같은 HLA-F1/F2 발현에 의한 계층화에 기반한 국소 진행된 또는 전이성 UBC를 갖는 근육 침습성 방광암 환자(n=55)로부터의 질병 특이성 생존(DSS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다.
도 28은 RT-qPCR 분석에 의해 정량분석된 바와 같은 HLA-F1/F2 및 HLA-G 엑손 8 mRNA 발현에 의한 계층화에 기반한 국소 진행된 또는 전이성 UBC를 갖는 근육 침습성 방광암 환자(n=55)로부터의 질병 특이성 생존(DSS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다.
도 29는 RT-qPCR 분석에 의해 정량분석된 바와 같은 HLA-F1/F2 및 HLA-B/C 엑손 8 mRNA 발현에 의한 계층화에 기반한 국소 진행된 또는 전이성 UBC를 갖는 근육 침습성 방광암 환자(n=55)로부터의 질병 특이성 생존(DSS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다.
도 30은 RT-qPCR 분석에 의해 정량분석된 바와 같은 HLA-B/C 엑손 8 mRNA 발현에 의한 계층화에 기반한 국소 진행된 또는 전이성 UBC를 갖는 근육 침습성 방광암 환자(n=55)로부터의 질병 특이성 생존(DSS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다.
본 발명을 하기에 상세하게 기재하지만, 본 발명은 다양할 수 있으므로 여기에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약으로 제한되지 않음을 이해해야 한다. 본원에 사용된 용어는 단지 특정 실시태양을 기재하기 위한 것이고, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니고, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것임을 이해해야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 여기서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
하기에서, 본 발명의 몇몇 요소를 기재할 것이다. 이러한 요소는 특정한 실시태양과 함께 나열될 수 있지만; 이들을 임의의 방식과 임의의 수로 조합하여 추가적인 실시태양을 생성시킬 수 있음은 물론이다. 다양하게 기재된 실시예 및 바람직한 구현예를, 오직 명백히 기재된 실시태양으로만 본 발명을 제한하는 것으로 해석해서는 안 된다. 이러한 기재는 명백히 기재된 실시태양을 임의의 수의 개시된 및/또는 바람직한 요소와 겸하는 실시태양을 지지하고 포함하는 것으로 이해해야 한다. 더욱 또한, 본원에 기재된 모든 요소의 임의의 순열 및 조합은 문맥상 달리 나타내지 않는 한 본원의 기재에 의해 개시되는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 당업자에게 명백한 바와 같이, 특정 유전자의 RNA 전사물의 발현 수준(상기 특정 유전자의 RNA 전사물의 한정된 발현 임계값보다 더 높거나 낮은) 및 이에 기반한 분자 하위유형에 관하여 본원에 개시된 특정 실시태양들을, 주어진 종양의 분자 하위유형의 식별을 허용하도록 조합할 수 있다.
실시태양 및 실시예의 기재를 진행하기 전에, 용어에 대한 일부 일반적인 언급은 하기를 따른다: 바람직하게, 본원에 사용되는 용어는 문헌["A multilingual glossary of biotechnological terms (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kolbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)]에 기재된 바와 같이 정의된다.
본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한, 당해 분야의 문헌에 설명되는 화학, 생화학, 세포 생물학, 면역학, 및 재조합 DNA 기법의 통상적인 방법을 사용할 것이다(예를 들어 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 2000]을 참조하시오).
본 명세서 및 하기의 청구범위 전체를 통해서, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, "포함하다"란 단어 및 "포함하는"과 같은 변형은 서술된 구성원, 정수 또는 단계 또는 구성원들, 정수들 또는 단계들의 그룹의 포함을 의미하고 임의의 다른 구성원, 정수 또는 단계 또는 구성원들, 정수들 또는 단계들의 그룹의 배제를 의미하지는 않지만, 일부 실시태양에서 이러한 다른 구성원, 정수 또는 단계 또는 구성원들, 정수들 또는 단계들의 그룹을 제외할 수도 있다, 즉 발명의 요지는 서술된 구성원, 정수 또는 단계 또는 구성원들, 정수들 또는 단계들의 그룹을 포함함에 있다. 본 발명을 기재하는 상황에서(특히 청구범위의 상황에서) 사용되는 단수 형태는 본원에서 달리 나타내지 않는 한 또는 문맥상 명백하게 반박되지 않는 한, 단수 및 복수를 모두 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 여기서 값의 범위를 언급하는 것은 단지 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 참조하는 속기 방법으로서 역할을 하는 것일 뿐이다. 본원에서 달리 나타내지 않는 한, 각각의 개별 값은 본원에 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 포함된다. 본원에 기재된 모든 방법을, 본원에서 달리 나타내거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 임의의 적절한 순서로 수행할 수 있다. 본원에 제공된 임의의 모든 실시예 또는 예시적인 언어(예를 들어 "∼와 같은")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 설명하기 위한 것이고, 달리 청구된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 명세서의 어떤 언어도 본 발명의 실행에 필수적인 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본원에 사용되는 바와 같은 환자의 "샘플의 분류"란 용어는 상기 샘플과 적어도 2개의 범주 중 하나와의 연관에 관한 것이다. 이러한 범주는 예를 들어 "고 위험" 및 "저 위험", 고, 중간 및 저 위험일 수 있고, 여기서 위험은 특정 기간 중에 발생하는 특정 사건, 예를 들어 전이의 발생, 무질병 생존 등의 확률이다. 이는 추가로 주어진 치료 등에 대한 질병의 유리하거나 불리한 임상 결과, 반응성 또는 비-반응성의 범주를 의미할 수 있다. 분류를 연산, 특히 판별 함수의 사용에 의해 수행할 수 있다. 연산의 간단한 예는 특정 임계값 초과 또는 미만인, 제1 정량적 매개변수, 예를 들어 관심 유전자의 발현 수준에 따른 분류이다. 환자 샘플의 분류를 사용하여 질병의 결과를 예측할 수 있다. 단일 관심 유전자의 발현 수준을 사용하는 것 대신에, 다수 관심 유전자의 합산 점수를 사용할 수도 있다. 더욱이, 추가적인 데이터를 제1 정량적 매개변수와 함께 사용할 수 있다. 이와 같은 추가적인 데이터는 환자로부터의 임상 데이터, 예를 들어 환자의 성별, 연령, 체중, 종양 등급 또는 병기 등일 수 있다.
"전이"란 용어는 신체의 원래의 부위에서 또 다른 부위로의 암세포의 확산을 지칭하고자 한다. 전이의 형성은 매우 복잡한 과정이고 원발 종양으로부터 악성 세포의 탈착, 세포외 기질의 침습, 내피 기저막을 침투하여 체강 및 혈관에 진입하고, 이어서 혈액에 의해 수송된 후, 표적 기관의 침윤에 의존한다. 최종적으로, 표적 부위에서 새로운 종양의 성장은 혈관형성에 의존한다. 종양 전이는 종종, 종양 세포 또는 성분이 여전히 남아있고 전이 잠재성을 나타내기 때문에, 원발 종양의 제거후에 조차 발생한다.
"판별 함수"는 대상 또는 사건의 분류에 사용되는 변수 집합의 함수이다. 따라서 판별 함수는 환자, 샘플 또는 사건을, 상기 환자, 샘플 또는 사건으로부터 입수할 수 있는 데이터 또는 매개변수에 따라 하나의 범주 또는 다수의 범주로 분류할 수 있게 한다. 이와 같은 분류는 당업자에게 주지된 통계 분석의 표준 장비이다. 예를 들어 환자를 상기 환자, 샘플 또는 사건으로부터 획득한 데이터에 따라 "고 위험" 또는 "저 위험", "높은 전이 확률" 또는 "낮은 전이 확률", "치료가 필요한" 또는 "치료가 필요하지 않은"으로서 분류할 수 있다. 분류는 "높은 대 낮은"으로 제한되지 않고, 다수의 범주, 등급 등으로 수행될 수 있다. 분류를 허용하는 판별 함수의 예는 비제한적으로 지원 벡터 머신(SVM), k-최근접 이웃(kNN), (미경험) 베이즈(Bayes) 모델에 의해 정의된 판별 함수, 또는 예를 들어 하위 그룹 발견, 의사 결정 트리, 데이터의 논리적 분석(LAD) 등과 같은 구분적으로 한정된 함수를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "예측"이란 용어는 환자가 주어진 치료법에 유리하게 또는 불리하게 반응할 가능성에 관한 것이다. 특히, 본원에 사용되는 바와 같은 "예측"이란 용어는, 종양이 주어진 치료법으로 치료되는 경우, 상기 종양의 악성의 개별적인 평가, 또는 환자의 예상되는 생존률(DFS, 무질병 생존)에 관한 것이다. 이와 대조적으로, "예후"란 용어는 종양이 치료되지 않은 채로 있는 경우, 상기 종양의 악성의 개별적인 평가 또는 환자의 예상되는 생존률(DFS, 무질병 생존률)에 관한 것이다.
"반응 마커"란 용어는 주어진 치료에 대한 환자의 임상 반응을 예측하는데 사용될 수 있는 마커에 관한 것이다. 반응은 예를 들어 CT-스캔 및/또는 혈청 생물마커에 의해 자명한 바와 같은 신보조 또는 완화 치료시 종양 수축의 직접적인 관찰뿐만 아니라 무질병 생존(DFS), 전체 생존(OAS), 전이 특이성 생존(MSS), 질병 특이성 생존에 대한 영향 및 관련 평가를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같은 환자의 "임상 반응"이란 용어는 환자에서 특정 치료법의 유효성에 관한 것이고, 이는 환자 상태의 임의의 척도, 예를 들어 당해 분야에 통상적으로 사용되는 척도, 예를 들어 전체 생존, 무진행 생존, 무-재발 생존, 및 원격 무-재발 생존의 개선을 의미한다. 무-재발 생존(RFS)은 수술로부터 첫 번째 국소적, 지역적, 또는 원격 재발까지의 시간(년)을 지칭한다. 원격 무-재발 생존(DFRS)은 수술 및/또는 초기 진단으로부터 첫 번째 해부학적으로 먼 재발까지의 시간(년)을 지칭한다. 실제로 이러한 척도의 계산은 검열되거나 고려되지 않은 사건의 정의에 따라 연구마다 다를 수 있다.
"신생물 질환"이란 용어는 암성 조직을 지칭하고 여기에는 암종, 예를 들어 제자리 암종, 침습성 암종, 전이 암종 및 전-암성 상태, 조직 기원과 무관한 신형태 변화가 포함된다. "선암종"이란 용어는 선 조직에서 기원하는 악성 종양을 지칭한다.
"암" 및 "암성"이란 용어는 전형적으로, 조절되지 않는 세포 증식을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 지칭하거나 기술한다. "암"이란 용어는 병든 조직 또는 세포 집단의 임의의 병기, 등급, 조직형태학적 특징, 침습성, 공격성 또는 악성으로 제한되지 않는다. 특히, 0기 암, I기 암, II기 암, III기 암, IV기 암, I 등급 암, II 등급 암, III 등급 암, 악성 암, 원발 암종, 및 부인과암과 특별히 연관된 다른 모든 유형의 암, 악성종양 및 형질전환이 포함된다. "신생물 질환" 또는 "암"이란 용어는 임의의 조직 또는 세포 유형으로 제한되지 않고, 또한 암 환자의 원발, 2차 또는 전이 병변을 포함하고, 국소적으로 침착되거나 환자의 신체 전체를 통해 자유롭게 떠다니는 암세포 또는 최소 잔류 질병 세포에 의해 병든 림프절을 또한 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "암"이란 용어는 비정상적으로 조절되는 세포 성장, 증식, 분화, 유착 및/또는 이동을 특징으로 하는 질병을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 암이란 용어는 또한 암 전이를 포함한다. "종양" 및 "암"이란 용어는 본원에서 호환가능하게 사용될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 "종양"이란 용어는 악성이든 양성이든 모든 신생물 세포 성장 및 증식, 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "폐암"이란 용어는 폐에서 진단되는 암 또는 악성종양을 지칭하고 폐 조직의 모든 암, 종양 성장 및 암성 변형을 포함하고자 한다. 폐암의 예는 비제한적으로 하기를 포함한다: 소세포 폐암종(SCLC) 및 비소세포 폐암종(NSCLC), 특히 편평 세포 폐암종, 선암종, 세기관지 폐포 암종, 대세포 폐암종 및 기타 흉막 폐모세포종 및 카르시노이드 종양.
"신생물 세포"라는 용어는 증가된 세포 증식, 변경된 세포 분열 대칭 또는 감소된 세포사 기전에 의해 정상보다 더 빠르게 성장하는 비정상 세포를 지칭한다. 이와 같이, 본 발명의 신생물 세포는 양성 신생물의 세포일 수 있거나 악성 신생물의 세포일 수 있다.
더욱 또한, 신생물 질환 또는 암의 "상태를 특성화하는"이라는 용어는 비제한적으로 하기의 조건 중 하나 이상의 측정 및 평가와 관련된다: 종양의 유형, 조직형태학적 외관, 외부 신호(예를 들어 호르몬, 성장 인자)에 대한 의존성, 침습성, 운동성, 악성 종양의 TNM 분류에 의한 상태(TNM), 국제 암 대항 연합(International Union Against Cancer)에 의해 개발되고 유지되는 암 병기결정 시스템, 또는 유사한, 공격성, 악성, 전이 가능성 및 주어진 치료법에 대한 반응성.
"치료법 양상", "치료 방식", "섭생" 또는 "화학 섭생"뿐만 아니라 "치료법 섭생"이라는 용어는 항종양 및/또는 항혈관 및/또는 면역 자극, 및/또는 혈구 증식제, 및/또는 방사선 요법, 및/또는 암 요법을 위한 온열 요법, 및/또는 저체온 요법의 적시의 순차적 또는 동시 투여를 지칭한다. 이들의 투여는 보조 및/또는 신보조 방식으로 수행될 수 있다. 이러한 "프로토콜"의 구성은 한정된 치료 창 내에서 단일제의 용량, 적용 기간 및 투여 빈도에 있어서 다양할 수 있다. 현재 다양한 약물 및/또는 물리적 방법의 다양한 조합 및 다양한 스케줄이 조사 중에 있다.
"내분비 치료"라는 용어는 호르몬/호르몬 수준의 변화를 통해 원하는 치료 효과를 생성시키는 호르몬 요법 또는 항호르몬 요법으로서 공지된 다양한 치료 양식을 나타낸다. 치료는 호르몬 또는 호르몬 유사체, 합성 호르몬 또는 기타 약물을 환자에게 투여하거나, 또는 호르몬 길항물질, 호르몬 수용체 길항물질, 또는 난소의 외과적 절제 또는 호르몬 합성의 화학적 억제에 의한 호르몬 제거 요법을 사용하여 체내 호르몬 수준을 감소시킴을 포함할 수 있다. 내분비 요법은 선택적 에스트로젠 재흡수 억제제, 선택적 에스트로젠 수용체 하향조절제, 아로마타제 억제제 및 난소 절제와 같은 호르몬 요법을 포함하는 것으로 간주될 것이다. 상기 내분비 치료는 호르몬 또는 호르몬 유사체, 합성 호르몬 또는 기타 약물, 예를 들어 타목시펜, 랄록시펜 및/또는 고세렐린(상표명 졸라덱스(Zoladex)(등록상표))을 환자에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서 상기 내분비 치료는 타목시펜, 또는 타목시펜과 고세렐린의 투여를 포함한다. 추가로, 상기 내분비 치료는 아나스트로졸, 레트로졸, 엑세메스탄, 풀베스트란트, 토레미펜 및 메가스테롤 아세테이트를 포함하는 군으로부터 선택된 항 에스트로젠 약물의 투여를 포함할 수 있다. 상기 내분비 치료는 또한 에스트로젠, 프로제스틴 및/또는 제스타젠 투여를 포함할 수 있다.
"비단백질 기준으로 유전자의 발현 수준 측정"이라는 용어는 2차 유전자 번역 산물, 즉 단백질에 초점을 맞추지 않고 RNA 및 DNA 분석을 기반으로 하는 다른 유전자 발현 수준에 초점을 맞춘 방법과 관련된다. 본 발명의 일부 실시태양에서, 분석은 그의 전구체 형태를 포함하는 mRNA를 사용한다. 예시적인 측정가능한 성질은 HLA mRNA, 즉 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-D, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H, HLA-J 또는 이들의 부분의 양이다.
대안적으로, 본원에 개시된 차등적으로 발현된 유전자는 시약 및 화합물을 식별하기 위한 방법, 및 치료 방법뿐만 아니라 암 치료를 위한 이들 시약 및 화합물의 용도에 사용될 수 있다. 유전자의 차등 조절은 특정 암 세포 유형이나 클론으로 제한되지 않고, 오히려 암세포, 근육 세포, 기질 세포, 결합 조직 세포, 기타 상피 세포, 지방 세포, 혈관 내피 세포뿐만 아니라 면역계의 세포, 예를 들어 림프구, 대식세포, 살해 세포의 상호작용을 나타낸다.
"RNA 발현 패턴"이라는 용어는 참조 RNA 또는 계산된 평균 발현 값과 비교하여 결정된 RNA 발현 수준을 의미한다. 패턴은 두 RNA의 비교로 제한되지 않고 참조 RNA 또는 샘플에 대한 RNA의 다중 비교와 더 관련이 있다. 특정한 "발현 수준 패턴"이 또한 생성될 수 있고 여러 RNA의 비교 및 측정에 의해 결정될 수 있고 이러한 전사물의 서로에 대한 상대적 풍부함을 나타낸다.
본 발명의 의미 내에서 "발현 수준의 참조 패턴"은 발현 수준의 다른 패턴과의 비교에 사용될 수 있는 임의의 발현 수준 패턴으로 이해되어야 한다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 발현 수준의 참조 패턴은 예를 들어 참조 그룹으로서 작용하는 건강하거나 질병에 걸린 개체의 그룹에서 관찰되는 발현 수준의 평균 패턴이다.
본원에 사용되는 바와 같은 "조절된" 또는 "조절" 또는 "조절된" 또는 "조절" 및 "차등 조절된"이란 용어는 상향 조절, 즉, 예를 들어 작용 또는 강화에 의한 활성화 또는 자극, 및 하향 조절, 즉, 예를 들어 길항, 감소 또는 억제에 의한 저해 또는 억제를 지칭한다.
"반응", "치료학적 성공" 또는 "치료법에 대한 반응"이라는 문구는 한정된 무종양 또는 무재발 또는 무진행 생존 기간(예를 들어 2년, 4년 , 5년, 10년)의 관찰에 대한 신보조, 보조 및 완화적 화학요법 설정을 지칭한다. 이러한 무질병, 무재발 또는 무진행 생존 기간은 다양한 종양 개체마다 다를 수 있지만 대부분의 재발이 나타나는 평균 기간보다 충분히 길다. 신보조 및 완화 요법 양식에서, 반응을 종양 덩어리의 세포자멸사 및 괴사로 인한 종양 수축 및 퇴행 또는 변경된 혈관형성 사건으로 인한 혈액 공급 감소를 측정함으로써 추가로 모니터링할 수 있다.
"재발" 또는 "재발성 질환"이라는 용어는 종양의 초기 진단 및 치료 후 수년 후에도 나타날 수 있는 원격 전이, 또는 국소 림프절로의 종양 세포 침윤, 또는 적합한 시간 내에 동일한 부위 및 기원 기관에서 종양 세포의 발생과 같은 국소 사건을 포함한다.
"재발 예측" 또는 "치료 성공 예측"은 본 발명에 기재된 방법을 지칭하고, 여기서 종양 시편은 예를 들어 유전자 발현, 게놈 상태 및/또는 조직병리학적 매개변수(예를 들어 TNM 및 등급) 및/또는 영상 데이터에 대해 분석되고 또한 참조 샘플로부터 알려진 패턴과 발현 패턴과의 상관관계에 기반하여 분류된다. 이러한 분류는 상기와 같은 주어진 종양이 재발을 일으키고 따라서 주어진 요법에 대해 "무반응" 종양으로 간주된다는 진술을 생성시키거나, 또는 연장된 치료후 무질병 시간을 갖는 종양으로 분류되는 결과를 생성시킬 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 "마커 유전자"란 용어는, 발현 패턴이 악성 신생물 또는 암 평가에서 예측, 예후 또는 진단 과정의 일부로 사용될 수 있거나 대안적으로 악성 신생물 및 특히 부인과 암의 치료 또는 예방에 유용한 화합물을 식별하기 위한 방법에 사용될 수 있는 차등 발현되는 유전자를 지칭한다. 마커 유전자는 또한 표적 유전자의 특성을 가질 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 "표적 유전자"는 표적 유전자 발현의 수준 또는 표적 유전자 생성물 활성의 조절이 악성 신생물의 증상을 개선하기 위해 작용할 수 있는 방식으로 암, 예를 들어 폐암에 관련되는, 차등적으로 발현되는 유전자를 지칭한다. 표적 유전자는 또한 마커 유전자의 특성을 가질 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 "수용체"란 용어는 신경전달물질, 호르몬 또는 기타 물질, 특히 에스트로젠으로서 호르몬과 같은 특정 분자(리간드)에 결합하고 세포 반응을 개시시키는 세포막상의 또는 세포질 또는 세포 핵 내의 단백질에 관한 것이다. 수용체 단백질 양상의 리간드-유발된 변화는 상기 리간드의 생물학적 작용을 구성하는 생리학적 변화를 초래한다.
"신호전달 경로"라는 용어는, 가장 흔히 세포 내외부에서 생화학적 반응의 정렬된 순서를 수반하는, 세포가 한 종류의 신호 또는 자극을 다른 종류의 신호 또는 자극으로 변환시키는 모든 세포내 또는 세포간 과정과 관련이 있고, 이는 효소에 의해 수행되고 호르몬 및 성장 인자(세포간)뿐만 아니라 2차 메신저(세포내)를 통해 연결되고, 후자는 "2차 메신저 경로"로 생각되는 결과를 초래한다. 많은 신호전달 경로에서, 이러한 사건에 참여하는 단백질 및 기타 분자의 수는 상기 과정이 초기 자극으로부터 발산함에 따라 증가하여 "신호 캐스케이드"를 초래하고, 종종 비교작 작은 자극을 초래하여 큰 반응을 이끌어낸다.
본원에 사용되는 바와 같은 "소분자"란 용어는 분자량이 약 5kD 미만, 가장 바람직하게는 약 4kD 미만인 화합물을 지칭한다. 소분자는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 펩티드모방물질, 탄수화물, 지질 또는 기타 유기(탄소 함유) 또는 무기 분자일 수 있다. 많은 제약 회사는 생물활성을 조절하는 화합물을 식별하기 위해 본 발명의 임의의 분석으로 선별될 수 있는 화학적 및/또는 생물학적 혼합물, 종종 진균, 세균 또는 조류 추출물의 광범위한 라이브러리를 보유하고 있다.
단일 가닥 핵산 서열과 관련하여 사용되는 경우, "실질적으로 상동성인"이란 용어는 상술한 바와 같은 낮은 엄격성 조건 하에서 단일-가닥 핵산 서열과 하이브리드화할 수 있는(즉, 상기의 보체인) 임의의 탐침을 지칭한다 .
본원에 사용되는 바와 같이, "하이브리드화"란 용어는 상보성 핵산의 짝짓기와 관련하여 사용된다.
본원에 사용되는 바와 같은 "하이브리드화 기반 방법"이란 용어는 상보적인 단일 가닥 핵산 또는 뉴클레오타이드 유사체를 단일의 이중 가닥 분자로 조합하는 과정을 부여하는 방법을 지칭한다. 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체는 통상적인 조건에서 보체에 결합하므로 두 개의 완벽하게 상보적인 가닥은 서로 쉽게 결합할 것이다. 생물학적 분석에서, 매우 종종 표지된 단일 가닥 탐침은 상보적인 표적 서열을 찾기 위한 것이다. 그러한 서열이 샘플에 존재하는 경우, 탐침은 상기 서열에 하이브리드화할 것이고, 이어서 상기 표지로 인해 검출될 수 있다. 다른 하이브리드화 기반 방법은 미세배열 및/또는 바이오칩 방법을 포함한다. 거기에서 탐침은 고체상에 고정화되고, 이어서 샘플에 노출된다. 샘플에 상보적 핵산이 존재하는 경우 이들은 탐침에 하이브리드화하고 따라서 검출될 수 있다. 이러한 접근법을 "배열 기반 방법"이라고도 한다. 더욱 또 다른 하이브리드화 기반 방법은 PCR이고, 이는 하기에 기재되어 있다. 발현 수준의 측정과 관련하여, 하이브리드화 기반 방법은 예를 들어 주어진 유전자에 대한 mRNA의 양을 측정하기 위해 사용될 수 있다.
"배열"은 장치 상의 주소 지정이 가능한 위치 또는 "주소"의 배열을 의미한다. 위치는 2차원 배열, 3차원 배열 또는 기타 행렬 형식으로 배열될 수 있다. 위치의 수는 몇 개에서 적어도 수십만 개까지 다양하다. 가장 중요한 것은 각 위치가 독립적인 반응 부위를 나타내는 것이다. 배열은 비제한적으로 핵산 배열, 단백질 배열 및 항체 배열을 포함한다. "핵산 배열"은 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 유전자의 보다 큰 부분과 같은 핵산 탐침을 함유하는 배열을 지칭한다. 배열상의 핵산은 바람직하게는 단일 가닥이다. 탐침이 올리고뉴클레오타이드인 배열은 "올리고뉴클레오타이드 배열" 또는 "올리고뉴클레오타이드 칩"으로 지칭된다. 본원에서 "미세배열"은 또한 "바이오칩" 또는 "생물학적 칩", 적어도 약 100/㎠, 및 바람직하게는 적어도 약 1000/㎠의 개별 영역 밀도를 갖는 영역들의 배열을 지칭한다. 미세배열 중의 영역은 약 10-250 ㎛ 범위의 전형적인 치수, 예를 들어 직경을 가지고, 배열 중의 다른 영역과 대략 동일한 거리만큼 분리된다.
"올리고뉴클레오타이드"라는 용어는 비제한적으로 단일 가닥 데옥시리보뉴클레오타이드, 단일 또는 이중 가닥 리보뉴클레오타이드, RNA:DNA 하이브리드 및 이중 가닥 DNA를 포함한, 비교적 짧은 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게는 단일 가닥 DNA 탐침 올리고뉴클레오타이드이다. 더욱이, 적용 가능한 검출 방법론의 맥락에서, "올리고뉴클레오타이드"라는 용어는 또한 PNA 및 모르폴리노와 같은 뉴클레오타이드 유사체를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "PCR 기반 방법"이란 용어는 폴리머라제 쇄 반응(PCR)을 포함하는 방법을 지칭한다. 이것은 살아있는 유기체를 사용하지 않고 효소 복제를 통해 DNA나 RNA와 같은 핵산을 기하급수적으로 증폭시키는 접근 방식이다. PCR은 시험관내 기술이므로, DNA의 형태에 제한 없이 수행될 수 있고, 다양한 유전자 조작을 수행하도록 광범위하게 변형시킬 수 있다. 발현 수준을 측정하는 경우에, PCR 기반 방법을 예를 들어, (1) 역전사효소의 도움으로 완전한 mRNA 풀(전사체라고 칭함)의 cDNA로의 역전사, 및 (2) 각 프라이머의 도움으로 주어진 cDNA의 존재의 검출에 의해 주어진 mRNA의 존재를 검출하는데 사용할 수 있다. 이러한 접근법은 통상적으로 역전사효소 PCR(rtPCR)로서 공지되어 있다. "PCR 기반 방법"이라는 용어는 종점 PCR 적용뿐만 아니라, 증폭된 표적의 함수로서 형광 신호를 방출하고 표적의 모니터링 및 정량화를 허용하는 특수 형광체 또는 삽입 염료를 적용하는 동역학/실시간 PCR 기법을 모두 포함한다. 정량화 방법은 외부 표준 곡선에 의해 절대적이거나 비교 내부 표준에 상대적일 수 있다.
"분자의 전기화학적 검출에 기반한 방법"이라는 용어는 분자, 특히 단백질, 핵산, 항원, 항체 등과 같은 생체 분자가 검출 가능한 신호 생성 하에서 결합하는 전극 시스템을 사용하는 방법에 관한 것이다. 이와 같은 방법은 예를 들어 WO 02/42759, WO 02/41992 및 WO 02/097413에 개시되어 있고, 그 내용은 본원에 참고로 인용된다. 이러한 검출기는 예를 들어 실리콘 칩의 결정학적 표면에 의해 형성된 평면 표면을 갖는 기판, 및 예를 들어, 인터디지털 전극 또는 2차원 전극 배열의 형상을 채택할 수 있는 전기 검출기를 포함한다. 이러한 전극은 표적 분자, 예를 들어 표적 핵산 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 탐침 분자, 예를 들어 핵산 탐침을 운반한다. 상기 탐침 분자는 예를 들어 티올-금-결합에 의해 고정화된다. 이를 위해서, 탐침을, 금 표면을 포함하는 전극에 결합하는 티올기로 5'- 또는 3'-말단에서 변형시킨다. 이러한 표적 핵산 분자는 예를 들어 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 또는 알칼리성 포스파타제와 같은 효소 표지를 운반할 수 있다. 표적 분자가 탐침에 결합된 후에, 기질(예를 들어 α-나프틸 포스페이트 또는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)을 추가하고 이는 특히 산화환원 반응에서 상기 효소에 의해 전환된다. 이어서 상기 반응의 생성물, 또는 전자 교환으로 인해 상기 반응에서 생성된 전류가 부위 특이적인 방식으로 전기 검출기의 도움으로 검출될 수 있다.
"핵산 분자"란 용어는 DNA, cDNA 및/또는 게놈 DNA, RNA, 바람직하게는 mRNA, 펩티드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA) 및/또는 모르폴리노를 포함하는 임의의 단일- 또는 이중 가닥 핵산 및/또는 유사한 분자를 가리키고자 한다.
"엄격한 조건"이란 용어는 탐침이 그의 표적 하위서열에 하이브리드화하지만 다른 서열에는 그렇지 않을 조건에 관한 것이다. 엄격한 조건은 서열-의존적이고 상이한 상황에서 상이할 것이다. 보다 긴 서열은 특이적으로 보다 높은 온도에서 하이브리드화한다. 일반적으로, 엄격한 조건은 한정된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열의 열 융점(Tm)보다 약 5℃ 낮도록 선택된다. 상기 Tm은 표적 서열에 상보성인 탐침의 50%가 평형시 표적 서열에 하이브리드화하는 온도(한정된 이온 강도, pH 및 핵산 농도하에서)이다. (표적 서열은 Tm에서 일반적으로 과잉으로 존재하므로, 평형시 탐침의 50%를 점유한다). 전형적으로, 엄격한 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0 M Na 이온 미만, 전형적으로는 약 0.01 내지 1.0 M Na 이온(또는 다른 염)이고 온도가, 짧은 탐침(예를 들어 10 내지 50 뉴클레오타이드)의 경우 적어도 약 30℃ 및 보다 긴 탐침의 경우 약 60℃인 조건일 것이다. 엄격한 조건은 또한 탈안정화제, 예를 들어 포름아미드 등의 첨가로 성취될 수 있다.
"핵산 분자의 단편"이란 용어는 청구된 서열 중 하나에 따른 핵산 분자의 부분집합을 포함하는 핵산을 가리키고자 한다. 이를 "핵산 분자의 분획"이란 용어에 적용할 수 있다.
"핵산 분자의 변이체"라는 용어는 본원에서 청구된 서열 중 하나에 따른 핵산 분자와 구조 및 생물학적 활성이 실질적으로 유사한 핵산 분자를 지칭한다.
"핵산 분자의 상동체"라는 용어는 청구된 서열 중 하나에 따른 핵산 분자와 비교하여 하나 이상의 뉴클레오타이드가 추가, 결실, 치환 또는 달리 화학적으로 변형되었지만, 단 항상 상동체가 후자와 실질적으로 동일한 결합 성질을 유지하는 서열을 갖는 핵산 분자를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "유도체"란 용어는 청구된 서열 중 하나에 따른 핵산 분자와 유사한, 표적 핵산 서열에의 결합 특성을 갖는 핵산 분자를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "하이브리드화 대응물"이란 용어는 엄격한 조건 하에서 핵산 분자에 하이브리드화할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다.
"병력"이라는 용어는 의사 또는 기타 의료 전문가가 환자나, 또는 그 사람을 알고 적절한 정보를 제공할 수 있는 다른 사람들에게, 진단을 공식화하고 환자에게 의료 서비스를 제공하는데 유용한 정보를 얻는 것을 목적으로 특정 질문을 함으로써 얻은 환자 데이터와 관련이 있다(이 경우에는 때때로 이종병력이라고 칭한다). 이러한 종류의 정보를 증상이라고 칭하고, 이는 직접 검사로 확인되는 임상 징후와 대조된다.
"병인병리학"이라는 용어는 질병의 경과, 즉 기간, 임상 증상 및 그 결과와 관련이 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 문서가 인용된다. 상기든 하기든, 본원에 인용된 각각의 문서(모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조업체의 명세서, 지침 등을 포함하여)는 내용 전체가 본원에 참고로 인용된다.
"임상 결과"라는 용어는 특히 치료, 예를 들어 증상의 감소 또는 개선 후 질병의 임상 결과로서 정의된다. 일부 실시태양에서, 불량한 임상 결과는 질병 특이성 생존(DSS), 무재발 생존(RFS), 무진행 생존(PFS) 및 원격 무재발 생존의 상대적인 감소 또는 그 이상을 포함한다. 암과 관련하여 "재발"이라는 용어는 기원 질병의 동일한 부위 및 기관에서 종양 세포의 재발, 암의 초기 진단 및 치료 후에 수년 후에조차 나타날 수 있는 전이, 또는 암의 침윤과 같은 국소적 사건, 예를 들어 종양 세포의 국소 림프절로의 침윤을 포함한다. "원격 재발"은 암세포가 국소 림프절을 벗어나 신체의 먼 부분(즉, 다른 기관)으로 확산된(전이) 시나리오를 지칭한다. 무재발 생존은 일반적으로 무작위 분류에서부터 첫 번째 재발, 재발, 두 번째 암 또는 사망까지의 시간으로 정의된다. 무진행 생존은 특정 일자(일반적으로 치료를 시작한 날 또는 임상시험에 등록한 날) 및 질병이 "진행"된 일자 또는 어떤 원인으로든 환자가 사망한 일자를 지난 때이다. "DSS" 및 "CSS"("암 특이적 생존"에 대한)라는 용어는 본 명세서에서 호환가능하게 사용될 수 있다.
특히 암의 치료와 관련하여 본원에 사용되는 바와 같은 "(치료학적) 치료"라는 용어는 건강 상태를 개선시키고/시키거나 환자의 수명을 연장(증가)시키는 임의의 치료를 지칭한다. 상기 치료는 암을 제거하고, 환자의 종양 크기 또는 수를 감소시키고, 환자의 암 발병을 정지시키거나 또는 늦추고, 환자에서 새로운 암의 발병을 억제하거나 늦추고, 환자에서 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시키고, 및/또는 현재 암에 걸렸거나 이전에 암에 걸린 적이 있는 환자의 재발을 감소시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, "치료" 및 "치료학적 치료"란 용어는 원발성 종양의 외과적 제거, 화학요법, 항호르몬 요법, 방사선 요법 및 면역요법/표적 요법 중 하나 이상을 지칭하고자 한다.
보조 요법은 1차, 주요 또는 초기 치료에 추가하여 제공되는 치료이다. 암 요법에 사용되는 수술 및 복잡한 치료 섭생은 상기 용어를 주로 보조 암 치료를 기술하는데 사용하게 하였다. 보조 요법의 예는 일반적으로 수술 후(수술-후) 제공되는 추가적인 치료(예를 들어 화학요법)로, 검출가능한 모든 질병이 제거되었지만 잠재성 질병으로 인한 재발의 통계적 위험이 남아 있는 경우이다. 신보조 요법은 1차, 주요 또는 초기 치료(예를 들어 수술-전 화학 요법) 전에 제공되는 치료이다.
본원에 사용되는 바와 같은 "RNA 전사물의 한정된 발현 임계값"란 용어는 다수의 샘플로부터 계산된 평균 컷오프 값(줄여서, 컷오프)을 지칭할 수 있고, 상기 수의 샘플은 다수의 피실험자, 특히 암이 있는 피실험자로부터 수득된다. 임계값을 얻기 위해서, 피실험자의 수는 상이한 분자 하위유형의 종양을 갖는 피실험자, 예를 들어 HER2-양성 종양을 갖는 피실험자 및/또는 삼중-음성 종양을 갖는 피실험자 및/또는 관내강 A형 종양을 갖는 피실험자 및/또는 관내강 B형 종양을 갖는 피실험자를 포함할 수 있다. 임계값은 RNA 전사물의 양 또는 농도를 나타낼 수 있다. 일부 실시태양에서, 임계값은 CT(주기 임계값; 또한 정량분석 주기, Cq로도 지칭됨) 값(하기 참조)으로서 제공된다. 일부 실시태양에서, (상대적) 발현 수준 및 발현 임계값은 40-ΔCT 또는 40-ΔΔCT 값으로서 표현된다(하기 참조).
본원에 사용되는 바와 같은 "피실험자"란 용어는 척추동물과 같은 임의의 유기체, 특히 인간 및 또 다른 포유동물, 예를 들어 설치류, 토끼 또는 원숭이와 같은 동물을 포함하는 임의의 포유동물과 관련된다. 설치류는 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그 또는 친칠라일 수 있다. 바람직하게는, 피실험자는 인간이다. 일부 실시태양에서, 피실험자는 본원에서 "환자"로도 지정되는, 질병, 특히 암을 갖거나 가질 것으로 의심되는 피실험자이다. 평균 컷오프 값의 결정을 위해서, 적어도 2명의 피실험자, 바람직하게는 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 600, 적어도 700, 적어도 800, 적어도 900, 적어도 1000, 적어도 1500, 또는 적어도 2000명의 피실험자가 시험된다.
바람직한 실시태양의 기재로 돌아와, 일부 실시태양에서, 컷오프/임계값은 하나 이상의 선행 임상 연구에 기초하여 정의된다. 또한 상기 컷오프/임계값의 설정 및 검증을 위해 추가적인 임상 연구가 수행될 수 있다. 상기 컷오프/임계값은 당업계에 공지된 기술에 의해 결정/정의될 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 유전자 마커에 대한 다양한 임상 연구가 이미 수행되었다. 훈련-시험 환경에서의 일치 연구는 "발현-양성" 또는 "발현-음성"의 정량적 결과의 이분법에 대한 임상 컷오프/임계값의 정의 및 검증에 충분할 수 있다.
일부 실시태양에서, 컷오프/임계값은 분할 시험(예를 들어 SAS 소프트웨어 JMP(등록상표) 9.0.0)에 의한 훈련 코호트에서, IHC-ISH와 같은 임상병리학적 매개변수, 및/또는 전체 생존(OS), 질병 특이성 생존(DSS), 및 무진행 생존(PFS)에 대한 데이터에 기초하여 결정/정의된다.
일부 실시태양에서, RNA 전사물의 발현 수준은 역전사(RT) 정량적 PCR(RT-qPCR)에 의해 측정된다. RNA는 PCR에서 직접 증폭될 수 없으므로 역전사효소를 사용하여 cDNA로 역전사시켜야 한다. 이를 위해 동일한 반응에서 PCR에 의한 DNA 증폭과 역전사 반응을 병행하는 1-단계 RT-qPCR을 사용할 수 있다. 1-단계 RT-qPCR에서, RNA 주형은 역전사효소, DNA 폴리머라제, 프라이머 및 탐침, dNTP, 염 및 세제를 포함하는 반응 믹스에 혼합된다. 첫 번째 PCR 단계에서, 표적 RNA는 표적 특이적 역방향 프라이머를 사용하여 역전사효소에 의해 역전사된다. 그 후에, 프라이머/탐침 및 DNA 폴리머라제를 사용하여 cDNA를 증폭시킨다.
예를 들어, 형광 기반 정량적 실시간 PCR을 사용할 수 있다. 형광 기반 정량적 실시간 PCR은 형광 표지된 탐침의 사용을 포함한다. 바람직하게는, 형광 표지된 탐침은 형광 리포터 염료 및 소광제 염료(=이중-표지 탐침) 모두로 표지된 올리고뉴클레오타이드로 이루어진다. 적합한 형광 리포터 및 소광제 염료/모이어티는 당업자에게 공지되어 있고 비제한적으로 리포터 염료/모이어티 6-FAM(상표), JOE(상표), Cy5(등록상표), Cy3(등록상표) 및 소광제 염료/모이어티 dabcyl, TAMRA(상표), BHQ(상표)-1, -2 또는 -3을 포함한다. 탐침-특이성 생성물의 증폭은 탐침의 절단(= 증폭 매개된 탐침 변위)을 일으켜 리포터 형광의 증가를 생성시킨다. 반응에서 형광의 증가는 표적 증폭의 증가에 정비례한다. 탐침으로부터 기원하는 형광의 검출을 위해서 라이트사이클러(LightCycler) 480 II 시스템(로슈) 또는 버산트(Versant) kPCR 시스템(지멘스(Siemens)) 또는 Mx3005P 시스템(에이질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies)) 또는 이와 동등한 실시간 장비를 사용하여 형광 증가를 실시간으로 측정할 수 있다. 분석 출력은 각 표적의 CT 값이다. CT(주기 임계값; 또한 정량분석 주기, Cq라고도 한다) 값은 PCR 증폭 주기의 수에 의해 결정되고, 그 후에 탐침의 형광 신호가 특정 배경 신호를 초과하고, 여기서 상기 CT 값은 PCR 증폭 전 샘플 중의 표적 분자의 양에 대한 척도이다. 바람직하게, CT 값을 적합한 소프트웨어(예를 들어 마이크로소프트 엑셀(Microsoft Excel)(상표)) 또는 통계 소프트웨어 패키지(예를 들어 SAS JMP(등록상표) 9.0.0, GraphPad Prism4, 진데이터 익스프레셔니스트(Genedata Expressionist)(상표)를 사용하여 추가로 분석한다. 상기 CT 값을, 공지된 표적 농도를 가진 표준 곡선의 CT 결과를 기반으로 절대 표적 분자량(예를 들어 ng/㎕ 또는 분자/㎕)으로 전환시킬 수 있다. 대안적으로, 표적 량을 참조(= ΔCT)를 기반으로 하는 x-배 감소된 또는 증가된 양으로 보고할 수 있다. 낮은 ΔCT 값(작은 차이)은 높은 ΔCT(큰 차이)와 비교하여 참조에 대해 보다 높은 양의 표적을 가리킨다. 고정된 값(예를 들어 PCR 주기 수, 예를 들어 40)에서 ΔCT를 감하여 상기 ΔCT를 다시 계산하는 것이 적합하다. 그 결과는 표적 량(높은 값 = 높은 양)과 직접적인 상관관계가 있는 값이고 40-ΔCT 값으로 표시되고, 여기서 정수 1은 표적 량의 배가를 지칭한다(예를 들어 34의 값은 33의 값의 2배 만큼 많은 양을 가리킨다). 상기 시스템의 목적하는 재현성 및 정확도에 따라, 다수의 참조 분석을 패널화하거나 교정기의 ΔCT를 사용하여 샘플의 ΔCT를 재계산/정규화하는 것이 가능하다(1점 교정; 문헌[Pfaffl(2001), Nucleic Acid Res., 29(9):e45]). 특정 탐침에 대해 서로 다른 형광단을 사용함으로써 동일한 반응에서 서로 다른 표적 분석을 다중화하는 것도 가능하다. PCR 동안, 상기 다중화 중의 각 표적은 병렬로 증폭되지만, 다른 형광 방출을 사용하여 별도로 검출된다.
일부 실시태양에서, 40-ΔCT 값은 하기와 같이 계산된다: 40 - [환자 샘플의 각 생물마커(예를 들어, HLA-E, HLA-F 또는 HLA-G)의 CT - 환자 샘플의 참조 유전자(예를 들어 CALM2)의 CT](= 계산 방법 1). 하나 초과의 참조 유전자가 사용되는 경우, 40-ΔCT 값은 하기와 같이 계산된다: 40 - (환자 샘플의 각 생물마커의 CT - 환자 샘플의 선택된 참조 유전자의 평균 CT)(= 계산 방법 2). 대안적으로, 40-ΔΔCT 값을 사용할 수 있고, 여기서 40-ΔΔCT는 하기와 같이 계산될 수 있다: ΔΔCT = 40 - [(환자 샘플의 CT 생물마커 - 참조 샘플의 CT 생물마커) - (환자 샘플의 CT 참조 유전자 - 참조 샘플의 CT 참조 유전자)] (= 계산 방법 3); 예를 들어 40-ΔΔCT = 40 - [(CT HLA-G 환자 샘플 - CT HLA-G 참조 샘플) - (환자 샘플의 CT CALM2 - 참조 샘플의 CT CALM2)]. 일부 실시태양에서, CALM2가 참조 유전자로서 사용된다.
예를 들어, 생물마커의 상대 발현 수준은 40-ΔΔCT 값으로 제공되고, 이는 하기와 같이 계산된다: 40 - [(환자 샘플의 CT 생물마커 - 환자 샘플의 CT 참조 유전자) - (대조용 샘플의 CT 생물마커 - 대조용 샘플의 CT 참조 유전자)](= 계산 방법 4); 예를 들어 40-ΔΔCT = 40 - [(CT HLA-G 환자 샘플 - CT 평균 CombRef 환자 샘플) - (CT HLA-G 대조용 샘플 - CT 평균 CombRef 대조용 샘플)]. 일부 실시태양에서, 상기 CT는 중간 CT 값이다. 참조 유전자의 CT는 단일 참조 유전자의 CT 또는 둘 이상의 참조 유전자의 평균 CT(Mean CombRef로서 지칭됨)일 수 있다. 바람직하게는, 동일한 대조용 샘플(또한 교정기로서 지칭됨)이 모든 분석에 사용되고 동일한 RT-qPCR 또는 qPCR 결과를 생성시킨다. 일부 실시태양에서, 대조용 샘플은 생물마커 mRNA 또는 cDNA 또는 생물마커 앰플리콘 또는 생물마커 앰플리콘의 일부를 일정한 비율로 나타내는 세포주 RNA, 시험관 내 전사된 인공 RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오타이드의 등몰 혼합물이다. 일부 실시태양에서, CALM2 및/또는 B2M을 참조 유전자로 사용하고 양성 대조군(예를 들어 시험관내 전사된 인공 RNA)은 대조용 샘플(교정기)로 사용한다.
하나의 또 다른 예시적인 실시태양에서, 평균 컷오프 값은 계산 방법 4에 따라 40-ΔΔCT 값으로서 주어지고, 여기서 HLA-G에 대한 평균 컷오프 값은 40.10의 40-ΔΔCT 값이다.
일부 실시태양에서, 방법의 단계(예를 들어, 단계 (a), (b), (c) 및 (d))들을 무작위 순서로 수행한다. 바람직한 실시태양에서, 단계 (a)를 먼저, 즉 단계 (b), (c) 및 (d) 전에 수행한다. 일부 실시태양에서, 단계 (d)를 단계 (a), (b) 및 (c) 후에 수행한다. 일부 실시태양에서, 단계 (a)를 단계 (b) 전에 수행하고, 단계 (b)를 단계 (c) 전에 수행하고, 단계 (c)를 단계 (d) 전에 수행한다.
상기에 정의된 바와 같은 탐침을 바람직하게는, 예를 들어 형광 표지, 형광 소광 표지, 발광 표지, 방사성 표지, 효소 표지 및 이들의 조합 중에서 선택된 표지로 표지한다. 바람직하게는, 상기에 정의된 바와 같은 탐침은 형광 리포터 모이어티 및 형광 소광제 모이어티를 포함하는 이중-표지 탐침이다.
본 발명의 신규성은 방광암에서 HLA 기반 암 생물마커의 mRNA 기반 결정뿐만 아니라 하위유형의 알고리즘적 포함을 포함한다.
본 발명의 이러한 모든 신규의 태양은 본 발명의 RT-qPCR 기반 접근법 및 키트의 예후값에 기여한다. 실제로, 이러한 신규성은 특히 진행된 단계에서 환자의 분자 하위유형에서 보다 정확하고 의미 있는 HLA 분류를 제공하여, 궁극적으로 암에서 보다 개별화된 치료 결정을 위한 예후 도구를 제공한다.
본 발명을 하기의 실시예에 의해 추가로 예시하고, 이들 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 해석되지 않는다.
실시예
실시예 1: 역전사(RT) 정량적 PCR(RT-qPCR)에 의한 mRNA 발현 수준의 측정
RNA를 포르말린-고정된 파라핀-포매 조직(= FFPE 조직)으로부터 단리하였다. 보다 특히, 5 내지 10 ㎛ 컬의 FFPE 종양 조직으로부터 전체 RNA를 RNXtract(등록상표) 추출 키트(바이오엔테크 다이아그노스틱스 GmbH, 독일 마인츠 소재)를 사용하여 추출하고, 참조 유전자 CALM2의 단편의 실시간 형광 RT-qPCR에 의해 정성분석하였다. 일반적으로, 각각의 정성분석된 추출의 2.5 ㎕ RNA(대략 50-100 ng)를 하기에 기재하는 바와 같이 RT-qPCR에 의해 분석하였다.
RT-qPCR 방법에 의한 유전자 발현의 상세한 분석을 위해서, 관심 영역에 인접한 프라이머 및 그 사이를 하이브리드화하는 형광 표지된 탐침을 사용하였다. 표적-특이적인 프라이머 및 탐침을 NCBI 프라이머 설계 도구(www.ncbi.nlm.nih.go)를 사용하여 선택하였다. RNA-특이성 프라이머/탐침 서열을 사용하여, 엑손/엑손 경계에 걸쳐 프라이머/탐침 서열을 배치시킴으로써 RNA-특이성 측정이 가능하였다. 더욱 또한, 공지된 다형성을 갖는 서열 영역(SNP)에 결합하지 않는 프라이머/탐침을 선택하였다. 동일 유전자의 다수의 동형이 존재하는 경우에, 모든 관련 이어맞추기 변이체를 증폭시키는 프라이머를 선택하였다. 모든 프라이머 쌍을 통상적인 PCR 반응에 의해 특이성에 대해 검사하였다.
TaqMan(등록상표) 검증 실험을 수행하여 표적 및 대조용 증폭의 효율이 대략 동일함을 입증하였고, 이는 비교 ΔCT 방법에 의한 유전자 발현의 상대적인 정량분석에 전제조건이다. 생물학적 샘플내 관심 유전자의 발현 분석을 수행하기 위해서, 2개의 특정 분석 각각의 프라이머/탐침을 혼합함으로써 4x 듀플렉스 분석-혼합물을 제조하였다. CT 값의 별도의 검출을 위해서, 분석 탐침을 상이한 형광 탐침으로 변형시켰다. 각각의 4x 분석-믹스는 2 μM의 변형되지 않은 순방향 및 역방향 프라이머 및 1.2 μM의 탐침을 함유하였다. 각각의 반응에 대해서, FFPE 섹션(상기 참조)으로부터 추출된 2.5 ㎕ 전체 RNA를 96-웰-광학 반응 플레이트의 하나의 웰에서 2.5 ㎕ 분석-믹스, 2.5 ㎕ 효소-믹스 및 2.5 ㎕ 수와 혼합하였다. PCR 반응의 측정을 적합한 조건(5분 50℃, 1 주기; 20s 95℃, 1 주기; 15s 95℃; 1분 60℃, 40 주기)하에서 버산트 kPCR 사이클러(지멘스) 또는 라이트사이클러 480(로슈)으로 제조사의 설명에 따라 수행하였다. 지금까지 분류되지 않은 생물학적 샘플의 측정에 앞서, 예를 들어 세포주, 건강한 대조용 샘플, 한정된 분자 종양 하위유형의 샘플에 대한 대조용 실험을, 실험 조건의 표준화를 위해 사용할 수 있다.
실시예 2: DNA 서열에 의한 고전적 및 비-고전적 HLA 유전자의 비교
게놈 분석 및 서열 정렬을 UCSC 게놈 브라우저(https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)에 엑세스하고 HLA-A1(NM_002116.7), HLA-A2(NM_001242758.1), HLA-G(NM_002127.5), HLA-F1(NM_001098479.1), HLA-F2(NM_018950.2), HLA-F3(NM_001098478.1), HLA-J(NR_024240.1) 및 HLA-H의 추정 서열(NR_001434.4)의 게놈 서열을 다운로드하여 수행하였다. 초기 정렬 분석은 잠재적인 번역 개시 영역, 및 세포외 알파 도메인에서 막관통 영역으로의 잠재적인 이행에 집중하였다. HLA-H는 프레임이동을 야기하여, 엑손 4 중에 조기 정지 코돈을 생성시키는 엑손 4 중의 단일-염기-쌍 결실로 인한 위유전자인 것으로 생각된다(문헌[Chorney et al., 1990. Transcription analysis, physical mapping, and molecular characterization of a non-classical human leukocyte antigen class I gene. Mol. Cell. Biol. 10:243-253] 및 문헌[Zemmour et al., 1990. HLA-AR, an inactivated antigen-presenting locus related to HLA-A. J. Immunol. 144:3619-3629]). 위유전자의 이와 같은 정의는 돌연변이로 인한 그의 단백질 암호화 능력의 기능 상실에 의해 잠재적으로 정의된다. 그러나, 서열 분석은 5' 및 3' 단부에서 ATG의 주변 뉴클레오타이드가 코작 서열의 필요성에 따른다는 것을 밝혀내었다.
도 1은 잠재적인 번역 개시 부위에서 HLA-A1, -A2, -B, -E, -F1, -F2, -F3, -J, -G 및 HLA-H의 서열 정렬을 묘사한다. 잠재적인 개시 코돈은 검은색 틀로 강조된다.
도 2는 엑손 4에서 엑손 5에의 접합부에서의 HLA-A1, -A2, -B, -E, -F1, -F2, -F3, -J, -G 및 HLA-H의 서열 정렬을 묘사한다. 조기 정지 코돈을 갖는 서열은 노란색 배경으로 묘사된다.
앞서 기재한 바와 같이, HLA-H는 문헌에서 엑손 4 중의 조기 정지 코돈으로 인한 위유전자로서 정의되었다. 이들은 인프레임 이동을 일으키는 서열 GAC-CAG-ACC-CA- -CAC(단일 뉴클레오타이드 결실이 붉은색으로 강조되었다)를 식별하였다. 초르니(Chorney) 등의 서열 비교에 의해(도 2에서 노란색 배경에 의해 묘사됨), 연구자는 단일 염기쌍 결실(도 2에서 붉은색 배경에 의해 묘사됨)을 관찰할 수 없었다. 이러한 관찰은 HLA-H가 또한 완전길이 단백질이고 따라서 위유전자가 아니라는 가정으로 이어진다. 더욱 또한, 연구자는 엑손 5에서, 알파 3 도메인을 암호화하는 서열을 식별하였다. 단일 염기쌍 결실이 엑손 5의 단부에서 조기 정지 코돈인 경우가 있다 하더라도, 이는 HLA-H가 막관통 및 세포질 도메인이 없음을 의미할 것이다. HLA-G의 경우, 인트론 5에 조기 정지 코돈을 갖는 전사물 변이체는 용해성 동형 HLA-G5의 번역을 야기하는 것으로 공지되어 있다. 따라서 HLA-H는 용해성 HLA-G5의 용해성 동족일것이다. 용해성 HLA-G 형태는 활성 단백질이어서, 다양한 수용체, 예를 들어 백혈구 면역글로불린 유사 수용체 1 및 2(LILRB1 및 LILRB2), 살해 세포 면역글로불린-유사 수용체 2DL4(KIR2DL4) 및 CD8과의 상호작용을 통해 면역 세포 억제를 일으킨다(문헌[Rajagopalan, S. and E. Long, KIR2DL4 (CD158d): An activation receptor for HLA-G. Frontiers in Immunology, 2012. 3(258)] 및 문헌[Carosella, et al., Beyond the increasing complexity of the immunomodulatory HLA-G molecule. Blood, 2008. 111(10): 4862-70]).
문헌은 서열 ctc-acg-gcg-tg-의 단부에서 엑손 7 중의 제2 단일 뉴클레오타이드 결실을 명명하였다. 연구자는 엑손 8에서 이 서열을 식별하였고, 이 서열은 번역되지 않은 영역을 암호화하고 단백질 번역에 관련이 없다.
도 3은 엑손 8에서의 HLA-A1, -A2, -B, -E, -F1, -F2, -F3, -J, -G 및 HLA-H의 서열 정렬을 묘사한다. 조기 정지 코돈을 갖는 서열은 노란색 배경으로 묘사된다.
연구자는 또한 서열 정렬로부터의 두 번째 위유전자, HLA-J의 엑손 5에서 또한 초르니 등의 추정된 단일 염기 쌍 결실을 갖는 서열 GAC-CAG-ACC-CA-를 식별하였다. HLA-H와 HLA-J간의 서열 비교는 이들 두 위유전자가 RNA에 대해 69% 서열 상동성을 공유하고 아미노산 서열간에는 단지 20%만을 공유함을 밝혀내었다(표 3).
| HLA-H 및 HLA-J의 서열 상동성 | ||||||||
| RNA | 단백질 | |||||||
| HLA-H | HLA-J | 비 상동성 | 상동성 | HLA-H | HLA-J | 비 상동성 | 상동성 | |
| 엑손1 | 21 | 64 | 33% | 67% | ||||
| 엑손2 | 22 | 186 | 12% | 88% | 9 | 21 | 43% | 57% |
| 엑손3 | 41 | 270 | 15% | 85% | 27 | 90 | 30% | 70% |
| 엑손4 | 276 | 276 | 100% | 0% | 92 | 92 | 100% | 0% |
| 엑손5 | 26 | 278 | 9% | 91% | 82 | 92 | 89% | 11% |
| 엑손6 | 12 | 102 | 12% | 88% | 35 | 35 | 100% | 0% |
| 엑손7 | 3 | 47 | 6% | 94% | 16 | 16 | 100% | 0% |
| 엑손8 | 126 | 457 | 28% | 72% | 15 | 15 | 100% | 0% |
| 합 | 527 | 1680 | 31% | 69% | 276 | 346 | 80% | 20% |
표 4는 HLA-H와 HLA 부류 I 유전자(HLA-A, B, C), 비 고전적 HLA 부류 I 유전자(HLA-E, F 및 G) 및 추가의 위유전자(HLA-J, L, V, Y)간의 상동성을 요약한다. HLA-H RNA는 HLA 부류 I 유전자(HLA-A, B, C), 비 고전적 HLA 부류 I 유전자(HLA-E, F 및 G)에 77.4% 상동성이고, 22.6% 비 상동성이다. 단백질 서열을 고려하면, HLA-H는 고전적 및 비-고전적 HLA 부류 I 유전자(HLA-A1, A2, B, C, E, F1, F2, F3, G)에 대해 27.3% 비 상동성이고 HLA-J에 대해 58.8% 비 상동성이다.
| HLA-H mRNA 및 단백질 서열과 HLA 부류 I 유전자 및 위유전자와의 서열 상동성 및 비 상동성 퍼센트 | ||||
| HLA-H 단백질 | HLA-H mRNA | |||
| 상동성 [%] | 비 상동성 [%] | 상동성 [%] | 비 상동성 [%] | |
| HLA-A1 | 77.0 | 23.0 | 87.3 | 12.7 |
| HLA-A2 | 75.2 | 24.8 | 83.2 | 16.8 |
| HLA-B | 79.7 | 20.3 | 81.9 | 18.1 |
| HLA-C | 76.6 | 23.4 | 81.9 | 18.1 |
| HLA-E | 66.2 | 33.8 | 71.3 | 28.7 |
| HLA-F1 | 69.9 | 30.1 | 69.7 | 30.3 |
| HLA-F2 | 69.9 | 30.1 | 76.0 | 24.0 |
| HLA-F3 | 68.0 | 32.0 | 69.6 | 30.4 |
| HLA-G | 72.1 | 27.9 | 76.0 | 24.0 |
| HLA-J 프레임3 | 41.2 | 58.8 | 65.1 | 34.9 |
| HLA-L 프레임1 | 17.6 | 82.4 | 59.3 | 40.7 |
| HLA-V 프레임1 | 69.2 | 30.8 | 61.0 | 39.0 |
| HLA-Y (DEL) | 80.2 | 19.8 | 91.9 | 8.1 |
실시예 3: 면역요법 치료된 요로상피암 코호트에서 역전사(RT) 정량적 PCR(RT-qPCR)에 의한 HLA mRNA 발현 수준의 측정
2016년과 2018년 사이에 방광암과 상부 요로상피암을 포함하여 조직학적으로 확인된 요로상피암으로 새로 진단된 72명의 환자가 연구에 등록되었다. 72명의 환자의 초기 연구 모집단은, 생검 샘플이 적합하지 않은 6명의 환자 및 림프절 전이로 인한 5명의 환자를 제외한 후 61명으로 제한되었다. 요로상피암(UC) 코호트 내에서, 49명의 환자는 요로상피 방광암(UBC)을 앓았고 12명의 환자는 상부 요로상피 관암종을 앓았다. 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 아테졸리주맙이 승인된 지침에 따라 1차, 2차 및 3차 단일 치료로 투여되었다.
생존 분석을 위해서, 질병 특이성 생존(DSS)을 카플란 마이어 생존 추정 및 콕스 회귀 분석에 사용하였다. 완전한 생존 데이터를 61명의 환자로부터 입수할 수 있었다. 데이터 마감시에, 중간 DSS는 4.32개월이었다.
HLA 유전자 발현의 평가를 위한 유전자 특이적 TaqMan-기반 프라이머/탐침 세트를 사용하였다. RT-qPCR 방법에 의한 유전자 발현의 상세한 분석을 위해서, 관심 영역에 인접한 프라이머 및 그 사이를 하이브리드화하는 형광 표지된 탐침을 사용하였다. 표적-특이적인 프라이머 및 탐침을 NCBI 프라이머 설계 도구(www.ncbi.nlm.nih.go)를 사용하여 선택하였다. RNA-특이성 프라이머/탐침 서열을 사용하여, 엑손/엑손 경계에 걸쳐 프라이머/탐침 서열을 배치시킴으로써 RNA-특이성 측정이 가능하였다. 더욱 또한, 공지된 다형성을 갖는 서열 영역(SNP)에 결합하지 않는 프라이머/탐침을 선택하였다. 동일 유전자의 다수의 동형이 존재하는 경우에, 모든 관련된 또는 선택된 이어맞추기 변이체를 증폭시키는 프라이머를 적합한 대로 선택하였다. 모든 프라이머 쌍을 통상적인 PCR 반응에 의해 특이성에 대해 검사하였다. 상기 프라이머/탐침의 추가적인 최적화 후에, 표 5에 나열된 프라이머 및 탐침이 최상의 결과를 제공하였다. 이들 프라이머/탐침은 종래 기술로부터 공지된 프라이머/탐침보다, 예를 들어 특이성 및 증폭 효율면에서 우수하다. 샘플 RNA의 양을 표준화하기 위해서, CALM2를 참조 유전자로서 선택하였는데, 그 이유는 상기가 분석된 샘플에서 차등 조절되지 않기 때문이었다. 치료전 생검 또는 치료후 절제술을 위한 낮은 RNA 함량(즉 22 미만의 CALM2에 대한 원 CT 값)을 갖는 짝을 이룬 샘플은 제외되었다.
| 유전자 | 순방향 프라이머 | 탐침 | 역방향 프라이머 |
| HLA-A (MP779) | GTAACTTCTTCCTTCCCTATTAAAATTAGA (서열번호 1) |
TTTACTTTCTCAAATTCTTGCCATGAGAGGTTGATG (서열번호 2) |
TGGACTCTGGAAGGTTCTCATG (서열번호 3) |
| HLA-B/C (MP783) | CCATCTCTGTCTCAAATTCATGGT(서열번호 4) | CACTGAGCTGCAACTTCTTACTTCCCTAATGA (서열번호 5) |
CAGGTCTTTATTTGCTCTCTCAACTTC (서열번호 6) |
| HLA-G Ex3 (MP728) |
GGCCGGAGTATTGGGAAGA(서열번호 7) | CAAGGCCCACGCACAGACTGACA (서열번호 8) |
GCAGGGTCTGCAGGTTCATT (서열번호 9) |
| HLA-G Ex4 (MP730) |
CTGCGGCTCAGATCTCCAA(서열번호 10) | CGCAAGTGTGAGGCGGCCAAT (서열번호 11) |
CAGGTAGGCTCTCCTTTGTTCAG (서열번호 12) |
| HLA-G Ex5 (MP743) |
CACCACCCTGTCTTTGACTATGAG(서열번호 13) | ACCCTGAGGTGCTGGGCCCTG (서열번호 14) |
AGTATGATCTCCGCAGGGTAGAAG (서열번호 15) |
| HLA-G Ex6 (MP744) |
CATCCCCATCATGGGTATCG(서열번호 16) | TGCTGGCCTGGTTGTCCTTGCA (서열번호 17) |
CCGCAGCTCCAGTGACTACA (서열번호 18) |
| HLA-G Ex8 (MP747) |
GACCCTCTTCCTCATGCTGAAC(서열번호 19) | CATTCCTTCCCCAATCACCTTTCCTGTT (서열번호 20) |
CATCCCAGCCCCTTTTCTG (서열번호 21) |
| HLA-G Ex3-5' (MP757) |
TTCATCGCCATGGGCTACG(서열번호 22) | CGACACGCAGTTCGTGCGGTTC (서열번호 23) |
ATCCTCGGACACGCCGAGT (서열번호 24) |
| HLA-G Ex2/3 (MP779) | CCGAACCCTCTTCCTGCTGC(서열번호 25) | CGAGACCTGGGCGGGCTCCC (서열번호 26) |
GCGCTGAAATACCTCATGGA (서열번호 27) |
| HLA-H Ex 2/3 (MP802) |
GAGAGAACCTGCGGATCGC(서열번호 28) | AGCGAGGGCGGTTCTCACACCATG (서열번호 29) |
CCACGTCGCAGCCATACAT (서열번호 30) |
| HLA-H (MP803) |
TGGCCCTGACCCTGACCC(서열번호 31) | AGACCTGGGCGCGCTCCCAC (서열번호 32) |
CGGGCCGGGACATGGT (서열번호 33) |
| CALM2 | GAGCGAGCTGAGTGGTTGTG(서열번호 34) | TCGCGTCTCGGAAACCGGTAGC (서열번호 35) |
AGTCAGTTGGTCAGCCATGCT (서열번호 36) |
TaqMan(등록상표) 검증 실험을 수행하여 표적 및 대조용 증폭의 효율이 대략 동일함을 입증하였고, 이는 비교 ΔCT 방법에 의한 유전자 발현의 상대적인 정량분석에 전제조건이다. 생물학적 샘플내 관심 유전자의 발현 분석을 수행하기 위해서, 2개의 특정 분석 각각의 프라이머/탐침을 혼합함으로써 4x 듀플렉스 분석-혼합물을 제조하였다. CT 값의 별도의 검출을 위해서, 분석 탐침을 상이한 형광 탐침으로 변형시켰다. 각각의 4x 분석-믹스는 2 μM의 변형되지 않은 순방향 및 역방향 프라이머 및 1.2 μM의 탐침을 함유하였다. 각각의 반응에 대해서, FFPE 섹션(상기 참조)으로부터 추출된 2.5 ㎕ 전체 RNA를 96-웰-광학 반응 플레이트의 하나의 웰에서 2.5 ㎕ 분석-믹스, 2.5 ㎕ 효소-믹스 및 2.5 ㎕ 수와 혼합하였다. PCR 반응의 측정을 적합한 조건(5분 50℃, 1 주기; 20s 95℃, 1 주기; 15s 95℃; 1분 60℃, 40 주기)하에서 버산트 kPCR 사이클러(지멘스) 또는 라이트사이클러 480(로슈)으로 제조사의 설명에 따라 수행하였다.
RT-qPCR에 의한 UC 코호트에서의 관내강 및 기저 하위유형의 측정은 유사한 범위에서 19 내지 48의 40-DCT 값 범위의 KRT5 및 KRT20의 넓은 동적 범위를 밝혀내었다. PD-1 및 PD-L1 mRNA 발현에 대한 동적 범위는 2개의 mRNA 분석 모두에 대해서 19 내지 41의 범위이다. FGFR 유전자에 대한 동적 범위는 FGFR 패밀리내에서 다소 개별적이다. FGFR1에 대한 동적 범위는 29 내지 37의 4-DCT 값의 범위이고, FGFR2의 경우 19 내지 39의 40-DCT 값의 범위이고, FGFR3의 경우 19 내지 43의 범위이고, FGFR4의 경우 19 내지 36의 40-DCT 값의 범위이다.
도 4는 근육 침습성 방광암 환자(n=61)의 FFPE 조직으로부터의 RT-qPCR에 의해 측정된 바와 같은 관내강 및 기저 하위유형 마커, 체크포인트 표적 유전자 및 FGFR1 내지 4 유전자 발현의 데이터 분포를 묘사한다.
스피어만 상관관계는 관내강 요로상피암 세포 유형(KRT20)내 FGFR 수용체 2(p=0.0008) 및 3(p=0.0066)의 높은 유의수준의 공-발현을 밝혀내었다. 기저 유사 요로상피암 사례의 경우에 어떠한 FGFR 유전자의 현저한 상향조절도 관찰할 수 없었다. 추가로, FGFR2 및 FGFR3 발현은 낮은 PD-1(p=0.02554) 및 PD-L1(p=0.0074) mRNA 발현과 유의수준으로 연관되었다. 그러나, 체크포인트 마커 PD-1(p=0.0004) 및 PD-L1(p=0.0452)은 기저 유사 요로상피암 하위유형(KRT5)에서 높은 유의수준의 발현을 보였다. 높은 PD-1 및 PD-L1 mRNA 발현은 모두 앞서 기재된(문헌[Eckstein et al., Oncotarget 2018]) 종양 조직으로의 면역세포의 침윤과 연관된다.
도 5는 근육 침습성 방광암 환자(n=61)의 조직으로부터의 RT-qPCR에 의해 측정된 바와 같은 관내강 및 기저 하위유형 마커, 체크포인트 표적 유전자 및 FGFR1 내지 4 유전자 mRNA 발현의 유전자간 스피어만 상관관계를 묘사한다.
관내강 및 기저 마커, PD-1, PD-L1 및 FGFR 패밀리의 mRNA 발현 분석 외에, 고전적 및 비 고전적 HLA의 발현 프로파일을 수행하였다.
도 6은 근육 침습성 방광암 환자(n=61)의 FFPE 조직으로부터의 RT-qPCR에 의해 측정된 바와 같은 HLA 유전자 mRNA 발현의 유전자간 스피어만 상관관계를 묘사한다.
도 6에 도시된 바와 같이, 다양한 HLA 유전자의 유전자간 상관관계는 복잡한 패턴을 나타낸다. 일례로서, HLA-J 발현은 비-고전적 HLA-G 또는 고전적 HLA-A 또는 HLA-B/C 유전자 발현과, 각각 0.34, 0.16 및 0.27 범위의 스피어만 상관성 계수로 단지 보통으로 상관된다. 유사하게, HLA-H Ex1/2 분석에 의해 예시되는 바와 같은 다른 위유전자 HLA-H는 고전적 및 비-고전적 HLA, 예를 들어 HLA-G, HLA-A, HLA-B/C, HLA-J(r=0.23993, r=0.2376, r=0.3373, r=0.1550)와 단지 미미하게 또는 보통으로 상관된다. 중요하게도, 다른 HLA 유전자 단편과 비교시 HLA-H ex1/2 대 HLA-H ex2/3과 같이 하나의 HLA의 상관성 계수의 실질적인 차이가 존재한다. 이는 임상적 관련성의 유전자내- 및 유전자간 상호작용을 초래하는 차등적인 이어맞추기 사건을 암시한다.
면역요법 중인 암 환자의 질병 특이성 생존에 영향을 미치는 HLA 유전자 발현의 유전자간 및 유전자내 상호작용의 일례로서, 우리는 HLA-A와 함께 HLA-G의 mRNA 발현을 분석하였다. 상기 두 유전자는 모두, 엑손 7 중의 번역 정지 뒤에 HLA 유전자의 필적하는 이종 부분 중의 특유의 영역을 결정하는 고도로 특이적인 분석에 의해 결정되었다.
도 7은 RT-qPCR 분석에 의해 정량분석된 바와 같은 HLA-A 엑손 8, HLA-G 엑손 8 및 HLA-G 엑손 5 mRNA 발현의 조합에 의한 계층화에 기반한 근육 침습성 방광암 환자(n=61)의 FFPE 조직으로부터의 질병 특이성 생존(DSS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다. 상대적인 mRNA 발현을 참조 유전자로서 CALM2를 사용하여 40-DCT 방법에 의해 측정한다. 낮은 HLA-G 엑손 8 mRNA(<28.43) 및 낮은 HLA-G 엑손 5 mRNA(<37.11) 발현을 나타내는 종양을 갖는 환자가 최고의 생존(회색, 실선)을 나타내었다. HLA-G 엑손 8 mRNA는 낮지만(<28.43) 높은 HLA-G 엑손 5 mRNA(>37.11) 발현을 나타내는 종양을 갖는 환자는 두 번째로 낮은 생존(회색, 점선)을 나타내었다. 높은 HLA-G 엑손 8 mRNA(>28.43) 및 높은 HLA-A 엑손 8 mRNA(>35.26)를 나타내는 종양을 갖는 환자는 두 번째로 높은 생존(검은색, 점선)을 나타내었다. HLA-G 엑손 8 mRNA는 높지만(>28.43)는 높지만 낮은 HLA-A 엑손 8 mRNA(<35.26) 발현을 나타내는 종양을 갖는 환자는 가장 낮은 생존(검은색, 실선)을 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 선행 화학요법 실패 후에 면역 종양학 약물로 치료중인 요로상피암 환자는, HLA-G 엑손 8이 발현되지만 HLA-A 엑손 8은 발현되지 않는 경우에(파란색 곡선과 금색 곡선 비교) 가장 낮은 생존을 갖는다. 이러한 데이터는 환자가 면역-종양학("IO") 치료를 받고 있을 때 고전적 HLA의 존재가 달리 비-고전적 HLA의 치명적인 발현을 보상할 수 있음을 나타낸다. 이것은 또한 체크포인트 억제를 표적화하는 면역 조절 약물(예를 들어 항-PD1/항 PDL1)이 적어도 부분적으로 온전한 고전적 HLA 기능을 갖는 종양에서 더 효율적인 것으로 보인다는 것을 나타낸다. 더욱이, 이러한 데이터는, 면역 요법의 효과를 최대화하고 화학요법 및 면역요법의 조합과 관련된 잠재적 위험성의 위험을 줄이기 위한 전제조건인, 개별적인 HLA 영역의 예후값을 지정하는 하나 초과의 HLA 유전자의 조합된 결정의 우수성을 입증한다.
도 8은 RT-qPCR 분석에 의해 정량분석된 바와 같은 HLA-A 엑손 8 및 HLA-G 엑손 8 mRNA 발현의 유전자간 조합에 의한 계층화에 기반한 근육 침습성 방광암 환자(n=61)의 FFPE 조직으로부터의 질병 특이성 생존(DSS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다. 상대적인 mRNA 발현을 참조 유전자로서 CALM2를 사용하여 40-DCT 방법에 의해 측정한다. 높은 HLA-G 엑손 8 mRNA(>28.43) 및 높은 HLA-A 엑손 8 mRNA(>35.26) 발현을 나타내는 종양을 갖는 환자가 두 번째로 높은 생존(검은색, 점선)을 나타내었다. HLA-G 엑손 8 mRNA는 높지만(>28.43) 낮은 HLA-G 엑손 8 mRNA(<35.26) 발현을 나타내는 종양을 갖는 환자는 가장 낮은 생존(검은색, 실선)을 나타내었다.
도 9는 RT-qPCR 분석에 의해 정량분석된 바와 같은 HLA-G 엑손 8 및 엑손 5 mRNA 발현의 유전자내 조합에 의한 계층화에 기반한 근육 침습성 방광암 환자(n=61)의 FFPE 조직으로부터의 질병 특이성 생존(DSS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다. 상대적인 mRNA 발현을 참조 유전자로서 CALM2를 사용하여 40-DCT 방법에 의해 측정한다. 낮은 HLA-G 엑손 8 mRNA(<28.43) 및 낮은 HLA-A 엑손 5 mRNA(<37.11) 발현을 나타내는 종양을 갖는 환자가 가장 높은 생존(회색, 실선)을 나타내었다. HLA-G 엑손 8 mRNA는 낮지만(<28.43) 높은 HLA-G 엑손 5 mRNA(>37.11) 발현을 나타내는 종양을 갖는 환자는 낮은 생존(회색, 점선)을 나타내었다.
면역요법 중인 암 환자의 질병 특이성 생존에 영향을 미치는 HLA 유전자 발현의 유전자내 상호작용의 일례로서, 우리는 RT-qPCR에 의해 HLA-G Ex8 및 HLA-G Ex5의 HLA-G 발현을 분석하였다. 상기 HLA-G Ex8을 측정함으로써, 유전자의 3' 단부(C-말단 뒤의)의 번역되지 않은 엑손, 세포질 단백질 단부를 정량분석한다. 이는 예를 들어 다양한 세포외 알파 도메인 및/또는 막관통 영역뿐만 아니라 세포질 부분을 포함하거나 제외할 수 있는 다수의 HLA-G 이어맞추기 변이체의 특유의 측정을 가능하게 한다. 이러한 종류의 HLA-G 측정은 단백질 수준의 항체에 의해 가능하지 않고 고도로 특이적인 HLA-G 평가를 나타낸다. 알파 3 도메인과 유사하게, HLA-G Ex5의 발현과 관련하여 상기 다수의 HLA-G 이어맞추기 변이체 발현을 설정하는 경우, 면역-종양학 치료("IO")의 개시로부터 사망까지의 시간을 고려할 때, 2개의 HLA-G mRNA 단편의 조합을 정량분석함으로써 우수한 또는 열등한 질병 특이성 생존을 갖는 환자의 상이한 예후 하위그룹을 구별할 수 있음은 자명해진다. 낮은 발현의 HLA-G 엑손 8 함유 이어맞추기 변이체를 갖지만, 동시에 보다 높은 수준의 HLA-G 엑손 5 함유 단편을 갖는 환자는 진행된 화학요법 불응성 상황에서 IO 치료가 시작되었음에도 불구하고 질병 특이성 사망의 위험이 더 높다.
조합적인 HLA 진단의 우수성을 입증하기 위해서, 단일 유전자 측정의 예후값을 비교하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이, HLA-G 엑손 8 단독의 측정은 또한 일반적인 예후값(p=0.0359)을 갖는다. 그러나 도 7에 도시된 바와 같이, HLA-A 엑손 8의 높은 발현을 나타내는 동시에 높은 단일 유전자 HLA-G 엑손 8 mRNA 발현의 "나쁜 예후" 그룹에 다수의 환자가 존재한다(HLA-A 엑손 8이 높은 저 위험 n=20, 높은 HLA-G 엑손 8 mRNA 발현에 근거하여 "고 위험" n=33). 따라서 "나쁜 예후" 그룹의 환자의 거의 2/3가 HLA 유전자 조합에 대해 보다 정확한 조직 진단을 수행할 때 추가적인 치료가 할애될 수 있다.
도 10은 RT-qPCR 분석에 의해 정량분석된 바와 같은 오직 HLA-G 엑손 8 및 엑손 5 mRNA 발현만의 단일 유전자 측정에 의한 계층화에 기반한 근육 침습성 방광암 환자(n=61)의 FFPE 조직으로부터의 질병 특이성 생존(DSS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다. 상대적인 mRNA 발현을 참조 유전자로서 CALM2를 사용하여 40-DCT 방법에 의해 측정한다. 높은 HLA-G 엑손 8 mRNA(>28.43) 및 높은 HLA-A 엑손 8 mRNA(<28.43) 발현을 나타내는 종양을 갖는 환자가 양호한 생존(회색, 점선)을 나타내었다. 높은 HLA-G 엑손 8 mRNA(>28.43)를 나타내는 종양을 갖는 환자는 낮은 생존(검은색, 실선)을 나타내었다.
실시예 4: 신보조 치료된 난소암 환자 코호트에서 역전사(RT) 정량적 PCR(RT-qPCR)에 의한 HLA 센스 및 HLA 안티센스 mRNA 발현 수준의 측정
추가로, 발명자는 하나보다 많은 HLA 그룹 유전자 서열의 조합적인 사용을 또한 방광암과 별개의 다른 유형의 종양, 예를 들어 부인과암, 특히 난소암에도 적용할 수 있는지의 여부를 측정하였다. 또한, 발명자는 HLA 그룹 안티센스 발현을 갖는 HLA 그룹 유전자만을 조합하여 사용하여 암에서의 결과를 예측할 수 있는지의 여부를 결정하였다. 더욱이, 발명자는 HLA 센스 및 안티센스 조합을 사용하여 면역-종양학 치료와 별개의 치료학적 섭생, 예를 들어 화학요법 및/또는 호르몬요법에 대한 반응/비 반응을 예측할 수 있는지의 여부를 평가하였다.
최적의 선행 수술에 부적합한, 조직학적으로 확인된 FIGO 병기 III-IV 상피 난소 또는 복막 암종을 갖고, 신보조 화학 요법의 후보로 새로 진단된 45명의 환자(상기 암종은 또한 본원에서 하기에 난소암으로서 지칭된다)가 2004년 9월과 2007년 12월 사이에 연구에 등록되었다. 기타 포함 기준은 18세 초과, 백금 기반 화학요법에 적합한 혈액, 신장, 간 및 심장 기능이었다. 제외 기준은 카르노프스키(Karnofsky) 수행 상태(KPS) 70% 미만, 다른 악성 종양의 병력 및 수술 금기였다. 최적의 용적축소 수술의 가능성은 개복 복강경에 의해 기준선에서 제외되었다. 45명의 환자의 초기 연구 모집단은, 생검 샘플이 미세배열 분석에 적합하지 않은 9명의 환자와 조직학적 교정 후 복막 중피종 진단으로 부적격으로 판명된 1명의 환자를 제외하고 35명으로 제한되었다. 카보플라틴 AUC 5 및 패클리탁셀 175 ㎎/㎡ Q3의 표준 요법을 3주마다 3시간에 걸쳐 6주기 동안 신보조 치료로서 투여하였다. 75세 이상 3명의 환자와 수행 상태가 좋지 않은 1명의 환자(KPS 70%)에서 단일-제 카보플라틴이 병용 화학요법보다 선호되었다.
조직병리학적 반응을 수술 샘플 분석과 함께 수술 후에 평가하였다. 현재까지 난소암에서 신보조 화학요법 후 치료 반응을 설명하기 위한 조직병리학적 기준은 확고하게 확립되지 않았다. 난소(문헌[Le et al. 2007, Sassen et al. 2007]) 및 유방암(문헌[Ogston et al. 2003])의 1차 화학요법에 대한 반응에 관한 문헌에 따르면, 완전한 병리학적 반응은 수술 시편에 암세포가 없고, 매우 우수한 부분 관해는 작은 클러스터(<1 ㎝) 또는 개별 암세포의 지속성 및 수술 후 육안으로 보이는 잔류물이 없는 것으로 간주되었다. 부분적 병리적 관해는 수술 시 종양 크기가 30% 내지 90% 감소한 것으로 정의된 반면, 안정 질환은 초기 진단 복강경과 비교하여 종양 크기 감소가 없거나 수술 시 30% 미만으로 감소하는 것으로 정의되었다. 완전하고 매우 우수한 부분 관해가 있는 환자만이 병리학적 반응자로 간주되었고 다른 모든 경우는 병리학적 무반응자로 간주되었다. 생존 분석의 경우, 초기 진단에서 진행까지(PFS) 또는 사망까지의 시간(OS) 또는 진행에서 사망까지의 시간(PDT)이 카플란 마이어 생존 추정 및 콕스 회귀 분석에 사용되었다. 40명의 환자로부터 완전한 생존 데이터가 제공되었다. 데이터 마감 시점에서 중간 PFS는 14.7개월이었고 중간 OS는 33.5개월로, 이는 연구 시작 시점에서 질병의 매우 진행된 단계를 감안할 때 높은 수치이다(절제 불가능 FIGO III - IV).
mRNA 검출을 위해서, 수집된 조직을 급속 동결하고 분석할 때까지 액체 질소에 보관하였다. 약 20-100 ㎎의 동결된 난소 종양 조직을 액체 질소에서 분쇄하였다. RNA를 상업적인 키트(퀴아겐(Qiagen))를 사용하여 추출하였고, RNA 무결성을 에이질런트 2100 바이오어낼라이저(Bioanalyzer)(에이질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies), 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)에서 평가하였고, cDNA는 인비트로젠(Invitrogen) 키트(인비트로젠 코포레이션(Invitrogen Corp.))를 사용하여 1 ㎎의 전체 RNA로부터 합성되고 달리 어딘가에 기재된 바와 같이(Ihnen et al. 2008) 애피메트릭스(Affymetrix) HG-U133A 미세배열(애피메트릭스 인코포레이티드(Affymetrix Inc.), 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재) 상에서 분석되었다.
검증을 목적으로, RT-qPCR을 독립적인 기술적 접근에 의해 배열 데이터를 검증하기 위해 상술한 바와 동일한 신선한 조직 생검으로부터 단리된 전체 RNA에 적용하였다. HLA-F 또는 HLA-F AS의 발현 평가를 위한 유전자 특이적인 TaqMan-기반 프라이머/탐침 세트를 사용하였다. RT-qPCR 방법에 의한 유전자 발현의 상세한 분석을 위해, 관심 영역에 인접한 프라이머 및 그 사이를 하이브리드화하는 형광 표지된 탐침을 사용하였다. 표적-특이적인 프라이머 및 탐침을 NCBI 프라이머 설계 도구(www.ncbi.nlm.nih.go)를 사용하여 선택하였다. RNA-특이성 프라이머/탐침 서열을 사용하여, 엑손/엑손 경계에 걸쳐 프라이머/탐침 서열을 배치시킴으로써 RNA-특이성 측정이 가능하였다. 더욱 또한, 공지된 다형성을 갖는 서열 영역(SNP)에 결합하지 않는 프라이머/탐침을 선택하였다. 동일 유전자의 다수의 동형이 존재하는 경우에, 모든 관련된 또는 선택된 이어맞추기 변이체를 증폭시키는 프라이머를 적합한 대로 선택하였다. 모든 프라이머 쌍을 통상적인 PCR 반응에 의해 특이성에 대해 검사하였다. 상기 프라이머/탐침의 추가적인 최적화 후에, 표 6에 나열된 프라이머 및 탐침이 최상의 결과를 제공하였다. 이들 프라이머/탐침은 종래 기술로부터 공지된 프라이머/탐침보다, 예를 들어 특이성 및 증폭 효율면에서 우수하다. 샘플 RNA의 양을 표준화하기 위해서, CALM2를 참조 유전자로서 선택하였는데, 그 이유는 상기가 분석된 샘플에서 차등 조절되지 않기 때문이었다. 치료전 생검 또는 치료후 절제술을 위한 낮은 RNA 함량(즉 22 미만의 CALM2에 대한 원 CT 값)을 갖는 짝을 이룬 샘플은 제외되었다.
| 유전자 | NM-Nr | 순방향 프라이머 | 탐침 | 역방향 프라이머 |
| HLA-F2+3 (MP781) |
NM_018950+ NM_001098478 |
TGTGAGACAGCTTCCTTGTGTG (서열번호 37) |
AATTCTGCTACATTGATATCTTGCTTCTCAGTCC (서열번호 38) |
TATGTATGTTCGTGAGGCACAAGTG (서열번호 39) |
| HLA-F1(MP782) | NM_001098479 | CTTTGGCTTCGGCTTTAGGA (서열번호 40) |
CTTCGTTCTTGGCACCATCTTATGAAAAGGGT (서열번호 41) |
CATGGGTCTTGCAACTTACTTTAGAAT (서열번호 42) |
| HLA-F AS1(MP839) | NR_026972 | CCAAGAAGGCAGTGTTGAAAGAT (서열번호 43) |
ATCCACATGTCACCCACCTTCCGG (서열번호 44) |
GGGTGCTCTTCCAAGGATATTTG (서열번호 45) |
| HLA-F AS1(MP840) | NR_026972 | AGGATTGCGGCCTGTTG (서열번호 46) |
AGAGTAGTGTCTTGGGCCCCAGCTGA (서열번호 47) |
CAGGGCATTGGATGTTGATATTC (서열번호 48) |
| HLA-F AS1(MP841) | NR_026972 | ACTCCCATGCAGAGAAGAAGCTC (서열번호 49) |
CACCTGTGGAGAGAGGATTGCGGC (서열번호 50) |
CTGGGGCCCAAGACACTACTC (서열번호 51) |
| HLA-F3 spez. (MP842) | NM_001098478 | TGCTCCGCAGATACTTGGAGAAT (서열번호 52) |
CTACAGCGC GCAGAGCAGT CTCCC (서열번호 53) |
GCCAGCAACGATGCCCAC (서열번호 54) |
| HLA-F1 spez. (MP843) | NM_001098479 | TCAGATAGAAACAGAGGGAGCTACTCT (서열번호 55) |
CTGCAGCCTACTCAGTGGTCAGCGG (서열번호 56) |
GAGAAATAAGCTTGACCACCATGTTA (서열번호 57) |
| HLA-F2 (+1) spez. (MP844) | NM_018950 | TGGAGTTGCTCCGCAGATACT (서열번호 58) |
CCTTTGGAGGATCTGCGCGCTG (서열번호 59) |
AGATGGGGTGGTGGGCA (서열번호 60) |
| HLA-F2 (+3) spez. (MP845) | NM_018950 | TCAGATAGAAACAGAGGGAGCTACTC (서열번호 61) |
CAGGCTGCAGTGTGAGACAGCTTCCTTG (서열번호 62) |
TTTATGTATGTTCGTGAGGCACAA (서열번호 63) |
| HLA-F3 spez. (MP846) | NM_001098478 | AGGAATATGCAGAGGAGTTCAGGA (서열번호 64) |
AGTATCTGCGGAGCAACTCCAGGCACTC (서열번호 65) |
GACTGCTCTGCGCGCTGT (서열번호 66) |
| HLA-F2 (+1) spez. (MP850) | NM_001098478 | AGGAATATGCAGAGGAGTTCAGGA (서열번호 67) |
AGTATCTGCGGAGCAACTCCAGGCACTC (서열번호 68) |
GGAGGATCTGCGCGCTGT (서열번호 69) |
TaqMan(등록상표) 검증 실험을 수행하여 표적 및 대조용 증폭의 효율이 대략 동일함을 입증하였고, 이는 비교 ΔCT 방법에 의한 유전자 발현의 상대적인 정량분석에 전제조건이다. 생물학적 샘플내 관심 유전자의 발현 분석을 수행하기 위해서, 2개의 특정 분석 각각의 프라이머/탐침을 혼합함으로써 4x 듀플렉스 분석-혼합물을 제조하였다. CT 값의 별도의 검출을 위해서, 분석 탐침을 상이한 형광 탐침으로 변형시켰다. 각각의 4x 분석-믹스는 2 μM의 변형되지 않은 순방향 및 역방향 프라이머 및 1.2 μM의 탐침을 함유하였다. 각각의 반응에 대해서, FFPE 섹션(상기 참조)으로부터 추출된 2.5 ㎕ 전체 RNA를 96-웰-광학 반응 플레이트의 하나의 웰에서 2.5 ㎕ 분석믹스, 2.5 ㎕ 효소-믹스 및 2.5 ㎕ 수와 혼합하였다. PCR 반응의 측정을 적합한 조건(5분 50℃, 1 주기; 20s 95℃, 1 주기; 15s 95℃; 1분 60℃, 40 주기)하에서 버산트 qPCR 사이클러(지멘스) 또는 라이트사이클러 480(로슈)으로 제조사의 설명에 따라 수행하였다.
도 11은 RT-qPCR에 의해 측정된 바와 같은 HLA-F 동형 및 안티센스 HLA-F 발현의 상대적인 mRNA 발현(40-DCT)의 데이터 분포를 묘사한다. 상기 도면은 HLA-F에 대해 예시된 바와 같은 HLA 유전자의 한정된 센스 및 안티센스 영역의 상대적인 mRNA 발현 수준을 묘사한다. 3개의 공지된 HLA-F 동형 HLA-F1, HLA-F2 및 HLA-F3뿐만 아니라, HLA-안티센스 동형 AS1 및 AS2의 엑손을, 핵산 추출물의 DNAse 절단 후에 RT-qPCR에 의해 측정하였다. 흥미롭게도 상이한 HLA-F AS 영역의 발현 수준은 현저하게 상이하였고, 이때 HLA-F AS1 엑손 6 발현은 37.88의 신보조 화학요법 전 중간 40-DCT에 의해 가장 높았다. 더욱이, 동형 비교의 감산 분석은 난소암 샘플의 치료전 생검에서 HLA-F2 및 HLA-F3의 특히 높은 발현을 밝혀냈다.
HLA-F 발현은 이전에 발표된 호르몬 의존성 관내강 및 호르몬 비의존성 난소암으로의 분자 하위유형 분류의 상황에서 설정되었다(문헌[Zamagni et al. Oestrogen receptor 1 mRNA is a prognostic factor in ovarian cancer patients treated with neo-adjuvant chemotherapy: determination by array and kinetic PCR in fresh tissue biopsies. ERC 2009]). 상기 목적을 위해서 ESR1, HLA-F3 및 HLA_F AS1 엑손 6의 mRNA 발현을 결정 트리 모델, 유전자 비율 및 선형 조합을 형성시켜 조합하였다.
도 12는 RT-qPCR에 의해 측정된 바와 같은 ESR1, HLA-F3 및 HLA-F AS1 발현의 상대적인 mRNA 발현(40-DCT)의 데이터 분포를 묘사한다.
HLA-F3은 항원 제시를 위한 단백질 홈을 제공하는 펩티드의 형성을 위한 세포외 알파 1 및 알파 2 도메인을 보유하지만 T-세포 활성화 또는 자연살해세포와 같은 면역 세포와의 상호작용을 위한 알파 3 도메인은 없는 비-고전적 MHC I 분자이다. HLA-F 동형의 모든 공지된 동형과 마찬가지로 HLA-F3도 또한 막관통 도메인을 함유하고 따라서 면역 세포 상호작용을 위해 세포 표면에 존재하는 것으로 생각된다.
HLA-F3 mRNA 발현의 예측값은 종점으로서 무진행 생존에 대한 분할 시험에 의해 시험되었다.
도 13은 무진행 생존을 예측하기 위해 RT-qPCR에 의해 측정된 바와 같은 신보조적으로 치료된 난소 암 환자의 치료-전 생검 샘플에서 HLA-F3 mRNA 발현에 대한 분할 시험을 묘사한다.
도 13에 도시된 바와 같이, 치료 전 HLA-F3의 중간 발현에 가까운 컷오프(DCT 34.94)는 신보조 난소암 코호트를 2개의 동일한 크기의 그룹으로 나누었고, 이때 HLA-F3의 현저하게 상이한 중간 생존 및 높은 발현은 연장된 생존(1.392일의 무진행 생존) 대 HLA-F3의 낮은 발현 시의 감소된 생존 (400일의 무진행 생존)과 연관된다.
도 14는 진행된 난소암 환자(n=27)의 신선한 조직으로부터의 RT-qPCR에 의해 정량분석된 바와 같은 오직 HLA-F3만의 단일 유전자 측정에 의한 계층화에 기반한 무진행 생존(PFS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다. 상대적인 mRNA 발현을 참조 유전자로서 CALM2를 사용하여 40-DCT 방법에 의해 측정한다. 높은 HLA-F3 mRNA 발현(>=34.94)을 나타내는 종양을 갖는 환자가 양호한 생존(검은색, 실선)을 나타내었다. 낮은 HLA-F3 mRNA 발현(<34.94)을 나타내는 종양을 갖는 환자는 낮은 생존(검은색, 파선)을 나타내었다.
카플란 마이어 분석은 HLA-F3 mRNA 발현에 의해 생존 예측의 중요성을 입증하였다. 도 14에 묘사된 바와 같이, 원발 난소암 조직에서 높은 HLA-F3 mRNA 발현을 나타내는 환자는 28.5 개월의 중간 무진행 생존을 갖는 반면, 낮은 HLA-F3 mRNA 발현을 갖는 환자는 12.5 개월의 감소된 중간 무진행 생존을 나타내었다.
유사하게, 카플란 마이어 방법에 의한 전체 생존 분석은 HLA-F3 mRNA에 기반하여 계층화시 현저한 생존 차이를 나타냈다. 도 14에 묘사된 바와 같이, 원발 난소암 조직에서 높은 HLA-F3 mRNA 발현을 나타내는 환자는 52.5 개월의 중간 전체 생존을 갖는 반면, 낮은 HLA-F3 mRNA 발현을 갖는 환자는 22.9 개월의 감소된 중간 전체 생존을 나타내었다.
도 15는 진행된 난소암 환자(n=27)의 신선한 조직으로부터의 RT-qPCR에 의해 정량분석된 바와 같은 오직 HLA-F3만의 단일 유전자 측정에 의한 계층화에 기반한 전체 생존(OS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다. 상대적인 mRNA 발현을 참조 유전자로서 CALM2를 사용하여 40-DCT 방법에 의해 측정한다. 높은 HLA-F3 mRNA 발현(>=34.94)을 나타내는 종양을 갖는 환자가 양호한 생존(검은색, 실선)을 나타내었다. 낮은 HLA-F3 mRNA 발현(<34.94)을 나타내는 종양을 갖는 환자는 낮은 생존(검은색, 파선)을 나타내었다.
등급, FIGO 병기 및 원발 부위(난소 대 복막)와 같은 임상적 매개변수에 대해 조절시, 높고 낮은 mRNA 발현으로의 mRNA 계층화는 여전히 6.14의 L-R 카이2 값(p=0.0132) 및 0.22의 위험비와 함께 무진행 생존 예측을 위한 독립적인 인자인 채로 있는 반면, 모든 다른 임상적 인자는 유의수준이 아니었다.
도 15는 등급, FIGO 병기, 원발 부위 및 HLA-F3 mRNA 발현을 포함한 콕스 비례 위험 모델을 사용하는 PFS에 대한 다변량 분석에 기반한다. 등급, FIGO 병기 및 원발 부위(난소 대 복막)와 같은 임상적 매개변수에 대해 전체 생존 예측 조절시, 높고 낮은 mRNA 발현으로의 mRNA 계층화는 여전히 3.19의 L-R 카이2 값(p=0.0441) 및 0.31의 위험비와 함께 무진행 생존 예측을 위한 독립적인 인자인 채로 있는 반면, 모든 다른 임상적 인자는 유의수준이 아니었다.
도 16은 등급, FIGO 단계, 원발 부위 및 HLA-F3 mRNA 발현을 포함한 콕스 비례 위험 모델을 사용한 OS에 대한 다변량 분석을 묘사한다.
다음 단계로서, HLA-F3 발현을, ESR1 mRNA 수준을 호르몬 의존적인 및 호르몬 독립적인 난소 암종으로 구별함으로써 분자 하위유형의 상황으로 설정하였다. 37.75인 40-DCT 값을 사용한 ESR1 mRNA 계층화는, ERS1 음성이고 대략 15.72 개월의 중간 무진행 생존을 갖는 난소암의 37%를, 36.47 개월의 중간 무진행 생존을 갖는 모든 난소암 환자의 63%를 차지하는 ESR1 양성 난소암과 구별하였다(도 17).
도 17은 무진행 생존을 예측하기 위해 RT-qPCR에 의해 측정된, 신보조적으로 치료된 난소 암 환자의 치료-전 생검 샘플에서 ESR1 및 HLA-F3 mRNA 발현에 대한 분할 시험을 묘사한다.
도 18은 진행된 난소암 환자(n=27)의 신선한 조직으로부터의 RT-qPCR에 의해 정량분석된 바와 같은 계층화 ESR1 및 HLA-F3 mRNA 발현에 기반한 무진행 생존(PFS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다. 상대적인 mRNA 발현을 참조 유전자로서 CALM2를 사용하여 40-DCT 방법에 의해 측정한다. 높은 ESR1 mRNA 발현(>=37.75) 및 높은 HLA-F3 mRNA 발현(>=34.94)을 나타내는 종양을 갖는 환자가 양호한 생존(검은색, 실선)을 나타내었다. 높은 ESR1 mRNA 발현(>=37.75) 및 낮은 HLA-F3 mRNA 발현(<34.94)을 나타내는 종양을 갖는 환자는 낮은 생존(검은색, 파선)을 나타내었다. 낮은 ESR1 mRNA 발현(<37.75)을 갖는 환자는 또한 나쁜 예후(회색, 실선)를 나타내었다.
카플란 마이어 분석은 ESR1 및 HLA-F3 mRNA 발현의 조합에 의해 무진행 생존 예측의 중요성을 입증하였다. 도 18에 묘사된 바와 같이, 원발 난소암 조직에서 높은 ESR1 및 높은 HLA-F3 mRNA 발현을 나타내는 환자는 38.7 개월의 중간 무진행 생존을 갖는 반면, 높은 ESR1 및 낮은 HLA-F3 mRNA 발현을 갖는 환자는 11.6 개월의 감소된 중간 무진행 생존을 나타내었다. 낮은 ESR1 mRNA 발현을 갖는 환자는 유사한 나쁜 예후를 나타내었다.
또한, 카플란 마이어 방법은 ESR1 및 HLA-F3 mRNA 발현의 조합에 의해 전체 생존 예측의 중요성을 입증하였다. 도 18에 묘사된 바와 같이, 원발 난소암 조직에서 높은 ESR1 및 높은 HLA-F3 mRNA 발현을 나타내는 환자는 38.7 개월의 중간 전체 생존을 갖는 반면, 높은 ESR1 및 낮은 HLA-F3 mRNA 발현을 갖는 환자는 11.6 개월의 감소된 중간 무진행 생존을 나타내었다. 낮은 ESR1 mRNA 발현을 갖는 환자는 유사한 나쁜 예후를 나타내었다.
도 19는 진행된 난소암 환자(n=27)의 신선한 조직으로부터의 RT-qPCR에 의해 정량분석된 바와 같은 계층화 ESR1 및 HLA-F3 mRNA 발현에 기반한 전체 생존(OS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다. 상대적인 mRNA 발현을 참조 유전자로서 CALM2를 사용하여 40-DCT 방법에 의해 측정한다. 높은 ESR1 mRNA 발현(>=37.75) 및 높은 HLA-F3 mRNA 발현(>=34.94)을 나타내는 종양을 갖는 환자가 양호한 생존(검은색, 실선)을 나타내었다. 높은 ESR1 mRNA 발현(>=37.75) 및 낮은 HLA-F3 mRNA 발현(<34.94)을 나타내는 종양을 갖는 환자는 낮은 생존(검은색, 파선)을 나타내었다. 낮은 ESR1 mRNA 발현(<37.75)을 갖는 환자는 또한 나쁜 예후(회색, 실선)를 나타내었다.
등급, FIGO 병기 및 원발 부위(난소 대 복막)와 같은 임상적 매개변수에 대해 조절시, ESR1 및 HLA-F3 mRNA 발현에 기반한 조합적 mRNA 계층화는 여전히 9.53의 L-R 카이2 값(p=0.0095)의 무진행 생존 예측을 위한 독립적인 인자인 채로 있는 반면, 모든 다른 임상적 인자는 유의수준이 아니었다. 높은 ESR1 및 높은 HLA-F3 mRNA 발현의 위험비는 ESR1 높은 & HLA-F3 낮은 또는 ESR1 낮은(각각 p = 0.0042 및 p = 0.0136)과 비교하여, 0.097 및 0.152의 위험비에 도달하였다.
도 20은 등급, FIGO 단계, 원발 부위 및 ESR1 및 HLA-F3 mRNA 발현의 조합을 포함한 콕스 비례 위험 모델을 사용한 PFS에 대한 다변량 분석을 묘사한다.
또한, 전체 생존을 분석하고 임상적 매개변수 등급, FIGO 병기 및 원발 부위(난소 대 복막)에 대해 조절시, ESR1 및 HLA-F3 mRNA 발현에 기반한 조합적 mRNA 계층화는 여전히 6.53의 L-R 카이2 값(p=0.0383)의 무진행 생존 예측을 위한 독립적인 인자인 채로 있는 반면, 모든 다른 임상적 인자는 유의수준이 아니었다. 높은 ESR1 및 높은 HLA-F3 mRNA 발현의 위험비는 ESR1 높은 & HLA-F3 낮은 또는 ESR1 낮은(각각 p = 0.0832 및 p = 0.0182)과 비교하여, 0.184 및 0.230의 위험비에 도달하였다.
도 21은 등급, FIGO 단계, 원발 부위 및 ESR1 및 HLA-F3 mRNA 발현의 조합을 포함한 콕스 비례 위험 모델을 사용한 OS에 대한 다변량 분석을 묘사한다.
상기 언급한 데이터 분석은 개별적인 HLA-F3 mRNA 수준을 하우스키핑 유전자로 조절하여 40-DCT 값으로서 묘사된 정규화된 발현 수준을 획득할 것을 필요로 한다. 흥미롭게도 HLA-F3의 게놈 유전자좌는 역방향 가닥상의 엑손 8의 3' 게놈 위치에 HLA-F3 AS로서 나타내는 안티센스 유전자를 함유하고, 이는 HLA-F3 mRNA의 유전자 발현 조절 및 단백질 번역에 중요할 수 있다. 추정적인 안티센스 전사물의 관련성을 조사하고 하우스키퍼 정규화의 필요성을 없애기 위해서, HLA-F3 및 HLA-F AS1의 유전자 비를 조사하였다.
도 22는 진행된 난소암 환자(n=27)의 신선한 조직으로부터의 RT-qPCR에 의해 정량분석된 바와 같은 계층화 HLA-F3 및 HLA-F AS1 mRNA 발현에 기반한 전체 생존(OS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다. 상대적인 mRNA 발현 대신에 하우스키퍼 측정이 없는 유전자 비를, 참조 유전자로서 CALM2를 사용하여 40-DCT 방법에 의해 측정한다. 높은 HLAF 유전자 비 발현(>=2.35)을 나타내는 종양을 갖는 환자가 양호한 생존(검은색, 실선)을 나타내었다. 낮은 유전자 비(<2.35)를 나타내는 종양을 갖는 환자는 낮은 생존(검은색, 파선)을 나타내었다.
도 22에 묘사된 바와 같이, 카플란 마이어 분석은 HLA-F3 및 HLA-F AS1 mRNA 발현의 조합에 의해 무진행 생존 예측의 중요성을 입증하였다. 원발 난소암 조직에서 높은 HLA-F3 mRNA 및 동시에 보다 낮은 수준의 HLA-F AS1 mRNA 발현을 나타내는 환자는 38.7 개월의 중간 무진행 생존을 갖는 반면(유전자 비 >= 2.35), 낮은 HLA-F3 및 높은 HLA-F AS1 mRNA 발현을 갖는 환자(유전자 비 < 2.35)는 12.6 개월의 감소된 중간 무진행 생존을 나타내었다.
도 23은 진행된 난소암 환자(n=27)의 신선한 조직으로부터의 RT-qPCR에 의해 정량분석된 바와 같은 계층화 HLA-F3 및 HLA-F AS1 mRNA 발현에 기반한 전체 생존(OS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다. 상대적인 mRNA 발현 대신에 하우스키퍼 측정이 없는 유전자 비를, 참조 유전자로서 CALM2를 사용하여 40-DCT 방법에 의해 측정한다. 높은 HLAF 유전자 비 발현(>=2.35)을 나타내는 종양을 갖는 환자가 양호한 생존(검은색, 실선)을 나타내었다. 낮은 유전자 비(<2.35)를 나타내는 종양을 갖는 환자는 낮은 생존(검은색, 파선)을 나타내었다.
카플란 마이어 분석은 또한 유전자 비에 의해 계산된 바와 같이 HLA-F3 및 HLA-F AS1의 조합에 의해 전체 생존 예측의 중요성을 입증하였다. 도 23에 묘사된 바와 같이, 원발 난소암 조직에서 높은 HLA-F 유전자 비(>= 2.35)를 나타내는 환자는 61.5 개월의 중간 전체 생존을 갖는 반면, 높은 ESR1 및 낮은 HLA-F3 mRNA 발현을 갖는 환자는 23.1 개월의 감소된 중간 무진행 생존을 나타내었다.
등급, FIGO 병기 및 원발 부위(난소 대 복막)와 같은 임상적 매개변수에 대해 조절시, ESR1 및 HLA-F3 mRNA 발현에 기반한 조합적 mRNA 계층화는 여전히 4.71의 L-R 카이2 값(p=0.0301)의 무진행 생존 예측을 위한 독립적인 인자인 채로 있는 반면, 원발 부위(p=0.0479)를 제외한 모든 다른 임상적 인자는 유의수준이 아니었다. 높은 HLAF3 및 낮은 HLA-F AS1 mRNA 발현의 위험비는 0.2866(p=0.0301)의 위험비에 도달하였다.
도 24는 등급, FIGO 단계, 원발 부위 및 HLA-F3 및 HLA-F AS1의 조합을 포함한 콕스 비례 위험 모델을 사용한 PFS에 대한 다변량 분석을 묘사한다.
또한, 전체 생존을 분석하고 임상적 매개변수 등급, FIGO 병기 및 원발 부위(난소 대 복막)에 대해 조절시, HLA-F3 및 HLA-F AS1 mRNA 발현에 기반한 조합적 mRNA 계층화는 여전히 8.41의 L-R 카이2 값(p=0.0037)의 무진행 생존 예측을 위한 독립적인 인자인 채로 있는 반면, 모든 다른 임상적 인자는 유의수준이 아니었다. 높은 HLA-F3/낮은 HLA-F AS1 대 낮은 HLA-F3/높은 HLA-F AS1의 위험비는 0.189(p=0.0037)의 위험비에 도달하였다.
도 25는 등급, FIGO 단계, 원발 부위 및 HLA-F3 및 HLA-F AS1의 조합을 포함한 콕스 비례 위험 모델을 사용한 OS에 대한 다변량 분석을 묘사한다.
실시예 5: 진행된, 화학요법 불응성 요로상피암에서 HLA 프로파일링
화학요법에 불응성이고 이후 PD-1 및 PD-L1 체크포인트 억제제 약물(즉, 아테졸리주맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙)에 의한 1차 또는 2차 면역종양학("IO") 치료를 받고 있는 원발 종양으로부터의 TUR 생검 및 방광절제술 샘플을 HLA 발현에 대해 분석하고 IO 치료 및 IO 후 질병 특이성 생존에 대한 반응 뿐만 아니라 조직병리학적 및 분자 매개변수와 연관지었다.
2016년부터 2018년까지 방광암과 상부 요로상피 관암종을 포함하여 조직학적으로 확인된 요로상피암으로 새로 진단된 72명의 환자를 연구에 등록하였다. 승인된 기준에 따라 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 아테주맙을 1차, 2차 및 3차 단일 치료로서 제공하였다. 상기 코호트 샘플로부터의 모든 헤마톡실린-에오신(HE) 염색된 종양 조직 섹션을 2명의 요로 병리학자가 평가하고 UICC의 TNM 분류(2017)에 따라 분류하였다. 희귀 조직학적 변이체를 세계보건기구(WHO 2016)의 비뇨생식기 종양 분류에 따라 분류하였다. 중앙 조직병리학적 검토 후에 18개 조직이, 종양 물질이 충분하지 않거나 요로상피암이 아니기 때문에 제외되었다. 5명의 환자로부터 단지 림프절 조직만을 입수할 수 있었고, 따라서 HLA 유전자 발현의 예후 및/또는 예측 효과의 1차 분석에서 제외되었다(도 26 참조; 콘소트 다이어그램 참조).
도 26은 진행된 또는 전이성 요로상피암 코호트의 콘소트 다이어그램을 묘사한다. 불충분한 및/또는 림프절 조직을 갖는 FFPE 블록의 배제 후에, 55명 환자의 조직을 분석을 위해 입수할 수 있었다.
mRNA 검출을 위해서, 상업적인 키트(Xtract, 스트래티파이어(Stratifyer))를 사용하여 TUR 생검, 방광절제술 및 상응하는 맵핑 방광 조직으로부터의 FFPE 조직으로부터 RNA를 추출하였다. 각각의 반응에 대해서, FFPE 섹션으로부터 추출된 2.5 ㎕ 전체 RNA를 96-웰-광학 반응 플레이트의 하나의 웰에서 2.5 ㎕ 분석-믹스, 2.5 ㎕ 효소-믹스 및 2.5 ㎕ 수와 혼합하였다. PCR 반응의 측정을 적합한 조건(5분 50℃, 1 주기; 20s 95℃, 1 주기; 15s 95℃; 1분 60℃, 40 주기)하에서 버산트 kPCR 사이클러(지멘스) 또는 라이트사이클러 480(로슈)으로 제조사의 설명에 따라 수행하였다. 상대적인 mRNA 발현을 개별적인 부위에서 평가된 바와 같은 RECIST 기준에 기반하여 측정된 IO 치료에 대한 반응 및 IO 치료의 시작에서부터 암 특이적 사망까지 측정된 바와 같은 질병 특이성 생존과 연관지었다. 생물통계학적 JMP SAS 9.0.0(SAS, 미국 노스캐롤라이나주 캐리 소재)을 사용하는 분할 검사를 수행하여 IO 치료에 반응하는 가능한 차이를 평가하였다.
RT-qPCR 방법에 의한 유전자 발현의 상세한 분석을 위해서, 관심 영역에 인접한 프라이머 및 그 사이를 하이브리드화하는 형광 표지된 탐침을 사용하였다. 표적-특이적인 프라이머 및 탐침을 NCBI 프라이머 설계 도구(www.ncbi.nlm.nih.go)를 사용하여 선택하였다. RNA-특이성 프라이머/탐침 서열을 사용하여, 엑손/엑손 경계에 걸쳐 프라이머/탐침 서열을 배치시킴으로써 RNA-특이성 측정이 가능하였다. 더욱 또한, 공지된 다형성을 갖는 서열 영역(SNP)에 결합하지 않는 프라이머/탐침을 선택하였다. 동일 유전자의 다수의 동형이 존재하는 경우에, 모든 관련된 또는 선택된 이어맞추기 변이체를 증폭시키는 프라이머를 적합한 대로 선택하였다. 모든 프라이머 쌍을 통상적인 PCR 반응에 의해 특이성에 대해 검사하였다. 상기 프라이머/탐침의 추가적인 최적화 후에, 상기 표(들)에 나열된 프라이머 및 탐침이 최상의 결과를 제공하였다. 이들 프라이머/탐침은 종래 기술로부터 공지된 프라이머/탐침보다, 예를 들어 특이성 및 증폭 효율면에서 우수하다. 샘플 RNA의 양을 표준화하기 위해서, CALM2를 참조 유전자로서 선택하였는데, 그 이유는 상기가 분석된 샘플에서 차등 조절되지 않기 때문이었다. TaqMan(등록상표) 검증 실험을 수행하여 표적 및 대조용 증폭의 효율이 대략 동일함을 입증하였고, 이는 비교 ΔCT 방법에 의한 유전자 발현의 상대적인 정량분석에 전제조건이다.
도 27은 RT-qPCR 분석에 의해 정량분석된 바와 같은 HLA-F1/F2 발현에 의한 계층화에 기반한 국소 진행된 또는 전이성 UBC(n=55)를 갖는 근육 침습성 방광암 환자로부터의 질병 특이적 생존(DSS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다. 상대적인 mRNA 발현을 참조 유전자로서 CALM2를 사용하여 40-DCT 방법에 의해 측정한다.
도 27에 묘사된 바와 같이, 높은 HLA-F1/2 mRNA 발현(>=34.63)은 2년 후에 60%의 생존 확률을 갖는 HLA-F1/F2 양성 환자의 경우 더 양호한 질병 특이성 생존과 유의수준으로 연관된 반면, HLA-F1/F2 엑손 음성 환자는 2년 후에 20%의 생존 확률을 가졌다(p=0.0245).
도 28은 RT-qPCR 분석에 의해 정량분석된 바와 같은 HLA-F1/F2 및 HLA-G 엑손 8 mRNA 발현에 의한 계층화에 기반한 국소 진행된 또는 전이성 UBC(n=55)를 갖는 근육 침습성 방광암 환자로부터의 질병 특이적 생존(DSS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다. 상대적인 mRNA 발현을 참조 유전자로서 CALM2를 사용하여 40-DCT 방법에 의해 측정한다.
도 28에 묘사된 바와 같이, 높은 HLA-F1/2 mRNA 발현(>= 34.63)과 HLA-G Ex8 mRNA 발현(>= 30.16)과의 조합시, 예측값이 개선될 수 있었다. 흥미롭게도, 낮은 HLA-G mRNA 발현을 갖는 높은 HLA-F1/F2는 2년 후에 80%의 생존 확률을 갖는 HLA-F1/F2 양성/HLA-G Ex8 음성 환자의 경우 더 양호한 질병 특이성 생존과 유의수준으로 연관된 반면, HLA-F1/F2 엑손 음성 환자는 2년 후에 20%의 생존 확률을 가졌고 HLA-F1/F2 양성/HLA-G Ex8 양성 환자는 2년 후에 40%의 생존 확률을 가졌다(p=0.0245).
도 29는 RT-qPCR 분석에 의해 정량분석된 바와 같은 HLA-F1/F2 및 HLA-B/C 엑손 8 mRNA 발현에 의한 계층화에 기반한 국소 진행된 또는 전이성 UBC(n=55)를 갖는 근육 침습성 방광암 환자로부터의 질병 특이적 생존(DSS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다. 상대적인 mRNA 발현을 참조 유전자로서 CALM2를 사용하여 40-DCT 방법에 의해 측정한다.
도 29에 묘사된 바와 같이, 높은 HLA-F1/2 mRNA 발현(>= 34.63)과 HLA-B/C Ex8 mRNA 발현(>= 34.2)과의 조합시, 높은 HLA-B/C는 2년 후에 60%의 생존 확률을 갖는 더 양호한 질병 특이성 생존과 유의수준으로 연관된 반면, HLA-B/C 엑손 8 및 HLA-F1/F2 음성 환자는 2년 후에 10%의 불량한 생존 확률을 가졌고 HLA-B/C 음성 & HLA-F1/F2 양성 환자는 2년 후에 60%의 양호한 생존 확률을 가졌다(p=0.0071).
대조적으로, HLA-B/C 엑손 8 mRNA 발현만을 볼 때 유의수준의 값을 측정할 수 없었다(p=0.2127).
도 30은 RT-qPCR 분석에 의해 정량분석된 바와 같은 HLA-B/C 엑손 8 mRNA 발현에 의한 계층화에 기반한 국소 진행된 또는 전이성 UBC(n=55)를 갖는 근육 침습성 방광암 환자로부터의 질병 특이적 생존(DSS) 확률을 나타내는 카플란 마이어 플롯을 묘사한다. 상대적인 mRNA 발현을 참조 유전자로서 CALM2를 사용하여 40-DCT 방법에 의해 측정한다.
도 30에 묘사된 바와 같이, 높은 HLA-B/C Ex8 mRNA 발현(>=34.2)을 갖는 환자는 2년 후에 60%의 생존 확률을 갖는, 낮은 HLA-B/C 발현을 갖는 환자보다 그다지 더 양호한 질병 특이성 생존을 갖지 않은 반면, HLA-B/C 엑손 8 음성 환자는 2년 후에 40%의 생존 확률을 가졌다. 이는 HLA 발현의 조합이 생존 예측에 우수함을 입증한다.
서열 목록
서열번호 1
GTAACTTCTT CCTTCCCTAT TAAAATTAGA
서열번호 2
TTTACTTTCT CAAATTCTTG CCATGAGAGG TTGATG
서열번호 3
TGGACTCTGG AAGGTTCTCA TG
서열번호 4
CCATCTCTGT CTCAAATTCA TGGT
서열번호 5
CACTGAGCTG CAACTTCTTA CTTCCCTAAT GA
서열번호 6
CAGGTCTTTA TTTGCTCTCT CAACTTC
서열번호 7
GGCCGGAGTA TTGGGAAGA
서열번호 8
CAAGGCCCAC GCACAGACTG ACA
서열번호 9
GCAGGGTCTG CAGGTTCATT
서열번호 10
CTGCGGCTCA GATCTCCAA
서열번호 11
CGCAAGTGTG AGGCGGCCAA T
서열번호 12
CAGGTAGGCT CTCCTTTGTT CAG
서열번호 13
CACCACCCTG TCTTTGACTA TGAG
서열번호 14
ACCCTGAGGT GCTGGGCCCT G
서열번호 15
AGTATGATCT CCGCAGGGTA GAAG
서열번호 16
CATCCCCATC ATGGGTATCG
서열번호 17
TGCTGGCCTG GTTGTCCTTG CA
서열번호 18
CCGCAGCTCC AGTGACTACA
서열번호 19
GACCCTCTTC CTCATGCTGA AC
서열번호 20
CATTCCTTCC CCAATCACCT TTCCTGTT
서열번호 21
CATCCCAGCC CCTTTTCTG
서열번호 22
TTCATCGCCA TGGGCTACG
서열번호 23
CGACACGCAG TTCGTGCGGT TC
서열번호 24
ATCCTCGGAC ACGCCGAGT
서열번호 25
CCGAACCCTC TTCCTGCTGC
서열번호 26
CGAGACCTGG GCGGGCTCCC
서열번호 27
GCGCTGAAAT ACCTCATGGA
서열번호 28
GAGAGAACCT GCGGATCGC
서열번호 29
AGCGAGGGCG GTTCTCACAC CATG
서열번호 30
CCACGTCGCA GCCATACAT
서열번호 31
TGGCCCTGAC CCTGACCC
서열번호 32
AGACCTGGGC GCGCTCCCAC
서열번호 33
CGGGCCGGGA CATGGT
서열번호 34
GAGCGAGCTG AGTGGTTGTG
서열번호 35
TCGCGTCTCG GAAACCGGTA GC
서열번호 36
AGTCAGTTGG TCAGCCATGC T
서열번호 37
TGTGAGACAG CTTCCTTGTG TG
서열번호 38
AATTCTGCTA CATTGATATC TTGCTTCTCA GTCC
서열번호 39
TATGTATGTT CGTGAGGCAC AAGTG
서열번호 40
CTTTGGCTTC GGCTTTAGGA
서열번호 41
CTTCGTTCTT GGCACCATCT TATGAAAAGG GT
서열번호 42
CATGGGTCTT GCAACTTACT TTAGAAT
서열번호 43
CCAAGAAGGC AGTGTTGAAA GAT
서열번호 44
ATCCACATGT CACCCACCTT CCGG
서열번호 45
GGGTGCTCTT CCAAGGATAT TTG
서열번호 46
AGGATTGCGG CCTGTTG
서열번호 47
AGAGTAGTGT CTTGGGCCCC AGCTGA
서열번호 48
CAGGGCATTG GATGTTGATA TTC
서열번호 49
ACTCCCATGC AGAGAAGAAG CTC
서열번호 50
CACCTGTGGA GAGAGGATTG CGGC
서열번호 51
CTGGGGCCCA AGACACTACT C
서열번호 52
TGCTCCGCAG ATACTTGGAG AAT
서열번호 53
CTACAGCGC GCAGAGCAGT CTCCC
서열번호 54
GCCAGCAACG ATGCCCAC
서열번호 55
TCAGATAGAA ACAGAGGGAG CTACTCT
서열번호 56
CTGCAGCCTA CTCAGTGGTC AGCGG
서열번호 57
GAGAAATAAG CTTGACCACC ATGTTA
서열번호 58
TGGAGTTGCT CCGCAGATAC T
서열번호 59
CCTTTGGAGG ATCTGCGCGC TG
서열번호 60
AGATGGGGTG GTGGGCA
서열번호 61
TCAGATAGAA ACAGAGGGAG CTACTC
서열번호 62
CAGGCTGCAG TGTGAGACAG CTTCCTTG
서열번호 63
TTTATGTATG TTCGTGAGGC ACAA
서열번호 64
AGGAATATGC AGAGGAGTTC AGGA
서열번호 65
AGTATCTGCG GAGCAACTCC AGGCACTC
서열번호 66
GACTGCTCTG CGCGCTGT
서열번호 67
AGGAATATGC AGAGGAGTTC AGGA
서열번호 68
AGTATCTGCG GAGCAACTCC AGGCACTC
서열번호 69
GGAGGATCTG CGCGCTGT
SEQUENCE LISTING
<110> INTELLEXON GmbH
<120> DETERMINING INDIVIDUAL HLA PATTERNS, USE AS PROGNOSTICATORS, TARGET GENES AND THERAPEUTIC AGENTS
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<151> 2019-07-05
<160> 69
<170> BiSSAP 1.3.6
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<211> 30
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<213> Artificial Sequence
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<223> HLA-A (MP779) Probe
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<223> HLA-A (MP779) Reverse Primer
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<223> HLA-B/C (MP783) Forward Primer
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<220>
<223> HLA-B/C (MP783) Probe
<400> 5
cactgagctg caacttctta cttccctaat ga 32
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<213> Artificial Sequence
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<223> HLA-B/C (MP783) Reverse Primer
<400> 6
caggtcttta tttgctctct caacttc 27
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<211> 19
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<223> HLA-G-Ex3 (MP728) Forward Primer
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ggccggagta ttgggaaga 19
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<223> HLA-G-Ex3 (MP728) Probe
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caaggcccac gcacagactg aca 23
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<223> HLA-G-Ex3 (MP728) Reverse Primer
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<223> HLA-G Ex4 (MP730) Forward Primer
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<223> HLA-G Ex4 (MP730) Reverse Primer
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caggtaggct ctcctttgtt cag 23
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<223> HLA-G Ex5 (MP743) Forward Primer
<400> 13
caccaccctg tctttgacta tgag 24
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<211> 21
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<213> Artificial Sequence
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<223> HLA-G Ex5 (MP743) Probe
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accctgaggt gctgggccct g 21
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-G Ex5 (MP743) Reverse Primer
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agtatgatct ccgcagggta gaag 24
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<211> 20
<212> DNA
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<223> HLA-G Ex6 (MP744) Forward Primer
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<223> HLA-G Ex6 (MP744) Probe
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<211> 20
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<223> HLA-G Ex6 (MP744) Reverse Primer
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ccgcagctcc agtgactaca 20
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-G Ex8 (MP747) Forward Primer
<400> 19
gaccctcttc ctcatgctga ac 22
<210> 20
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-G Ex8 (MP747) Probe
<400> 20
cattccttcc ccaatcacct ttcctgtt 28
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-G Ex8 (MP747) Reverse Primer
<400> 21
catcccagcc ccttttctg 19
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-G Ex3-5´(MP757) Forward Primer
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ttcatcgcca tgggctacg 19
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-G Ex3-5´(MP757) Probe
<400> 23
cgacacgcag ttcgtgcggt tc 22
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-G Ex3-5´(MP757) Reverse Primer
<400> 24
atcctcggac acgccgagt 19
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-G Ex2/3 (MP779) Forward Primer
<400> 25
ccgaaccctc ttcctgctgc 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-G Ex2/3 (MP779) Probe
<400> 26
cgagacctgg gcgggctccc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-G Ex2/3 (MP779) Reverse Primer
<400> 27
gcgctgaaat acctcatgga 20
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-H Ex 2/3 (MP802) Forward Primer
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gagagaacct gcggatcgc 19
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-H Ex 2/3 (MP802) Probe
<400> 29
agcgagggcg gttctcacac catg 24
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-H Ex 2/3 (MP802) Reverse Primer
<400> 30
ccacgtcgca gccatacat 19
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-H (MP803) Forward Primer
<400> 31
tggccctgac cctgaccc 18
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-H (MP803) Probe
<400> 32
agacctgggc gcgctcccac 20
<210> 33
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-H (MP803) Reverse Primer
<400> 33
cgggccggga catggt 16
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CALM2 Forward Primer
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gagcgagctg agtggttgtg 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> CALM2 Probe
<400> 35
tcgcgtctcg gaaaccggta gc 22
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CALM2 Reverse Primer
<400> 36
agtcagttgg tcagccatgc t 21
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-F2+3 (MP781) Forward Primer
<400> 37
tgtgagacag cttccttgtg tg 22
<210> 38
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-F2+3 (MP781) Probe
<400> 38
aattctgcta cattgatatc ttgcttctca gtcc 34
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-F2+3 (MP781) Reverse Primer
<400> 39
tatgtatgtt cgtgaggcac aagtg 25
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-F1 (MP782) Forward Primer
<400> 40
ctttggcttc ggctttagga 20
<210> 41
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-F1 (MP782) Probe
<400> 41
cttcgttctt ggcaccatct tatgaaaagg gt 32
<210> 42
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-F1 (MP782) Reverse Primer
<400> 42
catgggtctt gcaacttact ttagaat 27
<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-F AS1 (MP839) Forward Primer
<400> 43
ccaagaaggc agtgttgaaa gat 23
<210> 44
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-F AS1 (MP839) Probe
<400> 44
atccacatgt cacccacctt ccgg 24
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-F AS1 (MP839) Reverse Primer
<400> 45
gggtgctctt ccaaggatat ttg 23
<210> 46
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-F AS1 (MP840) Forward Primer
<400> 46
aggattgcgg cctgttg 17
<210> 47
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-F AS1 (MP840) Probe
<400> 47
agagtagtgt cttgggcccc agctga 26
<210> 48
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-F AS1 (MP840) Reverse Primer
<400> 48
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-F AS1 (MP841) Forward Primer
<400> 49
actcccatgc agagaagaag ctc 23
<210> 50
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-F AS1 (MP841) Probe
<400> 50
cacctgtgga gagaggattg cggc 24
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-F AS1 (MP841) Reverse Primer
<400> 51
ctggggccca agacactact c 21
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-F3 spez. (MP842) Forward Primer
<400> 52
tgctccgcag atacttggag aat 23
<210> 53
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-F3 spez. (MP842) Probe
<400> 53
ctacagcgcg cagagcagtc tccc 24
<210> 54
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-F3 spez. (MP842) Reverse Primer
<400> 54
gccagcaacg atgcccac 18
<210> 55
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-F1 spez. (MP843) Forward Primer
<400> 55
tcagatagaa acagagggag ctactct 27
<210> 56
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-F1 spez. (MP843) Probe
<400> 56
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<210> 57
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-F1 spez. (MP843) Reverse Primer
<400> 57
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<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-F2 (+1) spez. (MP844) Forward Primer
<400> 58
tggagttgct ccgcagatac t 21
<210> 59
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-F2 (+1) spez. (MP844) Probe
<400> 59
cctttggagg atctgcgcgc tg 22
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<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-F2 (+1) spez. (MP844) Reverse Primer
<400> 60
agatggggtg gtgggca 17
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-F2 (+3) spez. (MP845) Forward Primer
<400> 61
tcagatagaa acagagggag ctactc 26
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<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-F2 (+3) spez. (MP845) Probe
<400> 62
caggctgcag tgtgagacag cttccttg 28
<210> 63
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-F2 (+3) spez. (MP845) Reverse Primer
<400> 63
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<210> 64
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-F3 spez. (MP846) Forward Primer
<400> 64
aggaatatgc agaggagttc agga 24
<210> 65
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-F3 spez. (MP846) Probe
<400> 65
agtatctgcg gagcaactcc aggcactc 28
<210> 66
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-F3 spez. (MP846) Reverse Primer
<400> 66
gactgctctg cgcgctgt 18
<210> 67
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-F2 (+1) spez. (MP850) Forward Primer
<400> 67
aggaatatgc agaggagttc agga 24
<210> 68
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-F2 (+1) spez. (MP850) Probe
<400> 68
agtatctgcg gagcaactcc aggcactc 28
<210> 69
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-F2 (+1) spez. (MP850) Reverse Primer
<400> 69
ggaggatctg cgcgctgt 18
Claims (18)
- 제1 HLA 유전자의 제1 영역을 암호화하는 RNA 전사물의 제1 발현 수준을 측정하는 단계;
하나 이상의 제2 HLA 유전자의 하나 이상의 제2 영역의 센스 또는 안티센스 RNA 전사물의 적어도 제2 발현 수준을 측정하는 단계;
측정된 상기 제1 및 제2 발현 수준을 비교하여 개별적인 HLA 패턴을 획득하는 단계
를 포함하는, 종양의 개별적인 HLA 패턴을 측정하는 방법으로서, 상기 제1 HLA 유전자 및 제2 HLA 유전자가 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-D, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H 또는 HLA-J를 암호화하는 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 방법. - 제1항에 있어서,
제1 HLA 유전자 및 제2 HLA 유전자가 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-D, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H 및 HLA-J로 이루어지는 군으로부터 선택된 상이한 HLA 그룹을 암호화하는, 방법. - 제2항에 있어서,
제1 HLA 유전자가 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C로 이루어지는 군으로부터 선택된 제1 HLA 그룹을 암호화하고; 제2 HLA 유전자가 HLA-D, HLA-E 및 HLA-F, HLA-G, HLA-H 및 HLA-J로 이루어지는 군으로부터 선택된 제2 HLA 그룹을 암호화하는, 방법. - 제1항에 있어서,
제1 HLA 유전자 및 제2 HLA 유전자가 동일하거나, 동일한 HLA 그룹을 암호화하는, 방법. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 발현 수준이 HLA 그룹의 센스 RNA 전사물과 관련되고, 제2 발현 수준이 HLA 그룹의 안티센스 RNA 전사물과 관련되는, 방법. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 영역 및 제2 영역 중 하나가 엑손-엑손-경계를 포함하고 상기 제1 영역 및 제2 영역 중 다른 하나가 엑손-엑손-경계를 포함하지 않거나;
제1 영역이 엑손-엑손-경계를 포함하지 않고 제2 영역이 엑손-엑손-경계를 포함하지 않거나;
제1 영역이 엑손-엑손-경계를 포함하고 제2 영역이 엑손-엑손-경계를 포함하는,
방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 영역 및 제2 영역 중 하나 이상이 HLA 그룹의 신호 펩티드 영역을 암호화하고/하거나;
상기 제1 영역 및 제2 영역 중 하나 이상이 HLA 그룹의 막관통 영역을 암호화하는,
방법. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
개별적인 HLA 패턴이 제1 및 제2 발현 수준의 비교에 기반하여 우세하게 용해성인지 또는 막-결합된 것인지의 여부를 결정하는 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 및 제2 발현 수준의 비교에 기반하여 HLA 동형을 결정하는 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
HLA 그룹을 암호화하는 유전자의 하나 이상의 추가의 영역에 대한 하나 이상의 추가의 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법으로서, 상기 측정된 추가적인 발현 수준에 기반으로 비교하여 개별적인 HLA 패턴을 획득하는 방법. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
비교가 발현 수준 비의 형성을 포함하는 방법. - 특히 프라이머 및/또는 탐침으로서 사용하기 위한, 서열번호 1 내지 69 중 하나에 따른 핵산 분자.
- 제12항에 따른 핵산 분자를 포함하는 키트.
- 종양의 분자 하위유형을 식별하기 위한 제13항에 따른 키트의 용도.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 개별적인 HLA 패턴을 측정하는 단계; 및
치료제가 측정된 상기 개별적인 HLA 패턴에 특이적으로 결합하도록 측정된 상기 개별적인 HLA 패턴에 기반하여 치료제를 제조하는 단계
를 포함하는 치료제의 제조 방법으로서, 상기 치료제가 단백질, 단백질 도메인 및/또는 폴리펩티드를 포함하는, 제조 방법. - 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 개별적인 HLA 패턴을 측정하는 단계; 및
측정된 상기 개별적인 HLA 패턴에 기반하여 치료제를 제조하는 단계
를 포함하는 치료제의 제조 방법으로서, 상기 치료제가 면역계에 의한 항원의 합성을 허용하도록 상기 치료제가 핵산, 특히 항원을 암호화하는 RNA를 포함하는, 제조 방법. - 제15항 또는 제16항에 따른 제조 방법에 따라 제조된 치료제로서, 용해성 HLA 도메인을 포함하는 치료제.
- 악성 종양 또는 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위한, 제15항 또는 제16항에 따른 제조 방법에 따라 제조된 치료제.
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