KR20220039790A - FGF21 Fc 융합 단백질, GLP-1 Fc 융합 단백질 및 이들의 조합 치료제와 용도 - Google Patents

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Abstract

FGF21 Fc 융합 단백질, GLP-1 Fc 융합 단백질에 관한 것이다. 또한 FGF21 Fc 융합 단백질을 포함하는 제1 약물 조성물, 및 GLP-1 Fc 융합 단백질을 포함하는 제2 약물 조성물로 이루어진 조합 치료제에 관한 것이다. 비만, 고지혈증, 죽상동맥경화, 비알코올성 지방간 질환, 당뇨병, 당뇨병성 심근병증, 관상동맥 죽상경화성 심장 질환 및 인슐린 저항성에 관련된 기타 질환을 포함하는 심혈관 및/또는 대사계 질환에서 상기 융합 단백질 또는 그의 조합의 응용을 개시하였다.

Description

FGF21 Fc 융합 단백질, GLP-1 Fc 융합 단백질 및 이들의 조합 치료제와 용도
본 발명은 단백질 및 폴리펩티드 기술분야에 속하며, 더욱 구체적으로, FGF21 Fc 융합 단백질, GLP-1 Fc 융합 단백질, 및 이들을 포함하는 조합 치료제에 관한 것이며, 심혈관 및/또는 대사계 질환의 예방 또는 치료에 사용되며, 상기 심혈관 및/또는 대사계 질환은 비만, 고지혈증, 죽상동맥경화, 비알코올성 지방간 질환, 당뇨병, 당뇨병성 심근병증, 관상동맥 죽상경화성 심장 질환 및 인슐린 저항성에 관련된 기타 질환을 포함하되, 이에 한정되는 것은 아니다.
섬유아세포 성장인자-21(fibroblast growth factor-21, FGF21)은 FGF 패밀리에 속하며, 주로 간에서 합성되어, 내분비 방식으로 순환계에 들어가며, 이의 C-말단은 효과기관(effector organ) β-klotho 막횡단 단백질과 결합된 후, N-말단을 통해 FGFR1c와 특이적으로 결합되어 안정적인 FGF21/β-klotho/FGFR 복합체를 형성하고, 계속하여 하류 관련 분자 신호를 활성화한다. 대량의 기초적인 연구로부터 볼 수 있다시피, FGF21은 글루코스의 이용을 촉진시키고, 인슐린 감수성을 증가시키며, 지방산의 분해를 촉진시키고, 지질 신생을 감소시키며, 콜레스테롤의 평형을 조절하는 등 다양한 생리학적 활성을 구비함으로써, 심혈관 및 대사계 질환에 응용될 수 있는 거대한 잠재력을 보여주었다. 하지만, 천연적인 FGF21은 사구체에 의해 쉽게 여과 및 대사되고, 프로테아제의 가수분해에 의해 쉽게 절단됨으로써, 체내 반감기가 짧아져 약효성을 심각하게 제한한다. 생물학적 기술의 심도있는 발전으로, 천연적인 FGF21에 대해 구조적인 변형을 진행하여, 체내 반감기를 연장하고, 생체이용률을 향상시키는 것은, 전 세계 범위 내 주요 제약 회사의 연구 개발 핫스팟으로 되었다. 현재 다양한 지속형 FGF21 단백질은 이미 임상 연구 단계에 진입되었으며, 대부분은 폴리에틸렌글리콜의 변형, Fc 단백질의 융합 또는 CovX-Body 공유 결합 등 방식으로 FGF21의 반감기를 연장시킨다. 임상 연구에 따르면, 지속형 FGF21 단백질은 비알코올성 지방간 질환 환자의 간 지방증의 완화, 체중 감소 및 혈지 조절 측면에서 모두 적극적인 치료 효과를 나타냈으나, 당뇨병 환자의 혈당 제어에 대한 작용은 이미 시판된 혈당 강하 유형의 약물에 비해 명확한 약력학적 우세를 나타내지 못했다.
포유동물의 GLP-1 또는 Exendin-4와 비교할 경우, 지속형 GLP-1 수용체 작용제는 GLP-1 또는 Exendin-4 유사체의 구조적 변형에 의해 획득한 단백질 제품이며, 해당 단백질 제품은 체내 반감기 및 생체이용률을 대폭적으로 향상시키고, 주사 빈도를 감소시키는 단백질 제품이다. 현재 Eli Lilly & Co의 둘라글루타이드(Trulicity®) 및 novo nordisk 회사의 세마클루타이드(Sermaglutide) 등과 같은 여러 종의 GLP-1 수용체 작용제는 이미 시판되고 있으며, 임상 응용에서 기존의 경구 혈당강하제, 속효성 GLP-1 수용체 작용제 또는 인슐린 제품에 비해 혈당 제어 또는 환자의 사용 순응도 측면에서 현저한 우월성을 보여주었다. 하지만, 메커니즘의 한계로 인해, 지속형 GLP-1 수용체 작용제는 주로 클루코스의 자극 하에 췌장 β세포가 인슐린을 분비 및 방출하도록 촉진하여 효과를 발휘하며, 당 대사 측면에서 이의 생리학적 기능은 주로 인슐린의 활성에 의존하는바, 현재, 해당 유형의 제품이 체중 감소와 무관한 작용 메커니즘을 통해 당뇨병 환자에게 보편적으로 공존하는 인슐린 저항성, 비만, 비알코올성 지방간 질환 또는 고지혈증 등 다양한 병증에 대해 직접적이고 명확한 개선 효과를 가져다줄 수 있다는 명백한 임상적인 증거는 없다. 해당 유형의 제품은 환자의 음식 섭취를 억제함으로써, 어느 정도의 체중 감소 효과를 발휘할 수 있지만, 그 효과는 대부분 제품 자체의 위장 이상반응에 의존하는바, 부분적으로 적극적인 치료 효과를 획득하였지만, 치료 과정에서 환자의 임상적인 불편함이 증가되었다.
임상에서 대부분의 심혈관 및 대사성 질환 환자는 고지혈증, 비만, 고혈당, 지방간, 죽상동맥경화 등 다양한 질환이 동시에 존재한다. 역학의 결과에 나타낸 바와 같이, 2형 당뇨병 환자 중 비만 환자는 60%를 차지하고, 비알코올성 간 질환 환자는 50%를 차지하며, 당뇨병 환자 중 70%를 초과하는 당뇨병 환자는 비정상적인 혈지 수준이 동반되며; 당뇨병 환자가 심혈관 질환에 걸릴 위험성은 비당뇨병 환자의 2-4배이고, 심혈관계 사건은 당뇨병 환자에서 사망의 전부 원인 중 제1 요소이며; 심혈관계 사건은 비알코올성 지방간 환자의 두번째 사망 원인으로 된다. 현재, 임상에서는 다양한 질환의 질환 경과를 동시에 제어하기 위해 여러 종의 약물의 조합 치료법을 권장하고 있으나, GLP-1 Fc 융합단백질을 비롯한 이미 시판된 약물의 치료 효과의 한계점을 감안하면, 현재 아주 이상적인 단일 약물 또는 약물 조성물에 대한 치료 방안은 아직 획득하지 못했다. 따라서, 이러한 유형의 환자에 대해, 임상에서는 더욱 효과적이고, 더욱 전면적인 조합 예방 및 치료 방안을 제공하는 것이 시급하다. 창조적으로 생각한다면, 심혈관 및 대사성 질환 환자의 종합적인 관리 치료 측면에서, FGF21 Fc 융합 단백질 및 GLP-1 Fc 융합 단백질의 연합 사용은 거대한 치료 잠재력을 발휘할 수 있으며 임상 치료 효과를 충분히 충족시킬 수 있다.
본 발명의 목적은 심혈관 및/또는 대사계 질환을 예방 및 치료하기 위한 FGF21 Fc 융합 단백질, GLP-1 Fc 융합 단백질, 및 이들을 FGF21R/GLP-1R 이중 지속형 작용제로 하는 조합 치료제를 제공하는 것이며, 특히는 다양한 심혈관 또는 대사계 질환을 병발하는 환자를 위해 종합적인 관리 및 예방 치료 수단을 제공하는 것이다. 본 발명에서 더 제공하는 FGF21 Fc 융합 단백질 및 GLP-1 Fc 융합 단백질의 연합 투여 방식은, 비만, 당뇨병, 고지혈증, 비알코올성 지방성 간 질환, 죽상동맥경화 및 당뇨병성 심근병증 등 질환의 동물 모델에서, 모두 예상치 못한 현저한 시너지효과를 나타냈다.
한편으로, 본 발명은 FGF21 Fc 융합 단백질을 제공하였으며, 이의 아미노산 서열은:
(1) 서열번호 4에 기재된 바와 같으며; 또는
(2) 상기 서열 중의 임의의 서열과 기본적으로 동일하다(예를 들어 적어도 80％, 85％, 90％, 92％, 95％, 97％, 98％, 99％ 또는 이보다 더욱 유사하거나, 하나 또는 복수 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환), 결실 및/또는 첨가를 갖는 서열).
다른 한 측면에서, 본 발명은 GLP-1 Fc 융합 단백질을 제공하였으며, 이의 아미노산 서열은:
(1) 서열번호 5, 서열번호 6 또는 서열번호 7로 기재된 바와 같으며; 또는
(2) 상기 서열 중의 임의의 서열과 기본적으로 동일하다(예를 들어 적어도 80％, 85％, 90％, 92％, 95％, 97％, 98％, 99％ 또는 그 이상으로 유사하거나, 하나 또는 복수 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환), 결실 및/또는 첨가를 갖는 서열).
또 다른 측면에서, 본 발명은 조합 치료제를 제공하며, 상기 조합 치료제는 지속형 FGF21 Fc 융합 단백질을 포함하는 제1 약물 조성물 및, 지속형 GLP-1 Fc 융합 단백질을 포함하는 제2 약물 조성물로 이루어지며; 여기서 지속형 FGF21 Fc 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 4 또는 상기 서열 중의 임의의 서열과 기본적으로 동일(예를 들어 적어도 80％, 85％, 90％, 92％, 95％, 97％, 98％, 99％ 또는 그 이상으로 유사하거나, 하나 또는 더욱 많은 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 구비함), 결실 및/또는 첨가된 서열로부터 선택되고; 및 상기 지속형 GLP-1 Fc 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 5, 서열번호 6 또는 서열번호 7 또는 상기 서열 중의 임의의 서열과 기본적으로 동일(예를 들어 적어도 80％, 85％, 90％, 92％, 95％, 97％, 98％, 99％ 또는 그 이상으로 유사하거나, 하나 또는 더욱 많은 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환)을 구비함), 결실 및/또는 첨가된 서열로부터 선택된다.
추가적으로, 상기 제1 약물 조성물 및 제2 약물 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 및/또는 부형제 및/또는 안정제를 더 포함한다.
추가적으로, 상기 FGF21 Fc 융합 단백질 및 GLP-1 Fc 융합 단백질은 예방적 유효량 또는 치료적 유효량으로 상기 약물 조성물에 포함될 수 있으며; 여기서, 상기 예방적 또는 치료적 유효량은 치료를 필요로 하는 환자의 상태, 필요한 투여 경로 등과 같은 치료 목적 또는 예방 목적에 따라 결정된다.
추가적으로, 상기 제1 약물 조성물 및 제2 약물 조성물은 경구 투여 또는 주사 투여에 적합한 제형으로 조제된다.
추가적으로, 상기 제1 약물 조성물 및 제2 약물 조성물은 경구 투여 또는 주사 투여에 적합한 제형으로 각각 조제된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 심혈관 및/또는 대사계 질환을 예방 또는 치료하는 약물의 제조에서의 상기 조합 치료제의 용도를 더 제공한다.
추가적으로, 상기 심혈관 및/또는 대사계 질환은 비만, 고지혈증, 죽상동맥경화, 비알코올성 지방간 질환, 당뇨병, 당뇨병성 심근병증, 관상동맥 죽상경화성 심장 질환 및 인슐린 저항성에 관련된 기타 질환을 포함하되, 이에 한정되는 것은 아니다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 질환의 예방 및 치료를 위한 상기 조합 치료제의 사용방법을 제공하였다.
추가적으로, 상기 방법은 예방적 또는 치료적 유효량의 제1 약물 조성물 및 제2 약물 조성물을 피험자 또는 환자에게 연합 투여하는 것을 포함하며; 여기서, 상기 예방적 또는 치료적 유효량은 치료를 필요로 하는 환자의 상태, 필요한 투여 경로 등과 같은 치료 목적 또는 예방 목적에 따라 결정된다.
추가적으로, 제1 약물 조성물 및 제2 약물 조성물을 연합 투여할 경우, 양자를 동시에 함께 투여하거나, 동시에 별도로 투여하거나 또는 동시에 투여하지 않는 것으며; 상기 동시에 투여하지 않는 것은 선후 순서로 연속적으로 투여하는 것 또는 선후 순서로 일정한 간격을 두어 투여하는 것이다.
추가적으로, 상기 제1 약물 조성물 및 제2 약물 조성물은, 주사(예를 들어 정맥(i.v.) 주사 또는 피하(s.c) 주사)와 같은 본 분야에서 공지된 임의의 방식으로 투여할 수 있다.
본 발명의 장점은 한편으로 실제적인 임상 치료 효과 및 약물의 작용 메커니즘으로부터 출발하여, FGF21R/GLP-1R 이중 작용제 조합을 응용함으로써, 질환 발생메커니즘의 복잡성에 대처하고, 치료 수요의 다양성을 충족시키는데 있으며, 과학적인 실험 연구를 통해 지속형 FGF21 Fc 융합 단백질 및 지속형 GLP-1 Fc 융합 단백질의 연합 사용의 우월성 및 타당성을 충분히 밝혔다. 본 발명에서 제공하는 치료방법은 현재 심혈관 및 대사계 질환의 임상 치료 수단을 최적화 하였는바; 특히는 다양한 심혈관 또는 대사계 질환이 병발된 환자에게 더욱 효과적이고, 더욱 전면적인 조합 치료방안을 제공하였으며; 다른 한편으로, 본 발명에서 선택한 조합 치료제의 활성성분은 모두 지속형 단백질 약물이기 때문에, 임상에서 주 1회 투여 빈도를 구현할 수 있으며, 질환 환자의 수용도는 기타 인슐린 또는 GLP-1 유사체 제품에 비해 훨씬 높다.
발명에 대한 상세한 설명
용어 "FGF21"은 천연 인간 FGF21 및, FGF21의 활성을 유지하는 인간 FGF21 유사체 및 유도체를 의미한다.
천연 인간 FGF21 단백질의 서열은 UNIPROT 데이터베이스로부터 획득할 수 있으며, 등록번호는 Q9NSA1이다. 전구체 단백질은 209개의 아미노산으로 구성되고, 신호 펩티드(아미노산 1-28) 및 성숙 단백질(아미노산 29-209)을 포함한다.
특히 US2001012628A1로부터 알 수 있다시피, 성숙 단백질에는 Leu(본 발명의 서열번호 1의 174번 위치) 대신 Pro를 갖는 천연 인간 FGF21의 동형(isoform) 또는 대립 형태(allelic form)가 구비된다. 다른 1종의 천연 인간 FGF21의 동형의 Gly는 Ser에 의해 치환된다(본 발명의 서열번호 1의 141번 위치).
WO2003/011213으로부터 비교적 짧은 신호 펩티드(본 발명에서 서열번호 1의 23번 위치에 Leu가 누락됨)를 갖는 다른 1종의 동형을 알 수 있다(WO2003/011213에 개시된 서열번호 2, 27개의 아미노산을 갖는 신호 펩티드를 참조).
본 발명에서, 천연 인간 FGF21은 서열번호 1 및 L174P 또는 G141S 치환 동형체에서 리더 펩티드가 제거된 성숙 단백질 부분 서열(아미노산 29-209)을 포함하며; 또한, 이러한 서열 앞에 상기 27개 또는 28개 아미노산 신호 펩티드가 첨가된 전구체 단백질 전장 서열을 더 포함한다.
용어 "GLP-1"은 인간 GLP-1(7-37)(서열번호 2의 1-31번째 아미노산), 엑센딘(exendin)-4(7-45)(서열번호 3의 1-39번째 아미노산) 및 GLP-1의 활성을 유지하는 이의 유사체 및 유도체를 의미한다.
용어 "FGF21 유사체" 및 "GLP-1 유사체"는 그의 아미노산 서열을 변형시키거나 그의 아미노산 서열을 변형시켜 서열번호 1, 2 및 3 각각의 FGF21, GLP-1 및 엑센딘-4(Exendin-4)의 서열로부터 각각 추론되거나 유도되는 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 변형은 하나 또는 복수 개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 첨가를 포함할 수 있다. 예를 들어, 아미노산은 아미노산 서열의 C-말단, N-말단 또는 내부에서 첨가 및/또는 결실될 수 있다. 바람직하게, 아미노산은 C-말단 및/또는 N-말단, 더욱 바람직하게 N-말단에서 첨가 및/또는 결실된다. 본 분야에서 이미 공지된 바와 같이, C-말단 또는 N-말단 결실된 아미노산을 갖는 아미노산 서열은 절단된 서열이라 칭하기도 한다.
본 발명의 FGF21 Fc 융합 단백질 및 GLP-1 융합 단백질을 포함하는 약물 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 주사에 관하여, 상기 담체는 예를 들어 물 또는 생리식염수일 수 있다. 기타 약학적으로 허용가능한 물질, 예를 들어 희석제 및 적당한 완충액을 더 사용할 수 있다. 필요하다면, 기타 약학적으로 허용가능한 물질, 예를 들어 유화제, 현탁화제, 용매, 충진제, 팽창제, 보조제, 방부제, 항산화제, 착색제 및/또는 조미제를 더 사용할 수 있다. 본 분야에서 이미 공지된 바와 같이, 상기 FGF21 Fc 융합 단백질 및 GLP-1 융합 단백질은 정제된 폴리펩티드의 형태로 사용할 수 있으며, 또는 적합한 약학적으로 허용가능한 부형제를 이용하여 조제할 수 있다. 상기 약물 조성물은 주사(예를 들어 정맥(i.v.) 주사 또는 피하(s.c) 주사)와 같은 본 분야에서 공지된 임의의 방식으로 투여할 수 있다.
상기 FGF21 Fc 융합 단백질 및 GLP-1 융합 단백질의 치료적 유효량 또는 예방적 유효량은 약물 조성물에 포함될 수 있다. 상기 유효량은 치료를 필요로 하는 환자의 상태, 필요한 투여 경로 등과 같은 치료 목적 또는 예방 목적에 따라 결정된다.
용어 "인슐린 저항성"은 정상 사용량의 인슐린이 정상적인 생물학적 효과보다 낮은 효과를 생성하는 상태를 말하며, 지방 및 골격근에서 글루코스에 대한 섭취 속도를 느리게 하지만, 간의 글루코스 방출 및 지방 조직의 유리 지방산의 방출을 증가시킨다. 인슐린 저항성의 제1 반응은 신체의 감소된 감수성을 보상하기 위해, 인슐린이 보상적으로 생성 및 분비되어, 고인슐린혈증을 초래하는 것이다. 이로써, 높은 인슐린 수준 및 혈류에서 글루코스를 제거하는 조직의 감소된 반응성은 인슐린 저항의 특징으로 된다. 인슐린 저항은 보상성 고인슐린혈증, 이상지질혈증, 췌장 β세포 보상 기능 저하 및 고혈당증을 포함하는 일련의 대사 변화를 일으키는 주요 사건이다.
인슐린 저항성과 관련되는 질환은 구체적으로 인슐린 저항 증후군(IRS), 2형 당뇨병, 내당능장애, 대사증후군, 고혈당증, 고인슐린혈증, 동맥경화, 고콜레스테롤혈증, 고중성지방혈증, 고지혈증, 이상지질혈증, 비만, 중심성 비만, 다낭성 난소 증후군, 과응고, 고혈압, 미세단백뇨로부터 선택된다.
용어 "당뇨병"은 인슐린의 분비가 절대적 또는 상대적으로 부족하여 발생되는 내분비 및 대사성 질환이다. 2형 당뇨병의 발병 메커니즘은 간 및 말초 조직에서 인슐린 저항성이 점진적으로 발전하는 동시에, 췌장 β세포에서 인슐린 분비가 감소되어, 명확한 고지혈증을 초래(혈액 중 글루코스의 함량이 비정상적으로 높음)하는 것을 포함한다.
용어 "당뇨병 합병증"은 만성 고혈당으로 인한 당뇨병성 신병증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 족부 질환(족부궤양 및 순환 저하) 및 안과 질환(망막병증)과 같은 신체의 기타 부위의 기능 장애이다. 당뇨병은 또한 심장 질환 및 골격 질환과 관절 병증의 위험을 증가시킨다. 당뇨병의 기타 장기 합병증은 피부 문제, 소화 문제, 성기능 장애 및 치아와 잇몸 문제를 포함한다.
용어 "당뇨병성 심근병증"은 당뇨병 환자에서 발생되며, 고혈압성 심장 질환, 관상동맥 죽상경화성 심장 질환 및 기타 심근병증으로 해석할 수 없는 심근 진환을 의미한다. 해당 질환은 대사 장애 및 미세혈관 질환의 기초상 심근의 광범위한 국소적 괴사를 유발하고, 아임상의 심장기능 장애를 일으키며, 최종적으로 심부전, 부정맥 및 심인성쇼크로 발전하며, 중증 환자의 경우 심지어 급사까지도 발전한다.
용어 "관상동맥 죽상경화성 심장 질환"은 관상동맥 혈관에 동맥 죽상 경화 병변의 발생으로 인해 혈관 내강이 협착 또는 폐쇄되어, 심근허혈, 산소부족 또는 괴사를 일으키는 심장 질환이다.
용어 "이상지질혈증"은 지질 단백의 과도한 생성 또는 결핍을 포함하는 지질 단백 대사 병증이다. 이상지질혈증은 혈액 중 총 콜레스테롤, 저밀도 지질단백질(LDL) 콜레스테롤 및 트리글리세리드의 농도가 높아지고, 고밀도 지질단백질(HDL) 콜레스테롤이 감소되는 것으로 나타날 수 있다.
용어 "비알코올성 지방간 질환" 또는 "NAFLD"는 과량의 음주로 인해 발생한 것이 아니라 지방변성에 의해 발생되는 간의 모든 질환을 의미한다. NAFLDs는 단순한 비알코올성 지방간("NAFL"); 비알코올성 지방성 간염("NASH"); 간 섬유화를 동반하는 NAFL; 간경화를 동반하는 NAFL; 간 섬유화를 동반하는 NASH; 간경화를 동반하는 NASH; 및 간염, 비만, 당뇨병, 인슐린 저항, 고중성지방혈증, 지질단백혈증, 글리코겐 축적 질환, 웨버-크리스찬병, 월만병, 임신 또는 지방이영양증으로 인한 지방간 질환을 포함하되 이에 한정되는 것은 아니다.
용어 "비알코올성 지방성 간염(NASH)"은 알코올 소모와 무관한 간 질환이며, 이는 소엽내 염증 및 섬유화를 동반하는 간세포 지방 변성인 것을 특징으로 한다.
용어 "죽상 동맥 경화(atherosclerosis, AS)"는 지질 대사 장애와 관련되는 전신성 질환이며, 이의 병변 특징은 혈액 중의 지질이 동맥혈관벽에 진입되고 내막에 침착되어 죽상반을 형성하여 동맥이 두꺼워지고 경화되는 것이다. AS는 주로 대동맥과 중동맥에 영향을 미치며, 기본 병변은 동맥내막에 지질이 침착되고, 국소적 내막이 섬유화되며, 죽상반이 형성되고, 동맥벽이 경화되며, 동맥 내강이 협착되어, 일련의 2차 질환을 유발하는바, 특히 심장, 뇌, 신장 등 기관에서 발생되어 허혈성 변화를 일으키는 것이다.
용어 "약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제 및/또는 안정제"는 약리학 및/또는 생리학에서 피험자 및 활성성분과 양립되는 담체 및/또는 부형제 및/또는 안정제를 의미하며, 이들은 사용된 사용량 및 농도에서, 이들에 노출된 세포 또는 포유동물에 대해 독성이 없다. pH조절제, 계면활성제, 보조제, 이온 강도 증진제, 희석제, 삼투압을 유지시키는 시약, 흡수를 지연시키는 시약, 방부제를 포함하되 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, pH조절제는 인산염 완충액을 포함하되 이에 한정되는 것은 아니다. 계면활성제는 양이온, 음이온 또는 Tween-80과 같은 비이온형 계면활성제를 포함하되 이에 한정되는 것은 아니다. 이온 강도 증진제는 염화나트륨을 포함하되 이에 한정되는 것은 아니다. 방부제는 예를 들어 파라벤(Paraben), 2-트리클로로메틸-2-프로판올(2-Trichloromethyl-2-propanol), 페놀, 소르빈산(sorbic acid) 등 각종 항세균 시약 및 항진균 시약을 포함하되 이에 한정되는 것은 아니다.
삼투압을 유지시키는 시약은 당, NaCl 및 이의 유사체를 포함하되 이에 한정되는 것은 아니다. 흡수를 지연시키는 시약은 모노스테아린산염 및 젤라틴을 포함하되 이에 한정되는 것은 아니다. 희석제는 물, 수성완충액(예를 들어 완충식염수), 알코올 및 폴리올(예를 들어 글리세롤) 등을 포함하되 이에 한정되는 것은 아니다. 방부제는 예를 들어 티메로살(thimerosal), 2-페녹시에탄올, 파라벤(Paraben), 2-트리클로로메틸-2-프로판올(2-Trichloromethyl-2-propanol), 페놀, 소르빈산(sorbic acid) 등 각종 항세균 시약 및 항진균 시약을 포함하되 이에 한정되는 것은 아니다. 안정제는 본 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 의미를 구비하며, 약물 중의 활성성분의 원하는 활성을 안정시킬 수 있으며, 글루타민산나트륨, 젤라틴, SPGA, 당류(예를 들어 소르비톨, 만니톨, 전분, 자당, 락토스, 텍스트란, 또는 글루코스), 아미노산(예를 들어 글루탐산, 글리신), 단백질(예를 들어 건조한 유청, 알부민 또는 카제인) 또는 이의 분해 생성물(예를 들어 락트알부민 가수분해물) 등을 포함하되 이에 한정되는 것은 아니다.
용어 "환자", "피험자", "개체" 및 "대상"은 예방성 또는 치료성 치료를 받는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 의미하며, 특히는 사람이다. 예를 들어, 본 문에 따른 조합 치료제 및 방법은 당뇨병, NASA, NAFLD 또는 죽상 동맥경화성 질환을 앓고 있는 피험자를 치료하는데 사용할 수 있다. 용어 "비인간 동물"은 예를 들어 포유동물 및 비포유동물, 예를 들어 비인간 영장류 동물, 양, 강아지, 소, 닭, 양서동물, 파충류동물 등과 같은 모든 척추동물을 포함한다.
용량 "유효량"은 원하는 효과를 획득하거나 적어도 일부분을 획득하기에 충분한 양을 의미한다. 예를 들어, 질환(예를 들어 종양 또는 감염)을 예방하는 유효량은 단독적으로 사용하거나 다른 1종 또는 여러 종의 치료제와 조합하여 사용할 경우, 질환(예를 들어 종양 또는 감염)의 발생을 예방, 저지 또는 지연시키기에 충분한 양을 의미하며; 질환을 치료하는 유효량은 단독적으로 사용하거나 다른 1종 또는 여러 종의 치료제와 조합 사용할 경우, 이미 질환을 앓고 있는 환자의 질환 및 이의 합병증을 치유하거나 적어도 부분적으로 저지하기에 충분한 양을 의미한다. 이러한 유효량을 측정하는 것은 완전히 본 분야의 당업자의 능력 범위 내에 있다. 예를 들어, 치료 용도에 유효한 양은 치료하려는 질환의 중증도; 환자 자체의 면역 시스템의 전체적인 상태; 연령, 체중 및 성별과 같은 환자의 일반적인 상황; 약물의 투여방식, 및 동시에 투여되는 기타 치료 등에 따라 결정된다. 치료에 관련한 용어 "유효" 및 "유효성"은 약리학적 유효성 및 생리학적 안전성 양자를 포함한다. 약리학 유효성은 환자의 병증 또는 증상의 감퇴를 촉진시키는 능력을 의미한다. 생리학 안전성은 약물 투여로 인해 세포, 기관 및/또는 생물체 수준에서의 독성 또는 기타 생리학적 불량 효과를 초래하는 수준을 의미한다.
피험자에 대한 "치료" 또는 "요법"은 질환과 관련된 증상, 합병증, 병증 또는 생화학적 지표의 발생, 진전, 발전, 중증도 또는 재발을 역전, 경감, 개선, 억제, 완화 또는 방지하는 것을 목적으로 피험자에게 임의의 유형의 간섭 또는 처리를 수행하거나, 피험자에게 본 발명에 따른 조합 치료제를 투여하는 것을 의미한다.
도 1은 FP4I를 GLP-1 Fc 융합 단백질 둘라글루타이드, FP-B 및 FP-A와 각각 연합 사용하는 것이 비만 마우스 체중에 미치는 영향(means±SEM)을 보여주었으며; 통계학적 차이 마커의 주석: 용매 대조군과 비교하면, ## P＜0.01이고; 대응되는 GLP-1 Fc 융합 단백질을 단독 사용하는 군과 비교하면, ** P＜0.01이며; FP4I를 단독 사용하는 군과 비교하면, △△ P＜0.01이다.
도 2은 FP4I를 GLP-1 Fc 융합 단백질 둘라글루타이드, FP-B 및 FP-A와 각각 연합 사용하는 것이 비만 마우스 혈청 간 기능에 미치는 영향(means±SEM)을 보여주었으며; 통계학적 차이 마커의 주석: 용매 대조군과 비교하면, ## P＜0.01이고; 대응되는 GLP-1 Fc 융합 단백질을 단독 사용하는 군과 비교하면, ** P＜0.01이며; FP4I를 단독 사용하는 군과 비교하면, △△ P＜0.01이다.
도 3은 FP4I를 GLP-1 Fc 융합 단백질 둘라글루타이드, FP-B 및 FP-A와 연합 사용하는 것이 비만 마우스의 간 트리글리세리드 함량에 미치는 영향(means±SEM)을 보여주었으며; 통계학적 차이 마커의 주석: 용매 대조군과 비교하면, ## P＜0.01이고; 대응되는 GLP-1 Fc 융합 단백질을 단독 사용하는 군과 비교하면, ** P＜0.01이며; FP4I를 단독 사용하는 군과 비교하면, △△ P＜0.01이다.
도 4는 FP4I 를 GLP-1 Fc 융합 단백질 둘라글루타이드, FP-B 및 FP-A와 각각 연합 사용한 후 비만 마우스 간 조직의 병리학 도면이다.
도 5은 FP4I를 GLP-1 Fc 융합 단백질 둘라글루타이드, FP-B 및 FP-A와 각각 연합 사용하는 것이 비만 마우스 혈청 인슐린 함량에 미치는 영향(means±SEM)을 보여주었으며; 통계학적 차이 마커의 주석: 용매 대조군과 비교하면, ## P＜0.01이고; 대응되는 GLP-1 Fc 융합 단백질을 단독 사용하는 군과 비교하면, ** P＜0.01이며; FP4I를 단독 사용하는 군과 비교하면, △△ P＜0.01이다.
도 6은 FP4I 를 GLP-1 Fc 융합 단백질 둘라글루타이드, FP-B 및 FP-A와 각각 연합 사용하는 것이 비알코올성 지방간염 마우스 혈청 간 기능에 미치는 영향(means±SEM)을 보여주었으며; 통계학적 차이 마커의 주석: 용매 대조군과 비교하면, ## P＜0.01이고; 대응되는 GLP-1 Fc 융합 단백질을 단독 사용하는 군과 비교하면, ** P＜0.01이며; FP4I를 단독 사용하는 군과 비교하면, △△ P＜0.01이다.
도 7은 FP4I를 GLP-1 Fc 융합 단백질 둘라글루타이드, FP-B 및 FP-A와 연합 사용하는 것이 비알코올성 지방간염 마우스 간 트리글리세리드에 미치는 영향(means±SEM)을 보여주었으며; 통계학적 차이 마커의 주석: 용매 대조군과 비교하면, ## P＜0.01이고; 대응되는 GLP-1 Fc 융합 단백질을 단독 사용하는 군과 비교하면, * P＜0.05이며; FP4I를 단독 사용하는 군과 비교하면, △ P＜0.05이다.
도 8은 FP4I를 GLP-1 Fc 융합 단백질 둘라글루타이드, FP-B 및 FP-A와 각각 연합 사용한 후 비알코올성 지방간염 마우스 간 조직의 병리학 도면이다.
도 9는 FP4I를 GLP-1 Fc 융합 단백질 둘라글루타이드, FP-B 및 FP-A와 각각 연합 사용하는 것이 db/db 마우스 전체 심장 질량에 미치는 영향(means± SEM)을 보여주었으며; 통계학적 차이 마커의 주석: 정상적인 대조군과 비교하면, ## P＜0.01이고; 용매 대조군과 비교하면, ** P＜0.01이다.
본 발명에서는 지속형 FGF21-Fc 융합 단백질(FP4I로 명명하고, 중국 특허 CN107995914A를 참조)을 선택하여 각각 지속형 GLP-1 Fc 융합 단백질 둘라글루타이드(상품명: Trulicity) 또는 Ex(1-39)-L3-CTP1-vFcγ2-3(FP-A로 명명하고, 중국 특허 CN106117370B를 참조), 또는 Ex-(1-45)-L-vFc(FP-B로 명명하고, 중국 특허 CN106279430B를 참조)와 조합하여 사용하고; 비만, 고지혈증, 비알코올성 지방간 질환 또는 당뇨병의 동물 모델을 연구 대상으로 함으로써, 두 가지 유형 제품의 연합 사용의 우세를 충분히 설명하며, 심혈관 및 대사 질환의 종합적인 관리 및 예방 치료에 더욱 효과적이고 더욱 전면적인 해결방안을 제공한다.
아래는 구체적인 실시예를 결합하여 본 발명을 추가적으로 설명하기로 한다. 이해해야 할 것은, 이러한 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일뿐, 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것은 아니다.
실시예 1. 고지방 식이로 비만, 지질 대사 장애 및 지방간이 유발된 마우스에 대한 조합 사용의 치료 효과
1.1 약품 유래
지속형 FGF21-Fc 융합 단백질(FP4I로 명명, 제조방법은 CN107995914A를 참조하며, 본 발명에서 그의 아미노산 서열은 서열번호 4와 같음), 둘라글루타이드(미국 Lily 회사에서 생산되며, 본 발명에서 그의 아미노산 서열은 서열번호 5와 같음), Ex(1-39)-L3-CTP1-vFcγ2-3(FP-A로 명명, 제조방법은 중국 특허 CN106117370B를 참조하며, 본 발명에서 그의 아미노산 서열은 서열번호 6과 같음), Ex-(1-45)-L-vFc(FP-B로 명명, 제조방법은 중국 특허 CN106279430B를 참조하며, 본 발명에서 그의 아미노산 서열은 서열번호 7과 같음).
1.1 그룹으로 나누어 투여 및 샘플 수집
8주령의 수컷 C57BL/6J 마우스를 Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd.에서 구입한다. 식이 환경은 22~24℃이고, 상대적인 습도는 45~65％이며, 조명 시간은 12h/일이다. D12492 사료(지방 칼로리 60%, 미국 Research Diets 회사 제품)로 20주 동안 피딩한 후, 체중에 따라 랜덤으로 마우스를 용매 대조군, FP4I-5mg/kg군(FP4I군으로 약칭함), 둘라글루타이드-1.5mg/kg군(둘라글루타이드군으로 약칭함), FP-B-1.5mg/kg군(FP-B군으로 약칭함), FP-A-1.5mg/kg군(FP-A군으로 약칭함), FP4I-5mg+둘라글루타이드-1.5mg/kg군(FP4I+둘라글루타이드군), FP4I-5mg/kg+FP-B-1.5mg/kg군(FP4I+FP-B군으로 약칭함) 및 FP4I-5mg+FP-A-1.5mg/kg군(FP4I+FP-A군으로 약칭함)으로 나누고, 각각의 군은 8마리의 마우스이다. 용매 대조군 및 단일 약물 치료군의 목덜미 피하에 상응한 단백질 용액 또는 완충액을 주사 투여하며; 약물을 조합 사용하는 군의 목덜미 피하에 FP4I를 주사 투여하고, 복부 피하에 둘라글루타이드, FP-A 또는 FP-B를 주사 투여한다. 6일마다 1회 투여하고, 총 4회 투여한다. 마지막 투여 주기 후, 각 군의 마우스를 16h 동안 금식시키고, 안와에서 전혈을 취하며, 2000g에서 15분 동안 원심분리시켜, 혈청 샘플을 분리하여 얻는다. 간조직을 분리시켜, 중량을 칭량하고, 간 좌측엽을 급속 냉동시킨 후 -80℃ 냉장고에 전이하여 보존시키며, 간 우엽을 10%의 포르말린 용액에서 보존시킨다.
1.2 실험방법
생화학 자동분석장치(ERBA XL-200 생화학 자동분석장치, 독일 Erba Tech. 사의 제품) 및 이와 세트로 된 키트(Ningbo Medicalsystem Biotechnology Co., Ltd.의 제품)로 마우스 혈청 ALT, AST, TG, TC, LDL-c, HDL-c 함량을 검출한다. ELISA법(마우스 초민감성 인슐린 ELISA 키트, 미국 ALPCO회사의 제품)으로 마우스의 공복 혈청 중의 인슐린 함량을 검출한다. 마우스의 간 좌엽의 조직은 약 55mg이고, Floch법으로 간의 단위 질량에서 트리글리세리드의 함량을 검출한다. 마우스의 간 우엽을 취하여, HE 염색시키고, 조직 병리학적 검사를 시행한다.
데이터는 평균치±표준오차(means±SEM)의 형태로 표시되며, SPSS 18.0 통계적 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석한다. 정규분포(normal distribution)에 있어서, 여러 군 사이의 평균치 차이는 단일 요소 분산 분석을 사용하고, 등분산(equal variance)은 LSD검정을 사용하며, 이분산은 Dunnet T3검정을 사용하고; 비정규분포는 비모수 검정을 사용하며, P<0.05는 현저한 통계학적 차이가 있음을 나타낸다.
1.3 실험결과
결과는 도 1에 나타난 바와 같이, 용매 대조군에 비해, 둘라글루타이드군, FP-A군, FP-B군 및 FP4I군에서 마우스의 체중이 현저하게 감소되었다. 단독적으로 FGF21-Fc 융합 단백질 또는 GLP-1 Fc 융합 단백질을 투여하는 것에 비해, 이들을 연합 사용한 군에서 마우스의 체중은 추가적으로 현저히 감소되었다. 결과는 도 2 및 도 3과 같이, 약물을 연합 사용한 군에서 마우스의 간 기능 개선 정도가 단독적으로 사용한 군보다 현저하게 우수하였고, 간의 트리글리세리드의 함량은 단독적으로 사용한 군보다 현저하게 적다.
조직 병리학적 결과로부터 볼 수 있다시피, 용매 대조군의 마우스의 간은 거대소포성 및 미세소포성 혼합형 지방변성되며, 지방이 플레이크 형태로 융합된다. 둘라글루타이드, FP-B, FP-A 또는 FP4I를 단독적으로 투여하면, 마우스 간의 지방변성을 개선하는 효과가 있다. 단독적으로 FGF21-Fc 융합 단백질 또는 GLP-1 Fc 융합 단백질을 투여하는 것에 비해, 이들을 연합 사용한 군에서 마우스 간의 지방 병변 정도는 더욱 큰 정도의 완화를 가져왔으며, 결과는 도 4를 참조한다.
결과는 표 1 및 표 2에 나타난 바와 같이, GF21-Fc 융합 단백질 및 GLP-1 Fc 융합 단백질을 연합 사용하면 비만 마우스의 고지혈증 치료 효과는 이들을 단독적으로 사용한 군보다 우수하다.
표 1. 비만 마우스의 혈청 TG 및 TC 함량에 대한 FGF21-Fc 융합 단백질 및 지속형 GLP-1 Fc 융합 단백질의 연합 사용의 영향
Figure pct00001
비고: 용매 대조군에 비해, # P＜0.05, ## P＜0.01이고; 대응되는 GLP-1 Fc 융합 단백질을 단독적으로 사용하는 군에 비해, * P＜0.05, ** P＜0.01이며; FP4I를 단독적으로 사용하는 군에 비해, * P＜0.05, ** P＜0.01이고; 기타 표의 통계학적 주석은 표 1과 같다.
표 2. 비만 마우스의 혈청 HDL-c와 LDL-c 함량에 대한 FP4I 및 GLP-Fc 융합 단백질의 연합 사용의 영향
Figure pct00002
도 5의 결과와 같이, FP4I, 둘라글루타이드, FP-B 및 FP-A를 단독적으로 사용하면 모두 비만 마우스의 고인슐린혈증의 증상을 효과적으로 개선할 수 있다. FP4I 및 GLP-1 Fc 융합 단백질을 조합하여 사용한 후, 인슐린 저항성을 개선시키는 효과가 현저히 증가되었다.
본 실시예의 연구 내용으로부터 알 수 있다시피, 전형적인 대사 증후군의 특징을 갖는 비만 마우스를 연구 대상으로 할 경우, 지속형 FGF21 융합 단백질과 지속형 GLP-1 Fc 융합 단백질을 조합하여 사용하는 것은 단독적으로 상기 약물을 사용하는 것에 비해, 체중 감소, 지방간 및 지방간의 의해 유발된 간 손상의 회복, 이상지질혈증, 인슐린 저항성 및 저밀도 지질단백질이 높아짐으로 인해 유발된 혈관 병변성 질환의 완화 및 치료 측면에서 더욱 우수한 치료 효과를 나타낸다.
실시예 2. 고과당, 고지방, 고콜레스테롤 식이로 인해 유발되는 비알코올성 지방간염 마우스에 대한 조합 사용의 치료 효과
2.1 그룹으로 나누어 투여 및 샘플 수집
8주령 수컷 C57BL/6J 마우스를 Beijing HFK Bioscience Co., Ltd.에서 구입한다. 식이 환경은 22~24℃이고, 상대적인 습도는 45~65％이며, 조명 시간은 12h/일이다. D09100301 사료(지방 칼로리 40%, 과당 칼로리 40%, 콜레스테롤 질량 2%이며, 미국 Research Diets 회사의 제품)로 30주 동안 피딩한 후, 12h 동안 금식시키고, 내안각 정맥총으로부터 약 120μl의 전혈을 취하고, 혈청을 분리시켜 ALT수준을 검출한다. 체중 및 혈청 ALT 수준에 따라 랜덤으로 마우스를 용매 대조군, FP4I-5mg/kg군(FP4I군으로 약칭함), 둘라글루타이드-1.5mg/kg군(둘라글루타이드군으로 약칭함), FP-B-1.5mg/kg군(FP-B군으로 약칭함), FP-A-1.5mg/kg군(FP-A군으로 약칭함), FP4I-5mg+둘라글루타이드-1.5mg/kg군(FP4I+둘라글루타이드군), FP4I-5mg/kg+FP-B-1.5mg/kg(FP4I+FP-B군으로 약칭함) 및 FP4I-5mg+FP-A-1.5mg/kg군(FP4I+FP-A군으로 약칭함)으로 나누고, 각각의 군은 8마리의 마우스이다. 용매 대조군 및 단일 약물 치료군의 목덜미 피하에 상응한 단백질 용액 또는 완충액을 주사 투여하며; 약물을 조합 사용하는 군의 목덜미 피하에 FP4I를 주사 투여하고, 복부 피하에 둘라글루타이드, FP-A 또는 FP-B를 주사 투여한다. 6일마다 1회 투여하고, 총 8회 투여한다. 마지막 투여 주기 후, 각 군의 마우스를 16h 동안 금식시키고, 내안각 정맥총에서 전혈을 취하며, 2000g에서 15분 동안 원심분리시켜, 혈청 샘플을 분리하여 얻는다. 간조직을 분리시켜, 중량을 칭량하고, 간 좌측엽을 급속 냉동시킨 후 -80℃ 냉장고에 전이하여 보존시키며, 간 우엽을 10%의 포르말린 용액에서 보존시킨다.
2.2 실험방법
비알코올성 지방간염 스코어링 시스템(NAS 스코어)으로 치료 효과를 평가하며, 이의 표준은 미국 국립 보건원 병리학 작업팀 지침을 참조하는바, 구제적으로 다음과 같다: 간세포 지방변성: 0점(＜5％), 1점(5％~33％), 2점(34％~66％), 3점(＞66％)이고; 20배율 렌즈의 조건에서 소엽 내 염증: 0점(없음), 1점(＜2개), 2점(2~4개), 3점(＜4개)이며; 간세포 풍선변성: 0점(없음), 1점(드뭄), 2점(흔함)이다. 혈청 생화학 검출, 간의 트리글리세리드 함량 검출, 조직 병리학적 검사, 통계학적 분석 방법은 실시예 1의 상응한 부분과 동일하다.
2.3 실험결과
도 6 및 도 7과 같이, 단독적으로 약물을 사용하여 치료하는 기초상, 약물을 조합하여 사용하는 군은 비알코올성 지방간염 마우스의 간 기능을 추가적으로 개선할 수 있고, 간의 트리글리세리드의 함량을 감소시킬 수 있다.
조직 병리학 결과로부터 볼 수 있다시피, 용매 대조군 마우스의 간은 심각한 지방변성, 염증성 세포의 침윤으로 나타나며, 간헐적 간세포 풍선변성으로 나타났다. 본 실시예에서 설계된 투여 사용량 및 투여 주기 조건에서, 단독적으로 FGF21 Fc 융합 단백질 FP4I 또는 GLP-1 Fc 융합 단백질 둘라글루타이드, FP-A 또는 FP-B를 투여함으로써, 일정한 정도에서 비알코올성 지방간염 마우스의 간의 병변을 완화시킬 수 있다. 단독 치료군에 비해, 약물을 조합하여 사용하는 군에서 마우스의 간의 병리조직의 형태는 현저히 개선되었고, NAS 스코어는 현저히 감소되었다. 결과는 도 8과 표 3를 참조하면 된다.
본 실시예의 연구 내용으로부터 알 수 있다시피, FGF21 Fc 융합 단백질 및 GLP-1 Fc 융합 단백질의 조합 사용은 비알코올성 지방간염에 대해 더욱 적극적인 치료효과를 나타냈으며, 이의 효과는 단독 치료군에 비해 현저하게 우수하다.
표 3. NAS 스코어 결과
Figure pct00003
실시예 3. db/db 마우스의 혈당 감소 및 심장 보호 효과에 대한 조합 사용의 실험 연구
3.1 그룹으로 나누어 투여 및 샘플 수집
6주령 수컷 db/db 마우스를 Jiangsu GemPharmatech Co., Ltd.에서 구입한다. 식이 환경은 22~24℃이고, 상대적인 습도는 45~65％이며, 조명 시간은 12h/일이다. D12450B 사료로 14주령까지 피딩한 후, 내안각 정맥총에서 약 20μl의 전혈을 취하고, 당화헤모글로빈(glycosylated hemoglobin)의 함량을 검출한다. 체중 및 당화헤모글로빈 수준에 따라 랜덤으로 db/db 마우스를 용매 대조군, FP4I-5mg/kg군(FP4I군으로 약칭함), 둘라글루타이드-1.5mg/kg군(둘라글루타이드군으로 약칭함), FP-B-1.5mg/kg군(FP-B군으로 약칭함), FP-A-1.5mg/kg군(FP-A군으로 약칭함), FP4I-5mg+둘라글루타이드-1.5mg/kg군(FP4I+둘라글루타이드군), FP4I-5mg/kg+FP-B-1.5mg/kg(FP4I+FP-B군으로 약칭함) 및 FP4I-5mg+FP-A-1.5mg/kg군(FP4I+FP-A군으로 약칭함)으로 나누고, 동일한 주령의 db/m 마우스는 정상 대조군으로 하고, 각각의 군은 8마리의 마우스이다. 대조군 및 단일 약물 치료군의 목덜미 피하에 상응한 단백질 용액 또는 완충액을 주사 투여하며; 약물을 조합 사용하는 군의 목덜미 피하에 FP4I를 주사 투여하고, 복부 피하에 둘라글루타이드, FP-A 또는 FP-B를 주사 투여한다. 3일마다 1회 투여하고, 총 12회 투여한다. 마지막 투여 주기 후, 각 군의 마우스를 밤새 동안 금식시키고, 내안각 정맥총에서 전혈을 취하여 당화헤모글로빈의 함량을 검출하며, 혈액을 취한 후, 경추탈골로 마우스를 희생시키고, 마우스의 심장 조직을 분리시켜 전체 심장의 질량을 칭량한다.
3.2 실험방법
NycoCard Reader Ⅱ 특수단백질 골드 스탠더드 검출기(Alere Technologies AS, Norway의 제품)를 사용하고, 마이크로입자 크로마토그래피법으로 마우스의 당화헤모글로빈의 함량을 검출한다 통계학적 분석 방법은 실시예 1의 상응한 부분과 동일하다.
3.3 실험결과
결과는 표 4와 같이, 단독적으로 FGF21 Fc 융합 단백질 또는 GLP-1 Fc 융합 단백질을 단독적으로 투여함으로써, db/db 마우스에 대한 양호한 혈당 제어 효과를 나타냈으나, 여전히 마우스의 정상적인 혈당 수준보다 높다. 약물을 조합하여 사용한 후의 db/db 마우스의 당화헤모그로빈의 함량은 단독 치료군보다 현저히 낮으며, 그의 수준은 기본적으로 정상 마우스의 혈당 수준으로 회복되었다.
db/db는 임상 병증과 유사도가 높은 자발형 당뇨병 마우스로, 혈당강하제 약물의 치효효과를 비교적 정확하게 반영할 수 있다. 본 실시예의 연구 내용으로부터 알 수 있다시피, 약물의 조합 사용은 db/db 마우스의 혈당을 정상으로 회복시킬 수 있으며, 단독적인 치료군보다 우수하다.
당뇨병성 심근병증은 당뇨병의 주요 합병증 중의 하나로서, 주요 병리학적 특징은 심장비대로 나타난다. 결과는 도 9와 같이, 20주령의 db/db 마우스의 전체 심장의 질량은 정상 대조 마우스보다 현저히 높으며, 당뇨병성 심근병증 특징으로 표현된다. 단독적으로 FGF21-Fc 융합 단백질 또는 GLP-1 Fc 융합 단백질을 투여하는 것은 db/db 마우스 전체 심장의 질량에 명확한 영향을 미치지 않았다. 약물을 조합하여 사용한 후, db/db 마우스의 전체 심장의 질량은 현저히 감소되었다. 본 실시예의 연구 내용으로부터 알 수 있다시피, 약물을 조합하여 사용함으로써, 당뇨병성 심근병증의 발생 및 발전을 예방 및 치료할 수 있다.
표 4. 당화헤모글로빈의 함량
Figure pct00004
본 발명에서 언급된 모든 문헌은 각 문헌이 참조로서 단독적으로 인용되듯이, 모두 참조로서 본 출원에 인용된다. 여기서 이해해야 할 것은, 본 발명의 상기 기재 내용을 읽은 후, 본 분야의 당업자는 본 발명에 대해 각종 변형 또는 보정을 진행할 수 있지만, 이러한 등가적인 형태는 마찬가지로 본 출원에 첨부된 청구항에서 한정하는 범위에 속한다.
<110> AMPSOURCE BIOPHARMA SHANGHAI INC. <120> FGF21 FC FUSION PROTEIN, GLP-1 FC FUSION PROTEIN, AND COMBINATION THERAPEUTIC AGENT COMPRISING SAME AND USE THEREOF <130> 20190717 <160> 7 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 209 <212> PRT <213> native human FGF21 amino acid sequence (Homo sapiens) <400> 1 Met Asp Ser Asp Glu Thr Gly Phe Glu His Ser Gly Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Gly Ala Cys Gln Ala His Pro Ile Pro 20 25 30 Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr 35 40 45 Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg 50 55 60 Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu 65 70 75 80 Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val 85 90 95 Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly 100 105 110 Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu 130 135 140 His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly 145 150 155 160 Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu 165 170 175 Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp 180 185 190 Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala 195 200 205 Ser <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> native human GLP-1(7-37) amino acid sequence (Homo sapiens) <400> 2 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 3 <211> 39 <212> PRT <213> native Exendin-4(7-45) amino acid sequence (Heloderma suspectum) <400> 3 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 4 <211> 459 <212> PRT <213> FP4I amino acid sequence (Artificial Sequence) <400> 4 His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val 1 5 10 15 Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His 20 25 30 Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser 35 40 45 Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln 50 55 60 Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly 65 70 75 80 Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg 85 90 95 Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His 100 105 110 Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro 115 120 125 Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro 130 135 140 Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val 145 150 155 160 Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser 165 170 175 Pro Ser Tyr Ala Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 180 185 190 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 195 200 205 Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg 210 215 220 Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Val Glu Cys Pro 225 230 235 240 Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 245 250 255 Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 260 265 270 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn 275 280 285 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 290 295 300 Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 305 310 315 320 Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 325 330 335 Asn Lys Gly Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys 340 345 350 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 355 360 365 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 370 375 380 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 385 390 395 400 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 405 410 415 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 420 425 430 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 435 440 445 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 5 <211> 275 <212> PRT <213> Dulaglutide amino acid sequence (Artificial Sequence) <400> 5 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu 35 40 45 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 50 55 60 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 65 70 75 80 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 85 90 95 Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 100 105 110 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 115 120 125 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 130 135 140 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser 145 150 155 160 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 165 170 175 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 180 185 190 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 195 200 205 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 210 215 220 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr 225 230 235 240 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 245 250 255 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 260 265 270 Ser Leu Gly 275 <210> 6 <211> 317 <212> PRT <213> FP-A amino acid sequence (Artificial Sequence) <400> 6 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 35 40 45 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 50 55 60 Gly Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro 65 70 75 80 Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Val Glu 85 90 95 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu 100 105 110 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 115 120 125 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln 130 135 140 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 145 150 155 160 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu 165 170 175 Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 180 185 190 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 195 200 205 Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 210 215 220 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 225 230 235 240 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 245 250 255 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly 260 265 270 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 275 280 285 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn 290 295 300 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 305 310 315 <210> 7 <211> 278 <212> PRT <213> FP-B amino acid sequence (Artificial Sequence) <400> 7 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 50 55 60 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 65 70 75 80 Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 85 90 95 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 100 105 110 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 115 120 125 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 130 135 140 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 145 150 155 160 Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 165 170 175 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 180 185 190 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 195 200 205 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 210 215 220 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 225 230 235 240 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 245 250 255 Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 260 265 270 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 275

Claims (10)

  1. FGF21 Fc 융합 단백질에 있어서, 이의 아미노산 서열은:
    (1) 서열번호 4와 같으며; 또는
    (2) 상기 서열 중의 임의의 서열과 기본적으로 동일(예를 들어 적어도 80％, 85％, 90％, 92％, 95％, 97％, 98％, 99％ 또는 그 이상으로 유사하거나, 하나 또는 복수 개의 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환), 결실 및/또는 첨가를 갖는 서열) 한 것을 특징으로 하는 FGF21 Fc 융합 단백질.
  2. GLP-1 Fc 융합 단백질에 있어서, 이의 아미노산 서열은:
    (1) 서열번호 5, 서열번호 6 또는 서열번호 7과 같으며; 또는
    (2) 상기 서열 중의 임의의 서열과 기본적으로 동일 (예를 들어 적어도 80％, 85％, 90％, 92％, 95％, 97％, 98％, 99％ 또는 그 이상으로 유사하거나, 하나 또는 더욱 많은 아미노산 치환(예를 들어 보존적 치환), 결실 및/또는 첨가를 갖는 서열) 한 것을 특징으로 하는 GLP-1 Fc 융합 단백질.
  3. 제 1 항에 따른 FGF21 Fc 융합 단백질을 포함하는 제1 약물 조성물, 및 제 2 항에 따른 GLP-1 Fc 융합 단백질을 포함하는 제2 약물 조성물로 이루어진 것을 특징으로 하는 조합 치료제.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 FGF21 Fc 융합 단백질 및 GLP-1 융합 단백질은 예방적 유효량 또는 치료적 유효량으로 상기 제1 약물 조성물 및 제2 약물 조성물에 포함될 수 있는 것을 특징으로 하는 조합 치료제.
  5. 제 3 항에 있어서,
    상기 제1 약물 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 및/또는 부형제, 및/또는 안정제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조합 치료제.
  6. 제 3 항에 있어서,
    상기 제2 약물 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 및/또는 부형제, 및/또는 안정제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조합 치료제.
  7. 제 3 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 약물 조성물 및 제2 약물 조성물은 경구 투여 또는 주사 투여에 적합한 제형으로 조제되는 것을 특징으로 하는 조합 치료제.
  8. 제 3 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 약물 조성물 및 제2 약물 조성물은 경구 투여 또는 주사 투여에 적합한 제형으로 각각 조제되는 것을 특징으로 하는 조합 치료제.
  9. 심혈관 및/또는 대사계 질환의 예방 또는 치료에 사용되는 약제(바람직하게 제 3 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 조합 치료제)에서의 제 1 항에 따른 FGF21 Fc 융합 단백질 및/또는 제 2 항에 따른 GLP-1 Fc 융합 단백질의 용도.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 심혈관 및/또는 대사계 질환은 비만, 고지혈증, 죽상동맥경화, 비알코올성 지방간 질환, 당뇨병, 당뇨병성 심근병증, 관상동맥 죽상경화성 심장 질환 및 인슐린 저항성에 관련된 기타 질환을 포함하되, 이에 한정되지 않는 것을 특징으로 하는 용도.
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