KR20220037805A - A method of culturing roots derived from stem cell of Artemisia capillaris Thunb for mass increasing artemisinin - Google Patents
A method of culturing roots derived from stem cell of Artemisia capillaris Thunb for mass increasing artemisinin Download PDFInfo
- Publication number
- KR20220037805A KR20220037805A KR1020200120717A KR20200120717A KR20220037805A KR 20220037805 A KR20220037805 A KR 20220037805A KR 1020200120717 A KR1020200120717 A KR 1020200120717A KR 20200120717 A KR20200120717 A KR 20200120717A KR 20220037805 A KR20220037805 A KR 20220037805A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- artemisinin
- derived
- stem cell
- culture medium
- stem cells
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/001—Culture apparatus for tissue culture
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/002—Culture media for tissue culture
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
- A01H5/04—Stems
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
- A01H5/06—Roots
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
- A01H5/12—Leaves
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Botany (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Physiology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
본 발명은 아르테미시닌 대량 생산용 인진쑥 줄기세포 유래 뿌리 배양 방법 에 관한 것이다.The present invention relates to a method for culturing a root culture derived from Artemisinin stem cells for mass production of Artemisinin.
약용 작물은 전통생약으로서 오랫동안 복용해오고 있으며, 안전성에 대한 우려가 적은 장점이 있으며, 현대 생명공학 기술을 바탕으로 새롭게 연구가 이어지고 있다. 특히 약용식물은 오랜 임상 경험을 통해 유효성 및 안전성이 입증되어 바이오소재 제품으로의 실패를 줄일 수 있고 빠른 개발이 가능하다. 이러한 장점을 바탕으로 약용식물을 이용한 천연물 바이오 소재의 의약품 및 건강 기능식품으로 산업화가 가속화 되고 있으며, 국내외 의약품의 50%가 천연물에서 유래된 단일물질이다. 우리나라에서 약용자원으로 사용할 수 있는 식물은 약용 1,253종, 식용 826종으로 총 2,104종이 자생하고 있다. Medicinal crops have been taken for a long time as traditional herbal medicines, have the advantage of less concerns about safety, and are being researched based on modern biotechnology. In particular, medicinal plants have proven efficacy and safety through long clinical experience, reducing failures as biomaterial products and enabling rapid development. Based on these advantages, industrialization is accelerating into medicines and health functional foods made of natural biomaterials using medicinal plants, and 50% of domestic and foreign medicines are single substances derived from natural products. There are 1,253 medicinal plants and 826 edible plants that can be used as medicinal resources in Korea, with a total of 2,104 species growing wild.
그 중,한국의 자생 쑥은 30여 가지로, 식용과 약용으로 구분해서 사용하고 있다. 그 중에 대표적인 것이 인진쑥(Artemisia capillaris Thunb.)으로, 예로부터 지방간, 만성 간염, 위장병, 변비, 황달, 신경통 등에 사용하였고, 알코올 분해와 지방 축적 억제 작용이 있어 음주가 많은 사람과 간 질환자에게 좋고, 소염, 이뇨, 담석 억제 작용이 알려져 있다.Among them, 30 kinds of mugwort native to Korea are used for food and medicinal purposes. Among them, Artemisia capillaris Thunb. has been used since ancient times for fatty liver, chronic hepatitis, gastrointestinal disease, constipation, jaundice, and neuralgia. It is known to have anti-inflammatory, diuretic, and gallstone inhibitory effects.
특히 인진쑥은 Teroenoids계 이차대산물이고, 말라리아 치료제로 잘 알려진 아르테미시닌(artemisinin)을 포함하고 있으며, 아르테미시닌은 인진쑥의 우수한 항균, 항산화 및 항염성 효과의 주성분으로써, 여성냉증, 생리불순, 갱년기 장애에 좋으며, 몸이 찬 사람은 체온을 상승시킴으로써 면역력을 증진시켜줄 수 있다.In particular, Artemisinin is a secondary product of Teroenoids and contains artemisinin, which is well known as a treatment for malaria. It is good for menopausal disorders, and people with a cold body can improve immunity by raising body temperature.
그러나, 인진쑥은 시중 유통가격이 비싸고, 재배의 어려움으로 재배농가가 적어 경제성 있는 대량재배가 어려워 널리 보급하는데 결정적인 한계가 있으므로, 적은 비용으로 대량생산이 가능한 기술이 필요한 실정이다.However, since Injin mugwort is expensive in market distribution and difficult to cultivate, it is difficult to mass-cultivate economically because there are few farmers, so there is a crucial limitation in its widespread distribution.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 아르테미시닌(artemisinin) 대량생산용 인진쑥 줄기세포 유래 뿌리배양 방법 및 상기 배양 방법으로 배양된 인진쑥 줄기세포 유래 뿌리를 제공하는 것이다.The problem to be solved by the present invention is to provide a method for culturing Artemisinin stem cell-derived root for mass production and a root cultured with Artemisinin stem cell-derived root.
또한, 본 발명은 인진쑥 줄기세포, 상기 줄기세포 유래 뿌리 또는 이의 배양액을 포함하는 식품 조성물 또는 여성 청결제 조성물을 제공하고자 한다.In addition, the present invention is to provide a food composition or a feminine cleanser composition comprising Injin mugwort stem cells, the stem cell-derived root, or a culture solution thereof.
본 발명의 일실시예는 a) 인진쑥 조직을 2,4-D 및 NAA(naphthaleneacetic acid)가 포함된 배지에서 배양하여 캘러스로 유도하는 단계; b) 상기 캘러스에서 줄기세포를 분리하여 2,4-D 및 NAA(naphthaleneacetic acid)가 포함된 배지에서 배양하는 단계; 및 c) 상기 줄기세포를 2,4-D가 포함된 배지에 배양하여 뿌리 형성을 유도하는 단계;를 포함하는 아르테미시닌(artemisinin) 대량생산용 인진쑥 줄기세포 유래 뿌리배양 방법이다.An embodiment of the present invention comprises the steps of: a) culturing Injin mugwort tissue in a medium containing 2,4-D and NAA (naphthaleneacetic acid) to induce callus; b) separating the stem cells from the callus and culturing in a medium containing 2,4-D and NAA (naphthaleneacetic acid); and c) inducing root formation by culturing the stem cells in a medium containing 2,4-D.
상기 인진쑥 조직은 잎, 줄기, 엽병 또는 뿌리일 수 있다.The wormwood tissue may be a leaf, a stem, a petiole or a root.
상기 a) 단계 또는 b) 단계에서 2,4-D의 함량은 0.05~3.0mg/L이고, NAA의 함량은 0.001~0.5mg/L일 수 있다.The content of 2,4-D in step a) or b) may be 0.05 to 3.0 mg/L, and the content of NAA may be 0.001 to 0.5 mg/L.
상기 a) 단계 또는 b) 단계에서 배지는 고체배치이고, 수크로오스(Sucrose) 및 겔라이트(Gerlite)를 더 포함할 수 있다.The medium in step a) or b) is a solid batch, and may further include sucrose and gellite.
상기 a) 단계 또는 b) 단계에서 배양은 pH 5.5~6.5 및 20~30℃에서 암배양할 수 있다.The culture in step a) or step b) may be darkly cultured at pH 5.5-6.5 and 20-30°C.
상기 c) 단계에서 2,4-D의 함량은 0.01~0.1mg/L일 수 있다.The content of 2,4-D in step c) may be 0.01 to 0.1 mg/L.
상기 c) 단계에서 배지는 액체배지일 수 있다.The medium in step c) may be a liquid medium.
상기 뿌리는 아르테미시닌(artemisinin)의 함량이 인진쑥 조직의 2~5배일 수 있다.The root may have an artemisinin content of 2 to 5 times that of the Injin mugwort tissue.
본 발명의 다른 실시예는 아르테미시닌(artemisinin) 대량생산용 인진쑥 줄기세포 유래 뿌리이다.Another embodiment of the present invention is Artemisinin (artemisinin) stem cell-derived roots for mass production.
본 발명의 또 다른 실시예는 인진쑥 줄기세포, 상기 줄기세포 유래 뿌리 또는 이의 배양액을 포함하는 식품 조성물이다.Another embodiment of the present invention is a food composition comprising Injin mugwort stem cells, the stem cell-derived root, or a culture solution thereof.
본 발명의 또 다른 실시예는 인진쑥 줄기세포, 상기 줄기세포 유래 뿌리 또는 이의 배양액을 포함하는 포함하는 여성 청결제 조성물이다.Another embodiment of the present invention is a feminine cleanser composition comprising Injin mugwort stem cells, the stem cell-derived root, or a culture solution thereof.
본 발명의 인진쑥 줄기세포 유래 뿌리배양 방법을 이용하여 아르테미시닌(artemisinin) 대량생산용 인진쑥 줄기세포 유래 뿌리를 배양할 수 있으며, 이에 따라 줄기세포 유래 뿌리로부터 고함량의 아르테미시닌(artemisinin)을 대량으로 생산하여 산업화 할 수 있다.Injin mugwort stem cell-derived root culture method of the present invention can be used to culture Artemisinin stem cell-derived roots for mass production. It can be mass-produced and industrialized.
또한, 인진쑥 줄기세포, 상기 줄기세포 유래 뿌리 또는 이의 배양액을 포함하는 식품 조성물 또는 여성 청결제 조성물을 제공할 수 있다.In addition, it is possible to provide a food composition or a feminine cleanser composition comprising Injin mugwort stem cells, the stem cell-derived root, or a culture solution thereof.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 인진쑥으로부터 유도된 인진쑥 캘러스(callus)의 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 인진쑥 줄기세포로부터 유도된 뿌리의 사진이다.
도 3은 본 발명에 따른 아르테미시닌(artemisinin)의 생합성 모식도이다.
도 4는 본 발명에 따라 배양 조건을 달리하여 유도된 인진쑥 캘러스의 사진이다.
도 5는 본 발명에 따라 배양 조건을 달리하여 유도된 뿌리의 사진이다.
도 6는 본 발명에 따라 유도된 인진쑥 캘러스로에서 분리된 줄기세포의 과산화수소수 반응을 나타낸 사진이다.
도 7은 인진쑥 조직, 인진쑥 캘러스로부터 분리된 줄기세포 및 줄기세포로부터 유도된 뿌리의 아르테미시닌(artemisinin) 생합성량을 비교한 그래프이다.1 is a photograph of Injin mugwort callus derived from Injin mugwort according to an embodiment of the present invention.
2 is a photograph of roots derived from Injin mugwort stem cells according to an embodiment of the present invention.
3 is a schematic diagram of the biosynthesis of artemisinin according to the present invention.
4 is a photograph of Injin mugwort callus induced by different culture conditions according to the present invention.
5 is a photograph of roots induced by different culture conditions according to the present invention.
6 is a photograph showing the hydrogen peroxide reaction of stem cells isolated from Injin mugwort callus induced according to the present invention.
7 is a graph comparing the amount of artemisinin biosynthesis of Injin mugwort tissue, stem cells isolated from Injin mugwort callus, and stem cells-derived roots.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 구체적인 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.Hereinafter, specific embodiments of the present invention will be described in detail so that those of ordinary skill in the art can easily carry out the present invention. However, the present invention may be embodied in several different forms and is not limited to the embodiments described herein.
본 발명의 일실시예는 a) 인진쑥 조직을 2,4-D 및 NAA(naphthaleneacetic acid)가 포함된 배지에서 배양하여 캘러스로 유도하는 단계; b) 상기 캘러스에서 줄기세포를 분리하여 2,4-D 및 NAA(naphthaleneacetic acid)가 포함된 배지에서 배양하는 단계; 및 c) 상기 줄기세포를 2,4-D가 포함된 배지에 배양하여 뿌리 형성을 유도하는 단계;를 포함하는 아르테미시닌(artemisinin) 대량생산용 인진쑥 줄기세포 유래 뿌리배양 방법이다.An embodiment of the present invention comprises the steps of: a) culturing Injin mugwort tissue in a medium containing 2,4-D and NAA (naphthaleneacetic acid) to induce callus; b) separating the stem cells from the callus and culturing in a medium containing 2,4-D and NAA (naphthaleneacetic acid); and c) inducing root formation by culturing the stem cells in a medium containing 2,4-D.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 인진쑥으로부터 유도된 인진쑥 캘러스(callus)의 사진으로서, 도 1a는 인진쑥 줄기 유래 캘러스이고, 도 1b는 인진쑥 잎 유래 캘러스이고, 도 1c는 인진쑥 엽병 유래 캘러스이고, 도 1d는 인진쑥 뿌리 유래 캘러스이다.1 is a photograph of Injin mugwort callus derived from Injin mugwort according to an embodiment of the present invention, FIG. 1a is a callus derived from Injin mugwort stem, FIG. , Figure 1d is a callus derived from Injin mugwort root.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 인진쑥 줄기세포로부터 유도된 뿌리의 사진으로서, 도 2a는 잎 유래 줄기세포로부터 유도된 뿌리이고, 도 2b는 엽병 유래 줄기세포로부터 유도된 뿌리이고, 도 2c는 줄기 유래 줄기세포로부터 유도된 뿌리이다.2 is a photograph of a root induced from Injin mugwort stem cells according to an embodiment of the present invention, FIG. 2a is a root derived from leaf-derived stem cells, FIG. 2b is a root derived from petiole-derived stem cells, and FIG. 2c is a root derived from stem-derived stem cells.
도 3은 본 발명에 따른 아르테미시닌(artemisinin)의 생합성 모식도이다.3 is a schematic diagram of the biosynthesis of artemisinin according to the present invention.
도 1에 따른 캘러스(callus)는 식물체의 조직배양 시 외식편(外植片)을 배지위에 치상하고 적정 배양조건에서 배양하면 일정한 체제를 이루고 있는 세포괴를 형성하며 이 세포괴를 캘러스라 한다. 상기 캘러스는 줄기세포를 포함하고 있으며, 이에 따라 줄기세포를 캘러스에서 분리할 수 있다. In the callus according to FIG. 1 , when explants are placed on a medium during tissue culture of a plant and cultured under appropriate culture conditions, a cell mass forming a certain system is formed, and this cell mass is called a callus. The callus contains stem cells, and thus stem cells can be separated from the callus.
도 2에 따른 인진쑥 줄기세포 유래 뿌리는 인진쑥 줄기세포로부터 유래될 수 있으며, 상기 뿌리는 고 함량의 아르테미시닌(artemisinin)을 포함하고 있으며, 인진쑥 또는 인진쑥 줄기세포보다 다량의 아르테미시닌(artemisinin)이 함유되어 있다.The Injin mugwort stem cell-derived root according to FIG. 2 may be derived from the Injin mugwort stem cell, and the root contains a high content of artemisinin, and a greater amount of artemisinin than the Injin mugwort stem cell or Artemisinin. contains this.
도 3에 따른 아르테미시닌(artemisinin)은 Teroenoids계 이차대산물로서, 말라리아 치료제로 잘 알려져있다. 또한, 상기 아르테미시닌은 인진쑥의 우수한 항균, 항산화 및 항염성 효과의 주성분으로써, 여성냉증, 생리불순, 갱년기 장애에 좋으며, 몸이 찬 사람은 체온을 상승시킴으로써 면역력을 증진시켜줄 수 있어, 여성 청결제 등에 사용될 수 있다.Artemisinin according to FIG. 3 is a secondary product of teroenoids and is well known as a therapeutic agent for malaria. In addition, the artemisinin is a main component of the excellent antibacterial, antioxidant and anti-inflammatory effects of wormwood, and is good for female poor circulation, menstrual irregularities, and menopausal disorders. etc. can be used.
본 발명에서 상기 인진쑥 조직은 잎, 줄기, 엽병 또는 뿌리일 수 있으며, 바람직하게는 잎 또는 줄기일 수 있다. 상기 엽병은 잎몸을 줄기나 가지에 붙게 하는 꼭지 부분을 말한다.In the present invention, the Injin mugwort tissue may be a leaf, a stem, a petiole, or a root, preferably a leaf or a stem. The petiole refers to the top part that attaches the leaf body to the stem or branch.
상기 잎, 줄기, 엽병 또는 뿌리의 크기는 1~3mm일 수 있다.The size of the leaf, stem, petiole or root may be 1-3 mm.
또한, 본 발명에서 상기 인진쑥 조직을 배지에 치상하기 전에, 인진쑥 조직을 소독하는 살균 과정이 진행될 수 있다.In addition, in the present invention, before applying the Injin mugwort tissue to the medium, a sterilization process of sterilizing the Injin mugwort tissue may be performed.
상기 살균은 다음과 같은 순서로 진행될 수 있으며, 살균 처리시간에 따라 시간이 길어질 경우 조직이 파괴되고, 시간이 부족할 경우 표면조직의 각종 곰팡이 및 세균이 완전히 살균되지 않아 오염이 심하기 때문에 적당한 처리시간으로 살균을 실시하는 것이 중요하다.The sterilization can be performed in the following order, and if the time is prolonged depending on the sterilization treatment time, the tissue is destroyed. It is important to perform sterilization.
먼저, 50~90% 에탄올로 10~60초간 살균한다. 다음으로 살균된 조직을 멸균 증류수로 1~5회 세척한 후, 0.5~2% 차아염소산나트륨(Sodium Hypochlorite) 수용액에 5~10분간 침지하였다. 표피에 남아있는 소독약제가 내피세포로 침투하는 것을 방지하기 위하여 멸균된 증류수로 1~5회 세척한다. 그리고 다시 한 번 0.1~1% 차아염소산나트륨에 3~10분간 침지한 후 멸균수로 3~5회 세척하였다. First, sterilize for 10 to 60 seconds with 50 to 90% ethanol. Next, the sterilized tissue was washed 1 to 5 times with sterile distilled water, and then immersed in 0.5 to 2% sodium hypochlorite aqueous solution for 5 to 10 minutes. Wash 1-5 times with sterile distilled water to prevent the disinfectant remaining on the epidermis from penetrating into the endothelial cells. Then, it was immersed again in 0.1 to 1% sodium hypochlorite for 3 to 10 minutes, and then washed 3 to 5 times with sterile water.
상기 a)단계는 인진쑥 조직을 캘러스로 유도하는 단계이며, b)단계는 캘러스에서 줄기세포를 분리하고 이를 계대배양하는 단계이다.Step a) is a step of inducing Injin mugwort tissue into a callus, and step b) is a step of isolating stem cells from the callus and subculturing them.
상기 2,4-D(2-4-dichlorophenoxy acetic acid)는 생장조절물질인 옥신의 한 종류로서, a)단계 또는 b) 단계에서 상기 2,4-D의 함량은 0.05~3.0mg/L일 수 있으며, 바람직하게는 2.0~3.0mg/L일 수 있다. 상기 2,4-D의 함량이 0.05mg/L 미만이면, 강하고 길다란 뿌리가 형성되며, 캘러스로의 유도가 용이하지 않고, 3.0mg/L를 초과하면 노랗고 딱딱한 캘러만이 형성되어 줄기세포로의 분리가 용이하지 않다.The 2,4-D (2-4-dichlorophenoxy acetic acid) is a type of auxin that is a growth regulator, and the content of 2,4-D in step a) or b) is 0.05 to 3.0 mg/L and may preferably be 2.0 to 3.0 mg/L. When the content of 2,4-D is less than 0.05 mg/L, strong and long roots are formed, and induction into callus is not easy. Separation is not easy.
상기 NAA(naphthaleneacetic acid)는 나프탈렌 아세트산으로 생장조절물질인 옥신의 한 종류이다. 인돌아세트산과 거의 같지만 안정성이 높아서 발근을 촉진하거나 단위 결실을 유도하는 데 사용된다.The NAA (naphthaleneacetic acid) is naphthalene acetic acid and is a kind of auxin, a growth regulator. It is almost the same as indole acetic acid, but because of its high stability, it is used to promote rooting or induce unit deletion.
상기 a) 단계 또는 b) 단계에서 상기 NAA의 함량은 0.001~0.5mg/L일 수 있고, 바람직하게는 0.1~0.5mg/L일 수 있다. 상기 NAA의 함량이 0.001mg/L 미만이면 2,4-D 농도가 높을수록 단순한 캘러스가 생성되어 줄기세포의 분리가 용이하지 않을 수 있고, 0.5mg/L을 초과하면 캘러스가 생성되지 않고 뿌리만 유도될 수 있다. The content of the NAA in step a) or b) may be 0.001 to 0.5 mg/L, preferably 0.1 to 0.5 mg/L. If the content of NAA is less than 0.001 mg/L, the higher the 2,4-D concentration, the more simple callus is generated, so it may not be easy to separate stem cells. can be induced.
본 발명에서 a) 단계 또는 b) 단계에서 2,4-D 및 NAA를 함께 첨가함으로써 시너지 효과가 발생하여 단독으로 첨가하는 경우보다 인진쑥 캘러스 내에 포함되어 있는 줄기세포 배양 효과를 극대할 수 있다.In the present invention, when 2,4-D and NAA are added together in step a) or step b), a synergistic effect occurs, and the effect of culturing stem cells contained in Injinworm callus can be maximized compared to when added alone.
상기 a) 단계 또는 b) 단계에서 배지는 고체배치로서, 바람직하게는 MS 배지일 수 있으며, 상기 MS 배지는 하기 표 1과 같은 조성일 수 있다. 또한, 상기 a) 단계 또는 b) 단계에서 배지는 수크로오스(Sucrose) 및 겔라이트(Gerlite)를 더 포함할 수 있다.In step a) or b), the medium is a solid batch, preferably MS medium, and the MS medium may have a composition as shown in Table 1 below. In addition, the medium in step a) or step b) may further include sucrose (Sucrose) and gellite (Gerlite).
본 발명에서 상기 a) 단계 또는 b) 단계의 배양은 pH 5.5~6.5 및 20~30℃에서 암배양될 수 있다.In the present invention, the culture of step a) or step b) may be darkly cultured at pH 5.5-6.5 and 20-30°C.
또한, 상기 b) 단계에서 캘러스에서 줄기세포를 분리하고 계대배양할 수 있으며, 상기 b) 단계는 줄기세포의 갈변을 방지하기 위하여 25℃이하, 바람직하게는 18~22℃의 온도로 조절하고 산소를 차단하는 치상방법이 수행될 수 있다.In addition, in step b), the stem cells may be separated from the callus and subcultured, and in step b), the temperature is controlled to 25° C. or less, preferably 18 to 22° C., and oxygenated to prevent browning of the stem cells. A dentition method to block can be performed.
상기 c) 단계는 줄기세포에서 뿌리를 유도하는 단계로서, 상기 c) 단계에서 2,4-D의 함량은 0.01~0.1mg/L일 수 있고, 바람직하게는 0.05~0.1mg/L일 수 있다. 상기 c) 단계에서 2,4-D의 함량이 0.01mg/L 미만이거나, 0.1mg/L을 초과하면 뿌리로의 유도가 용이하지 않을 수 있다.Step c) is a step of inducing roots from stem cells, and the content of 2,4-D in step c) may be 0.01 to 0.1 mg/L, preferably 0.05 to 0.1 mg/L. . If the content of 2,4-D in step c) is less than 0.01 mg/L or exceeds 0.1 mg/L, induction into roots may not be easy.
상기 c) 단계에서 배지는 액체 배지일 수 있으며, 바람직하게는 MS 염류가 25~50중량% 포함된 액체 배지일 수 있다. 상기 MS 염류가 25중량% 미만이거나, 50중량%를 초과하면 줄기세포로부터 뿌리로의 유도가 용이하지 않을 수 있다.In step c), the medium may be a liquid medium, preferably a liquid medium containing 25 to 50% by weight of MS salts. If the MS salt is less than 25% by weight or exceeds 50% by weight, induction from stem cells to roots may not be easy.
본 발명에서 상기 c) 단계의 배양은 pH 5.5~6.5 및 20~30℃에서 암배양될 수 있다.In the present invention, the culture of step c) may be darkly cultured at pH 5.5-6.5 and 20-30°C.
본 발명에 따라 배양된 상기 뿌리는 아르테미시닌(artemisinin)의 함량이 인진쑥 조직의 2~5배일 수 있다.In the root cultured according to the present invention, the content of artemisinin may be 2 to 5 times that of Injin mugwort tissue.
이와 같이, 본 발명에 따른 배양 방법을 이용하면 아르테미시닌(artemisinin)대량생산용 인진쑥 줄기세포 유래 뿌리를 배양할 수 있다.As described above, using the culture method according to the present invention, it is possible to culture the roots derived from Artemisinin stem cells for mass production of Artemisinin.
본 발명의 다른 실시예는 아르테미시닌(artemisinin) 대량생산용 인진쑥 줄기세포 유래 뿌리이며, 상기 뿌리는 아르테미시닌(artemisinin)의 함량이 인진쑥 조직의 2~5배일 수 있다.Another embodiment of the present invention is an artemisinin stem cell-derived root for mass production, and the root may have an artemisinin content of 2 to 5 times that of an artemisinin tissue.
본 발명의 또 다른 실시예는 인진쑥 줄기세포, 상기 줄기세포 유래 뿌리 또는 이의 배양액을 포함하는 식품 조성물이다.Another embodiment of the present invention is a food composition comprising Injin mugwort stem cells, the stem cell-derived root, or a culture solution thereof.
또한, "배양액"이란 세포를 배양시킨 다음, 세포를 제외하고 남은 세포 배양용액을 의미한다. In addition, "culture solution" refers to a cell culture solution remaining after culturing the cells, excluding the cells.
본 발명에서 "캘러스"란, 탈분화 과정을 통하여 분화하지 않은 상태로 된 세포 또는 세포덩어리를 말하며, 줄기세포를 포함할 수 있다.In the present invention, "callus" refers to a cell or a cell mass that has not been differentiated through a dedifferentiation process, and may include stem cells.
본 발명의 상기 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food)및 식품 첨가제(food additives)등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.The food composition of the present invention includes all types of functional food (functional food), nutritional supplements (nutritional supplement), health food (health food) and food additives (food additives). Food compositions of this type can be prepared in various forms according to conventional methods known in the art.
예를 들면, 건강 식품으로는 상기 조성물 자체를 차, 주스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마말레이드 등), 어류, 육류, 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등)등에 추출물을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다. For example, as a health food, the composition itself may be prepared in the form of tea, juice, and drink to be consumed, or granulated, encapsulated, and powdered for ingestion. In addition, functional foods include beverages (including alcoholic beverages), fruits and their processed foods (eg canned fruit, canned fruit, jam, marmalade, etc.), fish, meat, and their processed foods (eg ham, sausage corn beef, etc.); Breads and noodles (eg udon noodles, soba noodles, ramen, spaghetti, macaroni, etc.), fruit juice, various drinks, cookies, syrup, dairy products (eg butter, cheese, etc.), edible vegetable oils and fats, margarine, vegetable protein, retort foods, It can be prepared by adding the extract to frozen food and various seasonings (eg, soybean paste, soy sauce, sauce, etc.). In addition, in order to use the composition of the present invention in the form of a food additive, it may be prepared and used in the form of a powder or a concentrate.
본 발명의 상기 인진쑥 줄기세포, 상기 줄기세포 유래 뿌리 또는 이의 배양액의 바람직한 함량은 식품 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 50% 일 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 50% 범위로 함유될 수 있다.The preferred content of the Injin mugwort stem cells of the present invention, the stem cell-derived roots, or a culture thereof may be 0.001 to 50%, preferably 0.1 to 50%, based on the total weight of the food composition.
본 발명의 또 다른 실시예는 인진쑥 줄기세포, 상기 줄기세포 유래 뿌리 또는 이의 배양액을 포함하는 여성 청결제 조성물이다.Another embodiment of the present invention is a feminine cleanser composition comprising Injin mugwort stem cells, the stem cell-derived root, or a culture solution thereof.
본 발명의 상기 인진쑥 줄기세포, 상기 줄기세포 유래 뿌리 또는 이의 배양액의 바람직한 함량은 여성 청결제 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 10% 일 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 10% 범위로 함유될 수 있다.The preferred content of the Injin mugwort stem cells of the present invention, the stem cell-derived roots, or a culture thereof may be 0.001 to 10%, preferably 0.1 to 10%, based on the total weight of the feminine cleanser composition.
또한, 상기 여성 청결제 조성물은 당업계에서 일반적으로 알려진 조성으로 구성될 수 있다.In addition, the feminine cleanser composition may be composed of a composition generally known in the art.
이하, 본 발명에 따른 구체적인 실시예를 들어 설명한다.Hereinafter, specific examples according to the present invention will be described.
실시예 1 : 인진쑥 줄기세포 유래 뿌리 배양Example 1: Injin mugwort stem cell-derived root culture
본 발명에서 사용한 인진쑥은 재료경남농업기술원 약용자원연구소에서 분양 받아서 국립농업과학원 생물자원부 온실 내 화분에서 재배하였고 실험에 필요한 양을 확보하기 위해 삽목을 실시하였다. 삽목한 지 약 8주 후, 30cm 길이로 자란 식물체의 잎, 줄기 및 뿌리를 사용하였다.Injin mugwort used in the present invention was sold from the Institute of Medicinal Resources, Gyeongnam Institute of Agricultural Technology, and was grown in pots in the greenhouse of the Ministry of Biological Resources of the National Academy of Agricultural Sciences. About 8 weeks after cutting, the leaves, stems and roots of plants grown to a length of 30 cm were used.
재료 살균material sterilization
인진쑥의 내피조직은 보존하고 표피조직의 완벽한 살균을 위하여, 70% 에탄올에 20초 침지한 후, 멸균증류수로 3회 세척하고, 1% 차아염소산나트륨(Sodium Hypochlorite) 수용액에 5~10분간 침지하였다. 표피에 남아있는 소독약제가 내피세포로 침투하는 것을 방지하기 위하여 멸균된 증류수로 1~5회 세척한다. 그리고 다시 한 번 0.5% 차아염소산나트륨에 3~10분간 침지한 후 멸균수로 3~5회 세척하였다.In order to preserve the endothelial tissue of Injin Artemisia and perfect sterilization of the epidermal tissue, it was immersed in 70% ethanol for 20 seconds, washed 3 times with sterile distilled water, and immersed in 1% sodium hypochlorite aqueous solution for 5 to 10 minutes. . Wash 1-5 times with sterile distilled water to prevent the disinfectant remaining on the epidermis from penetrating into the endothelial cells. Then, it was immersed again in 0.5% sodium hypochlorite for 3 to 10 minutes, and then washed 3 to 5 times with sterile water.
캘러스 유도 배양Callus induction culture
인진쑥의 잎은 2~3mm로 준비하고, 엽병은 잎과 배축을 이여주는 부분을 2mm로 준비하고, 줄기는 2mm로 준비하고, 뿌리는 MS 기본 배지에 생장점 배양을 하여 식물체로 발달된 인진쑥을 뿌리를 12주 배양하여 3mm로 잘라 준비하였다.Prepare the leaves of Injin mugwort 2~3mm, the petiole prepares the part connecting the leaf and the hypocotyl to 2mm, prepare the stem to be 2mm, and the roots are grown as a plant by culturing the growth point in MS basic medium. was prepared by culturing for 12 weeks and cutting it into 3 mm.
상기 잎, 엽병, 줄기 및 뿌리를 고체 배양 배지에 치상하였으며, 25±1℃에서 암배양하여 캘러스(callus) 유도 배양을 실시하였으며, 식물을 부위 별로 배양한 지 7일 정도부터 callus 형성을 관찰하기 시작하였다.The leaves, petioles, stems and roots were dented in a solid culture medium, and callus induction culture was performed by darkly culturing at 25±1° C., and observing callus formation from about 7 days after culturing the plants for each part. started
상기 고체 배양 배지는 표 1의 기본 MS 배지에 30g의 수크로오스 및 4g의 겔라이트를 첨가하였으며, 2,4-D, NAA 및 사이토카인의 한 종류인 BAP(벤조피렌)를 하기 표 2와 같이 첨가하였으며, 유도된 캘러스를 도 4에 나타내었다.For the solid culture medium, 30 g of sucrose and 4 g of gelite were added to the basic MS medium of Table 1, and 2,4-D, NAA, and BAP (benzopyrene), a type of cytokine, were added as shown in Table 2 below. , the induced callus is shown in FIG. 4 .
도 4는 본 발명에 따라 배양 조건을 달리하여 유도된 인진쑥 캘러스의 사진으로서, 도 4a는 줄기 유래 캘러스의 사진이고, 도 4b는 잎 및 엽병 유래 캘러스의 사진이고, 도 4c는 뿌리 유래 캘러스의 사진이다.4 is a photograph of Injin mugwort callus induced by different culture conditions according to the present invention, FIG. 4a is a photograph of a stem-derived callus, FIG. 4b is a photograph of a leaf and petiole-derived callus, and FIG. am.
도 4를 참조하면, 호르몬 무첨가인 고체 MS배지에서는 완전한 식물체로 분화하거나 뿌리가 유도되었다. 캘러스 유도에 있어서 2,4-D를 다양한 농도(0.05~3mg/L)로 처리한 결과(배양배지 1 내지 7) 낮은 농도인 0.05~0.2mg/L(배양배지 1 내지 3)에서는 캘러스 유도량이 적은 반면 강하고 굵은 뿌리가 형성되었으며, 0.5mg/L 이상(배양배지 4 및 5)에서부터 농도가 높아질수록 캘러스 유도량은 많아지는 반면 뿌리 형성은 낮아지면서 약하고 가늘어지는 경향을 나타냈다. Referring to FIG. 4 , in the solid MS medium without the addition of hormones, differentiation into a complete plant or roots were induced. As a result of treatment with 2,4-D at various concentrations (0.05 to 3 mg/L) in callus induction (
또한 2.0~3.0mg/L(배양배지 6 및 7)에서는 뿌리 형성은 거의 되지 않고 캘러스에 줄기세포의 특징인 흰색이며 끈적거리지만 떨어지며 띠를 형성하는 형태를 관찰할 수 있었다. In addition, at 2.0~3.0 mg/L (culture medium 6 and 7), root formation was hardly observed, and a white, sticky, but falling, band-forming form, characteristic of stem cells, was observed on the callus.
이로부터, 인진쑥은 부위 별로 배양했을 때 잎, 엽병, 줄기, 뿌리 각각 부위에서 2,4-D 농도가 높은 2~3mg/L 단독처리구에서 줄기세포를 포함하는 캘러스를 얻을 수 있었다. From this, it was possible to obtain callus containing stem cells in the 2~3mg/L single treatment group with high 2,4-D concentration in each part of the leaf, petiole, stem, and root when Injin mugwort was cultured for each part.
한편, NAA를 혼합 처리한 결과, 2,4-D는 0.1mg/L로 고정하고 NAA를 0.01~0.1mg/L 혼합처리한구(배양배지 8 내지 10)에서 NAA 농도가 높아질수록 강하고 굵은 뿌리가 형성되었다. 반면 2,4-D를 2.0mg/L로 고정하고, NAA를 0.1~0.5mg/L 혼합처리한구(배양배지 11 내지 13)에서는 부위 별로 약간 차이가 있었으나, 2,4-D 단독처리구(배양배지 1 내지 7)보다 거의 줄기세포로 덮여있는 캘러스를 얻을 수 있었다.On the other hand, as a result of mixing NAA, 2,4-D was fixed at 0.1 mg/L and NAA was mixed with 0.01 to 0.1 mg/L (culture medium 8 to 10), the higher the NAA concentration, the stronger and thicker roots was formed On the other hand, in the group treated with 2,4-D at 2.0 mg/L and NAA mixed with 0.1 to 0.5 mg/L (culture medium 11 to 13), there was a slight difference by site, but 2,4-D alone treatment group (culture medium 11 to 13) A callus covered with stem cells was obtained more than the
줄기 유래 처리구는 주로 줄기세포가 포함된 캘러스가 형성된 반면, 잎 유래 처리구는 NAA농도가 높을수록 약하고 가는 뿌리가 관찰되었다. 뿌리 유래 처리구는 연한 노란색을 띠며 캘러스 형성이 줄기 및 잎에 비해 적은 편이었다. In the stem-derived treatment group, callus containing mainly stem cells was formed, whereas in the leaf-derived treatment group, the higher the NAA concentration, the weaker and thinner roots were observed. The root-derived treatment group had a light yellow color and had less callus formation than the stem and leaf.
이로부터 식물의 종류, 식물체 부위, 호르몬의 종류 및 농도에 따라 상승적 효과가 나타나기도 하고 억제하기도 하며, 줄기세포를 포함하는 캘러스 유도에 영향을 미침을 알 수 있다.From this, it can be seen that a synergistic effect appears or inhibits depending on the type of plant, plant part, and the type and concentration of hormone, and affects the induction of callus including stem cells.
한편, 2,4-D와 cytokinin 계통의 대표적인 호르몬인 BAP를 혼한처리한구(배양배지 14 내지 16) 결과 줄기 및 잎 유래 배양 시 BAP농도가 높은 1mg/L 혼합처리한구(배양배지 16)에서는 어떠한 반응도 나타나지 않았다. 그러나 BAP 농도가 낮은 0.05~0.1mg/L 혼합처리구(배양배지 14 및 15)에서는 캘러스가 매우 적은 양으로 유도되었다. 반면 뿌리 유래 배양 시 BAP농도에 상관없이 어떠한 반응도 나타나지 않았다.On the other hand, in the group treated with 2,4-D and BAP, a representative hormone of the cytokinin system (culture medium 14 to 16), when cultured stem and leaf-derived, 1 mg/L mixed treatment with high BAP concentration (culture medium 16) No reaction appeared. However, in the 0.05~0.1mg/L mixed treatment group (culture medium 14 and 15) with a low BAP concentration, callus was induced in a very small amount. On the other hand, no reaction was observed regardless of the BAP concentration during root-derived culture.
줄기세포 분리 및 계대배양Stem cell isolation and subculture
캘러스로부터 줄기세포를 분리하기 위하여, 잎, 줄기 및 엽병에서 유도된 캘러스에 포함되어 있는 줄기세포(흰색을 띠며 손으로 문질렀을 때 뭉개지는 솜 같은 느낌의 띠를 형성한 줄기세포)를 따로 분리하였다. 이후, 계대배양하였으며, 계대배양 시 갈변을 방지하기 위하여, 20℃에서 치상 시 자른 면을 산소에 접촉 시키지 않고 뒤집어 계대배양하였다.In order to isolate stem cells from the callus, stem cells (white stem cells that form a cotton-like band that are crushed when rubbed by hand) contained in the callus induced from leaves, stems and petioles were separately isolated. . After that, subculture was carried out, and in order to prevent browning during subculture, the cut side was turned over without contact with oxygen when toothed at 20°C and subcultured.
줄기세포 유래 뿌리배양 1Stem Cell-derived
상기 배양배지 6 및 7에서 엽병, 입 및 줄기에서 유도된 캘러스에서 줄기세포를 분리하였다. 이후, MS 염류가 50중량% 및 25중량%가 포함된 액체 배지(1/2 MS 배지 및 1/4 MS 배지)에 2,4-D를 각각 0.05mg/L, 0.1mg/L 처리하고, 1L 플라스크에 500ml를 분주한 후, 캘러스에서 분리된 줄기세포를 치상하고 배양하였다. 배지 조건은 하기 표 3에 나타내었으며, 배양은 120rpm, 25±1℃. 암배양으로 12주간 현탁 배양하였다. 유도된 뿌리는 도 5에 나타내었다.Stem cells were isolated from callus derived from petiole, mouth and stem in the culture media 6 and 7. Thereafter, 2,4-D in a liquid medium (1/2 MS medium and 1/4 MS medium) containing 50% by weight and 25% by weight of MS salts was treated with 0.05 mg/L and 0.1 mg/L, respectively, After dispensing 500ml into a 1L flask, stem cells isolated from the callus were dented and cultured. The medium conditions are shown in Table 3 below, and the culture was 120rpm, 25±1℃. The cancer culture was cultured in suspension for 12 weeks. The induced roots are shown in FIG. 5 .
(중량%)MS salt content
(weight%)
도 5를 참조하면, 액체배양에서는 고체배양에서보다 더욱 빨리 성장함을 볼 수 있었는데 이는 액체배양은 고체배지에서보다 캘러스로부터 분리된 줄기세포가 조각으로 부서져 있어 훨씬 표면적이 더 커져서 배지로부터 양분의 흡수, 호르몬 농도의 영향 그리고 산소공급이 더 원활이 일어나기 때문이다.Referring to Figure 5, it was seen that the liquid culture grew faster than in the solid culture, which is that the stem cells separated from the callus are broken into pieces in the liquid culture than in the solid culture, and the surface area is much larger, so that the absorption of nutrients from the medium, This is because the effect of hormone concentration and oxygen supply occur more smoothly.
줄기의 경우, 2,4-D가 각각 0.05mg/L 및 0.1mg/L 첨가된 처리구에서도 캘러스로부터 분리된 줄기세포가 성장하고 있으며, 2,4-D 농도가 낮은 0.05 mg/L처리구(배양배지 19)에서는 간혹 뿌리가 1, 2개 형성되었으며, 1/4 배지보다 MS 함량이 높은 1/2 MS 배지에서는 2,4-D 농도가 낮은 경우(배양배지 22)에서 뿌리가 형성되었다. 즉, 줄기 유래 액체 배양에서는 뿌리보다는 캘러스로부터 분리된 줄기세포 형성 및 성장에 효과적임을 알 수 있었다.In the case of stems, stem cells isolated from the callus were growing even in the treatment groups in which 2,4-D was added at 0.05 mg/L and 0.1 mg/L, respectively, and in the 0.05 mg/L treatment group with a low 2,4-D concentration (culture In medium 19), sometimes 1 or 2 roots were formed, and in 1/2 MS medium with a higher MS content than 1/4 medium, roots were formed when the 2,4-D concentration was low (culture medium 22). That is, it was found that the stem-derived liquid culture is effective for the formation and growth of stem cells isolated from the callus rather than the roots.
잎의 경우, MS 농도 및 2,4-D 농도에 관계없이 뿌리가 형성되었다. 다만 1/4 MS 배지, 2,4-D 0.1mg/L의 경우(배양배지 24)에서는 뿌리가 엉킬정도의 뿌리가 형성되었으나 더 낮은 농도인 0.05mg/L인 경우(배양배지 18)에서는 뿌리가 짧게 형성이 되었다. 또한 1/2 MS, 2,4-D 농도가 0.1mg/L보다 낮은 0.05mg/L인 경우(배양배지 27)에서 서로 뒤엉킬 정도로 뿌리 형성율이 높았다. 즉, 뿌리 형성을 유도는 잎 유래 배양에서 2,4-D 0.1mg/L를 첨가한 1/4 MS 또는 2,4-D를 0.05mg/L를 첨가한 1/2 MS배지를 이용하는 것이 유리함을 알 수 있다.For leaves, roots were formed regardless of MS concentration and 2,4-D concentration. However, in the case of 1/4 MS medium, 2,4-D 0.1mg/L (culture medium 24), roots were formed to the extent that they were tangled, but at a lower concentration of 0.05mg/L (culture medium 18), roots was formed briefly. Also, when the 1/2 MS, 2,4-D concentration was 0.05 mg/L lower than 0.1 mg/L (culture medium 27), the root formation rate was high enough to become entangled with each other. That is, to induce root formation, it is advantageous to use 1/4 MS containing 0.1 mg/L of 2,4-D or 1/2 MS medium containing 0.05 mg/L of 2,4-D in leaf-derived culture. can be known
엽병 유래인 경우 1/4 MS, 1/2 MS, 2,4-D 0.1mg/l(배양배지 20 및 26)에서는 캘러스로부터 분리된 줄기세포만 유지 성장하였으나, 2,4-D농도가 낮은 0.05mg/L(배양배지 17 및 20)에서는 캘러스로부터 분리된 줄기세포가 형성이 되면서 가늘고 길다란 뿌리도 3,4개 형성되었다.In the case of petiole origin, only stem cells isolated from callus were maintained and grown in 1/4 MS, 1/2 MS, and 2,4-D 0.1 mg/l (culture medium 20 and 26), but the 2,4-D concentration was low. At 0.05 mg/L (culture medium 17 and 20), stem cells isolated from the callus were formed, and 3 or 4 long and thin roots were also formed.
줄기세포 유래 뿌리배양 2Stem cell-derived root culture 2
상기 배양배지 11 내지 13에서 엽병, 입 및 줄기에서 유도된 캘러스에서 줄기세포를 분리하였다. 이후, MS 염류가 50중량% 및 25중량%가 포함된 액체 배지(1/2 MS 배지 및 1/4 MS 배지)에 2,4-D를 각각 0.05mg/L, 0.1mg/L 처리하고, 1L 플라스크에 500ml를 분주한 후, 캘러스에서 분리된 줄기세포를 치상하고 배양하였다. 배지 조건은 하기 표 4 내지 6에 나타내었으며, 배양은 120rpm, 25±1℃. 암배양으로 12주간 현탁 배양하였다. Stem cells were isolated from callus derived from petiole, mouth and stem in the culture medium 11 to 13. Thereafter, 2,4-D in a liquid medium (1/2 MS medium and 1/4 MS medium) containing 50% by weight and 25% by weight of MS salts was treated with 0.05 mg/L and 0.1 mg/L, respectively, After dispensing 500ml into a 1L flask, stem cells isolated from the callus were dented and cultured. The medium conditions are shown in Tables 4 to 6 below, and the culture was performed at 120rpm, 25±1℃. The cancer culture was cultured in suspension for 12 weeks.
(중량%)MS salt content
(weight%)
(중량%)MS salt content
(weight%)
(중량%)MS salt content
(weight%)
고체배양 시 2,4-D 농도를 2.0mg/L로 고정하고 NAA 0.1~0.5mg/L 혼합처리한구(배양배지 11 내지 13)에서는 엽병 또는 잎 유래 캘러스에서 분리된 줄기세포에서 뿌리가 뒤엉킬 정도로 많은 뿌리가 형성되었다(미도시).In the case of solid culture, the 2,4-D concentration was fixed at 2.0 mg/L and NAA 0.1 to 0.5 mg/L mixed treatment (culture medium 11 to 13) caused the roots to become entangled in stem cells isolated from petiole or leaf-derived callus. So many roots were formed (not shown).
실시예 2 : 인진쑥 캘러스로부터 분리된 줄기세포에 대한 과산화수소수 반응Example 2: Hydrogen peroxide response to stem cells isolated from Artemisia callus
실시예 1에서 배양된 인진쑥 줄기세포를 포함한 캘러스에서 분리된 줄기세포가 줄기세포임을 확인하기 위하여 배양배지 11에서 배양된 인진쑥 캘러스에서 분리된 줄기세포에 과산화수소수를 처리하였으며, 이를 도 6에 나타내었다.In order to confirm that the stem cells isolated from the callus including the Injin mugwort stem cells cultured in Example 1 are stem cells, the stem cells isolated from the Injin mugwort callus cultured in culture medium 11 were treated with hydrogen peroxide, which is shown in FIG. .
형성층 유래의 어린 줄기세포에 다량 존재하는 것으로 알려진 peroxidase 및 catalase에 의해 과산화수소수는 물과 산소로 분해된다. 도 6을 참조하면, 본 발명에서 분리 배양한 인진쑥 캘러스에서 분리된 줄기세포에 과산화수소수를 처리한 결과, 물과 다량의 산소가 발생되어 기포로 뒤덮이는 결과를 보였으므로, 인진쑥 캘러스에서 분리된 줄기세포가 형성층 유래의 인진쑥 줄기세포임을 알 수 있다.Hydrogen peroxide is decomposed into water and oxygen by peroxidase and catalase, which are known to exist in large amounts in cambium-derived young stem cells. Referring to FIG. 6 , as a result of treatment with hydrogen peroxide water on stem cells isolated from Injin mugwort callus separated and cultured in the present invention, water and a large amount of oxygen were generated and the result was covered with air bubbles. It can be seen that the stem cells are cambium-derived Injin mugwort stem cells.
실시예 3 : 인진쑥 조직, 인진쑥 캘러스에서 분리된 줄기세포 및 줄기세포 유래 뿌리 내 아르테미시닌(artemisinin) 함량 비교Example 3: Comparison of Artemisinin Content in Injin Artemisia Tissue, Stem Cells Isolated from Injin Artemisia Callus and Stem Cell-derived Roots
아르테미시닌(artemisinin)의 함량을 분석하기 위하여, 액체 크로마토그래피-질량분석법(LC-MS/MS)를 이용하였다.In order to analyze the content of artemisinin, liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS/MS) was used.
구체적으로, 인진쑥 조직, 실시예 1에서 배양한 인진쑥 캘러스에서 분리된 줄기세포 및 줄기세포 유래 뿌리를 건조한 후, 각각의 50mg 건조시료를 5, 25, 25㎖ 메탄올로 3회 추출한 후 추출물에 물 25㎖을 첨가한 다음 헥산 10㎖로 2회 상분배하여 메탄올/물 층을 수거한 다음 농축하고 500μM 메탄올로 재용해하여 분석 시료로 사용하였고, 추출물의 아르테미시닌(artemisinin)의 함량을 분석하기 위하여, 액체 크로마토그래피-질량분석법(LC-MS/MS)를 이용하였다. 본 발명의 아르테미시닌(artemisinin) 함량 분석에 사용한 LC-MS/MS의 조건은 하기 표 7과 같다. Specifically, after drying the Injin mugwort tissue, the stem cells and stem cell-derived roots isolated from the Injin mugwort callus cultured in Example 1, each 50 mg dry sample was extracted three times with 5, 25, and 25 ml methanol, and then the extract was added with water 25 ㎖ was added and then phase partitioned twice with 10 mL of hexane to collect the methanol/water layer, concentrated, and re-dissolved in 500 μM methanol to be used as an analysis sample, and to analyze the content of artemisinin in the extract , liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS/MS) was used. The conditions of LC-MS/MS used for the analysis of the artemisinin content of the present invention are shown in Table 7 below.
인진쑥 조직, 인진쑥 캘러스에서 분리된 줄기세포 및 줄기세포 유래 뿌리의 아르테미시닌(artemisinin) 함량은 도 7에 나타내었다.Artemisinin content of stem cells and stem cell-derived roots isolated from Injin mugwort tissue, Injin mugwort callus is shown in FIG. 7 .
도 7a는 인진쑥 조직의 아르테미시닌(artemisinin)의 함량을 나타낸 도면, 도 7b는 인진쑥 캘러스에서 분리된 줄기세포의 아르테미시닌(artemisinin)의 함량을 나타낸 도면, 도 7c는 줄기세포 유래 뿌리의 아르테미시닌(artemisinin)의 함량을 나타낸 도면이다. 7A is a diagram showing the content of artemisinin in the Injin mugwort tissue, FIG. 7B is a diagram showing the content of artemisinin in stem cells isolated from Artemisia callus, and FIG. It is a diagram showing the content of myshinin (artemisinin).
도 7a 내지 7c를 참조하면, 줄기세포 유래 뿌리의 아르테미시닌(artemisinin)의 함량은 0.57±0.01 mg/L로 인진쑥 조직의 아르테미시닌(artemisinin) 함량 0.14 ± 0.01 mg/L의 약 4배인 것을 확인할 수 있으며, 줄기세포 유래 뿌리에서 아르테미시닌(artemisinin) 함량이 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있다.7a to 7c, the content of artemisinin in the stem cell-derived root is 0.57±0.01 mg/L, which is about 4 times the artemisinin content of 0.14±0.01 mg/L in the Injin mugwort tissue. It can be confirmed, and it can be confirmed that the content of artemisinin in the stem cell-derived root is significantly increased.
또한, 캘러스에서 분리해 낸 줄기세포의 특성을 고려할 때, 지속적인 대량 계대배양을 추진할 경우에도, 이러한 고농도의 기능성물질의 축적을 기대할수 있다.In addition, considering the characteristics of stem cells isolated from callus, accumulation of such a high concentration of functional substances can be expected even when continuous mass subculture is promoted.
한편, 인진쑥 캘러스에서 분리해 낸 줄기세포의 아르테미시닌(artemisinin) 생합성량은 0.23 ± 0.15mg/L로 인진쑥 조직의 약 1.8배임을 알 수 있다.On the other hand, it can be seen that the biosynthesis amount of artemisinin in stem cells isolated from Artemisia callus is 0.23 ± 0.15 mg/L, which is about 1.8 times that of Injin mugwort tissue.
이와 같이, 본 발명의 아르테미시닌(artemisinin) 대량생산용 인진쑥 줄기세포 유래 뿌리배양 방법을 이용하여 아르테미시닌(artemisinin)의 함량을 증가시킬 수 있으며, 이에 따라 줄기세포 유래 뿌리로부터 고함량의 아르테미시닌(artemisinin)을 대량으로 생산하여 산업화 할 수 있다.As described above, the content of artemisinin can be increased by using the root culture method for mass production of artemisinin of the present invention. It can be industrialized by mass production of artemisinin.
또한, 아르테미시닌(artemisinin)을 포함하는 인진쑥 줄기세포, 상기 줄기세포 유래 뿌리 또는 이의 배양액을 포함하는 식품 조성물 또는 여성 청결제 조성물을 제공할 수 있다.In addition, it is possible to provide a food composition or a feminine cleanser composition comprising Artemisinin-containing stem cells, stem cell-derived roots, or a culture solution thereof.
이상으로 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명하였다. 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다.The preferred embodiment of the present invention has been described in detail above. The description of the present invention is for illustration, and those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains will understand that other specific forms can be easily modified without changing the technical spirit or essential features of the present invention.
따라서, 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미, 범위 및 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.Therefore, the scope of the present invention is indicated by the claims to be described later rather than the detailed description, and all changes or modifications derived from the meaning, scope, and equivalent concept of the claims are interpreted as being included in the scope of the present invention. should be
Claims (11)
b) 상기 캘러스에서 줄기세포를 분리하여 2,4-D 및 NAA(naphthaleneacetic acid)가 포함된 배지에서 배양하는 단계; 및
c) 상기 줄기세포를 2,4-D가 포함된 배지에 배양하여 뿌리 형성을 유도하는 단계;
를 포함하는 아르테미시닌(artemisinin) 대량생산용 인진쑥 줄기세포 유래 뿌리배양 방법.a) inducing callus by culturing the Injin mugwort tissue in a medium containing 2,4-D and NAA (naphthaleneacetic acid);
b) separating the stem cells from the callus and culturing in a medium containing 2,4-D and NAA (naphthaleneacetic acid); and
c) inducing root formation by culturing the stem cells in a medium containing 2,4-D;
Artemisinin (artemisinin) Injin mugwort stem cell-derived root culture method for mass production comprising a.
상기 인진쑥 조직은 잎, 줄기, 엽병 또는 뿌리인 것을 특징으로 하는 아르테미시닌(artemisinin) 대량생산용 인진쑥 줄기세포 유래 뿌리배양 방법.According to claim 1,
The Artemisinin stem cell-derived root culture method for mass production of Artemisinin, characterized in that the Injin mugwort tissue is a leaf, a stem, a petiole or a root.
상기 a) 단계 또는 b) 단계에서 2,4-D의 함량은 0.05~3.0mg/L이고, NAA의 함량은 0.001~0.5mg/L인 것을 특징으로 하는 아르테미시닌(artemisinin) 대량생산용 인진쑥 줄기세포 유래 뿌리배양 방법.According to claim 1,
Injin mugwort for mass production of artemisinin, characterized in that the content of 2,4-D in step a) or b) is 0.05 to 3.0 mg/L, and the content of NAA is 0.001 to 0.5 mg/L Stem cell-derived root culture method.
상기 a) 단계 또는 b) 단계에서 배지는 고체배지이고, 수크로오스(Sucrose) 및 겔라이트(Gerlite)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 아르테미시닌(artemisinin) 대량생산용 인진쑥 줄기세포 유래 뿌리배양 방법.According to claim 1,
In step a) or b), the medium is a solid medium, and artemisinin is a method for mass production of Artemisinin stem cell-derived root culture, characterized in that it further comprises a solid medium.
상기 a) 단계 또는 b) 단계에서 배양은 pH 5.5~6.5 및 20~30℃에서 암배양하는 것을 특징으로 하는 아르테미시닌(artemisinin) 대량생산용 인진쑥 줄기세포 유래 뿌리배양 방법.According to claim 1,
The culture in step a) or step b) is an artemisinin stem cell-derived root culture method for mass production, characterized in that cancer culture at pH 5.5-6.5 and 20-30°C.
상기 c) 단계에서 2,4-D의 함량은 0.01~0.1mg/L인 것을 특징으로 하는 아르테미시닌(artemisinin) 대량생산용 인진쑥 줄기세포 유래 뿌리배양 방법.According to claim 1,
In the step c), the content of 2,4-D is 0.01 ~ 0.1 mg/L Artemisinin (artemisinin) mass production Injin mugwort stem cell-derived root culture method, characterized in that.
상기 c) 단계에서 배지는 액체배지인 것을 특징으로 하는 아르테미시닌(artemisinin) 대량생산용 인진쑥 줄기세포 유래 뿌리배양 방법.According to claim 1,
Artemisinin (artemisinin) mass production of Artemisinin stem cell-derived root culture method for mass production, characterized in that the medium in step c) is a liquid medium.
상기 뿌리는 아르테미시닌(artemisinin)의 함량이 인진쑥 조직의 2~5배인 것을 특징으로 하는 아르테미시닌(artemisinin) 대량생산용 인진쑥 줄기세포 유래 뿌리배양 방법.According to claim 1,
The root culture method derived from Artemisinin stem cells for mass production of Artemisinin, characterized in that the content of Artemisinin is 2 to 5 times that of Injin Artemisia tissue.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020200120717A KR102502961B1 (en) | 2020-09-18 | 2020-09-18 | A method of culturing roots derived from stem cell of Artemisia capillaris Thunb for mass increasing artemisinin |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020200120717A KR102502961B1 (en) | 2020-09-18 | 2020-09-18 | A method of culturing roots derived from stem cell of Artemisia capillaris Thunb for mass increasing artemisinin |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20220037805A true KR20220037805A (en) | 2022-03-25 |
KR102502961B1 KR102502961B1 (en) | 2023-02-24 |
Family
ID=80935434
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020200120717A KR102502961B1 (en) | 2020-09-18 | 2020-09-18 | A method of culturing roots derived from stem cell of Artemisia capillaris Thunb for mass increasing artemisinin |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
KR (1) | KR102502961B1 (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115918540A (en) * | 2022-12-26 | 2023-04-07 | 广西壮族自治区药用植物园 | Method for eliminating bacterial contamination in artemisia annua tissue culture |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20090115394A (en) * | 2008-05-02 | 2009-11-05 | 초임계연구소 주식회사 | Methods for Preparing Plant Stem Cells Assured by High Efficiency Differentiation |
KR20120040538A (en) * | 2010-10-19 | 2012-04-27 | 황재갑 | Cleansing composition comprising natural compounds extract of oenanthe javanica dc, artemisia capillaris and artemisiae capillaris flos complex for ladies, its method to use and process thereof |
KR20200101898A (en) | 2020-08-20 | 2020-08-28 | 인제대학교 산학협력단 | Aqueous extract of artemisia capillaris, and use and preparation method thereof |
-
2020
- 2020-09-18 KR KR1020200120717A patent/KR102502961B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20090115394A (en) * | 2008-05-02 | 2009-11-05 | 초임계연구소 주식회사 | Methods for Preparing Plant Stem Cells Assured by High Efficiency Differentiation |
KR20120040538A (en) * | 2010-10-19 | 2012-04-27 | 황재갑 | Cleansing composition comprising natural compounds extract of oenanthe javanica dc, artemisia capillaris and artemisiae capillaris flos complex for ladies, its method to use and process thereof |
KR20200101898A (en) | 2020-08-20 | 2020-08-28 | 인제대학교 산학협력단 | Aqueous extract of artemisia capillaris, and use and preparation method thereof |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115918540A (en) * | 2022-12-26 | 2023-04-07 | 广西壮族自治区药用植物园 | Method for eliminating bacterial contamination in artemisia annua tissue culture |
CN115918540B (en) * | 2022-12-26 | 2024-01-12 | 广西壮族自治区药用植物园 | Elimination of Artemisia annua L tissue culture contamination with medium bacteria is a method of (2) |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR102502961B1 (en) | 2023-02-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Piga | Cactus pear: a fruit of nutraceutical and functional importance | |
KR100934252B1 (en) | Its feed and an additive composition for poultry containing wild ginseng cultured root | |
KR102106441B1 (en) | Feed composition for domestic animals comprising cricket powders and manufacturing method thereof | |
KR102502961B1 (en) | A method of culturing roots derived from stem cell of Artemisia capillaris Thunb for mass increasing artemisinin | |
KR20180118361A (en) | Method for manufacturing concentrate of Aronia | |
KR102292878B1 (en) | A method of breeding white grubs using ginseng and a food composition comprising white grubs raised thereof | |
JP2004065240A (en) | Seed and plant containing vitamin b12, and method for producing the same | |
KR20180098888A (en) | Composition for increasing immunity having extract of peanut sprouts extract as active component | |
KR101930944B1 (en) | Feed for beekeeping with non-commercial fruit and manufacturing method thereof | |
KR100604342B1 (en) | method for manufacturing the diet feed for one's pet | |
KR20120095595A (en) | Method of preparing fattune liquid comprising onion and grapefruit | |
KR102182126B1 (en) | fermented sawdust for grub feed and manufacturing method thereof and breeding method of grub | |
KR101037572B1 (en) | Powder manufacturing process using rind and pip of rubus coreanus | |
KR101918890B1 (en) | Pollen Fermented liquid composition using glacial water and method of producing the same | |
JP3216814U (en) | Cookie-like vinegar egg food | |
KR102580993B1 (en) | Method of culturing Ixeris dentata NAKAI embryogenic callus for mass production of chrysoeriol-7-0-glucoside | |
KR101787643B1 (en) | Natural fermentation products using lactic acid bacteria and its producing method | |
KR100448253B1 (en) | Method of producing fermented beverage containing pine extracts and liquid fermented by lactic acid bacteria and the beverage produced thereby | |
KR20110113709A (en) | Process for the preparation of beverage composition aining vanadium and beverage composition containing vanadium prepared therefrom | |
WO2020213003A1 (en) | A composition of wheatgrass and process for preparation thereof | |
KR100402420B1 (en) | Manufacturing Method for Pumpkin Jelly | |
KR20040052747A (en) | Method for cultivating strawberry containing selenium | |
KR102683022B1 (en) | METHOD FOR MANUFACTURING SEASONING SAUCE FOR PORK USING Flammulina velutipes EXTRACT AND SEASONING SAUCE FOR PORK PRODUCED THEREBY | |
KR101692692B1 (en) | slices of raw skate seasoned with vegetable | |
KR100618145B1 (en) | Manufacturing method of soybean paste and fermented soybean including pine needle ingredient and mushroom |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant |